WO2026009609A1 - キメラリガーゼ - Google Patents

Abstract

本発明は、キメラリガーゼであって、好熱菌由来のリガ―ゼにおけるＯＢフォールドドメイン又はアデニル化ドメインが、好熱菌由来の異なる種の対応するドメインで置換されており、置換前のリガーゼとの比較でミスマッチ塩基対に対する識別能が向上している、キメラリガーゼ、を提供する。

Description

キメラリガーゼ

　本発明は広く、キメラリガーゼ等に関する。

　リガーゼは、遺伝子工学実験等に必要不可欠な酵素である。リガーゼの中には、接合部付近におけるミスマッチ塩基対を識別することができるリガーゼが存在し、そのようなリガーゼは、変異を有する遺伝子の検出に適用することができる。
　具体的には、例えば、変異型配列に相補的な、隣接する２つのプローブと、変異型配列とを含む核酸試料を、ミスマッチ塩基対を識別することができるリガーゼで処理すると、変異型配列にハイブリダイズした２つのプローブは、変異型配列との間でミスマッチ塩基対を生じないため、当該リガーゼによって接合される。一方で、変異型配列に相補的な、隣接する２つのプローブと、野生型配列とを含む核酸試料とを含む試料を、ミスマッチ塩基対を識別することができるリガーゼで処理すると、野生型配列にハイブリダイズした２つのプローブは、野生型配列との間でミスマッチ塩基対を生じるため、低頻度でしか、当該リガーゼによって接合されない。よって、核酸試料に変異型配列が含まれる場合に、より高頻度で、リガーゼによって接合された２つのプローブを含む産物が得られるため、当該産物を解析することで、変異の有無等を知ることができる。よって、ミスマッチ塩基対を識別することができるリガーゼを用いて、変異を有する遺伝子を検出することが可能になる。

　ミスマッチ塩基対の識別能を有するリガーゼの中でも、耐熱性を有する、好熱菌由来のリガーゼは、加熱処理工程を含むＬＤＲ法（Ｌｉｇａｓｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）やＬＣＲ法（Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）等の遺伝子変異検出法に適用することができるため、非常に有用である。ミスマッチ塩基対の識別能を有する、好熱菌由来のリガーゼとして、例えば、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・フィリフォルミス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、及びサーマス・スピーシーズ（Ｔｈｅｒｍｕｓ　Ｓｐｅｃｉｅｓ）由来のリガーゼが知られている（非特許文献１～４）。

　しかし、これら好熱菌由来のリガーゼが有するミスマッチ塩基対の識別能の正確性の程度は由来する菌によって様々であり、識別能の正確性の決定する因子については、これまで明らかになっていなかった。

Ｇｒｅｇｏｒｙ　Ｊ．　Ｓ．　Ｌｏｈｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．　Ａ　ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ　ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｌｉｇａｓｅ　ｆｉｄｅｌｉｔｙ．　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ．　２０１６，　４４（２），　ｅ１４． Ｊａｅ　Ｙｏｕｎｇ　Ｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ．　Ｃｒｙｓｔａｌ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ＮＡＤ＋－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ＤＮＡ　ｌｉｇａｓｅ：　ｍｏｄｕｌａｒ　ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．　Ｔｈｅ　ＥＭＢＯ　Ｊｏｕｒｎａｌ．　２０００，　１９，　１１１９－１１２９． Ｇｒｅｇ　Ｌｏｈｍａｎ．　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ａｎｄ　ｍｉｓｍａｔｃｈ　ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ　ｉｎ　ＤＮＡ　ｌｉｇａｓｅｓ．　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ，　Ｆｅａｔｕｒｅ　Ａｒｔｉｃｌｅｓ． Ｊｉｅ　Ｔｏｎｇ．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ａ　ｈｉｇｈ　ｆｉｄｅｌｉｔｙ　ＤＮＡ　ｌｉｇａｓｅ　ｆｒｏｍ　Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ＡＫ１６Ｄ．　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ．　１９９９，　２７（３），　７８８－７９４．

　発明が解決しようとする課題は、好熱菌由来のリガーゼのアミノ酸配列における、ミスマッチ塩基対の識別能に関与している領域を明らかにすること、及び、当該領域を修飾することで、ミスマッチ塩基対に対する識別能が向上した、新規なリガーゼを提供することである。

　本発明者が、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、好熱菌由来のリガーゼにおけるオリゴマー／オリゴヌクレオチド／オリゴ糖結合性ドメイン（ＯＢフォールドドメイン）又はアデニル化ドメインを、好熱菌由来の異なる種の対応するドメインで置換することで、置換前のリガーゼとの比較で、ミスマッチ塩基対に対する識別能が向上することを見出した。

　すなわち、本願は以下の発明を包含する。
［１］
　キメラリガーゼであって、好熱菌由来のリガ―ゼにおけるＯＢフォールドドメイン又はアデニル化ドメインが、好熱菌由来の異なる種の対応するドメインで置換されており、置換前のリガーゼとの比較でミスマッチ塩基対に対する識別能が向上している、キメラリガーゼ。
［２］
　好熱菌由来の異なる種の対応するドメインが、サーマス・スピーシーズ（Ｔｈｅｒｍｕｓ　Ｓｐｅｃｉｅｓ）に由来する、［１］に記載のキメラリガーゼ。
［３］
　キメラリガーゼであって、好熱菌由来のリガ―ゼにおけるＯＢフォールドドメイン又はアデニル化ドメインが、
１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるリガーゼ；
２）配列番号１に示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるリガーゼ；
３）配列番号１に示されるアミノ酸配列の１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるリガーゼ；並びに
４）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるリガーゼ
からなる群から選択される、好熱菌由来の異なる種のリガーゼの対応するドメインで置換されている、キメラリガーゼ。
［４］
　ＯＢフォールドドメインに対応するドメインが、配列番号１の３２０番目～４０６番目のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、［３］に記載のキメラリガーゼ。
［５］
　アデニル化ドメインに対応するドメインが、配列番号１の７３番目～３１９番目のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、［３］に記載のキメラリガーゼ。
［６］
　置換前のリガーゼとの比較で、リガーゼによる接合部の両側３塩基以内にミスマッチ塩基対が存在する場合の接合率が低くなっている、［１］～［５］のいずれか１つに記載のキメラリガーゼ。
［７］
　置換前の好熱菌由来のリガーゼが、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・ブロキアヌス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ）、サーマス・フィリフォルミス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、又はサーマス・オシマイ（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｏｓｈｉｍａｉ）由来のリガーゼである、［１］～［６］のいずれか１つに記載のキメラリガーゼ。
［８］
　置換前の好熱菌由来のリガーゼが、
１）配列番号２～５のうちいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるリガーゼ；
２）配列番号２～５のうちいずれか１つに示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるリガーゼ；
３）配列番号２～５のうちいずれか１つに示されるアミノ酸配列の１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるリガーゼ；並びに
４）配列番号２～５のうちいずれか１つに示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるリガーゼ
からなる群から選択されるリガーゼである、［１］～［７］のいずれか１つに記載のキメラリガーゼ。
［９］
　変異した標的配列を検出するためのキットであって、［１］～［８］のいずれか１つに記載のキメラリガーゼを含む、キット。
［１０］
　リガーゼ検出反応（ＬＤＲ）又はリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）に使用される試薬を更に含む、［９］に記載のキット。
［１１］
　試料において変異した標的配列を検出する方法であって、前記試料と［１］～［８］のいずれか１つに記載のキメラリガーゼとを接触させる工程と
リガーゼ反応を解析する工程と、
を含む、方法。
［１２］
　変異が一塩基多型である、［１１］に記載の方法。
［１３］
　リガーゼ反応を解析する工程が、リガーゼ検出反応（ＬＤＲ）又はリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を含む、［１１］又は［１２］に記載の方法。
［１４］
　試料における変異した標的配列の有無が、ＬＤＲ又はＬＣＲの反応産物の有無に基づいて決定される、［１３］に記載の方法。

　本発明によれば、高い正確性でミスマッチ塩基対を識別することができる、好熱菌由来の新規なキメラリガーゼを提供することができる。また、高い正確性でミスマッチ塩基対を識別可能な好熱菌由来のキメラリガーゼの、新規な製造方法を提供することもできる。
　さらには、当該新規なキメラリガーゼを用いて、変異した標的配列を検出することもできる。

Ｔｈｅｒｍｕｓ属細菌由来のリガーゼにおける、アデニル化ドメイン（アデニル化）、ＯＢフォールドドメイン（ＯＢ）、亜鉛フィンガードメイン（Ｚｎ）、ヘリックスーヘアピン―ヘリックスドメイン（ＨｈＨ）、及びＢＲＣＴドメイン（ＢＲＣＴ）の位置関係を示す。 架橋核酸としてｓｓＤＮＡオリゴを用いた場合の、Ｔｔｈ　ＬｉｇＡの正確性を評価した結果を示す。 架橋核酸としてｄｓＤＮＡアンプリコンを用いた場合の、Ｔｔｈ　ＬｉｇＡの正確性を評価した結果を示す。 架橋核酸としてｓｓＤＮＡオリゴを用いた場合の、Ｔｓｐ　ＬｉｇＡの正確性を評価した結果を示す。 架橋核酸としてｄｓＤＮＡアンプリコンを用いた場合の、Ｔｓｐ　ＬｉｇＡの正確性を評価した結果を示す。 架橋核酸としてｄｓＤＮＡアンプリコンを用いた場合のＴｔｈ　ＬｉｇＡの相対接合効率を１００％としたときの、Ｔｓｐ　ＬｉｇＡの相対接合効率を評価した結果を示す。 架橋核酸としてｓｓＤＮＡオリゴを用いた場合の、Ｔｔｈ　ＬｉｇＡ及びＴｓｐ　ＬｉｇＡの反応速度を評価した結果を示す。 架橋核酸としてｓｓＤＮＡオリゴを用いた場合の、Ｔｔｈ　ＬｉｇＡにおけるドメイン１～４を、それぞれＴｓｐ　ＬｉｇＡの対応するドメインで置換したＴｔｈ／ＴｓｐキメラＬｉｇＡ、Ｔｔｈ　ＬｉｇＡ、及びＴｓｐ　ＬｉｇＡの正確性を評価した結果を示す。 Ｔｔｈ／Ｔｓｐ　ドメイン１　キメラＬｉｇＡ、Ｔｔｈ／Ｔｓｐ　ドメイン２　キメラＬｉｇＡ、Ｔｔｈ　ＬｉｇＡ、及びＴｓｐ　ＬｉｇＡの反応速度を評価した結果を示す。 架橋核酸としてｓｓＤＮＡオリゴを用いた場合の、Ｔｔｈ／Ｔｓｐ　ドメイン２　キメラＬｉｇＡ、Ｔｔｈ　ＬｉｇＡ、及びＴｓｐ　ＬｉｇＡの正確性を評価した結果を示す。

　以下、本発明の実施の形態（以下、「本実施形態」という。）について説明するが、本発明の範囲は以下の実施形態に限定して解釈されない。

　第一の実施態様において、好熱菌由来のリガ―ゼにおけるＯＢフォールドドメイン又はアデニル化ドメインが、好熱菌由来の異なる種の対応するドメインで置換されており、置換前のリガーゼとの比較でミスマッチ塩基対に対する識別能が向上している、キメラリガーゼが提供される。

　本明細書で使用する場合、「キメラリガーゼ」とは、異なる種に由来する領域を含むリガーゼ、例えば、リガーゼを構成するアミノ酸配列における１つ以上の任意の領域であって、好ましくは活性部位を構成する領域（ドメイン）が、自身とは異なるリガーゼ由来のものに置換され、ある特性が、異なるリガーゼ由来のものに変化したリガ－ゼ、又は、自身とは異なるリガーゼを構成するアミノ酸配列における１つ以上の任意の領域であって、好ましくは活性部位を構成する領域（ドメイン）が付加されることで、新たな特性が付与されたリガーゼのことを指す。本実施形態で提供されるキメラリガーゼは、ＯＢフォールドドメイン又はアデニル化ドメインが、異なる種の対応するドメインで置換されたリガーゼである。
　「対応するドメイン」とは、置換前のドメインと同じ機能を有する、又は、相同性の高い配列を有する別のドメインのことを指し、「対応するドメインで置換される」とは、置換前のリガーゼにおける、あるドメインと同じ位置に、別のドメインが配置されることを指す。本実施形態においては、置換前のリガーゼにおけるＯＢフォールドドメインの位置に、異なる種の別のＯＢフォールドドメインが配置されるか、置換前のリガーゼにおけるアデニル化ドメインの位置に、異なる種の別のアデニル化ドメインが配置されるか、置換前のリガーゼにおけるＯＢフォールドドメイン及びアデニル化ドメインの位置に、異なる種の別のＯＢフォールドドメイン及びアデニル化ドメインが配置される。

　本明細書で使用する場合、「好熱菌」とは、一般に高温の環境で生育可能な微生物を指す。そのような微生物として、細菌、真菌、古細菌、ウイルス等が挙げられる。菌が生育できる限り高温の下限は特に限定されないが、好熱菌の最適生育温度は、例えば４０℃以上である。

　好熱性の細菌としては、例えば、サーマス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、サーモトガ属（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）、サーモアクチノマイセス属（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、サーモバチルス属（Ｔｈｅｒｍｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、サーモビフィダ属（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ）、アクイフェックス属（Ａｑｕｉｆｅｘ）、ジオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、及びバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）等に属する細菌が挙げられる。中でも、サーマス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）に属する細菌が好ましい。

　一実施形態において、サーマス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）に属する細菌は、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ；Ｔｔｈ）、サーマス・ブロキアヌス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ；Ｔｂｒ）、サーマス・スピーシーズ（Ｔｈｅｒｍｕｓ　Ｓｐｅｃｉｅｓ；Ｔｓｐ）、サーマス・オシマイ（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｏｓｈｉｍａｉ；Ｔｏｓ）、又はサーマス・フィリフォルミス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ；Ｔｆｉ）である。

