[go: up one dir, main page]

WO2025142929A1 - 肉芽腫または肉芽腫を伴う疾患を処置および／または予防するための組成物および対象が肉芽腫を有するか否かを判定するための方法およびキット - Google Patents

肉芽腫または肉芽腫を伴う疾患を処置および／または予防するための組成物および対象が肉芽腫を有するか否かを判定するための方法およびキット Download PDF

Info

Publication number
WO2025142929A1
WO2025142929A1 PCT/JP2024/045701 JP2024045701W WO2025142929A1 WO 2025142929 A1 WO2025142929 A1 WO 2025142929A1 JP 2024045701 W JP2024045701 W JP 2024045701W WO 2025142929 A1 WO2025142929 A1 WO 2025142929A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
pentose phosphate
phosphate pathway
granuloma
enzyme
inhibitor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/JP2024/045701
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
健治 椛島
聡 中溝
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kyoto University NUC
Original Assignee
Kyoto University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyoto University NUC filed Critical Kyoto University NUC
Publication of WO2025142929A1 publication Critical patent/WO2025142929A1/ja
Pending legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/34—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having five-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom, e.g. isosorbide
    • A61K31/345—Nitrofurans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/54—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one sulfur as the ring hetero atoms, e.g. sulthiame
    • A61K31/548—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one sulfur as the ring hetero atoms, e.g. sulthiame having two or more sulfur atoms in the same ring
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A61K31/675—Phosphorus compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pyridoxal phosphate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7135—Compounds containing heavy metals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • compositions for treating and/or preventing granulomas or diseases associated with granulomas and methods and kits for determining whether a subject has a granuloma.
  • Granulomas are a type of chronic inflammation that occurs as a defense response against pathogenic microorganisms and insoluble foreign bodies, and are formed by the accumulation of various inflammatory cells, mainly macrophage cells.
  • Known diseases that involve granulomas include mycobacterial infections such as sarcoidosis, tuberculosis, and leprosy, granuloma annulare, and Crohn's disease.
  • Sarcoidosis is a disease that causes granulomas in the skin, lungs, eyes, heart, etc., and can be fatal if it causes pulmonary fibrosis or arrhythmia. At present, the cause is unknown and there is no cure that can be considered a permanent solution.
  • JAK inhibitors may be a new treatment for sarcoidosis, and clinical trials are currently underway (Non-Patent Document 1). However, JAK inhibitors have systemic side effects such as carcinogenicity and immunosuppression, and are not suitable for long-term use.
  • Granulomas are diagnosed histopathologically. Granulomas in the skin are relatively easy to diagnose, but granulomas in the lungs, eyes, heart, liver, kidneys, lymph nodes, nerves, muscles, etc. are difficult to diagnose.
  • Angiotensin-converting enzyme ACE is used as a marker in blood tests for sarcoidosis.
  • One object of the present disclosure is to provide a composition for treating and/or preventing granulomas or diseases associated with granulomas.
  • One object of the present disclosure is to provide a method or kit for determining whether a subject has a granuloma.
  • the inventors discovered that the levels of enzymes related to the pentose phosphate pathway are high in macrophages contained in granulomas and in the blood of sarcoidosis patients, and further discovered that inhibition of enzymes related to the pentose phosphate pathway suppresses granuloma formation.
  • composition comprising an inhibitor of an enzyme associated with the pentose phosphate pathway for treating and/or preventing granulomas.
  • compositions for treating and/or preventing a disease associated with granulomas comprising an inhibitor of an enzyme associated with the pentose phosphate pathway.
  • kits for determining whether a subject has a granuloma including a reagent that specifically binds to an enzyme associated with the pentose phosphate pathway or a reagent for measuring gene expression of an enzyme associated with the pentose phosphate pathway.
  • the present disclosure is useful for treating and/or preventing granulomas or diseases associated with granulomas, or for determining whether a subject has granulomas.
  • FIG. 1 shows gene expression clustering of antigen-presenting cells in normal and sarcoidosis skin. The differential percentages of antigen-presenting cells in normal and sarcoidosis skin are shown. 4 shows differential gene expression in antigen-presenting cells in sarcoidotic skin. Immunostaining images of CD68, FBP1, and CD163 in normal skin and sarcoidosis skin lesions are shown. Figure 1 shows the expression of ACE, FBP1 and STAT1 in normal skin, and in skin lesions of atopic dermatitis, psoriasis, granuloma annulare, leprosy and sarcoidosis.
  • FIG. 1 shows immunostaining images of CD163 and FBP1 in normal skin and skin lesions of atopic dermatitis, psoriasis, sarcoidosis, and granuloma annulare. Immunostaining images of CD163, FBP1 and CD68 in sarcoidosis lesions of the lung, heart and lymph nodes are shown.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of the glucose metabolic pathway. Differential gene expression (genes related to the pentose phosphate cycle) in antigen-presenting cells of sarcoidotic skin. 1 shows differential gene expression (G6PD, FBP1, TXNRD1) in antigen-presenting cells in sarcoidosis skin.
  • Immunostaining images of CD163, FBP1 and G6PD in sarcoidosis lesions of the skin, lung, heart and lymph nodes are shown.
  • 1 shows immunostaining images of FBP1 and TXNRD1 in sarcoidosis lesions of the skin.
  • 1 shows serum FBP1 concentrations in sarcoidosis patients and healthy subjects.
  • Giemsa stained images of human monocytes after culturing them in the presence of cytokines for 3 days are shown.
  • 1 shows FBP1 and G6PD gene expression after human monocytes were cultured in the presence of cytokines for 3 days.
  • the numbers of CD4 + T cells, CD8 + T cells, macrophages, and monocytes infiltrating the ears of inflammation-induced mice were compared between a 6AN-administered group and a non-administered group.
  • the Giemsa stained images and the number of giant cells after human monocytes were cultured for 3 days in the presence of cytokines and various concentrations of MB07803 are shown.
  • the arrows indicate giant cells. Giemsa staining images and giant cell counts after human monocytes were cultured for 3 days in the presence of cytokines and various concentrations of MB06322 are shown.
  • Giemsa stained images of human monocytes after 3 days of culture in the presence of cytokines and 100 nM MB05032, MB07229 or MB07803, and the number of giant cells after 3 days of culture in the presence of various concentrations of each inhibitor are shown.
  • Representative images of skin tissue from inflammation-induced mice in the MB07803-administered and non-administered groups are shown.
  • the subject may be of any species, typically a mammal (e.g., human, mouse, rat, hamster, rabbit, cat, dog, cow, sheep, monkey, etc.), preferably a human.
  • a mammal e.g., human, mouse, rat, hamster, rabbit, cat, dog, cow, sheep, monkey, etc.
  • a human e.g., human, mouse, rat, hamster, rabbit, cat, dog, cow, sheep, monkey, etc.
  • Granulomas are nodular infiltrations of mononuclear phagocytes of the monocyte and macrophage system, and can be infectious or non-infectious. Granulomas are classified histopathologically as foreign body type, suppurative type, sarcoid type, tuberculoid type, palisade type, and interstitial type. In the present disclosure, the granuloma may be of any classification, for example, sarcoid type, tuberculoid type, or palisade type.
  • Granulomas can occur in various diseases, for example, sarcoidosis, granuloma annulare, mycobacterial infections (tuberculosis, leprosy, nontuberculous mycobacterial disease, etc.), and Crohn's disease.
  • the granuloma is granuloma annulare, mycobacterial infection, or Crohn's disease.
  • the site where the granuloma is formed is not limited, and examples include the skin, lungs, eyes, heart, liver, kidneys, lymph nodes, nerves, and muscles.
  • the granuloma is a granuloma that forms in the skin, lung, heart or lymph nodes, particularly the skin.
  • the pentose phosphate pathway is a pathway in the glucose metabolic pathway that metabolizes glucose 6-phosphate to ribose 5-phosphate or xylulose 5-phosphate.
  • fructose 1,6-bisphosphate is converted to glucose 6-phosphate.
  • NADPH which is generated in the process of converting glucose 6-phosphate to 6-phosphogluconic acid, is oxidized to NADP + .
  • a part of the glucose metabolic pathway including these reactions is shown in Figure 8.
  • pentose phosphate pathway-related enzyme refers to an enzyme that acts in the process of metabolizing fructose 1,6-bisphosphate to ribose 5-phosphate or xylulose 5-phosphate in the glucose metabolic pathway, and includes fructose-1,6-bisphosphatase 1 (FBP-1), glucose phosphate isomerase (GPI), glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD), 6-phosphogluconolactonase (PGLS), 6-phosphogluconate dehydrogenase (6PGD), ribulose phosphate 3-epimerase (RPE), ribose phosphate isomerase (RPI), and thioredoxin reductase 1 (TXNRD1).
  • the enzyme is FBP-1, GPI, G6PD, 6PGD, or TXNRD1, more preferably FBP-1, G6PD, or TXNRD1, and even more preferably FBP-1 or TXNRD
  • Fructose-1,6-bisphosphatase 1 is an enzyme that converts fructose-1,6-bisphosphate to fructose-6-phosphate.
  • Representative amino acid sequences of FBP-1 are registered under GenBank accession numbers NP_001121100.1 (human, SEQ ID NO: 1) and NP_062268.1 (mouse, SEQ ID NO: 2).
  • FBP-1 includes the products of all alleles.
  • inhibitors of enzymes associated with the pentose phosphate pathway refer to substances that inhibit the activity or expression of enzymes associated with the pentose phosphate pathway.
  • the inhibitors can be, for example, compounds, peptides, antibodies, or nucleic acids that inhibit the activity or expression of enzymes associated with the pentose phosphate pathway.
  • Substances known as inhibitors of enzymes associated with the pentose phosphate pathway, for example substances sold as inhibitors can be used.
  • Substances that inhibit the activity or expression of enzymes associated with the pentose phosphate pathway in in vitro or in vivo experimental systems may be identified and used.
  • siRNA refers to double-stranded RNA that specifically destroys a target mRNA. Single-stranded RNA (shRNA) in which such double strands are linked via a loop region is also included in siRNA. Those skilled in the art can design an appropriate siRNA based on the nucleotide sequence of the target mRNA. siRNAs targeting various mRNAs are commercially available, and an appropriate siRNA may be used.
  • the FBP-1 inhibitor is an siRNA against FBP-1.
