[go: up one dir, main page]

WO2026009803A1 - ヘパリン様物質を製造する方法 - Google Patents

ヘパリン様物質を製造する方法

Info

Publication number
WO2026009803A1
WO2026009803A1 PCT/JP2025/022967 JP2025022967W WO2026009803A1 WO 2026009803 A1 WO2026009803 A1 WO 2026009803A1 JP 2025022967 W JP2025022967 W JP 2025022967W WO 2026009803 A1 WO2026009803 A1 WO 2026009803A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
heparin
substance
cells
polynucleotide encoding
activity
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/JP2025/022967
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
正道 上平
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kyushu University NUC
Original Assignee
Kyushu University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyushu University NUC filed Critical Kyushu University NUC
Publication of WO2026009803A1 publication Critical patent/WO2026009803A1/ja
Pending legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Definitions

  • the present invention relates to a genetic engineering method for producing heparin-like substances, and the heparin-like substances produced thereby.
  • Heparin is an essential anticoagulant used in medical settings such as dialysis and extracorporeal circulation. Heparin used in pharmaceuticals is primarily extracted and purified from pig small intestine or bovine lung.
  • heparin-like substances are being produced using genetic engineering techniques.
  • the present inventors have attempted to produce heparin-like substances using cultured animal cells that produce heparin-like substances. They have found that heparin-like substances can be secreted into the culture supernatant and efficiently produced by recombinant CHO cells (CHO/NH-SDC) that have been transfected with (1) a gene encoding a bifunctional heparan sulfate N-deacetylase/N-sulfotransferase (hereinafter abbreviated as NDST2) and (2) a gene encoding heparan sulfate glucosamine 3-sulfotransferase 1 (hereinafter abbreviated as Hs3st1), both of which are involved in the production of heparin-like substances, and (3) a gene encoding the extracellular domain of syndecan (SDC) (Patent Document 1). Furthermore, they have found that heparin
  • Non-Patent Document 1 discloses a method for evaluating productivity and specific activity by examining nutrients added to the culture medium in the production of heparin-like substances using recombinant CHO cells expressing two exogenous enzymes in the heparin/heparan sulfate biosynthetic pathway.
  • a cell culture method for the production of soluble CTLA4 molecules includes: a) culturing host cells that produce soluble CTLA4 molecules at a first temperature of 37°C under cell culture conditions and for a period that allows cell growth; b) subsequently culturing the cells at a second temperature of 34°C; c) subsequently culturing the cells at a third temperature of 32°C; and d) subsequently culturing the cells at a fourth temperature of 30°C, wherein the cells are cultured at the second temperature starting on the fifth to seventh day of culture, with a four-day gap between the start of the second temperature and the start of the third temperature, and the fourth temperature starting two weeks after the start of culture and continuing until the end of the cell culture process (Patent Document 3).
  • Patent Document 2 The heparin-like substance produced by the inventors' method (Patent Document 2) has a lower specific activity than currently commercially available heparins. Heparin-like substances with higher activity are desired.
  • the inventors discovered that by setting the culture temperature of genetically modified CHO cells that produce heparin-like substances at a low temperature, the specific activity of the resulting heparin-like substances is dramatically improved, leading to the completion of this invention.
  • the present invention provides the following: [1] A method for producing a heparin-like substance, comprising the following steps: (1) preparing mammalian cells that produce heparin-like substances; (2) A step of culturing the heparin-like substance-producing mammalian cells prepared in step (1) at a temperature effective for inhibiting the proliferation of the cells to produce the heparin-like substance. [2] The production method described in 1, wherein the temperature effective for inhibiting proliferation is a temperature 2 to 14°C lower than the optimal temperature for proliferation. [3] The production method according to 1 or 2, wherein the mammalian cells are CHO cells.
  • a recombinant heparin-like substance produced by a production method comprising the following steps: (1) preparing CHO cells having at least one modification selected from the following group: - introduction of a polynucleotide encoding NDST2; - introduction of a polynucleotide encoding Hs3st1; - Introduction of a polynucleotide encoding the extracellular domain of SDC; and - Introduction of a polynucleotide encoding Hs6st3.
  • step (2) A step of culturing the CHO cells prepared in step (1) at 24 to 33°C to produce a heparin-like substance in the culture supernatant.
  • the recombinant heparin-like substance according to 10 having an anticoagulant factor Xa activity (specific activity per mg) of 100 IU/mg or more.
  • the recombinant heparin-like substance according to 10 or 11 having an anticoagulant factor IIa activity (specific activity per mg) of 75 IU/mg or more.
  • CHO/3F-S Changes in viable cell concentration and sGAG concentration over time when the culture temperature was raised to 37°C and 33°C in suspension batch cultures of CHO/2F-S, CHO/3F-S, and CHO/3F-S_CKO cells Time course of anti-FXa and anti-FIIa activity in suspension batch cultures of CHO/2F-S, CHO/3F-S, and CHO/3F-S_CKO cells at 37°C and 33°C Time course of anti-FXa and anti-FIIa specific activities in suspension batch cultures of CHO/2F-S, CHO/3F-S, and CHO/3F-S_CKO cells at culture temperatures of 37°C and 33°C Effect of culture temperature on suspension batch culture of CHO/3F-S_CKO cells Comparison of anti-FXa and anti-FIIa specific activities in culture supernatants on day 3 of suspension batch cultures of cell lines of different origins.
  • the present embodiment provides a method for producing heparin-like substances, comprising the following steps: (1) a step of preparing mammalian cells that produce heparin-like substances; (2) a step of culturing the mammalian cells that produce heparin-like substances prepared in step (1) at a temperature effective for inhibiting the proliferation of the cells to produce the heparin-like substances.
  • Heparin and heparan sulfate are linear polysaccharides in which disaccharide units of uronic acid ( ⁇ -D-glucuronic acid and ⁇ -L-iduronic acid) and glucosamine (D-N-acetylglucosamine and D-N-glucosamine sulfate) are repeatedly linked by ⁇ - or ⁇ -1,4 bonds.
  • Some types are O-sulfated at the 2-position of the uronic acid, O-sulfated at the 3- and 6-positions of the glucosamine, and N-sulfated at the amino group at the 2-position.
  • a protein or amino acid sequence when referred to as an amino acid sequence in which one or more amino acids have been substituted, deleted, inserted, and/or added, the number of substituted amino acids is not particularly limited, unless otherwise specified, for any protein, as long as the protein consisting of that amino acid sequence has the desired function, but is generally around 1-250, 1-200, 1-150, 1-100, 1-50, 1-40, 1-30, 1-20, 1-15, 1-9, or 1-4 amino acids, or even larger numbers of substitutions are possible as long as the substitutions are with amino acids with similar properties.
  • Means for preparing polynucleotides or proteins with such amino acid sequences are well known to those skilled in the art.
  • G Cost to open gap
  • -E Cost to extend gap
  • -q Penalty for nucleotide mismatch
  • -r reverse for nucleotide match
  • -e expect value
  • -W wordsize
  • -y [Dropoff(X) for blas -t extensions in bits] is 20 for blastn and 7 for programs other than blastn
  • -X X dropoff value for gapped alignment in bits
  • -Z final X dropoff value for gapped alignment in bits
  • Polypeptides having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, or added to the target amino acid sequence can be produced by site-directed mutagenesis [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997), Nucleic Acids These can be obtained by introducing site-specific mutations into DNA encoding a polypeptide containing, for example, the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 3, using techniques such as those described in Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985).
  • Any recombinant vector can be used as long as it is capable of autonomous replication in the host cell used or integration into the chromosome, and contains a suitable promoter in a position where the DNA encoding the polypeptide can be transcribed.
  • a recombinant vector it is preferable to use a plasmid in which a Kozak sequence, a ribosome binding sequence, is appropriately positioned around the start codon.
  • bases can be substituted to create codons optimal for expression within the host, thereby improving the production rate of the target NDST2 and Hs3st1.
  • Any recombinant vector that can function in animal cells can be used, such as pcDNA I, pcDM8 (Funakoshi Co., Ltd.), pAGE107 [Japanese Patent Publication No. 03-22979; Cytotechnology, 3, 133 (1990)], pAS3-3 (Japanese Patent Publication No. 02-227075), pcDM8 [Nature, 329, 840 (1987)], pcDNA I/Amp (Invitrogen), p Examples include cDNA3.1 (Invitrogen), pREP4 (Invitrogen), pAGE103 [J.
  • Any promoter that can function in animal cells can be used, including, for example, the promoter of the immediate early (IE) gene of cytomegalovirus (CMV), the SV40 early promoter, a retrovirus promoter, a metallothionein promoter, a heat shock promoter, an SR ⁇ promoter, or a promoter or enhancer of Moloney murine leukemia virus.
  • the enhancer of the IE gene of human CMV may also be used in combination with the promoter.
  • Recombinant vectors may contain a selection marker.
  • a selection marker is a gene that allows for the selection of cells that contain the gene. Selection can be positive or negative. Positive selection refers to the process by which positive selection occurs to select for cells that contain the selection marker.
  • Drug resistance is an example of a positive selection marker; cells that contain the marker survive in culture medium containing the drug, while cells that lack the marker die. Selection markers include drug resistance genes such as neo, which confers resistance to G418; hygr, which confers resistance to hygromycin; and puro, which confers resistance to puromycin. Other positive selection marker genes include genes that allow for the identification or screening of cells that contain the marker.
  • Negative selection refers to the process by which cells that contain the negative selection marker are killed by exposure to an appropriate negative selection drug.
  • cells containing the herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-tk) gene [Wigler et al., Cell 11:223 (1977)] are sensitive to the drug ganciclovir (GANC).
  • GANC herpes simplex virus thymidine kinase
  • GANC herpes simplex virus thymidine kinase
  • the gpt gene makes cells sensitive to 6-thioxanthine.
  • Any method for introducing DNA into animal cells can be used to introduce a recombinant vector into a host cell.
  • Examples include electroporation [Cytotechnology, 3, 133 (1990)], the calcium phosphate method (Japanese Patent Application Laid-Open No. 02-227075), or lipofection [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)].
  • compositions Comprising The Same
  • This embodiment provides heparin-like substances or fragments thereof produced by the methods described herein, and pharmaceutical compositions comprising the same.
  • the heparin-like substances or fragments thereof contained in the pharmaceutical compositions may be bound to a core protein.
  • the pharmaceutical compositions may also contain other therapeutic agents.
  • pharmaceutical compositions can be formulated, for example, by using conventional vehicles or diluents and pharmaceutical additives (e.g., excipients, binders, preservatives) of a type appropriate for the desired method of administration.
  • compositions include, for example, sterile injectable aqueous solutions.
  • Sterile injectable aqueous solutions can be formulated according to known techniques using appropriate dispersing or wetting agents and suspending agents.
  • the sterile injectable aqueous solution may also be a sterile injectable solution or suspension in a non-toxic parenterally acceptable diluent or solvent, such as a solution in 1,3-butanediol.
  • Acceptable vehicles and solvents that can be used include water, Ringer's solution, and isotonic saline.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition is not particularly limited and can take a wide variety of forms.
  • dosage forms for administering the pharmaceutical composition include tablets, capsules, sachets, lozenges, pills, powders, granules, elixirs, tinctures, liquids, suspensions, elixirs, syrups, ointments, creams, intravenous administration or injection, pastes, emulsions, or solutions.
  • transdermal administration via patch mechanisms or ointments Any of these may be modified into sustained-release and/or extended-release formulations.
  • Pharmaceutically acceptable carriers include, but are not limited to, vehicles, adjuvants, surfactants, suspending agents, emulsifiers, inert fillers, diluents, excipients, wetting agents, binders, lubricants, buffers, disintegrants, and carriers.
  • pharmaceutically acceptable carriers are chemically inert to the active compounds and have no adverse side effects or toxicity under the conditions of use.
  • the nature of the pharmaceutically acceptable carrier may vary depending on the particular dosage form used and other characteristics of the composition.
  • This embodiment provides a method for treating or preventing blood coagulation or a condition related to or caused by blood coagulation in a subject in need thereof, comprising administering a heparin-like substance or a fragment thereof produced by the method of this embodiment.
  • the heparin-like substance or a fragment thereof may be bound to a core protein.
  • Examples of blood coagulation or a condition related to or caused by blood coagulation include acute coronary syndrome, atrial fibrillation, deep vein thrombosis, and pulmonary embolism.
  • the subject is a mammal.
  • mammals include humans, primates, livestock animals (e.g., sheep, cows, horses, donkeys, pigs), companion animals (e.g., dogs, cats), laboratory test animals (e.g., mice, rabbits, rats, guinea pigs, hamsters), and captive wild animals (e.g., foxes, deer).
  • mammals are typically humans or primates, and more typically humans.
  • the dosage and timing of administration are preferably those that provide a therapeutic benefit in the treatment, prevention, or management of blood clotting or blood clotting-related conditions.
  • the specific effective dosage and timing may vary depending on factors such as the subject's condition, medical history, size, weight, and age.
  • CHO cell culture (1) Medium Composition: FreeStyle CHO Expression Medium (Cat. No. 12651014, Invitrogen) was used to culture CHO-S (Cat. No. R80007, Invitrogen), CHO/2F-S, CHO/3F-S, and CHO/3F-S_CKO cells. Penicillin (Cat. No. 021-07732, Wako) and streptomycin (Cat. No. 194-08512, Wako) were added as antibiotics. L-glutamine (Cat. No. 074-00522, Wako) was also added to the medium to a final concentration of 8 mM. Typically, cells were seeded at 1.2 x 10 5 cells/well onto a 24-well tissue culture plate (Cat. No. 150466, Nunc) and cultured at 37°C in a humidified 5% CO 2 incubator.
  • CHO/2F-S cells are CHO-S cells into which the genes for NDST2, Hs3st1, and the extracellular domain of syndecan 1 (SDC1) (SEQ ID NOs: 13, 15, 11, respectively) have been introduced (see Patent Document 1).
  • CHO/3F-S cells are CHO/2F-S cells into which the Hs6st3 gene (SEQ ID NO: 7) has been introduced (see Patent Document 2).
  • CHO/3F-S_CKO cells are CHO/3F-S cells in which the CSGalNAcT2 (CS2) gene has been knocked out (see below).
  • cells were seeded at a density of 0.5 ⁇ 10 cells/mL in 10 mL of a 50 mL bioreactor tube and cultured for 8 days.
  • cells were seeded at a density of 2.0 ⁇ 10 cells/mL in 10 mL of a 50 mL bioreactor tube and cultured for 30 days. In this case, the medium was replaced with fresh medium every other day, and after each replacement, the medium was collected and the cell count was measured. The cells were then reseeded to a density of 2.0 ⁇ 10 cells/mL and culture continued.
  • Anti-FXa activity was measured using BIOPHEN HEPARIN ANTI-Xa 2 stage (Cat. No. 221005, HBM), and anti-FIIa activity was measured using BIOPHEN HEPARIN ANTI-IIa 2 stage (Cat. No. 220005, HBM). Procedures were performed according to the kit manual.
  • the antithrombin powder (R1), FXa (or FIIa) powder (R2), and FXa (or FIIa)-specific luminescent substrate powder (R3) included in the kit were dissolved in 1 mL of sterile water as directed in the kit. These reagents are usually stored refrigerated and were gently mixed (100 rpm, 30 min, 25°C) using a deep-well maximizer (Model No. M-BR-022UP, Taitec) before the assay. The required amount was then dispensed, and R1 and R2 solutions were diluted 5-fold with Tris NaCl EDTA BSA buffer, pH 8.40 (Cat. No. AR031K, HBM), while R3 solution was diluted 5-fold with sterile water. Just before use in the assay, the solution was dispensed into microtubes and incubated at 37°C for 3 minutes in a heating bucket (Cat. No. Electronic Heating Bucket, Taitec).
  • the standard was prepared by dissolving BIOPHEN UFH Calibrator (Cat. No. 222301, HBM) powder with known activity in 1 mL of sterile water.
  • the standard was usually stored at -80°C in 5 ⁇ L aliquots in PCR tubes. Just before use, it was thawed at room temperature and diluted 15-fold with Tris NaCl EDTA Buffer. Once thawed, this standard was used only for that assay, and any remaining liquid was discarded.
  • the culture supernatant was centrifuged (10,000 ⁇ g, 10 min, RT) before the assay, and 10 ⁇ L was used as the sample, diluted appropriately with Freestyle CHO medium.
  • the aforementioned heparin solution (BIOPHEN UFH Calibrator powder dissolved in sterile water) was diluted 10-fold repeatedly until it reached 0.17 IU/mL, and then assayed.
  • Heparan sulfate (Cat. No. H7640-1MG, Merck, derived from bovine kidney) was used as the standard. It was diluted with sterile water to the desired concentrations (0, 0.3125, 0.625, 1.25, 2.5, 5 ⁇ g/mL). After preparing a 5 ⁇ g/mL solution, other concentrations were prepared by repeated two-fold dilutions. The culture supernatant was centrifuged (10,000 ⁇ g, 10 min, RT) before the assay, and 150 ⁇ L was used. For commercially available heparin, the heparin solution was diluted to 5 ⁇ g/mL, and 150 ⁇ L was also used for the measurement.
  • the sample was placed in a microtube, 500 ⁇ L of Blyscan Dye Reagent was added, and the mixture was vortexed and mixed in a deep-well maximizer (100 rpm, 30 min, 25°C). The mixture was vortexed again and the DMMB-sGAG complex was allowed to precipitate for 16 hours at 4°C. It was then centrifuged (15,000 x g, 30 min, 4°C) and the supernatant was removed to obtain a pellet. 250 ⁇ L of Dye Dissociation Reagent was added to the pellet and the pellet was completely dissolved by vortexing. 200 ⁇ L was placed in a 96-well ELISA plate (Cat. No. 3801-96, Iwaki), and the absorbance (656 nm) was measured using a plate reader. An approximate straight line to the standard plot was used as the calibration curve.
  • pU6-(BbsI)_CBh-Cas9-T2A-mCherry (#64324, Addgene) was digested with the same enzymes, and the resulting Cas9-2A-mCherry gene was used as the insert fragment. After ligation and transformation, pX330-mCherry was constructed. Next, transformation and plasmid extraction were performed to create pX330-mCherry as a donor plasmid. pX330-mCherry was digested with BbsI.
  • pX330-mCherry/CS2 was generated by ligating the donor plasmid with a double-stranded oligo DNA containing a gRNA sequence targeting CS2 (gRNA/PAM: AACTTCAGCTCTGTCGATCT (SEQ ID NO:25)/GGG) ( Figure 1).
  • the gRNA/Cas9 expression vector (pX330-mCherry/CS2) described above was transfected into CHO/3F-S cells using a gene transfection reagent. After 48 hours, red fluorescent-positive cells were isolated using a cell sorter and seeded onto 24-well plates to obtain bulk cells. Although a decrease in sGAG production was observed in the culture supernatant, a significant increase in the anti-FXa specific activity of heparin-like glycans was observed.
  • the CS2-targeted gRNA-transfected cells were cloned using limiting dilution. The culture supernatant of the obtained clones was then collected and their anti-FXa specific activity was evaluated.
  • clone #24 showed consistently high anti-FXa specific activity.
  • PCR amplification of the target sequence within the CS2 gene was followed by sequence analysis, revealing gene disruption due to an 8-base deletion at the expected position ( Figure 2). This resulted in the establishment of CS2 gene-disrupted CHO cells (CHO/3F-S_CKO).
  • Anti-FXa and anti-FIIa activity remained at the same level as before CS2 gene disruption (CHO/3F-S). Meanwhile, sGAG concentration was reduced to about half of that before gene disruption. This is thought to be due to a decrease in total glycan production caused by disruption of the CS2 gene, an enzyme involved in the early stage of chondroitin sulfate synthesis.
  • the anti-FXa specific activity was 1.6-fold higher than that of the original cells, and the anti-FIIa specific activity was 1.9-fold higher (Figure 3. Comparison of sGAG concentration, anti-FXa, and anti-FIIa activity in the culture supernatant of CHO/2F-S, CHO/3F-S, and CHO/3F-S_CKO cells on day 3 of culture).
  • Heparin-like sugar chains were continuously produced by semi-continuous culture of CHO/3F-S_CKO cells in high-density suspension culture at temperatures of 30°C and 33°C for 30 days (Fig. 11). Both anti-FXa and anti-FIIa activities were nearly stable over 30 days. Heparin-like sugar chains with higher activity were produced by culture at 30°C.

