[go: up one dir, main page]

WO2025146173A1 - 抗体以及包含其与tlr7/8激动剂的免疫偶联物及其用途 - Google Patents

抗体以及包含其与tlr7/8激动剂的免疫偶联物及其用途 Download PDF

Info

Publication number
WO2025146173A1
WO2025146173A1 PCT/CN2025/070576 CN2025070576W WO2025146173A1 WO 2025146173 A1 WO2025146173 A1 WO 2025146173A1 CN 2025070576 W CN2025070576 W CN 2025070576W WO 2025146173 A1 WO2025146173 A1 WO 2025146173A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibody
amino acid
seq
antigen
acid sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/CN2025/070576
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
熊慧中
游飞
李莉
熊尧
陈烨
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Innovent Biologics Suzhou Co Ltd
Original Assignee
Innovent Biologics Suzhou Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Innovent Biologics Suzhou Co Ltd filed Critical Innovent Biologics Suzhou Co Ltd
Publication of WO2025146173A1 publication Critical patent/WO2025146173A1/zh
Pending legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants

Definitions

  • TROP2 a trophoblast cell surface antigen, also known as tumor-associated calcium signaling protein (TACSTD2), is overexpressed in a variety of human epithelial cancers, including breast, lung, gastric, colorectal, pancreatic, prostate, cervical, head and neck, and ovarian cancers (Yezhe Cheng et al., Frontiers in Oncology, 2022 Dec 23;12:951589).
  • ADCs Anti-TROP2 antibody-drug conjugates
  • Trodelvy anti-human TROP2 antibody-SN-38 conjugate
  • ORR objective response rate
  • TNBC triple-negative breast cancer
  • One of the important mechanisms of Trodelvy is that SN-38 (load) is connected through a pH-sensitive linker, which can break and specifically release SN-38 in the acidic tumor microenvironment.
  • the linker of Trodelvy is not stable enough, the maleimide-mediated linker breaks through thiol exchange under physiological conditions, making Trodelvy's half-life in serum relatively short (about 1 day). Therefore, Trodelvy may have a relatively high off-target effect.
  • Ds-1062a Another anti-TROP2 antibody-drug conjugate Ds-1062a (Dato-DXd, AstraZeneca and Daiichi Sankyo) has significant efficacy in the treatment of patients with lung cancer and triple-negative breast cancer without gene mutations, it still has problems such as uneven distribution of DAR, which affects the efficacy and produces target toxicity in normal tissues.
  • Folate receptor ⁇ also known as folate receptor 1 (FOLR1)
  • FOLR1 folate receptor 1
  • TLR7 is mainly expressed on plasmacytoid cells and also on B-cells, which can be activated by binding to specific small molecule ligands (i.e., TLR7 agonists) or its natural ligands (i.e., single-stranded RNA, ssRNA). Altered immune cell responsiveness may be associated with the decline of natural immune responses during chronic viral infection. Agonist-induced TLR7 activation may thus represent a new approach for the treatment of chronic viral infections (D. J Connolly and L. A. J O’Neill, Current Opinion in Pharmacology 2012, 12: 510-518, P. A. Roethle et al., J. Med. Chem. 2013, 56, 7324-7333).
  • TLRs Toll-like receptors
  • TLR agonists are poorly tolerated due to toxicities associated with widespread immune activation after systemic administration.
  • TLR7/8 agonists As new antiviral and anti-tumor immunotherapies to provide more treatment options.
  • the present invention first provides novel TLR agonists, in particular TLR7/8 agonists.
  • the present invention also provides novel high-affinity TROP2 antibodies, or antigen-binding fragments thereof.
  • the present invention also provides novel high-affinity FR ⁇ antibodies, or antigen-binding fragments thereof.
  • the present invention also provides a novel immunoconjugate (ISAC), which comprises a TLR7/8 agonist coupled to a tumor-targeting antibody.
  • TAC novel immunoconjugate
  • the antibody immunoagonist conjugate of the present invention has good tolerance in vivo when systemically administered and induces strong activation of intratumoral myeloid cells, thereby leading to tumor clearance and subsequent immune memory.
  • the present invention provides an antibody or an antigen-binding fragment thereof that specifically binds to TROP2 (eg, human TROP2). In some embodiments, it comprises:
  • the anti-TROP2 antibody or its antigen-binding fragment of the present invention comprises a first heavy chain complementary determining region (HCDR1), a second heavy chain complementary determining region (HCDR2), a third heavy chain complementary determining region (HCDR3) and a first light chain complementary determining region (LCDR1), a second light chain complementary determining region (LCDR2) and a third light chain complementary determining region (LCDR3), wherein the HCDR1, HCDR2, HCDR3 and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 respectively comprise the amino acid sequences shown in SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 and SEQ ID NO:6 or are composed of the amino acid sequences shown in SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 and SEQ ID NO:6.
  • the anti-TROP2 antibodies or antigen-binding fragments thereof of the invention bind to TROP2 (e.g., human TROP2) with sufficient affinity, for example, with an equilibrium dissociation constant ( KD ) of ⁇ 100 nM, ⁇ 10 nM, ⁇ 1 nM , ⁇ 0.55 nM, ⁇ 0.5 nM, ⁇ 0.4 nM, or ⁇ 0.35 nM, for example, 10-8 M or less, for example, 10-7 M to 10-10 M, for example, between about 0.1 nM-1 nM, between greater than 0.3-0.7 nM, between about 0.4-0.6 nM, between about 0.4-0.5 nM, between about 0.5-0.6 nM, for example, as detected by ForteBio.
  • TROP2 is human, mouse, or cynomolgus monkey TROP2.
  • antibody binding affinity is determined using bio-optical interferometry.
  • the anti-TROP2 antibodies or antigen-binding fragments thereof of the present invention bind to TROP2 expressed on the surface of a cell.
  • the anti-TROP2 antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a heavy chain variable region VH and/or a light chain variable region VL, wherein VH
  • (i) comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO:7 or 12; or
  • (ii) comprises or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 or 12; or
  • amino acid sequence having one or more (preferably no more than 10, more preferably no more than 5, 4, 3, 2, 1) amino acid changes (preferably amino acid substitutions, more preferably conservative amino acid substitutions) compared to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 or 12, preferably, the amino acid changes do not occur in the CDR regions; and/or
  • (ii) comprises or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 or 14;
  • (iii) comprises or consists of an amino acid sequence having one or more (preferably no more than 10, more preferably no more than 5, 4, 3, 2, 1) amino acid changes (preferably amino acid substitutions, more preferably conservative amino acid substitutions) compared to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 or 14, and preferably, the amino acid changes do not occur in the CDR region.
  • the anti-TROP2 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention comprises VH and VL, wherein VH comprises or consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:7, and VL comprises or consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:8.
  • the anti-TROP2 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention further comprises a heavy chain constant region and/or a light chain constant region.
  • the anti-TROP2 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention is an IgG antibody.
  • the VH of the invention comprises HCDR1, HCDR2, HCDR3, and the VL comprises LCDR1, LCDR2, and LCDR3, wherein;
  • the anti-FR ⁇ antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention comprises:
  • the anti-FR ⁇ antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region, wherein the heavy chain variable region comprises or consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:33, and the light chain variable region comprises or consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:34.
  • the anti-FR ⁇ antibody light chain constant region of the present invention is a lambda or kappa light chain constant region, preferably a kappa light chain constant region, such as a human lambda or kappa light chain constant region.
  • the light chain constant region is a (human) lambda light chain constant region.
  • the lambda light chain constant region comprises an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 38 or an amino acid sequence having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% sequence identity with the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 38 and does not contain a cysteine mutation.
  • the light chain constant region is a (human) kappa light chain constant region.
  • the kappa light chain constant region comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:45 or an amino acid sequence having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:45.
  • the light chain constant region of the anti-FR ⁇ antibody or its antigen-binding fragment of the present invention has a cysteine mutation at position 166 (Eu numbering).
  • the light chain constant region of the anti-FR ⁇ antibody or its antigen-binding fragment of the present invention has cysteine mutations at positions 160 and 166 (Eu numbering).
  • the anti-FR ⁇ antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention may be any form of antibody or antigen-binding fragment thereof known in the art, such as monoclonal, chimeric, humanized, fully human, bispecific, or multispecific antibody or antibody fragment thereof.
  • the light chain of an anti-FR ⁇ antibody of the invention comprises
  • amino acid sequence comprising or consisting of an amino acid sequence that is at least 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identical to an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 36 or 37;
  • amino acid sequence comprising or consisting of one or more (preferably no more than 20 or 10, more preferably no more than 5, 4, 3, 2, 1) amino acid changes (preferably amino acid substitutions, more preferably conservative amino acid substitutions) compared to the amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 36 or 37.
  • the anti-FR ⁇ antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention comprises two identical heavy chains and two identical light chains, wherein
  • the heavy chain comprises a VH as described herein, or a HCDR1, HCDR2 and HCDR3 as described herein, and an Fc region and CH1 as described herein, or a heavy chain constant region as described herein; and/or
  • the light chain comprises a VL described herein or LCDR1, LCDR2 and LCDR3 described herein, and a kappa light chain constant region described herein.
  • the anti-FR ⁇ antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention comprises two identical heavy chains and two identical light chains, wherein
  • the heavy chain comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:35, and/or
  • the light chain comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:36.
  • the anti-FR ⁇ antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention comprises two identical heavy chains and two identical light chains, wherein
  • the heavy chain comprises or consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:35, and/or
  • the light chain comprises or consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:36.
  • the anti-FR ⁇ antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention comprises two identical heavy chains and two identical light chains, wherein
  • the heavy chain comprises a VH as described herein, or a HCDR1, HCDR2, and HCDR3 as described herein, and an Fc region and a CH1 as described herein, or a heavy chain constant region as described herein;
  • the light chain comprises a VL described herein or LCDR1, LCDR2 and LCDR3 described herein, and a Lambda light chain constant region comprising LLC160C and/or 166C described herein.
  • the anti-FR ⁇ antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention comprises two identical heavy chains and two identical light chains, wherein
  • the light chain comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:37.
  • the anti-FR ⁇ antibody or antigen-binding fragment thereof of the invention comprises two identical heavy chains and two identical light chains, wherein
  • the heavy chain comprises or consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:35, and/or
  • the light chain comprises or consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:37.
  • the anti-FR ⁇ antibody or antigen-binding fragment thereof of the invention is a chimeric antibody or a humanized antibody.
  • the anti-FR ⁇ antibody is a full-length antibody.
  • the anti-FR ⁇ antibody also encompasses multispecific antibodies such as bispecific antibodies.
  • the anti-FR ⁇ antibodies or antigen-binding fragments thereof of the present invention have better endocytosis activity on FR ⁇ -positive cells, such as FR ⁇ -positive tumor cells.
  • the present invention also provides a fusion protein comprising the anti-FR ⁇ antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention.
  • the present invention also provides an immunoconjugate, which comprises an anti-FR ⁇ antibody or an antigen-binding fragment thereof of the present invention, and further comprises a payload coupled to the antibody or its antigen-binding fragment.
  • the payload is a toxin, a small molecule drug/agent, a cytotoxic agent, an apoptotic agent, a chelating agent, an immunomodulator/immunostimulator/immunoagonist, an oligonucleotide, a polypeptide, a peptide epitope, a radionuclide, a prodrug, etc.
  • the payload is an immunostimulator/immunoactivator.
  • the payload is a TLR agonist.
  • the payload is a TLR7/8 agonist.
  • the present invention relates to a host cell comprising a nucleic acid or a vector of the present invention, preferably, the host cell is prokaryotic or eukaryotic, more preferably selected from yeast cells, mammalian cells (e.g., 293 cells or CHO cells, such as CHO-K cells or HEK293 cells) or other cells suitable for preparing antibodies or antigen-binding fragments thereof.
  • the host cell is prokaryotic or eukaryotic, more preferably selected from yeast cells, mammalian cells (e.g., 293 cells or CHO cells, such as CHO-K cells or HEK293 cells) or other cells suitable for preparing antibodies or antigen-binding fragments thereof.
  • Z' is selected from
  • the present invention provides a compound of formula (II) as described above, or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof, wherein
  • the present invention provides a compound of formula (II) as described above, or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof, wherein the compound is selected from:
  • the present invention also provides an immunoconjugate comprising a targeting moiety, a TLR agonist of the present invention, and/or a linker of the present invention for connecting a targeting moiety to a TLR agonist.
  • the targeting moiety is a specific antigen binding protein or a fragment thereof, for example, a molecule with an antibody or immunoglobulin structure, a free receptor, a cyclic peptide, etc.
  • the targeting moiety is an antibody or an antigen binding fragment thereof.
  • the targeting moiety e.g., an antibody
  • the immunoconjugate of the present invention comprises a TLR agonist (e.g., a TLR7/8 agonist of the present invention as defined above), preferably coupled to a tumor-targeting antibody.
  • TLR agonist e.g., a TLR7/8 agonist of the present invention as defined above
  • the immunoconjugate of the present invention has good tolerability in vivo when systemically administered, and induces strong activation of intratumoral myeloid cells, thereby leading to tumor clearance and subsequent immune memory.
  • the present invention provides an immunoconjugate having a structure as shown in formula (I), Ab-(L-(D) m ) p (I)
  • Ab is a specific antigen binding protein or a fragment thereof, preferably a monoclonal antibody or a fragment thereof;
  • L is a linker
  • D is a TLR agonist, preferably a TLR7/8 agonist
  • n is an integer from 1 to 6;
  • D in formula (I) is a compound as defined in the second aspect of the present invention.
  • L-D in formula (I) is a compound of formula (II) as defined in the third aspect of the present invention.
  • -L- in formula (I) has a structure selected from the following:
  • the left side of the structure is connected to Ab, and the right side is connected to D.
  • L-(D) in Formula (I) has a structure selected from the following:
  • the antibody immunoagonist conjugate of the invention or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof has a DAR value of 1-10, such as 2-8.
  • the antibody immunoagonist conjugate is selected from:
  • Ab is an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds TROP2 (eg, human TROP2) or FR ⁇ (eg, human FR ⁇ ), preferably as defined above;
  • q represents DAR, for example, 1-10, for example, 2-8, for example, about 3, 4, 5, or 6.
  • Ab in formula (I) is a specific antigen binding protein or a fragment thereof.
  • Ab is an antibody.
  • Ab is an antibody fragment.
  • Ab is a monoclonal antibody or a fragment thereof.
  • Ab causes and/or promotes the activation of immune cells, for example, by ADCP action.
  • Ab specifically binds to TROP2.
  • Ab specifically binds to FR ⁇ .
  • Ab has a cysteine mutation in its constant region.
  • the antibody immunoagonist conjugate of formula (I) or its subformula or a composition comprising one or more of the antibody immunoagonist conjugates (e.g., TROP2-ISAC or FR ⁇ -ISAC) of the present invention has an average DAR of any value selected from the following ranges: 1 ⁇ 0.4, 2 ⁇ 0.4, 3 ⁇ 0.4 or 4 ⁇ 0.4.
  • Ab in formula (I) is an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to TROP2.
  • the antibody that specifically binds to TROP2 binds to a different epitope than the TROP2 cytotoxic ADC.
  • Ab in formula (I) is an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to FR ⁇ .
  • the antibody that specifically binds to FR ⁇ binds to a different epitope than the FR ⁇ cytotoxic ADC.
  • the cysteine mutation allows the anti-FR ⁇ antibody or antigen-binding fragment thereof to be coupled to the linker via the mutated cysteine, for example, to achieve site-specific coupling of the immunoagonist.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising an antibody or fragment thereof, a nucleic acid, a vector, a host cell, a fusion protein, an immunoconjugate or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof as described above, and optionally one or more other therapeutic agents, such as chemotherapeutic agents, angiogenesis inhibitors, cytokines, cytotoxic agents, other antibodies, small molecule drugs or immunomodulators, and optional pharmaceutical excipients.
  • the present invention provides a drug combination comprising an antibody or fragment thereof, a nucleic acid, a vector, a host cell, a fusion protein, an immunoconjugate or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof, or a pharmaceutical composition as described above, and one or more other therapeutic agents, such as chemotherapeutic agents, angiogenesis inhibitors, cytokines, cytotoxic agents, other antibodies, small molecule drugs or immunomodulators.
  • therapeutic agents such as chemotherapeutic agents, angiogenesis inhibitors, cytokines, cytotoxic agents, other antibodies, small molecule drugs or immunomodulators.
  • TROP2 ISAC As a TROP2 ISAC, it has more significant single-agent efficacy and good safety in mice and monkeys compared with other ISACs with similar efficacy.
  • the TROP2-TLR7/8 agonist ISAC showed potent antitumor activity in the treatment of multiple TROP2+ heterologous tumor models, including, for example, gastric cancer and pancreatic cancer.
  • the anti-FR ⁇ antibody and/or immunoconjugate of the present invention has at least the following advantages:
  • the FR ⁇ -TLR7/8 agonist ISAC showed potent antitumor activity in the treatment of FR ⁇ + heterologous tumor models, such as multiple types of ovarian cancer.
  • the immune agonist is linked to the antibody via the mutated cysteine site, thereby
  • FIG. 1A to FIG. 1C show the results of antibody-dependent cellular phagocytosis (ADCP) functional assay.
  • ADCP antibody-dependent cellular phagocytosis
  • the F(ab')2 can be reduced under neutral conditions by destroying the disulfide bond in the hinge region, thereby converting the F(ab')2 dimer into a Fab' monomer.
  • the Fab' monomer is basically a Fab fragment with a hinge region.
  • the Fv fragment consists of the VL and VH domains of a single arm of an antibody.
  • the two domains of the Fv fragment, VL and VH can be encoded by independent genes, but recombinant methods can also be used to connect the two domains using synthetic connecting peptides to produce them as a single protein chain, and in the single protein chain, the VL region and the VH region are paired to form a single-chain Fv (scFv).
  • single-chain antibody scAb
  • Single-chain antibody is used in the broadest sense herein and specifically covers antibodies with monospecificity or multispecificity (e.g., bispecificity) that are initially produced as a single continuous polypeptide chain.
  • Such single-chain antibodies include, but are not limited to, having two linked VL and VH regions.
  • the single-chain antibody is a scFv.
  • Diabodies are small bivalent antibodies constructed by gene fusion, for example, dimers consisting of two polypeptide chains.
  • the VL and VH domains of each polypeptide chain of a diabody are bound by a linker, so that the VL and VH encoded in the same polypeptide chain form a dimer with different single-chain variable region fragments.
  • Diabodies generally have two antigen binding sites.
  • CDR region is a region in an antibody variable domain that is highly variable in sequence and forms a structurally determined loop ("hypervariable loop") and/or contains antigen contact residues ("antigen contact points"). CDR is primarily responsible for binding to antigen epitopes.
  • the CDRs of the heavy and light chains are usually referred to as CDR1, CDR2, and CDR3, and are numbered sequentially from the N-terminus.
  • the CDRs located in the antibody heavy chain variable domain are referred to as HCDR1, HCDR2, and HCDR3, while the CDRs located in the antibody light chain variable domain are referred to as LCDR1, LCDR2, and LCDR3.
  • a CDR can also be identified based on having the same Kabat numbering position as a reference CDR sequence (eg, any of the exemplary CDRs of the invention).
  • the residue positions in the antibody variable region refers to the numbering position according to the Kabat numbering system (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)).
  • the heavy chain variable region CDR of the antibody of the present invention is determined according to the following rules:
  • VH CDR1 was determined according to the Kabat & Chothia rules; and VH CDR2 and 3 were both determined according to the Kabat rules.
  • the light chain variable region CDRs of the antibodies of the invention are determined according to the Kabat rules.
  • the heavy chain variable region CDRs of the antibodies of the present invention are determined according to the following rules: VH CDR1 is determined according to the Kabat & Chothia rules; and VH CDR2 and 3 are both determined according to the Kabat rules; and the light chain variable region CDRs are determined according to the Kabat rules.
  • the boundaries of the CDRs of the variable regions of the same antibody obtained based on different assignment systems may be different. That is, the CDR sequences of the variable regions of the same antibody defined under different assignment systems are different. Therefore, when it comes to defining antibodies using specific CDR sequences defined in the present invention, the scope of the antibodies also covers antibodies whose variable region sequences contain the specific CDR sequences, but whose claimed CDR boundaries are different from the specific CDR boundaries defined in the present invention due to the application of different schemes (e.g., different assignment system rules or combinations).
  • an "antibody that binds to the same or overlapping epitope as a reference antibody” refers to an antibody that blocks 50%, 60%, 70%, 80%, 90% or more of the binding of the reference antibody to its antigen in a competition assay, whereas the reference antibody blocks 50%, 60%, 70%, 80%, 90% or more of the binding of the antibody to its antigen in a competition assay. Accordingly, if two antibodies or derivatives thereof bind to non-competitive epitopes, they bind to non-identical or non-overlapping epitopes and preferably do not exhibit mutual blocking and/or interference with binding to the antigen in a competition assay.
  • RIAs solid phase direct or indirect radioimmunoassays
  • EIAs solid phase direct or indirect enzyme immunoassays
  • An antibody that exhibits the same or similar binding affinity and/or specificity as a reference antibody refers to an antibody that has at least 50%, 60%, 70%, 80%, 90% or 95% or more of the binding affinity and/or specificity of the reference antibody. This can be determined by any method known in the art for determining binding affinity and/or specificity.
  • chimeric antibody is an antibody molecule in which (a) the constant region or a portion thereof is changed, replaced or exchanged so that the antigen binding site is connected to a constant region of a different or altered class, effector function and/or species or a completely different molecule (e.g., enzyme, toxin, hormone, growth factor, drug) or the like that imparts new properties to the chimeric antibody; or (b) the variable region or a portion thereof is changed, replaced or exchanged with a variable region having a different or altered antigen specificity.
  • a mouse antibody can be modified by replacing its constant region with a constant region from a human immunoglobulin. Due to the replacement with a human constant region, the chimeric antibody can retain its specificity in recognizing an antigen while having reduced immunogenicity in humans as compared to the original mouse antibody.
  • a “humanized antibody” is an antibody that retains the antigen-specific reactivity of a non-human antibody (e.g., a mouse monoclonal antibody) while being less immunogenic when administered to humans, for example, as a therapeutic agent. This can be achieved, for example, by retaining the non-human antigen binding site and replacing the remainder of the antibody with their human counterparts (i.e., replacing the constant region and the portion of the variable region that is not involved in binding with the corresponding portion of a human antibody).
  • a non-human antibody e.g., a mouse monoclonal antibody
  • Fc region is used herein to define the C-terminal region of an immunoglobulin heavy chain containing at least a portion of a constant region.
  • the term includes native sequence Fc regions and variant Fc regions.
  • a natural immunoglobulin "Fc domain” comprises two or three constant domains, i.e., a CH2 domain, a CH3 domain, and an optional CH4 domain.
  • an immunoglobulin Fc domain comprises the second and third constant domains (CH2 domain and CH3 domain) of two heavy chains derived from IgG, IgA, and IgD class antibodies; or comprises the second, third, and fourth constant domains (CH2 domain, CH3 domain, and CH4 domain) of two heavy chains derived from IgM and IgE class antibodies.
  • the numbering of amino acid residues in the Fc region or heavy chain constant region is numbered according to the EU numbering system (also called the EU index) as described in Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interes, 5th Edition, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
  • Fc region does not include the heavy chain variable region VH and light chain variable region VL of an immunoglobulin and the heavy chain constant region CH1 and light chain constant region CL, but may include the hinge region at the N-terminus of the heavy chain constant region in some cases.
  • the amino acid position to be mutated to cysteine is generally indicated by "chain type, mutation position”.
  • LLC represents lambda light chain
  • LC represents kappa light chain
  • HC represents heavy chain. Therefore, “LLC160C” means that the amino acid at EU position 160 of the lambda light chain is replaced by cysteine (C).
  • alkyl groups include, but are not limited to, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, sec-butyl, isobutyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, neopentyl, n-hexyl, 3-methylhexyl, 2,2-dimethylpentyl, 2,3-dimethylpentyl, n-heptyl, n-octyl, n-nonyl, n-decyl, etc.
  • haloalkyl refers to an alkyl group as defined herein that is substituted by one or more halogen groups as defined herein.
  • Halogenated alkyl may preferably be monohalogenated alkyl, dihalogenated alkyl or polyhalogenated alkyl (including perhalogenated alkyl).
  • Monohalogenated alkyl groups may contain one iodine, bromine, chlorine or fluorine in the alkyl group.
  • Dihalogenated alkyl and polyhalogenated alkyl groups may contain two or more identical halogen atoms or a combination of different halogenated groups in the alkyl group.
  • polyhalogenated alkyl groups contain up to 12, 10 or 8 or 6 or 4 or 3 or 2 halogen groups.
  • glycine can be represented by Gly
  • alanine can be represented by Ala
  • valine can be represented by Val
  • glutamine can be represented by Gln
  • glutamic acid can be represented by Glu
  • phenylalanine can be represented by Phe
  • leucine can be represented by Leu.
  • DAR drug:antibody ratio
  • D the average value of the ratio of the cargo moiety (D) to the Ab moiety conjugated to an immunoconjugate (e.g., ISAC) described herein.
  • the DAR value reflects the average value of the number of cargo molecules carried by each ISAC molecule based on a single antibody molecule (Ab moiety) in a population of immunoconjugates.
  • the DAR can be approximately determined by m and p in formula (I), for example, the DAR can be 1 to 16, for example, 2-16, 4-16, 5-12, 6-10, 2-8, 3-8, 2-6, 4-6, 6-10, for example, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 or 15.
  • the DAR can also be determined by the overall ratio of the drug moiety (D) coupled to the Ab moiety described herein to the Ab moiety in the product as measured by a detection method (e.g., by conventional methods such as mass spectrometry, ELISA assay, electrophoresis and/or HPLC), for example, when the number of cargo molecules (e.g., m ⁇ p) carried by individual ISAC molecules in a population of immunoconjugates varies greatly.
  • a detection method e.g., by conventional methods such as mass spectrometry, ELISA assay, electrophoresis and/or HPLC
  • the DAR value of the conjugate of the invention is 1 to 16, such as 2-16, 4-16, 5-12, 6-10, 2-8, 3-8, 2-6, 4-6, 6-10, such as 1.0-8.0, 2.0-6.0, such as 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5. 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, or 10.0, and ranges having two of these values as endpoints.
  • therapeutic agent encompasses any substance effective in preventing or treating tumors, such as cancer, including chemotherapeutic agents, cytokines, angiogenesis inhibitors, cytotoxic agents, other antibodies, small molecule drugs, or immunomodulators (e.g., immunosuppressants).
  • cytotoxic agent refers to a substance that inhibits or prevents the function of cells and/or causes cell death or destruction.
  • “Chemotherapeutic agents” include chemical compounds useful in treating cancer or immune system disorders.
  • drug refers to an organic compound capable of modulating biological processes, particularly altering or preventing pathological processes.
  • prodrug refers to a chemically modified active or inactive compound that, after administration to an individual, becomes an active drug through physiological actions in the body (e.g., hydrolysis, neogenesis, etc.).
  • physiological actions in the body e.g., hydrolysis, neogenesis, etc.
  • the techniques for making and using prodrugs are well known to those skilled in the art.
  • small molecule drug refers to low molecular weight organic compounds that can regulate biological processes, especially change or prevent pathological processes.
  • Small molecules are defined as molecules with a molecular weight of less than 10 kD, usually less than 2 kD and preferably less than 10 kD, more preferably less than 500 D.
  • Small molecule drugs include, but are not limited to, organic molecules, organic molecules containing inorganic components, molecules containing radioactive atoms, synthetic molecules, peptide mimics, and antibody mimics. As therapeutic agents, small molecules can be more permeable to cells, less susceptible to degradation, and less prone to eliciting immune responses than macromolecules.
  • Anti-tumor compounds are pharmaceutically active compounds that have an effect on tumors, including but not limited to cytotoxic agents or chemotherapeutic agents, such as cytotoxic agents disclosed in WO2021/173773, camptothecin compounds Exatecan (topoisomerase I inhibitor Exatecan), DXd (a novel topoisomerase I inhibitor Exatecan derivative), auristatin compounds such as monomethyl auristatin E (MMAE) or maytansine compounds such as small molecule microtubule inhibitor DM1. It should be understood that anti-tumor compounds can be substituted by isotopes including but not limited to deuterium, tritium, etc.
  • cytotoxic agents or chemotherapeutic agents such as cytotoxic agents disclosed in WO2021/173773, camptothecin compounds Exatecan (topoisomerase I inhibitor Exatecan), DXd (a novel topoisomerase I inhibitor Exatecan derivative), auristatin compounds such as monomethyl auristatin E (MMAE)
  • Deuterium substituted means that a hydrogen in the molecule is replaced with deuterium, for example, 1 or more hydrogens, for example 1-10 (eg, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10) hydrogens are replaced with deuterium.
  • immunomodulator refers to a natural or synthetic agent or drug that inhibits or regulates (e.g., activates) an immune response.
  • the immune response can be a humoral response or a cellular response.
  • Immunomodulators include immunosuppressants.
  • the immunomodulators of the present invention include immune checkpoint inhibitors or immune checkpoint agonists.
  • an effective amount refers to an amount or dosage of an antibody or fragment or composition or combination of the present invention, which produces a desired effect in a patient in need of treatment or prevention after being administered to the patient in a single or multiple doses. Depending on the desired effect, “therapeutically effective amount” and “prophylactically effective amount” may be included.
  • a “therapeutically effective amount” refers to an amount effective to achieve the desired therapeutic outcome at the desired dosage and for the desired period of time.
  • a therapeutically effective amount is also an amount in which any toxic or deleterious effects of the antibody or antibody fragment or composition or combination are outweighed by the therapeutically beneficial effects.
  • a “therapeutically effective amount” preferably inhibits a measurable parameter (e.g., tumor volume) by at least about 30%, even more preferably by at least about 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, or even 100%, relative to an untreated subject.
  • prophylactically effective amount refers to an amount effective to achieve the desired prophylactic result at the required dosage and for the required period of time. Typically, since a prophylactic dose is used in a subject prior to or at an earlier stage of disease, the prophylactically effective amount will be less than the therapeutically effective amount.
  • host cell refers to cells into which exogenous nucleic acid is introduced, including progeny of such cells.
  • Host cells include “transformants” and “transformed cells,” which include primary transformed cells and progeny derived therefrom, without regard to the number of passages. Progeny may not be completely identical to the parent cell in nucleic acid content, but may contain mutations. Mutant progeny screened or selected for the same function or biological activity as in the initially transformed cell are included herein.
  • label refers to a compound or composition that is directly or indirectly conjugated or fused to a reagent (such as a polynucleotide probe or antibody) and facilitates the detection of the reagent to which it is conjugated or fused.
  • the label itself can be detectable (e.g., a radioisotope label or a fluorescent label) or can catalyze a chemical change in a detectable substrate compound or composition in the case of an enzymatic label.
  • the term is intended to encompass direct labeling of a probe or antibody by coupling (i.e., physically connecting) a detectable substance to the probe or antibody and indirect labeling of a probe or antibody by reacting with another reagent that is directly labeled.
  • “Individuals” or “subjects” include mammals. Mammals include, but are not limited to, domestic animals (e.g., cows, sheep, cats, dogs, and horses), primates (e.g., humans and non-human primates such as monkeys), rabbits, and rodents (e.g., mice and rats). In some embodiments, the individual or subject is a human.
  • fixed combination means that two or more active agents are administered to a patient simultaneously in the form of a single entity.
  • the dosage and/or time interval of the two or more active agents are selected so that the combined use of the parts can produce an effect greater than that achieved by using any one component alone when treating a disease or condition.
  • Each component can be in the form of a separate formulation, which can be the same or different.
  • prevention includes inhibition of the occurrence or development of a disease or condition or symptoms of a particular disease or condition.
  • subjects with a family history of cancer are candidates for preventive regimens.
  • prevention refers to the administration of a drug before the signs or symptoms of cancer occur, particularly in a subject at risk for cancer.
  • LCDR1-3 are determined according to any CDR scheme, such as Kabat, AbM, Chothia or IMGT or a combination thereof;
  • the LCDR1, 2 and 3 are determined according to the Kabat protocol, respectively.
  • HCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO:1, or consists of the amino acid sequence, or HCDR1 comprises an amino acid sequence having one, two or three changes (preferably amino acid substitutions, preferably conservative substitutions) compared to the amino acid sequence of SEQ ID NO:1.
  • HCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO:2, or consists of the amino acid sequence, or HCDR2 comprises an amino acid sequence having one, two or three changes (preferably amino acid substitutions, preferably conservative substitutions) compared to the amino acid sequence of SEQ ID NO:2.
  • HCDR3 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO:3, or consists of the amino acid sequence, or HCDR3 comprises an amino acid sequence having one, two or three changes (preferably amino acid substitutions, preferably conservative substitutions) compared to the amino acid sequence of SEQ ID NO:3.
  • LCDR1 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO:4, or consists of the amino acid sequence, or LCDR1 comprises an amino acid sequence having one, two or three changes (preferably amino acid substitutions, preferably conservative substitutions) compared to the amino acid sequence of SEQ ID NO:4.
  • LCDR2 comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO:5, or consists of the amino acid sequence, or LCDR2 comprises an amino acid sequence having one, two or three changes (preferably amino acid substitutions, preferably conservative substitutions) compared to the amino acid sequence of SEQ ID NO:5.
  • the anti-FR ⁇ antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention comprises a heavy chain variable region (VH). In some aspects, the anti-FR ⁇ antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention comprises a light chain variable region (VL). In some aspects, the anti-FR ⁇ antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region. In some embodiments, the heavy chain variable region comprises 3 complementary determining regions (CDRs) from the heavy chain variable region, HCDR1, HCDR2, and HCDR3. In some embodiments, the light chain variable region comprises 3 complementary determining regions (CDRs) from the light chain variable region, LCDR1, LCDR2, and LCDR3.
  • CDRs complementary determining regions
  • the heavy chain variable region of the invention is:
  • (i) comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:33; or
  • (ii) comprises or consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:33;
  • (iii) comprises or consists of an amino acid sequence having one or more (preferably no more than 10, more preferably no more than 5, 4, 3, 2, 1) amino acid changes (preferably amino acid substitutions, more preferably conservative amino acid substitutions) compared to the amino acid sequence shown in any one of (i) to (ii), and preferably, the amino acid changes do not occur in the CDR regions.
  • the light chain variable region of the invention is a light chain variable region of the invention
  • (i) comprises or consists of an amino acid sequence that is at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identical to the amino acid sequence selected from SEQ ID NO:34; or
  • (ii) comprises or consists of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO:34;
  • HCDR can be determined according to any scheme for determining CDR, for example, according to the scheme of Kabat, AbM, Chothia, Contact or IMGT or a combination thereof;
  • the HCDR1 is determined according to a union of the Kabat and Chothia schemes, and the HCDR2 and HCDR3 are determined according to the Kabat scheme, respectively.
  • the three complementarity determining regions (LCDRs) from the light chain variable region, LCDR1, LCDR2 and LCDR3 of the present invention are selected from
  • LCDR can be determined according to any scheme for determining CDR, for example, according to the schemes of Kabat, AbM, Chothia, Contact or IMGT or a combination thereof;
  • the light chain constant region is a (human) kappa light chain constant region.
  • the kappa light chain constant region comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:45 or an amino acid sequence having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:45.
  • the light chain constant region of the anti-FR ⁇ antibody or its antigen-binding fragment of the present invention has cysteine mutations at positions 160 and 166 (Eu numbering).
  • the antibodies or antigen-binding fragments thereof of the invention comprise
  • the anti-FR ⁇ antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention may be any form of antibody or antigen-binding fragment thereof known in the art, such as monoclonal, chimeric, humanized, fully human, bispecific, or multispecific antibody or antibody fragment thereof.
  • the heavy chain of the anti-FR ⁇ antibody of the invention is N-(2-FR ⁇ )-2-FR ⁇ antibody
  • amino acid sequence comprising or consisting of an amino acid sequence that is at least 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identical to an amino acid sequence selected from SEQ ID NO:35;
  • amino acid sequence comprising or consisting of one or more (preferably no more than 20 or 10, more preferably no more than 5, 4, 3, 2, or 1) amino acid changes (preferably amino acid substitutions, more preferably conservative amino acid substitutions) compared to the amino acid sequence selected from SEQ ID NO:35.
  • the light chain of the anti-FR ⁇ antibody of the invention is the light chain of the anti-FR ⁇ antibody of the invention.
  • the anti-FR ⁇ antibodies or antigen-binding fragments thereof of the present invention have better endocytosis activity on FR ⁇ -positive cells, such as FR ⁇ -positive tumor cells.
  • the present invention provides a nucleic acid encoding any anti-TROP2 antibody or fragment thereof described herein.
  • the nucleic acid may comprise a nucleic acid encoding an amino acid sequence of a light chain variable region and/or a heavy chain variable region of an antibody, or a nucleic acid encoding an amino acid sequence of a light chain and/or a heavy chain of an antibody.
  • the nucleic acid of the present invention comprises a nucleic acid encoding an amino acid sequence selected from any one of SEQ ID NOs: 1-10, 12, and 14-16, or a nucleic acid encoding an amino acid sequence having at least 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identity with an amino acid sequence selected from any one of SEQ ID NOs: 1-10, 12, and 14-16.
  • each antibody or polypeptide amino acid sequence may be encoded by a variety of nucleic acid sequences due to codon degeneracy.
  • the nucleic acid of the present invention comprises a nucleic acid encoding an amino acid sequence selected from any one of SEQ ID NOs: 27-46, or a nucleic acid encoding an amino acid sequence having at least 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identity with an amino acid sequence selected from any one of SEQ ID NOs: 27-46.
  • each antibody or polypeptide amino acid sequence can be encoded by a variety of nucleic acid sequences due to codon degeneracy.
  • the nucleic acid sequence encoding the molecule of the present invention can be produced by methods well known in the art, such as by de novo solid phase DNA synthesis, or by PCR amplification.
  • a secretory signal peptide can be fused to the N-terminus of the heavy chain and/or light chain of the antibody, and/or a tag peptide that facilitates purification.
  • the polynucleotide encoding the polypeptide chain of the antibody of the present invention can be inserted into one or more vectors for further cloning and/or expression in a host cell. Methods well known to those skilled in the art can be used to construct expression vectors. Once an expression vector comprising one or more nucleic acid molecules of the present invention for expression has been prepared, the expression vector can be transfected or introduced into a suitable host cell. A variety of techniques can be used to achieve this purpose, for example, protoplast fusion, calcium phosphate precipitation, electroporation, retroviral transduction, viral transfection, gene gun, liposome-based transfection or other conventional techniques.
  • the present invention also provides vectors comprising nucleic acid of the present invention.
  • the vector is an expression vector, such as a eukaryotic expression vector.
  • Vectors include but are not limited to viruses, plasmids, cosmids, lambda phages or yeast artificial chromosomes (YAC).
  • the expression vector of the present invention is a pcDNA vector, such as a pcDNA3.1 expression vector.
  • the expression vector of the present invention is a pTT5 vector or an expression vector derived from pTT5.
  • a host cell comprising the vector.
  • the present invention also provides a host cell comprising the nucleic acid or the vector.
  • Host cells suitable for replication and support expression of antibodies of the present invention are well known in the art. Such cells can be transfected or transduced with specific expression vectors, and large amounts of vector-containing cells can be grown for inoculation of large-scale fermenters, thereby obtaining sufficient amounts of antibodies for clinical applications.
  • Suitable host cells for cloning or expressing vectors encoding antibodies include prokaryotic or eukaryotic cells described herein. For example, antibodies can be produced in bacteria, particularly when glycosylation and Fc effector functions are not required. After expression, antibodies can be separated from the bacterial cell paste in the soluble fraction and can be further purified.
  • the host cell is eukaryotic.
  • the host cell is selected from yeast cells, mammalian cells (e.g., CHO cells (e.g., CHO-S or CHO-K) or 293 cells (e.g., 293F or HEK293 cells)) or other cells suitable for preparing antibodies or fragments thereof.
  • the host cell is prokaryotic, for example, bacteria, such as Escherichia coli.
  • eukaryotic microorganisms such as filamentous fungi or yeast are suitable cloning or expression hosts for vectors encoding antibodies.
  • fungi and yeast strains in which the glycosylation pathway has been "humanized” result in the production of antibodies with partial or complete human glycosylation patterns.
  • Host cells suitable for expressing glycosylated antibodies are also derived from multicellular organisms (invertebrates and vertebrates). Vertebrate cells can also be used as hosts.
  • mammalian cell lines modified to be suitable for suspension growth can be used.
  • useful mammalian host cell lines are monkey kidney CV1 lines (COS-7) transformed with SV40; human embryonic kidney lines (HEK293, 293F or 293T cells), etc.
  • Other useful mammalian host cell lines include Chinese hamster ovary (CHO) cells, including DHFR-CHO cells, CHO-S cells, ExpiCHO, etc.; and myeloma cell lines such as Y0, NS0 and Sp2/0.
  • CHO Chinese hamster ovary
  • CHO Chinese hamster ovary
  • CHO-CHO cells including DHFR-CHO cells, CHO-S cells, ExpiCHO, etc.
  • myeloma cell lines such as Y0, NS0 and Sp2/0.
  • Mammalian host cell lines suitable for producing antibodies are known in the art.
  • the present invention provides an antibody immunoagonist conjugate having formula (I):
  • the method comprises culturing a host cell comprising a nucleic acid encoding the antibody (e.g., any one polypeptide chain and/or multiple polypeptide chains) or an expression vector comprising the nucleic acid under conditions suitable for expression of the antibody or its peptide chain, as provided above, and optionally recovering the antibody from the host cell (or host cell culture medium).
  • a host cell comprising a nucleic acid encoding the antibody (e.g., any one polypeptide chain and/or multiple polypeptide chains) or an expression vector comprising the nucleic acid under conditions suitable for expression of the antibody or its peptide chain, as provided above, and optionally recovering the antibody from the host cell (or host cell culture medium).
  • the present invention also provides a drug combination or a drug combination product comprising an antibody or fragment thereof or an ISAC molecule of the present invention, and one or more other therapeutic agents (e.g., therapeutic agents including chemotherapeutic agents, angiogenesis inhibitors, cytokines, cytotoxic agents, other antibodies, small molecule drugs or immunomodulators (e.g., immune checkpoint inhibitors or agonists), etc.).
  • therapeutic agents including chemotherapeutic agents, angiogenesis inhibitors, cytokines, cytotoxic agents, other antibodies, small molecule drugs or immunomodulators (e.g., immune checkpoint inhibitors or agonists), etc.
  • p' is a value between 1-15, for example, 2-10, 2-8, 2-6, 2-5, 3-5, 3.5-4.5.
  • the antibody targeting TROP2 or its fragment (e.g., antigen binding fragment) suitable for constructing the above-mentioned antibody-drug conjugate may be a mammalian-derived (e.g., human or mouse), humanized or chimeric antibody targeting TROP2 or antibody fragment.
  • the antibody targeting TROP2 or its fragment suitable for constructing the above-mentioned antibody-drug conjugate is an anti-TROP2 antibody or its fragment, such as an antigen binding fragment, as defined above.
  • the TROP2-targeting antibody or fragment thereof suitable for constructing the above-mentioned antibody-drug conjugate comprises a first heavy chain complementary determining region (HCDR1), a second heavy chain complementary determining region (HCDR2), a third heavy chain complementary determining region (HCDR3), and a first light chain complementary determining region (LCDR1), a second light chain complementary determining region (LCDR2), and a third light chain complementary determining region (LCDR3), wherein:
  • the HCDR1 comprises or consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:17;
  • the HCDR2 comprises or consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:18;
  • the HCDR3 comprises or consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:19;
  • the LCDR1 comprises or consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:20;
  • the LCDR2 comprises or consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:21;
  • the LCDR3 contains or consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:22.
  • the TROP2-targeting antibody or its fragment suitable for constructing the above-mentioned antibody-drug conjugate comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region, wherein the heavy chain variable region comprises HCDR1, HCDR2 and HCDR3, and the light chain variable region comprises LCDR1, LCDR2 and LCDR3, wherein the HCDR1, HCDR2, HCDR3 and LCDR1, LCDR2 and LCDR3 respectively comprise the amino acid sequences shown in SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22 or consist of the amino acid sequences shown in SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22.
  • the TROP2-targeting antibody or fragment thereof suitable for constructing the above-mentioned antibody-drug conjugate comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region, wherein the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:23 or comprises an amino acid sequence that is at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:23 or consists of the amino acid sequence, and the light chain variable region comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:24 or comprises an amino acid sequence that is at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:24 or consists of the amino acid sequence.
  • the TROP2-targeting antibody or fragment thereof suitable for constructing the above-mentioned antibody-drug conjugate comprises a heavy chain and a light chain
  • the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:25 or comprises an amino acid sequence that is at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:25 or consists of the amino acid sequence
  • the light chain variable region comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:26 or comprises an amino acid sequence that is at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:26 or consists of the amino acid sequence.
  • the antibody targeting TROP2 or its fragment suitable for constructing the above-mentioned antibody-drug conjugate comprises a heavy chain and a light chain, wherein the heavy chain comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 25 and the light chain comprises or consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 26.
  • the antibody targeting TROP2 or its fragment suitable for constructing the above-mentioned antibody-drug conjugate comprises a heavy chain with a sequence of SEQ ID NO: 25 and a light chain with a sequence of SEQ ID NO: 24.
  • the antibody targeting TROP2 suitable for constructing the above-mentioned antibody-drug conjugate is a full-length antibody.
  • the antibody targeting TROP2 comprises two heavy chains as defined above and two light chains as defined above, or is composed of two of the heavy chains and two of the light chains.
  • the antibody targeting TROP2 or its fragment suitable for constructing the above-mentioned antibody-drug conjugate is a multispecific antibody such as a bispecific antibody.
  • the antibody targeting TROP2 suitable for constructing the above-mentioned antibody-drug conjugate is a monoclonal antibody.
  • the antibody targeting TROP2 suitable for constructing the above-mentioned antibody-drug conjugate is a chimeric antibody or a humanized antibody.
  • the antibody fragment targeting TROP2 suitable for constructing the above-mentioned antibody-drug conjugate is selected from Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, single-chain antibody (e.g., scFv), (Fab') 2 , single-domain antibody such as VHH, dAb (domainantibody), bivalent antibody or linear antibody.
  • the antibody or fragment thereof targeting TROP2 is an antibody or fragment thereof targeting TROP2 in PCT/CN2024/121813, such as hRS7 antibody.
  • Patent application PCT/CN2024/121813 is incorporated herein in its entirety.
  • the other therapeutic agent is an antibody-drug conjugate targeting FR ⁇ , a stereoisomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof.
  • the antibody or fragment thereof targeting FR ⁇ is Mirvetuximab from ImmunoGen in U.S. Patent Application Publication No. US20200362029A1.
  • the antibody or fragment thereof targeting FR ⁇ is FR57 from ImmunoGen in U.S. Patent Application Publication No. US20200362029A1.
  • the antibody-drug conjugate targeting FR ⁇ is In some specific embodiments, the targeting FR ⁇ antibody-drug conjugate is FR57-Dxd.
  • Patent application US20200362029A1 is incorporated herein in its entirety.
  • the present invention provides a method for preventing or treating a tumor (eg, cancer) in a subject, comprising administering to the subject an effective amount of the antibody and/or ISAC molecule, pharmaceutical composition, pharmaceutical combination or kit of the present invention.
  • a tumor eg, cancer
  • the present invention provides a method for preventing or treating a tumor (eg, cancer) in a subject, comprising administering to the subject an effective amount of the antibody and/or ISAC molecule, pharmaceutical composition, pharmaceutical combination or kit of the present invention.
  • the antibodies and/or ISAC molecules of the present invention are capable of killing tumor cells, and/or inhibiting the proliferation of tumor cells, such as tumor cells expressing FR ⁇ , such as lung cancer cells, head and neck tumor cells, prostate cancer cells, melanoma cells, pancreatic cancer cells, breast cancer cells, esophageal cancer cells, cervical cancer cells, renal cancer cells, bladder cancer cells or ovarian cancer cells.
  • tumor cells such as tumor cells expressing FR ⁇ , such as lung cancer cells, head and neck tumor cells, prostate cancer cells, melanoma cells, pancreatic cancer cells, breast cancer cells, esophageal cancer cells, cervical cancer cells, renal cancer cells, bladder cancer cells or ovarian cancer cells.
  • the tumor is an immune evasive tumor.
  • composition can also be administered locally via an implanted membrane, sponge, or another suitable material on which the desired molecule is absorbed or encapsulated.
  • the device when an implant device is used, the device can be implanted in any suitable tissue or organ and can deliver the desired molecule via diffusion, a timed-release bolus, or continuous administration.
  • the human TROP2 extracellular segment protein (Acro, Cat#TR2-H5223) was emulsified with TiterMax (sigma, Cat#T2684) and then immunized Balb/c mice (purchased from Beijing Weitonglihua Experimental Animal Technology Co., Ltd.) four times, with subcutaneous injection once every two weeks (50 ⁇ g protein per mouse).
  • the serum titer meets the requirements, remove the spleen of the mouse to prepare B lymphocyte suspension, and then electro-fuse with SP2/0 myeloma cells (ATCC). Dilute the fused cells to 1-2 ⁇ 10 4 cells/ml with selective culture medium (1640 culture medium containing 20% FBS and 1 x HAT), spread them on 96-well plates, and add 100 ⁇ l of cell suspension to each well. Replace the selection culture medium (1640 culture medium containing 10% FBS and 1 x HT) on the 7th day after fusion, and take the supernatant for detection after culturing for 10 days (or longer, depending on the cell growth status).
  • selective culture medium (1640 culture medium containing 20% FBS and 1 x HAT)
  • Subcloning steps of the limiting dilution method prepare a 96-well plate and add 200 ⁇ l of culture medium to each well.
  • the culture medium is based on the screening culture medium, but HAT is replaced with HT (Gibco, Cat#11067-030), and the rest of the formula is the same.
  • Prepare a cell suspension from the cells of the positive wells screened by the above fusion take 100 ⁇ l and add it to each well of the first row and mix well, then take 100 ⁇ l of the cell suspension in the first row and add it to the second row, mix well and take 100 ⁇ l and add it to the next row; repeat the above steps until the last row is diluted, let the 96-well plate stand for 30 minutes, and observe and count under a microscope. Take the volume corresponding to 100 cells and add 20ml of culture medium, mix well and plate, 200 ⁇ l per well. Observe under a microscope one week later, determine and mark the monoclonal wells.
  • the high-throughput screening method described above is used for detection, and the target positive wells are picked out. After expansion and culture, the cells are frozen and the clone supernatant is subjected to affinity measurement.
  • the affinity measurement method (ForteBio) is carried out according to the existing method (Estep, P et al., High throughput solution Based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning. MAbs, 2013.5 (2): p. 270-8).
  • the AHQ (Pall, 1506091) sensor is offline balanced in the analysis buffer for 30 minutes, and then online detection is performed for 60 seconds to establish a baseline, and the purified antibody obtained as described above is loaded online onto the AHQ sensor (ForteBio) for ForteBio affinity measurement.
  • the sensor with the loaded antibody is then exposed to the antigen TROP2, and then the sensor is transferred to the analysis buffer for dissociation rate measurement.
  • the KD value is analyzed using the ForteBio analysis software.
  • the affinity detection results are shown in Table 1:
  • the antibody light and heavy chain gene sequences were retrieved from the hybridoma candidate clone obtained in Example 1.1, and human-mouse chimeric antibodies were constructed.
  • the heavy chain and light chain sequences of the chimeric antibody were shown in SEQ ID NO: 15 and 16, respectively.
  • the antibody light and heavy chain variable region sequences were correct and matched clones, and their light and heavy chain variable region gene fragments were respectively passed through the homologous recombinase ( Catalog number: C112-01) was connected to the pcDNA3.1 vector, in which the IgG1 subtype was selected as the constant region to obtain the expression plasmids of light chain and heavy chain antibodies.
  • the light chain plasmid and heavy chain plasmid of the same antibody were then mixed in a 1:1 molar ratio and transfected into 293F cells via polyethyleneimine (PEI) (Polysciences, Cat#23966). After 5-7 days of culture, when the cell viability was lower than 60%, the cell culture supernatant was collected and the monoclonal antibody was purified using a Protein A affinity column.
  • PEI polyethyleneimine
  • the equilibrium dissociation constant ( KD ) of the antibody of the present invention binding to human, monkey and mouse TROP2 was determined using the biofilm thin layer interferometry technique (ForteBio). ForteBio affinity determination was performed according to the existing method (Estep, P et al., High throughput solution Based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning. MAbs, 2013. 5 (2): p. 270-8).
  • the AHQ (Pall, 1506091) sensor was equilibrated offline in the assay buffer for 30 minutes, then online for 60 seconds to establish a baseline, and the purified antibodies obtained as described above were loaded online onto the AHQ sensor (ForteBio) for ForteBio affinity measurement. The sensor with the loaded antibody was then exposed to the antigen TROP2, after which the sensor was transferred to the assay buffer for dissociation rate measurement. KD values were analyzed using the ForteBio analysis software.
  • Antigen sources were: human (Acro, Cat#TR2-H5223), monkey (Sino, Cat#50922-M08H) and mouse (Sino, Cat#90893-C08H).
  • ADCP Antibody-dependent cellular phagocytosis
  • the present invention uses Fc ⁇ RIIa-H reporter cells (G9871, Promega) to detect the ADCP (Antibody-dependent cell-mediated phagocytosis) activity of TROP2 chimeric antibodies.
  • the cells are engineered Jurkat T cells.
  • NFAT Nuclear Factor of Activated T
  • Expi293F cells (purchased from Gibco) were cultured with Expi293F medium (Gibco, REF#A14351-01). The cell density was tested one day before transfection (viability must be greater than 95%) and adjusted to 3 ⁇ 10 6 cells/ml with fresh Expi293F medium for continued culture. On the day of transfection, the cell density was adjusted to 3 ⁇ 10 6 cells/ml.
  • Opti-MEM medium Gibco, REF#31985-070
  • the DNA to be transfected at a ratio of 1 mg/L, where the ratio of light and heavy chain plasmids is 1:1, mix well
  • PEIMax Polysciences Inc. Cat#24765-1
  • the cells are cultured in a shaker at 8% CO2, 36.5°C, and 120rpm.
  • HiTrap MabSelect PrismA GE Healthcare, Cat#17549853 affinity chromatography column was used for affinity capture.
  • 10-20 column volumes of 0.1 M NaOH were passed through the pipes and affinity chromatography column, and then 10-20 column volumes of distilled water were used to clean the pipes and columns, and 5 column volumes of 1 ⁇ PBS (Gibco) were used to balance the filler column;
  • the filtered cell feed was passed through the column, and then the filler column was cleaned with 10 column volumes of 1 ⁇ PBS to remove non-specific binding proteins;
  • the filler was rinsed with 5 column volumes of elution buffer (100 mM sodium citrate, pH 3.5), the eluate was collected, the pH was adjusted to 6.0 with 2 M Tris, filtered and sterilized, and used after the purity test was qualified.
  • elution buffer 100 mM sodium citrate, pH 3.5
  • the chimeric antibody obtained by hybridoma is humanized, and the specific steps are as follows:
  • hz1D9B10 whose CDR sequence, light chain variable region, heavy chain variable region, light chain and heavy chain amino acid sequences are shown in Table 4 below.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