  • the TXNRD1 inhibitor is an siRNA against TXNRD1.
  • a composition for the treatment and/or prevention of granulomas comprising an inhibitor of an enzyme associated with the pentose phosphate pathway.
  • a method for treating and/or preventing granulomas comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of an inhibitor of an enzyme associated with the pentose phosphate pathway.
  • an inhibitor of an enzyme associated with the pentose phosphate pathway for the treatment and/or prevention of granulomas for the treatment and/or prevention of granulomas.
  • there is provided the use of an inhibitor of an enzyme associated with the pentose phosphate pathway to treat and/or prevent granulomas.
  • an inhibitor of an enzyme associated with the pentose phosphate pathway in the manufacture of a composition for the treatment and/or prevention of granulomas.
  • Antibodies can be produced by existing general production methods using an enzyme associated with the pentose phosphate pathway or a partial peptide thereof having antigenicity as an immunogen.
  • polyclonal antibodies can be produced by immunizing an animal with an antigen, and monoclonal antibodies can be produced using hybridoma technology.
  • commercially available antibodies can be used.
  • the reagent may be labeled with a detectable substance.
  • detectable substances include radioisotopes, fluorescent labels, luminescent labels, bioluminescent labels, enzyme labels, and biotin.
  • a substance that specifically binds to the reagent and bears a label may also be used, such as a secondary antibody.
  • the reagent may be bound to a suitable support.
  • the support is not particularly limited as long as it is capable of immobilizing the reagent, and may be of any shape or material.
  • supports include membranes such as nylon membranes, beads, glass, plastic, and metal.
  • the sample may be tissue suspected of being a granuloma taken from a subject.
  • the level of the enzyme associated with the pentose phosphate pathway can be measured by contacting the sample with a reagent that binds to the enzyme associated with the pentose phosphate pathway and measuring the amount of bound reagent on an image.
  • the tissue may be sliced and observed, or the tissue may be fixed on a substrate such as a glass slide and observed.
  • General techniques for detecting substances in a sample such as fixation and permeabilization of the sample, are well known in the art.
  • the reagent that binds to the enzyme associated with the pentose phosphate pathway is as described above, and a label detectable by image processing is used.
  • the label is visualized under a microscope such as an upright microscope or a fluorescent microscope, and the image is photographed using a CCD camera, and the signal strength of the label is measured.
  • Image processing software such as ImageJ software (NIH, Bethesda, MD, USA), can be used to measure the signal strength.
  • Measuring levels of enzymes associated with the pentose phosphate pathway may utilize automated imaging and image analysis techniques, such as high content analysis (HCA) techniques.
  • HCA techniques are known in the art and involve automated imaging of large numbers of cells followed by quantitative image analysis. Synonyms for HCA include high content imaging and high content screening. Robotic or automated equipment or microfluidic devices may be used to speed up the measurement.
  • tissue suspected of being a granuloma may be lysed from a subject, and the levels of enzymes related to the pentose phosphate pathway in the sample may be measured using the immunological techniques described above.
  • Gene expression levels of the enzymes may be measured using known techniques such as quantitative PCR, microarray analysis, RNA sequencing, northern blotting, and SAGE.
  • the subject is determined to have a granuloma, and if the level is lower than the cutoff value, the subject is determined to not have a granuloma.
  • the subject When the level of the enzyme associated with the pentose phosphate pathway is equal to the cutoff value, the subject is determined to have or not have a granuloma, which can be arbitrarily set depending on the purpose of the determination. Thus, in one embodiment, when the level of the enzyme associated with the pentose phosphate pathway is equal to or greater than the cutoff value, the subject is determined to have a granuloma, and when the level of the enzyme associated with the pentose phosphate pathway is less than the cutoff value, the subject is determined to not have a granuloma.
  • the subject when the level of the enzyme associated with the pentose phosphate pathway is higher than the cutoff value, the subject is determined to have a granuloma, and when the level of the enzyme associated with the pentose phosphate pathway is equal to or less than the cutoff value, the subject is determined to not have a granuloma.
  • the cutoff value is a value that can divide a subject group with granuloma and a subject group without granuloma with a statistically significant difference.
  • the cutoff value can be set by a known method using various statistical analysis methods. For example, the cutoff value can be set by statistically analyzing the levels of enzymes related to the pentose phosphate pathway in samples obtained from a subject group with granuloma and the levels of enzymes related to the pentose phosphate pathway in samples obtained from a subject group without granuloma.
  • Statistical significance can be analyzed by known test methods such as chi-square test, generalized Wilcoxon test, Wilcoxon signed rank test, Mann-Whitney test, log-rank test, and Cox proportional hazards.
  • test methods such as chi-square test, generalized Wilcoxon test, Wilcoxon signed rank test, Mann-Whitney test, log-rank test, and Cox proportional hazards.
  • statistical analysis software such as Prism can be used to set the cutoff value.
  • the cutoff value may be set based on sensitivity and/or specificity. Preferably, the cutoff value exhibits both high sensitivity and high specificity.
  • sensitivity means the true positive rate
  • specificity means the true negative rate.
  • the level of an enzyme related to the pentose phosphate pathway that exhibits a high positive rate in a subject group with granulomas and a high negative rate in a subject group without granulomas may be set as the cutoff value.
  • the cutoff value can be set by receiver operating characteristic analysis (ROC analysis), which is a commonly used method for examining the usefulness of diagnostic tests.
  • ROC analysis receiver operating characteristic analysis
  • an ROC curve is created by plotting the sensitivity at each cutoff value on the vertical axis and the false positive rate (1-specificity) on the horizontal axis.
  • the ROC curve is a straight diagonal line for tests without diagnostic ability, but as the diagnostic ability improves, it becomes a curve that arches upward to the left.
  • the cutoff value that gives the point on the ROC curve that is the smallest distance from the upper left corner can be said to have excellent sensitivity and specificity.
  • the cutoff value can also be set based on the Youden index.
  • the sensitivity and specificity are calculated from the levels of enzymes related to the pentose phosphate pathway in a group of subjects with granulomas and a group of subjects without the disease, and an ROC curve is created based on these values using commercially available analysis software. Then, the values at which the sensitivity and specificity are as close to 100% as possible are calculated, and these values can be used as the cutoff value.
  • the diagnostic efficiency i.e., the ratio of the total number of cases in which subjects with granulomas were correctly diagnosed as having granulomas and the total number of cases in which subjects without granulomas were correctly diagnosed as not having granulomas
  • the level of the enzyme related to the pentose phosphate pathway that gives the highest diagnostic efficiency can be used as the cutoff value.
  • Cutoff values can also be set for subgroups of patients according to characteristics. For example, cutoff values can be set according to gender, age group, or race.
  • the results of the present method can be provided as information for diagnosis.
  • the method includes obtaining a sample from a subject.
  • the method comprises measuring the level of an enzyme associated with the pentose phosphate pathway in a sample obtained from the subject.
  • the methods include treating the granuloma in a subject determined to have a granuloma, for example, by administering an inhibitor of an enzyme associated with the pentose phosphate pathway in accordance with the present disclosure.
  • kits for determining whether a subject has a granuloma including a reagent that specifically binds to an enzyme associated with the pentose phosphate pathway or a reagent for measuring gene expression of an enzyme associated with the pentose phosphate pathway.
  • the reagent may be provided dissolved in water or a suitable buffer, such as phosphate buffered saline (PBS), or lyophilized and contained in a suitable container.
  • suitable containers include bottles, vials, syringes, test tubes, plates, membranes, and the like.
  • the container may be formed from a variety of materials, such as glass, plastic, and the like.
  • the kit may further include other components and reagents necessary for detecting the enzyme associated with the pentose phosphate pathway.
  • the kit may further include a labeled secondary antibody, a chromogenic substrate, a blocking solution, a washing buffer, and the like.
  • the kit may further include other materials desirable from a commercial and user standpoint, such as a package insert including instructions for use.
  • a reagent that specifically binds to an enzyme associated with the pentose phosphate pathway or a reagent for measuring gene expression of an enzyme associated with the pentose phosphate pathway is provided to determine whether a subject has a granuloma.
  • a reagent that specifically binds to an enzyme associated with the pentose phosphate pathway or a reagent for measuring gene expression of an enzyme associated with the pentose phosphate pathway to manufacture a kit for determining whether a subject has a granuloma.
  • composition described in item 3 wherein the disease associated with granuloma is sarcoidosis, granuloma annulare, mycobacterial infection or Crohn's disease.
  • the granuloma is a sarcoid, tuberculoid, or palisade granuloma.
  • the composition according to any one of items 1 to 5 wherein the granuloma is formed in the skin, lungs, eyes, heart, liver, kidneys, lymph nodes, nerves, or muscles.
  • composition according to any one of items 1 to 8, wherein the enzyme associated with the pentose phosphate pathway is FBP-1, GPI, G6PD, PGLS, 6PGD, RPE, RPI or TXNRD1.
  • the enzyme associated with the pentose phosphate pathway is FBP-1, GPI, G6PD, PGLS, 6PGD, RPE or RPI.
  • the enzyme associated with the pentose phosphate pathway is FBP-1, GPI, G6PD, 6PGD or TXNRD1.
  • composition according to any one of items 1 to 8, wherein the enzyme associated with the pentose phosphate pathway is FBP-1, GPI, G6PD or 6PGD.
  • the composition according to any one of items 1 to 8, wherein the enzyme associated with the pentose phosphate pathway is FBP-1, G6PD or TXNRD1.
  • the composition according to any one of items 1 to 8, wherein the enzyme involved in the pentose phosphate pathway is FBP-1 or G6PD.
  • the enzyme involved in the pentose phosphate pathway is FBP-1 or TXNRD1.
  • composition according to any one of items 1 to 8, wherein the enzyme involved in the pentose phosphate pathway is FBP-1.
  • the composition according to any one of items 1 to 8, wherein the enzyme involved in the pentose phosphate pathway is G6PD.
  • the composition described in any one of items 1 to 8, wherein the enzyme involved in the pentose phosphate pathway is TXNRD1.
  • the inhibitor of an enzyme associated with the pentose phosphate pathway is 2,5-dichloro-N-(5-chloro-2-benzoxazolyl)-benzenesulfonamide, MB05032, MB06322, MB07229, MB07803, 2-deoxy-D-glucose, 6-aminonicotinamide, auranofin, TRi-1, chaetocin, or LCS3.
