NO166800B - Fremgangsmaate ved fremstilling av antibiotika x-14868a, x-14868b, x-14868c, og x-14868d ved fermentering av nocardia x-14868. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av polyeterforbindelsene antibiotika X-14868A, X-14868B, X-14868C og X-14868D med den generelle formel

hvor, for antibiotikum X-14868A, R^ er metyl, R2 er hydrogen, er metyl og R4 er hydrogen; hvor, for antibiotikum X-14868B, R^ er metyl, R2 er hydrogen,

R3 er metyl og R^ er metyl; hvor, for antibiotikum X-14868C, R^ er hydrogen, R2 er hydrogen, R3 er metyl

og R4 er hydrogen; og, for antibiotikum X-14868D, R1

er metyl, R2 er metyl, R^ er hydrogen og R^ er hydrogen, og farmasøytisk foredragelige salter derav.

Videre inngår fremstillingen av det nye antibiotikum X-14868C og farmasøytisk fordragelige salter derav, natriumsaltet med de følgende fysikalske karakteristika: 1) et infrarødt spektrum som fremgår av fig. 3; 2) et smeltepunkt på 172-175°C (natriumsalt);

3) en spesifikk rotasjon på

4) en mikroanalyse på og fremstillingen av det nye antibiotikum X-14868D og farma-søytisk fordragelige salter derav, hvor natriumsaltet har de følgende fysikalske karakteristika: 1) et infrafødt spektrum som fremgår av fig. 4; 2) et smeltepunkt på 194-195°C (natriumsalt);

3) en spesifikk rotasjon på

4) en mikroanalyse på

Disse fire antibiotiske forbindelser erholdes ifølge oppfinnelsen ved en fremgangsmåte hvor man dyrker en subkultur av stammen Nocardia X-14868 ATCC 31585 i en vandig karbohydratoppløsning inneholdende et nitrogenholdig næringsmiddel, ved nøytral pH og ved en temperatur på 20-35°C, under neddykkede aerobiske betingelser og deretter separere og isolere sluttproduktet fra oppløsningen, og,om ønsket, konvertere disse til et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

I de her brukte strukturformler betyr Me betegnelsen me-

tyl .

Organismen som frembringer antibiotika1 ene ifølge foreliggende oppfinnelse er. en ny art kalt Nocardia sp. X-14868.

En kultur av den levende organisme som er gitt laboratorie-betegnelsen X-14868, er blitt deponert i American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA og tilført deres permanente samling av mikroorganismer som ATCC 31585. Kulturen er identifisert som en stamme av Nocardia.

De nye mikroorganismer ble isolert fra en prøve samlet fra sandstrand i Colloroy, Australia. En representativ stamme av Nocardia sp. X-l'4i868 har følgende karakteristika:

Generelle Karakteristika

Nocardia sp. X-14868i er karakterisert ved sin mangel på luftsporedannelse, fragmentering av gram-positiv substrat-mycelium etter flere dagers inkubasjon og celleveggsammen-setning av meso-diaminopimelinsyre, galaktose, arabinose og ribose.

Vekstkarakteristika

Organismen ble dyrket på standard ISP media (Difco) beskrevet av Shirling og Gottlieb "Methods for' Characterization of Streptomyces Species", Intern. J. System. Bacteriol., 16, s.313-340, 1066, såvel som forskjellige media som ble brukt for å karakterisere kulturen, og hvilke er angitt ne-denunder :

Gjærekstrakt:

Gjærekstrakt, 1,0 %|-glukose, 1,0 %^-agar, 1,5 %;

pH 6,8

Glukose-gjær-ekstrakt-pepton:

Glukose, 0,3%; gjær-ekstrakt, 0,5%; pepton, 0,5%;

CaC03, 0,75%; agar, 1,5%; pH 7,0.

Glukose-asparagin:

Glukose 1,0%; asparagin, 0,05% ;. K2HP0.4 , 0,05% ;

agar, 1,5%; pH 6,8

Sukrose-nitrat:

Sukrose, 1,0%; NaNO^, 0,2%; K2HP04, 0,1%;

MgS04.7H20, 0,05%; KC1, 0,05%; agar, 1,5%.

Media som ble anvendt i andre forsøk var sådanne fra de følgende referanser:

Forsøkene ble gjort ved 28°C og 37°C for nesten alle me-dier. Fargebestemmelser ble foretatt etter 2 og 4 ukers inkubasjon.

Karbonforbruk ble målt ved Shirling og Gottlieb's metode (ovenfor) ved bruk av ISP-9 (Difco) medium.

En 48 timer gammel ISP-1 qrøtkultur av X-14868 ble sentrifugert og homogenisert for å gi en vasket suspensjon for inokulering.

Organismenes evne til å vokse ved 10, 28, 36, 45 og 50°C ble undersøkt ved inokuleringsgrøt av ISP-1 (Difco) medium. Cellevegganalyse av isomeren av diaminopimelinsyre ble ut-ført etter metoden til Becker et al., Appl. microbiol., 12, 421-423, 1964. For sukkerinnholdet i celleveggen ble metoden til Lechevalier og Lechevalier, Actinomycetales, Ed.

H. Prauser, Gustav Fischer, Jena, s. 311-316, 1970 fulgt. Nokardomykolinsyreanalyse ble utført ved en liten modifi-kasjon av metoden til Lechevalier, Lechevalier, og Horan, Can. J. Microbiol. 19:965-972, 1973.

Resultater

Mikroskopisk undersøkelse. Stammen X-14868 gir et sub-stratmycel som fragmenterer etter noen dagers utstrakt my-celutvikling. Det gir et luftmycel bestående av snorlignen-de tuster, men sporer ble ikke funnet.

