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WO2025170054A1 - 脊髄梗塞治療のための多能性幹細胞 - Google Patents

脊髄梗塞治療のための多能性幹細胞

Info

Publication number
WO2025170054A1
WO2025170054A1 PCT/JP2025/004169 JP2025004169W WO2025170054A1 WO 2025170054 A1 WO2025170054 A1 WO 2025170054A1 JP 2025004169 W JP2025004169 W JP 2025004169W WO 2025170054 A1 WO2025170054 A1 WO 2025170054A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
spinal cord
negative
stem cells
muse
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/JP2025/004169
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
将之 大谷
佳克 齋木
真理 出澤
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tohoku University NUC
Original Assignee
Tohoku University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tohoku University NUC filed Critical Tohoku University NUC
Publication of WO2025170054A1 publication Critical patent/WO2025170054A1/ja
Pending legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system

Definitions

  • the present invention relates to a cell preparation for regenerative medicine. More specifically, the present invention relates to a cell preparation comprising pluripotent stem cells that is effective for treating, preventing, alleviating, and/or delaying the onset of spinal cord infarction in a subject.
  • Paraplegia a perioperative complication of aortic surgery, is caused by spinal cord ischemic injury or spinal cord ischemia-reperfusion injury, with spinal cord infarction being the primary pathological manifestation. In addition to decreased motor function in the lower limbs, it can also cause sensory impairment and bladder-rectum dysfunction, reducing quality of life and significantly impacting prognosis.
  • the incidence of paraplegia following thoracoabdominal aortic surgery, even in facilities with extensive surgical experience, has been reported to be 8.3% for thoracoabdominal aortic artificial vascular replacement (Non-Patent Document 1) and 11% for thoracoabdominal aortic stent graft treatment (Non-Patent Document 2).
  • Non-Patent Document 3 Cerebrospinal fluid drainage
  • permissive hypertension and the administration of medications such as steroids and naloxone are currently used as treatments, but their effectiveness is limited, and no established treatment method exists.
  • Non-Patent Documents 4-10 Multilineage-differentiating stress-enduring (Muse) cells were reported in 2010 as a new pluripotent stem cell present in the human body (Non-Patent Document 11). Muse cells are present in all connective tissues, blood, and bone marrow in adults, and can be identified by the pluripotency marker SSEA-3 (stage-specific embryonic antigen-3) (Non-Patent Document 12).
  • SSEA-3 stage-specific embryonic antigen-3
  • Muse cells Unlike embryonic stem (ES) cells and induced-pluripotent stem (iPS) cells, Muse cells exist in vivo and are therefore non-tumorigenic. Furthermore, Muse cells migrate to damaged tissues by simply administering them intravascularly, recognizing sphingosine-1-phosphate (S1P) as a neurotransmitter (Non-Patent Document 13). They then phagocytose apoptotic cells, spontaneously differentiating into tissue-specific cells and leading to tissue repair (Non-Patent Document 14).
  • S1P sphingosine-1-phosphate
  • Non-Patent Document 13 Previous studies of myocardial infarction models (Non-Patent Document 13), cerebral infarction models (Non-Patent Document 15), aortic aneurysm models (Non-Patent Document 16), renal failure models (Non-Patent Document 17), and acute liver injury models (Non-Patent Document 18) have shown that intravenous or local administration of Muse cells results in tissue-specific differentiation and structural and functional improvement (Patent Documents 1-4).
  • Muse cells express human leukocyte antigen (HLA)-G, which is expressed in the placenta, allogeneic donor Muse cells administered intravenously are less susceptible to immune rejection, selectively home to the recipient's damaged tissue, and survive as functional, differentiated cells for periods of more than six months.
  • HLA human leukocyte antigen
  • Muse cells have an anti-apoptotic effect (Non-Patent Document 20), an inhibitory effect on fibrosis and fibrolysis (Non-Patent Document 17), and angiogenesis (Non-Patent Document 13). Furthermore, Muse cells possess stress resistance and anti-inflammatory properties (Non-Patent Documents 21 and 22), suggesting that they may persist even under the stressful environment of inflammation. Because Muse cells are endogenous stem cells, functional improvement and tissue repair of damaged tissue may occur as a biological response, but it is expected that the therapeutic effect can be further enhanced by administering Muse cells into the body from outside the body. Due to these unique properties, it is believed that treatment of spinal cord infarction with Muse cells could be established as a new proactive treatment method that goes beyond conventional conservative treatments and other cell therapies.
  • S1P-S1PR2 Axis Mediates Homing of Muse Cells Into Damaged Heart for Long-Lasting Tissue Repair and Functional Recovery After Acute Myocardial Infarction. Circ Res. Apr 13 2018;122(8):1069-1083. doi:10.1161/CIRCRESAHA.117.311648 Wakao S, Oguma Y, Kushida Y, Kuroda Y, Tatsumi K, Dezawa M. Phagocytosing differentiated cell-fragments is a novel mechanism for controll ing somatic stem cell differentiation within a short time frame. Cell Mol Life Sci. Oct 6 2022;79(11):542.
  • Pluripotent Nontumorigenic Adipose Tissue-Derived Muse Cells have Immunomodulat ory Capacity Mediated by Transforming Growth Factor-beta1. Stem Cells Transl Med. Jan 2017;6(1):161-173. doi:10.5966/sctm.2016-0014
  • the present invention provides novel medical applications of pluripotent stem cells (e.g., Muse cells) in regenerative medicine. More specifically, the present invention provides cell preparations and/or pharmaceutical compositions containing Muse cells that are effective in treating, preventing, alleviating, and/or delaying the onset of spinal cord infarction in a subject, as well as methods for treating subjects with the above-mentioned diseases using the same.
  • pluripotent stem cells e.g., Muse cells
  • the present invention provides cell preparations and/or pharmaceutical compositions containing Muse cells that are effective in treating, preventing, alleviating, and/or delaying the onset of spinal cord infarction in a subject, as well as methods for treating subjects with the above-mentioned diseases using the same.
  • the inventors created a rat spinal cord infarction model and used this rat model to examine the therapeutic effects of Muse cell administration on spinal cord infarction. As a result, they found that a significant improvement in motor function was achieved compared to the control group, leading to the completion of the present invention.
  • the present invention is as follows.
  • [5] The cell preparation according to any one of [1] to [4], wherein the pluripotent stem cells are CD117-negative and CD146-negative.
  • [6] The cell preparation according to any one of [1] to [5], wherein the pluripotent stem cells are CD117-negative, CD146-negative, NG2-negative, CD34-negative, vWF-negative, and CD271-negative.
  • [7] The cell preparation according to any one of [1] to [6], wherein the pluripotent stem cells are CD34-negative, CD117-negative, CD146-negative, CD271-negative, NG2-negative, vWF-negative, Sox10-negative, Snail-negative, Slug-negative, Tyrp1-negative, and Dct-negative.
  • a method for producing a cell preparation containing SSEA-3-positive pluripotent stem cells for treating, preventing, alleviating, and/or delaying the onset of spinal cord infarction in a subject comprising a step of isolating the SSEA-3-positive pluripotent stem cells from mesenchymal tissue of a living body or cultured mesenchymal cells.
  • the method according to [11] comprising a step of enriching SSEA-3-positive pluripotent stem cells by external stress stimulation and/or MACS.
  • the experimental system scheme is shown. The day the spinal cord infarction model was created was defined as Day 0. Behavioral evaluation was performed using the BBB locomotor scale on Day 1, and animals with a BBB locomotor score of 0 were used in the experiment. Mice were randomly assigned to the MACS-Muse group, MSC group, or vehicle group, and behavioral evaluation and weight measurement were performed on Days 2, 3, 5, and 7, and every week thereafter until Day 56. The animals were then sacrificed. Mice to be used in the in vivo imaging system (IVIS) were sacrificed on Day 7 and photographed. SSEA-3-positive cells were collected from MSCs using MACS. The SSEA-3 positivity rate in the final cell population was shown by FACS analysis. MSCs from passages 7 to 9 were used.
  • IVIS in vivo imaging system
  • SSEA-3-positive cells were enriched by MACS, and cell populations with an SSEA-3 positivity rate of >70% were defined as MACS-Muse cells.
  • the graph shows the change over time in the BBB motor function score for each group.
  • the BBB motor function scores on Day 56 were 9.5 ⁇ 1.7 for the MACS-Muse group, 4.7 ⁇ 1.7 for the MSC group, and 4.5 ⁇ 1.3 for the vehicle group (MACS-Muse group vs. MSC group: p ⁇ 0.01, MACS-Muse vs. vehicle group: p ⁇ 0.01, MSC group vs. vehicle group: no significant difference).
  • the present invention relates to a cell preparation and pharmaceutical composition containing SSEA-3-positive pluripotent stem cells (e.g., Muse cells) for treating, preventing, alleviating, and/or delaying the onset of spinal cord infarction in a subject, as well as a method for treating spinal cord infarction using the cell preparation, etc.
  • SSEA-3-positive pluripotent stem cells e.g., Muse cells
  • a detailed description of the present invention is provided below.
  • BBB Basso, Beattie, Bresnahan CED: Convection-enhanced delivery
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • ET-1 Endothelin-1
  • FACS Fluorescence activated cell sorting
  • FBS Fetal bovine serum FITC: Fluorescein isothiocyanate
  • GFAP Glial fibrillary acidic protein
  • GFP Green fluorescent protein GST-pi: Glutathione S-transferase-pi hMit: human mitochondrial
  • HLA human leukocyte antigen
  • Iba1 ionized calcium-binding adaptor molecule 1
  • IPS Induced pluripotent stem cells
  • IVIS In vivo imaging system
  • MACS Magnetic activated cell sorting
  • MAP-2 Microtubule-associated protein-2
  • MSC Mesenchymal stem cell Muse: Multilineage-differentiating stress-enduring
  • NeuN neuronal nucleus NO: nitric oxide
  • PBS
  • the present invention can be used to treat, prevent, alleviate, and/or delay the onset of spinal cord infarction (ischemic myelopathy) using a cell preparation or pharmaceutical composition containing SSEA-3-positive pluripotent stem cells (Muse cells).
  • Spinal cord infarction is usually caused by ischemia originating from an artery outside the spinal canal and is characterized by sudden severe back pain, followed immediately by rapidly progressive, bilateral flaccid muscle weakness and sensory loss (particularly thermal pain sensation) in the limbs.
  • the cell preparations of the present invention can be used to treat disorders caused by spinal cord infarction, preferably motor dysfunction and sensory (functional) disorders.
  • motor dysfunction refers to a condition in which voluntary movement is difficult, impossible, or cannot be performed smoothly, and refers to motor paralysis and ataxia. Specific examples include disorders of fine motor skills, Babinski's sign, spasticity, spasm (chronic phase), increased deep tendon reflexes (chronic phase), muscle rigidity, bradykinesia, involuntary movements (tremor, chorea, athetosis, dystonia, etc.), ataxia (limb/trunk), and gait dysfunction.
  • “Sensory impairment” is used interchangeably with “sensory dysfunction” and refers to a condition in which, due to damage to the spinal cord, sensations such as superficial sensations like temperature, pressure, and touch, deep sensations like position sense and vibration, and complex sensations like two-point discrimination and cutaneous writing sense are not recognized normally. Depending on the severity, symptoms may include sensory loss (anesthesias), hypoesthesia (decreased sensation), hyperesthesia, or abnormal sensations (paresthesia).
  • Pluripotent stem cells The pluripotent stem cells used in the cell preparations of the present invention are cells that Idezawa, one of the present inventors, discovered in the human body and named "Muse (Multilineage-differentiating stress-enduring) cells.” Muse cells can be obtained from bone marrow fluid, adipose tissue (Ogura, F., et al., Stem Cells Dev., Nov 20, 2013 (Epub) (published on Jan 17, 2014)), and skin tissue such as the dermal connective tissue, and are also scattered in the connective tissue of various organs.
  • Muse cells or cell populations containing Muse cells can be isolated from biological tissues using, for example, these antigen markers as indicators. Details of the isolation, identification, and characteristics of Muse cells are disclosed in International Publication No. WO 2011/007900. Furthermore, as reported by Wakao et al. (S. Wakao, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 108, pp.
  • pluripotent stem cells isolated from biological mesenchymal tissue or cultured mesenchymal tissue using SSEA-3 as an antigen marker, which can be used in cell preparations for treating motor neuron diseases, or cell populations containing Muse cells, may be simply referred to as "SSEA-3-positive cells.”
  • non-Muse cells refer to cells contained in biological mesenchymal tissue or cultured mesenchymal tissue, other than “SSEA-3-positive cells.”
  • pharmaceutical composition is used to have a broader concept than “cell preparation,” or may be used synonymously with "cell preparation.”
  • Muse cells or cell populations containing Muse cells can be isolated from biological tissue (e.g., mesenchymal tissue) using an antibody against the cell surface marker SSEA-3 alone, or using both antibodies against SSEA-3 and CD105.
  • biological tissue e.g., mesenchymal tissue
  • biological organism refers to a mammalian organism.
  • biological organism does not include fertilized eggs or embryos at developmental stages earlier than the blastula stage, but does include embryos at developmental stages after the blastula stage, including fetuses and blastulas.
  • Mammals include, but are not limited to, humans, primates such as monkeys, rodents such as mice, rats, rabbits, and guinea pigs, cats, dogs, sheep, pigs, cows, horses, donkeys, goats, and ferrets.
  • the Muse cells used in the cell preparations of the present invention are clearly distinguished from embryonic stem cells (ES cells) and iPS cells in that they are isolated directly from biological tissue using markers.
  • ES cells embryonic stem cells
  • iPS cells embryonic stem cells
  • meenchymal tissue refers to tissues such as bone, synovium, fat, blood, bone marrow, skeletal muscle, dermis, ligaments, tendons, dental pulp, umbilical cord, and umbilical cord blood, as well as tissues present in various organs.
  • Muse cells can be obtained from bone marrow, skin, or adipose tissue.
  • mesenchymal tissue from a living body and isolate and use Muse cells from this tissue.
  • Muse cells may also be isolated from cultured mesenchymal cells such as fibroblasts or bone marrow mesenchymal stem cells using the above-mentioned isolation method.
  • the Muse cells used may be autologous or allogeneic to the recipient of the cell transplant.
  • Muse cells or cell populations containing Muse cells can be isolated from biological tissues using, for example, SSEA-3 positivity and double positivity for SSEA-3 and CD105 as indicators.
  • adult human skin is known to contain various types of stem and progenitor cells.
  • Muse cells are not the same as these cells.
