WO2025253985A1

WO2025253985A1 - 間葉系幹細胞培養物の製造方法

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Publication number: WO2025253985A1
Application number: PCT/JP2025/019221
Authority: WO
Inventors: 智宏赤澤; 洋馬渕
Original assignee: Juntendo Educational Foundation
Current assignee: Juntendo Educational Foundation
Priority date: 2024-06-06
Filing date: 2025-05-28
Publication date: 2025-12-11
Anticipated expiration: 2026-12-06

Abstract

間葉系幹細胞培養物の製造方法、間葉系幹細胞培養物、間葉系幹細胞培養物を含む医薬組成物、および間葉細胞の集団を製造する方を提供する。間葉系幹細胞培養物の製造方法は、(a) 間葉系幹細胞の集団を含む組織由来試料を血清飢餓条件または2-デオキシ-D-グルコース（2-DG）含有培地条件で培養し、それにより血清飢餓条件または2-DG含有培地条件を生き残った間葉系幹細胞の培養物を分離する工程を含み、間葉系幹細胞の集団は、個体からの組織由来試料の採取後、血清飢餓条件または2-DG含有培地条件での培養までの間に増殖条件に曝露されない、方法である。

Description

間葉系幹細胞培養物の製造方法

　本開示は、間葉系幹細胞培養物の製造方法、間葉系幹細胞培養物、および間葉系幹細胞培養物を含む医薬組成物に関する。本開示はさらに、間葉細胞の集団を製造する方法に関する。

　間葉系幹細胞（mesenchymal stem cells; MSCs）は、脂肪、骨、軟骨を含む多様な間葉細胞への分化が可能な、非血球系の幹細胞である。間葉系幹細胞は試験管内での増殖能および多様な細胞への分化能を有することから再生医療への広い応用が期待されている。間葉系幹細胞を用いた再生医療の実現に向けて世界中で盛んに研究が行われており、間葉系幹細胞は実際の治療においても既に使用されている。

　間葉系幹細胞は培養を続けると細胞老化（cell senescence）を引き起こすことが知られている。間葉系幹細胞の細胞老化には、ｐ５３経路を含む細胞老化関連遺伝子が関与しており、細胞老化によって、間葉系幹細胞は、増殖能と分化能という治療における使用のために重要な性質を徐々に失う。細胞老化の問題は、間葉系幹細胞を臨床応用する上での大きな問題であり、間葉系幹細胞の治療上の潜在性を制限する大きな要因の一つとなっている。また、従来の間葉系幹細胞試料は、典型的に、未分化な幹細胞以外にも接着性の線維芽細胞等が混入して雑多な細胞集団となっており、幹細胞製剤としての機能低下を引き起こし、老化を促進すると考えられている。

　これまでに、間葉系幹細胞を低血清条件に置くことが試みられている。例えば特許文献１においては、ヒト骨髄または臍帯血から単離された単核細胞群中の成分として調製された間充織幹細胞を、２０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）を含む標準培地で２週間培養して培養皿付着細胞とし、その後同標準培地でさらに３～５代、継代培養し、その後、細胞を、ｂ－ＦＧＦを欠いた０．５％ＦＢＳを含むα改変ＭＥＭ（特許文献１において「飢餓培地」と呼ばれている）に５～７日間置く処理が行われている。特許文献１はこのような「飢餓条件」下での培養工程を含む方法により、間充織幹細胞と対比される多能性細胞（奇形腫を形成できる細胞）を生産することを記載している。

　特許文献２においては、歯髄幹細胞が５％、１０％、または１５％ＦＢＳを含む培養液によって前培養されたのち、同じＦＢＳ濃度の培地を加えてから培地交換を一切行わずに１週間培養することにより「低血清状態」とされたことが記載されている。特許文献３では、生体組織由来細胞を細胞ストレスに暴露し生き残った細胞を回収することを含む多能性幹細胞又は多能性細胞画分を単離する方法を記載しており、多様な細胞ストレスのなかの一つとして「血清飢餓状態での培養」を挙げている。特許文献３の実施例では、販売会社から購入された骨髄間質細胞株を１０％ＦＢＳ含有培地で４～１０代継代したのち、無血清培地で２日間培養したことが記載されている。特許文献３はこのような細胞ストレスに細胞を曝露する工程を含む方法により、間葉系細胞と対比される多能性幹細胞（胚様体様細胞塊を形成できる細胞）を生産することを教示している。

　上記いずれの先行例においても、組織から単離された細胞は、まず高濃度の血清を含有する培地を用いた増殖条件で増殖させられたのちに、低血清条件で培養されている。すなわち、これらの例で開示されている方法は、組織から単離された細胞を増殖条件に曝露しないまま直ちに血清飢餓条件で一定期間培養するという工程を含むものでは無い。

特開2004-057198号公報国際公開第2018/143378号国際公開第2011/007900号

　本開示の様々な実施形態は、間葉系幹細胞培養物の製造方法、間葉系幹細胞培養物、および間葉系幹細胞培養物を含む医薬組成物を提供することを目的とする。本開示の実施形態はさらに、間葉細胞の集団を製造する方法を提供することを目的とする。

　本発明者らは、個体から採取された間葉系幹細胞の集団を含む組織由来試料を、増殖条件に曝露しないまま直接的に血清飢餓条件での培養に移行させ、それにより生き残った間葉系幹細胞の培養物を分離することで、特徴的な遺伝子発現プロファイルおよび代謝的特性を有する間葉系幹細胞（本明細書においてSTAR MSCと呼ぶ）の培養物を高純度で製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。

　本開示の一態様は、間葉系幹細胞培養物の製造方法であって、(a) 間葉系幹細胞の集団を含む組織由来試料を血清飢餓条件または2-デオキシ-D-グルコース（2-DG）含有培地条件で培養し、それにより前記条件を生き残った間葉系幹細胞の培養物を分離する工程を含み、前記間葉系幹細胞の集団は、個体からの前記組織由来試料の採取後、前記条件での培養までの間に増殖条件に曝露されない、方法を提供する。

