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WO2025234359A1 - 細胞外小胞を解析する方法 - Google Patents

細胞外小胞を解析する方法

Info

Publication number
WO2025234359A1
WO2025234359A1 PCT/JP2025/016189 JP2025016189W WO2025234359A1 WO 2025234359 A1 WO2025234359 A1 WO 2025234359A1 JP 2025016189 W JP2025016189 W JP 2025016189W WO 2025234359 A1 WO2025234359 A1 WO 2025234359A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
extracellular vesicles
analyzing
solid phase
analyzing extracellular
phase carrier
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/JP2025/016189
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
卓也 玉谷
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Rnai Inc
Original Assignee
Rnai Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rnai Inc filed Critical Rnai Inc
Publication of WO2025234359A1 publication Critical patent/WO2025234359A1/ja
Pending legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals

Definitions

  • the present invention relates to a method for analyzing extracellular vesicles.
  • Extracellular vesicles are a general term for particles released from cells that are covered by a lipid bilayer and lack a nucleus (they cannot replicate). Recent research has revealed that extracellular vesicles are released by almost all cells, including not only animals such as humans, but also plants, fungi, and bacteria.
  • Extracellular vesicles contain nucleic acids (DNA, mRNA, miRNA), proteins, lipids, various metabolic products, etc.
  • Extracellular vesicles derived from animal cells are classified into exosomes, apoptotic vesicles, and microvesicles based on their production mechanism, and are known to play an important role in intercellular communication. Not only EVs released from tissue cells in various organs in the body, but also EVs derived from intestinal bacteria and food are known to be taken up by the body and delivered to distant organs via the bloodstream, where they function in vivo.
  • EV may be the main active ingredient in functional foods, fermented foods, and probiotic preparations. It has also been revealed that the effects of cells used in treatment, such as mesenchymal stem cells (MSCs), can be replaced by the EVs they produce.
  • MSCs mesenchymal stem cells
  • analyzing EVs requires that they first be isolated, recovered, or concentrated.
  • a typical method for recovering EVs is, for example, ultracentrifugation, which is widely used.
  • ultracentrifugation separates or fractionates substances based on sedimentation velocity, it also contains other particles with similar properties and concentrations (such as endosomes) and high-mass proteins such as IgM, making it difficult to selectively capture and recover only specific EVs.
  • the high pressure applied by ultrahigh-speed centrifugation raises concerns about EV deformation and functional impairment.
  • immunoprecipitation Another method for effectively capturing, quantifying, and characterizing EVs is immunoprecipitation, which uses antibodies (e.g., EV markers such as CD9, CD63, and CD81) that specifically bind to specific proteins (antigens) on the surface of EVs.
  • antibodies e.g., EV markers such as CD9, CD63, and CD81
  • immunoprecipitation is based on an antigen-antibody reaction, it is possible to recover highly purified EVs of interest from a mixture.
  • magnetic beads pre-bound with antibodies are mixed with a sample containing EVs, allowing the EVs to bind to the antibodies and form an EV-antibody-magnetic bead complex.
  • the magnetic beads are then collected using a magnet, and finally, the EVs are eluted and recovered.
  • Non-Patent Document 1 a method that can easily and efficiently analyze EVs.
  • Flow cytometry in particular, is a method that can rapidly obtain information on individual EVs, making it a potentially very effective means of quantifying and characterizing EVs.
  • Cell analysis using flow cytometry can generally be performed without the need for sample purification and/or concentration.
  • previous analysis of EVs using flow cytometry has almost always required purification to remove unbound reagents, such as fluorescent antibodies used to label EVs, and reagents added before staining, such as anticoagulants and additives to the cell culture medium (e.g., phenol red).
  • the inclusion of such purification steps has led to problems in terms of time, effort, and cost, as well as sample loss due to purification.
  • an object of the present invention is to provide a technology for capturing and recovering extracellular vesicles (EVs) in a simple manner and for analyzing the characteristics of the recovered extracellular vesicles (EVs) quickly and with high accuracy.
  • a substrate coated with an ion exchanger can effectively capture extracellular vesicles (EVs), and have discovered that EVs can be analyzed quickly, easily, and with high sensitivity and accuracy by capturing EVs with an ion exchanger coated on the surface of a substrate such as a glass plate, labeling the EVs with a substance such as an antibody that specifically binds to a specific protein or sugar chain on the surface of the EV while the EVs are still adsorbed to the ion exchanger, detaching the labeled EVs from the ion exchanger and recovering them, and detecting the labeled EVs using a method such as flow cytometry, thereby conceiving the present invention.
  • a substance such as an antibody that specifically binds to a specific protein or sugar chain
  • the method for analyzing extracellular vesicles of the present invention includes: a step of adsorbing the extracellular vesicles onto a solid phase carrier comprising a substrate and an ion exchanger and having the ability to adsorb the extracellular vesicles; Labeling the extracellular vesicles adsorbed to the solid phase carrier; The method includes a step of washing the labeled extracellular vesicles while they are still adsorbed to the solid phase carrier, and a step of detecting the labeled extracellular vesicles.
  • a step of detaching the washed extracellular vesicles from the solid phase carrier may be included.
  • the step of labeling the extracellular vesicles is preferably carried out using an extracellular vesicle detection substance.
  • the extracellular vesicle detection substance is preferably at least one selected from the group consisting of antibodies, lectins, membrane-reactive substances, and nucleic acid-reactive substances.
  • the step of detecting the extracellular vesicles is preferably carried out by immunoassay or flow cytometry.
  • the ion exchanger is preferably a weak anion exchanger having secondary and/or tertiary amino groups as partial structures.
  • the ion exchanger is preferably a monovalent residue or a polyvalent residue derived from polyethyleneimine.
  • the polyethyleneimine is preferably a branched high-molecular-weight polyethyleneimine.
  • the ion exchanger and the substrate are covalently bonded, either via a linking moiety or without a linking moiety.
  • the ion exchanger and the substrate are bonded via a connecting portion, and it is preferable that the connecting portion includes a silicon-carbon bond.
  • the substrate is preferably made of glass, plastic, or metal oxide.
  • the substrate is preferably plate-shaped or particulate.
  • the substrate is preferably a glass slide.
  • the kit of the present invention for analyzing extracellular vesicles is characterized by using the method for analyzing extracellular vesicles described above.
  • the kit of the present invention can be used for testing and diagnosis.
  • the method for analyzing extracellular vesicles of the present invention can be used for testing and diagnosis.
  • the method of the present invention uses an ion exchanger to capture extracellular vesicles (EVs) and then labels the EVs with substances such as antibodies while they are still trapped on the ion exchanger.
  • EVs extracellular vesicles
  • This allows for easier and more cost-effective capture of EVs compared to methods that use antibodies (immunoprecipitation), and allows for the recovery of highly purified EVs from which contaminants have been removed without the need for special purification steps.
  • the EVs are labeled while adsorbed to the ion exchanger, the substances used for labeling can be washed away, and the labeled EVs can be recovered from the ion exchanger and directly subjected to the subsequent detection step.
  • the method of the present invention can comprehensively capture EVs that do not have specific antigens, making it possible to recover and analyze such EVs.
  • This graph shows the results of analysis using flow cytometry of EVs derived from human plasma, human urine, lemon, fungi (mushrooms), lactic acid bacteria, and Escherichia coli, which were immobilized on a solid support using the method of the present invention and stained with SYTO RNA, an RNA fluorescent staining reagent.
  • 1 is a graph showing the results of analysis using flow cytometry of human plasma-derived EVs immobilized on a solid support by the method of the present invention, stained with fluorescently labeled antibodies against human CD9, EpCAM, CD63, EGFR, HER2, and GPNMB.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of analysis using flow cytometry of human urinary-derived EVs immobilized on a solid support by the method of the present invention, stained with fluorescently labeled antibodies against human CD9, EpCAM, CD63, EGFR, HER2, and GPNMB.
  • the present invention is a method characterized by efficiently capturing and extracting extracellular vesicles using a solid phase carrier comprising a base material and an ion exchanger.
  • Extracellular Vesicles In this application, the term "extracellular vesicles (EVs)" is used in the sense commonly used in the art, for example, to refer to particles released from cells that are surrounded by a lipid bilayer membrane and lack a nucleus (cannot replicate). Extracellular vesicles derived from animal cells are primarily classified into exosomes, microvesicles, and apoptotic vesicles. Exosomes are vesicles derived from endosomal membranes formed during endocytosis, measuring approximately 50 to 200 nm in size, and are composed primarily of lipids, proteins, and nucleic acids.
  • Microvesicles are vesicles with a wide size distribution ranging from 100 to 1,000 nm. They differ from exosomes in that they bud directly from the cell membrane and are secreted extracellularly, but it is difficult to completely distinguish them from exosomes. Apoptotic vesicles are particles budded from the membrane of cells undergoing apoptosis (cell death), measuring approximately 50 to 5,000 nm in size.
  • Extracellular vesicles have lipids, proteins, carbohydrates, etc. on their surface derived from the cell membrane of the parent cell, and contain nucleic acids such as mRNA and miRNA, as well as proteins, inside, and contain information derived from the cell that released them.
  • the extracellular vesicles targeted by the present invention may be extracellular vesicles derived from any living cell, and include extracellular vesicles derived from animals (including humans), plants, fungi, microorganisms (including bacteria, yeast, etc.), etc.
  • Solid-phase carrier is a composite material comprising a base material and an ion exchanger. By containing the ion exchanger, the solid-phase carrier has the function of adsorbing extracellular vesicles and, if necessary, releasing them.
  • the ion exchanger is fixed to the substrate, for example, by directly or indirectly bonding to a portion or all of the surface of the substrate.
  • the bonding mode between the substrate and the ion exchanger is not particularly limited, and they may be bonded by a covalent bond or by an attractive interaction other than a covalent bond.
  • the ion exchanger can be directly bonded by a modification reaction of the substrate. Alternatively, the ion exchanger can be indirectly bonded to the substrate by a multi-stage modification reaction. A covalent bond is preferred as the bonding mode.
  • the other modified portion between the substrate and the ion exchanger is called a linking part (also called a linker, spacer, etc.), and in this case, the ion exchanger is said to be indirectly bonded to the surface of the substrate via the linking part.
  • a silane coupling agent e.g., 3-hydroxypropyltriethoxysilane, 3-aminopropyltriethoxysilane, etc.
  • the functional group can be covalently linked to the surface of glass (substrate).
  • a glass surface containing diethylaminoethyl can be obtained.
  • the diethylaminoethyl (DEAE) portion is called the ion exchanger, and the portion closer to the glass is called the linking portion.
  • Ion Exchanger Ion exchangers are classified into strong anion exchangers, weak anion exchangers, strong cation exchangers, and weak cation exchangers. As the ion exchangers used in the present invention, strong anion exchangers and weak anion exchangers are preferred, and weak anion exchangers are more preferred.
  • a strong anion exchanger refers to an ion exchanger that retains cationicity even at high pH, and has a partial structure such as quaternary ammonium, N,N-dialkylimidazolium, or N-alkylpyridinium.