  • Such stem and progenitor cells include skin-derived progenitor cells (SKPs), neural crest stem cells (NCSCs), melanoblasts (MBs), perivascular cells (PCs), endothelial progenitor cells (EPs), and adipose-derived stem cells (ADSCs).
  • Muse cells can be isolated using the "non-expression" of markers specific to these cells as an indicator.
  • Muse cells can be separated using as an indicator non-expression of at least one, for example, two, three, four, five, six, seven, eight, nine, ten, or eleven, of eleven markers selected from the group consisting of CD34 (a marker for EP and ADSC), CD117 (c-kit) (a marker for MB), CD146 (a marker for PC and ADSC), CD271 (NGFR) (a marker for NCSC), NG2 (a marker for PC), vWF factor (von Willebrand factor) (a marker for EP), Sox10 (a marker for NCSC), Snail (a marker for SKP), Slug (a marker for SKP), Tyrp1 (a marker for MB), and Dct (a marker for MB).
  • CD34 a marker for EP and ADSC
  • CD117 (c-kit) a marker for MB
  • CD146 a marker for PC and ADSC
  • CD271 (NGFR) a marker for NCSC
  • NG2 a marker for PC
  • vWF factor
  • separation can be performed using the non-expression of CD117 and CD146 as an indicator, and further separation can be performed using the non-expression of CD117, CD146, NG2, CD34, vWF, and CD271 as an indicator, and further separation can be performed using the non-expression of the above 11 markers as an indicator.
  • the Muse cells having the above characteristics used in the cell preparation of the present invention are as follows: (i) low or absent telomerase activity; (ii) have the ability to differentiate into cells of any of the three germ layers; (iii) not exhibiting neoplastic growth; and (iv) having self-renewal ability.
  • the Muse cells used in the cell preparation of the present invention have all of the above properties.
  • "low or no telomerase activity” refers to low or undetectable telomerase activity when detected using, for example, a TRAPEZE XL telomerase detection kit (Millipore).
  • telomere activity refers to, for example, telomerase activity equivalent to that of human fibroblasts, which are somatic cells, or telomerase activity that is 1/5 or less, preferably 1/10 or less, of that of HeLa cells.
  • Muse cells have the ability to differentiate into three germ layers (endodermal, mesodermal, and ectodermal) in vitro and in vivo. For example, by in vitro induction culture, they can differentiate into hepatocytes, nerve cells, skeletal muscle cells, smooth muscle cells, osteocytes, adipocytes, etc. In addition, when transplanted into the testis in vivo, they may also exhibit the ability to differentiate into three germ layers.
  • Muse cells have the ability to self-renew (self-replicate).
  • self-renewal refers to the fact that differentiation into three germ layers can be confirmed from cells contained in an embryoid-like cell mass obtained by culturing a single Muse cell in suspension culture, and that cells from the embryoid-like cell mass can be brought back into suspension culture at a single cell level to form a next-generation embryoid-like cell mass, from which differentiation into three germ layers and the formation of an embryoid-like cell mass in suspension culture can again be confirmed.
  • the self-renewal may be repeated one or more times.
  • the cell fraction containing Muse cells used in the cell preparation of the present invention may be a cell fraction enriched in SSEA-3-positive and CD105-positive pluripotent stem cells, which have at least one, and preferably all, of the following properties, and which is obtained by a method comprising applying an external stress stimulus to mesenchymal tissue of a living body or cultured mesenchymal cells, killing cells other than those resistant to the external stress, and recovering the surviving cells: (i) SSEA-3 positive; (ii) CD105 positive; (iii) low or absent telomerase activity; (iv) have the ability to differentiate into the three germ layers; (v) do not exhibit neoplastic growth; and (vi) have the ability to self-renew.
  • the external stress may be any one or a combination of protease treatment, culture at a low oxygen concentration, culture under low phosphate conditions, culture at a low serum concentration, culture under low nutrient conditions, culture under heat shock, culture at low temperature, freezing treatment, culture in the presence of harmful substances, culture in the presence of active oxygen, culture under mechanical stimulation, culture under shaking treatment, culture under pressure treatment, or physical impact.
  • the protease treatment time is preferably 0.5 to 36 hours in total to impart external stress to the cells.
  • the protease concentration may be any concentration used when detaching cells adhered to a culture vessel, disaggregating cell clumps into single cells, or recovering single cells from tissue.
  • the protease is preferably a serine protease, an aspartic acid protease, a cysteine protease, a metalloprotease, a glutamic acid protease, or an N-terminal threonine protease. Furthermore, it is preferable that the protease is trypsin, collagenase, or dispase.
  • the cell fraction containing Muse cells used in the cell preparation of the present invention may be enriched using magnetically activated cell sorting (MACS) (e.g., autoMACS® Pro Separator; Miltenyi Biotec Inc.) in addition to or instead of the above-mentioned external stress stimulus method.
  • MCS magnetically activated cell sorting
  • the Muse cells having the above characteristics used in the cell preparation of the present invention migrate to and engraft in the tissue at the site of spinal cord infarction after being administered to the body by intravenous administration or other means. It is believed that the Muse cells then differentiate into the cells that make up the tissue, thereby treating spinal cord infarction or related symptoms and diseases.
  • the cell preparations of the present invention can be obtained by suspending the Muse cells or cell populations containing Muse cells obtained in (1) above in physiological saline or an appropriate buffer (e.g., phosphate-buffered saline).
  • physiological saline or an appropriate buffer e.g., phosphate-buffered saline.
  • the cells may be cultured and expanded to a predetermined cell concentration before cell transplantation.
  • International Publication No. WO 2011/007900 Muse cells do not become tumorigenic. Therefore, even if undifferentiated cells are contained in biological tissue, the possibility of cancer formation is low and the preparation is safe.
  • the culture of the recovered Muse cells can be carried out in a standard growth medium (e.g., ⁇ -minimal essential medium ( ⁇ -MEM) containing 10% fetal bovine serum).
  • a standard growth medium e.g., ⁇ -minimal essential medium ( ⁇ -MEM) containing 10% fetal bovine serum.
  • a solution containing a predetermined concentration of Muse cells can be prepared by appropriately selecting a medium, additives (e.g., antibiotics, serum), etc., for the culture and proliferation of Muse cells.
  • the cell preparation of the present invention When the cell preparation of the present invention is administered to a human subject, approximately several milliliters of bone marrow fluid is collected from the human ilium, and bone marrow mesenchymal stem cells are cultured as adhesive cells from the bone marrow fluid and expanded to a cell quantity that allows for the isolation of an effective therapeutic amount of Muse cells.
  • the Muse cells are then isolated using the SSEA-3 antigen marker as an indicator, and autologous or allogeneic Muse cells can be prepared as a cell preparation.
  • Muse cells can be isolated using the SSEA-3 antigen marker as an indicator, and then cultured and expanded to a cell quantity that allows for the isolation of an effective therapeutic amount of Muse cells, and the autologous or allogeneic Muse cells can be prepared as a cell preparation.
  • the cell preparation may contain dimethyl sulfoxide (DMSO) or serum albumin to protect the cells, and antibiotics to prevent bacterial contamination and proliferation.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the cell preparation may contain other ingredients acceptable for the formulation (e.g., carriers, excipients, disintegrants, buffers, emulsifiers, suspending agents, soothing agents, stabilizers, preservatives, antiseptics, physiological saline, etc.), as well as cells or components contained in mesenchymal stem cells other than Muse cells.
  • ingredients acceptable for the formulation e.g., carriers, excipients, disintegrants, buffers, emulsifiers, suspending agents, soothing agents, stabilizers, preservatives, antiseptics, physiological saline, etc.
  • Those skilled in the art can add these factors and drugs to cell preparations at appropriate concentrations.
  • Muse cells can also be used as pharmaceutical compositions containing various additives.
  • the number of Muse cells contained in the cell preparation or pharmaceutical composition prepared as described above can be adjusted appropriately, taking into consideration the subject's gender, age, weight, condition of the affected area, and the condition of the cells used, so as to achieve a therapeutic effect against spinal cord infarction, such as improvement of motor dysfunction and sensory impairment.
  • Target individuals include, but are not limited to, mammals such as humans.
  • "improvement” refers to the treatment, prevention, improvement, prevention of worsening, or delay of spinal cord infarction and symptoms or conditions caused by spinal cord infarction, or the reversal, prevention, or delay of the progression of the disease.
  • an artificially prepared rat spinal cord infarction model can be used to examine the amelioration and therapeutic effects of the cell preparations of the present invention on brain disorders associated with spinal cord infarction (e.g., abnormalities in motor quality, abnormalities in neurological development).
  • this model can be prepared by injecting, for example, 0.7 ⁇ L of enodocerin-1 (ET-1) (2.5 mg/ml) into the left and right spinal cord at an angle of 40° to a depth of 1.5 mm (the fused silica tube is adjusted to a length of 1.5 mm) into the 13th thoracic spinal cord.
  • E-1 enodocerin-1
  • the cell preparation and pharmaceutical composition of the present invention can improve and/or treat spinal cord ischemic disorders (e.g., motor dysfunction, sensory impairment) caused by spinal cord infarction in mammals, including humans.
  • spinal cord ischemic disorders e.g., motor dysfunction, sensory impairment
  • the spinal cord infarction rat model prepared above can be used to experimentally examine the improvement of symptoms caused by spinal cord ischemic disorders caused by spinal cord infarction in rats by administering Muse cells, thereby evaluating the effects of the Muse cells.
  • Specific evaluation methods can be performed using standard experimental systems for evaluating motor dysfunction (e.g., motor paralysis), sensory impairment, and bladder-rectum disorders in rats.
  • motor function evaluation include, but are not limited to, the open field test, catwalk test, footfault test, and treadmill test.
  • sensory function evaluation include, but are not limited to, the von Frey test (pain sensation) and the hot plate test (temperature).
  • the "open field test” involves placing a test animal in a novel, fixed space (e.g., a box measuring 60 (W) x 60 (D) x 40 (H) cm) and observing the animal's emotional behavior, such as exploratory behavior.
  • the observer actually records the test animal's behavior and also films it with a video camera, and data can be extracted to evaluate activity/emotionality indicators (e.g., distance traveled, time spent stationary, rate of staying in the center).
  • the "foot fault test” is a method for assessing motor deficits in limb function (generally the hind limbs) and placement disorders during locomotion.
  • the subject animal is placed on a high, flat grid with openings, and each time the foot slips off the open grid, a “foot fault” is recorded, allowing the degree of impairment to be easily measured.
  • the "treadmill test” is a test in which the subject animal is made to walk at a constant speed on a treadmill and gradually increases the load to evaluate motor function.
  • the von Frey test is a physiological method for assessing pain sensitivity, measuring the subject's touch and pain thresholds through mechanical stimulation.
  • the "hot plate test” is a method for assessing the pain sensitivity of test animals. The test involves having the test animal touch a heated surface, observing its pain response, and assessing the presence and severity of pain.
  • CED Convection-enhanced delivery
  • the rat was fixed in a prone position in a stereotaxic apparatus (NARISHIGÉ, Tokyo, Japan), and rectal temperature was maintained at 36-37°C during surgery using a heating pad (BWT-100A, Bio Research Center Co., Ltd., Nagoya, Japan).
  • the back was shaved, and an approximately 3-cm dorsal midline incision was made from the 12th thoracic vertebra to the 1st lumbar vertebra.
  • the 13th thoracic arch was resected to widely expose the dorsal spinal cord.
  • the dura and arachnoid mater were punctured with a 27G needle, and a fused silica tube adjusted to a 1.5 mm diameter was inserted.
  • 4.0% Evans Blue (056-04061, FUJIFILM, Tokyo, Japan) dissolved in phosphate-buffered saline (PBS) was injected to optimize the puncture angle.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • the injection rate was 0.2 ⁇ L/min.
  • Rats were sacrificed with an overdose of isoflurane, and the spinal cord was removed and immersion-fixed in 4% paraformaldehyde (PFA). Spinal cord cross sections were observed under a microscope (Stemi 305, ZEISS, Oberkochen, Germany).
  • the muscle outside the puncture site was marked with 8-0 monofilament suture. After confirming hemostasis, the erector spinae muscle and skin were sutured closed. The animals received daily manual pressure to assist voiding until voiding ability was restored.
  • Triton-X-100 168-11805, Fujifilm
  • Triton-X-100 Triton-X-100
  • the sections were incubated overnight at 4°C with one of the following primary antibodies: rabbit anti-NeuN (1:500; ab177487, Abcam, Cambridge, England), goat anti-Iba1 (1:500; ab5076, Abcam), mouse anti-GFAP (1:500; G3893, Sigma-Aldrich), rabbit anti-GST-pi (1:200; 312, MBL, Tokyo, Japan), or rabbit anti-endothelial cell antibody (RECA-1; 1:100; ab9774, Abcam).
  • the sections were washed with PBS, mounted with SlowFade Gold antifade reagent (S36937, Life Technology, Carlsbad, CA), and observed under a laser confocal microscope (Eclipse Ti, Nikon, Tokyo, Japan).
  • TTC Triphenyltetrazolium chloride
  • the cells were cultured in a 10-cm dish at 37°C and 5% CO using Dulbecco's modified Eagle's medium (low glucose) (DMEM; Life Technologies, Carlsbad, CA), 10% fetal bovine serum (FBS) (Hyclone; Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), and 0.1 mg/mL kanamycin (Life Technologies).
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • FBS fetal bovine serum
  • MSCs were cultured under conditions 2.
  • Muse cells were isolated from MSCs at passages 7 to 9 as follows: rat anti-SSEA-3 IgM antibody (1:1000; BioLegend, San Diego, CA) was used as the primary antibody, and rat IgM ⁇ chain isotype control (1:1000; BioLegend) was used as the isotype control, and the cells were incubated for 1 hour.
  • the cells were incubated with FITC-labeled anti-rat IgM antibody (1:100; Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA) as the secondary antibody for 1 hour, and anti-FITC microbeads (1:50; Miltenyi Biotec Inc., Auburn, CA) as the tertiary antibody for 30 minutes, and SSEA-3 positive cells were separated using MACS (autoMACS® Pro Separator; Miltenyi Biotec Inc.). After cell separation, the percentage of SSEA-3 positive cells among the MACS-enriched cells was analyzed using a BD FACS Aria (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Cells containing 70% or more SSEA-3 positive cells were defined as MACS-Muse cells and used as transplant cells.