　好熱菌性の真菌としては、例えば、ラサムソニア属（Ｒａｓａｍｓｏｎｉａ）、サーモマイセス属（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）、ビソクラミス属（Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ）、ユーペニシリウム属（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、及びネオサルトリア属（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）等に属する真菌が挙げられる。

　好熱性の古細菌としては、例えば、サーモコッカス属（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）、パイロコッカス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、サーモプロテウス属（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ）、サーモプラズマ属（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）、メタノサーマス属（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ）、アーキオグロバス属（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、スルホロブス属（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）、アエロパイラム属（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ）、パイロロブス属（Ｐｙｒｏｌｏｂｕｓ）、パイロディクティウム属（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ）、及びパイロバキュラム属（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）等に属する古細菌が挙げられる。中でも、サーモコッカス属（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）に属する古細菌が好ましい。

　好熱性のウイルスとしては、例えば、原核生物に感染するバクテリオファージ等が挙げられる。

　本明細書における細菌、真菌、及び古細菌の表記は、新分類の表記で示されていてよく、旧分類の表記で示されていてもよい。

　本明細書で使用する場合、「リガーゼ」とは、核酸間のリン酸ジエステル結合の形成を触媒する酵素を指す。「リガーゼ」として、例えば、ＤＮＡリガーゼ等が挙げられる。リガーゼは、用いられる補因子によって、ＡＴＰ依存性リガーゼと、ＮＡＤ^＋依存型リガーゼとが挙げられる。

　本明細書で使用する場合、「ＯＢフォールドドメイン」とは、オリゴマー／オリゴヌクレオチド／オリゴ糖結合性ドメインであり、一般的に、一本鎖ＤＮＡへの結合に関与するドメインを指す。

　本明細書で使用する場合、「アデニル化ドメイン」とは、一般的に、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）を共有結合させる反応に関与するドメインを指し、ライゲーション反応においては、アデニル化された反応中間体の形成に関与している。
　図１に、Ｔｈｅｒｍｕｓ属細菌由来のリガーゼを例として、各ドメインの位置関係を示す。

　本明細書で使用する場合、「ミスマッチ塩基対」とは、アデニンとチミン、アデニンとウラシル、グアニンとシトシン、といった塩基のペアが水素結合して対合するワトソン－クリック型の塩基対ではなく、例えば、アデニンとシトシン、チミンとグアニン等の、ワトソン－クリック型の塩基対ではない塩基対を指す。

　本明細書で使用する場合、「ミスマッチ塩基対に対する識別能」とは、とは、接合する配列におけるミスマッチ塩基対の有無を識別して、ミスマッチ塩基対を有さない配列を優先的に接合する能力のことを指す。例えば、あるリガーゼが、ミスマッチ塩基対を有さない配列を、ミスマッチ塩基対を有する配列よりも、高い頻度で接合するとき、そのリガーゼは、ミスマッチ塩基対に対する識別能を有すると言うことができる。
　ミスマッチ塩基対に対する識別能が向上すると、より正確に、ミスマッチ塩基対の有無を識別することが可能になる。すなわち、より正確に、ミスマッチ塩基対を有さない配列を優先的に接合することが可能になる。
　また、「ミスマッチ塩基対に対する識別能が向上している」とは、特定のミスマッチ塩基対に対する識別能が向上していてもよく、複数の種類のミスマッチ塩基対に対する識別能が向上していてもよい。

　本実施形態のキメラリガーゼが、接合する配列におけるミスマッチ塩基対の有無を識別する際、当該配列におけるミスマッチ塩基対の位置は任意であってよいが、より高い正確性で、ミスマッチ塩基対を有さない配列を接合するために、ミスマッチ塩基対は、リガーゼによる接合部の両側の、好ましくは５塩基以内、より好ましくは、３塩基以内、２塩基以内又は１塩基以内に存在する。接合部の、好ましくは両側５塩基以内、より好ましくは３塩基以内にミスマッチ塩基が存在する場合には、リガーゼによる接合率が低くなる。
　接合部の両側３塩基以内とは、接合部から３塩基隣の位置、２塩基隣の位置、又は１塩基隣の位置（接合部に隣接する位置）を指す。また、接合部の５’側のみにミスマッチ塩基対があってもよく、接合部の３’側のみにミスマッチ塩基対があってもよく、接合部の５’側及び３’側の両方にミスマッチ塩基対があってもよい。
　本実施形態のキメラリガーゼは、好ましくは、ＯＢフォールドドメイン又はアデニル化ドメインが置換される前との比較で、リガーゼによる接合部の両側３塩基以内にミスマッチ塩基対が存在する場合の接合率が低くなる。

　ここで、本明細書で使用する場合、「接合部」とは、リガーゼによって接合された部分、又は、リガーゼの標的となり得る部分を指し、具体的には、リガーゼによって核酸間に形成されたホスホジエステル結合、当該ホスホジエステル結合を含む部分、又は、ホスホジエステル結合が形成される前の、隣接する核酸同士の間の部分等を指す。また、二本鎖核酸におけるニックのような、ホスホジエステル結合が切断された部分も、本明細書において、接合部に含まれる。

　リガーゼによる接合率が低くなる場合の例を、以下に示す。
　例えば、本実施形態のキメラリガーゼによって、平滑末端を有する二本鎖核酸Ａの５’末端と、平滑末端を有する二本鎖核酸Ｂの３’末端を接合するときに、二本鎖核酸Ａの５’末端から１～３塩基の位置に、及び／又は、二本鎖核酸Ｂの３’末端から１～３塩基の位置に、ミスマッチ塩基対が存在する場合、二本鎖核酸Ａの５’末端と、二本鎖核酸Ｂの３’末端とが接合される頻度は、ミスマッチ塩基対が存在しない核酸同士を接合する場合との比較で、低くなる。

　また、例えば、本実施形態のキメラリガーゼによって、５’突出末端を有する二本鎖核酸Ａと、３’突出末端を有する二本鎖核酸Ｂとを接合するときに、当該突出末端同士が二本鎖を形成して、接合部の両側３塩基以内にミスマッチ塩基が生じる場合、当該２つの二本鎖核酸ＡとＢとが接合される頻度は、ミスマッチ塩基対が存在しない核酸同士を接合する場合との比較で、低くなる。

　また、例えば、本実施形態のキメラリガーゼによって、二本鎖核酸におけるニックを接合するときに、当該ニック（接合部）の両側３塩基以内にミスマッチ塩基対が存在する場合、ニックが接合される頻度は、ミスマッチ塩基対が存在しない核酸におけるニックを接合する場合との比較で、低くなる。

　本実施形態のキメラリガーゼが、接合する配列におけるミスマッチ塩基対の有無を識別する際の、当該配列におけるミスマッチ塩基対の数は、接合する配列によって異なり、１つに限られない。例えば、本実施形態のキメラリガーゼが、接合部の両側３塩基以内にミスマッチ塩基対が存在するときに、ミスマッチ塩基対の有無を正確に識別することができる場合であって、当該キメラリガーゼが、ある配列同士を接合しなかった場合、接合部の両側３塩基以内にミスマッチ塩基対が存在していた蓋然性が高い。その場合、接合部の両側３塩基以内には、最大６つのミスマッチ塩基対が存在することになる。

　ミスマッチ塩基対の識別能が低いリガーゼの場合、２つの二本鎖核酸は、それらがミスマッチ塩基対を有しているか否かにかかわらず、また、それらの接合部の両側３塩基以内にミスマッチ塩基対が存在しているか否かにかかわらず、核酸同士が接合されてしまうが、本実施形態におけるキメラリガーゼは、２つの二本鎖核酸がミスマッチ塩基対を有するかどうかを正確に識別して、それらがミスマッチ塩基対を有さない場合、ミスマッチ塩基対を有する場合と比較して、より高頻度で核酸同士を接合する。接合部の両側３塩基以内にミスマッチ塩基対がある場合は、より正確に、２つの二本鎖核酸がミスマッチ塩基対を有するかどうかを識別することで、ミスマッチ塩基対を有さない配列を、より高頻度で接合することができる。
　本実施形態のキメラリガーゼは、ＯＢフォールドドメイン又はアデニル化ドメインが置換されていることで、置換される前との比較で、さらに正確にミスマッチ塩基対を識別する。本実施形態におけるキメラリガーゼは、ミスマッチ塩基対を有さない核酸同士を、好ましくは、接合部付近にミスマッチ塩基対がない核酸同士を、優先的に接合する。

　リガーゼにおけるＯＢフォールドドメイン又はアデニル化ドメインは、リガーゼのミスマッチ塩基対に対する識別能に関与しているため、当該ドメインを置換することで、リガーゼのミスマッチ塩基対に対する識別能を調節することが可能になる。すなわち、リガーゼにおけるＯＢフォールドドメイン又はアデニル化ドメインを、ミスマッチ塩基対の識別能が置換前のリガーゼよりも高いリガーゼ由来のＯＢフォールドドメイン又はアデニル化ドメインで置換することで、置換前との比較で、ミスマッチ塩基対に対する識別能が向上しているリガーゼを提供することが可能になる。また、置換前のリガーゼは、ミスマッチ塩基対の識別能を有さないリガーゼであってもよく、そのようなリガーゼは、ＯＢフォールドドメイン又はアデニル化ドメインが識別能を有するものと置換されることで、ミスマッチ塩基対の識別能が付与される場合がある。
　本実施形態のキメラリガーゼは、ＯＢフォールドドメインのみが置換されたリガーゼであってよく、アデニル化ドメインのみが置換されたリガーゼであってよく、ＯＢフォールドドメイン及びアデニル化ドメインの両方が置換されたリガーゼであってもよいが、ＯＢフォールドドメインのみ、又は、アデニル化ドメインのみが置換されたリガーゼであることが好ましい。

　ここで、本明細書において、置換前の好熱菌由来のリガ―ゼをリガーゼＩ、好熱菌由来の異なる種のリガーゼをリガーゼＩＩとすると、本実施形態のキメラリガーゼは、ＯＢフォールドドメイン又はアデニル化ドメイン以外の領域がリガーゼＩ由来で、ＯＢフォールドドメイン又はアデニル化ドメインがリガーゼＩＩ由来である、キメラリガーゼである。あるいは、本実施形態のキメラリガーゼは、ＯＢフォールドドメイン及びアデニル化ドメイン以外の領域がリガーゼＩ由来で、ＯＢフォールドドメイン及びアデニル化ドメインがリガーゼＩＩ由来である、キメラリガーゼである。

　リガーゼＩと、リガーゼＩＩは、用いられる補因子が同じリガーゼ同士であることが好ましく、ＮＡＤ^＋依存型リガーゼ同士、又は、ＡＴＰ依存性リガーゼ同士であることが好ましい。

　リガーゼＩの由来の好熱菌と、リガーゼＩＩの由来の好熱菌は、置換後のリガーゼが置換前との比較でミスマッチ塩基対の識別能が向上する限り、互いに属も種も異なる任意の好熱菌であってよいが、同じ属由来の、異なる種であることが好ましく、サーマス属細菌由来の、互いに異なる種の細菌であることがより好ましい。

　サーマス属細菌由来の、互いに異なる種の細菌の例として、リガーゼＩが、サーマス・サーモフィルス、サーマス・ブロキアヌス、サーマス・フィリフォルミス、サーマス・オシマイ又は由来のリガーゼであって、リガーゼＩＩが、サーマス・スピーシーズ由来のリガーゼである場合が挙げられる。サーマス・スピーシーズ由来のリガーゼは、サーマス・サーモフィルス、サーマス・ブロキアヌス、サーマス・フィリフォルミス、又はサーマス・オシマイ由来のリガーゼと比べて、より高い正確性でミスマッチ塩基対ミスを識別し得る。サーマス・サーモフィルス、サーマス・ブロキアヌス、サーマス・フィリフォルミス、又はサーマス・オシマイ由来のリガーゼが、低い正確性でしか識別できない特定のミスマッチ塩基対の組み合わせに対して、サーマス・スピーシーズ由来のリガーゼが、より高い正確性で識別する場合がある。よって、サーマス・サーモフィルス、サーマス・ブロキアヌス、サーマス・フィリフォルミス、又はサーマス・オシマイ由来のリガーゼにおけるＯＢフォールドドメイン又はアデニル化ドメインを、サーマス・スピーシーズ由来のリガーゼにおけるＯＢフォールドドメイン又はアデニル化ドメインで置換したキメラリガーゼは、置換前との比較で、ミスマッチ塩基対の識別能が向上している。

　一実施形態として、本実施形態のキメラリガーゼは、サーマス・サーモフィルス由来のリガーゼにおけるＯＢフォールドドメイン又はアデニル化ドメインを、サーマス・スピーシーズ由来のリガーゼにおけるＯＢフォールドドメイン又はアデニル化ドメインで置換したキメラリガーゼである。サーマス・スピーシーズ由来のリガーゼは、サーマス・サーモフィルス由来のリガーゼと比べてミスマッチ塩基対に対する識別能が高い一方で、反応速度は遅い。従って、リガーゼＩが、サーマス・サーモフィルス由来であって、リガーゼＩＩが、サーマス・スピーシーズ由来のリガーゼであるキメラリガーゼは、ミスマッチ塩基対に対する識別能が向上していて、かつ、反応速度も速いキメラリガーゼとなり得る。

　リガーゼＩが、リガーゼＩＩとの比較で、ＯＢフォールドドメイン又はアデニル化ドメインが関与しないある利点を有している場合であって、リガーゼＩＩが、リガーゼＩとの比較で、高いミスマッチ塩基対の識別能を有する場合、リガーゼＩ由来の利点を保持しつつ、置換前との比較でミスマッチ塩基対の識別能が向上した、リガーゼＩ及びリガーゼＩＩ由来のキメラリガーゼを提供することが可能になる。