  • partial structures such as tetraalkylammonium (e.g., trimethylammonioethyl, trimethylammoniopropyl, triethylammonioethyl, triethylammoniopropyl), 1-alkylpyridinium (e.g., 1-methylpyridinium-4-yl, 1-ethylpyridinium-3-yl), and 1,3-dialkylimidazolium (e.g., 1,3-dimethylimidazolium-4-yl).
  • tetraalkylammonium e.g., trimethylammonioethyl, trimethylammoniopropyl, triethylammonioethyl, triethylammoniopropyl
  • 1-alkylpyridinium e.g., 1-methylpyridinium-4-yl, 1-ethylpyridinium-3-yl
  • 1,3-dialkylimidazolium e.
  • Weak anion exchangers refer to ion exchangers that lose their cationic character at high pH and have a monovalent or polyvalent residue partial structure derived from primary, secondary, or tertiary amines, imidazole, monoalkylimidazole, N-unsubstituted pyridine, etc.
  • partial structures such as secondary amino groups (e.g., methylaminoethyl, ethylaminoethyl, methylaminopropyl, etc.), tertiary amino groups (e.g., dimethylaminoethyl, dimethylaminopropyl, diethylaminoethyl, diethylaminopropyl, pyridyl group, 1-methylimidazolyl group, 1-ethylimidazolyl group, etc.), and monovalent or polyvalent residue partial structures derived from polyethyleneimine.
  • diethylaminoethyl (DEAE) and monovalent or polyvalent residues derived from polyethyleneimine are preferably used.
  • PEI polyethyleneimine, monovalent or polyvalent residues derived from polyethyleneimine may be referred to as PEI.
  • Polyethyleneimine can be used regardless of its type, for example, unbranched linear low-molecular-weight polyethyleneimine, branched low-molecular-weight polyethyleneimine, unbranched linear polyethyleneimine, branched high-molecular-weight polyethyleneimine, etc., with branched high-molecular-weight polyethyleneimine being preferred. Since the selectivity for extracellular vesicles to be adsorbed varies depending on the type of polyethyleneimine, an appropriate type should be selected depending on the purpose.
  • a strong cation exchanger is an ion exchanger that retains anionic properties even at low pH, and has a partial structure such as a strongly acidic group (partial structure) such as a sulfonic acid group (sulfo group) or a phosphonic acid group.
  • a partial structure such as a strongly acidic group (partial structure) such as a sulfonic acid group (sulfo group) or a phosphonic acid group.
  • partial structures such as a sulfophenyl group and a sulfoalkyl group (e.g., sulfomethyl group, sulfoethyl group, sulfopropyl group, etc.).
  • a weak cation exchanger refers to an ion exchanger that loses its anionic character at low pH and has a weakly acidic group (partial structure) such as a carboxylic acid group (carboxyl group).
  • a carboxylic acid group such as carboxylic acid group (carboxyl group).
  • Specific examples include carboxyalkyl groups (e.g., carboxymethyl, carboxyethyl, etc.).
  • the substrate is a material capable of supporting an ion exchanger. As described above, an ion exchanger is immobilized by directly or indirectly binding to a portion or all of the surface of the substrate to form a solid phase carrier.
  • the substrate that can be used in the present invention is not particularly limited, and examples thereof include instruments, tools, materials, and the like commonly used in the fields of biological detection methods, quantification methods, or separation/purification methods. Specific examples include glass slides, cover glasses, well plates, microplates, dishes, flasks, resin substrates for column packings, separation beads (e.g., magnetic beads), and the like.
  • the substrate material is not particularly limited, and any substrate material (including instruments, tools, materials, etc.) commonly used in the fields of biological detection methods, quantification methods, or separation/purification methods can be used.
  • substrate materials include glass, plastic, metal, ceramic, semiconductor, resin, polysaccharide, paper, cloth, etc.
  • glass, plastic, ceramic, or resin is particularly preferably used.
  • the shape of the substrate is not particularly limited, and substrates (including instruments, tools, materials, etc.) commonly used in the fields of biological detection methods, quantification methods, or separation/purification methods can be used.
  • substrate shapes include plate-like, particulate, thread-like, net-like, fibrous, membrane-like, dish-like, and cylindrical. Of these, plate-like or particulate (bead-like) substrates are preferred for ease of handling.
  • the thickness of the plate-like substrate or the size of the particulate substrate are not particularly limited, and may be appropriately set within a range that is convenient for handling. These substrates may also be porous.
  • slide glasses are preferred, with well plates being particularly preferred.
  • substrates that have been treated to be water-repellent are preferably used.
  • a particulate solid phase carrier can also be created by fixing an ion exchanger to the surface of a particulate substrate.
  • Such particulate solid phase carrier can be used as a column packing material by filling it into a column.
  • the substrate forming the column packing material may be either inorganic or organic.
  • Inorganic materials include, for example, silicon, titanium, zinc, and aluminum
  • organic materials include, for example, agarose, cellulose, chitin, chitosan, amylose, heparin, hyaluronic acid, polysaccharides such as pectin, polyacrylamide, polyacrylic acid, polystyrene, polyvinyl alcohol, polymethacrylic acid, polyacrylic acid, polymethacrylic acid esters, polyacrylic acid esters, and derivatives thereof.
  • the particulate substrate forming the column packing material may be porous or non-porous particles.
  • the ion exchanger constituting the solid phase carrier is responsible for the adsorption action for extracellular vesicles.
  • the solid phase carrier is endowed with the adsorption ability for extracellular vesicles by the ion exchanger.
  • the solid phase carrier containing the ion exchanger has the adsorption ability for extracellular vesicles.
  • Ion exchangers have different adsorption capacities for various extracellular vesicles depending on the type, and by selecting an ion exchanger according to the purpose, it is possible to select the type of extracellular vesicles that can be adsorbed by the solid phase carrier. For example, when diethylaminoethyl (DEAE) or polyethyleneimine (PEI) is used as the ion exchanger, the solid phase carrier can adsorb any extracellular vesicles, regardless of their origin (e.g., human, plant, bacterial, etc.).
  • DEAE diethylaminoethyl
  • PEI polyethyleneimine
  • the method of the present invention for analyzing extracellular vesicles includes: (1) A step of adsorbing the extracellular vesicles onto a solid phase carrier comprising a substrate and an ion exchanger and having the ability to adsorb the extracellular vesicles; (2) labeling the extracellular vesicles adsorbed to the solid phase carrier; (3) washing the labeled extracellular vesicles while they are still adsorbed to the solid phase carrier; (4) optionally, a step of detaching the labeled extracellular vesicles from the solid phase carrier; and (5) a step of detecting the labeled extracellular vesicles. These steps are described in detail below.
  • Step of adsorbing extracellular vesicles Extracellular vesicles are adsorbed onto a solid phase carrier that includes a substrate and an ion exchanger and has the ability to adsorb extracellular vesicles. In the present application, this step may also be simply referred to as an adsorption step.
  • the extracellular vesicles to be detected are immobilized on a solid phase by adsorbing them to the solid phase.
  • This process allows the target extracellular vesicles to be efficiently immobilized on the solid phase.
  • the target extracellular vesicles can be efficiently labeled by labeling them while they are still adsorbed to the solid phase (see the labeling process described below).
  • the extracellular vesicles to be adsorbed to the solid phase are usually provided as a solution containing the extracellular vesicles (also called a liquid sample), and the target extracellular vesicles are adsorbed to the solid phase by contacting this liquid sample with the solid phase.
  • the liquid sample may be, for example, a solution containing purified (including partially purified) extracellular vesicles, or a solution containing unpurified extracellular vesicles.
  • unpurified liquid samples include plasma, serum, urine, saliva, tears, cerebrospinal fluid, bronchoalveolar lavage fluid, fruit juice, cell culture supernatant, and fungal or bacterial culture supernatant.
  • liquid sample solution it is preferable to adjust it so that it is isotonic with body fluids.
  • the liquid sample when the liquid sample comes into contact with the solid phase carrier, the extracellular vesicles will not be deformed by osmotic pressure.
  • the substrate is a solid phase carrier that is a variety of detection plates such as slide glasses, cover glasses, well plates, and microplates, or a cell culture vessel such as a dish or flask
  • the liquid sample is placed on the surface of the solid phase carrier and left to stand for a predetermined period of time, thereby adsorbing and immobilizing the extracellular vesicles to the solid phase carrier.
  • the target is extracellular vesicles that tend to float, there is no need to apply centrifugal force using a centrifuge or the like, and immobilization is easy.
  • the adsorption reaction is preferably carried out at a temperature range of 0 to 60°C, and is left to stand for at least 2 minutes, more preferably at least 3 minutes.
  • the reaction temperature and reaction time can be adjusted appropriately depending on the sample and carrier used.
  • the reaction temperature is more preferably 1 to 37°C.
  • the solid phase carrier may be washed with a washing solution, if necessary.
  • a washing solution for example, by washing the solid phase carrier with a washing solution under conditions that prevent the extracellular vesicles from being released from the solid phase carrier, unintended impurities can be removed more efficiently.
  • blocking may be effective in reducing nonspecific staining.
  • Blocking agents include those using proteins such as serum, BSA (bovine serum albumin), and skim milk. Treatment with these blocking agents may be performed as needed.
  • Step of labeling extracellular vesicles adsorbed to a solid phase carrier In the adsorption step, extracellular vesicles are adsorbed to a solid phase carrier, and after blocking is performed if necessary, the extracellular vesicles are labeled with an extracellular vesicle detection substance (hereinafter also referred to as a detection substance) while still adsorbed to the solid phase carrier. Note that in the present application, this step may also be simply referred to as a labeling step.
  • an extracellular vesicle detection substance hereinafter also referred to as a detection substance
  • extracellular vesicles are indirectly detected by labeling them with a detection substance and detecting the label.
  • a detection substance commonly used in the relevant technical field can be used without particular limitations.
  • the detection substance is selected appropriately depending on the type of detection method and the type of extracellular vesicles to be detected.
  • detection substances include antibodies [e.g., (FITC-labeled) anti-CD9 antibody, (rhodamine-labeled) anti-CD63 antibody], lectins, membrane-reactive substances [e.g., (rhodamine-labeled) polymyxin B, (FITC-labeled) vancomycin, DiI dye], nucleic acid-reactive substances [e.g., SYTO], and cytofluorescent stains [e.g., CFDA-SE].
  • These detection substances can specifically label the target extracellular vesicles by recognizing and binding to, for example, markers (proteins, glycans, etc.) on the surface of the target extracellular vesicles or intracellular nucleic acids.
  • a single detection substance can be used, or two or more can be used in combination.
  • the detection substance is directly or indirectly bound to a signal substance capable of generating a detectable signal.
  • the detection substance itself may also be a substance that generates a signal.
  • detection substances to which a signal substance is directly bound include reagents such as antibodies covalently bound to fluorescent dyes and nucleic acid binding molecules.
  • detection substances to which a signal substance is indirectly bound include reagents such as secondary antibodies covalently bound to signal substances (note that in the present invention, antibodies (primary antibodies) before being captured by secondary antibodies are also referred to as detection substances). When using antibodies, labeling can be achieved by reacting them at 4-37°C for approximately 30 minutes.