　本開示の一態様は、間葉系幹細胞培養物であって、(a) 間葉系幹細胞の集団を含む組織由来試料を血清飢餓条件または2-DG含有培地条件で培養し、それにより前記条件を生き残った間葉系幹細胞の培養物を分離する工程を含み、前記間葉系幹細胞の集団は、個体からの前記組織由来試料の採取後、前記条件での培養までの間に増殖条件に曝露されない方法によって製造された、間葉系幹細胞培養物を提供する。

　本開示の一態様は、医薬組成物であって、(a) 間葉系幹細胞の集団を含む組織由来試料を血清飢餓条件または2-DG含有培地条件で培養し、それにより前記条件を生き残った間葉系幹細胞の培養物を分離する工程を含み、前記間葉系幹細胞の集団は、個体からの前記組織由来試料の採取後、前記条件での培養までの間に増殖条件に曝露されない方法によって製造された間葉系幹細胞培養物を含む、医薬組成物を提供する。

　本開示の一態様は、(a) 間葉系幹細胞の集団を含む組織由来試料を血清飢餓条件または2-DG含有培地条件で培養し、それにより前記条件を生き残った間葉系幹細胞の培養物を分離する工程を含み、前記間葉系幹細胞の集団は、個体からの前記組織由来試料の採取後、前記条件での培養までの間に増殖条件に曝露されない方法によって製造された間葉系幹細胞培養物を、さらにインビトロで間葉細胞に分化させることを含む、間葉細胞の集団を製造する方法を提供する。

（A）CFU-FおよびSTAR MSCの単離のための手順の一例を示す。マウスの間葉系幹細胞（MSCs）は、骨髄（bone marrow）試料からのCD45陰性・CD31陰性・Ter119陰性の分画のうち、PdgfrαとSca-1の共陽性細胞を単離することにより精製することができる。マウスの間葉系幹細胞をフローサイトメーターにて単離し、20％または0.2％ FBS含有のDMEM培地にて1週間培養することにより、それぞれCFU-FまたはSTAR MSC細胞が得られる。（B）20% FBS含有培地（左）または0.2% FBS含有培地（中央）で1週間培養されたマウスの間葉系幹細胞培養物の顕微鏡写真。血清飢餓状態（0.2％ FBS）にて培養して得られた間葉系幹細胞であるSTAR MSCについて、20%の血清を含む培地に切り替えてさらに1週間培養することで、細胞が増殖能力を保持していることを確認した（右）。（A）STAR MSCの数の定量化。培養後にフラスコ上に存在するコロニーの数をカウントした。50個以上の細胞からなる細胞集団を間葉系幹細胞コロニーとして数えた。（B）STAR MSCから分化した間葉細胞（脂肪細胞（左）、軟骨細胞（中）、骨芽細胞（右））を示す。（C）マイクロアレイ解析による、CFU-F（20% FBSで培養された）とSTAR MSC（0.2% FBSで培養された）との遺伝子発現の比較を示す。ヒートマップは、赤色のクラスター（右上と左下）が2倍以上の高発現を示した遺伝子群（STAR MSCでは199遺伝子）を、青色のクラスター（左上と右下）が逆に2倍以上の低発現を示した遺伝子（STAR MSCでは492遺伝子）を示す。それぞれのクラスターにおける代表的な遺伝子を右端に示している。 CFU-Fと比べてSTAR MSCで有意な発現量変化が確認された遺伝子を対象とした遺伝子オントロジー（GO）解析の結果を示す。増加したGO Termのリストが（A）に示され、減少したGO Termのリストが（B）に示される。（C）は、（A）に列記されたGO Termを拡大して示している。（D）は、（B）に列記されたGO Termを拡大して示している。遺伝子セットエンリッチメント解析により、CFU-FとSTAR MSCが比較された。細胞周期遺伝子セット（A、左）およびクエン酸（TCA）サイクル遺伝子セット（A、右）によるエンリッチメントスコアを示す。細胞老化遺伝子セット（B、左）およびp53シグナル伝達経路遺伝子セット（B、右）によるエンリッチメントコアを示す。（A）2-DG（糖代謝阻害剤、1 mM）および／またはオリゴマイシン（OligoM）（酸化的リン酸化代謝経路阻害剤、1.5μM）を添加した培地により培養されたSTAR MSCのコロニー形成能力を示す。（B）STAR MSCで高発現している、細胞接着に関与する遺伝子群のうち、発現増加度上位10遺伝子を示す。図６は、2-DG添加培地を使用したSTAR MSCの培養方法の確立を示す。CFU-F細胞（上段）は2-DG非添加の20% FBS培地で、STAR MSC（下段）は2-DGを添加した20% FBS培地で培養し、7日目、14日目および21日目に写真を撮影した。

　以下、本開示の非限定的な実施形態を説明する。本開示は以下の実施形態における例示に限定されない。

[間葉系幹細胞培養物の製造方法]
　一態様において、間葉系幹細胞培養物の製造方法が提供される。この製造方法は、(a) 間葉系幹細胞の集団を含む組織由来試料を血清飢餓条件または2-DG含有培地条件で培養し、それにより前記血清飢餓条件または2-DG含有培地条件を生き残った間葉系幹細胞の培養物を分離する工程を含む。この製造方法において、前記間葉系幹細胞の集団は、個体からの前記組織由来試料の採取後、前記血清飢餓条件または2-DG含有培地条件での培養までの間に増殖条件に曝露されない。

　本開示において、「間葉系幹細胞」は、当業者に理解されるように、非血球系の幹細胞あるいは間質細胞であって、自己複製能力を有し、少なくとも脂肪細胞、骨細胞および軟骨細胞を含む間葉細胞への分化能を有する細胞を意味する。また、細胞の「培養物」は生体外でインビトロ(in vitro)培養された細胞を意味し、例えば間葉系幹細胞の培養物は、間葉系幹細胞、これを維持するための培地組成物、および間葉系幹細胞から分泌された分泌物を含み得る。前記培地組成物は、当業者に知られた、細胞の維持のための成分、例えば、緩衝液系、無機塩類、アミノ酸、核酸塩基類、糖類、脂質、ビタミン類、微量元素、血清、増殖因子、血清、血清代替物（serum replacements）、増殖因子、ホルモン等を必要に応じて含む。また必要に応じて、前記培地組成物は、これらの成分のいずれかを含まないものが使用される。本開示における血清としては、当業者に知られるように哺乳動物の血清を用いることが出来、好ましくは、牛胎仔血清（fetal bovine serum (FBS)、またはfetal calf serum (FCS)とも呼ばれる）を用いることができる。