Cellevegganalyse. Celleveggen inneholder mesoisomeren av diaminopimelinsyre såvel som galaktose og arabinose (celle-veggtype IV i klassifiseringen til Lechevalier et al., Adv. Appl. Microbiol., 14, 47-72, 1971). Organismen viser seg å gi nokardomykolinsyrer. Disse morfologiske og kjemiske kriterier henfører X-14868 til familien Nocardia.

Makroskopisk undersøkelse. Tabell 1 sammenfatter vekst-mengden, sporuleringsgraden, luftmassefarge, farge av reversert substrat-mycel og nærvær av løselig pigment fremstilt av stammen X-14868 på forskjellige faste media etter 4 ukers inkubering ved 28°C. Fysiologiske karakteristika. Stammen X-14868 hydrolyser-te gelatin og kasein, men ikke stivelse. Kulturen var be-standig mot en 10 enhets skive av penicillin samt 0,005 % lysozym oppløst i grøten når undersøkt ifølge metoden til Gordon, J. Gen. Microbiol., 45, 355-364, 1966. Stammen peptoniserte fullstendig i lakmusmelk, ingen melaminproduk-sjon ble påvist på ISP 1, 6 eller 7.

Tabell 2 angir resultatene av karbonforbruk på ISP 9 (Difco) av stammen X-14868 ved 28°C etter én måneds inkubering.

Tabell 3 er en liste av diagnostisk viktige, for det meste metaboliske egenskaper.

Stammen X-14868 kan adskilles fra andre Nocardia-arter på grunn av de biokjemiske karakteristika som angitt i tabell 4. Disse artene er valgt for sammenligning fordi de utgjør den eneste gruppen innen slekten Nocardia med hvilken X-14868 har noen grad av fenotyp affinitet.

Man kan se i tabell 4 at meget få biokjemiske data fore-ligger for fire av artene, nemlig N. transvalensis, N. formica.,N. petroleophila og N. saturnea. Imidlertid er

disse artene meget forskjellig fra X-14868. N. transvalensis er angitt å være meget lik N. brasiliensis, som inngår i tabell 4. N. formica er muligens feilplassert i slekten Nocardia og ligner mere på slekten Streptomyces. N. petroleophila og N.. saturnea er to meget forskjellige arter med liten affinitet til andre Nocardia arter. Medlemmer av

disse to arter kan leve i et karbonfritt medium på bekost-ning av atmosfærisk karbondioksyd, og dette er ikke til-fellet med andre arter, innbefattet X-14868.

De farmasøytisk fordraglige salter av antibiotikum X-14868 kan fremstilles ved konvensjonelle midler. Disse salter fremstilles fra den frie syreformen til antibiotikummet ved velkjente metoder på området, f.eks. ved å vaske den frie syre i løsning med en egnet base eller salt. Eksempler på slike farmasøytisk fordragelige basiske substanser som kan danne salter i foreliggende oppfinnelseshensikt innbefatter alkalimetallbaser, slik som natriumhydroksyd, kaliumhydroksyd, litiumhydroksyd og lignende; jordalkali-metallbaser, slik som kalsiumhydroksyd, bariumhydroksyd og lignende; og ammoniumhydroksyd. Alkalimetall- eller jordalkalimetallsalter egnet for dannelse av farmasøytisk akseptable salter kan innbefatte anioner, slik som karbo-nater, bikarbonater og sulfater.

Nocardia X-14868 fremstiller forbindelsen X-14868A ved

dyrkning under passende betingelser. En fermenteringsgrøt som inneholder Nocardia X-14868 fremstilles ved å inokulere sporer eller mycel av organismen som produserer forbindelsen X-14868A i et passende medium og deretter dyrke under aerobe betingelser. For fremstillingen av X-14868A

er dyrkning mulig på et fast medium, mens for fremstilling i store mengder foretrekkes dyrkning i et flytende medium. Dyrkningstemperaturen kan variere over et bredt område, 20-35°C, innenfor hvilke organismen kan vokse, men en temperatur på 26-30°C og hovedsakelig nøytral pH foretrekkes. I den submerse aerobe fermentering av organismen for fremstilling av antibiotikummet X-14868A , kan mediet inneholde som karbonkilde en kommersielt tilgjengelig glycerid-olje eller et karbohydrat slik som glycerol, glukose,

maltose, laktose, dekstrin, stivelse, etc. i ren eller rå tilstand og som; nitrogenkilde, et organisk materiale, så som soyamel, "distiller's solubles", peanøttmel, bomulls-frømel, kjøttekstrakt, pepton, fiskemel, gjærekstrakt, mais-støpevæske, etc, og om ønsket uorganiske nitrogenkilder såsom nitrater og ammoniumsalter. Det kan også inneholde mi-neralsalter slik som ammoniumsulfat, magnesiumsulfat, natriumklorid, kaliumklorid, kaliumfosfat, kalsiumkarbonat, og lignende,og buffermidler så som natriumcitrat eller fosfat og spormengder av tungmetallsalter. I luftgjennomblå-ste submerse dyrkningsmetoder brukes et anti-skummemiddel så som flytende paraffin, fettoljer eller silikonforbindel-ser fortrinnsvis. Mere enn én type karbonkilde, nitrogenkilde eller anti-skumkilde kan brukes for fremstilling av antibiotikumme.t X-14868A.

Den følgende tabell 5 angir den antimikrobielle aktivitet til antibiotikummet X-14868A og de tre bikomponenter X-14868B, X-14868C og X-14868D. Som angitt i tabell 5 har antibiotikum X-14868A og dets tre bikomponenter denL egenskap av de nedsetter veksten til be-stemte gram-positive bakterier. De vil derfor være anvendelige i vaskeløsninger for sanitære formål så som ved vask av hender og rensning av utstyr, gulver eller innbo i kon-taminerte rom eller laboratorier.

