MC2039A1 - Proteine ayant un ou plusieurs determinants immuno-reactifs et/ou antigeniques d'un antigene de surface d'eimeria,utilisation et procede de preparation - Google Patents

Description

1

La coccidiose est une maladie de la volaille provoquée par des parasites protozoaires intracellulaires du genre Eimeria. La maladie est endémique dans les grands établissements d'élevage intensif de volaille et le coût estimé de la lutte contre la maladie par chimiothérapie dépasse 100 millions de dollars chaque année aux Etats-Unis d'Amérique uniquement. Le développement de résistance aux médicaments anticoccidiens nécessite un développement ininterrompu de nouveaux agents à une époque ou le développement des médicaments devient de plus en plus cher et l'acceptation par les consommateurs de résidus de médicaments chez les animaux destinés à l'alimentation est en train de diminuer.

L'immunité protectrice contre l'infection naturelle par la coccidiose a été bien étudiée. Il a été montré que l'administration journalière contrôlée de petits nombres d'ookystes viables pendant plusieurs semaines confère une immunité complète contre une infection de provocation d'une dose normalement virulente [Rose et al., Parasitology 73:25 ( 1 976); Rose et al., Parasitology 8_8 : 1 99 ( 1 984)].

2

La démonstration d'une résistance acquise à l'infection suggère la possibilité d'élaborer un vaccin pour induire l'immunité chez les jeunes poulets, évitant la nécessité des coccidiostatiques chimiques. En fait, un tel prin-5 cipe a été testé dans la formulation Coccivac des Ster-win Laboratories, Opelika, Alabama, U.S.A.

1 0

1 5

20

25

Dans l'intention de produire un vaccin contre la coccidiose, Murray et al., Demande de brevet européen, Publication n° 167.443, ont préparé des extraits à partir de sporozoïtes ou d'ookystes sporulés d'Eimeria te-nella qui contiennent au moins 15 polypeptides dont beaucoup étaient associés à la surface du sporozoïte. L'injection de ces extraits aux poulets a réduit les lésions caecales après inoculation orale avec des ookystes sporulés d'E. tenella virulents. Plus récemment, Schenkel et al., Brevet U.S. n° 4.650.676 ont décrit la production d'anticorps monoclonaux anti-mérozoïtes d'E. tenella. En utilisant ces anticorps, Schenkel et al. ont identifié un certain nombre d'antigènes contre lesquels étaient dirigés les anticorps. En pré-incubant des sporozoïtes d'E. tenella avec ces anticorps, puis en introduisant les sporozoïtes traités dans le caecum de poulets, Schenkel et al. ont pu montrer une certaine réduction des indices des lésions caecales en comparaison des témoins non traités par les sporozoïtes.

Les progrès dans la technologie de recombinaison de l'ADN ont rendu possible une autre approche, à savoir 30 des vaccins de sous-unités. Dans l'application des procédés actuels de l'ADN recombinant, des séquences spécifiques d'ADN sont insérées dans un vecteurd'ADN approprié pour former des molécules d'ADN recombinant qui peuvent se répliquer dans des cellules hôtes. Des molé-cules d'ADN bicaténaire circulaire appelées plasmides

sont servent utilisées comme vecteurs et la préparation de ces formes d'ADN recombinant entraîne l'emploi d'endo-nucléases de restriction qui peuvent cliver l'ADN au niveau de sites spécifiques des séquences de bases. Une fois les coupures effectuées par une enzyme de restriction dans un plasmide et dans le segment d'ADN étranger qui doit être inséré, les deux molécules d'ADN peuvent être liées de façon covalente par une enzyme connue comme étant une ligase. Des méthodes générales pour la préparation de telles molécules d'ADN recombinant ont été décrites par Cohen et al. [Brevet U.S. n° 4.237.224], Collins et al. [Brevt U.S. n° 4.304.863] et Maniatis et al. [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory]. Etant donné qu'elles illustrent largement l'état actuel de la technique, ces références ont été incluses ici pour référence.

Une fois préparées, les molécules d'ADN recombinant ne peuvent être utilisées pour produire le produit spécifié par la séquence de gènes insérée que si un certain nombre de conditions sont remplies. En tout premier lieu, il y a l'exigence que la molécule recombinante soit compatible avec la cellule hôte et en conséquence capable de réplication autonome dans celle-ci. Dans de nombreux travaux récents, on a utilisé Escherichia coli comme organisme hôte parce qu'il est compatible avec une large gamme de plasmides recombinants. Suivant le système vecteur/cellule hôte utilisé, la molécule d'ADN recombinant est introduite dans l'hôte par transformation, transduc-tion ou transfaction.

La détection de la présence de plasmides recombinants dans les cellules hôtes peut être réalisée de façon pratique grâce à l'emploi d'activités de marqueurs plasmidiques tels que la résistance aux antibiotiques. Ainsi, un hôte

portant un plasmide codant pour la production d'une enzyme dégradant 1'ampici11ine pourrait être sélectionnée à partir de cellules non altérées en faisant croître l'hôte dans un milieu contenant de 1'ampici11ine. Un autre avantage peut être tiré des marqueurs de résistance aux antibiotiques là où un plasmide code pour une activité dégradant un deuxième antibiotique en un site où l'endo-nucléase de restriction choisie fait sa coupure et où est insérée la séquence de gènes étrangers. Les cellules hôtes contenant les plasmides recombinants proprement dits seront ensuite caractérisées par une résistance au premier antibiotique, mais par une sensibilité au deuxième.

La simple insertion d'un plasmide recombinant dans une cellule hôte et l'isolement de l'hôte modifié n'assurera pas en soi que des quantités significatives du produit de gènes souhaité seront produites. Pour que cela ait lieu, la séquence de gènes étrangers doit être fusionnée en une relation correcte avec une région signal dans le plasmide pour la transcription de l'ADN, appelée promoteur. Ou bien, l'ADN étranger peut porter son propre promoteur aussi longtemps qu'il est reconnu par l'hôte. Quelle que soit son origine, le promoteur est une séquence d'ADN qui dirige la liaison de l'ARN polymérase et par conséquent "active" la transcription de l'ADN en ARN messager (ARNm).

Ayant reçu une puissante activation qui peut fournir de grandes quantités d'ARNm, la production finale du produit de gènes voulu dépendra de l'efficacité de la traduction de l'ARNm en protéine. Ceci, à son tour, dépend de l'efficience de la liaison ribosomique à l'ARNm. Dans E. coli, le site de liaison ribosomique sur l'ARNm comprend un codon d'initiation (AUG) et une séquence de Shine-Dalgarno (SD) en amont. Cette séquence contenant 3-9 nucléo-tides et 3-11 nucléotides localisés à partir du codon AUG;

I

5

est conrçrlémentaire de l'extrémité 3' terminale de l'ARN ribosomique (ARNr) 16S d'E. coli [Shine and Dalgarno,

Nature 254:34 (1975)]. Apparemment, la liaison ribosomique à l'ARNm est facilitée par un appariement des bases 5 entre la séquence SD dans l'ARNm et la séquence à l'extrémité 3' terminale de l'ARNr 16S. Pour une revue sur la maximalisation de l'expression génétique, voir Roberts and Lauer, Methods in Enzymology, 6_8:473 ( 1 979).

10 Un autre système d'expression a été développé, basé

sur l'opéron lacZ en combinaison avec des vecteurs de phage lambda (Huynh et al., in DNA Cloning: Volume I, D.M. Glover, Ed.). Dans ce système, le gène de structure pour la bêta-galactosidase en même temps que le promoteur in-ductible contrôlant son expression ont été installés dans le phage vecteur. Un site de clonage unique à l'extrémité 3' terminale du gène pour la bêta-galactosidase aboutit à une fusion de gènes lors de l'insertion d'une copie d'ADNc d'un ARNm ou d'un fragment d'ADN génomique contenant ^^ une région codant pour une protéine.

L'expression du.gène de la bêta-galactosidase aboutit à la production d'une protéine de fusion contenant 114 kd de bêta-galactosidase et un polypeptide carboxy-terminal 25 codé par 1'insertd'ADNc, à condition que 1'insert contienne un cadre de lecture ouvert dans le même registre que le cadre de lecture pour la bêta-galactosidase. Un phage contenant un gène dont le produit est reconnu par un antisérum monoclonal ou polyclonal peut ainsi être 30 identifié par criblage immunologique de la banque après induction de l'expression de la protéine de fusion en utilisant le bêta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) pour inactiver le répresseur de lacZ. Ce système de vecteurs d'expression combine l'efficience du système des phages 35 dans 1'encapsidation de l'ADN et son introduction dans

les cellules d'E. coli avec une stabilité accrue des fusions du polypepti'de avec la bêta-galactosidase.

Dans l'approche des - sous-unités vaccinales, une sous unité du microorganisme infectieux entier est administrée à l'animal hôte dans un contexte immunologiquement convenable. La sous-unité pourrait être une protéine purifiée obtenue à partir du parasite, une protéine recombinante ou un fragment de protéine exprimé dans un système hétéro logue, un peptide synthétique comprenant un seul déterminant neutralisant ou une protéine introduite par un vecteur viral, tel qu'un virus vaccinal. Le système immunitaire de l'hôte élabore une réponse spécifique à la sous-unité sans jamais être exposé au parasite entier. Après provocation par une dose virulente du microorganisme infectieux, le système immunitaire de l'hôte élabore une défense satisfaisante, dirigée uniquement par la sous-unité vaccinale à laquelle il avait été exposé précédemment.

On peut trouver dans la littérature des données montrant la participation d'anticorps circulants, d'IgA s é c -rétoires dans l'épithélium intestinal [Davis et al., Immunology 3_4:879 ( 1978)] et du système immunitaire à médiation cellulaire [Giambroni et al., Poultry Science 5_9:38 ( 1980)] dans la résistance acquise à la coccidiose. Pour une revue, voir P.S. Davis in Avian Immunology, M.E. Rose, Ed., British Poultry Science, LTD., Edenberg, pp. 361-385 (1981). L'implication probable de diverses branches du système immunitaire signifie qu'une protection complète et durable peut nécessiter la faculté de simuler des aspects spécifiques du processus infectieux naturel. Ces aspects comprennent l'exposition locale au niveau du site où une protection est souhaitée, l'évocation d'une réponse inflammatoire pour rassembler les

7

10

20

25

30

cellules fabriquant l'antigène, la présentation d'un antigène de parasite approprié et éventuellement l'association avec des déterminants de MHC dans une configuration de membrane particulière.

Cette invention fournit des protéines purifiées ou des fragments de telles protéines ayant un ou plusieurs déterminants immunoréactifs et/ou antigéniques d'un antigène de surface d'Eimeria.

Plus spécialement, cette invention fournit des protéines ayant un ou plusieurs déterminants immunoréactifs et/ou antigéniques d'un antigène de surface d'Eimeria, cet antigène de surface ayant un poids moléculaire appa-rent de 28, 37, 120 ou de plus de 200 kilodaltons et se liant spécifiquement à un ou plusieurs anticorps mono-clonaux déposés à l'"American Type Culture Collection" (ATCC) et portant les numéros de dépôt HB 9707 à HB 9712. Des exemples desdites protéines sont des protéines ayant les séquences d'acides aminés représentées fig. 15, f i g.17, fig. 19 et fig. 21 et leurs équivalents fonctionnels. Lesdits équivalents fonctionnels sont des protéines ayant une séquence d'acides aminés dérivée' desdites séquences d'acides aminés mentionnées ci-dessus par additions, délé-tions, insertion et substitutions d'acides aminés a condition que/ces protéines conservent un ou plusieurs déterminants immunoréactifs et/ou antigéniques d'un antigène de surface d'Eimeria. Lesdites protéines peuvent être utilisées pour l'immunisation de la volaille contre la coccidiose.

Cette invention fournit en outre des anticorps dirigés contre les protéines mentionnées plus haut, en particulier des anticorps monoclonaux tels que les anti-35 corps monoclonaux portant les numéros de dépôt HB 9707,

HB 970S7 HB 9709, HB 9710, HB 9711 et HB 9712.

Cette invention fournit encore des séquences d'ADN codant pour les protéines mentionnées plus haut, des vecteurs recombinants comprenant de telles séquences d'ADN, en particulier des vecteurs recombinants qui sont capables de diriger l'expression desdites séquences d'ADN dans des organismes hôtes compatibles et des organismes hôtes transformés par de tels vecteurs recombinants, en particulier des organismes hôtes transformés qui sont capables d'exprimer les séquences d'ADN codant pour une protéine mentionnée plus haut comprise dans ledit vecteur recombinant.

Cette invention fournit encore un procédé pour la préparation d'une protéine ayant un ou plusieurs déterminants immunoréactifs et/ou antigéniques d'un antigène de surface d'Eimeria tenella, ce procédé comprenant:

(a) la culture d'un organisme hôte transformé par un vecteur recombinant comprenant une séquence d'ADN codant pour ladite protéine dans des conditions dans lesquelles la séquence d'ADN est exprimée; et

(b) l'isolement de la protéine ou d'un fragment à partir de la culture.

Cette invention fournit encore un procédé pour la préparation d'un or.ganisme hôte transformé mentionné plus haut, le procédé comprenant la transformation d'un organisme hôte par un vecteur recombinant comprenant une séquence d'ADN codant pour une protéine de la présente invention en utilisant des méthodes connues en soi.

Ceiute invention fournit encore des vaccins pour la protection de la volaille contre la coccidiose comprenant une ou plusieurs protéines de l'invention et un excipient ohysiologiquementment acceptable.

Cette invention fournit encore des vaccins pour la protection de la volaille dontre la coccidiose comprenant un vecteur viral contenant une séquence d'ADN ou un fragment de celle-ci codant pour une protéine de l'invention, ce vecteur viral étant capable d'exprimer la séquence d'ADN ou un fragment et un excipient physiologique-

f ment acceptable.

Cette invention fournit encore une méthode pour la protection de la volaille contre la coccidiose, méthode qui comprend l'administration d'une quantité efficace d'un vaccin de l'invention à une jeune volaille sensible à la coccidiose.

La présente invention peut être plus facilement comprise en se référant à la description suivante de l'invention et à l'Exemple en liaison avec les figures suivantes dans lesquelles:

La fig. 1 montre les résultats d'un test ELISA pour sporozoïtes d'E. tenella. Des dilution d'immunsérum de souris (MS 107-2: à) et de sérum de souris témoin (X)

4

ont été incubées avec 4x10 sporozoites purifies vivants. L'anticorps spécifique lié aux sporozoïtes a été détecté par un anticorps anti IgG de souris conjugué à la peroxydase et le substrat de la peroxydase o-phénylène diamine. La D0/no a été lue dans un lecteur de 492 nm R

de plaques Titertek Multiscan .

La fig. 2 montre les résultats d'un essai de transfert de Wester (Western blot) effectué avec des protéines

10

solubii-irsées de sporozoïtes d'E. tenella. Les protéines de sporozoïtes solubilisées ont été séparées par électro-phorèse sur gel de polyacrylamide-SDS réducteur dans des gels à 12,5 ?o, transférées sur des membranes de nitro-cellulose et mises en réaction avec chaque anticorps. Les protéines spécifiques reconnues par chaque anticorps ont été visualisées avec un anticorps anti IgG de souris conjugué à la peroxydase et le substrat de la peroxydase 4-chloro-1-naphtol. L'anticorps ayant réagi avec chaque bandelette est noté en haut de la bandelette.

La fig. 3 montre les résultats d'un test, de transfert Western (Western blot) effectué avec des protéines solubilisées de sporozoïtes et de mérozoïtes d'E. tenella et de sporozoïtes d'E. acervulina. Divers anticorps monoclonaux et sérums ont été incubés avec les protéines d'Eimeria liées à la nitrocellulose et visualisées comme expliqué dans la description de la figure 2. Les anticorps monoclonaux utilisés étaient 3A5 (1), 20C6 (2), 7D1 (3), 13A6 (4), 6A5 (5) et un anticorps témoin qui était non réactif à l'égard des protéines d'Eimeria. Les sérums utilisés étaient 1'immunsérum n° 107-2 de souris (7) et un sérum témoin (8).

La fig. 4 montre sur le panneau de gauche les résultats d'un test d'immunoprécipitation avec des protéines

12 5

de surface marquées au I de sporozoites d'E. tenella. Les protéines de surface des sporozoïtes ont été marquées par la méthode I0D0GEN ou I0D0BEADS, solubilisées et visualisées après électrophorèse en gel de polyacryla-mide-SDS dans des gels à 12,5% par autoradiographie. Le panneau de droite montre les résultats de 1'immunoprécipitation de protéines de surface de sporozoïtes marquées 125

au I par du sérum de souris immunisées par des sporozoïtes vivants. Des immunsérums de souris (105-1, 105-2,

11

105-3, 107-1, 107-2 et 107-3) et un sérum de souris témoin (Témoin) ont été incubés avec des protéines de sur-

12 5

face de sporozoites marquées au I, et les complexes immuns ont été capturés par un anticorps anti-souris 5 coup Lé à l'agarose. Les complexes immuns ont été solubilisés par un tampon échantillon de Laemmli, séparés par électrophorèse en gel SDS dans des gels à 12,5% et visualisés par autoradiographie. M représente les poids moléculaires de protéines marqueurs standards en kilodaltons.

10

La fig. 5 montre les résultats de 1'immunoprécipi-

tation de protéines de surface de sporozoïtes marquées 12 5

au I par des anticorps monoclonaux. La façon de pro-

12 5

céder pour identifier les I-protéines liées par chaque 15 anticorps est expliquée dans la description de la figure 4. Les anticorps monoclonaux spécifiques des sporozoites utilisés et l'anticorps témoin (Témoin) sont indiqués en haut de chaque bande de gel. Les poids moléculaires des protéines marqueurs standards sont indiqués en kilo-20 daltons".

La fig. 6 montre des microcraphies en contraste de phase et des micrographies de profils de coloration par immunofluorescence utilisant divers anticorps monoclonaux de préparations sur lames de sporozoïtes d'E. tenella séchés à l'air. Les côtés gauches des panneaux A, B, C et D sont des micrographies en contraste de phase montrant des sporozoïtes allongés intacts avec un grand corps refractile postérieur (PRB), un petit corps refrac-tile antérieur (ARB) et l'extrémité apicale (A) opposée au corps refractile postérieur. Les côtés droits des panneaux A, B, C et D montrent des lames qui ont été traitées avec les anticorps monoclonaux 14C3 (spécifique pour les antigènes de surface), 6A5 (spécifique pour la protéine de 'surface et des corps refractiles),

25

30

35

1 2

11D2 (spécifique pour l'extrémité apicale du sporozoïte) et l'anticorps témoin, respectivement. Les anticorps liés aux préparations ont été localisés par des anticorps anti-souris conjugués à la rhodamine, visualisés par épi-fluorescence en utilisant un microscope Leitz Dialux^. Toutes les micrographies sont 630X.

La fig. 7 montre la coloration d'anticorps de sporozoïtes intracellulaires et le parasite en voie de développement dans les cellules rénales de poulet. Les cellules rénales de poulet ont été infectées par des sporozoïtes et aux délais indiqués après l'infection, les cellules ont été traitées pour la coloration des anticorps. Les cultures ont été lavées avant fixation pour éliminer tous les sporozoïtes extracellulaires. Les micrographies en contraste de phase et les micrographies par immunofluo-rescence correspondantes ont été réalisées en utilisant les anticorps 7D4, 8A2, 7B2 et 15A3 comme indiqué. Les anticorps liés aux préparations ont été localisés par des anticorps a'nti-souris conjugués à la rhodamine , visualisés par épi fluorescence. Toutes les micrographies sont 630X.

La fig. 9 montre la neutralisation du développement des sporozoïtes intracellulaires par des anticorps anti-sporozoïtes. Des sporozoïtes d'E. tenella purifiés ont été préincubés pendant 1 heure à 40°C avec l'anticorps témoin (X) ou avec les anticorps anti-sporozoïtes 7D4 (□), 8A2 (O) , 14B1 (#) ou 6A5 (Ci), puis on les a laissés infecter des cultures de cellules MDBK. Des sporozoïtes ont été incubés également avec des milieux (A) ou avec l'agent anti-coccidien,lasalocide (*x.

Après infection, le développement du sporozoïte intracellulaire a été mesuré par l'incorporation de

1 3

"^H-uracile dans les cultures cellulaires. Etant donné que le lasalocide empêche le développement intracellulaire du sporozoïtie, les cultures prétraitées avec cet agent ont montré une incorporation minimale de ^H-uracile.

La fig. 10 montre les résultats de l'analyse par électrophorèse en gel de polyacrylamide-SDS/transfert de Western(Western blot) d'échantillons de protéines de fusion 65K-bêta-galactosidase ou d'autres échantillons comme indiqué. L'analyse par transfert de Western (Western blot) a été effectuée en utilisant un anticorps anti-bêta-galctosidase murine (panneau A) ou les anticorps 7D1 , 7D4 et 20C6 rassemblés (panneau B) en liaison avec le conjugué HPOD anti-souris de chèvre. Les bandes dans les deux panneaux représentent (1) bêta galactosidase (m) marqueurs de poids moléculaire précolorés,

dont les tailles sont indiquées à gauche de la plaque A en kd, (2) protéines totales du culot cellulaire, (3) protéine libérée du culot par action des ultrasons et (4) protéine solubilisée par la guanidine-HC1 à partir du culot après traitement aux ultrasons.

La fig. 11 est une représentation schématique d'un plasmide pEV/2-4, un plasmide d'expression d'une protéine de 65 kd contenant un insert d'ADN EcoRI de 1,7 kb du phage \m2-4.Les positions des divers sites des enzymes de restriction dans l'insert sont indiquées par rapport au site EcoRI, y compris PstI (P à bp 53 et 776), Kpnl (K à bp 202), BstNI (B, à bp 584, 1303 et 1412) et Sau3A (S, à bp 1017 et 1439) .

La fig. 12 est une carte de pEV3-SEQ, contenant un polylinker avec les sites indiqués insérés entre les sites EcoRI et Sali de pEV-vrf3. L'oligonucléotide synthétique CGGTCGACTCGAGCCA, indiqué par la flèche en pointillés,

14

a été utilisé comme amorce pour l'analyse de la séquence d'ADN de terminaison de chaîne.

La fig. 13 est une carte de restriction de clones 5 d'ADNc codant pour les protéines reconnues par l'anticorps monoclonal 6A5. Les sites de 1'endonucléase de restriction utilisés pour l'analyse des séquence d'ADN de Maxam-Gilbert de 1'ADNc de 1,1 kb sont montrés. Le site EcoRI entre parentèses est à l'extrémité de l'ADNc 10 de 0,9 kb.Le trait au-dessus de la carte montre le cadre de lecture ouvert prévu à partir de la séquence d'ADN,

avec le peptide signal potentiel rempli. Les lignes sous la carte indiquent les délétions exolll utilisées pour l'analyse des séquence de terminaison des chaînes.

1 5

La fig. 14 est la séquence nue 1éotidique de la molécule d'ADN de 1,1 kb codant pour la protéine de 20 kd reconnue par l'anticorps monoclonal 6A5.

20 La' fig. 15 et la séquence d'acides aminés de la pro téine de la fig. 14, prévue à partir de la séquence nucléotidique de cette figure.

La fig. 16 est la séquence nucléotidique de la mo-25 lécule d'ADNc de 1,7 kb codant pour la protéine de 65 kd reconnue par les anticorps monoclonaux 7D1, 7D4 et 20C6.

La fig. 17 est la séquence d'acides aminés de la protéine de la fig. 16, prévue à partir de la séquence 30 nucléotidique de cette figure et confirmée par analyse séquentielle des peptides trypsiques produits à partir de la protéine de 65 kd. Les régions dans la séquence totale d'acides aminés correspondant à certains de ces peptides sont soulignées. Les séquences déterminées de 35 ces peptides sont surlignées.

I

15

La fig. 18 est la séquence nucléotidique de la molécule d'ADNc de 1,1 kb codant pour la protéine de 28 kd reconnue par l'anticorps monoclonal 8A2.

La fig. 19 est la séquence d' acides aminés de la pro téine de la fig. 18, prévue à partir de la séquence nucléotidique de cette figure.

La fig. 20 est la séquence nucléotidique de la molécule d'ADNc de 3,2 k codant pour la protéine reconnue par l'anticorps monoclonal 7B2.

\

La fig. 21 est la séquence d' acides aminés de la pro téine de la fig. 20, prévue à partir de la séquence nucléotidique de cette figure.