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

より活性の高いヘパリン様物質を製造できる方法を提供する。 以下の工程を含む、ヘパリン様物質を製造する方法を提供する：（１）ヘパリン様物質を産生する哺乳動物細胞を調製する工程；（２）工程（１）で調製したヘパリン様物質を産生する哺乳動物細胞を、該細胞の増殖抑制上有効な温度で培養し、ヘパリン様物質を産生させる工程。増殖抑制上有効な温度は、好ましくは増殖上至適な温度より2～14℃低い温度である。

Description

ヘパリン様物質を製造する方法
　本発明は、ヘパリン様物質の遺伝子工学的な製造方法、及びそれにより製造されたヘパリン様物質に関する。
　ヘパリンは抗血液凝固薬として、人工透析や体外循環などの医療現場で使用されている必要不可欠な薬剤である。医薬品等に用いられるヘパリンは、主にブタの小腸又はウシの肺から抽出、精製されている。
　一方で、遺伝子工学的な手法を用いてヘパリン様物質を生産することが検討されている。本発明者らは、ヘパリン様物質を産生する培養動物細胞を用いたヘパリン様物質の産生を試みてきた。そして、ヘパリン様物質の生産に関わる、（１）両機能性ヘパラン硫酸エステルＮ－脱アセチラーゼ／Ｎ－硫酸転移酵素（以下、ＮＤＳＴ２と略す。）をコードする遺伝子、及び（２）へパラン硫酸エステルグルコサミン３　硫酸転移酵素１（以下、Ｈｓ３ｓｔ１と略す。）をコードする遺伝子が導入されたＣＨＯ細胞に、さらに（３）シンデカン（ＳＤＣ）の細胞外ドメインをコードする遺伝子を導入した組換えＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ＮＨ－ＳＤＣ）により、ヘパリン様物質が培養上清中に分泌され、効率的に生産できることを見出してきた（特許文献１）。また、それらの３つの改変に加えて、さらに6-O-硫酸化酵素をコードするポリヌクレオチドが導入された細胞により、活性が向上したヘパリン様物質が得られることを見出している（特許文献２）。
　一方、ヘパリン／ヘパラン硫酸生合成経路の2つの外因性酵素を発現させた組換えCHO細胞によるヘパリン様物質の生産に関し、培地に添加する栄養素の検討により、生産性や比活性を高めたことが報告されている（非特許文献１）。また、可溶性CTLA4分子の生産に関し、a)細胞増殖が可能な期間及び細胞培養条件下で37℃の第1温度で可溶性CTLA4分子を生成する宿主細胞を培養し、b)次いで34℃の第2温度で細胞を培養し、c)次いで32℃の第3温度で細胞を培養し、d)次いで30℃の第4温度で細胞を培養することを含む細胞培養方法であって細胞を培養第5日～第7日に開始する該第2温度で培養し、第2温度の開始と第3温度の開始の間が4日間あり、第4温度が培養開始から2週間に開始し、細胞培養工程の終了までである方法が提案されている（特許文献３）。
国際公開ＷＯ２０２１／０６６１６７ 国際公開ＷＯ２０２３／１５７８９９ 国際公開ＷＯ２００４／０５８８００（特許第４５４１１５７号）
Biotechnol J. 2015 Jul; 10(7): 1067-1081.
　本発明者らの方法（特許文献２）で生産したヘパリン様物質は、現在市販されているヘパリンよりも比活性が低い。より活性の高いヘパリン様物質が望まれる。
　本発明者らは、ヘパリン様物質を生産する遺伝子改変したCHO細胞において、培養温度を低く設定することにより、得られるペパリン様物質の比活性が飛躍的に向上することを見出し、本発明を完成した。
　本発明は以下を提供する。
［１］　以下の工程を含む、ヘパリン様物質を製造する方法：
（１）ヘパリン様物質を産生する哺乳動物細胞を調製する工程；
（２）工程（１）で調製したヘパリン様物質を産生する哺乳動物細胞を、該細胞の増殖抑制上有効な温度で培養し、ヘパリン様物質を産生させる工程
［２］　増殖抑制上有効な温度が、増殖上至適な温度より2～14℃低い温度である、１に記載の製造方法。
［３］　哺乳動物細胞が、CHO細胞である、１又は２に記載の製造方法。
［４］　培養1～4日目にヘパリン様物質を回収する工程を含む、１～３のいずれか１項に記載の製造方法。
［５］　培養が、4週間以上連続して行われる、１～４のいずれか１項に記載の製造方法。
［６］　増殖抑制上有効な温度が、23～35℃である、１～５のいずれか１項に記載の製造方法。
［７］　増殖抑制上有効な温度が、24～34℃である、１～５のいずれか１項に記載の製造方法。
［８］　ヘパリン様物質を産生する哺乳動物細胞が、以下の群から選択される少なくとも一つの改変がされたものである、１～７のいずれか１項に記載の製造方法：
・ヘパラン硫酸エステルN－脱アセチラーゼ/N－硫酸転移酵素（NDST2）をコードするポリヌクレオチドの導入；
・へパラン硫酸エステルグルコサミン3　硫酸転移酵素１（Hs3st1）をコードするポリヌクレオチドの導入；
・シンデカン（SDC）の細胞外ドメインをコードするポリヌクレオチドの導入；及び
・6-O-硫酸化酵素をコードするポリヌクレオチドの導入。
［９］　ヘパリン様物質を産生する哺乳動物細胞が、８に定義した群のすべての改変がされたものである、８に記載の製造方法。
［１０］　以下の工程を含む、製造方法により製造される、組換えヘパリン様物質：
（１）以下の群から選択される少なくとも一つの改変がされた、CHO細胞を調製する工程；
・NDST2をコードするポリヌクレオチドの導入；
・Hs3st1をコードするポリヌクレオチドの導入；
・SDCの細胞外ドメインをコードするポリヌクレオチドの導入；及び
・Hs6st3をコードするポリヌクレオチドの導入。
・コンドロイチン硫酸N-アセチルガラクトサミン転移酵素2（chondroitin sulfate N-acetylgalactosaminyltransferase 2, CS-GalNAcT2）のノックアウト
（２）工程（１）で調製したCHO細胞を、24～33℃で、培養し、ヘパリン様物質を培養上清中に産生させる工程
［１１］　抗凝固第Xa因子活性（1mg当たりの比活性）が、100 IU/mg以上である、１０に記載の組換えヘパリン様物質。
［１２］　抗凝固第IIa因子活性（1mg当たりの比活性）が、75 IU/mg以上である、１０又は１１に記載の組換えヘパリン様物質。
CS2遺伝子ノックアウト用gRNA/Cas9発現ベクターの作製 CHO/3F-S_CKO(#24)細胞での配列解析によるCS2遺伝子破壊の確認 CHO/2F-S, CHO/3F-S及びCHO/3F-S_CKO細胞の培養３日目における培養上清中のsGAG濃度、抗FXa及び抗FIIa活性の比較。n=3, *p<0.05 vs CHO/2F-S, #p<0.05 vs CHO/3F-S CHO/2F-S, CHO/3F-S及びCHO/3F-S_CKO細胞の懸濁回分培養における培養温度を37℃と33℃にした際の生細胞濃度及びsGAG濃度の経時変化 CHO/2F-S, CHO/3F-S及びCHO/3F-S_CKO細胞の懸濁回分培養における培養温度を37℃と33℃にした際の抗ＦXa活性及び抗FIIa活性の経時変化 CHO/2F-S, CHO/3F-S及びCHO/3F-S_CKO細胞の懸濁回分培養における培養温度を37℃と33℃にした際の抗ＦXa比活性及び抗FIIa比活性の経時変化 CHO/3F-S_CKO細胞の懸濁回分培養で培養温度の影響 由来の異なる細胞株の懸濁回分培養での培養3日目における培養上清中の抗ＦXa比活性及び抗FIIa比活性の比較。#24; CHO/3F-S_CKO, #16; CHO/3F(+)-S_CKO, #30; CHO/3F(++)-S_CKO #24の細胞株の懸濁回分培養での培養3日目における培養上清中の抗ＦXa比活性及び抗FIIa比活性の比較 #24の細胞株の懸濁回分培養での培養3日目における培養上清中のsGAG濃度の比較 CHO/3F-S_CKO細胞の高密度懸濁半連続培養によるヘパリン様糖鎖の連続生産 CHO細胞の遺伝子改変に用いたベクターでの発現ユニットの構成
I. ヘパリン様物質の製造方法
　本実施形態は、以下の工程を含む、ヘパリン様物質を製造する方法を提供する。
（１）ヘパリン様物質を産生する哺乳動物細胞を調製する工程
（２）工程（１）で調製したヘパリン様物質を産生する哺乳動物細胞を、該細胞の増殖抑制上有効な温度で培養し、ヘパリン様物質を産生させる工程
＜ヘパリン様物質を産生する哺乳動物細胞を調製する工程＞
［へパリン様物質］
　本発明に関し、ヘパリン様物質というときは、ヘパリン、へパラン硫酸、及びこれらの混合物のいずれかを指す。ヘパリンはヘパラン硫酸のなかでも高度に硫酸化されたものということができる。ヘパリン及びヘパラン硫酸は、ウロン酸（β－Ｄ－グルクロン酸及びα－Ｌ－イズロン酸とグルコサミン（Ｄ－Ｎ－アセチルグルコサミン及びＤ－Ｎ－硫酸グルコサミン）の二糖が１単位となって、それらがα又はβ－１，４結合を繰り返した直鎖状の多糖である。ウロン酸の２位がＯ－硫酸化、グルコサミンの３位と６位がＯ－硫酸化されたものと、２位のアミノ基がＮ－硫酸化されたものがある。
　ヘパリン様物質は、硫酸化グリコサミノグリカン類、sulphatedglycosaminoglycans, sGAG）として当業者には周知の方法で定量できる。またヘパリン様物質の活性は、抗凝固第Xa因子（FXa）活性として、当業者には周知の方法で測定することができる。活性は、比活性（sGAGの質量あたりの活性）として表すこともできる。本実施形態により製造されるヘパリン様物質は、硫酸化レベルが高く、そのため抗凝固活性が向上している。一般に、低分子ヘパリンや合成ヘパリンでは、抗FXa活性のみが認められ、抗凝固第IIa因子（FIIa）活性は認められない。これに対し、本実施形態により製造されるヘパリン様物質は、抗FXa活性及び抗FIIa活性の両方の活性を有しうる。このことは、本発明により製造されるヘパリン様物質が市販ヘパリンと同様の構造を有している可能性を示している。
［動物細胞］
　本実施形態に用いる動物細胞の例として、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞CHO細胞［Journal of Experimental Medicine, 108, 945 (1958); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60 , 1275 (1968); Genetics, 55, 513 (1968); Chromosoma, 41, 129 (1973); Methods in Cell Science, 18, 115 (1996); Radiation Research, 148, 260 (1997); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980); Proc. Natl. Acad. Sci., 60, 1275 (1968); Cell, 6, 121 (1975); Journal of Bioscience and Bioengineering, 137, 471 (2024); Molecular Cell Genetics, Appendix I, II (pp. 883-900)］、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子が欠損したCHO細胞（CHO／DG44細胞）［Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,4216(1980)］、CHO-K1（ATCC　CCL-61）、DUkXB11（ATCC　CCL-9096）、Pro-5（ATCC　CCL-1781）、CHO-S（Life　Technologies、Cat＃11619）、Pro-3、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）、ヒト臍帯動脈内皮細胞（HUAEC）、ヒト肺微小血管内皮細胞（HLMVEC）、ヒト大動脈内皮細胞（HAoEC）、ヒト冠状動脈内皮細胞（HCAEC）、ヒト肺動脈内皮細胞（HPAEC）、ヒト胎児腎臓（HEK）、ラットミエローマ細胞YB2／3HL．P2．G11．16Ag．20（又はYB2／0ともいう）、サル細胞COS細胞、マウスミエローマ細胞NSO、マウスミエローマ細胞SP2／0-Ag14、シリアンハムスター細胞BHK又はHBT5637（日本国特開昭63-000299号公報）、哺乳動物由来マスト細胞が挙げられる。
　一態様では、生産効率等の観点から、CHO細胞、CHO／DG44細胞又はCHO-K1（ATCC　CCL-61）、CHO-S細胞を、後述するように形質転換して用いる。
　また別の態様では、元来、ヘパリンを生産することができる、マスト細胞を用いる。哺乳動物由来マスト細胞の例として、HMC-1.2（ヒトマスト細胞株）、IC-2（マスト細胞前駆体細胞のクローン）、LT4Tr（マスト細胞前駆体細胞のクローンLT4から自然転換した細胞株）、P-815（マウスマスト細胞腫）、MEDMC-NT2（マウスマスト細胞系細胞株、MEDMC-BRC6（マウスマスト細胞系細胞株。マウスES細胞（BRC6; AES0010）由来、C57BL/6系統）が挙げられる。
　本実施形態の製造方法においては、好ましい態様の一つでは、以下の群から選択される少なくとも一つの改変がなされた動物細胞を用いることができる。
(i)　ヘパラン硫酸エステルN－脱アセチラーゼ/N－硫酸転移酵素（NDST2）をコードするポリヌクレオチド；
(ii) へパラン硫酸エステルグルコサミン3　硫酸転移酵素１（Hs3st1）をコードするポリヌクレオチド；
(iii) シンデカン（SDC）の細胞外ドメインをコードするポリヌクレオチドの導入；及び
(iv) 硫酸化経路の各ステップに関与するタンパク質（輸送体、酵素等）をコードするポリヌクレオチド。
　上記の群のうち、少なくとも２つの改変、より特定すると(i)及び(ii)の改変が行われていることが好ましく、少なくとも３つの改変、より特定すると(i)、(ii)、及び(iii)の改変が行われていることがより好ましく、すべての改変が行われていることがさらに好ましい。
［ヘパラン硫酸エステルN－脱アセチラーゼ/N－硫酸転移酵素（NDST2）]
　本実施形態の製造方法に用いられる動物細胞には、NDST2をコードするポリヌクレオチドが導入されていてもよい。NDST2は、硫酸転移酵素1タンパク質のN－脱アセチラーゼ/N－硫酸転移酵素サブファミリーの一員であり、N-脱アセチル化とN-硫酸化という２つの機能を有する酵素である。ヘパラン硫酸エステルN－脱アセチラーゼ/N－硫酸転移酵素の両機能性の酵素をコードするポリヌクレオチドの代わりに、N-脱アセチル化の機能を有する酵素をコードするポリヌクレオチド、及びN-硫酸化の機能を有する酵素をコードするポリヌクレオチドの、2つのポリヌクレオチドを導入することでもよい。
　NDST2をコードするポリヌクレオチドの好ましい例は、下記のいずれかである。
(A2)配列番号1又は13に記載の配列からなるポリヌクレオチド;