  • signal substances include fluorescent substances and radioisotopes, which are substances that generate signals by themselves, and enzymes (e.g., alkaline phosphatase, peroxidase, ⁇ -galactosidase, luciferase), which generate signals by catalyzing the reaction of other substances.
  • fluorescent substances include fluorescent dyes such as fluorescein isothiocyanate (FITC), rhodamine, and Alexa Fluor (registered trademark), and fluorescent proteins such as GFP.
  • fluorescent substances include fluorescent dyes such as fluorescein isothiocyanate (FITC), rhodamine, and Alexa Fluor (registered trademark), and fluorescent proteins such as GFP.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • Alexa Fluor registered trademark
  • radioisotopes include 125 I, 14 C, and 32 P.
  • Step of washing labeled extracellular vesicles while they are still adsorbed to the solid phase carrier After labeling the extracellular vesicles with the detection substance, the solid phase carrier is washed with a washing solution while the extracellular vesicles are still adsorbed to the solid phase carrier. Note that in the present application, this step may also be simply referred to as the washing step.
  • a solution that has little effect on extracellular vesicles such as phosphate-buffered saline (PBS), can be preferably used as a washing solution. Washing may be performed using multiple washing solutions; for example, after washing with PBS, further washing may be performed with ion-exchanged water, distilled water, etc.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • the supernatant is removed, followed by the addition of PBS, which is then repeatedly aspirated and washed.
  • PBS PBS
  • it can also be washed by immersing it in a container filled with ion-exchanged water and shaking the slide.
  • Step of detaching labeled extracellular vesicles from the solid phase carrier After washing the labeled extracellular vesicles while they are still adsorbed to the solid phase carrier, the target extracellular vesicles adsorbed to the solid phase carrier are detached. Note that in the present application, this step may also be referred to simply as the detachment step. This operation allows extracellular vesicles with fewer impurities than in the initial liquid sample to be extracted in a state labeled with the detection substance, thereby obtaining a solution containing a high concentration of labeled extracellular vesicles. Note that if the labeled extracellular vesicles are analyzed while still adsorbed to the solid phase carrier, this detachment step can be omitted.
  • Extracellular vesicles can be eluted by increasing the ionic strength (salt concentration) of the buffer or by changing the pH.
  • Methods for increasing ionic strength include elution with a high-concentration salt solution (for example, a 1 molar NaCl solution).
  • a high-concentration salt solution for example, a 1 molar NaCl solution.
  • the eluent should be selected appropriately depending on the type of ion exchanger that makes up the solid phase support.
  • adsorbed extracellular vesicles can be eluted by using an alkaline eluent.
  • adsorbed extracellular vesicles can be eluted by using an acidic eluent.
  • EVs can also be released from the solid support by scraping them off the solid surface with a cell scraper, which is used to detach adherent cells.
  • scraping EVs with a cell scraper causes almost no damage to the EVs, and is preferable to methods such as treatment with a high-concentration salt solution or ultrasonic treatment.
  • Step of detecting labeled extracellular vesicles released from the solid phase carrier Labeled extracellular vesicles released from the solid phase carrier can be indirectly detected by detecting the signal generated from the labeled detection substance (a signal generated from a signal substance directly or indirectly bound to the detection substance) using various techniques. Note that when the signal substance is an enzyme that generates a signal by catalyzing the reaction of another substance, the signal can be detected using a substrate for the enzyme. Examples of measurement techniques for detecting signals include flow cytometry.
  • Flow cytometry is an experimental technique based on the detection of fluorescence, which can simultaneously analyze various characteristics of suspended objects (cells, extracellular vesicles, etc.) such as the number of objects and the amount of protein expressed by each object. Below, a specific method will be described using extracellular vesicles as the object.
  • a suspension of extracellular vesicles stained with fluorescent dyes is passed through a thin stream, and the line of extracellular vesicles is adjusted so that they pass through a light source one after the other.
  • the scattering of the light source and the fluorescence emitted by each extracellular vesicle as it passes are measured at various wavelengths.
  • Fluorescent molecules that bind to specific components of extracellular vesicles may be used, or fluorescently labeled antibodies that recognize specific proteins, glycans, etc. may be used.
  • Flow cytometry can obtain quantitative information at the single extracellular vesicle level (e.g., the number of extracellular vesicles of a specific type, the amount of specific proteins or glycans expressed on the membrane surface of those extracellular vesicles, and the amount of specific proteins or nucleic acids expressed within the extracellular vesicles by permeabilizing the membrane), and can also analyze the correlation between these multiple pieces of information for each single extracellular vesicle. It is particularly effective in identifying and quantifying the type of extracellular vesicle, taking advantage of the fact that different types of extracellular vesicles express different proteins on the cell surface. Extracellular vesicles are labeled with fluorescent dyes or other agents to distinguish them from other types of extracellular vesicles, taking advantage of the fact that antibodies specifically recognize and bind to specific proteins. This process is known as phenotypic analysis.
  • Antibodies labeled with fluorescent dyes are used for phenotypic analysis. By labeling antibodies targeting different proteins with different fluorescent dyes, they can be analyzed simultaneously using a flow cytometer. Analysis using multiple antibodies at the same time is also called multiplex analysis, and it is possible to analyze two or more types of antibodies simultaneously. For example, in immunophenotypic analysis, depending on the antibodies selected for analysis, it is possible to simultaneously identify multiple types of immune cell-derived extracellular vesicles from a single sample, such as T cell-derived extracellular vesicles, B cell-derived extracellular vesicles, and monocyte-derived extracellular vesicles.
  • Flow cytometry is a method suitable for phenotypic analysis because it is very fast and can quantitatively analyze thousands or tens of thousands of extracellular vesicles in a short period of time. Another advantage of phenotypic analysis using flow cytometry is that extracellular vesicles sorted by phenotype can be used for analysis. This makes it possible to perform functional analysis of specific extracellular vesicle populations after analysis depending on the analysis results.
  • various types of extracellular vesicles can be quantified by binding a specific antibody to the extracellular vesicles of interest and detecting the enzymatic reaction caused by a labeled enzyme bound directly or indirectly to the antibody using an appropriate substrate. Quantification using immunoassay methods has the advantage of being relatively simple.
  • This section describes an example of the quantification (quantification step) of extracellular vesicles immobilized on a solid-phase carrier (the substrate is a detection plate such as a well plate or microplate) using an immunoassay method.
  • the extracellular vesicles are adsorbed and immobilized on the solid-phase carrier. If necessary, the solid-phase carrier is blocked with a blocking solution, and then an antibody specific to the extracellular vesicles of interest (e.g., an antibody specific to a protein on the surface of the extracellular vesicles of interest) is contacted with the solid-phase carrier to label the extracellular vesicles.
  • an antibody specific to the extracellular vesicles of interest e.g., an antibody specific to a protein on the surface of the extracellular vesicles of interest
  • an enzyme-labeled secondary antibody is bound to the antibody. After that, excess antibody is removed using a washing solution, and the substrate of the labeled enzyme is contacted with the solid-phase carrier to cause an enzymatic reaction. The product of the enzymatic reaction is detected and quantified, allowing the amount of extracellular vesicles of interest to be quantified.
  • the ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) method is particularly preferred.
  • the ELISA method captures the target antigen or antibody contained in a sample solution with a specific antibody or antigen, and then detects and quantifies it using an enzyme reaction.
  • Kit The kit for analyzing extracellular vesicles of the present invention uses the method for analyzing extracellular vesicles of the present invention and is used to detect or quantify extracellular vesicles.
  • the kit of the present invention can be used for testing and diagnosis.
  • the present invention allows extracellular vesicles to be captured and recovered in a simple manner, and their properties can be analyzed with high precision, compared to conventional methods involving ultracentrifugation or immunoprecipitation. This makes it possible to quickly and inexpensively clarify the properties of extracellular vesicles, making it useful for the development of EV-related products and the testing and diagnosis of various diseases.
  • a slide glass with an ion exchanger immobilized thereon (hereinafter referred to as a DEAE-immobilized slide glass) was used as the solid phase support.
  • the DEAE-immobilized slide glass was prepared by preparing a slide glass pre-coated with amino groups, binding 2-diethylaminoethylamine to the amino groups on the slide glass using glutaraldehyde as a crosslinker, and immobilizing DEAE as an ion exchanger. The details of the method for preparing the DEAE-immobilized slide glass are described below.
  • a 2-5% glutaraldehyde solution (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added as a crosslinking agent to each well of the amino-coated slide glass, at 70 ⁇ L per well, and the slide glass was left to stand at room temperature for at least two hours. The slide glass was then washed with ion-exchanged water to remove any unreacted crosslinker or by-products. After washing, 70 ⁇ L of a 2-5% 2-diethylaminoethylamine solution (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) was added to each well, and the slide glass was left to stand at room temperature for at least two hours.
  • a 2-5% 2-diethylaminoethylamine solution (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) was added to each well, and the slide glass was left to stand at room temperature for at least two hours.
  • the slide glass surface was washed with ion-exchanged water to remove any unreacted ion exchanger or by-products, resulting in the preparation of a DEAE-immobilized slide glass.
  • a slide glass already coated with amino groups was prepared to produce an ion exchanger-immobilized slide glass, but coating of amino groups on the slide glass can also be performed using, for example, a silane coupling agent (e.g., 3-aminopropyltriethoxysilane).
  • a silane coupling agent e.g., 3-aminopropyltriethoxysilane
  • ⁇ Step of adsorbing extracellular vesicles onto an ion exchanger-immobilized slide glass The following sample solutions containing extracellular vesicles (EVs) were prepared: Fungus (mushroom)-derived EV sample: The mushroom mycelium culture solution was centrifuged to remove the precipitate, and the resulting supernatant was used as a fungus (mushroom)-derived EV sample. - Escherichia coli-derived EV sample: DH5 ⁇ strain-derived EV (manufactured by Cosmo Bio Co., Ltd.) was used as the Escherichia coli-derived EV sample.
  • Fungus (mushroom)-derived EV sample The mushroom mycelium culture solution was centrifuged to remove the precipitate, and the resulting supernatant was used as a fungus (mushroom)-derived EV sample.
  • - Escherichia coli-derived EV sample DH5 ⁇ strain-derived EV (manufact
  • Lactic acid bacteria-derived EV sample A commercially available lactic acid bacteria drink was partially purified by ultrafiltration (using a 100 kDa cutoff filter) to prepare a lactic acid bacteria-derived EV sample.
  • Lemon-derived EV sample 100% lemon juice (Pokka Lemon 100; Pokka Sapporo Food & Beverage Co., Ltd.) was partially purified by ultrafiltration (using a 100 kDa cutoff filter) to obtain a lemon-derived EV sample.
  • - Human urine-derived EV sample Urine was collected from healthy individuals to prepare a human urine-derived EV sample.
  • Human plasma-derived EV sample Blood from healthy individuals was collected or purchased to obtain a human plasma-derived EV sample.
  • the adsorption and fixation of EV onto the ion exchanger-immobilized slide glass was carried out using the following procedure. First, the ion exchanger-immobilized slide glass was washed with ion-exchanged water and then tapped to remove unreacted ion exchanger and by-products. Next, 10-20 ⁇ L of sample solution containing EV was added to each well of the slide glass and left to stand at room temperature for 30 minutes, allowing the EV in the sample solution to be adsorbed and fixed onto the slide glass.
