WO2025178393A1

WO2025178393A1 - 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드를 함유하는 피부 개선용 화장료 조성물

Info

Publication number: WO2025178393A1
Application number: PCT/KR2025/002464
Authority: WO
Inventors: 강성수; 전승현
Original assignee: LG H&H Co Ltd
Current assignee: LG H&H Co Ltd
Priority date: 2024-02-23
Filing date: 2025-02-21
Publication date: 2025-08-28
Anticipated expiration: 2026-08-23

Abstract

니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드를 함유하는 피부 개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드의 세포내 역가가 향상된 화장료 조성물로 피부 세포내로 전달되는 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드 농도를 상승시키고, 피부 노화 억제, 피부 결 개선, 주름 및 탄력 개선, 피부 재생 및 피부 장벽 강화 효과를 제공하는 것이다.

Description

니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드를 함유하는 피부 개선용 화장료 조성물

니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드를 함유하는 피부 개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 니코틴아마이이드 아데닌 다이뉴클레오타이드, 글리시르레틴산 및 쿼세틴 조합을 포함하는 화장료 조성물로 피부 세포내로 전달되는 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드 양을 늘이고, 피부 노화 억제효과를 제공하는 것이다.

니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드는 생화학적으로 매우 불안정한 특성이 있다. 그래서 피부 개선효과가 체감되려면 화장품에 과량으로 배합해야 하고, 그럼에도 불구하고 항상성 조절 기작으로 인해 그 효과가 제한되는 문제점이 있다.

이러한 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드의 세포내 역가문제를 해결하기 위한 대체재로 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드 유도체인 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드 인산(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADP)이 있으나, 이 유도체가 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드만큼 충분한 피부 노화 억제 효과가 있는지는 불분명하다.

이러한 배경하에, 본 발명자들은 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드의 세포내 역가 문제를 해결하고자 니코틴아마이이드 아데닌 다이뉴클레오타이드, 글리시르레틴산, 및 쿼세틴 조합을 사용하여 화장료 조성물을 제조하면, 종래 역가 문제를 해결하고 안정성을 확보하며, 피부에 도포시 피부 세포 내로 전달된 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드 양이 여러 기작에 의해 감소하지 않고, 피부 노화 억제 효과를 제공하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 외래 유래 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드의 역가를 향상시키는 화장료 조성물을 제공하고자 한다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

전술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 제1양태는, 니코틴아마이이드 아데닌 다이뉴클레오타이드; 글리시르레틴산; 및 쿼세틴;을 포함하는, 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

전술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 제2양태는, 니코틴아마이이드 아데닌 다이뉴클레오타이드; 글리시르레틴산; 쿼세틴; 및 시토스테롤 또는 토코페릴 아세테이트를 포함하는, 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

이하, 본 발명을 보다 자세히 설명한다.

본 발명의 용어, “니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(Nicotinamide adenine dinucleotide, NAD+)”은 비타민 B3의 하나인 니코틴아마이드를 기반으로 만들어지며, 세포 내에서 산화 환원과 같은 생화학 반응에서 전자 전달체로 작동한다. 또한 피부 세포 에너지 생성, 스트레스 완화, DNA 복구, 염증 조절 등 피부 노화 예방에 중요한 역할을 한다. 나이가 들면서 피부 세포 내에서 NAD+ 농도가 자연스럽게 감소하고, 이로 인해 피부의 자연 재생 능력이 약화되며 노화가 촉진된다. 따라서 피부 세포 내 NAD+ 수준을 유지하거나 증가시키는 방법은 피부 노화를 완화하는데 중요한 전략으로 연구되고 있다.

상술한 바와 같이, NAD+는 생화학적으로 매우 불한정한 특성으로 인하여, 직접적으로 화장료 조성물에 포함하는 사례는 매우 드물다. 또한, NAD+가 세포 내에서 빠르게 비활성형으로 전환되어, 피부 도포시 충분한 항노화 및 주름 개선 효과를 기대하기 어려운 문제점이 있다.