  • the MSCs were then incubated with rat anti-SSEA-3 IgM antibody (1:1000; BioLegend) as the primary antibody and allophycocyanin-labeled anti-rat IgM antibody (1:100; Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.) as the secondary antibody, and SSEA-3-positive and -negative cells were separated using FACS.
  • rat anti-SSEA-3 IgM antibody (1:1000; BioLegend) as the primary antibody
  • allophycocyanin-labeled anti-rat IgM antibody (1:100; Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.
  • SSEA-3-positive and -negative cells were separated using FACS.
  • Muse cells separated by MACS the separated cells were mixed so that the proportion of SSEA-3 positive cells was 70%, and the mixture was designated as "Akaluc-Muse cells.”
  • the day the spinal cord infarction model was created was defined as Day 0. Behavioral evaluation was performed 24 hours after surgery (Day 1), and animals with a BBB locomotor score of 0 were selected.
  • the spinal cord infarction model was randomly divided into the following groups: a vehicle group administered with PBS, a group administered with 400,000 MSC cells, and a group administered with 400,000 Muse cells. All transplanted cells were suspended in 400 ⁇ L of PBS and administered via the penile vein. For the Muse cell group, MACS-enriched cells (MACS-Muse cells) were administered in behavioral evaluation experiments.
  • rat anti-SSEA-3 IgM antibody (1:1000; BioLegend) was used as the primary antibody, and allophycocyanin-labeled anti-rat IgM antibody (1:100; Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.) was used as the secondary antibody.
  • the model animals were randomly assigned to three groups, and various cells were intravenously administered: (1) 400,0000 Akaluc-Muse cells/400 ⁇ L PBS (Akaluc-Muse group), (2) 400,0000 Akaluc-MSC cells/400 ⁇ L PBS (Akaluc-MSC group), and (3) 400 ⁇ L PBS (vehicle group).
  • Sections were cut at 3 mm intervals, and the sum of the total flux of each section was defined as the individual's value. Quantification of luminous intensity was performed using Living Image software (ver. 4.5, PerkinElmer, Waltham, MA). The total flux of each organ in the Akaluc-Muse and Akaluc-MSC groups was evaluated after subtracting the total flux (autofluorescence) of each organ in the vehicle group.
  • the primary antibodies used were rabbit anti-human mitochondria (1:200, ab133789, Abcam), mouse anti-NeuN (1:200; MAB377, Sigma-Aldrich), mouse anti-MAP-2 (1:200; M1406, Sigma-Aldrich), mouse anti- ⁇ -TUBLINIII (1:200; T8660, Sigma-Aldrich), goat anti-Iba1 (1:500; ab5076, Abcam), mouse anti-GFAP (1:500; G3893, Sigma-Aldrich), goat anti-GST3/GST-pi (1:50; ab53943, Abcam), and goat anti-CD31 (1:200; AF3628, RD).
  • Example 1 Preparation of a Rat Spinal Cord Infarction Model
  • a rat spinal cord infarction model was prepared by injecting 0.7 ⁇ L of enodocerin-1 (ET-1) (2.5 mg/ml) into the left and right spinal cord at a 40° angle to a depth of 1.5 mm (the fused silica tube was adjusted to a length of 1.5 mm) into the 13th thoracic spinal cord (hereinafter referred to as the "ET-1 group").
  • ET-1 group enodocerin-1
  • Example 2 Improvement of hindlimb motor function by intravenous administration of Muse cells in a rat spinal cord infarction model
  • the experimental system scheme for the cell administration experiment is shown in Figure 1. 24 hours after model creation, Muse cells concentrated by MACS (MACS-Muse cells) (Figure 2), MSCs, or PBS were administered. Rats that died during observation were excluded from the graph.
  • Figure 3 shows the time course of the BBB motor function score in each group. The BBB motor function score in the MACS-Muse group was statistically significantly higher than that in the MSC group and vehicle group from Day 35 onwards.
  • the BBB motor function scores on Day 56 were 9.5 ⁇ 1.7 in the MACS-Muse group, 4.7 ⁇ 1.7 in the MSC group, and 4.5 ⁇ 1.3 in the vehicle group (MACS-Muse group vs. MSC group; p ⁇ 0.01, MACS-Muse group vs. vehicle group; p ⁇ 0.01, MSC group vs. vehicle group; not significant).
  • Example 3 Body weight transition in each group Body weight was monitored up to Day 56 for each group.
  • the mean preoperative body weight was set to 1.0, and the weight change was calculated as a ratio at each time point (Figure 4).
  • the weights were 0.93 for the MACS-Muse group, 0.93 for the MSC group, and 0.94 for the vehicle group.
  • the weights were 1.00 for the MACS-Muse group, 0.96 for the MSC group, and 0.96 for the vehicle group.
  • the weights were 1.25 for the MACS-Muse group, 1.22 for the MSC group, and 1.20 for the vehicle group. No statistically significant differences were observed in the preoperative weight ratios between the groups at each observation time point.
  • Example 5 Histological Evaluation of the Spinal Cord in Cell-Transplanted Rats Histological evaluation was performed using spinal cord tissue from a rat spinal cord infarction model transplanted with Muse cells. Spinal cord tissue from the area surrounding the puncture site was used from the Akaluc-Muse group (Day 7) and the MACS-Muse group (Day 56) ( Figure 6). GFP-positive cells were observed in the Akaluc-Muse group, and human mitochondrial-positive cells were observed in the MACS-Muse group. Positive and negative controls for each staining are shown in Figure 7. The distribution of transplanted cells in the spinal cord tissue surrounding the spinal cord infarction site was analyzed ( Figure 8A).
  • Example 6 Differentiation of Muse Cells into Neurons and Vascular Cells
  • Spinal cord tissue from the MACS-Muse group (Day 56) was double-stained with human mitochondrial antibodies and the neuronal markers NeuN, MAP-2, and TUJ-1, the oligodendrocyte marker GST3/GST-pi, the astrocyte marker GFAP, the microglial marker Iba-1, and the vascular endothelial marker CD31 ( Figure 9). Positive and negative controls for each staining are shown in Figure 10. Double positivity was observed with NeuN, MAP2, TUJ1, GST3/GST-pi, and CD31. However, double positivity with GFAP or Iba-1 was not observed.
  • Example 8 Efficiency of differentiation into vascular endothelial cells In the same area as above, 17.6 ⁇ 1.8% of cells were found to be double positive for human mitochondria and CD31 (data not shown).
  • Muse cells spontaneously differentiate into tissue-specific cells by phagocytosing apoptotic cells, replacing and repairing the damaged tissue (Iseki M, et al., 2017 (supra); Kajitani T, et al., 2021 (supra)).

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Abstract

再生医療において、多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）を用いた新たな医療用途を提供することを目的とする。本発明は、生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞から分離されたＳＳＥＡ－３陽性の多能性幹細胞を含む、脊髄梗塞を治療し、予防し、軽減し及び／又は発症を遅延させるための細胞製剤及び医薬組成物を提供する。本発明は、脊髄梗塞を有する対象に対し、Ｍｕｓｅ細胞を投与することにより、脊髄梗塞部位の組織に生着させ、脊髄梗塞を治療等する機構に基づく。

Description

脊髄梗塞治療のための多能性幹細胞
　本発明は、再生医療のための細胞製剤に関する。より具体的には、本発明は、多能性幹細胞を含む、対象における脊髄梗塞の治療、予防、軽減及び／又は発症の遅延のために有効な細胞製剤に関する。