  • Fluorescent staining of EVs was performed using the following procedure. First, EVs were adsorbed and fixed onto the slide glass as described above, and then the supernatant of the sample solution was removed. 20 ⁇ L of blocking solution (20-100% FBS-PBS) was added per well and allowed to stand at room temperature for 30 minutes for blocking. After removing the blocking solution, the wells were washed with PBS. After washing, 20 ⁇ L of fluorescent staining reagent (nucleic acid staining reagent or fluorescently labeled antibody) diluted to an appropriate concentration was added and allowed to stand at room temperature for 30 minutes.
  • blocking solution (20-100% FBS-PBS
  • fluorescent staining reagent nucleic acid staining reagent or fluorescently labeled antibody
  • the reagent supernatant was removed, the slide glass was washed with ion-exchanged water, and the water was removed by suction. PBS was added, and the fixed EVs were scraped off with a cell scraper. The EVs suspended in PBS were collected in a tube and analyzed using a flow cytometer.
  • Example 1 EV samples derived from human plasma, human urine, lemon, fungi (mushrooms), lactic acid bacteria, and Escherichia coli were immobilized on a solid support (DEAE-immobilized glass slide) according to the method described above, stained with SYTO RNA, an RNA fluorescent staining reagent, and then analyzed using a flow cytometer. The results are shown in Figure 1.
  • Figure 1(a) shows the results of an unstained human plasma-derived EV sample (negative control)
  • Figure 1(b) shows the results of a human plasma-derived EV sample stained with SYTO
  • Figure 1(c) shows the results of a human urine-derived EV sample stained with SYTO
  • Figure 1(d) shows the results of a lemon-derived EV sample stained with SYTO
  • Figure 1(e) shows the results of a fungus-derived EV sample stained with SYTO
  • Figure 1(f) shows the results of a lactic acid bacteria-derived EV sample stained with SYTO
  • Figure 1(g) shows the results of an Escherichia coli-derived EV sample stained with SYTO.
  • the horizontal axis represents green fluorescence intensity
  • the vertical axis represents the count (frequency).
  • the method of the present invention enables human, plant, fungal, and bacterial EVs to be adsorbed onto a solid support (DEAE-immobilized slide glass), which can then be fluorescently stained and analyzed using a flow cytometer. Furthermore, as shown in Figure 1, more than 90% of the particles adsorbed onto a solid support (DEAE-immobilized slide glass) using the method of the present invention are RNA+ EVs stained with SYTO RNA, confirming that the method of the present invention enables highly pure EVs to be obtained simply and specifically. Furthermore, while it has been reported that EVs are damaged by the pressure of ultracentrifugation when separated using conventional ultracentrifugation (see, for example, Douglas D. Taylor et al., Methods, vol. 87, pp. 3-10, 2015), the method of the present invention is also superior in that it does not cause such damage.
  • Example 2 Human plasma-derived EV samples were immobilized on DEAE-immobilized slides according to the method described above, stained with fluorescently labeled antibodies against human CD9, human EpCAM, human CD63, human EGFR, human HER2, and human GPNMB, and then analyzed using a flow cytometer. The results are shown in Figure 2.
  • Figures 2(a) to 2(c) show the results for the unstained (negative control), stained with anti-human CD9 antibody, and stained with anti-human EpCAM antibody, respectively.
  • the horizontal axis represents the green fluorescence intensity
  • the vertical axis represents the number of counts (frequency).
  • Figures 2(d) to 2(h) show the results for no staining (negative control), staining with anti-human CD63 antibody, staining with anti-human EGFR antibody, staining with anti-human HER2 antibody, and staining with anti-human GPNMB antibody, respectively.
  • the horizontal axis represents red fluorescence intensity
  • the vertical axis represents the number of counts (frequency).
  • Figure 2 confirms that human plasma-derived EVs express the exosome markers CD9 and CD63.
  • Example 3 Human urine-derived EV samples were immobilized by adsorption onto DEAE-immobilized slides according to the method described above, stained with fluorescently labeled antibodies against human CD9, human EpCAM, human CD63, human EGFR, human HER2, and human GPNMB, and then analyzed using a flow cytometer. The results are shown in Figure 3.
  • Figures 3(a) to 3(c) show the results for the unstained (negative control), stained with anti-human CD9 antibody, and stained with anti-human EpCAM antibody, respectively.
  • the horizontal axis represents the green fluorescence intensity
  • the vertical axis represents the number of counts (frequency).
  • Figures 3(d) to 3(h) show the results for no staining (negative control), staining with anti-human CD63 antibody, staining with anti-human EGFR antibody, staining with anti-human HER2 antibody, and staining with anti-human GPNMB antibody, respectively.
  • the horizontal axis represents red fluorescence intensity
  • the vertical axis represents the number of counts (frequency).
  • Figure 3 confirms that human urine-derived EVs express the exosome markers CD9 and CD63. These results confirm that human urine-derived extracellular vesicles can be adsorbed onto a solid support (DEAE-immobilized slide glass), and can be fluorescently stained and analyzed using a flow cytometer.