涉及TLR7/8激动剂，以及包含其与靶向Trop2的抗体和靶向FRα的抗体的免疫偶联物，还提供了所述免疫偶联物的治疗和诊断用途。

Description

抗体以及包含其与TLR7/8激动剂的免疫偶联物及其用途 技术领域
本发明属于肿瘤治疗领域和靶向治疗领域。具体地，本发明提供了新的抗TROP2抗体、新的FRα抗体，和新的TLR(例如，TLR7/8)激动剂，和包含所述新的抗体和/或新的TLR激动剂的免疫偶联物(ISAC)以及含有所述偶联物的组合物，还提供了所述ISAC的治疗和诊断用途。
发明背景
TROP2，一种滋养层细胞表面抗原，也称为肿瘤相关钙信号转导蛋白(TACSTD2)在多种人类上皮癌中过度表达，包括乳腺癌、肺癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、前列腺癌、宫颈癌、头颈癌和卵巢癌等(Yezhe Cheng等，Frontiers in Oncology，2022 Dec 23；12:951589)。临床前和临床研究已经对抗TROP2抗体-药物偶联物(ADC)用于癌症的治疗，但是，临床结果仅仅是差强人意。例如，Trodelvy(抗人TROP2抗体-SN-38偶联物)在治疗难治性实体瘤当中取得了可观的治疗效果，例如，在耐药性三阴性乳腺癌(TNBC)患者中的客观缓解率(ORR)达到33％。Trodelvy的一个重要作用机制之一，SN-38(载荷)通过pH敏感的连接子进行连接，在酸性的肿瘤微环境中连接子能够断裂并且特异性的释放SN-38。但是因为Trodelvy的连接子不够稳定，马来酰亚胺介导的连接子在生理条件下通过硫醇交换发生断裂，使得Trodelvy在血清中的半衰期相对较短(约1天)。因此，Trodelvy可能具有相对较高的脱靶效应。而另一种抗TROP2抗体-药物偶联物Ds-1062a(Dato-DXd，阿斯利康和第一三共)虽然在治疗无基因突变肺癌和三阴性乳腺癌患者中疗效显著，但是也仍然存在DAR分布不均一从而影响药效以及在正常组织的中产生靶毒性等问题。
叶酸受体α(FRα)，亦称为叶酸受体1(FOLR1)，属于叶酸受体家族，作为叶酸结合蛋白被发现，但其除了运送叶酸外还参与调控肿瘤细胞的增殖和转移。由于叶酸是维持细胞生长和代谢所必需的重要营养物质，该分子在DNA和RNA的合成中起着关键作用。在某些快速增殖的癌细胞(如乳腺癌、卵巢癌、肺癌等)中，由于对叶酸的需求更高，叶酸受体α表达水平明显增加从而使得癌细胞维持其异常高的增殖速率和代谢活性。目前已有多项靶向FOLR1的抗肿瘤治疗策略，包括单抗、双抗、ADC药物以及CAR-T疗法等。
Toll样受体(TLR)是模式识别受体(PRR)，其主要表达于树突细胞、巨噬细胞、单核细胞、天然杀伤细胞和T淋巴细胞上。TLR与来自细菌、真菌、原生动物和病毒的病原体相关分子模式(PAMPS)结合，并作为抵御入侵病原体的第一道防线。人体中存在10种已知的TLR家族成员，它们是I型跨膜蛋白，以富含亮氨酸的胞外结构域和包含保守的Toll/白细胞介素(IL)-1受体(TIR)结构域的胞质尾区为特征。在该家族中，TLR3、TLR7、TLR8和TLR9位于内体内。
TLR7主要在浆细胞样细胞上表达并且还在B-细胞上表达，其可以通过结合特异性小分子配体(即TLR7激动剂)或其天然配体(即单链RNA、ssRNA)被活化。改变的免疫细胞应答性可能与慢性病毒感染过程中天然免疫应答的下降有关。激动剂诱导的TLR7活化由此可能代表用于治疗慢性病毒感染的新方法(D.J Connolly和L.AJ O’Neill,Current Opinion in Pharmacology 2012,12：510-518,P.A.Roethle等人,J.Med.Chem.2013,56,7324-7333)。
Toll样受体(TLR)还可以改变肿瘤微环境并启动适应性抗肿瘤免疫。
然而，由于全身给药后与广泛免疫激活相关的毒性，TLR激动剂的耐受性不佳。对于研发有效和安全的TLR激动剂、特别是TLR7/8激动剂作为新的抗病毒和抗肿瘤免疫疗法以提供更多的治疗方案存在非常迫切的临床需求。
发明概述
本发明首先提供了新的TLR激动剂、特别是TLR7/8激动剂。
本发明还提供了新的高亲和力TROP2抗体，或其抗原结合片段。
本发明还提供了新的高亲和力FRα抗体，或其抗原结合片段。
本发明还提供了一种新型免疫偶联物(ISAC)，其包含与肿瘤靶向抗体偶联的TLR7/8激动剂。本发明的抗体免疫激动剂偶联物在全身施用时在体内具有良好的耐受性，并引发瘤内髓系细胞的强烈激活，从而导致肿瘤清除和随后的免疫记忆。
在第一方面，本发明提供了特异性结合TROP2(例如人TROP2)的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，其包含：
(i)如SEQ ID NO:7所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和/或如SEQ ID NO:8所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
(ii)如SEQ ID NO:12所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:14所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在本发明的抗TROP2抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，其包含第一重链互补决定区(HCDR1)、第二重链互补决定区(HCDR2)、第三重链互补决定区(HCDR3)以及第一轻链互补决定区(LCDR1)、第二轻链互补决定区(LCDR2)和第三轻链互补决定区(LCDR3)，其中所述HCDR1、HCDR2、HCDR3以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或分别由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，本发明的抗TROP2抗体或其抗原结合片段以足够的亲和力结合TROP2(例如人TROP2)，例如，以下述平衡解离常数(KD)与TROP2结合，所述KD≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.55nM，≤0.5nM，≤0.4nM或≤0.35nM，例如10-8M以下，例如10-7M至10-10M，例如在大约0.1nM-1nM之间，在大于0.3-0.7nM之间，在大约0.4-0.6nM之间，在大约0.4-0.5nM之间，在大约0.5-0.6nM之间，例如通过ForteBio所检测的。在一些实施方案中，TROP2为人、小鼠或食蟹猴TROP2。在一些实施方案中，抗体结合亲和力是使用生物光干涉测量测定的。
在一些实施方案中，本发明的抗TROP2抗体或其抗原结合片段结合细胞表面表达的TROP2。
在一些实施方案中，本发明的抗TROP2抗体或其抗原结合片段可以诱导内吞，例如抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段可以抑制和/或减小体内肿瘤的生长和/或体积。
在一些实施方案中，抗TROP2抗体或其抗原结合片段包含重链可变区VH和/或轻链可变区VL，其中VH
(i)包含与SEQ ID NO:7或12的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
(ii)包含SEQ ID NO:7或12的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
(iii)包含与SEQ ID NO:7或12的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，优选地，所述氨基酸改变不发生在CDR区中；和/或
其中VL
(i)包含与SEQ ID NO:8或14的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
(ii)包含SEQ ID NO:8或14的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
(iii)包含与SEQ ID NO:8或14的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，优选地，所述氨基酸改变不发生在CDR区中。
在一些实施方案中，本发明的抗TROP2抗体或其抗原结合片段包含VH和VL，其中VH包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或由其组成，且VL包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的抗TROP2抗体或其抗原结合片段还包含重链恒定区和/或轻链恒定区。
在一些实施方案中，本发明的抗TROP2抗体或其抗原结合片段为IgG抗体。
在一些实施方案中，本发明的抗TROP2抗体或其抗原结合片段的重链恒定区来自IgG1或IgG2或IgG3或IgG4，例如IgG1。
在一些实施方案中，本发明的抗TROP2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，其中重链
(i)包含与SEQ ID NO:9或15的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；
(ii)包含SEQ ID NO:9或15的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
(iii)包含与SEQ ID NO:9或15的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；和/或
轻链
(i)包含与SEQ ID NO:10或16的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；
(ii)包含SEQ ID NO:10或16的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
(iii)包含与SEQ ID NO:10或16的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，本发明的抗TROP2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，其中重链包含由SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或由其组成，且轻链包含由SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的抗TROP2抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，其中重链包含由SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列或由其组成，且轻链包含由SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的抗TROP2抗体或其抗原结合片段是嵌合抗体或人源化抗体。
在一些实施方案中，本发明的抗TROP2抗体的抗原结合片段是例如Fv，Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2；dAb(domain antibody)；线性抗体；单链抗体(例如scFv)；单结构域抗体例如VHH；双价抗体或其片段；或骆驼科抗体。
在一些实施方案中，本发明还提供了融合蛋白，其包含本发明的抗TROP2抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，本发明还提供了免疫偶联物，其包含本发明的抗TROP2抗体或其抗原结合片段，并且还包含偶联至所述抗体或其抗原结合片段上的载荷(payload)。在一些实施方案中，所述载荷是毒素、小分子药物/药剂、细胞毒性剂、细胞凋亡剂、螯合剂、免疫调节剂/免疫刺激剂/免疫激动剂、寡核苷酸、多肽、肽表位、放射性核素、前药等。在一些优选的实施方案中，所述载荷是免疫刺激剂/免疫激活剂。在一些更优选的实施方案中，所述载荷是TLR激动剂。在一些更优选的实施方案中，所述载荷是TLR7/8激动剂。
在一些实施方案中，本发明涉及一种分离的核酸，其编码本发明的抗TROP2抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，本发明涉及一种包含本发明的核酸的载体，优选地所述载体是表达载体。
在一些实施方案中，本发明涉及一种包含本发明的核酸或载体的宿主细胞，优选地，所述宿主细胞是原核的或真核的，更优选的选自酵母细胞、哺乳动物细胞(例如293细胞或CHO细胞，例如CHO-K细胞或HEK293细胞)或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。
在一些实施方案中，本发明涉及一种制备抗TROP2抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括
a)在适于表达编码本发明的抗TROP2抗体或其抗原结合片段的核酸的条件下培养本发明的宿主细胞，
b)任选地分离所述抗体或其抗原结合片段，
c)任选地所述方法还包括从所述宿主细胞回收所述抗TROP2抗体或其抗原结合片段，任选地，所述抗体被纯化，例如被ProteinA纯化。
在另一方面，本发明提供了一种抗FRα抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段与FRα(例如人FRα或食蟹猴FRα)特异性结合。在一些实施方案中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段与FRα(例如人FRα)的结合亲和力的KD值小于或等于大约10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM或2nM，或大于大约0.5nM或1nM，或在所述数值之间。在一些实施方案中，本发明的抗体结合亲和力是通过生物膜薄层干涉技术例如(ForteBio Octet)测定的。
在一些实施方案中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段能够有效结合FRα，例如人FRα。
在一些实施方案中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段包含3个来自重链可变区的互补决定区(HCDR)，HCDR1、HCDR2和HCDR3。在一些实施方案中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段包含3个来自轻链可变区的互补决定区(LCDR)，LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段包含3个来自重链可变区的互补决定区(HCDR)和3个来自轻链可变区的互补决定区(LCDR)。
在一些方面中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)。在一些方面中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区(VL)。在一些方面中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中，所述重链可变区包含3个来自重链可变区的互补决定区(CDR)，HCDR1、HCDR2和HCDR3。在一些实施方案中，所述轻链可变区包含3个来自轻链可变区的互补决定区(CDR)，LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段还包含抗体重链恒定区。在一些实施方案中，本发明抗FRα抗体或其抗原结合片段还包含抗体轻链恒定区。在一些实施方案中，本发明抗FRα抗体或其抗原结合片段还包含重链恒定区和轻链恒定区。
在一些实施方案中，本发明重链可变区：
(i)包含与SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
(ii)包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
(iii)包含与(i)-(ii)中任一项所示的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，优选地，所述氨基酸改变不发生在CDR区中。
在一些实施方案中，本发明的轻链可变区
(i)包含与选自SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
(ii)包含选自SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；
或者
(iii)包含与选自(i)-(ii)中任一项所示的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，优选地，所述氨基酸改变不发生在CDR区中。
在一些实施方案中，本发明的3个来自重链可变区的互补决定区(HCDR)，HCDR1、HCDR2和HCDR3选自
(i)如SEQ ID NO:33所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3；或者
(i)相对于(i)中任一项的序列，在所述三个HCDR区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的序列，
其中所述HCDR可以分别根据任何确定CDR的方案来确定，例如分别根据Kabat、AbM、Chothia、Contact或IMGT或其组合的方案确定；
例如，所述HCDR1是根据Kabat和Chothia方案的并集确定的，所述HCDR2和HCDR3分别是根据Kabat方案确定的。
在一些实施方案中，本发明的3个来自轻链可变区的互补决定区(LCDR)，LCDR1、LCDR2和LCDR3选自
(i)如SEQ ID NO:34所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3，或
(i)相对于(i)中任一项的序列，在所述三个LCDR区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的序列，
其中所述LCDR可以分别根据任何确定CDR的方案来确定，例如分别根据Kabat、AbM、Chothia、Contact或IMGT或其组合的方案确定；
例如，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别是根据Kabat方案确定。
在一些实施方案中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段包含：
如SEQ ID NO:33所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:34所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3；
其中所述HCDR和LCDR可以分别根据任何确定CDR的方案来确定，例如分别根据Kabat、AbM、Chothia、Contact或IMGT或其组合的方案确定；
例如，所述HCDR1是根据Kabat和Chothia方案的并集确定的，所述HCDR2和HCDR3分别是根据Kabat方案确定的，且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别是根据Kabat方案确定的。
在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者HCDR1包含与SEQ ID NO:27的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HCDR2包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者HCDR2包含与SEQ ID NO:28的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HCDR3包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者HCDR3包含与SEQ ID NO:29的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，LCDR1包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者LCDR1包含与SEQ ID NO:30的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，LCDR2包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者LCDR2包含与SEQ ID NO:31的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，LCDR3包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者LCDR3包含与SEQ ID NO:32的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。
在一些具体的实施方案中，本发明的抗FRα抗体包含第一重链互补决定区(HCDR1)、第二重链互补决定区(HCDR2)、第三重链互补决定区(HCDR3)以及第一轻链互补决定区(LCDR1)、第二轻链互补决定区(LCDR2)和第三轻链互补决定区(LCDR3)，其中
所述HCDR1、HCDR2、HCDR3以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列或分别由SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32所示所示的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，本发明的VH包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，以及VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中；
所述HCDR1、HCDR2、HCDR3以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列或分别由SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32所示所示的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段，其包含：
包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的VH，和/或包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的VL。
在一些实施方案中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
在本发明的一个实施方案中，本文所述的氨基酸改变包括氨基酸的置换、插入或缺失。在一些实施方案中，本文所述的氨基酸改变是保守氨基酸改变。优选的，本文所述的氨基酸改变为氨基酸置换，优选地保守置换。在优选的实施方案中，本发明所述的氨基酸改变发生在CDR外的区域(例如在FR中)。更优选地，本发明所述的氨基酸改变发生在重链可变区外和/或轻链可变区外的区域。
在一些实施方案中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段还包含抗体重链。在一些实施方案中，本发明抗FRα抗体或其抗原结合片段还包含抗体轻链。在一些实施方案中，本发明抗FRα抗体或其抗原结合片段还包含重链和轻链。在一些实施方案中，本发明的抗体重链包含重链可变区和重链恒定区，或由重链可变区和重链恒定区组成。在一些实施方案中，本发明的抗体轻链包含轻链可变区和轻链恒定区，或由轻链可变区和轻链恒定区组成。在一些实施方案中，本发明的抗体包含两条重链和两条轻链，或由两条重链和两条轻链组成。在一些实施方案中，本发明的抗体包含两条相同的重链和两条相同的轻链，或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的抗FRα抗体重链恒定区为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区，例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定区。在一些实施方案中，重链恒定区是IgG重链恒定区，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区。在一些实施方案中，所述重链恒定区是IgG1重链恒定区，例如其包含SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的抗FRα抗体轻链恒定区为lambda或Kappa轻链恒定区，优选的Kappa轻链恒定区，例如人lambda或Kappa轻链恒定区。在一些实施方案中，轻链恒定区是(人)Lambda轻链恒定区。在一些实施方案中，Lambda轻链恒定区包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的且不包含半胱氨酸突变的氨基酸序列。在一些实施方案中，轻链恒定区是(人)Kappa轻链恒定区。在一些实施方案中，Kappa轻链恒定区包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段是在轻链恒定区具有半胱氨酸突变的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含一条或两条Lambda轻链恒定区，且在Lambda轻链恒定区的第160位(EU编号)具有半胱氨酸取代(LLC160C或LLC160)，和/或Lambda轻链恒定区的第166位(EU编号)具有半胱氨酸取代(LLC166C或LLC166)。
在一些实施方案中，相对于野生型的Lambda轻链恒定区，例如SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段的轻链恒定区在第160位(Eu编号)具有半胱氨酸突变。
在一些实施方案中，在第160位具有半胱氨酸突变的Lamda轻链恒定区包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的且包含氨基酸序列VKAGVCTTTPS(SEQ ID NO:42)。
在一些实施方案中，相对于野生型的Lambda轻链恒定区，例如SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段的轻链恒定区在第166位(Eu编号)具有半胱氨酸突变。
在一些实施方案中，在第166位具有半胱氨酸突变的Lamda轻链恒定区包含SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的且包含氨基酸序列TTTPSCQSNNK(SEQ ID NO:43)。
在一些实施方案中，相对于野生型的Lambda轻链恒定区，例如SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段的轻链恒定区在第160位和第166位(Eu编号)具有半胱氨酸突变。
在一些实施方案中，在第160位和第166位具有半胱氨酸突变的Lamda轻链恒定区包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的且包含氨基酸序列VKAGVCTTTPSCQSNNK(SEQ ID NO:44)。
在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含
(i)一条或两条在第160位(Eu编号)具有半胱氨酸突变的Lamda轻链恒定区；和/或
(ii)一条或两条在第166位(Eu编号)具有半胱氨酸突变的Lamda轻链恒定区。
在一些实施方案中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段也可以在重链恒定区或其中所含的Fc区中包含改变对一种或多种Fc受体的结合亲和力的修饰。在一个实施方案中，所述Fc受体是Fcγ受体，特别地是人Fcγ受体。在一些实施方案中，所述Fc区包含降低与Fcγ受体结合的突变。在再一些优选的实施方案中，Fc片段可以具有导致增加的血清半衰期的突变，例如改善Fc片段与FcRn结合的突变。
本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段可以是本领域已知的任何形式的抗体或其抗原结合片段，如单克隆的、嵌合的、人源化的、完全人的、双特异性的、或多特异性的抗体或其抗体片段。
在一些实施方案中，本发明的抗FRα抗体的重链包含
包含与选自SEQ ID NO:35的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；
包含选自SEQ ID NO:35的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
包含与选自SEQ ID NO:35的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，本发明的抗FRα抗体的轻链包含
包含与选自SEQ ID NO:36或37的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；
包含选自SEQ ID NO:36或37的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
包含与选自SEQ ID NO:36或37的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段包含两条相同的重链和两条相同的轻链，其中
重链包含本文所述的VH或本文所述的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和本文所述的Fc区和CH1，或本文所述的重链恒定区；和/或
轻链包含本文所述的VL或本文所述的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和本文所述的Kappa轻链恒定区。
在一些实施方案中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段包含两条相同的重链和两条相同的轻链，其中
所述重链包含与SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成，和/或
所述轻链包含与SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段包含两条相同的重链和两条相同的轻链，其中
所述重链包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列或由其组成，和/或
所述轻链包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段包含两条相同的重链和两条相同的轻链，其中
重链包含本文所述的VH或本文所述的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和本文所述的Fc区和CH1，或本文所述的重链恒定区；
轻链包含本文所述的VL或本文所述的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和本文所述的包含LLC160C和/或166C的Lambda轻链恒定区。
在一个具体的实施方案中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段包含两条相同的重链和两条相同的轻链，其中
所述重链包含与SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成，和/或
所述轻链包含与SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成。
在一个更具体的实施方案中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段包含两条相同的重链和两条相同的轻链，其中
所述重链包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列或由其组成，和/或
所述轻链包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段是嵌合抗体或人源化抗体。
在一些实施方案中，本发明的抗FRα抗体的抗原结合片段是例如Fv，Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2；dAb(domain antibody)；线性抗体；单链抗体(例如scFv)；单结构域抗体例如VHH；双价抗体或其片段；或骆驼科抗体。
在一个实施方案中，所述抗FRα抗体是全长抗体。
在一个实施方案中，所述抗FRα抗体还涵盖多特异性抗体例如双特异性抗体。
在一些实施方案中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段在FRα阳性细胞，例如FRα阳性肿瘤细胞上较好的内吞活性。
在一些实施方案中，本发明还提供了融合蛋白，其包含本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，本发明还提供了免疫偶联物，其包含本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段，并且还包含偶联至所述抗体或其抗原结合片段上的载荷(payload)。在一些实施方案中，所述载荷是毒素、小分子药物/药剂、细胞毒性剂、细胞凋亡剂、螯合剂、免疫调节剂/免疫刺激剂/免疫激动剂、寡核苷酸、多肽、肽表位、放射性核素、前药等。在一些优选的实施方案中，所述载荷是免疫刺激剂/免疫激活剂。在一些更优选的实施方案中，所述载荷是TLR激动剂。在一些更优选的实施方案中，所述载荷是TLR7/8激动剂。
在一些实施方案中，本发明涉及一种分离的核酸，其编码本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，本发明涉及一种包含本发明的核酸的载体，优选地所述载体是表达载体。
在一些实施方案中，本发明涉及一种包含本发明的核酸或载体的宿主细胞，优选地，所述宿主细胞是原核的或真核的，更优选的选自酵母细胞、哺乳动物细胞(例如293细胞或CHO细胞，例如CHO-K细胞或HEK293细胞)或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。
在一些实施方案中，本发明涉及一种制备抗FRα抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括
a)在适于表达编码本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段的核酸的条件下培养本发明的宿主细胞，
b)任选地分离所述抗体或其抗原结合片段，
c)任选地所述方法还包括从所述宿主细胞回收所述抗FRα抗体或其抗原结合片段，任选地，所述抗体被纯化，例如被ProteinA纯化。
在另一方面，本发明提供了一种新的TLR激动剂，尤其是TLR7/8激动剂，其选自下式的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物：
(1)式(D-1)的化合物：
其中：
R1是未取代的或被一个或多个选自下列的取代基取代的C1-C6烷基：羟基、卤素、氰基、C3-C6环烷基、氨基、NH(C1-C6烷基)、N(C1-C6烷基)2、C1-C6烷氧基和C3-C6环烷氧基；
R2和R3独立的选自氢、C1-C6烷基、羟基、卤素、氰基、氨基、C1-C6烷氧基、芳基C1-C6烷氧基和C1-C6烷氧基羰基，所述芳基任选地被一个或多个选自下列的基团取代：C1-C6烷基、羟基、卤素、氰基、氨基和C1-C6烷氧基；
R4是未取代的或被一个或多个选自下列的取代基取代的C1-C6烷基：羟基、卤素、氰基、C3-C6环烷基、芳基C1-C6烷基、氨基、NH(C1-C6烷基)、N(C1-C6烷基)2、C1-C6烷氧基、被NHR5取代的C1-C6烷氧基和被NHR5取代的C1-C6烷基羰基氧基；其中所述芳基任选地被一个或多个选自下列的基团取代：C1-C6烷基、羟基、卤素、氰基、氨基、C1-C6烷氧基和C1-C6烷基氨基；
R5选自C1-C6烷基和C1-C6烷基羰基，其中所述的C1-C6烷基和C1-C6烷基羰基任选地被一个或多个选自下列的取代基取代：羟基、卤素、氨基、NH(C1-C6烷基)、N(C1-C6烷基)2、C1-C6烷氧基和C3-C6环烷氧基；
(2)式(D-2)的化合物：
其中：
X不存在，或者是-NH-(C＝O)-、-(C＝O)-NH-或C1-C6亚烷基，其中所述C1-C6亚烷基任选地被一个或多个选自羟基或卤素的取代基所取代并且其中的一个或多个碳原子可以被选自-NH-和-(C＝O)-的基团所替代；
X1选自CH或N；
X2选自CH2或N；
X3是NR8，其中R8选自H和C1-C6烷基，所述C1-C6烷基任选地被羟基、C1-C6烷氧基和氨基取代的C1-C6烷氧基取代；
X4是CH2或C(＝O)；
R6和R7彼此独立地选自H和C1-C6烷基，所述C1-C6烷基任选地被一个或多个选自羟基、卤素、氰基、C3-C6环烷基、氨基、NH(C1-C6烷基)、N(C1-C6烷基)2和C1-C6烷氧基的基团取代；
并且
表示单键或双键；
(3)式(D-3)的化合物：
其中：
R9选自羟基、氨基、NH(C1-C6烷基)、N(C1-C6烷基)2和C1-C6烷氧基；
R10和R11独立地选自氢和C1-C8烷基，所述C1-C8烷基任选地被一个或多个选自羟基、卤素、C1-C6烷氧基和NR15R16的取代基所取代，其中R15和R16独立地选自H、C1-C6酰基和羟基取代的C1-C6酰基；
R12不存在，或者选自氢和芳基C1-C6烷基，其中所述芳基任选地被一个或多个选自羟基、卤素、C1-C6烷氧基和杂环基C1-C6烷基的取代基所取代，并且所述的杂环基任选地被一个或多个选自C1-C6烷基、C1-C6烷氧基-C1-C6烷基和C1-C6酰基的取代基所取代；
R13选自氢、卤素、羟基或氧代基团(＝O)；
R14选自氢、卤素、羟基、C1-C6烷基或C1-C6烷氧基；
r是0或1；
Y选自C或NR17，其中R17选自氢或任选地被芳基或杂环基取代的C1-C6烷基，所述的芳基和杂环基任选地被选自C1-C6酰基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、羟基C1-C6烷基和NR18R19-C1-C6烷基的取代基所取代，其中R18和R19独立地选自H、C1-C6烷基和C1-C6酰基；并且
表示单键或双键。
在一个实施方案中，本发明提供了如上式(D-1)所示结构的化合物，其具有式(D-1’)所示的结构：
其中R2和R3如上所定义；并且
R选自H和
其中R1’和R2’独立地选自氢和C1-C6烷基，p’是选自1-6的整数。
在一个实施方案中，本发明提供了如上式(D-2)所示结构的化合物，其中的R6和R7选自C1-C6烷基，优选正丙基。
在一个实施方案中，本发明提供了如上式(D-3)所示结构的化合物，其具有式(D-3’)所示的结构:
其中
R4’表示任选地被一个或多个选自羟基、卤素、氨基和C1-C6烷氧基的取代基取代的C3-C6烷基，优选正戊基；
R5’选自H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基-C1-C6烷基、C1-C6酰基；优选选自H、乙酰基、甲氧基乙基。
在一个实施方案中，本发明提供了如上式(D-3)所示结构的化合物，其具有式(D-3”)所示的结构:
其中：
Q选自OR6’和NR7’R8’；
其中R6’选自H和C1-C6烷基；
R7’和R8’独立地选自H、C1-C6酰基、羟基取代的C1-C6酰基，优选R7’和R8’均是H，或者R7’和R8’之一是H并且另一个是乙酰基或羟基乙酰基。
在一个实施方案中，本发明提供了如上式(D-3)所示结构的化合物，其具有式(D-3’”)所示的结构:
其中：
R9’是C1-C6烷基，优选C3-C6直链烷基，例如正丁基；
r是0或1；
X5选自C1-C6亚烷基，例如-CH2-、-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-；
B选自芳基或杂环基，例如苯基、四氢异喹啉基和哌啶基，所述的芳基和杂环基任选地被C1-C6酰基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、羟基C1-C6烷基或NR’R”-C1-C6烷基取代，所述R’和R”独立地选自H、C1-C6烷基和C1-C6酰基。
在一个实施方案中，本发明提供了如上式(D-1)所示结构的化合物，其具有式(D-1”)所示的结构：
其中R1’和R2’独立地选自氢和C1-C6烷基，优选R1’和R2’均是甲基，或者R1’是氢并且R2’是3,3-二甲基-丁基。
在一个实施方案中，本发明提供了如上所定义的化合物，其选自如下化合物：


