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WO2026003367A1 - Vorrichtung und verfahren zum trennen unterschiedlicher zelltypen - Google Patents

Vorrichtung und verfahren zum trennen unterschiedlicher zelltypen

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Publication number
WO2026003367A1
WO2026003367A1 PCT/EP2025/068460 EP2025068460W WO2026003367A1 WO 2026003367 A1 WO2026003367 A1 WO 2026003367A1 EP 2025068460 W EP2025068460 W EP 2025068460W WO 2026003367 A1 WO2026003367 A1 WO 2026003367A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
chamber
cell type
cells
affinity reagent
cell types
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/EP2025/068460
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Minxing Liu
Sebastian PILSL
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Robert Bosch GmbH
Original Assignee
Robert Bosch GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Robert Bosch GmbH filed Critical Robert Bosch GmbH
Publication of WO2026003367A1 publication Critical patent/WO2026003367A1/de
Pending legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502761—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip specially adapted for handling suspended solids or molecules independently from the bulk fluid flow, e.g. for trapping or sorting beads, for physically stretching molecules
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C—MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C1/00—Magnetic separation
    • B03C1/02—Magnetic separation acting directly on the substance being separated
    • B03C1/025—High gradient magnetic separators
    • B03C1/031—Component parts; Auxiliary operations
    • B03C1/033—Component parts; Auxiliary operations characterised by the magnetic circuit
    • B03C1/0332—Component parts; Auxiliary operations characterised by the magnetic circuit using permanent magnets
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/04—Cell isolation or sorting
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/043—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces magnetic forces

Definitions

  • the present invention relates to a device for separating different cell types. Furthermore, the present invention relates to a method for separating different cell types using the device.
  • CTCs circulating tumor cells
  • WO 2019/005967 A1 describes a method in which CTCs from a blood sample are bound in a sponge made of carbon nanotubes. By rotating the sponge, unbound CTCs are released into a culture medium.
  • a device for separating different cell types comprising a rotatable chamber. At least one first affinity reagent for at least one first cell type is arranged on a first side of the chamber. At least one second affinity reagent for at least one second cell type is arranged on a second side of the chamber opposite the first side.
  • the first cell type can, in particular, be a CTC cell type, and the second cell type can, in particular, be a background cell type.
  • This device enables the enrichment of CTCs on the affinity reagent of the first side and the binding of background cells to the affinity reagent of the second side, thus depleting the background cells in the chamber.
  • the chamber's rotatability offers the advantage that a cell suspension containing different cell types, introduced into the chamber, can be alternately exposed to the first and second affinity reagents. This utilizes the fact that cells in the chamber sediment at its bottom due to gravity. By rotating the chamber, either the first or the second affinity reagent can be selectively positioned at the bottom.
  • Such a device can be designed as a microfluidic apparatus. It can be used for separating both living and fixed cells.
  • the affinity reagents are arranged in cavities on the first and second sides of the chamber, respectively, so that minimal cell loss is expected.
  • the affinity reagents are primarily antibodies.
  • the first affinity reagent is preferably bound to first magnetic beads and The first side has at least one first magnet configured to hold the first magnetic beads.
  • the second affinity reagent is preferably bound to second magnetic beads.
  • the second side has at least one second magnet configured to hold the second magnetic beads.
  • the first and second magnets are electromagnets, which allows for easy release of a cell type by switching off the respective electromagnet, thereby releasing the respective magnetic beads, along with the bound affinity reagents and cells, from their respective sides of the chamber.
  • the magnets are permanent magnets that can be mechanically removed from their respective sides of the chamber to allow the beads to be released.
  • the chamber has an inlet on a third side and an outlet on a fourth side.
  • the third and fourth sides are, in particular, orthogonal to the first and second sides.
  • the chamber is rotatable about an axis that passes through the third and fourth sides.
  • the inlet allows a cell suspension to be introduced into the chamber in order to separate different cell types contained therein.
  • the outlet allows cells that have not been bound to any of the affinity reagents to be flushed out of the chamber.
  • the device has a filter arranged between the first and second sides.
  • the pore diameter of the filter is preferably selected such that blood cells can pass through it, while one of the cell types to be separated, in particular CTCs, is retained. If bead-coupled affinity reagents are used in the chamber that are not held in place by a magnet on one side, the filter can also be used to prevent unwanted mixing of the different beads. For this purpose, the pore diameter of the filter is smaller than the diameter of the beads. In addition to separation by means of the Using the filter, affinity reagents achieve separation based on cell size.
