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WO2025168167A1 - Vegf-b蛋白、vegf-b蛋白活性肽段在制备预防和/或治疗急性前葡萄膜炎的药物中的应用 - Google Patents

Vegf-b蛋白、vegf-b蛋白活性肽段在制备预防和/或治疗急性前葡萄膜炎的药物中的应用

Info

Publication number
WO2025168167A1
WO2025168167A1 PCT/CN2025/092006 CN2025092006W WO2025168167A1 WO 2025168167 A1 WO2025168167 A1 WO 2025168167A1 CN 2025092006 W CN2025092006 W CN 2025092006W WO 2025168167 A1 WO2025168167 A1 WO 2025168167A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
vegf
peptide
protein
seq
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/CN2025/092006
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
李旭日
卢蔚斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhongshan Ophthalmic Center
Original Assignee
Zhongshan Ophthalmic Center
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhongshan Ophthalmic Center filed Critical Zhongshan Ophthalmic Center
Publication of WO2025168167A1 publication Critical patent/WO2025168167A1/zh
Pending legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1858—Platelet-derived growth factor [PDGF]
    • A61K38/1866—Vascular endothelial growth factor [VEGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents

Definitions

  • the present invention belongs to the field of biomedicine technology, and specifically relates to the use of VEGF-B protein and VEGF-B protein active peptide segments in the preparation of drugs for preventing and/or treating acute anterior uveitis.
  • vascular endothelial growth factor (VEGF-B) is a member of the VEGF family. It primarily binds to vascular endothelial growth factor receptor-1 (VEGFR-1) and neuropilin-1 (NRP-1) and is expressed in most tissues and organs.
  • VEGFR-1 vascular endothelial growth factor receptor-1
  • NRP-1 urokinase-type plasminogen activator
  • Uveitis is an inflammatory disease of the eye, primarily affecting the iris, ciliary body, and choroid. Severe cases can even lead to blindness, accounting for 10% to 15% of blindness worldwide and approximately 4% to 10% of blindness in China.
  • Acute anterior uveitis (AAU) is the most common type of uveitis, with an incidence of approximately 28% to 61%. Clinical manifestations of AAU include ciliary congestion, pronounced anterior chamber flare, sudden eye pain, redness, photophobia, and blurred vision. Severe cases can develop or worsen posterior synechiae and glaucoma, leading to irreversible vision loss or damage.
  • Clinically used drugs for the treatment of anterior uveitis include: 1) mydriatics and ciliary muscle paralytics, which can only relieve clinical symptoms such as pain and photophobia; 2) non-steroidal anti-inflammatory drugs, which are only effective for certain non-necrotizing anterior scleral inflammations, and systemic use increases the risk of gastrointestinal ulcers; 3) steroids, the main drugs for the treatment of uveitis, are divided into topical and systemic administration and have serious side effects.
  • Ocular side effects include cataracts, increased intraocular pressure, and glaucoma, and systemic side effects include diabetes, hypertension, peptic ulcers, insomnia, and osteoporosis; 4) immunomodulatory therapies, such as anti-TNF- ⁇ , anti-IL-6, and anti-IL-1 ⁇ therapies, can achieve better results when combined with traditional steroids or cellular immunosuppressants, but infections caused by immunosuppression are the main side effect. Because current drugs used in the treatment of acute anterior uveitis can only control inflammation to a certain extent and have serious side effects that can further lead to vision loss, there is an urgent need for safe and effective targeted drugs to prevent and treat acute anterior uveitis.
  • the purpose of the present invention is to provide the use of VEGF-B protein or VEGF-B protein active peptide segment in the preparation of a drug for preventing and/or treating acute anterior uveitis.
  • VEGF-B protein or an active peptide fragment of the VEGF-B protein in the preparation of a medicament for preventing and/or treating acute anterior uveitis is provided.
  • the VEGF-B protein and active peptide fragment of the VEGF-B protein provided by the present invention have excellent anti-inflammatory effects, can reduce the number of inflammatory cells in the eye and inhibit the expression of inflammatory factors, thereby playing a role in treating acute anterior uveitis, providing new ideas for the prevention and treatment of eye diseases, and has very broad application prospects in the medical field.
  • the drug for preventing and/or treating acute anterior uveitis is a drug for reducing ocular inflammatory cells.
  • the inflammatory cells include CD45 positive cells (CD45+ cells).
  • the active peptide segment of VEGF-B protein includes at least one of Peptide 1, Peptide 2, Peptide 3, Peptide 4 and Peptide 5; the amino acid sequence of Peptide 1 is shown as SEQ ID NO. 1, the amino acid sequence of Peptide 2 is shown as SEQ ID NO. 2, the amino acid sequence of Peptide 3 is shown as SEQ ID NO. 3, the amino acid sequence of Peptide 4 is shown as SEQ ID NO. 4, and the amino acid sequence of Peptide 5 is shown as SEQ ID NO. 5.
  • the active peptide segment of the VEGF-B protein includes Peptide 5.
  • Peptide 5 has a stronger anti-inflammatory effect.
  • VEGF-B protein or an active peptide segment of VEGF-B protein in the preparation of a drug for inhibiting macrophage M1 polarization.
  • the active peptide segment of the VEGF-B protein includes Peptide 5.
  • Peptide 5 has a stronger anti-inflammatory effect.
  • a medicine which comprises VEGF-B protein and/or VEGF-B protein active peptide segment as an active ingredient.
  • VEGF-B protein and VEGF-B protein active peptide fragments can reduce the number of inflammatory cells in the eye and inhibit the expression of inflammatory factors, have anti-acute anterior uveitis effects, and can inhibit macrophage M1 polarization. They can be used to prepare drugs for preventing and treating acute anterior uveitis or drugs for inhibiting macrophage M1 polarization, providing new ideas for the prevention and treatment of eye diseases and having very broad application prospects in the medical field.