　本実施形態におけるリガーゼＩ及びリガーゼＩＩは、修飾されたリガーゼであってよく、１若しくは複数のアミノ酸が、付加、置換、及び／又は欠失していてよい。付加、置換、及び／又は欠失しているアミノ酸の数は、リガーゼ活性を有する限り任意であってよく、当業者によって適宜決定することができる。

　本実施形態におけるリガーゼＩが、例えば、サーマス・サーモフィルス、サーマス・ブロキアヌス、サーマス・オシマイ、又はサーマス・フィリフォルミス由来のリガーゼである場合、これらのリガーゼは、一実施形態において、配列番号２～５に示されるアミノ酸配列のいずれか１つにおいて、１～６７個、１～６０個、１～５０個、１～４０個、１～３０個、１～２０個、１～１０個、又は１～５個のアミノ酸が、付加、置換、及び／又は欠失している酵素である。ここで、配列番号２～５の配列は、それぞれ、サーマス・サーモフィルス、サーマス・ブロキアヌス、サーマス・フィリフォルミス、サーマス・オシマイ由来のリガーゼの配列の一例である。
　また、本実施形態におけるリガーゼＩＩが、例えば、サーマス・スピーシーズ由来のリガーゼである場合、当該リガーゼは、一実施形態において、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１～６７個、１～６０個、１～５０個、１～４０個、１～３０個、１～２０個、１～１０個、又は１～５個のアミノ酸が、付加、置換、及び／又は欠失している酵素である。ここで、配列番号１の配列は、サーマス・スピーシーズ由来のリガーゼの配列の一例である。

　また、本実施形態におけるリガーゼＩ又はリガーゼＩＩは、それぞれ、配列番号２～５に示されるアミノ酸配列のいずれか１つ、又は配列番号１に示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるリガーゼであってよい。

　本明細書で使用する場合、「同一性」とは、２つのアミノ酸配列をアライメントした際に、同じ位置又は列に並ぶアミノ酸が、同一のアミノ酸である割合（％）を指す。２つのアミノ酸配列をアライメントした際に、同じ位置又は列に並ぶアミノ酸が、同一又は類似のアミノ酸である割合（％）は、相同性と呼ぶ。本明細書において、配列の相同には、「同一」の場合も含まれる。

　ある酵素が、１００個のアミノ酸からなる特定の酵素と８０％の同一性を有する場合、例えば、当該１００個のアミノ酸からなる特定の酵素のアミノ酸配列とアライメントしたとき、同一のアミノ酸が、同じ位置又は列に並ぶ箇所が８０箇所ある。

　また、本明細書で使用する場合、「類似のアミノ酸」とは、化学的又は物理的性質が互いに類似する２つ以上のアミノ酸を指す。そのような類似性を判断するには一般的なアミノ酸の分類が参考となる。例えば、２つのアミノ酸が、それぞれ酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、水酸基を有するアミノ酸、親水性アミノ酸、又は疎水性アミノ酸等の、同じアミノ酸のグループに分類される場合、その２つのアミノ酸は、化学的又は物理的性質が類似する、と判断される。

　一実施形態において、本実施形態におけるリガーゼＩ又はリガーゼＩＩは、それぞれ、配列番号２～５に示されるアミノ酸配列のいずれか１つ、又は配列番号１に示されるアミノ酸配列と８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％の同一性を有する酵素である。
　また、一実施形態において、本実施形態におけるリガーゼＩ又はリガーゼＩＩは、それぞれ、配列番号２～５に示されるアミノ酸配列のいずれか１つ、又は配列番号１に示されるアミノ酸配列と８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％の相同性を有する酵素である。

　また、本実施形態におけるリガーゼＩ又はリガーゼＩＩは、それぞれ、配列番号２～５に示されるアミノ酸配列のいずれか１つ、又は配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるリガーゼであってもよい。

　本明細書で使用する場合、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、配列番号１～５に示されるアミノ酸配列をコードする野生型遺伝子の相補配列をプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、サザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味する。

　本明細書で使用する場合、「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリッドのシグナルが非特異的なハイブリッドのシグナルと明確に識別される条件であり、使用するハイブリダイゼーションの系と、プローブの種類、配列及び長さによって異なる。そのような条件は、ハイブリダイゼーションの温度を変えること、洗浄の温度及び塩濃度を変えることにより決定可能である。

　例えば、非特異的なハイブリッドのシグナルまで強く検出されてしまう場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を上げるとともに、必要により洗浄の塩濃度を下げることにより特異性を上げることができる。また、特異的なハイブリッドのシグナルも検出されない場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を下げるとともに、必要により洗浄の塩濃度を上げることにより、ハイブリッドを安定化させることができる。

　一部の態様において、ストリンジェントな条件の具体例としては以下のものを含む。例えば、プローブとしてＤＮＡプローブを用い、ハイブリダイゼーションは、５×ＳＳＣ、１．０％（ｗ／ｖ）核酸ハイブリダイゼーション用ブロッキング試薬（ベーリンガ・マンハイム社製）、０．１％（ｗ／ｖ）Ｎ－ラウロイルサルコシン、０．０２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを用い、一晩（８～１６時間程度）で行う。洗浄は、０．１～０．５×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、好ましくは０．１×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを用い、１５分間、２回行う。ハイブリダイゼーション及び洗浄を行う温度は６５℃以上、好ましくは６８℃以上である。

　ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列としては、例えば、コロニー若しくはプラーク由来の野生型遺伝子の相補配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションすることによって得られるＤＮＡや、０．５～２．０ＭのＮａＣｌ存在下にて、４０～７５℃でハイブリダイゼーションを実施した後、好ましくは０．７～１．０ＭのＮａＣｌ存在下にて、６５～６８℃でハイブリダイゼーションを実施した後、０．１～１×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ　塩化ナトリウム、１５ｍＭ　クエン酸ナトリウム）を用い、５５～６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡ等を挙げることができる。プローブの調製やハイブリダイゼーションの方法は、Ｍｏｌｅｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ－Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．，１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　１－３８，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９８７－１９９７等に記載されている方法に準じて実施することができる。
　高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列としては、例えば、１．０ＭのＮａＣｌ存在下にて、６５℃でハイブリダイゼーションを実施した後、０．５×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ　塩化ナトリウム、１５ｍＭ　クエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡ等を挙げることができる。

　なお、当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度や温度等の条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブ長さ、反応時間等の諸条件を加味して、野生型遺伝子の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を得るための条件を適宜設定することができる。

　本実施形態における、配列番号１～５に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるリガーゼは、野生型遺伝子の塩基配列によってコードされるリガーゼが有するアミノ酸配列において１から複数個、好ましくは数個のアミノ酸の欠失、置換、付加等を有するアミノ酸配列を有するリガーゼである蓋然性があるが、野生型遺伝子の塩基配列によってコードされるリガーゼと同じリガーゼ活性及びその他の活性を有するものである。

　一実施形態において、本実施形態におけるリガーゼＩは、
１）配列番号２～５のうちいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるリガーゼ；
２）配列番号２～５のうちいずれか１つに示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるリガーゼ；
３）配列番号２～５のうちいずれか１つに示されるアミノ酸配列の１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるリガーゼ；並びに
４）配列番号２～５のうちいずれか１つに示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるリガーゼ
からなる群から選択されるリガーゼである。
　すなわち、本実施形態は、キメラリガーゼであって、
１）配列番号２～５のうちいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるリガーゼ；
２）配列番号２～５のうちいずれか１つに示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるリガーゼ；
３）配列番号２～５のうちいずれか１つに示されるアミノ酸配列の１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるリガーゼ；並びに
４）配列番号２～５のうちいずれか１つに示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるリガーゼ
からなる群から選択されるリガーゼにおけるＯＢフォールドドメイン又はアデニル化ドメインが、好熱菌由来の異なる種の対応するドメインで置換されており、置換前のリガーゼとの比較でミスマッチ塩基対に対する識別能が向上している、キメラリガーゼ、も提供する。

　一実施形態において、本実施形態におけるリガーゼＩＩは、
１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるリガーゼ；
２）配列番号１に示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるリガーゼ；
３）配列番号１に示されるアミノ酸配列の１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるリガーゼ；並びに
４）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるリガーゼ
からなる群から選択されるリガーゼである。
　すなわち、本実施形態は、キメラリガーゼであって、
好熱菌由来のリガ―ゼにおけるＯＢフォールドドメイン又はアデニル化ドメインが、
１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるリガーゼ；
２）配列番号１に示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるリガーゼ；
３）配列番号１に示されるアミノ酸配列の１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるリガーゼ；並びに
４）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるリガーゼ
からなる群から選択される、好熱菌由来の異なる種のリガーゼの対応するドメインで置換されている、キメラリガーゼ、も提供する。当該リガーゼは、置換前との比較で、ミスマッチ塩基対に対する識別能が向上している。

　本実施形態は、キメラリガーゼであって、
１）配列番号２～５のうちいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるリガーゼ；
２）配列番号２～５のうちいずれか１つに示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるリガーゼ；
３）配列番号２～５のうちいずれか１つに示されるアミノ酸配列の１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるリガーゼ；並びに
４）配列番号２～５のうちいずれか１つに示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるリガーゼ
からなる群から選択されるリガーゼにおけるＯＢフォールドドメイン又はアデニル化ドメインが、
１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるリガーゼ；
２）配列番号１に示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるリガーゼ；
３）配列番号１に示されるアミノ酸配列の１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるリガーゼ；並びに
４）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるリガーゼ
からなる群から選択される、好熱菌由来の異なる種のリガーゼの対応するドメインで置換されている、キメラリガーゼ、も提供する。好ましくは、本実施形態におけるキメラリガーゼは、キメラリガーゼであって、配列番号２～５のうちいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるリガーゼにおけるＯＢフォールドドメイン又はアデニル化ドメインが、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるリガーゼの対応するドメインで置換されている、キメラリガーゼ、である。これらのリガーゼは、置換前との比較で、ミスマッチ塩基対に対する識別能が向上している。

　本実施形態におけるキメラリガーゼは、リガーゼＩのＯＢフォールドドメイン又はアデニル化ドメインが、リガーゼＩＩのＯＢフォールドドメイン又はアデニル化ドメインで置換されたキメラリガーゼである。リガーゼＩ又はリガーゼＩＩのアミノ酸配列における、ＯＢフォールドドメイン又はアデニル化ドメインの位置は、ＮＣＢＩ等の公知のデータベースにおいて開示されている情報に基づき、当業者が適宜決定することができるが、例えば、リガーゼＩ又はリガーゼＩＩが、それぞれ、配列番号２～５に示されるアミノ酸配列のいずれか１つ、又は配列番号１であるときの、それぞれのアミノ酸配列におけるＯＢフォールドドメイン又はアデニル化ドメインの位置の例を、以下に示す。

　本実施形態におけるリガーゼＩがサーマス・サーモフィルス由来のリガーゼである場合、ＯＢフォールドドメインの位置は、例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列において３２３番目～４０９番目であり、アデニル化ドメインの位置は、例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列において７３番目～３２２番目である。

　本実施形態におけるリガーゼＩがサーマス・ブロキアヌス由来のリガーゼである場合、ＯＢフォールドドメインの位置は、例えば、配列番号３に示されるアミノ酸配列において３２０番目～４０６番目であり、アデニル化ドメインの位置は、例えば、配列番号３に示されるアミノ酸配列において７３番目～３１９番目である。

　本実施形態におけるリガーゼＩがサーマス・フィリフォルミス由来のリガーゼである場合、ＯＢフォールドドメインの位置は、例えば、配列番号４に示されるアミノ酸配列において３２０番目～４０６番目であり、アデニル化ドメインの位置は、例えば、配列番号４に示されるアミノ酸配列において７３番目～３１９番目である。

　本実施形態におけるリガーゼＩがサーマス・オシマイ由来のリガーゼである場合、ＯＢフォールドドメインの位置は、例えば、配列番号５に示されるアミノ酸配列において３２０番目～４０６番目であり、アデニル化ドメインの位置は、例えば、配列番号５に示されるアミノ酸配列において７３番目～３１９番目である。

　本実施形態におけるリガーゼＩＩがサーマス・スピーシーズ由来のリガーゼである場合、ＯＢフォールドドメインの位置は、例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列において３２０番目～４０６番目であり、アデニル化ドメインの位置は、例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列において７３番目～３１９番目である。
　リガーゼＩＩがサーマス・スピーシーズ由来のリガーゼである場合、本実施形態におけるキメラリガーゼは、一実施形態において、リガーゼＩのＯＢフォールドドメイン又はアデニル化ドメインが、配列番号１の３２０番目～４０６番目のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む配列、又は配列番号１の７３番目～３１９番目のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む配列、で置換されたキメラリガーゼである。
　すなわち、リガーゼＩＩがサーマス・スピーシーズ由来のリガーゼである場合の、本実施形態におけるＯＢフォールドドメインが置換されたキメラリガーゼは、一実施形態において、配列番号１の３２０番目～４０６番目のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、アデニル化ドメインが置換されたキメラリガーゼは、一実施形態において、配列番号１の７３番目～３１９番目のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＯＢフォールドドメイン及びアデニル化ドメインが置換されたキメラリガーゼは、一実施形態において、配列番号１の３２０番目～４０６番目のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号１の７３番目～３１９番目のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