  • the device has an inlet on a third side, a first outlet on a fourth side between the first side and the filter, and a second outlet on the fourth side between the second side and the filter. If different cell types are separated based on cell size, the separated cells can then be selectively removed from the chamber via the two outlets. If bead-coupled affinity reagents are used in the chamber that are not held in place on one of the sides by a magnet, it is further preferred that the inlet and each of the outlets have an additional filter whose pore diameter is smaller than the diameter of the beads, in order to hold them inside the chamber.
  • the chamber has two separable parts.
  • the first part contains the first side
  • the second part contains the second side. This makes it possible, after the separation of the cell types is complete, to separate the two parts of the chamber in order to examine the contents of one of the parts microscopically.
  • a method for separating different cell types using the device comprises introducing a suspension containing at least one first cell type and at least one second cell type into the chamber.
  • This suspension is, in particular, a blood sample.
  • the blood sample first undergo selective erythrocyte lysis, be centrifuged, and then resuspended in a physiological buffer before being introduced into the chamber.
  • the chamber is rotated so that at least once the first side and at least once the second side is at the bottom. This brings cells that have settled at the bottom of the chamber into contact with the respective affinity reagent located at the bottom.
  • the chamber is rotated multiple times so that the cells are brought into contact with each of the affinity reagents several times, thus achieving the most complete possible binding of the first cell type to the first affinity reagent and of the second cell type to the second affinity reagent.
  • the term "below” means that the first side is positioned along a vertical axis below the second side, and vice versa.
  • selective separation of the first affinity reagent from the first side and/or selective separation of the second affinity reagent from the second side can be performed to release the first cell type and/or the second cell type into the interior of the chamber. If the affinity reagents are magnetically held to their respective sides, this can be achieved by removing the magnetic field. If this is not possible, affinity reagents can be detached from their respective sides, for example, using UV light, especially if they are bound to the respective side via an ortho-nitrobenzyl bridge. Separation of affinity reagents from their respective sides could also be achieved by introducing at least one protease into the chamber, which digests affinity reagents in the form of antibodies at surface receptors.
  • a further analytical step involves separating the chamber into two parts, with the first part containing the first side and the second part containing the second side. This allows the cells fixed to the first side to be examined microscopically or using surface resonance plasmonography after separation.
  • the first side is typically made of gold or silicon.
  • Figure 2 schematically shows the sequence of an embodiment of the method according to the invention using the device according to the first embodiment of the invention.
  • Separating 57 of the second part 12 from the first part 11 of the chamber makes it possible to examine the cells of the first cell type 41 in the first part 11 of the chamber 10 microscopically.
  • the chamber 10 differs from the first embodiment in that a filter 60 divides the chamber 10 into two separate areas parallel to the first side 21 and the second side 22.
  • the chamber 10 in this embodiment has two outlets 27, 28.
  • the first outlet 27 is located in the fourth side 24 between the first side 21 and the filter 60
  • the second outlet 28 is located in the fourth side 24 between the second side 22 and the filter 60.
  • Figure 4 shows the sequence of the method according to the invention using the device according to the second embodiment of the invention.
  • the same process steps 51 to 57 are carried out as are used when using the device according to the first embodiment of the invention.
  • the pore diameter of the filter 60 is selected such that the cells of the third cell type 43 are retained by it, while the cells of the fourth cell type 44 can pass through it.
  • the cells of the third cell type 43 are retained by the filter 60.
  • the chamber 10 is rotated again 54, the cells of the fourth cell type 44 pass through the filter 60 again.
  • the cells of the first cell type 41 are flushed out of the chamber 10 through the first outlet 27. If a fluid exchange 56 takes place, the cells of the third cell type 43 are flushed out of the chamber 10 exclusively through the first outlet 27, while the cells of the fourth cell type 44 can also leave the chamber 10 via the second outlet 28.
  • the filter 60 is a component of the second part 12 of chamber 10. When separating 57 of the parts 11 , 12 of chamber 10, it is therefore removed together with the second side 22 from the first part 11, so that it does not hinder a microscopic examination of the cells of the first cell type 41.