(B2)配列番号1又は13に記載の配列と相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつNDST2活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(C2)配列番号1又は13に記載の配列と90%以上の同一性を有する配列からなり、かつNDST2活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(D2)配列番号2又は14に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(E2)配列番号2又は14に記載のアミノ酸配列において複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、かつNDST2活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(F2)配列番号2又は14に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつNDST2活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［へパラン硫酸エステルグルコサミン3　硫酸転移酵素１（Hs3st1）］
　本実施形態の製造方法に用いられる動物細胞には、Hs3st1をコードするポリヌクレオチドが導入されていてもよい。Hs3st1は、ヘパラン硫酸生合成酵素ファミリーの一員であり、ヘパラン硫酸グルコサミニル3-O-硫酸転移酵素活性と抗凝固性ヘパラン硫酸変換活性の両方を有し、抗凝固性ヘパラン合成の速度制限酵素である。
　Hs3st1をコードするポリヌクレオチドの好ましい例は、下記のいずれかである。
(A3)配列番号9、15、又は19に記載の配列からなるポリヌクレオチド;
(B3)配列番号9、15、又は19に記載の配列と相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつHs3st1活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(C3)配列番号9、15、又は19に記載の配列と90%以上の同一性を有する配列からなり、かつHs3st1活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(D3)配列番号10、16、又は20に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(E3)配列番号10、16、又は20に記載のアミノ酸配列において複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、かつHs3st1活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(F3)配列番号10、16、又は20に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつHs3st1活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［シンデカン（SDC）の細胞外ドメイン］
　本実施形態の製造方法に用いられる動物細胞には、シンデカンの細胞外ドメインをコードするポリヌクレオチドが導入されていてもよい。シンデカンは、保持された原形質膜ドメインと細胞質ドメインを持った細胞表面の4種のプロテオグリカンファミリーの一員である。シンデカンの構造は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインからなる。このうち、細胞外ドメインはグリコサミノグリカン結合部位を含んでいる。
　シンデカンの細胞外ドメインをコードするポリヌクレオチドの好ましい例は、下記のいずれかである。
(A4)配列番号11に記載の配列からなるポリヌクレオチド;
(B4)配列番号11に記載の配列と相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつヘパリン様物質生産性動物細胞に導入したときに、培養上清のヘパリン様物質の量を増加する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(C4)配列番号11に記載の配列と90%以上の同一性を有する配列からなり、かつヘパリン様物質生産性動物細胞に導入したときに、培養上清のヘパリン様物質の量を増加する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(D4)配列番号12に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(E4)配列番号12に記載のアミノ酸配列において複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、かつヘパリン様物質生産性動物細胞に導入したときに、培養上清のヘパリン様物質の量を増加する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(F4)配列番号12に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつヘパリン様物質生産性動物細胞に導入したときに、培養上清のヘパリン様物質の量を増加する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
　シンデカンの細胞外ドメインをコードするポリヌクレオチドに関し、培養上清のヘパリン様物質の量を増加する機能を有するとは、シンデカンの細胞外ドメインをコードするポリヌクレオチドが導入されていないヘパリン様物質生産性動物細胞に、対象となるポリヌクレオチドを導入したときに、導入前の場合と比較して、培養上清のヘパリン様物質の量が増加することをいう。ここでいうヘパリン様物質生産性動物細胞の例は、NDST2をコードするポリヌクレオチド、及びHs3st1をコードするポリヌクレオチドが導入されたCHO細胞である。より具体的な例として、CHO-S/NH細胞（特許文献１参照）が挙げられる。
［硫酸化経路の各ステップに関与するタンパク質（輸送体、酵素等）］
　本実施形態の製造方法に用いられる動物細胞には、硫酸化経路の各ステップに関与するタンパク質（輸送体、酵素等）をコードするポリヌクレオチドが導入されていてもよい。硫酸化経路の各ステップに関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチドは下記を含む。
・細胞内への硫酸イオンの輸送体（例えば、SLC26A1、SLC26A2、SLC13A1、SLC13A4）をコードする遺伝子、
・硫酸イオンからPAPSを合成する酵素（例えば、SLC26A1、SLC26A2、SLC13A1、SLC13A4）をコードする遺伝子、
・PAPSのゴルジ体への輸送体（例えば、PAPSS1、PAPSS2）をコードする遺伝子、
・糖鎖の変換酵素（例えば、Glce）をコードする遺伝子、
・脱N-アセチル化/N-硫酸化酵素（例えば、NDST1、NDST2）をコードする遺伝子、
・2-O-硫酸化酵素（例えば、Hs2st）をコードする遺伝子、
・6-O-硫酸化酵素（例えば、Hs6st1、Hs6st2、Hs6st3）をコードする遺伝子、
・3-O-硫酸化酵素（例えば、Hs3st1、Hs3st5）をコードする遺伝子
　本発明者らの検討によると、これらの硫酸化経路の各ステップに関与するタンパク質をコードする遺伝子のうち、6-O-硫酸化酵素遺伝子を導入することが好ましく、Hs6st3遺伝子を導入することがより好ましい。導入により、ヘパリン様物質生産性動物細胞の産生するヘパリン様物質の硫酸化レベルを高め、抗凝固第Xa因子活性を向上するからである。
　Hs6st3遺伝子、すなわちHs6st3をコードするポリヌクレオチドの好ましい例は、下記のいずれかである。
(A)配列番号7又は17に記載の配列からなるポリヌクレオチド;
(B)配列番号7又は17に記載の配列と相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつヘパリン様物質生産性動物細胞の産生するヘパリン様物質の抗凝固第Xa因子活性を向上する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(C)配列番号7又は17に記載の配列と90%以上の同一性を有する配列からなり、かつヘパリン様物質生産性動物細胞の産生するヘパリン様物質の抗凝固第Xa因子活性を向上する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(D)配列番号8又は18に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(E)配列番号8又は18に記載のアミノ酸配列において複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、かつヘパリン様物質生産性動物細胞の産生するヘパリン様物質の抗凝固第Xa因子活性を向上する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(F)配列番号8又は18に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつヘパリン様物質生産性動物細胞の産生するヘパリン様物質の抗凝固第Xa因子活性を向上する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
　Hs6st1遺伝子、すなわちHs6st1をコードするポリヌクレオチドの好ましい例は、下記のいずれかである。
(A5)配列番号3に記載の配列からなるポリヌクレオチド;
(B5)配列番号3に記載の配列と相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつヘパリン様物質生産性動物細胞の産生するヘパリン様物質の抗凝固第Xa因子活性を向上する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(C5)配列番号3に記載の配列と90%以上の同一性を有する配列からなり、かつヘパリン様物質生産性動物細胞の産生するヘパリン様物質の抗凝固第Xa因子活性を向上する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(D5)配列番号4に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(E5)配列番号4に記載のアミノ酸配列において複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、かつヘパリン様物質生産性動物細胞の産生するヘパリン様物質の抗凝固第Xa因子活性を向上する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(F5)配列番号4に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつヘパリン様物質生産性動物細胞の産生するヘパリン様物質の抗凝固第Xa因子活性を向上する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
　Hs6st2遺伝子、すなわちHs6st2をコードするポリヌクレオチドの好ましい例は、下記のいずれかである。
(A6)配列番号5に記載の配列からなるポリヌクレオチド;
(B6)配列番号5に記載の配列と相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつヘパリン様物質生産性動物細胞の産生するヘパリン様物質の抗凝固第Xa因子活性を向上する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(C6)配列番号5に記載の配列と90%以上の同一性を有する配列からなり、かつヘパリン様物質生産性動物細胞の産生するヘパリン様物質の抗凝固第Xa因子活性を向上する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(D6)配列番号6に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(E6)配列番号6に記載のアミノ酸配列において複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、かつヘパリン様物質生産性動物細胞の産生するヘパリン様物質の抗凝固第Xa因子活性を向上する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(F6)配列番号6に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつヘパリン様物質生産性動物細胞の産生するヘパリン様物質の抗凝固第Xa因子活性を向上する機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
　6-O-硫酸化酵素をコードするポリヌクレオチドに関し、ヘパリン様物質生産性動物細胞の産生するヘパリン様物質の抗凝固第Xa因子活性を向上する機能を有するとは、6-O-硫酸化酵素をコードするポリヌクレオチドが導入されていないヘパリン様物質生産性動物細胞に、対象となるポリヌクレオチドを導入したときに、導入前の場合と比較して、ヘパリン様物質生産性動物細胞の産生するヘパリン様物質の抗凝固第Xa因子活性が向上することをいう。ここでいうヘパリン様物質生産性動物細胞の例は、NDST2をコードするポリヌクレオチド、Hs3st1をコードするポリヌクレオチド、及びSDCの細胞外ドメインをコードするポリヌクレオチドが導入されたCHO細胞である。より具体的な例として、CHO-S/NH-SDC細胞（特許文献１参照）が挙げられる。
［コンドロイチン硫酸N-アセチルガラクトサミン転移酵素（CSGALNACT）］
　本実施形態の製造方法に用いられる動物細胞は、コンドロイチン硫酸N-アセチルガラクトサミン転移酵素（CSGALNACT）において、機能が低下している、又は機能不能であることが好ましい。CSGALNACTとして、I型（CS1）、及びII型（CS2）が挙げられる。機能低下、又は機能不能とするためには、用いる動物細胞において、その酵素をコードする遺伝子をノックアウトすることにより達成できる。一態様では、用いる動物細胞において、CSGalNAcT1 (Chondroitin sulfate N-acetylgalactosaminyltransferase 1, CS1)遺伝子、CSGalNAcT2 (Chondroitin sulfate N-acetylgalactosaminyltransferase 2, CS2)遺伝子の少なくとも一方がノックアウトされる。十分な比活性の向上が期待できている観点からは、CS2遺伝子がノックアウトされる。ノックアウトのための方法として、ゲノム編集CRISPR/Cas9システムが利用できる。
　CS1遺伝子、すなわちCS1をコードするポリヌクレオチドの好ましい例は、下記のいずれかである。
(A7)配列番号21に記載の配列からなるポリヌクレオチド;