优选地，所述化合物选自如下化合物：



在一些实施方案中，本发明的化合物具有均衡的TLR7和TLR8刺激活性。
在第三方面，本发明还提供了连接到连接子的TLR激动剂，其选自式(II)的化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物：
L-(D)m   (II)
其中：
D是如上第二方面所定义的TLR激动剂；
L具有如下结构：
Z’-L1-E-L2-L3-
其中L3与D连接；
Z’选自
L1是-(CH2)n-C(＝O)-或-(CH2)n-(O(CH2)2)t(CH2)n-C(＝O)-；
E不存在或者是包含2-10个氨基酸的肽残基，其中所述的氨基酸残基为天然氨基酸残基或非天然氨基酸残基并且任选地被C1-C6烷基取代，并且所述肽残基的C末端与L2共价连接；
L2不存在或者是
L3不存在或者是-C(＝O)-*、-C(＝O)((CH2)nO)t(CH2)n-*或-NH(CH2)-*，其中*表明所述末端与D共价连接；
n是0-10的整数，
t是1-10的整数，
m是1-6的整数。
在一个实施方案中，本发明提供了如上所述的式(II)化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中
E具有下式所示的结构：
-X1-X2-
其中X1表示-(N(R0)C(R0)2C(＝O))s-，其中R0彼此独立地表示H或C1-C6烷基；s＝0-10，优选2、4、6和8；
X2不存在或是选自
在一个实施方案中，本发明提供了如上所述的式(II)化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中
E选自
其中s＝0-8。
在一个实施方案中，本发明提供了如上所述的式(II)化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中
L-具有选自如下的结构：

在一个实施方案中，本发明提供了如上所述的式(II)化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，所述化合物选自：
在一个实施方案中，式(II)化合物选自下列化合物



在一些实施方案中，本发明还提供了免疫偶联物，其包含靶向部分、本发明的TLR激动剂，和/或本发明的用于连接靶向部分与TLR激动剂的连接子。在一些实施方案中，所述靶向部分是特异性抗原结合蛋白或其片段，例如，具有抗体或免疫球蛋白结构的分子，游离型受体，环肽等。在一些优选的实施方案中，所述靶向部分是抗体或其抗原结合片段。在一些优选的实施方案中，靶向部分(例如，抗体)引起和/或促进免疫细胞的激活，例如通过ADCP作用。
在一些优选的实施方案中，本发明的免疫偶联物包含TLR激动剂(例如，以上所定义的本发明的TLR7/8激动剂)，优选地与肿瘤靶向抗体偶联。本发明的免疫偶联物在全身施用时在体内具有良好的耐受性，并引发瘤内髓系细胞的强烈激活，从而导致肿瘤清除和随后的免疫记忆。
在一些实施方案中，本发明提供了一种具有式(I)所示结构的免疫偶联物，
Ab-(L-(D)m)p   (I)
或其药学上可接受的盐或溶剂化物，
其中：
Ab是特异性抗原结合蛋白或其片段，优选地，单克隆抗体或其片段；
L是连接子；
D是TLR激动剂，优选TLR7/8激动剂；并且
m是1-6的整数；并且
p为1至16的数值，例如2-10。在一些实施方案中，式(I)中的D是本发明第二方面所定义的化合物。
在一些实施方案中，式(I)中的L-D是本发明第三方面所定义的式(II)化合物。
在一些实施方案中，式(I)中的-L-具有选自如下的结构：
其中该结构的左侧与Ab连接，右侧与D连接。
在一些实施方案中，式(I)中L-(D)m具有选自如下的结构：