　大動脈手術の周術期合併症である対麻痺は、脊髄虚血性障害、若しくは脊髄虚血再灌流障害が原因であり、脊髄梗塞がその主病態である。下肢運動機能低下に加え、感覚障害や膀胱直腸障害を生じ、生活の質を低下させ生命予後にも大きな影響を与える。その胸腹部大動脈手術における対麻痺発生率は、手術経験豊富な施設においても、胸腹部大動脈人工血管置換術で８．３％（非特許文献１）、胸腹部大動脈ステントグラフト治療で１１％（非特許文献２）と報告されている。術前画像診断技術や術中モニタリング技術の劇的な進歩と相反して、脊髄障害発症率は過去１０年間で大きな改善は見られていない。脳脊髄液ドレナージ（非特許文献３）、ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ　ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ、ステロイドやナロキソン等の薬剤投与などが治療として選択されるが、治療効果は限定的であり、確立された治療方法は存在しない。
　これまでに脊髄虚血性障害に対する間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ；ＭＳＣ）を用いた実験的研究の治療効果は数多く示されているが、いずれも短期間の観察に留まるものしかなく、治療機序としてはパラクライン効果や抗炎症効果によるとされる（非特許文献４～１０）。Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ－ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ　ｓｔｒｅｓｓ　ｅｎｄｕｒｉｎｇ（Ｍｕｓｅ）細胞はヒト生体内に内在する新たな多能性幹細胞として２０１０年に報告された（非特許文献１１）。Ｍｕｓｅ細胞は成人のあらゆる結合組織や血液、骨髄に存在し、多能性マーカーであるＳＳＥＡ－３（ｓｔａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ－３）によって同定可能である（非特許文献１２）。胚性幹（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ；ＥＳ）細胞や人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ－ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ；ｉＰＳ）細胞と異なり、生体内に存在するため腫瘍性は示さない。さらに，Ｍｕｓｅ細胞は血管内投与のみでスフィンゴシン－１－リン酸（Ｓ１Ｐ）を伝達物質として認識して障害組織に遊走し（非特許文献１３）、アポトーシスを起こした細胞を貪食することにより自発的に組織特異的な細胞へと分化することで組織修復をもたらす（非特許文献１４）。過去の心筋梗塞モデル（非特許文献１３）、脳梗塞モデル（非特許文献１５）、大動脈瘤モデル（非特許文献１６）、腎不全モデル（非特許文献１７）、急性肝障害モデル（非特許文献１８）を対象とした研究では、Ｍｕｓｅ細胞を静脈投与又は局所投与することにより、Ｍｕｓｅ細胞の組織特異的な細胞への分化、構造的・機能的な改善がもたらされることが示されている（特許文献１～４）。さらに、Ｍｕｓｅ細胞は胎盤で発現しているヒト白血球抗原（ＨＬＡ）－Ｇを発現しているため、静脈投与された同種ドナーＭｕｓｅ細胞は免疫拒絶を受けにくく、レシピエントの障害組織に選択的にホーミングして半年以上の長期間、機能的な分化細胞として生存する。脳梗塞患者に対するＭｕｓｅ細胞投与治療を行なった臨床治験（ＪａｐｉｃＣＴＩ－１８４１０３）においては、プラセボ群に比較してＭｕｓｅ細胞投与群で統計学的有意に上肢運動機能改善が維持されることを認めた（非特許文献１９）。Ｍｕｓｅ細胞のバイスタンダー効果による抗アポトーシス効果（非特許文献２０）、線維化抑制及び線維溶解作用（非特許文献１７）、血管新生（非特許文献１３）なども報告されている。また、Ｍｕｓｅ細胞はストレス耐性、抗炎症作用を有し（非特許文献２１及び２２）、炎症というストレス環境下においても細胞の残存が期待される。Ｍｕｓｅ細胞は内在性の幹細胞であるため、障害組織の機能改善及び組織修復は生体反応としても生じている可能性はあるが、さらに体外から体内にＭｕｓｅ細胞を投与することでその治療効果を増強できることが期待される。これらのユニークな特性により、Ｍｕｓｅ細胞による脊髄梗塞の治療が従来の保存的治療法やその他の細胞治療を超えた新たな積極的治療法として確立し得るものと考えられる。
特許５９６８４４２号 特許６６０４４９２号 特許７０２９７２９号 特許７０７２７７７号
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　本発明は、再生医療における多能性幹細胞（例えば、Ｍｕｓｅ細胞）による新規な医療用途を提供する。より具体的には、本発明は、Ｍｕｓｅ細胞を含む、対象における脊髄梗塞を治療し、予防し、軽減し及び／又は発症を遅延させるのに有効な細胞製剤及び／又は医薬組成物、ならびにこれらを用いて上記の疾患を有する対象を治療する方法を提供する。
　本発明者らは、ラット脊髄梗塞モデルを作製し、該ラットモデルを用いて、Ｍｕｓｅ細胞投与による脊髄梗塞の治療効果を検討した結果、対照群と比較して、顕著な運動機能改善が得られることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は、以下の通りである。
　［１］生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞から分離されたＳＳＥＡ－３陽性の多能性幹細胞を含む、対象における脊髄梗塞を治療し、予防し、軽減し及び／又は発症を遅延させるための細胞製剤。
　［２］外部ストレス刺激によりＳＳＥＡ－３陽性の多能性幹細胞が濃縮された細胞画分を含む、［１］に記載の細胞製剤。
　［３］ＭＡＣＳ及び／又はＦＡＣＳによりＳＳＥＡ－３陽性の多能性幹細胞が濃縮された細胞画分を含む、［１］又は［２］に記載の細胞製剤。
　［４］多能性幹細胞がＣＤ１０５陽性である、［１］～［３］のいずれかに記載の細胞製剤。
　［５］多能性幹細胞がＣＤ１１７陰性及びＣＤ１４６陰性である、［１］～［４］のいずれかに記載の細胞製剤。
　［６］多能性幹細胞が、ＣＤ１１７陰性、ＣＤ１４６陰性、ＮＧ２陰性、ＣＤ３４陰性、ｖＷＦ陰性、及びＣＤ２７１陰性である、［１］～［５］のいずれかに記載の細胞製剤。
　［７］多能性幹細胞が、ＣＤ３４陰性、ＣＤ１１７陰性、ＣＤ１４６陰性、ＣＤ２７１陰性、ＮＧ２陰性、ｖＷＦ陰性、Ｓｏｘ１０陰性、Ｓｎａｉ１陰性、Ｓｌｕｇ陰性、Ｔｙｒｐ１陰性、及びＤｃｔ陰性である、［１］～［６］のいずれかに記載の細胞製剤。
　［８］多能性幹細胞が、以下の性質の全てを有する多能性幹細胞である、［１］～［７］のいずれかに記載の細胞製剤：
（ｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
（ｉｉ）三胚葉のいずれかの胚葉の細胞に分化する能力を持つ；
（ｉｉｉ）腫瘍性増殖を示さない；及び
（ｉｖ）セルフリニューアル能を持つ。
　［９］脊髄梗塞が、運動機能障害、感覚障害、又は膀胱直腸障害である、［１］～［８］のいずれかに記載の細胞製剤。
　［１０］多能性幹細胞が脊髄梗塞部位の組織内に生着する能力を有する、［１］～［９］のいずれかに記載の細胞製剤。
　［１１］ＳＳＥＡ－３陽性の多能性幹細胞を含む、対象における脊髄梗塞を治療し、予防し、軽減し及び／又は発症を遅延させるための細胞製剤の製造方法であって、前記ＳＳＥＡ－３陽性の多能性幹細胞を、生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞から分離する工程を含む方法。
　［１２］外部ストレス刺激及び／又はＭＡＣＳによりＳＳＥＡ－３陽性の多能性幹細胞を濃縮する工程を含む、［１１］に記載の方法。
　本発明は、脊髄梗塞を患っている対象に対し、Ｍｕｓｅ細胞を静脈等から投与することにより、Ｍｕｓｅ細胞が脊髄梗塞部位において該部位周辺の正常組織を構成する細胞に分化するという組織再生メカニズムによって、脊髄梗塞を改善することができる。
実験系シェーマを示す。脊髄梗塞モデル作製日をＤａｙ　０（０日目）と定義した。Ｄａｙ　１にＢＢＢ運動機能スケール（ｌｏｃｏｍｏｔｏｒ　ｓｃａｌｅ）スケールによる行動評価を行い、ＢＢＢ運動機能スコア（ｌｏｃｏｍｏｔｏｒ　ｓｃｏｒｅ）が０点の個体を実験に使用した。ＭＡＣＳ－Ｍｕｓｅ群、ＭＳＣ群、ビヒクル群に無作為に振り分け、Ｄａｙ　２、３、５、７、以降１週間おきにＤａｙ　５６まで行動評価、及び体重計測を行った。その後犠牲死させた。インビボ画像システム（ＩＶＩＳ）に用いる個体をＤａｙ　７に犠牲死させ、撮影を行った。 ＭＳＣからＭＡＣＳでＳＳＥＡ－３陽性細胞を採取した。最終的に得られた細胞群におけるＳＳＥＡ－３陽性率をＦＡＣＳ解析で示す。継代数７～９回のＭＳＣを使用した。ＭＡＣＳによりＳＳＥＡ－３陽性細胞を濃縮し、ＳＳＥＡ－３陽性率＞７０％となる細胞集団をＭＡＣＳ－Ｍｕｓｅ細胞と定義した。 各群におけるＢＢＢ運動機能スコアの推移を示す。ＭＡＣＳ－Ｍｕｓｅ群（ｎ＝１３）、ＭＳＣ群（ｎ＝１２）、ビヒクル群（ｎ＝１２）のＢＢＢ運動機能スコアの推移を示した。Ｄａｙ　５６時点におけるＢＢＢ運動機能スコアは、ＭＡＣＳ－Ｍｕｓｅ群９．５±１．７、ＭＳＣ群４．７±１．７、ビヒクル群４．５±１．３であった（ＭＡＣＳ－Ｍｕｓｅ群対ＭＳＣ群；ｐ＜０．０１、ＭＡＣＳ－Ｍｕｓｅ対ビヒクル群；ｐ＜０．０１、ＭＳＣ群対ビヒクル群；有意差なし）。 Ｄａｙ　５６までの各群における体重推移を示す。ＭＡＣＳ－Ｍｕｓｅ群（ｎ＝１３）、ＭＳＣ群（ｎ＝１２）、ビヒクル群（ｎ＝１２）。術前の平均体重を１．０とした。Ｄａｙ　１において、ＭＡＣＳ－Ｍｕｓｅ群０．９３、ＭＳＣ群０．９３、ビヒクル群０．９４であった。Ｄａｙ　１４において、ＭＡＣＳ－Ｍｕｓｅ群１．００、ＭＳＣ群０．９６、ビヒクル群０．９６、Ｄａｙ　５６において、ＭＡＣＳ－Ｍｕｓｅ群１．２５、ＭＳＣ群１．２２、ビヒクル群１．２０であった。各観察時点、各群間の術前体重比は統計学的有意差を認めなかった。 ＩＶＩＳによる投与細胞の生体内局在分布を示す。Ｄａｙ　７における、（Ａ）脊髄、（Ｂ）肺に対するＭｕｓｅ細胞、ＭＳＣの集積。（Ｃ）脳、心臓、胃、小腸、大腸、膵臓、脾臓、肝臓、腎臓、膀胱、大腿骨、脛骨、腓骨、大腿筋でのＩＶＩＳ像。（Ｄ）各臓器の総光度。Ａｋａｌｕｃ－Ｍｕｓｅ群（ｎ＝３）、Ａｋａｌｕｃ－ＭＳＣ群（ｎ＝３）、＊；ｐ＜０．０５。 経静脈投与したＭｕｓｅ細胞の脊髄断面における局在を示す。（Ａ）Ａｋａｌｕｃ－Ｍｕｓｅ群における脊髄組織（Ｄａｙ　７）。脊髄前角を中心にＡｋａｌｕｃ－ＧＦＰ陽性細胞を認めた。白色点線で灰白質輪郭を示した。（Ｂ）ＭＡＣＳ－Ｍｕｓｅ群における脊髄組織（Ｄａｙ　５６）。脊髄前角を中心にヒトミトコンドリア陽性細胞を認めた。白色点線で灰白質輪郭を示した。 各染色のおける陽性対照と陰性対照を示す。ａ及びｂは、ヒト臍帯を使用した。ｃ及びｄは、ＧＦＰマウスの大脳を使用した。 経静脈投与したＭｕｓｅ細胞の脊髄断面における局在を示す。（Ａ）脊髄梗塞（穿刺部）を中心として、吻尾側３ｍｍ、６ｍｍ、９ｍｍの計７断面において、脊髄前角を中心に８００μｍ四方のフィールドを左右から任意に選択した。（Ｂ）各断面におけるヒトミトコンドリア陽性細胞数（ｎ＝３）。梗塞中心におけるヒトミトコンドリア陽性細胞数は６ｍｍ吻側、６ｍｍ尾側に対して、統計学的有意に少なかった（ｐ＜０．０５）。 Ｍｕｓｅ細胞の神経細胞及び血管構成細胞への分化を示す。ＭＡＣＳ－Ｍｕｓｅ群におけるＤａｙ　５６時点での脊髄免疫組織学的染色。ヒトミトコンドリアと神経細胞マーカーであるＮｅｕＮ、ＭＡＰ－２、ＴＵＪ－１、オリゴデンドロサイトマーカーマーカーであるＧＳＴ３／ＧＳＴ－ｐｉ、血管内皮マーカーであるＣＤ３１と二重陽性を認めた。アストロサイトマーカーであるＧＦＡＰ、ミクログリアマーカーであるＩｂａ－１との二重陽性細胞は確認できなかった。白色矢印は二重陽性細胞を示している。Ｂａｒ＝５０μｍ。 各染色のおける陽性対照と陰性対照を示す。ａ－ｆはラット脊髄灰白質を使用した。ｇ及びｈはラット脊髄白質を使用した。ｉ及びｊはラット前脊髄動脈を使用した。 神経系細胞への分化効率を示す。ヒトミトコンドリアとの二重陽性細胞の割合は、ＮｅｕＮ　７０．６±５．４％、ＭＡＰ－２　６８．０±１１．４％、ＧＳＴ３／ＧＳＴ－ｐｉ　１０．６±０．３％であった。ＧＦＡＰ及びＩｂａ－１との二重陽性細胞は確認できなかった。
　本発明は、ＳＳＥＡ－３陽性の多能性幹細胞（例えば、Ｍｕｓｅ細胞）を含有する、対象における脊髄梗塞を治療し、予防し、軽減し及び／又は発症を遅延させるための細胞製剤及び医薬組成物、並びに該細胞製剤等を用いた脊髄梗塞を治療するための方法に関する。以下、本発明の詳細な説明を説明する。
　本明細書において、使用される略語について、下記の通り詳述する。なお、当該技術分野において、一般的に使用される略語については、慣習に従うものとする。
使用される略語
ＢＢＢ：Ｂａｓｓｏ，Ｂｅａｔｔｉｅ，Ｂｒｅｓｎａｈａｎ
ＣＥＤ：対流増強送達
ＤＭＥＭ：ダルベッコ変法イーグル培地
ＥＴ－１：エンドセリン－１
ＦＡＣＳ：蛍光活性化セルソーティング
ＦＢＳ：ウシ胎児血清
ＦＩＴＣ：フルオレセインイソチオシアネート
ＧＦＡＰ：グリア線維性酸性タンパク質
ＧＦＰ：緑色蛍光タンパク質
ＧＳＴ－ｐｉ：グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ－ｐｉ
ｈＭｉｔ：ヒトミトコンドリア
ＨＬＡ：ヒト白血球抗原
Ｉｂａ１：イオン化されたカルシウム結合アダプター分子１
ｉＰＳ：人工多能性幹
ＩＶＩＳ：生体内イメージングシステム
ＭＡＣＳ：磁気活性化セルソーティング
ＭＡＰ－２：微小管関連タンパク質－２
ＭＳＣ：間葉系幹細胞
Ｍｕｓｅ：Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ－ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ　ｓｔｒｅｓｓ－ｅｎｄｕｒｉｎｇ
ＮｅｕＮ：ニューロン核
ＮＯ：一酸化窒素
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ＰＦＡ：パラホルムアルデヒド
Ｓ１Ｐ：スフィンゴシン－１－リン酸
Ｓ１ＰＲ２：スフィンゴシン－１－リン酸受容体２
ＳＳＥＡ－３：ｓｔａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ－３
ＴＴＣ：トリフェニルテトラゾリウムクロリド
ＴＵＪ－１：抗βチューブリン３
ＴＵＮＥＬ：ＴｄＴ媒介ｄＵＴＰニックエンドラベリング
１．適用疾患
　本発明は、ＳＳＥＡ－３陽性の多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）を含む細胞製剤又は医薬組成物を用いて、脊髄梗塞（虚血性脊髄症）の治療、予防、軽減及び／又はその発症の遅延に使用することができる。脊髄梗塞は、通常、脊柱管外部の動脈に由来する虚血に起因し、突発的な重度の背部痛、その直後に四肢に生じる急速進行性かつ両側性の弛緩性筋力低下と感覚消失（顕著には温痛覚）などがある。
　本発明によれば、本発明の細胞製剤等により、脊髄梗塞に起因する障害、好ましくは運動機能障害及び感覚（機能）障害の治療等を行うことができる。本明細書で使用される場合、「運動機能障害」とは、随意運動が困難又は不能、あるいは円滑に行えない状態を指し、運動麻痺及び運動失調を意味する。具体的には、巧緻運動の障害、Ｂａｂｉｎｓｋｉ徴候、痙性麻痺、ｓｐａｓｔｉｃｉｔｙ（慢性期）、深部腱反射亢進（慢性期）、筋固縮（ｒｉｇｉｄｉｔｙ）、動作緩徐、不随意運動（振戦、舞踏運動、アテトーゼ、ジストニア等）、運動失調（四肢・体幹）、歩行機能障害が挙げられる。「感覚障害」は、「感覚機能障害」と互換的に使用され、脊髄の障害により、温覚、圧覚、触覚等の表在感覚、位置感覚、振動覚などの深部感覚、２点識別覚や皮膚書字覚等の複合感覚などの感覚が正常に認識されない状態をいい、その程度により、感覚消失（脱失）、感覚鈍麻（減退）、感覚過敏、感覚異常（錯感覚）がある。
２．細胞製剤及び医薬組成物
（１）多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）