(B7)配列番号21に記載の配列と相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつCS1活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(C7)配列番号21に記載の配列と90%以上の同一性を有する配列からなり、かつCS1活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(D7)配列番号22に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(E7)配列番号22に記載のアミノ酸配列において複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、かつCS1活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(F7)配列番号22に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつCS1活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
　CS2遺伝子、すなわちCS2をコードするポリヌクレオチドの好ましい例は、下記のいずれかである。
(A8)配列番号23に記載の配列からなるポリヌクレオチド;
(B8)配列番号23に記載の配列と相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつCS2活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(C8)配列番号23に記載の配列と90%以上の同一性を有する配列からなり、かつCS2活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(D8)配列番号24に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(E8)配列番号24に記載のアミノ酸配列において複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、かつCS2活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(F8)配列番号24に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつCS2活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
　本発明者らの検討によると、CS2遺伝子のノックアウトにより、抗FXa比活性、及び抗FIIa比活性を、ノックアウトしていない元の細胞に比較して向上させ得る。
［動物細胞の調製］
　本実施形態の製造方法における、ヘパリン様物質を産生する哺乳動物細胞を調製する工程では、所定の動物細胞が調製されるが、調製とは、培養する細胞を、培養スケールに応じて必要な数量で準備することを指す。
＜増殖抑制上有効な温度で培養し、ヘパリン様物質を産生させる工程＞
　本実施形態のヘパリン様物質の製造方法は、上記の工程で調製された動物細胞を培養し、ペパリン様物質を産生させるが、このペパリン様物質の産生を増殖抑制上有効な温度で実施することを特徴の一つとする。
［温度］
　増殖抑制上有効な温度とは、その温度で対象となる細胞を培養した際に、増殖上至適な温度で培養した場合に比較して、増殖が抑制される温度をいう。増殖上至適な温度とは、増殖の速さが最も大きい温度をいう。増殖が抑制される度合いは様々であり得るが、例えば、適切な細胞密度（例えば1×106cells/ml）で培養を開始したときの培養4日目の時点での細胞数が、至適な温度で培養した場合の80％以下、70％以下、60％以下、50％以下、40％以下、30%以下、20％以下、10％以下、5％以下であることを指す。なお、本発明に関し細胞数を言うときは、特に記載した場合を除き、生細胞の数をいう。
　増殖抑制上有効な温度は、増殖上至適な温度を、下方に変化させた温度であり得る。下方に変化させる程度は、細胞が目的の機能を発揮できる限り特に限定されない。一般に、動物細胞の培養においては、温度が低すぎると細胞が増殖しないだけでなく、目的の機能が抑制され、さらには生育が維持できない状態となりうる。したがって、増殖上有効な温度は、増殖上至適な温度を、例えば2～15℃、2～14℃、3～14℃、又は4～13℃、下方に変化させた温度であり得る。
　本実施形態のヘパリン様物質の製造方法において、CHO細胞を形質転換したものを用いる場合、増殖抑制上有効な温度は、23～35℃であり、好ましくは23～34℃であり、より好ましくは24～34℃、例えば24℃、26℃、28℃、30℃、33℃である。
　本発明に関し、動物細胞の培養の温度をいうときは、特に記載した場合を除き、培養中の培養液の温度を指す。培養中の培養液の温度は、従来の方法により測定でき、また制御できる。
［他の条件］
　培養における温度以外の条件は、ヘパリン様物質の産生を促進する条件であることが好ましい。
　培地は、少なくとも細胞の生存率を維持し、ヘパリン様物質の発現を可能にするために十分な炭素、窒素、酸素及び他の栄養素、成長因子、緩衝剤、補因子及び他の任意の物質を含有することが好ましい。ヘパリン様物質をコードする遺伝子が誘導性プロモーターの制御下にあるか、又は誘導性プロモーターを含む実施形態では、培地はさらにインデューサーを含んでもよい。
　培地としては、例えば、10％ウシ胎児血清（FCS）を添加したRPMI又はDMEM、並びに抗菌剤、増殖因子、他のサイトカインなどの因子を添加した組織培養培地が挙げられる（例えば、Cell Biology (Third Edition) A Laboratory Handbook, vol. 1, 2006, Elsevier Inc.）。具体的には例えば、当業者に公知の培地製剤、例えば、RPMI、IMDM、DMEM、DMEM／F12、無血清又は低血清のEMEMが挙げられる。これらの培地は、抗生物質、脂質、トランスフェリン、インスリン、アミノ酸などの追加の栄養補助食品、及び必要に応じて補因子を含んでもよい。
　一態様では、培地は、産生された物質の精製が簡素化できることや、精製物への夾雑物の混入の懸念がより少ないとの観点から、無血清培地、又は動物由来成分不含培地を用いる。このような培地は、抗体等の有用物質産生のために広く用いられており、本実施形態の製造方法のためにも適宜用いることができる。本実施形態のためには、動物由来成分不含の培地として市販されているものを用いてもよい。そのような例として、FreeStyle CHO Expression Medium (Thermo Fisher Scientific社)、FreeStyle 293 Expression Medium (Thermo Fisher Scientific社)、FreeStyle F17 (Thermo Fisher Scientific社)、Viral Production Medium (Thermo Fisher Scientific社)、BalanCD Transfectory CHO(富士フイルム和光純薬株式会社)、BalanCD HEK293 medium(富士フイルム和光純薬株式会社)が挙げられる。
　ヘパリン様物質の産生を促進する観点から、培地は、グルコース、硫酸塩及びリン酸から選ばれる少なくとも1を含有することが好ましい。培地におけるグルコースの濃度は、通常5～75mMであることが好ましく、より好ましくは10～60mM、さらに好ましくは15～35mMである。培地における硫酸塩の濃度は、通常0．5～50mMであることが好ましく、より好ましくは10～50mM、さらに好ましくは30～50mMである。培地におけるリン酸塩の濃度は、通常0．5～50mMであることが好ましく、より好ましくは1～50mM、さらに好ましくは10～50mMである。
　培養上清中にヘパリン様物質を生成蓄積させ、培養上清から採取することにより、ヘパリン様物質を製造することができる。組換え細胞を培地中で培養する方法は、通常の方法に従って行うことができる。培養は、通常pH6～8、5％CO2存在下などの条件下で行う。培養は、比較的高い密度で実施することができ、また細胞の回収が容易であることから、浮遊培養（懸濁培養）であることが好ましい。
　培養は、回文（バッチ）培養、流加（フェドバッチ）培養、連続培養のいずれであってもよい。培養液を回収することにより、産生されたヘパリン様物質を回収することができる。回文培養では、細胞は最初培地中で培養され、この培地は除去も、交換も、添加も行わないことができる。所望の生成物は培養行程の終了時に回収される。流加培養では、培養期間中、新しい培地が適宜供給される。供給は、毎日(連日)、1日おき、2日に1回など、1日に1回以上、又は1日に1回未満などを含むことができる。連続培養の場合、新鮮培地を適宜補充し、培養液一部が回収されるが、その際に適切であれば細胞の一部を回収し、細胞密度を適切に保つようにしてもよい。連続培養の場合、数週間以上、例えば2週間以上、4週間以上、8週間以上、12週間以上、24週間以上、連続して行うことができる。回収操作は、毎日行ってもよく、数日毎、例えば、２～４日毎に行ってもよい。
　適切な回収のタイミングを培養上清における目的物質の濃度や活性により決定してもよい。例えば培養上清の抗FXa活性、抗FIIa活性の少なくとも一方が十分に高くなったときに回収することができる。
　ヘパリン様物質が産生されていることは、培養上清にヘパリンリアーゼI、II、IIIを含む酵素溶液を添加して酵素処理後、不飽和二糖分析用HPLCで定量することにより確認できる。組換え細胞からのヘパリン様物質の分泌生産は、培養上清中におけるsGAG量を測定することによっても確認できる。
　一態様では、細胞からは、培養上清中にGAGであるヘパリン様物質に結合したコアタンパク質を含む糖タンパク質であるプロテオグリカンが分泌される。培養上清からのタンパク質の単離は、当該分野で従来公知の方法により行う。例えば、アフィニティータグのようなヘパリン様物質の単離を容易にするタグを用いてもよい。タグとしては、例えば、ポリヒスチジン（His6タグ）、ニッケルマトリックス、キチン結合タンパク質（CBP）、マルトース結合タンパク質（MBP）、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）、FLAGタグ又はエピトープタグが挙げられる。
　コアタンパク質からのヘパリン様物質の単離は、当該技術分野において従来公知の方法により行う。例えば、ヘパリナーゼを用いた酵素消化法、水酸化ナトリウム又はアルカリ水素化ホウ素による処理が挙げられる。
　得られるヘパリン様物質は、様々な長さの二糖単位の繰り返し構造を含み得る。ヘパリン様物質は、UA-GlcNAc（6S）、UA（2S）-GlcNAc、UA-（2S）-GlcNAc（6S）、UA-GlcNS、UA-GlcNS（6S）、UA（2S）-GlcNS、UA（2S）-GlcNS（6S）のいずれかを含むことが好ましく、これらはヘパリン様物質中に任意の順序で存在してもよい。
　上記において、UAはウロン酸残基（すなわち、グルクロン酸又はイズロン酸）、Acはアセチル、GlcNAcはN-アセチルグルコサミン、GlcNSはグルコサミン-N-硫酸、2Sは2-O-硫酸塩、6Sは6-O-硫酸塩である。
＜得られるヘパリン様物質＞
　一態様では、本実施形態の製造方法により得られるヘパリン様物質は、低分子ヘパリン様物質である。特定の態様では、本実施形態の製造方法により得られるヘパリン様物質の分子量は、3,000～10,000である。
　本実施形態の製造方法により、抗凝固第Xa因子（FXa）比活性が、50 IU/mg以上であるヘパリン様物質を得ることができる。好ましい態様では、抗FXa比活性は90 IU/mg以上とすることができ、100 IU/mg以上、110 IU/mg以上、120 IU/mg以上、130 IU/mg以上、150 IU/mg以上、170 IU/mg以上、200 IU/mg以上、250 IU/mg以上であり得る。
　また本実施形態の製造方法により、抗凝固第IIa因子（FIIa）比活性が、20 IU/mg以上であるヘパリン様物質を得ることができる。好ましい態様では、抗FIIa比活性は40 IU/mg以上とすることができ、50 IU/mg以上、75 IU/mg以上、100 IU/mg以上、130 IU/mg以上、150 IU/mg以上、200 IU/mg以上であり得る。
　本発明に関し、抗FXa比活性あるいは抗FIIa比活性を数値で示すときは、特に記載した場合を除き、下記の測定原理による方法でヘパリン活性として測定した値を、下記の測定原理によりグルコサミノグリカン総量の濃度として測定した値で除して算出した値である。
　ヘパリン活性（抗FXa活性）測定原理：
　サンプルにアンチトロンビンIIIを加え、ヘパリン・アンチトロンビンIII複合体とし、これに一定過剰量の凝固第Ｘa因子を加えて反応させると、ヘパリン・アンチトロンビンIII複合体は、その量に応じて凝固第Ｘa因子と結合し、活性のないヘパリン・アンチトロンビンIII・凝固第Ｘa因子複合体を形成する。これに基質（N－ベンゾイル－L－イソロイシル－L－グルタミル（γ－OR）－グリシル－L－アルギニル－p－ニトロアニリド・塩酸塩）を加えると、残存凝固第Ｘa因子活性に相当するp－ニトロアニリンが遊離する。この凝固第Ｘa因子の残存活性は、サンプル中のヘパリン活性（抗FXa活性）を反映するので、この遊離したp－ニトロアニリンを405nmで比色定量することによりサンプルのヘパリン活性（抗FXa活性）を求めることができる。
　この原理による測定は、市販のヘパリン測定キット、例えばテストチーム　ヘパリンＳ#30564000（積水メディカル）を用いて行うことができ、また抗FXa活性についてはBIOPHEN HEPARIN ANTI-Xa 2 stage（HBM）、抗FIIa活性についてはBIOPHEN HEPARIN ANTI-IIa 2 stage（HBM）を用いて行うことができる。この場合、スタンダードとして試薬として販売されているもの、例えばヘパリンナトリウム（製品コード081-00131,085-00134,081-00136,087-00133、富士フィルム和光純薬）を用いることができる。
　グルコサミノグリカン測定原理：
　サンプルに、硫酸化糖鎖に特異的に結合するBlyscan Dye(1,9-dimethyl-methylene blue)を加え、サンプル中の可溶性硫酸化プロテオグリカン及び硫酸化グリコサミノグリカンをペレットとする。ペレットから試薬で色素を溶出し、656 nmで比色定量することによりサンプルのグルコサミノグリカン総量の濃度を求めることができる。
　この原理による測定は、市販のグリコサミノグリカン測定キット、例えばBlyscan Glycosaminoglycan Assay Kit（商品コードB1000,Biocolor）を用いて測定することができる。
　本実施形態の製造方法により得られたヘパリン様物質は、市販ヘパリンと同等の比活性を有しうる。このようなヘパリン様物質は、新規なものである可能性がある。したがって、本実施形態は、下記の製造方法により製造される組換えヘパリン様物質を提供する。