  • Figure 1 shows the mRNA expression level of VEGF-B in the iris-ciliary body complex of mice in the normal group and the acute anterior uveitis model group.
  • Figure 2 shows the results of VEGF-B gene knockout promoting the inflammatory response in acute anterior uveitis.
  • A shows the mRNA expression level of VEGF-B in the iris-ciliary complex of VEGF-B knockout mice (Vegf-b -/- ) and their wild-type littermates (WT);
  • B shows the slit lamp microscopic observation of VEGF-B knockout mice (Vegf-b -/- ) and their wild-type littermates (WT) after modeling;
  • C shows the clinical severity score of VEGF-B knockout mice (Vegf-b -/- ) and their wild-type littermates (WT);
  • D and E show the hematoxylin-eosin (HE) staining and quantification of eye sections of VEGF-B knockout mice (Vegf-b -/- ) and their wild-type littermates (WT);
  • F and G show the fluorescence staining and quantification of eye sections of VEGF
  • FIG. 3 shows the results of VEGF-B protein inhibiting macrophage M1 polarization.
  • A shows the relative mRNA expression levels of inflammatory factors TNF- ⁇ , IL-6, and IL-1 ⁇ in THP-1 cells with siRNA knockdown of VEGF-B expression (si-VEGF-B) and normal THP-1 cells (si-NC);
  • B shows the mRNA expression levels of inflammatory factors TNF- ⁇ , IL-6, and IL-1 ⁇ in peritoneal macrophages from VEGF-B knockout mice (Vegf-b -/- ) and wild-type littermates (WT) after LPS treatment;
  • C, D, and E show the mRNA expression levels of inflammatory factors IL-1 ⁇ , IL-6, and TNF- ⁇ in THP-1 cells treated with lipopolysaccharide (LPS), bovine serum albumin (BSA), and VEGF-B protein, respectively.
  • LPS lipopolysaccharide
  • BSA bovine serum album
  • FIG4 shows the results of VEGF-B protein specifically inhibiting inflammatory response.
  • Figure 6 shows the results of VEGF-B protein treatment for acute anterior uveitis.
  • A shows the expression of VEGF-B protein in the iris-ciliary complex of LPS-treated AAV-VEGF-B and AAV-GFP mice;
  • B shows the results of slit lamp microscopy observation of LPS-treated AAV-VEGF-B and AAV-GFP mice;
  • C shows the clinical severity scores of LPS-treated AAV-VEGF-B and AAV-GFP mice;
  • D shows the flow cytometry results of LPS-treated AAV-VEGF-B and AAV-GFP mice;
  • E and F show the hematoxylin-eosin (HE) staining and quantification of eye sections of LPS-treated AAV-VEGF-B and AAV-GFP mice;
  • G and H show the fluorescence staining and quantification of eye sections of LPS-treated AAV-VEGF-B and AAV-GFP mice.
  • HE hematoxyl
  • Example 1 VEGF-B expression is correlated with acute anterior uveitis
  • mice C57 mice purchased from Jiangsu Jicui Yaokang Biotechnology Co., Ltd.
  • LPS lipopolysaccharide
  • mice were anesthetized with an intraperitoneal injection of 1% sodium pentobarbital (10 mL/kg), tropicamide was used to dilate the pupil, procainamide was used for corneal anesthesia, and sodium carboxymethylcellulose was used to prevent corneal desiccation.
  • LPS (1 ⁇ L/eye, 12.5 ng) was injected intravitreally using a sterile 5 ⁇ L syringe (Hamilton, 7633-01) and a 33-gauge blunt needle (Hamilton, 7803-05) through a 0.2 mm diameter puncture behind the mouse corneal limbus.
  • the iris-ciliary body complex of the mouse was removed, washed once with PBS, lysed with 500 ⁇ L Trizol, and transferred to a 1.5 mL centrifuge tube.
  • the VEGF-B mRNA expression level was detected on an ABI QuantStudio 6Flex device (Life Technologies) using the SYBR Green (ROCHE) kit.
  • Example 3 VEGF-B protein has the effect of inhibiting macrophage M1 polarization
  • the method for knocking down VEGF-B expression in THP-1 cells by siRNA is as follows:
  • THP-1 cells 1 ⁇ 10 6 THP-1 cells were seeded in each well of a 6-well plate. After induction of adherence, the transfection system was prepared according to the following scheme:
  • Solution A Add 100 ⁇ L of Opti-MEM to 6 ⁇ L of RNAiMax, mix gently, and let stand at room temperature for 5 minutes;
  • LPS was used to treat peritoneal macrophages from VEGF-B knockout mice (Vegf-b -/- ) and peritoneal macrophages from wild-type mice (WT) of the same littermates.
  • qRT-PCR was then used to detect the mRNA expression levels of inflammatory factors TNF- ⁇ , IL-6, and IL-1 ⁇ in peritoneal macrophages from VEGF-B knockout mice (Vegf-b /- ) and peritoneal macrophages from wild-type mice (WT) of the same littermates after LPS stimulation.
  • the results of qRT-PCR detection are shown in Figure 3B.
  • PCMs mouse peritoneal macrophages
  • THP-1 cells were treated with LPS and VEGF-B recombinant protein was added to the cells.
  • qRT-PCR was then used to detect the mRNA expression levels of inflammatory factors TNF- ⁇ , IL-6, and IL-1 ⁇ in THP-1 cells after LPS treatment.
  • the qRT-PCR test results are shown in Figure 3C-E.