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum Trennen unterschiedlicher Zelltypen, aufweisend eine drehbare Kammer (10) mit einer ersten Seite (21), welche mindestens ein erstes Affinitätsreagenz (31) für mindestens einen ersten Zelltyp aufweist, und einer der ersten Seite (21) gegenüberliegenden zweiten Seite (22), welche mindestens ein zweites Affinitätsreagenz (32) für mindestens einen zweiten Zelltyp aufweist. In einem Verfahren zum Trennen unterschiedlicher Zelltypen mittels der Vorrichtung erfolgt ein Einbringen einer Suspension, welche mindestens einen ersten Zelltyp und mindestens einen zweiten Zelltyp aufweist, in die Kammer (10), und ein Drehen der Kammer, so dass mindestens einmal die erste Seite (21) und mindestens einmal die zweite Seite (22) unten angeordnet ist.

Description

Beschreibung
Titel
Vorrichtung und Verfahren zum Trennen unterschiedlicher Zelltypen
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum Trennen unterschiedlicher Zelltypen. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Trennen unterschiedlicher Zelltypen unter Verwendung der Vorrichtung.
Stand der Technik
In der Krebsdiagnostik ist die Quantifizierung von zirkulierenden Tumorzellen (circulating tumor cells; CTCs) ein vielversprechender Prädiktor für das Ansprechen einer Therapie oder für den Krankheitsverlauf. Dabei handelt es sich um Tumorzellen, welche sich vom Primärtumor abgelöst haben und im Blut zirkulieren. Diese Zellen können dann an einer anderen Stelle wieder aus dem Blut ins Gewebe eindringen und dort unter Umständen Metastasen ausbilden.
Zur Quantifizierung von CTCs wird einem Patienten Blut entnommen und auf die Anwesenheit von CTCs hin untersucht. Diese Untersuchung wird allerdings durch eine Vielzahl von für die Analyse unerwünschten Zellen erschwert, die im Blut enthalten sind und als Hintergrundzellen bezeichnet werden.
Die WO 2019/005967 A1 beschreibt ein Verfahren, in dem CTCs aus einer Blutprobe in einem Schwamm aus Kohlenstoff-Nanoröhren gebunden werden. Durch Drehen des Schwammes werden ungebundene CTCs in ein Kulturmedium freigesetzt.
Offenbarung der Erfindung In einem ersten Aspekt ist eine Vorrichtung zum Trennen unterschiedlicher Zelltypen vorgesehen, die eine drehbare Kammer aufweist. Auf einer ersten Seite der Kammer ist mindestens ein erstes Affinitätsreagenz für mindestens einen ersten Zelltyp angeordnet. An einer der ersten Seite gegenüberliegenden zweiten Seite der Kammer ist mindestens ein zweites Affinitätsreagenz für mindestens einen zweiten Zelltyp angeordnet. Bei dem ersten Zelltyp kann es sich insbesondere um einen CTC-Zelltyp handeln, und bei dem zweiten Zelltyp kann es sich insbesondere um einen Hintergrundzelltyp handeln.
Diese Vorrichtung ermöglicht eine Anreicherung von CTCs an dem Affinitätsreagenz der ersten Seite und eine Bindung von Hintergrundzellen an dem Affinitätsreagenz der zweiten Seite, so dass die Hintergrundzellen in der Kammer abgereichert werden. Die Drehbarkeit der Kammer hat den Vorteil, dass eine in die Kammer eingeleitete Zellsuspension, welche unterschiedliche Zelltypen enthält, abwechselnd mit dem ersten Affinitätsreagenz und dem zweiten Affinitätsreagenz in Kontakt gebracht werden kann. Hierbei wird ausgenutzt, dass Zellen in der Kammer schwerkraftgetrieben an ihrer Unterseite sedimentieren. Durch Drehen der Kammer ist wahlweise das erste Affinitätsreagenz oder das zweite Affinitätsreagenz an der Unterseite der Kammer angeordnet.
Eine derartige Vorrichtung kann als mikrofluidische Vorrichtung ausgeführt werden. Dabei kann sie sowohl zum Trennen von lebenden Zellen als auch zum Trennen von fixierten Zellen verwendet werden. Die Affinitätsreagenzien sind insbesondere an der ersten Seite und der zweiten Seite jeweils in Kavitäten in der ersten Seite und in der zweiten Seite der Kammer angeordnet, so dass mit wenig Zellverlust zu rechnen ist.
Bei den Affinitätsreagenzien handelt es sich insbesondere um Antikörper.