　本実施形態におけるリガーゼＩがサーマス・サーモフィルス由来のリガーゼであって、リガーゼＩＩがサーマス・スピーシーズ由来のリガーゼであり、ＯＢフォールドドメインが置換される場合、一実施形態において、本実施形態におけるキメラリガーゼは、キメラリガーゼにおける１番目～３２２番目、及び４１０番目～６７６番目のアミノ酸配列はサーマス・サーモフィルス由来であり、３２３番目～４０９番目のアミノ酸配列は、サーマス・スピーシーズ由来である、リガーゼである。
　また、一実施形態において、本実施形態におけるキメラリガーゼは、配列番号６、７、及び１０～１２のうちいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるリガーゼである。

　また、リガーゼＩにおけるＯＢフォールドドメイン又はアデニル化ドメインは、ドメインを構成するアミノ酸配列の全てが置換されてもよいが、置換されるドメインの活性が失われる限り、リガーゼＩにおけるドメインの一部が置換されてよい。また、リガーゼＩにおけるＯＢフォールドドメイン又はアデニル化ドメインは、リガーゼＩＩの対応するドメインを構成するアミノ酸配列の全てによって置換されてもよいが、活性を有する限り、リガーゼＩＩにおけるドメインの一部によって置換されてよい。

　さらにまた、アミノ酸配列のＮ末端側及び／又はＣ末端側にアミノ酸リンカーが付加された、リガーゼＩＩにおけるＯＢフォールドドメイン又はアデニル化ドメインによって、リガーゼＩにおける対応するドメインが置換されてもよい。
　リンカーは、好ましくは１～１５個のアミノ酸、より好ましくは１～１０個のアミノ酸、さらに好ましくは１～６個のアミノ酸のペプチドからなるアミノ酸リンカーである。また、上記１～１５個の範囲内あるいは好適な範囲内で、２個以上であってもよく、３個以上、４個以上であってもよい。
　当該リンカーとしては、ペプチド同士を連結する際に用いられるリンカーを用いることができ、例えば、グリシンとセリンを含むＧＳリンカー等が挙げられる。
　また、リンカーとしては、ＯＢフォールドドメイン又はアデニル化ドメインが存在する元のリガーゼＩＩのアミノ酸配列におけるＯＢフォールドドメイン又はアデニル化ドメインのＮ末端側又はＣ末端側に存在するアミノ酸配列をリンカーとしてもよい。好ましくは、リガーゼＩ及びリガーゼＩＩの共通配列をリンカーとして用いる。
　置換前のリガーゼとの比較でミスマッチ塩基対に対する識別能が向上している限り、任意のリンカーを選択することができる。

　本実施形態は、キメラリガーゼをコードする核酸も提供する。当該核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれであってもよく、ＤＮＡ／ＲＮＡのキメラ核酸であってもよい。また、当該核酸は、本実施形態におけるキメラリガーゼを発現し得る核酸であれば特に限定されないが、キメラリガーゼのアミノ酸配列の各アミノ酸をコードするコドンが連続する核酸であることが好ましく、また、キメラリガーゼをコードする核酸と相補的な塩基配列を有する核酸であってもよい。キメラリガーゼをコードする核酸と相補的な塩基配列を有する核酸は、宿主細胞内で、キメラリガーゼをコードする核酸を産生してもよく、例えば、キメラリガーゼをコードする核酸と相補的な塩基配列を有するＤＮＡを鋳型として、キメラリガーゼをコードする配列を有するＲＮＡが産生されてもよい。

　本実施形態における核酸は、ベクター中に含まれていてもよい。ベクターの種類は特に限定されず、当業者に公知のいかなるベクターを用いてもよく、例えば、プラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージ及びウイルスベクター等を用いることができる。よって、本実施形態は、キメラリガーゼをコードする核酸を含むベクターも提供する。核酸がベクター中に含まれる場合、ベクター中において、核酸は、転写や翻訳に必要な因子、例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の調節因子と共に取り込まれてよく、ベクター中において核酸はそれらと連続して、あるいは、不連続に存在していてよい。
　本明細書で使用する場合、「ベクター」とは、クローニングベクターや、発現ベクターを包含する概念を指し、宿主、好ましくは細胞を形質転換し、導入された配列の発現（例えば転写及び翻訳）を促進するように、目的の遺伝子を運ぶ核酸のことを意味する。

　本実施形態はまた、上記ベクターが導入された形質転換体も提供する。本実施形態における形質転換体としては、キメラリガーゼを発現させる宿主、好ましくは細胞（宿主細胞）である。
　本明細書で使用する場合、「形質転換」とは、宿主が導入後の遺伝子（核酸）を発現して、目的のペプチドを産生するように、核酸やベクターを宿主に導入することを指す。核酸を含む宿主、好ましくは核酸をベクターの形態で含む宿主は、形質転換体とも称される。

　本実施形態における核酸、ベクター、形質転換体は、当業者に公知のいかなる方法によって製造されてよく、製造されたこれらは本実施形態におけるキメラリガーゼを製造するために用いることができる。また、本実施形態における核酸として、キメラリガーゼをコードする核酸と相補的な塩基配列を有する核酸も、当業者に公知のいかなる方法によって製造されてよい。

　本実施形態のキメラリガーゼは、当業者に公知のいかなる方法によって製造されてもよいが、例えば、目的のキメラリガーゼを発現する遺伝子を含むベクターを、宿主に導入して形質転換し、宿主に発現させることで製造されることが好ましい。本実施形態における、核酸、ベクター、形質転換体を用いて製造することもできる。

　本明細書で使用する場合、「宿主」とは、所望とするタンパク質を発現するように形質転換された生物体、例えば細菌、真菌、又は植物細胞等を指す。宿主となる細菌は、大腸菌、枯草菌、又は放線菌等であってよく、宿主となる真菌は、酵母、又は糸状菌等であってよい。

　一実施形態において、宿主は大腸菌である。

　宿主細胞の形質転換は、当業者に公知のいかなる方法により実施されてもよい。形質転換法として、エレクトロポレーション法やヒートショック法等がある。

　宿主を形質転換するために、目的のキメラリガーゼをコードする外来のベクターが調製される。ベクターは複数の目的のキメラリガーゼをコードしてもよい。ベクターは、形質転換体の選択に使用する選択マーカー、例えば抗生物質耐性遺伝子をコードしてもよい。

　形質転換効率を増大させる観点から、宿主は形質転換前に熱処理又は電気的処理にかけられることが好ましい。このような処理により、得られるコンピテントセルは、ベクターの取り込み効率が増大したものとなる。

　形質転換後の宿主は形質転換体ともいう。形質転換体の選択、形質転換体の増殖、目的のリガーゼの発現誘導、及び目的のキメラリガーゼを発現した宿主回収も、当業者に公知のいかなる方法により実施されてよい。

　例えば、ベクターと宿主のコンピテントセルの混合液を、ベクターがコードする選択マーカーに相当する抗生物質を含む培地中で培養し、形成されたコロニーを選択することで、形質転換体が選択される。そのような培地は宿主細胞によって異なるが、大腸菌の培地としてＬＢ培地がある。形質転換体の選択に使用する培地は平板培地が好ましい。培養条件は、例えば、３０℃～３７℃程度の培養温度、１２時間～一晩程度の培養時間の間で適宜調節される。

　選択された形質転換体は培養により増殖される。本培養前に前培養を行ってもよい。形質転換体の増殖も形質転換体の選択において使用された培養条件で実施することができるが、培地は液体培地であることが好ましい。培養温度と培養時間は、所望とする形質転換体の増殖の程度に応じて適宜調節されるため、限定することを意図するものではないが、１６℃～３７℃程度の培養温度、１２時間～一晩程度の培養時間の間で適宜調整される。

　目的のリガーゼの発現を誘導する条件は、使用する発現系により異なる。限定することを意図するものではないが、大腸菌を宿主とする場合の発現系はｐＥＴシステムが好ましい。ｐＥＴシステムは、ｌａｃＵＶ５　プロモーターに制御されアロラクトースやラクトース類似体であるＩＰＴＧ（イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド）存在下で発現誘導が起こるＴ７　ＲＮＡポリメラーゼが標的遺伝子の転写を行うタンパク質発現系である。

　ｐＥＴシステムを用いた発現系の場合、培地にＩＰＴＧを添加し、所定の条件の下で培養することで目的のキメラリガーゼの発現を誘導することができる。培養温度と培養時間は、所望とする発現量の程度に応じて適宜調節されるため、限定することを意図するものではないが、１時間～一晩程度の培養時間、１６℃～３７℃程度の培養温度の間で適宜調節される。

　発現したキメラリガーゼを宿主から回収するために、宿主細胞は破壊工程にかけられる。ここで、本明細書で使用する場合、細胞の破壊とは、細胞壁が破壊されていればよい。破壊の手段は特に限定されないが、その手段は大きく分けて機械的方法又は非機械的方法に分けられる。機械的方法の例としては、超音波破壊、ホモジナイザー、ブレンダー等の公知の装置を用いた等の破壊が挙げられる。非機械的方法は機械的方法に含まれないその他の方法であり、その例としては、界面活性剤等の化学薬品や、リゾチーム等の酵素を用いた化学的方法が挙げられる。界面活性剤等の化学薬品や、リゾチーム等の酵素を用いて宿主細胞を破壊する際、界面活性剤やリゾチーム等の他に、必要に応じてプロテアーゼインヒビターやＤＮａｓｅ等を添加してもよい。非機械的方法は化学的方法に限定されず、浸透圧の差を利用してもよい。

　宿主細胞を破壊する工程における各種の条件、例えば温度条件は当業者により適宜決定される。例えば、機械的方法は破壊工程で熱を発生させるため一般的には氷上で実施される。非機械的方法としての化学的方法には溶菌試薬法が含まれるが、これは、界面活性剤、又はリゾチームを添加したバッファー中に宿主を懸濁して室温で処理することで細胞壁を破壊するものである。しかしながら、本発明において非機械的方法が宿主細胞の破壊に使用される場合、その処理温度は室温ではないことが好ましい。室温とは、例えば、１０～３０℃であってよい。

　室温ではない処理温度の下で宿主細胞を非機械的方法により破壊する方法の条件は、当業者により適宜決定される。例えば、非機械的方法の中でも、溶菌試薬法によって破壊する場合、処理温度の調節は、界面活性剤、リゾチーム等の必要な試薬を適宜添加したバッファー中に宿主を混合する操作を氷上で行うことにより実施される。試薬を添加したバッファーと宿主の混合液を、氷上から離し、ボルテックスミキサー等の公知の装置を用いて懸濁する場合は、混合液の温度が室温まで上がらないように速やかに、例えば、１０秒間以内で混合液を懸濁することが好ましい。氷上から離してボルテックスミキサー等を用いて懸濁した後、混合液を氷上に戻し、また氷上から離してボルテックスミキサー等を用いて懸濁するという操作を繰り返し行ってもよい。ボルテックスミキサー等の公知の装置を用いずに混合液を懸濁する場合は、常に氷上で懸濁操作を行うことが好ましい。混合、懸濁させた後、室温でのインキュベーションを行わないことで、加熱工程への速やかな移行が可能になる。混合、懸濁させた後、速やかに加熱工程へ移行しない場合は、氷上等で保管しておくことが好ましい。

　宿主細胞は、破壊工程後に、加熱工程にかけられる。加熱工程は、宿主細胞由来のタンパク質を変性させるために行われ、その温度は６４℃未満の温度であって、宿主細胞由来のタンパク質が変性する温度で行われる。加熱工程で使用される温度は、「加熱温度」又は「処理温度」ともいい、互いに同義で使用される。変性は、タンパク質のらせん構造やシート構造が破壊されることにより生じるが、タンパク質が変性する温度は、円二色性スペクトルや蛍光スペクトルのように、タンパク質の二次構造解析手法として公知のものにより決定することができる。

　本明細書で使用する場合、「６４℃未満の温度であって、宿主細胞由来のタンパク質が変性する温度」とは、宿主細胞由来のタンパク質の構造が変化し、そのタンパク質の機能が失われる、特定の温度以上であって、６４℃未満である温度のことである。また、宿主細胞由来のタンパク質は変性するが、好熱菌由来のタンパク質又はその相同体は変性しない温度のことである。

　加熱温度は、好熱菌の生育温度に応じて当業者が適宜決定することもできる。

　一実施形態において、加熱温度は５０℃以上である。

　加熱温度は、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃又は６３℃である。加熱温度は、５３℃～６２℃であることが好ましく、５５℃～６０℃であることがより好ましい。また、加熱工程の時間は、加熱温度によって変動するが、宿主細胞由来のタンパク質が変性すれば任意の時間であってよい。

　一実施形態において、加熱温度は約５３～６２℃、好ましくは約５５～６０℃である。

　一実施形態において、加熱温度が５０～６０℃の範囲内である場合、加熱工程の時間は、例えば５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、１５分、１６分、１７分、１８分又は１９分である。

　加熱は、当業者に公知のいかなる装置を用いてもよく、例えば、ヒートブロック等のインキュベーターを用いて加熱を行ってよい。また、工業的に生産する場合は、例えば、加熱用のタンクを用いて加熱を行ってもよい。

　宿主及び／又は宿主から産生されるタンパク質は、加熱工程後に冷却されてもよい。宿主で産生されたタンパク質は通常遠心分離等の工程によりその他の成分と分離されるが、宿主及び／又は宿主から産生されるタンパク質を冷却することで、冷却しない場合よりも、不溶性画分と可溶性画分とを明確に分離することができ、それにより、どちらかの画分に含まれる目的のリガーゼの回収量が増加し得る。冷却は、氷上で冷却されることが好ましいが、例えば、室温より低い温度で冷却されればよく、例えば、０～１０℃で冷却されればよい。また、冷却する時間は、不溶性画分と可溶性画分とを明確に分離することができれば任意であってよいが、例えば、１～３０分である。冷却工程は、加熱処理後速やかに行われることが好ましい。