在一些实施方案中，本发明的抗体免疫激动剂偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物具有1-10例如2-8的DAR值。
在一些实施方案中，所述抗体免疫激动剂偶联物选自
其中Ab是是结合TROP2(例如人TROP2)或FRα(例如人FRα)的抗体或其抗原结合片段，优选如前文所定义；q表示DAR，例如为1-10，例如2-8，例如大约3、4、5、或6。
在一些实施方案中，式(I)中的Ab是特异性抗原结合蛋白或其片段。在一些实施方案中，Ab是抗体。在一些实施方案中，Ab是抗体片段。在一些实施方案中，Ab是单克隆抗体或其片段。在一些优选的实施方案中，Ab引起和/或促进免疫细胞的激活，例如通过ADCP作用。在一些优选的实施方案中，Ab特异性结合TROP2。在一些优选的实施方案中，Ab特异性结合FRα。在一些优选的实施方案中，Ab在其恒定区具有半胱氨酸突变。
在一些实施方案中，本发明的式(I)或其亚式的抗体免疫激动剂偶联物或包含一种或多种所述抗体免疫激动剂偶联物(例如TROP2-ISAC或FRα-ISAC)的组合物具有选自如下范围内的任意数值的平均DAR：1±0.4、2±0.4、3±0.4或4±0.4。
在一些优选的实施方案中，式(I)中的Ab是特异性结合TROP2的抗体或其抗原结合片段。在一些优选的实施方案中，所述特异性结合TROP2的抗体与TROP2细胞毒性ADC结合不同的表位。
在一些优选的实施方案中，式(I)中的Ab是特异性结合FRα的抗体或其抗原结合片段。在一些优选的实施方案中，所述特异性结合FRα的抗体与FRα细胞毒性ADC结合不同的表位。
在一些实施方案中，在包含本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段的抗体免疫激动剂偶联物中，所述的半胱氨酸突变使得所述抗FRα抗体或其抗原结合片段经由该突变的半胱氨酸与连接子偶联，例如实现免疫激动剂的定点偶联。
在另一方面，本发明提供了药物组合物，其包含如前文所述的抗体或其片段、核酸、载体、宿主细胞、融合蛋白、免疫偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，以及任选的一种或多种其它治疗剂，例如化疗剂、血管生成抑制剂、细胞因子、细胞毒性剂、其它抗体、小分子药物或免疫调节剂，以及任选的药用辅料。在另一方面，本发明提供了药物组合，其包含如前文所述的抗体或其片段、核酸、载体、宿主细胞、融合蛋白、免疫偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物、或药物组合物，以及一种或多种其它治疗剂，例如化疗剂、血管生成抑制剂、细胞因子、细胞毒性剂、其它抗体、小分子药物或免疫调节剂。
在另一方面，本发明提供了预防或治疗受试者中肿瘤的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如前文所述的抗体或其片段、核酸、载体、宿主细胞、融合蛋白、免疫偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物、或如上所述的药物组合物、或如上所述的药物组合。
在另一方面，本发明提供了本发明的抗体或其片段、核酸、载体、宿主细胞、融合蛋白、免疫偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物、或如上所述的药物组合物、或如上所述的药物组合的用途，用于制备抗肿瘤药剂。
在一些实施方案中，所述肿瘤为癌症，优选地，所述癌症具有升高水平的(例如核酸或蛋白质水平的)TROP2或FRα，例如与健康个体或与所述患者癌症组织临近的健康组织相比。
在一些实施方案中，所述癌症选自肺癌、黑色素瘤、头颈部肿瘤、前列腺癌、食管癌、宫颈癌、肾癌、膀胱癌、卵巢癌、胰腺癌或乳腺癌。
在一些实施方案中，所述方法还包括向患者施用一种或多种疗法，例如治疗方式和/或其它治疗剂，优选地，治疗方式包括放射疗法或手术，或者治疗剂包括化疗剂、血管生成抑制剂、细胞因子、细胞毒性剂、其它抗体、小分子药物或免疫调节剂。
本发明的抗TROP2抗体和/或免疫偶联物至少具有以下优点：
(1)以高亲和力结合人和食蟹猴TROP2；
(2)具有优异的体内抗肿瘤功效；
(3)在动物实验中，例如在小鼠和猴子中具有良好的安全性；
和
(4)与其他的免疫偶联物，例如TROP2 ADC相比，具有非竞争性表位，利于组合/联合用药。
本发明的免疫偶联物尤其地具有以下优点：
(1)作为TROP2 ISAC，与其他具有类似效力的ISAC相比，单药疗效更加显著，且在小鼠和猴子体内具有良好的安全性。
(2)使用聚肌氨酸/聚乙二醇(PEG)作为稳定的连接剂，以避免释放的有效载荷TLR7/8激动剂的高毒性，避免PEG连接剂的免疫原性
(3)作为单药治疗，TROP2-TLR7/8激动剂ISAC在多种TROP2+异源肿瘤模型的治疗中显示出强大的抗肿瘤活性，例如，包括胃癌和胰腺癌。
本发明的抗FRα抗体和/或免疫偶联物至少具有以下优点：
(1)以高亲和力结合人、食蟹猴和小鼠FRα；
(2)具有优异的体内抗肿瘤功效；
(3)在动物实验中，例如在小鼠中具有良好的安全性；
和
(4)与其他的免疫偶联物，例如FRαADC相比，具有非竞争性表位，利于组合/联合用药。
本发明的免疫偶联物尤其地具有以下优点：
(1)作为FRαISAC，与其他具有类似效力的ISAC相比，单药疗效更加显著，且在小鼠体内具有良好的安全性。
(2)使用聚肌氨酸/聚乙二醇(PEG)作为稳定的连接剂，以避免释放的有效载荷TLR7/8激动剂的高毒性，避免PEG连接剂的免疫原性。
(3)作为单药治疗，FRα-TLR7/8激动剂ISAC在FRα+异源肿瘤模型的治疗中显示出强大的抗肿瘤活性，例如，多种类型的卵巢癌。
(4)免疫激动剂经由突变的半胱氨酸位点与抗体连接，从而
(i)偶联物更为亲水，
(ii)偶联物在血浆中更为稳定，小分子毒素不易脱落；
(iii)偶联物在动物体内具有更强的药效，例如具有平均DAR为4的ISAC，能够与具有DAR为8的抗体未经半胱氨酸突变改造的偶联物所持平的药效。
附图说明：
图1A至图1C显示了抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)功能检测结果。
图2显示了人源化抗体的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)功能检测结果。
图3显示了人源化抗体的巨噬细胞内吞功能检测结果。
图4A至图4D显示了本发明化合物在H-TLR7 NFKB Reporter 293和H-TLR8 NFKB Reporter 293细胞系中的活性检测结果，其中4A和图4B显示了各化合物的TLR7活性，图4C和图4D显示了各化合物的TLR8活性。
图5显示了本发明的TROP2-ISAC在PBMC与肿瘤细胞共培养体系中的检测结果。
图6A至6D显示了本发明的TROP2-ISAC在NCI-N87模型中的抗肿瘤效果，其中图6A和6C显示肿瘤体积随时间的变化，图6B和6D显示动物体重随时间的变化。
图7A和7B显示了本发明的TROP2-ISAC在BxPC3模型中的抗肿瘤效果，其中图7A显示肿瘤体积随时间的变化，图7B显示动物体重随时间的变化。
图8A和8B显示了本发明的TROP2-ISAC在BALB/C小鼠中的毒性实验结果。
图9显示了本发明的TROP2-ISAC在hTROP2 KI小鼠中的毒性实验结果。
图10A至10C显示了本发明的TROP2-ISAC在CT26-hTROP2模型中的抗肿瘤效果，其中图10A显示肿瘤体积随时间的变化，图10B显示动物体重随时间的变化，图10C显示动物存活率随时间的变化。
图11A和11B显示了本发明的TROP2-ISAC联合TROP2-ADC在BxPC3模型中的抗肿瘤效果，其中图11A显示肿瘤体积随时间的变化，图11B显示动物体重随时间的变化。
图12A和12B显示了本发明的TROP2-ISAC联合TROP2-ADC在LK-2模型中的抗肿瘤效果，其中图12A显示肿瘤体积随时间的变化，图12B显示动物体重随时间的变化。
图13A和13B显示了本发明的TROP2-ISAC在BALB/C小鼠中的高剂量毒性实验结果。
图14显示了抗FRα抗体克隆BC1254-A1的ADCP活性，与其他抗体对比。
图15显示了抗FRα抗体克隆BC1254-A1的巨噬细胞ADCP活性。
图16显示了通过RP-HPLC测定BC1254-A1 V2-化合物6偶联物的平均DAR值。
图17显示了通过HIC-HPLC测定BC1254-A1-化合物6偶联物的平均DAR值。
图18显示了抗FRα抗体克隆BC1254-A1在半胱氨酸突变改造前后以及与免疫激活剂偶联前后的ADCP活性对比。
图19显示了通过测定TNFα分泌评估抗FRα-ISAC在与PBMC和靶肿瘤细胞共培养体系中的免疫刺激作用。
图20显示了通过测定IFNα分泌评估抗FRα-ISAC在与PBMC和靶肿瘤细胞共培养体系中的免疫刺激作用。
图21A和21B分别显示了OV90细胞皮下成瘤的模型小鼠在接受FRα-ISAC治疗后，肿瘤体积和小鼠体重随时间变化的折线图。
图22A和22B分别显示了A2780cisR-FRα细胞皮下成瘤的模型小鼠在接受FRα-ISAC治疗后，肿瘤体积和小鼠体重随时间变化的折线图。
图23A和23B显示了分别显示了A2780cisR-FRα细胞皮下成瘤的模型小鼠在接受FRα-ISAC与FRα-ADC联合治疗后，肿瘤体积和小鼠体重随时间变化的折线图。
图24显示了通过观察小鼠体温变化测定FRα-ISAC对小鼠的毒性。
发明详述
I.定义
在下文详细描述本发明前，应理解本发明不限于本文中描述的特定方法学、方案和试剂，因为这些可以变化。还应理解本文中使用的术语仅为了描述具体实施方案，而并不意图限制本发明的范围，其仅会由所附权利要求书限制。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域中普通技术人员通常的理解具有相同的含义。
为了解释本说明书，将使用以下定义，并且只要适当，以单数形式使用的术语也可以包括复数，并且反之亦然。要理解，本文所用的术语仅是为了描述具体的实施方案，并且不意欲是限制性的。
术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值。
如本文所用，术语“和/或”意指可选项中的任一项或可选项的两项或多项。
如本文所用，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组合的情形。例如，当提及“包含”某个具体序列的抗体可变区时，也旨在涵盖由该具体序列组成的抗体可变区。
术语“TROP2”、“TACD2”在本文中可互换使用，指人滋养层细胞表面糖蛋白抗原。是在人类癌症中高度表达的I型细胞表面糖蛋白。它最初被鉴定为人类胃肠道肿瘤上存在的抗原，并且是该家族两个成员中的第二个。小鼠、食蟹猴TROP2的序列与其人类对应物具有较高同源性。在本发明的一些实施方案中，TROP2是人TROP2。在一些实施方案中，TROP2是在UniProt数据库登录号P09758下的蛋白质。
本文所用的术语“抗TROP2抗体”、“抗TROP2”、“TROP2抗体”或“抗TROP2的抗体”是指这样的抗体，所述抗体或其抗原结合片段能够以足够的亲合力结合TROP2蛋白。所述抗体可以用作靶向TROP2中的诊断剂和/或治疗剂，或用于构建免疫偶联物，例如抗体免疫激动剂偶联物。
术语“FOLR1”、“FRα”在本文中可互换使用，指叶酸受体α(FRα)，亦称为叶酸受体1(FOLR1)，属于叶酸受体家族，是分子量38-40kD的细胞表面糖蛋白。在某些快速增殖的癌细胞中，FRα表达水平明显增加。在本发明的一些实施方案中，FRα是人FRα。在一些实施方案中，FRα是在UniProt数据库登录号P15328下的蛋白质。
本文所用的术语“抗FRα抗体”、“抗FRα”、“FRα抗体”或“靶向FRα的抗体”是指这样的抗体，所述抗体或其抗原结合片段能够以足够的亲合力结合FRα蛋白。所述抗体可以用作靶向FRα中的诊断剂和/或治疗剂，或用于构建免疫偶联物，例如抗体免疫激动剂偶联物。
术语“抗原”是指引发免疫应答的分子。这种免疫应答可能涉及抗体产生或特异性免疫细胞的活化，或两者兼有。技术人员将理解，任何大分子，包括基本上所有的蛋白质或肽，都可以用作抗原。此外，抗原可以衍生自重组或基因组DNA。如本文所用，术语“表位”指抗原(例如，TROP2)中与抗体分子特异性相互作用的部分。
术语“完全抗体”、“全抗体”或“全长抗体”在本文中可互换使用，是指具有天然免疫球蛋白分子结构的抗体分子。在常规四链IgG抗体的情况下，全长抗体包含由二硫键相互连接的两条重链(H)和两条轻链(L)。在仅具有重链而缺乏轻链的重链抗体情况下，全长抗体包含由二硫键相互连接的两条重链(H)。对于常规四链IgG抗体，全长抗体重链通常由重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区组成，其中重链恒定区至少包含3个结构域CH1、CH2和CH3。全长抗体轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成，其中轻链恒定区由一个结构域CL组成。每个重链可变区VH和每个轻链可变区都由三个CDR和4个FR组成，从氨基端到羧基端以如下顺序排列：FR1,CDR1,FR2,CDR2,FR3,CDR3,FR4。术语“抗体片段”包括完整抗体的一部分。在优选的实施方案中，抗体片段为抗原结合片段。
术语抗体的“抗原结合片段”是与全长抗体不同的分子，其包含全长抗体的一部分，但其能结合全长抗体的抗原或与全长抗体(即与抗原结合片段所来源的全长抗体)竞争结合抗原。可以通过重组DNA技术、或通过酶或化学切割完整的抗体制备抗原结合片段。抗原结合片段包括但不限于Fv，Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2、dAb(domain antibody)、线性抗体、单链抗体(例如scFv)；单结构域抗体例如VHH、双价抗体或其片段、或骆驼科抗体、双体抗体(diabody)、单域抗体(sdAb)、纳米抗体。例如，通过木瓜蛋白酶消化全长抗体能够获得Fab片段。此外，通过胃蛋白酶在铰链区的二硫键下面消化完全抗体产生F(ab')2，其为Fab’的二聚体，是二价的抗体片段。F(ab')2可以在中性条件下通过破坏铰链区中的二硫键而被还原，由此将F(ab')2二聚体转化为Fab'单体。Fab'单体基本上是具有铰链区的Fab片段。Fv片段由抗体单臂的VL和VH结构域组成。Fv片段的两个结构域VL和VH可以由独立的基因编码，但是也可以使用重组方法，使用合成性连接肽连接这两个结构域以使其作为单条蛋白链产生，并且在所述单条蛋白链中VL区和VH区配对以形成单链Fv(scFv)。
术语“单链抗体(scAb)”在本文中以最宽泛的含义使用，并具体覆盖最初作为单个连续多肽链产生的具有单特异性或多特异性(例如双特异性)的抗体。此类单链抗体包括但不限于，具有两个相连接的VL区和VH区。在一个实施方案中，单链抗体是scFv。
“双体抗体”是通过基因融合构建的二价小型抗体，例如其是由两个多肽链组成的二聚体。双体抗体的每一多肽链的VL和VH域通过接头结合，从而编码在同一多肽链中的VL和VH形成具有不同的单链可变区片段的二聚体。双体抗体一般具有两个抗原结合位点。
“互补决定区”或“CDR区”或“CDR”是抗体可变结构域中在序列上高变并且形成在结构上确定的环(“超变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。CDR主要负责与抗原表位结合。重链和轻链的CDR通常被称作CDR1、CDR2和CDR3，从N-端开始顺序编号。位于抗体重链可变结构域内的CDR被称作HCDR1、HCDR2和HCDR3，而位于抗体轻链可变结构域内的CDR被称作LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一个给定的轻链可变区或重链可变区氨基酸序列中，各CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多公知的抗体CDR指派系统的任一种或其组合确定，所述指派系统包括例如：基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学的Chothia(Chothia等人.(1989)Nature 342:877-883，Al-Lazikani等人,“Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins”,Journal of Molecular Biology,273,927-948(1997))，基于抗体序列可变性的Kabat(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第4版,U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987)),AbM(University of Bath)，Contact(University College London)，国际ImMunoGeneTics database(IMGT)(在万维网上imgt.cines.fr/上)，以及基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinity propagation clustering)的North CDR定义(North等，“A New Clustering of Antibody CDR Loop Con格式ions”，Journal of Molecular Biology，406，228-256(2011))。
以下为采用kabat、AbM、Chothia、Contact和IMGT方案定义的CDR的区域范围。
CDR也可以基于与参考CDR序列(例如本发明示例性CDR之任一)具有相同的Kabat编号位置而确定。
除非另有说明，否则在本发明中，术语“CDR”或“CDR序列”涵盖以上述任一种方式确定的CDR序列。
除非另有说明，否则在本发明中，当提及抗体可变区中的残基位置(包括重链可变区残基和轻链可变区残基)时，是指根据Kabat编号系统(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))的编号位置。
在一个实施方案中，本发明抗体的重链可变区CDR按照如下规则确定:
VH CDR1按照Kabat&Chothia规则确定；并且VH CDR2和3均按照Kabat规则确定。
在一个实施方案中，本发明抗体的轻链可变区CDR按照Kabat规则确定。
在一个实施方案中，本发明抗体的重链可变区CDR按照如下规则确定：VH CDR1按照Kabat&Chothia规则确定；并且VH CDR2和3均按照Kabat规则确定；且轻链可变区CDR按照Kabat规则确定。
应该注意，基于不同的指派系统获得的同一抗体的可变区的CDR的边界可能有所差异。即不同指派系统下定义的同一抗体可变区的CDR序列有所不同。因此，在涉及用本发明定义的具体CDR序列限定抗体时，所述抗体的范围还涵盖了这样的抗体，其可变区序列包含所述的具体CDR序列，但是由于应用了不同的方案(例如不同的指派系统规则或组合)而导致其所声称的CDR边界与本发明所定义的具体CDR边界不同。
与参照抗体“结合相同或重叠表位的抗体”是指这样的抗体，其在竞争测定中阻断50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的所述参照抗体与其抗原的结合，反言之，参照抗体在竞争测定中阻断50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的该抗体与其抗原的结合。相应地，如果两种抗体或其衍生物结合非竞争性表位，则它们结合不相同或不重叠的表位，并且在竞争测定中优选地不表现出相互阻断和/或干扰与抗原的结合。众多类型的竞争性结合测定可用于确定一种抗体是否与另一种竞争，这些测定例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定。
与参照抗体显示相同或相似的结合亲和力和/或特异性的抗体是指这样的抗体，其能够具有参照抗体的至少50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的结合亲和力和/或特异性。这可以通过本领域已知的任何测定结合亲和力和/或特异性的方法进行测定。
术语“嵌合抗体”是这样的抗体分子，其中(a)将恒定区或其部分改变、替换或交换，从而抗原结合位点与不同的或改变的类别、效应子功能和/或物种的恒定区或赋予嵌合抗体新性能的完全不同的分子(例如，酶、毒素、激素、生长因子、药物)等连接；或(b)将可变区或其部分用具有不同或改变的抗原特异性的可变区改变、替换或交换。例如，小鼠抗体可以通过将其恒定区更换为来自人免疫球蛋白的恒定区进行修饰。由于更换为人类恒定区，该嵌合抗体可以保留其在识别抗原方面的特异性，同时如与原始小鼠抗体相比，具有在人类中降低的免疫原性。
“人源化抗体”是一种保留非人类抗体(例如小鼠单克隆抗体)的抗原特异性反应性，同时例如在作为治疗药对人施用时免疫原性较低的抗体。这可以例如通过保留非人类抗原结合位点并将抗体的剩余部分替换成它们的人类相应部分(即，将恒定区以及可变区中不参与结合的部分替换为人类抗体的相应部分)来实现。
术语“Fc区”在本文中用来定义免疫球蛋白重链的含有至少一部分恒定区的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。天然的免疫球蛋白“Fc结构域”包含两个或三个恒定结构域，即CH2结构域、CH3结构域和可选的CH4结构域。例如，在天然抗体中，免疫球蛋白Fc结构域包含源自IgG、IgA和IgD类抗体的两条重链的第二和第三恒定结构域(CH2结构域和CH3结构域)；或者包含源自IgM和IgE类抗体的两条重链的第二、第三和第四恒定结构域(CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域)。除非本文中另外说明，否则Fc区或重链恒定区中的氨基酸残基编号根据如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interes,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述的EU编号体系(也称作EU索引)进行编号。在本文中，术语“Fc区”不包括免疫球蛋白的重链可变区VH和轻链可变区VL以及重链恒定区CH1和轻链恒定区CL，但在一些情况下可以包括在重链恒定区N端的铰链区。
术语“氨基酸取代”或“氨基酸突变”指将预先确定的亲本氨基酸序列中的至少一个氨基酸残基替换为不同的“取代”氨基酸残基。该取代残基或多个残基可以是“天然存在的氨基酸残基”(即由遗传密码编码)并且选自：丙氨酸(Ala)；精氨酸(Arg)；天冬酰胺(Asn)；天冬氨酸(Asp)；半胱氨酸(Cys)；谷氨酰胺(Gln)；谷氨酸(Glu)；甘氨酸(Gly)；组氨酸(His)；异亮氨酸(Ile)：亮氨酸(Leu)；赖氨酸(Lys)；甲硫氨酸(Met)；苯丙氨酸(Phe)；脯氨酸(Pro)；丝氨酸(Ser)；苏氨酸(Thr)；色氨酸(Trp)；酪氨酸(Tyr)；和缬氨酸(Val)。
待突变为半胱氨酸的氨基酸位置一般用“链类型，突变位置”来表示。在本文中，如无特殊说明，则LLC代表lambda轻链，LC代表kappa轻链，HC代表重链。因此，“LLC160C”是指，位于lambda轻链的EU位置160的氨基酸被半胱氨酸(C)取代。
在本发明提及重链氨基酸位置时，如无明确说明，是指根据IgG1重链编号的氨基酸位置，即其涵盖基于IgG1重链编号的氨基酸位置，以及在其他重链上对应于所述氨基酸位置的氨基酸位置。
"序列同一性"定义为在比对序列并在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性后，氨基酸序列变体中同样的残基的百分比。
“亲本蛋白(例如亲本抗体或亲本恒定区或亲本Fc区)”指包含其中一个或多个氨基酸残基有待用一个或多个其他氨基酸残基例如半胱氨酸残基替换的氨基酸序列的蛋白。亲本蛋白可以包含天然的或野生型的序列。亲本蛋白可具有相对于其它天然的、野生型的、或修饰形式的蛋白而言的现有氨基酸序列修饰(诸如添加、缺失和/或取代)。亲本抗体可以针对目的靶抗原，例如生物学重要的多肽。
如本文所用，术语“结合”或“特异性结合”意指结合作用对抗原是选择性的并且可以与不想要的或非特异的相互作用区别。抗原结合位点与特定抗原结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域已知的常规结合测定法如通过放射性免疫测定(RIA)或生物膜薄层干涉测定法或MSD测定法或表面等离子体共振法(SPR)测定。
“免疫偶联物”在本文中是指通过接头将有效载荷连接到抗体或其抗原结合片段上，从而抗体或其抗原结合片段可以作为载体将该有效载荷靶向运输到目标位点。术语“有效载荷”指缀合本发明的抗体或抗体片段的活性部分，并且可以包括用于附着抗体或抗体片段的任何部分。在一些实施方案中，有效载荷可以是药物例如小分子药物、放射性核素、DNA、RNA、酶或多肽等。在一些实施方案中，免疫偶联物涵盖抗体药物偶联物(ADC)、抗体免疫刺激剂(激动剂)偶联药物(ISAC)，抗体寡核苷酸偶联物(AOC)，抗体多肽偶联药物(APC)、抗体核素偶联药物(RDC)或抗体降解偶联药物(ADeC)等。适用于与抗体相连的有效载荷或活性部分包括例如细胞毒性剂、化学治疗剂、先天免疫激动剂(例如Toll样受体激动剂(TLR)类ISAC药物SBT6050、SBT6290、BDC-1001；STING激动剂ISAC药物XMT-2056，Treg细胞调节ISAC药物ADCT-301等)、免疫调节剂、治疗性寡核苷酸(siRNA、PMO等)或放射性核素等。在一些实施方案中，本发明的免疫偶联物是抗体免疫激动剂偶联物即ISAC。
如本文所用的，“抗体免疫激动剂偶联物(ISAC)”是指通过连接抗体与免疫激动剂(优选TLR7/8激动剂)所得的结构。
术语“连接子”是指将药物(例如小分子药物例如TLR7/8激动剂)与抗体部分连接起来的结构片段。应当理解，连接子在连接至抗体或其抗原结合片段之前具有可与抗体或其抗原结合片段的官能团形成键的官能团。
术语“连接子-有效载荷”是指有效载荷，例如药物(例如小分子药物例如TLR7/8激动剂)与连接子连接形成的化合物。
本文所述的术语“位点特异性偶联”是指通过连接子将药物特异性连接到抗体的特定位点的偶联。
本文所述的术语“烷基”指完全饱和的支链的或无支链的烃基团。烷基优选包含1-16个碳原子，例如1-12个碳原子、1-10个碳原子、1-6个碳原子或1-4个碳原子。例如，C1-C6烷基是指包含1-6个碳原子的完全饱和的支链的或无支链的烃基团。烷基的代表性示例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、3-甲基己基、2,2-二甲基戊基、2,3-二甲基戊基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基等。
本文所述的术语“C1-C6烷氧基”是指式-O-(C1-C6烷基)的基团，其中的烷基如上所定义。C1-C6烷氧基的代表性示例包括但不限于甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基和叔丁氧基。
本文所述的术语“C1-C6酰基”是指式-C(＝O)-(C1-C6烷基)的基团，其中的烷基如上所定义。C1-C6酰基的代表性示例包括但不限于甲酰基、乙酰基、丙酰基等。
本文所述的术语“杂环基”表示具有3至10个环原子的单价饱和或部分不饱和的单环或双环环系，其包含1至5个选自N、O和S的环杂原子，其余环原子为碳。杂环基的代表性示例包括但不限于氮杂环丙基、氧杂环丙基、氮杂环丁基、氧杂环丁基、吡咯烷基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、吡唑烷基、咪唑烷基、哌啶基、四氢吡喃基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、二氧代硫代吗啉基、氮杂环庚烷基、二氮杂环庚烷基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基等。
术语“芳基”是指具有共轭π电子系统的单环或稠环的芳香族烃基，例如苯基、萘基等。
术语“烯基”指含有2-16个碳原子并且包含至少一个双键且不包含叁键的直链或支链烃基团。烯基基团优选含有2-12个碳原子、2-10个碳原子、2-8碳原子2-6个碳原子或2-4个碳原子。烯基的代表性示例包括但不限于乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基等。
术语“炔基”指含有2-16个碳原子并且包含至少一个叁键的直链或支链烃基团。炔基基团优选含有2-12个碳原子、2-10个碳原子、2-8碳原子2-6个碳原子或2-4个碳原子。炔基的代表性示例包括但不限于乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基等。
术语“卤素”或“卤代”指氟(-F)、氯(-Cl)、溴(-Br)和碘(-I)。
术语“卤代烷基”指被一个或多个本文所定义的卤素基团取代的如本文所定义的烷基。卤代烷基可以优选是单卤代烷基、二卤代烷基或多卤代烷基(包括全卤代烷基)。单卤代烷基基团在烷基中可以含有一个碘、溴、氯或氟。二卤代烷基和多卤代烷基基团在烷基中可以含有两个或多个相同的卤原子或含有不同卤代基团的组合。优选地，多卤代烷基最多包含12、10或8或6或4或3或2个卤素基团。卤代烷基的非限制性示例包括氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、氯甲基、二氯甲基、三氯甲基、五氟乙基、七氟丙基、二氟氯甲基、二氯氟甲基、二氟乙基、二氟丙基、二氯乙基和二氯丙基。全卤代烷基指所有氢原子被卤素原子替换的烷基。
术语“卤代烯基”指被一个或多个本文所定义的卤素基团取代的如本文所定义的烯基。术语“卤代炔基”指被一个或多个本文所定义的卤素基团取代的如本文所定义的炔基。对于“卤代烷基”定义的“卤代”含义可适用于“卤代烯基”和“卤代炔基”。
术语“多元醇基团”是指由含有多个(例如2-10个，例如3、4、5、6、7或8个)羟基的如上所定义的烷基，其任选含有1个或多个(例如2、3或4个)其他基团(例如氨基、羰基)。“多元醇基团”的非限制性实例包括例如
术语“氨基酸”是指天然存在和合成的氨基酸。氨基酸可以是L或D异构体。本文涉及的常规氨基酸的编写遵循常规用法。参见例如，Immunology-A Synthesis(2nd Edition,E.S.Golub and D.R.Gren,Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991))，其以引用的方式并入本文中。并且在本公开中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，甘氨酸可用Gly表示，丙氨酸可用Ala表示、缬氨酸可用Val表示、谷氨酰胺可用Gln表示、谷氨酸可用Glu表示、苯丙氨酸可用Phe表示和亮氨酸可用Leu表示。
术语“任选的”或“任选地”：意为随后描述的事件或情况发生或不发生，并且该描述包括所述事件或情况发生的实例以及所述事件或情况没有发生的实例。例如，当基团或结构是“任选被取代的”，所述基团或结构可以被取代，也可以是不被取代的。
术语“药学上可接受的盐”表示指保持本发明的ISAC偶联物的生物学效应和性能的盐，并且该盐在生物学上或其它方面不是不被期望的。本发明的ISAC偶联物可以以它们的药学上可接受的盐形式存在，包括酸加成盐和碱加成盐。在本发明中，药学上可接受的无毒的酸加成盐表示本发明中的ISAC偶联物与有机或无机酸形成的盐，有机或无机酸包括但不限于盐酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、磷酸、硝酸、高氯酸、乙酸、草酸、马来酸、富马酸、酒石酸、苯磺酸、甲磺酸、水杨酸、琥珀酸、柠檬酸、乳酸、丙酸、苯甲酸、对甲苯磺酸、苹果酸等。药学上可接受的无毒的碱加成盐表示本发明中的ISAC偶联物与有机或无机碱所形成的盐，包括但不限于碱金属盐，例如锂、钠或钾盐；碱土金属盐，例如钙或镁盐；有机碱盐，例如通过与含N基团的有机碱形成的铵盐。
术语“溶剂化物”表示一个或多个溶剂分子与本发明中的抗体免疫激动剂偶联物所形成的缔合物。形成溶剂化物的溶剂包括但不限于水、甲醇、乙醇、异丙醇、乙酸乙酯、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜等。
在根据上下文无矛盾的情况下，本文中“药学上可接受的”和“药用”可互换使用。
术语“药物:抗体比率”或“DAR”是指偶联于本文所述的免疫偶联物(例如，ISAC)的载荷部分(D)与Ab部分的比例的平均值。换言之，DAR值反映了在免疫偶联物的群体中，每个基于单个抗体分子(Ab部分)的ISAC分子所携带的载荷分子数的平均值。
在本文所述的一些实施方案中，免疫偶联物的群体中大部分ISAC分子携带相同数量的载荷分子，此时，DAR可大致由式(I)中的m与p确定，例如DAR可以为1至16，例如2-16、4-16、5-12、6-10、2-8、3-8、2-6、4-6、6-10，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。DAR也可通过检测方法(例如通过常规方法如质谱法、ELISA测定、电泳和/或HPLC)测得的产品中偶联于本文所述的Ab部分的药物部分(D)与Ab部分的总体比例，例如，当免疫偶联物的群体中单个ISAC分子携带的载荷分子的数量(例如，m×p)相差较大时。在一些实施方案中，本发明偶联物的DAR值是1至16，例如2-16、4-16、5-12、6-10、2-8、3-8、2-6、4-6、6-10，例如1.0-8.0，2.0-6.0，例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0，以及以这些数值中的两个作为端点的范围。
本文所述的术语“治疗剂”涵盖在预防或治疗肿瘤，例如癌症中有效的任何物质，包括化疗剂、细胞因子、血管生成抑制剂、细胞毒性剂、其它抗体、小分子药物或免疫调节剂(例如免疫抑制剂)。
术语“细胞毒性剂”用在本发明中指抑制或防止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。
“化疗剂”包括在治疗癌症或免疫系统疾病中有用的化学化合物。
术语“药物”是指能够调节生物过程尤其改变或预防病理过程的有机化合物。
术语“前药”是指被化学修饰的活性或非活性的化合物，给药至个体后，其经过体内的生理作用(例如水解、新成代谢等)变为活性药物。有关制造和使用前药的技术是本领域技术人员众所周知的。
术语“小分子药物”是指低分子量的能够调节生物过程尤其改变或预防病理过程的有机化合物。“小分子”被定义为分子量小于10kD、通常小于2kD和优选小于1kD的分子，更优选小于500D。小分子药物包括但不限于有机分子、含无机组分的有机分子、含放射性原子的分子、合成分子、肽模拟物和抗体模拟物。作为治疗剂，小分子可以比大分子更能透过细胞、对降解更不易感和更不易于引发免疫应答。
“抗肿瘤化合物”是对肿瘤有作用的药学活性化合物，其包括但不限于细胞毒性剂或化疗剂，例如WO2021/173773中公开的细胞毒性剂、喜树碱类化合物依喜替康(拓扑异构酶I抑制剂Exatecan)、DXd(一种新型拓扑异构酶I抑制剂Exatecan衍生物)、澳瑞他汀类化合物例如单甲基澳瑞他汀E(MMAE)或美登素类化合物例如小分子微管抑制剂DM1。应当理解，抗肿瘤化合物可以被同位素包括但不限于例如氘、氚等取代。例如用氘取代后，碳-氘键替换碳-氢键后，由于前者比后者更稳定，该取代可直接影响某些药物的吸收、分布、代谢和排泄等属性，从而提高药物的疗效、安全性和耐受性。因此，本申请的“抗肿瘤化合物”可以涵盖被氘取代的化合物。
“被氘取代的”是指分子中的氢被氘替换，例如1个或多个氢例如1-10个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氢被氘替换。
本文使用的术语“免疫调节剂”指抑制或调节(例如激活)免疫应答的天然或合成活性剂或者药物。免疫应答可以是体液应答或细胞应答。免疫调节剂包含免疫抑制剂。在一些实施方案中，本发明的免疫调节剂包括免疫检查点抑制剂或免疫检查点激动剂。
术语“有效量”指本发明的抗体或片段或组合物或组合的这样的量或剂量，其以单一或多次剂量施用患者后，在需要治疗或预防的患者中产生预期效果。根据预期效果，可以包括“治疗有效量”和“预防有效量”。
“治疗有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需治疗结果的量。治疗有效量也是这样的一个量，其中抗体或抗体片段或组合物或组合的任何有毒或有害作用不及治疗有益作用。相对于未治疗的对象，“治疗有效量”优选地抑制可度量参数(例如肿瘤体积)至少约30％、甚至更优选地至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％甚至100％。
“预防有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需预防结果的量。通常，由于预防性剂量在对象中在疾病较早阶段之前或在疾病较早阶段使用，故预防有效量将小于治疗有效量。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可交换地使用且是指其中引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括初级转化的细胞和来源于其的后代，而不考虑传代的数目。后代在核酸内容上可能与亲本细胞不完全相同，而是可以包含突变。本文中包括在最初转化的细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物学活性的突变体后代。
本文所使用的术语“标记”是指被直接或间接缀合或融合至试剂(诸如多核苷酸探针或抗体)并且促进其所缀合或融合的试剂的检测的化合物或组合物。标记本身可以是可检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)或在酶促标记的情况下可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。术语旨在涵盖通过将可检测物质偶联(即，物理连接)至探针或抗体来直接标记探针或抗体以及通过与直接标记的另一种试剂反应来间接标记探针或抗体。
“个体”或“受试者”包括哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，家养动物(例如，牛，羊，猫，狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)，兔，以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在一些实施方案中，个体或受试者是人。
“分离的”抗体或其他分子(例如ISAC分子)是这样的抗体或分子，其已经与其天然环境或表达其的环境的组分分离。在一些实施方案中，将抗体或ISAC分子纯化至超过95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)确定的。
术语“抗肿瘤作用”指可以通过多种手段展示的生物学效果，包括但不限于例如，肿瘤体积减少、肿瘤细胞数目减少、肿瘤细胞增殖减少或肿瘤细胞存活减少。
术语“癌症”和“癌性”指向或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调节的生理疾患。癌症可以处于早期、中期或晚期或是转移性癌。适合于通过本发明的分子来治疗的癌症包括但不限于肺癌、黑色素瘤、头颈部肿瘤、前列腺癌、食管癌、宫颈癌、肾癌、膀胱癌、卵巢癌、胰腺癌或乳腺癌，包括那些癌症的转移性形式。
术语“肿瘤”指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。“肿瘤”涵盖实体瘤和血液肿瘤以及转移性病灶术语“癌症”、“癌性”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
术语“药用辅料”指与活性物质一起施用的稀释剂、佐剂(例如弗氏佐剂(完全和不完全的))、赋形剂、载体或稳定剂等。
术语“药物组合物”指这样的组合物，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对施用所述组合物的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。
术语“药物组合”是指非固定组合产品或固定组合产品，包括但不限于药盒、药物组合物。术语“非固定组合”意指活性成分(例如，(i)本发明的抗体和/或ISAC分子、以及(ii)其他治疗剂)以分开的实体被同时、无特定时间限制或以相同或不同的时间间隔、依次地施用于患者，其中这类施用在患者体内提供预防或治疗有效水平的两种或更多种活性剂。在一些实施方案中，药物组合中使用的本发明的抗体和/或ISAC分子和其他治疗剂以不超过它们单独使用时的水平施用。术语“固定组合”意指两种或更多种活性剂以单个实体的形式被同时施用于患者。优选对两种或更多种活性剂的剂量和/或时间间隔进行选择，从而使各部分的联合使用能够在治疗疾病或病症时产生大于单独使用任何一种成分所能达到的效果。各成分可以各自呈单独的制剂形式，其制剂形式可以相同也可以不同。
术语“组合疗法”是指施用两种或更多种治疗剂或治疗方式(例如放射疗法或手术)以治疗本文所述疾病。这种施用包括以基本上同时的方式共同施用这些治疗剂，例如以具有固定比例的活性成分的单一胶囊。或者，这种施用包括对于各个活性成分在多种或在分开的容器(例如片剂、胶囊、粉末和液体)中的共同施用。粉末和/或液体可以在施用前重构或稀释至所需剂量。此外，这种施用还包括以大致相同的时间或在不同的时间以顺序的方式使用每种类型的治疗剂。在任一情况下，治疗方案将提供药物组合在治疗本文所述的病症或病状中的有益作用。
用于本文时，“治疗”指减缓、中断、阻滞、缓解、停止、降低、或逆转已存在的症状、病症、病况或疾病的进展或严重性。
用于本文时，“预防”包括对疾病或病症或特定疾病或病症的症状的发生或发展的抑制。在一些实施方式中，具有癌症家族病史的受试者是预防性方案的候选。通常，在癌症的背景中，术语“预防”是指在癌症的病征或症状发生前，特别是在具有癌症风险的受试者中发生前的药物施用。
术语“载体”当在本文中使用时是指能够增殖与其相连的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及结合到已经引入其的宿主细胞的基因组中的载体。一些载体能够指导与其可操作相连的核酸的表达。这样的载体在本文中被称为“表达载体”。
“受试者/患者/个体样品”指从患者或受试者得到的细胞或流体的集合。组织或细胞样品的来源可以是实体组织，像来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活检样品或穿刺样品；血液或任何血液组分；体液，诸如脑脊液、羊膜液(羊水)、腹膜液(腹水)、或间隙液；来自受试者的妊娠或发育任何时间的细胞。组织样品可能包含在自然界中天然不与组织混杂的化合物，诸如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养物、抗生素、等等。
II.抗体、核酸、宿主细胞
在一些实施方案中，本发明的抗TROP2抗体或其抗原结合片段包含3个来自重链可变区的互补决定区(HCDR)，HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在一些实施方案中，本发明的抗TROP2抗体或其抗原结合片段包含3个来自轻链可变区的互补决定区(LCDR)，LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，本发明的抗TROP2抗体或其抗原结合片段包含3个来自重链可变区的互补决定区(HCDR)和3个来自轻链可变区的互补决定区(LCDR)。
在一些方面中，本发明的抗TROP2抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)。在一些方面中，本发明的抗TROP2抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区(VH)。在一些方面中，本发明的抗TROP2抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区(VH)。在一些实施方案中，所述重链可变区包含3个来自重链可变区的互补决定区(CDR)，HCDR1、HCDR2和HCDR3。在一些实施方案中，所述轻链可变区包含3个来自轻链可变区的互补决定区(CDR)，LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，本发明的抗TROP2抗体或其抗原结合片段还包含抗体重链恒定区。在一些实施方案中，本发明抗TROP2抗体或其抗原结合片段还包含抗体轻链恒定区。在一些实施方案中，本发明抗TROP2抗体或其抗原结合片段还包含重链恒定区和轻链恒定区。
在一些实施方案中，本发明重链可变区：
(i)包含与选自SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
(ii)包含选自SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:12的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
(iii)包含与选自SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:12的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列由所述氨基酸序列组成，优选地，所述氨基酸改变不发生在CDR区中。
在一些实施方案中，本发明的轻链可变区
(i)包含与选自SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
(ii)包含选自SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:14的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
(iii)包含与选自SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:14的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列由所述氨基酸序列组成，优选地，所述氨基酸改变不发生在CDR区中。
在一些实施方案中，本发明的3个来自重链可变区的互补决定区(HCDR)，HCDR1、HCDR2和HCDR3选自
(i)如SEQ ID NO:7或12所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3；
(ii)相对于(i)中任一项的序列，在所述三个HCDR区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的序列，
其中，所述HCDR1-3分别是按照任何CDR方案确定的，例如Kabat、AbM、Chothia或IMGT或其组合确定；
优选地，所述HCDR1根据AbM方案确定的，且所述HCDR2和HCDR3分别是根据Kabat方案确定的。
在一些实施方案中，本发明的3个来自轻链可变区的互补决定区(LCDR)，LCDR1、LCDR2和LCDR3选自
(i)如SEQ ID NO:8或14所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3，或
(ii)相对于(i)中任一项的序列，在所述三个LCDR区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的序列，
其中，所述LCDR1-3分别是按照任何CDR方案确定的，例如Kabat、AbM、Chothia或IMGT或其组合确定；
优选地，所述LCDR1、2和3分别是根据Kabat方案确定。
在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者HCDR1包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HCDR2包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者HCDR2包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HCDR3包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者HCDR3包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，LCDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者LCDR1包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，LCDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者LCDR2包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，LCDR3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者LCDR3包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的抗体重链恒定区为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区，优选的IgG4的重链恒定区。在一些实施方案中，本发明的抗体轻链恒定区为lambda或Kappa轻链恒定区，优选的Kappa轻链恒定区。
在一些实施方案中，本发明的抗体的重链恒定区包含Fc区或突变的Fc区。
在一些实施方案中，Fc区为来自人的IgG Fc，例如，来自人IgG1的Fc,来自人IgG2的Fc,来自人IgG3的Fc或来自人IgG4的Fc。在一个实施方案中，Fc区来自人IgG1。
在一些具体的实施方案中，本发明的抗TROP2抗体包含第一重链互补决定区(HCDR1)、第二重链互补决定区(HCDR2)、第三重链互补决定区(HCDR3)以及第一轻链互补决定区(LCDR1)、第二轻链互补决定区(LCDR2)和第三轻链互补决定区(LCDR3)，其中所述HCDR1、HCDR2、HCDR3以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或分别由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列组成；或
在一些实施方案中，本发明的VH包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，以及所述VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3分别包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或分别由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列组成，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或分别由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段，其包含：
(i)包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的VH，和/或包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的VL；
(ii)包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的VH，和/或包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的VL。
在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中
(i)重链可变区包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或由其组成，且轻链可变区包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或由其组成；或者
(ii)重链可变区包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或由其组成，且轻链可变区包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的抗TROP2抗体或其抗原结合片段还包含抗体重链。在一些实施方案中，本发明抗TROP2抗体或其抗原结合片段还包含抗体轻链。在一些实施方案中，本发明抗TROP2抗体或其抗原结合片段还包含重链和轻链。
在一些实施方案中，所述重链包含
(i)包含与选自SEQ ID NO:9或15的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；
(ii)包含选自SEQ ID NO:9或15的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
(iii)包含与选自SEQ ID NO:9或15的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，所述轻链包含
(i)包含与选自SEQ ID NO:10或16的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；
(ii)包含选自SEQ ID NO:10或16的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
(iii)包含与选自SEQ ID NO:10或16的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，其中所述重链包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或由其组成，且所述轻链包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，其中所述重链包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列或由其组成，且所述轻链包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含两条所述重链和两条所述轻链，或由两条所述重链和两条所述轻链组成，任选地，两条所述重链相同和/或两条所述轻链相同。
在本发明的一个实施方案中，本文所述的氨基酸改变包括氨基酸的置换、插入或缺失。优选的，本文所述的氨基酸改变为氨基酸置换，优选地保守置换。
在一些实施方案中，本发明的抗TROP2抗体或其抗原结合片段具有以下一个或多个特性：
(i)显示与本发明抗体对TROP2相同或相似的结合亲和力和/或特异性；
(ii)抑制(例如，竞争性抑制)本发明抗体与TROP2的结合；
(iii)与本发明抗体结合相同或重叠的表位；
(iv)与本发明抗体竞争结合TROP2；
(v)具有本发明抗体的一个或多个生物学特性。
在一些实施方案中，本发明的抗TROP2抗体是IgG1形式的抗体或IgG2形式的抗体或IgG3形式的抗体或IgG4形式的抗体，优选的，为IgG1形式的抗体。
在一些实施方案中，所述抗TROP2抗体是单克隆抗体。
在一些实施方案中，所述抗TROP2抗体是人源化的。
在一些实施方案中，所述抗TROP2抗体是嵌合抗体。
在一个实施方案中，本发明的抗TROP2抗体还涵盖其抗体片段(例如抗原结合片段)，优选地选自以下的抗体片段：Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、单链抗体(例如scFv)、(Fab’)2、单结构域抗体例如VHH、dAb(domain antibody)、双价抗体或线性抗体。
在一个实施方案中，所述抗TROP2抗体是全长抗体。
在一个实施方案中，所述抗TROP2抗体还涵盖多特异性抗体例如双特异性抗体。
在一些实施方案中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段包含3个来自重链可变区的互补决定区(HCDR)，HCDR1、HCDR2和HCDR3。在一些实施方案中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段包含3个来自轻链可变区的互补决定区(LCDR)，LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段包含3个来自重链可变区的互补决定区(HCDR)和3个来自轻链可变区的互补决定区(LCDR)。
在一些方面中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)。在一些方面中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区(VL)。在一些方面中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中，所述重链可变区包含3个来自重链可变区的互补决定区(CDR)，HCDR1、HCDR2和HCDR3。在一些实施方案中，所述轻链可变区包含3个来自轻链可变区的互补决定区(CDR)，LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段还包含抗体重链恒定区。在一些实施方案中，本发明抗FRα抗体或其抗原结合片段还包含抗体轻链恒定区。在一些实施方案中，本发明抗FRα抗体或其抗原结合片段还包含重链恒定区和轻链恒定区。
在一些实施方案中，本发明重链可变区：
(i)包含与SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
(ii)包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
(iii)包含与(i)-(ii)中任一项所示的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，优选地，所述氨基酸改变不发生在CDR区中。
在一些实施方案中，本发明的轻链可变区
(i)包含与选自SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
(ii)包含选自SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；
或者
(iii)包含与选自(i)-(ii)中任一项所示的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，优选地，所述氨基酸改变不发生在CDR区中。
在一些实施方案中，本发明的3个来自重链可变区的互补决定区(HCDR)，HCDR1、HCDR2和HCDR3选自
(i)如SEQ ID NO:33所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3；或者
(i)相对于(i)中任一项的序列，在所述三个HCDR区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的序列，
其中所述HCDR可以分别根据任何确定CDR的方案来确定，例如分别根据Kabat、AbM、Chothia、Contact或IMGT或其组合的方案确定；
例如，所述HCDR1是根据Kabat和Chothia方案的并集确定的，所述HCDR2和HCDR3分别是根据Kabat方案确定的。
在一些实施方案中，本发明的3个来自轻链可变区的互补决定区(LCDR)，LCDR1、LCDR2和LCDR3选自
(i)如SEQ ID NO:34所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3，或
(i)相对于(i)中任一项的序列，在所述三个LCDR区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的序列，
其中所述LCDR可以分别根据任何确定CDR的方案来确定，例如分别根据Kabat、AbM、Chothia、Contact或IMGT或其组合的方案确定；
例如，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别是根据Kabat方案确定。
在一些实施方案中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段包含：
如SEQ ID NO:33所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:34所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3；
其中所述HCDR和LCDR可以分别根据任何确定CDR的方案来确定，例如分别根据Kabat、AbM、Chothia、Contact或IMGT或其组合的方案确定；
例如，所述HCDR1是根据Kabat和Chothia方案的并集确定的，所述HCDR2和HCDR3分别是根据Kabat方案确定的，且所述LCDR1、LCDR2和LCDR3分别是根据Kabat方案确定的。
在一些实施方案中，HCDR1包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者HCDR1包含与SEQ ID NO:27的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HCDR2包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者HCDR2包含与SEQ ID NO:28的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，HCDR3包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者HCDR3包含与SEQ ID NO:29的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，LCDR1包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者LCDR1包含与SEQ ID NO:30的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，LCDR2包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者LCDR2包含与SEQ ID NO:31的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，LCDR3包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者LCDR3包含与SEQ ID NO:32的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。
在一些具体的实施方案中，本发明的抗FRα抗体包含第一重链互补决定区(HCDR1)、第二重链互补决定区(HCDR2)、第三重链互补决定区(HCDR3)以及第一轻链互补决定区(LCDR1)、第二轻链互补决定区(LCDR2)和第三轻链互补决定区(LCDR3)，其中
所述HCDR1、HCDR2、HCDR3以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列或分别由SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32所示所示的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，本发明的VH包含HCDR1、HCDR2、HCDR3，以及VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中；
所述HCDR1、HCDR2、HCDR3以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列或分别由SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32所示所示的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段，其包含：
包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的VH，和/或包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的VL。
在一些实施方案中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
在本发明的一个实施方案中，本文所述的氨基酸改变包括氨基酸的置换、插入或缺失。在一些实施方案中，本文所述的氨基酸改变是保守氨基酸改变。优选的，本文所述的氨基酸改变为氨基酸置换，优选地保守置换。在优选的实施方案中，本发明所述的氨基酸改变发生在CDR外的区域(例如在FR中)。更优选地，本发明所述的氨基酸改变发生在重链可变区外和/或轻链可变区外的区域。
在一些实施方案中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段还包含抗体重链。在一些实施方案中，本发明抗FRα抗体或其抗原结合片段还包含抗体轻链。在一些实施方案中，本发明抗FRα抗体或其抗原结合片段还包含重链和轻链。在一些实施方案中，本发明的抗体重链包含重链可变区和重链恒定区，或由重链可变区和重链恒定区组成。在一些实施方案中，本发明的抗体轻链包含轻链可变区和轻链恒定区，或由轻链可变区和轻链恒定区组成。在一些实施方案中，本发明的抗体包含两条重链和两条轻链，或由两条重链和两条轻链组成。在一些实施方案中，本发明的抗体包含两条相同的重链和两条相同的轻链，或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的抗FRα抗体重链恒定区为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区，例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定区。在一些实施方案中，重链恒定区是IgG重链恒定区，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区。在一些实施方案中，所述重链恒定区是IgG1重链恒定区，例如其包含SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的抗FRα抗体轻链恒定区为lambda或Kappa轻链恒定区，优选的Kappa轻链恒定区，例如人lambda或Kappa轻链恒定区。在一些实施方案中，轻链恒定区是(人)Lambda轻链恒定区。在一些实施方案中，Lambda轻链恒定区包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的且不包含半胱氨酸突变的氨基酸序列。在一些实施方案中，轻链恒定区是(人)Kappa轻链恒定区。在一些实施方案中，Kappa轻链恒定区包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段是在轻链恒定区具有半胱氨酸突变的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含一条或两条Lambda轻链恒定区，且在Lambda轻链恒定区的第160位(EU编号)具有半胱氨酸取代(LLC160C或LLC160)，和/或Lambda轻链恒定区的第166位(EU编号)具有半胱氨酸取代(LLC166C或LLC166)。
在一些实施方案中，相对于野生型的Lambda轻链恒定区，例如SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段的轻链恒定区在第160位(Eu编号)具有半胱氨酸突变。
在一些实施方案中，在第160位具有半胱氨酸突变的Lamda轻链恒定区包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的且包含氨基酸序列VKAGVCTTTPS(SEQ ID NO:42)。
在一些实施方案中，相对于野生型的Lambda轻链恒定区，例如SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段的轻链恒定区在第166位(Eu编号)具有半胱氨酸突变。
在一些实施方案中，在第166位具有半胱氨酸突变的Lamda轻链恒定区包含SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的且包含氨基酸序列TTTPSCQSNNK(SEQ ID NO:43)。
在一些实施方案中，相对于野生型的Lambda轻链恒定区，例如SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段的轻链恒定区在第160位和第166位(Eu编号)具有半胱氨酸突变。
在一些实施方案中，在第160位和第166位具有半胱氨酸突变的Lamda轻链恒定区包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的且包含氨基酸序列VKAGVCTTTPSCQSNNK(SEQ ID NO:44)。
在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含
(i)一条或两条在第160位(Eu编号)具有半胱氨酸突变的Lamda轻链恒定区；和/或
(ii)一条或两条在第166位(Eu编号)具有半胱氨酸突变的Lamda轻链恒定区。
本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段可以是本领域已知的任何形式的抗体或其抗原结合片段，如单克隆的、嵌合的、人源化的、完全人的、双特异性的、或多特异性的抗体或其抗体片段。
在一些实施方案中，本发明的抗FRα抗体的重链
包含与选自SEQ ID NO:35的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；
包含选自SEQ ID NO:35的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
包含与选自SEQ ID NO:35的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，本发明的抗FRα抗体的轻链
包含与选自SEQ ID NO:36或37的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；
包含选自SEQ ID NO:36或37的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
包含与选自SEQ ID NO:36或37的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过20个或10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段包含两条相同的重链和两条相同的轻链，其中
重链包含本文所述的VH或本文所述的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和本文所述的Fc区和CH1，或本文所述的重链恒定区；和/或
轻链包含本文所述的VL或本文所述的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和本文所述的Kappa轻链恒定区。
在一些实施方案中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段包含两条相同的重链和两条相同的轻链，其中
所述重链包含与SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成，和/或
所述轻链包含与SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段包含两条相同的重链和两条相同的轻链，其中
所述重链包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列或由其组成，和/或
所述轻链包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段包含两条相同的重链和两条相同的轻链，其中
重链包含本文所述的VH或本文所述的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和本文所述的Fc区和CH1，或本文所述的重链恒定区；
轻链包含本文所述的VL或本文所述的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和本文所述的包含LLC160C和/或166C的Lambda轻链恒定区。
在一个具体的实施方案中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段包含两条相同的重链和两条相同的轻链，其中
所述重链包含与SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成，和/或
所述轻链包含与SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成。
在一个更具体的实施方案中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段包含两条相同的重链和两条相同的轻链，其中
所述重链包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列或由其组成，和/或
所述轻链包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段是嵌合抗体或人源化抗体。
在一些实施方案中，本发明的抗FRα抗体的抗原结合片段是例如Fv，Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2；dAb(domain antibody)；线性抗体；单链抗体(例如scFv)；单结构域抗体例如VHH；双价抗体或其片段；或骆驼科抗体。
在一个实施方案中，所述抗FRα抗体是全长抗体。
在一个实施方案中，所述抗FRα抗体还涵盖多特异性抗体例如双特异性抗体。
在一些实施方案中，本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段在FRα阳性细胞，例如FRα阳性肿瘤细胞上较好的内吞活性。
在一些实施方案中，本发明还提供了融合蛋白，其包含本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，本发明还提供了免疫偶联物，其包含本发明的抗FRα抗体或其抗原结合片段，并且还包含偶联至所述抗体或其抗原结合片段上的载荷(payload)。在一些实施方案中，所述载荷是毒素、小分子药物/药剂、细胞毒性剂、细胞凋亡剂、螯合剂、免疫调节剂/免疫刺激剂/免疫激动剂、寡核苷酸、多肽、肽表位、放射性核素、前药等。在一些优选的实施方案中，所述载荷是免疫刺激剂/免疫激活剂。在一些更优选的实施方案中，所述载荷是TLR激动剂。在一些更优选的实施方案中，所述载荷是TLR7/8激动剂。
因此，本发明提供了靶向FRα的抗体或其抗原结合片段和靶向FRα的抗体免疫激动剂偶联物(ISAC)。
在一个方面，对本发明的抗体或其抗原结合片段进行半胱氨酸改造，以使得所述抗体或其抗原结合片段在其重链或轻链上将某个或某几个氨基酸突变为半胱氨酸。根据半胱氨酸上的巯基可以与具有马来酰亚胺接头的小分子(例如，免疫激动剂，特别是TLR激动剂，更特别是TLR7/8激动剂)发生亲核反应，从而在半胱氨酸偶联上所述小分子来制备位点特异性偶联的ISAC分子。
在一些实施方案中，本发明ADC(包括式(II)或(III)的那些)中的Ab包含半胱氨酸。在一些实施方案中，在本发明的ADC中，所述Ab通过其半胱氨酸(例如天然的和/或半胱氨酸突变引入的)与连接子连接，例如所述连接子通过半胱氨酸的巯基与所述Ab偶联。
在一些实施方案中，所述Ab通过天然半胱氨酸与连接子偶联，例如所述连接子通过二硫键打开的半胱氨酸的巯基与所述Ab偶联(例如随机偶联)。
在一些实施方案中，所述Ab通过其半胱氨酸突变引入的半胱氨酸与连接子偶联，例如所述Ab通过没有配对或以其它方式成为分子内或分子间二硫键一部分的半胱氨酸残基(例如半胱氨酸突变后获得的半胱氨酸)与连接子偶联(例如定点偶联)，或者例如所述连接子通过二硫键打开的半胱氨酸的巯基与所述Ab偶联(例如随机偶联或定点偶联)。
在一些实施方案中，在本发明的ADC分子中，所述Ab通过其半胱氨酸突变引入的半胱氨酸经由连接子与一种毒素偶联(例如定点偶联)，且通过其天然半胱氨酸与另一种毒素偶联(例如随机偶联)。
在一些实施方案中，本发明的ADC分子中的Ab包含半胱氨酸突变引入的半胱氨酸，从而所述连接子经由该突变的半胱氨酸的巯基与所述抗体偶联。在一些实施方案中，所述Ab在其重链或轻链上包含将一个或多个非半胱氨酸突变为半胱氨酸，从而连接子与该半胱氨酸偶联，例如定点偶联。本文中详细描述了适用于本发明ADC的包含所述半胱氨酸突变的抗体或其抗原结合片段，其中所述突变后获得的半胱氨酸与连接子偶联，例如定点偶联。
在一些实施方案中，本发明的ISAC分子中，Ab经由如下突变获得的半胱氨酸与连接子偶联：
(i)一条或两条Lamda轻链恒定区在第160位半胱氨酸突变后获得的半胱氨酸；和/或
(ii)一条或两条Lamda轻链恒定区在第166位半胱氨酸突变后获得的半胱氨酸。
本文提及的任何抗体或其抗原结合片段经由任何本文获得的半胱氨酸突变后获得的半胱氨酸都可以用于与连接子偶联，例如定点偶联来获得本发明的免疫刺激分子。
在一个方面，本发明的抗体或其抗原结合片段在恒定区较为隐蔽的位点具有半胱氨酸突变，从而为包含其的免疫偶联物(例如，ISAC)带来更好的稳定性和/或亲水性。如本文所定义的“半胱氨酸突变”是指在蛋白质中将原来并非半胱氨酸的氨基酸取代为半胱氨酸。
在一方面，本发明提供编码本发明的抗体或其抗原结合片段的任一条链或任何单体或结构域的核酸。可以采用本领域熟知的方法，产生编码各条链的多核苷酸序列。例如，当从适宜的表达载体表达时，由所述核酸编码的多肽能够显示人TROP2抗原结合能力。例如，在一些实施方案中，所述编码重链和/或轻链的可变区的核酸在读框中与编码重链和/或轻链的恒定区的核酸可操作连接，从而当从适宜的表达载体表达时，产生编码所述抗体重链和/或的核酸。
在一方面，本发明提供了编码本文所述任何抗TROP2抗体或其片段的核酸。所述核酸可以包含编码抗体的轻链可变区和/或重链可变区的氨基酸序列的核酸，或包含编码抗体的轻链和/或重链的氨基酸序列的核酸。
例如，本发明的核酸包含编码选自SEQ ID NO:1-10、12和14-16中任一项所示氨基酸序列的核酸，或编码与选自SEQ ID NO:1-10、12和14-16中任一项所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列的核酸。如本领域技术人员明了的，因为密码子简并性，每一个抗体或多肽氨基酸序列可以由多种核酸序列编码。编码本发明分子的核酸序列可以采用本领域熟知的方法，例如通过从头固相DNA合成，或通过PCR扩增而产生为了便于生产和纯化，可以在抗体的重链和/或轻链的N端融合分泌性信号肽，和/或利于纯化的标签肽。
在另一方面，本发明提供了编码本文所述任何抗FRα抗体或其片段的核酸。所述核酸可以包含编码抗体的轻链可变区和/或重链可变区的氨基酸序列的核酸，或包含编码抗体的轻链和/或重链的氨基酸序列的核酸。
例如，本发明的核酸包含编码选自SEQ ID NO:27-46中任一项所示氨基酸序列的核酸，或编码与选自SEQ ID NO:27-46中任一项所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列的核酸。如本领域技术人员明了的，因为密码子简并性，每一个抗体或多肽氨基酸序列可以由多种核酸序列编码。编码本发明分子的核酸序列可以采用本领域熟知的方法，例如通过从头固相DNA合成，或通过PCR扩增而产生为了便于生产和纯化，可以在抗体的重链和/或轻链的N端融合分泌性信号肽，和/或利于纯化的标签肽。
可以将编码本发明抗体的多肽链的多核苷酸插入一个或多个载体中以便进一步在宿主细胞中克隆和/或表达。可以使用本领域技术人员熟知的方法来构建表达载体。一旦已经制备了用于表达的包含本发明的一种或多种核酸分子的表达载体，则可以将表达载体转染或引入适宜的宿主细胞中。多种技术可以用来实现这个目的，例如，原生质体融合、磷酸钙沉淀、电穿孔、逆转录病毒的转导、病毒转染、基因枪、基于脂质体的转染或其他常规技术。
本发明也提供包含本发明核酸的载体。在一个实施方案中，载体是表达载体，例如真核表达载体。载体包括但不限于病毒、质粒、粘粒、λ噬菌体或酵母人工染色体(YAC)。在优选的实施方案中，本发明的表达载体是pcDNA载体，例如pcDNA3.1表达载体。在另一些优选的实施方案中，本发明的表达载体是pTT5载体或衍生自pTT5的表达载体。
在一个实施方案中，提供包含所述载体的宿主细胞。本发明也提供包含所述核酸或所述载体的宿主细胞。适用于复制并支持本发明抗体表达的宿主细胞是本领域中公知的。可以用特定的表达载体转染或转导这类细胞，并且可以生长大量的含载体细胞以用于接种大规模发酵罐，从而获得充足量的抗体用于临床应用。用于克隆或表达编码抗体的载体的适当宿主细胞包括本文描述的原核或真核细胞。例如，抗体可在细菌中产生，特别当不需要糖基化和Fc效应子功能时。在表达后，抗体可以从可溶级分中的细菌细胞糊状物分离，并且可以进一步纯化。
在一个实施方案中，宿主细胞是真核的。在另一个实施方案中，宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞(例如CHO细胞(例如CHO-S或CHO-K)或293细胞(例如293F或HEK293细胞))或适用于制备抗体或其片段的其它细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是原核的，例如是细菌，例如大肠杆菌。
例如，真核微生物诸如丝状真菌或酵母是关于编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主。例如，糖基化途径已经进行“人源化”的真菌和酵母菌株导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。适于表达糖基化抗体的宿主细胞也衍生自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。也可以将脊椎动物细胞用作宿主。例如，可以使用被改造以适合于悬浮生长的哺乳动物细胞系。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它实例是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(HEK293、293F或293T细胞)等。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞、CHO-S细胞、ExpiCHO等；以及骨髓瘤细胞系如Y0，NS0和Sp2/0。本领域已知适合产生抗体的哺乳动物宿主细胞系。
III.免疫偶联物
本发明提供一种具有式(I)的抗体免疫激动剂偶联物：
Ab-(L-D)p(I)
或其药学上可接受的盐或溶剂化物，
其中：
Ab是结合TROP2(例如人TROP2)的抗体或其片段；
L是连接子；
D是药物，优选抗肿瘤化合物；并且
p为1至16，例如1-10、1-9、2-8、4-10、3-7、4-6、2-6，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或12。
在一些实施方案中，本发明式(I)中的Ab是前述本发明的抗TROP2抗体或其抗原结合片段或抗FRα抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，本发明式(I)中的D可以是任何TLR7/8激动剂化合物，例如以上所定义的式(D-1)至(D-5)的化合物，例如式(D-1’)的化合物，例如选自下列的化合物：

