WO2026018922A1 - ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症治療および／または予防用細胞及びその製法 - Google Patents

Abstract

本開示は、新型コロナウイルス感染症に対し、汎用性が高く即納型の他家Ｔ細胞並びにその製法を提供することを目的とする。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的なヒトＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を、インビトロでＴ細胞またはＴ前駆細胞に単独あるいは複数個発現させる工程を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的なヒトＴＣＲを発現するＴ細胞またはＴ前駆細胞を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症治療および／または予防用細胞集団の製造方法、ならびにかかる方法にて製造された他家由来のＴ細胞またはＴ前駆細胞を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症治療および／または予防用細胞集団を提供する。

Description

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症治療および／または予防用細胞及びその製法

　本開示はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症治療および／または予防用細胞及びその製法に関する。

　世界保健機関（ＷＨＯ）が２０２０年３月に新型コロナウイルス感染症を「パンデミック（世界的大流行）」と表明してから４年がたった。ＷＨＯが２０２３年５月に緊急事態の終了を宣言し、日本でも同月、感染症法上の５類に移行したが、新型コロナウイルスの流行は続いている。新型コロナウイルス感染症の治療には抗ウイルス薬の他に回復患者から採取した血清／血漿を用いる方法、抗体分子をクローニングして作製したモノクローナル抗体を用いる方法などが開発されている。一方で治療用や予防用のＴ細胞製剤開発についてはほとんど報告されていない。

　一般にウイルス感染症に対する免疫反応は抗体とキラーＴ細胞が２本柱として働くことが知られている。抗体はウイルスに結合して中和する働きを持ち、感染を防ぐ、症状を軽くするなど、主に感染初期に作用する。一方キラーＴ細胞は感染細胞を殺傷することにより病原体を駆逐することにより、感染初期から感染後期に渡りウイルス感染症へ作用する。

　ウイルス感染症に対する細胞療法として、第三者のＴ細胞を材料にして体外でウイルス抗原特異的Ｔ細胞を増幅して投与するという方法はこれまでも行われている。かかる治療が造血幹細胞移植後のサイトメガロウイルスやＥＢウイルスの再活性化に対して有効であることは示されている（非特許文献１)。しかし、第三者ドナーとレシピエントのＨＬＡを完全に一致させるのは難しく、ＨＬＡ部分的ミスマッチのＴ細胞が投与されることになる。したがって、かかる治療法は移植などの治療のために免疫不全状態とされた患者にしか使えない。

　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症に対しても同様の治療法を準備する動きはあった（非特許文献２）が、ほとんど使われることはなかった。第三者のＴ細胞を利用する場合、ＨＬＡを合致させることが困難であるという問題がある。造血幹細胞移植後の患者は免疫不全状態であり、そのウイルス再活性化の治療のために部分的に合致しないＨＬＡを有するＴ細胞を投与することは可能である。しかしながら、一般のウイルス感染症患者に同じ方法を用いるのは困難である。

　また、他家ではなく、自家のＴ細胞にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的外来Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を導入してＴ細胞製剤を作製し患者に戻すというアイデアは、シンガポールのＢｅｒｔｏｌｅｔｔｉらによって２０２０年４月に提唱されたことがある（非特許文献３）。しかし、その後続報がなく、実現には至らなかったと推察される。患者数が多い場合、オーダーメイドのT細胞製剤の作製は現実的ではない。

　他家の多能性幹細胞由来のＴ細胞をコロナの治療や予防に使うという事業は、申請者の知る限りではあるが、報告が無い。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症について重症化した患者や、重症化に向かう中等症の患者に対して、根治につながる有効な治療法は現時点で得られていない。抗体療法は初期にしか効果がなく、また新たな変異株に対しては効力を発揮しない可能性がある。ワクチンによる予防は大きく進展したが、治療薬を提供するものではない。

　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症に起因する重度のサイトカインストームに対してステロイド剤や抗ＩＬ－６Ｒ抗体などの投与による対症療法の開発は進んでいる。一方で、感染症の治療法の開発が望まれている。

Blood, 121: 5113, 2013 Front Immunol,12:751869, 2021 Duke-NUS Medical Schoolの２０２０年４月２１日付プレスリリース

　本開示は、新型コロナウイルス感染症の治療および／または予防のための、汎用性が高く即納型の他家Ｔ細胞並びにその製法を提供することを目的とする。

　本願は、下記を提供する：
（１）　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的なヒトＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を、インビトロでＴ細胞またはＴ前駆細胞に単独あるいは複数個発現させる工程を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的なヒトＴＣＲを発現するＴ細胞またはＴ前駆細胞を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症治療および／または予防用細胞集団の製造方法。
（２）　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的なヒトＴＣＲを発現するＴ細胞またはＴ前駆細胞が、ＣＤ８αβを発現している、（１）に記載の製造方法。
（３）　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的なヒトＴＣＲを発現するＴ細胞を含み、Ｔ細胞がキラー活性を持つＴ細胞である、（１）または（２）に記載の製造方法
（４）　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的なヒトＴＣＲを発現するＴ細胞またはＴ前駆細胞が、ＨＬＡのいずれかあるいは全てが欠失している細胞である、（１）～（３）いずれかに記載の製造方法。
（５）　Ｔ細胞に分化し得る細胞へ、ヒトＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を導入する工程、およびヒトＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を導入した細胞をＴ細胞またはＴ前駆細胞へ分化する工程を含む、（１）～（４）いずれかに記載の製造方法。
（６）　Ｔ細胞に分化し得る細胞が、多能性幹細胞である、（５）に記載の製造方法。
（７）　多能性幹細胞が、ＨＬＡのいずれかあるいは全てが欠失している多能性幹細胞である、（６）記載の製造方法。
（８）　多能性幹細胞がヒトＥＳ細胞株ＳＥＥＳ３由来のＥＳ細胞である、（６）または（７）記載の製造方法。
（９）　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的なＴＣＲが、配列番号１～７のいずれかのエピトープに特異的である、（１）～（８）いずれかに記載の製造方法。
（１０）　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＴＣＲのＣＤＲが、下記の組み合わせより選択される、（９）に記載の製造方法。

（１１）　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＴＣＲのアミノ酸配列が、下記の組み合わせより選択される、（１０）に記載の製造方法。

（１２）　（１）～（１１）いずれか１項に記載の方法で作成された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的なヒトＴＣＲを発現する他家由来のＴ細胞またはＴ前駆細胞を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症治療および／または予防用細胞集団。
（１３）　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的な同一のヒトＴＣＲが発現され、ＨＬＡのいずれかあるいは全てが欠失している他家由来のＴ細胞またはＴ前駆細胞集団を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症治療および／または予防用細胞集団。
（１４）　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質に特異的な同一のヒトＴＣＲが発現され、ＨＬＡのいずれかあるいは全てが欠失している他家由来のＴ細胞またはＴ前駆細胞集団を複数種組み合わせて含む、（１３）記載の細胞集団。
（１５）　Ｔ細胞またはＴ前駆細胞が、ＣＤ８αβを発現する、（１３）記載の細胞製剤。
（１６）　Ｔ細胞がキラー活性を持つＴ細胞である、（１３）～（１５）いずれかに記載の細胞集団。
（１７）　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＴＣＲが、配列番号１～７のいずれかのエピトープに特異的である、（１３）～（１６）いずれかに記載の細胞集団。
（１８）　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＴＣＲのＣＤＲが、下記の組み合わせより選択される、（１7）に記載の細胞集団。

（１９）　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＴＣＲのアミノ酸配列が、下記の組み合わせより選択される、（１８）に記載の細胞集団。

（２０）　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的なヒトＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を、必要な患者のＴ細胞へ発現させる工程を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２治療および／または予防法。