　遠心分離法等を用いて宿主から産生されたキメラリガーゼは、冷却した後に回収される。

　産生されたキメラリガーゼは、当業者に公知の方法、例えば、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、又はゲルろ過クロマトグラフィー等によって精製されてよい。

　本実施形態は、キメラリガーゼの製造方法であって、好熱菌由来のリガ―ゼにおけるＯＢフォールドドメイン又はアデニル化ドメインを、好熱菌由来の異なる種の対応するドメインで置換する工程を含み、置換前のリガーゼとの比較でミスマッチ塩基対に対する識別能が向上している、方法、も提供する。置換する工程に代えて、所望とする配列を合成してもよい。例えば、形質転換体を通じでキメラリガーゼを製造する場合、キメラリガーゼを発現する遺伝子を含むベクターを合成してもよい。

　本実施形態のキメラリガーゼの性能の評価は、コントール、例えば置換前のリガーゼとの比較で行われる。両者の比較により、例えば、ミスマッチ塩基対の識別能の向上が決定される。

　ここで、ミスマッチ塩基対に対する識別能は、当業者に公知のいかなる方法によって評価されてもよいが、例えば、ミスマッチ塩基対を有する核酸と、その接合相手となる核酸とを含む試料をキメラリガーゼで処理した後、そのライゲーション産物を解析することで、ミスマッチ塩基対を有する配列を識別できるかどうかを評価することができる。ある特定のミスマッチ塩基対に対する識別能を評価する場合は、当該ミスマッチ塩基対を有する核酸と、その接合相手となる核酸とを含む試料をリガーゼで処理した後、そのライゲーション産物を解析することで、特定のミスマッチ塩基対に対する識別能を評価することができる。
　ライゲーション産物を解析することで評価する方法としては、例えば、相対接合率（％）（相対接合効率（％）であってもよい。）を用いて評価する方法がある。相対接合率（％）の算出方法は、接合する配列や比較対象に応じて、適宜決定することができる。例えば、比較対象がドメイン置換前のリガーゼの正確性である場合は、ある核酸試料をドメイン置換後のキメラリガーゼで処理した場合のライゲーション産物の量を、ミスマッチ塩基対を有さない当該核酸試料をドメイン置換前のリガーゼで処理した場合のライゲーション産物の量で割った値に１００をかけた値を、相対接合率（％）とすることができる。また、ある核酸試料をリガーゼで処理した場合のライゲーション産物の量を、試料に含まれる当該核酸が全て接合された場合の量で割った値に１００をかけて算出した値を、相対接合率（％）とすることもできる。ライゲーション産物の増幅産物を解析してミスマッチ塩基対の識別能を評価する場合は、増幅反応における、ＰＣＲ効率（ｅ）、比較対象とのＣｔ値の差（ΔＣｔ）等から、相対接合率（％）を算出してもよく、例えば、以下の式１で算出することができる。
＜式１＞
相対接合率（％）＝｛１／（１＋ｅ）^ΔＣｔ｝×１００

　相対接合率（％）を用いて、本実施形態におけるキメラリガーゼが、置換前のリガーゼとの比較でミスマッチ塩基対に対する識別能が向上したことを評価する場合、例えば以下のように評価する。
　ミスマッチ塩基対を有するある核酸に対する置換前のリガーゼの相対接合率と、同じ核酸に対する置換後のキメラリガーゼの相対接合率とを比較することで、ドメイン置換前のリガーゼとドメイン置換後のキメラリガーゼの、ミスマッチ塩基対の識別能の正確性を比較し、ドメインを置換することで識別能の正確性が向上したかどうかを評価する。

　ミスマッチ塩基対を有する核酸試料をリガーゼで処理した場合の相対接合率（％）は、ミス接合率（％）と呼んでもよい。
　ミス接合率（％）が０％に近いほど、ミスマッチ塩基対を有する核酸を接合しなかったと評価することができる。また、ミスマッチ塩基対を有さない核酸試料をリガーゼで処理した場合の相対接合率（％）が、１００％に近いほど、接合活性の高いリガーゼであると評価することができる。よって、例えば、ミスマッチ塩基対を有さない核酸試料をキメラリガーゼで処理した場合の相対接合率（％）が１００％に近く、ミス接合率（％）が０％に近いキメラリガーゼは、高い正確性で、ミスマッチ塩基対を有さない配列を接合するキメラリガ－ゼであると評価することができる。
　ドメイン置換後のキメラリガーゼが、ドメイン置換前のリガーゼとの比較で、ミス接合率がより低く、かつ、ミスマッチ塩基対を有さない核酸試料を処理した場合の相対接合率が同等又はより高い場合に、ドメインを置換することでミスマッチ塩基対に対する識別能が向上したと評価してよい。

　第二の実施態様において、試料において変異した標的配列を検出する方法であって、前記試料と第一の実施態様として提供されるキメラリガーゼとを接触させる工程と、リガーゼ反応を解析する工程と、を含む、方法、が提供される。

　本明細書で使用する場合、「変異」とは、塩基の置換、欠失、又は塩基の挿入等が生じた１つ又は複数の塩基、また、その塩基の置換等が生じている状態を指す。「変異」は、「多型」と互換的に使用することができる。塩基の置換、欠失、又は塩基の挿入等が生じる塩基の位置や、置換、欠失する塩基数、また、挿入される塩基数は解析される標的配列によって異なる。変異の種類としては、特に限定されないが、ミスセンス変異、ナンセンス変異、フレームシフト変異、又はサイレント変異等が挙げられる。本実施形態において、変異は多型であってよく、一塩基多型であることが好ましい。

　本実施形態における変異した標的配列の検出は、キメラリガ－ゼの、ミスマッチ塩基対を識別することができる特性、すなわち、高い正確性で、ミスマッチ塩基対を有さない配列を接合するという特性を利用することで、可能になる。

　具体的には、変異の検出を必要とする試料であって、変異した配列が存在する場合に、キメラリガーゼによって高い正確性で接合される核酸を含む試料を、当該キメラリガーゼで処理すると、試料に変異した標的配列が存在する場合に、当該キメラリガーゼによる反応産物が得られるため、キメラリガーゼによって変異した標的配列を検出することが可能になる。

　そのような検出にはプローブが使用される。具体的には、変異した標的配列に相補的な、隣接する２つのプローブを、変異の検出を必要とする試料に添加して、その試料を当該リガーゼで処理すると、試料に変異した標的配列が含まれる場合、変異した標的配列にハイブリダイズした２つのプローブは、変異した標的配列との間でミスマッチ塩基対を生じないため、キメラリガーゼによって、高い正確性で接合される。一方で、試料に野生型配列が含まれる場合、野生型配列にハイブリダイズした２つのプローブは、野生型配列との間でミスマッチ塩基対を生じるため、キメラリガーゼによって、低頻度でしか接合されないか、又は全く接合されない。よって、キメラリガーゼで処理する試料に、変異した標的配列が含まれる場合には、キメラリガーゼによって接合された２つのプローブからなる反応産物が高頻度で得られるため、キメラリガーゼで処理したこの試料を解析することで、変異の有無等を知ることができる。すなわち、変異した標的配列を検出することができる。

　本実施形態において、変異の検出を必要とする試料には、変異の検出の対象となる標的配列や、変異の検出に必要なプローブが含まれ得る。標的配列は、任意の形態で試料に含まれてよく、例えば、ゲノムＤＮＡ、細胞サンプル、組織サンプル等の一部として、また、標的配列を含む領域を、ＰＣＲ等によって増幅した増幅産物として、試料に含まれてよいが、増幅産物として試料に含まれることが好ましい。標的核酸が増幅産物として試料に含まれる場合、増幅する領域や、その長さは、当業者が適宜決定してよい。標的核酸は、一本鎖の核酸であってよく、二本鎖の核酸であってよい。試料に含まれる標的配列は、変異した標的配列と野生型の標的配列とが混合したものであってよく、変異した標的配列のみからなるものであってもよく、野生型の標的配列のみからなるものであってもよい。また、試料は、標的配列の他に、任意の配列、バッファー、試薬等も含んでいてもよい。

　本実施形態の方法は、試料とキメラリガーゼとを接触させる工程を含む。試料とキメラリガーゼとを接触させることで、試料に含まれる、変異があった場合に接合されるプローブのライゲーション反応が、キメラリガーゼによって触媒される。
　本実施形態において、キメラリガーゼは、任意のタイミングで試料に添加されてよい。試料に始めから含まれていてもよく、プローブを標的配列にハイブリダイズさせる工程が終わってから添加されてもよい。ハイブリダイズ工程と、キメラリガーゼによるライゲーション反応は、並行してよいし、又は、ハイブリダイズ工程の後に、ライゲーション反応を実施してもよい。また、キメラリガーゼと試料とを反応させる時間、及び処理温度等の各反応条件は、当業者が適宜決定することができる。

　本実施形態の方法は、リガーゼ反応を解析する工程を含んでもよい。リガーゼ反応の解析は、広くキメラリガーゼによるライゲーション反応の解析を指し、具体的には、変異した標的配列を検出するためのライゲーション反応の解析を指す。変異した標的配列を検出するためのライゲーション反応の解析は、特に限定されず、当業者に公知のいかなる方法であってもよいが、これまでに知られている、リガーゼを利用した、変異した標的配列の検出方法として、例えば、リガーゼ検出反応（ＬＤＲ法：Ｌｉｇａｓｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）や、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ法：Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）等がある。リガーゼ反応を解析する工程は、ＬＤＲ法又はＬＣＲ法を含むことが好ましい。

　本実施形態における、リガーゼ反応を解析する工程は、ライゲーション反応産物を解析することを含む。ライゲーション反応産物には、変異した標的配列が存在する場合に高頻度で接合されることで生じる反応産物が含まれ得る。当該ライゲーション反応産物を解析することで、変異した標的配列の有無を決定することができる。
　ライゲーション反応産物を解析する方法は、特に限定されず、当業者に公知のいかなる方法によっても実施することができ、例えば、電気泳動、ＰＣＲ等の増幅反応、マイクロアレイ解析、磁気ビーズを用いた解析等によって、解析することができる。反応産物を、蛍光物質や特定の配列等、任意の方法で標識して、解析してもよい。

　ミスマッチ塩基対の識別能を有さないリガーゼは、ライゲーションする、標的配列と検出のために用いられるプローブとが形成する二本鎖配列がミスマッチ塩基対を有していても、識別できずライゲーションしてしまうところ、キメラリガーゼは、ライゲーションにおいて、接合部付近にミスマッチ塩基対がない配列を識別することができる。この特性を利用して、キメラリガーゼは、変異した標的配列を検出することができる。本実施形態は、変異した標的配列を検出するための、キメラリガーゼ、も提供する。

ＬＤＲ法
　本実施形態において、リガーゼ反応を解析する工程がＬＤＲ法を含む場合、すなわち、ＬＤＲ法によって変異した標的配列を検出する場合、キメラリガーゼと接触させる試料は、変異の検出の対象となる標的配列、変異した標的配列と相補的な配列を含む核酸（以降、第１核酸とする）、及び標的配列の５’側又は３’側隣接配列と、相補的な配列を含む核酸（以降、第２核酸とする）の３つを含むことが好ましい。

　第１核酸、及び第２核酸は、二本鎖の核酸であってもよいが、一本鎖の核酸であることが好ましい。また、第１核酸、及び第２核酸は、それぞれ、標識プライマー、及び共通プライマーと呼んでもよい。

　第１核酸、及び第２核酸の長さは、数ヌクレオチド～数百ヌクレオチド、好ましくは、約１０～２００ヌクレオチドである。

　一実施形態において、第１核酸、及び第２核酸の長さは、数ヌクレオチド～数百ヌクレオチド、例えば、１０～２００ヌクレオチド、１０～１５０ヌクレオチド、好ましくは、１２～１００ヌクレオチドである。

　ＬＤＲ法の具体的な手順は、当業者が適宜決定することができるが、各手順の一例を、以下に記載する。

　まず、キメラリガーゼと接触させる試料において、第１核酸、及び第２核酸を、標的配列を含む一本鎖配列にハイブリダイズさせる。標的配列が二本鎖を形成した状態で試料に含まれる場合は、試料を加熱して、標的配列の二本鎖を変性させて一本鎖にしてから、ハイブリダイズさせてもよい。

　ハイブリダイズと並行して、又はハイブリダイズが完了した後、試料はキメラリガーゼと接触される。
　標的配列に変異が含まれる場合、核酸は、キメラリガーゼによって、高い正確性で、接合され得る。例えば、変異した標的配列を含む一本鎖配列が、第１核酸と、相補的な二本鎖配列を形成する結果、変異した標的配列を含む一本鎖配列にハイブリダイズした、第１核酸、及び第２核酸は、ミスマッチ塩基対の識別能を有するキメラリガーゼによって、高い正確性で、接合される。
　一方で、標的配列に変異が含まれない場合、核酸は、キメラリガーゼによって、低頻度でしか接合されないか、又は全く接合されない。例えば、変異していない野生型の標的配列を含む一本鎖配列が、第１核酸と、ミスマッチ塩基対を有する二本鎖配列を形成する結果、変異した標的配列を含む一本鎖配列にハイブリダイズした、第１核酸、及び第２核酸は、ミスマッチ塩基対の識別能を有するキメラリガーゼによって、低頻度でしか接合されないか、又は全く接合されない。