IV.本发明的抗体和ISAC分子的制备
本发明提供了制备抗体的方法，例如，制备本发明的抗TROP2抗体或其抗原结合片段或抗FRα抗体或其抗原结合片段，制备用于本发明的ISAC的Ab。
在一个实施方案中，所述方法包括在适合抗体或其肽链表达的条件下，培养包含编码所述抗体(例如任意一条多肽链和/或多条多肽链)的核酸或包含所述核酸的表达载体的宿主细胞，如上文所提供的，和任选地从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述抗体。
如本文所述制备的Ab可以通过已知的现有技术如高效液相色谱、离子交换层析、凝胶电泳、亲和层析、尺寸排阻层析等纯化。用来纯化特定蛋白质的实际条件还取决于净电荷、疏水性、亲水性等因素，并且这些对本领域技术人员是显而易见的。
在一些实施方案中，本发明涉及一种制备抗TROP2或FRα的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括
a)在适于表达编码本发明的抗TROP2或FRα抗体或其抗原结合片段的核酸的条件下培养本发明的宿主细胞，
b)任选地分离所述抗体或其抗原结合片段，
c)任选地所述方法还包括从所述宿主细胞回收所述抗TROP2或FRα抗体或其抗原结合片段，任选地，所述抗体被纯化，例如被ProteinA纯化。
本发明的另一个方面提供了一种应用本发明的抗体制备ISAC的方法。本发明中的“ISAC”被定义为通过连接子(L)偶联至具有生物学和/药学活性的活性物质(D)的抗体。所述方法包括将本发明的抗体(Ab)通过一个或多个本发明定义的连接子(L)偶联至一个或多个的活性物质D上。优选地，连接子-活性物质位点特异性偶联至抗体。
在一些实施方案中，所述方法包括如下步骤：
(a)将抗体Ab加入缓冲溶液中，加入还原剂，然后进行孵育；
(b)向步骤(a)中的反应溶液中加入连接子-有效载荷进行偶联，获得粗产物；和
(c)任选地将粗产物进行纯化得到本发明的抗体药物偶联物；
其中Ab如上所定义。
应当理解，所述连接子-有效载荷与Ab反应提供式(I)化合物中的-L-D部分，在-L-D清楚定义的情况下，可以确定连接子-有效载荷的结构。
在一些实施方案中，步骤a)的缓冲溶液为PBS缓冲液，优选地，其pH为5.0-9.0，例如6.0-8.0。
在一些实施方案中，步骤a)的还原剂为TCEP。
在一些实施方案中，连接子-有效载荷具有如下式(II)所示的结构，
L-(D)m   (II)
其中D和L如上所定义。
在一些实施方案中，所述步骤在实施例中公开的具体反应条件下进行。
应当指出的是，实施例中公开的具体反应条件的范围或具体值浮动100％、80％、60％、40％、20％或10％得到的实施方案也在本发明的考虑中。
V.药物组合物
在一些实施方案中，本发明提供包含本文所述的任何抗体或其片段、ISAC分子或其药学上可接受的盐的组合物，优选地组合物为药物组合物或药物制剂。在一个实施方案中，所述组合物还包含药用辅料。在一个实施方案中，组合物，例如，药物组合物，包含本发明的抗体或其片段、ISAC分子，以及一种或多种其它治疗剂的组合。
本发明还包括包含本发明的抗体或其片段、ISAC分子或其药学上可接受的盐的组合物(包括药物组合物)。这些组合物还可以包含合适的药用辅料，如本领域中已知的药用载体、药用赋形剂，包括缓冲剂。
如本文所用，“药用载体”包括生理上相容的任何和全部溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等。
对于药用辅料的使用及其用途，亦参见“Handbook of Pharmaceutical Excipients”,第八版,R.C.Rowe,P.J.Seskey和S.C.Owen,Pharmaceutical Press,London,Chicago。
本发明的组合物可以处于多种形式。这些形式例如包括液体、半固体和固体剂型，如液态溶液剂(例如，可注射用溶液剂和可输注溶液剂)、散剂或混悬剂、脂质体剂和栓剂。优选的形式取决于预期的施用模式和治疗用途。
可以通过将具有所需纯度的本发明的抗体或其片段或ISAC分子与一种或多种任选的药用辅料混合来制备包含本文所述的ISAC的药物，优选地以冻干制剂或水溶液的形式。
本发明的药物组合物或制剂还可以包含超过一种活性成分，所述活性成分是被治疗的特定适应证所需的，优选具有不会不利地彼此影响的互补活性的那些活性成分。例如，理想的是还提供其它治疗剂，包括化疗剂、血管生成抑制剂、细胞因子、细胞毒性剂、其它抗体、小分子药物或免疫调节剂(例如免疫检查点抑制剂或激动剂)等。所述活性成分以对于目的用途有效的量合适地组合存在。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半渗透基质，所述基质呈成形物品，例如薄膜或微囊形式。
VI.药物组合和药盒
在一些实施方案中，本发明还提供了药物组合或药物组合产品，其包含本发明的抗体或其片段或ISAC分子，以及一种或多种其它治疗剂(例如治疗剂，包括化疗剂、血管生成抑制剂、细胞因子、细胞毒性剂、其它抗体、小分子药物或免疫调节剂(例如免疫检查点抑制剂或激动剂)等)。
在一些实施方案中，所述的其它治疗剂是靶向TROP2的抗体-药物偶联物、其立体异构体或药学上可接受的盐或溶剂合物。
在一些实施方案中，所述的其它治疗剂是PCT/CN2024/121813中公开的抗体-药物偶联物或药学上可接受的盐或溶剂合物。
在一些实施方案中，所述的其它治疗剂是下式的抗体-药物偶联物、其立体异构体或药学上可接受的盐或溶剂合物，
其中A表示靶向TROP2的抗体或其片段：
p’是1-15，例如2-10、2-8、2-6、2-5、3-5、3.5-4.5之间的值。
在一些实施方案中，适用于构建上述抗体-药物偶联物的靶向TROP2的抗体或其片段(例如抗原结合片段)可为哺乳动物来源的(例如人或小鼠)、人源化的或嵌合的靶向TROP2的抗体或抗体片段。在一些实施方案中，适用于构建上述抗体-药物偶联物的靶向TROP2的抗体或其片段是上文定义的抗TROP2抗体或其片段例如抗原结合片段。
在一些实施方案中，适用于构建上述抗体-药物偶联物的靶向TROP2的抗体或其片段包含第一重链互补决定区(HCDR1)、第二重链互补决定区(HCDR2)、第三重链互补决定区(HCDR3)以及第一轻链互补决定区(LCDR1)、第二轻链互补决定区(LCDR2)和第三轻链互补决定区(LCDR3)，其中：
所述HCDR1包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列或由其组成；
所述HCDR2包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列或由其组成；
所述HCDR3包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列或由其组成；
所述LCDR1包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列或由其组成；
所述LCDR2包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列或由其组成；
所述LCDR3包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，适用于构建上述抗体-药物偶联物的靶向TROP2的抗体或其片段包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述HCDR1、HCDR2、HCDR3以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列或分别由SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，适用于构建上述抗体-药物偶联物的靶向TROP2的抗体或其片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列或包含与SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，轻链可变区包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列或包含与SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，适用于构建上述抗体-药物偶联物的靶向TROP2的抗体或其片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列且轻链可变区包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，适用于构建上述抗体-药物偶联物的靶向TROP2的抗体或其片段包含序列为SEQ ID NO:23的重链可变区和序列为SEQ ID NO:24的轻链可变区。
在一些实施方案中，适用于构建上述抗体-药物偶联物的靶向TROP2的抗体或其片段包含重链和轻链，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列或包含与SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，轻链可变区包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列或包含与SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，适用于构建上述抗体-药物偶联物的靶向TROP2的抗体或其片段包含重链和轻链，其中所述重链含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列且轻链包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，适用于构建上述抗体-药物偶联物的靶向TROP2的抗体或其片段包含序列为SEQ ID NO:25的重链和序列为SEQ ID NO:24的轻链。
在一些具体的实施方案中，适用于构建上述抗体-药物偶联物的靶向TROP2的抗体是全长抗体。在一个具体的实施方案中，靶向TROP2的抗体包含两条如上所定义的重链和两条如上所定义的轻链，或由两条所述重链和两条所述轻链组成。
在一些具体的实施方案中，适用于构建上述抗体-药物偶联物的靶向TROP2的抗体或其片段是多特异性抗体例如双特异性抗体。在一些具体的实施方案中，适用于构建上述抗体-药物偶联物的靶向TROP2的抗体是单克隆抗体。在一些具体的实施方案中，适用于构建上述抗体-药物偶联物的靶向TROP2的抗体是嵌合抗体或人源化抗体。在一些具体的实施方案中，适用于构建上述抗体-药物偶联物的靶向TROP2的抗体片段选自Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、单链抗体(例如scFv)、(Fab’)2、单结构域抗体例如VHH、dAb(domainantibody)、双价抗体或线性抗体。
在一些实施方案中，所述靶向TROP2的抗体或其片段是PCT/CN2024/121813中的靶向TROP2的抗体或其片段，例如hRS7抗体。专利申请PCT/CN2024/121813在本文中以其全文并入本文。
在一些实施方案中，所述的其它治疗剂是靶向FRα抗体-药物偶联物、其立体异构体或药学上可接受的盐或溶剂合物。在一些具体的实施方案中，所述靶向FRα的抗体或其片段是美国专利申请公开号US20200362029A1中的来自ImmunoGen公司的Mirvetuximab。在一些具体的实施方案中，所述靶向FRα的抗体或其片段是美国专利申请公开号US20200362029A1中的来自ImmunoGen公司的FR57。在一些具体的实施方案中，所述靶向FRα抗体-药物偶联物是在一些具体的实施方案中，所述靶向FRα抗体-药物偶联物是FR57-Dxd。专利申请US20200362029A1在本文中以其全文并入本文。
上述抗体-药物偶联物可以按照以下实施例所描述的方法或相关申请PCT/CN2024/121813和US20200362029A1中所记载的方法制备。
本发明的另一个目的是提供一种成套药盒，其包含本发明的药物组合，优选地所述药盒为药物剂量单元形式。由此可以依据给药方案或药物施用间隔提供剂量单元。
在一个实施方案中，本发明的成套药盒在同一包装内包含：
-含有包含本发明的抗体或其片段、和/或ISAC分子的药物组合物的第一容器；
-含有包含其它治疗剂的药物组合物的第二容器。
VII.用途和方法
本发明一方面提供了在受试者中预防或治疗肿瘤(例如癌症)的方法，包括向受试者施用有效量的本发明的抗体和/或ISAC分子、药物组合物、药物组合或药盒。
在一些实施方案中，所述肿瘤例如癌症包括实体肿瘤和血液肿瘤以及转移性病灶。在一个实施方案中，实体瘤的例子包括恶性肿瘤。癌症可以处于早期、中期或晚期或是转移性癌。
在一些实施方案中，所述肿瘤例如癌症是TROP2阳性的，例如其包含表达TROP2的肿瘤细胞。在一些实施方案中，所述患者的肿瘤包含表达TROP2的肿瘤细胞。在一些实施方案中，所述患者的肿瘤细胞表达TROP2，例如中等表达TROP2，优选的高表达TROP2。在一些实施方案中，所述肿瘤(例如癌症)患者的肿瘤组织中具有(例如升高水平的，例如核酸或蛋白质水平的)TROP2，例如与健康个体的相同组织或与患者肿瘤组织临近的健康组织中的TROP2水平相比。在一些实施方案中，所述患者的肿瘤细胞中具有(例如升高水平的，例如核酸或蛋白质水平的)TROP2，例如与健康个体的相同细胞或与患者肿瘤细胞临近的健康细胞中的TROP2水平相比。
在一个具体的实施方案中，本发明的抗体和/或ISAC分子能够杀伤肿瘤细胞，和/或抑制肿瘤细胞增殖，例如表达TROP2的肿瘤细胞，例如肺癌细胞、头颈部肿瘤细胞、前列腺癌细胞、黑色素瘤细胞、胰腺癌细胞、乳腺癌细胞、食管癌细胞、宫颈癌细胞、肾癌细胞、膀胱癌细胞或卵巢癌细胞。
在一些实施方案中，所述肿瘤例如癌症是FRα阳性的，例如其包含表达FRα的肿瘤细胞。在一些实施方案中，所述患者的肿瘤包含表达FRα的肿瘤细胞。在一些实施方案中，所述患者的肿瘤细胞表达FRα，例如中等表达FRα，优选的高表达FRα。在一些实施方案中，所述肿瘤(例如癌症)患者的肿瘤组织中具有(例如升高水平的，例如核酸或蛋白质水平的)FRα，例如与健康个体的相同组织或与患者肿瘤组织临近的健康组织中的FRα水平相比。在一些实施方案中，所述患者的肿瘤细胞中具有(例如升高水平的，例如核酸或蛋白质水平的)FRα，例如与健康个体的相同细胞或与患者肿瘤细胞临近的健康细胞中的FRα水平相比。
在一个具体的实施方案中，本发明的抗体和/或ISAC分子能够杀伤肿瘤细胞，和/或抑制肿瘤细胞增殖，例如表达FRα的肿瘤细胞，例如肺癌细胞、头颈部肿瘤细胞、前列腺癌细胞、黑色素瘤细胞、胰腺癌细胞、乳腺癌细胞、食管癌细胞、宫颈癌细胞、肾癌细胞、膀胱癌细胞或卵巢癌细胞。
在一些实施方案中，肿瘤是肿瘤免疫逃逸。
在一些实施方案中，所述肿瘤是癌症，例如肺癌、头颈部肿瘤、前列腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、乳腺癌、食管癌、宫颈癌、肾癌、膀胱癌或卵巢癌。
受试者可以是哺乳动物，例如，灵长类，优选地，高级灵长类，例如，人类(例如，患有本文所述疾病或具有患有本文所述疾病的风险的个体)。在一个实施方案中，受试者患有本文所述疾病(例如，癌症)或具有患有本文所述疾病的风险。在一些实施方案中，受试者接受或已经接受过其它治疗，例如化疗治疗和/或放射疗法。在一些实施方案中，受试者之前已经接受过或正在接受免疫疗法。
在其他方面，本发明提供上述抗体和/或ISAC分子或药物组合物或药物组合或药盒在生产或制备药物中的用途，所述药物用于本文所述的用途，例如用于预防或治疗本文提及的相关疾病或病症。
在一些实施方案中，本发明的抗体和/或ISAC分子或药物组合物或药物组合或药盒会延迟病症和/或与病症相关的症状的发作。
在一些实施方案中，本发明的抗体和/或ISAC分子或药物组合物还能与一种或多种其它疗法例如治疗方式和/或其它治疗剂组合施用，用于本文所述的用途，例如用于预防和/或治疗本文提及的相关疾病或病症。
在一些实施方案中，治疗方式包括外科手术；放射疗法、局部照射或聚焦照射等。
在一些实施方案中，治疗剂选自化疗剂、血管生成抑制剂、细胞因子、细胞毒性剂、其它抗体、小分子药物或免疫调节剂(例如免疫检查点抑制剂或激动剂)。
示例性的其他抗体包括特异性结合免疫检查点的抗体。
本发明的组合疗法涵盖组合施用(例如两种或更多种治疗剂包含在同一配制剂或分开的配制剂中)，和分开施用，在该情况中，可以在施用别的治疗剂和/或药剂之前，同时，和/或之后发生本发明的抗体和/或ISAC分子的施用。
药物组合物的施用途径是根据已知方法，例如，经口、通过静脉内注射、腹膜内、脑内(实质内)、脑室内、肌内、眼内、动脉内、门脉内或病灶内途径；通过持续释放系统或通过植入装置。在某些实施方案中，组合物可通过弹丸注射或通过连续输注或通过植入装置施用。
组合物还可经由植入膜、海绵或其上吸收或胶囊包封所需分子的另一种适当的材料被局部施用。在某些实施方案中，当使用植入装置时，所述装置可被植入到任何合适的组织或器官中，并且可经由扩散、定时释放的大丸剂、或连续施用递送所需分子。
本发明的这些以及其它方面和实施方案在附图和以下的发明详述中得到描述并且示例于以下实施例中。上文以及整个本申请中所论述的任何或所有特征可以在本发明的各种实施方案中组合。以下实施例进一步说明本发明，然而，应理解实施例以说明而非限定的方式来描述，并且本领域技术人员可以进行多种修改。
实施例
实施例1.1杂交瘤制备抗TROP2抗体
1.1.1免疫
将人的TROP2胞外段蛋白(Acro，Cat#TR2-H5223)，与TiterMax(sigma,Cat#T2684)乳化后免疫Balb/c小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)四次，每两周皮下注射一次(每只小鼠50μg蛋白)。
1.1.2细胞融合和高通量筛选
当血清效价满足要求后，摘取小鼠的脾制备B淋巴细胞悬液，与SP2/0骨髓瘤细胞(ATCC)进行电融合。将融合后的细胞用选择性培养基(含20％ FBS，1 x HAT的1640培养基)稀释细胞至1～2×104个细胞/ml，铺到96孔板，每孔加入100μl细胞悬液。融合后第7天更换筛选培养基(含10％ FBS，1 x HT的1640培养基)，培养第10天(或更久，根据细胞生长状态)后取上清进行检测。
通过流式细胞仪(FACS)筛选出特异性表达抗TROP2抗体的杂交瘤细胞。将待检测细胞(huTROP2/GS-CHO&cynoTROP2/GS-CHO，内部构建)计数，并稀释至1×106个细胞/ml，向U型底96孔板中加入100μl/孔。500g离心5min，去除细胞培养基。将杂交瘤96孔板培养上清加入U型板并重悬细胞，每孔加100μl，冰上静置30min。500g离心5min去除上清，PBS洗细胞1遍。500g 5min去除PBS，每孔加入100μl抗鼠Fab(Jackson Immunoresear,Cat#115-545-006)的FITC标记的二抗(1:500稀释于PBS中)，阳性对照抗体加入100μl抗人Fc的PE(Biolegend,Cat#409304)标记的二抗。冰上避光孵育30min。500g 5min去除上清，PBS洗细胞1遍。用50μl 1×PBS重悬细胞，FACS上机检测。将cell binding阳性的克隆进行亲和力测定。最终克隆用有限稀释法进行亚克隆，挑取单克隆细胞。
1.1.3阳性杂交瘤细胞亚克隆
有限稀释法亚克隆步骤：准备一块96孔板，每孔加入200μl培养基，该培养基是在筛选培养基的基础上将HAT更换成HT(Gibco,Cat#11067-030)，其余配方相同。将上述融合筛选出的阳性孔的细胞制成细胞悬液，分别取100μl加入到第一排的每个孔中混匀，然后将第1排细胞悬液取100μl加入第2排，充分混匀后取100μl加入下一排；重复上述步骤直到稀释至最后一排，静置96孔板30min，显微镜下观察计数。取100个细胞对应的体积加入20ml培养基，并混匀铺板，每孔200μl。一周后显微镜下观察，判断并标记出单克隆孔。
待每孔细胞汇合度达到50％以上时，同上述高通量的筛选方法检测，挑出目标阳性孔，扩大培养后进行细胞冻存，同时将克隆上清进行亲和力测定。亲和力测定方法(ForteBio)按照现有的方法(Estep,P等人，High throughput solution Based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning.MAbs,2013.5(2):第270-8页)进行。简言之，AHQ(Pall，1506091)传感器在分析缓冲液中线下平衡30分钟，然后线上检测60秒建立基线，在线加载如上所述获得的经纯化的抗体至AHQ传感器(ForteBio)上进行ForteBio亲和测量。再将具有加载的抗体的传感器暴露于抗原TROP2，之后将传感器转移至分析缓冲液用于解离速率测量。使用ForteBio分析软件分析KD值。亲和力的检测结果同见表1：
表1.TROP2杂交瘤候选克隆的结合动力学常数
实施例1.2嵌合抗体的制备
对实施例1.1中获得的杂交瘤候选克隆进行抗体轻重链基因序列的调取，并将其构建成人鼠嵌合抗体。所述嵌合抗体的重链和轻链序列分别为SEQ ID NO:15和16所示。
取新鲜培养的每株细胞约5×106个，抽提RNA(Macherey-Nagel，Cat#740984.250)。利用PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara)反转录获得cDNA。以位于5’端FR1区的碱基序列设计上游引物，以位于抗体恒定区或FR4区的碱基设计下游引物，扩增出抗体轻链和重链可变区基因片段。将其连接到T载体中(Mighty TA-cloning Kit试剂盒，Takara)，挑取单克隆进行测序，将测序结果利用MEGA7软件进行分析比对。
经比对，抗体轻重链可变区序列正确且配对的克隆，分别将其轻重链可变区基因片段通过南京诺维赞公司的同源重组酶(目录号：C112-01)连接到pcDNA3.1载体中，其中恒定区选择IgG1亚型，获得轻链和重链抗体的表达质粒。
然后将同一抗体的轻链质粒与重链质粒按1:1的摩尔比混合，经聚乙烯亚胺(PEI)(Polysciences，Cat#23966)转染293F细胞，培养5-7天后，细胞活力低于60％时，收集细胞培养上清并用Protein A亲和柱纯化出单克隆抗体。
实施例1.3嵌合抗体的体外筛选
1.3.1亲和力测定
采用生物膜薄层干涉测定技术(ForteBio)测定本发明抗体结合人、猴和鼠的TROP2的平衡解离常数(KD)。ForteBio亲和力测定按照现有的方法(Estep,P等人，High throughput solution Based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning.MAbs,2013.5(2):第270-8页)进行。
简言之，AHQ(Pall，1506091)传感器在分析缓冲液中线下平衡30分钟，然后线上检测60秒建立基线，在线加载如上所述获得的经纯化的抗体至AHQ传感器(ForteBio)上进行ForteBio亲和测量。再将具有加载的抗体的传感器暴露于抗原TROP2，之后将传感器转移至分析缓冲液用于解离速率测量。使用ForteBio分析软件分析KD值。抗原来源为：人(Acro，Cat#TR2-H5223)、猴(Sino，Cat#50922-M08H)和鼠(Sino，Cat#90893-C08H)。
抗体亲和力的检测结果如表2所示：
表2.TROP2嵌合抗体的结合动力学常数
1.3.2抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)功能检测
本发明使用FcγRIIa-H报告细胞(G9871,Promega)检测TROP2嵌合抗体的ADCP(Antibody-dependent cell-mediated phagocytosis)活性，该细胞是工程化改造的Jurkat T细胞，当该细胞表面的FcγRIIa被结合并激活后，通过下游信号NFAT(Nuclear Factor of Activated T)向实验体系中释放荧光素酶，从而可以检测细胞的激活程度。
具体方法如下：使用96孔白色平底细胞培养板，每孔加入靶细胞FaDu(HTB-43，ATCC)或COLO 205(TCHu102，中国科学院细胞库)或SK-BR-3(HTB-30，ATCC)6×104个以及效应细胞FcγRIIa-H细胞3×104个，然后加入对应浓度的TROP2单克隆抗体，置于37℃培养箱培养6小时。使用TROP2 ADC Trodelvy的抗体部分hRS7作为对照抗体(序列及来源见WO2003/074566)。然后取出培养板，加入Bio-Glo(G7940,Promega)，使用酶标仪(Spectra,Molecular Devices)进行波长检测。结果如图1A(FaDu)、1B(COLO 205)、1C(SK-BR-3)所示，无论在TROP2高表达细胞系FaDu，还是TROP2中等表达的细胞系COLO 205、SK-BR-3，克隆ch1D9B10的ADCP活性均优于hRS7，适合用于ISAC(Immune-Stimulating Antibody Conjugate)的制备。
hRS7抗体制备：
根据WO2003/074566获得表达抗体所用的质粒DNA。
用Expi293F培养基(Gibco，REF#A14351-01)培养Expi293F细胞(购自Gibco)，转染前一天检测细胞密度(活力需大于95％)，并用新鲜的Expi293F培养基调整到3×106个细胞/ml继续培养，转染当天将细胞密度调整为3×106个细胞/ml。
取1/10转染终体积的Opti-MEM培养基(Gibco，REF#31985-070)作为转染缓冲液，按照1mg/L的比例加入待转染的DNA，其中轻重链质粒配比为1:1，混匀，按照DNA：PEI质量比1:3加入PEIMax(Polysciences Inc.Cat#24765-1)，混匀，室温孵育20min，然后将混合物轻柔地倒入Expi293F细胞悬液中，边倒边摇，细胞置于摇床培养，培养条件为8％CO2、36.5℃、120rpm。
培养16～18h后，向细胞悬液中补加2％(体积比)的浓度为200g/L的Feed(100g/L Phytone Peptone+100g/L Difco Select Phytone)、终浓度为5g/L的葡萄糖溶液和终浓度为2.2mM的Valproic acid sodium salt(Merk，Cat#P4543-100G)，轻轻混匀，8％CO2、36.5℃、120rpm继续培养7天后收样。将细胞料液与硅藻土(Sartorius，Cat 1000037025)混匀(1L细胞料液加40g硅藻土)，用0.22μm的一次性真空过滤装置进行过滤。
亲和层析纯化目的蛋白：选用HiTrap MabSelect PrismA(GE Healthcare，Cat#17549853)亲和层析柱进行亲和捕获，纯化前用10-20倍柱体积的0.1M NaOH流经管路及亲和层析柱，然后用10-20倍柱体积的蒸馏水清洗管路以及柱子，用5倍柱体积的1×PBS(Gibco)平衡填料柱；将过滤后的细胞料液通过柱子，再用10倍柱体积的1×PBS清洗填料柱，去除非特异性结合蛋白；用5倍柱体积的洗脱缓冲液(100mM sodium citrate，pH 3.5)冲洗填料，收集洗脱液，用2M Tris调节pH至6.0，过滤除菌，待纯度检测合格后使用。
表3.最终克隆鼠抗体的VH、VL序列

实施例1.4嵌合抗体的人源化
根据常规方法，将杂交瘤得到的嵌合抗体进行人源化，具体步骤如下：
①确定CDR环结构；
②在人种系序列数据库为重链和轻链的每个V/J区域找到最接近的同源序列；
③筛选与重链轻链最匹配的人种系以及最低量的回复突变；
④将嵌合抗体的CDR区构建至人的骨架区上；
⑤使用序列和结构特征，确定骨架区中起到维持CDR功能的氨基酸位置；
⑥在确定为重要的序列位置进行回复突变(返回到输入氨基酸类型)；
⑦优化风险位点的氨基酸。
由此获得人源化抗体：hz1D9B10，其CDR序列、轻链可变区和重链可变区、轻链和重链的氨基酸序列参见下表4所示。
表4.最终人源化克隆序列
实施例1.5 ForteBio测定人源化抗体与抗原的亲和力
采用生物膜薄层干涉测定技术(ForteBio)测定本发明抗体结合人TROP2的平衡解离常数(KD)。ForteBio亲和力测定遵循现有的方法(Estep,P等人，High throughput solution Based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning.MAbs,2013.5(2):第270-8页)。简言之，AHC(Sartorius，18-5060)传感器在分析缓冲液中线下平衡30分钟，然后线上检测60秒建立基线，在线加载如上所述获得的经纯化的抗体至AHC传感器(ForteBio)上进行ForteBio亲和测量。再将具有加载的抗体的传感器暴露于抗原人TROP2，之后将传感器转移至分析缓冲液用于解离速率测量。使用ForteBio分析软件分析KD值。
抗体亲和力的检测结果如表5所示，人源化后的抗体对抗原TROP2依然具有高的亲和力，其与相应的嵌合抗体具有针对抗原相当的平衡解离常数KD。
表5.ForteBio检测抗原抗体结合的亲和力常数(M)
实施例1.6人源化抗体的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)功能检测
TROP2人源化抗体的ADCP活性使用FcγRIIa-H报告细胞进行检测，靶细胞为TROP2中低表达细胞系NUGC-4(JCRB0834，JCRB CELL BANK)，检测方法同实施例1.3.2，结果如图2所示，hz1D9B10的ADCP活性与相应的嵌合抗体相当，均优于对照抗体hRS7，说明人源化过程未影响抗体的ADCP功能。
实施例1.7人源化抗体的巨噬细胞内吞功能验证
TROP2抗体人源化克隆的ADCP活性使用诱导分化的人M1型巨噬细胞进行验证，将巨噬细胞、靶细胞分别使用荧光标记，当两者借助抗体发生ADCP时，即可观察到双阳细胞群。
M1型巨噬细胞诱导分化：用无CD16耗损的人单核细胞富集试剂盒(19058，STEMCELL)从新鲜人外周血单个核细胞(PBMC,TPCS)中分离单核细胞，按照1×106个/ml的密度重悬于AIMMedium CTS(A3021002，Gibco)培养基，放置于细胞培养瓶中，37℃贴壁培养4小时。随后将培养基更换为Medium CTS(A3021002，Gibco)+10％灭活胎牛血清(FBS，SH30406.05，Hyclone)+25ng/ml human MCSF1(216-MC-500，R&D)培养。随后的七天内，每隔三天使用培养基AIMMedium CTS(A3021002，Gibco)+10％灭活胎牛血清(FBS，SH30406.05，Hyclone)半换液一次。七天后使用培养基AIMMedium CTS(A3021002，Gibco)+10％灭活胎牛血清(FBS，SH30406.05，Hyclone)+100ng/ml IFNg(285-IF-100/CF，R&D)进行半换液，第二天进行巨噬细胞内吞实验。
巨噬细胞内吞实验：Accutase(A6964-500ML，Sigma)消化诱导分化后的巨噬细胞，使用含10％胎牛血清(FBS，SH30406.05，Hyclone)的RPMI-1640完全培养基(22400-071，Gibco)调整细胞密度，于96孔低吸附板中每孔加入1×105个细胞。将靶细胞FaDu(HTB-43，ATCC)使用CFSE(C34554，INVITROGEN)37℃标记10min，含10％胎牛血清(FBS，SH30406.05，Hyclone)的RPMI-1640完全培养基(22400-071，Gibco)洗两遍，于96孔低吸附板中每孔加入2.5×104个细胞。将靶细胞、巨噬细胞与梯度稀释的TROP2人源化抗体吹打混匀，置于37℃培养箱培养4小时。
流式染色：使用CD14 PE/Cy7(557742，BD)标记巨噬细胞后进行流式检测，检测PE/Cy7、CFSE双阳性区域细胞即为目标细胞群。
结果如图3所示，hz1D9B10抗体在人咽鳞癌细胞FaDu存在时可诱导M1型巨噬细胞发生ADCP作用，活性与相应的嵌合抗体相当。
实施例2 ISAC分子的合成
实施例2.1化合物1、化合物2和化合物3的合成
合成路线