（１）以下の群から選択される少なくとも一つの改変がされた、CHO細胞を調製する工程；
・NDST2をコードするポリヌクレオチドの導入；
・Hs3st1をコードするポリヌクレオチドの導入；
・SDCの細胞外ドメインをコードするポリヌクレオチドの導入；及び
・Hs6st3をコードするポリヌクレオチドの導入。
・コンドロイチン硫酸N-アセチルガラクトサミン転移酵素2（chondroitin sulfate N-acetylgalactosaminyltransferase 2, CS-GalNAcT2）のノックアウト
（２）工程（１）で調製したCHO細胞を、24～33℃で、培養し、ヘパリン様物質を培養上清中に産生させる工程
＜その他＞
［ポリヌクレオチド、タンパク質］
　本発明に関し、ポリヌクレオチド、又はタンパク質というときは、特に記載した場合を除き、ヒト由来であってもよく、ヒト以外の哺乳類動物由来のものであってもよい。ヒト以外の哺乳類動物には、ブタ、マウス、ラット、ハムスターが含まれる。
　本発明に関し、ポリヌクレオチドについてストリンジェントな条件下でハイブリダイズするというときは、特に記載した場合を除き、いずれのポリヌクレオチドにおいても、ハイブリダイゼーションの条件は、Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 4th ed. (Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Laboratory Press)及びHybridization of Nucleic Acid Immobilization on Solid Supports(ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 138,267-284(1984))の記載に従い、取得しようとするポリヌクレオチドに合わせて適宜選定することができる。例えば50%以上の同一性を有するDNAを取得する場合、6倍濃度のSSC溶液(1倍濃度のSSC溶液の組成は、150 mM塩化ナトリウム、15 mMクエン酸ナトリウムよりなる)及び5%ホルムアミドの存在下、40℃でハイブリダイゼーションを行った後、4倍濃度のSSC溶液を用い、49℃でフィルターを洗浄する条件を用いればよい。また85%以上の同一性を有するDNAを取得する場合、2倍濃度のSSC溶液及び50%ホルムアミドの存在下、40℃でハイブリダイゼーションを行った後、0.1倍濃度のSSC溶液を用い、57℃でフィルターを洗浄する条件を用いればよい。また90%以上の同一性を有するDNAを取得する場合、2倍濃度のSSC溶液及び50%ホルムアミドの存在下、45℃でハイブリダイゼーションを行った後、0.1倍濃度のSSC溶液を用い、62℃でフィルターを洗浄する条件を用いればよい。
　また、本発明に関し、タンパク質又はアミノ酸配列について1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列というときの置換等されるアミノ酸の個数は、特に記載した場合を除き、いずれのタンパク質においても、そのアミノ酸配列からなるタンパク質が所望の機能を有する限り特に限定されないが、1-250個、1-200個、1-150個、1-100個、1-50個、1-40個、1-30個、1-20個、1-15個、1-9個又は1-4個程度であるか、性質の似たアミノ酸への置換であれば、さらに多くの個数の置換等がありうる。このようなアミノ酸配列に係るポリヌクレオチド又はタンパク質を調製するための手段は、当業者にはよく知られている。
　本発明に関し、ヌクレオチド配列（塩基配列ということもある。）又はアミノ酸配列に関し、同一性というときは、特に記載した場合を除き、2つの配列を最適の態様で整列させた場合に、2つの配列間で共有する一致したヌクレオチド又はアミノ酸の個数の百分率を意味する。すなわち、同一性＝(一致した位置の数/位置の全数)×100で算出でき、市販されているアルゴリズムを用いて計算することができる。また、このようなアルゴリズムは、Altschul et al., J. Mol. Biol. 215(1990)403-410に記載されるNBLAST及びXBLASTプログラム中に組込まれている。より詳細には、配列の同一性に関する検索・解析は、当業者には周知のアルゴリズム又はプログラム(例えば、BLASTN、BLASTP、BLASTX、ClustalW)により行うことができる。プログラムを用いる場合のパラメーターは、当業者であれば適切に設定することができ、また各プログラムのデフォルトパラメーターを用いてもよい。これらの解析方法の具体的な手法もまた、当業者には周知である。同一性の計算には遺伝子情報処理ソフトウェア　GENETIX(登録商標)(株式会社ゼネティックス)を用いてもよい。なお、同一性%を求める対象配列が、末端にタグ配列等の、比較する配列には存在しない付加配列を有する場合には、その付加配列部分は同一性%の計算には含めない。
　本発明に関し、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列について、同一性というときは、特に記載した場合を除き、いずれの場合も、少なくとも50%、例えば60%以上、70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、さらに好ましくは97.5%以上、さらに好ましくは99%以上の配列の同一性を指す。
　本実施形態で用いるポリヌクレオチド又は遺伝子、及びタンパク質又は酵素は、当業者であれば、従来技術を利用して調製することができる。
　デフォルトのパラメータとしては、G（Cost to open gap）が塩基配列の場合は5、アミノ酸配列の場合は11、-E(Cost to extend gap）が塩基配列の場合は2、アミノ酸配列の場合は1、-q（Penalty for nucleotide mismatch）が-3、-r（reward for nucleotide match）が1、-e（expect value）が10、-W（wordsize）が塩基配列の場合は11残基、アミノ酸配列の場合は3残基、-y［Dropoff（X）for blast extensions in bits］がblastnの場合は20、blastn以外のプログラムでは7、-X（X dropoff value for gapped alignment in bits）が15及び-Z（final X dropoff value for gapped alignment in bits）がblastnの場合は50、blastn以外のプログラムでは25である（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch）。
　目的とするアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、部位特異的変異導入法［Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)］などを用いて、例えば配列番号1～3のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするDNAに、部位特異的変異を導入することにより得ることができる。
［組換え細胞］
　本発明に関し、動物細胞の改変は、所定のポリヌクレオチドを含む組換えベクターを、宿主細胞となる動物細胞に導入することにより達成できる。
　組換えベクターとしては、使用する宿主細胞における自律複製又は染色体中への組込みが可能で、ポリペプチドをコードするDNAを転写できる位置に、適当なプロモーターを含有しているものであればいずれも用いることができる。
　組換えベクターには、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。さらに、該組換えベクターには、プロモーターを制御する遺伝子を含んでいてもよい。
　組換えベクターとしては、リボソーム結合配列であるコザック配列を開始コドン周辺に適当に配置したプラスミドを用いることが好ましい。
　DNAの塩基配列において、宿主内での発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することができ、これにより目的とするNDST2及びHs3st1の生産率を向上させることができる。
　組換えベクターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、pcDNA I、pcDM8（フナコシ社）、pAGE107［日本国特開平03-22979号公報； Cytotechnology, 3, 133 (1990)］、pAS3-3（日本国特開平02-227075号公報）、pcDM8［Nature, 329, 840 (1987)］、pcDNA I／Amp（インビトロジェン社）、pcDNA3．1（インビトロジェン社）、pREP4（インビトロジェン社）、pAGE103［J. Biochemistry, 101, 1307 (1987)］、pAGE210、pME18SFL3、pKANTEX93（国際公開第97／10354号）、N5KG1val（米国特許第6001358号明細書）、INPEP4（Biogen-IDEC社）及びトランスポゾンベクター（国際公開第2010／143698号）などが挙げられる。
　プロモーターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（CMV）のimmediate early（IE）遺伝子のプロモーター、SV40の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、SRαプロモーター、又はモロニーマウス白血病ウイルスのプロモーター若しくはエンハンサーが挙げられる。また、ヒトCMVのIE遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
　組換えベクターは選択マーカーを含む場合がある。選択マーカーは、遺伝子を含有する細胞の選択を可能にする遺伝子である。選択には正の選択と負の選択がある。正の選択とは、正の選択が起こって、選択マーカーを含有する細胞を選択するプロセスを指す。薬剤耐性が正の選択マーカーの一例であり、マーカーを含有する細胞は薬剤含有培養培地中で生存し、マーカーのない細胞は死滅する。選択マーカーとしては、G418耐性を与えるneo；ハイグロマイシン耐性を与えるhygr；及びピューロマイシン耐性を与えるpuroなどの薬剤耐性遺伝子が挙げられる。他の正の選択マーカー遺伝子には、マーカーを含有する細胞の同定又はスクリーニングを可能にする遺伝子が含まれる。これらの遺伝子としては、とりわけ、蛍光タンパク質（GFP及びGFP様発色団、ルシフェラーゼ）遺伝子、lacZ遺伝子、アルカリ性ホスファターゼ遺伝子、及びCD8などの表面マーカーが挙げられる。負の選択とは、適切な負の選択薬剤に曝露して、負の選択マーカーを含有する細胞を死滅させるプロセスを指す。例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSV-tk）遺伝子を含有する細胞［Wigler et al, Cell 11:223 (1977)］は薬剤ガンシクロビル（GANC）に対して感受性である。同様に、gpt遺伝子は細胞を6-チオキサンチン感受性にする。
　宿主細胞への組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にDNAを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、エレクトロポレーション法［Cytotechnology、3、133(1990)］、リン酸カルシウム法（日本国特開平02-227075号公報）、又はリポフェクション法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)］などが挙げられる。
II. ヘパリン様物質、及びそれを含む医薬組成物
　本実施態様は、本明細書に記載の方法により製造されたヘパリン様物質又はその断片、及びそれ含む医薬組成物を提供する。医薬組成物に含まれるヘパリン様物質又はその断片は、コアタンパク質に結合していてもよい。医薬組成物は他の治療薬を含有してもよい。また、医薬組成物は、例えば、慣用のビヒクル又は希釈剤、ならびに所望の投与方法に適したタイプの医薬添加剤（例えば賦形剤、結合剤、保存剤）を使用することにより処方され得る。
　医薬組成物の形態としては、例えば、滅菌注射用水性剤が挙げられる。滅菌注射用水性剤は、適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を使用して、既知の技術に従って処方することができる。滅菌注射用水性剤は、例えば1，3-ブタンジオール中の溶液のような、無毒の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の滅菌注射用溶液又は懸濁液であってもよい。使用可能な許容されるビヒクル及び溶媒は、水、リンゲル液及び等張食塩水である。
　医薬組成物の剤型は特に限定されず、多種多様な剤型とすることができる。医薬組成物を投与するための剤型としては、例えば、組成物は、錠剤、カプセル剤、サシェ剤、トローチ剤、丸剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、液剤、懸濁剤、エリキシル剤、シロップ剤、軟膏剤、クリーム剤などの形態での投与、静脈内投与若しくは注射、ペースト、エマルジョン又は溶液が挙げられる。また、例えば、パッチメカニズム又は軟膏による経皮投与が挙げられる。これらのいずれも、徐放及び／又は持続放出製剤に改変してもよい。
　薬学的に許容される担体には、ビヒクル、アジュバント、界面活性剤、懸濁剤、乳化剤、不活性充填剤、希釈剤、賦形剤、湿潤剤、結合剤、滑沢剤、緩衝剤、崩壊剤及び担体が含まれるがこれらに限定されない。典型的には、薬学的に許容される担体は活性化合物に対して化学的に不活性であり、そして使用条件下で有害な副作用又は毒性を有さない。薬学的に許容される担体の性質は、使用される特定の剤型及び組成物の他の特徴に応じて異なり得る。
III. 治療方法及び予防方法
　本実施形態は、本実施形態の方法により製造されたヘパリン様物質又はその断片を投与することを含む、それを必要とする被験体における血液凝固又は血液凝固に関連する又はそれによって引き起こされる状態を治療又は予防する方法を提供する。本態様において、ヘパリン様物質又はその断片は、コアタンパク質に結合していてもよい。血液凝固又は血液凝固に関連する又はそれによって引き起こされる状態としては、例えば、急性冠症候群、心房細動、深部静脈血栓症又は肺塞栓症が挙げられる。
　前記被験体は哺乳動物をいう。哺乳動物としては、例えば、ヒト、霊長類、家畜動物（例えば、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ブタ）、コンパニオンアニマル（例えば、イヌ、ネコ）、実験室試験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター）、捕獲野生動物（例えば、キツネ、シカ）が挙げられる。哺乳動物は、典型的にはヒト又は霊長類であり、より典型的にはヒトである。