参考例１、ＥＳ細胞からＴ細胞への分化誘導法の概略。 参考例２、ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩダブルノックアウトＥＳ細胞由来Ｔ細胞の作製法の概略。 参考例２、ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩダブルノックアウトのためにＢ２Ｍ／ＣＩＩＴＡ遺伝子座に導入した変異。 参考例２、ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩダブルノックアウト、及び、ＮＹ－ＥＳＯ－１－ＴＣＲ遺伝子導入ＥＳ細胞をＴ細胞へ分化誘導してＤＰ細胞を得た。 参考例２、ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩダブルノックアウト、及び、ＮＹ－ＥＳＯ－１－ＴＣＲ遺伝子導入ＥＳ細胞をＴ細胞へ分化誘導して得たＣＤ８ＳＰ細胞は、ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩを発現していないことを確認した。 実施例１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＴＣＲ遺伝子クローニングの概略。 実施例１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＴＣＲの抗原特異性を確認した。 実施例１で得たＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＴＣＲの抗原ペプチドに対する結合親和性を確認した。 実施例１で得たＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＴＣＲの抗原ペプチドに対する結合親和性を確認した。 実施例２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＴＣＲ遺伝子のクローニング法の概略。 実施例２、得られたＴＣＲのエピトープ特異的活性化の確認。 実施例４のキリングアッセイのためのターゲット細胞の製造方法の概略。 実施例４のキリングアッセイの概略。 実施例４のキリングアッセイの概略（エフェクター細胞の作製および細胞傷害活性の測定） 実施例４のキリングアッセイの結果（ＱＹＩ　Ａ１、ＱＹＩ＿Ｂ１、ＱＹＩ　Ｈ５、ＲＬＱ　３およびＹＬＱ　２８）。 実施例４のキリングアッセイの結果（１０ＢＡ、ＣＥ２ＡＢ）。 実施例４のキリングアッセイの結果（２ＢＡ）。 実施例４のペプチド特異的キリングアッセイの結果（１０ＢＡ、ＣＥ２ＡＢ）。 実施例５および６のアッセイに用いるＡ２４：０２発現Ａ５４９＋ＡＣＥ２細胞の製造。 実施例５のキリングアッセイの概略。 実施例５のキリングアッセイの結果（ＣＥ2ＡＢ、１０ＢＡ）。 実施例６のxCELLigenceシステムを用いたペプチド特異的キリングアッセイの結果（１０ＢＡ）。 実施例６のＳＡＲＳ－ＣｏＶ感染細胞に対するキリングアッセイの概略。 実施例６のＳＡＲＳ－ＣｏＶ感染細胞に対するキリングアッセイの結果（ＣＥ２ＡＢ、ＱＹＩ＿Ｂ１）。 実施例７、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＴＣＲ単独発現再生ＣＴＬの取得の概略。 実施例７、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＴＣＲ（１０ＢＡ、２ＢＡ）単独発現再生ＣＴＬとしてダブルポジティブ細胞を得た。 実施例７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＴＣＲ（２ＢＡ）単独発現再生ＣＴＬの、キリングアッセイの結果。 実施例７のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＴＣＲ（ＱＹ１　Ｂ１）単独発現再生ＣＴＬの、キリングアッセイの結果。

　本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的なヒトＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を、インビトロでＴ細胞またはＴ前駆細胞に単独あるいは複数個発現させる工程を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的なヒトＴＣＲを発現するＴ細胞またはＴ前駆細胞を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症治療および／または予防用細胞集団の製造方法を提供する。

　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的なヒトＴＣＲは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染歴がある、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン接種歴のあるドナーより取得することができる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンとしては、不活化ワクチン、組換えタンパク質ワクチン、ペプチドワクチン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）ワクチン、ＤＮＡワクチン、ウイルスベクターワクチンなどが例示されるが、これらに限定されない。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的なＴＣＲは、ドナーより取得されたＴ細胞から得ることができる。

　ヒトＴ細胞は、ヒトの組織から公知の手法により単離することができる。ヒトの組織としては、前記Ｔ細胞を含む組織であれば特に制限はないが、例えば、末梢血、リンパ節、骨髄、胸腺、脾臓、臍帯血、病変部組織が挙げられる。これらの中では、ヒトに対する侵襲性が低く、調製が容易であるという観点から、末梢血、臍帯血が好ましい。ヒトＴ細胞を単離するための公知の手法としては、ＣＤ４等の細胞表面マーカーに対する抗体と、セルソーターとを用いたフローサイトメトリーが挙げられる。また、サイトカインの分泌や機能性分子の発現を指標に、所望のＴ細胞を単離することも出来る。グランザイムやパーフォリンなどの分泌又は産生、あるいはＣＤ８の発現を指標として、キラー活性を有するＴ細胞を単離することが出来る。

　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的なヒトＴＣＲは、不活化したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のタンパク質またはペプチドでドナーから取得したＴ細胞を含む生体試料、例えば末梢血単核球を刺激することによって得ることができる。

　活性化したＴ細胞のスクリーニングのための指標としては、活性化マーカー、例えばＣＤ６９、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４などを単独あるいは組み合わせて用いることができる。

　特定の抗原特異的ヒトＴ細胞を単離する場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的Ｔ細胞を含むヒト培養細胞またはヒトの組織より、目的の抗原を固定化したアフィニティカラム等を用いて精製する方法を採用することができる。また、所望の抗原を結合させたＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）を４量体化させたもの（いわゆる「ＭＨＣテトラマー」）を用いて、ヒトの組織よりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異性を有するＴ細胞を精製する方法も採用することができる。

　また、得られたＴＣＲが目的とする特異性を有することの確認は、当該ＴＣＲをＮＦＡＴ－ＧＦＰレポーター細胞に導入し、ドナーＢ細胞存在下、ＨＬＡに認識され得るアミノ酸長のペプチドで刺激し、活性化の見られるＴＣＲを選択すればよい。ＮＦＡＴ－ＧＦＰレポーター細胞を用いてＴＣＲの特異性を確認する方法は、（（Matsumoto et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 534:680-686.2021）に記載されている。

　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のタンパク質としては、Ｓタンパク質、Ｎタンパク質などが例示される。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のペプチドとしては、Ｓタンパク質、Ｎタンパク質由来のペプチドが例示される。ペプチドとしては、７～１５マー、８～１２マー、例えば８～１０マーのものが好適に用いられる。

　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は変異が繰り返し生じ、様々な変異株や変異系統が報告されている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のタンパク質、ペプチドとしては治療のターゲットとするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異株や変異系統より取得して用いればよい。

　本開示では、９種類のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＴＣＲを特定した。各ＴＣＲが認識するエピトープ、各エピトープが由来する抗原部位並びに拘束されるＨＬＡのタイプを表５に示す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的なＴＣＲを取得する際は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染歴のある対象あるいはワクチン接種歴のある対象より取得した生体試料をかかるエピトープペプチドを用いて刺激し、いずれかのペプチドに特異的な活性化を示すＴ細胞を取得し、特異的ＴＣＲを取得してもよい。

　本開示にて特定した各ＴＣＲのＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の配列は以下の通りである。
１０ＢＡ
ＴＣＲα（配列番号８）
MISLRVLLVILWLQLSWVWSQRKEVEQDPGPFNVPEGATVAFNCTYSNSASQSFFWYRQDCRKEPKLLMSVYSSGNEDGRFTAQLNRASQYISLLIRDSKLSDSATYLCVVNHLGGSNYKLTFGKGTLLTVNPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
ＴＣＲβ（配列番号９）
MSIGLLCCVAFSLLWASPVNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHNSMYWYRQDPGMGLRLIYYSASEGTTDKGEVPNGYNVSRLNKREFSLRLESAAPSQTSVYFCASSEGEGYEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG

１４ＡＢ
ＴＣＲα（配列番号１０）
MISLRVLLVILWLQLSWVWSQRKEVEQDPGPFNVPEGATVAFNCTYSNSASQSFFWYRQDCRKEPKLLMSVYSSGNEDGRFTAQLNRASQYISLLIRDSKLSDSATYLCVVNNGNMLTFGGGTRLMVKPHIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
ＴＣＲβ（配列番号１１）
MSIGLLCCAALSLLWAGPVNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMSWYRQDPGMGLRLIHYSVGAGITDQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCASTTLNTLEQFFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG

ＣＥ２ＡＢ
ＴＣＲα（配列番号１２）
MEKNPLAAPLLILWFHLDCVSSILNVEQSPQSLHVQEGDSTNFTCSFPSSNFYALHWYRWETAKSPEALFVMTLNGDEKKKGRISATLNTKEGYSYLYIKGSQPEDSATYLCAFVPLSDGQKLLFARGTMLKVDLNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
ＴＣＲβ（配列番号１３）
MGPGLLCWALLCLLGAGLVDAGVTQSPTHLIKTRGQQVTLRCSPKSGHDTVSWYQQALGQGPQFIFQYYEEEERQRGNFPDRFSGHQFPNYSSELNVNALLLGDSALYLCASSPGQGILEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG　

２ＢＡ
ＴＣＲα（配列番号１４）
MAMLLGASVLILWLQPDWVNSQQKNDDQQVKQNSPSLSVQEGRISILNCDYTNSMFDYFLWYKKYPAEGPTFLISISSIKDKNEDGRFTVFLNKSAKHLSLHIVPSQPGDSAVYFCAAVDYGGSQGNLIFGKGTKLSVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
ＴＣＲβ（配列番号１５）
MSLGLLCCAAFSLLWAGPVNAGVTQTPKFRVLKTGQSMTLLCAQDMNHEYMYWYRQDPGMGLRLIHYSVGEGTTAKGEVPDGYNVSRLKKQNFLLGLESAAPSQTSVYFCASILTGNTEAFFGQGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF

ＱＹＩ－Ａ１
ＴＣＲα（配列番号１６）
MSLSSLLKVVTASLWLGPGIAQKITQTQPGMFVQEKEAVTLDCTYDTSDPSYGLFWYKQPSSGEMIFLIYQGSYDQQNATEGRYSLNFQKARKSANLVISASQLGDSAMYFCASSWGKLQFGAGTQVVVTPDIQNPDPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
ＴＣＲβ（配列番号１７）
MSTRLLCWALLCLLGAGLVDAGVTQSPTHLIKTRGQQVTLRCSPKSGHDTVSWYQQALGQGPQFIFQYYEEEERQRGNFPDRFSGHQFPNYSSELNVNALLLGDSALYLCASSLVGANTGELFFGEGSRLTVLEDLKNVFPPEVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNSRAKRSGSG

ＱＹＩ－Ｂ１
ＴＣＲα（配列番号１８）
MLLLLVPAFQVIFTLGGTRAQSVTQLDSQVPVFEEAPVELRCNYSSSVSVYLFWYVQYPNQGLQLLLKYLSGSTLVESINGFEAEFNKSQTSFHLRKPSVHISDTAEYFCAVSDIFEGGFKTIFGAGTRLFVKANIQNPDPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
ＴＣＲβ（配列番号１９）
MLLLLLLLGPGSGLGAVVSQHPSRVICKSGTSVKIECRSLDFQATTMFWYRQFPKQSLMLMATSNEGSKATYEQGVEKDKFLINHASLTLSTLTVTSAHPEDSSFYICSARDRDKAYEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNSRAKRSGSG

ＱＹＩ－Ｈ５
ＴＣＲα（配列番号２０）
MEKNPLAAPLLILWFHLDCVSSILNVEQSPQSLHVQEGDSTNFTCSFPSSNFYALHWYRWETAKSPEALFVMTLNGDEKKKGRISATLNTKEGYSYLYIKGSQPEDSATYLCAFPNGGSNYKLTFGKGTLLTVNPNIQNPDPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
ＴＣＲβ（配列番号２１）
MFWYRQFPKKSLMLMATSNEGSKATYEQGVEKDKFLINHASLTLSTLTVTSAHPEDSSFYICSARDVGTGGHYEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNSRAKRSGSG

ＹＬＱ２８
ＴＣＲα（配列番号２２）
MISLRVLLVILWLQLSWVWSQRKEVEQDPGPFNVPEGATVAFNCTYSNSASQSFFWYRQDCRKEPKLLMSVYSSGNEDGRFTAQLNRASQYISLLIRDSKLSDSATYLCVVNNNNDMRFGAGTRLTVKPNIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
ＴＣＲβ（配列番号２３）
MGTRLLCWVVLGFLGTDHTGAGVSQSPRYKVAKRGQDVALRCDPISGHVSLFWYQQALGQGPEFLTYFQNEAQLDKSGLPSDRFFAERPEGSVSTLKIQRTQQEDSAVYLCATLDENTGELFFGEGSRLTVLEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNSRAKRSGSG

ＲＬＱ３
ＴＣＲα（配列番号２４）
MMKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMFIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAGSSNDYKLSFGAGTTVTVRANIQNPDPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
ＴＣＲβ（配列番号２５）
MGPGLLCCAALSLLWAGPVNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMSWYRQDPGMGLRLIHYSVGAGITDQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCASTLRDSETQYFGPGTRLLVLEDLKNVFPPEVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNSRAKRSGSG

　各ＴＣＲ配列情報を、IMGT（登録商標）、the international ImMunoGeneTics information system（登録商標）により提供されるIMGT/V-QUESTに基づき解析して得られるＴＣＲβ鎖、ＴＣＲα鎖それぞれについてＶ領域、Ｊ領域およびＣＤＲ３は下記となる。

　本開示においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的なＴＣＲとしては、本開示で特定したＴＣＲを有するものが例示される。本開示においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的なＴＣＲとしては、表６に特定したＣＤＲ３の配列のいずれかを有するＴＣＲが例示される。

　本願の方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的なヒトＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を、インビトロでＴ細胞またはＴ前駆細胞に単独あるいは複数個発現させる工程を含む。

　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的なＴＣＲを発現させるＴ細胞は、ヒトから単離されたＴ細胞またはＴ前駆細胞であってよい。Ｔ細胞またはＴ前駆細胞へインビトロでＴＣＲを発現させる方法は限定されず、公知のいずれの方法を用いてもよい。

　Ｔ細胞としては、ＣＤ３を発現しており、且つＣＤ４及びＣＤ８からなる群から選択される少なくとも一の分子が発現しているＴ細胞である。このようなヒトＴ細胞としては、例えば、ＣＤ４陽性細胞であるヘルパー／制御性Ｔ細胞、ＣＤ８陽性細胞である細胞傷害性Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ^＋ＣＤ６２Ｌ^＋細胞）、セントラルメモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ６２Ｌ^＋細胞）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ６２Ｌ^－細胞）、及びターミナルエフェクターＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ^＋ＣＤ６２Ｌ^－細胞）が挙げられる。

　Ｔ前駆細胞としては、その分化成熟段階をおってＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ４５陽性、ＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１a陽性、さらにＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３陽性細胞などが挙げられ、これらのマーカーを単独または組み合わせることによってタイピングもしくは分取することができる。Ｔ細胞系列特異的かつ特定の分化成熟段階のＴ前駆細胞を選別する場合にはＣＤ１a、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４などを発現する細胞が例示される。

　Ｔ細胞、またはＴ前駆細胞としては、ＣＤ８αβを発現するＴ細胞であることが好ましい。またＴ細胞としてはキラー活性を有するＴ細胞またはキラー活性を有するＴ細胞へ分化可能なＴ細胞が好適に用いられる。

　本開示において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＴＣＲを発現するＴ細胞またはＴ前駆細胞は、ＨＬＡのいずれかあるいは全てが欠失している細胞であることが好ましい。ＨＬＡのいずれか、あるいはすべてを欠失させることによって、本開示によって提供されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症治療および／または予防用細胞集団は、免疫不全状態の患者で無くとも使用することが可能となる。

　ＨＬＡのノックアウトは公知の方法にて行えば良い。例えば細胞のＢ２ＭおよびＣＩＩＴ遺伝子に遺伝子編集、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって変異を入れることにより、ＨＬＡ－ＩおよびＨＬＡ－ＩＩの両方をノックアウトすることが可能である（Thongsin et al., Stem Cell Research, Volume 71, September 2023, 103138)。