La fig. 22 est une analyse par électrophorèse en gel de polyacrylamide-SDS de la protéine de 65 kd purifiée par immuno-affinité. Le gel a été visualisé par le colorant bleu de Coomassie et par analyse de transfert de Western (Western blot). Les bandes 2 et 4 et 3 et 5 contiennent la protéine purifiée de deux préparations. Les bandes 1 et 6 contiennent des mélanges de protéines marqueurs de poids moléculaire ayant les poids moléculaires indiqués à gauche et à droite de la figure.

!

La fig. 23 est un profil d'élution HPLC d'un produit de digestion de la protéine de 65 kd réduit par le bêta-mercapto-éthanol (panneau A) et non réduit (panneau B), montrant 1'absorbance à 215 my en fonction du temps de rétention sur la colonne.

La fig. 24 montre des cartes de restriction de quatre éléments du vecteur basique utilisé pour la recombinaison des gènes codant pour les antigènes coccidiens

16

dans le virus vaccinal. Ces éléments comprennent l'élément promoteur 7j5K (a et b, à gauche), le locus TK (a et b, à droite), une partie du plasmide pUC8 (c) et le site de polyclonage de M13tgl31 (d). La direction de la transcription des promoteurs viraux 7,5K et TK est de gauche à droite (c'est-à-dire du site de restriction BglII au site de restriction EcoRI du polylinker.

!

La fig. 25 montre la séquence d '• acides aminés de l'extrémité N-terminale de l'antigène d'Eimeria reconnu par l'anticorps monoclonal 8A2 (A) exprimé à partir d'une construction 'contenant le codon d'initiation de traduction AUG dans l'élément polylinker du vecteur de la fig. 24 et (B) fusionné au segement de tête (premier de 34 aci'des aminés) paludéen de 190 kd et le polylinker du vecteur clonant de la fig. 24 (13 acides aminés suivants). Pendant le processus de maturation de la protéine, les 19 premiers acides aminés à l'extrémité N-termi-nale peuvent être clivés à la position indiquée par un codon.

Sur les figures, les abréviations d'une unique lettre standard sont utilisées pour représenter les nucléotides et les abréviation d'une ou trois lettres standard sont utilisées pour représenter les Les significations de ces abréviations peuvent être trouvées dans les manuels de biochimie standard, tels que Lehninger, Principles of Biochemistry, 1984, Worth Publishers, Inc., New York, pp. 96, 798.

Telles qu'elles.sont utilisées ici, les expressions suivantes auront les significations suivantes:

"Protéine de 20 kd" signifie une protéine recombinante ou synthétique ayant un poids moléculaire apparent d'environ

17

20 kilodaltons dans 1'électrophorèse en gel de polyacrylamide-SDS, qui se lie spécifiquement à l'anticorps monoclonal 6A5. Cet anticorps réagit également spécifiquement avec un antigène de surface d'Eimeria (d'un extrait total de protéines d'Eimeria) ayant un poids moléculaire apparent d'environ 28 kilodaltons dans les gels SDS. Cet antigène est présent au stade de développement du sporozoïte. La séquence nucléotidique d'une molécule d'ADNc codant pour cette protéine et la séquence d'acides aminés prévue à partir de cette dernière sont montrées respectivement sur les fig. 14 et 15.

"Protéine de 65 kd" signifie une protéine recombinante ou synthétique ayant un poids moléculaire apparent de 65 kilodaltons dans l'électrophorèse en gel de polyacrylamide-SDS, qui se lie spécifiquement aux anticorps monoclonaux 7D1, 7D4 et 20C6. Ces anticorps réagissent également spécifiquement avec un antigène de surface d'extraits d'Eimeria ayant un poids moléculaire apparent d'environ 120 kilodaltons dans les gels SDS. Cet antigène est présent aux stades de développement du sporozoïte, du schizonte et du mérozoïte. La séquence nucléotidique d'une molécule d'ADNc codant pour cette protéine et la séquence d' acides aminés prévue à partir de cette dernière sont montrées respectivement sur les fig. 16 et 17.

"Protéine de 28 kd" signifie une protéine recombinante ou synthétique ayant un poids moléculaire apparent d'environ 28 kd dans l'électrophorèse en gel de polyacrylamide-SDS, qui se lie spécifiquement à l'anticorps monoclonal 8A2. Cet anticorps réagit également spécifiquement avec un antigène de surface d'Eimeria ayant un poids moléculaire apparent d'environ 37 kilodaltons dans les gels SDS. Cet antigène est présent aux stades de développement du sporozoïte, du schizonte et du mérozoïte. La

18

séquence nucléotidique d'une molécule d'ADNc codant pour cette protéine et la séquence d'acides aminés prévue à pâtir de cette dernière sont montrées respectivement sur les fig. 18 et 19.

"Protéine de 45 kd" signifie une protéine recombinante ou synthétique ayant un poids moléculaire apparent d'environ 45 kilodaltons dans l'électrophorèse en gel de polyacrylamide-SDS, qui se lie spécifiquement à l'anticorps monoclonal 7B2. L'anticorps réagit également spécifiquement avec un antigène de surface d'Eimeria ayant un poids moléculaire apparent supérieur à 200 kilodaltons dans les gels SDS. Cet antigène est présent au stade de développement du sporozoïte. La séquence nucléotidique d'une molécule d'ADNc codant pour cette protéine et la séquence d' acides aminés prévue à partir de cette dernière sont montrées respectivement sur les fig. 20 et 21 .

L'expression "protéine ayant un ou plusieurs déterminants immunoréactifs et/ou antigéniques d'un antigène de surface d'Eimeria" signifie une protéine ayant une ou plusieurs régions ou épitopes qui sont capables d'évoquer une réponse immunitaire dans un organisme hôte immunologiquement compétent et/ou sont capables de se lier spécifiquement à un anticorps complémentaire.

A cause de la dégénérescence du code génétique, il sera entendu qu'il y a de nombreuses séquences nucléoti-diques potentielles (équivalents fonctionnels) qui pourraient coder pour les séquences d' acides aminés montrées sur les fig. 15, 17, 19 et 21. Il doit être entendu également que les séquences nucléotidiques des séquences d'ADN et des fragments de l'invention insérés dans les vecteurs peuvent inclure des nucléotides qui ne font pas

19

partie des gènes de structure réels, tant que les vecteurs recombinants contenant ces séquences et fragments sont capables de diriger la production dans un organisme hôte approprié d'une protéine ou d'un fragment ayant un ou plusieurs déterminants immunoréactifs et/ou antigéniques d'un antigène de surface d'Eimeria.

De plus, on savait qu'il se produit des substitutions d'acides aminés dans les protéines qui ne modifient pas essentiellement les activités biologiques et immuno-logiques et elles ont été décrites, par exemple, par Neurath et al. in "The Proteins", Academic Press, New York (1979), en particulier sur la fig. 6, page 14. Les substitutions d'acides aminés le plus fréquemment observées sont: Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly,

et vice versa.

Ces variations de séquences nucléotidiques fonction-nellement équivalentes et substitutions d'acide aminés des réalisations de cette invention prises comme exemples entrent dans le cadre de l'invention tant que les protéines résultantes conservent un ou plusieurs déterminants immunoréactifs et/ou antigéniques d'un antigène de surface d'Eimeria.

Le terme "fragment" signifie une séquence d'ADN ou une protéine comprenant une sous-séquence d'un des ADNc 30 ou des protéines de l'invention. Ces fragments peuvent être produits par clivage enzymatique des plus grandes molécules, en utilisant des endonucléases de restriction pour l'ADN et des protéases pour les protéines. Les fragments de l'invention ne se limitent cependant pas 35 aux produits d'une forme quelconque de clivage enzymatique,

(

10

1 5

20

25

20

mais i Ts" comprennent des sous-séquences dont les extrémités terminales ne correspondent à aucun des points de clivage enzymatique. Ces fragments peuvent être faits, par exemple, par synthèse chimique . en utilisant les données de séquences fournies ici. Des fragments d'ADN peuvent être produits par synthèse d'ADN complémentaire (ADNc) incomplet à partir d'ARN messager (ARNm). Des fragments de protéine peuvent également être produits par expression de fragments d'ADN codant pour les fragments de protéine. Ces fragments de protéine peuvent être utiles dans/cette invention s'ils contiennent un nombre suffisant de résidus d'acides aminés pour constituer un déterminant immunoréactif et/ou antigénique. En général, au moins 7 ou 8 résidus sont nécessaires. Comme cela est expliqué plus loin, il peut être nécessaire de coupler ces fragments à une moléculte de porteur immunogène pour les rendre immunoréactifs.

Les protéines de cette invention peuvent être réalisées par des méthodes connues dans la profession, notamment par la méthode de recombinaison de l'ADN, par synthèse chimique ou par isolement à partir de préparations d'Eimeria.

Les ADN nécessaires pour produire les protéines de cette invention pourraient être synthétisés chimiquement, en utilisant l'information sur les séquences nucléotidiques fournie sur les fig. 14, 16, 18 et 20. Cette synthèse chimique pourrait être réalisée en utilisant l'une quelconque des méthodes connues, bien que la méthode du support solide en phosphoramidite de Mateucci et al. [J. Am. Chem. Soc. 103: 3185 (1981)] soit préférée.

Ou encore, l'ADNc peut être obtenu à partir d'ARNm d'Eimeria. L'ARN messager peut être isolé à partir

21

d'ookystes sporulants ou de mérozoïtes d'Eimeria en utilisant des techniques standard. Ces échantillons d'ARNm peuvent être utilisés ensuite pour produire un ADNc bicaténaire comme décrit par Maniatis et al., v.plus haut. Cet ADNc peut être inséré ensuite dans un vecteur de clonage approprié qui peut être utilisé pour transformer E. coli, pour créer une banque d'ADNc.

La banque d'ADNc peut ensuite être criblée en utilisant les gènes clonés de cette invention ou leurs fragments, comme sondes. Ces gènes ou fragments peuvent être radiomarqués, par exemple par déplacement de coupure en utilisant la Pol I DNA polymérase en présence de quatre

32

désoxyribonucléotides, dont l'un contient P en position a (Maniatis et al. v.plus haut, p. 109), pour être utilisés comme sondes.

Bien qu Eimeria tenella ait été utilisé comme source d'ARNm dans les exemples ci-dessous, les gènes clonés à partir de cette espèce peuvent être utilisés comme sondes pour isoler des gènes d'autres espèces d'Eimeria, compte tenu de l'homologie des séquences d'ADN parmi les différentes espèces.

Une fois identifiés et isolés, les gènes d'Eimeria de cette invention sont insérés dans un vecteur d'expression approprié qui contient les éléments nécessaires à la transcription et à la traduction des séquences de gènes insérées. Des vecteurs de clonage utiles peuvent consister en segments de séquences d'ADN chromosomiques, non chromosomiques et synthétiques, tels que divers plasmides bactériens connus, ADN phagiques, combinaisons de plasmides et d'ADN phagiques,tels que plasmides qui ont été modifiés pour utiliser des séquences d'ADN phagiques ou d'autres séquences de contrôle d'expression, ou plasmides

22

de levure. Les vecteurs de clonage spécifiques qui pourraient être utilisés et qui sont connus du spécialiste, comprennent, mais sans s'y limiter, les plasmides pEV-vrf (pEV-vrfl. -2 et -3); SV 40 adénovirus; levure; lambda-gt-WES-lambda B; Charon 4A et 28; lambda-gt-11-lambda B ; vecteurs dérivés de M13 tels que pl)C8, 9, 18 et 19, pBR31 3, 322 et 325; pAC105 ; pVA51; pACY 17 7 ; pKH47; pACYCI84 ; pUB110 ; pMB9; colEl; pSC101 ; pm121 ; RSF2124; pCR1 ou RP4.

L'insertion des gènes d'Eimeria dans un vecteur de clonage est facilement réalisée lorsque les gènes et le vecteur de clonage souhaité ont tous deux été coupés par le même ou les mêmes enzymes de restriction, étant donné qu'ainsi sont créées des extrémités terminales d'ADN complémentaires. Si cela ne peut pas être effectué, il peut être nécessaire de modifier les extrémités coupées qui sont produites en digérant un ADN simple brin pour produire des bouts francs ou en parvenant au même résultat en remplissant les extrémités terminales simple brin avec une DNA polymérase appropriée. De cette façon, la ligation des bouts francs par une enzyme telle que la T4 DNA ligase peut être effectuée. Ou bien, tout site souhaité peut être produit par ligation de séquences nucléotidiques (linkers) aux extrémités de l'ADN. Ces linkers peuvent comprendre des séquences d'oligonuc1éo-tides spécifiques qui codent pour les séquences de reconnaissance des sites de restriction. Le vecteur clivé et les gènes d'Eimeria peuvent également être modifiés par addition de queues (extension homopolymérique) comme décrit par Morrow [Methods in Enzymology 6_8 : 3 ( 1 979,|J.

De nombreux vecteurs de clonage qui peuvent être utilisés dans cette invention contiennent une ou plusieurs activités de marqueurs pouvant être utilisées pour

23

sélectîTTnner les transformants souhaités, tels que résistance à 1 ' ampicilline et à la tétracycline dans pBR322 , résistance à 1'ampicilline et activité bêta-galactosidase dans pUC8 et résistance à 1'ampici11ine dans pEV-vrf2. La sélection des cellules hôtes dans lesquelles ces vecteurs ont été insérés est grandement simplifiée lorsque les cellules hôtes sont dépourvues autrement des activités qu'apportent les vecteurs.

Il faut savoir que les séquences nucléotidiques des gènes d'Eimeria insérées en un site choisi dans un vecteur de clonage peuvent inclure des nucléotides qui ne font pas partie des gènes.de structure réels. Ou bien, le gène peut ne contenir qu'une partie du gène de type sauvage complet. La seule chose nécessaire est que les fragments de gène insérés dans le vecteur de clonage soient capables de diriger la production dans un organisme hôte approprié d'un polypeptide ou d'une protéine ayant au moins un déterminant immunoréactif et/ou anti-génique d'un antigène de surface d'Eimeria.

La sélection d'un organisme hôte approprié est influencée par un certain nombre de facteurs connus dans la profession. Ces facteurs comprennent, par exemple, la compatibilité avec le vecteur choisi, la toxicité des protéines codées par le plasmide hybride, la facilité de récupération de la protéine souhaitée, les caractéristiques d'expression, la bio-innocuité et les coûts. Un équilibre de ces facteurs doit être frappant et il faut savoir que tous les hôtes ne seront pas également efficaces pour l'expression d'une molécule d'ADN recombinant particulière.

Les organismes hôtes unicellulaires appropriés pouvant être utilisés dans l'invention comprennent, sans

24

s'y limTter, des cellules de végétaux, de mammifère ou de levure et des bactéries telles que Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus et Actyno-myces. Escherichia c'oli souche MC1061, qui a été décrite par Casabadan et al. [J.Mol.Biol. 13 8:179 (1980)], est particulièrement préférée. Cette souche peut être utilisée ou toute autre souche d'E. coli K-12 contenant le plasmide pRK248cIts. Le plasmide pRK248cIts pour utilisation dans d'autres souches d'E. coli K-12 peut être obtenu à l'American Type Culture Collection et son n° de dépôt est ATCC 33766. L souche MC1061 d'E. coli a également été déposée et son numéro est ATCC 53338.

Le transfert du vecteur de clonage recombinant dans la cellule hôte peut être effectué de diverses façons. Suivant le système particulier vecteur/cellule hôte choisi, ce transfert peut être effectué par transformation, trans-duction ou transfection. Une fois produite une telle cellule hôte modifiée, la cellule peut être cultivée et le produit d'expression de la protéine peut être isolé à partir de la culture.

Les clones produisant les protéines d'Eimeria de l'invention peuvent être identifiés en utilisant des anticorps convenablement marqués spécifiques pour les protéines. Les anticorps monoclonaux, qui sont préférés, peuvent être préparés en utilisant des méthodes standard comme suit.

Des protéines antigéniques d'Eimeria tenella sont utilisées pour immuniser des animaux tels que souris,

rats, chevaux, moutons, porcs, lapins, etc., pour obtenir des cellules somatiques élaborant des anticorps pour la fusion aux cellules de myélome.

25

Le-a- cellules somatiques ayant le pouvoir de produire des anticorps, en particulier les cellules B, conviennent pour la fusion avec une lignée de cellules de myélome. Ces cellules somatiques peuvent être obtenues à partir de ganglions lymphatiques, de la rate et du sang périphérique d'animaux sensibilisés. Dans la réalisation préférée de cette invention, des cellules de rate de souris sont utilisées, en partie parce que ces cellules produisent un pourcentage relativement élevé de fusions stables avec des lignées de myélome murin. Il serait possible, cependant, d'utiliser aussi des cellules de -rat, de lapin, de grenouille ou autres.

Des lignées de cellules de myélome spécialisées ont été développées à partir de tumeurs lymphocytaires pour être utilisées dans des procédés de fusion produisant des hybridomes [Kohler and Milstein, Eur . J . Immunol. 6^:511 (1976)]; Shulman et al., Nature 2^6:269 (1978); Volk et al., J.Virol. 4_2:220 ( 1982)]. Ces lignées cellulaires ont été développées pour au moins trois raisons. La première est de faciliter la sélection d'hybridomes fusionnés parmi les cellules de myélome non fusionnées et s'auto-reproduisant indéfiniment par analogie. Habituellement, cela se fait en utilisant des myélomes avec des déficits enzymatiques qui les rendent incapables de se développer dans certains milieux sélectifs qui entretiennent la croissance d'hybridomes. La seconde raison provient de la faculté inhérente des cellules tumorales lymphocytaires de produire leurs propres anticorps. L'objectif d'utiliser des techniques monoclonales est d'obtenir des lignées de cellules hybrides fusionnées de durées de vie illimitées qui produisent l'unique anticorps souhaité sous contrôle génétique du composant cellules somatiques de l'hybridome. Pour éliminer la production d'anticorps anti-cellules tumorales par les

26

hybridômes, des lignées de cellules de myélome incapables de produire des .chaînes d1immunog1obu1inés légères ou lourdes ou déficitaires en mécanismes de sécrétion i ■

d'anticorps sont utilisées. Une troisième raison pour le choix de ces lignées cellulaires réside dans leur valeur et leur efficacité pour la fusion.

De nombreuses lignées de cellules de myélome peuvent être utilisées pour la production d'hybrides de cellules fusionnées, y compris, par exemple, P3/X63-Ag 8, P3/NSI/ 1-Ag 4-1, SP2/0-Ag-14 et 5194/5.XXO . BU.1. Les lignées cellulaires P3/X63-Ag 8 et P3/NSI/1-Ag 4-1 ont été décrites par Kohler et Milstein [ Eur . J . Immunol. 6_:511, ( 1 976)]. Shulman et al. [Nature 276:269 (1978)] ont développé la lignée de myélome Sp2/0-Ag14. La lignée S194/5.XXO . BU . 1 a été décrite par Trowbridge [J.Exp.Med. 148:313 (1979)]. Dans l'exemple de la présente invention, la lignée des cellules murines PAI-0 (un sous-clone de P3/X63-Ag 8 ne produisant pas d'Ig) a été utilisée.

Les méthodes pour générer des hybrides de cellules de rate ou de ganglions lymphatiques produisant des anticorps et de cellules de myélome comprennent habituellement le mélange de cellules somatiques avec des cellules de myélome dans une proportion 10:1 (bien que la proportion puisse varier entre environ 20:1 et 1:1), respectivement, en présence d'un agent ou d'agents (chimiques, viraux ou électriques) qui favorisent la fusion des membranes cellulaires. Il est préféré que la même espèce animale serve comme source des cellules somatiques et de myélome utilisées dans le processus de fusion. Les méthodes de fusion ont été décrites par Kohler and Milstein [Nature J25j6 : 495 (1975) et Eur . J . Immunol. 6:51 1 ( 1 976)], par Gefter et al. [Somatic Cell Genet. _3:231 ( 1 977)] et par Volk et al. [J.Virol. 42:220 (1982)]. Les agents favorisant

27

la fusion utilisés par ces chercheurs étaient le virus Sendai et le polyéthylène glycol (PEG). Le processus de fusion pour l'exemple de la présente invention utilise le PEG.

5

Du fait que les processus de fusion ne produisent des hybrides viables qu'à une très faible fréquence (par exemple, lorsque des rates sont utilisées comme source de cellules somatiques, un seul hybride est obtenu 10 à peu près pour 1 x 10^ cellules spléniques), il est essentiel d'avoir un moyen pour sélectionner les hybrides de cellules fusionnées parmi les cellules restantes non fusionnées, en particulier les cellules de myélome non fusionnées. Un moyen de détecter les hybridômes

1 S

souhaités produisant des anticorps parmi d'autres hybrides de cellules fusionnées est donc nécessaire.

Généralement, la sélection d'hybrides de cellules fusionnées est réalisée en cultivant les cellules dans 20 des milieux qui favorisent la croissance des hybridômes, mais empêchent la croissance des cellules de myélome qui, normalement, continueraient à se diviser indéfiniment. (Les cellules somatiques utilisées dans la fusion ne conservent pas de viabilité à long-terme en culture in 25 vitro et en conséquence ne posent pas de problème). Dans l'exemple de la présente invention, les cellules de myélome dépourvues d'hypoxanthine phosphoribosy1 trans-

t férase (HPRT-négatives) ont été utilisées. La sélection par rapport à ces cellules est efffectuée dans un milieu 30 d'hypoxanthine/aminopterine/thymidine (HAT), un milieu dans lequel les hybrides de cellules fusionnées survivent par suite du génotype HAT-positif des cellules spléniques. L'utilisation de cellules de myélome avec des déficits génétiques différents (sensibilités médicamenteuses, etc.)

3 5

qui peuvent être sélectionnées dans des milieux favorisant

28

la croissance d'hybrides génotypiquement compétents est également possible.

Plusieurs semaines sont nécessaires pour cultiver sélectivement les hybrides de cellules fusionnées. Au début de cette période, il est nécessaire d'identifier les hybrides qui produisent l'anticorps voulu de sorte qu'ils puissent par la suite être clonés et multipliés. Généralement, environ 10% d'hybrides obtenus produisent l'anticorps voulu, bien qu'une marge entre 1 et 30°â ne soit pas rare. La détection d'hybrides produisant des anticorps peut être réalisée par l'une quelconque de plusieurs méthodes d'analyse standard, y compris les techniques ELISA (enzyme-linked immunoassay) et du dosage radioimmunologique qui ont été décrites dans la littérature [voir par exemple, Kennet et al. (editors), Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A New Dimension in Bio-logical Analyses, pp. 376-384, Plénum Press, New York (1980)]. Plusieurs méthodes de détection ont été utilisées dans l'exemple de la présente invention.

Lorsque les hybrides voulus de cellules fusionnées ont été sélectionnés et clonés en lignées cellulaires séparées produisant des anticorps, chaque lignée cellulaire peut être multipliée par l'une des deux voies standard. Une suspension de cellules d'hybridome peut être injectée à un animal h'istocompatible. L'animal injecté développera ensuite des tumeurs qui sécrètent l'anticorps monoclonal spécifique produit par l'hybride de cellules fusionnées. Les liquides de l'organisme de l'animal, tels que sérum ou liquide ascitique, peuvent être ponctionnés pour fournir des anticorps monoclonaux en concentration élevée. Ou bien, les différentes lignées cellulaires peuvent être/fnultipliées in vitro dans des récipients de culture de laboratoire. Le milieu de culture contenant

29

des concentrations élevées d'un seul anticorps monoclonal spécifique peut être récolté par décantation, filtra-tion ou centrifugation.

t Telles qu'elle sont produites dans E. coli, les protéines d'Eimeria restent dans le cytoplasme ou dans les corps d'inclusion. Pour libérer les protéines, il est dojnc nécessaire de désintégrer la membrane extérieure. Cela se fait de préférence par action des ultrasons ou par d'autres moyens mécaniques de désintégration, p. ex. chambre de pression de French ou un homogénéiseur de Gaulin.

La désintégration des cellules pourrait également être réalisée par des moyens chimiques ou enzymatiques. Etant donné que des cations bivalents sont souvent nécessaires pour l'intégrité de la membrane cellulaire, un traitement par des agents de chélation appropriés tels que EDTA ou EGTA pourrait s'avérer suffisamment puissant pour faciliter la fuite des protéines hors des cellules. De même, des enzymes telles que le lysozyme ont été utilisées pour parvenir au même résultat. Cette enzyme hydrolyse le squelette du peptidoglycane de la paroi cellulaire.