이에, 본 발명은 NAD+를 피부에 도포 시 세포 내에서 농도 및 생체활성도를 높게 유지시키기 위해 글리시르레틴산, 쿼세틴 및 시토스테롤 또는 토코페릴 아세테이트를 함께 사용하여 상기 문제점을 해소하고자 하였다.

본 발명의 용어, “글리시르레틴산(Glycyrrhetinic acid)”은 감초의 주요 활성 성분 중 하나로 피부진정, 항염증, 항산화, 향균 특성을 가지고 있다. 피부 자극을 줄이고 외부 자극으로부터 피부를 보호하여 건강항 피부 상태를 유지하는 효과를 위해 화장료 조성물에 포함되기도 한다.

상기 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴틀레오타이드 및 글리시르레틴산은 1: 0.0004 내지 1 : 0.4, 1: 0.0004 내지 1 : 0.3, 1: 0.0004 내지 1 : 0.25, 1 : 0.004 내지 1 : 0.4, 1: 0.004 내지 1 : 0.3, 1: 0.004 내지 1 : 0.25, 1: 0.01 내지 1 : 0.4, 1: 0.01 내지 1 : 0.3 또는 1 : 0.01 내지 1 : 0.25의 중량비로 포함될 수 있다.

본 발명의 용어, '쿼세틴(Quercetin)'은 플라보노이드 계열의 폴리페놀 화합물로, 자연적으로 과일, 채소, 잎, 씨앗, 곡물 등 다양한 식물에서 발견된다. 강력한 항산화제이며, 항염증, 항균, 항알레르기, 항암 작용등 다방면에서 생리활성을 가진 물질로 알려져 있다. 특히, 피부 노화를 방지하고 손상된 피부를 회복하며, 자극 및 염증을 완화하는데 유효하다.

상기 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴틀레오타이드 쿼세틴은 1: 0.0004 내지 1 : 0.4, 1: 0.0004 내지 1 : 0.3, 1: 0.0004 내지 1 : 0.25, 1 : 0.004 내지 1 : 0.4, 1: 0.004 내지 1 : 0.3, 1: 0.004 내지 1 : 0.25, 1: 0.01 내지 1 : 0.4, 1: 0.01 내지 1 : 0.3 또는 1 : 0.01 내지 1 : 0.25의 중량비로 포함될 수 있다.

본 발명의 용어, '시토스테롤(Sitosterol)'은 식물성 스테롤의 한 종류로, 스테로이드 구조를 가지며 천연유래 물질이다. 주로 콩, 밀, 옥수수 땅콩, 참깨 등 식물성 기름에서 추출된다. 특히, 보습, 항염, 항산화, 유화 안정화 등의 기능을 통해 피부를 보호하고 진정시키며, 손상된 피부를 회복 효과를 제공한다.

상기 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴틀레오타이드 및 시토스테롤은 1: 0.0004 내지 1 : 0.4, 1: 0.0004 내지 1 : 0.3, 1: 0.0004 내지 1 : 0.25, 1 : 0.004 내지 1 : 0.4, 1: 0.004 내지 1 : 0.3, 1: 0.004 내지 1 : 0.25, 1: 0.01 내지 1 : 0.4, 1: 0.01 내지 1 : 0.3 또는 1 : 0.01 내지 1 : 0.25의 중량비로 포함될 수 있다.

본 발명의 용어, '토코페릴 아세테이트(Tocopheryl acetate)'은 비타민 E의 유도체로, 아세트산과 결합된 합성 화합물이다. 강력한 항산화제로 알려진 비타민E(토코페롤)는 빛과 열에 민감하여 화장품에서 쉽게 분해되지만, 토코페릴 아세테이트는 이런 조건에서 더 안정적이다. 토코페릴 아세테이트는 항산화, 피부 보호, 재생, 보습, 피부 개선 효과를 제공한다.

상기 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴틀레오타이드 및 토코페릴 아세테이트는 1: 0.0004 내지 1 : 1, 1: 0.0004 내지 1: 0.8, 1: 0.0004 내지 1: 0.5, 1: 0.004 내지 1 : 1, 1: 0.004 내지 1: 0.8, 1: 0.004 내지 1: 0.5, 1: 0.01 내지 1 : 1, 1: 0.01 내지 1: 0.8, 또는 1: 0.01 내지 1: 0.5의 중량비로 포함될 수 있다.