　「組織由来試料」とは、個体の組織に由来し個体から分離された試料を意味する。本開示の間葉系幹細胞培養物の製造方法の工程(a)で用いられる組織由来試料は、骨髄、脂肪、臍帯、胎盤、または歯髄の組織に由来する試料を含み得る。これらの組織は間葉系幹細胞を含むことが当業者に知られている。骨髄の組織に由来する試料が特に好ましい。これらの組織由来試料は、当業者に知られた方法によって個体から採取することができる。例えば、骨髄穿刺によって個体から採取した骨髄液、分娩の際に個体から放出された臍帯または胎盤の消化物、抜歯の際に歯に付随して採取された歯髄部分等が組織由来試料を提供し得る。

　組織由来試料は、個体からの採取後に様々な処理を受けた組織由来試料であり得る。そのような処理の例には、酵素処理（例えば、結合組織を消化して個々の細胞を分離するためのコラゲナーゼ処理、プロテアーゼ処理等）、夾雑物の除去（例えば動物骨髄試料に含まれ得る骨片の除去）、および関心対象でない細胞の除去または関心対象である細胞の精製もしくは濃縮（例えば純水による赤血球の溶血、密度勾配分離法による単核細胞の単離等）が含まれる。間葉系幹細胞の文脈において、「精製」、「濃縮」、および「単離」という用語は、当業者に通常理解されるように、多様な種類の細胞からなる組織由来試料から間葉系幹細胞の集団を選択的にあるいは優先的に回収して間葉系幹細胞の割合を高めることを表す。あるいは、いくつかの実施形態では、精製、濃縮、または単離されていない組織由来試料を直接、血清飢餓条件での培養に移行させてもよい。血清飢餓条件を生き残る能力は実質的にSTAR MSC細胞に特異的であるからである。

　いくつかの実施形態において、当該方法は、個体からの組織由来試料の採取後、前記血清飢餓条件または2-DG含有培地条件での培養前に、フローサイトメトリーにより間葉系幹細胞について前記組織由来試料を精製することを含み得る。間葉系幹細胞の集団をフローサイトメトリーにより単離する手法は当業者に知られている。典型的には、蛍光物質で標識された、細胞表面マーカー蛋白質に対する抗体を、組織由来試料とインキュベーションすることによって、そのマーカー蛋白質遺伝子を発現する細胞が特異的に蛍光標識される。蛍光標識された細胞は、フローサイトメーターによって他の細胞から分離することが出来る。このような選別のためのマーカー遺伝子としては、当業者によって知られた、間葉系幹細胞特異的に発現する遺伝子を用い得る。また、間葉系幹細胞において発現しないマーカー遺伝子を、負の選択のために用いることもできる。このようなマーカーの非限定的な例としては、ヒトにおけるLNGFR⁺、THY-1⁺、VCAM-1⁺、マウスにおけるPdgfrα⁺、Sca-1⁺、CD45^-、CD31^-、Ter119^-等を挙げることが出来る。ある実施形態では、ヒトの組織由来試料が、LNGFR⁺、THY-1⁺、VCAM-1⁺を含むマーカーの組合せに基づいて間葉系幹細胞について精製される（Stem Cell Reports, Vol. 1, 152-165）。ある実施形態では、マウスの組織由来試料が、Pdgfrα⁺、Sca -1⁺、CD45^-、Ter119^-を含むマーカーの組合せに基づいて間葉系幹細胞について精製される（J. Exp. Med., Vol. 206, No. 11, 2483-2496；Nature Protocols, VOL.7, NO.12, 2012, 2103）。また、後述するSTAR MSCにおいて高発現または低発現する遺伝子の一部をマーカーとして用いて細胞の選択を行ってもよい。このような遺伝子の例としては、Bmp4、Fgfr2、Pparg、Alcam、CD44、Fgf2が挙げられる。

　組織由来試料としては、哺乳類の組織由来試料を用いることが出来、ヒト組織に由来する試料を用いることが好ましい。

　本技術分野において通常、間葉系幹細胞の培養は、牛胎仔血清等の血清または当業者に知られる血清代替物を含む培地で行われるところ、「血清飢餓（serum starvation）」の条件とは、細胞の増殖が妨げられ細胞死が起こる程にまで血清および血清代替物が濃度低減または除去された培地環境に一定時間にわたり細胞が置かれそれゆえに組織由来試料中の大部分（少なくとも過半数）の細胞が死滅する条件を指す。

　本開示における血清飢餓条件は、血清および血清代替物のいずれも含まないかまたはそれらの合計含量が０．００２重量％、０．０２重量％、０．１重量％、０．２重量％、または０．４重量％を超えない培地での培養条件であり得る。当業者に知られているように、「血清代替物」とは、細胞培養において血清の代替となることができる組成物であって、細胞培養物の維持に必要なホルモン、成長因子、蛋白質、脂質、ビタミン、アミノ酸、微量元素、および糖類から選ばれる一つ以上の成分を含むものであり得ることが当業者によって理解される。血清代替品は動物由来の成分を含まないか、僅かにしか含まない（＜１重量％）組成物であり得る。