　本開示において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＴＣＲを発現させるＴ細胞またはＴ前駆細胞は、多能性幹細胞から分化誘導された細胞であってもよい。多能性幹細胞としては、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞が例示される。例えば、ヒトＥＳ細胞株ＳＥＥＳ３由来のＥＳ細胞株が例示される。ヒトＥＳ細胞株ＳＥＥＳ３は、理化学研究所バイオリソース研究センター（日本国茨城県）より、細胞番号ＨＥＳ０００８、細胞名ＳＥＥＳ３として入手可能である。ここでヒトＥＳ細胞株ＳＥＥＳ３由来の細胞株には、ＳＥＥＳ３そのものも含まれる。

　ヒト多能性幹細胞から所望の抗原特異性を有するＴ細胞を得る方法は、当業者に知られている方法を適宜用いればよい。例えばＷＯ２０１７／１５９０８７、ＷＯ２０１６／０１０１５５、ＷＯ２０１６／０１０１５４、ＷＯ２０１６／０１０１５３、ＷＯ２０１７／１５９０８８、ＷＯ２０１７／１７９７２０、ＷＯ２０１８／１２４２０７などに開示の方法を用いることができる。

　ヒト多能性幹細胞は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＴＣＲを有するＴ細胞から分化誘導してもよい。例えばかかるＴ細胞へヤマナカ因子を導入してＴ－ｉＰＳ細胞を得ることができる(Takahashi and Yamanaka, Cell 126, 663-673 (2006), Takahashi et al., Cell 131, 861-872(2007)および Grskovic et al., Nat. Rev. Drug Dscov. 10,915-929(2011))。

　多能性幹細胞としては、すでに株化されている多能性幹細胞、Ｔ細胞以外から誘導された、もしくは目的とするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＴＣＲ以外のＴＣＲを有する多能性幹細胞を用いてもよい。かかる多能性幹細胞をＴ細胞へと分化誘導するにあたり、分化誘導前にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＴＣＲを多能性幹細胞へ導入した上でＴ細胞へと分化誘導することによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＴＣＲを有するＴ細胞を得ることができる。

　ＴＣＲをインビトロで細胞に導入するには、ＴＣＲをコードする核酸を発現ベクターに搭載して細胞に導入すればよい。ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖を発現させるために好適に用いうるベクターとしては、プロモーターの下流にＴＣＲβ－Ｐ２Ａ－ＴＣＲαをコードする核酸を含むものが例示される。ベクターは、その他所望により、転写及び翻訳調節配列、リボソーム結合部位、エンハンサー、複製起点、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー遺伝子などを含んでいてもよい。

　本開示においてＴＣＲの導入には遺伝子組換えに用いられるベクターを適宜選択して用いればよく、例えばウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクターが例示される。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ、ＰＡＣ）などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる。目的に応じて市販のベクターを適宜選択して用いれば良い。

　プロモーターとしては、例えば、ＥＦ１αプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ユビキチンプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、ＭＭＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）ＬＴＲ、ＨＳＶ－ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーター、ＴＣＲ　Ｖα遺伝子プロモーター、ＴＣＲ　Ｖβ遺伝子プロモーターなどが用いられる。

　本開示においてはまた、多能性幹細胞は、そのゲノム内にマーカータンパク質をコードする遺伝子を含むカセットテープ遺伝子をマーカータンパク質が発現可能なように含むカセットデッキ構造を有しているものであってもよい。かかるカセットデッキ構造を有する細胞については、ＷＯ２０２０／０２２５１２、ＷＯ２０２２／０６５４４４に開示されている。マーカータンパク質としては、既知のＴＣＲ遺伝子を用いることが例示される。

　多能性幹細胞に、既知のＴＣＲ遺伝子を含むカセットデッキ構造を含む細胞を培養して、これをＴ細胞またはＴ前駆細胞へ分化誘導した後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的な他家ＴＣＲ遺伝子を含むカセットテープを用い、カセットデッキ構造に含まれる既知のＴＣＲとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＴＣＲ遺伝子を入れ替えて発現させることができる。この方法によって、ＴＣＲα、ＴＣＲβのミスペアリングを回避してもよい。

　Ｔ細胞もしくはＴ前駆細胞を多能性幹細胞から分化誘導して得る場合、ＨＬＡの一部もしくは全部をノックアウトした多能性幹細胞を用いることによって、ＨＬＡの一部もしくは全部がノックアウトされたＴ細胞を得ることができる。Ｔ細胞またはＴ前駆細胞へ分化誘導する多能性幹細胞としては、ゲノム内にマーカータンパク質をコードする遺伝子を含むカセットテープ遺伝子をマーカータンパク質が発現可能なように含むカセットデッキ構造を有し、ＨＬＡの一部もしくは全部をノックアウトされている多能性幹細胞が例示される。

　本開示はまた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的な1または複数個の同一のヒトＴＣＲが発現され、ＨＬＡのいずれかあるいは全てが欠失している他家由来のＴ細胞またはＴ前駆細胞集団を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症治療および／または予防用細胞集団を提供する。ここで「他家由来のＴ細胞またはＴ前駆細胞」とは、治療対象のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症患者に対して他家であるドナーから取得された細胞を操作して得られたＴ細胞またはＴ前駆細胞であることを意味する。本開示のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症治療および／または予防用細胞集団は、それぞれが同一の１または複数個のヒトＴＣＲを発現するＴ細胞またはＴ前駆細胞集団であっても、それぞれが同一の１または複数個のヒトＴＣＲを発現するＴ細胞またはＴ前駆細胞集団を複数種類、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０種類を組み合わせて含む細胞集団であってもよい。

　本開示において提供されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症治療および／または予防用細胞集団は、ヒト対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染に対する治療や予防において好適に用いることができる。本開示において「治療」とは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染によって生じる様々な症状を治癒、軽快させること、症状の進行を抑制することを意味する。本開示において「予防」とはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染によって生じる症状を発症していないが、かかる症状を発症する可能性が高いと予測される対象において、該ウイルスへの感染による症状の発症を抑制すること、あるいは発症する症状を減弱化させることを意味する。

　ここで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染によって生じる症状を発症する可能性が高いと予測される対象とは、例えば感染者と濃厚な接触があった対象、発症はしていないが検査によりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への感染が認められた対象、抗がん剤の投与や造血幹細胞移植の前処置などにより免疫不全状態を誘導する前の対象、感染者がいる病棟で働く医療従事者等があげられる。

　本開示のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症治療および／または予防用細胞集団は自家細胞から製造したものであっても、多家細胞から製造したものであってもよい。広くＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の治療および／または予防に用いるには、他家細胞から製造したものが好適に用いられる、

　本開示のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症治療および／または予防用細胞集団は、ＨＬＡ拘束性に有効であることから、搭載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＴＣＲが認識するＨＬＡのタイプを有する対象の治療および／または予防に用いうる。対象のＨＬＡは、常法によって確認すればよい。

　本願の細胞集団は、適当な媒体、例えば生理的食塩水やＰＢＳ、その他細胞療法に用いられる公知の媒体に懸濁して対象へ投与する。対象への投与は経静脈的に行えばよい。

　投与細胞数は特に限定されず、対象の年齢、性別、身長、体重、対象疾患、症状等に応じて適宜定めればよい。最適な投与細胞数は臨床試験により適宜決定すればよいが、例えば１０^６－１０^７細胞／ｋｇで、１回ないし複数回、対象へ経静脈投与することが例示される。

　本開示はまた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的なヒトＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を、必要なヒト対象のＴ細胞へ発現させる工程を含む細胞の製法、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の治療および／または予防法を提供する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的なヒトＴＣＲをヒト対象のＴ細胞へ発現させるには、例えば当該ＴＣＲをコードするｍＲＮＡをデリバリー媒体、例えば脂質ナノ粒子に封入し、Ｔ細胞を志向する機構を付与した上で対象に投与する方法が例示される。さらに必要であれば、ＴＣＲα、ＴＣＲβのミスペアリングを回避する機構を付与してもよい。