L'application du choc osmotique pourrait également être utilisée. En résumé, cela pourrait être réalisé en plaçant d'abord les cellules dans une solution hypertoni-que qui amènerait les cellules à perdre de l'eau et à se rétracter. Le fait de les placer, ensuite dans une solution de "choc" hypotonique entraînerait un rapide influx d'eau dans les cellules avec expulsion des protéines souhaitées.

Une fois libérées des cellules, les protéines d'Eimeria peuvent être concentrées par précipitation par des sels tels que sulfate de sodium ou d'ammonium,

!

30

ultrafiltration ou d'autres méthodes bien connues des spécialistes. Une purification plus poussée pourrait être réalisée par des techniques classiques de purification des protéines, y compris, mais sans que ce soit 1 i m i -5 tatif, la filtration sur gel, la chromatographie par

échange ionique, l'électrophorèse préparative en gel sur disque ou en rideau, la focalisation isoélectrique, le fractionnement par des solvants organiques à basse température ou la distribution à contre-courant. Mais la puri-10 fication est effectuée de préférence par chromatographie par immuno-affinité comme décrit plus bas.

Les protéines de cette invention ou leurs fragments peuvent également être synthétisées chimiquement par une 15 méthode appropriée telle que méthodes de synthèse en phase solide exclusive, en phase solide partielle, condensation des fragments ou synthèse en solution classique. La synthèse en phase solide comme elle est décrite par Merrifield [ J . Am . Chem . Soc . j35_:21 49 ( 1 963)] est préférée.

2 0

Cette synthèse est réalisée avec des acides aminés qui sont protégés à l'extrémité terminale alpha-amino. Des acides aminés trifonctionne1 s avec des chaînes latérales labiles sont également protégés par des groupe-25 ments appropriés qui empêcheront une réaction chimique d'avoir lieu en ce site pendnt l'assemblage du peptide. Le groupement protecteur d'alpha-amino est éliminé sélectivement pour permettre à la réaction suivante de se produire à l'extrémité N-terminale. Les conditions d'élimi-nation du groupement protecteur d'alpha-amino ne provoquent pas de déprotection des groupements protecteurs des chaînes latérales.

Les groupements protégeant alpha-amino sont ceux 35 dont on sait qu'ils sont utiles dans le type de synthèse

C

31

des p e p-fcri des par étapes. Sont compris les groupements protecteurs du type acyle (p.ex. formyle, trifluoro-acétyle, acétyle), les groupements protecteurs du type uréthane aromatique (p.ex. benzyloxycarbonyle (Cbz) et benzyloxycarbonyle substitué), les groupements protecteurs du type uréthane aliphatique (p.ex. t-butyloxycar-bonyle (Boc), isopropyloxycarbonyle , cyclohexyloxycar-bonyle) et les groupements protecteurs du type alkyle (p.ex. benzyle, triphénylméthyle ) . Le groupement protecteur préféré est Boc. Les groupements protégeant les chaînes latérales pour Tyr comprennent le tétrahydro-pyranyle, le ter.-butyle,le trityle,le benzyle, le Cbz, le 4-Br-Cbz et le 2,6-dichlorobenzyle. Le groupement protecteur des chaînes latérales préféré pour Tyr est le 2,6-dichlorobenzyle. Les groupements protecteurs des chaînes latérales pour Asp comprennent le benzyle, le 2,6-dichlorobenzyle, le méthyle, l'éthyle et le cyclo-hexyle. Le groupement protecteur des chaînes latérales préféré pour Asp est le cyclohexyle. Les groupements protecteurs des chaînes latérales pour Thr et Ser comprennent l'acétyle, le benzoyle, le trityle, le tétrahydro-pyranyle, le benzyle, le 2,6-dichlorobenzyle et le Cbz. Le groupement protecteur préféré pour Thr et Ser est le benzyle. Les groupements protecteurs des chaînes latérales pour Arg comprennent le nitro, le Tos, le Cbz, 11adamantyloxycarbonyle et le Boc. Le groupement protecteur préféré pour Arg est Tos. Le groupement amino des chaînes latérales de Lys peut être protégé par Cbz, 2-ClCbz, Tos ou Boc. Le groupement 2-Cl-Cbz est le groupe ment protecteur préféré pour Lys. Le choix diyÉjroupement protecteur des chaînes latérales est basé sur ce qui suit Le groupement protecteur des chaînes latérales reste intact pendant le couplage et il n'est pas dissocié pendant la déprotection du groupement protecteur de l'extrémité N-terminale ni pendant les conditions de couplage

32

Le g r o erp-e ment protecteur des chaînes latérales doit pouvoir être éliminé à la fin de la synthèse du peptide final en utilisant des conditions réactionnelles qui n'altéreront pas le peptide cible.

La synthèse en phase solide est réalisée habituellement à partir de l'extrémité C-terminale en couplant l'acide aminé protégé en alpha-amino'(chaîne latérale protégée) à un support solide approprié. Il se forme une liaison ester lorsque la fixation se fait à une résine chlorométhylée ou hydroxyméthylée et le peptide cible qui en résulte aura un groupement carboxyle libre à l'extrémité C-terminale. Ou bien, on utilise une résine à la benzhydrylamine ou à la p-méthylbenzhydrylamine, dans ce cas il se forme une liaison amide et le peptide cible qui en résulte aura un groupement carboxamide à l'extrémité C-terminale. Ces résines se trouvent dans le commerce et leur préparation est décrite par Stewart et al., "Solid Phase Peptide Synthesis" (2nd Edition, Pierce Chemical Co., Rockford, IL, 1984).

L'acide aminé C-terminal, Arg, protégé à la chaîne latérale par Tos et au niveau de la fonction alpha-amino par Boc est couplé à la résine à la benzhydrylamine en utilisant divers agents activateurs comprenant le dicyclo-hexylcarbodiimide (DCC), le N,N'-diisopropylcarbodiimide et le carbonyldiimidazole. Après la fixation au support résine, le groupement protecteur d'alpha-amino est éliminé en utilisant l'acide trifluoroacétique (TFA) ou HC1 dans le dioxane à une température comprise entre 0 et 25°C. Du disulfure de méthyle est ajouté à l'acide t r i — fluoroacétique après l'introduction de méthionine (Met) pour supprimer une S-alkylation possible. Après élimination du groupement protégeant alpha-amino, les acides aminés protégés restants sont couplés par étapes dans

33

l'ordre—voulu pour obtenir la séquence de peptides souhaitée.

Divers agents activateurs peuvent être utilisés pour les réactions de couplage, y compris le DDC, le N,N '-diisopropylcarbodiimide, 1'hexafluorophosphate de benzotriazol-1-yl-oxy-tris-(diméthylamino)-phosphonium (BOP) et le DDC-hydroxybenzotriazole (HOBt). Chaque acide aminé protégé est utilisé en excès (> 2,5 équivalents) et les couplages sont habituellement effectués dans DMF, Ch^C^ ou leurs mélanges. L'achèvement de la réaction de couplage est contrôlé à chaque étape par la réaction à la ninhydrine, comme décrit par Kaiser et al., Anal. Biochem. 3_4;595 ( 1970). Dans les cas où un couplage incomplet es.t déterminé, la réaction de couplage est répétée. Les réactions de couplage peuvent être effectuées automatiquement sur un synthétiseur Vega 250, Applied Biosystems ou un autre appareil du commerce. Après l'assemblage complet du peptide cible, la peptide-résine est déprotégée par le TFA/dithioéthane, puis clivée par un réactif tel que HF liquide pendant 1-2 heures à 0°C qui sépare le peptide de la résine et élimine tous les groupements protecteurs des chaînes latérales.

La cyclisation chaîne latérale à chaîne latérale sur le support solide exige l'emploi d'un schéma de protection orthogonale qui permet le clivage sélectif des fonctions des chaînes latérales des acides aminés acides (p.ax. Asp) et des acides aminés basiques (p.ex. Lys). Le groupement protecteur 9-f1uorénylméthyle (OFm) pour la chaîne latérale d'Asp et le groupement protecteur 9-fluorényl-méthoxycarbonyle (Fmoc) pour la chaîne latérale de Lys peuvent être utilisés à cet effet. Dans ces cas, les groupements protecteurs des chaînes latérales de la peptide-résine protégée par Boc sont sélectivement

34

éliminés par la pipéridine dans DMF. La cyclisation est obtenue sur le support solide en utilisant divers agents activateurs, y compris DDC, DDC/HOBt ou BOP. La réaction au HFiest réalisée sur la peptide-résine cycli-sée comme décrit plus haut.

La purification des protéines synthétiques peut être réalisée comme décrit plus haut pour les protéines produites par recombinaison.

Les protéines d'Eimeria peuvent également être récupérées à partir d'extraits de protéines de membrane d'E. tenella ou d'autres espèces Eimeria par immunopréci-pitation ou par chromatographie par immuno-affinité.

Comme déjà noté, ces méthodes peuvent produire les protéines de type sauvage, complètes. Dans certains cas, ces protéines sont de plus grande taille que les protéines obtenues par la méthode de l'ADN recombinant. Des anticorps monoclonaux à cette fin peuvent être produits comme décrit plus haut en utilisant des protéines synthétiques ou des protéines d'Eimeria naturelles comme antigène.

D'autres protéines utiles qui ont les déterminants immunoréactifs et/ou antigéniques nécessaires sont les anticorps ou leurs fragments qui sont anti-idiotypiques à l'égard du ou des déterminants actifs sur les protéines de l'invention. Ces anticorps anti-idiotypiques peuvent être élaborés contre d'autres anticorps qui sont spécifiques pour les déterminants sur les protéines de l'invention (c'est-à-dire, les anticorps anti-idiotypiques sont des anticorps anti-anticorps) . Des anticorps anti-idiotypiques monoclonaux sont utilisés de préférence. De tels anticorps peuvent être administrés en tant que vaccin^ de la même manière les protéines d'Eimeria

35

elles-mêmes peuvent être utilisées.

Une ou plusieurs protéines d'Eimeria et un ou plusieurs anticorps anti-idiotypes de cette invention peuvent être formulés dans des vaccins comprenant les protéines et un excipient physiologiquement acceptable. Des excipients acceptables comprennent, par exemple, un tampon phosphate 0,01 à 0,1 M de pH neutre ou le sérum physiologique.

Une immunité renforcée contre la coccidiose peut être provoquée en un ou deux jours. Premièrement, un adjuvant ou un immunorenforçateur peut être ajouté au vaccin. Deuxièmement, les protéines de l'invention peuvent être présentées à un animal devant être immunisé sous une forme de plus grande taille, soit comme complexe réticulé soit conjuguées à une molécule vectrice.

Les adjuvants appropriés comprennent, mais sans s'y limiter, l'Adjuvant 65 (contenant de l'huile d'arachide, du monoolé^-ate de mannide et du monostéarate d'aluminium); des gels minéraux tels que l'hydroxyde d'aluminium, le phosphate d'aluminium et l'alun; des surfactants, tels que 1'hexadécylamine, 1'octadécylamine, la lysolécithine, le bromure de diméthyldioctadécy1ammonium, la N,N-diocta-décyl-N',N'-bis(2-hydroxyméthyl)-propanediamine, le méthoxyhexadécylglycérol et les polyols pluroniques; des polyanions tels que le pyrane, le sulfate de dextrane, le poly IC, l'acide polyacrylique et le carbopol; des peptides tels que le dipeptide muramyle, la diméthylgly-cineet la tuftsine; et des émulsions huileuses. Les protéines pourraient également être administrées après incorporation dans des liposomes ou autres microvéhicules.

36

L '"incorporation dans des liposomes ou d'autres micro-véhicules fournit un moyen par lequel la libération d'un vaccin peut être maintenue pendant une longue période. Une pompe telle qu'une pompe Alza pourrait être utilisée dans le même but.

L1immunogénicité des protéines de l'invention, en particulier des fragments de plus petite taille, peut être renforcée par réticulation ou par couplage avec une molécule vectrice immunogène (c'est-à-dire une macromolécule ayant la propriété d'induire indépendamment une réponse immunitaire chez un animal hôte, à laquelle les protéines ou les fragments de protéines de l'invention peuvent être liés de façon covalente). Une réticulation ou une conjugaison avec une molécule vectrice peut être nécessaire parce que des fragments de protéines de petite ttaille agissent parfois comme des haptènes (des molécules qui sont capables de se lier spécifiquement à un anticorps, mais qui sont incapables d'induire la production d'anticorps, c'est-à-dire qu'elles ne sont pas immuno-gènes). La conjugaison de tels fragments avec une molécule vectrice immunogène rend les fragments immunogènes grâce au phénomène appelé couramment l'"effet porteur".

Les molécules vectrices appropriées comprennent, par exemple, des protéines et des composés polymères naturels ou synthétiques, tels que polypeptides, poly-saccharides, lipopolysaccharides, etc. Un porteur utile est un glycoside appelé Quil A qui a été décrit par Morein et al., Nature 308:457 (1984). Des molécules vectrices protéiques sont spécialement préférées comprenant, mais sans s'y limiter, des protéines de sérum de mammifères, telles que 1 ' hémocyanine de patelles, la gammaglobuline humaine ou bovine, la sérumalbumine humaine, bovine ou de lapin ou des dérivés méthylés ou autres de ces

37

protéines. D'autres porteurs protéiques seront évidents pour les spécialistes. Le porteur protéique sera de préférence, mais pas obligatoirement, étranger à l'animal hôté chez lequel des anticorps anti-protéines d'Eimeria doivent être élaborés.

Un couplage covalent avec la molécule vectrice peut être réalisé en utilisant des méthodes bien connues dans la profession, dont le choix exact sera dicté par la nature de la molécule vectrice utilisée. Lorsqbe la molécule vectrice est une protéine, les protéines ou les fragments de l'invention peuvent être couplés, par exemple, en utilisant des carbodiimides solubles tels que le dicyclohexylcarbodiimide ou le glutaraldéhyde.

Des agents de couplage tels que ceux-ci peuvent également être utilisés pour réticuler les protéines et les fragments entre eux sans utiliser de molécule vectrice séparée. Une telle réticulation en agrégats de protéines ou de fragments de protéines peut également augmenter 1'immunogénicité.

L'administration d'une quantité efficace des vaccins de cette invention peut protéger la volaille contre l'infection par E. tenella. Les anticorps monoclonaux antiantigènes d'E. tenella entrent en réaction croisée avec E. acervulina et E. maxima in vitro, ce qui indique que la protection peut aussi être conférée contre ces espèces. Une dose efficace des protéines ou des fragments de protéines est comprise entre environ 10 et environ 50 micro-grammes/kg de poids corporel de l'animal vacciné. Une dose d'environ 25 à 50 yg/kg est préférée. Les vaccinations initiales sont de préférence suivies de vaccinations de rappel administrées une à plusieurs semaines plus tard.

38

Des rappels multiples peuvent être administrés. Les doses de ces rappels sont généralement comprises entre environ 5 et 50 yg/kg, de préférence entre environ 20 et 50 yg/kg. Les voies standard d'administration peuvent 5 être utilisées, telles que sous-cutanée, intradermique, intramusculaire, orale, anale ou administration dans l'oeuf.

La présentation des antigènes coccidiens de l'inven-10 tion aux systèmes immunitaires de la volaille peut être réalisée en clonant les gènes codant pour les antigènes dans des bactéries (par exemple, E. coli ou Salmonella) ou dans des virus (par exemple, poxvirus ou herpesvirus) et en administrant les systèmes vecteurs vivants aux 15 oiseaux oralement, par injection ou par d'autres voies couramment uti'lisées. Carbit et al. [in: Vaccines, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory, pp. 68-71] ont décrit l'utilisation d'E. coli, alors que Clements [Pathol.Immunopathol Res. 6_: 1 37 ( 1 987)] a décrit l'utilisation de Salmonella. Moss et al. [Ann. Rev. Immunol. _5:305 ( 1 987 )] ont passé en revue l'emploi de systèmes vecteurs viraux en utilisant des poxvirus recombinants.

20

25

30

35

Un type de poxvirus, le virus vaccinal, peut être utilisé pour tester la délivrance d'antigènes coccidiens dans une culture cellulaire et chez les animaux. Il a été trouvé gue pour des études analytiques le virus vaccinal est plus efficace que le virus de la variole aviaire, un autre poxvirus porteur pouvant être utilisé. La raison réside en ce que le virus vaccinal se multiplie plus rapidement que le virus aviaire et en ce que son spectre d'hôtes ne se limite pas aux cellules de poulet. De grandes quantités d'ADN hétérologue peuvent être insérées dans le génome du virus vaccinal sans inhiber ni la maturation ni 1'infectivité virale [Smith et al.,

3 9

Gene 2 5-r21 (1983)].L'insertion et l'expression de gènes hétérologues multiples en utilisant le virus induit la production d'anticorps dirigés contre les antigènes exprimés chez les animaux infectés [Perkus et al., Science 229:981 (1985)].

Les techniques utilisées pour produire des virus vaccinaux recombinants peuvent être facilement adaptées par des procédés de routine aux systèmes de virus de la variole aviaire et des herpesvirus. L'emploi de tels virus recombinants comme vecteurs dans les vaccins contre la coccidiose est particulièrement avantageux en ce que la volaille vaccinée développe l'immunité à la fois contre l'antigène coccidien et le vecteur viral (c'est-à-dire que ces vaccins sont bivalents). L'utilité de ces vaccins peut être encore accrue en insérant des gènes supplémentaires dans le virus porteur. Par exemple, des parties du génome viral de la maladie de Newcastle peuvent être insérées en même temps qu'un gène d'antigène coccidien dans un virus de variole aviaire, conférant ainsi l'immunité contre la maladie de Newcastle, la coccidiose et la variole aviaire, le tout avec un seul vaccin.

L'administration de vaccins à base de vecteurs vivants de l'invention peut être réalisée par de nombreuses méthodes bien connues. Par exemple, la méthode de la "piqûre" couramment utilisée pour vacciner la volaille contre le virus de la variole aviaire peut être employée. Cette méthode consiste à transpercer ou à piquer le tissu de l'aile avec une aiguille pointue plongée dans le vaccin. L'aiguille a habituellement un chas près de l'extrémité comme une aiguille pour machine à coudre dans lequel se trouve une goutte de vaccin. Ou bien, les vaccins vivants peuvent être administrés en

40

injection sous-cutanée ou intradermique dans le tissu de l'aile ou en tout autre endroit.

Les vaccins vecteurs vivants recombinants peuvent également être ajoutés à l'eau de boisson ou même pulvérisés sur les poulets devant être vaccinés. Ils peuvent également être administrés avec la nourriture, de préférence après encapsulation protectrice [Balancou et al., Nature 322: 3 7 3 (1986)], ou dans l'oeuf. Dans cette dernière méthode, les vaccins viraux sont injectés directement dans les embryons de poulets [Sharma, Avian Dis. 25:1155 (1985)].

EXEMPLE

Sauf indication contraire, les pourcentages pour les substances solides dans les mélanges solides, les liquides dans les liquides et les solides dans les liquides sont donnés sur une base respectivement de poids/poids, volume/ volume et poids/volume.

1. PREPARATION D'ANTICORPS MONOCLONAUX ANTI ANTIGENES D' EIMERIA

1.1. PREPARATION DES PARASITES

Des sporozoïtes de E. tenalla, E. acervulina, E.

brunetti et E. maxima ont été isolés à partir d'ookystes sporulés par des procédés standard. En résumé, les

41

ookyste-s" sporulés ont été lavés avec de l'eau distillée et 20?o de chlorure de chaux, puis avec de l'eau distillée. Les ookystes ont été broyés dans un homogénéiseur pour tissus et le matériel insoluble, comprenant les sporo-cystes, a été récupéré par centrifugation. Les sporo-cystes libérés et le reste du matériel présent dans le culot ont été remis en suspension dans la trypsine à 0,25?a et la bile de poulet dans une solution de sel de Hank, pH 8, et incubés pendant 2 heures à 4Q°C. La solution se séparant a été éliminée par deux lavages avec le milieu RPMI-1640 contenant 10?o de sérum de foetus de veau (FBS), suivis de deux lavages avec du PBS, pH 7,4.

Les sporozoïtes ont ensuite été purifiés en gradient de metrazimide [Wisher et al., Parasitology 8_8:515 ( 1 984)]. En résumé, les sporozoïtes ont été remis en suspension dans 2 ml de PBS, pH 7,0, et 1 ml de suspension a été étalé sur un gradient de metrizamide. Le gradient était composé de 5 ml de 12?o, 18% et 24% de metrazimide dans PBS, pH 7,0. Les sporozoïtes ont été sédimentés par centrifugation à 900 X g pendant 40 min. Les sporozoïtes purifiés ont été isolés à partir de l'interface entre le metrizamide à 18% et 24% en introduisant une aiguille de calibre 21 par le côté du tube et en aspirant les sporozoïtes dans une seringue.

Les sporozoïtes purifiés ont été lavés 3 fois avec le PBS, pH 7,0 et utilisés immédiatement pour les études d'immunisation, d'infection, le marquage de surface avec 12 5

I, des tests d ' immunofluorescence ou 1 ' électrophorèse en gel de polyacrylamide-SDS [Laemmli, Nature 227:680 (1970)] et des études de transfert de Western (Western blotting ) .

42

D^e- mérozoïtes de E. tenella ont été isolés comme décrit plus loin dans le paragraphe 6.2.3. Les mérozoïtes purifiés ont été utilisés pour l'immunisation et ont été solubilisés avec le tampon d'un échantillon de Laemmli pour l'électrophorèse en gel de polyactylamide-SDS et pour les études de transfert de Western.

1.2. IMMUNISATION

Huit souris Balb/c femelles (Charles River, Wilming-ton, Mass.) ont été immunisées avec des sporozoïtes vivants purifiés selon le schéma suivant.

1 x 10 sporozoïtes p.voie intraveineuse (i.v.) 6 x 10^ sporozoïtes p.voie intrapéritonéale (i.p.) 6 x 10^ sporozoïtes i.p.

3 x 107 sporozoïtes i.p.

Jour 1 Jour 7 Jour 85 Jour 120

Jour 244 Rappels d'immunisation de pré-fusion Jour 1'

5 x 10^ sporozoïtes i.v., 5 x 10^

sporozoites i.p.

Jour 2 comme Jour 1

Jour 5 fusion de splénocytes hyperimmuns et de cellules de myélome

Le sérum de chaque souris a été analysé pour doser les anticorps anti-sporozoïtes par le test ELISA avec les protéines de sporozoïtes purifiés, par des tests de transfert de Western avec les protéines de sporozoïtes solubilisés, par immunoprécipitation de protéines de surface

125

de sporozoites marqués au I, et par des tests d'immuno-fluorescence avec les sporozoïtes purifiés. La souris avec la réactivité d'anticorps anti-sporozoïtes la plus élevée (souris 107-2) a été choisie pour les rappels d'immunisation de pré-fusion (voir fig. 1 pour l'analyse par ELISA de cet antisérum). Le cinquième jour, la souris a été sacrifiée et la rate a été prélevée pour la préparation de splénocytes.

43

1.3. CULTURE CELLULAIRE ET FUSIONS CELLULAIRES

i

Deux jours avant la fusion, des cellules feeder de splénocytes ont été préparées à partir de souris 5 naïves dans un milieu complet [milieu de Dulbecco modifié par Iscove (IMDM, Gibco) avec 10?o de FBS, de la glu-tamine (2,0 mM) et du 2-mercaptoéthano1 (100 yM) plus HAT (100 yM d'hypoxanthine, 0,4 yM d1aminopterine et 16 yM de thymidine). En utilisant une modification du 0 procédé de St. Groth et al. [J.Immunol.Methods 35:1

g

(1980)], 10 cellules de rate ont été fusionnées avec g

10 cellules de myélome murin PAI-0. Toute autre cellule de myélome convenant pour la préparation d'hybridomes pourrait être utilisée. Un certain nombre de ces cellu-^ les de myélome sont connues et sont accessibles au spécialiste.

Les cellules ont été mélangées, précipitées par centrifugation et remises en suspension sous agitation ménagée continue dans 1,0 ml de 35?o (vol/vol) de p o 1 y -éthylène glycol dans l'IMDM à 37°C pendant 1 minute.

Après 3 minutes d'incubation à 37°C, les cellules ont été précipitées de nouveau et remises en suspension avec ménagement dans 10 ml d'IDMD + HAT. Les cellules ont

2 5 6

ensuite été diluées à 1 x 10 cellules/ml dans le milieu complet + HAT et réparties sur des plaques de microti-

£

tration à 24 cupules (1 ml/cupule) contenant 5x10 cellules feeder de splénocytes dans 1 ml de milieu complet.