(S)-(1-((2-(乙氧基甲基)-1-(2-羟基-2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基甲酸叔丁酯(1-1)
向雷西莫特(1.0g，3.18mmol)的DMF(12mL)溶液中添加Boc-Ala-OH(0.9g，4.77mmol)、DMAP(0.7g，5.73mmol)和EDCI(1.1g，5.73mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将混合物用EtOAc(50mL)稀释并用饱和NH4Cl水溶液、盐水依次洗涤并经无水Na2SO4干燥，减压浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化残余物，得到呈淡黄色油状的化合物1-1(0.9g，58％收率)。
LC-MS(ESI):m/z 486.3[M+H]+
(S)-2-氨基-N-(2-(乙氧基甲基)-1-(2-羟基-2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-基)丙酰胺(1-2)
在0℃下，向化合物1-1(70mg，0.144mmol)的DCM(5mL)溶液中添加TFA(5mL)。将反应混合物搅拌1小时，然后减压浓缩，得到化合物1-2(70mg)，其无需进一步纯化即可用于下一步。
LC-MS(ESI):m/z 386.2[M+H]+
((S)-1-(((S)-1-((2-(乙氧基甲基)-1-(2-羟基-2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁酯(1-3)
向化合物1-2(70mg，0.144mmol)在DCM(10mL)的溶液中添加Boc-Val-OH(32.8mg，0.152mmol)、HOBt(22mg,0.16mmol)、DIPEA(46.4mg，0.36mmol)和EDCI(30.4mg，0.16mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将混合物用EtOAc(30mL)稀释并用饱和NH4Cl水溶液、盐水依次洗涤并经无水Na2SO4干燥，减压浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化残余物，得到呈淡黄色油状的化合物1-3(50mg，两步收率38％)。
LC-MS(ESI):m/z 585.6[M+H]+.
(S)-2-氨基-N-((S)-1-((2-(乙氧基甲基)-1-(2-羟基-2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4)-基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)-3-甲基丁酰胺(1-4)
在0℃下，向化合物1-3(200mg，0.34mmol)的DCM(10mL)溶液中添加TFA(10mL)。将反应混合物搅拌1小时，然后减压浓缩，得到化合物1-4(200mg)，其无需进一步纯化即可用于下一步。
LC-MS(ESI):m/z 485.3[M+H]+.
6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-((S)-1-(((S)-1-((2-(乙氧基甲基)-1-(2-羟基-2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)己酰胺(化合物1)
向化合物1-4(200mg，0.34mmol)在DMF(5mL)的溶液中添加N-琥珀酰亚胺基6-马来酰亚胺己酸酯(105mg，0.34mmol)和DIPEA(132mg，1.02mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将混合物用EtOAc(20mL)稀释并用饱和NH4Cl水溶液、盐水依次洗涤并经无水Na2SO4干燥，减压浓缩。通过制备型HPLC纯化残余物，得到呈白色固体状的化合物1(65mg，两步收率28％)。
LC-MS(ESI):m/z 678.3[M+H]+.
1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-((S)-1-(((S)-1-((2-(乙氧基甲基)-1-(2-羟基-2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-3,6,9,12-四氧十五烷-15-酰胺(化合物2)
向化合物1-4(82mg，0.17mmol)和Mal-PEG4-酸(59mg)在DCM(5mL)的溶液中添加HATU(65mg，0.17mmol)和DIPEA(55mg，0.43mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将混合物用饱和NaHCO3水溶液(5mL)、饱和NH4Cl水溶液、盐水依次洗涤并经无水Na2SO4干燥，减压浓缩。通过制备型HPLC纯化残余物，得到呈白色固体状的化合物2(37mg，产率27％)。
LC-MS(ESI):m/z 812.2[M+H]+.
1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-((S)-1-(((S)-1-((2-(乙氧基甲基)-1-(2-羟基-2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧廿七烷-27-酰胺(化合物3)
向化合物1-4(107mg，0.22mmol)和Mal-PEG8-酸(116mg)在DCM(8mL)的溶液中添加HATU(85mg，0.22mmol)和DIPEA(72mg，0.56mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将混合物用饱和NaHCO3水溶液(8mL)、饱和NH4Cl水溶液、盐水依次洗涤并经无水Na2SO4干燥，减压浓缩。通过制备型HPLC纯化残余物，得到呈白色固体状的化合物3(11mg，产率5％)。
LC-MS(ESI)：m/z 989.0[M+H]+。
实施例2.2化合物4的合成
合成路线
1-(2-(乙氧基甲基)-4-(三苯甲基氨基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-2-甲基丙-2-醇(2-1)
在N2气氛下，向雷西莫特(0.1g，0.3mmol)在CH3CN(5mL)的悬浮液中添加Et3N(76mg，0.75mmol)和三苯甲基氯(100mg，0.36mmol)。将反应混合物在微波反应器中于100℃下照射30分钟。将混合物冷却至0℃。通过过滤收集沉淀物并用冷CH3CN洗涤，得到呈白色固体状的化合物2-1(120mg，产率68％)。
LC-MS(ESI)：m/z 557.5[M+H]+。
N-(叔丁氧基羰基)-(2-((1-(2-(乙氧基甲基)-4-(三苯甲基氨基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-2-甲基丙-2-基)氧基)乙基)氨基磺酸(2-2)
在N2气氛下，向NaH(分散在油中60％，28mg，0.72mmol)在DMF(2mL)的悬浮液中滴加化合物2-1(200mg，0.36mmol)在DMF(2mL)中的溶液。将混合物在0℃下搅拌1小时，并在室温下搅拌30分钟。在0℃下向该溶液中添加2,2-二氧化物-1,2,3-恶噻唑烷-3-甲酸-1,1-二甲基乙酯(160mg，0.72mmol)。使混合物升至室温并搅拌过夜。将混合物倒入冰水中并用EtOAc萃取。合并有机层，用水、盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥并减压浓缩。通过硅胶柱色谱法(DCM/MeOH＝150:1)纯化残余物，得到呈白色泡沫状的化合物2-2(150mg，收率54％)。
LC-MS(ESI):m/z 802.6[M+Na]+.
1-(2-(2-氨基乙氧基)-2-甲基丙基)-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺(2-3)
在0℃下，向化合物2-2(150mg，0.19mmol)的DCM(8mL)溶液中添加Et3SiH(100mg)，然后添加TFA(8mL)。将反应混合物在室温下搅拌3小时。将混合物减压浓缩，得到化合物2-3(67mg，收率97％)。
LC-MS(ESI):m/z 358.4[M+H]+.
(S)-(1-((2-((1-(4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-2-甲基丙-2-基)氧基)乙基)氨基)-4,4-二甲基-1-氧代戊烷-2-基)氨基甲酸苄酯(2-4)
在0℃下，向化合物2-3(2.7g，7.55mmol)在DMF(15mL)的溶液中添加DIPEA(3.9g，30.2mmol)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基(S)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)-4,4-二甲基戊酸酯(3.4g，9.06mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将混合物用EtOAc稀释，用0.5N HCl、盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥并减压浓缩。通过制备型HPLC纯化残余物，得到呈白色泡沫状的化合物2-4(2.5g，产率54％)。
LC-MS(ESI):m/z 619.5[M+H]+.
(S)-2-氨基-N-(2-((1-(4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-2-甲基丙-2-基)氧基)乙基)-4,4-二甲基戊酰胺(2-5)
在N2气氛下，向化合物2-4(100mg，0.16mmol)的MeOH(5mL)溶液中添加10％Pd/C(10mg)。将反应混合物在H2气氛下于室温搅拌5小时。过滤反应物并减压浓缩滤液，得到呈白色固体状的化合物2-5(NeoR848,78mg，定量)。
LC-MS(ESI):m/z 485.4[M+H]+.
(S)-N-(1-((2-((1-(4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-2-甲基丙-2-基)氧基)乙基)氨基)-4,4-二甲基-1-氧代戊烷-2-基)-1-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12-四氧十五烷-15-酰胺(化合物4)
向化合物2-5(78mg，0.16mmol)和Mal-PEG4-酸(56mg)在DCM(10mL)的溶液中添加HATU(61mg，0.16mmol)和DIPEA(41mg，0.32mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将混合物用饱和NaHCO3水溶液(5mL)、饱和NH4Cl水溶液、盐水依次洗涤并经无水Na2SO4干燥，减压浓缩。通过制备型HPLC纯化残余物，得到呈白色泡沫状的化合物4(19mg，产率15％)。
LC-MS(ESI)：m/z 812.5[M+H]+。
实施例2.3化合物5的合成
合成路线
N-(N-((苄氧基)羰基)-N-甲基甘氨酰)-N-甲基甘氨酸甲酯(3-1)
向Cbz-Sar-OH(10g，44.8mmol)在DCM(100mL)的溶液中添加H-Sar-OMe.HCl(6.9g，49.3mmol)、DIPEA(14.4g，112mmol)、EDCI(9.4g，49.3mmol)和HOBt(6.7g，49.3mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将混合物用1N HCl(3×100mL)、水(100mL)、饱和NaHCO3水溶液(3×100mL)、盐水(100mL)依次洗涤并经无水Na2SO4干燥，减压浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱纯化(石油醚/EtOAc＝100:1至30:1)，得到呈淡黄色油状的化合物3-1(11.2g，收率81％)。
LC-MS(ESI)：m/z 309.2[M+H]+。
N-(N-((苄氧基)羰基)-N-甲基甘氨酰)-N-甲基甘氨酸(3-2)
在0℃下，向化合物3-1(6.0g，4.2mmol)在MeOH(120mL)的溶液中添加LiOH.H2O(5.28g，126mmol)在H2O(30mL)中的溶液。将反应混合物在相同温度下搅拌2小时。将混合物用3N HCl酸化并用EtOAc萃取。将有机层用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥并减压浓缩。通过硅胶柱色谱法(DCM/MeOH＝150:1)纯化残余物，得到呈无色油状的化合物3-2(5.2g，收率90％)。
LC-MS(ESI)：m/z 317.1[M+Na]+。
4,7,10-三甲基-3,6,9-三氧代-1-苯基-2-氧杂-4,7,10-三氮杂十二烷-12-酸甲酯(3-3)
向化合物3-2(5.2g，17.67mmol)在DCM(100mL)的溶液中添加H-Sar-OMe.HCl(2.47g，17.67mmol)、DIPEA(6.85g，53.0mmol)、EDCI(3.74g，19.47mmol)和HOBt(2.63g，19.47mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将混合物用1N HCl(3×100mL)、水(100mL)、饱和NaHCO3水溶液(3×100mL)、盐水(100mL)依次洗涤并经无水Na2SO4干燥，减压浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱纯化(石油醚/EtOAc＝100:1至30:1)，得到呈淡黄色油状的化合物3-3(3.4g，收率51％)。
LC-MS(ESI)：m/z 402.3[M+Na]+。
4,7,10-三甲基-3,6,9-三氧代-1-苯基-2-氧杂-4,7,10-三氮杂十二烷-12-酸(3-4)
在0℃下，向化合物3-3(3.4g，8.98mmol)的MeOH(15mL)溶液中添加LiOH.H2O(1.5g，35.9mmol)的H2O(15mL)溶液。将反应混合物在相同温度下搅拌2小时。将混合物用3N HCl酸化并用EtOAc萃取。将有机层用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥并减压浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱纯化(DCM/MeOH＝100:1至50:1)，得到呈无色油状的化合物3-4(2.1g，收率64％)。
LC-MS(ESI)：m/z 388.5[M+Na]+。
4,7,10,13-四甲基-3,6,9,12-四氧代-1-苯基-2-氧杂-4,7,10,13-四氮杂十五烷-15-酸甲酯(3-5)
向化合物3-4(3.0g，8.2mmol)在DCM(100mL)的溶液中添加H-Sar-OMe.HCl(1.2g，8.2mmol)、DIPEA(3.1g，24.0mmol)、EDCI(1.7g，9.0mmol)和HOBt(1.2g，9.0mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将混合物用1N HCl(3×100mL)、水(100mL)、饱和NaHCO3(3×100mL)、盐水(100mL)依次洗涤并经无水Na2SO4干燥，减压浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱纯化(石油醚/EtOAc＝100:1至30:1)，得到呈淡黄色油状的化合物3-5(1.2g，收率32％)。LC-MS(ESI)：m/z 451.3[M+H]+。
4,7,10,13-四甲基-3,6,9,12-四氧代-1-苯基-2-氧杂-4,7,10,13-四氮杂十五烷-15-酸(3-6)
在0℃下，向化合物3-5(12.3g，27.3mmol)在MeOH(120mL)的溶液中添加LiOH.H2O(4.6g，109.2mmol)在H2O(30mL)中的溶液。将反应混合物在相同温度下搅拌2小时。将混合物用3N HCl酸化并用EtOAc萃取。将有机层用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥并减压浓缩。通过硅胶柱色谱法(DCM/MeOH＝100:1至50:1)纯化残余物，得到呈无色油状的化合物3-6(5.3g，收率45％)。
LC-MS(ESI)：m/z 459.2[M+Na]+。
(S)-(20-(4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-3,6,9,12,15-五甲基-13-新戊基-2,5,8,11,14-五氧代-18-氧杂-3,6,9,12,15-五氮杂二十烷基)(甲基)氨基甲酸苄酯(3-7)
在0℃下，向化合物3-6(200mg，0.46mmol)的DCM(10mL)溶液中添加EDCI(114mg，0.60mmol)和HOBt(80mg，0.60mmol)。搅拌5分钟后，添加化合物2-5(实施例2.2，266mg，0.56mmol)和DIPEA(178mg，1.38mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将混合物用1N HCl(2×10mL)、水(10mL)、NaHCO3(2×10mL)、盐水(10mL)依次洗涤并用无水Na2SO4干燥，减压浓缩。通过制备型HPLC纯化残余物，得到呈淡黄色固体状的化合物3-7(148mg，产率36％)。
LC-MS(ESI)：m/z 903.7[M+H]+。
(S)-(20-(2-(乙氧基甲基)-4-(三苯甲基氨基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-3,6,9,12,15-五甲基-13-新戊基-2,5,8,11,14-五氧代-18-氧杂-3,6,9,12,15-五氮杂二十烷基)(甲基)氨基甲酸苄酯(3-8)
在N2气氛下，向化合物3-7(180mg，0.18mmol)在CH3CN(5mL)的悬浮液中添加Et3N(41mg，40.5mmol)和三苯甲基氯(68mg，0.23mmol)。将反应混合物在微波反应器中于80℃下照射45分钟。将混合物减压浓缩。通过制备型TLC(DCM/MeOH＝20:1)纯化残余物，得到呈黄色固体的化合物3-8(100mg，44％)。
LC-MS(ESI)：m/z 1145.9[M+H]+。
(S)-N-(2-((1-(2-(乙氧基甲基)-4-(三苯甲基氨基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-2-甲基丙-2-基)氧基)乙基)-4,4-二甲基-2-(5,8,11-三甲基-4,7,10-三氧代-2,5,8,11-四氮杂十三烷-13-酰氨基)戊酰胺(3-9)
在N2气氛下，向化合物3-8(80mg)的MeOH(5mL)溶液中添加10％Pd/C(40mg)。将反应混合物在H2气氛下于室温搅拌4小时。过滤反应物，减压浓缩滤液，得到呈黄色固体状的化合物3-9(69mg，收率98％)。
LC-MS(ESI)：m/z 1011.6[M+H]+。
(S)-2-(14-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12-四甲基-4,7,10,13-四氧代-3,6,9,12-四氮杂十四酰氨基)-N-(2-((1-(2-(乙氧基甲基)-4-(三苯甲基氨基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-2-甲基丙-2-基)氧基)乙基)-4,4-二甲基戊酰胺(3-10)
向化合物3-9(69mg，0.069mmol)和马来酰亚胺乙酸(13.8mg，0.069mmol)在DCM(25mL)的溶液中添加HATU(33mg，0.083mmol)和DIPEA(19mg，0.14mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将混合物用饱和NaHCO3水溶液(20mL)洗涤。饱和NH4Cl水溶液(20mL)、盐水(20mL)依次洗涤并用无水Na2SO4干燥，减压浓缩，得到呈黄色固体状的化合物3-10(85mg)。
LC-MS(ESI)：m/z 1149.0[M+H]+。
(S)-N-(2-((1-(4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-2-甲基丙-2-基)氧基)乙基)-2-(14-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12-四甲基-4,7,10,13-四氧代-3,6,9,12-四氮杂十四酰氨基)-4,4-二甲基戊酰胺(化合物5)
在0℃下，向化合物3-10(85mg，0.074mmol)的DCM(5mL)溶液中添加Et3SiH(18mg，0.148mmol)和TFA(0.5mL)。将反应混合物在室温下搅拌4小时。将混合物减压浓缩。通过制备型HPLC纯化残余物，得到呈白色泡沫状的化合物5(11mg，两步收率18％)。
LC-MS(ESI)：m/z 906.8[M+H]+。
实施例2.4化合物6的合成
合成路线
N-甲基-N-(N-甲基-N-(N-甲基-N-(甲基甘氨酰)甘氨酰)甘氨酰)甘氨酸甲酯(4-1)
在N2气氛下向4,7,10,13-四甲基-3,6,9,12-四氧代-1-苯基-2-氧杂-4,7,10,13-四氮杂十五烷-15-酸甲酯(5g，11.1mmol)的MeOH(50mL)溶液中添加10％Pd/C(0.5mg)。将反应混合物在H2气氛下于室温搅拌6小时。过滤反应物，减压浓缩滤液，得到呈淡黄色油状的化合物4-1(3.5g，定量)。
LC-MS(ESI)：m/z 339.1[M+Na]+。
4,7,10,13,16,19,22,25-八甲基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧代-1-苯基-2-氧杂-4,7,10,13,16,19,22,25-八氮杂二十七烷-27-酸甲酯(4-2)
在10℃向Cbz-Sar-Sar-Sar-Sar-OH(4.8g,11.1mmol)的DCM(80mL)溶液中添加HATU(5.06g,13.3mmol)。搅拌5分钟后，添加H-Sar-Sar-Sar-Sar-OMe(3.5g，11.1mmol)和DIPEA(2.86g，22.2mmol)在DCM(25mL)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将混合物用1N HCl(100mL)、水(100mL)、饱和NaHCO3(100mL)、盐水(100mL)依次洗涤并用无水Na2SO4干燥，减压浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱纯化(DCM/MeOH＝100:1至50:1)，得到呈淡黄色油状的化合物4-2(2.2g，收率27％)。
LC-MS(ESI)：m/z 757.7[M+Na]+。
4,7,10,13,16,19,22,25-八甲基-3,6,9,12,15,18,24-八氧代-1-苯基-2-氧杂-4,7,10,13,16,19,22,25-八氮杂廿七烷-27-酸(4-3)
在0℃下，向化合物4-2(2.2g，2.99mmol)的MeOH(15mL)溶液中添加LiOH.H2O(0.5g,11.96mmol)的H2O(5mL)溶液。将反应混合物在相同温度下搅拌3小时。通过浓缩除去溶剂。将所得水溶液用3N HCl酸化并用EtOAc洗涤。通过冻干除去水。通过制备型HPLC纯化残余物，得到白色固体状的化合物4-3(601mg，产率28％)。
LC-MS(ESI)：m/z 721.6[M+H]+。
4,7,10,13,16,19,22,25-八甲基-3,6,9,12,15,18,24-八氧代-1-苯基-2-氧杂-4,7,10,13,16,19,22,25-八氮杂廿七烷-27-酸叔丁酯(4-4)
在0℃下，向化合物4-3(600mg，0.83mmol)的DCM(10mL)溶液中添加N,N'-二异丙基氨基甲酸叔丁酯(928mg,4.63mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将混合物用1N HCl(2×5mL)、水(5mL)、饱和NaHCO3(2×5mL)、盐水(5mL)依次洗涤并经无水Na2SO4干燥，减压浓缩，得到呈淡黄色油状的化合物4-4(702mg，定量)。
LC-MS(ESI)：m/z 799.8[M+H]+。
5,8,11,14,17,20,23-七甲基-4,7,10,13,16,19,22-七氧代-2,5,8,11,14,17,20,23-八氮杂廿五烷-25-酸叔丁酯(4-5)
在N2气氛下，向化合物4-4(700mg)的MeOH(10mL)溶液中添加10％Pd/C(100mg)。将反应混合物在H2气氛下于室温搅拌4小时。过滤反应物，减压浓缩滤液，得到呈淡黄色油状的化合物4-5(360mg，收率62％)。
LC-MS(ESI)：m/z 643.2[M+H]+。
26-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12,15,18,21,24-八甲基-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧代-3,6,9,12,15,18,21,24-八氮杂廿六烷酸叔丁酯(4-6)
向化合物4-5(360mg，0.56mmol)和马来酰亚胺乙酸(104mg，0.672mmol)在DCM(10mL)的溶液中添加HATU(255mg，0.672mmol)和DIPEA(108mg，0.84mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将混合物用饱和NaHCO3水溶液(5mL)、饱和NH4Cl水溶液(5mL)、盐水(5mL)依次洗涤并经无水Na2SO4干燥，减压浓缩，得到呈淡黄色油状的化合物4-6(436mg，定量)。
LC-MS(ESI)：m/z 802.3[M+H]+。
26-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12,15,18,21,24-八甲基-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧代-3,6,9,12,15,18,21,24-八氮杂廿六烷酸(4-7)
在0℃下，向化合物4-6(435mg，0.56mmol)的DCM(8mL)溶液中添加TFA(4mL)。将反应混合物在室温下搅拌4小时。将混合物减压浓缩。通过制备型HPLC纯化残余物，得到呈白色固体状的化合物4-7(295mg，产率74％)。
LC-MS(ESI)：m/z 746.4[M+Na]+。
(S)-N-(2-((1-(4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-2-甲基丙-2-基)氧基)乙基)-2-(26-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12,15,18,21,24-八甲基-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧代-3,6,9,12,15,18,21,24-八氮杂廿六酰氨基)-4,4-二甲基戊酰胺(化合物6)
在0℃下，向化合物4-7(90mg，0.12mmol)的DCM(2mL)溶液中添加EDCI(30mg，0.16mmol)和HOBt(21mg，0.16mmol)。搅拌5分钟后，添加化合物2-5(实施例2.2，59mg，0.13mmol)。将反应混合物在室温下搅拌4小时。通过制备型HPLC纯化残余物，得到呈白色固体状的化合物6(36mg，产率24％)。
LC-MS(ESI)：m/z 1212.8[M+Na]+。
实施例2.5化合物7和化合物8的合成
合成路线
(9H-芴-9-基)甲基((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-12-(4-氨基-2-(乙氧基甲基))-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-11,11-二甲基-5-新戊基-3,6-二氧代-2,10-二氧杂-4,7-二氮杂十二烷基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸酯(5-2)
向化合物2-5(实施例2.2，250mg，0.516mmol)和DIPEA(272mg，2.1mmol)DMF(8mL)溶液中添加Fmoc-Val-Cit-PAB-PNP(396mg，0.516mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将混合物用EtOAc(20mL)稀释，用饱和NaHCO3水溶液(5mL)、NH4Cl水溶液(5mL)、盐水(5mL)依次洗涤并用无水Na2SO4干燥，减压浓缩，得到化合物5-2(粗品，550mg)。LC-MS(ESI):m/z 1112.1[M+H]+.
4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基((S)-1-((2-((1-(4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-2-甲基丙-2-基)氧基)乙基)氨基)-4,4-二甲基-1-氧代戊烷-2-基)氨基甲酸酯(5-3)
在0℃下，向化合物5-2(550mg，0.19mmol)的DMF(5mL)溶液中添加哌啶(420mg)。将反应混合物在室温下搅拌3小时。通过制备型HPLC纯化混合物，得到化合物5-3(238mg，产率52％)。
LC-MS(ESI):m/z 890.3[M+H]+.
4-((2S,5S)-20-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5-异丙基-9,12,15,18-四甲基-4,7,10,13,16,19-六氧代-2-(3-脲基丙基)-3,6,9,12,15,18-六氮杂二十烷酰氨基)苄基((S)-1-((2-((1-(4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-2-甲基丙-2-基)氧基)乙基)氨基)-4,4-二甲基-1-氧代戊烷-2-基)氨基甲酸酯(化合物7)
向Mal-Sar4-OH(25mg，0.056mmol)和HOBt(10mg，0.07mmol)的DMF(0.5mL)溶液中添加EDCI(14mg，0.07mmol)。将反应混合物在N2下于室温搅拌2小时。将反应混合物在N2下于室温搅拌10分钟，然后添加化合物5-3(50mg 0.056mmol)。将反应混合物在N2下于室温搅拌2小时。过滤混合物并通过制备型HPLC纯化滤液，得到呈白色固体状的化合物7(20mg，产率27％)。
LC-MS(ESI):m/z 1311.3[M+H]+.
4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基((S)-1-((2-((1-(4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-2-甲基丙-2-基)氧基)乙基)氨基)-4,4-二甲基-1-氧代戊烷-2-基)氨基甲酸酯(化合物8)
向化合物5-3(60mg，0.067mmol)的DMF(2mL)溶液中添加DIPEA(8.8mg，0.067mmol)和N-琥珀酰亚氨基6-马来酰亚胺己酸酯(21mg，0.067mmol)。将反应混合物在室温下搅拌4小时。通过制备型HPLC纯化混合物，得到呈白色固体的化合物8(20mg，收率27％)。LC-MS(ESI):m/z 1083.2[M+H]+。
实施例2.6化合物9的合成
合成路线
(1-((2-((1-(4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-2-甲基丙-2-基)氧基)乙基)氨基)-2-甲基-1-氧代丙烷-2-基)氨基甲酸苄酯(6-4)
在0℃下，向化合物2-3(参见化合物4的合成)(600mg，1.68mmol)的DMF(10mL)溶液中添加DIPEA(759mg，5.88mmol)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基(S)-2-(((苄氧基)-羰基)氨基)-4,4-二甲基戊酸酯(573mg，1.7mmol),将反应混合物在室温下搅拌过夜。将混合物用EtOAc(50mL)稀释，用0.5N HCl、盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥并减压浓缩。通过制备型HPLC纯化残余物，得到呈白色泡沫状的化合物6-4(560mg，产率58％)。
LC-MS(ESI):m/z 577.1[M+H]+.
2-氨基-N-(2-((1-(4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-2-甲基丙-2-基)氧基)乙基)-2-甲基丙酰胺(6-5)
在N2气氛下向化合物6-4(560mg，0.97mmol)的MeOH(10mL)溶液中添加10％Pd/C(500mg)。将反应混合物在H2气氛下于室温搅拌4小时。过滤反应物并减压浓缩滤液，得到呈白色固体状化合物6-5(390mg，91％收率)。
LC-MS(ESI):m/z 443.2[M+H]+.
(9H-芴-9-基)甲基((S)-1-(((S)-1-((4-(12-(4-氨基-2-(乙氧基甲基))-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-5,5,11,11-四甲基-3,6-二氧代-2,10-二氧杂-4,7-二氮杂十二烷基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸酯(6-6)
向化合物6-5(390mg，0.88mmol)和DIPEA(569mg，4.4mmol)的DMF(10mL)溶液中添加Fmoc-Val-Cit-PAB-PNP(675mg，0.88mmol)，将反应混合物在室温下搅拌过夜。将混合物用EtOAc(50mL)稀释，用饱和NaHCO3水溶液(5mL)、NH4Cl水溶液(5mL)、盐水(5mL)依次洗涤并用无水Na2SO4干燥，减压浓缩，得到化合物6-6(粗品，958mg)。
LC-MS(ESI):m/z 1070.3[M+H]+.
4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基(1-((2-((1-(4-氨基-2-(乙氧基甲基))-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-2-甲基丙-2-基)氧基)乙基)氨基)-2-甲基-1-氧代丙-2-基)氨基甲酸酯(6-7)
在0℃下，向化合物6-6(958mg，0.88mmol)的DMF(5mL)溶液中添加哌啶(750mg)。将反应混合物在室温下搅拌3小时。通过制备型HPLC纯化混合物，得到化合物6-7(210mg，产率28％)。
LC-MS(ESI):m/z 848.1[M+H]+.
4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基(1-((2-((1-(4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-2-甲基丙-2-基)氧基)乙基)氨基)-2-甲基-1-氧代丙烷-2-基)氨基甲酸酯(化合物9)
向化合物6-7(50mg，0.056mmol)的DMF(1mL)溶液中添加DIPEA(7mg，0.056mmol)和N-琥珀酰亚氨基6-马来酰亚胺己酸酯(18mg，0.056mmol)，将反应混合物在室温下搅拌4小时。通过制备型HPLC纯化混合物，得到呈白色固体的化合物化合物9(15mg，收率25％)。
LC-MS(ESI):m/z 1041.1[M+H]+.
实施例3 TLR7/8免疫激动剂在H-TLR7 NFKB Reporter 293、H-TLR8 NFKB Reporter 293细胞系中的活性检测
本发明使用H-TLR7 NFKB Reporter 293(GM-C15426，吉满生物)、H-TLR8 NFKB Reporter293(GM-C15427，吉满生物)报告基因细胞检测TLR7/8免疫激动剂的TLR7、TLR8激活活性。当细胞内的TLR7、TLR8受体被结合并激活后，通过下游信号NF-κB向实验体系中释放荧光素酶，从而可以检测细胞的激活程度。
具体方法如下：使用96孔白色平底细胞培养板，每孔加入H-TLR7 NFKB Reporter293(GM-C15426，吉满生物)、H-TLR8 NFKB Reporter 293(GM-C15427，吉满生物)报告基因细胞3×104个，37℃贴壁生长过夜。第二天弃上清，加入对应浓度的TLR7/8免疫激动剂，置于37℃培养箱继续培养6小时。然后取出培养板，加入Bio-Glo(G7940,Promega)，使用酶标仪(Spectra,Molecular Devices)进行波长检测。
各化合物的TLR7活性见图4A、4B，TLR8活性见图4C、4D。从图4A可以看出，除化合物A1、化合物A3、化合物A6、化合物A11、化合物A8、化合物A4以外的化合物均可在H-TLR7 NFKB Reporter 293上检测出活性，说明仅化合物A1、化合物A3、化合物A6、化合物A11、化合物A8、化合物A4不是TLR7激动剂，其他化合物均为TLR7激动剂。此外，不同化合物的激活效力不同，例如化合物A20、化合物A21、化合物A9、化合物A10、化合物A5、化合物A16、化合物A22的TLR7活性较高，高于雷西莫特(Resiquimod，R848)，其余化合物的TLR7活性低于雷西莫特(Resiquimod，R848)。从图4B可以看出，化合物A13、化合物A18、化合物A19的TLR7活性较弱，化合物A17无TLR7活性。从图4C可以看出，化合物A11、化合物A8、化合物A6、化合物A5、化合物A3、化合物A1、化合物A20在H-TLR8 NFKB Reporter 293上检测出较高活性，活性高于雷西莫特(Resiquimod，R848)，化合物A21、化合物A10的TLR8活性低于雷西莫特(Resiquimod，R848)，其余化合物无TLR8活性。从图4D可以看出，化合物A13、化合物A17、化合物A18、化合物A19均无TLR8活性。
因此，化合物A2、化合物A12、化合物A14、化合物A15、化合物A16、化合物A9、化合物A22、化合物A23、化合物A24、化合物A25、化合物A13、化合物A18、化合物A19是TLR7激动剂，化合物A1、化合物A3、化合物A6、化合物A11、化合物A8是TLR8激动剂，化合物A5、化合物A20、化合物A21、化合物A10是TLR7/8双激动剂，其中化合物A5是比雷西莫特(Resiquimod，R848)活性更强的TLR7/8双激动剂。
实施例4偶联物的制备
4.1 hz1D9B10-化合物5的制备
具体方法如下：
(a)抗体hz1D9B10溶于PBS缓冲液。
(b)加入还原剂溶液(TCEP,Aldrich,Catalog Number 646547,溶于水)，将反应混合物置于室温反应2小时，其中
(i)hz1D9B10的最佳浓度为5-10mg/mL，
(ii)TCEP/mAb的最佳摩尔比为2.0，
(iii)反应的最佳温度为25℃，
(iv)反应的最佳pH值为6.0到8.0之间。
(c)加入过量的连接子-毒素(化合物5,溶解在DMSO中)，与步骤(b)中还原的抗体反应，反应混合物放置在室温2小时，其中
(i)化合物5/mAb的最佳摩尔比为6.0，
(ii)反应的最佳温度为25℃，
获得ADC粗产物。
(d)所得ADC粗产物经自旋脱盐、超滤或透析纯化得到最终ADC产物。
(e)采用RP-HPLC、LC-MS和SEC HPLC对ADC产品进行检测，确定DAR平均值为4和SEC纯度。
4.2 hz1D9B10-化合物6的制备
具体方法如下：
(a)抗体hz1D9B10溶于PBS缓冲液。
(b)加入还原剂溶液(TCEP,Aldrich,Catalog Number 646547,溶于水)，将反应混合物置于室温反应2小时，其中
(i)hz1D9B10的最佳浓度为5-10mg/mL，
(ii)TCEP/mAb的最佳摩尔比为2.0，
(iii)反应的最佳温度为25℃，
(iv)反应的最佳pH值为6.0到8.0之间。
(c)加入过量的连接子-毒素(化合物6,溶解在DMSO中)，与步骤(b)中还原的抗体反应，反应混合物放置在室温2小时，其中
(i)化合物6/mAb的最佳摩尔比为6.0，
(ii)反应的最佳温度为25℃，
获得ADC粗产物。
(d)所得ADC粗产物经自旋脱盐、超滤或透析纯化得到最终ADC产物。
(e)采用RP-HPLC、LC-MS和SEC HPLC对ADC产品进行检测，确定DAR平均值为4和SEC纯度。
4.3 hz1D9B10-化合物7的制备
具体方法如下：
(a)抗体hz1D9B10溶于PBS缓冲液。
(b)加入还原剂溶液(TCEP,Aldrich,Catalog Number 646547,溶于水)，将反应混合物置于室温反应2小时，其中
(i)hz1D9B10的最佳浓度为5-10mg/mL，
(ii)TCEP/mAb的最佳摩尔比为2.0，
(iii)反应的最佳温度为25℃，
(iv)反应的最佳pH值为6.0到8.0之间。
(c)加入过量的连接子-毒素(化合物7,溶解在DMSO中)，与步骤(b)中还原的抗体反应，反应混合物放置在室温2小时，其中
(i)化合物7/mAb的最佳摩尔比为6.0，
(ii)反应的最佳温度为25℃，
获得ADC粗产物。
(d)所得ADC粗产物经自旋脱盐、超滤或透析纯化得到最终ADC产物。
(e)采用RP-HPLC、LC-MS和SEC HPLC对ADC产品进行检测，确定DAR平均值为4和SEC纯度。
4.4 hz1D9B10-化合物8的制备
具体方法如下：
(a)抗体hz1D9B10溶于PBS缓冲液。
(b)加入还原剂溶液(TCEP,Aldrich,Catalog Number 646547,溶于水)，将反应混合物置于室温反应2小时，其中(i)hz1D9B10的最佳浓度为5-10mg/mL，
(ii)TCEP/mAb的最佳摩尔比为2.0，
(iii)反应的最佳温度为25℃，
(iv)反应的最佳pH值为6.0到8.0之间。
(c)加入过量的连接子-毒素(化合物8,溶解在DMSO中)，与步骤(b)中还原的抗体反应，反应混合物放置在室温2小时，其中
(i)化合物8/mAb的最佳摩尔比为6.0，
(ii)反应的最佳温度为25℃，
获得ADC粗产物。
(d)所得ADC粗产物经自旋脱盐、超滤或透析纯化得到最终ADC产物。
(e)采用RP-HPLC、LC-MS和SEC HPLC对ADC产品进行检测，确定DAR平均值为4和SEC纯度。
4.5 hz1D9B10-化合物9的制备
具体方法如下：
(a)抗体hz1D9B10溶于PBS缓冲液。
(b)加入还原剂溶液(TCEP,Aldrich,Catalog Number 646547,溶于水)，将反应混合物置于室温反应2小时，其中
(i)hz1D9B10的最佳浓度为5-10mg/mL，
(ii)TCEP/mAb的最佳摩尔比为2.0，
(iii)反应的最佳温度为25℃，
(iv)反应的最佳pH值为6.0到8.0之间。
(c)加入过量的连接子-毒素(化合物9,溶解在DMSO中)，与步骤(b)中还原的抗体反应，反应混合物放置在室温2小时，其中
(i)化合物9/mAb的最佳摩尔比为6.0，
(ii)反应的最佳温度为25℃，
获得ADC粗产物。
(d)所得ADC粗产物经自旋脱盐、超滤或透析纯化得到最终ADC产物。
(e)采用RP-HPLC、LC-MS和SEC HPLC对ADC产品进行检测，确定DAR平均值为4和SEC纯度。
4.6 IgG-化合物6的制备
具体方法如下：
(a)抗体isotype control(同型对照)IgG1溶于PBS缓冲液。
(b)加入还原剂溶液(TCEP,Aldrich,Catalog Number 646547,溶于水)，将反应混合物置于室温反应2小时，其中
(i)isotype control IgG1的最佳浓度为5-10mg/mL，
(ii)TCEP/mAb的最佳摩尔比为2.0，
(iii)反应的最佳温度为25℃，
(iv)反应的最佳pH值为6.0到8.0之间。
(c)加入过量的连接子-毒素(化合物6,溶解在DMSO中)，与步骤(b)中还原的抗体反应，反应混合物放置在室温2小时，其中
(i)化合物6/mAb的最佳摩尔比为6.0，
(ii)反应的最佳温度为25℃，
获得ADC粗产物。
(d)所得ADC粗产物经自旋脱盐、超滤或透析纯化得到最终ADC产物。
(e)采用RP-HPLC、LC-MS和SEC HPLC对ADC产品进行检测，确定DAR平均值为4和SEC纯度。
4.7 IgG-NT3的制备
具体方法如下：
(a)抗体isotype control(同型对照)IgG1溶于PBS缓冲液。
(b)加入还原剂溶液(TCEP,Aldrich,Catalog Number 646547,溶于水)，将反应混合物置于室温反应2小时，其中
(i)isotype control IgG1的最佳浓度为5-10mg/mL，
(ii)TCEP/mAb的最佳摩尔比为2.0，
(iii)反应的最佳温度为25℃，
(iv)反应的最佳pH值为6.0到8.0之间。
(c)加入过量的连接子-毒素(NT3，来自WO2021173773A1,溶解在DMSO中)，与步骤(b)中还原的抗体反应，反应混合物放置在室温2小时，其中
(i)NT3/mAb的最佳摩尔比为6.0，
(ii)反应的最佳温度为25℃，
获得ADC粗产物。
(d)所得ADC粗产物经自旋脱盐、超滤或透析纯化得到最终ADC产物。
(e)采用RP-HPLC、LC-MS和SEC HPLC对ADC产品进行检测，确定DAR平均值为4和SEC纯度。
4.8 hRS7-NT3的制备
通过如下方法制备下式的hRS7-NT3
其中A为hRS7，p’为约4.3。
(a)将抗体hRS7溶于PBS缓冲液(pH 7.4)；
(b)加入还原剂溶液(TCEP，Aldrich，Catalog Number 646547，溶于水)，将反应混合物置于室温反应2小时，其中：(i)hRS7的最佳浓度为5mg/mL，(ii)TCEP/mAb的最佳摩尔比为2.0，(iii)反应的最佳温度为25℃，(iv)反应的最佳pH值为6.0到8.0之间；
(c)加入过量的NT3(来自WO2021173773A1,溶解在DMSO中)，与步骤(a)中还原的抗体反应，反应混合物放置在室温2小时，其中：(i)NT3/mAb的最佳摩尔比为6.0，
(ii)反应的最佳温度为25℃，从而获得ADC粗产物；
(d)所得ADC粗产物经自旋脱盐、超滤或透析纯化得到最终ADC产物；
(e)采用RP-HPLC、LC-MS和SEC HPLC对ADC产品进行检测，确定DAR平均值和SEC纯度。
其中，DAR平均值为4.3，SEC纯度为98.42。
实施例5不同抗体-免疫激动剂偶联药物(Immune-Stimulating Antibody Conjugate，简称ISAC)在PBMC与肿瘤细胞共培养体系中的活性
用无CD16耗损的人单核细胞富集试剂盒(19058，STEMCELL)从人外周血单个核细胞(PBMC,TPCS)中分离单核细胞，按照1×107个/ml的密度重悬于含10％胎牛血清(FBS，SH30406.05，Hyclone)，0.1％β-巯基乙醇(21985023，Gibco)的RPMI-1640完全培养基(22400-071，Gibco)中，于96孔平底细胞培养板中每孔加入5×105个细胞。消化靶细胞FaDu(HTB-43，ATCC)，用上述培养基调整细胞密度至2×106个/ml，每孔加入1×105个细胞，随后加入各对应浓度的TROP2 ISAC或TROP2单克隆抗体，混合均匀后置于37℃培养箱培养18小时。取出细胞培养板，使用ELISA方法检测无细胞上清中IFNa分泌。结果如图5所示，hz1D9B10-化合物6、hz1D9B10-化合物7、hz1D9B10-化合物8作用下的IFNa分泌量均比hz1D9B10-化合物9少，说明hz1D9B10-化合物6、hz1D9B10-化合物7、hz1D9B10-化合物8的体外活性弱于hz1D9B10-化合物9。
实施例6 TROP2-ISAC在NCI-N87模型中的治疗作用
6.1 hz1D9B10-化合物7、hz1D9B10-化合物9在NCI-N87模型中的治疗作用
本实验采用NCI-N87细胞接种CB17-SCID小鼠测定本发明的TROP2-ISAC抗体的抗肿瘤作用。
CB17-SCID小鼠：
雌性CB17-SCID背景的小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司,等级为SPF级，质检单位为北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证编号为NO.110011221100703563。小鼠到达后检疫适应3天，随后开始研究。
细胞：
NCI-N87细胞购自ATCC(CAT#:CRL-5822)，并严格按照说明书进行常规传代培养用于后续体内实验。离心收集细胞，在无菌PBS中重悬细胞并调整细胞密度为10×106个/ml。在第0天取0.2ml细胞悬液皮下接种至CB17-SCID小鼠右侧腹部区域中来建立NCI-N87荷瘤小鼠模型。
给药：
肿瘤细胞接种8天后检测各只小鼠瘤体积，挑选出瘤体积在约78-138mm3之间的小鼠按瘤体积平均分组(每组6只小鼠)，给药剂量和方式如表8所示，h-IgG(购自EQUITECH-BIO)作为阴性对照，在接种后第8天给药，每周2次监测小鼠瘤体积与体重。在每次给药前测定体重和肿瘤体积，接种后第26天计算相对肿瘤抑制率(TGI％)，计算公式如下：TGI％＝100％*(对照组肿瘤体积–治疗组肿瘤体积)/(对照组肿瘤体积–对照组给药前肿瘤体积)。肿瘤体积测定：采用游标卡尺测定肿瘤的最大长轴(L)和最大宽轴(W)，肿瘤体积按如下公式计算：V＝L×W2/2。采用电子天平测定体重。
表8.实验设计
hz1D9B10\hz1D9B10-化合物7\hz1D9B10-化合物9组的肿瘤抑制率为8.44％\104％\113％，hz1D9B10-化合物7和hz1D9B10-化合物9的抑瘤效果相当，都能显著抑制肿瘤生长，药效结果如图6A和表9所示。同时我们对小鼠体重进行监测，结果如图6B所示，小鼠体重无显著差异。因此，本发明中TROP2-ISAC药物对肿瘤有明显的抑制效果，并且小鼠一般状况良好，说明副反应或脱靶效应不明显。
表9.第26天肿瘤抑制率
6.2 hz1D9B10-化合物5、hz1D9B10-化合物8、hz1D9B10-化合物6在NCI-N87模型中的治疗作用
本实验采用NCI-N87细胞接种CB17-SCID小鼠测定本发明的TROP2-ISAC抗体的抗肿瘤作用。
CB17-SCID小鼠：
雌性CB17-SCID背景的小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司,等级为SPF级，质检单位为北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证编号为NO.110011221104924762。小鼠到达后检疫适应3天，随后开始研究。
细胞：
NCI-N87细胞购自ATCC(CAT#:CRL-5822)，并严格按照说明书进行常规传代培养用于后续体内实验。离心收集细胞，在无菌PBS中重悬细胞并调整细胞密度为10×106个/ml。在第0天取0.2ml细胞悬液皮下接种至CB17-SCID小鼠右侧腹部区域中来建立NCI-N87荷瘤小鼠模型。
给药：
肿瘤细胞接种8天后检测各只小鼠瘤体积，挑选出瘤体积在约100-122mm3之间的小鼠按瘤体积平均分组(每组6只小鼠)，给药剂量和方式如表10所示，h-IgG(购自EQUITECH-BIO)作为阴性对照，在接种后第8天给药，每周2次监测小鼠瘤体积与体重。在每次给药前测定体重和肿瘤体积，接种后第25天计算相对肿瘤抑制率(TGI％)，计算公式如下：TGI％＝100％*(对照组肿瘤体积–治疗组肿瘤体积)/(对照组肿瘤体积–对照组给药前肿瘤体积)。肿瘤体积测定：采用游标卡尺测定肿瘤的最大长轴(L)和最大宽轴(W)，肿瘤体积按如下公式计算：V＝L×W2/2。采用电子天平测定体重。
表10.实验设计
hz1D9B10-化合物8\hz1D9B10-化合物6\hz1D9B10-化合物5组的肿瘤抑制率为92.67％\116.78％\112.73％，药效结果如图6C和表11所示。同时我们对小鼠体重进行监测，结果如图6D所示，小鼠体重无显著差异。因此，本发明中TROP2-ISAC药物对肿瘤有明显的抑制效果，并且小鼠一般状况良好，说明副反应或脱靶效应不明显。
表11.第25天肿瘤抑制率
实施例7 TROP2-ISAC在BxPC3模型中的治疗作用
本实验采用BxPC3细胞接种CB17-SCID小鼠测定本发明的TROP2-ISAC抗体的抗肿瘤作用。
CB17-SCID小鼠：
雌性CB17-SCID背景的小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司,等级为SPF级，质检单位为北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证编号为NO.110011221110560000。小鼠在到达后驯化3天，随后开始研究。
细胞：
BxPC3细胞购自中科院细胞库(CAT#:TCHu012)，并严格按照说明书进行常规传代培养用于后续体内实验。离心收集细胞，在无菌PBS中重悬细胞并调整细胞密度为15×106个/ml。在第0天取0.2ml细胞悬液皮下接种至CB17-SCID小鼠右侧腹部区域中来建立BxPC3荷瘤小鼠模型。
给药：
肿瘤细胞接种11天后检测各只小鼠瘤体积，挑选出瘤体积在约76-122mm3之间的小鼠按瘤体积平均分组(每组7只小鼠)，给药剂量和方式如表12所示，h-IgG(购自EQUITECH-BIO)作为阴性对照，在接种后第11天给药，每周2次监测小鼠瘤体积与体重。在每次给药前测定体重和肿瘤体积，接种后第35天计算相对肿瘤抑制率(TGI％)，计算公式如下：TGI％＝100％*(对照组肿瘤体积–治疗组肿瘤体积)/(对照组肿瘤体积–对照组给药前肿瘤体积)。肿瘤体积测定：采用游标卡尺测定肿瘤的最大长轴(L)和最大宽轴(W)，肿瘤体积按如下公式计算：V＝L×W2/2。采用电子天平测定体重。
表12.实验设计
肿瘤抑制率结果如图7A和表13所示：在接种后第35天hz1D9B10-化合物6\hz1D9B10-化合物9组的肿瘤抑制率为155％\150％，药效结果如图7A和表13所示。同时我们对小鼠体重进行监测，结果如图7B所示，小鼠体重无显著差异。因此，本发明中TROP2-ISAC药物对肿瘤有明显的抑制效果，并且小鼠一般状况良好，说明副反应或脱靶效应不明显。
表13.第35天肿瘤抑制率
实施例8 TROP2-ISAC在BALB/C小鼠中的毒性研究
8.1 hz1D9B10-化合物7、hz1D9B10-化合物9的毒性研究
本实验采用BALB/C小鼠,通过间隔7天静脉注射两次TROP2-ISAC药物观察小鼠体温变化与死亡情况测定药物的毒性大小。
BALB/C鼠：
雌性BALB/C小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司,等级为SPF级，质检单位为北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证编号为110011221105222536，小鼠购自维通利华小鼠在到达后驯化3天，随后开始研究。
给药：
按表14实验设计分组、称重，分别在第0、7天静脉注射TROP2-ISAC药物，然后在第7天给药前测量初始小鼠直肠温度，以及给药后的20min\40min\60min小鼠直肠温度。
表14.实验设计
直肠温度结果如图8A和表15所示：在D7第二次给药后，TROP2-化合物7组的小鼠直肠温度在60min时下降到29.88℃，TROP2-化合物9组的小鼠直肠温度在60min时下降到31.18℃。因此，间隔7天给药TROP2-化合物7、TROP2-化合物9对BALB/C小鼠有毒性作用。
表15.第7天给药前及给药后小鼠直肠温度
8.2 hz1D9B10-化合物5、hz1D9B10-化合物8、hz1D9B10-化合物6的毒性研究
本实验采用BALB/C小鼠,通过间隔7天静脉注射两次TROP2-ISAC药物观察小鼠体温变化与死亡情况测定药物的毒性大小。
BALB/C鼠：
雌性BALB/C小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司,等级为SPF级，质检单位为北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证编号为110011221105981185，小鼠购自维通利华小鼠在到达后驯化3天，随后开始研究。
给药：
按表16实验设计分组、称重，分别在第0、7天静脉注射TROP2-ISAC药物，然后在第7天给药前测量初始小鼠直肠温度，以及给药后的20min\40min\60min小鼠直肠温度。
表16.实验设计
直肠温度结果如图8B和表17所示：在D7第二次给药后，只有TROP2-化合物5组的小鼠直肠温度在60min时下降到35.9℃，其他组温度未发生明显下降。因此，间隔7天给药TROP2-化合物8、TROP2-化合物6对BALB/C小鼠没有毒性作用。
表17.第7天给药前及给药后小鼠直肠温度
实施例9 TROP2-ISAC在hTROP2 KI小鼠中的毒性作用
本实验采用hTROP2 KI小鼠,通过静脉注射两次TROP2-ISAC药物观察小鼠体温变化与死亡情况测定药物的毒性大小。
hTROP2 KI转基因鼠：
雌性hTROP2 KI(B-hTROP2)小鼠购自百奥赛图江苏基因生物技术有限公司，,等级为SPF级，质检单位为苏州西山生物技术有限公司，合格证编号为3207262221100150728，小鼠购自百奥赛图小鼠在到达后驯化3天，随后开始研究。
给药：
按表18实验设计分组、称重，分别在第0、7天静脉注射TROP2-ISAC药物，然后在第7天给药前测量初始小鼠直肠温度，以及给药后的20min\40min\60min小鼠直肠温度。
表18.实验设计
直肠温度结果如图9和表19所示：在D7第二次给药后，TROP2-化合物8组的小鼠直肠温度在60min时下降到34.55℃，TROP2-化合物9组的小鼠直肠温度在60min时下降到29.20℃，TROP2-化合物6组温度未发生明显下降。因此，间隔7天给药TROP2-化合物6-10mg/kg对hTROP2 KI小鼠没有毒性作用。
表19.第7天小鼠直肠温度
实施例10 hz1D9B10-化合物6(以下简称偶联物A)重复静脉输注给予食蟹猴4周的剂量探索试验
本试验在昭衍(苏州)新药研究中心有限公司完成。研究的目的是评价偶联物A每2周或1周1次、连续4周(共3次)静脉输注/皮下注射给予食蟹猴可能出现的毒性反应，判断毒性靶器官，考察偶联物A的免疫原性及在体内的暴露水平。
本试验共使用8只食蟹猴(4只/性别)，分性别区段按照体重随机分为4个组。第1和2组动物分别给予10和30mg/kg的偶联物A，每2周给药1次，静脉输注给药，共给药3次，给药容量为5mL/kg，给药速度约为10mL/kg/h，给药时间约30min。第3组动物给予15mg/kg的偶联物A，每周给药1次，静脉输注给药，共给药4次，给药容量为5mL/kg，给药速度约为10mL/kg/h，给药时间约30min。第4组动物给予30mg/kg的偶联物A，每2周给药一次，皮下注射给药，共给药3次，给药容量为2mL/kg。第1、2、4组存活的动物于末次药后7天(D36)解剖，第3组存活的动物于末次药后7天(D29)解剖。
试验期间，对动物进行临床观察、体重、食量、体温、眼科、临床病理(血细胞计数、凝血功能、血液生化)、免疫细胞表型、细胞因子、循环免疫复合物CIC、抗药抗体大体解剖、脏器称重和组织病理学的检查，同时对动物进行ISAC(偶联物A)、总抗(偶联物A总抗体)及来自偶联物A中小分子(payload,linker-payload,cys-linker-payload)含量的测定并进行毒代动力学分析。
在本试验条件下，30mg/kg静脉输注以及皮下注射组的雌性动物均濒死或发现死亡。15mg/kg剂量组(静脉给药QW)雌性动物可见体重降低。此外，各组动物主要可见食量降低，免疫相关毒性(WBC、Neut、Lymph、CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD20+先降低后升高或者恢复，Mono、IgG、IgM、MCP-1、IP-10、IL-6升高)，肾脏相关毒性，红细胞相关指标的改变(RBC、HGB持续降低)，以及凝血功能异常(死亡/濒死动物可见牙龈/面颊苍白、牙龈出血、皮肤红斑、PLT降低，凝血/生化指标无法检测到数值；其余动物可见Retic升高)。最高非严重毒性剂量(HNSTD)为15mg/kg(静脉输注QW)。
首次给药后，低、高剂量组动物血清中偶联物A、偶联物A总抗体的药物峰浓度(Cmax)及药物暴露量(AUClast)随给药剂量的增加而增加。皮下注射给予30mg/kg的偶联物A，首次给药后，偶联物A在雄性及雌性动物中的生物利用度(AUClast，皮下组/AUClast，静脉组)分别为69％及98％，偶联物A总抗体在雄性及雌性动物中的生物利用度分别为60％及89％。重复给药后，可能由于抗药抗体的产生，血药浓度下降较快，计算的参数和比值仅供参考。首次给药后，动物体内偶联物A的药物峰浓度(Cmax)和药物暴露量(AUClast)与偶联物A总抗体基本一致。
各组动物偶联物A和偶联物A总抗体毒代动力学参数结果如下：
表20.偶联物A和偶联物A总抗体毒代动力学参数
注：15mg/kg的AUClast*统计的是0-168h，10mg/kg和30mg/kg统计的是0-336h。
实施例11 TROP2-ISAC在CT26-hTROP2模型中的治疗作用
本实验采用CT26-hTROP2细胞接种BALB/C小鼠测定本发明的TROP2-ISAC的抗肿瘤作用。
BALB/C小鼠：
雌性BALB/C小鼠购自浙江维通利华实验动物技术有限公司，等级为SPF级，质检单位为北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证编号为NO.20230510Abzz0619000585。小鼠在到达后驯化3天，随后开始研究。
细胞：
CT26-hTROP2细胞由信达生物构建，并进行常规传代培养用于后续体内实验。离心收集细胞，在无菌PBS中重悬细胞并调整细胞密度为5×106个/ml。在第0天取0.2ml细胞悬液皮下接种至BALB/C小鼠右侧腹部区域中来建立CT26-hTROP2荷瘤小鼠模型。
给药：
肿瘤细胞接种8天后检测各只小鼠瘤体积，挑选出瘤体积在约100mm3左右的小鼠按瘤体积平均分组(每组7只小鼠)，给药剂量和方式如表21所示，h-IgG(购自EQUITECH-BIO)作为阴性对照，分别在接种后第8、11、15、18天给药，每周2次监测小鼠瘤体积与体重。在每次给药前测定体重和肿瘤体积，接种后第22天计算相对肿瘤抑制率(TGI％)，计算公式如下：TGI％＝100％*(对照组肿瘤体积–治疗组肿瘤体积)/(对照组肿瘤体积–对照组给药前肿瘤体积)。肿瘤体积测定：采用游标卡尺测定肿瘤的最大长轴(L)和最大宽轴(W)，肿瘤体积按如下公式计算：V＝L×W2/2。采用电子天平测定体重。
表21.实验设计
药效结果如图10A和表22所示，在接种后第22天hz1D9B10-化合物6的肿瘤抑制率为52％。同时我们对小鼠体重进行监测，结果如图10B所示，小鼠体重无显著差异。小鼠存活率结果如图10C所示，hz1D9B10-化合物6没有引起小鼠死亡。因此，本发明中TROP2-ISAC药物对肿瘤有明显的抑制效果，并且小鼠一般状况良好，无明显副反应。
表22.第22天肿瘤抑制率
实施例12 TROP2-ISAC联合TROP2-ADC在BxPC3模型中的治疗作用
本实验采用BxPC3细胞接种CB17-SCID小鼠测定TROP2-ISAC联合TROP2-ADC的抗肿瘤作用。
CB17-SCID鼠：
雌性CB17-SCID小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，等级为SPF级，质检单位为北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证编号为NO.110011230103807533。小鼠在到达后驯化3天，随后开始研究。
细胞：
BxPC3细胞购自中科院细胞库(CAT#:TCHu012)，并严格按照说明书进行常规传代培养用于后续体内实验。离心收集细胞，在无菌PBS中重悬细胞并调整细胞密度为1.5×107个/ml。在第0天取0.2ml细胞悬液皮下接种至CB17-SCID小鼠右侧腹部区域中来建立BxPC3荷瘤小鼠模型。
给药：
肿瘤细胞接种13天后检测各只小鼠瘤体积，挑选出瘤体积在约100mm3左右的小鼠按瘤体积平均分组(每组7只小鼠)，给药剂量和方式如表23所示，在接种后第13天给药，每周2次监测小鼠瘤体积与体重。在每次给药前测定体重和肿瘤体积，接种后第59天计算相对肿瘤抑制率(TGI％)，计算公式如下：TGI％＝100％*(对照组肿瘤体积–治疗组肿瘤体积)/(对照组肿瘤体积–对照组给药前肿瘤体积)。肿瘤体积测定：采用游标卡尺测定肿瘤的最大长轴(L)和最大宽轴(W)，肿瘤体积按如下公式计算：V＝L×W2/2。采用电子天平测定体重。
表23.实验设计
药效结果如图11A和表24所示：在接种后第59天，hz1D9B10-化合物6/TROP2 ADC(1mg/kg)/TROP2 ADC(5mg/kg)/hz1D9B10-化合物6+TROP2 ADC(1+1mg/kg)/hz1D9B10-化合物6+TROP2 ADC(1+5mg/kg)的肿瘤抑制率分别为：37％/19％/44％/86％/106％。hz1D9B10-化合物6+TROP2 ADC联合组药效强于hz1D9B10-化合物6与TROP2 ADC单药组。同时对小鼠体重进行检测，结果如图11B所示，小鼠体重无显著差异。因此，TROP2-ISAC联合TROP2-ADC对BxPC3肿瘤有明显的协同抑制效果，且对小鼠无明显毒副作用。
其中TROP2-ADC为以上实施例4.8制备的hRS7-NT3。
表24.第59天肿瘤抑制率
实施例13 TROP2-ISAC联合TROP2-ADC在LK-2模型中的治疗作用
本实验采用LK-2细胞接种CB17-SCID小鼠测定TROP2-ISAC联合TROP2-ADC的抗肿瘤作用。
CB17-SCID鼠：
雌性CB17-SCID小鼠购自北京维通利华股份有限公司，等级为SPF级，质检单位为北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证编号为NO.110011231104065475。小鼠在到达后驯化3天，随后开始研究。
细胞：
LK-2细胞购自南京科佰(CAT#:CBP60105)，并严格按照说明书进行常规传代培养用于后续体内实验。离心收集细胞，在无菌PBS中重悬细胞并调整细胞密度为1.5×107个/mL。在第0天取0.2mL细胞悬液皮下接种至CB17-SCID小鼠右侧腹部区域中来建立LK-2荷瘤小鼠模型。
给药：
肿瘤细胞接种9天后检测各只小鼠瘤体积，挑选出瘤体积在约120mm3左右的小鼠按瘤体积平均分组(每组7只小鼠)，给药剂量和方式如表25所示，h-IgG(购自EQUITECH-BIO)作为阴性对照，分别在接种后第9、19、29天给药，每周2次监测小鼠瘤体积与体重。在每次给药前测定体重和肿瘤体积，接种后第36天计算相对肿瘤抑制率(TGI％)，计算公式如下：TGI％＝100％*(对照组肿瘤体积–治疗组肿瘤体积)/(对照组肿瘤体积–对照组给药前肿瘤体积)。肿瘤体积测定：采用游标卡尺测定肿瘤的最大长轴(L)和最大宽轴(W)，肿瘤体积按如下公式计算：V＝L×W2/2。采用电子天平测定体重。
表25.实验设计
药效结果如图12A和表26所示：在接种后第36天，hz1D9B10-化合物6，TROP2 ADC和hz1D9B10-化合物6+TROP2 ADC的肿瘤抑制率分别为：29％，17％和63％.联合组药效强于单药组。同时对小鼠体重进行检测，结果如图12B所示，小鼠体重无显著差异。因此，TROP2-ISAC联合TROP2-ADC对LK-2肿瘤有明显的协同抑制效果，且对小鼠无明显毒副作用。
其中TROP2-ADC为以上实施例4.8制备的hRS7-NT3。
表26.第36天肿瘤抑制率
实施例14 TROP2-ISAC在BALB/C小鼠中的高剂量毒性研究
本实验采用BALB/C小鼠,通过间隔7天静脉注射两次TROP2-ISAC药物观察小鼠体温变化与死亡情况测定药物的毒性大小。
BALB/C鼠：
雌性BALB/C小鼠购自北京维通利华股份有限公司，等级为SPF级，质检单位为北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证编号为110011221111661541。小鼠在到达后驯化3天，随后开始研究。
给药：
按表27实验设计分组、称重，每组5只，h-IgG(购自EQUITECH-BIO)作为阴性对照，分别在第0、7天静脉注射TROP2-ISAC药物，然后在第7天给药前测量初始小鼠直肠温度，以及给药后的30min\60min测量小鼠直肠温度。
表27.实验设计
直肠温度结果如图13A和表28所示：在第7天给药后，hz1D9B10-化合物6,5mg/kg、hz1D9B10-化合物6,15mg/kg、hz1D9B10-化合物6,45mg/kg的直肠温度与给药前相比没有下降。同时我们对小鼠存活率进行统计，结果如图13B所示，给予不同剂量的hz1D9B10-化合物6没有引起小鼠死亡。因此，间隔7天给药高剂量hz1D9B10-化合物6对BALB/C小鼠没有毒性作用。
表28.第7天给药前及给药后小鼠直肠温度