　本開示において提供されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症治療および／または予防用細胞の特異性は、本開示の実施例に示したアッセイにて確認することができる。アッセイとしては、標的となる抗原ペプチドまたはタンパク質を添加するか発現している標的細胞に対するキリングアッセイが例示される。キリングアッセイに際しては、標的細胞は対象のＨＬＡを発現する細胞を用いることが好ましい。さらに、同様に標的細胞からの刺激に応じたＴ細胞自体の増殖やＴ細胞活性化マーカーの発現を測定することでも細胞の特性を確認することができる。またこの方法を用いることで、対象の生体由来検体に対していずれのＴＣＲタイプの細胞が適合しうるかまたその強度や効果を知ることができ、治療や予防の指標とすることができる。この際の検体は感染後の急性期から回復期もしくは後遺症等が疑われる慢性期の対象から採取されたものであってもよい。

　以下、本開示を参考例並びに実施例によりさらに詳細に説明する。以下の実施例は本願発明の理解のためのものであり、本願発明を限定するものではない。

参考例１

Ｔ細胞へ分化可能なＥＳ細胞株の選択
　京都大学医生物学研究所、および成育医療研究センターで樹立された複数のES細胞株を用いた（JMA J. 2020 Oct 15; 3(4): 287-294. doi: 10.31662/jmaj.2018-0029）。表７に各細胞株名を示す。既報（「新世代フローサイトメトリー活用スタンダード」（清田　純，山本拓也／編），羊土社，141-157頁、2021）に基づきES細胞をＴ細胞へ分化誘導した。図１にその概略を示す。分化誘導では、最初にＥＳ細胞の胚様体を形成し、ＣＤ３４／４３＋血液前駆細胞へ誘導した。その後、胚様体内に含まれる血液前駆細胞をＯＰ９／ＤＬＬ１上へ播種してＴ細胞誘導を行った。分化誘導工程の各段階において、目的の細胞が得られていることを確認するため、Ｄａｙ１４でＣＤ３４／４３、Ｄａｙ３０でＣＤ５／７、Ｄａｙ３７でＣＤ４／８両陽性の発現を確認した。これらの分化マーカーの発現は、ＥＳ細胞株ごとに異なった。その中でも、ヒトＥＳ細胞株ＳＥＥＳ３由来のＳＥＥＳ－３－１０は分化誘導過程で、ＣＤ３４／４３＋血液前駆細胞、ＣＤ５／７Ｔ前駆細胞、ＣＤ４／８両陽性（ＤＰ）未熟Ｔ細胞が安定して得られることが確認でき、さらに、最も多くのＣＤ４／８ＤＰ細胞を得ることができた。これらの結果から、以下の実施例においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＴＣＲを導入するＴ細胞としてＳＥＥＳ３－１０を使用した。

ND: No Data

参考例２

ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩダブルノックアウトＥＳ細胞由来Ｔ細胞の作製
　ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩを発現しないＥＳ細胞由来Ｔ細胞を作製した。概略を図２に示す。
　最初にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって、ＳＥＥＳ３－１０のＢ２Ｍ／ＣＩＩＴＡをノックアウトした。Ｂ２Ｍのノックアウトでは、Ｂ２Ｍ遺伝子座のエクソン１の内部を標的配列（ＧＧＣＣＧＡＧＡＴＧＴＣＴＣＧＣＴＣＣＧ）とするｇＲＮＡを設計した。ＣＩＩＴＡのノックアウトでは、ＣＩＩＴＡ遺伝子座のエクソン３の内部を標的配列　（ＴＣＡＡＣＴＧＣＧＡＣＣＡＧＴＴＣＡＧＣ）とするｇＲＮＡを設計した。

　ノックアウト操作を行ったＥＳ細胞をシングルセルクローニングし、Ｂ２ＭおよびＣＩＩＴＡの塩基配列を確認した。その結果、Ｂ２Ｍ／ＣＩＩＴＡ遺伝子座共に、両アレルに１塩基挿入の変異が生じたＥＳ細胞クローンが得られた（図３）。得られたＥＳ細胞クローンに、レンチウイルスによってＮＹ－ＥＳＯ－１－ＴＣＲ－ＩＲＥＳ－Ｖｅｎｕｓ遺伝子を導入し、Ｖｅｎｕｓ発現細胞のコロニーを取得した。得られたコロニーを再度シングルセルクローニングした。

　ＨＬＡ－Ｉ／ＩＩノックアウト、及び、ＮＹ－ＥＳＯ－１－ＴＣＲ遺伝子導入を行った４つのＥＳ細胞クローン（ＳＥＥＳ３－１０－ＤＫＯ－ＮＹ１／３／５／６）を得た。これらの細胞を参考例1と同じ方法にてＴ細胞へ分化誘導した。これらのＥＳ細胞クローンからは、全てＣＤ４／８ダブルポジティブ（ＤＰ）細胞が得られることが確認できた（図４）。次いでＣＤ４＋細胞を磁気細胞分離法によって分離した。

　ＣＤ４／８ＤＰ細胞を含む分離後のＣＤ４＋細胞に対して、７日毎にＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチドをパルスしたlymphoblastoid cell line（ＬＣＬ）と共培養して刺激を加えることで、ＣＤ８ＳＰＴ細胞（ＣＤ８シングルポジティブＴ細胞）を増幅した。増幅後のＣＤ８ＳＰＴ細胞は、ＮＹ－ＥＳＯ－１に特異的なＴＣＲを有し、かつＨＬＡ－Ｉ／ＩＩを発現していないことが確認された（図５）。以下、多能性幹細胞から誘導されたＣＤ８ＳＰＴ細胞を、「再生ＣＴＬ」とする。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原特異的ＴＣＲ遺伝子のクローニング（１）
（１）ワクチン接種者より抗原ペプチドを指標に単離（ＱＹＩ＿Ａ１、ＱＹＩ＿Ｂ１、ＱＹＩ＿Ｈ５、ＹＬＱ＿２８、ＲＬＱ＿３）
　概略を図６に示す。新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ワクチン接種歴のある健常ボランティアドナーのＨＬＡタイピングを行い、ＨＬＡ－Ａ２４およびＨＬＡ－Ａ０２陽性のドナーを選んだ。各ドナーから採取した末梢血単核球をＨＬＡ－Ａ２４拘束性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原ペプチドであるＱＹＩＫＷＰＷＹＩ（ＱＹＩ）、ＨＬＡ－Ａ０２拘束性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原ペプチドであるＹＬＱＰＲＴＦＬＬ（ＹＬＱ）、およびＲＬＱＳＬＱＴＹＶ（ＲＬＱ）それぞれを搭載したＰＥ蛍光標識ＭＨＣテトラマーで染色し、スパイクタンパク質抗原特異的Ｔ細胞の頻度をフローサイトメトリーで測定した。ＭＨＣテトラマーで陽性を示すＣＤ８陽性Ｔ細胞集団をセルソーターで９６ウェルＰＣＲプレートの各ウェルに１細胞ずつ分離し、マルチプレックスＲＴ－ＰＣＲで各ウェルの単一Ｔ細胞からｃＤＮＡの合成・増幅を行った。

　続いてＩＭＧＴデータベースから得られたリーダーペプチド配列から設計したプライマーを用いてＴＣＲα鎖遺伝子とＴＣＲβ鎖遺伝子それぞれを増幅し、サンガーシークエンスでＴＣＲα鎖とβ鎖のＣＤＲ３配列を同定し、ＴＣＲクロノタイプの頻度解析を行った。

　ドナーの抹消血単核球から検出したＱＹＩ、ＹＬＱ、およびＲＬＱ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞の頻度および、シングルセルシークエンス解析によって得られたＴＣＲクロノタイプの結果を図６に示す。シングルセル解析によって、ＨＬＡ－Ａ２４拘束性抗原に対してはＱＹＩ－ＭＨＣテトラマーで陽性を示したＴ細胞分画から４種類の異なるＴＣＲαβペア配列を有するクロノタイプが同定できた。ＨＬＡ－Ａ０２拘束性抗原に対しては、ＹＬＱでは計４種類、ＲＬＱでは計１３種類の異なるＴＣＲαβペア配列を取得することができた。

　続いて取得したＴＣＲの機能解析を行うために、同定したＴＣＲαβペア遺伝子の中からＱＹＩに対しては３種類、ＹＬＱに対しては１種類、ＲＬＱに対しては１種類のＴＣＲ遺伝子発現レトロウイルスベクターを構築した。それぞれのＴＣＲαβのＣＤＲ３の配列情報を表８に示す。