  • a solid support DEAE-immobilized slide glass

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Abstract

細胞外小胞を簡便な方法で補足及び回収し、回収した細胞外小胞の特性を迅速に高精度で解析する技術を提供する。　基材とイオン交換体とを含み、細胞外小胞の吸着能を有する固相担体に細胞外小胞を吸着させる工程、 固相担体に吸着した細胞外小胞を標識する工程、 標識された細胞外小胞を固相担体に吸着した状態のまま洗浄する工程、 必要に応じて標識された細胞外小胞を固相担体から脱離する工程、及び 固相担体から脱離した標識された細胞外小胞を検出する工程 を含む細胞外小胞を解析する方法。

Description

細胞外小胞を解析する方法
　本発明は、細胞外小胞を解析する方法に関する。
　細胞外小胞（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅｓ；以下ＥＶと略す場合もある。）は、細胞から放出される脂質二重層で覆われた核を持たない（複製できない）粒子の総称である。最近の研究から、細胞外小胞は、ヒトなどの動物に限らず、植物、真菌、細菌にいたるまで、ほぼすべての細胞が放出していることが明らかになっている。
　細胞外小胞は、核酸（ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、タンパク質、脂質、各種代謝産物等を含み、動物細胞由来の細胞外小胞は、その産生機構から、エクソソーム、アポトーシス小胞、マイクロベシクルに分類され、細胞間情報伝達で重要な役割を果たしていることが知られている。体内の各臓器の組織細胞から放出されるＥＶのみならず、腸内細菌由来ＥＶや食物などに由来するＥＶも、体内に取り込まれ、血流を通じて遠隔の臓器に送達されて、生体内で機能することが分かっている。
　最近では、機能食品、発酵食品や生菌製剤などの効果についても、主な有効成分はＥＶではないかと考えられている。また、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）など治療に用いられる細胞の効果も、当該細胞が出すＥＶにより代替できることが明らかになっている。このようなことからＥＶに関する研究の進展によりＥＶ創薬の機運も高まっており、米国ではすでに１００を超えるＥＶを効果成分とした製剤の治験が実施されている。ＥＶはこれからの商品開発・創薬のターゲットとして高いポテンシャルがあると考えられている。
　ＥＶを解析するにあたっては、現在の技術では、まずＥＶを単離、回収又は濃縮する必要がある。ＥＶを回収する代表的な方法として、例えば、超遠心分離を用いた手法が広く利用されている。しかし、超遠心分離は沈降速度に基づいて物質を分離又は分画する手法であるため、性状・濃度が類似した他粒子（エンドソーム等）や、ＩｇＭなどの高質量のタンパク質も含まれ、特定のＥＶのみを選択的に捕捉して回収することが困難である。さらに超高速遠心により高圧がかかるため、ＥＶの変形や機能低下が懸念される。
　ＥＶを有効に補足し定量及び特性解析する他の手法として、ＥＶ表面の特定のタンパク質（抗原）と特異的に結合する抗体（例えば、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１等のＥＶマーカー）を用いる免疫沈降法がある。免疫沈降法は抗原抗体反応に基づくため、混合物中から目的とするＥＶを高純度で回収することが可能である。例えば、あらかじめ抗体を結合させた磁気ビーズとＥＶを含む検体とを混合し、ＥＶと抗体とを結合させＥＶ－抗体－磁気ビーズの複合体を形成し、その後、磁石を使って磁性ビーズを集め、最後にＥＶのみを溶出させて回収する。しかし、表面に特定のタンパク質（抗原）を有していないＥＶの場合には回収が困難であり、補足できるＥＶがその抗体の認識可能なＥＶに限定されてしまう。また技術的に複雑で手間がかかる方法であるため、ある程度の熟練が必要であったり、処理中にＥＶが損傷する場合があったりするという問題がある。
　さらに、ＥＶの定量や特性解析は、電子顕微鏡、ナノ粒子トラッキング解析、免疫沈降、高分解能フローサイトメトリー（非特許文献１）等を組み合わせて別々に実施する必要があるが、これらの手法はどれも作業時間を要する。前述のＥＶ補足技術と共に、簡便に効率よくＥＶを解析できる手法が望まれている。
　特にフローサイトメトリー法は、個々のＥＶの情報が迅速に得られる方法なので、ＥＶの定量や特性解析に非常に有効な手段となりうる。細胞のフローサイトメトリー法を用いた分析は、一般的にサンプルの精製及び／又は濃縮を必要としないで実施できる場合が多い。しかしながら、これまでのフローサイトメトリー法を用いたＥＶの分析を行う場合、ＥＶを標識するための蛍光抗体などの未結合試薬、抗凝固剤や細胞培養液への添加物（例えば、フェノールレッド）などの染色前に添加された試薬等を除去するために精製が必要となる場合がほとんどであった。このような精製工程が入ることによって、時間、手間、及び費用がかかること、さらには精製によるサンプルのロスが問題となっていた。
Ｊ　Ｅｘｔｒａｃｅｌｌ　Ｖｅｓｉｃｌｅｓ．　２０２３　Ｆｅｂ；１２（２）：ｅ１２２９９．　ｄｏｉ：　１０．１００２／ｊＥＶ２．１２２９９
　従って、本発明の目的は、細胞外小胞（ＥＶ）を簡便な方法で補足及び回収し、回収した細胞外小胞（ＥＶ）の特性を迅速に高精度で解析する技術を提供することである。
　上記目的に鑑み、本発明者らは、イオン交換体を塗布した基材が細胞外小胞（ＥＶ）を効果的に補足できるという発明者らの先の知見を発展させて、ガラスプレート等の基材表面に塗布したイオン交換体でＥＶを補足し、イオン交換体にＥＶが吸着した状態のままＥＶ表面の特定のタンパク質や糖鎖と特異的に結合する抗体等の物質でＥＶを標識し、標識されたＥＶをイオン交換体から離脱させて回収し、標識されたＥＶをフローサイトメトリー法等の方法で検出することで、迅速にかつ簡便に高感度・高精度でＥＶを解析できることを見いだし、本発明に想到した。
　すなわち、本発明の細胞外小胞を解析する方法は、
　基材とイオン交換体とを含み、前記細胞外小胞の吸着能を有する固相担体に前記細胞外小胞を吸着させる工程、
　前記固相担体に吸着した前記細胞外小胞を標識する工程、
　前記標識された細胞外小胞を前記固相担体に吸着した状態のまま洗浄する工程、及び
　前記標識された細胞外小胞を検出する工程
を含む。
　前記洗浄する工程の後に、前記洗浄された細胞外小胞を前記固相担体から脱離する工程を有していても良い。
　前記細胞外小胞を標識する工程は、細胞外小胞検出物質を用いて行うのが好ましい。
　前記細胞外小胞検出物質は、抗体、レクチン、膜反応性物質、及び核酸反応性物質からなる群より選ばれた少なくとも１種であるのが好ましい。
　前記細胞外小胞を検出する工程は、イムノアッセイ法又はフローサイトメトリー法によって行うのが好ましい。
　前記イオン交換体は二級及び／又は三級アミノ基を部分構造として有する弱陰イオン交換体であるのが好ましい。
　前記イオン交換体はポリエチレンイミンから誘導される１価残基、又は多価残基であるのが好ましい。
　前記ポリエチレンイミンは、分岐している高分子量ポリエチレンイミンであるのが好ましい。
　前記イオン交換体と前記基材とは、連結部を介して又は連結部を介さずに共有結合で結合しているのが好ましい。
　前記イオン交換体と前記基材とが連結部を介して結合しており、前記連結部がケイ素－炭素結合を含むのが好ましい。
　前記基材はガラス、プラスチック又は金属酸化物からなるのが好ましい。
　前記基材は板状又は粒子状であるのが好ましい。
　前記基材はスライドグラスであるのが好ましい。
　細胞外小胞を解析するための本発明のキットは、前記細胞外小胞を解析する方法を用いることを特徴とする。
　本発明のキットは、検査・診断に用いることができる。
　本発明の細胞外小胞を解析する方法は、検査・診断に用いることができる。
　本発明の方法は、イオン交換体を使用して細胞外小胞（ＥＶ）を補足し、イオン交換体に補足した状態で抗体等の物質でＥＶを標識するため、抗体を使用した方法（免疫沈降法）に比べて低いコストで簡便にＥＶを補足でき、特別な精製工程を必要とせずに夾雑物が除去されたＥＶを高純度で回収することができる。イオン交換体に吸着した状態でＥＶを標識するので、標識に使用した物質を洗浄除去することができ、イオン交換体から標識したＥＶを回収後そのまま後段の検出工程に供することができる。
　また本発明の方法は、特異的な抗原を持たないＥＶについても網羅的に補足できるのでそのようなＥＶの回収、解析が可能となる。
ヒト血漿由来、ヒト尿由来、レモン由来、真菌（キノコ）由来、及び乳酸菌由来、大腸菌由来のＥＶを、本発明の方法により固相担体に固定して、ＲＮＡ蛍光染色試薬であるＳＹＴＯ　ＲＮＡで染色して、フォローサイトメトリーを用いて解析した結果を示すグラフである。 ヒト血漿由来ＥＶを、本発明の方法により固相担体に固定して、ヒトＣＤ９、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ６３、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、及びＧＰＮＭＢに対する蛍光標識抗体で染色して、フォローサイトメトリーを用いて解析した結果を示すグラフである。 ヒト尿由来ＥＶを、本発明の方法により固相担体に固定して、ヒトＣＤ９、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ６３、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、及びＧＰＮＭＢに対する蛍光標識抗体で染色して、フォローサイトメトリーを用いて解析した結果を示すグラフである。
　以下に、本発明について詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。なお、下記の固相担体、キット、検出方法、分離・精製方法、検査・診断方法、固定化方法等についての説明は、相互に参照されて援用できる。
　本発明は、基材とイオン交換体とを含む固相担体を用いて細胞外小胞を効率的に補足し、抽出することを特徴とする方法である。本発明の方法を説明する前に、細胞外小胞及び固相担体についてまず説明する。
［１］細胞外小胞
　本願において細胞外小胞（ＥＶ）は、当該技術分野で通常用いられる意味で使用され、例えば、細胞から放出される核を持たない（複製できない）脂質二重膜で囲まれた粒子をいう。動物細胞由来の細胞外小胞は、主にエクソソーム、マイクロベシクル、アポトーシス小胞に分類される。エクソソームは、５０～２００　ｎｍ程度のサイズを有するエンドサイトーシス過程で形成されるエンドソーム膜由来の小胞であり、主に脂質、タンパク質、及び核酸で構成されている。マイクロベシクルは１００～１，０００　ｎｍと幅広いサイズ分布を有する小胞であり、細胞膜から直接出芽して細胞外へと分泌される点がエクソソームと異なるが、エクソソームと完全に区別することは難しい。アポトーシス小胞は、アポトーシス（細胞死）を起こした細胞において膜から出芽される粒子であり、５０～５，０００　ｎｍ程度のサイズを有する。
　細胞外小胞は、その表面に親細胞の細胞膜由来の脂質、タンパク質、糖質等を有し、内部にはｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等の核酸やタンパク質が含まれており、放出した細胞由来の情報が含まれている。本発明で対象とする細胞外小胞は、任意の生細胞に由来する細胞外小胞であってよく、動物（ヒトを含む）、植物、真菌、微生物（細菌、酵母等を含む）等に由来する細胞外小胞を含む。
［２］固相担体
　固相担体は、基材とイオン交換体とを含んでなる複合材料であり、イオン交換体を含むことにより細胞外小胞を吸着したり、必要に応じて脱離したりする機能を有する。
　イオン交換体は、例えば、基材の表面の一部又は全部の領域に直接的又は間接的に結合して基材に固定されている。基材とイオン交換体との結合の様式は特に限定されず、共有結合で結合していても、共有結合以外の引力的な相互作用によって結合していてもよい。基材の修飾反応によってイオン交換体を直接結合することができる。また多段階の修飾反応によって基材上にイオン交換体を間接的に結合することができる。結合様式は共有結合が好ましい。
　多段階の修飾反応によって基材上にイオン交換体を間接的に結合する場合、基材とイオン交換体との間にあるそれら以外の修飾部分を連結部（リンカー、スペーサー等とも言う。）といい、このとき、イオン交換体は、基材の表面に連結部を介して間接的に結合しているという。