30

Les surnageants d'hybridomes ont été analysés pour doser les anticorps anti-sporozoïtes par le test ELISA avec les sporozoïtes purifiés, par le test de transfert de Western avec les protéines de sporozoïtes, par immuno-•*5 précipitation avec les protéines de surface de sporozoïtes

44

125

marques au I et par immunofluorescence avec les sporozoïtes purifiés et les cellules infectées par des sporozoïtes. Les hybridômes ont été clonés par dilution limitante.

5

1.4. ELISA POUR SPOROZOÏTES

Des sporpzoïtes purifiés (4 x 10^) ont été ajoutés à chaque cupule d'une plaque en PVC à fond en U et à 10 96 cupules après blocage préalable avec 1 ?o de BSA dans PBS, pH 7,0. Les sporozoïtes ont été précipités au fond des cupules par centrifugation à 1000 x g pendant 5 minutes. Les sporozoïtes ont été remis en suspension dans 100 y1 d'antisérum dilué ou de surnageants d'hybridomes

1 S

et incubés pendant 2 heures à température ambiante sous agitation continue. Les sporozoïtes ont ensuite été lavés avec 1 ?o de BSA dans PBS, pH 7,0 pour éliminer l'anticorps non lié.

Pour détecter l'anticorps spécifique lié aux sporo-

20 zoïtes, 100 y 1 d'I g G anti-souris de chèvre conjugué à la peroxydase ont été ajoutés aux sporozoïtes remis en suspension et la' suspension a été incubée pendant 2 heures à température ambiante. Les sporozoïtes ont été lavés à l'eau et l'anticorps lié a été visualisé en ajoutant une solution de substrat (o-phénylènediamine, 0,4 mg/ml dans 0,1 M de tampon citrate, pH 4,5, 0 , 1 2 ?a de peroxyde d'hydrogène) pendant 30 minutes à température ambiante. La réaction a été arrêtée par l'addition de 2 ; 5 M de H^SO^ contenant 50 mM de métabisulfite de sodium. La quantité ^ d'abticorps lié a été déterminée par lecture de la DO^gg de la couleur du substrat.

35

Sur un total de 480 cupules préparées sur les plaques à partir de la fusion cellulaire, 432 étaient positives pour la croissance d'hybridomes. Parmi ceux-ci, 358

45

hybridômes étaient positifs pour la production d'anticorps dans le test ELISA primaire pour les sporozoïtes. Pendant la multiplication et le passage de ces cellules d'hybridomes parentales originales, 104 sont mortes ou 5 ont cessé de produire des anticorps et en conséquence étaient négatives dans les criblages ultérieurs par les tests ELISA pour les sporozoïtes et de transfert Western. Le test ELISA pour sporozoïtes a identifié 205 hybridômes qui produisaient des anticorps à des niveaux 10 de base de 10X.

20

1.5. TRANSFERT DE WESTERN (WESTERN BLOTTING) DE PROTEINES DE SPOROZOÏTES

15 Des sporozoïtes purifiés (environ 5 x 10^ sporo zoïtes par ml par gel) ont été solubilisés dans le tampon y

d'un échantillon de Laemmli, séparés par électrophorèse en gel de polyacrylamide-SDS soit dans un gel à 12,5%

soit dans un gel en gradient de 7,5 à 20% (Laemmli, voir plus haut) et transférés électrophorétiquement sur des feuilles de nitrocellulose.. Les feuilles ont été bloquées dans un tampon de gélatine à 3 /O (3/0 de gélatine, Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M de NaCl) et découpées en bandes et on a laissé les bandes réagir avec de l'antisérum dilué ou avec un surnageant d'hybridome pendant 12 heures à 4°C dans un tampon de BSA à 1 % ( 1 % de BSA, 50 mM de phosphate de sodium, pH 6,5, 0,5 M de NaCl, 0,05% de Tween 20). Les bandes ont été lavées dans le PBS, pH 7,4, le Tween-20 à 0,05% et l'anticorps lié spécifiquement a été détecté avec un anticorps anti-souris conjugué à la peroxydase. Les anticorps liés ont été visualisés par addition d'une solution de substrat [4-chloro-1-naphto1-(30 mg dissous dans 10 ml de méthanol refroidi sur la glace et 50 ml de Tris-HCl, pH 7,5), 0,15 M de NaCl, 0,015% de concentration finale de H 2 H 2 ] pendant 30 minutes

25

30

35

46

à tempeïïature ambiante. La réaction a été arrêtée par un lavage abondant à l'eau distillée.

Parmi les anticorps qui étaient positifs dans le test ELISA pour les sporozoïtes, 160 étaient également positifs dans l'analyse par transfert de Western en utilisant des protéines de sporozoïtes solubilisés.

L'analyse par transfert de Western (voir fig. 2) a montré que les anticorps monoclonaux se situent dans l'un des trois profils de réactivité: (a) ceux qui se lient à des protéines d'Eimeria uniques (p.ex. 11A1 et 11D1), (b) ceux qui se lient à 2 ou 3 protéines (p.ex. 6A5 et 20C6) et (c) ceux qui se lient à des protéines multiples (p.ex. 11A5, 13A6 et 14B5).

Les anticorps ont été en outre caractérisés par analyse de transfert de Wester (Western blot) en utilisant des protéines de mérozoïtes de E. tenella et de sporozoïtes de E. acervulina (fig. 3). Un certain nombre d'anticorps, notamment 3A5, 13A6, 7D1 et 20C6, ont reconnu des protéines isolées de sporozoïtes de E. tenella et E. acervulina et de mérozoïtes de E. tenella. Pour d'autres anticorps, tels que 6A5, il a été montré qu'ils sont spécifiques de l'espèce et du stade et qu'ils se lient uniquement aux protéines de sporozoïtes de E. tenella.

Un résumé des résultats obtenus sur certains anticorps est présenté dans le tableau 1 dans lequel la spéci ficité des anticorps est montrée à la fois en ce qui concerne (a) l'origine et la taille de la (des) protéine(s)

dans les gels auxquelles les anticorps se sont liés et (b)

12 5

la taille des protéines d'Eimeria tenella marquées au précipitées par les anticorps (colonne de droite). Les anticorps sont en outre caractérisés dans le tableau par 1'isotype.

/ r a

46

TABLEAU 1

ANALYSE PAR TRANSFERT DE WESTERN (WETSERN BLOT)

Anticorps Isotype

Taille de la

Protéine d'Eimeria (taille gel, kd) protéine préc, Tenella Acervulina Maxiraa

Mrz

Spz

(kd)

10

15

20

7B2

c2a

>200

-

-

-

-

7D4

G1

120

120

120

-

110

7D1

G1

120

120

120

N.D.

110

20C6

G1

120

120

120

N.D.

110

3A5

M

120

120

120

17

120

19D6

G3

180

180

-

-

120

8A2

G2a

37

37

-

-

37

6 AS

G2b

1 28/26

-

-

-

25

14B5

N.D.

>150

N.D.

N.D.

15B3

N.D.

>150

N.D.

N.D.

14B1-

G3

6

6

-

-

24/17

12B2

«3

28/26

-

-

-

24/17

15 A3

G1

28/6

-

-

-

17/15/6

15C4

M

28/26

-

-

-

105/15/6

12C3

°3

28 •

-

N.D.

N.D.

25

5B6

G3

-

N.D.

6

3C4

M

m m

m

-

70

16D2

M

m m

m

-

70/85

13A6

M

m m

m

-

110

11B6

• g3

m ni m

-

105

12 A3

g3

m m

m

-

24/17

12D4

G1

m

N.D.

N.D.

25

Spz et Mrz sont des abréviations respectivement pour sporozoïte en mérozoïte.

G et M désignent respectivement IgG et IgM.

m indique que les anticorps se sont liés à des protéines multiples de taille comprise entre 24 et plus de 200 kd.

N.D. - valeurs non déterminées.

35

47

1.6. IMMUNOPRECIPITATION DE PROTEINES DE SURFACE DE SPOROZOÏTES MARQUEES AU 125I

Les protéines de surface de sporozoïtes purifiés

12 5

5 ont été marquées au I par la méthode IODOGEN (Pierce

Chemical Co.) ou par emploi de IODOBEADS (Pierce Chemical

Co.). Pour ce dernier procédé, 4 IODOBEADS ont été

lavés 3 fois avec 0,2 M de phosphate de sodium, pH 7,5,

12 5

et 1-3 mCi de I-Na ont été ajoutés et incubés pen-10 dant 5 minutes à température ambiante. Des sporozoïtes purifiés (3 x 10^) dans 200 yl de PBS, pH 7,0, ont été ajoutésau flacon réactionnel, et l'incubation a été poursuivie pendant 15 minutes. A la fin de l'incubation, du fluorure de phénylméthanesulfonyle (PMSF) a été ajouté 15 à une concentration finale de 0,5 mM.

Les sporozoïtes ont été récupérés du mélange d'incubation par centrifugation à 12.000 x g pendant 30 secondes et solubilisés dans 1 ml de 2% de dodécylsulfate 2 0 de sodium (SDS) ou de 1% de Triton X-100 dans PBS, pH

7,0. Le matériel insoluble a été éliminé par centrifuga-tion pendant 3 minutes à 12.000 x g. Les protéines de sporozoïtes solubilisés ont été dialysées contre 3 litres de PBS, pH 7,0, à 4°C en utilisant une membrane de sépara-2 5.

tion d'un poids moléculaire de 3.500 pour éliminer tout 12 5

I libre résiduel. Les protéines de sporozoites marquées

12 5 8

au I (spécifiquement 1,5 x 10 cpm incorporés dans la protéine) ont été conservées à 4°C jusqu'à leur utilisation. La radioactivité précipitable au TCA était typiquement en excès de 95% de la radioactivité totale. L'analyse par électrophorèse en gel de polyacrylamide-SDS des

12 5.

protéines de sporozoites marquées au I est illustrée sur la fig. 4, panneau de gauche.

35

48

LTmmunoprécipitation a été réalisée en ajoutant

300 y 1 de surnageant d'hybridomesou d'antisérum dilué à

12 5

250 yl de protéines de sporozoites marquées au I (1 x 10^ cpm) dans le Tampon I (0,25% de NP-40, 10 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M de NaCl). Après incubation pendant 16 heures à 4 0 C , 100-200 yl d'une suspension à 50% d ' I g G anti-souris de chèvre couplé à l'agarose (Sigma Chemical Co.) ont été ajoutés et le mélange a été incubé sur un mélangeur rotatif pendant 2 heures à température ambiante. Les billes ont été précipitées par centrifuga-tion pendant 1 minute à 12.000 x g et lavées 3 fois dans le Wash Buffer (Tampon de lavage) (0,1% de SDS, 0,5% de NP-40, 0,2% de désoxycholate de sodium, 10 mM de PMSF, 10 mM de Tris-HCl, pH 8,5, 0,15 M de NaCl).

12 5

Les protéines marquées au I liées aux anticorps de la phase solide ont été libérées et dénaturées par addition de 60 yl de 2 x le tampon d'un échantillon de

Laemmli et chauffage pendant 3 minutes à 95°C. Les pro-

12 5

téines de sporozoites marquées au I immunoprécipitées ont été séparées par électrophorèse en gel de polyacrylamide-SDS dans un gel à 12,5% et visualisées par auto-radiographie.

Les résultats du test d'immunoprécipitation avec l'immunsérum de souris sont présentés sur la fig. 4, panneau de droite. Parmi les anticorps d'hybridomes qui étaient positifs dans le test ELISA pour les sporozoïtes, 74 étaient positifs dans le test d'immunoprécipitation. Comme le montre la fig. 5, les anticorps d'hybridomes se classent en deux catégories, ceux qui ont précipité seulement des protéines uniques (p.ex., 3C4, 6A5, 7D4, 8A2, 11D2 et 20C6) et ceux qui ont précipité deux protéines ou plus (p.ex., 12B2, 15A3, 15C4 et 19D6).

49

1.7. TESTS D'IMMUNQFLUORESCENCE AVEC DES SPOROZOÏTES PURIFIES

Des sporozoïtes (1 x 10^) ont été ajoutés à des lames dans 8 compartiments (Lab Tek) dans PBS, pH 7,0, et séchés à l'air à 37°C pendant 12 heures. Les lames ont été fixées avec du sérum de chèvre normal à 10% pendant 2 heures à 37°C. De l'antisérum dilué ou du surnageant d'hybridomes ont été ajoutés à chaque compartiment et incubés pendant 2 heures à température ambiante. Les lames ont été lavées et un anticorps anti-souris conjugué à la rhodamine (dilué dans PBS, pH 7,0, Triton X-100 à 0,3%) a été ajouté pendant 1 heure à température ambiante. Après avoir lavé les lames, l'anticorps lié a été visualisé par fluorescence.

La plupart des anticorps ont présenté une immuno-fluorescence spécifique à la membrane de surface et/ou au corps refractile des sporozoïtes séchés à l'air (fig. 6, panneaux A et B). Certains anticorps ont intensivement coloré l'extréimité apicale du sporozoïte et n'ont coloré que légèrement le reste de la surface du sporozoïte (fig.6, panneau C). On peut voir une représentation des sporozoïtes purifiés séchés à l'air sur la fig. 6, lames de gauche des panneaux A, B, C et D. Les sporozoïtes purifiés étaient intacts et allongés et présentaient le grand corps refractile postérieur saillant (PRB) et le corps refractile antérieur plus petit (ARB). L'extrémité apicale (A) du sporozoïte était à l'opposé du corps refractile postérieur. Il y avait également une légère contamination des préparations par des sporocystes intacts (panneau B, lame de gauche) et des membranes de sporocystes broyés.

50

17ÏÏ. RESUME DES RESULTATS DES TESTS ELISA, WESTERN

BLOT, IMMUNOPRECIPITATION ET IMMUNOFLUORESCENCE

Un résumé des résultats des analyses ci-dessus de anticorps monoclonaux est présenté dans le tableau 2.

50e

TABLEAU 2

RESUME DES ANALYSES DES ANTICORPS MONOCLONAUX

WESTERN BLOT

10

15

25

35

E. tenella

Low

E. acervulina

E. tenella

Iramuno-

nH corps

Spz.a

Spz.b

Spz.C

Mz.d

IFAe

DPt. £

3C4

M1

k V ^ •

60-80

11B6

M1

+

+

+

1,2,4

105

12A5

M1

-

-

_

1

14D4

M1

+

+

1,3,4

66

15B6

M1

1,4,7

20-24

17A5

M1

+

h

1

150/83

18B6

. M1

+

+

+

-

T25/20,

M1

[66/60

19C6

+

+

1,2

25/20

20A2

M1

+

+

\

5

66/60

20B4

M1

+

+

\r

1,4

86/60

11C4

M2

+

1,6

_

I2A3

M 2

-

-

-

1,4,7

22/24

13A6

M2

+

+

Y

1,5

110

14B6

M2

1,4,7

105-120

14D1

M2

-

120

9B2

M3

+

4

h

5

66/45

12B1

M3

+

-

-

6

26-28

14C6

M3

-

-

-

105

I5C4

M3

+

-

-

6

105

16D2

M3

-

60-80

20C3

M3

+

+

h

3

14-17

3A5

120

+

+

<c

3

—

6A4

120

-

-

7D1

120

+

(•

1,2,4

110

7D4

120

•*

+

5,1

110

10A6

120

+

-

-

1,2,6

105

11D2

120

-

-

-

4,1,2

105

14A1

120

-

-

-

6,1

110

17B6

120

-

-

1,6,7

120

17C6

120

-

-

8,1

105

19D6

120

+

-

•

3

120

20C6

120

+

+

•f

1,2

110

51

TABLEAU 2 (suite)

WESTERN BLOT

10

25

E. tenella

LOW

E. acervulina

E, tenella

Anticorps Spz.a

Spz.b

Spz.c

Mz.d

IFAe

10A5

>150

7,5

11A6

>150

-

-

-

3

7B2

>200

+

11B1

>150,200

1,7,6

11D4

120/24

+

-

—

1

11D6

120/24

+

-

-

2

12C3

120/24

+

-

_

1,8,2

15B2

120/24

+

+

f

3

15A3

90/10-14

+

.

1,6

14C3

60

-

-

-

1,4

14A5

120/6

-

-

1,3,6

8A2

37

+

+

1,4

6A5

28, 10-14

+

-

1.6

11A1

24

+

_

1,6

11C1

24

+

-

-

12B2

24

+

-

-

1,5

12C6

24

+

-

-

16B1

24

+

1,4

18D5

24

+

-

-

1,6

20C4

24

1,3

14B1

< 6

+

...

1,6

10A2

-

-

1,2,4

5B6

-

1,6

Imrauno-

PPt.f

105 >200

27 27

25

28/14-17 6 6

37 25-28

24/120

6/14-17 48/25/6 5/14-17

20-24 6/105 6/17/15

30 a. Les valeurs indiquées sont les poids moléculaires des protéines de sporozoïtes (Spz) d'E. tenella reconnues par les anticorps dans les transferts de Western (Western blots) ou de groupes de protéines reconnues ayant des poids moléculaires de , 40-150 kd (Ml), 120 et 80-150 kd (M2) et 25 et 40-150 kd (M ).

b. Les tests de transfert de Western (Western blot) ont été 35 effectués avec 1/5 de la quantité habituelle de protéines de sporozoïtes (Spz) d'E. tenella. Les anticorps présentant une réaction positive sont par conséquent d'une affinité plus élevée.

Laréactivité du Western blot est montrée à l'égard des protéines des sporozoïtes (Spz) d'E. acervulina.

La réactivité du Western blot est montrée à l'égard des protéines des mérozoïtes (Mz) d'E. tenella.

Les résultats des profils de coloration dans les tests d'immunofluorescence (IFA) sont résumés pour le test indirect de sporozoïtes d'E. tenella séchés à l'air de la façon suivante: (1) surface, (2) extrémité, (3) surface tachetée, (4) surface brillante, (5) surface claire, (6) surface diffuse, (7) corps refractile et (8) coloration ponctuée.

Les poids moléculaires des protéines des sporozoïtes d'E. tenella marquées au fixées par les anticrops dans les tests d'immunoprécipitation (Immunoppt.) sont présentés.

53

Les anticorps monoclonaux 7D4, 7D1, 20C6, 8A2, 6A5 et 7B2, qui sont préférés, ont été déposés sous forme de cellules d'hybridomes sécrétant ces anticorps monoclonaux à l'American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, 5 Rockville, Maryland, U.S.A. conformément aux dispositions du Traité de Budapest et les numéros de dépôt suivants leur ont été attribués respectivement: HB 9707, HB 9708, HB 9709, HB 9710, HB 9711 et HB 9712.

10 1.9. TESTS D'INFECTION IN VITRO

Des cellules épithéliales primaires de rein de poulet ont été préparées selon la méthode de Doran et al., J. Protozool. 2_5 : 544 (1978) et cultivées jusqu'à une confluence de 40-50% sur des lames Lab Tek dans 4 compartiments. Des cellules MDBK (Madin-Darby bovine kidney) (ATCC-CCL 22) ont également été utilisées à la place des cellules épithéliales de rein de poulet.

Les cellules ont été inoculées avec 50.000 ou 200.000 sporozoïtes purifiés. 16 heures après l'infection, les monocouches cellulaires ont été lavées plusieurs fois pour éliminer les sporozoïtes qui n'avaient pas pénétré dans les cellules. Des cultures de cellules inoculées représentatives ont été fixées dans le méthanol à 10 0% (température ambiante pendant 5 minutes) 3, 16, 24, 48, 64, 96 et 120 heures après l'infection. Les lames fixées ont été conservées dans BSA à 1% dans PBS, pH 7,0, à 4°C jusqu'au traitement pour 1'immunofluorescence comme décrit plus haut. Les profils de coloration obtenus avec divers anticorps sont montrés à la fig.7.

35

Entre 3 et 24 heures après l'infection, les cultures fixées ont montré des sporozoïtes intracellulaires (fig.7, 7D4 à 3 heures et 8A2 à 19 heures). A des délais plus

54

tardifs, les sporozoïtes ont dégénéré en corps reftactiles uniquement (7D4, 60.heures). La surface et l'extrémité apicale des sporozoïtes intracellulaires ont pris une coloration vive avec l'anticorps 7D4 (fig. 7, 7D4 à 3 heures), 5 mais cet anticorps n'a pas coloré la surface des cellules infectées.

Après 24 heures, les sporozoïtes ont commencé à dégénérer et à se développer en schizontes qui sont parvenus à maturité dans les 48 heures suivantes. L'anticorps 7D4 a continué à réagir avec les sporozoïtes dégénérés, mais n' a pas réagi avec les schizontes immatures (fig. 7, 7D4, 60 heures). Mais, à mesure de la maturation des schizontes, 7D4 a commencé à réagir avec les structures à l'intérieur 15 des schizontes (fig. 7, 7D4, 100 heures). Ces structures

étaient les mérozoïtes en voie de développement, et l'anticorps 7D4 a continué à réagir avec un antigène de surface des mérozoïtes matures et libérés (fig. 7, 7D4, 120 heures)

20 Ainsi, 7D4 a identifié un antigène de membrane de

120 kd qui était présent sur les sporozoïtes et les mérozoïtes d'E. tenella. Cet antigène n'était pas exprimé pendant le stade schizonte du développement du parasite jusqu'à ce que des mérozoïtes immatures soient développés 25 dans les schizontes.

L'anticorps 14B1 a présenté un profil de réactivité semblable à celui de l'anticorps 7D4, colorant la surface et l'extrémité des sporozoïtes intracellulaires (fig. 8, 30 14B1, 16 heures) et montrant une coloration diffuse du cytoplasme au voisinage immédiat du sporozoïte intracellulaire. L'antigène reconnu par 14B1 est présent à l'extrémité apicale du mérozoïte immature dans le schizonte mature (fig. 8, 14B1 , 100 heures) et l'extrémité apicale 35 des mérozoïtes' libérés matures (fig. 8, 14B1, 120 heures).

55

Les p r o-f"i ls de coloration présentés par 7 D 4 et 1 4 B1 sont analogues, mais les protéines que ces anticorps reconnaissent ont des poids moléculaires très différents, respectivement de 120 et 6 kd.

Bien que les anticorps 7D4 et 14B1 aient réagi avec la plupart des stades de développement du parasite, d'autres anticorps ont régi uniquement avec des antigènes de surface (fig. 7, 15 A 3 ) ou avec le corps refractile (fig. 7, 7A2) des sporozoïtes intracellulaires, mais pas avec les stades schizonte ou mérozoïte du parasite.

Deux anticorps particuliers, 8 A 2 et 19D6, ont été identifiés par le test d'infection. L'anticorps 8A2 a réagi avec une protéine de 37 kd présente à la surface des sporozoïtes (fig. 7C, 8A2, 19 heures), à tous les stades du schizonte en développement (fig. 7C, 8A2, 120 heures) et à la surface des mérozoïtes libérés (fig. 7C, 8A2, 120 heures). A la différence des protéines reconnues par les anticorps 7D4 et 14B1, la protéine de 37 kd était synthétisée pendant tout le développement intracellulaire du parasite.

L'anticorps 19D6 a réagi non seulement avec une protéine de surface des sporozoïtes de 180 kd, mais aussi avec une protéine dans le cytoplasme des cellules infectées par les sporozoïtes (fig. 8, 19D6 à 3 heures). La protéine cytoplasmique reconnue par l'anticorps 19D6 a pu être éliminée par le sporozoïte après l'infection des cellules étant donné que la protéine a disparu pendant le développement du schizonte immature et a réapparu dans le schizonte mature et dans les mérozoïtes libérés (fig. 8B, 19D6, 120 heures) .

56

Les anticorps du sérum de poulets qui ont survécu à une infectio^ par E. tenella colorent l'extrémité apicale et la surface des sporozoïtes intracellulaires (fig. 8B,Sérums de poulets immuns, 3 heures) selon un profil semblable au profil de coloration de l'anticorps 7D4, mais non les corps refractiles du sporozoïte intracellulaire.

Les études d'immunofluorescence avec des cellules de rein de poulet infectées par des sporozoïtes ont identifié des antigènes (a) qui étaient spécifiques du sporozoïte (p.ex., les protéines de plus de 200 et 28 kd reconnues par les anticorps 7B2 et 6A5 respectivement), (b) qui étaient trouvés à tous les stades du parasite intracellulaire (p.ex., la protéine de 37 kd reconnue par 8A2) et (c) qui étaient spécifiques des sporozoïtes et des mérozoïtes, mais pas du schizonte (p.ex. les protéines de 120 et 6 kd reconnues par les anticorps 7D4 et 14B1 respectivement).