Bei der Trennung der Zelltypen kann es vorteilhaft sein, wenn an einem der Affinitätsreagenzien gebundene Zellen zu einem frei wählbaren Zeitpunkt selektiv von der jeweiligen Wand der Kammer freigesetzt werden können. Hierzu ist in einer Ausführungsform der Vorrichtung vorgesehen, dass das erste Affinitätsreagenz vorzugsweise an erste magnetische Beads gebunden ist und die erste Seite mindestens einen ersten Magneten aufweist, der eingerichtet ist, um die ersten magnetischen Beads an der ersten Seite zu halten. Das zweite Affinitätsreagenz ist vorzugsweise an zweite magnetische Beads gebunden. Die zweite Seite weist dabei mindestens einen zweiten Magneten auf, der eingerichtet ist, um die zweiten magnetischen Beads an der zweiten Seite zu halten. Vorzugsweise sind der erste Magnet und der zweite Magnet jeweils Elektromagneten, was ein einfaches Freisetzen eines Zelltyps ermöglicht, indem durch Abschalten des jeweiligen Elektromagneten die jeweiligen magnetischen Beads zusammen mit den daran gebundenen Affinitätsreagenzien und den daran gebundenen Zellen von der jeweiligen Seite der Kammer gelöst werden. Grundsätzlich ist es aber auch denkbar, dass die Magneten als Permanentmagneten ausgeführt sind, die mechanisch von ihrer jeweiligen Seite der Kammer entfernt werden können, um so ein Freisetzen der Beads zu ermöglichen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Vorrichtung weist die Kammer einen Einlass in einer dritten Seite und einen Auslass in einer vierten Seite auf. Die dritte Seite und die vierte Seite verlaufen insbesondere orthogonal zur ersten Seite und zur zweiten Seite. Die Kammer ist insbesondere um eine Achse drehbar, welche durch die dritte Seite und durch die vierte Seite verläuft. Der Einlass ermöglicht es, eine Zellsuspension in die Kammer einzuleiten, um darin enthaltene unterschiedliche Zelltypen zu trennen. Der Auslass ermöglicht es, Zellen, die an keines der Affinitätsreagenzien gebunden wurden, aus der Kammer herauszuspülen.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Vorrichtung weist diese einen Filter auf, der zwischen der ersten Seite und der zweiten Seite angeordnet ist. Ein Porendurchmesser des Filters ist vorzugsweise so gewählt, dass Blutzellen diesen passieren können, während einer der zu trennenden Zelltypen, insbesondere CTCs, zurückgehalten wird. Wenn in der Kammer Bead- gekoppelte Affinitätsreagenzien verwendet werden, welche nicht durch einen Magneten an einer der Seiten festgehalten werden, so kann der Filter außerdem verwendet werden, um ein ungewolltes Vermischen der verschiedenen Beads zu verhindern. Hierzu ist der Porendurchmesser des Filters kleiner als ein Durchmesser der Beads. Zusätzlich zur Auftrennung mittels der Affinitätsreagenzien wird unter Verwendung des Filters eine Auftrennung über die Zellgröße erreicht, da nun größere Zellen, wie beispielsweise noch nicht an Affinitätsreagenzien gebundene CTCs, vom Filter zurückgehalten werden, während kleinere Zellen, wie beispielsweise Leukozyten, den Filter passieren können, um wiederholt in räumliche Nähe zu den zu ihnen korrespondierenden Affinitätsreagenzien zu gelangen und eine Bindung einzugehen. Die Drehbarkeit der Kammer verhindert ein Verstopfen des Filters.
In dieser Ausführungsform der Vorrichtung weist diese einen Einlass in einer dritten Seite auf, einen ersten Auslass in einer vierten Seite zwischen der ersten Seite und dem Filter und einen zweiten Auslass in der vierten Seite zwischen der zweiten Seite und dem Filter. Wenn eine Auftrennung unterschiedlicher Zelltypen über die Zellgröße erfolgt, können die getrennten Zellen anschließend selektiv über die beiden Auslässe aus der Kammer entfernt werden. Sollten in der Kammer Bead-gekoppelte Affinitätsreagenzien verwendet werden, die nicht an einer der Seiten mittels eines Magneten festgehalten werden, so ist es weiterhin bevorzugt, dass der Einlass und jeder der Auslässe einen weiteren Filter aufweist, dessen Porendurchmesser kleiner ist als ein Durchmesser der Beads, um diese so im Inneren der Kammer festzuhalten.