NAD+는 세포 내에서 세포의 수명 연장 및 장수 (Longevity) 관련 생물학적 기작들을 활성화시키는 것으로 알려져 있다(Laurent Mouchiroud, Cell, 2013). 대표적으로 시르투인 (Sirtuin) 단백질을 활성화하는데 NAD+가 필요하며, 세포내 NAD+를 증진시킴을 통하여, 항노화 효과를 얻을 수 있음이 보여진바 있다.

단. 외부에서 피부 세포 내로 NAD+를 주입하게 되면, 자체적인 항상성 (Homeostasis) 기작에 의해 NAD+는 빠르게 분해된다. 가장 대표적인 기작은 NADase (NAD+ 분해효소)라고도 불리는 CD38 단백질에 의한 NAD+의 분해로, CD38의 활성 또는 발현을 억제시킴으로써, 세포내 NAD+의 농도를 증가시킬 수 있음이 규명된 바 있다. (Carlos Escande, Diabetes. 2013)

본 발명에서는, 피부 세포에 NAD+를 처리하게 되면 CD38이 과발현되는데, 쿼세틴, 글리시르레틴산, 시토스테롤, 토코페릴 아세테이트 및 이들의 조합이 이런 CD38의 과발현을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다. 이를 통하여, 피부 세포 내의 NAD+ 농도가 효과적으로 증가, 즉 외부 유래 NAD+의 생체활성도를 크게 증가시킬 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 조성물은 피부 노화 억제용 또는 광노화 억제용일 수 있다.

다른 양태로서, 본 발명은, 니코틴아마이이드 아데닌 다이뉴클레오타이드; 글리시르레틴산; 및 쿼세틴;을 포함하는 화장료 조성물을 대상체의 피부에 도포하는 단계를 포함하는, 피부 노화 억제 또는 광노화 억제 방법을 제공한다.

본 발명에서, 용어 “대상체”는 항노화, 광노화 억제, 주름 또는 피부 재생 개선이 필요한 인간을 포함한 모든 포유 동물을 의미할 수 있다.

본 발명에서, 용어 “도포”는 대상체의 피부에 본 발명에 따른 조성물을 접촉 또는 제공하는 것을 의미하며, 피부에 도달하거나 피부 내부로 흡수시키는 일반적인 경로를 사용하여 도포될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물(화장품)은 화장품에 사용가능한 모든 종류의 성분, 예컨대 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 헥산다이올, 메칠글루세스-20, 다이글리세린, 에틸헥실글리세린과 같은 보습제; 에칠헥실메톡시신나메이트, 에칠헥실살리실레이트, 에칠헥실트리아존, 옥토크릴렌, 비스-에칠헥실옥시페놀메톡시페닐트리아진과 같은 자외선 차단제; 트리에탄올아민과 같은 pH 조절제; 카보머, 잔탄검, 아크릴레이트/C10-30알킬아크릴레이트크로스폴리머, 히알루론산과 같은 점증제; 페녹시에탄올, 메틸파라벤, 프로필 파라벤과 같은 방부제; 비에이치티, 에칠아스코빌에텔, 아스코빅애씨드와 같은 산화방지제; 베타글루칸과 같은 피부 컨디셔닝제; 세테아릴 글루코사이드, 솔비탄 스테아레이트와 같은 계면활성제; 향료 또는 색소를 추가로 포함할 수 있으며 그 성분에 제한이 있는 것은 아니다.