De følgende tabell 6 angir den antikokkidale virkning sammenlignet med en infisert ikke-behandlet kontroll (IUC) og en ikke-infisert ubehandlet kontroll (UUC) etter den for-søksmetode som er beskrevet i det følgende. Forsøksmetodikk. Dette forsøk anvender 10 kyllinger pr. drogegruppe. 10 kyllinger anvendes som vektkontroll og 10 kyller som infisert kontroll. Drogen gis 48 timer forut for infeksjonen. 1 g av forsøksdrogen blandes i en mekanisk mikser med en tilstrekkelig mengde av kyllingfir til å gi den ønskede dosering. Infeksjonen består i ca. 300.000 oo-cytter gitt oralt med pipette av Eimeria acervulina, E. mivati, E. maxima, E. necatrix og E. tenella. Forsøket va-rer 6 dager og deretter åpnes de overlevende fugler og un-dersøkes med hensyn til hovedskader i ceca. Forsøksfuglene graderes som følge av antall overlevende og antall innven-dige skader. Resultatene uttrykkes som gjennomsnittlig infeksjonsgrad (A.D.I.). En gjennomsnittlig infeksjonsgrad på mindre enn 2,5 betraktes som signifikant.

De coccidiostatiske blandinger ifølge foreliggende oppfinnelse inneholder som aktiv bestanddel antibiotikum X-14868A eller dets farmasøytisk fordragelige salter eller den tørkete ufiltrerte grøt fremstilles ved å blande den aktive bestanddel med en inert bestanddel. Den inerte bestandel kan omfatte et ffiritoff, fyllmaterialer oa lignende. Med uttrykket "inert bestanddel" menes et materiale som ikke virker som et antiparasittmiddel, f.eks. et coccidi-ostatikum er inaktivt overfor den aktive bestanddel, og som trygt kan fordøyes av dyrene som skal behandles , og således er et slikt, inert materiale et som er inaktivt for for-målet til foreliggende oppfinnelse.

Ved oral administrering til husdyr som er utsatt for kokkidiose, spesielt fjærkre, slik som kalkun og kyllinger, kon-trollerer den aktive bestandel, som en fdr komponent, effek-tivt sykdommen, enten ved å forebygge den eller kurere den, etter at den opptrer. Videre holder det behandlete fjærkre enten sin vekt eller tiltar faktisk i vekt sammenlignet med kontrollene. Blandingene ifølge foreliggende oppfinnelse kontrollererer således ikke bare kokkidiose, men hjelper også til å bedre virkningsgraden av overføringen av for til vektøkning.

Den aktuelle konsentrasjon av den aktive bestanddel i dyre-fAret kan selvfølgelig justeres som følge av de individuel-le behov og kan variere over et stort område. Den begren-sende konsentrasjonsfaktor er at den minimale konsentrasjon er slik at en tilstrekkelig mengde av aktiv bestanddel tilveiebringes til å bevirke den ønskede kontroll av kokkidiose/og den maksimale konsentrasjon er slik at mengden av fordøyet blanding ikke fører til noen skadelig eller uønskede bivirkninger.

Således inneholder f.eks. en f6r-forblanding eller et fer-digfor tilstrekkelig aktiv bestanddel til å gi fra ca. 0,0003 til 0,001 vekt% av det daglige forforbruk. Foretrukket anvendes ca. 0,0005 % til 0,001 vekt%. Generelt er ca. 0,0005% av den aktive bestanddel tilstrekkelig for å kon-trollere og bekjempe kokkidiose. Mengder større enn 0,001%, selv om disse er aktive mot kokkidiose, gir i alminnelig-het ikke forbedrete resultater frem for 0,001%, og kan i noen tilfeller negativt påvirke veksten, férvirkningsgra-den og dødeligheten.

Selv om mengder over 0,001% er virkningsfulle for bekjempelse av kokkidiose, er denne mengde den foretrukne øvre grense av økonomiske årsaker, dvs. omkostninger pr. enhet virkningsgrad er lavest innenfor dette område. Lavere mengder enn 0,0003% er ikke effektive for bekjempelse av kokkidiose. En nedre grense på 0,0005% foretrekkes fordi denne sikrer virksomhet. Den mest foretrukne mengde, dvs. ca. 0,0005 vekt% av det daglige fjærkréfdrkonsum er spesielt virkningsfult da man får maksimal effekt med minimal dose.

Det optimale doseringsnivå vil selvfølgelig variere med dyrets størrelse. Når man bruker antibiotika ifølge oppfinnelsen for behandling eller forebygning av kokkidiose, kan den først settes sammen med eller blandes med en f6rbestand-del eller bærer til en f6rtilsetningsforblanding, et f6r-konsentrat eller et f6rtilsetningsmiddel. En fortilsetning, konsentrat eller firblanding er en artikkel som er ment å fortynnes til et fullstendig f6r, dvs. en artikkel som er ment for direkte forbruk av et dyr eller som kan fortynnes videre til et fullstendig for eller som kan fordøyes og brukes som et tilskudd til andre rasjoner. Firtilsetnings-tilskudd, konsentrater og forblandinger inneholder en rela-tiv høy andel av kokkidiostatika, dvs. den aktive bestanddel i forhold til et passende bæremiddel og som blandes på en måte som gir hovedsakelig jevn fordeling av kokkidiosta-tikummet i bæremidlet. Egnete bæremidler er faste stoffer som er inerte med' hensyn til den aktive bestanddel og som trygt kan fordøyes av dyrene som skal behandles. Typiske for slike bæremidler er kommersielle fjærkréfér, malte ce-realkorn, biprodukter av korn, planteproteinkonsentrater (soya, jordnøtter, etc.) fermenteringsbiprodukter, salter, kalk, uorganiske forbindelser og lignende eller blandinger derav. Flytende dispersjoner kan fremstilles ved å bruke vann eller vegetabilsk olje, fortrinnsvis også et overflate-aktivt middel, emulgeringsmiddel og lignende i væskedisper-sjonen, så som etylendiamintetraeddiksyre, etc, og solubi-lisatorer. Alle egnete bæremidler eller fortynningsmateri-aler kan virke som inert bestanddel i den faste formuleringen av antiparasittmidlet forutsatt at det er inert overfor det aktive materiale og ikke er toksisk for dyret som det skal gies til.