Es ist weiterhin bevorzugt, dass die Kammer zwei voneinander trennbare Teile aufweist. Das erste Teil enthält die erste Seite, und das zweite Teil enthält die zweite Seite. Dies ermöglicht es, nach Abschluss der Trennung der Zelltypen die beiden Teile der Kammer voneinander zu trennen, um so den Inhalt eines der Teile mikroskopisch zu untersuchen.
In einem anderen Aspekt ist ein Verfahren zum Trennen unterschiedlicher Zelltypen mittels der Vorrichtung vorgesehen. Das Verfahren umfasst ein Einbringen einer Suspension, welche mindestens einen ersten Zelltyp und mindestens einen zweiten Zelltyp aufweist, in die Kammer. Bei dieser Suspension handelt es sich insbesondere um eine Blutprobe. Um vor Einbringen der Suspension bereits Erythrozyten aus dem Hintergrund zu entfernen, ist es bevorzugt, dass die Blutprobe zunächst einer selektiven Erythrozytenlyse unterzogen wird, zentrifugiert wird und anschließend in einem physiologischen Puffer resuspendiert wird, bevor sie in die Kammer eingebracht wird. Nach dem Einbringen erfolgt ein Drehen der Kammer, so dass mindestens einmal die erste Seite und mindestens einmal die zweite Seite unten angeordnet ist Dadurch gelangen am Boden der Kammer sedimentierte Zellen in Kontakt mit dem jeweils unten angeordneten Affinitätsreagenz. Grundsätzlich kann dies dadurch erreicht werden, dass beim Einbringen der Suspension die erste oder die zweite Seite unten angeordnet ist und die Kammer anschließend einmalig gedreht wird, um die Position der ersten Seite mit der Position der zweiten Seite zu vertauschen. Vorzugsweise erfolgt jedoch ein mehrfaches Drehen der Kammer, so dass die Zellen mehrfach mit jedem der Affinitätsreagenzien in Kontakt gebracht werden, um so ein möglichst vollständiges Binden des ersten Zelltyps an das erste Affinitätsreagenz und des zweiten Zelltyps an das zweite Affinitätsreagenz zu erreichen.
Hierbei ist mit dem Begriff „unten“ gemeint, dass die erste Seite entlang einer Vertikalachse unterhalb der zweiten Seite angeordnet ist und umgekehrt.
Nachdem das Drehen abgeschlossen ist und die Zellen des ersten Zelltyps und des zweiten Zelltyps an dem ersten Affinitätsreagenz bzw. dem zweiten Affinitätsreagenz gebunden sind, können mehrere weitere Verfahrensschritte durchgeführt werden, um eine Analyse der Zelltypen vorzunehmen. Diese Verfahrensschritte können einzeln oder in Kombination vorgesehen sein.
In einem Analyseschritt kann ein selektives Trennen des ersten Affinitätsreagenz von der ersten Seite und/oder ein selektives Trennen des zweiten Affinitätsreagenz von der zweiten Seite erfolgen, um den ersten Zelltyp und/oder den zweiten Zelltyp in den Innenraum der Kammer freizusetzen. Wenn die Affinitätsreagenzien magnetisch an ihrer jeweiligen Seite festgehalten werden, so kann dies durch Wegnahme des Magnetfeldes realisiert werden. Wenn diese Möglichkeit nicht besteht, können Affinitätsreagenzien beispielsweise mittels UV- Licht von ihrer jeweiligen Seite abgelöst werden, insbesondere wenn diese über eine ortho-Nitrobenzyl-Brücke an der jeweiligen Seite angebunden sind. Ein Trennen von Affinitätsreagenzien von der jeweiligen Seite könnte weiterhin durch ein Einleiten mindestens einer Protease in die Kammer erfolgen, welche Affinitätsreagenzien in Form von Antikörpern an Oberflächenrezeptoren verdaut. Wenn die Affinitätsreagenzien an einzelsträngige Nukleinsäuren gekoppelt sind und die jeweilige Seite der Kammer, an welche sie gebunden sind, eine entsprechende revers komplementäre Nukleinsäure aufweist, sind diese über Hybridisierung an die jeweilige Seite angebunden. Diese Wechselwirkung kann durch Erhitzen oder durch Zugabe einer Nuklease wieder aufgehoben werden. Es ist insbesondere bevorzugt, dass das erste Affinitätsreagenz über einen anderen Bindungsmechanismus an die erste Seite angebunden ist als das zweite Affinitätsreagenz an die zweite Seite. Dadurch ist es möglich, selektiv nur eines der Affinitätsreagenzien von seiner Seite der Kammer zu trennen.