  • composition according to any one of items 1 to 8, wherein the inhibitor of an enzyme associated with the pentose phosphate pathway is 2,5-dichloro-N-(5-chloro-2-benzoxazolyl)-benzenesulfonamide, MB05032, MB07229, 6-aminonicotinamide, auranofin, or TRi-1.
  • the inhibitor of an enzyme associated with the pentose phosphate pathway is 2,5-dichloro-N-(5-chloro-2-benzoxazolyl)-benzenesulfonamide or 6-aminonicotinamide.
  • composition according to any one of items 1 to 8, wherein the inhibitor of an enzyme associated with the pentose phosphate pathway is MB05032, MB06322, MB07229, MB07803, auranofin or TRi-1.
  • the composition according to any one of items 1 to 8, wherein the inhibitor of an enzyme associated with the pentose phosphate pathway is MB05032, MB07229, MB07803, auranofin or TRi-1.
  • the inhibitor of an enzyme associated with the pentose phosphate pathway is MB05032, MB07229, auranofin or TRi-1.
  • composition according to any one of items 1 to 8, wherein the inhibitor of an enzyme associated with the pentose phosphate pathway is MB07229, MB07803, auranofin or TRi-1.
  • the composition according to any one of items 1 to 8, wherein the inhibitor of an enzyme associated with the pentose phosphate pathway is MB07229, auranofin, or TRi-1.
  • the composition according to any one of items 1 to 8, wherein the inhibitor of an enzyme associated with the pentose phosphate pathway is MB07229 or MB07803.
  • the composition according to any one of items 1 to 8, wherein the inhibitor of an enzyme associated with the pentose phosphate pathway is MB07229.
  • composition according to any one of items 1 to 8, wherein the inhibitor of an enzyme associated with the pentose phosphate pathway is MB07803.
  • the composition according to any one of items 1 to 8, wherein the inhibitor of an enzyme associated with the pentose phosphate pathway is auranofin or TRi-1.
  • the composition according to any one of items 1 to 8, wherein the inhibitor of an enzyme associated with the pentose phosphate pathway is MB06322, MB07803 or auranofin.
  • the composition according to any one of items 1 to 8, wherein the inhibitor of an enzyme associated with the pentose phosphate pathway is an siRNA against FBP-1, GPI, G6PD, 6PGD or TXNRD1.
  • the kit according to item 49 wherein the enzyme involved in the pentose phosphate pathway is FBP-1, GPI, G6PD, 6PGD or TXNRD1.
  • the kit according to item 49 wherein the enzyme involved in the pentose phosphate pathway is FBP-1, GPI, G6PD or 6PGD.
  • the kit according to item 49 wherein the enzyme involved in the pentose phosphate pathway is FBP-1.
  • the kit described in item 49, wherein the enzyme related to the pentose phosphate pathway is TXNRD1.
  • the kit according to any one of items 49 to 55 comprising a reagent that specifically binds to an enzyme associated with the pentose phosphate pathway.
  • the reagent is an antibody.
  • Tissues from atopic dermatitis, psoriasis, granuloma annulare, cutaneous sarcoidosis, and pulmonary sarcoidosis used for histological staining were immersed in 10% neutral buffered formalin for 24 hours after biopsy and surgery, and then embedded in paraffin. Serum was collected using a serum separator-containing spitz and collected after centrifugation.
  • RNA-sequencing libraries After thawing, the frozen biopsy specimens were treated for 2 hours with Whole Skin Dissociation Kit, human (Miltenyi Biotec) to create a cell suspension. The cell suspension was used to create libraries using Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.1 (10x Genomics). The libraries were sequenced on the DNBSEQ-G400 (MGI Tech) platform, yielding approximately 150 to 200 million reads. The sequence data was analyzed using CellRanger 3.1.0 (10x Genomics).
  • Seurat Clustering analysis using the Seurat package was performed both at a first level across all cells and at a second level of high resolution within cell types.
  • Single-cell RNA-seq datasets were combined into a single Seurat object and normalized using the SCTransform function to remove batch effects. Cells with fewer than 100 genes, more than 5000 genes, or mitochondrial content greater than 20% were excluded.
  • Differentially expressed genes (DEGs) were identified in each cluster using Wilcoxon rank sum tests to define broad cell types and were repeated for each resulting cell type to further characterize subpopulations.
  • Immunostaining was performed on formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissues. Staining was performed using a BOND RX automated immunostainer (Leica). Antigen retrieval was performed with ER solution 2 for 40 min. Sections were stained with CD163 (clone 10D6, 1:200; Leica), FBP-1 (clone EPR4619, 1:100; Abcam, Cambridge, MA, USA), CD68 (clone PG-M1, 1:200; Dako), G6PD (1:2000; Abcam), and TXNRD1 (clone B-2, 1:100; SANTA CRUZ).
  • CD163 clone 10D6, 1:200; Leica
  • FBP-1 clone EPR4619, 1:100; Abcam, Cambridge, MA, USA
  • CD68 clone PG-M1, 1:200; Dako
  • G6PD 1:2000; Abcam
  • TXNRD1 clone B-2, 1:100; SANTA
  • the secondary antibody used was an Opal tyramide signaling amplification kit (Akoya Biosciences, Marlborough, MA, USA). Images were taken using a fluorescence microscope BZ9000 (Keyence) and analyzed using ImageJ software (NIH).
  • the serum FBP1 concentration was measured using Human FBP1 ELISA Kit (LSBio).
  • Peripheral blood mononuclear cells were isolated from peripheral blood of healthy subjects using lymph node isolation solution (Nacalai).
  • CD14 positive monocytes were isolated from peripheral blood mononuclear cells using CD14 microbeads (Miltenyi Biotec). Monocytes were placed in RPMI containing 10% fetal bovine serum, concanavalin A (Sigma, 5 ⁇ M), CD40L (Peprotech, 300 ng/ml) or anti-human CD40 antibody (BioLegend, 1 ⁇ g/ml), and IFN ⁇ (Peprotech, 10 ng/ml), and seeded at 0.5 ⁇ 10 5 /well on a 96-well flat-bottom plate.
  • fructose-1,6-bisphosphatase-1 inhibitor (FBP-1 inhibitor, 2,5-dichloro-N-(5-chloro-2-benzoxazolyl)-benzenesulfonamide) (Cayman, 100 or 500 ⁇ M), tofacitinib (Sigma, 1 ⁇ M), 6-aminonicotinamide (6AN) (Sigma, 100 ⁇ M), MB05032 (Cayman, 10 ⁇ M), MB07729 (TargetMol, 10 ⁇ M), auranofin (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, 0.1 ⁇ M or 10 ⁇ M), and TRi-1 (Selleck, 1 ⁇ M or 10 ⁇ M) were added.
  • FBP-1 inhibitor 2,5-dichloro-N-(5-chloro-2-benzoxazolyl)-benzenesulfonamide
  • tofacitinib Sigma, 1 ⁇ M
  • 6-aminonicotinamide
  • mice were maintained under specific pathogen-free conditions at the Kyoto University graduate School of Medicine, Laboratory Animal Research Facility. Female mice aged 7-10 weeks were used for all experiments. All experimental procedures were approved by the Kyoto University Animal Care and Use Committee.
  • Mouse skin sarcoidosis model 7-week-old C57BL/6 mice (Charles River) were intraperitoneally administered 6AN (20 mg/kg) or PBS (Nacalai Tesque). Seven hours later, 2000 beads (Bio-Gel P1000, Bio-Rad) and 25 ⁇ g of concanavalin A were injected intradermally into the ear under anesthesia. The ear thickness was measured daily using a constant pressure thickness gauge (Tecrock). On the fourth day of the experiment, the mice were euthanized and analyzed.
  • Staining method for mouse skin tissue Ear skin was immersed in 10% neutral buffered formalin for 24 hours and then embedded in paraffin. Sections were prepared at a thickness of 5 ⁇ m and stained with hematoxylin and eosin (Sigma).
  • Mouse ears were divided into dorsal and ventral sheets and placed in RPMI 1640 containing 10% fetal calf serum, 1% penicillin-streptomycin, 1% sodium pyruvate, 1% MEM non-essential amino acids (Thermo Fisher Scientific), 0.25 mg/ml Liberase TL (Roche, Basel, Switzerland), and 0.3 mg/ml DNase I (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) at 37°C for 60 minutes. The digested skin sheets were filtered using a 40 ⁇ m cell strainer (BD Biosciences) to prepare single cell suspensions.
  • RPMI 1640 containing 10% fetal calf serum, 1% penicillin-streptomycin, 1% sodium pyruvate, 1% MEM non-essential amino acids (Thermo Fisher Scientific), 0.25 mg/ml Liberase TL (Roche, Basel, Switzerland), and 0.3 mg/ml DNase I (Sigma-Aldrich, St.
  • FBP-1 expression was confirmed in granuloma annulare and granulomas of sarcoidosis in the lungs, heart, and lymph nodes, but not in atopic dermatitis or psoriasis lesions ( Figures 6 and 7).
  • FBP-1 acts on the pentose phosphate cycle in the glucose metabolic pathway (Fig. 8).
  • GPI glucose phosphate isomerase
  • G6PD glucose-6-phosphate dehydrogenase
  • 6PGD 6-phosphogluconate dehydrogenase
  • TXNRD1 thioredoxin reductase 1
  • Giant cell formation was also suppressed in the presence of FBP1 inhibitors (MB05032 (10 ⁇ M), MB07229 (10 ⁇ M)) or TXNRD inhibitors (auranofin (0.1 ⁇ M), TRi-1 (0.1 ⁇ M)), which have already been clinically tested in humans for other diseases and can be administered systemically (FIGS. 17 and 18). Furthermore, in the presence of siRNA against the FBP-1 gene, FBP-1 gene expression and giant cell formation were suppressed (FIG. 19). Giant cell formation was also suppressed by the use of 2-deoxy-D-glucose, a GPI inhibitor.
  • inhibitors of enzymes related to the pentose phosphate pathway similar to JAK inhibitors, which have been shown to be effective in treating sarcoidosis, may be used to prevent and treat granuloma-forming diseases such as sarcoidosis.
  • mice were intraperitoneally administered 6AN (20 mg/Kg) suspended in dimethyl sulfoxide (DMSO), followed by intradermal injection of concanavalin A and beads, and the inflammation and accumulation of macrophages in the skin were examined.