（２）クローニングしたＴＣＲ遺伝子の抗原特異性の検討
方法）
　ＮＦＡＴ－ＺｓＧｒｅｅｎ－１レポーター遺伝子を発現させたＴ細胞株（Ｊｕｒｋａｔ細胞）に、クローニングした各ＴＣＲαβペア遺伝子を遺伝子導入してＴＣＲ発現レポーター細胞を作製した。ＴＣＲ発現レポーター細胞の抗原特異性を検討するために、ＨＬＡ－Ａ０２陽性細胞株であるＮＡＬＭ６細胞にＨＬＡ－Ａ２４を遺伝子導入して作製したＨＬＡ－Ａ０２とＨＬＡ－Ａ２４を両発現する細胞株を、レポーター細胞に対する抗原提示細胞として用いた。培養プレート内でＴＣＲ発現レポーター細胞と抗原提示細胞の共培養をＱＹＩ、ＹＬＱ、ＲＬＱそれぞれのペプチド添加下で行い、培養開始から８時間後のレポーター活性を蛍光顕微鏡で観察した。

　結果を図７に示す。抗原提示細胞と共培養した各ＴＣＲ発現レポーター細胞は、ペプチド添加下条件でのみ活性化を示し、クローニングした各ＴＣＲがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原由来のエピトープペプチドに対して反応性を示すことが確認できた。

（３）クローニングしたＴＣＲの抗原ペプチドに対する結合親和性の検討
　クローニングしたＴＣＲの抗原ペプチドに対する結合親和性を検討するために、抗原提示細胞と共培養したＴＣＲレポーター細胞に、段階希釈したＱＹＩ、ＹＬＱ、ＲＬＱそれぞれのペプチドを添加し、共培養開始から８時間後に活性化した細胞分画の頻度をフローサイトメトリーで測定した。レポーター活性の指標としてStimulation index（ペプチド刺激された細胞におけるZsGreen-1陽性頻度％/未刺激の細胞におけるZsGreen-1陽性頻度％）を用い、最大活性の５０％を示すペプチド濃度（ＥＣ５０）を算出し、各ＴＣＲの抗原ペプチドに対する結合親和性を評価した。結果を図８及び図９に示す。

　各ＴＣＲ発現レポーター細胞において、NFAT-ZsGreen-1の発現レベルが、ペプチド濃度が上昇するにつれて上昇することが確認できた（図８）。フローサイトメトリーで測定したZsGreen-1陽性細胞分画の頻度からStimulation indexを算出し、それらの値をペプチド濃度ごとでプロットして得られた用量反応曲線を図９に示す。
　これらの用量反応曲線によって得られた各ＴＣＲの抗原ペプチドに対するＥＣ５０の結果を表９に示す。

　同一抗原エピトープを認識するＱＹＩ特異的ＴＣＲにおいては、ＱＹＩ＿Ｂ１、ＱＹＩ＿Ｈ５、ＱＹＩ＿Ａ１の順で結合親和性が高いことが確認された。データベースを用いた解析で、取得したＴＣＲの認識する抗原ペプチド配列は、これまでに報告されている流行変異株（アルファ株からオミクロン株）のスパイク領域において変異が確認されておらず、株間で高度に保存された領域であることから、これらのＴＣＲは現行の流行株だけでなく今後新たに出現する変異株に対しても有効であることが予想される。

　得られたＴＣＲのＴＣＲαおよびＴＣＲβの配列を以下に示す。

　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原特異的ＴＣＲ遺伝子のクローニング（２）
（１）ＣＯＶＩＤ－１９感染患者より単離（１０ＢＡ、２ＢＡ）
　概略を図１０に示す。
　ＣＯＶＩＤ－１９に感染後、回復した患者より採取した末梢血単核球を、不活化したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイク糖タンパク質のＳペプチドプール（JPT Peptide Technologies, PM-WCPV-S-1）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の膜糖タンパク質のＭペプチドプール（Miltenyi Biotec, 130-126-702）、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオプロテインまたはヌクレオカプシドホスホプロテインのＮペプチドプール（Miltenyi Biotec, 130-126-698）で２０時間刺激した。Ｔ細胞活性化マーカーであるＣＤ６９、ＣＤ１３７あるいはＣＤ１５４高陽性のＴ細胞を分取し、シングルセルＴＣＲ／ＲＮＡシークエンス（ｓｃＴＣＲ／ＲＮＡ－ｓｅｑ）解析を行った。

　ＣＤ８＋Ｔ細胞にクラスタリングされたＴＣＲクロノタイプのうち、公的データベース上で健常者に比べＣＯＶＩＤ－１９患者で多く見られたクロノタイプ約６５種類を選び、クローニングした。当該ＴＣＲクロノタイプをＮＦＡＴ－ＧＦＰレポーター細胞（Matsumoto et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 534:680-686.2021）に導入し、ドナーのＢ細胞存在下でＳ、Ｎペプチドプール（JPT Peptide Technologies, PM-WCPV-S-1およびMiltenyi Biotec, 130-126-698）で刺激し、活性化の見られたクロノタイプとして１０ＢＡおよび２ＢＡを同定した（図１１左）。

　ＳペプチドプールライブラリーでＴＣＲを導入したレポーター細胞を刺激し、活性化したペプチドをＴＣＲのエピトープとして同定した。さらに、候補となるＨＬＡ　Ａ２４：０２あるいはＢ３５：０１を含むドナーＨＬＡクラスＩを導入した培養細胞との共培養により、当該ＴＣＲを拘束するＨＬＡを同定した。

（２）ｍＲＮＡワクチン接種者より単離（１４ＡＢ、ＣＥ２ＡＢ）
　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染歴がないが、ｍＲＮＡワクチンであるコミナティ筋注ＢＮＴ１６２ｂ２接種前と１回目の接種３週間後および６週間後、２４週間後（それぞれ２回目の接種３、２１週間後）の末梢血を、Ｓペプチドプールで刺激し、刺激により増殖したＴ細胞を分取してｓｃＴＣＲ／ＲＮＡ－ｓｅｑ解析を行った。各ドナーにおいてワクチン接種後に増殖したＴＣＲクロノタイプのうち最も増殖した１６クロノタイプを選び、クローニングを行った。ＮＦＡＴ－ＧＦＰレポーター細胞に導入後、ドナーの自家Ｂ細胞存在下においてＳペプチドプールで刺激し、活性化の見られたクロノタイプとして１４ＡＢおよびＣＥ２ＡＢを同定した。

　エピトープと拘束性ＨＬＡの同定は上記と同様に行った。（図１１右）。同定した各ＴＣＲクロノタイプのターゲットタンパク質、エピトープ並びにＨＬＡ－Ｉ拘束性を以下の表１１に示す。

　得られたＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖のアミノ酸配列を以下に示す。

　ＥＳ細胞由来再生ＣＴＬにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＴＣＲの発現
（１）レトロウイルスベクターの調製
　実施例１および実施例２で得たＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＴＣＲを遺伝子導入するためレトロウイルスベクターを構築した。表１３に各コンストラクトを示す。遺伝子導入の確認のため、蛍光タンパク質であるＢＦＰをコンストラクトに含ませた。パッケージング細胞であるＰＬＡＴ－Ｅ細胞さらにＰＧ１３細胞でレトロウイルスを産生させこの操作により高力価のレトロウイルスを産生するＰＧ１３を得た。

（２）ＤＫＯ－再生ＣＴＬにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＴＣＲの発現
　参考例２にて得たＥＳ細胞由来ＤＫＯ－再生ＣＴＬのうち、ＳＥＥＳ－１０－ｄＫＯ－２－ＮＹ５を用いた。この細胞にはがん抗原ＮＹ－ＥＳＯ－Ｉを認識する内在性ＴＣＲ（ＮＹ５）が予め発現している。外来ＴＣＲを遺伝子導入することにより、ＮＹ５と外来ＴＣＲの両方を発現する再生ＣＴＬを作成した。なお、外来ＴＣＲを遺伝子導入することによりそれぞれのTCRのα鎖とβ鎖がミスペアリングを起こしたものが混在する可能性は否定できない。ミスペアリングＴＣＲは未知の抗原に対する免疫応答が危惧されるが、本実施例ではin vitroでの検証であることから、ネガティブコントロール(ＴＣＲとしてＮＹ５のみを発現するＣＴＬ）を設定することで検証を行った。