　キメラリガーゼと試料とを接触させる際、キメラリガーゼによるミスマッチ塩基対の識別をより正確にするために、接合部の両側３塩基以内にミスマッチ塩基対が存在することが好ましい。すなわち、変異を有さない標的配列を含む一本鎖配列にハイブリダイズした際に、接合部の両側３塩基以内にミスマッチ塩基対が存在するように、第１核酸の塩基配列を設計することが好ましい。例えば、第１核酸、及び第２核酸が、標的配列を含む一本鎖配列にハイブリダイズした際に、第１核酸の３’末端側に、第２核酸が存在する場合を例に説明する。この場合、標的配列における変異した塩基と相補的な塩基が、第１核酸の３’末端、３’末端の１塩基隣、及び／又は３’末端の２塩基隣に、位置することが好ましい。このような配置では、標的配列における変異した塩基と相補的な塩基が存在する場合、第１核酸が、変異を有さない標的配列を含む一本鎖配列にハイブリダイズした際に、接合部の両側１、２、及び／又は３塩基以内に、ミスマッチ塩基対が生じることになるため、キメラリガーゼは、より正確にミスマッチ塩基対を認識することができるようになる。よって、接合部の両側３塩基以内にミスマッチ塩基が存在する場合には、キメラリガーゼによる接合率が低くなる。

　ここで、第１核酸、及び第２核酸は、それぞれ、それらと相補的な配列を連続した配列として含む限り、他に、任意の配列を含んでもよい。当該任意の配列の、各核酸における位置、長さは、当業者によって適宜決定されてよいが、標的配列を含む一本鎖配列にハイブリダイズした際に、接合部の両側３塩基以内となる位置以外に、当該任意の配列を含むことが好ましい。また、当該任意の配列は、試料を解析する際に標識となるような配列であってもよい。

　リガーゼ反応後、試料内に変異した標的配列が存在する場合には、キメラリガーゼによってライゲーションされた、第１核酸、及び第２核酸を含む反応産物が生じるが、変異した標的配列が存在しない場合には、そのような反応産物が、低頻度でしか生じないか、又は全く生じない。よって、試料における変異した標的配列の有無は、ＬＤＲ法の反応産物の有無に基づいて決定され得る。

　以上から、キメラリガーゼは、正確性の高いミスマッチ識別能を持ったリガーゼが必要とされるＬＤＲ法にも適用することができるため、本実施形態は、ＬＤＲ法によって変異した標的配列を検出する方法も提供する。また、本実施形態は、ＬＤＲ法によって変異した標的配列を検出するための、キメラリガーゼ、も提供する。

　また、本実施形態の、ＬＤＲ法による方法で検出される、変異した標的配列は、１種類に限られない。複数の種類の、変異した標的配列の検出は、複数の変異に対応した、第１核酸を、試料に含ませることで、可能になる。

ＬＣＲ法
　本実施形態において、リガーゼ反応を解析する工程がＬＣＲ法を含む場合、すなわち、ＬＣＲ法によって変異した標的配列を検出する場合、キメラリガーゼと接触させる試料は、変異の検出の対象となる標的配列、変異した標的配列と相補的な配列を含む核酸（第１核酸）、標的配列の５’側又は３’側隣接配列と、相補的な配列を含む核酸（第２核酸）、変異した標的配列を含む核酸（以降、第３核酸とする）、及び標的配列の５’側又は３’側隣接配列を含む核酸（以降、第４核酸とする）の５つを含むことが好ましい。

　第１核酸、第２核酸、第３核酸、及び第４核酸は、二本鎖の核酸であってもよいが、一本鎖の核酸であることが好ましい。

　第１核酸、第２核酸、第３核酸、及び第４核酸の長さは、数ヌクレオチド～数百ヌクレオチド、好ましくは、約１０～２００ヌクレオチドである。

　一実施形態において、第１核酸、第２核酸、第３核酸、及び第４核酸の長さは、数ヌクレオチド～数百ヌクレオチド、例えば、１０～２００ヌクレオチド、１０～１５０ヌクレオチド、好ましくは、１２～１００ヌクレオチドである。

　ＬＣＲ法の具体的な反応工程は、当業者が適宜決定することができるが、各工程の一例を、以下に記載する。

　まず、リガーゼと接触させる試料において、第１核酸、及び第２核酸は、標的配列を含む一本鎖配列にハイブリダイズされ、さらに、第３核酸、及び第４核酸を、変異した標的配列を含む一本鎖配列の相補鎖にハイブリダイズされる。標的配列が二本鎖を形成した状態で試料に含まれる場合は、試料を加熱して、標的配列の二本鎖を変性させて一本鎖にしてから、ハイブリダイズさせてもよい。

　ハイブリダイズが完了した後、試料はキメラリガーゼと接触される。
　標的配列に変異が含まれる場合、核酸は、キメラリガーゼによって、高い正確性で、接合され得る。例えば、変異した標的配列を含む一本鎖配列が、第１核酸と、相補的な二本鎖配列を形成する結果、変異した標的配列を含む一本鎖配列にハイブリダイズした、第１核酸、及び第２核酸は、ミスマッチ塩基対の識別能を有するキメラリガーゼによって、高い正確性で、接合される。あるいは、変異した標的配列を含む一本鎖配列の相補鎖が、第３核酸と相補的な二本鎖配列を形成する結果、変異した標的配列を含む一本鎖配列の相補鎖にハイブリダイズした、第３核酸、及び第４核酸は、ミスマッチ塩基対の識別能を有するキメラリガーゼによって、高い正確性で、接合される。
　一方で、標的配列に変異が含まれない場合、核酸は、キメラリガーゼによって、低頻度でしか接合されないか、又は全く接合されない。例えば、変異を有さない標的配列を含む一本鎖配列が、第１核酸と、ミスマッチ塩基対を有する二本鎖配列を形成する結果、変異した標的配列を含む一本鎖配列にハイブリダイズした、第１核酸、及び第２核酸は、ミスマッチ塩基対の識別能を有するキメラリガーゼによって、低頻度でしか接合されないか、又は全く接合されない。あるいは、変異を有さない標的配列を含む一本鎖配列の相補鎖が、第３核酸と、ミスマッチ塩基対を有する二本鎖配列を形成する結果、変異した標的配列を含む一本鎖配列の相補鎖にハイブリダイズした、第３核酸、及び第４核酸は、ミスマッチ塩基対の識別能を有するキメラリガーゼによって、低頻度でしか接合されないか、又は全く接合されない。

　キメラリガーゼと試料とを接触させる際、キメラリガーゼによるミスマッチ塩基対の識別をより正確にするために、接合部の両側３塩基以内にミスマッチ塩基対が存在することが好ましい。すなわち、変異を有さない標的配列を含む一本鎖配列、又は変異を有さない標的配列を含む一本鎖配列の相補鎖にハイブリダイズした際に、接合部の両側３塩基以内にミスマッチ塩基対が存在するように、第１核酸、又は第３核酸の塩基配列を設計することが好ましい。
　例えば、第１核酸、及び第２核酸が、標的配列を含む一本鎖配列にハイブリダイズした際に、第１核酸の３’末端側に、第２核酸が存在する場合、標的配列における変異した塩基と相補的な塩基が、第１核酸の３’末端、３’末端の１塩基隣、及び／又は３’末端の２塩基隣に、位置することが好ましい。
　また、例えば、第３核酸、及び第４核酸が、標的配列を含む一本鎖配列の相補鎖にハイブリダイズした際に、第３核酸の３’末端側に、第４核酸、が存在する場合、標的配列における変異した塩基が、第３核酸の３’末端、３’末端の１塩基隣、及び／又は３’末端の２塩基隣に、位置することが好ましい。
　このような配置では、標的配列における変異した塩基と相補的な塩基、又は標的配列における変異した塩基が存在する場合、第１核酸、又は第３核酸が、それぞれ、変異を有さない標的配列を含む一本鎖配列、又は変異を有さない標的配列を含む一本鎖配列の相補鎖にハイブリダイズした際に、接合部の両側１、２、及び／又は３塩基以内に、ミスマッチ塩基対が生じることになるため、キメラリガーゼは、より正確にミスマッチ塩基対を認識することができるようになる。よって、接合部の両側３塩基以内にミスマッチ塩基が存在する場合には、リガーゼによる接合率が低くなる。

　ここで、第１核酸、第２核酸、第３核酸、及び第４核酸は、それぞれ、核酸に含まれる各配列を連続した配列として含む限り、他に、任意の配列を含んでもよい。当該任意の配列の、各核酸における位置、長さは、当業者によって適宜決定されてよいが、標的配列を含む一本鎖配列、又はその相補鎖にハイブリダイズした際に、接合部の両側３塩基以内となる位置以外に、当該任意の配列を含むことが好ましい。また、第１核酸、第２核酸、第３核酸、及び第４核酸に含まれる任意の配列は、試料を解析する際に標識となるような配列であってもよい。

　リガーゼ反応後、試料内に変異した標的配列が存在する場合には、キメラリガーゼによってライゲーションされた、第１核酸、及び第２核酸を含む反応産物、及び、第３核酸、及び第４核酸を含む反応産物、が生じる。これらの２つの反応産物は、２本鎖を形成していてもよい。

　これらの２つの反応産物、及び試料に含まれる標的配列は、変異した標的配列を含む一本鎖配列、又は、変異した標的配列を含む一本鎖配列の相補鎖として働き、試料における、第１核酸、第２核酸、第３核酸、及び第４核酸と反応することができるため、上記のハイブリダイズ工程及びライゲーション工程を更に繰り返すことで、試料が変異した標的配列を含む場合、変異した標的配列を含む配列、及びその相補鎖を指数関数的に増やすことができる。試料において、変異した標的配列が存在しない場合には、そのような反応産物が、低頻度でしか生じないか、又は全く生じない。よって、試料における変異した標的配列の有無は、ＬＣＲ法の反応産物の有無から決定され得る。

　以上から、キメラリガーゼは、正確性の高いミスマッチ識別能を持ったリガーゼが必要とされるＬＣＲ法にも適用することができるため、本実施形態は、ＬＣＲ法によって変異した標的配列を検出する方法も提供する。また、本実施形態は、ＬＣＲ法によって変異した標的配列を検出するための、第一の実施態様として提供されるリキメラガーゼ、も提供する。

　また、本実施形態の、ＬＣＲ法による方法で検出される、変異した標的配列は、１種類に限られない。複数の種類の、変異した標的配列の検出は、複数の変異に対応した、第１核酸、及び第３核酸を、試料に含ませることで可能になる。

　キメラリガーゼがＬＤＲ法やＬＣＲ法に適用可能か否かは、ミスマッチ塩基対の識別能を確認する手段を用い、任意の方法により評価することができる。例えば、ＬＤＲ法やＬＣＲ法における工程を再現した実験に供与することで評価することができ、また、ＬＤＲ法やＬＣＲ法に準じた工程を実施する実験に供与することでも、評価することができる。

　また、キメラリガーゼがＬＤＲ法やＬＣＲ法に適用可能か否かは、例えば、変異した標的配列、変異した標的配列に相補的な配列、変異していない標的配列に相補的な配列、及び標的配列の隣接配列に相補的な配列を含む試料に対して、キメラリガーゼを反応させた際の、変異した標的配列に相補的な配列、及び標的配列の隣接配列に相補的な配列を含むライゲーション産物と、変異していない標的配列に相補的な配列、及び標的配列の隣接配列に相補的な配列を含むライゲーション産物とを比較することで評価することができる。すなわち、キメラリガーゼがＬＤＲ法やＬＣＲ法に適用可能か否かは、ミスマッチ塩基対が接合部付近にあるのにもかかわらず、接合されることで生じる、変異していない標的配列に相補的な配列、及び標的配列の隣接配列に相補的な配列を含むライゲーション産物の量や、割合等によって、評価することができる。例えば、ミス接合率（％）に基づいて、評価してよい。

　キメラリガーゼがＬＤＲ法やＬＣＲ法に適用可能か否かは、また、例えば、変異した標的配列、変異していない標的配列、及び、変異した標的配列に相補的な配列を含む一本鎖環状配列の、変異を有する部位付近にニックが入って開環した一本鎖配列、を含む試料に対して、リガーゼを反応させることでも、評価することができる。試料における、変異した標的配列、変異していない標的配列は、増幅産物として含まれることが好ましい。
　この場合、ニックがライゲーションされることで、変異した標的配列に相補的な配列を含む環状配列がライゲーション産物として生じる。よって、ミスマッチ塩基対を識別できるキメラリガーゼかどうかは、変異した標的配列を添加した際の、環状配列を含むライゲーション産物と、変異していない標的配列を添加した際の、環状配列を含むライゲーション産物とを比較することで、評価することができる。キメラリガーゼがＬＤＲ法やＬＣＲ法に適用可能か否かは、また、ライゲーションにより環状化して、ニックを含む領域をＰＣＲ等によって増幅することができるようになるため、当該増幅産物を解析することでも、評価することができる。すなわち、キメラリガーゼがＬＤＲ法やＬＣＲ法に適用可能か否かは、ミスマッチ塩基対が接合部付近にあるのにもかかわらず、接合されることで生じる、環状配列を含むライゲーション産物、又はニックを含む領域の増幅産物の量や、割合等によって、評価することができる。例えば、ミス接合率（％）に基づいて、評価してよい。

（変異した標的配列を検出するためのキット）
　第三の実施態様において、変異した標的配列を検出するためのキットであって、第一の実施態様として提供されるキメラリガーゼを含む、キット、が提供される。

　本実施形態のキットとして提供されるキメラリガーゼは、任意のバッファー、核酸、その他必要な試薬等と一緒に提供されてよい。キメラリガーゼは、特に、リガーゼ検出反応（ＬＤＲ）又はリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）に使用される試薬と一緒に提供されることが好ましく、他には、例えば、ジチオトレイトール、水、塩化カリウム、ＥＤＴＡ、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ＢＳＡ、ＤＭＳＯ、グリセロール、ＤＮＡ又はＲＮＡ分解酵素阻害剤、界面活性剤等と一緒に提供されてもよい。ＬＤＲに使用される試薬は、変異した標的配列と相補的な配列を含む核酸、及び標的配列の５’側又は３’側隣接配列と、相補的な配列を含む核酸を含んでいてもよい。ＬＣＲに使用される試薬は、変異した標的配列と相補的な配列を含む核酸、変異した標的配列を含む核酸、標的配列の５’側又は３’側隣接配列と、相補的な配列を含む核酸、及び標的配列の５’側又は３’側隣接配列を含む核酸を含んでいてもよい。