1.10. TESTS DE NEUTRALISATION DES SPOROZOÏTES IN VITRO

Dans une modification de la méthode de Schmatz et al., J.Protozool. _3JL: 1 0 9 (1986), des cellules MDBK ont été trypsinisées et mises en suspension dans le Minimal Essential Médium (Gibco) enrichi en FBS à 1 ?o à une densité de 7,5 x 104 cellules/ml. A chaque cupule d'une plaque de microtitration ( culture tissulaire traitée, 96 cupules )> 1,5 x 104 cellules ont été ajoutées et incubées pendant 48 heures à 40°C. Les sporozoïtes purifiés ont été soit prétraités avec un anticorps pendant 1 heure à 40°C soit laissés sans traitement avant d'infecter les monocouches cellulaires. Les anticorps (surnageants de cultures tissulaires, liquide ascitique ou antisérum)

ont été soumis à une dialyse poussée contre PBS, pH 7,0,

57

inactivés par la chaleur à 56°C pendant 30 minutes et filtrés pour assurer la stérilité avant l'emploi.

Immédiatement après l'infection, du [ 5 , 6 ] - ^ H - u r a c i 1 e a été ajouté à toutes les cupules pour obtenir une concentration finale de 5 yCi/ml. 19 heures après l'infection, le milieu a été enlevé et les cultures ont été lavées une fois avec PBS. Les cellules sont libérées avec de la trypsine et de l'EDTA pendant 15 minutes à 40°C et récoltées sur des filtres en fibres de verre. Les filtres ont été séchés, placés dans du liquide de scintillation p

(READY-SOLV , New England Nuclear) et soumis au comptage pour la radioactivité liée. La faculté des anticorps d'inhiber la pénétration des sporozoïtes et/ou le dévelop pement a été déterminée d'après la radioactivité incorporée dans les cellules infectées par des sporozoïtes non traités comparées aux cellules infectées par des sporozoïtes traités par un anticorps.

Des sporozoïtes ont également été pré-incubés avec des anticorps témoins, un tampon ou du lasalocide, un coccidiostatique. Le lasalocide bloque complètement le développement des sporozoïtes dans les cellules MDBK et réduit considérablement l'incorporation du ^H-uracile.

Les résultats sont représentés sur la fig. 9 sur laquelle on peut voir que les anticorps 7D4 (□), 8A2 (O) et 14B1 (0) ont inhibé significativement l'incorporation de ^H-uridine dans les cultures de MDBK infectées. L'anti corps 6A5 (#) a été moins actif, mais il a présenté une certaine inhibition. Le traitement avec le tampon (A) et l'anticorps témoin (X) n'a provoqué aucune inhibition, alors que lasalocide (*) a provoqué une inhibition complète.

58

2. CONSTITUTION DE BANQUES D'EXPRESSION D'ADNc

2.1. PREPARATION D'OOKYSTES SPORULANTS

Les caecums ont été prélevés chez des poulets de 3 semaines (Hubbard Cross; Avian Services, Frenchtown, New Jersey, •U . S.A . ) 7 jours après inoculation orale avec 50.000 ookystes sporulés d'E. tenella par oiseau, et broyés dans un mélangeur Waring avec de l'eau distillée pendant 1 minute. Le volume a été ajusté à 1 litre avec de l'eau distillée et de la Pepsine (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, U.S.A.) a été ajoutée à 3 g/1. Le pH a été ajusté à 2,0 avec HC1 concentré et le mélange a été incubé et agité pendant 2 à 3 heures à 3 9 0 C ou jusqu' ce qu'une suspension d'ookystes isolés soit observée.

Après digestion, le pH a été ajusté à 8,0 avec NaOH 10 N et 3 litres d'eau distillée ont été ajoutés. Le mélange a été laissé au repos pendant la nuit. Le surnageant a ensuite été éliminé et le précipité a été lavé avec de l'eau jusqu'à ce que le surnageant soit limpide. Les ookystes ont été sporulés en faisant passer des bulles d'air à travers la suspension dans l'eau distillée à température ambiante. La sporulation a été arrêtée après 24 heures pour la préparation d'ARN.

i

2.2. ISOLEMENT D'ARNmDES OOKYSTES SPORULANTS

L'ARN total a été préparé par une modification de la méthode du chlorure de guanidinium/césium décrite par Maniatis et al., v. plus haut, page 196. Les ookystes ont été lavés avec PBS (NaCl 0,15 M, phosphate de sodium 20 mM, pH- 7,9) et remis en suspension en mélangeant en tournant avec ménagement dans 10 ml de solution contenant 5 M d'isothiocyanate de guanidinium, 50 mM de Tris-HCl, 10 mM d'acide éthylènediaminetétracétique (EDTA),

59

0,5?o dë"""Sarkosy 1 (sodium N-lauroyl sarcosine, Sigma Chemical Co.) et 0,1 M de bêta-mercaptoéthanol, pH 7,4, avec 5 jul d'Antifoam A (Union Carbide, Danbury, Connecti-cut, U.S.A.) ou un autre agent antimoussant ajouté de préférence. La suspension cellulaire a été homogénéisée jusqu'à ce qu'un bon broyage des ookystes soit observé au microscope.

Les débris cellulaires insolubles ont été éliminés

!

par centrifugation à faible vitesse et l'homogénat a été divisé en 4 parties aliquotes et étalé sur 1,2 ml de 5,7 M de CsCl, 0,1 M d'EDTA, pH 7,7, dans des tubes en polycarbonate de 12 ml. Les tubes ont été centrifugés à 40.000 t/min dans une centrifugeuse Beckman SW 50.1 pendant 17 heures à 15°C. Le liquide surnageant a été rejeté, les parois des tubes ont été séchées et les culots ont été remis en suspension dans 1,25 ml de 10 mM de Tris-HCl, 1 mM d'EDTA, 1 % de dodécylsulfate de sodium (SDS), pH 7,5, avec 200 yg/ml de Protéinase K (Boehringer-Mannheim). Après incubation à 37°C pendant 30 minutes, la solution a été extraite 3 fois avec le phénol. L'ARN dans la phase aqueuse finale a été précipité 3 fois avec de l'éthanol, puis dissous dans 1 ml d'eau.

L'ARN polyadénylé [poly(A)+] a été préparé en faisant passer deux fois environ 2 mg d'ARN total sur une colonne d'oligo(dT)-cellulose (Pharmacia Fine Chemicals) comme décrit par Maniatis et al., v. plus haut, page 197. L'ARN pol(A)+ a été précipité deux fois à l'éthanol et dissous dans 200 yl d'eau. Le rendement a été d'environ 26 yg, calculé d'après la densité optique à 260 nm.

60

2.3. PREPARATION DE MEROZOÏTES

Des mérozoïtes d'E. tenella ont été récoltés à partir de caecums de 50 poulets infectés (Hubbard Cross de 3 se-5 maines; Avian Services, Frenchtown, NJ) 5 jours après infection par 50.000 ookystes ci-dessus par oiseau.

Les caecums ont été prélevés et lavés avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pendant 15 minutes sur un agitateur magnétique. Les débris épthéliaux ont 10 été partiellement éliminés par centrifugation à faible vitesse (50 x g) et les mérozoïtes bruts ont été récupérés par centrifugation à 2000 x g à 4°C pendant 10 minutes. Le culot a été remis en suspension dans un tampon lysant (Lysing Buffer) (8,29 g/1 de NH^Cl, 0,372 g/1 de 15 Na2EDTA, 1,0 g/1 de KCO^) et incubé sur la glace pendant 30 minutes. Les mérozoïtes ont été recueillis par centri-fugation, lavés une fois dans PBS et passés sur une colonne contenant 1,0 g de fibre de nylon filée (Scrub Nylon Fiber, Fenwall Laboratories, Deerfield, Illinois, U.S.A.) ^ dans une ampoule à décanter. Les mérozoïtes ont été recueillis par centrifugation comme précédemment et congelés sur carboglace pour l'isolement de l'ARN, ou encore purifiés dans la diéthylaminoéthy1 cellulose (DEAE, Whatman DE52, Whatman, Clifton, New Jersey, U.S.A.) pour l'analyse

2 5

par transfer de Western (Western blot).

Pour la purification dans la DEAE cellulose, environ 9

1x10 mérozoites ont été chargés dans PBS sur une colonne d'un volume de lit de 10 ml et élués avec PBS. Les m é r o -30 zoïtes ont été récupérés dans les premiers 100 ml d'écoulement, essentiellement exempts d'érythrocytes et d'autres débris cellulaires.

35

q

61

2.4. ISOLEMENT DE L'ARNm DES MEROZOÏTES

9

Les culots de mérozoites congelés contenant 1x10 1 0

à 1 x 10 microorganismes ont été décongelés dans 10 ml de tampon TEL/SDS [0,2 M de Tris-HCl, 0,1 M de LiCl, 25 mM d'EDTA, 1% (p/v) de dodécylsulfate de sodium (SDS), pH 8,8] contenant 1 mM de dithiothréitol (DTT) et 300 unités de RNasin (Promega Biotec, Madison, Wisconsin, U.S.A.) et homogénéisés par 10-12 coups dans un homo-généiseur pour tissus enrobé de teflon. Les débris insolubles ont été séparés par centrifugation à froid à 3000 x g. Le liguide surnageant a été extrait deux fois avec le mélange phénol :chloroforme : alcool isoamyligue (24:24:1, v/v) gui avait été éguilibré avec le tampon TEL.

La phase agueuse a été digérée avec 100 jig/ml de protéinase K à 37°C pendant 10 minutes et ré-extraite avec un volume égal de phénol : chloroforme (1:1) et l'acide nucléique a été précipité par deux volumes d'éthanol pendant 1 heure sur carboglace ou pendant une nuit à -20°C. Le culot, après centrifugation à 10.000 x g pendant 1 heure, a été remis en suspension dans TE (10 mM de Tris, pH 7,5, 2 mM d'EDTA) et centrifugé à travers une couche d'amortissement de 4 ml de CsCl (5,7 M de CsCl, 0,1 M d'EDTA) à 150.000 x g pendant 20 heures à 15GC. Le culot d'ARN a été reprécipité à partir de 0,2 M d'acétate de potassium par 2,5 volumes d'éthanol. On a fait passer cet ARN total une fois sur de l'oligo-dT cellulose pour enrichir en ARN poly(A)+, comme décrit par Maniatis et al., v. plus haut, page 197. Un rendement

9

typique de 1,9 mg d'ARN total à partir de 5 x 10 mérozoïtes contenait approximativement 20 y g d'ARN poly(A)+.

62

2T5. SYNTHE5E D'ADNc D'OOKYSTES ET DE MEROZOÏTES ET INSERTION DANS DES VECTEURS PHAGIQUES

Un ADNc double-brin a été synthétisé à partir de 6 yg d'ARN poly(A)+ d'ookystes sporulants, comme décrit par Gubler et al., Gene 2_5:263 ( 1 983), en utilisant une transcriptase inverse (B R L) pour allonger à partir d'une amorce oligo(dT) et la RNase H (BRL) et la E.coli DNA poly-mérase I (New England Biolabs) pour synthétiser le brin complémentaire. Les extrémités de l'ADNc double-brin ont ensuite été rendues franches en utilisant la DNA polymérase de T 4 (BRL), et des lieurs (linkers) Eco RI (GGAATTCC, Collaborative Research) ont été ajoutés après traitement par EcoRI méthylase (New England Biolabs), conformément aux protocoles des fabricants.

Après digestion de l'ADNc ainsi préparé avec EcoRI, une banque a été préparée dans X g 111 (Stratagene Cloning Systems, San Diego, California, U.S.A.), comme décrit par Huynh et al., in D. Glover (éd.), DNA Cloning vol.I: A Practical Approach, 198 5, IRL Press, Washington, D.C., pp. 49-78. Les fragments d'ADNc EcoRI ont été liés aux bras déphosphorylés deÀgtll digérés par EcoRI (Stratagene Cloning Systems) et l'ADN obtenu a été encapsidé dans p

un phage avec le Gigapack kit (Stratagene Cloning Systems), conformément aux protocoles des fabricants.

La banque obtenue a été amplifiée par étalement sur des cellules hôtes Y1088 (ATCC n° 37195). Le pourcentage de recombinants a été estimé comme étant d'environ 90% en se fondant sur le rapport des plages bleues aux plages incolores sur les plaques X-gal (Maniatis, v. plus haut,

page 24) en présence d ' isopropyl-B-D-thiogalactopyranoside (IPTG, Sigma Chemical Co.).

63

Des copies d'ADNc double-brin de l'ARN poly(A)+ ont été synthétisées essentiellement comme décrit plus haut. L'ADNc double-brin utilisé dans la constitution de la banque contenait de 200 à 4500 paires de bases (pb), comme 5 on a pu en juger d'après la migration dans des gels dénaturants [Bailey et al., Anal. Biochem. ( 1 976 )].

L'ADNc des mérozoïtes a été méthylé et lié à des lieurs (linkers) EcoRI comme décrit plus haut, si ce n'est 0 que des lieurs (linkers) CCGAATTCGG (Collaborative Research) ont été utilisés. Après digestion par EcoRI, les ADNc ont été fractionnés dans le Biogel A-50M pour éliminer les molécules de linkers en excès et les ADNc inférieurs à environ 300 pb, comme décrit par Huynh et ' al., v.plus haut.

Les ADNc ont été liés aux bras de'Xgt11, et l'ADN a été encapsidé dans un phage comme décrit plus haut. La banque obtenue, qui contenait environ 50.000 phages, a 20 été amplifiée par étalement sur des cellules hôtes Y1088. L'analyse des plages sur des plaques X-gal en présence d'IPTG a révélé environ 90% recombinants.

3. CRIBLAGE IMMUNOLOGIQUE DE BANQUES D'ADNc

La banque d'expression d'ADNc de mérozoïtes X g 111 a été étalée sur des cellules Y1090 (ATCC n° 37197) avec une densité d'environ 10.000 plages par plaque de 150 mm. Six plaques ont été incubées pendant 3,5 heures à 42°C, recouvertes de filtres en nitrocellulose préalablement trempés dans 10 mM d'IPTG pour induire l'expression de la protéine de fusion 3-galactosidase, et incubées pendant 4-5 heures supplémentaires jusqu'à une nuit à 37°C. Les filtres ont été enlevés des plaques et soumis à plusieurs lavages par portions avec TBS (20 mM de Tris,

c

64

pH 8,0, 0,15 M de NaCl). Les sites de liaison aux protéines non spécifiqùes ont été bloqués par incubation dans du sérum de foetus de veau (FCS) à 20% dans TBS pendant 2-4 heures sur un agitateur rotatif, à 4°C.

Du liquide ascitique pour neuf anticorps monoclonaux dont on sait qu'ils réagissent avec les antigènes des mérozoïtes (désignés 7D4, 7D1, 20C6, 13A6, 20C1, 11B6, 3A5, 13A1 et 15B2) a été rassemblé, ajusté à 20% de FCS et 0,15 M de NaCl dans un volume final de 100 ml et appliqué sur chacun des filtres dans des boîtes de Pétri, deux filtres par boîte. Les filtres ont été incubés avec le pool d'anticorps monoclonaux primaires à 4°C pendant une nuit sur un agitateur rotatif. L'anticorps non lié a été éliminé en lavant les filtres 5-6 fois avec TBS à température ambiante. L'anticorps lié a été détecté en incubant les filtres avec un conjugué peroxydase de raifort (HP0D) anti-souris de chèvre (Boehringer Mannheim puis développement de la couleur en utilisant 3 mg/ml de 4-chloro-1-naphtol (Bio Rad) et 0,018% de comme décrit par Hawkes et al., Anal.Biochem. 119:142 (1982).

Les plages positives identifiées dans le criblage initial à densité élevée ont été purifiées dans un criblage secondaire utilisant le même pool d'anticorps monoclonaux. Chaque positif a été attribué à un monoclonal particulier du pool par étalement des positifs en des rangées de grilles multiples, dont chacune a été induite avec IPTG, transférée sur la nitrocellulose et incubée avec un des monoclonaux du pool. Un phage positif appelé Xm2-4 a été identifié, qui a été reconnu par trois des huit anticorps du pool, les anticorps 7D1, 7D4 et 20C6.

Des méthodes analogues ont été utilisées pour cribler la banque d'ADNc d'ookystes sporulants, si ce.

65

n'est qu'un pool d'anticorps monoclonaux contenant les anticorps 6A5, 7B2, 15A3 et 20C6 a été utilisé pour le criblage initial; 7B2, 15A3, 20C6 et 8A2 ont été utilisés dans un deuxième criblage; et 15A3, 7B2 et 20C6 ont été utilisés dans un troisième criblage, et le tampon d'incubation contenait en plus 0,05% de Tween-20 [polyoxy-éthylène(20)sorbitan monolaurate]. De cette façon, les plages appelées XS1-3, XS1-4 et XS1-7; XS2-1, XS2-4 et XS2-5; et XS3-1 qui ont été reconnues par les anticorps monoclonaux 6A5, 8A2 et 7B2 respectivement, ont été identifiées dans la banque d'ADNc d'ookystes. L'ADN obtenu à partir de la protéine produisant le phage qui a réagi avec l'anticorps 6A5 a été analysé par digestion par EcoRI et électrophorèse en gels d'agarose (Maniatis et al., v.plus haut, page 150). Trois inserts différents ayant des tailles d'environ 1150, 890 et 615 pb ont ainsi été trouvés.

4. EXPRESSION DES GENES D'EIMERIA DANS E. COLI

Les molécules d'ADN EcoRI de 1,1 kb et 0,9 kb provenant respectivement des phages XS1-7 et XS1-3, ont été isolées et insérées dans le site EcoRI de chacun des trois vecteurs d'expression à cadre de lecture variable, pEV-vrfl, pEV-vrf2 et pEV-vrf3, construits comme décrit par Crowl et al., Gene 2J3.:31 ( 1 985 ). Les plasmides contenant les inserts dans les deux orientations possibles ont été transformés comme décrit par Mandel et al. [J.Mol.Biol. 5_3:159 (1970)] dans E. coli souche MC1061 portant le plasmide compatible pRK248cIts décrit par Bernard et al.

[Methods in Enzymology 68_:482 ( 1979)]. La souche MC1061 et le plasmide pRK248cIts ont été déposés à 1'Amer ican Type Culture Collection et ont reçu respectivement les numéros de dépôt 33766 et 53338.

6 6

Les transformants bactériens ont été cultivés à 30°C dans le milieu M9 [Maniatis et al., v.plus haut, page 68]

avec 0,5% de glucose et 0,5?o de Casamino acides et déplacés à 42°C à une D.O. (550 mp) de 0,5 comme décrit par Crowl et al., v. plus haut, pour induire la transcription au niveau du promoteur AP^. Après incubation pendant 2-3 heures, des échantillons de 1 ml ont été prélevés et les cellules dans les échantillons ont été recueillies par centrifuga-tion. Les culots cellulaires ont été traités comme décrit par Crowl et al., v.plus haut, et les lysats ont été soumis à une électrophorèse en gel de po1 yacry1amide-dodécy1 su 1-fate de sodium (SDS), comme décrit par Laemmli [Nature 227:680 (1970). Après l'électrophorèse, les protéines dans les gels ont été ou bien colorées avec le bleu brillant de Coomassie ou bien transférées sur des membranes de nitrocellulose pour l'analyse par transfert de Western (Western blot) [Towbin et al., Proc.Natl.-Acad.Sci.USA 7_6:4350 ( 1 979); Burnetti, Anal. Biochem. 1 1 2 : 1 95 ( 1 981 )], en utilisant li'anticorps monoclonal 6A5 et le conjugué HP0D anti-souris de chèvre pour la détection.

Cette analyse a montré que la molécule d'ADNc de 0,9 kb dans une direction dans le vecteur pEV-vrfl a produit une protéine de 20 kd qui a réagi avec l'anticorps 6A5. Aucune expression n'a été observée avec la molécule de 1,1 kb, probablement parce qu'elle contenait des séquenc© 5' non-codantes. Pour optimiser le rendement de cette protéine, divers milieux d'expression ont été examinés. Il a été trouvé que le milieu préféré contenait par litre (^ 10%) 6,0 g de K H 2 P 0 ^ , 4,0 g de K 2 H P 0 ^ , 5,0 g de (NH4)2S04, 3,5 g de MgS04.7H20, 21,0 g d'extrait de levure, 3,5 g de Bacto Tryptone, 1,0 ml deLB625 Antifoam, 25 g de glucose, 70 mg de thiamine-HCl, 2,5 ml de solution vitaminique [GIBC0 MEM (10□X) Solution Vitamin]

67

et 1,0—m1 d'oligo-éléments. LB625 Antifoam, un produit un d'Union Carbide, est^polymère linéaire d'éthylène et d'oxyde de polypropylène ayant une viscosité de 625 Saybolt Univer'sal Seconds à 37,8°C.

Les vitamines par litre de bouillon de fermentation comprenaient 0,25 mg de chacune des vitamines suivantes: pantothénate de D-calcium, chlorure de choline, acide folique, nicotinimide, pyridoxal-HCl et thiamine-HCl supplémentaire; 0,50 mg d'i-inositol et 0,025 mg de riboflavine. Les oligo-éléments par litre de bouillon comprenaient 2,7 mg de FeCl^.ôh^O; 0,8 mg de ZnSO^^b^O et de CuSO^.Sh^O; 0,7 mg de CoCl^.ôH^O et de Na2Mo04.21^0 ; 0,2 mg de H^BO-j et 0,5 mg de MnSO^.H^O.

La nature de la protéine immunoréactive exprimée par le phage Àm2-4 a été étudiée d'abord dans un lysogène isolé d'une infection de cellules Y1090 par croissance différentielle aux températures permissive (30°C) et non permissive (42°C). Pour l'analyse par transfert de Western (Western blot), des protéines synthétisées par ce lysogène, une culture de 50 ml a été réalisée à 30°C dans le milieu LB [Maniatis et al., v.plus haut, page 69] à une D.0. (550 my) de 0,5 et déplacées à 42°C pour induire la réplication du phage. Après 15 minutes à 42°C, IPTG a été ajouté jusqu'à, 10 mM, et l'incubation a été poursuivie à 37°C pendant 30 minutes. Les cellules ont été récoltées par centrifugation à 4°C et lysées par ébulli-tion pendant 5 minutes dans le tampon de l'échantillon de Laemmli (0,125 M de Tris, pH 6,8, 1% (p/v) de SDS, 1,4 m de bêta-mercaptoéthanol, 001% de bleu de bromophénol (p/v), 20% (v/v) de glycérol).

L'équivalent de 1,0 ml de culture a été résolu par électrophorèse en gel de polyacrylamide-SDS à 12,5%,

68

transféré électrophorétiquement sur la nitrocellulose et testé comme décrit plus haut avec un pool de trois anticorps monoclonaux (7D1, 7D4 et 20C6) qui ont identifié le phage Am2-4. Le développement du Western blot a révélé une protéine de fusion d'une taille supérieure à 150 kd gui était présente dans le lysogène induit (fig. 10, panneau B, bande 2). L'anticorps spécifique de la bêta-galactosidase a également réagi avec cette protéine de haut poids moléculaire et à une protéine d'environ 114 kd, la taille prévue de la bêta-galactosidase seule (voir fig. 10, panneau A, bande 2).

L'ADN du phage Am2-4 a été digéré par EcoRI pour produire une molécule d'ADN de 1,7 kb. Cette molécule a été sous-clonée dans un pool de plasmides linéarisés par EcoRI contenant les plasmides pEV-VRF1, 2 et 3 [Crowl et al., v.plus haut] et transformée dans E. coli souche MC1061 contenant le plasmide pRK248cIts, comme décrit plus haut. Les transformants ont été criblés pour l'expression d'une protéine immunoréactive après induction par la température en utilisant le pool de trois anticorps monoclonaux pour lesquels il a été montré qu'ils réagissent avec la protéine de fusion dans le lysogène Xm2-4. La protéine recombinante immunoréactive a encore été caractérisée par analyse par transfert de Western (Western blot) des lysats d'E. coli en utilisant un des trois anticorps monoclonaux du pool, 7D4. Il a été trouvé que chacune des colonies positives contient un ADN plasmidique avec l'insert prévu de 1,7 kb et commande la synthèse d'une protéine d'environ 65 kd après induction, comme déterminé par analyse par électrophorèse en gel de polyacrylamide-SDS.