Den aktive bestanddel kan blandes til en mos / pellett eller annen ønsket form med det inerte bæremiddel eller fortynningsmiddel i. form av fast materiale ved alle vanlige teknikker. F.eks. kan blandinger dannes ved å finmale eller pulverisere den aktive bestanddel og den inerte bestanddel ved å bruke en hvilken som helst kommersielt tilgjengelig malerkvern eller pulveriseringsapparat i nærvær eller fravær av formateriale. Hvis fArmateriale ikke er tilstede når malingen eller pulveriseringen finner sted kan det resulterende materiale fordeles i

ethvert vanlig tilgjengelig formateriale. Ty-

piske fjærkréf6r som kan gies sammen med den aktive bestanddel ifølge oppfinnelsen kan inneholde flere bestanddeler, f.eks. kan de inneholde kornprodukter med høy energi, så

som mais, hvete, "hveterød"-hundemel, durra, havremel eller lignende, middels og lavenergikornprodukter, sa som havre, bygg/ hvetemel, kliblandinger, standard kliblandinger el-

ler lignende, stabiliserte fett, vegetabilsk protein, så

som soyabønnemel, maisklistermel, peanut-mel, eller lignende; dyreprotein'så som fiskemel, løselige fiskeproduk-

ter, kjøttavfall eller lignende. UGF (ikkeidentifisert vekstfaktor) kilder og andre B-vitaminbærerer så som tør-kete melkeprodukter, tørket bryggerigjær, oppløselige de-stillasjonsrester, oppløselige mesk, eller lignende, de-hydratisert alfalfa-mel, og forskjellige spesielle tilset-ningsmidler så som ytterligere riboflavin, vitamin B12, kalsiumpantotenat, niacin, kolin, vitamin K og vitamin E eller lignende, såvel som stabilisert vitamin A, vitamin

(d-aktiverte animalske steroler), kaliusm- og fosfortil-setninger så som dikalsiumfosfat, dampet benmel, defluorert fosfat, kalk, eller lignende, jodtilsatt salt, mangansul-

fat, sinkkarbonat, en antibiotisk fértilsetning, metionin eller dens hydroksyanalog derav, og en antioksydant.

Som det fremgår fra det ovenstående er de kokkidiostatiske blandinger ment for oralt bruk. De kan tilsettes det norma-le féret til det behandlete dyr eller kan gies ved andre metoder, så som innføring i en tablett, pille eller stor pille og gies dyret som tvangsfor. Administreringen av den aktive bestanddel må tas hensyn til avhengig av det spesielle dyret ut fra vanlig husdyravlpraksis.

Bikomponentene X-14868B, C og D viser også antikokkidiostatisk aktivitet ved in vitro forsøk. X-14868B har også vist seg å være aktiv in vivo.

En omtale av mekanismen for fordøyelsen av f6ret, nedbrytningen og metabolismen i et drøvtyggende dyr kan finnes i US patent nr. 3.839.557 som beskriver bruken av visse, antibiotika for å bedre utnyttel-sesgraden av drøvtyggerf6r. Økonomisk viktige drøvtyggende

dyr er storfé, sau og geiter.

Virkningsgraden til antibiotikum X-14868A ved modifisering av forholdet til. flyktige fettsyrer som fremstilles i vommen er påvist ved hjelp av de følgende in vitro-

-f orsøk.

Vomvæske erholdes fra en okse med en fistelvom. Oksen holdes på følgende rasjon:

Korn: 89,9%

Alfalfa mel: 5,000%

Soyabønneoljemel: 3,00%

Kalk: 0,80%

NaCl: 0,60%

Dikalsiumf osf atr. 0,50%

Sporminéraler: 0,025%

Vitaminforblandingstilsetninger: 0,1%

Vitamin A, TIU: 4,0003

Vitamin D3, IU: 0,801

Vitamin E, TIU: 3,002

Vomvæsken føres øyeblikkelig gjennom en sikt. For hver fermentering tilsettes 75 ml av den resulterende væske til en 250 ml's kolbe som inneholder følgende: 1 g 80%:20% finmalt korn: høyforhold; 1 ml av en 18%'ig vandig glukoseløsning (1 mmol pr. kolbe); 1,5 ml av en 3,1 %<1>ig vandig urealøsning (0,76 mmol pr. kolbe); 60 mikromol av hver av de lo essentielle aminosyrer (arginin, histidin, leucin, metionin, treonin, valin,, lysin, isoleucin, fenylalanin, tryptofan) ;

1, ml av en vandig løsning av forsøksdrogen som skal gies enten 10 eller 25 pq/ ml (beregnet total volum av fermenteringsblanding av 80 ml);

Alle kolber inkuberes ved 38°C i et rystevannbad utstyrt med en gasshette. Karbondioksyd føres kontinuerlig gjennom gasshetten. Etter 4 timers inkubasjon sentrifugeres en 10 ml's mengde av fermenteringsvæsken ved 14.000 omdr./min.