  • Example 4 VEGF-B protein is specific for inhibiting inflammatory responses
  • BMDMs bone marrow-derived macrophages
  • the cells were then filtered through a 70 ⁇ m cell strainer and transferred to a 15 mL centrifuge tube.
  • the cells were centrifuged at 1500 rpm/min for 5 minutes, the supernatant discarded, and the tube was resuspended in red blood cell lysis buffer and allowed to stand for 5 minutes.
  • the tube was then centrifuged at 1500 rpm/min for 5 minutes.
  • the supernatant discarded and the tube was resuspended in cold bone marrow macrophage induction medium.
  • the tube was plated (2 ⁇ 10 6 viable cells/dish). On the third day of culture, half of the bone marrow macrophage induction medium was replaced, and on the fifth day, the entire medium was replaced. The tube was ready for subsequent experiments on the seventh day.
  • FIG. 5A The specific structural regions of the active peptides of VEGF-B167 protein, Peptide 1, Peptide 2, Peptide 3, Peptide 4, and Peptide 5, are shown in Figure 5A, and their sequences are shown in Table 2. As shown in Figure 5A, Peptide 1, Peptide 2, and Peptide 3 are located in the VEGFR1 binding region (KDR binding region), while Peptide 4 and Peptide 5 are located in the NRP1 binding region.
  • qRT-PCR was used to detect the mRNA expression levels of inflammatory factors TNF- ⁇ , IL-6, and IL-1 ⁇ in the CTL, LPS, VB FL, Peptide 1, Peptide 2, Peptide 3, Peptide 4, and Peptide 5 groups, respectively.
  • the qRT-PCR results are shown in Figure 5B.
  • Figure 5B As shown in Figure 5B, compared with the CTL group, the expression levels of inflammatory factors TNF- ⁇ , IL-6, and IL-1 ⁇ in the LPS group were significantly increased.
  • Example 6 VEGF-B protein has the effect of treating acute anterior uveitis
  • FIG. 6B The results of slit lamp microscopic observation of the anterior segment of the eyes of the AAV-VEGF-B group and the AAV-GFP group after modeling are shown in Figure 6B (scale bar: 200 ⁇ m).
  • the AAV-GFP group mice showed more severe inflammatory phenotypes after modeling, including more severe pupil constriction caused by posterior synechiae (the pupil is circled by the white dotted line), more severe ciliary congestion (indicated by the white arrow), and more severe pus in the anterior chamber of the eye (circled by the yellow dotted line).
  • the inflammatory phenotype of the AAV-VEGF-B group mice after modeling was significantly improved, including normal pupils (indicated by the white dotted line), clear and clean corneas, and no obvious ciliary congestion (indicated by the white arrow) and hypopyon (indicated by the yellow dotted line).
  • the clinical severity scores are shown in Figure 6C. As shown in Figure 6C, compared with the mice in the AAV-GFP group, the mice in the AAV-VEGF-B group had lower clinical severity scores and showed a milder inflammatory phenotype.