Il a été trouvé que l'expression de cette protéine de 65 kd est relativement insensible aux variations dans

69

10

le milieu de croissance et du protocole d'induction. La protéine a été récupérée quantitativement dans le surnageant après désagrégation du culot cellulaire par les ult rasons.

Le plasmide d'expression contenant l'insert de 1,7 kb a été utilisé dans la production ultérieure d'une protéine recombinante et il est représenté schématique-ment sur la fig. 11. Ce plasmide a été multiplié dans des cellules hôtes MC 1061 lysogènes pour XcI857 (préparation en utilisant des méthodes standard pour la génération de lysogènes du phage lambda décrites par Arber et al., in Cold Spring Harbor Monograph, Lambda II, 1983, Hendrix et al., Eds., Cold Spring Harbor Labora-tories, Cold Spring Harbor, p. 450) à 30°C, pour maintenir l'état réprimé du promoteur dans le plasmide.

En utilisant des méthodes analogues, l'expression d'une protéine de 28 kd codée par un segment d'ADNc d'ookystes sporulants ayant environ 1,1 kb a été réalisée. Cette protéine s'est liée spécifiquement à l'anticorps monoclonal 8A2. L'expression d'une protéine de 45 kd codée par un ADNc d'ookystes sporulants d'environ 1,2 kb a également été réalisée. Cette protéine s'est liée spécifiquement à l'anticorps monoclonal 7B2.

20

25

5. ANALYSE DE SEQUENCES D'ADN

30 En général, un isolement à petite échelle d'ADN plasmi-

dique à partir de 1 ml de cultures saturées pendant une nuit a été effectué en utilisant le procédé de Birnboim et al. [Nucleic Acids Research 7_:1 513 (1979)]. Ce procédé permet l'isolement d'une petite quantité d'ADN à partir 35 d'une colonie bactérienne à des fins d'analyse. Des quantités

70

plus irtTpor tantes d'ADN plasmidique ont été préparées.en utilisant des cultures de 1 litre conformément à un protocole standard avec centrifugation avec le chlorure de césium [Maniatis et al., v.plus haut,page 93].

Les séquences d'ADN des ADNc de la banque d'ookystes sporulants ont été déterminées par la méthode du clivage chimique de Maxam et al., Methods in Enzymology 65:499 (1980) et par la méthode de terminaison de chaînes de Sanger et al., Proc . Natl. Acad . Sci . USA J7_4 ; 5 4 6 3 (1 977),

telle qu'elle a été modifiée pour l'ADN plasmidique double brin par Smith et al., Cell J_6 : 753 ( 1 979) et Wallace et al., Gene J_6:21 (1981). Dans le protocole de terminaison de chaînes, 7-deaza-dGTP [Barr et al., Biotechniques 4^:428 (1986)] a été utilisé en remplacement de dGTP pour éliminer les artefacts de compression de G-C.

Pour faciliter l'analyse des séquences, la molécule EcoRI de 1,1 kb de XS1-7 a été transférée dans le plasmide pEV-SEQ (fig. 12), qui a un lieur multisite (polylinker) à côté du site EcoRI de pEV-vrf3. Ce lieur multisite (polylinker) a été utilisé pour linéariser le plasmide au niveau des sites BamHI et Kpnl pour générer des délétions unidirectionnelles avec 1'exonucléase III [Henikoff, Gene 2_8:351 ( 1984)]. Le site Xbal dans le lieur multisite (polylinker) a été utilisé pour le marquage de l'extrémité 3'-terminale pour le séquençage de Maxam-Gilbert des délétions et l'amorce CGGTCGACTCGAGCCA a été utilisée pour le séquençage de Sanger. Cette amorce a été marquée 3 2

au P à son extrémité 5' terminale en utilisant 3 2

[y- P]ATP (ICN) et une polynucléotide kinase, comme décrit par Maniatis et al., v.plus haut, page 122.

I

71

La fig. 13 montre les sites de restriction dans la molécule EcoRI de 1,1 kb utilisé pour le séquençage de Maxam-Gilbert. La position des sites EcoRI dans la molécule de 0,9 kb sont également montrés, car ils ont été 5 également utilisés. Les points finals des délétions faites avec 11exonucléase III sont également montrés. Le séquençage a eu lieu soit à partir du site Xbal dans le lieur multisite de pEV-SEQ par la méthode de Maxam-Gilbert soit avec une extension d'amorce (fig. 12) par

10 la méthode de Sanger. Les deux brins de l'ADNc entier ont été séquencés par une ou les deux méthodes. En raison de la teneur élevée en G-C de l'ADN, les réactions de Maxam-Gilbert ont été habituellement fractionnées dans des gels polyacrylamide-urée à la fois à 8?a et à 15?o.

1 3

L'extension de l'amorce a été effectuée en incubant 1,5 yuig d'ARN poly(A)+ avec 2 pmoles de l'amorce d'oligo-nucléotide synthétique marquée à l'extrémité 5' terminale, GAGGTCTGCCATTTTGC, pendant 60 minutes à 42°C dans

20 50 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 8 mM de MgSO^, 0,1 M de NaCl,

2 mM de dithiothréitol, 2 mM de chaque désoxynucléotide triphosphate (dNTP, Pharmacia Fine Chemicals), 20 unités de RNasin (Promega Biotec, Madison, WI) et 20 unités de transcriptase inverse AMV (Pharmacia, Piscataway, NJ,

FLPCpure). Les produits ont été analysés dans les gels polyacrylamide-urée à 8?o utilisés pour l'analyse des séquences, avec l'ADN de pBR322 digéré par Hpall marqué 32

au P en tant que marqueur de la taille moléculaire.

30 Pour l'analyse des séquences, les produits primaires ont été élués du gel et analysés par la méthode du clivage chimique de Maxam et al., v.plus haut, ou des ddNTP ont été utilisés dans la réaction d'extension [Tolan et al., J.Biol.Chem.259:1127 (1984); Graves et al., J.Biol.Chem.

35 261 :1 1409 ( 1986)]. Les réactions ont été analysées dans des gels de polyacrylamide-urée à 8%.

c

72

La séquence nucléotidique de la molécule d'ADNc de 1,1 kb est représentée sur la fig. 14. La séquence de la molécule de 0,9 kb s'étend de la base 188 à la base 1082 dans cette molécule de plus grande taille.La séquence 5 des acides aminés prévue à partir de l'analyse du cadre de lecture ouvert de cette séquence nucléotidique est représentée sur la fig. 15. L'exactitude de la séquence des acides aminés prévue présentée sur la fig. 15 a été confirmée comme suit.

10

Des polypeptides synthétiques ont été préparés ayant des séquences d'acides aminés correspondant aux résidus 41-54 et 145-164 de la fig. 15. Des antisérums de lapin élaborés contre ces deux polypeptides ont été utilisés

15 dans l'analyse de transfert de Western (Western blot)

à la fois des protéines totales des sporozoïtes et d'un lysat du transform ant E. coli exprimant l'ADNc de 0,9 kb. Les anticorps dirigés contre les deux polypeptides se sont liés aux protéines dans les deux Western blots.

20

En utilisant des méthodes analogues, la séquence nucléotidique de l'insert de 1,7 kb codant pour la protéine de 65 kd dans le phage Am2-4 a été déterminée,

avec les résultats montrés sur la fig. 16. La séquence

2 S

des acides aminés prévue de la protéine codée par cette séquence d'ADN est représentée sur la fig. 17.Cette séquence a été confirmée par une analyse de la séquence d'acides aminés effectuée sur des polypeptides produits par digestion trypsique de la protéine de 65 kd exprimée,

30

comme décrit plus loin. Des régions dans la séquence totale d'acides aminés correspondant à certains de ces peptides sont soulignées sur la fig. 17.

I

35

73

Cû"Fieusement, on se serait attendu à ce que le cadre de lecture ouvert de la séquence d'ADN pour la molécule de 1,7 kb code pour une protéine d'environ 33.349 daltons. Cependant, le produit d'expression pro-5 venant de ce fragment d'ADN migre dans les gels de SDS avec un poids moléculaire apparent de 65 kd. La raison de cette différence entre la taille prévue et observée de la protéine est inconnue. Cette protéine est désignée ici par "protéine de 65 kd".

10

D'une façon analogue, la séquence nucléotidique etla séquence prévue des acides aminés de la molécule d'ADNc codant pour la protéine de 28 kd reconnue par l'anticorps monoclonal 8A2 ont été déterminée , avec les résultats présentés respectivement sur les fig. 18 et 19.

De même, la séquence nucléotidique et la séquence prévue des acides aminés de l'ADNc 7B2 de 1,2 kb ont été déterminées. Etant donné qu'un cadre de lecture ouvert ^ continu a été trouvé et que la protéine isolée à partir des sporozoïtes par immunoprécipitation est supérieure à 200 kd, la banque a été criblée pour des ADNc de plus grande taille, en utilisant l'ADNc de 1,2 kb comme sonde. Un ADNc de 3,2 kb a ainsi été obtenu, ayant la séquence

25

nucléotidique et la séquence prévue d'acides aminés représentées respectivement sur les fig. 20 et 21.

30

35

74

6. PURIFICATION ET CARACTERISAT ION DE LA PROTEINE DE 65 KD

6.1. PURIFICATION DE LA PROTEINE

i

5 Une fermentation à haute densité cellulaire de MC1061

d'E. coli (pRK248cIts) contenant le plasmide d'expression pEV/2-4 a été effectuée dans des fermenteurs de 10 litres dans un milieu 1,5 x M-9 en utilisant des protocoles standard d'induction de température, comme décrit plus 10 haut, après environ 4 heures de croissance à la température permissive. La masse cellulaire a été récoltée 5 heures après induction, donnant 500 grammes de bouillie cellulaire.

15 Cinquante grammes de la bouillie de cellules d'E.

coli ont été mis en suspension uniformément dans 500 ml de 10 mM de Tris-HCl, 5 mM d'EDTA, pH 8,0, et agités à 2-8°C pendant deux heures. On a fait passer la suspension par un homgénéiseur de Gaulin (APV Gaulin, Everett, 20 Massachusetts, U.S.A.) deux à trois fois à 7000 psi. Le lysat cellulaire a été centrifugé à 24.000 x g pendant une heure dans une centrifugeuse Sorvall RC-5 et le culot a été rejeté. Du sulfate d'ammonium solide a été ajouté au surnageant (concentration finale 80%). Le s u r -25 nageant a été maintenu ainsi à 4°C pendant deux heures,

puis centrifugé à 24.,000 x g pendant une heure. Le culot a été dissous dans 20 mM de phosphate de potassium, pH 6,8. Après centrifugation, le surnageant a été dialysé contre 20 mM de phosphate de potassium, pH 6,8.

30

Une colonne en verre Pharmacia (diamètre 5 cm x hauteur 10 cm) a été chargée avec un support de silice NuGel P-DE 200^ (200 angstrom, 40-60 ym, faible échangeur d'anions, Séparation Industries, Metuchen, NJ). Le gel a été équilibré avec 20 mM de phosphate de potassium,

75

pH 6,8. L'échantillon a été chargé (10 ml/min), lavé avec le tampon d'équilibration et élue avec 20 mM de' phosphate de potassium contenant 0,4 M de NaCl, pH 6,8. Les fractions de la colonne ont été analysées par transfert de Western (Western blotting) avec l'anticorps 7D4 pour détecter la protéine.

Une colonne d1immuno-immunité a été utilisée pour purifier encore la protéine de 65 kd. L'adsorbant pour cette colonne a été préparé en immobilisant l'anticorps monoclonal 7D4 sur un support de silice Nugel P-poly-aldéhyde (500 angstrom, 40-60 um, Séparation Industries, Metuchen, New Jersey, U.S.A.). Le procédé d'immobilisation a consisté en ce qui suit: 10 grammes de support polyaldéhyde ont été mis en suspension et lavés avec 0,1 M de phosphate de potassium, 0,1 M de NaCl, pH 6,8, et transférés quantitativement dans une fiole d'Erlen-meyer contenant 20 ml d'anticorps monoclonal 7D4 à une concentration de protéine de 8 mg/ml. Du cyanoborohydrure de sodium (4 mg) a ensuite été ajouté à la suspension. Le mélange a été agité avec ménagement à 4°C pendant 16 heures. Le gel a été filtré et lavé avec 0,1 M de phosphate de potassium, 0,1 M de NaCl, pH 6,8. Les filtrats rassemblés ont été vérifiés pour l'anticorps non lié. Les sites activés non couplés ont été bloqués en mettant en suspension le gel dans 20 ml de 1 M d'éthanolamine, pH 7,5. Du cyanoborohydrure de sodium (4 mg) a été ajouté à la suspension qui a été agitée ensuite à 4°C pendant 16 heures. Le gel a.été recueilli et lavé avec soin avec un tampon de couplage froid.

Pour réaliser la chromatographie d'immuno-affinité, une colonne (1 cm x 10 cm) a été chargée avec l'anticorps 7D4 immobilisé et équilibrée avec de la solution saline tamponnée au phosphate (PBS) froide contenant 0,1% de Triton x-100. Un pool des fractions de la colonne de NuGel

76

p

P-DE-2U0 contenant la protéine de 65 kd a été dilué- 2 x avec PBS contenant 0,1% de Triton X-100 et chargé sur la colonne avec un débit de 10 ml/min. Après le chargement,

le gel a été lavé avec PBS pour éliminer le matériel non

5 adsorbé. Le matériel immunoréactif adsorbé a été élué

avec un tampon de 0,3 M d'acide acétique, 0,1 M de NaCl,

pH 2,7. La protéine a ensuite été concentrée dans un

R

appareil Amicon Stircell en utilisant une membrane YM 10 (Amicon, Div. W.R. Grâce & Co., Danvers, Massa--1 chusetts, U.S.A.).

La pureté de la protéine a été déterminée par élec-trophorèse en gel de polyacrylamide-SDS, comme décrit 15 par Laemmli [Nature 2 2 7:680 (1970)]. Le gel a été coloré au bleu de Coomassie. Une analyse par transfert de Western (Western blot) a également été effectuée en utilisant l'anticorps monoclonal 7D4 avec un conjugué peroxydase de raifort anti-souris de chèvre. Les résultats 20 sont présentés sur la fig. 22. Les bandes 2, 3, 4 et 5 contiennent la protéine purifiée de deux préparations. Les bandes 1 et 6 contiennent un mélange de protéines marqueurs du poids moléculaire ayant les poids moléculaires indiqués à gauche et à droite de la figure. Dix micro-25 grammes de protéine ont été analysés dans chaque bande.

Sur la fig. 22, on peut voir que la protéine purifiée a migré dans le gel SDS en tant que bande principale ayant un poids moléculaire apparent d'environ 65 kd, avec 30 des bandes mineures ayant une mobilité plus élevée et plus faible.

35

77

6 7Z. DETERMINATION DU POINT 150ELECTRIQUE

Dix microgrammes de la protéine de 65 kd purifiée ont été soumis à une focalisation isoélectrique dans un gel de focalisation isoélectrique préformé fourni par LKB Instruments, Gaithèrsburg, Maryland, U.S.A. Un mélange de protéines standard ayant des points isoélectriques connus a été analysé en même temps. Le gel a été expérimenté pendant environ 2 heures à 50 mA, 1500 V, conformément aux instructions du fabricant , en utilisant un gradient de pH,de 3,5 à 9,5.

Après la fin de 11 électrofocalisation, le gel a été coloré au bleu de Coomassie pour détecter les bandes de protéines. Le point isoélectrique de la protéine purifiée a ensuite été déterminé en mesurant la position dans le gradient de pH en relation avec les positions des standards des protéines. Le point isoélectrigue de la protéine ainsi déterminé a été de 4,6.

6.3. ANALYSE DE LA COMPOSITION EN ACIDES AMINES

L'analyse de la composition en acides aminés a été réalisée en utilisant une réaction après la colonne avec la fluorescamine, comme décrit par Pan et al., dans Methods of Protein Microcharacterization, 1 986, Shively, éd., The Humana Press, pp. 105-119. Des échantillons contenant '3 y g de la protéine de 65 kd ont été hydrolysés HC1 6 N contenant 4% d'acide thioglycolique à 110°C pendant 20 à 24 heures sous vide. Les valeurs de cystéine ont été déterminées après oxydation à l'acide performique. Les résultats sont présentés dans le tableau 3.

78

TABLEAU 3

ANALYSE DE LA COMPOSITION EN ACIDES AMINES DE LA PROTEINE DE 65 KD

ACIDE AMINE MOLES EN POUR CENT

Asp 6.06

Thr 6.07

Ser 7.27

Glu 18.24

Pro B.3 5

Gly 16.76

Ala 11.71

Cys 4.4 5

Val 4.8 8

Met i 2.08

Ile 2.17

Leu 3.22

Tyr 2.20

Phe 2.13

His 1.07

Lys 2.72

Arg 3.61

Trp ND

ND = non déterminé

79

6.4. ANALYSE DES SEQUENCES N- ET C-TERMINALES

Deux cents picomoles de la protéine (telle qu'elle a été déterminée par analyse de la composition en acides 5 aminés) ont été soumis à une analyse N-terminale en utilisant la méthode de Hewick et al., J. Biol.Chem. 256: 7990 (1981) et un séquenceur modèle 470A des Applied Bio-systems (Applied Biosystems, Inc., Foster City, California, U.S.A.). La séquence N-terminale ainsi déterminée était 10 M-N-K-N-S-7-L-G-G-F-7-S-M-Q-E-S-P-P-P-. Les identités des résidus des acides aminés aux positions indiquées par des points d'interrogation sont incertaines car la récupération de PTH-Cys a été faible et les résidus de cystéine pourraient être impliqués dans les ponts disulfures 15 [Hewick et al., J.Biol.Chem. 256:7990 ( 1 981 )].

L'analyse C-terminale a été effectuée sur 1200 picomoles de la protéine de 65 kd par le déroulement de la digestion par la carboxypeptidase Y, comme décrit par Hayashi, Methods in Enzymology 4^7:84 ( 1 977). La carboxypeptidase Y (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) a été utilisée à une concentration de 0,8 yg/350 yl dans un tampon d'acétate de sodium 0,05 M, pH 5,9, et des parties aliquotes ont été prélevées après 0, 2, 5, 10, 20 et 30 inin. pour analyse. Les parties aliquotes des échantillons ont été acidifiées avec HCl pour arrêter la réaction ultérieure, puis soumises à l'analyse des acides aminés, comme décrit plus haut. Cette analyse a montré que la séquence des acides aminés à l'extrémité C-terminale est probablement (Met, Trp)-Ala-Ser. Il a été observé que le tryptophane augmente en même temps que la méthionine, mais Trp est difficile à quantifier dans l'analyseur à f1uorescamine car il a une faible réactivité avec la fluorescamine. C'est pourquoi, les positions relatives se Trp et Met n'ont pas pu être déterminées avec certitude par cette analyse.

80

10

20

25

30

6.5. ANALYSE DES PEPTIDES APRES DIGESTION TRYPSIQUE

En partie pour vérifier la séquence d'acides aminés prévue à partir de la séquence nucléotidique de l'ADNc codant pour la protéine de 65 kd, une partie de la protéine a été digérée par la trypsine (Cooper Biochemical, Philadelphia, Pennsylvania, U.S.A.) et les peptides résultants ont été séquencés comme décrit plus loin .

Les digestions trypsiques ont été effectuées pendant une nuit à 37°C sur 148 jUg de protéine dans le bicarbonate d'ammonium 0,2 M, pH 8, en utilisant un rapport enzyme/ substrat de 1:30 (poids ou base molaire?). Les peptides ainsi générés ont été séparés dans un système HPLC Waters 15 en utilisant une colonne C-18 Altex ultrasphere de 250 x 4,6 mm (Beckman Instruments, Fullerton, CA) avec un gradient de 0 à 55% d'acétonitrile croissant dans l'acide trifluoroacétique à 0,1% (base). Avant la séparation par HPLC, le produit de la digestion a été réduit avec du bêta-mercaptoéthanol pendant 30 minutes à 37°C pour couper tous les ponts disulfures dans les peptides. L'effluent de la colonne a ét^/contrôlé à 215 m y en utilisant un détecteur Laboratory Data Control (Laboratory Data Control, Rivera Beach, Florida, U.S.A.). La colonne HPLC a résolu 8 pics principaux, comme le montre la fig. 23A.

35

Chaque pic a d'abord été analysé par analyse des acides aminés comme décrit plus haut pour déterminer à la fois la quantité et la composition des peptides.

Ensuite, la plupart des pics de la colonne HPLC ont été séquencés par dégradation d'Edman automatisée, en utilisant un séquenceur en phase gazeuse Modèle 470A des Applied Biosystems. Les dérivés acides aminés de phénylthio-hydantoïne (PTH) ont été identifiés dans un système HPLC

<

81

en utilisant une colonne Altex ultrasphere C-18 comme décrit par Hawkes et al. [Anal.Biochem. 120 ; 302 ( 1982)] ou dans un analyseur on-line d'acides aminés PTH Applied Biosystems modèle 120A.

5

Les séquences d'acides aminés de certains de ces peptides sont indiquées sous les régions soulignées de la fig. 17. Le nombre de chacun de ces peptides (correspondant aux nombres de pics HPLC) est indiqué par un 10 chiffre encerclé à côté de la séquence correspondante.

L'incertitude de l'identité de certains des résidus dans les séquences des peptides est indiquée par un point d'interrogation en ces positions, bien que les analyses de la composition en acides aminés des peptides aient 15 ' montré que les acides aminés indiqués aux positions correspondantes de la séquence prévue étaient présents dans les peptides. L'incertitude de l'identité de certains des résidus peptidiques était due à la faible réactivité du tryptophane avec la fluorescamine.

20

Le peptide 6, qui correspond à l'extrémité N-terminale de la protéine complète de 65 kd, contient 4 résidus à son extrémité N-terminale qui sont codés par des nucléotides dans le plasmide d'expression. L'analyse 25 du peptide 8 a donné une séquence d'acides aminés semblable à celle du peptide 3, mais dépourvue des 4 résidus C-terminaux, suggérant que c'était probablement la conséquence d'une digestion try.psique incomplète. Le peptide 5 n'a pas été séquencé parce que l'analyse de 30 la composition des acides aminés de ce peptide a montré qu'elle était la même que pour le peptide 6, moins les 3 premiers résidus d'acides aminés à l'extrémité N-terminale.

35

L'analyse HPLC du produit de digestion trypsique

82

effectuée comme décrit plus haut mais sans réduction' préalable au mercaptoéthanol, a donné un profil d'élution dans lequel les pics 4, 7 et 8 étaient absents (fig. 23B). Cette observation suggère que ces peptides contenant de la cystéine intervenaient probablement dans la formation des ponts disulfures dans la protéine non réduite.

10 7. IMMUNISATION DE LA VOLAILLE

7.1. UTILISATION DE L'ANTIGENE DE 65 KD

1 5

20

25

30

35

Pour déterminer si l'administration de la protéine recombinante purifiée de 65 kd pouvait protéger les poulets contre l'exposition aux ookystes sporulés d'Eimeria tenella, une série d'expériences d'immunisation a été réalisée. Dans ces expériences, des poulets Leghorn âgés d'un jour.à trois semaines (Avian Services, Frenchtown, New Jersey, U.S.A.) ont été gardés dans un local propre et soignés par un personnel qui n'avait pas de contact avec d'autres oiseaux jusqu'au moment de l'exposition. Les oiseaux étaient gardés dans des éleveuses chauffées électriquement jusqu'à l'âge de 3 ou 4 semaines, après quoi ils ont été transférés dans des cages de croissance.

Pendant toute la durée des expériences, les oiseaux recevaient à volonté un aliment de démarrage pour poulets de chair sans addition de médicaments et de l'eau de boisson. Au moment de l'exposition aux ookystes, les oiseaux ont été transférés dans un autre bâtiment où ils ont été gardés jusqu'à la fin des expériences. L'état clinique des animaux a été vérifié au moins trois fois par semaine avant l'immunisation et quotidiennement après

83

l'immunisation. Les oiseaux ont été identifiés individuellement au moyen de bandelettes sur les ailes à l'âge de 3 ou 4 semaines avant l'assignation au hasard aux divers groupes d'essai.

5

Divers lots de la protéine de 65 kd purifiée par chromatographie par immuno-affinité comme décrit plus haut ont été utilisés en qualité d ' immunogène. Ces lots d'immunogène contenaient une activité d'endotoxine 10 bactérienne comprise entre environ 0,3 et environ 50

unités endotoxine par yg de protéine, l'activité étant déterminée et définie comme décrit dans la Pharmacopée des Etats-Unis, 21ème Révision, 1985, United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, Md., pp. 116 5— 1167. La protéine a été dissoute dans un tampon K^HPO^ 0,02 M, pH 6,8, avant emploi et diluée avec le même tampon suivant les besoins.