　参考例２で得たＤＫＯ－再生ＣＴＬにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＴＣＲ遺伝子のレトロウイルスを感染させた。ＴＣＲベクターに含まれるＢＦＰの発現による蛍光を、フローサイトメーターを用いて遺伝子の導入を確認した。ＴＣＲ遺伝子の導入が確認された再生ＣＴＬを実施例４～６のキリングアッセイに用いた。

ＥＳ細胞由来再生ＣＴＬによるキリングアッセイ
（１）ターゲット細胞の作製
　再生ＣＴＬによるキリングアッセイを行うために、ターゲット細胞の作製を行った。実施例２で得たＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＴＣＲは、Ｓタンパク質がＡ２４０２もしくはＡ０２０１、Ｎタンパク質はＢ３５０１にマウントされるペプチドを認識すると予想されるため、ＨＬＡ－Ａ２４：０２／０２：０１発現Lymphoblastoid cell line（ＬＣＬ）へＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳタンパク質遺伝子を、ＨＬＡ－Ｂ３５：０１発現ＬＣＬにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＮタンパク質遺伝子を、それぞれレトロウイルスベクターを用いて導入を行った。概略を図１２に示す。

（２）ＴＣＲを発現させた再生ＣＴＬのＨＬＡ拘束性キリング活性
　概略を図１３および図１４に示す。
　実施例３で得た５種類のＴＣＲ（ＱＹＩ　Ａ１、ＱＹＩ　Ｂ１、ＱＹＩ　Ｈ５、ＲＬＱ　３およびＹＬＱ　２８）をそれぞれ発現させた再生ＣＴＬを用いた。Ｓタンパク質を発現させたＡ２４／Ａ０２＋ＬＣＬをＥＴ比１：１で共培養し、１８時間後にＬＣＬの生細胞の割合をフローサイトメトリーで測定した。ＬＣＬは、共培養前にＣＴＶ（ＣｅＬＬＴｒａｃｅ　Ｖｉｏｌｅｔ）で標識し再生ＣＴＬと区別した。結果を図１５および表１４に示す。
　５種類全てのＳタンパク質特異的ＴＣＲを有する再生ＣＴＬは、Ｓタンパク発現ＣＴＬとの共培養においてキリング活性が認められた。

（３）ＴＣＲを発現させた再生ＣＴＬのＨＬＡ拘束性キリング活性
　概略を図１３および図１４に示す。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＴＣＲ（１０ＢＡ、ＣＥ２ＡＢ）
　実施例３で得たＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＴＣＲ（１０ＢＡ、ＣＥ２ＡＢ）発現再生ＣＴＬとＳタンパク質を発現させたＬＣＬを共培養し、１８時間後にＬＣＬの生細胞の割合をフローサイトメトリーで測定した。ＬＣＬは、共培養前にＣＴＶ　（ＣｅＬＬＴｒａｃｅ　Ｖｉｏｌｅｔ）で標識し再生ＣＴＬと区別した。Ｅ／Ｔ比は、ＬＣＬの細胞数を５．０×１０⁴／ウエルに固定し、ＢＦＰポジティブの再生ＣＴＬ細胞数の割合を変化させた。結果を図１６および表１５に示す。

　１０ＢＡ－ＴＣＲ発現再生ＣＴＬおよびＣＥ２ＡＢ－ＴＣＲ発現再生ＣＴＬは、Ｓタンパク質をＨＬＡ－Ａ２４：０２／０２：０１発現ＬＣＬに発現させたターゲットに対し再生ＣＴＬの割合依存的なキリング活性を示した。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＴＣＲ（２ＢＡ）
　図１３および図１４に示す方法に準じて実施した。実施例３で得たＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＴＣＲ（２ＢＡ）を発現する再生ＣＴＬとＮタンパク質を発現させたＨＬＡ－Ｂ３５：０１を有するＬＣＬを共培養し、１８時間後にＬＣＬの生細胞の割合をフローサイトメトリーで測定した。Ｅ／Ｔ比は、ＬＣＬの細胞数を３．０×１０⁴／ウエルに固定し、ＢＦＰポジティブの再生ＣＴＬ細胞数の割合を変化させた。結果を図１７および表１６に示す。２ＢＡ－ＴＣＲ発現再生ＣＴＬでは、Ｎタンパク質をＨＬＡ－Ｂ３５：０１発現ＬＣＬに発現させたターゲットに対して再生ＣＴＬ割合依存的なキリング活性を示した。

　これらの結果より、ＬＣＬ内でプロセッシングされたＳタンパク質やＮタンパク質がＨＬＡに提示され、再生ＣＴＬ上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＴＣＲにより認識され傷害されることが明らかとなった。

（４）ＴＣＲを発現させた再生ＣＴＬのエピトープペプチド特異的キリングアッセイ
　実施例３で得た１０ＢＡおよびＣＥ２ＡＢ-ＴＣＲをそれぞれ発現する再生ＣＴＬを用いた。エピトープペプチドとして、１０ＢＡ－ＴＣＲに認識されるＳ４４８ペプチド、ＣＥ２ＡＢ－ＴＣＲに認識されるＳ１２０９ペプチドを用いた。Ｅ／Ｔ比が１．０となるように再生ＣＴＬとＨＬＡ－Ａ２４：０２並びに表に記載の量の各ペプチドを共存培養し、１６時間後にフローサイトメーターにより生細胞の割合を測定した。結果を図１８および表１７に示す。

各ペプチドに特異的なＴＣＲを発現する再生ＣＴＬとの共培養において、ペプチド濃度依存的なキリング活性が認められた。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞に対するキリングアッセイ
（１）標的細胞：Ａ２４：０２発現Ａ５４９＋ＡＣＥ２の作製
　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が細胞に感染するには、細胞膜上のＡＣＥ２に結合した後に膜融合することが重要である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＴＣＲ発現再生ＣＴＬが感染細胞をキリングし得るかを検討するため、ＡＣＥ２を発現するヒト肺がん由来上皮細胞株Ａ５４９細胞株（ＨＬＡ―Ａ２６：０３／３０：０１）にＨＬＡ－Ａ２４：０２をレトロウイルスベクターで遺伝子導入したＡ５４９＋ＡＣＥ２＋Ａ２４細胞株を作製した（図１９）。

（２）標的細胞に対するＴＣＲを発現させた再生ＣＴＬのキリング活性。
　実施例３で得たＣＥ２ＡＢおよび１０ＢＡ－ＴＣＲを発現させた再生ＣＴＬとＡ５４９＋ＡＣＥ２＋Ａ２４：０２をＳ１２０９（ＣＥ２ＡＢ）またはＳ４４８（１０ＢＡ）ペプチド存在下で共培養し、１６時間後にフローサイトメーターにより生細胞の割合を測定した。概略を図２０に、結果を図２１に示す。結果、ＬＣＬでの結果同様にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＴＣＲによるペプチド濃度依存的なキリング活性が認められた。

ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステムを用いたアッセイ
（１）エピトープペプチド特異的キリングアッセイ
　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染はＰ３条件下での解析が必要であるが、Ｐ３条件下ではフローサイトメーターは使用できないため代替の測定機器が必要となる。そこで、Ｐ３条件下で解析可能なxCELLigence RTCA SPシステム（Agilent Technologies Japan, Ltd., CA, USA #380601030）により、再生ＣＴＬのＡ５４９細胞に対するキリング活性を調べた。