  • 6AN dimethyl sulfoxide
  • Subcutaneous granuloma formation was observed in the DMSO (solvent) and 6AN groups.
  • the size of the granuloma in the 6AN group was significantly reduced compared to the DMSO group ( Figure 22).
  • the 6AN group showed suppressed ear swelling ( Figure 23) compared to the non-treated group.
  • the IC50 of FBP-1 inhibitors MB05032, MB07229 or MB07803 was measured for giant cell formation in an in vitro sarcoidosis model. The results are shown in Figure 27.
  • the IC50 of MB05032 and MB07229 was 100 ⁇ M or higher, and the IC50 of MB07803 was 10-20 nM.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

肉芽腫を処置および／または予防するための、ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤を含む組成物が提供される。肉芽腫を伴う疾患を処置および／または予防するための、ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤を含む組成物が提供される。また、対象から採取された試料におけるペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルに基づいて、対象が肉芽腫を有するか否かを判定するための方法またはキットが提供される。

Description

肉芽腫または肉芽腫を伴う疾患を処置および／または予防するための組成物および対象が肉芽腫を有するか否かを判定するための方法およびキット
　本特許出願は、日本国特許出願第２０２３－２１８３２４号について優先権を主張するものであり、ここに参照することによって、その全体が本明細書中へ組み込まれるものとする。
　本開示は、肉芽腫または肉芽腫を伴う疾患を処置および／または予防するための組成物、および、対象が肉芽腫を有するか否かを判定するための方法およびキットに関する。
　肉芽腫は、病原性微生物や不溶性異物に対する生体防御反応として生じる慢性炎症の一つであり、マクロファージ系の細胞を中心に様々な炎症細胞が集積して形成される。肉芽腫を伴う疾患として、サルコイドーシス、結核およびハンセン病などの抗酸菌感染症、環状肉芽腫、クローン病などが知られている。
　サルコイドーシスは、皮膚、肺、眼、心臓などに肉芽腫をきたす疾患であり、肺線維症や不整脈を引き起こした場合は致死的である。現状では原因不明であり根治療法といえるものはない。ＪＡＫ阻害剤はサルコイドーシスの新たな治療薬の可能性があり現在治験が行われている（非特許文献１）。しかしながら、ＪＡＫ阻害剤には発がん性、免疫抑制といった全身性の副作用があり、長期の服用に適していない。
　肉芽腫は病理組織学的に診断され、皮膚の肉芽腫は比較的診断しやすいが、肺、眼、心臓、肝臓、腎臓、リンパ節、神経、筋などの肉芽腫の診断は困難である。サルコイドーシスの血液検査には、マーカーとしてアンギオテンシン転換酵素（ＡＣＥ）が使用されている。
William Damsky, Durga Thakral, Nkiruka Emeagwali, Anjela Galan, Brett King, Tofacitinib Treatment and Molecular Analysis of Cutaneous Sarcoidosis, N Engl J Med. 2018 Dec 27;379(26):2540-2546
　本開示の目的の１つは、肉芽腫または肉芽腫を伴う疾患を処置および／または予防するための組成物を提供することである。本開示の目的の１つは、対象が肉芽腫を有するか否かを判定するための方法またはキットを提供することである。
　本発明者らは、肉芽腫に含まれるマクロファージおよびサルコイドーシス患者の血中ではペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルが高いことを見出し、さらに、ペントースリン酸経路に関連する酵素を阻害することにより、肉芽腫の形成が抑制されることを見出した。
　従って、ある態様では、肉芽腫を処置および／または予防するための、ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤を含む組成物が提供される。
　ある態様では、ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤を含む、肉芽腫を伴う疾患の処置および／または予防用の組成物が提供される。
　ある態様では、対象から採取された試料におけるペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルに基づいて、対象が肉芽腫を有するか否かを判定するための方法が提供される。
　ある態様では、ペントースリン酸経路に関連する酵素に特異的に結合する試薬またはペントースリン酸経路に関連する酵素の遺伝子発現を測定するための試薬を含む、対象が肉芽腫を有するか否かを判定するためのキットが提供される。
　本開示は、肉芽腫または肉芽腫を伴う疾患を処置および／または予防するために、または、対象が肉芽腫を有するか否かを判定するために有用である。
正常皮膚およびサルコイドーシス皮膚の抗原提示細胞の遺伝子発現によるクラスタリングを示す。 正常皮膚およびサルコイドーシス皮膚の抗原提示細胞の分画別割合を示す。 サルコイドーシス皮膚の抗原提示細胞の分画別遺伝子発現を示す。 正常皮膚およびサルコイドーシス皮膚病変における、ＣＤ６８、ＦＢＰ１およびＣＤ１６３の免疫染色像を示す。 正常皮膚、アトピー性皮膚炎、乾癬、環状肉芽腫、ハンセン病およびサルコイドーシスの皮膚病変における、ＡＣＥ、ＦＢＰ１およびＳＴＡＴ１の発現を示す。 正常皮膚、アトピー性皮膚炎、乾癬、サルコイドーシスおよび環状肉芽腫の皮膚病変における、ＣＤ１６３およびＦＢＰ１の免疫染色像を示す。 肺、心臓およびリンパ節のサルコイドーシス病変における、ＣＤ１６３、ＦＢＰ１およびＣＤ６８の免疫染色像を示す。 グルコース代謝経路の模式図である。 サルコイドーシス皮膚の抗原提示細胞の分画別遺伝子発現（ペントースリン酸回路に関係した遺伝子）を示す。 サルコイドーシス皮膚の抗原提示細胞の分画別遺伝子発現（Ｇ６ＰＤ、ＦＢＰ１、ＴＸＮＲＤ１）を示す。 皮膚、肺、心臓およびリンパ節のサルコイドーシス病変における、ＣＤ１６３、ＦＢＰ１およびＧ６ＰＤの免疫染色像を示す。 皮膚のサルコイドーシス病変における、ＦＢＰ１およびＴＸＮＲＤ１の免疫染色像を示す。 サルコイドーシス患者と健常人の血清ＦＢＰ１濃度を示す。 ヒト単球をサイトカインの存在下で３日間培養した後のギムザ染色像を示す。 ヒト単球をサイトカインの存在下で３日間培養した後のＦＢＰ１とＧ６ＰＤ遺伝子発現を示す。 ヒト単球をサイトカインおよびＦＢＰ阻害剤、６ＡＮまたはトファチニブの存在下で３日間培養した後のギムザ染色像と巨細胞数を示す。 ヒト単球をサイトカインおよびＭＢ０５０３２またはＭＢ０７２２９の存在下で３日間培養した後のギムザ染色像と巨細胞数を示す。 ヒト単球をサイトカインおよびオーラノフィンまたはＴＲｉ－１の存在下で３日間培養した後のギムザ染色像を示す。 ヒト単球をサイトカインおよびＦＢＰ遺伝子に対するｓｉＲＮＡの存在下で３日間培養した後のギムザ染色像、ＦＢＰ１遺伝子発現および融合率を示す。 ヒト単球をサイトカインの存在下で３日間培養し、ＦＢＰ阻害剤、６ＡＮまたはトファチニブの存在下でさらに３日間培養した後のギムザ染色像と巨細胞数を示す。 ヒト単球をサイトカインの存在下で３日間培養し、オーラノフィンまたはＴＲｉ－１の存在下でさらに３日間培養した後のギムザ染色像を示す。 ６ＡＮ投与群と非投与群の炎症誘導マウスの代表的な皮膚組織像を示す。 ６ＡＮ投与群と非投与群の炎症誘導マウスの耳介厚を示す。 炎症誘導マウスの耳介に浸潤しているＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、マクロファージおよび単球の数を、６ＡＮ投与群と非投与群で比較した結果を示す。 ヒト単球をサイトカインおよび様々な濃度のＭＢ０７８０３の存在下で３日間培養した後のギムザ染色像と巨細胞数を示す。矢印は巨細胞を示す。 ヒト単球をサイトカインおよび様々な濃度のＭＢ０６３２２の存在下で３日間培養した後のギムザ染色像と巨細胞数を示す。 ヒト単球をサイトカインおよび１００ｎＭのＭＢ０５０３２、ＭＢ０７２２９またはＭＢ０７８０３の存在下で３日間培養した後のギムザ染色像、および、様々な濃度の各阻害剤の存在下で３日間培養した後の巨細胞数を示す。 ＭＢ０７８０３投与群と非投与群の炎症誘導マウスの代表的な皮膚組織像を示す。
　特に具体的な定めのない限り、本明細書で使用される用語は、有機化学、医学、薬学、分子生物学、微生物学等の分野における当業者に一般に理解されるとおりの意味を有する。以下にいくつかの本明細書で使用される用語についての定義を記載するが、これらの定義は、本明細書において、一般的な理解に優先する。
　本明細書では、数値が「約」の用語を伴う場合、その値の±１０％の範囲を含むことを意図する。例えば、「約２０」は、「１８～２２」を含むものとする。数値の範囲は、両端点の間のすべての数値および両端点の数値を含む。範囲に関する「約」は、その範囲の両端点に適用される。従って、例えば、「約２０～３０」は、「１８～３３」を含むものとする。
　本開示において、対象はいかなる種であってもよく、典型的には哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル等）、好ましくはヒトである。
　肉芽腫は、単球およびマクロファージ系の単核食細胞が結節状に浸潤した状態であり、感染性のものと非感染性のものがある。肉芽腫は、病理組織学的に、異物型、化膿型、サルコイド型、類結核型、柵状、間質型に分類される。本開示において、肉芽腫はいかなる分類のものであってもよく、例えば、サルコイド型、類結核型または柵状肉芽腫である。肉芽腫は様々な疾患において生じ、例えば、サルコイドーシス、環状肉芽腫、抗酸菌感染症（結核、ハンセン病、非結核性抗酸菌症など）およびクローン病において生じ得る。ある実施態様では、肉芽腫は環状肉芽腫、抗酸菌感染症またはクローン病における肉芽腫である。肉芽腫が形成される部位は限定されず、例えば、皮膚、肺、眼、心臓、肝臓、腎臓、リンパ節、神経、筋が挙げられる。ある実施態様では、肉芽腫は、皮膚、肺、心臓またはリンパ節、特に皮膚で形成される肉芽腫である。