(ca. 30.000 g) i 20 minutter. 3 ml av supernatanten settes til 1 ml av en 25%'ig metafosforsyreløsning som inneholder 2 3 mikromol 2-metylvaleriansyre som intern standard. Den

resulterende væske får sette seg ved romtemperatur i 30 minutter. Væsken filtreres gjennom et 0,22 millimikron Milli-pore-filter og avkjøles frem til gass-væske-kromatografiske analyser på flyktige fettsyrer.

Gass-væske-kromatografiske (GLC) analyser av fire in vitro kontrollfermenteringer og to fermenteringer hver med 10

og 25 ppm antibiotikum X-14868A er angitt i den følgende tabell.

Som vist i tabell 7 forbedres forholdet av propionat (C^) til acetat og n-butyrat betydelig. Med økningen av propionater frem for acetater fra karbohydrater, økes virkningsgraden av karbohydrat og derfor f6rutnyttelsesgraden.

Administrering av antibiotikummet X-14868A (i det følgende "antibiotikum" eller "antibiotisk forbindelse") forhindrer og behandler ketose samt forbedrer fcirutnyttelsesgraden.

Årsaksmekanismen for ketose er manglende produksjon av propionat-forbindelser. En i øyeblikket anbefalt behandling er administrering av propionsyre eller for som fortrinnsvis gir propionater. Det er klart at stimulering av propionatpro-duksjonen fra vanlige forstoffer vil redusere forekomst av ketose.

Det er blitt funnet at antibiotikum X-14868A øker virkningsgraden av fdrutnyttelsen hos drøvtyggere når det gies oralt til dyr. Den letteste måte å gi antibiotikummet er å blande det i dyrets for.

Imidlertid kan antibiotikummet også gis på andre måter. F.

eks. kan det innføres i tabletter, utbløtningsvæsker, store piller eller kapsler, og gies dosert til dyr. Formuleringer av den antibiotiske forbindelse i slike doseringsformer kan oppnåes ved hjelp av velkjente metoder på det veterinær-farmasøytiske felt.

Kapsler er lette å fremstille ved å fylle gelatinkapsler med hvilken som helst ønsket form av de ønskete antibiotika. Hvis ønsket kan antibiotikummet fortynnes med et inert pulverisert fortynningsmiddel, så som sukker, stivelse eller renset krystallinsk cellulose for å øke volumet for lettere fylling i kapsler.

Tabletter av antibiotikummet fremstilles ved konvensjonelle farmasøytiske prosesser. I tillegg til den aktive bestanddel inneholder en tablett vanligvis et basisstoff, et sprengningsmiddel, en absorbent, et bindemiddel og et smøre-middel. Typiske baser er laktose, melis, natriumklorid, stivelse og mannitol. Stivelse er også et godt sprengningsmiddel likesom alginsyre. Overflateaktive midler såsom na-triumlaurylsulfat og dioktylnatriumsulfosuccinat brukes også noen ganger. Vanlig brukte absorbenter er igjen stivelse og laktose, mens magnesiumkarbonat også kan brukes for oljeaktige substanser. Hyppig brukte bindemidler er gelatin, gummier, stivelse, dekstrin og forskjellige cellu-losedeirvater. Blant de vanlig brukte smøremidler er mag-nesiumstearat, talkum, paraffinvoks, forskjellige metall-såper og polyetylenglykol.

Administreringen av den antibiotiske forbindelse kan skje ved en langsomt avgivende stor pille. Slike store piller lages som tabletter bortsett fra at et middel for å for-sinke oppløsningen av antibiotikummet tilveiebringes. Store piller lages for avgivelse gjennom lange tidsrom. Den langsomme oppløsning hjelpes ved å velge en sterkt vann-uløselig form av antibiotikummet. En substans slik som jernspon tilsettes for å øke densiteten til den store pil-len og holde den statisk på bunnen av vommen.

Oppløsning av antibiotikummet forsinkes ved å bruke en ma-trise av uløselige materialer hvori drogen innstøpes. F. eks. er substanser, såsom vegetabilske vokser, rensete mi-neralvokser og vannuløselige polymermaterialer anvendelige.

Utbløtningsvæsker av antibiotikummet fremstilles lettest ved å velge en vannløselig form av antibiotikummet. Hvis en uløselig form av en eller annen grunn er ønsket, kan man lage en suspensjon. Alternativt kan en utbløtnings-væske formuleres som en løsning i et fysiologisk akseptabelt løsningsmiddel slik som en polyetylenglykol.

Suspensjoner av uløselige former av antibiotikummet kan fremstilles i ikke-løsningsmidler så som vegetabilske oljer som peanøtt, mais, eller sesamolje, i en glykol så som pro-pylenglykol eller en polyetylenglykol eller i vann, avhengig av formen av det valgte antibiotikum.

Egnete fysiologisk fordragelige hjelpestoffer er nødvendig for å holde antibiotikummet suspendert. Hjelpestoffene kan velges blant fortykningsmidler, så som karboksymetylcellu-lose, polyvinylpyrrolidon, gelatin og alginatene. Mange klasser av overflateaktive midler tjener til å oppslemme antibiotikummet. F.eks. lecithin, alkylfenyl/polyetylen-oksydaddukter, naftalensulfonater, alkylbenzensulfonater og polyoksyetylensorbitanestere er anvendelige for å frem-

stille suspensjoner i flytende ikke-løsningsmidler.

I tillegg kan mange forbindelser som bevirker hydrofili-sitet, densitet og overflatespenning av væsken hjelpe til å danne suspensjoner i enkelte tilfeller. F.eks. silikon-antiskummidler, glykoler, sorbitol og sukre kan anvendes som suspensjonsmidler.