　血清飢餓条件の代わりにまたはそれに加えて、2-デオキシ-D-グルコース（2-DG）含有培地条件を使用する実施形態も企図される。当業者に知られるように、2-DGは糖代謝（解糖）の阻害剤である。通常、間葉系幹細胞の培養は、細胞が主なエネルギー供給手段として糖代謝を利用できる培地環境で行われるところ、2-DG含有培地条件とは、組織由来試料中の大部分の細胞が死滅または増殖阻害され、2-DG耐性である間葉系幹細胞が選択的に生存または増殖するように培地が2-DGを含有する条件を指す。組織由来試料を2-DG含有培地条件で培養することにより、血清飢餓条件を生き残った間葉系幹細胞の培養物に対応する、酸化的リン酸化経路を利用して生存する間葉系幹細胞の集団が濃縮または単離された培養物を得ることができる。2-DG含有培地条件における2-DGの濃度は例えば０．５～２０ｍＭの範囲内であり得、０．７～１０ｍＭまたは１～５ｍＭの範囲内であってもよい。

　前記工程（a）は、血清飢餓条件または2-DG含有培地条件を生き残った間葉系幹細胞の培養物を分離することを含む。生き残った間葉系幹細胞の培養物を分離することは、血清飢餓条件または2-DG含有培地条件で死滅した細胞を細胞培養物から取り除くことを含み得る。このような分離のために１回以上の培地交換が行われてもよい。通常、生きた間葉系幹細胞は培養基材に付着し続けるのに対し死滅した細胞は培養基材から離れて培地中に浮遊するので、生き残った間葉系幹細胞を容易に分離することができる。また、生き残った間葉系幹細胞を分離するために、フローサイトメーター等のセルソーターによる分離が行われてもよい。

　間葉系幹細胞の集団を含む組織由来試料を血清飢餓条件で培養する期間は、血清飢餓条件の定義に基づき大部分の細胞が死滅する期間であるが、その正確な長さは特に限定されない。前記期間は３日以上、１週間以上、または１ヶ月以上であり得る。前記期間は例えば２カ月以内、または１ヶ月以内であり得る。前記期間は３日以上の期間であることが好ましく、２週間以内の期間であることが好ましい。STAR MSCは血清飢餓条件中で長期間にわたり生存できることが見出された。これらの期間中、新鮮な（ただし、依然として血清および血清代替物が濃度低減または除去された）培地を置き換えてもよい。組織由来試料を2-DG含有培地条件で培養する期間も同様であり、例えば１週間～２カ月であり得る。

　本開示の間葉系幹細胞培養物の製造方法は、間葉系幹細胞の集団が、個体からの組織由来試料の採取後、血清飢餓条件または2-DG含有培地条件での培養までの間に（すなわち血清飢餓条件または2-DG含有培地条件での培養に移行する時点の前に）増殖条件に曝露されないことで特徴付けることができる。このことによって、後述するように、従来の間葉系幹細胞培養物と対比される特徴的な遺伝子発現プロファイルおよび代謝的特性を有するSTAR MSC培養物の単離が促進される。STAR MSCの培養物は、従来の間葉系幹細胞培養物と比較して、幹細胞の純度、未分化状態の維持能力、老化の抑制、等から選択される１つ以上の利点を提供することができる。特定の理論に拘束されないが、豊富な栄養下での活発な増殖による細胞分裂の繰り返しは細胞の老化という悪影響を引き起こし得（例えばテロメアの短縮）、培養物中の混入細胞による悪影響も拡大させ得る。本開示の製造方法はそのような悪影響が起こる前に純粋かつ未老化の間葉系幹細胞の培養物を確立することができる。また、例えば特許文献２のような従来の間葉系幹細胞培養物の調製方法で行われていた前培養段階を含まないため、迅速かつ低コストで純粋な間葉系幹細胞を提供することができる。

　本開示の間葉系幹細胞培養物の製造方法は、前記工程（a）で分離された後の間葉系幹細胞の培養物を、増殖条件に曝露することにより増殖させる工程（b）を含んでもよい。本開示において、細胞の集団に関する「増殖条件」とは、細胞増殖を許容乃至促進させる培養培地環境に一定時間にわたり細胞の集団が置かれ細胞集団としてのダブリングが起こる環境的・時間的要件を指す。細胞集団が増殖条件に曝露されるとは、その細胞集団が増殖条件を充足することを意味する。このような増殖条件は、例えば重量基準で２％超、５％以上、１０％以上、１５％以上、または２０％以上の血清または血清代替物を含む培地での培養条件であり得る。血清または血清代替物の濃度は通常は３０重量％以下である。「増殖条件」に関するこれらの説明は、前記工程（b）における「増殖条件」のみならず、上述したように個体からの組織由来試料の採取後、血清飢餓条件または2-DG含有培地条件での培養までの間に間葉系幹細胞の集団が「増殖条件に曝露されない」という場合の増殖条件にも同様に当てはまる。

　特定の実施形態において、例えば工程（a）で血清飢餓条件が使用された場合において、工程(b)の増殖条件で使用される培地は、2-デオキシ-D-グルコースを含み得る。例えば、上記の血清または血清代替物に加えて、０．１～１０ｍＭまたは０．５～２ｍＭの2-デオキシ-D-グルコースが培地に含まれ得る。培地に2-デオキシ-D-グルコースを添加することにより、酸化的リン酸化を利用して生存および増殖する間葉系幹細胞の集団の維持を促進することができる。

[間葉系幹細胞培養物]
　本開示の別の態様において、間葉系幹細胞培養物であって、上述した方法、すなわち、(a) 間葉系幹細胞の集団を含む組織由来試料を血清飢餓条件または2-DG含有培地条件で培養し、それにより前記条件を生き残った間葉系幹細胞の培養物を分離する工程を含み、前記間葉系幹細胞の集団は、個体からの前記組織由来試料の採取後、前記条件での培養までの間に増殖条件に曝露されない方法によって製造された、間葉系幹細胞培養物が提供される。この間葉系幹細胞培養物の諸要素（製造に用いる細胞とその由来、培地成分、血清飢餓条件、増殖条件、培養期間等を含む）については、上記製造方法の実施形態に関連して提供された説明を適用することができる。