　本発明の細胞製剤に使用される多能性幹細胞は、本発明者らの一人である出澤が、ヒト生体内にその存在を見出し、「Ｍｕｓｅ（Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ－ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ　ｓｔｒｅｓｓ－ｅｎｄｕｒｉｎｇ）細胞」と命名した細胞である。Ｍｕｓｅ細胞は、骨髄液、脂肪組織（Ogura, F., et al., Stem Cells Dev., Nov 20, 2013 (Epub) (published on Jan 17,2014)）や真皮結合組織等の皮膚組織から得ることができ、各臓器の結合組織にも散在する。また、この細胞は、多能性幹細胞と間葉系幹細胞の両方の性質を有する細胞であり、例えば、それぞれの細胞表面マーカーである「ＳＳＥＡ－３（Ｓｔａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ－３）」と「ＣＤ１０５」のダブル陽性として同定される。したがって、Ｍｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団は、例えば、これらの抗原マーカーを指標として生体組織から分離することができる。Ｍｕｓｅ細胞の分離法、同定法、及び特徴などの詳細は、国際公開第ＷＯ２０１１／００７９００号に開示されている。また、Ｗａｋａｏら（S. Wakao, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 108, p.9875-9880 (2011)）によって報告されているように、骨髄、皮膚などから間葉系細胞を培養し、それをＭｕｓｅ細胞の母集団として用いる場合、ＳＳＥＡ－３陽性細胞の全てがＣＤ１０５陽性細胞であることが分かっている。したがって、本発明における細胞製剤においては、生体の間葉系組織又は培養間葉系幹細胞からＭｕｓｅ細胞を分離する場合は、単にＳＳＥＡ－３を抗原マーカーとしてＭｕｓｅ細胞を精製し、使用することができる。なお、本明細書においては、運動ニューロン疾患を治療するための細胞製剤において使用され得る、ＳＳＥＡ－３を抗原マーカーとして、生体の間葉系組織又は培養間葉系組織から分離された多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団を単に「ＳＳＥＡ－３陽性細胞」と記載することがある。また、本明細書においては、「非Ｍｕｓｅ細胞」とは、生体の間葉系組織又は培養間葉系組織に含まれる細胞であって、「ＳＳＥＡ－３陽性細胞」以外の細胞を指す。なお、本明細書では、「医薬組成物」なる用語は、「細胞製剤」より広い概念を有するものとして使用されるか、又は「細胞製剤」と同義で使用され得る。
　簡単には、Ｍｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団は、細胞表面マーカーであるＳＳＥＡ－３に対する抗体を単独で用いて、又はＳＳＥＡ－３及びＣＤ１０５に対するそれぞれの抗体を両方用いて、生体組織（例えば、間葉系組織）から分離することができる。ここで、「生体」とは、哺乳動物の生体をいう。本発明において、生体には、受精卵や胞胚期より発生段階が前の胚は含まれないが、胎児や胞胚を含む胞胚期以降の発生段階の胚は含まれる。哺乳動物には、限定されないが、ヒト、サル等の霊長類、マウス、ラット、ウサギ、モルモット等のげっ歯類、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、ヤギ、フェレット等が挙げられる。本発明の細胞製剤に使用されるＭｕｓｅ細胞は、生体の組織から直接マーカーを持って分離される点で、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）やｉＰＳ細胞と明確に区別される。また、「間葉系組織」とは、骨、滑膜、脂肪、血液、骨髄、骨格筋、真皮、靭帯、腱、歯髄、臍帯、臍帯血などの組織及び各種臓器に存在する組織をいう。例えば、Ｍｕｓｅ細胞は、骨髄や皮膚、脂肪組織から得ることができる。例えば、生体の間葉系組織を採取し、この組織からＭｕｓｅ細胞を分離し、利用することが好ましい。また、上記分離手段を用いて、線維芽細胞や骨髄間葉系幹細胞などの培養間葉系細胞からＭｕｓｅ細胞を分離してもよい。なお、本発明の細胞製剤においては、使用されるＭｕｓｅ細胞は、細胞移植を受けるレシピエントに対して自家であってもよく、又は他家であってもよい。
　上記のように、Ｍｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団は、例えば、ＳＳＥＡ－３陽性、及びＳＳＥＡ－３とＣＤ１０５の二重陽性を指標にして生体組織から分離することができるが、ヒト成人皮膚には、種々のタイプの幹細胞及び前駆細胞を含むことが知られている。しかしながら、Ｍｕｓｅ細胞は、これらの細胞と同じではない。このような幹細胞及び前駆細胞には、皮膚由来前駆細胞（ＳＫＰ）、神経堤幹細胞（ＮＣＳＣ）、メラノブラスト（ＭＢ）、血管周囲細胞（ＰＣ）、内皮前駆細胞（ＥＰ）、脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）が挙げられる。これらの細胞に固有のマーカーの「非発現」を指標として、Ｍｕｓｅ細胞を分離することができる。より具体的には、Ｍｕｓｅ細胞は、ＣＤ３４（ＥＰ及びＡＤＳＣのマーカー）、ＣＤ１１７（ｃ－ｋｉｔ）（ＭＢのマーカー）、ＣＤ１４６（ＰＣ及びＡＤＳＣのマーカー）、ＣＤ２７１（ＮＧＦＲ）（ＮＣＳＣのマーカー）、ＮＧ２（ＰＣのマーカー）、ｖＷＦ因子（フォンビルブランド因子）（ＥＰのマーカー）、Ｓｏｘ１０（ＮＣＳＣのマーカー）、Ｓｎａｉ１（ＳＫＰのマーカー）、Ｓｌｕｇ（ＳＫＰのマーカー）、Ｔｙｒｐ１（ＭＢのマーカー）、及びＤｃｔ（ＭＢのマーカー）からなる群から選択される１１個のマーカーのうち少なくとも１個、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又は１１個のマーカーの非発現を指標に分離することができる。例えば、限定されないが、ＣＤ１１７及びＣＤ１４６の非発現を指標に分離することができ、さらに、ＣＤ１１７、ＣＤ１４６、ＮＧ２、ＣＤ３４、ｖＷＦ及びＣＤ２７１の非発現を指標に分離することができ、さらに、上記の１１個のマーカーの非発現を指標に分離することができる。
　また、本発明の細胞製剤に使用される上記特徴を有するＭｕｓｅ細胞は、以下：
（ｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
（ｉｉ）三胚葉のいずれの胚葉の細胞に分化する能力を持つ；
（ｉｉｉ）腫瘍性増殖を示さない；及び
（ｉｖ）セルフリニューアル能を持つ
からなる群から選択される少なくとも１つの性質を有してもよい。本発明の一局面では、本発明の細胞製剤に使用されるＭｕｓｅ細胞は、上記性質を全て有する。ここで、上記（ｉ）について、「テロメラーゼ活性が低いか又は無い」とは、例えば、ＴＲＡＰＥＺＥ　ＸＬ　ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いてテロメラーゼ活性を検出した場合に、低いか又は検出できないことをいう。テロメラーゼ活性が「低い」とは、例えば、体細胞であるヒト線維芽細胞と同程度のテロメラーゼ活性を有しているか、又はＨｅｌａ細胞に比べて１／５以下、好ましくは１／１０以下のテロメラーゼ活性を有していることをいう。上記（ｉｉ）について、Ｍｕｓｅ細胞は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ及びｉｎ　ｖｉｖｏにおいて、三胚葉（内胚葉系、中胚葉系、及び外胚葉系）に分化する能力を有し、例えば、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで誘導培養することにより、肝細胞、神経細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、骨細胞、脂肪細胞等に分化し得る。また、ｉｎ　ｖｉｖｏで精巣に移植した場合にも三胚葉に分化する能力を示す場合がある。さらに、静注により生体に移植することで損傷を受けた臓器（心臓、皮膚、脊髄、肝、筋肉等）に遊走及び生着し、組織に応じた細胞に分化する能力を有する。上記（ｉｉｉ）について、Ｍｕｓｅ細胞は、浮遊培養では増殖速度約１．３日で増殖するが、浮遊培養では１細胞から増殖し、胚様体様細胞塊を作り１４日間程度で増殖が止まる、という性質を有するが、これらの胚様体様細胞塊を接着培養に持っていくと、再び細胞増殖が開始され、細胞塊から増殖した細胞が広がっていく。さらに精巣に移植した場合、少なくとも半年間は癌化しないという性質を有する。また、上記（ｉｖ）について、Ｍｕｓｅ細胞は、セルフリニューアル（自己複製）能を有する。ここで、「セルフリニューアル」とは、１個のＭｕｓｅ細胞から浮遊培養で培養することにより得られる胚様体様細胞塊に含まれる細胞から３胚葉性の細胞への分化が確認できると同時に、胚様体様細胞塊の細胞を再び１細胞で浮遊培養に持っていくことにより、次の世代の胚様体様細胞塊を形成させ、そこから再び３胚葉性の分化と浮遊培養での胚様体様細胞塊が確認できることをいう。セルフリニューアルは１回又は複数回のサイクルを繰り返せばよい。
　また、本発明の細胞製剤に使用されるＭｕｓｅ細胞を含む細胞画分は、生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞に外的ストレス刺激を与え、該外的ストレスに耐性の細胞以外の細胞を死滅させ、生き残った細胞を回収することを含む方法によって得られる、以下の性質の少なくとも１つ、好ましくは全てを有する、ＳＳＥＡ－３陽性及びＣＤ１０５陽性の多能性幹細胞が濃縮された細胞画分であってもよい。
（ｉ）ＳＳＥＡ－３陽性；
（ｉｉ）ＣＤ１０５陽性；
（ｉｉｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
（ｉｖ）三胚葉に分化する能力を持つ；
（ｖ）腫瘍性増殖を示さない；及び
（ｖｉ）セルフリニューアル能を持つ。
　上記外的ストレスは、プロテアーゼ処理、低酸素濃度での培養、低リン酸条件下での培養、低血清濃度での培養、低栄養条件での培養、熱ショックへの曝露下での培養、低温での培養、凍結処理、有害物質存在下での培養、活性酸素存在下での培養、機械的刺激下での培養、振とう処理下での培養、圧力処理下での培養又は物理的衝撃のいずれか又は複数の組み合わせであってもよい。例えば、上記プロテアーゼによる処理時間は、細胞に外的ストレスを与えるために合計０．５～３６時間行うことが好ましい。また、プロテアーゼ濃度は、培養容器に接着した細胞を剥がすとき、細胞塊を単一細胞にばらばらにするとき、又は組織から単一細胞を回収するときに用いられる濃度であればよい。プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、金属プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ又はＮ末端スレオニンプロテアーゼであることが好ましい。さらに、前記プロテアーゼがトリプシン、コラゲナーゼ又はジスパーゼであることが好ましい。
　また、本発明の細胞製剤に使用されるＭｕｓｅ細胞を含む細胞画分は、上記の外的ストレス刺激による手段に加えて又はそれに代えて、磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）（例えば、ａｕｔｏＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏ　Ｓｅｐａｒａｔｏｒ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ　Ｉｎｃ．）を用いて濃縮されてもよい。
　また、本発明の細胞製剤に使用される上記特徴を有するＭｕｓｅ細胞は、静脈投与等により生体に投与後、脊髄梗塞部位の組織に遊走及び生着する。その後、Ｍｕｓｅ細胞は、該組織を構成する細胞に分化し、脊髄梗塞又はこれに関連する症状及び疾患を治療等するものと考えられる。
（２）細胞製剤及び医薬組成物の調製及び使用
　本発明の細胞製剤は、限定されないが、上記（１）で得られたＭｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団を生理食塩水や適切な緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）に懸濁させることによって得られる。この場合、自家又は他家の組織から分離したＭｕｓｅ細胞数が少ない場合には、細胞移植前に細胞を培養して、所定の細胞濃度が得られるまで増殖させてもよい。なお、すでに報告されているように（国際公開第ＷＯ２０１１／００７９００号パンフレット）、Ｍｕｓｅ細胞は、腫瘍化しないため、生体組織から回収した細胞が未分化のまま含まれていても癌化の可能性が低く安全である。また、回収したＭｕｓｅ細胞の培養は、特に限定されないが、通常の増殖培地（例えば、１０％仔牛血清を含むα－最少必須培地（α－ＭＥＭ））において行うことができる。より詳しくは、上記国際公開第ＷＯ２０１１／００７９００号パンフレットを参照して、Ｍｕｓｅ細胞の培養及び増殖において、適宜、培地、添加物（例えば、抗生物質、血清）等を選択し、所定濃度のＭｕｓｅ細胞を含む溶液を調製することができる。ヒト対象に本発明の細胞製剤を投与する場合には、ヒトの腸骨から数ｍｌ程度の骨髄液を採取し、例えば、骨髄液からの接着細胞として骨髄間葉系幹細胞を培養して有効な治療量のＭｕｓｅ細胞を分離できる細胞量に達するまで増やした後、Ｍｕｓｅ細胞をＳＳＥＡ－３の抗原マーカーを指標として分離し、自家又は他家のＭｕｓｅ細胞を細胞製剤として調製することができる。あるいは、例えば、Ｍｕｓｅ細胞をＳＳＥＡ－３の抗原マーカーを指標として分離後、有効な治療量に達するまで細胞を培養して増やした後、自家又は他家のＭｕｓｅ細胞を細胞製剤として調製することができる。
　また、Ｍｕｓｅ細胞の細胞製剤への使用においては、該細胞を保護するためにジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）や血清アルブミン等を、細菌の混入及び増殖を防ぐために抗生物質等を細胞製剤に含有させてもよい。さらに、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）や間葉系幹細胞に含まれるＭｕｓｅ細胞以外の細胞又は成分を細胞製剤に含有させてもよい。当業者は、これら因子及び薬剤を適切な濃度で細胞製剤に添加することができる。このように、Ｍｕｓｅ細胞は、各種添加物を含む医薬組成物として使用することも可能である。
　上記で調製される細胞製剤又は医薬組成物中に含有するＭｕｓｅ細胞の数は、脊髄梗塞に対する治療効果、例えば、運動機能障害の改善、感覚障害の改善等の効果が得られるように、対象の性別、年齢、体重、患部の状態、使用する細胞の状態等を考慮して、適宜、調整することができる。対象とする個体はヒトなどの哺乳動物を含むがこれに限定されない。なお、本明細書で使用される場合、「改善」とは、脊髄梗塞、これに起因した症状又は状態の治療、予防、好転、悪化防止、遅延、又は該疾患の進行の逆転、防止若しくは遅延をいう。また、本発明の細胞製剤は、単回投与でもよいが、所望の治療効果が得られるまで、複数回（例えば、２～１０回、又は、それ以上）、適宜、間隔（例えば、１日に２回、１日に１回、１週間に２回、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、１カ月に１回、２カ月に１回、３カ月に１回、６カ月に１回など）をおいて投与されてもよい。投与の時期は、治療効果が得られる限り、発症初期、中期、後期のいずれでもよい。
　治療上有効量としては、対象の状態にもよるが、例えば、一個体あたり一回につき１×１０３細胞～１×１０１１細胞、好ましくは１×１０４細胞～１×１０１０細胞、さらに好ましくは１×１０５細胞～１×１０９細胞などが挙げられる。また、本発明の細胞製剤は、特に限定されないが、脊髄に直接に投与されてもよく、また、静脈内に投与されてもよい。