La sérumalbumine bovine (BSA, Pentex) a été utilisée comme témoin. A cause de la présence d'activité pyrogène dans l'immunogène utilisé, à peu près les mêmes quantités d'une telle activité ont été ajoutées à tous les témoins BSA pour tenir compte de tous effets non spécifiques qui pourraient être dus à cette activité. Cette activité

25

pyrogène a été ajoutée à la BSA sous forme de lysat d'E. coli non transformés, préparé en déasgrégeant E. coli par les ultrasons puis en filtrant le matériel sur un filtre Millipore de 0,45 y.

30 Des échantillons dilués de BSA témoin ou : . l'anti gène d'Eimeria ont été combinés avec un volume égal d'adjuvants et mélangés avec soin dans des seringues en verre munies d'aiguilles de calibre 18 avant l'administration. Les adjuvants complet et incomplet de Freund ont été uti-35 lisés respectivement pour les immunisations primaires et

84

de rappel. Les deux adjuvants ont été fournis par GIBCO Grand Island, New York, U.S.A.

Les immunisations primaires ont été faites par voie sous-cutanée à la partie postérieure du corps, à la base du cou, lorsque les oiseaux étaient âgés de 4 semaines. Certains oiseaux ont reçu également des immunisations de rappel à l'âge de 6 semaines. Le volume injecté était com pris entre 0,4 et 2,4 ml. Pour de plus grands volumes, la dose a été divisée en deux injections. Deux ou trois semaines après la dernière vaccination, les oiseaux ont été exposés à 25.000 ou 50.000 ookystes sporulés d'E. tenella, administrés oralement. Sept jours après l'infection, les oiseaux survivants ont été sacrifiés, autopsiés et évalués pour les lésions macroscopiques.

Tous les oiseaux morts pendant les expériences ont également été autopsiés. Les diagnostics ont été posés et les lésions intestinales ont été évaluées comme suit: 0 = nor mal, 1 = infestation légère, 2=infestation modérée, 3 = infestation sévère et 4 = mort. Les lectures obtenues ont été récapitulées en tant que degré moyen d'infection pour chaque groupe d'oiseaux. Les oiseaux ont également été pesés au moment de l'infection et 7 jours après l'infection. Certains oiseaux n'ont été vaccinés ni avec BSA ni avec l'antigène coccidien, ils ont été traités comme témoins non vaccinés, infectés ou non infectés.

Les résultats de deux de ces expériences sont présentés dans le tableau 4.

85

TABLEAU 4

EFFET DE L'IMMUNISATION SOUS-CUTANEE DE POULETS AYANT REÇU UNE OU DEUX VACCINATIONS D'ANTIGENE DE 65 KD RECOMBINANT PURIFIE

Gain/perte

Nbre d' Traite- Dose (ug) à l'âge de Indice lé- de poids c) oiseaux ment a) 4 sem. 6 sem. sionnel b) (grammes)

Expérience 1

10

IUC

-

-

2.8

-25

8

Antigère

3.15

-

2.4

-44

10

Antigène

12.25

-

2.5

-10

6

BSA

17.5

-

3.0

+40

10

UUC

-

-

0

+ 107

10

IUC

-

-

2.9

■ 40

8

Antigène

3.15

1.6

2.0e

-15

10

Antigène

17.5

13.2

1.8®

+5

8

BSA

12.25

13.2

2.5

-13

10

UUC

-

-

0

+ 87

,

Expérience 2

8<*

IUC

-

-

2.6

-11

10

Antigène

4

-

2.2

+65

10

Antigène

20

-

2.0

+ 19

9

Antigène

100

-

2.9

•♦14

10

BSA

100

-

2.4

-7

10

IUC

-

-

2.5

•♦15

10

Antigène

4

4

2.1

+35

10

Antigène

20

20

2.0

+74

8

Antigène

100

100

2.1

+ 81

10

BSA

100

100

2.4

469

4

UUC

-

-

0

-3

a - IUC, Antigène, BSA et UUC désignent respectivement les témoins infectés (avec des ookystes) non immunisés, la protéine de 65 kd purifiée et la sérumalbumine bovine et les témoins non infectés non immunisés.

b - Dans l'Expérience 1, les oiseaux ayant reçu une seule immunisation ont été exposés 3 semaines plus tard à 50.000 ookystes sporulés d'E. tenella; ceux ayant reçu une vaccination de rappel ont été exposés 2 semaines plus tard à 25.000 ookystes. Dans l'Expérience 2, la programmation des expositions aux ookystes a été la même, mais 25.000 ookystes ont été administrés aussi bien aux oiseaux ayant été vaccinés une seule fois qu'à ceux ayant reçu un rappel. Des témoins infectés non immunisés

86

ont été utilisés pour chaque expérience et ont reçu des nombres identiques d'ookystes sporulés au même âge, sept jours avant le sacrifice. Les résultats sont basés sur un score de 0-4, comme décrit dans le texte.

c - Ces valeurs représentent la différence entre le poids au moment de l'infection et le poids 7 jours après l'infection.

d - Ce groupe contenait initialement 9 oiseaux, mais un oiseau est mort après une semaine.

e - p - 0,05 en comparaison de IUC.

10

Les données du tableau 4 montrent que la vaccination avec la protéine de 65 kd a généralement donné des indices lésionnels numériquement plus bas en comparaison des témoins 15 infectés non immunisés. Deux groupes d'oiseaux ayant reçu des vaccinations de rappel dans l'Expérience 1 (indiqués par un e en exposant dans le tableau) ont présenté des indices lésionnels réduits, qui étaient statistiquement significatifs. Dans d'autres cas, le degré de réduction 2 0 des indices lésionnels n'était pas aussi important, mais le gain pondéral était toutefois généralement amélioré chez les oiseaux vaccinés.

Pour déterminer si une troisième vaccination peut 25 encore renforcer la protection, une expérience a été

réalisée dans laquelle des groupes de 8 oiseaux ont été traités comme témoins infectés ou non infectés, non vaccinés ou vaccinés avec BSA ou la protéine des mérozoïtes à l'âge de 3 et 5 semaines ou à l'âge de 3, 5 et 7 semaines. ^ Les deux premières vaccinations ont été faites avec l'adjuvant complet de Freund. Lorsqu'une troisième vaccination était faite, l'adjuvant incomplet de Freund a été utilisé. Les inoculations ont été faites par voie sous-cutanée, comme décrit plus haut.

35

c

87

Deux semaines après la dernière vaccination, chaque oiseau a été exposé à 25.000 ookystes sporulés d'E. tenella par voie orale. Le poids corporel a été déterminé au moment de l'exposition et 7 jours plus tard, moment où les oiseaux ont été sacrifiés et les lésions caecales ont été évaluées. Les résultats sont présentés dans le tableau 5.

10

1 5

20

TABLEAU 5

EFFET DE L'IMMUNISATION SOUS-CUTANEE DE POULETS AYANT RE9U DEUX OU TROIS VACCINATIONS D'ANTIGENE DE 65 KD RECOMBINANT PURIFIE

Traite- Dose !(ug)à l'âge de ment a) 3 sem. 5 sem. 7 sem.

IUC

Antigène

Antigène

Antigene

Antigène

BSA

BSA

UUC

IUC

Antigène Antigène BSA

Gain/perte Indice lé- de poids c) sionnel b) (grammes)

4 4 20 20 20 20

4 20 20

4 4 20 20 20 20

4 20 20

4

20 20

2.13 1.75 2.88 1.88 1.88 3.13 2.38 0

2.25 2.25 2.25 1.75

+59 + .1.22 + 128 +87 +69 + 106 +131 + 131 + 23 +91 + 86 478

a - IUC, Antigène, BSA et UUC désignent respectivement les témoins infectés (avec des ookystes) non immunisés, la protéine de 65 kd purifiée, la sérumalbumine bovine et les témoins non infectés non immunisés.

b - Les oiseaux ont été exposés 2 semaines après la dernière vaccination à 25.000 ookystes sporulés d'E. tenella, ou sept jours avant le sacrifice pour les témoins infectés non immunisés. Ces témoins étaient âgés de sept et neuf semaines pour les études de double et triple immunisation, respectivement, lorsqu'ils étaient infectés. Les résultats sont basés sur un score de 0-4, comme décrit dans le texte.

c - Les valeurs représentent la différence entre le poids au moment de l'infection et le poids 7 jours après l'infection.

35

I

88

Lets données du tableau 5 montrent que l'immunité n'a pas été améliorée par l'administration d'une troisième vaccination. Une plus grande protection, comme indiqué par les indices lésionnels caecaux réduits, a été con-5 férée par l'antigène en comparaison des témoins infectés non traités ou des oiseaux vaccinés avec BSA.

Pour déterminer si des voies d'administration autres que l'injection sous-cutanée peuvent donner de meilleurs 10 résultats, deux doses de protéine de 65 kd ont été administrées trois fois, à deux semaines d'intervalle, à des groupes de 8 poulets Leghorn de 3 semaines, en utilisant les voies d'administration intradermique, sous-cutanée, intramusculaire, orale et anale. Deux semaines après la dernière administration d ' immunogène, les oiseaux ont été exposés à 25.000 ookystes sporulés d'E. tenella administrés oralement. Les oiseaux ont été sacrifiés une semaine après l'exposition et les indices lésionnels caecaux ont été déterminés.

20

Les injections sous-cutanées ont été administrées comme décrit plus haut. Les injections intramusculaires ont été faites profondément à la face extérieure de la cuisse gauche. Les injections intradermiques ont été 25 faites dans le côté antérieur de l'aile droite. Pour l'administration orale, on a utilisé une aiguille à extrémité en boule de calibre 18 et de 5 cm de long, déposant l'inoculum dans le jabot de l'oiseau. Pour l'administration anale, on a utilisé une aiguille à extrémité en olive de calibre 18 et de 5 cm de longueur, introduite sur toute sa longueur dans l'overture cloacale. Après l'administration orale et anale, les oiseaux ont été maintenus dans une position respectivement debout et retournée pendant plusieurs minutes pour éviter une expulsion possible de l'inoculum.

30

35

89

La forme pour l'administration sous-cutanée était celle decrite plus haut, l'adjuvant complet de Freund étant utilisé pour l'injection primaire et l'adjuvant incomplet de Freund pour les injections de rappel. Les formes pharmaceutiques pour les autres voies d'administration contenaient la protéine aux doses indiquées dans un tampon I^HPO^ 0,02 M, pH 6,8. Les résultats de cette expérience sont présentés dans le tableau 6.

TABLEAU 6

EFFET DE DIFFERENTES VOIES D'ADMINISTRATION SUR LA VACCINATION

DE POULETS AVEC L'ANTIGENE DE 65 KD

Gain/perte

Traitement/

Dose (ug)

à 1'

âge de

Indice lé-

de poids voie a)

3 sem. 5

sem.

7 sem.

sionnel b)

(grammes)

IUC

-

—

-

2.9

+58

Antigène'sc

5

5

5

2.3

+66

Antigêrï/SC

25

25

25

2.8

+68

BSA/SC

25

25

25

2.8

+47

Antigèrï/IM

5

5

5

2.3

+33

Antigène'IM

25

25

25

2.3

+72

Antigèrtf'A

5

5

5

2.5

+53

Antigèrï/A

25

25

25

2.6

+50

Antigène'O

5

5

5

1.8d

+67

Antigèrtf'O

25

25

25

2.5

+87

Antigène'ID

5

5

5

2.1

+26

Antigène'ID

25

25

25

1.9d

+ 114

UUC

-

-

-

0

+ 114

a - IUC, Antigène, BSA et UUC désignent respectivement les témoins infectés (par des ookystes) non immunisés, la protéine de 65 kd purifiée, la sérumalbumine bovine et les témoins non infectés non immunisés. SC, IM, A, 0 et ID désignent respectivement l'administration sous-cutanée, intramusculaire, anale, orale et intradermique.

b - Les oiseaux ont été exposés 2 semaines après la dernière vaccination à 25.000 ookystes sporulés d'E. tenella, ou sept jours avant le sacrifice pour les témoins infectés non immunisés. Ces témoins étaient âgés de 9 semaines au moment de l'infection. Les résultats sont basés sur un score de 0-4, comme décrit dans le texte.

c - Les valeurs représentent la différence entre le poids au moment de l'infection et le poids 7 jours après l'infection.

35

d - p < 0,05 en comparaison de IUC.

90

Le tableau 6 montre que les indices lésionnels caecaux les plus bas ont été observés chez les oiseaux immunisés avec 5 g d'antigène par voie orale et avec 2 5 ^g d'antigène par voie intradermique. Ces résultats étaient 5 statistiquement significatifs. Des indices lésionnels numériquement plus bas ont été observés pour d'autres voies d'administration et d'autres doses, indiquant une tendance protectrice. Mais les différences entre ces indices et ceux des oiseaux IUC n'étaient pas statistique-10 ment significatives.

Il est possible que le fait de ne pas observer de relations doses-réponses linéaires dans les expériences qui précèdent ait été dû à des différences des contami-15 nants traces et/ou de la teneur en pyrogènes dans les pré parations d'antigène de 65 kd, ou à d'autres facteurs.

7.2. VACCINATION AVEC UN VECTEUR VACCINAL

20

25

30

Pour obtenir un moyen plus efficace d'immunisation des poulets avec les antigènes d'E. tenella de cette invention, l'ADNc de 1,1 kb codant pour la protéine de 20 kd reconnue par l'anticorps monoclonal 6A5 (fig. 14) et la molécule d'ADNc de 1,1 kb codant pour la protéine de 28 kd reconnue par l'anticorps monoclonal 8A2 (fig.18) ont été clonés dans le virus vaccinal et utilisés pour vacciner les poulets, comme décrit-plus loin.

7.2.1. Préparation du vecteur

Tous les : recombinants réalisés étaient basés sur la recombinaison homologue dans le -locus de la thymidine kinase (TK) virale, comme décrit par Mackett et ai. [Proc Natl.Acad.Sci.USA 7^:7415 (1982)]. Le locus TK a été 35 relié au fragment Hindi II J du virus vaccinal (VV)

91

[Hruby et al., J.Virol. 4 3:40 3 ( 1982)], et une partie de ce fragment a été séquencée [Weir et al., J.Virol. 46:530 (1983)].

i

5 Pour construire un vecteur pour la recombinaison,

le fragment HindIII J du VV a été sous-cloné dans pUC8 (fig. 24a). Cette construction a été clivée avec Hpall. Les fragments ont été traités avec un fragment Klenow de l'ADN polymérase d'E. coli (Klenow) et clivés de nou-10 veau avec HindIII, et le morceau contenant le gène de

TK virale a été isolé de 1'agarose à bas point de fusion. Le fragment isolé a été lié dans le site HindIII et EcoRI à extrémités franches (traitement 51) d'un vecteur pUC8 (fig. 24b, à droite). Ensuite, le site HindIII a été éli-15 miné en traitant l'ADN digéré par HindIII avec Klenow et en liant à nouveau le fragment du vecteur. Pour l'insertion du promoteur de VV (appelé promoteur 7,5K), le vecteur a été clivé par Clal et EcoRI.

20

25

30

Le promoteur 7,5K du VV est localisé dans un des plus petits fragments Sali du virus [Venkatesan et al., Cell 2_5:805 ( 1 981 )]. Le fragment correspondant a été cloné dans M13mp8. Un clone a été sélectionné dans lequel la transcription était orientée vers le site EcoRI de M13mp8 (fig. 24a, à gauche). L'ADN a été clivé par Seal et les lieurs (linkers) Smal, BglII ont été ajoutés et l'ADN a été lié de nouveau (fig. 24b). Le fragment EcoRI-AccI contenant le segment du promoteur viral a été isolé de la construction M13 et lié dans le fragment pUC8-TK décrit plus haut conduisant au vecteur pUC8-TK-7,5K*. Ce nouveau vecteur a été digéré avec BglII et EcoRI.

Pour créer un vecteur avec des sites de clonage multiples, un polylinker approprié a été inclus 35 dans la construction ci-dessus. A cette fin, le polylinker

C

92

contena—dans le M13tg131 (Amersham) a été choisi (fig. 24d). Le fragment du polylinker a été isolé en digérant l'ADN phagique par BglII et EcoRI et le fragment a été inséré dans la construction pUC8-TK-7, 5K*, conduisant au vecteur de base final pour la recombinaison d'antigènes étrangers dans le VV (fig. 24c) qui est pl)C8-TK-7, 5K.

Le fragment EcoRI codant pour la protéine de 28 kd qui se lie à l'anticorps monoclonal 8A2 ne contient pas la séquence pour la partie N-terminale de la protéine. Le codon d'initiation original et la séquence de tête pour la protéine manquent.

Pour compenser ces régions manquantes, deux constructions différentes ont été réalisées et testées pour l'expression. Dans la première construction, un codon d'initiation in-frame a été généré par délétion de la partie du polylinker dans le vecteur de base pour la recombinaison pUC8-TK-7,5K (fig. 24c). Le vecteur a été digéré par EcoRV et Smal, éliminant une partie du polylinker (fig. 24d), puis lié de nouveau. Par cette manipulation, le codon ATG contenu dans le site de restriction SphI a été placé dans le cadre de lecture correct pour la région codante de la protéine des ookystes sur le fragment EcoRI. Le succès de la manipulation a été confirmé par le séquençage du nouveau fragment du polylinker. La séquence prévue des acides aminés de l'extrémité N-terminale de la protéine codée par cette construction est représentée sur la fig. 25A.

Pour compenser dans la séquence d'ADN non seulement le codon d'initiation mais aussi la séquence de tête manquante, le fragment EcoRI a été placé dans le cadre de lecture correct derrière une séquence de tête d'un antigène paludéen. L'antigène paludéen utilisé pour isoler

93

la séqiTënçe de tête était la protéine de 190 kd décrite en tant que Ro-33 [Certa et al., EMBO J. 6_:4137 ( 1 987 )]. Il faut noter, cependant, que d'autres séquences de tête, telles que des séquences de tête coccidiennes, pourraient être utilisées dans le même but.

Pour isoler le fragment d'ADN contenant la séquence de tête, l'ADN de Ro-33 a été digéré par Dral. Le fragment contenant les sites de reconnaisance pour les enzymes de restriction PvuII et HindIII a été isolé et digéré par HindIII. La construction du vecteur original pl_IC8-TK-7,5K (fig. 24c) a été clivéepar Sali, traité avec Klenow, puis digéréepar HindIII. Dans ce fragment de vecteur, le fragment de tête de l'antigène paludéen Dral-HindlII isolé a été cloné. Cette construction a été utilisée pour exprimer une protéine de fusion entre la protéine de 190 kd de P. falciparum et l'antigène d'E. tenella reconnue par l'anticorps 8A2 et codée par le fragment EcoRI. La séquence prévue d'acides aminés de l'extrémité N-terminale de cette protéine de fusion est représentée sur la fig. 25B.

Le fragment EcoRI codant pour la protéine de 28 kd a été cloné dans le site EcoRI du polylinker contenu dans le vecteur de base (fig. 24c). Les constructions contenant le fragment avec l'orientation correcte ont été multipliées et utilisées pour la recombinaison dans le virus vaccinal.

A cause de la façon dont le site d'initiation pour 4a traduction du fragment a été introduit dans le vecteur de base (voir plus haut), on s'attendait à ce que deux séquences N-terminales différentes pour le gène soient exprimées par le virus vaccinal recombinant (fig. 25).

Alors que seulement 3 acides aminés supplémentaires

94

10

20

25

30

(Met, Arg et Trp) sont ajoutés à la séquence originale dans la première construction (fig. 25A), dans la deuxième, un total de 47 acides aminés dérivés de la séquence de tête de l'antigène paludéen de 190 kd sont fusionnés à l'extrémité N-terminale du polypeptide reconnu par l'anticorps monoclonal 8A2 (fig. 25B). Par traitement au niveau du site de clivage potentiel de la séquence de tête, 19 des acides aminés supplémentaires sont éliminés, conduisant à une protéine mature commençant par Val, Thr, His.

Le fragment EcoRI codant pour la protéine de 20 kd reconnue par l'anticorps monoclonal 6A5 contient la séquence complète. Ce fragment, sans autre manipulation, a été cloné dans le site EcoRI du vecteur de VV, comme 15 décrit plus haut.

La recombinaison des gènes ci-dessus codant pour les antigènes coccidiens dans une souche de virus vaccinal WR a été effectuée en utilisant un procédé à deux étapes pour la sélection du virus recombinant.

35

Dans la première étape, des cellules de singe CV1

ont été cultivées dans le milieu I (Milieu Essentiel Minimal d'Eagle (MEM), 5% de sérum de foetus de veau (FCS, d'Amimed),

pénicille/streptomycine (respectivement 100 unités/ml et

100 yg/ml) et 2 mM de glutamine; tous les réactifs de Gibco]

2

dans des plaques de culture de 8 cm jusqu'à une confluence de 80-90?o. Le milieu a été enlevé et remplacé par 0,2 ml de suspension de virus contenant la souche ts N7 du virus vaccinal thermostable [Drillen et al.,

Virology 1 31 : 385 ( 1 983)] à 0,1 unité formant colonies (PFU)/cellule. Les plaques ont été laissées à température ambiante pendant 1 heure, puis 2 ml de Milieu I ont été ajoutés à chaque plaque et les plaques ont été incubées

O

95

pendant 2 heures à 33°C (la température de croissance permissive pour ce virus) dans un incubateur sous CO^ [Kieny et al., Nature 31 2: 1 6 3 (1984)].

Une demi-heure avant la fin de cette période d'incubation, un précipité de phosphate de calcium contenant l'ADN a été préparé. Celui-ci contenait du tampon HeBS [280 mM de NaCl, 1,5 mM d'hydrogénophosphate de sodium, 50 mM de HEPES], 200 ng d'ADN de virus vaccinal souche WR et 200 ng de gène d'antigène coccidien purifié contenant l'ADN plasmidique, dans un volume total de 0,55 ml. Chaque ADN a été ajouté dans 1 fd de tampon TE (10 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM d'EDTA). A cette solution, on a ajouté goutte-à-goutte et en tournant doucement, 0,55 ml de solution de chlorure de calcium 250 mM. Ce mélange a été laissé à température ambiante pendant 20 minutes.

!

Après l'incubation de 2 heures, le milieu a été aspiré des plaques de culture et remplacé par 0,25 ml du précipité de calcium ci-dessus contenant l'ADN et les plaques ont été laissées à température ambiante pendant une heure. Ensuite, 2 ml de Milieu I ont été ajoutés à chaque plaque et les plaques ont été incubées à 39,5°C dans un incubateur à 5 ?o de CO^ (Kieney et al., v.plus haut). A cette température, le virus ts N7 ne peut pas se répliquer, entraînant une sélection des virus qui se sont recombinés au moins dans le locus ts7. Etant donné que le phosphate de calcium est éventuellement inhibiteur de la croissance cellulaire, le milieu a été éliminé après les 2 heures d'incubation ci-dessus et lés cellules ont été lavées 3 fois avec 1 ml de PBS en faisant tourner légèrement. La solution finale de PBS a été aspirée, et 2 ml de Milieu I ont été ajoutés à chaque plaque. L'incubation à 39,5°C dans un incubateur à CO^ a été poursuivie pendant 2 jours.

96

Après l'incubation de deux jours, les plaques de-culture avec le milieu et les cellules ont été placées à -30°C pendant une courte période, puis décongelées, les cellules adhérant encore ont été grattées du fond de la plaque i et la solution a été traitée par les ultra-' sons comme décrit plus haut. Cet homogénat a été utilisé pour la deuxième étape de sélection.

Dans cette étape, le milieu d'un gazon presque confluent de cellules 143B TK humaines (ATCC CRL 8303) pous-

2

sant dans des plaques de culture de 8 cm a été éliminé et remplacé par 0,2 ml d'homogénat non dilué ou d'homo-génat dilué à 1:5 ou 1:30 (vol/vol) avec PBS. On a laissé se poursuivre l'infection des cellules TK- à température ambiante pendant 1 heure.