　投与量及び投与時期は、血液凝固又は血液凝固に関連する状態の治療、予防又は管理において治療上の利益を提供する投与量及び時期であることが好ましい。有効である具体的な投与量及び投与時期は、被験体の状態、病歴、体格、体重、年齢などの要因に応じて変動し得る。
　以下に実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
１．CHO細胞培養
(1) 培地の組成
　CHO-S（Cat. No. R80007, Invitrogen）、CHO/2F-S、 CHO/3F-S、及びCHO/3F-S_CKO 細胞を培養するための培地として、FreeStyle CHO Expression Medium（Cat. No. 12651014, Invitrogen）を用いた。抗生物質としてペニシリン（Cat. No. 021-07732, Wako）及びストレプトマイシン（Cat. No. 194-08512, Wako）を添加した。また、培地中に最終濃度8 mMとなるようにL-グルタミン（Cat. No. 074-00522, Wako）を添加した。通常、細胞の培養は、24-well tissue culture plate（Cat. No. 150466、Nunc）へ1.2×105 cells/wellで細胞を播種し、37℃で湿潤に保った5% CO2インキュベーター内で培養した。
　CHO/2F-S細胞は、CHO-S細胞にNDST2, Hs3st1及びシンデカン１(SDC1)の細胞外ドメインの遺伝子（順に、SEQ ID NOs:13, 15, 11）を導入した細胞である（特許文献１参照。）。CHO/3F-S細胞は、CHO/2F-S細胞にHs6st3遺伝子（SEQ ID NO:7）を導入した細胞である(特許文献２参照)。CHO/3F-S_CKO細胞は、CHO/3F-S細胞においてCSGalNAcT2(CS2)遺伝子をノックアウトした細胞である（後述）。
(2) バイオリアクターチューブを用いた細胞培養
　懸濁培養の場合、細胞は、振盪インキュベーター（モデル番号0081704-000、タイテック）内で45°の角度で置かれたバイオリアクターチューブ（#87050、TPP、Techno Plastic Products AG、Trasadingen, Switzerland）で、5％ CO2インキュベーター内で37℃、33℃又は30℃で振盪培養した。
　懸濁回分培養では、細胞を 0.5 × 106 cells/mL の密度で、50 mL バイオリアクターチューブに10 mL播種して8日間培養した。高細胞密度での連続生産では、 2.0 × 107 cells/mL の細胞密度で 50 mL バイオリアクターチューブに10 mL播種して30日間培養した。この場合は、培地を 1 日おきに新しい培地と交換し、交換のたびに培地を回収して細胞数を計測し、2.0 × 107 cells/mLになるように再播種して培養を続けた。
２．細胞産生物の評価方法
(1) 培養上清の抗FXa活性及び抗FIIa活性の測定
　細胞の培養上清中に含まれるヘパリン様物質について、抗FXa活性及び抗FIIa活性(sGAG質量当たりの、抗FXa活性又は抗FIIa活性（IU/mg）)を測定することで抗凝固活性を評価した。各細胞株を0.6 × 106 cells/wellの細胞密度で2 mL/wellとなるように6 wellプレート（Cat. No. 130184, Thermo）にFreeStyleCHO-S Expression Mediumを用いて播種し、培養3日目に上清を回収した。培養上清の原液をサンプルとして用いた。
　抗FXa活性は、BIOPHEN HEPARIN ANTI-Xa 2 stage（Cat.No. 221005, HBM）を、抗FIIa活性は、BIOPHEN HEPARIN ANTI-IIa 2 stage（Cat.No. 220005, HBM）を用いて測定した。操作はキットのマニュアルに従った。
　キット内のアンチトロンビン粉末（R1）とFXa（あるいはFIIa）粉末（R2）、FXa（あるいはFIIa）特異的発光基質粉末（R3)は、キットに記載のように滅菌水1 mLを加えて溶解させた。これらの試薬は通常冷蔵保存しておりアッセイ前にディープウェルマキシマイザー（Model. No. M・BR-022UP、Taitec）で穏やかに混合（100 rpm、30 min、25℃）した。その後、必要量だけ分注し、R1、R2溶液はTris NaCl EDTA BSA buffer-pH 8.40（Cat. No. AR031K、HBM）で、R3溶液は滅菌水でそれぞれ5倍希釈した。アッセイに使用する直前にマイクロチューブに分注し、ヒートバケット（Cat. No. Electronic Heating Bucket、Taitec）で37℃で3分間保温した。
　スタンダードは、活性値が既知であるBIOPHEN UFH Calibrator（Cat. No. 222301、HBM）粉末を滅菌水1 mLに溶解することで調製した。スタンダードは通常PCRチューブに5 μLずつ分注した状態で-80℃で保存しており、使用直前に室温で解凍後、Tris NaCl EDTA Bufferで15倍希釈して使用した。このスタンダードは一度解凍した場合はそのアッセイのときのみ使用し、余りは廃棄した。培養上清はアッセイ前に遠心（10,000×g、10 min、RT）後、適宜Freestyle CHO培地で希釈しながら10 μLをサンプルとして使用した。また、市販へパリンについては、前述のヘパリン溶液（BIOPHEN UFH Calibrator粉末を滅菌水に溶解したもの）を10倍希釈を繰り返して0.17 IU/mLまで希釈し測定を行った。
(2) 培養上清中のsGAG量の測定
　sGAG濃度の測定には、Blyscan Glycosaminoglycan Assay Kit（Cat. No. B1000、Biocolor）を用い、一部プロトコルを変更して行った。手順を以下に示す。
　スタンダードにはへパラン硫酸（Cat. No. H7640-1MG、Merck、bovine kidney由来）を用いた。滅菌水を用いて所定の濃度（0、0.3125、0.625、1.25、2.5、5 μg/mL）まで希釈した。5 μg/mL溶液を調製後、2倍希釈を繰り返すことでそれ以外の濃度に調製した。培養上清はアッセイ前に遠心（10,000×g、10 min、RT）して150 μLを使用した。また、市販へパリンについてはヘパリン溶液を5 μg/mLに希釈し、同じく150 μLを用いて測定を行った。サンプルをマイクロチューブに入れ、Blyscan Dye Reagent 500 μLを加え、ボルテックス後にディープウェルマキシマイザーで混合（100 rpm、30 min、25℃）した。再度ボルテックスをし、4℃で16時間DMMB-sGAG複合体を沈殿させた。その後、遠心（15,000×g、30 min、4℃）し、上清を除去してペレットを得た。このペレットにDye Dissociation Reagent 250 μLを加え、ボルテックスによりペレットを完全に溶解した。200 μLを96-well ELISA plate（Cat. No. 3801-96、Iwaki）に取り、吸光度（656nm）をプレートリーダーで測定した。検量線にはスタンダードのプロットに対する近似直線を用いた。
３．コンドロイチン硫酸N-アセチルガラクトサミン転移酵素2（CSGALNACT2[CS2]）ノックアウト細胞の作製
　CSGalNAcT2 (Chondroitin sulfate N-acetylgalactosaminyltransferase 2; CS2)遺伝子(NW_003614048)(SEQ ID NO:23)ノックアウトのためのgRNA/Cas9発現ベクター（pX330-mCherry/CS2）の作製手順を示す。まず、ドナープラスミドとして、BglII及びEcoRIで切断したpX330 (#42230, Addgene) を調製した。pU6-(BbsI)_CBh-Cas9-T2A-mCherry (#64324, Addgene) を同酵素で切断し得られたCas9-2A-mCherry遺伝子をインサート断片とした。ライゲーション、形質転換を経て、pX330-mCherryを作製した。続いて、pX330-mCherryをドナープラスミドとするために形質転換、プラスミド抽出を行った。pX330-mCherryをBbsIで切断した。作製したドナープラスミドとCS2を標的としたgRNA配列(gRNA/PAM: AACTTCAGCTCTGTCGATCT(SEQ ID NO:25)/GGG)の二本鎖オリゴDNAをライゲーションすることでpX330-mCherry/CS2を作製した（図１）。
　上記のgRNA/Cas9発現ベクター（pX330-mCherry/CS2）をCHO/3F-S細胞に遺伝子導入試薬を用いて導入した。48時間後、セルソーターを用いて赤色蛍光陽性細胞を分取し、24-well plateに播種してバルク細胞を取得後、培養上清中に含まれるsGAG生産の低下がみられたが、ヘパリン様糖鎖の抗FXa比活性の顕著な向上が観察された。CS2に対するgRNA導入細胞について、限界希釈法によるクローニングを行い、取得したクローンについて、培養上清を回収後、抗FXa比活性を評価した。取得したクローンのうち、安定して高い抗FXa比活性を示した#24について、CS2遺伝子内の標的配列をPCR増幅後、シークエンス解析を行ったところ、期待された位置において8塩基欠損による遺伝子破壊が見られた（図２）。これにより、CS2遺伝子破壊CHO細胞（CHO/3F-S_CKO）を樹立した。
　抗FXa及び抗FIIa活性はCS2遺伝子破壊前（CHO/3F-S）と同等に維持されていた。一方で、sGAG濃度は遺伝子破壊前と比較して半分程度に低下した。これは、コンドロイチン硫酸合成の初期にかかわる酵素であるCS2の遺伝子を破壊したことで、総糖鎖生産量が減少したためであると考えられる。抗FXa比活性は元細胞の1.6倍、抗FIIa比活性は1.9倍向上した（図３．CHO/2F-S, CHO/3F-S及びCHO/3F-S_CKO細胞の培養３日目における培養上清中のsGAG濃度、抗FXa及び抗FIIa活性の比較）。
４．懸濁回分培養でのヘパリン様糖鎖の生産
　8日間の懸濁回分培養で培養温度を37℃と33℃にした際の生細胞濃度及びsGAG濃度（図４）、抗FXa活性及び抗FIIa活性（図５）、抗ＦXa比活性及び抗FIIa比活性（図６）の経時変化を測定した。33℃では細胞増殖が抑えられた。sGAG生産は、いずれの温度でもCHO/3F-S_CKO細胞で低下したが、抗FXa比活性、抗FIIa比活性は、CHO/3F-S_CKO細胞では他の細胞より高くなった。37℃と33℃での抗FXa活性、抗FIIa活性の比較では、33℃で高くなったが、その効果はCHO/3F-S_CKO細胞で顕著であった。また、低温での抗FIIa比活性の向上割合は抗FXa比活性の向上割合よりも大きくなった。
　CHO/3F-S_CKO細胞における、温度の影響（37℃、33℃、30℃）をまとめた（図７）。培養温度が低くなるにつれて、抗FXa活性、抗FIIa活性の向上が大きくなった。抗FXa比活性、抗FIIa比活性は、培養2～3日目で最大となった。
　温度を低下させることによる細胞が生産するヘパリン様糖鎖の抗FXa比活性及び抗FIIa比活性の増大は、由来の異なる細胞株でも観察された（図８）。
　#24の細胞株における、更に低い温度条件（37℃、33℃、30℃、28℃、26℃、24℃）での抗ＦXa比活性及び抗FIIa比活性（図９）、並びにsGAG生産濃度（図１０）を測定した。30℃より低い温度でも、抗ＦXa比活性及び抗FIIa比活性は上昇した（図９）。
５．半連続培養でのヘパリン様糖鎖の連続生産
　CHO/3F-S_CKO細胞を、30℃と33℃の培養温度において高密度懸濁培養で30日間の半連続培養によりヘパリン様糖鎖の連続生産を行った（図１１）。抗FXa活性、抗FIIa活性とも30日間ほぼ安定していた。30℃での培養でより高い活性のヘパリン様糖鎖を生産した。
[配列表に掲載した配列]
SEQ ID NO:1 Human NDST2 cDNA(NM_003635)
SEQ ID NO:2 Human NDST2, PRT sequence
SEQ ID NO:3 Mouse Hs6st1 cDNA(BC052316.1)
SEQ ID NO:4 Mouse Hs6st1, PRT sequence
SEQ ID NO:5 Mouse Hs6st2 cDNA(BC037659.1)
SEQ ID NO:6 Mouse Hs6st2, PRT sequence
SEQ ID NO:7 Mouse Hs6st3 cDNA(NM_015820.2)
SEQ ID NO:8 Mouse Hs6st3, PRT sequence
SEQ ID NO:9 Mouse Hs3st1 cDNA(NM_010474)
SEQ ID NO:10 Mouse Hs3st1, PRT sequence
SEQ ID NO:11 Human Extracellular domain of SDC, nucleotide sequence(特許文献1のSEQ ID NO:6に対応)
SEQ ID NO:12 Human Extracellular domain of SDC, PRT sequence(特許文献1のSEQ ID NO:1に対応)
SEQ ID NO:13 Human NDST2, nucleotide sequence(特許文献1のSEQ ID NO:4に対応)
SEQ ID NO:14 Human NDST2, PRT sequence(特許文献1のSEQ ID NO:2に対応)
SEQ ID NO:15 Mouse Hs3st1, nucleotide sequence(特許文献1のSEQ ID NO:5に対応)
SEQ ID NO:16 Hs3st1, PRT sequence(特許文献1のSEQ ID NO:3に対応)
SEQ ID NO:17 Human heparan sulfate 6-O-sulfotransferase 3 (HS6ST3) (NM_153456)
SEQ ID NO:18 Human HS6ST3, PRT sequence
SEQ ID NO:19 Human heparan sulfate-glucosamine 3-sulfotransferase 1 (HS3ST1) (NM_005114)
SEQ ID NO:20 Human HS3ST1, PRT sequence
SEQ ID NO:21 Chondroitin sulfate N-acetylgalactosaminyltransferase 1; CS1 (NW_003613760)
SEQ ID NO:22 CS1, PRT sequence
SEQ ID NO:23 CSGalNAcT2 Chondroitin sulfate N-acetylgalactosaminyltransferase 2; CS2 (NW_003614048)
SEQ ID NO:24 CS2, PRT sequence
SEQ ID NO:25 gRNA Sequence