　ペントースリン酸経路は、グルコース代謝経路において、グルコース６－リン酸をリボース５－リン酸またはキシルロース－５－リン酸に代謝する経路である。その前段階で、フルクトース１，６－ビスリン酸がグルコース６－リン酸に変換される。また、グルコース－６－リン酸が６－ホスホグルコン酸に変換される過程で生じるＮＡＤＰＨは、ＮＡＤＰ＋に酸化される。これらの反応を含むグルコース代謝経路の一部を図８に示す。本開示において、「ペントースリン酸経路に関連する酵素」は、グルコース代謝経路においてフルクトース１，６－ビスリン酸がリボース５－リン酸またはキシルロース－５－リン酸に代謝される過程で作用する酵素を意味し、フルクトース－１，６－ビスホスファターゼ１（ＦＢＰ－１）、グルコースフォスフェートイソメラーゼ（ＧＰＩ）、グルコース－６－リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤ）、６－ホスホグルコノラクトナーゼ（ＰＧＬＳ）、６－ホスホグルコン酸脱水素酵素（６ＰＧＤ）、リブロースホスフェート３－エピメラーゼ（ＲＰＥ）、リボースホスフェートイソメラーゼ（ＲＰＩ）およびチオレドキシン還元酵素１（ＴＸＮＲＤ１）を含む。好ましくは、酵素は、ＦＢＰ－１、ＧＰＩ、Ｇ６ＰＤ、６ＰＧＤまたはＴＸＮＲＤ１であり、より好ましくはＦＢＰ－１、Ｇ６ＰＤまたはＴＸＮＲＤ１であり、さらに好ましくはＦＢＰ－１またはＴＸＮＲＤ１である。
　フルクトース－１，６－ビスホスファターゼ１（ＦＢＰ－１）は、フルクトース－１，６－ビスリン酸をフルクトース－６－リン酸に変換する酵素である。ＦＢＰ－１の代表的なアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１１２１１００．１（ヒト、配列番号１）およびＮＰ＿０６２２６８．１（マウス、配列番号２）として登録されている。本開示において、ＦＢＰ－１は、すべての対立遺伝子の産物を含む。
　グルコースフォスフェートイソメラーゼ（ＧＰＩ）は、フルクトース－６－リン酸をグルコース－６－リン酸に変換する酵素である。ＧＰＩの代表的なアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１１７１６５１．１（ヒト、配列番号３）およびＮＰ＿０３２１８１．２（マウス、配列番号４）として登録されている。本開示において、ＧＰＩは、すべての対立遺伝子の産物を含む。
　グルコース－６－リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤ）は、グルコース－６－リン酸をグルコノ－１，５－ラクトン－６－リン酸に変換する酵素である。Ｇ６ＰＤの代表的なアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００３９３．４（ヒト、配列番号５）、ＮＰ＿０３２０８８．１（マウス、配列番号６）およびＮＰ＿０６２３４１．２（マウス、配列番号７）として登録されている。本開示において、Ｇ６ＰＤは、すべての対立遺伝子の産物を含む。
　６－ホスホグルコノラクトナーゼ（ＰＧＬＳ）は、グルコノ－１，５－ラクトン－６－リン酸を６－ホスホグルコン酸に変換する酵素である。ＰＧＬＳの代表的なアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０３６２２０．１（ヒト、配列番号８）およびＮＰ＿０７９６７２．１（マウス、配列番号９）として登録されている。本開示において、ＰＧＬＳは、すべての対立遺伝子の産物を含む。
　６－ホスホグルコン酸脱水素酵素（６ＰＧＤ）は、６－ホスホグルコン酸をリブロース－５－リン酸に変換する酵素である。６ＰＧＤの代表的なアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００２６２２．２（ヒト、配列番号１０）およびＮＰ＿００１０７４７４３．１（マウス、配列番号１１）として登録されている。本開示において、６ＰＧＤは、すべての対立遺伝子の産物を含む。
　リブロースホスフェート３－エピメラーゼ（ＲＰＥ）は、リブロース－５－リン酸をキシルロース－５－リン酸に変換する酵素である。ＲＰＥの代表的なアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１２６５２１１．１（ヒト、配列番号１２）およびＮＰ＿００１２９７５７１．１（マウス、配列番号１３）として登録されている。本開示において、ＲＰＥは、すべての対立遺伝子の産物を含む。
　リボースホスフェートイソメラーゼ（ＲＰＩ）は、リブロース－５－リン酸をリボース－５－リン酸に変換する酵素である。ＲＰＩの代表的なアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿６５３１６４．２（ヒト、配列番号１４）およびＮＰ＿０３３１０１．２（マウス、配列番号１５）として登録されている。本開示において、ＲＰＩは、すべての対立遺伝子の産物を含む。
　チオレドキシン還元酵素１（ＴＸＮＲＤ１）は、酸化型チオレドキシンを還元型チオレドキシンに還元し、ＮＡＤＰＨをＮＡＤＰ＋に酸化する酵素である。ＴＸＮＲＤ１の代表的なアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿８７７３９３．１（ヒト、配列番号１６）およびＮＰ＿００１０３５９７８．１（マウス、配列番号１７）として登録されている。本開示において、ＴＸＮＲＤ１は、すべての対立遺伝子の産物を含む。
　本開示に関して、ペントースリン酸経路に関連する酵素は、その機能が維持されている限り、本来のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換あるいは付加した配列を含んでいてもよい。「数個」とは、好ましくは２～７個、より好ましくは２～５個、最も好ましくは２～３個のアミノ酸を意味する。アミノ酸置換は、類似するアミノ酸残基間の保存的置換が好ましい。アミノ酸残基はその側鎖によって、酸性アミノ酸（例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸、２－アミノアジピン酸）、塩基性アミノ酸（例えば、ヒスチジン、リシン、アルギニン）、脂肪族アミノ酸（例えば、メチオニン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、２－アミノヘプタン酸、ノルロイシン）、芳香族アミノ酸（例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）、極性無電荷アミノ酸（例えば、アスパラギン、システイン、グルタミン、セリン、スレオニン）などのグループに分類できる。好ましくは、アミノ酸置換は同一グループ内のアミノ酸残基間の保存的置換である。
　また、ペントースリン酸経路に関連する酵素は、その機能が維持されている限り、本来のアミノ酸配列と、ＢＬＡＳＴ等を用いて計算したときに（例えば、ＢＬＡＳＴのデフォルト、即ち初期条件のパラメーターを用いた場合に）、少なくとも約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９７％以上、約９８％以上もしくは約９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。
　後述する実施例により立証される通り、ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤を対象に投与することにより、肉芽腫を処置および／または予防し得る。本開示において、「肉芽腫を処置する」または「肉芽腫の処置」は、肉芽腫を有する対象において、肉芽腫の進行を遅延または停止させること、および／または、肉芽腫を軽減、緩和、改善または除去することを意味する。
　本開示において、「肉芽腫を予防する」または「肉芽腫の予防」は、対象において、特に、肉芽腫を形成するリスクがある対象において、肉芽腫形成を防止すること、または、肉芽腫を形成する可能性を低減することを意味する。肉芽腫を形成するリスクがある対象には、例えば、サルコイドーシス、抗酸菌感染症およびクローン病などの肉芽腫を伴う疾患の患者が含まれる。
　また、ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤を対象に投与することにより、肉芽腫を伴う疾患を処置および／または予防し得る。本開示において、「疾患を処置する」または「疾患の処置」は、疾患を有する対象において、疾患の進行を遅延または停止させること、および／または、疾患を軽減、緩和、改善または除去することを意味する。
　本開示において、「疾患を予防する」または「疾患の予防」は、対象において、特に、疾患を発症する可能性が高いが、未だ発症していない対象において、疾患の発症を防止すること、または、疾患を発症する可能性を低減することを意味し、ここで、疾患の発症には再発が含まれる。
　本開示において、「ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤」は、ペントースリン酸経路に関連する酵素の活性または発現を阻害する物質を意味する。当該阻害剤は、例えば、ペントースリン酸経路に関連する酵素の活性または発現を阻害する化合物、ペプチド、抗体または核酸であり得る。ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤として知られている物質、例えば、阻害剤として販売されている物質を使用することができる。インビトロまたはインビボの実験系でペントースリン酸経路に関連する酵素の活性または発現を阻害する物質を同定し、使用してもよい。
　ＦＢＰ－１阻害剤として、例えば、２，５－ジクロロ－Ｎ－（５－クロロ－２－ベンゾキサゾリル）－ベンゼンスルホンアミド、ＭＢ０５０３２（Ｐ－［５－［２－アミノ－５－（２－メチルプロピル）－４－チアゾリル］－２－フラニル］ホスホン酸、ＣＡＳ番号：２６１３６５－１１－１）もしくはそのプロドラッグであるＭＢ０６３２２（エチル（２Ｓ）－２－［［［５－［２－アミノ－５－（２－メチルプロピル）－１，３－チアゾール－４－イル］フラン－２－イル］－［［（２Ｓ）－１－エトキシ－１－オキソプロパン－２－イル］アミノ］ホスファニル］アミノ］プロパン酸、ＣＡＳ番号：２８０７８２－９７－０）、または、ＭＢ０７２２９（（５－（２－アミノ－５－ピバロイルチアゾール－４－イル）フラン－２－イル）ホスホン酸、ＣＡＳ番号：８８２７５５－９５－５）もしくはそのプロドラッグであるＭＢ０７８０３（エチル２－［（｛５－［２－アミノ－５－（２，２－ジメチルプロパノイル）－１，３－チアゾール－４－イル］フラン－２－イル｝［（１－エトキシ－２－メチル－１－オキソプロパン－２－イル）アミノ］ホスホリル）アミノ］－２－メチルプロパン酸、ＣＡＳ番号：８８２７５７－２４－６）を使用し得る。Ｇ６ＰＤおよび６ＰＧＤの阻害剤として、例えば、６－アミノニコチンアミドを使用し得る。ＧＰＩの阻害剤として、例えば、２－デオキシ－Ｄ－グルコースを使用し得る。ＴＸＮＲＤ１の阻害剤として、例えば、オーラノフィン、ＴＲｉ－１、ケトシン（chaetocin）またはＬＣＳ３を使用し得る。ある実施態様では、ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤は、２，５－ジクロロ－Ｎ－（５－クロロ－２－ベンゾキサゾリル）－ベンゼンスルホンアミド、ＭＢ０５０３２、ＭＢ０６３２２、ＭＢ０７２２９、ＭＢ０７８０３、６－アミノニコチンアミド、オーラノフィンまたはＴＲｉ－１である。ある実施態様では、ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤は、２，５－ジクロロ－Ｎ－（５－クロロ－２－ベンゾキサゾリル）－ベンゼンスルホンアミド、ＭＢ０５０３２、ＭＢ０７２２９、ＭＢ０７８０３、６－アミノニコチンアミド、オーラノフィンまたはＴＲｉ－１である。ある実施態様では、ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤は、２，５－ジクロロ－Ｎ－（５－クロロ－２－ベンゾキサゾリル）－ベンゼンスルホンアミド、ＭＢ０５０３２、ＭＢ０７２２９、６－アミノニコチンアミド、オーラノフィンまたはＴＲｉ－１である。ある実施態様では、ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤は、ＭＢ０６３２２、ＭＢ０７８０３またはオーラノフィンである。