Det suspenderbare antibiotikum kan presenteres som en suspensjon eller en tørr blanding av antibiotikummet og hjelpestoffer, hvilket skal fortynnes før bruk.

Antibiotikummet kan også gies i drikkevann til drøvtyggere. Innføring i drikkevann utføres ved å tilsette en vannløse-lig eller vannsuspenderbar form av antibiotikummet til van-net i riktig mengde. Formulering av antibiotikummet for tilsetning til drikkevann følger de samme prinsipper som formulering av utbløtningsvæsker.

Den mest praktiske måte å behandle dyr på med den antibiotiske forbindelse er gjennom formuleringen av forbindelsen i foret. Alle typer for kan tilsettes de antibiotiske forbindelser ,, så som vanlig tørrfor, væskefor og pelletterte fér.

Fremgangsmåtene for å formulere droger i dyref6r er velkjente. Det er vanlig å fremstille en konsentrert drogefor-blanding som råmateriale for medikamentholdig f6r. F.eks. kan typiske drogeforblandinger inneholde fra ca. 1 til 400 g droge pr .0-, 5 k<J forblanding. Det vide område kommer av det vide konsentrasjonsområde av drogen som kan være ønsket i det endelige féret. Forblandinger kan enten være flytende eller faste.

Formuleringen av vomfor som inneholder riktige mengder av antibiotikummet som er egnet for behandling, er velkjent. Det er bare nødvendig å beregne den mengde av forbindelse som skal gies til hvert dyr, ta hensyn til den formengde pr. dag som dyret eter, og konsentrasjonen av den antibiotiske forbindelse i forblandingen som skal brukes, og beregne den riktige konsentrasjon av antibiotisk forbindelse, eller forblanding, i foret.

Alle metodene for formulering, blanding og pellettering

av for som man normalt bruker på vomforområdet,er fullstendig egnet for fremstilling av f6r som inneholder den antibiotiske forbindelse.

Som vist forandrer oral administrering av antibiotikummet på fordelaktig måte produksjonen av propionater i forhold til produksjonen av acetater i vommen. Det kan derfor po-stuleres at den samme behandling også ville tilgodese mo-nogastriske dyr som fermenterer vegetabilske fibermateri-aler i cecum, da det ville forventes at en fordelaktig for-andring i propionat/acetatforholdet ville inntreffe etter oral administrering av foreliggende antibiotikum. Hester, svin og kaniner er eksempler på dyr som fordøyer en del av sitt f6r ved cecal fermentering.

Antibiotikum X-14868A har altså påviselig aktivitet som et middel ved behandling eller forebygning av svinedysenteri. Forbindelsen ble undersøkt med hensyn til aktivitet mot Treponema hyodysenteriae, det etiologiske middel for svinedysenteri. Resultatene som er et sammenlignignsforsøk etter velkjente forsøksmetoder mot et kjent middel ved behandling og forebygning av svinedysenteri er angitt i ne-denstående tabell.

En del av foreliggende oppfinnelse er også fremstillingen av de nye bikomponentene kalt X-14868B, C og D. Disse komponenter oppviser in vitro antikokkidiostatisk aktivitet mot E. tenella som vist nedenfor.

Strukturformelen til forbindelsen X-14868B er som følqer:

De infrarøde absorpsjonsspektra for de respektive forbindelser er som følger:

Tabell 9 angir fysikalske konstanter for de forskjellige komponenter fremstilt ved fermentering av Nocardia X-14868. De følgende eksempler vil tjene til å illustrere oppfinnelsen uten å begrense denne.

EKSEMPEL 1

Rysteflaskefermentering av Nocardia X- 14868

Den antibiotika-produserende X-14868A kultur dyrkes og holdes på en skrå stivelse-kasein-agar med følgende sammensetning (g/l destillert vann):

Juster pH til 7,4 med NaOH før autoklavering ved 15 pund trykk i 20 minutter.

Skråagaren inokuleres med Nocardia X-14868 kultur og inkuberes ved 28°C i 7-14 dager. En del agar inneholdende my-'cel fra velvokst skråagar brukes deretter for å inokulere en 500 ml<1>s Erlenmeyer kolbe som innholder 100 ml sterilisert inokulum-medium med den følgende sammensetning (g/l destillert vann):

Juster pH til 7,0 med NaOH før sterilisering.

Det inokulert inokulummedium inkuberes ved 28°C i 72 timer på en rotasjonsryster som arbeider ved 250 omdr/min..

En 3 ml's porsjon (3%, vol./vol.) av den.resulterende kultur brukes deretter for å inokulere en 500 ml's Erlenmeyer kolbe som inneholder 100 ml sterilisert fremstillingsmedium med følgende sammensetning (g/l destillert vann):

Juster pH til 6,4 før autoklavering.

Det inokulerte medium inkuberes ved 28°C i 5 dager på et roterende rystebrett ved 250 omdr./min.. Styrken av antibiotikum X-14868A i fermenteringsgrøten måles ved virkning mot Staphylococcus aureus ATCC 6 5 38P ved bruk av agar-dif f us jonskopp-plate-måling.