Claims (12)

  1. 　以下の工程を含む、ヘパリン様物質を製造する方法：
    （１）ヘパリン様物質を産生する哺乳動物細胞を調製する工程；
    （２）工程（１）で調製したヘパリン様物質を産生する哺乳動物細胞を、該細胞の増殖抑制上有効な温度で培養し、ヘパリン様物質を産生させる工程
  2. 　増殖抑制上有効な温度が、増殖上至適な温度より2～14℃低い温度である、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　哺乳動物細胞が、CHO細胞である、請求項１に記載の製造方法。
  4. 　培養1～4日目にヘパリン様物質を回収する工程を含む、請求項１に記載の製造方法。
  5. 　培養が、4週間以上連続して行われる、請求項１に記載の製造方法。
  6. 　増殖抑制上有効な温度が、23～35℃である、請求項１～５のいずれか１項に記載の製造方法。
  7. 　増殖抑制上有効な温度が、24～34℃である、請求項１～５のいずれか１項に記載の製造方法。
  8. 　ヘパリン様物質を産生する哺乳動物細胞が、以下の群から選択される少なくとも一つの改変がされたものである、請求項１～５のいずれか１項に記載の製造方法：
    ・ヘパラン硫酸エステルN－脱アセチラーゼ/N－硫酸転移酵素（NDST2）をコードするポリヌクレオチドの導入；
    ・へパラン硫酸エステルグルコサミン3　硫酸転移酵素１（Hs3st1）をコードするポリヌクレオチドの導入；
    ・シンデカン（SDC）の細胞外ドメインをコードするポリヌクレオチドの導入；及び
    ・6-O-硫酸化酵素をコードするポリヌクレオチドの導入。
  9. 　ヘパリン様物質を産生する哺乳動物細胞が、請求項８に定義した群のすべての改変がされたものである、請求項８に記載の製造方法。
  10. 　以下の工程を含む、製造方法により製造される、組換えヘパリン様物質：
    （１）以下の群から選択される少なくとも一つの改変がされた、CHO細胞を調製する工程；
    ・NDST2をコードするポリヌクレオチドの導入；
    ・Hs3st1をコードするポリヌクレオチドの導入；
    ・SDCの細胞外ドメインをコードするポリヌクレオチドの導入；及び
    ・Hs6st3をコードするポリヌクレオチドの導入。
    ・コンドロイチン硫酸N-アセチルガラクトサミン転移酵素2（chondroitin sulfate N-acetylgalactosaminyltransferase 2, CS-GalNAcT2）のノックアウト
    （２）工程（１）で調製したCHO細胞を、24～33℃で、培養し、ヘパリン様物質を培養上清中に産生させる工程
  11. 　抗凝固第Xa因子活性（1mg当たりの比活性）が、100 IU/mg以上である、請求項１０に記載の組換えヘパリン様物質。
  12. 　抗凝固第IIa因子活性（1mg当たりの比活性）が、75 IU/mg以上である、請求項１０又は１１に記載の組換えヘパリン様物質。 
PCT/JP2025/022967 2024-07-05 2025-06-26 ヘパリン様物質を製造する方法 Pending WO2026009803A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2024-109010 2024-07-05
JP2024109010 2024-07-05