　例えば、末端にイオン交換体導入用の官能基を有するシランカップリング剤（例えば、３－ヒドロキシプロピルトリエトキシシラン、３－アミノプロピルトリエトキシシランなど）を用いることで、ガラス（基材）の表面に官能基を共有結合で連結することができる。このようにガラス表面に導入した官能基に対して、ジエチルアミノエチルクロリド塩酸塩を反応させることで、ジエチルアミノエチルを有するガラス表面が得られる。前記官能基に対して、架橋剤としてのグルタルアルデヒド、及び２－ジエチルアミノエチルアミンを反応させることで、同様に、ジエチルアミノエチルを有するガラス表面が得られる。このとき、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）の部分をイオン交換体といい、それよりもガラスに近い部分を連結部という。
　アミノ基などの官能基がコートされている市販のスライドグラスを用いても良い。
（１）イオン交換体
　イオン交換体は、強陰イオン交換体、弱陰イオン交換体、強陽イオン交換体、及び弱陽イオン交換体に分類されるが、本発明で使用するイオン交換体としては、強陰イオン交換体、及び弱陰イオン交換体が好ましく、弱陰イオン交換体がより好ましい。
　強陰イオン交換体は、高ｐＨ下においてもカチオン性を保持するイオン交換体を意味し、４級アンモニウム、Ｎ，Ｎ－ジアルキルイミダゾリウム、Ｎ－アルキルピリジニウム等の部分構造を有している。具体的に、例えば、テトラアルキルアンモニウム（例えばトリメチルアンモニオエチル、トリメチルアンモニオプロピル、トリエチルアンモニオエチル、トリエチルアンモニオプロピルなど）、１－アルキルピリジニウム（例えば１－メチルピリジニウム－４－イル、１－エチルピリジニウム－３－イルなど）、１，３－ジアルキルイミダゾリウム（例えば１，３－ジメチルイミダゾリウム－４－イルなど）等の部分構造が例示される。
　弱陰イオン交換体は、高ｐＨ下においてカチオン性を失うイオン交換体を意味し、１～３級アミン、イミダゾール、モノアルキルイミダゾール、Ｎ位無置換ピリジン等から誘導される１価残基又は多価残基の部分構造を有している。具体的に、例えば、二級アミノ基（例えばメチルアミノエチル、エチルアミノエチル、メチルアミノプロピルなど）、三級アミノ基（例えばジメチルアミノエチル、ジメチルアミノプロピル、ジエチルアミノエチル、ジエチルアミノプロピル、ピリジル基、１－メチルイミダゾリル基、１－エチルイミダゾリル基など）等の部分構造、ポリエチレンイミンから誘導される１価残基、又は多価残基の部分構造を挙げることができる。本発明においては、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、及びポリエチレンイミンから誘導される１価残基、又は多価残基を好ましく使用できる。なお、本願明細書において、ポリエチレンイミン、ポリエチレンイミンから誘導される１価残基、又は多価残基は、ＰＥＩと表記する場合がある。
　ポリエチレンイミンは、特に種類によらず使用することができ、例えば、分岐のない直線状の低分子量ポリエチレンイミン、分岐している低分子量ポリエチレンイミン、分岐のない直線状のポリエチレンイミン、分岐している高分子量ポリエチレンイミンなどを使用でき、中でも、分岐している高分子量ポリエチレンイミンを好ましく使用できる。ポリエチレンイミンの種類によって吸着する細胞外小胞の選択性が異なるため、目的に応じて適宜選択する。
　強陽イオン交換体は、低ｐＨ下においてもアニオン性を保持するイオン交換体を意味し、スルホン酸基（スルホ基）、ホスホン酸基等の強酸性の基（部分構造）等の部分構造を有している。具体的に、例えばスルホフェニル基、スルホアルキル基（例えばスルホメチル基、スルホエチル基、スルホプロピル基など）等の部分構造を挙げることができる。
　本発明において、弱陽イオン交換体は、低ｐＨ下においてアニオン性を失うイオン交換体を意味し、カルボン酸基（カルボキシル基）等の弱酸性の基（部分構造）等を有している。具体的に、例えば、カルボキシアルキル基（例えばカルボキシメチル、カルボキシエチルなど）を挙げることができる。
（２）基材
　基材は、イオン交換体を保持できる物質である。前述のとおり、基材の表面の一部又は全部の領域にイオン交換体を直接的又は間接的に結合して固定化し、固相担体とする。本発明において使用できる基材は、特に限定されず、生物学的な検出法、定量法又は分離・精製法の分野において一般的に使用される器具、用具、材料等の基材が挙げられる。具体的には、スライドグラス、カバーグラス、ウェルプレート、マイクロプレート、ディッシュ、フラスコ、カラム充填剤用樹脂基材、分離用ビーズ（例えば、磁気ビーズ）等を挙げることができる。
　基材の素材は、特に限定されず、生物学的な検出法、定量法又は分離・精製法の分野において一般的に使用される基材（器具、用具、材料等を含む）の素材を使用できる。基材の素材の例として、ガラス、プラスチック、金属、セラミック、半導体、樹脂、多糖、紙、布等を挙げることができる。本発明においては、特にガラス、プラスチック、セラミック又は樹脂を好ましく使用できる。
　基材の形状は、特に限定されず、生物学的な検出法、定量法又は分離・精製法の分野において、一般的に使用される基材（器具、用具、材料等を含む）の形状の物を使用できる。基材の形状の例として、板状、粒子状、糸状、網状、繊維状、膜状、皿状、筒状等を挙げることができる。中でも板状又は粒子状（ビーズ状）の基材を用いるのが取り扱う上で好ましい。板状基材の厚さや粒子状基材のサイズは特に限定されず、取り扱い上好ましい範囲で適宜設定すれば良い。これらの基材は多孔質状であってもよい。板状基材としては、スライドグラスが好ましく、特にウェルプレートが好ましい。また撥水加工されたもの（高撥水性印刷スライドグラスなど）が好ましく用いられる。
　粒子状の基材表面にイオン交換体を固定することで粒子状の固相担体としてもよい。このような粒子状の固相担体はカラム充填剤としてカラムに充填して用いることができる。
　カラム充填剤を形成する基材としては、無機系及び有機系どちらの素材であってもよく、無機系の素材としては、例えば、ケイ素、チタン、亜鉛、アルミニウム等を挙げることができ、有機系の素材としては、例えば、アガロース、セルロース、キチン、キトサン、アミロース、ヘパリン、ヒアルロン酸、ペクチン等の多糖類、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、ポリメタクリル酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸エステル、ポリアクリル酸エステル、及びこれらの誘導体等を挙げることができる。カラム充填剤を形成する粒子状の基材は、多孔性の粒子であっても良いし、非多孔性の粒子であっても良い。
（３）吸着能
　固相担体を構成するイオン交換体は、細胞外小胞に対する吸着作用を担っている。固相担体は、イオン交換体により、細胞外小胞に対する吸着能が付与される。すなわち、イオン交換体を含む固相担体は、細胞外小胞の吸着能を有している。
　イオン交換体は、その種類によって種々の細胞外小胞に対する吸着能が異なっており、目的に応じてイオン交換体を選択することで、固相担体が吸着できる細胞外小胞の種類を選択できる。例えば、イオン交換体としてジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）やポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いた場合、固相担体は、細胞外小胞の由来（例えばヒト、植物、細菌由来など）によらず任意の細胞外小胞を吸着できる。
［３］細胞外小胞を解析する方法
　細胞外小胞を解析する本発明の方法は、
（１）基材とイオン交換体とを含み、前記細胞外小胞の吸着能を有する固相担体に前記細胞外小胞を吸着させる工程、
（２）前記固相担体に吸着した前記細胞外小胞を標識する工程、
（３）前記標識された細胞外小胞を前記固相担体に吸着した状態のまま洗浄する工程、
（４）必要に応じて、前記標識された細胞外小胞を前記固相担体から脱離する工程、及び
（５）前記標識された細胞外小胞を検出する工程
を含む。
　以下にこれらの工程について詳細に説明する。
（１）細胞外小胞を吸着させる工程
　基材とイオン交換体とを含み、細胞外小胞の吸着能を有する固相担体に細胞外小胞を吸着させる。なお、本願においてこの工程を単に吸着工程という場合もある。
　吸着工程は、検出目的の細胞外小胞を固相担体に吸着させることで固相に固定する。この工程により、目的の細胞外小胞を効率的に固相担体に固定することができる。さらに固相担体に吸着した状態のまま細胞外小胞を標識する（後述の標識工程を参照）ことで、目的の細胞外小胞を効率的に標識することができる。固相担体に吸着させる細胞外小胞は、通常、細胞外小胞を含む溶液（液体試料ともいう）として提供され、この液体試料を固相担体に接触させることで、目的の細胞外小胞を固相担体に吸着させる。
　液体試料としては、例えば、精製（部分精製を含む）された細胞外小胞を含む溶液であってもよく、未精製の細胞外小胞を含む溶液であってもよい。未精製の液体試料としては、血漿、血清、尿、唾液、涙液、脳脊髄液、気管支肺胞洗浄液、果汁、細胞培養上清液、真菌や細菌の培養上清液などを挙げることができる。
　液体試料の溶液は、得に限定はされないが、体液と等張となるように調整するのが好ましい。このような液体試料であると、液体試料と固相担体とが接触するとき、細胞外小胞が浸透圧によって変形するようなことがない。
　液体試料と固相担体とを接触させることにより、細胞外小胞の固相担体への吸着を行うのが好ましい。基材がスライドグラス、カバーグラス、ウェルプレート、マイクロプレート等の各種検出用プレートや、ディッシュ、フラスコなどの細胞培養容器である固相担体の場合、固相担体の表面に液体試料をのせて、所定時間静置することによって、細胞外小胞が固相担体へ吸着され固定される。このとき、例えば、対象が浮遊しやすい細胞外小胞であっても、遠心機等を使用して遠心力を与える必要がなく、簡便に固定化が可能である。吸着反応は、好ましくは０～６０℃の温度範囲で、２分以上、より好ましくは３分以上静置して行う。反応温度及び反応時間は使用する試料及び担体によって適宜調節すればよい。反応温度はより好ましくは１～３７℃である。反応時間の上限は特に限定されないが、作業効率の点から、１０時間以内が好ましく、２時間以内がより好ましい。
　細胞外小胞を固相担体へ吸着させた後、必要に応じて、洗浄液を用いて固相担体を洗浄してもよい。例えば、細胞外小胞が固相担体から遊離しないような条件下で、洗浄液を用いて固相担体を洗浄することで、目的外の不純物をより効率的に除去できる。洗浄液としては、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）などの細胞外小胞への影響が少ない溶液を好ましく用いることができる。洗浄は複数の洗浄液を用いて行ってもよい。
　ＥＶ吸着後、非特異的な染色を低減させるために、ブロッキングすることが有効な場合がある。ブロッキング剤としては、血清、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、スキムミルクなどのタンパク質を用いたブロッキングなどがある。必要に応じてこれらのブロッキンズ剤で処理してもよい。
（２）固相担体に吸着した細胞外小胞を標識する工程
　吸着工程で固相担体に細胞外小胞を吸着させ、必要であればブロッキングを行った後、細胞外小胞が固相担体に吸着した状態のまま、細胞外小胞検出物質（以下検出物質ともいう）により標識する。なお、本願においてこの工程を単に標識工程という場合もある。
　本発明においては、細胞外小胞を検出物質により標識し、その標識を検出することで間接的に検出する。検出物質は、当該技術分野において一般的に用いられる検出物質であれば、特に限定なく使用できる。通常、検出手法の種類、検出対象の細胞外小胞の種類によって適宜選択される。検出物質としては、抗体［例えば、（ＦＩＴＣ標識）抗ＣＤ９抗体、（ローダミン標識）抗ＣＤ６３抗体］、レクチン、膜反応性物質［例えば、（ローダミン標識）ポリミキシンＢ、（ＦＩＴＣ標識）バンコマイシン、ＤｉＩ色素］、核酸反応性物質［例えば、ＳＹＴＯ］、細胞蛍光染色剤［例えば、ＣＦＤＡ－ＳＥ］等の試薬を挙げることができる。このような検出物質は、例えば、検出対象の細胞外小胞の表面上のマーカー（タンパク質、糖鎖等）や細胞内の核酸を認識して結合することによって対象の細胞外小胞を特異的に標識できる。検出物質は、１つのみでも使用でき、２つ以上を組み合わせて使用することもできる。