实施例15展示库制备抗FRα抗体
实验策略：以噬菌体展示技术为依托，从信达自有知识产权的humanscFv library中用human FOLR1(FRα)淘选两轮，随后将淘选的文库抽提质粒。通过PCR的方式将文库片段转移至酵母系统，进而进一步获得功能强的分子。
15.1噬菌体展示抗体淘选
取出冻存的humanscFv library重组噬菌体在室温条件下溶解，根据展示IgM/IgG抗体类型的不同将文库合成6个子文库，PBST(PBS+0.05％ Tween 20)加入4％ BSA过滤除菌配制成封闭液。分别取出2x1012的重组噬菌体室温振荡封闭1小时，同时取出DynabeadsTMM-280(Invitrogen)同样室温振荡封闭1小时。使用已封闭的磁珠加入封闭好的重组phage室温振荡1小时来达到负筛的目的，将离心管放入磁力架吸附磁珠，吸取重组噬菌体转移至新的离心管中，加入30pmol的生物素化的Human FOLR1(Acro Biosystems)室温振荡结合1.5小时。抗原-重组噬菌体复合物中加入封闭好的磁珠进行吸附，室温振荡0.5小时，使用PBST缓冲液洗涤8次，收集磁珠加入0.5ml甘氨酸洗脱液室温振荡10分钟，置于磁力架吸附磁珠，移出上清并加入Tris进行PH中和。侵染TG1感受态细胞后吸取100ul稀释涂板测定文库大小，离心去除过多培养基，涂布于2xYT(2％葡萄糖)大平板进行过夜30℃培养用于文库刮板制备重组噬菌体。
15.2重组噬菌体制备
将一轮筛选的产出output从培养板上刮下，取一部分菌液投入到2xTY(2％葡萄糖)液体培养板中，使其OD600＝0.1，37℃，220rpm培养，使其OD600＝0.5。加入适量的辅助噬菌体M13K07(PROGEN)侵染1小时，离心收集菌体重悬到2xTY(2％葡萄糖)培养基，30℃过夜培养。过夜培养的菌液离心去除沉淀，将上清中加入1/4体积的PEG/Nacl，冰上静置1h，离心20min,去除上清，保留沉淀，加入PBS重悬，检测噬菌体的滴度，完成重组噬菌体制备。
使用human FOLR1进行2轮的phage panning，文库能够富集到约109的水平，挑取570个单克隆进行ELISA验证human FOLR1和cyno FOLR1的结合能力，结果显示cross binder达到48％的水平，可以进行下一步phage to yeast。收集第二轮的文库刮板菌液约8x108个大肠杆菌进行质粒抽提，NanoDropTM 2000测定质粒的浓度，冻存保藏用于后续的酵母文库构建。
15.3酵母展示文库构建
基于humanscFv library抗体序列设计混合引物，以噬菌体展示技术淘选后的文库抽提质粒为模板，分别扩增展示IgM/IgG抗体类型文库scFv片段。以酵母展示质粒pYDC011为模板扩增上下游同源臂长度约150bp，使用overlap PCR技术进行扩增片段全长约1200bp，同时使用限制性内切酶BamH I处理质粒pYDC011，得到线性化载体。将全长片段以及线性化载体使用电穿孔仪(BioRad)同时混合转化进酿酒酵母EBY100(购自ATCC)，获得经转化的酿酒酵母，转接至对应的液体缺陷培养基中过夜培养，同时梯度稀释涂布缺陷培养基平板进行文库大小鉴定，以及送往测序进行文库质量QC，过夜培养筛选成功转化后的菌群用于文库筛选。
15.4酵母展示文库诱导
过夜培养的酵母文库进行离心收集菌体，使用预冷的PBSA(PBS+0.1％BSA)缓冲液重悬离心洗涤两次，收集菌体转接适量体积YPGP诱导培养基(2％半乳糖，2％蛋白胨，1％酵母提取物，0.54％Na2HPO4,0.86％ NaH2PO4.H2O)20℃过夜诱导72h使得文库scFv抗体片段展示在酵母表面，用于后续的文库染色筛选。
15.5酵母展示文库筛选
使用流式细胞仪(BD)进行酵母文库的分选：将经过缺陷培养基筛选后获得约1x108的酵母细胞用PBSA缓冲液洗三次，于含有生物素标记的human FOLR1抗原以及Mouse anti Flag M2(sigma)中室温下振荡孵育1小时。弃去培养液，细胞用PBSA缓冲液洗脱两次，并与SA-PE(Thermo Fisher)和Goat Anti Mouse-647(Thermo Fisher)试剂混合，室温振荡孵育20分钟。用预冷的PBSA缓冲液洗脱两次，并重悬于适量体积的PBSA缓冲液中，将细胞过40um筛网后转移至流式上样管中，使用BD FACSAriaTM圈取阳性菌群，分选阳性酵母细胞并转接至液体缺陷培养基中过夜培养。
15.6酵母展示文库筛选的克隆鉴定
将FACS分选富集三次的菌群进行涂布缺陷培养基平板，30℃培养72小时至长出单克隆，挑取适量单克隆接种至液体缺陷培养基中活化扩增，取一部分菌液送往测序，剩余菌液离心弃上清，转接至YPGP诱导培养72小时，使用低浓度生物素标记的human FOLR1抗原以及Mouse anti Flag M2(sigma)中室温下振荡孵育1小时。弃去培养液，细胞用PBSA缓冲液洗脱两次，并与SA-PE(Thermo Fisher)和Goat Anti Mouse-647(Thermo Fisher)试剂混合，室温振荡孵育20分钟。用预冷的PBSA缓冲液洗脱两次，并重悬于适量体积的PBSA缓冲液中，将细胞过40um筛网后转移至流式上样管中，使用FACS进行单克隆信号分析，PE的信号代表和human FOLR1抗原结合的强度。
15.7酵母测序及蛋白表达
挑选信号较高的酵母单克隆送至金唯智进行测序，随后对序列分析。将潜在的分子的DNA序列扩增至真核表达载体pcDNA3.1并连接到轻链恒定区编码基因和IgG1重链恒定区编码基因而构建)中。构建成功的质粒可转染真核细胞进行抗体表达，得到全长抗体BC1254-A1。
实施例16.抗FRα抗体半胱氨酸突变改造与表达
为了获得更稳定强效的免疫偶联物分子，基于实施例15中BC1254-A1进行半胱氨酸突变改造，将BC1254-A1抗体两条轻链恒定区改造为携带有第160位和第166位(均根据EU编号)的氨基酸突变为半胱氨酸的lambda轻链恒定区。
抗体BC1254-A1和改造后的抗体BC1254-A1-V2的主要序列如下：
抗体序列信息：
16.1质粒构建：序列由金唯智基因合成，装载到pTT5载体上。
16.2蛋白表达：采用ExpiCHOTM Expression system(Gibco,A29133)表达系统生产蛋白，具体而言：根据所需转染体积传代ExpiCHO-STM细胞(Gibco)，转染前一天将细胞密度调整至3.5×106个细胞/ml。转染当天将细胞密度调整为6×106个细胞/ml。取一支50ml的离心管，按8％转染细胞体积加入转染缓冲试剂OptiPROTM SFM(Gibco,12309019)，按0.8μg/ml转染细胞计算总的所需质粒量，其中轻链:重链质粒质量比为1:1，利用0.22μm滤膜过滤含DNA质粒的转染缓冲液至另一个新的50ml离心管中,按DNA:Reagent＝1:4比例向过滤后的混合物中加入ExpiFectamineTM CHO reagent(Gibco,100033022)，充分混合，将转染试剂与质粒DNA混合后立即缓慢加到细胞中，边加边轻轻晃动摇瓶，控制转染试剂与质粒孵育的时间不要超过5min；37℃摇床培养，8％ CO2。18-22h后，按6μL/ml细胞体积加入Enhancer(Gibco，100033019)，300μl/ml细胞体积加入Feed(Gibco，A29101-01)，于37℃，120rpm，8％的CO2条件下培养。连续培养至第7天或者细胞活力≤60％时，收集细胞料液。将细胞料液与硅藻土(Sartorius，Cat 1000037025)混匀(1L细胞料液加40g硅藻土)，用0.22μm的一次性真空过滤装置进行过滤，上清用于接下来的亲和纯化。
16.3亲和层析纯化目的蛋白：选用HiTrap MabSelect PrismA(GE Healthcare，Cat#17549853)亲和层析柱进行亲和捕获，纯化前用10-20倍柱体积的0.1M NaOH流经管路及亲和层析柱，然后用10-20倍柱体积的蒸馏水清洗管路以及柱子，用5倍柱体积的1×PBS(Gibco)平衡填料柱；将过滤后的细胞料液通过柱子，再用10倍柱体积的1×PBS清洗填料柱，去除非特异性结合蛋白；用5倍柱体积的洗脱缓冲液(100mM sodium citrate，pH3.5)冲洗填料，收集洗脱液，用2M Tris调节pH至6.0，过滤除菌。
16.4抗体体外还原氧化：纯化的抗体加入适量GSH，用2M Tris调节反应pH至8.0。室温过夜。反应物换液至PBS中于4℃放置备用。
16.5离子交换层析纯化抗体：选用Mono S 5/50GL(获自GE Healthcare)离子交换层析柱，并置于AKTApure系统(获自GE healthcare)内。用0.5M NaOH对装备有Mono S 5/50GL离子交换层析柱的AKTApure系统除内毒素2小时，然后，用蒸馏水清洗系统以及柱子。使用5-10倍柱体积的上样缓冲液(20mM NaPO4,pH 6.6)平衡柱子，直至电导以及pH稳定；将亲和层析所获得的蛋白用上样缓冲液稀释10倍，然后上样；使用5倍柱体积的上样缓冲液再平衡；以洗脱缓冲液(20mM NaPO4,1M NaCl,pH 6.6)的含量为0-40％的梯度进行线性洗脱，共洗脱30个柱体积，根据紫外吸收值来收集样品。
利用大小排阻层析(size exclusion chromatography；SEC)检测收集的各级分管中样品的纯度。根据SEC结果将纯度大于95％的级分管中的样品合并。
将纯化后的抗体溶液使用15ml超滤离心管，4500转/分钟离心30分钟，使用PBS将蛋白稀释后继续离心，4500转/分钟离心30分钟，重复该操作几次，以更换缓冲液。将更换缓冲液后的抗体合并，测抗体浓度。进一步利用毛细管电泳(CE-SDS)和液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)相结合对抗体的成分和含量进行定性和定量。
实施例17 ForteBio测定抗体与抗原的亲和力
采用生物膜薄层干涉测定技术(ForteBio)测定本发明的抗FRα抗体结合人、猴和鼠的FRα的平衡解离常数(KD)。ForteBio亲和力测定按照现有的方法(Estep,P等人，High throughput solution Based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning.MAbs,2013.5(2):第270-8页)进行。
简言之，AHC(Sartorius，18-5060)传感器在分析缓冲液中线下平衡30分钟，然后线上检测60秒建立基线，在线加载如上所述获得的经纯化的抗体至AHC传感器(ForteBio)上进行ForteBio亲和测量。再将具有加载的抗体的传感器暴露于抗原FRα，之后将传感器转移至分析缓冲液用于解离速率测量。使用ForteBio分析软件分析KD值。抗原来源为：人(Acro，Cat#FO1-H82E2)、猴(Acro，Cat#FO1-C52H8)、小鼠(Acro，Cat#FO1-M5225)和大鼠(Sino，Cat#81073-R08H)。
抗体亲和力的检测结果如表29所示，抗体BC1254-A1对抗原FRα具有高亲和力，且突变后的抗体BC1254-A1 V2保持了针对抗原相当的平衡解离常数KD。
表29 ForteBio检测抗原抗体结合的亲和力常数(M)
备注：N D表示没有数据，N B表示没有结合。
Mirvetuximab为对照抗体，来自ImmunoGen公司，为FRαADC的抗体，序列及来源见美国专利申请公开号US20200362029A1(huMov19(or M9346A))。
FR57为对照抗体，来自ImmunoGen公司，序列及来源见美国专利申请公开号US20200362029A1
实施例18抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)功能检测
使用FcγRIIa-H报告细胞(G9871,Promega)检测FRα抗体的ADCP(Antibody-dependent cell-mediated phagocytosis)活性，该细胞是工程化改造的Jurkat T细胞，当该细胞表面的FcγRIIa被结合并激活后，通过下游信号NFAT(Nuclear Factor of Activated T)向实验体系中释放荧光素酶，从而可以检测细胞的激活程度。
具体方法如下：使用96孔白色平底细胞培养板，每孔加入靶细胞SKOV-3(HTB-77，ATCC)6×104个以及效应细胞FcγRIIa-H细胞3×104个，然后加入对应浓度的FRα单克隆抗体，置于37℃培养箱培养6小时。然后取出培养板，加入Bio-Glo(G7940,Promega)，使用酶标仪(Spark Multimode Microplate Reader,Tecan)进行波长检测。
结果如图14所示，克隆BC1254-A1的ADCP活性均优于mirvetuximab，适合用于ISAC(Immune-Stimulating Antibody Conjugate)的制备。
实施例19抗体的巨噬细胞内吞功能验证
使用诱导分化的人M1型巨噬细胞验证FRα抗体的ADCP活性，将巨噬细胞、靶细胞分别使用荧光标记，当两者借助抗体发生ADCP时，即可观察到双阳细胞群。
M1型巨噬细胞诱导分化：用无CD16耗损的人单核细胞富集试剂盒(19058，STEMCELL)从新鲜人外周血单个核细胞(PBMC,TPCS)中分离单核细胞，按照1×106个/ml的密度重悬于AIMMedium CTS(A3021002，Gibco)培养基，放置于细胞培养瓶中，37℃贴壁培养4小时。随后将培养基更换为AIMMedium CTS(A3021002，Gibco)+10％灭活胎牛血清(FBS，SH30406.05，Hyclone)+25ng/ml human MCSF1(216-MC-500，R&D)培养。随后的七天内，每隔三天使用培养基AIMMedium CTS(A3021002，Gibco)+10％灭活胎牛血清(FBS，SH30406.05，Hyclone)半换液一次。七天后使用培养基AIMMedium CTS(A3021002，Gibco)+10％灭活胎牛血清(FBS，SH30406.05，Hyclone)+100ng/ml IFNg(285-IF-100/CF，R&D)进行半换液，第二天进行巨噬细胞内吞实验。
巨噬细胞内吞实验：Accutase(A6964-500ML，Sigma)消化诱导分化后的巨噬细胞，使用含10％胎牛血清(FBS，SH30406.05，Hyclone)的RPMI-1640培养基(22400-071，Gibco)调整细胞密度，于96孔低吸附板中每孔加入1×105个细胞。将靶细胞SKOV-3(HTB-77，ATCC)使用CFSE(C34554，INVITROGEN)37℃标记10min，含10％胎牛血清(FBS，SH30406.05，Hyclone)的RPMI-1640培养基(22400-071，Gibco)洗两遍，于96孔低吸附板中每孔加入2.5×104个细胞。将靶细胞、巨噬细胞与梯度稀释的FRα抗体吹打混匀，置于37℃培养箱培养4小时。
流式染色：使用CD14 PE/Cy7(557742，BD)标记巨噬细胞后进行流式检测，检测PE/Cy7、CFSE双阳性区域细胞即为目标细胞群。
结果如图15所示，BC1254-A1抗体在SKOV-3存在时可诱导M1型巨噬细胞发生ADCP作用。
实施例20偶联物(FRαISAC和FRαADC)的制备
20.1 BC1254-A1 V2-化合物6的制备
具体方法如下：
(a)将抗体BC1254-A1 V2溶于组氨酸缓冲液(20mM，pH 6.5，Sigma,Lot#K5376054201)；
(b)加入还原剂溶液(TCEP，Aldrich，Catalog Number 646547，溶于水)，将反应混合物置于室温反应2小时，其中
(i)BC1254-A1 V2抗体的最佳浓度为5～15mg/mL；
(ii)TCEP/mAb的最佳摩尔比为10～20；
(iii)反应的最佳温度为25℃；
(iv)反应的最佳pH值为6.0～8.0。
(c)还原结束后，使用脱盐、超滤或透析纯化将还原剂除尽。
(d)加入氧化剂脱氢抗坏血酸(dhAA，Aldrich，Catalog Number 261556，溶于DMSO)(DMSO，Sigma，Catalog Number 276855)，水浴氧化2～3h，其中
(i)BC1254-A1 V2抗体的最佳浓度为5～15mg/mL；
(ii)dhAA/mAb的最佳摩尔比为20～40；
(iii)反应的最佳温度为20～37℃；
(iv)反应的最佳pH值为6.0～8.0。
(e)加入过量的连接子-毒素(化合物6，溶解在DMSO中)，与步骤(d)中的抗体反应，溶液
中DMSO的体积比为10％，反应混合物放置在室温1～2小时，其中
(i)化合物6/mAb的最佳摩尔比为6～8；
(ii)反应的最佳温度为20～37℃。
所得ISAC粗产物经自旋脱盐、超滤或透析纯化得到最终ISAC产物。
20.2 BC1254-A1-化合物6的制备
具体方法如下：
(a)抗体BC1254-A1溶于PBS缓冲液。
(b)加入还原剂溶液(TCEP,Aldrich,Catalog Number 646547,溶于水)，将反应混合物置于
室温反应2小时，其中
(i)BC1254-A1抗体的最佳浓度为5-10mg/mL，
(ii)TCEP/mAb的最佳摩尔比为2.0，
(iii)反应的最佳温度为25℃，
(iv)反应的最佳pH值为6.0到8.0之间。
(c)加入过量的连接子-毒素(化合物6,溶解在DMSO中)，与步骤(b)中还原的抗体反应，反应混合物放置在室温2小时，其中
(i)化合物6/mAb的最佳摩尔比为6.0，
(ii)反应的最佳温度为25℃，
所得ISAC粗产物经自旋脱盐、超滤或透析纯化得到最终ISAC产物。
20.3 FR57-DXd的制备
具体方法如下：
(a)抗体FR57溶于PBS缓冲液。
(b)加入还原剂溶液(TCEP,Aldrich,Catalog Number 646547,溶于水)，将反应混合物置于室温反应2小时，其中
(i)FR57的最佳浓度为5-10mg/mL，
(ii)TCEP/mAb的最佳摩尔比为10-20，
(iii)反应的最佳温度为37℃，
(iv)反应的最佳pH值为6.0到8.0之间。
(c)加入过量的MC-GGFG-DXd(MCE,HY-13631E,溶解在DMSO中)，与步骤(b)中还原的抗体反应，反应混合物放置在室温2小时，其中
(i)MC-GGFG-DXd/mAb的最佳摩尔比为10-12，
(ii)反应的最佳温度为25℃，
所得ADC粗产物经自旋脱盐、超滤或透析纯化得到最终ADC产物。
实施例21 FRαISAC的DAR分析
BC1254-A1 V2-化合物6样品用DTT(阿拉丁,Catalog Number D104860)进行还原处理，将反应混合物置于37℃反应0.5小时，其中
(i)ISAC的最终浓度是1mg/mL，
(ii)DTT/mAb的最佳摩尔比为200～300，
(iii)反应的最佳温度为25℃，
(iv)反应的最佳pH值为7.0到8.0之间。
使用RP-HPLC来测定BC1254-A1 V2-化合物6的平均DAR值，根据UV280nm处的各个峰的峰面积计算平均DAR值，相关参数见表30。
表30
图16表示用于BC1254-A1 V2-化合物6平均DAR值计算的RP-HPLC图。其中LC代表没有连接化合物6的轻链组分，LC+化合物6*1代表偶联上1个化合物6的轻链组分，LC+化合物6*2代表偶联上2个化合物6的轻链组分。HC代表没有连接化合物6的重链组分。经计算，BC1254-A1 V2-化合物6的平均DAR值为3.07。
使用HIC-HPLC来测定BC1254-A1-化合物6的平均DAR值，根据UV280nm处的各个峰的峰面积计算平均DAR值，相关参数见表31。
表31
图17表示用于BC1254-A1-化合物6平均DAR值计算的HIC-HPLC图。其中D0代表没有连接化合物6的抗体组分，D2代表偶联上2个化合物6的抗体组分，D4代表偶联上4个化合物6的抗体组分，D6代表偶联上6个化合物6的抗体组分，D8代表偶联上8个化合物6的抗体组分。经计算，BC1254-A1-化合物6的平均DAR值为3.54。
实施例22抗体改造前后以及偶联前后的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)功能检测
改造后的FRα抗体的ADCP活性使用FcγRIIa-H报告细胞进行检测，靶细胞为FRα高表达细胞系IGROV-1(CTCC-009-0048,Meisen)，检测方法同实施例18。
结果如图18所示，改造后的BC1254-A1 V2抗体的ADCP活性与改造前的BC1254-A1抗体相当，且BC1254-A1和BC1254-A1 V2抗体偶联前后的ADCP活性也相当，说明半胱氨酸突变改造及偶联过程并未影响抗体的ADCP功能。
实施例23抗体-免疫激动剂偶联药物(ISAC)在PBMC与肿瘤细胞共培养体系中的活性
用无CD16耗损的人单核细胞富集试剂盒(19058，STEMCELL)从人外周血单个核细胞(PBMC,TPCS)中分离单核细胞，按照1×107个/ml的密度重悬于含10％胎牛血清(FBS，SH30406.05，Hyclone)，0.1％β-巯基乙醇(21985023，Gibco)的RPMI-1640完全培养基(22400-071，Gibco)中，于96孔平底细胞培养板中每孔加入5×105个细胞。消化靶细胞SKOV-3(HTB-77，ATCC)，用上述培养基调整细胞密度至2×106个/ml，每孔加入1×105个细胞，随后加入各对应浓度的FRαISAC，混合均匀后置于37℃培养箱培养24小时。取出细胞培养板，使用ELISA方法检测细胞上清中有无IFNα和TNFα分泌。
结果如图19、图20所示，只在靶细胞SKOV-3存在时，FRαISAC才可以刺激IFNα和TNFα分泌，说明FRαISAC具有抗原依赖性的免疫刺激作用。
实施例24 FRα-ISAC在OV90模型中的治疗作用
本实验采用OV90细胞接种CB17-SCID小鼠测定本发明的FRα-ISAC的抗肿瘤作用。CB17-SCID小鼠：
雌性CB17-SCID背景的小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，等级为SPF级，质检单位为北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证编号为NO110011241100336441.。小鼠在到达后驯化3天，随后开始研究。
细胞：
OV90细胞购自浙江美森细胞科技有限公司(CAT#:CTCC-001-0363)，并严格按照说明书进行常规传代培养用于后续体内实验。离心收集细胞，在无菌PBS中重悬细胞并调整细胞密度为1.5×107个/ml。在第0天取0.2ml细胞悬液皮下接种至CB17-SCID小鼠右侧腹部区域中来建立OV90荷瘤小鼠模型。
给药：
肿瘤细胞接种7天后检测各只小鼠瘤体积，挑选出瘤体积在约130mm3左右的小鼠按瘤体积平均分组(每组6只小鼠)分组，给药剂量和方式如表32所示，IgG(购自EQUITECH-BIO)作为阴性对照，在接种后第7天给药，每周2次监测小鼠瘤体积与体重。在每次给药前测定体重和肿瘤体积，接种后第21天计算相对肿瘤抑制率(TGI％)，计算公式如下：TGI％＝100％*(对照组肿瘤体积–治疗组肿瘤体积)/(对照组肿瘤体积–对照组给药前肿瘤体积)。肿瘤体积测定：采用游标卡尺测定肿瘤的最大长轴(L)和最大宽轴(W)，肿瘤体积按如下公式计算：V＝L×W2/2。采用电子天平测定体重。
表32实验设计
药效结果如图21A和表33所示，在接种后第21天BC1254-A1-化合物6和BC1254-A1V2-化合物6组的肿瘤抑制率为27％和53％。同时我们对小鼠体重进行监测，结果如图21B所示，小鼠体重无显著差异。因此，本发明中BC1254-A1 V2-化合物6药物对肿瘤有明显的抑制效果，并且小鼠一般状况良好，说明副反应或脱靶效应不明显。
表33第21天肿瘤抑制率