본 발명에 따른 화장품에 포함되는 상기한 성분 각각은 바람직하게는 각 정부에서 정하는 「화장품 안전·기술 규범」에 규정된 최대 사용량을 초과하지 않는 범위 내에서 본 발명의 화장료 조성물에 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 화장품은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 화장품은 유연 화장수 또는 영양 화장수 등과 같은 화장수, 스프레이 타입의 화장수, 훼이셜 로션, 바디 로션 등과 같은 유액, 영양 크림, 수분 크림, 아이 크림 등과 같은 크림, 스틱, 에센스, 화장연고, 스프레이, 젤, 팩, 선스크린, 메이크업 베이스, 액체 타입 또는 스프레이 타입 등의 파운데이션, 파우더, 클렌징 로션, 클렌징 오일과 같은 메이크업 제거제, 클렌징 폼, 비누, 바디 워쉬 등과 같은 세정제 등의 제형을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

한 구체예에서, 상기 화장품의 제형은 밤(balm), 유중수형(W/O), 수중유형(O/W), 가용화 제형 또는 오일 제형일 수 있다.

본 발명의 화장품은 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용횟수를 달리할 수 있다.

구체적인 일 실시예에서는, 본 발명의 화장료 조성물은 피부 세포 내 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드 농도를 상승시키며, 항노화, 피부 결 개선, 주름 개선, 피부 재생 및 장벽강화 효과를 제공하는 것을 확인하였다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실험예 및 제조예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실험예 및 제조예에 한정되는 것이 아니라, 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.

본 발명의 화장료 조성물은 피부에 도포할 경우 피부 세포 내 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드 농도를 상승시키며, 항노화, 피부 결 개선, 주름 개선, 피부 재생 및 장벽강화 효과를 제공한다.

도 1은 본 발명 실험예 3의 세포 노화도 결과를 나타낸 사진이다.

도 2는 본 발명 실험예 5의 세포 복제 수명 연장 효과 결과를 나타낸 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실험예 1 CD 38 발현 억제능 확인

CD38 발현 억제능은 항노화 및 피부 건강 개선 평가 지표로, 본 실험에서는 본 발명의 조성물을 처리했을 때 CD 38의 발현이 억제되는지를 확인하여 표 1에 나타내었다.

구체적으로, 섬유아세포(Fibroblast, HS68)를 12 well plate에, seeding 후 24시간 배양하였다. 배양 시 배지(media)는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Solbiopharm, Korea)를 사용하였고, 37℃ 5% CO₂가 유지되는 인큐베이터를 사용하였다. 24시간이 지나면 배지를 제거하고, PBS (Phosphate Buffered Saline)로 1회 세척하였다. PBS 제거 후, NAD+ 25ppm과 표 1에 따른 평가대상이 포함된 각 DMEM을 세포에 첨가하였다. 24시간 후, 다시 배지를 제거하고, RNA를 추출한 후(AccuPrep® Universal RNA Extraction Kit, Bioneer, Korea) 이 RNA와 cDNA 합성 kit (TOPscript™ cDNA Synthesis Kit (dN6 Mix), Enzynomics, Korea)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 이어서, TOPreal™ SYBR Green RT-qPCR Kit와 Rt-qPCR 장비 (Applied Biosystems™ StepOne™ Real-Time PCR System, Thermofisher, USA)를 이용하여 RT-qPCR(Real-time polymerase chain reaction)을 수행하고, CD38의 발현량을 분석하였다. 이때, 평가대상의 영향을 확인하기 위해 NAD+ 25 ppm을 포함하되 평가대상 성분은 포함하지 않는 DMEM(Control)도 같은 방법으로 수행하여 CD38의 발현량을 분석하였다. 그리고 다음 계산식에 의해 Control 대비 CD38 억제율을 계산하여 표1에 나타내었다.

CD38 억제율 (%) = [1 - (평가 대상의 결과값 ÷ Control의 결과값]] × 100

	평가 대상	억제율[%]
비교예 1	Quercetin 1 ppm	6.38
비교예 3	Glycyrrhetinic acid 5 ppm	10.64
비교예 5	Sitosterol 5 ppm	10.80
실시예 6	Quercetin 1ppm + Glycyrrhetinic acid 5 ppm + Sitosterol 5ppm	64.15
비교예 6	Tocopheryl acetate 1 ppm	15.61
실시예 8	Quercetin 1ppm + Glycyrrhetinic acid 5 ppm + Tocopheryl acetate 1 ppm	42.53

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, NAD+에 의해 발현되는 CD38이 쿼세틴, 글리시르레틴산 조합 및 이에 시토스테롤 또는 토코페릴 아세테이트를 함께 조합할 경우 유의미하게 억제되는 효과를 확인할 수 있었다. 특히, 본 발명의 실시예 6 및 실시예 8은 억제율이 현저히 높아 피부 노화 방지 및 개선에 효과적인 것을 확인했다.