　本実施形態のキットは、キメラリガーゼと、任意のバッファー、核酸、その他必要な試薬等とが一緒の容器に入れられて提供されてもよく、試薬はそれぞれ別の容器で提供されてもよい。また、試薬がそれぞれ別の容器に入れて提供される場合、それらの容器は１つの箱等にまとめて提供されてもよい。

　本実施形態のキットは、キットに含まれるキメラリガーゼ、及び、必要に応じて、一緒に提供される試薬等を、変異の検出を必要とする試料と反応させることで、変異した標的配列を検出することを可能にする。変異した標的配列の検出は、好ましくは、変異の検出を必要とする試料を、キメラリガーゼを含む本実施形態のキットで処理した後、当該試料を解析することで可能になる。変異した標的配列の検出は、より好ましくは、変異の検出を必要とする試料を、キメラリガーゼを含む本実施形態のキットで処理した後、変異があった場合に生じるライゲーション産物を解析することで可能になる。

　本実施形態のキットは、ＬＤＲによって変異した標的配列を検出するためのキットであってもよく、ＬＣＲによって変異した標的配列を検出するためのキットであってもよい。

　本実施形態は、キメラリガーゼを含む、キットを用いて、変異した標的配列を検出する方法も提供する。

　以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。

＜キメラタンパク質組み換え部位の設計＞
　Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｓｐｅｃｉｅｓ（Ｔｓｐ）由来ＬｉｇＡ（配列番号１）、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｆｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）由来ＬｉｇＡ（配列番号２）、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ（Ｔｂｒ）由来ＬｉｇＡ（配列番号３）、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｆｉ）由来ＬｉｇＡ（配列番号４）、Ｔｈｅｒｍｕｓ　Ｏｓｈｉｍａｉ（Ｔｏｓ）由来ＬｉｇＡ（配列番号５）のアミノ酸相同性解析を行い、３１６番目から３２９番目アミノ酸（ＡＹＫＦＰＡＥＥＫＥＴＲＬＬ＝配列Ｘ）、４２１番目から４４３番目アミノ酸（ＫＥＧＫＶＨＲＣＰＮＰＬＣＰＡＫＲＦＥＡＩＲＨ＝配列Ｙ）、６０２番目から６１６番目アミノ酸（ＴＧＥＬＳＲＰＲＥＥＶＫＡＬＬ＝配列Ｚ）が種間でアミノ酸配列が保存されていることを見出した。配列Ｘの上流にはアデニル化ドメイン（ドメイン１）が、配列Ｘと配列Ｙの間はオリゴマー結合ドメイン（ＯＢフォールドドメイン）及び亜鉛フィンガードメイン（両者でドメイン２）が、配列Ｙと配列Ｚの間にはヘリックスーヘアピン―ヘリックスドメイン（ドメイン３）が、配列Ｚの下流にはＢＲＣＴドメイン（ドメイン４）が存在する。図１に、Ｔｈｅｒｍｕｓ属細菌由来のリガーゼにおける、アデニル化ドメイン（アデニル化）、ＯＢフォールドドメイン（ＯＢ）、亜鉛フィンガードメイン（Ｚｎ）、ヘリックスーヘアピン―ヘリックスドメイン（ＨｈＨ）、及びＢＲＣＴドメイン（ＢＲＣＴ）の位置関係の例を示した。
　種間で保存されている領域である配列Ｘ～Ｚを利用して、Ｇｉｂｓｏｎ　Ａｓｓｅｍｂｌｙ組換え法により、Ｔｔｈ　ＬｉｇＡのドメイン１～４をＴｓｐ　ＬｉｇＡの同ドメインと各々組換えたキメラＬｉｇＡ発現コンストラクトを作製した（配列番号６～９）。配列Ｘ～Ｚを末端に含む領域を、それぞれ組換えた。
　また、Ｔｂｒ　ＬｉｇＡ，Ｔｆｉ　ＬｉｇＡ，Ｔｏｓ　ＬｉｇＡのドメイン２をＴｓｐ　ＬｉｇＡの同ドメインと組み替えたキメラＬｉｇＡ発現コンストラクトを作製した（配列番号１０～１２）。
　なお、全てのコンストラクトのＮ末端には６×Ｈｉｓ配列及びＴＥＶプロテアーゼ認識配列を付加した（配列番号１３）。

＜形質転換＞
　Ｔｓｐ　ＬｉｇＡコンストラクト、Ｔｔｈ　ＬｉｇＡコンストラクト、Ｔｂｒ　ＬｉｇＡコンストラクト、Ｔｆｉ　ＬｉｇＡコンストラクト、Ｔｏｓ　ＬｉｇＡコンストラクト、Ｔｔｈ／Ｔｓｐ（ドメイン１）　ＬｉｇＡコンストラクト、Ｔｔｈ／Ｔｓｐ（ドメイン２）　ＬｉｇＡコンストラクト、Ｔｔｈ／Ｔｓｐ（ドメイン３）　ＬｉｇＡコンストラクト、Ｔｔｈ／Ｔｓｐ（ドメイン４）　ＬｉｇＡコンストラクト、Ｔｂｒ／Ｔｓｐ（ドメイン２）　ＬｉｇＡコンストラクト、Ｔｆｉ／Ｔｓｐ（ドメイン２）　ＬｉｇＡコンストラクト、Ｔｏｓ／Ｔｓｐ（ドメイン２）　ＬｉｇＡコンストラクトが組み込まれたｐＥＴベクターをＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社、Ｃａｔ：ＥＣ０１１４）に形質転換した。形質転換した大腸菌をアンピシリン含有ＬＢプレートに播種して一晩３７℃条件で培養し、大腸菌コロニーを形成させた。

＜酵素タンパク質発現誘導＞
　シングルコロニーを少量のカルベニシリン含有液体ＬＢ培地に播種し、一晩３７℃条件で振盪培養した（２２５ｒｐｍ、前培養）。翌日、新しいカルベニシリン含有液体ＬＢ培地に１／４０量の前培養液を加えて４時間３７℃条件で振盪培養した（２２５ｒｐｍ、本培養）。本培養液のＯＤ６００値が０．４－０．６の間であることを確認し、終濃度０．１ｍＭのＩＰＴＧ（富士フイルム和光、Ｃａｔ：０９９－０５０１３）を添加し、３時間３０℃条件で振盪培養した（２２５ｒｐｍ、ＩＰＴＧ誘導）。ＩＰＴＧ誘導大腸菌液を回収し、遠心分離（１０，０００ｘｇ，　１０分，　４℃）により大腸菌ペレットを回収し、湿重量を測定した上で、－８０℃冷凍庫内で一晩以上凍結させた。

＜大腸菌の溶菌及び可溶性画分採取＞
　凍結大腸菌を氷上に移し、１，０００Ｕ／ｍＬ　ｒＬｙｓｏｚｙｍｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｃａｔ：７１１１０－４）＋１／２００　Ｖｏｌｕｍｅ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｃａｔ：５３９１３４－１ＭＬＣＮ）含有ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｃａｔ：７０９２１－４）を大腸菌湿重量１ｇあたり５ｍＬ添加し、温まらないように速やかにボルテックスで完全に懸濁させた。大腸菌懸濁液を１．５ｍＬマイクロチューブに分注し、６０℃に設定した各ヒートブロックに移し、１５分間振盪反応させた（６００ｒｐｍ）。加熱処理後速やかに氷上に設置したアルミブロック上に移し、１５分間冷却処理し沈殿を熟成させた。遠心分離処理（１６，０００ｘｇ，２０分，４℃）後、可溶性画分を回収し、新しい１．５ｍＬマイクロチューブに移した。

＜Ｈｉｓアフィニティ精製＞
　２５０μＬのＨｉｓ－Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｇｅｌ（Ｈｉｓ－Ｓｐｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　ｋｉｔ（ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ：Ｐ２００２）同梱品）をＨｉｓ－Ｓｐｉｎ　ｃｐｌｕｍｎＨｉｓ－Ｓｐｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　ｋｉｔ同梱品）に移し、遠心分離処理（１５，０００ｘｇ，２０秒，４℃）でゲル分散液を除去した。可溶性画分３００μＬを添加し、２５℃で５分間振盪処理した（１，５００ｒｐｍ）。遠心処理（同上）し、フロースルー液をデカントで廃棄した。２５０μＬの洗浄バッファー（１０ｍＭイミダゾール（ナカライテスク、Ｃａｔ：０８７８７－２２）、０．０３％トライトンＸ（登録商標）－１００（富士フイルム和光、Ｃａｔ：１６０－２４７５１）を添加して、穏やかにボルテックスで混和し、遠心処理（同上）する。フロースルー液を廃棄し、同洗浄操作をさらに２回繰り返した。カラムを新しい１．５ｍＬマイクロチューブにセットし、２５０μＬのＨｉｓ－Ｅｌｕｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｈｉｓ－Ｓｐｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　ｋｉｔ同梱品）を添加して、ボルテックスにより１０秒程度混和し、氷上で１分以上静置した。遠心処理（同上）により、溶出液を回収した。　溶出液量を正確に記録した。

＜溶出液中タンパク質濃度測定＞
　吸光度計を用いてタンパク質を構成する芳香族アミノ酸（チロシン，トリプトファン）の側鎖に由来する２８０ｎｍの吸収量を測定することでタンパク質濃度を計測した。測定に際しては、ブランク液としてＨｉｓ－Ｅｌｕｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒを用いた。溶出液量と測定値の乗算値を用いた大腸菌湿重量で除することで、収量（μｇタンパク質／μｇ菌体湿重量）を算出した。

＜リガーゼ活性評価―ｓｓＤＮＡオリゴ架橋リガーゼ反応＞
　各ＬｉｇＡのタンパク質濃度が３．４ｎｇ／μＬとなるようにＬｉｇＡ希釈液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ塩化カリウム（ナカライテスク、Ｃａｔ：２８５３８－７５）、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｔ：１５５７５－０２０）、１ｍＭ　ジチオトレイトール、０．１％　トライトンＸ（登録商標）－１００、５０％グリセロール）で各溶出液を希釈した。２０ｎＭ鋳型ＤＮＡオリゴ（配列番号１４から配列番号２０のいずれかのＤＮＡオリゴ）、２０ｎＭ架橋ｓｓＤＮＡオリゴ（配列番号２１から配列番号２８のいずれかのＤＮＡオリゴ）、１×ＨｉＦｉ　Ｔａｑ　Ｌｉｇａｓｅ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｃａｔ：Ｍ０６４７Ｓ添付バッファー）を含む反応液に１０ｖ／ｖ％となるように上記希釈ＬｉｇＡ液を添加して、よく混和した。９５℃で５分間熱変性処理を行い、特に断りがない限りは、５０℃で１時間リガーゼ反応を行った。反応終了後速やかに冷却し、反応停止液（８０％ホルムアミド（富士フイルム和光、Ｃａｔ：０６６－０２３０１）、１００ｍＭ　ＥＤＴＡ）を反応液の１．５倍量添加して、混和後氷上に静置した。

＜リガーゼ活性評価―ｄｓＤＮＡアンプリコン架橋リガーゼ反応＞
　各ＬｉｇＡのタンパク質濃度が３．４ｎｇ／μＬとなるようにＬｉｇＡ希釈液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ塩化カリウム（ナカライテスク、Ｃａｔ：２８５３８－７５）、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｔ：１５５７５－０２０）、１ｍＭ　ジチオトレイトール、０．１％　トライトンＸ（登録商標）－１００、５０％グリセロール）で各溶出液を希釈した。１０ｎＭ鋳型ＤＮＡオリゴ（配列番号１４から配列番号２０のいずれかのＤＮＡオリゴ）、１０ｎＭ架橋ｄｓＤＮＡアンプリコン（配列番号２９から配列番号３６のいずれかのＤＮＡオリゴ）、１×ＨｉＦｉ　Ｔａｑ　Ｌｉｇａｓｅ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｃａｔ：Ｍ０６４７Ｓ添付バッファー）を含む反応液に１０ｖ／ｖ％となるように上記希釈ＬｉｇＡ液を添加して、良く混和した。９５℃で５分間熱変性処理を行い、５０℃で３分間、８０℃で１５秒を１サイクルとして１５サイクルリガーゼ反応を行った。

＜リガーゼ活性評価―定量リアルタイムＰＣＲ反応＞
　反応停止処理済み反応液をＵｌｔｒａＰｕｒｅ　ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ　Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ　Ｗａｔｅｒで４０，０００倍希釈し、１ＸＰｒｉｍｅ　Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ａｓｓａｙ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、２０　μＭの配列番号３７及び３８、１０μＭの配列番号３９のＤＮＡオリゴから構成される。配列番号３９には５’末端に蛍光分子であるＦＡＭが、３’末端に消光分子であるＩｏｗａ　Ｂｌａｃｋ（登録商標）　ＦＱが修飾されている）、１ＸＰｒｉｍｅＴｉｍｅ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　、Ｃａｔ；１０５５７７１）から成る定量リアルタイムＰＣＲ反応液に２μＬ添加した。３分間の９５℃熱変性処理後、１５秒の９５℃熱変性処理、３０秒の６０℃伸長反応を１サイクルとして計４５サイクルのＰＣＲ反応を行った。蛍光シグナルは各サイクル終了後に１回検出した。測定した蛍光シグナル増幅曲線の二次導関数（２回微分した曲線）が最大となる位置をＣｔ値として算出した。