　キリング活性測定は、装置のマニュアルに従って行った。Ａ５４９＋ＡＣＥ２＋Ａ２４細胞を専用プレートに播種し、細胞がプレートに接着した後、各ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のエピトープペプチド添加の約３時間後に参考例２で得たＮＹ－ＥＳＯ－1特異的ＴＣＲを発現した再生ＣＴＬ（ＮＹ５）または実施例３で得た１０ＢＡ－ＴＣＲ発現再生ＣＴＬをＥ／Ｔ比１．０の割合で添加し、抵抗値をモニターした。結果を図２２に示す。
　１０ＢＡ－ＴＣＲ発現再生ＣＴＬは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶエピトープペプチド依存的な抵抗値の低下が確認されたが、ＮＹ－ＥＳＯ－１－ＴＣＲ発現再生ＣＴＬでは変化が無かった。

（２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞に対するキリングアッセイ
　実施例５（１）で得た標的細胞（Ａ２４：０２発現Ａ５４９＋ＡＣＥ２）を、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃe専用プレートに播種した。２４時間後にＳＡＲＳ－ＣｏＶ２武漢株（ＵＴ－ＮＣＧＭ０２）をＭＯＩ：１０で１時間接触感染させた。

　接触感染完了の２４時間後に、参考例２で得たＮＹ－ＥＳＯ－1特異的ＴＣＲを発現した再生ＣＴＬ（ＮＹ５）、実施例３で得たＣＥ２ＡＢ特異的ＴＣＲを発現した再生ＣＴＬ、およびＱＹＩ＿Ｂ１特異的ＴＣＲを発現した再生ＣＴＬを、Ｅ／Ｔ比１．０で添加し、抵抗値をモニターした。概略を図２３に、結果を図２４に示す。ＣＥ２ＡＢ特異的ＴＣＲ発現再生ＣＴＬおよびＱＹＩ＿Ｂ１特異的ＴＣＲを発現する再生ＣＴＬにおいて感染による抗原特異的な抵抗値の低下が確認された。
　これより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２特異的ＴＣＲを発現させた再生ＣＴＬは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染細胞をキリングすることが可能であることが確認された。

（１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＴＣＲ単独発現ＥＳ細胞の樹立
　参考例１で得たＨＬＡ－ＤＫＯＥＳ細胞へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＴＣＲ遺伝子導入
　実施例３から５で使用した再生ＣＴＬは、内在性ＴＣＲであるＮＹ－ＥＳＯ１特異的ＴＣＲと外来生ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＴＣＲの両者と、それぞれのＴＣＲα、ＴＣＲβがミスペアリングを起こしたＴＣＲの計４種類が発現している可能性がある。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原特異的なキリング活性は認められたものの、ミスペアリングＴＣＲが未知の抗原を認識する危険性を考慮すると、ミスペアリングの危険の無い、１種類のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＴＣＲのみが発現する再生ＣＴＬを使用することが好ましい。

　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＴＣＲ発現ＥＳ細胞を樹立した。参考例１で得たＨＬＡをＤＫＯしたＥＳ細胞にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＴＣＲを遺伝子導入するため、レンチウイルスベクターに組み換え、レンチウイルス産生パッケージング細胞を作製した。その後、ＥＳ細胞にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＴＣＲ遺伝子を含むレンチウイルスをＤＫＯ－ＥＳ細胞に感染させ、各ＴＣＲを発現するコロニーを採取した。概略を図２５に示す。

（２）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＴＣＲ発現ＥＳ細胞の再生ＣＴＬへの分化
　得られたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＴＣＲを遺伝子導入したＥＳ細胞クローンから再生ＣＴＬへ、参考例１と同じ方法にて分化誘導した。その結果、ｄａｙ１３、ｄａｙ１３＋１６、ｄａｙ１３＋２３においてポジティブコントロールであるＮＹ－ＥＳＯ１特異的ＴＣＲ導入ＥＳ細胞と似た分化パターンを示し、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブ細胞まで分化していることが明らかとなった（図２６）。

（３）ＴＣＲを発現させた再生ＣＴＬのＨＬＡ拘束性キリングアッセイ
　上記（２）で得た２ＢＡ－ＴＣＲを発現する再生ＣＴＬを、Ｎタンパク質を発現させたＨＬＡ－Ｂ３５：０１＋Ｂ３５ＬＣＬと共培養した。上記と同様にして得たＱＹＩ_Ｂ１－ＴＣＲを発現する再生ＣＴＬを、Ｓタンパク質を発現させたＡ２４／Ａ０２＋ＬＣＬと共培養した。１６時間後にＬＣＬの生細胞の割合をフローサイトメトリーで測定した。ＬＣＬは、共培養前にＣＴＶ（ＣｅＬＬＴｒａｃｅ　Ｖｉｏｌｅｔ）で標識し再生ＣＴＬと区別した。Ｅ／Ｔ比は、ＬＣＬの細胞数を固定し、ＢＦＰポジティブの再生ＣＴＬ細胞数の割合を変化させた。結果を図２７および図２８に示す。

　いずれもＮタンパク質またはＳタンパク質を発現するＬＣＬにおいてのみ、再生ＣＴＬの割合依存的なキリング活性が認められた。

Claims (19)

1. 　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的なヒトＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を、インビトロでＴ細胞またはＴ前駆細胞に単独あるいは複数個発現させる工程を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的なヒトＴＣＲを発現するＴ細胞またはＴ前駆細胞を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症治療および／または予防用細胞集団の製造方法。
2. 　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的なヒトＴＣＲを発現するＴ細胞またはＴ前駆細胞が、ＣＤ８αβを発現している、請求項１に記載の製造方法。
3. 　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的なヒトＴＣＲを発現するＴ細胞を含み、Ｔ細胞がキラー活性を持つＴ細胞である、請求項１または２に記載の製造方法
4. 　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的なヒトＴＣＲを発現するＴ細胞またはＴ前駆細胞が、ＨＬＡのいずれかあるいは全てが欠失している細胞である、請求項１～３いずれかに記載の製造方法。
5. 　Ｔ細胞に分化し得る細胞へ、ヒトＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を導入する工程、およびヒトＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を導入した細胞をＴ細胞またはＴ前駆細胞へ分化する工程を含む、請求項１～４いずれかに記載の製造方法。
6. 　Ｔ細胞に分化し得る細胞が、多能性幹細胞である、請求項５記載の製造方法。
7. 　多能性幹細胞が、ＨＬＡのいずれかあるいは全てが欠失している多能性幹細胞である、請求項６記載の製造方法。
8. 　多能性幹細胞がヒトＥＳ細胞株ＳＥＥＳ３由来である、請求項６または７記載の製造方法。
9. 　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的なＴＣＲが、配列番号１～７のいずれかのエピトープに特異的である、請求項１から８いずれかに記載の製造方法。
10. 　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＴＣＲのＣＤＲが、下記の組み合わせより選択される、請求項９に記載の製造方法。
    
11. 　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＴＣＲのアミノ酸配列が、下記の組み合わせより選択される、請求項１０に記載の製造方法。
    
12. 　請求項１～１１いずれか１項に記載の方法で作成された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的なヒトＴＣＲを発現する他家由来のＴ細胞またはＴ前駆細胞を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症治療および／または予防用細胞集団。
13. 　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的な同一のヒトＴＣＲが発現され、ＨＬＡのいずれかあるいは全てが欠失している他家由来のＴ細胞またはＴ前駆細胞集団を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症治療および／または予防用細胞集団。
14. 　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質に特異的な同一のヒトＴＣＲが発現され、ＨＬＡのいずれかあるいは全てが欠失している他家由来のＴ細胞またはＴ前駆細胞集団を複数種組み合わせて含む、請求項１３記載の細胞集団。
15. 　Ｔ細胞またはＴ前駆細胞が、ＣＤ８αβを発現する、請求項１３記載の細胞集団。
16. 　Ｔ細胞がキラー活性を持つＴ細胞である、請求項１３～１５いずれかに記載の細胞集団。
17. 　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＴＣＲが、配列番号１～７のいずれかのエピトープに特異的である、請求項１３～１６いずれかに記載の細胞集団。
18. 　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＴＣＲのＣＤＲが、下記の組み合わせより選択される、請求項１７に記載の細胞集団。
    
19. 　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＴＣＲのアミノ酸配列が、下記の組み合わせより選択される、請求項１８に記載の細胞集団。