실험예 2 세포 내 NAD+ 증가 확인

NAD+는 세포 내 물질대사에 관여하는 인자로 노화와 관련 있다. NAD+/NADH ratio는 NAD+가 얼마나 NADH로 변하지 않고 남아있는지를 확인할 수 있는 지표로, 수치가 높을수록 피부 노화 억제 효과가 높다고 말할 수 있다. 본 실험예에서는 본 발명의 조성물을 처리했을 때 상기 지표가 증가하는지 감소하는지를 확인하여 표 2에 나타내었다.

구체적으로, 섬유아세포 (Fibroblast, HS68)를 12 well plate에, seeding 후 24시간 배양하였다. 배양 시 배지(media)는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Solbiopharm, Korea)를 사용하였고, 37℃ 5% CO₂가 유지되는 인큐베이터를 사용하였다. 24시간이 지나면 배지를 제거하고, PBS (Phosphate Buffered Saline)로 1회 세척하였다. PBS 제거 후, NAD+ 25 ppm과 표 2에 따른 평가 대상이 포함된 각 DMEM을 세포에 첨가하였다. 24시간 후 배지를 제거하고, PBS로 세포를 3회 세척했다. 세포 내 NAD+, 와 NADH를 450nm에서의 흡광도로 정량할 수 있는 kit (PicoSens™ NAD/NADH Assay Kit, Biomax, Korea)를 제조사의 protocol 대로 수행하여 정량하고 각 평가 대상의 NAD+/NADH ratio를 계산했다. 이때, 평가 대상의 영향을 확인하기 위해 NAD+ 25 ppm을 포함하되 평가 대상 성분은 포함하지 않는 DMEM(Control)도 같은 방법으로 수행하였다. 그리고 다음 계산식에 의해 Control 대비 NAD+/NADH ratio 개선율을 계산하여 표 2에 나타내었다.

NAD+/NADH ratio 개선율 (%)

= [(평가 대상의 결과값 ÷ Control의 결과값)-1] × 100

	평가대상	개선율[%]
비교예 1	Quercetin 1 ppm	22.54
비교예 2	Glycyrrhetinic acid 1 ppm	5.63
비교예 3	Glycyrrhetinic acid 5 ppm	36.90
비교예 4	Sitosterol 1 ppm	4.39
비교예 5	Sitosterol 5 ppm	5.04
비교예 7	Tocopheryl acetate 10 ppm	74.65
실시예 1	Quercetin 1ppm + Glycyrrhetinic acid 1 ppm	53.76
실시예 2	Quercetin 1ppm + Glycyrrhetinic acid 5 ppm	66.55
실시예 4	Quercetin 1ppm + Glycyrrhetinic acid 1 ppm + Sitosterol 5 ppm	72.39
실시예 5	Quercetin 1ppm + Glycyrrhetinic acid 5 ppm + Sitosterol 1 ppm	60.56
실시예 6	Quercetin 1ppm + Glycyrrhetinic acid 5 ppm + Sitosterol 5 ppm	214.29
실시예 7	Quercetin 1ppm + Glycyrrhetinic acid 1 ppm + Tocopheryl acetate 10 ppm	142.42

상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 실시예 1, 실시예 2, 실시예 4 내지 7에서 기대치 이상으로 NAD+/NADH ratio가 증가하는 것을 확인하였다. 특히, 실시예 6 및 실시예 7은 개선율이 현저히 높았으며, 그 결과 본 발명에 따른 피부 외용제를 사용하면 피부 세포 내 니코틴아마이이드 아데닌 다이뉴클레오타이드 농도를 상승시켜 효과적으로 피부 노화를 억제할 수 있는 것을 확인했다.