  • HE staining and immunofluorescence staining were performed on the eyeball sections of the AAV-VEGF-B group and AAV-GFP group mice after modeling.

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Abstract

VEGF-B蛋白、VEGF-B蛋白活性肽段在制备预防和/或治疗急性前葡萄膜炎的药物中的应用。VEGF-B蛋白、VEGF-B蛋白活性肽段具备良好的成药安全性和抗急性前葡萄膜炎作用，能够减少眼部炎症细胞的数量和抑制炎症因子的表达，并能抑制巨噬细胞M1极化。

Description

VEGF-B蛋白、VEGF-B蛋白活性肽段在制备预防和/或治疗急性前葡萄膜炎的药物中的应用 技术领域：
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及VEGF-B蛋白、VEGF-B蛋白活性肽段在制备预防和/或治疗急性前葡萄膜炎的药物中的应用。
背景技术：
血管内皮生长因子VEGF-B(Vascular endothelial growth factor B)是VEGF家族成员，主要与血管内皮生长因子受体-1(VEGFR-1)和神经纤毛蛋白1(NRP-1)结合，在大多数组织和器官中表达。当VEGF-B与VEGFR-1特异性结合时，血管内皮细胞可通过增加纤溶酶原激活物抑制物1(PAI-1)和尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)的表达和活性来应答VEGF-B；而NRP-1作为一种脑衰蛋白/信号素的受体，具有引导神经元生长锥体的功能，可选择性与VEGF-B结合发挥作用。
葡萄膜炎(Uveitis)是一类以虹膜、睫状体和脉络膜等眼色素膜为主的眼内炎症性病变，病情严重者甚至导致失明，占全球失明患者的10％～15％，在中国约有4％～10％的失明患者是因葡萄膜炎致盲。急性前部葡萄膜炎(Acute anterior uveitis，AAU)是最常见的葡萄膜炎类型，发病率约28％～61％。AAU临床表现包括睫状充血、明显的前房闪辉、突发眼痛、眼红、畏光和视力模糊等，严重者会形成或加重虹膜后粘连，并发青光眼，造成视力的不可逆损伤或丧失。临床上用于治疗前葡萄膜炎的药物包括：1)散瞳和睫状肌麻痹剂，只能用于缓解疼痛、畏光等临床症状；2)非甾体的抗炎药，只对某些非坏死性的前巩膜炎症效果有效，并且全身性使用会增加消化道溃疡的风险；3)类固醇类，治疗葡萄膜炎的主要药物，分为局部和全身给药，具有严重的副作用，眼部副作用包括白内障、眼压升高和青光眼，全身性副作用包括糖尿病、高血压、消化性溃疡、失眠、骨质疏松等；4)免疫调节疗法，如抗TNF-α，抗IL-6，抗IL-1β疗法等，与传统的类固醇或细胞免疫抑制剂联用能取得较好的效果，但是免疫抑制所带来的感染是主要副作用。由于现临床上用于治疗急性前葡萄膜炎的药物只能在一定程度上控制炎症，且具有严重的副作用，会进一步导致视力的丧失，因此，亟需预防和治疗急性前葡萄膜炎的安全有效的靶点药物。
发明内容：
本发明的目的是提供VEGF-B蛋白或VEGF-B蛋白活性肽段在制备用于预防和/或治疗急性前葡萄膜炎的药物中的应用。
根据本发明的一个方面，提供VEGF-B蛋白或VEGF-B蛋白活性肽段在制备用于预防和/或治疗急性前葡萄膜炎的药物中的应用。本发明所提供的VEGF-B蛋白、VEGF-B蛋白活性肽段具备良好的抗炎作用，能够减少眼部炎症细胞的数量和抑制炎症因子的表达，从而起到治疗急性前葡萄膜炎的作用，为眼部疾病的预防和治疗提供了新的思路，在医学领域具有十分广阔的应用前景。
优选地，用于预防和/或治疗急性前葡萄膜炎的药物为用于减少眼部炎症细胞的药物。
优选地，炎症细胞包括CD45阳性细胞(CD45+细胞)。
优选地，VEGF-B蛋白活性肽段包括Peptide1、Peptide2、Peptide3、Peptide4、Peptide5中的至少一种；Peptide1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，Peptide2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，Peptide3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，Peptide4的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，Peptide5的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
优选地，VEGF-B蛋白活性肽段包括Peptide5。VEGF-B蛋白活性肽段中Peptide5具有更强的抗炎作用。
根据本发明的另一个方面，提供VEGF-B蛋白或VEGF-B蛋白活性肽段在制备用于抑制巨噬细胞M1极化的药物中的应用。
优选地，用于抑制巨噬细胞M1极化的药物为用于降低炎症因子的表达的药物。
优选地，炎症因子包括TNF-α、IL-6、IL-1β中的至少一种。
优选地，VEGF-B蛋白活性肽段包括Peptide1、Peptide2、Peptide3、Peptide4、Peptide5中的至少一种；Peptide1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，Peptide2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，Peptide3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，Peptide4的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，Peptide5的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
优选地，VEGF-B蛋白活性肽段包括Peptide5。VEGF-B蛋白活性肽段中Peptide5具有更强的抗炎作用。
优选地，VEGF-B蛋白包括VEGF-B167。
根据本发明的另一个方面，提供一种药物，其包含VEGF-B蛋白和/或VEGF-B蛋白活性肽段作为活性成分。
本发明具有以下有益效果：
本发明研究发现VEGF-B蛋白、VEGF-B蛋白活性肽段能够减少眼部炎症细胞的数量和抑制炎症因子的表达，具有抗急性前葡萄膜炎作用，并能抑制巨噬细胞M1极化，可用于制备防治急性前葡萄膜炎的药物或抑制巨噬细胞M1极化的药物，为眼部疾病的预防和治疗提供了新的思路，在医学领域具有十分广阔的应用前景。