　ある実施態様では、ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤は、ＭＢ０７２２９またはＭＢ０７８０３、好ましくはＭＢ０７８０３である。ＭＢ０７８０３は他のＦＢＰ１阻害剤と比較して低用量で使用し得る、および／または、濃度依存活性曲線が緩やかで用量設定の自由度が高い、等の利点を有する。例えば、ＭＢ０７８０３を、約１００～１０００ｍｇ／日、約１５０～５００ｍｇ／日、約２００～４００ｍｇ／日で投与し得る。例えば、約１０００ｍｇのＭＢ０７８０３を単回投与し得る。例えば、約４００ｍｇのＭＢ０７８０３を１日１回、または、約２００ｍｇのＭＢ０７８０３を１日２回、反復投与し得る。例えば、ＭＢ０７８０３を経口投与または非経口投与（例えば、静脈内投与）することができる。
　ペントースリン酸経路に関連する酵素の活性または発現を阻害する核酸は、これらの酵素の遺伝子の転写、転写後調節、翻訳、翻訳後修飾等のいかなる段階を阻害するものであってもよく、酵素活性を阻害するものであってもよい。このような核酸として、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイム、核酸アプタマー、デコイ核酸等が挙げられる。ペントースリン酸経路に関連する酵素の発現を阻害する核酸は、例えば、ｓｉＲＮＡである。
　ｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡを特異的に破壊する二本鎖ＲＮＡを意味する。ループ領域を介してかかる二本鎖を連結させた一本鎖ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）も、ｓｉＲＮＡに含まれる。当業者は、標的ｍＲＮＡのヌクレオチド配列に基づいて適当なｓｉＲＮＡを設計できる。各種のｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡが販売されており、適当なｓｉＲＮＡを用いてもよい。ある実施態様では、ＦＢＰ－１阻害剤は、ＦＢＰ－１に対するｓｉＲＮＡである。ある実施態様では、ＴＸＮＲＤ１阻害剤は、ＴＸＮＲＤ１に対するｓｉＲＮＡである。
　ペントースリン酸経路に関連する酵素の活性または発現を阻害する核酸を含むベクターを使用することもできる。ベクターの例として、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルスベクター等のウイルスベクターが挙げられる。
　ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤の投与方法は特に限定されず、経口投与、非経口投与、注射、輸液等の一般的な投与経路を経ることができる。非経口投与は、全身投与であっても局所投与であってもよい。例えば、静脈内投与、動脈内投与、皮内投与、皮下投与、経皮投与、筋肉内投与、腹腔内投与または鼻腔内投与が挙げられる。肉芽腫が皮膚にある場合、好ましくは局所投与であり、より具体的には、肉芽腫のある部位への塗布、噴霧または注入が挙げられる。
　ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤は、組成物に含めて投与し得る。組成物は、固体、液体またはその間の任意の形態（例えば半固体）であり得、肉芽腫の部位、投与方法および投与量に応じて、公知の各種製剤形態を採り得る。例えば、錠剤、粉剤、粒剤、顆粒剤、細粒剤、カプセル剤、坐剤、用時溶解する固形の注射剤、液状の注射剤、注入剤、点滴用剤などの剤形が挙げられる。また、組成物は、スプレー剤、ローション剤、クリーム剤、貼付剤、軟膏、液剤、乳剤または懸濁剤などの外用剤であり得る。
　これらの剤形は、常法により製剤化することによって製造される。さらに製剤上の必要に応じて、医薬品への使用が認められ得る各種の製剤用物質を配合することができる。製剤用物質は製剤の剤形により適宜選択することができるが、例えば、緩衝化剤、界面活性剤、安定化剤、防腐剤、賦形剤、希釈剤、添加剤、崩壊剤、結合剤、被覆剤、潤滑剤、滑沢剤、風味剤、甘味剤、可溶化剤、色素、染料、香料等が挙げられる。
　ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤の投与量および投与回数は、有効量の当該阻害剤が対象に投与されるように、投与対象の動物種、健康状態、年齢、体重、投与経路、投与形態等に応じて当業者が適宜設定できる。ある状況での有効量は、日常的な実験によって容易に決定することができる。
　ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤は単回投与してもよく、複数回投与してもよく、持続投与してもよい。複数回投与する場合、例えば、１日１回～数回、例えば、１日１回、２回または３回の投与頻度で、連日または数日おきに、例えば、１日、２日、３日または７日おきに、投与し得る。投与期間は制限されず、例えば、肉芽腫が軽減されるまで投与を継続し得る。休薬期間を設けてもよい。
　ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤は、単独で、または、１種またはそれ以上のさらなる有効成分、特に、肉芽腫を処置または予防する有効成分と併用できる。成分を「併用する」ことは、全成分を含有する投与剤形の使用および各成分を別個に含有する投与剤形の組合せの使用のみならず、それらが肉芽腫の処置または予防のために使用される限り、各成分を同時に、または、いずれかの成分を遅延して投与することも意味する。２種またはそれ以上のさらなる有効成分を併用することも可能である。例えば、ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤に加えて、１種またはそれ以上のさらなる有効成分を含む組成物を使用し得る。
　併用に適する有効成分には、例えば、ＪＡＫ阻害剤、非ステロイド消炎鎮痛薬、ステロイド、抗ヒスタミン薬、抗アレルギー薬、免疫抑制剤、抗生物質、抗真菌剤、抗ウイルス剤などが含まれる。肉芽腫を伴う疾患の治療剤を併用することもできる。
　ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤の投与に加えて、薬物療法以外の医療行為、例えば、外科的切除などを実施することもできる。
　ある態様では、ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤を含む肉芽腫の処置および／または予防用の組成物が提供される。
　ある態様では、肉芽腫の処置および／または予防を必要としている対象に有効量のペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤を投与することを含む、肉芽腫の処置および／または予防方法が提供される。
　ある態様では、肉芽腫の処置および／または予防用のペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤が提供される。
　ある態様では、肉芽腫を処置および／または予防するためのペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤の使用が提供される。
　ある態様では、肉芽腫の処置および／または予防用の組成物の製造における、ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤の使用が提供される。
　ある態様では、ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤を含む、肉芽腫を伴う疾患の処置および／または予防用の組成物が提供される。
　ある態様では、肉芽腫を伴う疾患の処置および／または予防を必要としている対象に有効量のペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤を投与することを含む、肉芽腫を伴う疾患の処置および／または予防方法が提供される。
　ある態様では、肉芽腫を伴う疾患の処置および／または予防用のペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤が提供される。
　ある態様では、肉芽腫を伴う疾患を処置および／または予防するためのペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤の使用が提供される。
　ある態様では、肉芽腫を伴う疾患の処置および／または予防用の組成物の製造における、ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤の使用が提供される。
　また、後述する実施例により立証される通り、肉芽腫に含まれるマクロファージおよびサルコイドーシス患者の血中ではペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルが高い。従って、対象から採取された試料におけるペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルに基づいて、対象が肉芽腫を有するか否かを判定することができる。当該酵素のレベルは、試料中の酵素の量または濃度であってもよく、酵素の発現レベルであってもよい。
　試料は、対象から採取された血液、血漿または血清であり得る。血液試料は、通常の方法で、例えば静脈または動脈から、採取され得る。血漿試料または血清試料は、当業者に周知の方法により血液を適宜処理することにより調製し得る。この処理は、特に限定されず、臨床学的に許容されるいかなる処理でもあってもよい。例えば、抗凝固剤の添加、遠心分離などが行われる。試料は、対象から採取された他の体液、例えば、脳脊髄液、唾液、鼻汁、痰、胸水または腹水であってもよい。採取された試料を、必要に応じて適宜濃縮または希釈して使用し得る。試料は、使用に先立ち、その調製中または調製後に低温下で保存してもよく、例えば、冷凍保存し得る。
　試料中のペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルは、ペントースリン酸経路に関連する酵素に特異的に結合する試薬を用いて測定することができる。ペントースリン酸経路に関連する酵素に特異的に結合する試薬は、例えば、化合物、ペプチド、抗体またはアプタマーであり得る。これらの試薬は、ペントースリン酸経路に関連する酵素と特異的に結合できるものであれば、断片、誘導体または類似体であってもよい。
　例えば、試料中のペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルは、それに結合する抗体を用いる免疫学的手法により測定できる。免疫学的手法としては、酵素免疫固相法（ＥＬＩＳＡ法、例えば、直接法、間接法、サンドイッチ法または競合法）、イムノクロマト法、ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー解析、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）などを例示でき、好ましくはＥＬＩＳＡ法である。
　本開示に関して、抗体は、免疫グロブリン骨格をベースとする親和性リガンドを意味し、任意の起源のモノクローナルおよびポリクローナル抗体を含み、ネズミ、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒトおよび他の抗体、並びに複数の種に由来する配列を含むキメラ抗体、例えば、部分的にヒト化された抗体、例えば、部分的にヒト化されたマウス抗体を含む。抗体は、ペントースリン酸経路に関連する酵素と特異的に結合できるものであれば、その断片または誘導体であってもよい。