实施例25 FRα-ISAC在A2780cisR-FRα模型中的治疗作用
本实验采用A2780cisR-FRα细胞接种CB17-SCID小鼠测定FRα-ISAC的抗肿瘤作用。CB17-SCID鼠：
雌性CB17-SCID背景的小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，等级为SPF级，质检单位为北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证编号为NO.20240318Abzz0619000270。小鼠在到达后驯化3天，随后开始研究。
细胞：
A2780cisR-FRα细胞由信达生物构建(不表达FRα的亲本顺铂抗性A2780-cisR卵巢癌细胞(CBP60283DR,南京科佰)，引入FRα稳定转染)，并进行常规传代培养用于后续体内实验。离心收集细胞，在无菌PBS中重悬细胞并调整细胞密度为2.5×107个/ml。在第0天取0.2ml细胞悬液皮下接种至CB17-SCID小鼠右侧腹部区域中来建立A2780cisR-FRα荷瘤小鼠模型。
给药：
肿瘤细胞接种9天后检测各只小鼠瘤体积，挑选出瘤体积在约100mm3左右的小鼠按瘤体积平均分组(每组6只小鼠，其中bevacizumab(Genentech)组4只)分组，给药剂量和方式如表34所示，IgG(购自EQUITECH-BIO)作为阴性对照，在接种后第9天给药，每周2次监测小鼠瘤体积与体重。在每次给药前测定体重和肿瘤体积，接种后第26天计算相对肿瘤抑制率(TGI％)，计算公式如下：TGI％＝100％*(对照组肿瘤体积–治疗组肿瘤体积)/(对照组肿瘤体积–对照组给药前肿瘤体积)。肿瘤体积测定：采用游标卡尺测定肿瘤的最大长轴(L)和最大宽轴(W)，肿瘤体积按如下公式计算：V＝L×W2/2。采用电子天平测定体重。
表34实验设计
药效结果如图22A和表35所示：在接种后第26天，低剂量BC1254-A1 V2-化合物6、高剂量BC1254-A1 V2-化合物6、paclitaxel和bevacizumab组的肿瘤抑制率分别为：74％、90％、63％和41％，BC1254-A1 V2-化合物6组药效强于paclitaxel和bevacizumab组。同时对小鼠体重进行检测，结果如图22B所示，除paclitaxel组外，小鼠体重无显著差异。因此，BC1254-A1 V2-化合物6药物对肿瘤有明显的抑制效果，并且小鼠一般状况良好，说明副反应或脱靶效应不明显。
表35第26天肿瘤抑制率
实施例26 FRα-ISAC联合FRα-ADC(FR57-DXd)在A2780cisR-FRα模型中的治疗作用
本实验采用A2780cisR-FRα细胞接种CB17-SCID小鼠测定FRα-ISAC联合FRα-ADC(FR57-DXd)的抗肿瘤作用。
CB17-SCID鼠：
雌性CB17-SCID背景的小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，等级为SPF级，质检单位为北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证编号为NO.110011241105958341。小鼠在到达后驯化3天，随后开始研究。
细胞：
A2780cisR-FRα细胞由信达生物构建，并进行常规传代培养用于后续体内实验。离心收集细胞，在无菌PBS中重悬细胞并调整细胞密度为2.5×107个/ml。在第0天取0.2ml细胞悬液皮下接种至CB17-SCID小鼠右侧腹部区域中来建立A2780cisR-FRα荷瘤小鼠模型。
给药：
肿瘤细胞接种16天后检测各只小鼠瘤体积，挑选出瘤体积在约100mm3左右的小鼠按瘤体积平均分组(每组5只小鼠)分组，给药剂量和方式如表36所示，IgG(购自EQUITECH-BIO)作为阴性对照，在接种后第16天给药，每周2次监测小鼠瘤体积与体重。在每次给药前测定体重和肿瘤体积，接种后第33天计算相对肿瘤抑制率(TGI％)，计算公式如下：TGI％＝100％*(对照组肿瘤体积–治疗组肿瘤体积)/(对照组肿瘤体积–对照组给药前肿瘤体积)。肿瘤体积测定：采用游标卡尺测定肿瘤的最大长轴(L)和最大宽轴(W)，肿瘤体积按如下公式计算：V＝L×W2/2。采用电子天平测定体重。
表36实验设计
药效结果如图23A和表37所示：在接种后第33天，BC1254-A1 V2-化合物6、FR57-DXd和BC1254-A1 V2-化合物6+FR57-DXd联合组的肿瘤抑制率分别为：71％、73％和102％。联合组药效强于单药组。同时对小鼠体重进行检测，结果如图23B所示，小鼠体重无显著差异。因此，FRα-ISAC联合FRα-ADC对A2780cisR-FRα肿瘤有明显的协同抑制效果，且对小鼠无明显毒副作用。
表37第33天肿瘤抑制率
实施例27 FRα-ISAC在BALB/c小鼠中的高剂量毒性研究
本实验采用BALB/c小鼠,通过间隔7天静脉注射两次FRα-ISAC药物观察小鼠体温变化测定药物的毒性大小。
BALB/c鼠：
雌性BALB/c背景的小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，等级为SPF级，质检单位为北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证编号为NO110011241105136147.小鼠在到达后驯化3天，随后开始研究。
给药：
按表38实验设计分组、称重，每组5只，IgG(购自EQUITECH-BIO)作为阴性对照，分别在第0、7天静脉注射FRα-ISAC药物，然后在第7天给药前测量初始小鼠直肠温度，以及给药后的30min和60min测量小鼠直肠温度。
表38实验设计
直肠温度结果如图24和表39所示：在第7天给药后，BC1254-A1-化合物9组的直肠温度明显下降，在给药30min后下降到31.62℃，在给药60min后进一步下降到29.50℃。而BC1254-A1-化合物6和BC1254-A1 V2-化合物6组直肠温度未发生明显下降。因此，间隔7天给药高剂量BC1254-A1-化合物9对BALB/C小鼠有明显毒副作用，而高剂量BC1254-A1-化合物6和BC1254-A1 V2-化合物6对BALB/C小鼠无明显毒副作用。
表39第7天给药前及给药后小鼠直肠温度
序列信息：




Claims (92)

  1. 一种抗TROP2抗体或其抗原结合片段，所述抗体包含：
    (i)如SEQ ID NO:7所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:8所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
    (ii)如SEQ ID NO:12所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:14所示的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3。
  2. 一种抗TROP2抗体或其抗原结合片段，其包含第一重链互补决定区(HCDR1)、第二重链互补决定区(HCDR2)、第三重链互补决定区(HCDR3)以及第一轻链互补决定区(LCDR1)、第二轻链互补决定区(LCDR2)和第三轻链互补决定区(LCDR3)，其中：所述HCDR1、HCDR2、HCDR3以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或分别由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列组成。
  3. 权利要求1或2所述的抗TROP2抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)，其中所述重链可变区包含与选自SEQ ID NO:7或12所示的氨基酸序列具有至少90％至多100％序列同一性的氨基酸序列，或由所述序列组成；或，包含选自SEQ ID NO:7或12所示的氨基酸序列，或由所述序列组成。
  4. 权利要求1-3中任一项所述的抗TROP2抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区(VL)，其中所述轻链可变区包含与选自SEQ ID NO:8或14所示的氨基酸序列具有至少90％至多100％序列同一性的氨基酸序列，或由所述序列组成；或，包含选自SEQ ID NO:8或14所示的氨基酸序列，或由所述序列组成。
  5. 权利要求1或2所述的抗TROP2抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中
    (i)所述重链可变区包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或
    (ii)所述重链可变区包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
  6. 权利要求1-5中任一项所述的抗TROP2抗体或其抗原结合片段，其包含Fc区。
  7. 权利要求6的所述抗TROP2抗体或其抗原结合片段，其中所述Fc区是来自人的IgG的Fc，例如，来自人IgG1的Fc,来自人IgG2的Fc,来自人IgG3的Fc或来自人IgG4的Fc。
  8. 权利要求1-7中任一项所述的抗TROP2抗体或其抗原结合片段，其包含重链，其中所述重链
    (i)包含与选自SEQ ID NO:9或15的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或
    (ii)包含选自SEQ ID NO:9或15的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
  9. 权利要求1-8中任一项所述的抗TROP2抗体或其抗原结合片段，其包含轻链，其中所述轻链
    (i)包含与选自SEQ ID NO:10或16的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或
    (ii)包含选自SEQ ID NO:10或16的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
  10. 权利要求1-9中任一项所述的抗TROP2抗体或其抗原结合片段，其包含重链和轻链，其中所述重链包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或由其组成的，所述轻链包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或由其组成。
  11. 权利要求1-10中任一项所述的抗TROP2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是单克隆抗体。
  12. 权利要求1-11中任一项所述的抗TROP2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是人源化的抗体或嵌合抗体。
  13. 权利要求1-12中任一项所述的抗TROP2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是选自以下的抗体片段：Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、单链抗体(例如scFv)、(Fab’)2、单结构域抗体例如VHH、dAb(domainantibody)、双价抗体或线性抗体。
  14. 融合蛋白，其包含权利要求1-13中任一项所述的抗TROP2抗体或其抗原结合片段
  15. 免疫偶联物，其包含权利要求1-13中任一项所述的抗TROP2的抗体或其抗原结合片段和其它物质，例如毒素、小分子药物、细胞毒性剂、细胞凋亡剂、螯合剂、免疫调节剂，例如抗炎剂或免疫抑制剂。
  16. 如权利要求15所述的免疫偶联物，其包含免疫调节剂，例如TLR激动剂，例如TLR7/8激动剂。
  17. 分离的核酸，其编码权利要求1-13中任一项所述的抗TROP2抗体或其抗原结合片段。
  18. 包含权利要求17的核酸的载体，优选地所述载体是表达载体。
  19. 包含权利要求17的核酸或权利要求18的载体的宿主细胞，优选地，所述宿主细胞是原核的或真核的，更优选的选自酵母细胞、哺乳动物细胞(例如293细胞或CHO细胞，例如CHO-K细胞或HEK293细胞)或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。
  20. 制备抗TROP2抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括
    a)在适于表达编码权利要求1-13中任一项所述的抗TROP2抗体或其抗原结合片段的核酸的条件下培养权利要求19的宿主细胞，
    b)任选地分离所述抗体或其抗原结合片段，
    c)任选地所述方法还包括从所述宿主细胞回收所述抗TROP2抗体或其抗原结合片段，任选地，所述抗体被纯化，例如被ProteinA纯化。
  21. 一种抗FRα抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：
    如SEQ ID NO:33所示的VH中所含的三个互补决定区域HCDR1、HCDR2和HCDR3，和如SEQ ID NO:34的VL中所含的三个互补决定区域LCDR1、LCDR2和LCDR3。
  22. 一种抗FRα抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含第一重链互补决定区(HCDR1)、第二重链互补决定区(HCDR2)、第三重链互补决定区(HCDR3)以及第一轻链互补决定区(LCDR1)、第二轻链互补决定区(LCDR2)和第三轻链互补决定区(LCDR3)，其中所述HCDR1、HCDR2、HCDR3以及LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列或分别由SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列组成。
  23. 权利要求21或22所述的抗FRα抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)，其中所述重链可变区包含与SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由所述序列组成；或包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列，或由所述序列组成。
  24. 权利要求21-23中任一项所述的抗FRα抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区(VL)，其中所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由所述序列组成；或包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，或由所述序列组成。
  25. 一种抗FRα抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：
    包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的VH，和/或包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的VL。
  26. 权利要求21或22所述的抗FRα抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中
    所述重链可变区包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
  27. 权利要求21-26中任一项所述的抗FRα抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含Fc区，例如所述Fc区来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc区，例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc区。
  28. 权利要求21-27中任一项所述的抗FRα抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链恒定区，所述重链恒定区来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定区，例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定区，例如所述IgG1重链恒定区
    (i)包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或
    (ii)包含与SEQ ID NO:46的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
  29. 权利要求21-28中任一项所述的抗FRα抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含轻链恒定区，所述轻链恒定区为lambda或Kappa轻链恒定区，例如人lambda或Kappa轻链恒定区，优选地，所述轻链恒定区
    (i)包含与SEQ ID NO:38-41和45中任一项的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或
    (ii)包含SEQ ID NO:38-41和45中任一项的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
  30. 权利要求21-29中任一项所述的抗FRα抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含一条或两条Lambda轻链恒定区，且在Lambda轻链恒定区的第160位(EU编号)具有半胱氨酸取代(LLC160C)。
  31. 权利要求30所述的抗FRα抗体或其抗原结合片段，其中所述包含LLC160C的Lambda轻链恒定区包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的且包含氨基酸序列VKAGVCTTTPS(SEQ ID NO:42)。
  32. 权利要求21-29中任一项所述的抗FRα抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含一条或两条Lambda轻链恒定区，且在Lambda轻链恒定区的第166位(EU编号)具有半胱氨酸取代(LLC166C)。
  33. 权利要求32所述的抗FRα抗体或其抗原结合片段，其中所述包含LLC166C的Lambda轻链恒定区包含SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的且包含氨基酸序列TTTPSCQSNNK(SEQ ID NO:43)。
  34. 权利要求21-29中任一项所述的抗FRα抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含一条或两条Lambda轻链恒定区，且在Lambda轻链恒定区的第160和166位(EU编号)具有半胱氨酸取代(LLC160C&LLC 166C)。
  35. 权利要求34所述的抗FRα抗体或其抗原结合片段，其中所述包含LLC160C和LLC166C的Lambda轻链恒定区包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的且包含氨基酸序列VKAGVCTTTPSCQSNNK(SEQ ID NO:44)。
  36. 权利要求21-35中任一项所述的抗FRα抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含
    (i)一条或两条在第160位(Eu编号)具有半胱氨酸突变的Lamda轻链恒定区；和/或
    (ii)一条或两条在第166位(Eu编号)具有半胱氨酸突变的Lamda轻链恒定区。
  37. 权利要求21-36中任一项所述的抗FRα抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含两条相同的重链和两条相同的轻链，其中
    所述重链包含与SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成，和/或
    所述轻链包含与SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成。
  38. 权利要求21-36中任一项所述的抗FRα抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段两条相同的重链和两条相同的轻链，其中
    所述重链包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列或由其组成，和/或
    所述轻链包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列或由其组成。
  39. 权利要求21-36中任一项所述的抗FRα抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含两条相同的重链和两条相同的轻链，其中
    所述重链包含与SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成，和/或
    所述轻链包含与SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由其组成。
  40. 权利要求21-36中任一项所述的抗FRα抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段两条相同的重链和两条相同的轻链，其中
    所述重链包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列或由其组成，和/或
    所述轻链包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列或由其组成。
  41. 权利要求21-40中任一项所述的抗FRα抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是人源化的抗体或嵌合抗体。
  42. 融合蛋白，其包含权利要求21-41中任一项所述的抗FRα抗体或其抗原结合片段。
  43. 免疫偶联物，其包含权利要求21-41中任一项所述的抗FRα的抗体或其抗原结合片段和其它物质，例如毒素、小分子药物、细胞毒性剂、细胞凋亡剂、螯合剂、免疫调节剂，例如抗炎剂或免疫抑制剂。
  44. 如权利要求43所述的免疫偶联物，其包含免疫调节剂，例如TLR激动剂，例如TLR7/8激动剂。
  45. 分离的核酸，其编码权利要求21-41中任一项所述的抗FRα抗体或其抗原结合片段。
  46. 包含权利要求42的核酸的载体，优选地所述载体是表达载体。
  47. 包含权利要求45的核酸或权利要求46的载体的宿主细胞，优选地，所述宿主细胞是原核的或真核的，更优选的选自酵母细胞、哺乳动物细胞(例如293细胞或CHO细胞，例如CHO-K细胞或HEK293细胞)或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。
  48. 制备抗FRα抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括
    (a)在适于表达编码权利要求21-41中任一项所述的抗FRα抗体或其抗原结合片段的核酸的条件下培养权利要求47的宿主细胞，
    (b)任选地分离所述抗体或其抗原结合片段，
    (c)任选地所述方法还包括从所述宿主细胞回收所述抗FRα抗体或其抗原结合片段，任选地，所述抗体被纯化，例如被ProteinA纯化。
  49. 选自以下的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物：
    (1)式(D-1)的化合物：
    其中：
    R1是未取代的或被一个或多个选自下列的取代基取代的C1-C6烷基：羟基、卤素、氰基、C3-C6环烷基、氨基、NH(C1-C6烷基)、N(C1-C6烷基)2、C1-C6烷氧基和C3-C6环烷氧基；
    R2和R3独立的选自氢、C1-C6烷基、羟基、卤素、氰基、氨基、C1-C6烷氧基、芳基C1-C6烷氧基和C1-C6烷氧基羰基，所述芳基任选地被一个或多个选自下列的基团取代：C1-C6烷基、羟基、卤素、氰基、氨基和C1-C6烷氧基；
    R4是未取代的或被一个或多个选自下列的取代基取代的C1-C6烷基：羟基、卤素、氰基、C3-C6环烷基、芳基C1-C6烷基、氨基、NH(C1-C6烷基)、N(C1-C6烷基)2、C1-C6烷氧基、被NHR5取代的C1-C6烷氧基和被NHR5取代的C1-C6烷基羰基氧基；其中所述芳基任选地被一个或多个选自下列的基团取代：C1-C6烷基、羟基、卤素、氰基、氨基、C1-C6烷氧基和C1-C6烷基氨基；
    R5选自C1-C6烷基和C1-C6烷基羰基，其中所述的C1-C6烷基和C1-C6烷基羰基任选地被一个或多个选自下列的取代基取代：羟基、卤素、氨基、NH(C1-C6烷基)、N(C1-C6烷基)2、C1-C6烷氧基和C3-C6环烷氧基；
    (2)式(D-2)的化合物：
    其中：
    X不存在，或者是-NH-(C＝O)-、-(C＝O)-NH-或C1-C6亚烷基，其中所述C1-C6亚烷基任选地被一个或多个选自羟基或卤素的取代基所取代并且其中的一个或多个碳原子可以被选自-NH-和-(C＝O)-的基团所替代；
    X1选自CH或N；
    X2选自CH2或N；
    X3是NR8，其中R8选自H和C1-C6烷基，所述C1-C6烷基任选地被羟基、C1-C6烷氧基和氨基取代的C1-C6烷氧基取代；
    X4是CH2或C(＝O)；
    R6和R7彼此独立地选自H和C1-C6烷基，所述C1-C6烷基任选地被一个或多个选自羟基、卤素、氰基、C3-C6环烷基、氨基、NH(C1-C6烷基)、N(C1-C6烷基)2和C1-C6烷氧基的基团取代；
    并且
    表示单键或双键；
    (3)式(D-3)的化合物：
    其中：
    R9选自羟基、氨基、NH(C1-C6烷基)、N(C1-C6烷基)2和C1-C6烷氧基；
    R10和R11独立地选自氢和C1-C8烷基，所述C1-C8烷基任选地被一个或多个选自羟基、卤素、C1-C6烷氧基和NR15R16的取代基所取代，其中R15和R16独立地选自H、C1-C6酰基和羟基取代的C1-C6酰基；
    R12不存在，或者选自氢和芳基C1-C6烷基，其中所述芳基任选地被一个或多个选自羟基、卤素、C1-C6烷氧基和杂环基C1-C6烷基的取代基所取代，并且所述的杂环基任选地被一个或多个选自C1-C6烷基、C1-C6烷氧基-C1-C6烷基和C1-C6酰基的取代基所取代；
    R13选自氢、卤素、羟基或氧代基团(＝O)；
    R14选自氢、卤素、羟基、C1-C6烷基或C1-C6烷氧基；
    r是0或1或2；
    Y选自C或NR17，其中R17选自氢或任选地被芳基或杂环基取代的C1-C6烷基，所述的芳基和杂环基任选地被选自C1-C6酰基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、羟基C1-C6烷基和NR18R19-C1-C6烷基的取代基所取代，其中R18和R19独立地选自H、C1-C6烷基和C1-C6酰基；并且
    表示单键或双键。
  50. 权利要求49的化合物，其具有式(D-1’)所示的结构：
    其中R2和R3如权利要求21所定义；并且
    R选自H和
    其中R1’和R2’独立地选自氢和C1-C6烷基，p’是选自1-6的整数。
  51. 权利要求49的化合物，具有式(D-2)所示的结构并且其中的R6和R7选自C1-C6烷基，优选正丙基。
  52. 权利要求49的化合物，其具有式(D-3’)所示的结构:
    其中
    R4’表示任选地被一个或多个选自羟基、卤素、氨基和C1-C6烷氧基的取代基取代的C3-C6烷基，优选正戊基；
    R5’选自H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基-C1-C6烷基、C1-C6酰基；优选选自H、乙酰基、甲氧基乙基。
  53. 权利要求49的化合物，其具有式(D-3”)所示的结构:
    其中：
    Q选自OR6’和NR7’R8’；
    其中R6’选自H和C1-C6烷基；
    R7’和R8’独立地选自H、C1-C6酰基、羟基取代的C1-C6酰基，优选R7’和R8’均是H，或者R7’和R8’之一是H并且另一个是乙酰基或羟基乙酰基。
  54. 权利要求49的化合物，其具有式(D-3’”)所示的结构:
    其中：
    R9’是C1-C6烷基，优选C3-C6直链烷基，例如正丁基；
    r是0或1；
    X5选自C1-C6亚烷基，例如-CH2-，-CH2-CH2-，-CH2-CH2-CH2-，-CH2-CH2-CH2-CH2-，-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-，-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-；
    B选自芳基或杂环基，例如苯基、四氢异喹啉基和哌啶基，所述的芳基和杂环基任选地被C1-C6酰基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、羟基C1-C6烷基或NR’R”-C1-C6烷基取代，所述R’和R”独立地选自H、C1-C6烷基和C1-C6酰基。
  55. 权利要求49的化合物，其具有式(D-1”)所示的结构：
    其中R1’和R2’独立地选自氢和C1-C6烷基，优选R1’和R2’均是甲基，或者R1’是氢并且R2’是3,3-二甲基-丁基。
  56. 根据权利要求49-55任一项所述的化合物，其选自


  57. 式(II)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物：
    L-(D)m   (II)
    其中D是如权利要求21-28任意一项所定义的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物；
    L具有如下结构：
    Z’-L1-E-L2-L3-
    其中L3与D连接；
    Z’选自
    L1是-(CH2)n-C(＝O)-或-(CH2)n-(O(CH2)2)t(CH2)n-C(＝O)-；
    E不存在或者是包含2-10个氨基酸的肽残基，其中所述的氨基酸残基为天然氨基酸残基或非天然氨基酸残基并且任选地被C1-C6烷基取代，并且所述肽残基的C末端与L2共价连接；
    L2不存在或者是
    L3不存在或者是-C(＝O)-*、-C(＝O)((CH2)nO)t(CH2)n-*或-NH(CH2)-*，其中*表明所述末端与D共价连接；
    n是0-10的整数，
    t是1-10的整数，
    m是1-6的整数。
  58. 如权利要求57所述的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中
    E具有下式所示的结构：
    -X1-X2-
    其中X1表示-(N(R0)C(R0)2C(＝O))s-，其中R0彼此独立地表示H或C1-C6烷基；s＝0-10，优选2、4、6和8；
    X2不存在或是选自
  59. 如权利要求58所述的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中E选自
    其中s＝0-8。
  60. 如权利要求57-59任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中L-具有选自如下的结构：

  61. 权利要求57所述的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，所述化合物选自：


  62. 一种具有式(I)的免疫偶联物：
    Ab-(L-(D)m)p   (I)
    或其药学上可接受的盐或溶剂化物，
    其中：
    Ab是特异性抗原结合蛋白或其片段；
    L是连接子；
    D是TLR激动剂，优选TLR7/8激动剂；
    m是1-6的整数；并且
    p为1至16的整数，例如2-10。
  63. 根据权利要求62所述的免疫偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中式(I)中的D是权利要求49-56中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
  64. 根据权利要求62或63所述的免疫偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中式(I)中的L-(D)m是如权利要求57-61中任一项所述的式(II)的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
  65. 根据权利要求64所述的免疫偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中的-L-具有选自如下的结构：

    其中该结构的左侧与Ab连接，右侧与D连接。
  66. 根据权利要求64所述的免疫偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中的L-(D)m具有选自如下的结构：




  67. 根据权利要求62-66中任一项所述的免疫偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其具有1-10(例如2-8)的DAR值。
  68. 根据权利要求62所述的免疫偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其是
    其中，q表示DAR，例如为1-10，例如2-8，例如3、4、5、6、或7。
  69. 权利要求62-68中任一项的免疫偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中Ab特异性结合到TROP2。
  70. 如权利要求69所述的免疫偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中Ab是如权利要求1-13中任一项所述的抗TROP2抗体或其抗原结合片段。
  71. 根据权利要求69或70所述的免疫偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其具有1-10(例如2-8)的DAR值或平均DAR值。
  72. 药物组合物，其包含权利要求1-13中任一项的抗体或其抗原结合片段，权利要求14的融合蛋白，权利要求15或16的免疫偶联物，权利要求17的核酸，权利要求18的载体，权利要求19的宿主细胞，权利要求49-56中任意一项的化合物或权利要求62-71中任一项的免疫偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，
    以及任选的一种或多种其它治疗剂，例如化疗剂、血管生成抑制剂、细胞因子、细胞毒性剂、其它抗体、小分子药物或免疫调节剂，以及任选的药用辅料。
  73. 药物组合，其包含权利要求1-13中任一项的抗体或其抗原结合片段，权利要求14的融合蛋白，权利要求15或16的免疫偶联物，权利要求17的核酸，权利要求18的载体，权利要求19的宿主细胞，权利要求49-56中任意一项的化合物或权利要求62-71中任一项的免疫偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物或权利要求72的药物组合物，
    以及一种或多种其它治疗剂，例如化疗剂、血管生成抑制剂、细胞因子、细胞毒性剂、其它抗体、小分子药物或免疫调节剂。
  74. 预防或治疗受试者中肿瘤的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1-13中任一项的抗体或其抗原结合片段，权利要求14的融合蛋白，权利要求15或16的免疫偶联物，权利要求17的核酸，权利要求18的载体，权利要求19的宿主细胞，权利要求49-56中任意一项的化合物或权利要求62-71中任一项的免疫偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物、权利要求72的药物组合物、或权利要求73的药物组合。
  75. 权利要求74所述的方法，其中所述肿瘤为癌症，优选地，所述癌症具有升高水平的(例如核酸或蛋白质水平的)TROP2，例如与健康个体或与所述患者癌症组织临近的健康组织相比。
  76. 权利要求75所述的方法，其中所述癌症选自非小细胞肺癌、三阴性乳腺癌、头颈鳞癌、尿路上皮癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胃癌、结直肠癌、宫颈癌。
  77. 权利要求74-76中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向患者施用一种或多种疗法，例如治疗方式和/或其它治疗剂，优选地，治疗方式包括放射疗法或手术，或者治疗剂包括化疗剂、血管生成抑制剂、细胞因子、细胞毒性剂、其它抗体、小分子药物或免疫调节剂。
  78. 权利要求1-13中任一项的抗体或其抗原结合片段，权利要求14的融合蛋白，权利要求15或16的免疫偶联物，权利要求17的核酸，权利要求18的载体，权利要求19的宿主细胞，权利要求49-56中任意一项的化合物或权利要求62-71中任一项的免疫偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物、权利要求72的药物组合物、或权利要求73的药物组合在制备用于治疗肿瘤的药剂中的用途。
  79. 如权利要求78所述的用途，其中所述肿瘤为癌症，优选地，所述癌症具有升高水平的(例如核酸或蛋白质水平的)TROP2，例如与健康个体或与所述患者癌症组织临近的健康组织相比，更优选地，所述癌症选自非小细胞肺癌、三阴性乳腺癌、头颈鳞癌、尿路上皮癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胃癌、结直肠癌、宫颈癌。
  80. 权利要求62-68中任一项的免疫偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中Ab特异性结合到FRα。
  81. 如权利要求80所述的免疫偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中Ab是如权利要求21-41中任一项所述的抗FRα抗体或其抗原结合片段。
  82. 根据权利要求80或81所述的免疫偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其具有1-10(例如2-8)的DAR值或平均DAR值。
  83. 药物组合物，其包含权利要求21-41中任一项的抗体或其抗原结合片段，权利要求42的融合蛋白，权利要求43或44的免疫偶联物，权利要求45的核酸，权利要求46的载体，权利要求47的宿主细胞，权利要求49-56中任意一项的化合物或权利要求62-68和80-82中任一项的免疫偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，
    以及任选的一种或多种其它治疗剂，例如化疗剂、血管生成抑制剂、细胞因子、细胞毒性剂、其它抗体、小分子药物或免疫调节剂，以及任选的药用辅料。
  84. 药物组合，其包含权利要求21-41中任一项的抗体或其抗原结合片段，权利要求42的融合蛋白，权利要求43或44的免疫偶联物，权利要求45的核酸，权利要求46的载体，权利要求47的宿主细胞，权利要求49-56中任意一项的化合物或权利要求62-68和80-82中任一项的免疫偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物或权利要求83的药物组合物，
    以及一种或多种其它治疗剂，例如化疗剂、血管生成抑制剂、细胞因子、细胞毒性剂、其它抗体、小分子药物或免疫调节剂。
  85. 权利要求84所述的药物组合，其中所述的其它治疗剂是靶向FRα的抗体-药物偶联物、其立体异构体或药学上可接受的盐或溶剂合物。
  86. 预防或治疗受试者中肿瘤的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求21-41中任一项的抗体或其抗原结合片段，权利要求42的融合蛋白，权利要求43或44的免疫偶联物，权利要求45的核酸，权利要求46的载体，权利要求47的宿主细胞，权利要求49-56中任意一项的化合物或权利要求62-68和80-82中任一项的免疫偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物、权利要求83的药物组合物或权利要求84或85的药物组合。
  87. 权利要求86所述的方法，其中所述肿瘤为癌症，优选地，所述癌症具有升高水平的(例如核酸或蛋白质水平的)FRα，例如与健康个体或与所述患者癌症组织临近的健康组织相比。
  88. 权利要求87所述的方法，其中所述癌症选自非小细胞肺癌、三阴性乳腺癌、头颈鳞癌、尿路上皮癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胃癌、结直肠癌、宫颈癌。
  89. 权利要求86-88中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向患者施用一种或多种疗法，例如治疗方式和/或其它治疗剂，优选地，治疗方式包括放射疗法或手术，或者治疗剂包括化疗剂、血管生成抑制剂、细胞因子、细胞毒性剂、其它抗体、小分子药物或免疫调节剂。
  90. 权利要求89所述的方法，其中所述其它治疗剂是如权利要求85中所定义的抗体-药物偶联物。
  91. 权利要求21-41中任一项的抗体或其抗原结合片段，权利要求42的融合蛋白，权利要求43或44的免疫偶联物，权利要求45的核酸，权利要求46的载体，权利要求47的宿主细胞，权利要求49-56中任意一项的化合物或权利要求62-68和80-82中任一项的免疫偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物、权利要求83的药物组合物或权利要求84或85的药物组合在制备用于治疗肿瘤的药剂中的用途。
  92. 如权利要求91所述的用途，其中所述肿瘤为癌症，优选地，所述癌症具有升高水平的(例如核酸或蛋白质水平的)FRα，例如与健康个体或与所述患者癌症组织临近的健康组织相比，更优选地，所述癌症选自非小细胞肺癌、三阴性乳腺癌、头颈鳞癌、尿路上皮癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胃癌、结直肠癌、宫颈癌。
PCT/CN2025/070576 2024-01-05 2025-01-03 抗体以及包含其与tlr7/8激动剂的免疫偶联物及其用途 Pending WO2025146173A1 (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410022814 2024-01-05
CN202410022814.9 2024-01-05

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2025146173A1 true WO2025146173A1 (zh) 2025-07-10

Family

ID=96300106

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/CN2025/070576 Pending WO2025146173A1 (zh) 2024-01-05 2025-01-03 抗体以及包含其与tlr7/8激动剂的免疫偶联物及其用途

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2025146173A1 (zh)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107406508A (zh) * 2014-12-04 2017-11-28 阿布鲁佐治疗诊断有限公司 人源化的抗trop‑2单克隆抗体及其应用
CN111228510A (zh) * 2013-12-25 2020-06-05 第一三共株式会社 抗trop2抗体-药物偶联物
WO2022187809A1 (en) * 2021-03-02 2022-09-09 The Research Foundation For The State University Of New York Tlr7 and tlr8 agonists for the treatment of cancer and/or infectious diseases
WO2023076599A1 (en) * 2021-10-29 2023-05-04 Bolt Biotherapeutics, Inc. Tlr agonist immunoconjugates with cysteine-mutant antibodies, and uses thereof
CN116457023A (zh) * 2020-08-20 2023-07-18 Ambrx公司 抗体-tlr激动剂缀合物、方法及其用途
WO2023154318A1 (en) * 2022-02-09 2023-08-17 Bolt Biotherapeutics, Inc. Anti-tr0p2, aminobenzazepine immunoconjugates, and uses thereof
WO2023178451A1 (en) * 2022-03-25 2023-09-28 Zymeworks Bc Inc. Anti-folate receptor alpha antibodies and methods of use

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111228510A (zh) * 2013-12-25 2020-06-05 第一三共株式会社 抗trop2抗体-药物偶联物
CN107406508A (zh) * 2014-12-04 2017-11-28 阿布鲁佐治疗诊断有限公司 人源化的抗trop‑2单克隆抗体及其应用
CN116457023A (zh) * 2020-08-20 2023-07-18 Ambrx公司 抗体-tlr激动剂缀合物、方法及其用途
WO2022187809A1 (en) * 2021-03-02 2022-09-09 The Research Foundation For The State University Of New York Tlr7 and tlr8 agonists for the treatment of cancer and/or infectious diseases
WO2023076599A1 (en) * 2021-10-29 2023-05-04 Bolt Biotherapeutics, Inc. Tlr agonist immunoconjugates with cysteine-mutant antibodies, and uses thereof
WO2023154318A1 (en) * 2022-02-09 2023-08-17 Bolt Biotherapeutics, Inc. Anti-tr0p2, aminobenzazepine immunoconjugates, and uses thereof
WO2023178451A1 (en) * 2022-03-25 2023-09-28 Zymeworks Bc Inc. Anti-folate receptor alpha antibodies and methods of use

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DAISUKE, O. ET AL.: "Datopotamab Deruxtecan, a Novel TROP2-directed Antibody-drug Conjugate, Demonstrates Potent Antitumor Activity by Efficient Drug Delivery to Tumor Cells", MOLECULAR CANCER THERAPEUTICS, vol. 20, no. 12, 31 December 2021 (2021-12-31), XP055921509, DOI: 10.1158/1535-7163.MCT-21-0206 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230072897A1 (en) Anti-b7-h4 antibody-drug conjugate and medicinal use thereof
TWI670081B (zh) 新穎抗體結合物及其用途
JP7803577B2 (ja) 抗ｓｅｚ６ｌ２抗体および抗体薬物コンジュゲート
JP5800809B2 (ja) Ｔｌｒ３結合剤
JP2022101693A (ja) 抗ｃｕｂドメイン含有タンパク質１（ｃｄｃｐ１）抗体、抗体薬物コンジュゲート、およびその使用方法
CN114846021A (zh) 抗trop-2抗体-依喜替康类似物偶联物及其医药用途
JP2020527332A (ja) 抗−ｉｌ１ｒａｐ抗体および抗体薬物コンジュゲート
TWI891749B (zh) 抗體-藥物偶聯物及其醫藥用途
MX2012011234A (es) Anticuerpos contra csf-1r.
TWI876009B (zh) 抗體藥物偶聯物及其醫藥用途
WO2022171134A1 (zh) 包含抗cldn18.2的抗体或其抗原结合片段的抗体药物偶联物及其用途
WO2023143315A1 (zh) 一种靶向ror1的抗体或其抗原结合片段及其应用
AU2017358360A1 (en) Antibody binding to carbonic anhydrase and use thereof
TW202227498A (zh) 新型抗ｃｌａｕｄｉｎ１８抗體
US20250066499A1 (en) Antibody binding to human cd73, preparation method therefor, and use thereof
WO2021121204A1 (zh) 抗cea抗体-依喜替康类似物偶联物及其医药用途
CN118852442A (zh) 抗ptk7抗体及其用途
EP4534105A1 (en) Anti-cldn18.2 antibody, and antibody-drug conjugate and use thereof
WO2024104431A1 (zh) 一种靶向FRα的抗体或其抗原结合片段及其应用
WO2025146173A1 (zh) 抗体以及包含其与tlr7/8激动剂的免疫偶联物及其用途
CN111303288B (zh) 一种分离的结合抗原psma的蛋白及其用途
JP2023549925A (ja) 抗ｃｄ４８抗体、抗体薬物コンジュゲート及びその使用
WO2025228330A1 (en) Antibodies targeting dll3 and antibody-drug conjugates and uses thereof
US20240390509A1 (en) Antibody-drug conjugate, preparation method therefor, and pharmaceutical use thereof
RU2827531C2 (ru) Конъюгат антитела к b7-h4 и лекарственного средства и его медицинское применение

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 25736411

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1