실험예 3 세포 노화 억제 효과 확인

섬유아세포에 산화스트레스(H₂O₂)를 처리하여 세포 노화도를 증가시킨 다음 본 발명의 조성물을 처리하여 노화도가 개선되는지를 확인하고 표 3 및 도 1에 나타내었다.

구체적으로, 섬유아세포 (Fibroblast, HS68)를 96 well plate에, seeding 후 24시간 배양하였다. 배양 시 배지(media)는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Solbiopharm, Korea)를 사용하였고, 37℃ 5% CO2가 유지되는 인큐베이터를 사용하였다. 24시간이 지나면 배지를 제거하고, PBS (Phosphate Buffered Saline)로 1회 세척하였다. PBS 제거 후, NAD+ 25 ppm과 표 3에 따른 평가 대상이 포함된 각 DMEM을 세포에 첨가하였다. 4시간 후, 과산화수소 (Hydrogen peroxide) 300 μM (최종농도 기준)을 세포에 처리하고 2시간 배양한 후, 배지를 제거한 후 PBS로 2회 세척했다. 다시 표 3에 따른 평가대상이 포함된 각 DMEM을 세포에 투입하고 24시간 배양했다. 24시간이 지나면 배지를 제거하고, PBS로 1회 세척했다. 이후 세포노화 (Cellular Senescence) 측정용 kit (Cellular Senescence Plate Assay Kit - SPiDER-β Gal, Dojindo, Japan)를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하고 Ex: 535 nm; Em: 580 nm 조건에서 형광 강도를 측정하여 세포노화도를 정량했다. 이때, 평가대상의 영향을 확인하기 위해 세포에 평가 대상 없이 DMEM만 가하고, 과산화수소를 가하는 단계를 거치지 않은 실험군(음성대조군, N.Control), 세포에 평가 대상 없이 DMEM만 가하고, 과산화수소를 가하는 단계를 거친 실험군(기준값, Reference), 그리고 NAD+ 25 ppm을 포함하되 평가대상 성분은 포함하지 않는 DMEM(Control)도 같은 방법으로 수행했다. 그리고 다음 계산식에 의해 기준값 대비 노화 개선율을 계산하였다.

세포 노화 개선율 (%) =

[1 - (평가 대상의 결과값 ÷ 기준값의 결과값]] × 100

노화가 심화되면 초록 형광이 강해지도록 설계된, 노화도를 시각화 하는 실험에서는 세포노화의 지표인 SA-bgal의 염색 kit (Cellular Senescence Detection Kit - SPiDER-ßGal, Dojindo, Japan)를 사용했다. 제조사의 프로토콜에 따라 염색하고 형광현미경 (EVOS™ M7000, Thermofisher, USA)를 통해 관찰하였으며, 본 발명의 조성물을 처리한 결과를 도 1에 나타내었다.

	평가 대상	개선율 [%]
비교예 1	Quercetin 1ppm	12.43
비교예 2	Glycyrrhetinic acid 1 ppm	5.41
비교예 3	Glycyrrhetinic acid 5 ppm	12.43
비교예 4	Sitosterol 1 ppm	2.16
비교예 5	Sitosterol 5 ppm	5.41
비교예 6	Tocopheryl acetate 1 ppm	8.11
비교예 7	Tocopheryl acetate 10 ppm	9.19
실시예 1	Quercetin 1 ppm + Glycyrrhetinic acid 1 ppm	18.92
실시예 3	Quercetin 1 ppm + Glycyrrhetinic acid 1 ppm + Sitosterol 1 ppm	29.19
실시예 4	Quercetin 1 ppm + Glycyrrhetinic acid 1 ppm + Sitosterol 5 ppm	37.84
실시예 8	Quercetin 1 ppm + Glycyrrhetinic acid 5 ppm + Tocopheryl acetate 1 ppm	32.43
실시예 9	Quercetin 1 ppm + Glycyrrhetinic acid 5 ppm + Tocopheryl acetate 10 ppm	34.05

표 3 및 도 1에 나타낸 바와 같이, 섬유아세포에 산화스트레스(과산화수소처리)를 높이고 본 발명의 실시예 1, 실시예 3, 실시예 4, 실시예 8 및 실시예 9를 처리했을 때 세포 노화도가 개선되는지를 확인한 결과, 기대치 이상의 시너지 효과가 확인되었으며, 특히 실시예 4를 적용했을 때 도 1과 같이 노화에 의해 유도된 초록 형광이 거의 사라지는 것이 확인되었다. 따라서, 본 발명의 화장료 조성물의 세포 노화 억제에 효과적인 것을 확인하였다.