附图说明
图1为正常组、急性前葡萄膜炎模型组小鼠的虹膜-睫状体复合物中VEGF-B的mRNA表达水平。
图2为敲除VEGF-B基因促进急性前葡萄膜炎炎症反应的结果。其中，A为VEGF-B基因敲除小鼠(Vegf-b-/-)、同窝野生型小鼠(WT)的虹膜-睫状体复合物中VEGF-B的mRNA表达水平；B为造模后的VEGF-B基因敲除小鼠(Vegf-b-/-)、同窝野生型小鼠(WT)的裂隙灯显微镜下观察结果；C为造模后的VEGF-B基因敲除小鼠(Vegf-b-/-)、同窝野生型小鼠(WT)的临床严重性评分；D和E为造模后的VEGF-B基因敲除小鼠(Vegf-b-/-)、同窝野生型小鼠(WT)眼球切片的苏木素-伊红染色(HE染色)及定量；F和G为造模后的VEGF-B基因敲除小鼠(Vegf-b-/-)、同窝野生型小鼠(WT)眼球切片的荧光染色结果及定量。
图3为VEGF-B蛋白抑制巨噬细胞M1极化的结果。其中，A为siRNA敲低VEGF-B表达的THP-1细胞(si-VEGF-B)、正常的THP-1细胞(si-NC)中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA相对表达水平；B为LPS处理后的VEGF-B基因敲除小鼠(Vegf-b-/-)腹腔来源的巨噬细胞、同窝野生型小鼠(WT)腹腔来源的巨噬细胞中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA表达水平；C、D和E依次为经脂多糖(LPS)、牛血清白蛋白(BSA)、VEGF-B蛋白处理的THP-1细胞中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表达水平。
图4为VEGF-B蛋白特异性抑制炎症反应的结果。
图5为VEGF-B蛋白及其活性肽段抑制炎症反应的结果。其中，A为VEGF-B167的具体结构区域；B为经LPS刺激的THP-1细胞在分别加入VEGF-B蛋白、Peptide1、Peptide2、Peptide3、Peptide4、Peptide5后炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA表达水平。
图6为VEGF-B蛋白治疗急性前葡萄膜炎的结果。其中，A为经LPS处理的AAV-VEGF-B组小鼠、AAV-GFP组小鼠的虹膜-睫状体复合物中VEGF-B蛋白的表达情况；B为经LPS处理的AAV-VEGF-B组小鼠、AAV-GFP组小鼠的裂隙灯显微镜下观察结果；C为经LPS处理的AAV-VEGF-B组小鼠、AAV-GFP组小鼠的临床严重评分；D为经LPS处理的AAV-VEGF-B组小鼠、AAV-GFP组小鼠的流式检测结果；E和F为经LPS处理的AAV-VEGF-B组小鼠、AAV-GFP组小鼠眼球切片的苏木素-伊红染色(HE染色)及定量；G和H为经LPS处理的AAV-VEGF-B组小鼠、AAV-GFP组小鼠眼球切片的荧光染色结果及定量。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所使用的试剂和材料如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
实施例1 VEGF-B表达与急性前葡萄膜炎具有相关性
1、急性前葡萄膜炎造模
向小鼠(从江苏集萃药康生物科技股份有限公司购入C57小鼠)的玻璃体腔内注射脂多糖(LPS)作为急性前葡萄膜炎模型组(EIU)，未在玻璃体腔内注射LPS的小鼠作为正常组。
EIU的造模方法如下：小鼠腹腔注射1％戊巴比妥钠进行麻醉(剂量10mL/kg)，托吡卡胺用于扩大瞳孔，普鲁卡因胺用于角膜表面麻醉，羧甲基纤维素钠用于防止角膜干燥。使用消毒的5μL注射器(Hamilton，7633-01)和33号钝针(Hamilton，7803-05)，通过小鼠角膜缘后直径0.2mm的穿刺孔在玻璃体内注射LPS(1μL/眼，12.5ng)。
小鼠眼部经注射LPS造模后，小鼠出现流泪、眼角分泌物，瞳孔缩小，状充血和水肿等症状，说明急性葡萄膜炎造模成功。
2、qRT-PCR检测正常组、模型组小鼠的虹膜-睫状体复合物中VEGF-B的mRNA表达水平
1)取造模后的小鼠的虹膜-睫状体复合物，用PBS洗1次，加入500μL Trizol裂解，转移至1.5mL离心管中；
2)加入100μL三氯甲烷，用力摇晃20s，静置3min后4℃离心10min，12000rpm；
3)将上清吸取到新的离心管中(不要吸到中间层)，按1:1的体积比向上清中加入异丙醇，混匀，静置10min后4℃离心10min；
4)弃上清，加入1mL 75％的乙醇；
5)4℃离心5min，弃上清，加入1mL 75％乙醇，4℃离心5min后，弃上清，将离心管倒立于干净的吸水纸上，待管底的白色沉淀变透明，加入50μL dd H2O，-20℃保存；
6)获得总RNA，利用FastKing RT kit with gDNase(TIANGEN)试剂盒进行逆转录，合成cDNA；
7)以合成好的cDNA为模板，参照SYBR Green(ROCHE)试剂盒，在ABI QuantStudio 6Flex device(Life Technologies)PCR仪上检测VEGF-B的mRNA表达水平；
8)以18S rRNA为内参基因，用delta-delta Ct法对各基因的表达进行计算。各基因的引物序列在Primerbank网站上获取。
表1 qPCR各基因引物序列
qRT-PCR的检测结果如图1所示。由图1可知，相较于正常组，模型组小鼠的虹膜-睫状体复合物中VEGF-B的mRNA表达水平明显更低。由此说明，VEGF-B的表达与急性前葡萄膜炎具有相关性。
实施例2 敲除VEGF-B基因能够促进急性前葡萄膜炎的炎症反应
1、急性前葡萄膜炎造模：向VEGF-B基因敲除小鼠(Vegf-b-/-)、同窝野生型小鼠(WT)的玻璃体腔内注射LPS(1μL/眼，12.5ng)。VEGF-B基因敲除小鼠(Vegf-b-/-)、同窝野生型小鼠(WT)由Jackson实验室构建，父母基因型为het×het进行合笼繁殖获得。
2、qRT-PCR检测VEGF-B基因敲除小鼠(Vegf-b-/-)、同窝野生型小鼠(WT)的虹膜-睫状体复合物中VEGF-B的mRNA表达水平。qRT-PCR检测结果如图2中的A所示。由图2中的A可知，与同窝野生型小鼠(WT)相比，VEGF-B基因敲除小鼠(Vegf-b-/-)的虹膜-睫状体复合物中VEGF-B的mRNA相对表达水平明显更低。
3、裂隙灯显微镜下观察造模后的VEGF-B基因敲除小鼠(Vegf-b-/-)、同窝野生型小鼠(WT)眼前段的炎症表型