Ein anderer Analyseschritt besteht darin, dass ein Fluidaustausch in der Kammer erfolgt, indem eine Flüssigkeit durch den Einlass in die Kammer eingeleitet wird und Zellen, die weder an das erste Affinitätsreagenz noch an das zweite Affinitätsreagenz gebunden sind, aus der Kammer ausschwemmt. Dies ist insbesondere vorteilhaft, bevor eine selektive Lyse eines Zelltyps oder ein selektives Trennen eines Affinitätsreagenz von seiner Kammerseite erfolgt, um so störende Hintergrundzellen vorab aus der Kammer zu entfernen.
Wenn die erste Seite aus Gold besteht, können die Zellen des daran gebundenen Zelltyps mittels Oberflächenresonanzplasmonographie (surface plasmon resonance spectroscopy; SPR) untersucht werden. Besteht die erste Seite aus Glas, so können die Zellen des ersten Zelltyps mit Hilfe von Durchlichtmikroskopie und/oder Fluoreszenzmikroskopie untersucht werden. Dem kann ein Einleiten des Farbstoffs durch den Einlass in die Kammer vorangehen, um die Zellen anzufärben.
Ein weiterer Analysenschritt sieht vor, dass die Kammer in zwei Teile getrennt wird, wobei das erste Teil die erste Seite enthält und das zweite Teil die zweite Seite enthält. Dies ermöglicht es, nach dem Trennen die an der ersten Seite fixierten Zellen mikroskopisch oder mithilfe von Oberflächenresonanzplasmonographie zu untersuchen. Hierzu besteht die erste Seite insbesondere aus Gold oder aus Silizium.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Zeichnungen dargestellt und werden in der nachfolgenden Beschreibung näher erläutert.
Figur 1 zeigt eine schematische Querschnittsdarstellung eines ersten Ausführungsbeispiels der erfindungsgemäßen Vorrichtung.
Figur 2 zeigt schematisch den Ablauf eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung der Vorrichtung gemäß dem ersten Ausführungsbeispiel der Erfindung.
Figur 3 zeigt eine schematische Querschnittsdarstellung einer Vorrichtung gemäß einem zweiten Ausführungsbeispiel der Erfindung.
Figur 4 zeigt schematisch den Ablauf eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung des zweiten Ausführungsbeispiels der erfindungsgemäßen Vorrichtung.
Ausführungsbeispiele der Erfindung
In einem ersten Ausführungsbeispiel der Erfindung ist diese als mikrofluidische Vorrichtung ausgeführt, welche eine Kammer 10 aufweist. Dies ist in Figur 1 dargestellt. Die Kammer 10 besteht aus zwei voneinander trennbaren Teilen 11 , 12. Sie weist eine erste Seite 21 auf, die beispielsweise aus Gold besteht. Eine zweite Seite 22 liegt der ersten Seite 21 gegenüber. Eine dritte Seite 23 verbindet die erste Seite 21 mit der zweiten Seite 22. Eine vierte Seite 24 liegt der dritten Seite 23 gegenüber. In der dritten Seite 23 ist ein Einlass 25 angeordnet. In der vierten Seite 24 ist ein Auslass 26 angeordnet. Die erste Seite 21 ist ein Bestandteil des ersten Teils 11 , und die zweite Seite 22 ist ein Bestandteil des zweiten Teils 12. Die Kammer 10 ist in der mikrofluidischen Vorrichtung um eine Achse drehbar gelagert, welche durch die dritte Seite 23 und die vierte Seite 24 verläuft und die parallel zur ersten Seite 21 und zur zweiten Seite 22 verläuft. Die erste Seite 21 weist an ihrer Innenseite ein erstes Affinitätsreagenz 31 in Form von Antikörpern auf. Diese weisen beispielsweise eine Affinität zum epithelialen Zelladhäsionsmolekül (epithelial cell adhesion molecule; EpCAM) auf und sind damit in der Lage, CTCs zu binden. Die zweite Seite 22 weist ein zweites Affinitätsreagenz 32 in Form von Antikörpern auf, welche eine Affinität für den Rezeptortyp Tyrosin-Proteinphosphatase C (CD45) aufweisen. Damit sind sie in der Lage, Leukozyten zu binden.