　検出物質には、検出可能なシグナルを発生可能なシグナル物質が直接又は間接的に結合しているのが好ましい。また検出物質自体がシグナルを発生するような物質でも良い。シグナル物質が直接結合している検出物質としては、蛍光色素が共有結合した抗体、核酸結合分子等の試薬を挙げることができる。シグナル物質が間接的に結合している検出物質としては、シグナル物質が共有結合している二次抗体等の試薬を挙げることができる（なお、本発明では、二次抗体に補足される前の抗体（一次抗体）等も検出物質という。）。抗体を用いる場合は、４～３７℃で３０分程度反応させることで標識できる。
　シグナル物質としては、それ自体がシグナルを発生する物質である蛍光物質、放射性同位元素等を挙げることができ、他の物質の反応を触媒することでシグナルを発生する酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ）などを挙げることができる。蛍光物質としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）などの蛍光色素、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質などを挙げることができる。放射性同位元素としては、１２５Ｉ、１４Ｃ、３２Ｐ等を挙げることができる。
（３）　標識された細胞外小胞を固相担体に吸着した状態のまま洗浄する工程
　細胞外小胞を検出物質により標識した後、細胞外小胞が固相担体に吸着した状態のまま洗浄液を用いて固相担体を洗浄する。なお、本願においてこの工程を単に洗浄工程という場合もある。細胞外小胞が固相担体から遊離しないような条件下で、洗浄液を用いて固相担体を洗浄することで、目的外の不純物（未結合の検出物質など）を効率的に除去できる。
　洗浄液としては、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）などの細胞外小胞への影響が少ない溶液を好ましく用いることができる。洗浄は複数の洗浄液を用いて行ってもよく、例えば、ＰＢＳで洗浄した後で、さらにイオン交換水、蒸留水等を用いて洗浄してもよい。
　例えば、９６穴などのプレートを用いた場合、上清を取り除いた後にＰＢＳを加え、それを吸引除去することを繰り返して洗浄する。平板のスライドガラスなどの場合は、イオン交換水を満たした容器中に浸漬して、スライドグラスを振り洗浄してもよい。
（４）　標識された細胞外小胞を固相担体から脱離する工程
　標識された細胞外小胞を固相担体に吸着した状態のまま洗浄した後、固相担体に吸着した目的の細胞外小胞を脱離させる。なお、本願においてこの工程を単に脱離工程という場合もある。この操作により、最初の液体試料よりも不純物が減少した細胞外小胞を検出物質により標識された状態で取り出すことができ、標識された細胞外小胞を高濃度で含む溶液を得ることができる。なお標識された細胞外小胞を固相単体に吸着させたままで分析する場合、この脱離工程は省略することもできる。
　細胞外小胞の脱離は、バッファーのイオン強度（塩濃度）を高めるか、あるいはｐＨを変えて溶出することができる。イオン強度を高める方法としては、高濃度の塩溶液（たとえば１モルのＮａＣｌ溶液）で溶出する方法などがある。ｐＨを変えて溶出する場合は、固相担体を構成するイオン交換体の種類によって溶出液を適宜選択して行う。イオン交換体として陰イオン交換体を用いた場合、アルカリ性の溶出液を使用することで吸着した細胞外小胞を脱離させることができる。逆に、イオン交換体として陽イオン交換体を用いた場合、酸性の溶出液を使用することで吸着した細胞外小胞を脱離させることができる。
　また、接着細胞の剥離に使用するセルスクレイパーにより、固相面からＥＶを掻きとることにより固相担体からＥＶを脱離することもできる。本発明のイオン交換体固定化固相担体を用いる方法においては、セルスクレイパーによって掻きとってもＥＶにほとんどダメージを与えることがなく、高濃度の塩溶液での処理や超音波処理等の方法よりも好ましい。
（５）　固相担体から脱離した標識された細胞外小胞を検出する工程
　固相担体から離脱した標識された細胞外小胞は、標識した検出物質から発生するシグナル（検出物質に直接的又は間接的に結合しているシグナル物質から発生するシグナル）を種々の手法によって検出することで間接的に検出することができる。なお、シグナル物質が他の物質の反応を触媒することでシグナルを発生する酵素である場合、前記酵素の基質を用いてシグナルを検出できる。シグナルを検出する測定手法としては、例えば、フローサイトメトリー法が挙げられる。
　また例えば、イムノアッセイ法などを用いる場合、標識された細胞外小胞を固相単体から離脱せずに、固相単体に吸着させたままで分析することも可能である。
（ａ）　フローサイトメトリー法
　フローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）は蛍光の検出をベースにした実験手法であり、対象物（細胞、細胞外小胞等）を懸濁した試料から対象物の数や個々の対象物が発現するタンパク質量などの様々な特性を同時に解析することができる。以下に、細胞外小胞を対象物として具体的な方法を説明する。
　フローサイトメトリーでは、蛍光色素で染色された細胞外小胞の懸濁液を細く流して、一列に並んだ細胞外小胞が順次光源を通過するように調整し、個々の細胞外小胞が通過した際の光源の散乱や発する蛍光を様々な波長で計測する。励起波長や蛍光波長の異なる蛍光分子を組み合わせて使用することで、１つの細胞外小胞から同時に複数のパラメーターを読み取ることができる。細胞外小胞の特定の構成成分に結合する蛍光分子を用いる場合と、特定のタンパク質や糖鎖などを認識する蛍光標識した抗体を使用する場合がある。
　フローサイトメトリーは単一細胞外小胞レベルでの定量的情報（例えば、特定のタイプの細胞外小胞の数、その細胞外小胞の膜表面に発現する特定のタンパク質や糖鎖の量、膜の透過処理を行うことで細胞外小胞内に発現する特定のタンパク質や核酸の量）を得ることができ、単一細胞外小胞ごとにこれらの複数の情報の相関関係を解析することもできる。特に細胞外小胞のタイプの特定と定量化に有効な手段であり、異なるタイプの細胞外小胞が細胞表面に異なるタンパク質を発現することを利用している。抗体が特定のタンパク質を特異的に認識して結合することを利用し、細胞外小胞を他のタイプの細胞外小胞と区別するために蛍光色素等で標識する。このプロセスは表現型解析と言われている。
　表現型解析には蛍光色素で標識した抗体を用いる。異なるタンパク質を標的とする抗体を異なる蛍光色素で標識することで、フローサイトメーターでこれらを同時に解析することができる。複数の抗体で同時に多重染色する解析は、マルチプレックス解析とも呼ばれ、２種の抗体、又はより多くの抗体で同時解析することが可能である。例えば、免疫表現型解析では、解析に利用する抗体の選択次第で１つのサンプルから、Ｔ細胞由来細胞外小胞、Ｂ細胞由来細胞外小胞、単球由来細胞外小胞など複数のタイプの免疫細胞由来細胞外小胞を同時に特定することができる。
　フローサイトメトリーは処理がとても速く、短時間で何千、何万もの細胞外小胞を定量解析することができるので、表現型解析に適した手法である。フローサイトメトリーによる表現型解析のもう１つの利点は、表現型によりソーティングにより取り分けた細胞外小胞を解析に用いることができることである。このため、解析後の細胞外小胞を解析結果に応じて特定の細胞外小胞集団ごとに機能解析することも可能である。
（ｂ）　イムノアッセイ法
　イムノアッセイ法（例えば、ＥＬＩＳＡ法）を用いた場合、細胞外小胞を固相単体に吸着させたままで検出することもできる。その際には、イムノアッセイ法にあわせて適切に検出物質を含む検出試薬（例えば、酵素標識抗体や該酵素の基質）を選択して使用する。
　イムノアッセイ法（例えばＥＬＩＳＡ法）により細胞外小胞を検出する場合、検出は目的の細胞外小胞に特異的な抗体を結合させ、前記抗体に直接的又は間接的に結合している標識酵素による酵素反応を、適切な基質を用いて検出することで、各種の細胞外小胞の定量ができる。イムノアッセイ法による定量は、比較的簡便に行うことができる点で有利である。
　イムノアッセイ法を用いた、固相担体（基材はウェルプレート、マイクロプレート等の検出用プレート）に固定化した細胞外小胞の定量（定量工程）の例を示す。まず、固相担体上に細胞外小胞を吸着し固定化する。必要に応じて固相担体をブロッキング溶液にてブロッキングした後、目的の細胞外小胞に特異的な抗体（例えば、目的の細胞外小胞の表面上のタンパク質に特異的な抗体）を固相担体に接触させて、細胞外小胞を標識する。洗浄液を用いて余分な抗体を除去した後、必要に応じて（抗体が標識されていない場合）、酵素標識された二次抗体を該抗体に結合させる。その後、洗浄液を用いて余分な抗体を除去した後、前記標識酵素の基質を固相担体に接触させることで、酵素反応を生じさせ、その酵素反応の生成物を検出、定量することで、目的の細胞外小胞の量を定量することができる。
　イムノアッセイ法の中でもＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓａｙ）を用いるのが特に好ましい。ＥＬＩＳＡ法は、試料溶液中に含まれる目的の抗原又は抗体を、特異抗体又は抗原で捕捉するとともに、酵素反応を利用して検出・定量する方法である。
［４］キット
　本発明の細胞外小胞を解析するためのキットは、本発明の細胞外小胞を解析する方法を用いたものであり、細胞外小胞を検出又は定量するために使用される。本発明のキットは、検査・診断に使用できる。
　本発明によれば、従来の超遠心処理を含む方法や免疫沈降法などに比べて、細胞外小胞を簡便な方法で補足及び回収し、それらの特性を高精度で解析することができるので、低いコストで迅速に細胞外小胞の特性を明らかにすることができ、ＥＶ関連製品の開発や様々な疾病の検査・診断に有用である。
　以下に、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、これらは本発明をより良く理解するためのものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
＜イオン交換体固定化スライドグラスの作製＞
　固相担体として、イオン交換体が固定されたスライドグラス（以下、ＤＥＡＥ固定化スライドグラスという。）を用いた。ＤＥＡＥ固定化スライドグラスは、あらかじめアミノ基がコートされているスライドグラスを準備し、前記スライドグラス上のアミノ基に架橋剤としてグルタルアルデヒドを用いて２－ジエチルアミノエチルアミンを結合させ、イオン交換体としてＤＥＡＥを固定することによって行った。ＤＥＡＥ固定化スライドグラスの作製方法の詳細を以下に示す。
　アミノ基コートスライドグラスに、架橋剤として２～５％グルタルアルデヒド溶液（富士フィルム和光純薬社製）を１穴あたり７０μＬ添加し、室温で２時間以上静置した。つぎに、未反応の架橋剤や副生成物を除去するために、イオン交換水でスライドグラスを洗浄した。洗浄後、スライドグラスに、２～５％　２－ジエチルアミノエチルアミン溶液（東京化成工業社製）を１穴あたり７０μＬ添加し、室温で２時間以上静置した。細胞外小胞を固定する直前に、スライドグラス表面をイオン交換水で洗浄して、未反応のイオン交換体や副生成物を除去することで、ＤＥＡＥ固定化スライドグラスを作製した。
　なお本実施例では、すでにアミノ基がコートされているスライドグラスを用意してイオン交換体固定化スライドグラスを作製したが、スライドグラス上へのアミノ基のコートは、例えば、シランカップリング剤（３－アミノプロピルトリエトキシシランなど）により行うことができる。
＜イオン交換体固定化スライドグラスへ細胞外小胞を吸着させる工程＞
　以下の細胞外小胞（ＥＶ）を含むサンプル溶液を用意した。
・真菌（キノコ）由来ＥＶサンプル：キノコ菌糸体培養液を遠心して沈殿物を取り除いた上清液を、真菌（キノコ）由来ＥＶサンプルとした。
・大腸菌由来ＥＶサンプル：ＤＨ５α株由来ＥＶ（コスモ・バイオ社製）を大腸菌由来ＥＶサンプルとして使用した。
・乳酸菌由来ＥＶサンプル：市販の乳酸菌飲料を限外ろ過法（１００　ｋＤａカットのフィルターを使用）により部分精製し、乳酸菌由来ＥＶサンプルとした。
・レモン由来ＥＶサンプル：１００％レモン果汁（ポッカレモン１００；ポッカサッポロフード＆ビバレッジ社）を限外ろ過法（１００　ｋＤａカットのフィルターを使用）により部分精製し、レモン由来ＥＶサンプルとした。