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2026009803A1 true WO2026009803A1 (ja) 2026-01-08

Family

ID=98318193

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2025/022967 Pending WO2026009803A1 (ja) 2024-07-05 2025-06-26 ヘパリン様物質を製造する方法

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2026009803A1 (ja)

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004092218A1 (ja) * 2003-04-17 2004-10-28 Mitsubishi Pharma Corporation 組換えアンチトロンビンの製造方法
JP2005521401A (ja) * 2002-03-27 2005-07-21 イミュネックス・コーポレーション ポリペプチド産生を増加させる方法
JP2008504009A (ja) * 2003-12-23 2008-02-14 アプライド リサーチ システムズ エーアールエス ホールディング ナームロゼ フェンノートシャップ 腫瘍壊死因子結合蛋白質を生産する方法
WO2012091124A1 (ja) * 2010-12-28 2012-07-05 中外製薬株式会社 動物細胞の培養方法
JP2013524825A (ja) * 2010-04-26 2013-06-20 ノバルティス アーゲー 改良型細胞培養培地
JP2016005454A (ja) * 2014-05-31 2016-01-14 Ｊｃｒファーマ株式会社 ウリジンとｎ−アセチル−ｄ−マンノサミンとを含有する培地
JP2018515125A (ja) * 2015-05-22 2018-06-14 ツェー・エス・エル・ベーリング・レコンビナント・ファシリティ・アクチエンゲゼルシャフト 改変フォン・ヴィルブランド因子を製造するための方法
JP2019531746A (ja) * 2016-10-19 2019-11-07 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 免疫コンジュゲートを製造するための方法
WO2021066167A1 (ja) * 2019-10-02 2021-04-08 国立大学法人九州大学 ヘパリン様物質の製造方法、組換え細胞及びその製造方法
WO2023157899A1 (ja) * 2022-02-17 2023-08-24 国立大学法人九州大学 組換えヘパリン様物質、及びその製造方法

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005521401A (ja) * 2002-03-27 2005-07-21 イミュネックス・コーポレーション ポリペプチド産生を増加させる方法
WO2004092218A1 (ja) * 2003-04-17 2004-10-28 Mitsubishi Pharma Corporation 組換えアンチトロンビンの製造方法
JP2008504009A (ja) * 2003-12-23 2008-02-14 アプライド リサーチ システムズ エーアールエス ホールディング ナームロゼ フェンノートシャップ 腫瘍壊死因子結合蛋白質を生産する方法
JP2013524825A (ja) * 2010-04-26 2013-06-20 ノバルティス アーゲー 改良型細胞培養培地
WO2012091124A1 (ja) * 2010-12-28 2012-07-05 中外製薬株式会社 動物細胞の培養方法
JP2016005454A (ja) * 2014-05-31 2016-01-14 Ｊｃｒファーマ株式会社 ウリジンとｎ−アセチル−ｄ−マンノサミンとを含有する培地
JP2018515125A (ja) * 2015-05-22 2018-06-14 ツェー・エス・エル・ベーリング・レコンビナント・ファシリティ・アクチエンゲゼルシャフト 改変フォン・ヴィルブランド因子を製造するための方法
JP2019531746A (ja) * 2016-10-19 2019-11-07 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 免疫コンジュゲートを製造するための方法
WO2021066167A1 (ja) * 2019-10-02 2021-04-08 国立大学法人九州大学 ヘパリン様物質の製造方法、組換え細胞及びその製造方法
WO2023157899A1 (ja) * 2022-02-17 2023-08-24 国立大学法人九州大学 組換えヘパリン様物質、及びその製造方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210095317A1 (en) N-Glycosylation
KR101812348B1 (ko) 단백질의 생산 방법
Sun et al. Development of a proline-based selection system for reliable genetic engineering in Chinese hamster ovary cells
US9340592B2 (en) CHO/CERT cell lines
US10889845B2 (en) Production of N-glycoproteins for enzyme assisted glycomodification
EP2225389A1 (en) Sm-protein based secretion engineering
US20250154290A1 (en) Recombinant heparin-like substance and method for producing the same
US8535940B2 (en) Cell growth
JP7715392B2 (ja) ヘパリン様物質の製造方法、組換え細胞及びその製造方法
WO2026009803A1 (ja) ヘパリン様物質を製造する方法
US9410176B2 (en) Method for producing proteins
US11834473B2 (en) Engineered O-glycosylation in recombinant polypeptides and uses thereof
HK1146088A (en) Sm-protein based secretion engineering