　本実施形態の間葉系幹細胞培養物は、血清飢餓条件または2-DG含有培地条件での培養の代わりに増殖条件で培養された対応培養物と比べて、（i）Bmp4およびFgfr2から選択される遺伝子の１つ以上もしくは全ての発現量が増加している、（ii）Pparg、Alcam、CD44、およびFgf2から選択される遺伝子の１つ以上もしくは全ての発現量が減少している、または（i）と（ii）の両方に該当し得る。ここでいう発現量はmRNAレベルでの発現量または蛋白質レベルでの発現量であり得、mRNAレベルでの発現量であることが好ましい。発現量の有意な増加または減少を決定する方法は当業者に知られており、例えば倍数変化（fold change）で１．４倍以上または２倍以上の増加または減少であり得る。

　一般に「colony forming unit-fibroblast (CFU-F)」とは、間葉系幹細胞等の幹細胞が分化して生じた線維芽細胞の集団を意味し、そのコロニー数は元の細胞集団に含まれた間葉系幹細胞の数を反映するものと当業者によって理解される。これに対して、本段落を除く、本開示の記載においては、「CFU-F」という用語は、「CFU-Fに分化する能力を有する間葉系幹細胞」の集団を意味するものとして用いられる。また、CFU-F（20% FBS）という用語は、CFU-Fに分化する能力を有する間葉系幹細胞の集団であって、組織由来試料が個体から単離された後、血清飢餓条件（または2-DG含有培地条件）で培養されずに、20% FBSを含む増殖条件に曝露されて培養された間葉系幹細胞の集団を指す。CFU-F（20% FBS）は下記の本願実施例において、対照として用いられる。

　また、STAR MSCとは、本開示における間葉系幹細胞培養物の製造方法によって取得することができる間葉系幹細胞を意味し、STAR MSC（0.2% FBS）は、STAR MSCのうち、工程（a）における血清飢餓条件を0.2% FBS含有培地で培養する条件として取得した間葉系幹細胞を意味する。

[医薬組成物]
　本開示の一態様において、医薬組成物であって、上述した方法、すなわち、(a) 間葉系幹細胞の集団を含む組織由来試料を血清飢餓条件または2-DG含有培地条件で培養し、それにより前記条件を生き残った間葉系幹細胞の培養物を分離する工程を含み、前記間葉系幹細胞の集団は、個体からの前記組織由来試料の採取後、前記条件での培養までの間に増殖条件に曝露されない方法によって製造された間葉系幹細胞培養物を含む、医薬組成物が提供される。

　この医薬組成物の諸要素については、上記製造方法および間葉系幹細胞培養物の実施形態に関連して提供された説明を適用することができる。本実施形態の投与対象は、哺乳動物であり、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、またはウマが好ましく、ヒトがより好ましい。本実施形態の医薬組成物は、間葉系幹細胞の他に、薬学的に許容される担体または賦形剤を含み得る。生存状態の細胞を維持できる担体および賦形剤は当業者に知られている。本実施形態の医薬組成物は典型的に水性懸濁液の形態で提供される。

[間葉細胞の集団を製造する方法]
　本開示の一態様において、間葉細胞の集団を製造する方法が提供される。この方法は、上述した方法、すなわち、(a) 間葉系幹細胞の集団を含む組織由来試料を血清飢餓条件または2-DG含有培地条件で培養し、それにより前記条件を生き残った間葉系幹細胞の培養物を分離する工程を含み、前記間葉系幹細胞の集団は、個体からの前記組織由来試料の採取後、前記条件での培養までの間に増殖条件に曝露されない方法によって製造された間葉系幹細胞培養物を、さらに、インビトロで間葉細胞に分化させることを含む。

　この間葉細胞の集団を製造する方法の諸要素については、上記製造方法、間葉系幹細胞および医薬組成物の実施形態に関連して提供された説明を適用することができる。

　本開示の間葉細胞の集団を製造する方法において、間葉系幹細胞培養物を、インビトロで間葉細胞に分化させることは、上記の製造方法で得られた間葉系幹細胞を、当業者によって知られた方法で間葉細胞に分化させることを含む。前記間葉細胞は、好ましくは脂肪細胞、骨芽細胞、または軟骨細胞であるが、これ以外の間葉系分化細胞でもあり得る。

　間葉系幹細胞を間葉細胞に分化させる手法自体は当業者に知られている。本開示の間葉細胞の集団を製造する方法において、脂肪細胞への分化誘導は、例えば脂肪分化誘導培地（#PT-3004、Lonza）等の分化用培地中で間葉系幹細胞を培養することにより行うことが出来る。脂肪細胞への分化は、Oil red O等の染料による当業者によって知られた染色法によって確認することが出来る。本開示の間葉細胞の集団を製造する方法において、骨芽細胞への分化誘導は、例えば骨芽分化誘導培地（#PT-3002、Lonza）等の分化用培地中で間葉系幹細胞を培養することにより行うことが出来る。骨芽細胞への分化は、Alizarin Red等の染料による、当業者によって知られた染色法によって確認することができる。本開示の間葉細胞の集団を製造する方法において、軟骨細胞への分化誘導は、例えば軟骨分化誘導培地（#PT-3003、Lonza）等の分化用培地中で間葉系幹細胞を培養することにより行うことが出来る。軟骨細胞への分化は、Toluidine Blue等の染料による、当業者によって知られた染色法によって確認することができる。

　本明細書において、「Ａ～Ｂ」（あるいは「ＡからＢまで」または「ＡとＢの間」）という表現を用いて示された数値範囲は、記載された数値ＡおよびＢをそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示し、また、その最小値および／または最大値を除外した範囲も包含する。また、上記「Ａ～Ｂ」等の記載は、「Ａ以上」または「Ａ超」という範囲、および「Ｂ以下」または「Ｂ未満」という範囲の文言的根拠も提供すると解される。複数の数値範囲が記載されている場合は、或る記載された数値範囲の上限値または下限値は、別の記載された数値範囲の上限値または下限値と組み合わせることができ、そのように組み合わされてできる数値範囲も本願において開示されていると解する。本明細書において、「Ａを含む」または「Ａを有する」という表現は、文脈に反しない限り、Ａと合わせてＡ以外のものも含む対象物を意味しており、また、Ａ以外のものを含まずＡのみを含む対象物すなわちＡからなる対象物の文言的根拠もその記載に包含され、その逆も然りであると解される。単数の対象物への言及は、複数の対象物が使用される実施形態の開示も包含していると解される。