造模后的VEGF-B基因敲除小鼠(Vegf-b-/-)、同窝野生型小鼠(WT)眼前段的裂隙灯显微镜下观察结果如图2中的B(比例尺：200μm)所示。由图2中的B可知，相对于同窝野生型小鼠(WT)，VEGF-B基因敲除小鼠(Vegf-b/-)表现为更为严重的炎症表型，包括更为严重的虹膜后粘连所导致的瞳孔缩小(白色虚线所圈为瞳孔)、更多炎症细胞和色素细胞附着在角膜后(黄色箭头所示)、更为严重的睫状充血(白色箭头所示)和更为严重的眼球前房的积脓(黄色虚线所圈)。
4、根据急性前葡萄膜炎的临床评分标准对造模后的VEGF-B基因敲除小鼠(Vegf-b-/-)、同窝野生型小鼠(WT)进行评分
造模后的VEGF-B基因敲除小鼠(Vegf-b-/-)、同窝野生型小鼠的临床严重性评分如图2中的C所示。由图2中的C可知，相对于同窝野生型小鼠(WT)，VEGF-B基因敲除小鼠(Vegf-b-/-)的临床严重性评分更高，呈现更为严重的炎症表型。
5、对造模后的VEGF-B基因敲除小鼠(Vegf-b-/-)、同窝野生型小鼠(WT)的眼球切片进行苏木素-伊红染色(HE染色)、免疫荧光染色
苏木素-伊红染色(HE染色)的操作如下：二甲苯(SCRC，10023418)脱蜡20分钟，二甲苯II(SCRC，10023418)脱蜡20分钟，100％乙醇I(SCRC，100092683)脱蜡5分钟，100％乙醇II(SCRC，100092683)脱蜡5分钟，75％乙醇脱蜡5分钟。随后将眼球切片用苏木精溶液(Servicebio，G1003)染色5分钟，用自来水冲洗，然后用苏木精分化液(Servicebio，G1003)染色，再用自来水冲洗。用苏木精-scott Tap blue(Servicebio，G1003)处理，用自来水冲洗。用85％乙醇处理5分钟，95％乙醇处理5分钟，然后用伊红染料(Servicebio，G1003)处理5分钟。脱水后，用中性胶(SCRC，10004160)密封切片。使用AX10成像仪Z2(蔡司)显微镜拍摄图像。
免疫荧光染色的操作如下：将眼球切片在1×PBS中配制的0.5％Triton X-100(Sigma，X100)中孵育15分钟，然后用5％正常山羊血清封闭1小时，一抗4℃孵育过夜。切片1×PBS洗涤三遍后，二抗在室温下孵育1小时，然后DAPI孵育5分钟进行细胞核染色(Sigma，D9542)。采用AX10成像仪Z2(蔡司)显微镜成像，并使用ZEN 2012(蔡司)和ImageJ进行分析。
VEGF-B基因敲除小鼠(Vegf-b-/-)、同窝野生型小鼠(WT)的眼球切片的HE染色结果如图2中的D(比例尺：50μm)、E所示。由图2中的D、E可知，相较于同窝野生型小鼠(WT)，VEGF-B基因敲除小鼠(Vegf-b-/-)的前房内浸润了更多的CD45阳性细胞(黄色箭头所示)和渗出了更多的纤维蛋白(**所示)。
VEGF-B基因敲除小鼠(Vegf-b-/-)、同窝野生型小鼠(WT)的眼球切片的免疫荧光染色结果如图2中的F(比例尺：50μm)、G所示。由图2中的F、G可知，相较于同窝野生型小鼠(WT)，VEGF-B基因敲除小鼠(Vegf-b-/-)的CD45阳性细胞数目明显更多。
由此说明，VEGF-B功能缺失促进了急性前葡萄膜炎的炎症反应。
实施例3 VEGF-B蛋白具有抑制巨噬细胞M1极化的作用
1、siRNA敲低THP-1细胞(购于中乔新舟生物科技有限公司，货号：ZQ0086)中VEGF-B的表达。然后qRT-PCR检测siRNA敲低VEGF-B表达的THP-1细胞(si-VEGF-B)、正常的THP-1细胞(si-NC)中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的表达水平。qRT-PCR检测结果如图3中的A所示。由图3中的A可知，与正常的THP-1细胞(si-NC)相比，siRNA敲低VEGF-B表达的THP-1细胞(si-VEGF-B)中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的表达水平明显更高。由此说明，敲低VEGF-B蛋白表达能够显著促进细胞中炎症因子的表达，即促进巨噬细胞向M1亚型极化。
siRNA敲低THP-1细胞中VEGF-B表达的方法如下：
(1)6孔板每个孔种植THP-1细胞1×106个，诱导贴壁后，按照如下方案配置转染体系：
A液：Opti-MEM 100μL，加入RNAiMax 6μL，轻轻混匀，室温静置5min；
B液：Opti-MEM 100μL，加入浓度为20μM的siRNA(siRNA的序列如下：GCTTAGAGCTCAACCCAGA)3μL，轻轻混匀，室温静置5min；
(2)将A液、B液轻轻混匀，室温静置10min，得到转染液；
(3)将步骤(2)中的转染液用Opti-MEM稀释到1.5mL，加入上述6孔板中；
(4)将上述6孔板于培养箱中培养6h，更换为全培养基。48h后进行后续的实验。
2、LPS处理VEGF-B基因敲除小鼠(Vegf-b-/-)腹腔来源的巨噬细胞、同窝野生型小鼠(WT)腹腔来源的巨噬细胞。然后qRT-PCR检测LPS刺激后的VEGF-B基因敲除小鼠(Vegf-b/-)腹腔来源的巨噬细胞、同窝野生型小鼠(WT)腹腔来源的巨噬细胞中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA表达水平。qRT-PCR检测结果如图3中的B所示。由图3中的B可知，相对于LPS处理后的同窝野生型小鼠(WT)腹腔来源的巨噬细胞，LPS处理后的VEGF-B基因敲除小鼠(Vegf-b-/-)腹腔来源的巨噬细胞中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA表达水平明显更高。
小鼠腹腔来源的巨噬细胞(PCMs)的提取及培养方法如下：
(1)FTG溶液配制
4g FTG(Fluid Thioglycollate Medium；厂家：Sigma；货号：T9032；规格：1kg)+100mL H2O→高压蒸汽灭菌→4℃冷藏备用。
(2)6～8周龄小鼠，腹腔注射(2mL FTG溶液/只小鼠)
以左手抓住小鼠，使腹部向上，右手将注射针头于左下腹部刺入皮下，使针头向前推0.5cm，再以45度角穿过腹肌，固定针头，缓缓注入药液，为避免伤及内脏，可使小鼠处于头低位，使内脏移向上腹。
(3)2天后，处死小鼠，取腹腔巨噬细胞。
1)小鼠颈椎脱臼处死；
2)75％酒精浸泡或者擦洗腹部，腹面朝上置于工作台；
3)用小镊子提起小鼠下腹部皮肤，剪开一小口，上下撕开皮肤，使腹膜完全暴露；
4)用10mL注射器，注入8mL 1640培养基→适当摇晃按摩小鼠腹部；
5)换小针头，针尖朝上，避开肠和脂肪，可抽出约6mL腹腔液；
6)重复灌洗腹腔一次(步骤4-5)；
7)细胞悬液离心，弃上清；