실험예 4 자외선에 의한 MMP-1 발현 억제능 확인

자외선 처리 후 세포 MMP-1 발현을 증가시킨 후 본 발명의 조성물을 처리했을 때 MMP-1 발현이 억제되는지를 확인하였다.

구체적으로, 섬유아세포 (Fibroblast, HS68)를 12 well plate에, seeding 후 24시간 배양하였다. 배양 시 배지(media)는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Solbiopharm, Korea)를 사용하였고, 37℃ 5% CO2가 유지되는 인큐베이터를 사용하였다. 24시간이 지나면, 배지를 제거하고, PBS (Phosphate Buffered Saline)로 1회 세척하였다. PBS 제거 후, NAD+ 25 ppm과 표 4에 따른 평가 대상이 포함된 각 DMEM을 세포에 첨가하였다. 4시간 배양 후 배지를 제거하고 PBS를 세포에 투여한후 자외선을 조사하였다. 자외선 조사는 BIO-SUN 자외선 조사기(Vilber Lourmat, France)를 사용하여, 312 nm narrow-band UVB를 35 mJ/cm2, 365 nm narrow-band UVA를 15 mJ/cm2 조사하였다. 이 후, PBS를 제거하고, 다시 표 4에 따른 평가 대상이 포함된 각 DMEM을 세포에 투입하고, 48시간 배양했다. 48시간 후, 배지 상층액을 수확하고 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)를 통해 MMP-1 발현량을 정량화했다. 이를 위하여 Human Total MMP-1 DuoSet ELISA (R&D systems, USA)를 사용하였으며, 제조사의 가이드에 따라 실험을 진행하였다. 단백질 정량은 BCA assay (Pierce™ BCA Protein Assay Kits, Thermofisher, USA)를 이용하여 수행하였다. 이때, 평가대상의 영향을 확인하기 위해 세포에 평가 대상 없이 DMEM만 가하고, 자외선을 조사하는 단계를 거치지 않은 실험군(음성대조군, N.Control)과 NAD+ 25 ppm을 포함하되 평가대상 성분은 포함하지 않는 DMEM(Control)도 같은 방법으로 수행했다. 그리고 다음 계산식에 의해 Control 대비 MMP-1 발현 억제능을 계산하였다.

MMP-1 발현 억제능(%) =

[1 - (평가 대상의 결과값 ÷ Control의 결과값]] × 100

	평가 대상	개선율 [%]
비교예 1	Quercetin 1 ppm	5.58
비교예 2	Glycyrrhetinic acid 1 ppm	14.55
실시예 1	Quercetin 1 ppm + Glycyrrhetinic acid 1 ppm	30.18

표 4에 나타낸 바와 같이, 섬유아세포에 자외선을 처리하여 MMP-1 발현량을 높이고 본 발명의 실시예 1를 처리하여 세포 노화 예방 및 개선율을 확인한 결과, 실시예 1의 MMP-1 발현율 억제능이 높아지는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 화장료 조성물의 피부 노화 예방, 탄력 유지에 효과적인 것을 확인하였다.

실험예 5 세포 복제 수명 연장 효과 확인

본 발명에 따른 조성물이 세포 분열능 및 복제 수명을 연장시켜주는 효과가 있는지를 확인하였다.