In einem Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens wird einem Patienten eine Blutprobe von beispielsweise 7,5 ml entnommen. Diese wird mittels des Ammoniumchlorid-Verfahrens einer selektiven Erythrozytenlyse unterzogen, zentrifugiert und in einer phosphatgepufferten Salzlösung (phospate- buffered saline; PBS) resuspendiert. Wie in Figur 2 dargestellt ist, wird die so erhaltene Zellsuspension durch den Einlass 25 in die Kammer 10 eingebracht, 51. Dabei ist die Kammer 10 so angeordnet, dass sich ihre erste Seite 21 unten befindet. Die Zellsuspension enthält als ersten Zelltyp 41 EpCAM-positive CTCs. Als zweiten Zelltyp 42 enthält sie Leukozyten, bei denen es sich um CD45- positive Zellen handelt. Als dritten Zelltyp 43 enthält sie EpCAM-negative CTCs. Als vierten Zelltyp 44 enthält sie CD45-negative Zellen. Nach kurzer Inkubation 52 haben die Zellen des ersten Zelltyps 41 an das erste Affinitätsreagenz 31 an der ersten Seite 21 gebunden. Nun erfolgt ein Drehen 53 der Kammer 10 um 180°. Die zunächst an der ersten Seite 21 sedimentierten Zellen der Zelltypen 42 bis 44, die nicht am ersten Affinitätsreagenz 31 gebunden sind, gelangen nun an die jetzt unten liegende zweite Seite 22. Dort binden die Zellen des zweiten Zelltyps 42 an das zweite Affinitätsreagenz 32. Anschließend erfolgt ein erneutes Drehen 54 der Kammer 10 um 180°, so dass die Zellen des dritten und vierten Zelltyps 43 bis 44 wieder an die erste Seite 21 gelangen.
Zur Vorbereitung einer Analyse der CTCs des ersten Zelltyps 41 können nun wahlweise unterschiedliche Verfahrensschritte 55 bis 57 durchgeführt werden. Durch ein selektives Trennen 55 des ersten Affinitätsreagenz 31 von der ersten Seite 21 können die Zellen des ersten Zelltyps 41 von der ersten Seite 21 gelöst werden, um sie anschließend aus dem Auslass 26 aus der Kammer 10 herauszuspülen und außerhalb der Kammer 10 zu analysieren.
Durch einen Fluidaustausch 56 werden die Zellen des dritten und vierten Zelltyps 43 bis 44 bei einer hohen Strömungsgeschwindigkeit eines in die Kammer 10 eingeleiteten Fluids aus dem Auslass 26 herausgespült, während die Zellen des ersten Zelltyps 41 und des zweiten Zelltyps 42 über ihre jeweiligen Affinitätsreagenzien 31 , 32 an der ersten Seite 21 und der zweiten Seite 22 festgehalten werden.
Ein Trennen 57 des zweiten Teils 12 vom ersten Teil 11 der Kammer ermöglicht es, die Zellen des ersten Zelltyps 41 im ersten Teil 11 der Kammer 10 mikroskopisch zu untersuchen.
In einem zweiten Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung unterscheidet sich die Kammer 10 vom ersten Ausführungsbeispiel dadurch, dass parallel zur ersten Seite 21 und zur zweiten Seite 22 ein Filter 60 die Kammer 10 in zwei separate Bereiche unterteilt. Anstatt eines einzelnen Auslasses 26 weist die Kammer 10 in diesem Ausführungsbeispiel zwei Auslässe 27, 28 auf. Der erste Auslass 27 befindet sich in der vierten Seite 24 zwischen der ersten Seite 21 und dem Filter 60, und der zweite Auslass 28 befindet sich in der vierten Seite 24 zwischen der zweiten Seite 22 und dem Filter 60.