8)适量1640完全培养液重悬，细胞计数；
9)计算数目后，铺板，6孔板种细胞2×106个/每孔；
10)在37℃培养2小时后，用1640培养液洗一遍后换液，去除不贴壁的细胞。
3、LPS处理THP-1细胞并向细胞中添加VEGF-B重组蛋白。然后qRT-PCR检测LPS处理后的THP-1细胞中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA表达水平。qRT-PCR检测结果如图3中的C-E所示。由图3中的C-E可知，向LPS处理后的THP-1细胞中添加对照的牛血清白蛋白(BSA)，细胞中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的表达水平较高；而向LPS处理后的THP-1细胞中添加VEGF-B重组蛋白，细胞中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的表达水平较低。由此说明，VEGF-B蛋白能够有效地抑制巨噬细胞促炎M1亚型极化。
实施例4 VEGF-B蛋白对抑制炎症反应具有特异性
1、从野生型小鼠中提取骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)：小鼠麻醉后脱臼处死，将小鼠放置在盛有足量75％乙醇的烧杯中浸泡消毒5min，于无菌操作台上分离小鼠的胫骨和股骨。用预冷的培养基将骨髓从胫骨和股骨中冲出，反复吹洗3次，直至腿骨内看不到明显的红色为止。用5mL移液枪将含有骨髓细胞的培养基反复吹打，使细胞团块分散，然后使用70μm细胞滤器将细胞过筛，转移至15mL离心管内，1500rpm/min离心5min，弃上清，加入红细胞裂解液重悬静置5min后1500rpm/min离心5min，弃上清用冷的配置好的骨髓巨噬细胞诱导培养基重悬，铺板(2×106个活细胞/皿)。培养第三天后更换一半骨髓巨噬细胞诱导培养基，第五天更换全部培养基，第七天即可用于后续实验。
2、LPS刺激小鼠骨髓来源的巨噬细胞6h，然后向细胞中分别加入VEGF-B重组蛋白(100-20B，Peprotech)、VEGF-A重组蛋白(100-20，Peprotech)孵育6小时。qRT-PCR检测小鼠骨髓来源的巨噬细胞中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA表达水平。qRT-PCR的检测结果如图4所示。由图4可知，VEGF-B蛋白表现出了显著性的抑制炎症反应的功能，而VEGF-A蛋白无明显抑制炎症反应的作用。由此说明，VEGF-B蛋白对抑制炎症反应具有特异性。
实施例5 VEGF-B蛋白发挥抑制炎症作用的具体结构区域
1、VEGF-B167蛋白活性肽段Peptide1、Peptide2、Peptide3、Peptide4、Peptide5的具体结构区域如图5中的A所示，序列如表2所示。由图5中的A可知，Peptide1、Peptide2、Peptide3位于与VEGFR1结合区域(KDR结合区域)，Peptide4、Peptide5位于与NRP1结合区域。
表2 VEGF-B167蛋白活性肽段序列表
2、以正常的THP-1细胞作为对照组(CTL组)，经LPS刺激的THP-1细胞作为LPS组，向经LPS刺激6h后的细胞中加入VEGF-B全长蛋白作为VB FL组，向经LPS刺激6h后的细胞中加入VEGF-B蛋白活性肽段Peptide1作为Peptide1组、向经LPS刺激6h后的细胞中加入Peptide2作为Peptide2组、向经LPS刺激6h后的细胞中加入Peptide3作为Peptide3组、向经LPS刺激6h后的细胞中加入Peptide4作为Peptide4组、向经LPS刺激6h后的细胞中加入Peptide5作为Peptide5组。
qRT-PCR分别检测CTL组、LPS组、VB FL组、Peptide1组、Peptide2组、Peptide3组、Peptide4组、Peptide5组中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA表达水平。qRT-PCR检测结果图5中的B所示，由图5中的B可知，相较于CTL组，LPS组中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的表达水平明显升高。相较于LPS组，加入VEGF-B全长蛋白、Peptide1、Peptide2、Peptide3、Peptide4、Peptide5后的细胞中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的表达水平下降。由此说明，VEGF-B全长蛋白、Peptide1、Peptide2、Peptide3、Peptide4、Peptide5均显示出一定程度的抑制炎症的作用，其中位于NRP1结合区域的Peptide5表现出了最为显著的抑制炎症的作用。
实施例6 VEGF-B蛋白具有治疗急性前葡萄膜炎的效果
1、向小鼠玻璃体腔内注射表达VEGF-B167蛋白的腺相关病毒(购于山东维真生物科技有限公司)作为AAV-VEGF-B组，向小鼠玻璃体腔内注射表达GFP的腺相关病毒作为AAV-GFP组。
2、Western blotting检测AAV-VEGF-B组小鼠、AAV-GFP组小鼠虹膜-睫状体复合物中VEGF-B蛋白的表达情况
Western blotting检测结果如图6中的A所示。由图6中的A可知，相较于AAV-GFP组，AAV-VEGF-B组小鼠的虹膜-睫状体复合物中VEGF-B蛋白过表达。
3、急性前葡萄膜炎造模：LPS处理AAV-VEGF-B组小鼠、AAV-GFP组小鼠。
4、裂隙灯显微镜下观察造模后的AAV-VEGF-B组小鼠、AAV-GFP组小鼠眼前段的炎症表型
造模后的AAV-VEGF-B组小鼠、AAV-GFP组小鼠眼前段的裂隙灯显微镜下观察结果如图6中的B(比例尺：200μm)所示。由图6中的B可知，造模后的AAV-GFP组小鼠表现为更为严重的炎症表型，包括更为严重的虹膜后粘连所导致的瞳孔缩小(白色虚线所圈为瞳孔)，更为严重的睫状充血(白色箭头所示)和更为严重的眼球前房的积脓(黄色虚线所圈)，造模后的AAV-VEGF-B组小鼠的炎症表型得到了非常显著的改善，包括正常的瞳孔(白色虚线所示)，透明干净的角膜，无明显的睫状充血(白色箭头所示)和前房积脓(黄色虚线所示)。
5、根据急性前葡萄膜炎临床评分标准对造模后的AAV-VEGF-B组小鼠、AAV-GFP组小鼠进行评分
临床严重评分如图6中的C所示。由图6中的C可知，相较于AAV-GFP组小鼠，AAV-VEGF-B组小鼠的临床严重评分更低，呈现更轻的炎症表型。
6、对造模后的AAV-VEGF-B组小鼠、AAV-GFP组小鼠眼部进行流式技术检测