　本発明の細胞製剤（又は医薬組成物）には、ヒト由来のＭｕｓｅ細胞を使用し得るが、投与される対象が該細胞と異種の関係にある対象（例えば、マウス、ラット）には、異種細胞の生体内で拒絶反応を抑制するために、異種細胞の投与前又は同時に免疫抑制剤（シクロスポリンなど）が投与し得る。なお、本発明によれば、本発明の細胞製剤及び医薬組成物を運動ニューロン疾患の治療等に適用する場合において、このような免疫抑制剤を併用してもよく又は併用しなくてもよい。また、本発明の細胞製剤及び医薬組成物を患者に投与する場合、特に、免疫抑制剤を併用しないことも好ましい態様となる。
　このように本発明の細胞製剤の適切な使用により、対象における脊髄梗塞を治療し、予防し、軽減し及び／又は発症を遅延されることを目的とするものである。本明細書で使用される場合、「治療」とは、脊髄梗塞に起因する障害（例えば、運動機能障害及び感覚障害）を抑制すること又は完全に消失させることをいう。「予防」とは、脊髄梗塞に起因する障害の発症の防止や遅延、又は該障害の危険性の低下などを指す。
３．ラット脊髄梗塞モデルの作製
　本明細書においては、本発明の細胞製剤等による脊髄梗塞に伴う脳障害（例えば、運動の質の異常、神経学的発達の異常）の改善及び治療効果を検討するために、人為的に作製したラット脊髄梗塞モデルを使用することができる。該モデルは、後述の実施例１に記載されるように、例えば、０．７μＬのエノドセリン－１（ＥＴ－１）（２．５ｍｇ／ｍｌ）を第１３胸髄に４０°の角度、深さ１．５ｍｍ（フューズドシリカチューブを１．５ｍｍの長さに調整）で左右脊髄に注入することにより作製することができる。
４．脊髄梗塞モデルラットにおけるＭｕｓｅ細胞による改善及び治療効果
　本発明の細胞製剤及び医薬組成物は、ヒトを含む哺乳動物における脊髄梗塞に起因する脊髄虚血性障害（運動機能障害、感覚障害など）を改善及び／又は治療することができる。本発明によれば、上記で作製した脊髄梗塞ラットモデルを用いて、実験的に脊髄梗塞に起因する脊髄虚血性障害のラットにおけるＭｕｓｅ細胞投与による症状の改善等を検討し、該Ｍｕｓｅ細胞の効果を評価することができる。具体的な評価方法としては、ラットを用いた運動機能障害（例えば、運動麻痺）、感覚障害、及び膀胱直腸障害を評価する一般的な実験系を用いて行うことができる。運動機能評価としては、限定されないが、オープンフィールド試験（Ｏｐｅｎ　Ｆｉｅｌｄ　Ｔｅｓｔ）、キャットウォーク試験（Ｃａｔ　Ｗａｌｋ　Ｔｅｓｔ）、フットフォールト試験、トレッドミル試験などが挙げられる。また、感覚機能評価としては、限定されないが、ｖｏｎ　Ｆｒｅｙ試験（痛覚）、ホットプレート試験（温度）などが挙げられる。
　「オープンフィールド試験」は、新奇な一定の空間（例えば、６０（Ｗ）×６０（Ｄ）×４０（Ｈ）ｃｍのボックス）に被験動物を入れ、被験動物の探索行動などの情動行動を観察することに基づく。観察者が被験動物の行動を実際に記録するとともに、ビデオカメラでも撮影し、データを抽出し、活動性／情動性の指標（例えば、移動距離、静止時間、中心での滞在率）を評価することができる。
　「キャットウォーク試験」は、内部にＬＥＤを照射した透明なガラス板の上を被験動物に歩かせ、内部全反射の原理で接触面だけを光らせた足跡を下からビデオ撮影した画像により、パソコンのソフトウェアで解析し、被験動物の肢の動きや歩行状態の評価を行うことができる。
　「フットフォールト試験」は、四肢機能の運動欠陥（一般的には後肢）及び移動運動中の配置障害を評価する方法であり、被験動物を開口部を有する高い平らなグリッドに配置し、足が開いたグリッドからすべる度に「フットフォールト」として記録し、障害の程度を容易に計測する方法である。
　「トレッドミル試験」は、被験動物をトレッドミル上で一定の速度で歩行させ、徐々に負荷をかけることによって運動機能を評価する試験である。
　「ｖｏｎ　Ｆｒｅｙ試験」は、疼痛感受性を評価するための生理学的な手法であり、機械的な刺激により被験動物の感触や痛覚の閾値を測定する試験である。
　「ホットプレート試験」は、被験動物の疼痛感受性を評価する手法であり、被験動物が熱された表面に触れることにより、その痛覚反応を観察し、疼痛の存在や程度を評価する試験である。
　以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
材料及び方法
１．ラット脊髄梗塞モデルの作製
　本研究における動物実験は東北大学大学院医学系研究科動物実験委員会の審査及び承認のもとに実施された（承認番号：２０２０医動－１４６、２０２２医動－０７３）。８週齢オスＷｉｓｔｅｒラット（Ｊａｐａｎ　ＳＬＣ，Ｉｎｃ．，Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）を用いた。ラットは温度２２～２５℃、１２時間の明暗サイクル（午前８時から午後８時まで点灯）に保たれた室内でケージに入れ、餌と水を自由に摂取できるようにした。なお、本実施例で使用されるラット脊髄梗塞モデル及びその作製法については、本発明者らによるStroke Vasc Neurol . 2024 Jun 21:svn-2023-002962. doi: 10.1136/svn-2023-002962も参照されたい。
（１）対流増強送達（Ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ－ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ；ＣＥＤ）技術
　ラット脊髄梗塞モデルを作製するために、先行文献を参考に対流増強送達（ＣＥＤ）技術を用いた（Endo T, Fujii Y, Sugiyama SI, et al. Properties of convective delivery in spinal cord gray matter: laboratory investigation and computational simulations. J Neurosurg Spine. Feb 2016;24(2):359-366. doi:10.3171/2015.5.SPINE141148；Ogita S, Endo T, Sugiyama S, et al. Convection-enhanced delivery of a hydrophilic nitrosourea ameliorates deficits and suppresses tumor growth in experimental spinal cord glioma models. Acta Neurochir (Wien). May 2017;159(5):939-946. doi:10.1007/s00701-017-3123-2を参照されたい）。１０μＬのハミルトンシリンジに、ポリエチレンチューブ（６０１０－３５６０６；内径２５０μｍ、ＧＬ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を接続し、先端には２７Ｇ針とフューズドシリカチューブ（ＴＳＰ１００１７０；内径／外径：１００／１７０μｍ、Ｍｏｌｅｘ，Ｌｉｓｌｅ，ＩＬ）を用いることで穿刺システムを確立した。５．０％イソフルランにより麻酔を導入し、２．０％で維持した。定位固定装置（ＮＡＲＩＳＨＩＧＥ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）にラットを腹臥位に固定し、ヒーティングパッド（ＢＷＴ－１００Ａ，Ｂｉｏ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ　Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｎａｇｏｙａ，Ｊａｐａｎ）を用いて術中直腸温を３６～３７℃に維持した。背部を剃毛し、第１２胸椎から第１腰椎の範囲にわたり、約３ｃｍの背側正中切開を置いた。第１３胸椎弓を切除し背側脊髄を広範に露出した。後根が起始する高さよりやや腹側の側索を穿刺部位として選択した。硬膜、くも膜を２７Ｇ針で穿刺し、１．５ｍｍに調整したフューズドシリカチューブを刺入した。次に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解した４．０％Ｅｖａｎｓ　Ｂｌｕｅ（０５６－０４０６１，ＦＵＪＩＦＩＬＭ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を注入し、穿刺角度の最適化を図った。注入速度は０．２μＬ／分とした。ラットはイソフルラン過剰投与で犠牲死させ、脊髄を摘出し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で浸漬固定を行った。脊髄断面を顕微鏡（Ｓｔｅｍｉ　３０５，ＺＥＩＳＳ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で観察した。
（２）エンドセリン－１（ＥＴ－１）の定位局所注入
　エンドセリン－１（ＥＴ－１；Ｅ７７６４，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（Yanagisawa M, Kurihara H, Kimura S, et al. A novel potent vasoconstrictor peptide produced by vascular endothelial cells. Nature. Mar 31 1988;332(6163):411-5. doi:10.1038/332411a0）を生理食塩水に溶解して２．５ｍｇ／ｍｌ濃度に調整し、０．２μＬ／分の速度で０．７μＬ注入した。針先は５分間静置後に、１分間かけて抜去した。穿刺部位の外側の筋肉を８－０モノフィラメント縫合糸でマーキングした。止血を確認後、脊柱起立筋と皮膚を縫合閉鎖した。動物は排尿能力が回復するまで、排尿を補助するために連日用手圧迫を行った。
（３）行動評価
　全ての動物は、術前、術後２時間、術後１日目、３日目、５日目、７日目、以後術後５６日目まで週１回、死亡するまで後肢運動機能を評価した。各々のラットの後肢運動は５分間ビデオ撮影し記録した上で、Ｂａｓｓｏ，Ｂｅａｔｔｉｅ，Ｂｒｅｓｎａｈａｎ（ＢＢＢ）運動機能スケール（ｌｏｃｏｍｏｔｏｒ　ｓｃａｌｅ）を用いて評価した（Basso DM, Beattie MS, Bresnahan JC. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. J Neurotrauma. Feb 1995;12(1):1-21. doi:10.1089/neu.1995.12.1；Metz GA, Merkler D, Dietz V, Schwab ME, Fouad K. Efficient testing of motor function in spinal cord injured rats. Brain Res. Nov 17 2000;883(2):165-77. doi:10.1016/s0006-8993(00)02778-5を参照されたい）。撮影者と評価者は異なる者とし、評価者に対し処置内容を盲検化した上で行動評価を行った。行動評価の時点で、体重も測定した。なお、評価に使用されるＢＢＢ運動機能スコアの点数表を表１に示す。
（４）病理組織学的評価
　ラットをイソフルラン過量投与で犠牲死させ、ＰＢＳで心内灌流を行った後、４％ＰＦＡで灌流した。脊髄を摘出し、４℃で一晩浸漬固定した。その後、組織を１５％、２０％、２５％スクロース溶液でスクロース置換を行い、Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ　Ｏ．Ｃ．Ｔ．化合物（４５８３，ＳＡＫＵＲＡ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）に包埋し、薄切切片（～７μｍ厚）を作製した。切片は、２０％ＢｌｏｃｋＡｃｅ（ＵＫＢ４０，ＫＡＣ　Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）、５％ウシ血清アルブミン（０１８６０－６５，Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ，ＩＮＣ．，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００（１６８－１１８０５，Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）を含むブロッキング液中でインキュベートした後、以下の一次抗体のいずれかを用いて４℃で一晩インキュベートした；ウサギ抗ＮｅｕＮ（１：５００；ａｂ１７７４８７，Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）、ヤギ抗Ｉｂａ１（１：５００；ａｂ５０７６，Ａｂｃａｍ）、マウス抗ＧＦＡＰ（１：５００；Ｇ３８９３，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ウサギ抗ＧＳＴ－ｐｉ（１：２００；３１２，ＭＢＬ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）、またはウサギ抗内皮細胞抗体（ＲＥＣＡ－１；１：１００；ａｂ９７７４，Ａｂｃａｍ）。
　切片をＰＢＳで洗浄した後、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８標識ロバ抗ヤギＩｇＧ、マウスＩｇＧ、ウサギＩｇＧ（１：２００，それぞれ７０５－５４５－００３，７１５－５４６－１５０，７１１－５８６－１５２，Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ．）と４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ；１：５００，Ｄ９５４２，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄、ＳｌｏｗＦａｄｅ　Ｇｏｌｄ　ａｎｔｉｆａｄｅ試薬（Ｓ３６９３７，Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で封入し、レーザー共焦点顕微鏡（Ｅｃｌｉｐｓｅ　Ｔｉ，Ｎｉｋｏｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で観察した。穿刺断面において、ＮｅｕＮとＴＵＮＥＬについては前角と後角からそれぞれ６エリア（１フィールドあたり２００×２００μｍ）と１０エリア（１フィールドあたり１５０×１５０μｍ）を、ＲＥＣＡ－１については腹側と背側の灰白質と白質からそれぞれ１０エリア（１フィールドあたり１５０×１５０μｍ）を無作為に選択した。シグナル陽性細胞を数え、単位面積当たりの細胞数（細胞／ｍｍ２）を算出した。
（５）トリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ）染色
　ＥＴ－１脊髄局所注入後、７日目に採取した脊髄を厚さ３．０ｍｍにスライスし、２％ＴＴＣ／ＰＢＳ中で３７℃、３０分間インキュベートした後、４％ＰＦＡで固定した。正常ラット（８週齢）の脊髄も染色した。
（６）ＴｄＴ媒介ｄＵＴＰニックエンドラベリング（ＴＵＮＥＬ）アッセイ
　ＴＵＮＥＬアッセイは、インサイチュ細胞死検出キット（ＴＭＲ　Ｒｅｄ，Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いた。陰性対照には、ＴＵＮＥＬ反応混合液の代わりにラベル溶液を用いた。陽性対照として、ＤＮａｓｅで処理した正常脊髄を用いた。
２．Ｍｕｓｅ細胞の分離