　抗体は、ペントースリン酸経路に関連する酵素またはその抗原性を有する部分ペプチドを免疫原として用い、既存の一般的な製造方法によって製造し得る。例えば、ポリクローナル抗体は、動物を抗原で免疫化することにより産生し得、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を使用して産生し得る。あるいは、市販の抗体を使用してもよい。
　試薬は、検出可能な物質で標識することができる。検出可能な物質の例としては、放射性同位元素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、酵素標識およびビオチンが挙げられる。試薬に特異的に結合し、標識を有する物質、例えば二次抗体を使用してもよい。
　試薬は、適切な支持体に結合されていてもよい。支持体は、試薬を固定できるものであれば特に限定されず、どのような形状や材質であっても良い。例えば、ナイロン膜などのメンブレン、ビーズ、ガラス、プラスチックおよび金属などの支持体が挙げられる。
　あるいは、試料は、対象から採取された肉芽腫が疑われる組織であり得る。試料をペントースリン酸経路に関連する酵素に結合する試薬と接触させ、結合した試薬の量を画像上で測定することにより、ペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルを測定することができる。例えば、組織を切片にして観察してもよく、組織をスライドガラス等の基板に固定して観察してもよい。試料の固定、透過処理等の、試料中の物質の検出のための一般的な技術は、当分野で周知である。ペントースリン酸経路に関連する酵素に結合する試薬は上記の通りであり、画像処理により検出可能な標識を用いる。
　正立顕微鏡、蛍光顕微鏡などの顕微鏡下で標識を可視化し、ＣＣＤカメラなどにより撮影し、標識のシグナル強度を測定する。シグナル強度の測定には、画像処理用のソフトウェア、例えば、ImageJ ソフトウェア（NIH, Bethesda, MD, USA）などを使用できる。
　ペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルの測定には、自動イメージングおよび画像解析技術、例えばハイコンテント分析（ＨＣＡ）技術を利用してもよい。ＨＣＡ技術は当分野で知られており、多数の細胞の自動イメージングと、これに続く定量的画像解析を含む。ＨＣＡの同義語には、ハイコンテンツイメージングおよびハイコンテンツスクリーニングが含まれる。測定のスピードを速めるために、ロボットもしくは自動装置またはマイクロ流体デバイスを用いてもよい。
　あるいは、対象から採取された肉芽腫が疑われる組織を溶解し、上記の免疫学的手法により試料中のペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルを測定してもよい。酵素の遺伝子発現レベルを、定量ＰＣＲ、マイクロアレイ分析、ＲＮＡシーケンシング、ノーザンブロッティング、ＳＡＧＥ法などの公知の手法により測定してもよい。
　本方法では、対象から採取された試料におけるペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルがカットオフ値と比較して高い場合に、対象が肉芽腫を有すると判定され、レベルがカットオフ値と比較して低い場合に対象が肉芽腫を有さないと判定される。
　ペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルがカットオフ値と同等である場合、対象が肉芽腫を有すると判定するか、有さないと判定するか、判定の目的などに応じて任意に設定できる。従って、ある実施態様では、ペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルがカットオフ値以上である場合に対象が肉芽腫を有すると判定し、ペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルがカットオフ値未満である場合に対象が肉芽腫を有さないと判定する。別の実施態様では、ペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルがカットオフ値より高い場合に対象が肉芽腫を有すると判定し、ペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルがカットオフ値以下である場合に対象が肉芽腫を有さないと判定する。
　カットオフ値は、肉芽腫を有する対象群と有さない対象群を、統計的に有意差をもって分けることができる値である。カットオフ値の設定は、種々の統計解析手法を用いて、公知の方法により実施できる。例えば、肉芽腫を有する対象群から取得された試料におけるペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルと、肉芽腫を有さない対象群から取得された試料におけるペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルを統計解析的に処理することにより、カットオフ値を設定できる。統計的有意差は、カイ二乗検定、一般化Wilcoxon検定、Wilcoxonの符号順位検定、Mann-Whitney検定、ログランク検定、Cox比例ハザードなどの公知の検定方法により解析され得る。カットオフ値の設定には、例えば、Prism等の統計解析用ソフトウェアを使用し得る。
　カットオフ値は、感度および／または特異度に基づいて設定し得る。好ましくは、カットオフ値は、高い感度および高い特異度の両方を示す。ここで、感度とは、真の陽性率を意味する。また、特異度とは真の陰性率を意味する。例えば、肉芽腫を有する対象群で高い陽性率を示し、かつ、肉芽腫を有さない対象群で高い陰性率を示すペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルを、カットオフ値として設定し得る。
　例えば、診断検査の有用性を検討する手法として一般的に用いられているＲＯＣ解析（receiver operating characteristic analysis）により、カットオフ値を設定することができる。ＲＯＣ解析では、各カットオフ値における感度を縦軸に、偽陽性率（１－特異度）を横軸にプロットしたＲＯＣ曲線が作成される。ＲＯＣ曲線は、診断能のない検査では対角線上の直線となるが、診断能が向上するほど、左上方に弧を描く曲線となる。左上隅との距離が最小となるＲＯＣ曲線上の点を与えるカットオフ値は、感度と特異度に優れると言える。また、ヨーデン指標（Youden index）に基づいてカットオフ値を設定することもできる。具体的には、肉芽腫を有する対象群および罹患していない対象群のペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルから感度および特異度を求め、これらの値に基づき、市販の解析ソフトを使用してＲＯＣ曲線を作成する。そして、感度と特異度が可能な限り１００％に近いときの値を求めて、その値をカットオフ値とし得る。
　また、例えば、診断効率（即ち、肉芽腫を有する対象を「肉芽腫を有する」と正しく診断した症例と、肉芽腫を有さない対象を「肉芽腫を有さない」と正しく診断した症例との合計数の全症例数に対する割合）を求め、最も高い診断効率が算出されるペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルをカットオフ値とし得る。
　特徴に応じてサブグループ化された患者群についてカットオフ値を設定することもできる。例えば、性別、年齢層または人種に応じてそれぞれカットオフ値が設定されてよい。
　ある実施態様では、本方法による判定結果を、診断のための情報として提供することができる。
　ある実施態様では、本方法は、対象から試料を採取することを含む。
　ある実施態様では、本方法は、対象から採取された試料におけるペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルを測定することを含む。
　ある実施態様では、本方法は、肉芽腫を有すると判定された対象において、肉芽腫を処置することを含む。例えば、本開示に従って、ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤を投与する。
　別の態様では、ペントースリン酸経路に関連する酵素に特異的に結合する試薬またはペントースリン酸経路に関連する酵素の遺伝子発現を測定するための試薬を含む、対象が肉芽腫を有するか否かを判定するためのキットが提供される。試薬は、水または適当な緩衝液、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に溶解されるか、または凍結乾燥された状態で、適切な容器中に収容されて提供され得る。好適な容器には、ボトル、バイアル、シリンジ、試験管、プレート、メンブレン等が含まれる。容器は、ガラス、プラスチックなどの多様な材料から形成されていてよい。キットは、ペントースリン酸経路に関連する酵素の検出に必要な他の成分や試薬をさらに含んでもよい。例えば、キットは、標識二次抗体、発色基質、ブロッキング液、洗浄緩衝液などをさらに含み得る。キットは、さらに、使用のための説明を含む添付文書等の、商業的見地および使用者の見地から望ましいその他の材料をさらに含み得る。
　ある態様では、対象が肉芽腫を有するか否かを判定するための、ペントースリン酸経路に関連する酵素に特異的に結合する試薬またはペントースリン酸経路に関連する酵素の遺伝子発現を測定するための試薬が提供される。
　ある態様では、対象が肉芽腫を有するか否かを判定するためのキットを製造するための、ペントースリン酸経路に関連する酵素に特異的に結合する試薬またはペントースリン酸経路に関連する酵素の遺伝子発現を測定するための試薬の使用が提供される。
　例えば、下記の実施態様が提供される。
［１］肉芽腫を予防および／または処置するための、ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤を含む組成物。
［２］肉芽腫が、サルコイドーシス、環状肉芽腫、抗酸菌感染症またはクローン病における肉芽腫である、第１項に記載の組成物。
［３］ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤を含む、肉芽腫を伴う疾患の処置および／または予防用の組成物。
［４］肉芽腫を伴う疾患がサルコイドーシス、環状肉芽腫、抗酸菌感染症またはクローン病である、第３項に記載の組成物。
［５］肉芽腫が、サルコイド型、類結核型または柵状肉芽腫である、第１項～第４項のいずれかに記載の組成物。
［６］肉芽腫が、皮膚、肺、眼、心臓、肝臓、腎臓、リンパ節、神経、筋で形成される肉芽腫である、第１項～第５項のいずれかに記載の組成物。
［７］肉芽腫が、皮膚、肺、心臓またはリンパ節で形成される肉芽腫である、第１項～第６項のいずれかに記載の組成物。
［８］肉芽腫が皮膚で形成される肉芽腫である、第１項～第７項のいずれかに記載の組成物。
［９］ペントースリン酸経路に関連する酵素が、ＦＢＰ－１、ＧＰＩ、Ｇ６ＰＤ、ＰＧＬＳ、６ＰＧＤ、ＲＰＥ、ＲＰＩまたはＴＸＮＲＤ１である、第１項～第８項のいずれかに記載の組成物。
［１０］ペントースリン酸経路に関連する酵素が、ＦＢＰ－１、ＧＰＩ、Ｇ６ＰＤ、ＰＧＬＳ、６ＰＧＤ、ＲＰＥまたはＲＰＩである、第１項～第８項のいずれかに記載の組成物。
［１１］ペントースリン酸経路に関連する酵素が、ＦＢＰ－１、ＧＰＩ、Ｇ６ＰＤ、６ＰＧＤまたはＴＸＮＲＤ１である、第１項～第８項のいずれかに記載の組成物。
［１２］ペントースリン酸経路に関連する酵素が、ＦＢＰ－１、ＧＰＩ、Ｇ６ＰＤまたは６ＰＧＤである、第１項～第８項のいずれかに記載の組成物。
［１３］ペントースリン酸経路に関連する酵素が、ＦＢＰ－１、Ｇ６ＰＤまたはＴＸＮＲＤ１である、第１項～第８項のいずれかに記載の組成物。