(1)小鼠眼前段组织单细胞悬液的制备：将小鼠眼球浸入含10％FBS的RPIM-1640中，在显微镜下用眼剪切除眼周肌肉和筋膜。沿角膜巩膜边缘做圆形切口，分离前后房组织，用200μL枪头轻轻吸出玻璃体腔内浸润细胞，取出晶状体、视网膜和脉络膜。用镊子将虹膜与睫状体-角膜复合体分离，轻轻撕成小片，将培养基移入15mL离心管。50g离心1min，将培养基上清转移到另一个干净的15mL离心管中，用PBS洗涤两次剩余组织，然后加入500μL 7mg/mL的I型胶原酶，37℃放置20min，加入3mg/mL DNase I酶，37℃继续消化10min，加入上一步收集的培养基灭活酶活性。1mL枪头轻轻吹打组织，依次通过70μm和40μm细胞筛。
(2)流式技术检测：上述制备的单细胞悬液用含有1％BSA的PBS洗涤2次后，用CD16/32抗体于冰上孵育20min(1:200)，加入目的抗体于冰上孵育30min。避光，用含有1％BSA的PBS洗涤3次后，PI染色。用含有1％BSA的PBS洗涤3次，重悬细胞上机检测，flowJo软件对数据进行分析。
小鼠前房组织(角膜、虹膜、睫状体、以及浸润的细胞)的单细胞悬液的流式检测结果如图6中的D所示。由图6中的D可知，相较于AAV-GFP组小鼠，AAV-VEGF-B组小鼠前房中炎症细胞的比例明显减少。
7、对造模后的AAV-VEGF-B组小鼠、AAV-GFP组小鼠的眼球切片进行HE染色、免疫荧光染色
AAV-VEGF-B组小鼠、AAV-GFP组小鼠眼球切片的HE染色染色结果如图6中的E(比例尺：50μm)、F所示。由图6中的E、F可知，AAV-VEGF-B组小鼠前房中浸润的CD45阳性细胞显著减少，并且前房中纤维蛋白的渗出(**所示)显著减少。
AAV-VEGF-B组小鼠、AAV-GFP组小鼠眼球切片的免疫荧光染色结果如图6中的G(比例尺：50μm)、H所示。由图6中的G、H可知，与AAV-GFP组小鼠相比，AAV-VEGF-B组小鼠前房中浸润的CD45阳性细胞明显更少。由此说明，VEGF-B蛋白能够有效地抑制炎症细胞在眼部的浸润和保护血-房水屏障的完整性，即VEGF-B蛋白具备治疗急性前葡萄膜炎的作用。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，但这些修改或替换均在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

  1. VEGF-B蛋白或VEGF-B蛋白活性肽段在制备用于预防和/或治疗急性前葡萄膜炎的药物中的应用；所述VEGF-B蛋白活性肽段包括Peptide1、Peptide2、Peptide3、Peptide4、Peptide5中的至少一种；
    所述Peptide1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
    所述Peptide2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，
    所述Peptide3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，
    所述Peptide4的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，
    所述Peptide5的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
  2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述用于预防和/或治疗急性前葡萄膜炎的药物为用于减少眼部炎症细胞的药物。
  3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述炎症细胞包括CD45阳性细胞。
  4. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述VEGF-B蛋白活性肽段为Peptide5。
  5. VEGF-B蛋白或VEGF-B蛋白活性肽段在制备用于抑制巨噬细胞M1极化的药物中的应用；所述VEGF-B蛋白活性肽段包括Peptide1、Peptide2、Peptide3、Peptide4、Peptide5中的至少一种；
    所述Peptide1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
    所述Peptide2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，
    所述Peptide3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，
    所述Peptide4的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，
    所述Peptide5的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
  6. 如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述用于抑制巨噬细胞M1极化的药物为用于降低炎症因子表达的药物。
  7. 如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述炎症因子包括TNF-α、IL-6、IL-1β中的至少一种。
  8. 一种药物，其特征在于，包含VEGF-B蛋白活性肽段作为活性成分；所述VEGF-B蛋白活性肽段包括Peptide1、Peptide2、Peptide3、Peptide4、Peptide5中的至少一种；
    所述Peptide1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
    所述Peptide2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，
    所述Peptide3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，
    所述Peptide4的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，
    所述Peptide5的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
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