EKSEMPEL 2

Isolering av antibiotikum X-14868A-Na salt og antibiotikum X-14868B-Na salt fra rystekolbefermentering: Trinn A: Hele grøten fra 50 1/2-liters Erlenmeyer kolber som hver inneholder 100 ml, ble etter 5 dagers fermentering slått sammen (5 liter) og ekstrahert to ganger med halve volumet etylacetat. Etter omrøring 1 1/2 time ble løsningsmiddelsjiktet skilt fra og konsentrert til en olje (4 g) under redusert trykk. Oljen ble oppløst i dietyleter og kromatografert på en 200 g's kiselgelkolonhe pakket oppslemmet i dietyleter. Kolonnen ble eluert med en gradient mellom 2 liter dietyleter og 2 liter dietyleter/ aceton (9:1) og deretter 2 liter dietyleter/aceton (1:1) og så 2 liter metylenklorid/etylalkohol (7:3). Fraksjoner på 40 ml hver ble samlet opp og fra fraksjonnummer 18-75 ble slått sammen, løsningsmidlet fjernet under redusert trykk og resten (1,66 g) oppløst i etylacetat og vasket med samme volum IN HC1 to ganger, etterfulgt av vasking med samme volum Na2C03 (mettet ved romtemperatur) to ganger. Oppløsningsmiddelfasen ble tørket over Na2S0^, og ved tilsetning av n-heksan fikk man krystaller av antibio-tikumsaltet X-14868A-Na. Omkrystallisering fra etylacetat/ n-heksan ga analytisk prøve av antibiotikum X-14868A-Na salt. Smp. 193-194°C.

Trinn B: Fra fraksjonene nummer 161-215 fikk man, etter at løsningsmidlet var fjernet under redusert trykk, og resten oppløst i etylacetat og vasket med IN HC1, fulgt av Na2C0.j (mettet ved romtemperatur) , vask og tørking over Nå2S04, etter tilsetning av n-heksan, antibiotikum X-14868B-Na saltkrystaller. Smp. 172,5-174°C.

EKSEMPEL 3

Tankfermentering av Nocardia X- 14868

Den antibiotikum X-14868A -produserende kultur Nocardia X-14868 dyrkes og holdes på en stivelse-kasein-skråagar med følgende sammensetning (g/l destillert vann):

Juster pH til 7,4 med NaOH før autoklavering.

Skråagaren inokuleres med Nocardia X-14868 kultur og inkuberes i 7-14 dager ved 28°C. En del agar som inneholder mycel fra den velutviklete skråagar brukes så for å fremstille vegetativt inokulum ved å inokulere en 500 ml<1>s Erlenmeyer-kolbe med 100 ml inokulum-medium med den føl-gende sammensetning (g/l destillert vann).

pH justeres til 7,0 før autoklavering.

Det inokulerte medium inkuberes i 72 timer ved 28°C på et roterende rystebord ved 2 50 omdr./rain..

60 ml (3 % volum/volum) av denne vekstgrøten brukes til å inokulere en 6-liters Erlenmeyer-kolbe som inneholder 2 liter inokulum-medium med følgende sammensetning (g/l destillert vann):

pH justeres til 7,0 før autoklavering.

Det inokulerte medium inkuberes i 72 timer ved 28°C på et roterende rystebord-ved 250 omdr./min..

4 liter av denne kultur anvendes til å. inokulere 230 1 av det følgende fremstillingsmedium i en 380 l's fermentor (g/l springvann):

pH for mediet justeres til 6,4 før sterilisering i 1 1/4 time med 4,2 kg/cm 2 damp.

Det inokulerte medium luftgjennomblåses med komprimert luft ved en hastighet på 90 l/min. og røres med røreverk med 280 omdr./min.. Fermenteringen utføres ved 28°C i 5 dager.

Styrken av antibiotikummet X-148G8A i fermenteringsgrøten måles med Staphylococcus aureus ATCC 6538P under bruk av agardiffusjonskopp-platemetode.

EKSEMPEL 4

Isolering av antibiotikum X-14868A-; C-; og D natriumsalter fra tankfermentering av Nocardia X-14868.

Trinn A: Til hele grøten fra en 230 liters fermentering som beskrevet i eksempel 3 settes, etter 115 timers vekst, samme volum etylacetat. Etter røring i 1 time skilles løs-ningsmiddels j iktet fra og konsentreres til 4,2 liter under redusert trykk. Konsentrert løsningsmiddelekstrakt ble vasket med samme volum IN HC1 to ganger etterfulgt av vask-ning to ganger med samme volum Na2C03 (mettet ved romtemperatur ). Løsningsmiddel f asen tørkes over Na2S0^ og konsentreres til en olje under redusert trykk. Oljen ble oppløst i n-heksan og ekstrahert én gang med acetonitril etterfulgt av to ekstraksjoner med acetonitril/metanol (8:2). Acetonitril- og acetonitril/metanol- (8:2) ekstraktene ble slått sammen og løsningsmiddel ble fjernet under redusert trykk. Den resulterende olje løses i dietyleter, behandles med ak-tivt karbon, filtreres og ved tilsetning av n-heksan får man rå antibiotikum X-14868A-Na saltkrystaller. De rå antibiotiske krystaller oppløses i metylenklorid og kromatograferes på en metylenkloridoppslemningspakket 600 g kiselgelkolonne. Kolonnen elueres med 4 liter dietyleter/aceton/ ammoniumhydroksyd (8/2/0,02). Fraksjoner på 45 ml hver oppsamles og fraksjon nr. 13-15 slås sammen. Løsnings-midlet fjernes under redusert trykk, resten oppløses i etylacetat og vaskes så to ganger med IN HC1 og to ganger med Na2C03 (mettet ved romtemperatur), tørkes over Na2S0^. Etylacetatfasen ble konsentrert til en olje og oppløses i metylenklorid og ved tilsetning av n-heksan får man krystallinsk antibiotikum X-14868A-Na salt. Smp. 193-195°C.