　以下に本発明の実施例を記載するが、本発明の実施形態は以下に示す特定の例に限定されない。

　材料と方法
　1. 間葉系幹細胞（MSCs）の単離・培養
　本質的にNature Protocols, VOL.7, NO.12, 2012, 2103に記述された方法に従ってMSCsを単離した。6週齢オスのマウス（C57BL/6 J）大腿骨および脛骨の骨髄から採取した組織試料を0.2%コラゲナーゼ溶液に入れ、37℃、110 rpm、60分振盪してコラゲナーゼ処理した。70μmフィルター（BD Falcon）を用いて骨片を除去した後、滅菌水を用いて赤血球を溶血し除去した。これによって得られた細胞をHBSS+に懸濁し、CD45、CD31、Ter119、Sca-1、およびPDGFRαのそれぞれに対する抗体を添加し、30分氷上で抗体染色した。CD45(-)、CD31(-)、Ter119(-)、Sca-1(+)、Pdgfrα(+)の細胞（PαS細胞）をフローサイトメーターによって単離した。単離された試料は、MSCsについて精製された組織由来試料である。この組織由来試料を、0.2%または20%のFBSを含むMSC培地で満たされた培養皿へ播種した。0.2% FBSでの培養は、血清飢餓条件を提供する。マウスからの骨髄由来試料の採取からこの培養皿へ播種までの間に、MSCs試料は増殖条件に曝露されなかった。上記と同じFBS濃度を有するMSCs培地の交換を3,4日ごとに行った。また、同様にPαS細胞を2000個ソーティングし、血清飢餓条件での培養後、colony forming unit-fibroblast（CFU-F）解析および分化能力解析の実験に用いた。
　上記間葉系幹細胞（MSCs）の単離および培養において用いた0.2%コラゲナーゼ溶液、HBSS+、およびMSCs培地の組成は以下の通りであった。
・0.2%コラゲナーゼ溶液
　20 mL DMEM（Dulbecco’s modified Eagle's medium）
　10 mM HEPES
　1% ペニシリン-ストレプトマイシン
　0.2% コラゲナーゼ
　500U DNase I
　4 ng/mL DISPASE II
・HBSS+（calcium- and magnesium-free Hank’s-Balanced Salt溶液）
　500 mL DMEM
　2% FBS
　10 mM HEPES
　1% ペニシリン-ストレプトマイシン
・MSCs培地
　DMEM glutamax（#10569-010, gibco）
　0.2または20% FBS
　5μg/mL bFGF（塩基性線維芽細胞増殖因子）
　1% ペニシリン-ストレプトマイシン

　2. コロニー形成能力解析
　コロニー形成能力を解析するため、細胞を100 mmディッシュにて、以下に組成を示す間葉系幹細胞通常培地で14日間培養した。培養した細胞を4%パラホルムアルデヒドで10分間固定し、以下に組成を示すクリスタルバイオレット染色液を用いて20分間室温で染色した後PBSで洗浄し、50個以上の細胞を含むコロニーの数をカウントした。
・間葉系幹細胞通常培地
　DMEM glutamax（#10569-010, gibco）
　20% FBS
　5 ng/mL b-FGF（塩基性線維芽細胞増殖因子）
　1% ペニシリン-ストレプトマイシン
　1% HEPES
・クリスタルバイオレット染色液
　10 mg/mL クリスタルバイオレット
　50%(v/v) メタノール
　50%(v/v) 4%パラホルムアルデヒド

　3. 脂肪細胞への分化誘導
　24 wellプレートに2.0 × 10⁵cells/wellの密度で細胞を播種した。細胞がコンフルエントに達するまで培養した。100%コンフルエントに達したら、脂肪分化誘導培地（#PT-3004、Lonza）を用いて分化誘導を行った。分化誘導は、2サイクルの誘導培地／メンテナンス培地で誘導した。すなわち、1サイクルあたり、脂肪分化誘導培地で4日間培養した後、メンテナンス培地で3日間の培養を行なった。培養は37℃, 5%CO₂インキュベーターで行った。
　脂肪細胞分化したCD73陽性細胞をOil red O染色した。具体的には、4%パラホルムアルデヒドで10分間室温にて細胞を固定し、その後PBSで3回洗浄し、60%イソプロピルアルコールで30秒間室温にて処理した。脂肪染色用Oil red O染色原液と超純水を3:2で混合した染色溶液を用いて、遮光、室温下で30分間染色を行った。染色後、60%イソプロピルアルコールで30秒間室温にて処理し、PBSで3回洗浄した。赤色で染色された脂肪滴を有する細胞を脂肪細胞として解析した。

　4. 骨芽細胞への分化誘導
　24wellプレートに5.0 × 10⁴ cells/wellの密度で細胞を播種した。3日間培養後、骨芽分化誘導培地（#PT-3002、Lonza）（基礎培地、Dexamethasone、L-glutamine、Ascorbate、Penicillin/streptomycin, MCGS、およびβ-glycerophosphateを含む）を用いて37℃, 5%CO₂インキュベーター内で14日間培養した。3～4日毎に骨芽分化誘導培地の培地交換を行った。
　骨芽細胞分化したCD73陽性細胞をAlizarin Red染色した。具体的には、4%パラホルムアルデヒドで10分間室温にて細胞を固定後、PBSで3回洗浄した。その後、Osteogenesis Quantitation Kit（#ECM815、Merck Millipore Corporation）のAlizarin Red Solution を用いて室温で20分間細胞を染色した。染色後、超純水で4回洗浄した。赤色にて染色されたカルシウム沈着を指標に、骨芽細胞への分化を定量的に解析した。