＜実施例１＞
　各ＢＲＡＦ遺伝子変異を検出するための検出鋳型ＤＮＡオリゴの５’側及び３’側の各１３塩基ずつに対して完全相補的な配列を含み、検出鋳型ＤＮＡオリゴの５’側及び３’側にアニーリングした際ニックを形成する架橋ｓｓＤＮＡオリゴ（検出鋳型ＤＮＡオリゴと架橋ｓｓＤＮＡオリゴの変異バリアントが対応した条件）、あるいは、同様に検出鋳型ＤＮＡオリゴにアニーリングした際ニックを形成するが、検出鋳型ＤＮＡオリゴと完全相補的でなく、検出鋳型ＤＮＡオリゴと３’側にミスマッチを生じるＢＲＡＦ　架橋ｓｓＤＮＡオリゴ（ミスマッチ条件）の存在下において、ニックが接合されて検出鋳型ＤＮＡオリゴが環状化した効率（％）を評価した。

　Ｔｔｈ　ＬｉｇＡを用い、検出鋳型ＤＮＡオリゴと架橋ｓｓＤＮＡオリゴの変異バリアントが対応した条件の接合量を１００％とした場合の、各ミスマッチ条件における、上記で算出したＣｔ値を用いた相対接合率を図２に示した。いずれのミスマッチの組合せにおいても、相対接合率が概ね１％未満と良好な正確性を示したものの、８つの組合せにおいて、１％を上回り、最大３．６５％のミス接合が生じた。なお、Ｔｔｈ　ＬｉｇＡは先行文献１（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　１９９６，　Ｖｏｌ．　２４，　Ｎｏ．　１４　３０７１－３０７８）において正確性が高いと言われている。

＜実施例２＞
　実施例１の試験に対して、架橋核酸としてｓｓＤＮＡオリゴではなく、各ＢＲＡＦ遺伝子変異を有するプラスミドＤＮＡから増幅して精製したアンプリコンを架橋核酸（架橋ｄｓＤＮＡアンプリコン）として使用した場合の、正確性を評価した。Ｔｔｈ　ＬｉｇＡを用い、検出鋳型ＤＮＡオリゴと架橋ｄｓＤＮＡアンプリコンの変異バリアントが一致した条件の接合量を１００％とした場合の、各ミスマッチ条件における、上記で算出したＣｔ値を用いた相対接合率を図３に示した。架橋ｄｓＤＮＡアンプリコンを使用した場合において、正確性が５％を上回る組み合わせが１３通り観察された。正確性が１％を上回る組み合わせは合計１９つであった。

＜実施例３＞
　先行文献２（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　１９９９，　Ｖｏｌ．　２７，　Ｎｏ．　３）において、Ｔｓｐ　ＬｉｇＡはＴｔｈ　ＬｉｇＡよりも正確性が高いと報告されているため、実施例１で使用したＴｔｈ　ＬｉｇＡの代わりにＴｓｐ　ＬｉｇＡを用いて、その正確性を評価した（図４）。Ｔｔｈ　ＬｉｇＡ（図２）に比べて、正確性が向上し、わずかに１つの組合せにおいてのみ正確性が１％を上回った。

＜実施例４＞
　同様に架橋核酸としてｄｓＤＮＡアンプリコンを使用して、実施例２の試験で使用したＴｔｈ　ＬｉｇＡの代わりにＴｓｐ　ＬｉｇＡを用いて、その正確性を評価した（図５）。Ｔｔｈ　ＬｉｇＡ（図３）に比べて、正確性が向上し、正確性が５％を上回る組み合わせが３通、正確性が１％を上回る組み合わせは合計８つに減った。

　一方、Ｔｓｐ　ＬｉｇＡはＴｔｈ　ＬｉｇＡに比べて、架橋核酸としてｄｓＤＮＡアンプリコンを用いた完全相補条件での環状化効率が低く、特にＥ１，Ｄ，Ｇの検出鋳型ＤＮＡオリゴを用いた場合に半分以下であった（図６）。すなわち、長鎖ｄｓＤＮＡを架橋核酸として使用した時の接合効率が低いと考えられた。

＜実施例５＞
　Ｔｓｐ　ＬｉｇＡを用いて、ｄｓＤＮＡアンプリコンを架橋核酸とした場合の接合活性の低さは、反応速度に起因すると考え、ｓｓＤＮＡオリゴを架橋核酸として用いた場合の反応速度を評価した。実施例１、３の試験条件のうち、リガーゼ反応時間を５，１０，２０，３０，４５，６０分とし、検出鋳型ＤＮＡオリゴ及び架橋ｓｓＤＮＡオリゴにＢＲＡＦ　Ｅ１を用いた。Ｔｔｈ　ＬｉｇＡが反応時間１０分で接合反応がほぼプラトーに達していたのに対して、Ｔｓｐ　ＬｉｇＡはプラトーに達するまで約４５分を要した。予想した通り、反応速度の低さが架橋核酸をｄｓＤＮＡにした場合の反応率の低さの原因であると考えた。

＜実施例６＞
　Ｔｓｐ　ＬｉｇＡの高い正確性と、Ｔｔｈ　ＬｉｇＡの高速な反応性の特性を併せ持つ酵素を作製するため、Ｔｔｈ　ＬｉｇＡにおけるドメイン１～４を、それぞれＴｓｐ　ＬｉｇＡの対応するドメインで置換したＴｔｈ／ＴｓｐキメラＬｉｇＡを合成し、実施例１の試験条件のうち、検出鋳型ＤＮＡオリゴにＢＲＡＦ　Ｅ１を用いて、完全相補的な架橋核酸としてＢＲＡＦ　Ｅ１　ｓｓＤＮＡオリゴを、ミスマッチ架橋核酸としてＢＲＡＦ　Ｇ　ｓｓＤＮＡオリゴを用いた。図８に示した通り、完全相補鎖となる架橋核酸を用いた条件（Ｐｅｒｆｅｃｔ　Ｍａｔｃｈ）において、いずれのキメラＬｉｇＡもＴｓｐ　ＬｉｇＡの反応効率を上回り、ミスマッチ架橋核酸を用いた条件（Ｍｉｓ－ｍａｔｃｈ）において、Ｔｓｐ　ＬｉｇＡのドメイン１とドメイン２を組み込んだキメラＬｉｇＡ（ｃｈｉｍｅｒａ１，　ｃｈｉｍｅｒａ２）についてはＴｔｈ　ＬｉｇＡよりも正確性が向上した。

＜実施例７＞
　実施例６でＴｓｐ　ＬｉｇＡよりも反応性が向上し、Ｔｔｈ　ＬｉｇＡよりも正確性が向上したＴｔｈ／Ｔｓｐ　ドメイン１　キメラＬｉｇＡ（図９、Ｃｈｉｍｅｒａ１）及びＴｔｈ／Ｔｓｐ　ドメイン２　キメラＬｉｇＡ（図９、Ｃｈｉｍｅｒａ２）に関して、実施例５と同様に反応速度を評価した。検討の結果、両キメラＬｉｇＡともＴｓｐ　ＬｉｇＡは元より、Ｔｔｈ　ＬｉｇＡよりも、接合産物量が増大し、反応速度もＴｓｐ　ＬｉｇＡに比して大幅に向上した。その効果は、Ｔｔｈ　ＬｉｇＡのドメイン２をＴｓｐ　ＬｉｇＡのドメイン２で組み替えたＴｔｈ／Ｔｓｐ　ドメイン２　キメラＬｉｇＡでより顕著であった。

＜実施例８＞
　実施例６，７において、Ｔｓｐ　ＬｉｇＡの正確性とＴｔｈ　ＬｉｇＡの反応性を持ち合わせたＴｔｈ／Ｔｓｐ　ドメイン２　キメラＬｉｇＡについて、架橋核酸としてｄｓＤＮＡアンプリコンを用いた場合の反応性及び正確性を評価した。検出鋳型ＤＮＡオリゴにＢＲＡＦ　Ｅ１を用いて、完全相補的な架橋核酸としてＢＲＡＦ　Ｅ１　ｄｓＤＮＡアンプリコンを、ミスマッチ架橋核酸としてＢＲＡＦ　Ｇ　ｄｓＤＮＡアンプリコンあるいはＢＲＡＦ　Ｋ　ｄｓＤＮＡアンプリコンを用いた。図１０に示した通り、Ｔｔｈ　ＬｉｇＡを用いた場合の相対接合率を１００％とした場合の、上記で算出したＣｔ値を用いたＴｔｈ／Ｔｓｐ　ドメイン２　キメラＬｉｇＡ（図９、Ｃｈｉｍｅｒａ２）の相対接合効率は、Ｔｓｐ　ＬｉｇＡ使用時に半分まで低下していたところ、約８０％まで回復した。一方、ＢＲＡＦ　Ｇ　ｄｓＤＮＡアンプリコンを架橋核酸に用いた場合に、Ｔｔｈ　ＬｉｇＡでは約２０％のミス接合が起こっていたものが、キメラＬｉｇＡではＴｓｐ　ＬｉｇＡと同等の正確性が付与されていた。

＜実施例９＞
　Ｔｓｐ　ＬｉｇＡのドメイン２を組み込んだキメラＬｉｇＡは高正確性が付与される効果が普遍的にあることを確認するため、Ｔｂｒ　ＬｉｇＡ、Ｔｆｉ　ＬｉｇＡ、Ｔｏｓ　ＬｉｇＡのドメイン２をＴｓｐ　ＬｉｇＡのドメイン２で組み替えたキメラＬｉｇＡをそれぞれ作製し、正確性改善効果を評価した。
　リガーゼ反応時の検出鋳型ＤＮＡオリゴには配列番号４０、４３、４６、４９、１４、５２のいずれかを用い、各検出鋳型ＤＮＡオリゴに完全相補的な架橋ｓｓＤＮＡオリゴには配列番号４１、４４、４７、５０、２１、５３のいずれかを、ミスマッチ架橋ｓｓＤＮＡオリゴには配列番号４２、４５、４８、５１、２８、２４のいずれかを用いた。

　また、定量リアルタイムＰＣＲ反応時には、配列番号５４から配列番号６２のうち、解析する遺伝子バリアント種にマッチした３種類のプライマー・プローブセットを使用した。

　表７に示す通り、１６通りの検出鋳型ＤＮＡオリゴとミスマッチ架橋ｓｓＤＮＡオリゴの使用組合せにおいて、キメラＬｉｇＡを使用することで、１４個で正確性改善効果が見られた。特に、野生型ＬｉｇＡ使用時の正確性が低かった組合せにおいて、Ｔｓｐ　ＬｉｇＡドメイン２組み替えによる正確性改善効果がより顕著であった。

Claims (14)

1. 　キメラリガーゼであって、好熱菌由来のリガ―ゼにおけるＯＢフォールドドメイン又はアデニル化ドメインが、好熱菌由来の異なる種の対応するドメインで置換されており、置換前のリガーゼとの比較でミスマッチ塩基対に対する識別能が向上している、キメラリガーゼ。
2. 　好熱菌由来の異なる種の対応するドメインが、サーマス・スピーシーズ（Ｔｈｅｒｍｕｓ　Ｓｐｅｃｉｅｓ）に由来する、請求項１に記載のキメラリガーゼ。
3. 　キメラリガーゼであって、好熱菌由来のリガ―ゼにおけるＯＢフォールドドメイン又はアデニル化ドメインが、
   １）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるリガーゼ；
   ２）配列番号１に示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるリガーゼ；
   ３）配列番号１に示されるアミノ酸配列の１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるリガーゼ；並びに
   ４）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるリガーゼ
   からなる群から選択される、好熱菌由来の異なる種のリガーゼの対応するドメインで置換されている、キメラリガーゼ。
4. 　ＯＢフォールドドメインに対応するドメインが、配列番号１の３２０番目～４０６番目のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のキメラリガーゼ。
5. 　アデニル化ドメインに対応するドメインが、配列番号１の７３番目～３１９番目のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のキメラリガーゼ。
6. 　置換前のリガーゼとの比較で、リガーゼによる接合部の両側３塩基以内にミスマッチ塩基対が存在する場合の接合率が低くなっている、請求項１～５のいずれか１項に記載のキメラリガーゼ。
7. 　置換前の好熱菌由来のリガーゼが、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・ブロキアヌス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ）、サーマス・フィリフォルミス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、又はサーマス・オシマイ（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｏｓｈｉｍａｉ）由来のリガーゼである、請求項１～５のいずれか１項に記載のキメラリガーゼ。
8. 　置換前の好熱菌由来のリガーゼが、
   １）配列番号２～５のうちいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるリガーゼ；
   ２）配列番号２～５のうちいずれか１つに示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるリガーゼ；
   ３）配列番号２～５のうちいずれか１つに示されるアミノ酸配列の１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるリガーゼ；並びに
   ４）配列番号２～５のうちいずれか１つに示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるリガーゼ
   からなる群から選択されるリガーゼである、請求項１～５のいずれか１項に記載のキメラリガーゼ。
9. 　変異した標的配列を検出するためのキットであって、請求項１～５のいずれか１項に記載のキメラリガーゼを含む、キット。
10. 　リガーゼ検出反応（ＬＤＲ）又はリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）に使用される試薬を更に含む、請求項９に記載のキット。
11. 　試料において変異した標的配列を検出する方法であって、
    前記試料と請求項１～５のいずれか１項に記載のキメラリガーゼとを接触させる工程と
    リガーゼ反応を解析する工程と、
    を含む、方法。
12. 　変異が一塩基多型である、請求項１１に記載の方法。
13. 　リガーゼ反応を解析する工程が、リガーゼ検出反応（ＬＤＲ）又はリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を含む、請求項１１に記載の方法。
14. 　試料における変異した標的配列の有無が、ＬＤＲ又はＬＣＲの反応産物の有無に基づいて決定される、請求項１３に記載の方法。