　ヒト骨髄由来ＭＳＣ（Ｌｏｎｚａ　Ｊａｐａｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用した。過去の文献（Kuroda Y, Wakao S, Kitada M, Murakami T, Nojima M, Dezawa M. Isolation, culture and evaluation of multilineage-differentiating stress-enduring (Muse) cells. Nature protocols. 2013;8(7):1391-415. doi:10.1038/nprot.2013.076を参照されたい）に従い、ダルベッコ変法イーグル培地（低グルコース）（ＤＭＥＭ；Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ；Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）、０．１ｍｇ／ｍＬカナマイシン（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて１０ｃｍディッシュで３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。継代数７回から９回のＭＳＣを使用しＭｕｓｅ細胞を以下の通り分離した。１次抗体としてラット抗ＳＳＥＡ－３　ＩｇＭ抗体（１：１０００；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、アイソタイプ対照としてラットＩｇＭκ鎖アイソタイプ対照（１：１０００；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を１時間反応させた。２次抗体としてＦＩＴＣ標識抗ラットＩｇＭ抗体（１：１００；Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ　Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を１時間、３次抗体として抗ＦＩＴＣマイクロビーズ（１：５０；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ　Ｉｎｃ．，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を３０分間反応させ、ＭＡＣＳ（ａｕｔｏＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏ　Ｓｅｐａｒａｔｏｒ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ　Ｉｎｃ．）によりＳＳＥＡ－３陽性細胞を分離した。細胞分離後、ＢＤ　ＦＡＣＳ　Ａｒｉａ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ　Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を用いてＭＡＣＳで濃縮した細胞中のＳＳＥＡ－３陽性細胞の割合を解析した。ＳＳＥＡ－３陽性細胞が７０％以上含まれているものをＭＡＣＳ－Ｍｕｓｅ細胞と定義し、移植細胞として用いた。一部のＭＳＣには過去の文献（Shono Y, Kushida Y, Wakao S, et al. Protection of liver sinusoids by intravenous administration of human Muse cells in a rat extra-small partial liver transplantation model：American Journal of Transplantation. Jun 2021;21(6):2025-2039. doi: 10.1111/ajt.16461を参照されたい）を参考にレンチウイルスを用いてＡｋａｌｕｃ／ｐｃＤＮＡ３を導入し、１次抗体としてラット抗ＳＳＥＡ－３　ＩｇＭ抗体（１：１０００；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、２次抗体としてアロフィコシアニン標識抗ラットＩｇＭ抗体（１：１００；Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ．）を反応させ、ＦＡＣＳを用いてＳＳＥＡ－３陽性細胞とＳＳＥＡ－３陰性細胞を分離した。ＭＡＣＳにより分離したＭｕｓｅ細胞を模して、ＳＳＥＡ－３陽性細胞の割合が７０％となるように分離した細胞を混和し、「Ａｋａｌｕｃ－Ｍｕｓｅ細胞」とした。
３．静脈内投与による細胞移植
　脊髄梗塞モデル作製日をＤａｙ　０（０日目）と定義する。術後２４時間後（Ｄａｙ　１（１日目））に行動評価を行い、ＢＢＢ運動機能スコア（ｌｏｃｏｍｏｔｏｒ　ｓｃｏｒｅ）が０点の個体を選択した。以下の如く無作為に群分けを行った：脊髄梗塞モデルにＰＢＳを投与するビヒクル群、ＭＳＣ　４００，０００細胞投与群、Ｍｕｓｅ　４００，０００細胞投与群。いずれの移植細胞もＰＢＳ　４００μＬに懸濁し、経陰茎静脈的に投与した。Ｍｕｓｅ細胞投与群に関しては、行動評価実験ではＭＡＣＳで濃縮した細胞（ＭＡＣＳ－Ｍｕｓｅ細胞）を投与した。生体内分布の評価実験ではＡｋａｌｕｃ－Ｍｕｓｅ細胞またはＡｋａｌｕｃ－ＭＳＣを投与し、免疫組織化学評価も行った（Iwano S, Sugiyama M, Hama H, et al. Single-cell bioluminescence imaging of deep tissue in freely moving animals. Science. Feb 23 2018;359(6378):935-939. doi:10.1126/science.aaq1067を参照されたい）。
４．細胞移植ラットの行動評価
　各々のラットの後肢運動は５分間ビデオ撮影し記録した上で、Ｂａｓｓｏ，Ｂｅａｔｔｉｅ，Ｂｒｅｓｎａｈａｎ（ＢＢＢ）運動機能スケールを用いて評価した（Basso DM, et al., 1995（前掲）；Metz GA, et al., 2000（前掲）を参照されたい）。直径１００ｃｍの円形プールの上で自由に行動させた。撮影者と評価者は異なる者とし、評価者に対し処置内容を盲検化した上で行動評価を行った。全ての動物は、術後２時間、及びＤａｙ　１に行動評価を行い、Ｄａｙ　１時点でＢＢＢスコアが０点の個体を選択し、それ以外の個体は解析から除外した。ラット脊髄梗塞モデルを無作為に３群に振り分け、（１）ＭＡＣＳ－Ｍｕｓｅ細胞投与群（ＭＡＣＳ－Ｍｕｓｅ群）、（２）ＭＳＣ投与群（ＭＳＣ群）、（３）ＰＢＳ投与群（ビヒクル群）の各種細胞を経静脈的に投与した。ＭＡＣＳ－Ｍｕｓｅ群１３匹、ＭＳＣ群１２匹、ビヒクル群１２匹のラットモデルを使用した。以降はＤａｙ　２、３、５、７、以後Ｄａｙ　５６まで週に１回、後肢運動機能を評価した後にＤａｙ　５６に犠牲死させた。行動評価の時点で、体重も測定した。Ｄａｙ　５６までに死亡した個体は解析から除外した。
５．移植細胞の生体内分布の評価
　経静脈投与後のＭｕｓｅ細胞の生体内での分布を観察する目的で、レンチウイルスを用いてＭＳＣにＶｅｎｕｓ－Ａｋａｌｕｃを導入した。まず、Ｉｗａｎｏ（Iwano S, et al., 2018（前掲））により提供されたｐｃＤＮＡ３　Ｖｅｎｕｓ－ＡｋａｌｕｃをベクタープラスミドであるｐＷＰＸＬに挿入し、ｐＷＰＸＬ－Ｖｅｎｕｓ－Ａｋａｌｕｃを構築した。次に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてｐＷＰＸＬ－Ｖｅｎｕｓ－ＡｋａｌｕｃをパッケージングプラスミドであるｐＭＤ２Ｇ、エンベローププラスミドであるｐＣＭＶ　ｄｅｌｔａＲ８．７４と共にレンチウイルスパッケージ用細胞であるＬｅｎｔｉＸ－２９３Ｔ細胞（ＴａＫａＲａ　Ｂｉｏ　Ｉｎｃ，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）に導入した。３日間培養した後、レンチウイルス液である上清を回収、遠心し、０．４５μｍフィルターを通した上でＭＳＣに導入した。これをＶｅｎｕｓ（＋）細胞（Ａｋａｌｕｃ－ＭＳＣｓ）とＶｅｎｕｓ（＋）／ＳＳＥＡ－３（＋）の二重陽性細胞（Ａｋａｌｕｃ－Ｍｕｓｅ細胞）としてＦＡＣＳを用いて分離した。Ａｋａｌｕｃ－Ｍｕｓｅ細胞を分離するため、１次抗体としてラット抗ＳＳＥＡ－３　ＩｇＭ抗体（１：１０００；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、２次抗体としてアロフィコシアニン標識抗ラットＩｇＭ抗体（１：１００；Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ．）を用いた。上記行動評価に従い、脊髄梗塞モデル作製後から２４時間後にモデル動物を無作為に３群に振り分け、（１）Ａｋａｌｕｃ－Ｍｕｓｅ細胞４００，００００個／４００μＬ　ＰＢＳ（Ａｋａｌｕｃ－Ｍｕｓｅ群）、（２）Ａｋａｌｕｃ－ＭＳＣ細胞４００，００００個／４００μＬ　ＰＢＳ（Ａｋａｌｕｃ－ＭＳＣ群）、（３）４００μＬ　ＰＢＳ（ビヒクル群）の各種細胞を経静脈的に投与した。各群ｎ＝３のラットモデルを使用した。Ｍｕｓｅ細胞とＭＳＣの生体内での局在はＩＶＩＳ　Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　ＣＴ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて、Ｄａｙ　７に評価した。ラットモデルはＡｋａｌｕｃの人工基質である０．５ｍｌの１５－ｍＭ　ＡｋａＬｕｍｉｎｅ－ＨＣＬを経静脈的に投与した５分後に過剰量のイソフルランを用いて犠牲死させ、すみやかに各臓器を摘出した。各臓器は０．５ｍＭ　ＡｋａＬｕｍｉｎｅ－ＨＣＬに浸漬させた後、Ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｉｍａｇｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ（ＩＶＩＳ）によって撮像した。Ｍｕｓｅ細胞とＭＳＣの局在は臓器表面の光度の合計Ｔｏｔａｌ　Ｆｌｕｘ（光子／ｓ；光強度）で評価した。脊髄組織のＴｏｔａｌ　Ｆｌｕｘは脊髄へのＥＴ－１注入部位を中心として３ｃｍの範囲で評価した。３ｍｍ間隔で細切し、各セクションのＴｏｔａｌ　Ｆｌｕｘの総和をその個体の数値と定義した。光度の定量には　Ｌｉｖｉｎｇ　Ｉｍａｇｅ　ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖｅｒ．４．５，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用した。Ａｋａｌｕｃ－Ｍｕｓｅ群とＡｋａｌｕｃ－ＭＳＣ群の各臓器のＴｏｔａｌ　ｆｌｕｘはビヒクル群の各臓器のＴｏｔａｌ　ｆｌｕｘ（自家蛍光）を減じた上で評価した。
６．細胞移植ラット脊髄の病理組織学的評価
　Ｄａｙ　５６にイソフルラン過量投与によりラットを犠牲死させ、上記１（４）と同様にして、脊髄の病理組織学的評価を行った。生体内評価実験で用いた脊髄組織も病理組織学的評価を行った。一次抗体は以下のいずれかを用いた：ウサギ抗ヒトミトコンドリア（１：２００，ａｂ１３３７８９，Ａｂｃａｍ）、マウス抗ＮｅｕＮ（１：２００；ＭＡＢ３７７，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、マウス抗ＭＡＰ－２（１：２００；Ｍ１４０６，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、マウス抗βＴＵＢＬＩＮＩＩＩ（１：２００；Ｔ８６６０，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ヤギ抗Ｉｂａ１（１：５００；ａｂ５０７６，Ａｂｃａｍ）、マウス抗ＧＦＡＰ（１：５００；Ｇ３８９３、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ヤギ抗ＧＳＴ３／ＧＳＴ－ｐｉ（１：５０；ａｂ５３９４３，ａｂｃａｍ）、ヤギ抗ＣＤ３１（１：２００；ＡＦ３６２８、ＲＤ　ＳＹＳＴＥＭ、ＭＮ、ＵＳＡ）、チキン抗ＧＦＰ（１：１０００；ａｂ１３９７０、Ａｂｃａｍ）。二次抗体としては、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８標識ロバ抗ウサギＩｇＧ、チキンＩｇＧ（１：２００、それぞれ７１１－５８６－１５２，７０３－５４５－１５５，Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ．）またはＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５９４標識ロバ抗マウスＩｇＧ、ヤギＩｇＧ（１：２００，それぞれ７１５－５８６－１５０，７０５－５８５－００３，Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ．）を用いた。脊髄梗塞発症後５６日目の個体に関しては、脊髄梗塞部位を中心として吻尾側方向に９ｍｍの範囲において脊髄前角を中心として８００×８００μｍのエリアを左右２箇所選択した。ヒトミトコンドリア陽性細胞を数え、各断面における単位面積当たりの細胞数（細胞／ｍｍ２）を算出した。
７．統計学的解析
　全ての統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ　Ｐｒｉｓｍソフトウェアパッケージ、バージョン１０．０．２（ＧｒａｐｈＰａｄ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて行った。結果は平均値±標準誤差で示した。２群以上の比較には２元配置分散分析とＴｕｋｅｙの正直有意差検定を用いた。２群間の比較にはｔ検定を用いた。有意水準はＰ＜０．０５（＊）とした。
実施例１．ラット脊髄梗塞モデルの作製
　０．７μＬのエノドセリン－１（ＥＴ－１）（２．５ｍｇ／ｍｌ）を第１３胸髄に４０°の角度、深さ１．５ｍｍ（フューズドシリカチューブを１．５ｍｍの長さに調整）で左右脊髄に注入することによりラット脊髄梗塞モデルを作製した（以下、「ＥＴ－１群」と呼ぶ）。
実施例２．ラット脊髄梗塞モデルに対するＭｕｓｅ細胞静脈投与による後肢運動機能の改善
　細胞投与実験の実験系シェーマを図１に示した。モデル作製２４時間後、ＭＡＣＳにより濃縮したＭｕｓｅ細胞（ＭＡＣＳ－Ｍｕｓｅ細胞）（図２）、ＭＳＣ、もしくはＰＢＳを投与した。観察中に死亡したラットはグラフから除外した。各群におけるＢＢＢ運動機能スコアの推移を図３に示した。ＭＡＣＳ－Ｍｕｓｅ群のＢＢＢ運動機能スコアは、ＭＳＣ群、ビヒクル群に対し、Ｄａｙ　３５以降、統計学的有意に高値であった。Ｄａｙ　５６時点におけるＢＢＢ運動機能スコアは、ＭＡＣＳ－Ｍｕｓｅ群９．５±１．７、ＭＳＣ群４．７±１．７、ビヒクル群４．５±１．３であった（ＭＡＣＳ－Ｍｕｓｅ群対ＭＳＣ群；ｐ＜０．０１、ＭＡＣＳ－Ｍｕｓｅ群対ビヒクル群；ｐ＜０．０１、ＭＳＣ群対ビヒクル群；有意差なし）。
実施例３．各群における体重推移
　体重は、各群Ｄａｙ　５６日目までモニターした。術前平均体重を１．０とし、体重変化は各時点での比率として算出した（図４）。Ｄａｙ　１において、ＭＡＣＳ－Ｍｕｓｅ群０．９３、ＭＳＣ群０．９３、ビヒクル群０．９４であった。Ｄａｙ　１４において、ＭＡＣＳ－Ｍｕｓｅ群１．００、ＭＳＣ群０．９６、ビヒクル群０．９６、Ｄａｙ　５６において、ＭＡＣＳ－Ｍｕｓｅ群１．２５、ＭＳＣ群１．２２、ビヒクル群１．２０であった。各観察時点、各群間の術前体重比は統計学的有意差を認めなかった。
実施例４．移植細胞の生体内分布評価
　Ａｋａｌｕｃ－Ｍｕｓｅ群、Ａｋａｌｕｃ－ＭＳＣ群において、Ｄａｙ　７時点で脊髄と肺でＡｋａｌｕｃのシグナルを認めた（図５Ａ及びＢ）。その他の臓器においてシグナルは認めなかった（図５Ｃ）。脊髄におけるＴｏｔａｌ　ＦｌｕｘはＡｋａｌｕｃ－Ｍｕｓｅ群３０６６．５±５３３．６、Ａｋａｌｕｃ－ＭＳＣ群１０７９．７±２１９．４であり、統計学的有意にＡｋａｌｕｃ－Ｍｕｓｅ群でシグナルの集積を認めた（ｐ＝０．０４９）。肺におけるＴｏｔａｌ　ＦｌｕｘはＡｋａｌｕｃ－Ｍｕｓｅ群８１９．５±４１１．８、Ａｋａｌｕｃ－ＭＳＣ群１６０６．６±９２５．５であり、Ａｋａｌｕｃ－ＭＳＣの方がシグナル集積を認めるものの統計学的有意差は認めなかった（ｐ＝０．５０、図５Ｄ）。