　5. 軟骨細胞への分化誘導
　15 mLポリプロピレンチューブに1.0 × 10⁶ cells/本の細胞を入れた。チューブを309 g、4℃で5分間遠心した。遠心後、上清を除去し軟骨分化誘導培地（#PT-3003、Lonza）（軟骨細胞基礎培地、dexamethasone、ascorbate、ITS+supplement、GA-1000、sodium pyruvate, proline、L-glutamine、10 ng/ml TGF-β3、500 ng/mL Recombinant Human BMP-6を含む）を加え細胞を懸濁した。その後、150 g、4℃で5分間遠心した。遠心後、CO₂ガス交換のためにチューブのキャップを半分緩め37℃, 5%CO₂インキュベーター内で21日間培養した。3～4日毎に軟骨分化誘導培地の培地交換を行った。
　軟骨分化したCD73陽性細胞に対しパラフィン包埋処理を行い、Toluidine Blue染色を行った。

　6. 代謝阻害剤によるSTAR MSCの生存率の解析
　マウス大腿骨よりPαS細胞を2000個ソーティングし、100 mmディッシュ中の0.2％FBS培養液にて培養した。その際、下記のいずれかの添加物を添加した群を用意した。
　(1) 2-DG（糖代謝阻害剤、1 mM）
　(2) オリゴマイシン（酸化的リン酸化代謝経路阻害剤、1.5μM）
　(3) 2-DG（1 mM）およびオリゴマイシン（1.5μM）
　(4) 何も添加しない群
　上記の条件で1週間培養したのち、20% FBSの培養液にて細胞増殖を活性化して、形成されたコロニーをカウントすることで、(1)～(4)の各処理を経た後の細胞生存率を推定し比較した。

　実施例１
　間葉系幹細胞（MSCs）試料は一般的に高濃度（10%～20%）の血清を含む培地で培養され、この培養条件下において細胞増殖が活発になる。しかし高濃度血清の培養条件は生体内環境とは大きく異なり、遺伝子発現および細胞性質に差異を引き起こす。本発明者らはマウス成体の骨髄（BM）からMSCs（PDGFRα⁺ SCA-1⁺ 細胞）を単離し、その後、通常の血清濃度（20%）で１週間培養したものと、血清濃度を100分の1（0.2%）まで低下させた培地で１週間培養したもの（血清飢餓条件）と、を比較した（図1A）。通常血清濃度（20%）で培養した場合（図1B「FBS 20%」）に細胞は増殖したが、低血清濃度（0.2%）の培地で培養されたMSCs試料は、実質的に増殖しないどころか、大多数の細胞が死滅した。しかしながら、ごく少数の細胞は低血清濃度条件を生き残っていたと見られた（図1B「FBS 0.2％」；枠で囲った単一細胞の拡大写真を左下に示している）。

　低血清濃度で培養した後、培地を通常の高濃度血清（20%）に交換すると、生き残っていた少数のMSCsの細胞増殖は活発化した（図1B「FBS 0.2%→20%」）。コロニーを形成する細胞を定量すると、通常培養を経たコロニー形成細胞（CFU-F）と比べて、1/7程度の数の細胞がこの特定の低血清条件で生存できていたと見られた（図2A）。低血清条件（血清飢餓条件）で生存できる細胞は、飢餓（starvation）に耐えることができるCFU-Fであることにちなんで、STAR MSCと名付けられた。STAR MSCは、自己複製する能力を有するとともに、脂肪細胞、軟骨細胞、および骨芽細胞に分化する能力が高く、MSCsの特性を示していた（図2B）。同様の実験で、STAR MSCは血清飢餓条件下で１カ月以上でも生存し続けられること、および、ヒト組織からもSTAR MSCを分離できることが確認された（データは図示してない）。

　実施例２
　発明者らはCFU-F（20%血清）とSTAR MSC（0.2%血清）からmRNAを抽出し、マイクロアレイを用いて、網羅的な遺伝子発現解析を行った。両者を比較すると、低血清濃度で培養された細胞において有意な（倍数変化で２倍以上の）高発現を示す１９９個の遺伝子と、高血清濃度で培養された細胞において有意な（倍数変化で２倍以上の）高発現を示す４９２個の遺伝子が同定された（図2C）。STAR MSCでは、発生段階に重要なBmp4とFgfr2の発現が高く、MSCsの分化成熟に関連する遺伝子（Pparg、Alcam、CD44、Fgf2）の発現が減少していることが観察された（図2C）。

　遺伝子オントロジー（GO）解析では、CFU-F（20%血清）とSTAR MSC（0.2%血清）との間で遺伝子発現の2倍以上の変動が確認された遺伝子群について、それぞれが関与することが知られる遺伝子機能を調べた（図3）。その結果、STAR MSCでは代謝関連GO termが顕著に上昇しており（図3A,C）、一方で細胞周期に関与するGO termが低下していた（図3B,D）。

　当業者に知られる手法による遺伝子セットエンリッチメント解析（GSEA解析）は、CFU-Fと比べてSTAR MSCでは細胞周期（図4A左）およびクエン酸サイクル（TCAサイクル）（図4A右）に関連する遺伝子の発現相関が減少していることを示した。一方、STAR MSCはCFU-Fよりも細胞老化（図4B左）およびp53シグナル伝達経路（図4B右）に関連する遺伝子セットの発現レベルが低いことが示された。以上のことから、CFU-Fと比較してSTAR MSCは、未分化状態を保っており老化が抑制された状態であると示唆される。

　STAR MSCではクエン酸サイクルに関連する遺伝子の発現が減少していると同時に、酸化的リン酸化代謝経路に関連する遺伝子の発現が上昇していたことが観察された。そこで、2-デオキシ-D-グルコースすなわち2-DG（糖代謝阻害剤）および／またはオリゴマイシン（酸化的リン酸化代謝経路の阻害剤）を添加してSTAR MSCを培養する実験を行った。その結果、STAR MSCは2-DG単独による糖代謝の阻害によってはほとんど生存に影響を受けないと見られたのに対し（図5A左）、オリゴマイシン単独の添加による酸化的リン酸化代謝経路の阻害により細胞死が引き起こされ生存率が著しく減少されたことが示された（図5A中央）。糖代謝と酸化的リン酸化代謝の両方を同時に阻害するとSTAR MSCも実質的に生存能を失うと見られた（図5A右）。STAR MSCは、酸化的リン酸化代謝経路を利用して血清飢餓状態を生き延びていることが示唆された。