Trinn B; Moderluten fra de rå antibiotiske X-14868A-Na saltkrystaller (beskrevet i trinn A foran) kromatograferes på en metylenkloridoppslemningspakket 1 kg kiselgelkolonne. Kolonnen elueres med 1 liter n-heksan og så en gradient mellom 4 liter dietyleter/n-heksan (7:3) til 4 liter dietyleter/aceton (8:2). Fraksjoner på 40 ml hver oppsamles og fraksjoner nr. 4 3-80 slås sammen. Løsningsmidlet fjernes under redusert trykk og resten oppløses i etylacetat og vaskes med IN HC1, fulgt av vandig Na2C03~(mettet ved romtemperatur) vask og aktiv karbonbehandling. Etter filtrering konsentreres etylacetatfasen til en olje. Oljen oppløses i dietyleter og tilsetningen av n-heksan ga ytterligere antibiotikum X-14868A-Na salt. Smp. 193-195°C.

Trinn C: Fraksjonene nr. 22-40 fra kiselgelkolonnen, som er beskrevet ovenfor i trinn A,gir krystallinsk antibiotikum X-14868C-Na salt. Smp. 172-175°C.

Trinn D: Moderluten fra det krystallinske antibiotikum X-14868A-Na salt beskrevet i trinn B og fraksjonene 16-21 fra kiselgelkolonnen beskrevet i trinn A ble slått sammen, konsentrert og kromatografert på en metylenkloridoppslem-ningsmpakket 600 g kiselgelkolonne. Kolonnen elueres med 4 liter dietyleter/heksan (1:1), 4 liter dietyleter/aceton/- n-heksan/ammoniumhydroksyd (6:2:2:0,002); 2 liter dietyleter/aceton (8:2). Fraksjoner på 40 ml hver oppsamles. Fraksjon nr. 71-98 slås sammen og krystallisering gir ytterligere krystallinsk antibiotikum X-14868A-Na salt. Fraksjonene 141-172 slås også sammen, løsningsmiddel fjernes under redusert trykk og krystallisasjon fra dietyleter/n-heksan gir antibiotikum X-14868D-Na salt. Smp. 194-195°C.

EKSEMPEL 5

Fremstilling av talliumsaltet av antibiotikummet X-14868A.

En løsning av 51 mg antibiotikum X-14 86 8A-Na salt i metylenklorid vaskes med IN HC1, fulgt av vask med vann og deretter fire ganger med en vandig løsning av talliumkarbonat.

■Løsningsmidlet skilles fra og konsentreres til et lite volum under redusert trykk og etter tilsetningen av n-heksan, fikk man krystallinsk talliumsalt av antibiotikum X-14868A. Omkrystallisering fra dietyleter/n-heksan gir krystaller som var egnet for røntgenanalyse.

EKSEMPEL 6

Fremstilling av kalsiumsaltet av antibiotikum X-14868A.

En løsning av 200 mg antibiotikum X-14868A-Na salt i etylacetat ble først vasket med IN HC1, derpå tre ganger med en vandig løsning av kalsiumhydroksyd (mettet ved romtemperatur ). Løsningsmidlet ble skilt fra og fjernet under redusert trykk. Kalsiumsaltet av antibiotikum X-14868A ble isolert som et hvitt fast skum.

EKSEMPEL 7

Rystekolbefermentering av Nocardia X-14868

Antibiotikum X-14868A produserende kultur ble dvrket oq holdt på en stivelse-kaseinskråagar med følgende sammensetning (g/l destillert vann):

pH ble justert til 7,4 med NaOH før autoklavering ved 15 pund trykk i 20 minutter.

Skråagaren ble inokulert med Nocardia X-14868 kultur og inkubert ved 28°C i 7-14 dager. : En del av a<3aJ? som in~ neholdt mycel fra den velutviklete skråagar ble deretter brukt til å inokulere en 500 ml Erlenmeyer-kolbe med 100 ml sterilisert inokulum-medium med den følgende sammensetning (g/l destillert vann):

pH ble justert til 7,0 med NaOH før sterilisering.

Det inokulerte inokulom-medium ble inkubert ved 28°C i 72 timer på et roterende rystebord ved 250 omdr./min..

En 3 ml's porsjon (3%, volum/volum) av den resulterende kultur brukes så til å inokulere en 500 ml Erlenmeyer kolbe med 100 ml sterilisert fremstillingsmedium med følgende sammensetning (g/l destillert vann):

Det inokulerte medium inkuberes ved 28°C i 7 dager på et roterende rystebord ved 250 omdr./min.. Styrken av antibiotikum X-14868A i fermenteringsgrøten ble målt ved hjelp av Staphylococcus. aureus ATCC 6538P under bruk av agar-difusjonskopp-platemetode.

Claims (2)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av polyeterforbindelsene antibiotika X-14863A, X-14863B, X-14868C og X-14868D med den generelle formel hvor, for antibiotikum X-14868A, R, er metyl, R2 er hydrogen, R3 er metyl og R4 er hydrogen; hvor, for antibiotikum X-14868B, R^ er metyl, R2 er hydrogen, R^ er metyl og R^ er metyl; hvor, for antibiotikum X-14868C, R^ er hydrogen, R^ er hydrogen, R^ er metyl og R^ er hydrogen; og, for antibiotikum X-14868D, R-^ er metyl, R2 er metyl, R3 er hydrogen og R4 er hydrogen, karakterisert ved å dyrke en subkultur av stammen Nocardia X-14868 ATCC 31585 i en vandig karbohydratoppløsning inneholdende et nitrogenholdig næringsmiddel, ved nøytral pH og ved en temperatur på 20 - 35UC, under neddykkede aerobiske betingelser og deretter separere og isolere sluttproduktet fra opp-løsningen og om ønsket konvertere disse til et farma-søytisk akseptabelt salt derav.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at polyeterforbindelsen X-14868A fremstilles .