Figur 4 zeigt den Ablauf des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung der Vorrichtung gemäß dem zweiten Ausführungsbeispiel der Erfindung. Es werden dieselben Verfahrensschritte 51 bis 57 durchgeführt, die auch bei Verwendung der Vorrichtung gemäß dem ersten Ausführungsbeispiel der Erfindung angewandt werden. Der Porendurchmesser des Filters 60 ist so gewählt, dass die Zellen des dritten Zelltyps 43 von ihm zurückgehalten werden, während die Zellen des vierten Zelltyps 44 ihn passieren können. Nach dem ersten Drehen 53 der Kammer 10 gelangen also nur die Zellen des zweiten Zelltyps 42 und des vierten Zelltyps 44 an die zweite Seite 22 der Kammer 10. Die Zellen des dritten Zelltyps 43 werden hingegen vom Filter 60 zurückgehalten. Beim erneuten Drehen 54 der Kammer 10 passieren die Zellen des vierten Zelltyps 44 den Filter 60 erneut. Wird ein selektives Trennen 55 des ersten Affinitätsreagenz 31 von der ersten Seite 21 durchgeführt, so werden die Zellen des ersten Zelltyps 41 durch den ersten Auslass 27 aus der Kammer 10 ausgespült. Wenn ein Fluidaustausch 56 erfolgt, werden die Zellen des dritten Zelltyps 43 ausschließlich durch den ersten Auslass 27 aus der Kammer 10 ausgespült, während die Zellen des vierten Zelltyps 44 auch über den zweiten Auslass 28 die Kammer 10 verlassen können. Der Filter 60 ist ein Bestandteil des zweiten Teils 12 der Kammer 10. Beim Trennen 57 der Teile 11 , 12 der Kammer 10 wird er also gemeinsam mit der zweiten Seite 22 vom ersten Teil 11 entfernt, so dass er eine mikroskopische Untersuchung der Zellen des ersten Zelltyps 41 nicht behindert.

Claims

Ansprüche
1 . Vorrichtung zum Trennen unterschiedlicher Zelltypen (41 -44), aufweisend eine drehbare Kammer (10) mit einer ersten Seite (21), welche mindestens ein erstes Affinitätsreagenz (31) für mindestens einen ersten Zelltyp (41) aufweist, und einer der ersten Seite (21) gegenüberliegenden zweiten Seite (22), welche mindestens ein zweites Affinitätsreagenz (32) für mindestens einen zweiten Zelltyp (42) aufweist.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der erste Zelltyp (41) ein CTC-Zelltyp ist und der zweite Zelltyp (42) ein Hintergrundzelltyp ist.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Affinitätsreagenz (31) an erste magnetische Beads gebunden ist und die erste Seite (21) mindestens einen ersten Magneten aufweist, der eingerichtet ist, um die ersten magnetischen Beads an der ersten Seite (21) zu halten.
4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das zweite Affinitätsreagenz (42) an zweite magnetische Beads gebunden ist und die zweite Seite (22) mindestens einen zweiten Magneten aufweist, der eingerichtet ist, um die zweiten magnetischen Beads an der zweiten Seite (22) zu halten.
5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Kammer (11) einen Einlass (25) in einer dritten Seite (23) und einen Auslass (26) in einer vierten Seite (24) aufweist.
6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass ein Filter (60) zwischen der ersten Seite (21) und der zweiten Seite (22) angeordnet ist, wobei die Kammer (10) einen Einlass (25) in einer dritten Seite (23), einen ersten Auslass (27) in einer vierten Seite (24) zwischen der ersten Seite (21) und dem Filter (60) und einen zweiten Auslass (28) in der vierten Seite (24) zwischen der zweiten Seite (21) und dem Filter (60) aufweist.
7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Kammer (10) zwei voneinander trennbare Teile (11 , 12) aufweist, wobei das erste Teil (11) die erste Seite (21) aufweist und das zweite Teil (12) die zweite Seite (22) aufweist.
8. Verfahren zum Trennen unterschiedlicher Zelltypen (41 -44) mittels einer Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, umfassend die folgenden Schritte:
Einbringen (51) einer Suspension, welche mindestens einen ersten Zelltyp (41) und mindestens einen zweiten Zelltyp (42) aufweist, in die Kammer (10), und Drehen (53, 54) der Kammer (10), so dass mindestens einmal die erste Seite (21) und mindestens einmal die zweite Seite (22) unten angeordnet ist.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass nach dem Drehen (53, 54) ein selektives Trennen (56) des ersten Affinitätsreagenz (31) von der ersten Seite (21) und/oder ein selektives Trennen (56) des zweiten Affinitätsreagenz (32) von der zweiten Seite (22) erfolgt.
10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass nach dem Drehen (53, 54) ein Fluidaustausch (57) in der Kammer (10) erfolgt.
11 . Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Kammer (10) nach dem Drehen (53, 54) in zwei Teile (11 , 12) getrennt wird, wobei das erste Teil (11) die erste Seite (21) aufweist und das zweite Teil (12) die zweite Seite (22) aufweist.
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