　STAR MSCで発現増加していた細胞接着に関連する遺伝子群のうち発現増加度トップ10の遺伝子の発現ヒートマップを図5Bに示している。Icam1、Itgb8、およびCD274（PD-L1; 免疫調節回避に関与）遺伝子の高発現が示されている。

　実施例３
　次に発明者らは、STAR MSCの性質を保ったままそれを増殖させることができるかを検証する実験を行った。2-DG（解糖系の経路を阻害）が添加された20% FBS含有培地にて間葉系幹細胞を3週間培養した。その結果、2-DGの存在下で培養されたSTAR MSCは、2-DGの非存在下で培養されたCFU-Fと比較して細胞増殖速度はゆっくりではあるが、増殖することがわかった（図6）。STAR MSCの形態はCFU-Fと異なっており、小さな細胞体を持つ均一な細胞であった（図6）。2-DGは、STAR MSCの選別および維持の両方に使用することができた。

　本発明の実施形態は以下のものを含む。
［項１］
　間葉系幹細胞培養物の製造方法であって、
　(a) 間葉系幹細胞の集団を含む組織由来試料を血清飢餓条件または2-デオキシ-D-グルコース（2-DG）含有培地条件で培養し、それにより前記血清飢餓条件または2-DG含有培地条件を生き残った間葉系幹細胞の培養物を分離する工程
を含み、前記間葉系幹細胞の集団は、個体からの前記組織由来試料の採取後、前記血清飢餓条件または2-DG含有培地条件での培養までの間に増殖条件に曝露されない、方法。
［項２］
　前記血清飢餓条件は、血清および血清代替物のいずれも含まないかまたはそれらの合計含量が０．４重量％を超えない培地での培養条件である、項１に記載の方法。
［項３］
　前記血清飢餓条件または2-DG含有培地条件での培養が３日以上、１週間以上、または１ヶ月以上行われる、項１または２に記載の方法。
［項４］
　前記組織由来試料は、骨髄、脂肪、臍帯、胎盤、または歯髄の組織に由来する試料を含む、項１～３のいずれか一項に記載の方法。
［項５］
　前記組織由来試料はヒトの組織に由来する試料である、項１～４のいずれか一項に記載の方法。
［項６］
　個体からの前記組織由来試料の採取後、前記血清飢餓条件または2-DG含有培地条件での培養前に、フローサイトメトリーにより間葉系幹細胞について前記組織由来試料を精製することを含む、項１～５のいずれか一項に記載の方法。
［項７］
　前記工程(a)で分離された後の間葉系幹細胞の培養物を、増殖条件に曝露することにより増殖させる工程(b)をさらに含む、項１～６のいずれか一項に記載の方法。
［項８］
　前記工程(b)の増殖条件は、２重量％超の血清または血清代替物を含む培地での培養条件である、項７に記載の方法。
［項９］
　前記工程(b)の増殖条件で使用される培地が、2-デオキシ-D-グルコースを含む、項７または８に記載の方法。
［項１０］
　項１～９のいずれか一項に記載の方法によって製造された、間葉系幹細胞培養物。
［項１１］
　項１０に記載の間葉系幹細胞培養物を含む、医薬組成物。
［項１２］
　間葉細胞の集団を製造する方法であって、項１～９のいずれか一項に記載の方法によって製造された間葉系幹細胞培養物をインビトロで間葉細胞に分化させることを含む、方法。
［項１３］
　前記間葉細胞は脂肪細胞、骨芽細胞、または軟骨細胞を含む、項１２に記載の方法。

　上記いくつかの実施形態を参照して本発明を説明したが、本発明は上記個々の実施形態に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明の趣旨の範囲内で様々な変更を加えられることを、本開示を参照した当業者は理解するであろう。

Claims

　間葉系幹細胞培養物の製造方法であって、
　(a) 間葉系幹細胞の集団を含む組織由来試料を血清飢餓条件または2-デオキシ-D-グルコース（2-DG）含有培地条件で培養し、それにより前記血清飢餓条件または2-DG含有培地条件を生き残った間葉系幹細胞の培養物を分離する工程
を含み、前記間葉系幹細胞の集団は、個体からの前記組織由来試料の採取後、前記血清飢餓条件または2-DG含有培地条件での培養までの間に増殖条件に曝露されない、方法。
　前記血清飢餓条件は、血清および血清代替物のいずれも含まないかまたはそれらの合計含量が０．４重量％を超えない培地での培養条件である、請求項１に記載の方法。
　前記血清飢餓条件または2-DG含有培地条件での培養が３日以上、１週間以上、または１ヶ月以上行われる、請求項１に記載の方法。
　前記組織由来試料は、骨髄、脂肪、臍帯、胎盤、または歯髄の組織に由来する試料を含む、請求項１に記載の方法。
　前記組織由来試料はヒトの組織に由来する試料である、請求項１に記載の方法。
　個体からの前記組織由来試料の採取後、前記血清飢餓条件または2-DG含有培地条件での培養前に、フローサイトメトリーにより間葉系幹細胞について前記組織由来試料を精製することを含む、請求項１に記載の方法。
　前記工程(a)で分離された後の間葉系幹細胞の培養物を、増殖条件に曝露することにより増殖させる工程(b)をさらに含む、請求項１に記載の方法。
　前記工程(b)の増殖条件は、２重量％超の血清または血清代替物を含む培地での培養条件である、請求項７に記載の方法。
　前記工程(b)の増殖条件で使用される培地が、2-デオキシ-D-グルコースを含む、請求項７に記載の方法。
　請求項１～９のいずれか一項に記載の方法によって製造された、間葉系幹細胞培養物。
　請求項１０に記載の間葉系幹細胞培養物を含む、医薬組成物。
　間葉細胞の集団を製造する方法であって、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法によって製造された間葉系幹細胞培養物をインビトロで間葉細胞に分化させることを含む、方法。
　前記間葉細胞は脂肪細胞、骨芽細胞、または軟骨細胞を含む、請求項１２に記載の方法。