Après 1'incubation, 2 ml de Milieu II semi-solide (Milieu I avec des acides aminés non essentiels (GIBCO; n° d'ordre 043-1140), des vitamines essentielles (GIBCO; n° d'ordre 042-1120) et 1% d'agarose) contenant 0,1 mg/ml de bromodésoxyuridine (BUdR, Sigman Chemical Co.) ont été ajoutés aux cellules. Les plaques ont ensuite été incubées pendant 16-24 heures à 37°C dans un incubateur à CO^. Une deuxième couche de Milieu II semi-solide, contenant 0,2?o de rouge neutre en plus des composants ci-dessus, a été déposée sur les cellules et les plaques ont été incubées pendant une autre période de 16-24 heures. Des plages incolores, nettement visibles, sont apparues, et le virus a été récupéré en tant que clones individuels en perçant la région de la plage avec une pipette Pasteur (purification des plages). Le virus récupéré de cette façon a été cultivé sur des cellules CV1 comme décrit plus haut et soumis à un deuxième et un troisième tour de purification sur des cellules 143B TK . Ces virus purifiés par plages ont été cultivés et purifiés comme décrit plus haut.

97

PSTTr tester l'expression de l'antigène coccidien par le virus recombinant, des cellules CV1 infectées par le virus recombinant ont été sédimentées dans une centrifugeuse de table (Hettich Mikrorapid K, 100% pendant 3 5 minutes à 20°C) et le culot a été lavé deux fois avec PBS, recentrifugé et remis en suspension dans PBS. La suspension cellulaire a été déposée sur une lame de microscope en verre (Flow) et on l'a laissée sécher. Une deuxième méthode a consisté à faire pousser les cellules ^ CV1 directement sur les lames de microscope (Miles Lab-Tek 4808), à infecter les cellules avec le virus et à incuber pendant 1-2 jours. Les cellules ont ensuite été lavées avec PBS pour les débarrasser du milieu de culture et on les a laissées sécher sur les lames à température ' ambiante. Pour fixer les cellules, les lames ont été plongées dans l'acétone pendant au moins une heure à -30°C et on les a laissées sécher à température ambiante.

Des anticorps monoclonaux anti-antigène coccidien de souris dilués dans PBS ont été étalés sur les lames de microscope de façon que les cellules soient couvertes uniformément par le liquide. Les lames ont été placées dans une chambre humide à 37°C pendant une heure, puis lavées plusieurs fois avec PBS. Sans laisser sécher les lames, un deuxième anticorps (IgG anti-souris de chèvre marqué au FITC, Nordic) également dilué dans PBS a été étalé sur les lames et les lames ont été placées dans une chambre humide à 37°C pendant une heure pour permettre aux anticorps de réagir. Après plusieurs lavages avec PBS, on a laissé les lames sécher complètement. Quelques gouttes de glycérol à 20% (vol/vol) dans l'eau ont été pipettées sur la lame et un couvre-objet en verre (Menzel 24x60) a été placé dessus. La fluorescence de la préparation cellulaire a ensuite été monitorée sous lumière UV à l'aide d'un microscope (Zeiss ICM 405, objectif F10 ou Planapo 63).

98

Le-virus souche WR peut se multiplier dans presque tous les types de cellules [Drillen et al., J.Virology _2_8_:843 (1978)] et sa multiplication peut être observée d'après la formation de plages. Mais dans la plupart des cas, des cellules de fibroblastes d'embryon de poulet (CEF) ont été utilisées pour préparer de grandes réserves de virus.

Pour obtenir des cellules CEF, des embryons de 11 jours ont été isolés des oeufs, libérés de leurs extrémités,

coupés en petits morceaux et remis en suspension dans une solution de trypsine à 0,25% (Difco) pendant 2 heures à température ambiante. Cette suspension a été diluée avec un volume de Milieu I et filtrée sur un tamis cellulaire (Bellco, 150 mesh) et les cellules ont été sédimentées (centrifugeuse de table Hermie, 5 minutes, 2000 t/min, température ambiante). Le culot cellulaire a été remis en suspension dans 1/4 du volume original de Milieu I et cette suspension de cellules CEF a été inoculée dans des plaques de culture cellulaire. Suivant la densité cellulaire de départ, on a laissé les cultures se développer pendant 1-2 jours et elles ont été utilisées pour l'infection directement ou après 1-2 autres passages. On peut trouver un bref exposé de l'obtention de telles cultures primaires dans Frehney, Culture of Animal Cells, Alan R.

Liss Verlag, Nelw York 1983, Chapter II, p. 99.

Pour l'infection, le milieu a été éliminé des cellules CEF confluant à 80-90% poussant dans des flacons de culture de 175 cm (Falcon 3028) et les cellules ont été incubées dans une solution PBS contenant le virus (0,1 PFU/cellule), 0,01 ml/cm ) pendant une heure à température ambiante (20°C) (PBS/Dulbecco, Amimed). Du Milieu I a ensuite été ajouté (0,2 ml/cm ) et les flacons ont été incubés à 37°C pendant 2-3 jours jusqu'à ce que

99

environ 8 0% des cellules soient lysés. La solution de-réserve ainsi obtenùe a été conservée directement avec les cellules et le milieu dans les flacons de culture d'origine à -30°C avant la purification du virus.

Les étapes de purification suivantes ont été utilisées pour obtenir une préparation virale exempte de tous les composants spécifiques des cellules hôtes. Les cultures de cellules infectées qui avaient été stockées à -30°C ont é t: é décongelées et les cellules restantes ont été enlevées de la surface du flacon en secouant ou en grattant. Les cellules et le virus ont été séparées du milieu par centrifugation (centrifugeuse Sorvall,

rotor GSA,, 1 heure à 5000 t/min, 10°C). Le culot des cellules et des particules virales a été remis en suspension dans PBS 10-20 fois le volume du culot) et recentrifugé comme ci-dessus. Ce culot a ensuite été remis en suspension dans 10 fois le volume de tampon RSB (10 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM de KC1, 1 mM de MgCl2). .

Pour lyser les cellules intactes restantes et débar-

i rassen-le virus des membranes cellulaires, la suspension ci-dessus a été soumise à l'act.ion des ultrasons (deux fois, 10 secondes à 60 watts, température ambiante, Lab-sonic 1510 avec sonde de 4 mm). Le mélange a ensuite été centrifugé dans un rotor GSA Sorval pendant 3 minutes à 3000 t/min, 10°C. Une suspension virale exempte de noyaux cellulaires et de débris cellulaires de grande taille a ainsi été obtenue. Le surnageant a été soigneusement enlevé et le culot a été remis en suspension dans le tampon RSB, retraité aux ultrasons et centrifugé comme ci-dessus.

Le second surnageant a été combiné avec le premier, étalé sur une couche de 10 ml de saccharose à 35% (Fluka,

100

dans 19—mM de Tris-HCl, pH 8,0) et centrifugé pendant 90 minutes à 14.000 t/min dans un rotor Kontron TST 28. 38/17 (analogue au Beckman SW 27) à 10°C. Le surnageant a été décanté et le culot de particules virales a été remis en suspension dans 10 ml de Tris-HCl 10 mM, pH 8,0,

traité aux ultrasons pour homogénéiser le mélange (deux fois pendant 10 secondes à température ambiante, comme décrit plus haut) et chargé sur un gradient par étapes pour une purification ultérieure.

Le gradient par étapes consistait en parties aliquotes de 5 ml de saccharose dans 10 mM de Tris-HCl, pH 8,0 des concentrations suivantes: 20%, 25%, 30%, 35% et 40%. Ce gradient a été centrifugé dans un rotor Kontron TST 28. 38/17 pendant 35 minutes à 14.000 t/min, 10°C. Plusieurs bandes contenant des particules virales étaient visibles dans la région de 30%-40% de saccharose. Cette région du grandient a été enlevée (10 ml), la solution de saccharose a été diluée avec PBS (20 ml) et les particules virales ont été sédimentées (rotor Kontron, 90 minutes à 14.000 t/min, 10°C). Le culot contenait presque exclusivement des particules virales (comme on a pu en juger par comparaison de la mesure de la D0 et de l'essai des plages, voir plus loin). Ce culot a été remis en suspension dans PBS pour que la concentration du virus soit en g

moyenne de 1-5 x 10 PFU/ml. Cette réserve virale a été utilisée soit directement soit diluée avec PBS.

Pour déterminer la concentration du virus et la pureté de la réserve virale, deux méthodes ont été utilisées. La concentration absolue des particules virales a été obtenue de façon commode en mesurant la densité optique (D0) de la solution de réserve dans un spectro-

photomètre (Uvikon 860) à 260 nm (D0/260), où 1 D0/260

1 0

est égal à environ 1,2 x 10 particules par ml [Joklik,

101

Virology _1_8:9 (1962)]. La concentration du virus a également été obtenue en titrant le virus sur les cellules (essai des plages), en supposant qu'une seule particule virale sur 60 peut infecter une cellule.

Pour titrer la concentration du virus sur des cellules cultivées, les cellules CEF ont été cultivées sur le Milieu I dans des plaques de culture en plastique de 8 cm (Falcon 3001). Lorsque les cellules ont atteint une confluence de 80-90%, le milieu a été éliminé, remplacé par 0,2 ml d'une solution virale diluée dans PBS et laissées à température ambiante pendant 1 heure. La solution virale de réserve a été diluée de dix fois par étapes. Après incubation à température ambiante, 2 ml de Milieu I semi-solide (Milieu I + 1% d'agarose) ont été ajoutés à chaque plaque et les plaques ont été placées pendant 16-24 heures dans un incubateur à CO2. Ensuite, 2 ml de Milieu I semi-solide contenant 0,2% de rouge neutre (Fluka 72210) ont été étalés pour colorer les cellules vivantes et les plaques ont été incubées pendant une nouvelle période de 16-24 heures. Les plages incolores ont ensuite été déccomptées sous un microscope.

7.2.2. Immunisation des poulets

Pour déterminer si des vecteurs de virus vaccinal portant des gènes codant pour les protéines d'E. tenella qui se lient spécifiquement aux anticorps monoclonaux 8A2 et 6A5 peuvent protéger les poulets contre l'infection par des ookystes sporulés d'une souche pathogène d'E. tenella (souches T2-750/7, T7-776/1 et T6-771 ) , les tests suivants ont été effectués.

Tous les tests ont été menés en utilisant des coquelets d'une race pondeuse (Warren) fournis par l'accouveur

1 01a

E. Wuttnrich, Belp, Suisse. Les poussins d'un jour ont été élevés dans des éleveuses en batterie chauffées jusqu'aux âges indiqués, puis ils ont été répartis dans différents groupes expériméntaux et gardés exempts de coccidiose dans des cages à fond grillagé. Pendant toute la durée des tests, ils ont reçu un aliment pour élevage de poulets de chair du commerce, à base de farine de maïs, de blé et de soja (protéines brutes 21 ,7 ?o ) .

Dans le premier test, le 42ème jour, des poulets de même poids ont été répartis au hasard en trois groupes de six oiseaux chacun. Trois jours plus tard, le poulets ont été immunisés avec le virus de la Vaccine recombinant ou du type sauvage au moyen de deux injections de 50 yl

1 0

chacune de la suspension virale correspondante (10 PFU/ml dans PBS), administrées par voie sous-cutanée dans l'aile droite. Deux virus vaccinaux recombinants ont été utilisés; les deux contenaient l'ADN codant pour la protéine d'E. tenella se liant spécifiquement à l'anticorps 8A2. L'un des virus (désigné 37K M3) contenait la séquence de tête de l'antigène paludéen de 190 kd; l'autre virus (désigné 37K K3) n'avait pas cette séquence de tête. La souche vaccinale WR type sauvage a sérvi de témoin négatif.

Une semaine après la première injection, une injection de rappel a été faite dans l'aile gauche des poulets dans des conditions identiques, en utilisant le même type de virus vaccinal que précédemment. Une semaine après le rappel (59ème jour), des échantillons de sang de 2 ml chacun ont été prélevés chez tous les poulets et le sérum a été analysé pour déterminer la présence d'anticorps spécifiques par le test ELISA. En résumé, les cupules d'une plaque de microtitration (Immunoplaque F96 NUN) ont été enduites avec une suspension de sporozoïtes

102

1 0

1 5

2 0

25

d'E. tenella (10.000 cellules/ml) et incubés avec le.

sérum des poulets à des taux de dilution croissants.

Comme agents de détection, des immunoglobulines antipoulet de chèvre conjuguées à la peroxydase de raifort (Kirkegaard and Perry Laboratory, Gaithersburg, USA) ont été utilisées avec la tétraméthylbenzidine comme substrat. La couleur bleue se développant a été lue dans Titertek Multiscan MCC/340 Mkll à une longueur d'onde de 450 nm. Le titre a été défini comme étant la valeur inverse de celui de la dilution sérique, donnant une densité optique représentant au moins le double de la valeur de base (tableau 7 ) .

Quatre semaines après la première injection (73ème jour), les poulets ont été exposés à 50.000 ookystes sporulés. L'inoculum de coccidies, en suspension dans 1 ml de sérum physiologique, a été administré par voie orale dans le jabot des poulets à l'aide d'une aiguille émoussée sur une seringue étalonnée. Le 80ème jour, tous les poulets ont été sacrifiés, autopsiés et évalués pour les lésions macroscopiques dans les caecums (score 0 = normal, 1 = infestation légère, 2 = infestation moyenne, 3 = lésions sévères, 4 = poulet mort de coccidiose). Les fèces ont été recueillies quantitativement les deux derniers jours du cycle infectieux et le nombre d'ookystes excrétés a été déterminé dans un échantillon représentatif de fèces. Les résultats sont présentés dans le tableau 7.

30

35

c

103

TABLEAU 7

VACCINATION DE POULETS DE 45 JOURS AVEC DES VIRUS VACCINAUX EXPRIMANT LA PROTEINE DE 28 KD

Titre

Nbre de d'anti- Indice lésion-

polilets corps nel caecal

Excrétion journ. d'ookystes/ pou-

Virus3

(X.10~6)

let

37 K3 37 M3

Type sauvage

6^ 6

6

430 1360 200

1.33 1.50 2.67

149 107 271

a - Le virus 37 M3 contenait la séquence de tête de l'antigène paludéen de 190 kd; le virus 37 K3 ne la contenait pas. Le virus de type sauvage était la souche vaccinale WR.

b - Deux poulets ont été sacrifiés avant l'infection par la coccidiose.

Le tableau 7 montre qu'en comparaison du virus témoin du type sauvage, les deux virus contenant l'ADN codant pour la protéine de 28 kd ont induit la production d'anticorps spécifiques du parasite et ont conféré une certaine protection contre 1'infestation par les ookystes, du point de vue à la fois d'une réduction de l'indice lésionnel caecal et d'une, excrétion réduite d'ookystes. En ce qui concerne la protection contre la coccidiose, les deux virus ont été également efficaces; cependant la construction avec la séquence de tête paludéenne (37 M3) a généré un titre plus élevé d'anticorps dirigés contre l'antigène des sporozoïtes que la construction standard du virus (37 K3) chez le poulet, indiquant un avantage de la construction par fusion.

104

Dans le deuxième test, des coquelets ont été élevés et immunisés comme décrit plus haut, mais en commençant le 22ème jour. Une dose virale de 2 x 10® PFU dans 100 ml de PBS a été administrée à ce moment-là. Les virus utilisés provenaient de différentes préparations de virus vaccinal contenant l'ADN codant pour la protéine de 28 kd sans (désigné 37 K5) ou avec (désigné 37 M19) la séquence de tête paludéenne. Le même virus souche WR du type sauvage a été utilisé comme témoin. Des injections de rappel dans les ailes droites aux mêmes doses ont été administrées une ou deux semaines après la première injection.

Le 57ème jour (5 semaines après la première injection), tous les poulets ont été exposés à 50.000 ookystes sporulés. Une semaine plus tard, les poulets ont été sacrifiés, autopsiés et évalués comme décrit plus haut. Le gain pondéral journalier après l'infection et l'excrétion d'ookystes pendant les deux derniers jours ont également été déterminés. Les résultats sont présentés dans le tableau 8.

105

TABLEAU 8

VACCINATION DE POULETS DE 22 JOURS AVEC DES VIRUS EXPRIMANT LA PROTEINE DE 28 KD

Excrétion journ.

Moment du

Gain pondé

Indice d ' ookyste

rappel

Nbre de ral journa lésionnel poulet

Virus3

(semaines)

Doulats lier (a)

caecal

(x 10"6)

37 K5

1

8

11.45

2.38

21.0

37 M19

1

8

15.61

2.13

24.0

Type sauvagfe

8

8.77

2.50

33.1

37 K5

2

8

5.14

2.25

22.3

37 M19

2

8

11.79

2.13

32.7

Type sauvagè

8

8.34

2.63

37.0

a - Le virus 37 M19 contenait la séquence de tête de l'antigène paludéen de 190 kd. Le virus 37 K5 ne le contenait pas. Le virus de type sauvage était la souche vaccinale WR.

Le tableau 8 montre que, en comparaison du virus témoin du type sauvage, les deux virus contenant l'ADN coccidien ont conféré une certaine protection contre l'in-festation par les ookystes pathogènes du point de vue du gain pondéral, de l'indice lésionnel caecal et de l'excrétion d'ookystes. Les deux virus étaient presque également efficaces. L'administration du rappel 1 semaine après l'injection primaire a provoqué un meilleur gain pondéral et une plus faible excrétion d'ookystes, mais les indices lésionnels caecaux étaient pratiquement les mêmes pour les deux schémas de rappel.

106

10

1 5

20

25

D»os le troisième test, l'effet de trois vaccinations a été examiné. Des poulets ont reçu, à l'âge de

21 jours, des injections (ailes droites) de deux parties g

aliquotes de 50 yl (3 x 10 PFU/ml) de suspensions de virus vaccinal du type sauvage ou de virus contenant l'ADN codant pour la protéine de 20 kd qui s'est liée spécifiquement à l'anticorps monoclonal 6A5. Tous les poulets ont reçu des injections de rappel de la même dose le 28ème jour dans les ailes gauches. Certains poulets ont reçu des injections de rappel supplémentaires de la même dose dans les ailes des deux côtés le 35ème jour. D'autres poulets ont été gardés sans vaccination, comme •témoins.

Le 42ème jour, des échantillons de sang ont été pré-

i-

levés chez tous les poulets et analysés par le test ELISA pour détecter la présence d'anticorps spécifiques dirigés contre le stade sporozoïte du parasite, comme décrit précédemment. Le 49ème jour (4 semaines après la première injection), tous les poulets ont été exposés à 50.000 ookystes sporulés. Une semaine plus tard, les poulets ont été sacrifiés, autopsiés et évalués pour les lésions caecales macroscopiques, comme décrit plus haut. Le poids corporel a été enregistré chaque semaine pour le calcul du gain pondéral journalier, et les fèces ont été recueillies pendant les deux derniers jours du cycle infectieurs pour déterminer l'excrétion d'ookystes. Les résultats sont présentés dans le tableau 9.

30

35

1 07

i

TABLEAU 9

VACCINATION DE POULETS DE 21 JOURS AVEC DES VIRUS EXPRIMANT LA PROTEINE DE 20 KD

Titre

Gain pon

Indice

Excrétion d'

Nbre d'

Nbre de d'anti déral lésion.

ookystes/g

VV

Injections jDOule.ts corps journ.(g)

caecal faeces (xio-6)

rVV

2

6

210

2.9

2.33

1.69

rVV

3

6

7200

4.2

1.67

1.32

WT

3

6

560

-4.1

2.67

2.09

N

-

6

0

-3.8

2.83

1.75

rVV avec ADN coccidien WT type sauvage N aucun

Les données du tableau 9 montrent que lorsque le virus produisant l'antigène coccidien a été injecté trois fois, il a généré un titre élevé d'anticorps dirigés spécifiquement contre les protéines des sporozoïtes. De plus, les deux traitements avec ce type de virus recombinant ont assuré une certaine protection contre l'infection par les ookystes du point de vue d'un gain pondéral accru, d'un indice lésionnel caecal réduit et d'une plus faible excrétion- d'ookystes. La comparaison des résultats obtenus avec des témoins non vaccinés montre que la vaccination avec le virus vaccinal du type sauvage n'a pas conféré de protection. C'est pourquoi, la protection conférée par le virus contenant l'ADN coccidien était spécifique et n'était pas due à une stimulation immunitaire généralisée provoquée par l'exposition au virus vaccinal lui-même. Trois vaccinations ont été plus efficaces que deux.

108

Be-aucoup de modifications et de variations de cette invention peuvent être faites sans s'éloigner de son esprit et de sa portée, comme pourront le voir les spécialistes en la matière. Les réalisations spécifiques décrites ici ne sont présentées qu'à titre d'exemple, et l'invention ne doit être limitée que par les termes des revendications jointes.

Claims (13)

109 REVENDTCATIONS ;

1. Procédé pour la préparation d'une protéine ayant un ou plusieurs déterminants immunoréactifs et/ou antigéniques d'un antigène de surface d'Eimeria, ce procédé . comprenant :

(a) la culture d'un organisme hôte transformé contenant un vecteur recombinant comprenant une séquence d'ADN codant pour une protéine ayant un ou plusieurs déterminants immunoréactifs et/ou antigéniques d'un antigène de surface d'Eimeria, cet antigène de surface ayant un poids moléculaire apparent de 28, 37, 120 ou de plus de 200 kilodaltons et se liant spécifiquement à un ou plusieurs anticorps monoclonaux déposés à l'American Type Culture Collection et ayant reçu les n° de dépôt HB 9707 à HB 9712, dans des conditions dans lesquelles la séquence d'ADN

ou son fragment est exprimée; et

(b) l'isolement de la protéine à partir de la culture.

i

2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel un orgnisme hôte transformé contenant un vecteur recombinant comprenant une séquence d'ADN codant pour une protéine ayant la séquence d'acides aminés représentée sur la fig. 15 ou un équivalent fonctionnel de celle-ci est utilisé.

3. Procédé selon la revendication 1, dans lequel un organisme hôte transformé contennt un vecteur recombinant comprenant une séquence d'ADN codant pour une protéine ayant la séquence d'acides aminés représentée sur la fig. 17 ou un équivalent fonctionnel de celle-ci est utilisé.

110

4. Procédé selon la revendication 1, dans lequel un organisme hôte transformé contenant un vecteur recombinant comprenant une séquence d'ADN codant pour une protéine ayant la séquence d'acides aminés représentée sur

5 la fig. 19 ou un équivalent fonctionnel de celle-ci est. utilisé.

5. Procédé selon la revendication 1, dans lequel un organisme hôte transformé contenant un vecteur recom-

^ binant comprenant une séquence d'ADN codant pour une protéine ayant la séquence d'acides aminés représentée sur la fig. 19 ou un équivalent fonctionnel de celle-ci est utilisé.

6. Procédé pour la préparation d'un organisme hôte transformé capable d'exprimer une séquence d'ADN codant pour une protéine comme défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 5, ce procédé comprenant la transformation de l'organisme hôte par un vecteur recom-

20

binant comprenant ledit ADN d'une manière connue en soi.

7. Procédé pour la préparation d'anticorps dirigés contre une protéine comme défini dans l'une quelconque

^ des revendications 1 à 5, ce procédé comprenant l'injection de ladite protéine d'une manière connue en soi à un animal qui est capable d'élaborer une réponse imuni-taire contre ladite protéine et l'isolement des anticorps produits par des méthodes connues dans la profession.

30

8. Vaccin pour l'immunisation de la volaille contre la coccidiose, comprenant une ou plusieurs protéines, comme défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 5 et un excipient physiologiquement accepte table.

111

9. Utilisation d'une protéine, comme défini dans l'une quelconque des revendication 1 à 5, pourla préparation d'un vaccin capable de protéger la volaille contre lacoccidiose.

10. Protéine ayant un ou plusieurs déterminants immunoréactifs et/ou antigéniques d'un antigène de surface d'Eimeria, chaq'ue fois préparée par un procédé comme revendiqué dans l'une quelconque des revendications 1 à 5.

11. Organisme hôte transformé capable d'exprimer une séquence d'ADN codant pour une protéine, comme défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 5, chaque fois préparée par un procédé comme revendiqué dans la revendication 6.

12. Anticorps dirigé contre une protéine, comme dé^ fini dans l'une quelconque des revendications 1 à 5, chaque fois préparée par un procédé comme revendiqué dans la revendication 7.

13. L'invention telle qu'elle est décrite dans ce qui précède. ORIGINAL

5

10

25

en

contenant

.. page*

Renvois Lmot rayé r»u'

30

26 y», Bduîi Princesse Charlotte

T&ONTE-CARLO P»r procuration de

F. HOFFMANN LA ROCHE & CIE S.A. .

35