・ヒト尿由来ＥＶサンプル：健常者の尿を採取し、ヒト尿由来ＥＶサンプルとした。
・ヒト血漿由来ＥＶサンプル：健常者の血液を採取又は購入して、ヒト血漿由来ＥＶサンプルを得た。
　ＥＶのイオン交換体固定化スライドグラスへの吸着及び固定は以下の手順により行った。まず、イオン交換体固定化スライドグラスを、イオン交換水で洗浄した後、タッピングすることで未反応のイオン交換体や副生成物を除去した。つぎに、スライドグラスにＥＶを含むサンプル溶液を１穴あたり１０～２０μＬ添加し、室温で３０分静置することで、サンプル溶液中のＥＶをスライドグラスに吸着させて固定した。
＜細胞外小胞を標識する工程＞
　スライドグラスに固定したＥＶを、フローサイトメーターで観察可能にするよう蛍光染色した。蛍光染色は、以下の試薬を使用した。
・ＳＹＴＯ　ＲＮＡ　Ｓｅｌｅｃｔ　Ｇｒｅｅｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｃｅｌｌ　Ｓｔａｉｎ（サーモフィシャー社製）
・Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８標識ヒトＣＤ９　抗体（マウスモノクローナル（ｃｌｏｎｅ　２０９３０６）；Ｒ＆Ｄ社製）
・Ｔｉｄｅ　ＦｌｕｏｒＴＭ５ＷＳ標識抗ヒトＣＤ６３抗体（マウスモノクローナル（８Ａ１２）；コスモ・バイオ社製）
・Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６４７標識ヒトＥＧＦＲ抗体（マウスモノクローナル（ＡＹ１３）；バイオレジェンド社製）
・Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８標識ヒトＥｐＣＡＭ抗体（マウスモノクローナル（９Ｃ４）；バイオレジェンド社製）
・Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６４７標識ヒトＨＥＲ２抗体（マウスモノクローナル（２４Ｄ２）；バイオレジェンド社製）
・Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６４７標識ヒトＧＰＮＭＢ抗体（マウスモノクローナル（Ｄ－９）；サンタクルズ社製）
　ＥＶの蛍光染色は、以下の手順により行った。まず、上記のようにスライドグラスにＥＶを吸着させ固定した後、サンプル溶液上清を取り除き、ブロッキング溶液（２０～１００％　ＦＢＳ－ＰＢＳ）を１穴あたり２０μＬ添加し、室温で３０分間静置することでブロッキングした。ブロッキング溶液を取り除いた後、ＰＢＳにて洗浄を行った。洗浄後、適切な濃度に希釈した蛍光染色試薬（核酸染色試薬又は蛍光標識抗体）を２０μＬ添加して室温で３０分静置した。
　蛍光染色後、試薬上清を取り除き、スライドグラスをイオン交換水で洗浄し、吸引にて水気を取り除き、ＰＢＳを添加してセルスクレイパーにて固定されているＥＶを掻きとった。ＰＢＳに懸濁したＥＶをチューブに採取して、フローサイトメーターを使用してＥＶを解析した。
実施例１
　ヒト血漿由来、ヒト尿由来、レモン由来、真菌（キノコ）由来、乳酸菌由来、及び大腸菌由来のＥＶサンプルを、前述の方法に従って固相担体（ＤＥＡＥ固定化スライドグラス）上に吸着させて固定化し、ＲＮＡ蛍光染色試薬であるＳＹＴＯ　ＲＮＡで染色した後、フローサイトメーターを用いて解析した。結果を図１に示す。
　図１（ａ）はヒト血漿由来ＥＶサンプルの無染色（ネガティブコントロール）の結果を示し、図１（ｂ）はヒト血漿由来ＥＶサンプルをＳＹＴＯで染色したときの結果を示し、図１（ｃ）はヒト尿由来ＥＶサンプルをＳＹＴＯで染色したときの結果を示し、図１（ｄ）はレモン由来ＥＶサンプルをＳＹＴＯで染色したときの結果を示し、図１（ｅ）は真菌由来ＥＶサンプルをＳＹＴＯで染色したときの結果を示し、図１（ｆ）は乳酸菌由来ＥＶサンプルをＳＹＴＯで染色したときの結果を示し、図１（ｇ）は大腸菌由来ＥＶサンプルをＳＹＴＯで染色したときの結果を示す。各グラフとも、横軸は緑色の蛍光強度を示し、縦軸はカウント数（頻度）を示す。
　図１から、本発明の方法により、ヒト、植物、真菌及び細菌由来ＥＶを固相担体（ＤＥＡＥ固定化スライドグラス）に吸着させることができ、それらを蛍光染色してフローサイトメーターにより解析できることが確認できた。また、図１に示すとおり、本発明の方法により固相担体（ＤＥＡＥ固定化スライドグラス）に吸着させた粒子の９割以上がＳＹＴＯ　ＲＮＡで染色されたＲＮＡ＋のＥＶであることから、本発明の方法によると、簡便に、且つ特異的に、ＥＶを高純度で取得することができることが確認できた。さらに、従来の超遠心法による分離では、超遠心の圧力によってＥＶがダメージを受けることが報告されているが（Douglas D. Taylor et.al., Methods, vol. 87, pp.3-10, 2015等参照）、本発明の方法は、そのようなダメージが無い点でも優れているといえる。
　また、本実施例においては、上述のとおり、固相担体に吸着させた粒子をセルスクレイパーで掻きとり、フローサイトメーターに供している。フローサイトメーターにより粒子を解析する本発明の方法においては、抗原抗体反応を保ったまま粒子を剥がす必要がある。そのため、高濃度の塩溶液での処理や超音波処理等の種々の方法を試したが、粒子を十分に剥がすことができなかった。これまでの本技術分野の常識では、スライドグラスに吸着した粒子をセルスクレイパー等で物理的な力を加えて剥がすことは、粒子へのダメージの観点から行われていなかった。ところが、ヒト血漿中の粒子と、ヒト血漿を固相担体（ＤＥＡＥ固定化スライドグラス）に吸着させた後にセルスクレイパーで剥がした粒子とを比較すると、ＦＳＣ×ＳＳＣのパターンや、粒子の平均直径に殆ど変化がなかった（データは示さず）。このように、予想外に、本発明のイオン交換体固定化スライドグラスの場合は、高濃度の塩溶液での処理や超音波処理等種々の方法で剥がすことができなかった粒子を、ダメージを与えることなくセルスクレイパーによって剥がすことができることが、本発明者らによって明らかになった。
実施例２
　ヒト血漿由来ＥＶサンプルを、前述の方法に従って、ＤＥＡＥ固定化スライドグラス上に吸着させて固定化し、ヒトＣＤ９、ヒトＥｐＣＡＭ、ヒトＣＤ６３、ヒトＥＧＦＲ、ヒトＨＥＲ２及びヒトＧＰＮＭＢに対する蛍光標識抗体で染色した後、フローサイトメーターを用いて解析した。結果を図２に示す。
　図２（ａ）～図２（ｃ）は、それぞれ無染色（ネガティブコントロール）の結果、抗ヒトＣＤ９抗体で染色したときの結果、及び抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体で染色したときの結果を示す。各グラフとも、横軸は緑色の蛍光強度を示し、縦軸はカウント数（頻度）を示す。
　図２（ｄ）～図２（ｈ）は、それぞれ無染色（ネガティブコントロール）の結果、抗ヒトＣＤ６３抗体で染色したときの結果、抗ヒトＥＧＦＲ抗体で染色したときの結果、抗ヒトＨＥＲ２抗体で染色したときの結果、及び抗ヒトＧＰＮＭＢ抗体で染色したときの結果を示す。各グラフとも、横軸は赤色の蛍光強度を示し、縦軸はカウント数（頻度）を示す。
　図２から、ヒト血漿由来ＥＶに、エクソソームのマーカーであるＣＤ９及びＣＤ６３が発現していることが確認された。これらの結果から、ヒト血漿由来細胞外小胞を固相担体（ＤＥＡＥ固定化スライドグラス）に吸着させることができ、それらを蛍光染色してフローサイトメーターにより解析できることが確認された。
実施例３
　ヒト尿由来ＥＶサンプルを、前述の方法に従って、ＤＥＡＥ固定化スライドグラス上に吸着させて固定化し、ヒトＣＤ９、ヒトＥｐＣＡＭ、ヒトＣＤ６３、ヒトＥＧＦＲ、ヒトＨＥＲ２及びヒトＧＰＮＭＢに対する蛍光標識抗体で染色した後、フローサイトメーターを用いて解析した。結果を図３に示す。
　図３（ａ）～図３（ｃ）は、それぞれ無染色（ネガティブコントロール）の結果、抗ヒトＣＤ９抗体で染色したときの結果、及び抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体で染色したときの結果を示す。各グラフとも、横軸は緑色の蛍光強度を示し、縦軸はカウント数（頻度）を示す。
　図３（ｄ）～図３（ｈ）は、それぞれ無染色（ネガティブコントロール）の結果、抗ヒトＣＤ６３抗体で染色したときの結果、抗ヒトＥＧＦＲ抗体で染色したときの結果、抗ヒトＨＥＲ２抗体で染色したときの結果、及び抗ヒトＧＰＮＭＢ抗体で染色したときの結果を示す。各グラフとも、横軸は赤色の蛍光強度を示し、縦軸はカウント数（頻度）を示す。
　図３から、ヒト尿由来ＥＶに、エクソソームのマーカーであるＣＤ９及びＣＤ６３が発現していることが確認された。これらの結果から、ヒト尿由来細胞外小胞を固相担体（ＤＥＡＥ固定化スライドグラス）に吸着させることができ、それらを蛍光染色してフローサイトメーターにより解析できることが確認された。

Claims (17)

  1. 　細胞外小胞を解析する方法であって、
    　基材とイオン交換体とを含み、前記細胞外小胞の吸着能を有する固相担体に前記細胞外小胞を吸着させる工程、
    　前記固相担体に吸着した前記細胞外小胞を標識する工程、
    　前記標識された細胞外小胞を前記固相担体に吸着した状態のまま洗浄する工程、及び
    　前記標識された細胞外小胞を検出する工程
    を含む細胞外小胞を解析する方法。
  2. 　請求項１に記載の細胞外小胞を解析する方法において、
    前記洗浄する工程の後に、前記洗浄された細胞外小胞を前記固相担体から脱離する工程を有することを特徴とする細胞外小胞を解析する方法。
  3. 　請求項１又は２に記載の細胞外小胞を解析する方法において、
    前記細胞外小胞を標識する工程は、細胞外小胞検出物質を用いて行うことを特徴とする細胞外小胞を解析する方法。
  4. 　請求項３に記載の細胞外小胞を解析する方法において、
    前記細胞外小胞検出物質が、抗体、レクチン、膜反応性物質、及び核酸反応性物質からなる群より選ばれた少なくとも１種であることを特徴とする細胞外小胞を解析する方法。
  5. 　請求項１に記載の細胞外小胞を解析する方法において、
    　前記細胞外小胞を検出する工程は、イムノアッセイ法によって行うことを特徴とする細胞外小胞を解析する方法。
  6. 　請求項２に記載の細胞外小胞を解析する方法において、
    　前記細胞外小胞を検出する工程は、フローサイトメトリー法によって行うことを特徴とする細胞外小胞を解析する方法。
  7. 　請求項１に記載の細胞外小胞を解析する方法において、
    　前記イオン交換体が二級及び／又は三級アミノ基を部分構造として有する弱陰イオン交換体であることを特徴とする細胞外小胞を解析する方法。
  8. 　請求項７に記載の細胞外小胞を解析する方法において、
    　前記イオン交換体がポリエチレンイミンから誘導される１価残基、又は多価残基であることを特徴とする細胞外小胞を解析する方法。
  9. 　請求項８に記載の細胞外小胞を解析する方法において、
    　前記ポリエチレンイミンが、分岐している高分子量ポリエチレンイミンであることを特徴とする細胞外小胞を解析する方法。
  10. 　請求項７～９のいずれかに記載の細胞外小胞を解析する方法において、
    　前記イオン交換体と前記基材とが連結部を介して又は連結部を介さずに共有結合で結合していることを特徴とする細胞外小胞を解析する方法。
  11. 　請求項１０に記載の細胞外小胞を解析する方法において、
    　前記イオン交換体と前記基材とが連結部を介して結合しており、前記連結部がケイ素－炭素結合を含むことを特徴とする細胞外小胞を解析する方法。
  12. 　請求項１に記載の細胞外小胞を解析する方法において、
    　前記基材がガラス、プラスチック又は金属酸化物からなることを特徴とする細胞外小胞を解析する方法。
  13. 　請求項１に記載の細胞外小胞を解析する方法において、
    　前記基材が板状又は粒子状であることを特徴とする細胞外小胞を解析する方法。
  14. 　請求項１に記載の細胞外小胞を解析する方法において、
    　前記基材がスライドグラスあることを特徴とする細胞外小胞を解析する方法。
  15. 　請求項１に記載の細胞外小胞を解析する方法を用いることを特徴とする細胞外小胞を解析するためのキット。
  16. 　検査・診断に用いるための請求項１９に記載のキット。
  17. 　検査・診断に用いるための請求項１に記載の細胞外小胞を解析する方法。
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