実施例５．細胞移植ラットの脊髄組織学的評価
　Ｍｕｓｅ細胞を移植したラット脊髄梗塞モデルの脊髄組織を用いて組織学的評価を行った。Ａｋａｌｕｃ－Ｍｕｓｅ群（Ｄａｙ　７）、及びＭＡＣＳ－Ｍｕｓｅ群（Ｄａｙ　５６）の、穿刺部周囲の脊髄組織を使用した（図６）。Ａｋａｌｕｃ－Ｍｕｓｅ群においてＧＦＰ陽性細胞を、ＭＡＣＳ－Ｍｕｓｅ群において、ヒトミトコンドリア陽性細胞を認めた。各染色の陽性対照と陰性対照を図７に示した。脊髄梗塞部位周辺の脊髄組織において、移植細胞がどのように分布しているか解析した（図８Ａ）。Ｄａｙ　５６時点でのＭＡＣＳ－Ｍｕｓｅ群において、ヒトミトコンドリア陽性細胞数（／ｍｍ２）は、梗塞中心から９ｍｍ吻側１０．９±２．８、６ｍｍ吻側１７．４±２．２、３ｍｍ吻側１４．３±４．２、梗塞中心１．８±１．２、３ｍｍ尾側１０．４±５．０、６ｍｍ尾側１８．０±４．０、９ｍｍ尾側１３．３±３．１であった（ｎ＝３、梗塞中心対６ｍｍ吻側、６ｍｍ尾側、ｐ＜０．０５、図８Ｂ）。
実施例６．Ｍｕｓｅ細胞の神経細胞及び血管構成細胞への分化
　ＭＡＣＳ－Ｍｕｓｅ群（Ｄａｙ　５６）の脊髄組織において、ヒトミトコンドリア抗体と神経細胞マーカーであるＮｅｕＮ、ＭＡＰ－２、ＴＵＪ－１、オリゴデンドロサイトマーカーであるＧＳＴ３／ＧＳＴ－ｐｉ、アストロサイトマーカーであるＧＦＡＰ、ミクログリアマーカーであるＩｂａ－１、及び血管内皮マーカーであるＣＤ３１との二重染色を施行した（図９）。各染色の陽性対照と陰性対照を図１０に示した。ＮｅｕＮ、ＭＡＰ２、ＴＵＪ１、ＧＳＴ３／ＧＳＴ－ｐｉ、ＣＤ３１との二重陽性を認めた。一方、ＧＦＡＰやＩｂａ－１との二重陽性は認めなかった。
実施例７．神経系細胞への分化効率
　ＮｅｕＮ、ＭＡＰ－２、ＧＳＴ３／ＧＳＴ－ｐｉ、ＧＦＡＰ、Ｉｂａ－１とヒトミトコンドリア抗体の二重陽性細胞数をカウントし、Ｍｕｓｅ細胞の神経への分化効率を調べた（ｎ＝３）。ヒトミトコンドリア抗体との二重陽性細胞の割合は、ＮｅｕＮ　７０．６±５．４％、ＭＡＰ－２　６８．０±１１．４％、ＧＳＴ３／ＧＳＴ－ｐｉ　１０．６±０．３％であった（図１１）。ＧＦＡＰ、Ｉｂａ－１との二重陽性は確認できなかった。
実施例８．血管内皮細胞への分化効率
　上記と同一のエリアにおいて、ヒトミトコンドリアとＣＤ３１の二重陽性細胞は１７．６±１．８％認めた（データ示さず）。
考察
　本研究では、ラット脊髄梗塞モデルに対して経静脈投与したＭｕｓｅ細胞は、梗塞脊髄組織に遊走及び生着し、免疫抑制薬を使用せずに８週間にわたり後肢運動機能が改善することを示した。加えて、後肢運動機能の改善効果はＭＳＣに対して統計学的有意に大きかった。
（１）ヒトＭｕｓｅ細胞の梗塞脊髄へのホーミング
　Ｄａｙ　７時点におけるＩＶＩＳ解析では脊髄組織でＡｋａｌｕｃシグナルを認め、さらに組織学的評価でもＡｋａｌｕｃ－ＧＦＰ陽性細胞を認めた。加えて、Ｄａｙ　５６におけるＭＡＣＳ－Ｍｕｓｅ群の組織学的評価ではヒトミトコンドリア陽性細胞を認めた。この結果は、Ｍｕｓｅ細胞が虚血性障害を受けた梗塞脊髄を認識して、脊髄にホーミングしたことを示している。Ｍｕｓｅ細胞が選択的に傷害臓器に遊走する現象は、心臓（Yamada Y, et al., 2018（前掲））、肺（Yabuki H, et al., 2018（前掲））、大動脈（Hosoyama K, Wakao S, Kushida Y, et al. Intravenously injected human multilineage-differentiating stress-enduring cells selectively engraft into mouse aortic aneurysms and attenuate dilatation by differentiating into multiple cell types. J Thorac Cardiovasc Surg. Jun 2018;155(6):2301-2313 e4. doi:10.1016/j.jtcvs.2018.01.098）、肝臓（Iseki M, et al., 2017（前掲））、腎臓（Uchida N, et al., 2017（前掲））でも確認されており、さらには脳梗塞モデル（Abe T, Aburakawa D, Niizuma K, et al. Intravenously Transplanted Human Multilineage-Differentiating Stress-Enduring Cells Afford Brain Repair in a Mouse Lacunar Stroke Model. Stroke. Feb 2020;51(2):601-611. doi:10.1161/STROKEAHA.119.026589）や外傷性脊髄損傷モデル（Kajitani T, Endo T, Iwabuchi N, et al. Association of intravenous administration of human Muse cells with deficit amelioration in a rat model of spinal cord injury. J Neurosurg Spine. Jan 1 2021;34(4):648-655. doi:10.3171/2020.7.SPINE20293）、ＡＬＳモデル（Yamashita T, Kushida Y, Wakao S, et al. Therapeutic benefit of Muse cells in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Sci Rep. Oct 13 2020;10(1):17102. doi:10.1038/s41598-020-74216-4）においても報告されている。Ｍｕｓｅ細胞の遊走メカニズムとしてＳ１Ｐ－Ｓ１Ｐ受容体２（Ｓ１ＰＲ２）軸が明らかとなっており（Yamada Y, et al., 2018（前掲））、Ｓ１ＰＲ２を発現しているＭｕｓｅ細胞は、障害組織から産生されるＳ１Ｐを感知して障害組織に遊走する能力を持つ。
　ＩＶＩＳにより静脈投与されたＡｋａｌｕｃ－Ｍｕｓｅ細胞の組織内局在を解析した。ＥＴ－１注入部位、つまり脊髄梗塞の中心ではＡｋａｌｕｃシグナルを認めず、その吻尾側方向周辺にシグナルを確認できた。Ｄａｙ　５６におけるＭＡＣＳ－Ｍｕｓｅ群脊髄組織の組織学的評価においても、脊髄梗塞中心でヒトミトコンドリア陽性細胞が少なく、吻尾側方向３－９ｍｍの方が多いという結果であった（図８Ｂ）。この結果はＩＶＩＳにおける結果と矛盾せず、静脈投与したＭｕｓｅ細胞がＤａｙ　７からＤａｙ　５６にかけて生着し続けていることを意味する。梗塞中心と比較して、完全には梗塞に至ってはいない、血流が残存している脊髄梗塞周辺領域において、より多くのＭｕｓｅ細胞が集積していたことが示唆された。
（２）ヒトＭｕｓｅ細胞の神経または血管構成細胞への自発的分化
　Ｍｕｓｅ細胞は障害組織へのホーミング後、アポトーシスを起こした細胞を貪食することにより自発的に組織特異的な細胞に分化自発的に分化し、障害組織に置き換わり、修復することが知られている（Iseki M, et al., 2017（前掲）；Kajitani T, et al., 2021（前掲））。マウス脳梗塞モデルに対してＭｕｓｅ細胞投与を行った研究では、生着したＭｕｓｅ細胞は観察断面において、ＮｅｕＮ陽性細胞が約６５％、ＭＡＰ－２陽性細胞が約３０％、ＧＳＴ－ｐｉ陽性細胞が約１０％観察され、ＧＦＡＰやＩｂａ－１陽性細胞は認めなかった（Uchida H, et al., 2017（前掲））。また、ラット外傷性脊髄損傷モデルに対してＭｕｓｅ細胞投与を行った研究では、ＭＡＰ－２陽性細胞が約５０％、ＧＦＡＰ陽性細胞が約２５％、ＧＳＴ－ｐｉ陽性細胞が約２５％観察された（Takahashi Y, Kajitani T, Endo T, et al. Intravenous Administration of Human Muse Cells Ameliorates Deficits in a Rat Model of Subacute Spinal Cord Injury. Int J Mol Sci. Sep 27 2023;24(19)doi:10.3390/ijms241914603）。本研究でも類似した結果が得られ、ヒトミトコンドリアとの二重陽性細胞の割合は、ＮｅｕＮ　７０．６±９．４％、ＭＡＰ－２　６８．０±１１．４％、ＧＳＴ３／ＧＳＴ－ｐｉ　１０．６±０．３％であった（ｎ＝３、図１１）。ヒトミトコンドリアとＣＤ３１の二重陽性細胞は１７．６±１．８％認めた。
（３）ラット脊髄梗塞モデルに対するヒトＭｕｓｅ細胞の後肢運動機能改善効果
　本研究では、ヒトＭｕｓｅ細胞を投与したラット脊髄梗塞モデルが、ＭＳＣ投与群やビヒクル群と比較して、統計学的有意に後肢運動機能の改善を示した。本実験結果から考えられる治療効果の機序としては、（ｉ）Ｍｕｓｅ細胞の神経細胞への分化、及び（ｉｉ）Ｍｕｓｅ細胞の血管内皮細胞への分化による血流改善効果が考えられる。脊髄への血流はＡｄａｍｋｉｅｗｉｃｚ動脈のみならず、側副血行路も重要とされる「Ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ　ｎｅｔｗｏｒｋ　ｃｏｎｃｅｐｔ」という考えが主流である（Griepp RB, Griepp EB. Spinal cord perfusion and protection during descending thoracic and thoracoabdominal aortic surgery: the collateral network concept. Ann Thorac Surg. Feb 2007;83(2):S865-9; discussion S890-2. doi:10.1016/j.athoracsur.2006.10.092）。静脈投与したＭｕｓｅ細胞は、神経細胞への分化のみならず、側副血行路の構築に寄与していることも治療機序の一部として推測される。
　一方、Ｄａｙ　５６時点でのＢＢＢ運動機能スコアはＭＳＣ群４．７±１．７、ビヒクル群４．５±１．３であり、この２群間での統計学的有意差は認めなかった。しかし、脊髄虚血性障害に対するＭＳＣ投与の先行文献は多数あり、治療効果として有効であると報告されている（Takahashi S, et al., 2018（前掲）；Kurose T, et al., 2019（前掲）；Yasuda N, Sasaki M, Kataoka-Sasaki Y, et al. Intravenous delivery of mesenchymal stem cells protects both white and gray matter in spinal cord ischemia. Brain Res. Nov 15 2020;1747:147040. doi:10.1016/j.brainres.2020.147040）。本実験において、ＭＳＣの有効な治療効果を認めなかった理由は以下の内容を考える。第一に、ラット脊髄虚血モデルに対するＭＳＣ投与に関する文献は、投与細胞数を１００万細胞としているものが多いが、本実験の投与細胞数は４０万細胞であり、既報とは投与条件が異なる。第二に、本研究では５６日間という長期間にわたる観察であり、散見される短期間の治療成績報告とは異なるものである。第三に、本実験は新規のラット脊髄梗塞モデルを用いたため、既報の大動脈遮断による脊髄梗塞モデルを使用した実験とは一概に比較できない可能性がある。
（４）Ｍｕｓｅ細胞の至適投与時期
　本実験のプロトコルでは、脊髄梗塞を生じた翌日にヒトＭｕｓｅ細胞を投与するものである。これは臨床において、大動脈術後脊髄梗塞が生じた場合、「術中脊髄梗塞発生から手術終了後に対麻痺を認知するまでの時間」を想定して設定した。脊髄梗塞発症翌日にＭｕｓｅ細胞を投与することで治療効果を認めたが、さらなる治療効果が得られる投与タイミングがある可能性もある。各タイムポイントで脊髄組織のＳ１Ｐ濃度を計測することで、最適化を図れるかもしれない。
（５）今後の展望
　本研究では、脊髄梗塞発症翌日にＭｕｓｅ細胞を投与し、免疫抑制薬を使用せずに５６日間という長期観察期間において後肢運動機能の改善を認めた。本プロトコルは実臨床に則したものであり、脊髄虚血性障害に対するＭｕｓｅ細胞治療は、今後新たな治療戦略として期待される。
結論
　エンドセリン－１を脊髄組織に局所注入することで、脊髄前角を中心とした梗塞を生じ、長期間脊髄機能障害が持続し、かつ長期間生存が得られる新規のラット脊髄梗塞モデルを確立した。５６日間にわたる行動評価と経時的な組織学的評価を行い、生存率を明らかにした成果は本研究が初めてである。ラット脊髄梗塞モデルに対して、脊髄梗塞発症翌日に免疫抑制剤無しにヒトＭｕｓｅ細胞を静脈投与することで、後肢運動機能改善を認めた。さらに、Ｍｕｓｅ細胞は梗塞脊髄にホーミングし、脊髄神経細胞、及び血管内皮細胞に分化し、神経機能回復に寄与したと考えられた。脊髄梗塞発症急性期にＭｕｓｅ細胞を経静脈投与という簡便な方法で投与し、免疫抑制薬を使用しなくとも、５６日間という長期間治療効果が持続する可能性が示唆された。
　本明細書に引用されるすべての特許、特許出願、及び他の刊行物の開示は、各個別の刊行物又は特許出願が、参照により援用されるように具体的かつ個別に指示された場合と同じ程度に、その全体が参照により本明細書に援用される。

Claims (12)

  1. 　生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞から分離されたＳＳＥＡ－３陽性の多能性幹細胞を含む、対象における脊髄梗塞を治療し、予防し、軽減し及び／又は発症を遅延させるための細胞製剤。
  2. 　外部ストレス刺激によりＳＳＥＡ－３陽性の多能性幹細胞が濃縮された細胞画分を含む、請求項１に記載の細胞製剤。
  3. 　ＭＡＣＳ及び／又はＦＡＣＳによりＳＳＥＡ－３陽性の多能性幹細胞が濃縮された細胞画分を含む、請求項１に記載の細胞製剤。
  4. 　多能性幹細胞がＣＤ１０５陽性である、請求項１～３のいずれか１項に記載の細胞製剤。
  5. 　多能性幹細胞がＣＤ１１７陰性及びＣＤ１４６陰性である、請求項１～３のいずれか１項に記載の細胞製剤。
  6. 　多能性幹細胞が、ＣＤ１１７陰性、ＣＤ１４６陰性、ＮＧ２陰性、ＣＤ３４陰性、ｖＷＦ陰性、及びＣＤ２７１陰性である、請求項１～３のいずれか１項に記載の細胞製剤。
  7. 　多能性幹細胞が、ＣＤ３４陰性、ＣＤ１１７陰性、ＣＤ１４６陰性、ＣＤ２７１陰性、ＮＧ２陰性、ｖＷＦ陰性、Ｓｏｘ１０陰性、Ｓｎａｉ１陰性、Ｓｌｕｇ陰性、Ｔｙｒｐ１陰性、及びＤｃｔ陰性である、請求項１～３のいずれか１項に記載の細胞製剤。
  8. 　多能性幹細胞が、以下の性質の全てを有する多能性幹細胞である、請求項１～３のいずれか１項に記載の細胞製剤：
    （ｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
    （ｉｉ）三胚葉のいずれかの胚葉の細胞に分化する能力を持つ；
    （ｉｉｉ）腫瘍性増殖を示さない；及び
    （ｉｖ）セルフリニューアル能を持つ。
  9. 　脊髄梗塞が、運動機能障害、感覚障害、又は膀胱直腸障害である、請求項１～３のいずれか１項に記載の細胞製剤。
  10. 　多能性幹細胞が脊髄梗塞部位の組織内に生着する能力を有する、請求項１～３のいずれか１項に記載の細胞製剤。
  11. 　ＳＳＥＡ－３陽性の多能性幹細胞を含む、対象における脊髄梗塞を治療し、予防し、軽減し及び／又は発症を遅延させるための細胞製剤の製造方法であって、前記ＳＳＥＡ－３陽性の多能性幹細胞を、生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞から分離する工程を含む方法。
  12. 　外部ストレス刺激及び／又はＭＡＣＳによりＳＳＥＡ－３陽性の多能性幹細胞を濃縮する工程を含む、請求項１１に記載の方法。
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