구체적으로, 섬유아세포 (Fibroblast, HS68)를 96 well plate에, 10개의 세포를 seeding 후 24시간 배양하였다. 배양 시 배지(media)는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Solbiopharm, Korea)를 사용하였고, 37℃ 5% CO2가 유지되는 인큐베이터를 사용하였다. 24시간이 지나면 배지를 제거하고 PBS (Phosphate Buffered Saline)로 1회 세척하였다. PBS 제거 후, NAD+ 25ppm과 표 5에 따른 평가대상이 포함된 각 DMEM을 세포에 첨가하였다. 이후 7일마다 배지를 교체해주면서 0일차, 21일차, 28일차에서 Cell population 과 증식(Proliferation)을 측정하였다. 이때, 평가대상의 영향을 확인하기 위해 DMEM만 처리한 음성대조군(N.Control)과, NAD+ 25 ppm을 포함하되 평가대상 성분은 포함하지 않는 DMEM(Control)도 같은 방법으로 수행하고 측정했다. 측정은 CCK-8 assay (CK04, Dojindo, Japan)에 의해 이루어졌으며 그 결과는 도 2에 나타내었다. 이 때, Relative cell population는 세포 숫자와 비례했으며, 측정값을 바탕으로 세포 분열능 및 복제 수명을 연장시켜주는 효과를 다음 계산식에 따라 계산하고 표 5에 나타내었다.

효과 (%) = [1 - (평가 대상의 결과값 ÷ N.Control의 결과값]] × 100

	평가 대상	개선율 (%, 21일차)	개선율 (%, 28일차)
Control	-	13.3	26.6
실시예6	Quercetin 1ppm + Glycyrrhetinic acid 5 ppm+ Sitosterol 5 ppm	34.1	82.3
실시예7	Quercetin 1ppm + Glycyrrhetinic acid 1 ppm+ Tocopheryl acetate 10 ppm	30.0	71.1

표 5 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 실시예 6 및 7과 같이 삼중 조합할 경우 세포 분열능 및 복제 수명을 연장 효과를 확인하였다. 따라서, 본 발명의 화장료 조성물이 세포 노화 억제, 피부 결 개선, 피부 재생 및 장벽강화에 효과적인 것을 확인하였다.

본 발명의 실시예 및 실험예를 종합하면, 본 발명의 화장료 조성물은 피부 세포 내 니코틴아마이이드 아데닌 다이뉴클레오타이드 농도를 상승시켜 손상된 피부의 노화 개선 효과와 피부 주름 및 탄력 개선 효과를 제공하는 것을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

니코틴아마이이드 아데닌 다이뉴클레오타이드; 글리시르레틴산; 및 쿼세틴;을 포함하는, 화장료 조성물.
제1항에 있어서,

상기 화장료 조성물에 시토스테롤 또는 토코페릴 아세테이트를 더 포함하는 것인, 화장료 조성물.
제1항에 있어서,

상기 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴틀레오타이드 및 글리시르레틴산은 1: 0.0004 내지 1 : 0.4 중량비로 포함되는 것인 화장료 조성물.
제1항에 있어서,

상기 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴틀레오타이드 및 쿼세틴은 1: 0.0004 내지 1 : 0.4 중량비로 포함되는 것인 화장료 조성물.
제2항에 있어서,

상기 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴틀레오타이드 및 시토스테롤은 1: 0.0004 내지 1 : 0.4 중량비로 포함되는 것인 화장료 조성물.
제2항에 있어서,

상기 상기 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴틀레오타이드 및 토코페릴 아세테이트는 1 : 0.0004 내지 1 : 1 중량비로 포함되는 것인 화장료 조성물.
제1항에 있어서,

상기 조성물은 피부 노화 억제용인 화장료 조성물.
제1항에 있어서,

상기 조성물은 광노화 억제용인 화장료 조성물.
니코틴아마이이드 아데닌 다이뉴클레오타이드; 글리시르레틴산; 및 쿼세틴;을 포함하는 화장료 조성물을 대상체의 피부에 도포하는 단계를 포함하는, 피부 노화 억제 방법.
니코틴아마이이드 아데닌 다이뉴클레오타이드; 글리시르레틴산; 및 쿼세틴;을 포함하는 화장료 조성물을 대상체의 피부에 도포하는 단계를 포함하는, 광노화 억제 방법.