［１４］ペントースリン酸経路に関連する酵素が、ＦＢＰ－１またはＧ６ＰＤである、第１項～第８項のいずれかに記載の組成物。
［１５］ペントースリン酸経路に関連する酵素が、ＦＢＰ－１またはＴＸＮＲＤ１である、第１項～第８項のいずれかに記載の組成物。
［１６］ペントースリン酸経路に関連する酵素がＦＢＰ－１である、第１項～第８項のいずれかに記載の組成物。
［１７］ペントースリン酸経路に関連する酵素がＧ６ＰＤである、第１項～第８項のいずれかに記載の組成物。
［１８］ペントースリン酸経路に関連する酵素がＴＸＮＲＤ１である、第１項～第８項のいずれかに記載の組成物。
［１９］ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤が、２，５－ジクロロ－Ｎ－（５－クロロ－２－ベンゾキサゾリル）－ベンゼンスルホンアミド、ＭＢ０５０３２、ＭＢ０６３２２、ＭＢ０７２２９、ＭＢ０７８０３、２－デオキシ－Ｄ－グルコース、６－アミノニコチンアミド、オーラノフィン、ＴＲｉ－１、ケトシンまたはＬＣＳ３である、第１項～第８項のいずれかに記載の組成物。
［２０］ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤が、２，５－ジクロロ－Ｎ－（５－クロロ－２－ベンゾキサゾリル）－ベンゼンスルホンアミド、ＭＢ０５０３２、ＭＢ０６３２２、２－デオキシ－Ｄ－グルコースまたは６－アミノニコチンアミドである、第１項～第８項のいずれかに記載の組成物。
［２１］ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤が、２，５－ジクロロ－Ｎ－（５－クロロ－２－ベンゾキサゾリル）－ベンゼンスルホンアミド、ＭＢ０５０３２、ＭＢ０６３２２、ＭＢ０７２２９、ＭＢ０７８０３、６－アミノニコチンアミド、オーラノフィンまたはＴＲｉ－１である、第１項～第８項のいずれかに記載の組成物。
［２２］ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤が、２，５－ジクロロ－Ｎ－（５－クロロ－２－ベンゾキサゾリル）－ベンゼンスルホンアミド、ＭＢ０５０３２、ＭＢ０７２２９、ＭＢ０７８０３、６－アミノニコチンアミド、オーラノフィンまたはＴＲｉ－１である、第１項～第８項のいずれかに記載の組成物。
［２３］ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤が、２，５－ジクロロ－Ｎ－（５－クロロ－２－ベンゾキサゾリル）－ベンゼンスルホンアミド、ＭＢ０５０３２、ＭＢ０７２２９、６－アミノニコチンアミド、オーラノフィンまたはＴＲｉ－１である、第１項～第８項のいずれかに記載の組成物。
［２４］ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤が、２，５－ジクロロ－Ｎ－（５－クロロ－２－ベンゾキサゾリル）－ベンゼンスルホンアミドまたは６－アミノニコチンアミドである、第１項～第８項のいずれかに記載の組成物。
［２５］ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤が、ＭＢ０５０３２、ＭＢ０６３２２、ＭＢ０７２２９、ＭＢ０７８０３、オーラノフィンまたはＴＲｉ－１である、第１項～第８項のいずれかに記載の組成物。
［２６］ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤が、ＭＢ０５０３２、ＭＢ０７２２９、ＭＢ０７８０３、オーラノフィンまたはＴＲｉ－１である、第１項～第８項のいずれかに記載の組成物。
［２７］ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤が、ＭＢ０５０３２、ＭＢ０７２２９、オーラノフィンまたはＴＲｉ－１である、第１項～第８項のいずれかに記載の組成物。
［２８］ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤が、ＭＢ０７２２９、ＭＢ０７８０３、オーラノフィンまたはＴＲｉ－１である、第１項～第８項のいずれかに記載の組成物。
［２９］ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤が、ＭＢ０７２２９、オーラノフィンまたはＴＲｉ－１である、第１項～第８項のいずれかに記載の組成物。
［３０］ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤がＭＢ０７２２９またはＭＢ０７８０３である、第１項～第８項のいずれかに記載の組成物。
［３１］ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤がＭＢ０７２２９である、第１項～第８項のいずれかに記載の組成物。
［３２］ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤がＭＢ０７８０３である、第１項～第８項のいずれかに記載の組成物。
［３３］ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤が、オーラノフィンまたはＴＲｉ－１である、第１項～第８項のいずれかに記載の組成物。
［３４］ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤が、ＭＢ０６３２２、ＭＢ０７８０３またはオーラノフィンである、第１項～第８項のいずれかに記載の組成物。
［３５］ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤が、ＦＢＰ－１、ＧＰＩ、Ｇ６ＰＤ、６ＰＧＤまたはＴＸＮＲＤ１に対するｓｉＲＮＡである、第１項～第８項のいずれかに記載の組成物。
［３６］ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤が、ＦＢＰ－１、ＧＰＩ、Ｇ６ＰＤまたは６ＰＧＤに対するｓｉＲＮＡである、第１項～第８項のいずれかに記載の組成物。
［３７］ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤がＦＢＰ－１に対するｓｉＲＮＡである、第１項～第８項のいずれかに記載の組成物。
［３８］ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤がＴＸＮＲＤ１に対するｓｉＲＮＡである、第１項～第８項のいずれかに記載の組成物。
［３９］対象から採取された試料におけるペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルをカットオフ値と比較することを含む、対象が肉芽腫を有するか否かを判定するための方法。
［４０］対象から採取された試料におけるペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルを測定することを含む、第３９項に記載の方法。
［４１］ペントースリン酸経路に関連する酵素が、ＦＢＰ－１、ＧＰＩ、Ｇ６ＰＤ、ＰＧＬＳ、６ＰＧＤ、ＲＰＥ、ＲＰＩまたはＴＸＮＲＤ１である、第３９項または第４０項に記載の方法。
［４２］ペントースリン酸経路に関連する酵素が、ＦＢＰ－１、ＧＰＩ、Ｇ６ＰＤ、ＰＧＬＳ、６ＰＧＤ、ＲＰＥまたはＲＰＩである、第３９項または第４０項に記載の方法。
［４３］ペントースリン酸経路に関連する酵素が、ＦＢＰ－１、ＧＰＩ、Ｇ６ＰＤ、６ＰＧＤまたはＴＸＮＲＤ１である、第３９項または第４０項に記載の方法。
［４４］ペントースリン酸経路に関連する酵素が、ＦＢＰ－１、ＧＰＩ、Ｇ６ＰＤまたは６ＰＧＤである、第３９項または第４０項に記載の方法。
［４５］ペントースリン酸経路に関連する酵素がＦＢＰ－１である、第３９項または第４０項に記載の方法。
［４６］ペントースリン酸経路に関連する酵素がＴＸＮＲＤ１である、第３９項または第４０項に記載の方法。
［４７］対象から採取された試料におけるペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルがカットオフ値と比較して高い場合に、対象が肉芽腫を有すると判定される、第３９項～第４６項のいずれかに記載の方法。
［４８］対象から採取された試料におけるペントースリン酸経路に関連する酵素のレベルがカットオフ値と比較して低い場合に、対象が肉芽腫を有さないと判定される、第３９項～第４６項のいずれかに記載の方法。
［４９］対象から採取された試料が、血液、血漿、血清または肉芽腫が疑われる組織である、第３９項～第４８項のいずれかに記載の方法。
［５０］対象から採取された試料が、血液、血漿または血清である、第３９項～第４９項のいずれかに記載の方法。
［５１］対象から採取された試料が、肉芽腫が疑われる組織である、第３９項～第４９項のいずれかに記載の方法。
［５２］ペントースリン酸経路に関連する酵素に特異的に結合する試薬またはペントースリン酸経路に関連する酵素の遺伝子発現を測定するための試薬を含む、対象が肉芽腫を有するか否かを判定するためのキット。
［５３］ペントースリン酸経路に関連する酵素が、ＦＢＰ－１、ＧＰＩ、Ｇ６ＰＤ、ＰＧＬＳ、６ＰＧＤ、ＲＰＥ、ＲＰＩまたはＴＸＮＲＤ１である、第４９項に記載のキット。
［５４］ペントースリン酸経路に関連する酵素が、ＦＢＰ－１、ＧＰＩ、Ｇ６ＰＤ、ＰＧＬＳ、６ＰＧＤ、ＲＰＥまたはＲＰＩである、第４９項に記載のキット。
［５５］ペントースリン酸経路に関連する酵素が、ＦＢＰ－１、ＧＰＩ、Ｇ６ＰＤ、６ＰＧＤまたはＴＸＮＲＤ１である、第４９項に記載のキット。
［５６］ペントースリン酸経路に関連する酵素が、ＦＢＰ－１、ＧＰＩ、Ｇ６ＰＤまたは６ＰＧＤである、第４９項に記載のキット。
［５７］ペントースリン酸経路に関連する酵素がＦＢＰ－１である、第４９項に記載のキット。
［５８］ペントースリン酸経路に関連する酵素がＴＸＮＲＤ１である、第４９項に記載のキット。
［５９］ペントースリン酸経路に関連する酵素に特異的に結合する試薬を含む、第４９項～第５５項のいずれかに記載のキット。
［６０］試薬が抗体である、第４９項～第５６項のいずれかに記載のキット。
　本明細書で引用するすべての文献は、出典明示により本明細書の一部とする。
　上記の説明は、すべて非限定的なものであり、本発明は添付の特許請求の範囲において定義され、その技術的思想を逸脱しない範囲で種々の変更が可能である。以下、実施例にて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
［材料と方法］
患者検体の収集
　ヒト試料は、京都大学大学院医学研究科の倫理委員会により承認されたプロトコルに基づき入手した（Ｒ０７４３）。サルコイドーシス患者は過去２週間に外用ステロイド／免疫調節剤を使用しておらず、過去４週間に全身性免疫抑制剤治療を受けていなかった。皮膚は生検後にバンバンカー（日本ジェネティクス）溶液に入れたあと－８０℃で凍結保存した。組織染色に用いたアトピー性皮膚炎、乾癬、環状肉芽腫症、皮膚サルコイドーシス、肺サルコイドーシス組織は、生検、手術後１０％中性緩衝ホルマリン液に２４時間浸した後、パラフィン包埋した。血清は血清分離剤入りスピッツを用いて採血し、遠心後に血清を回収した。
１細胞ＲＮＡシークエンスのライブラリ作成
　凍結保存された生検検体は解凍したのち、Ｗｈｏｌｅ　Ｓｋｉｎ　Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ，　ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて２時間処理し細胞懸濁液を作成した。細胞懸濁液はＣｈｒｏｍｉｕｍ　Ｎｅｘｔ　ＧＥＭ　シングルセル　３'　キット　ｖ３．１（１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を用いてライブラリを作成した。ライブラリＤＮＢＳＥＱ－Ｇ４００（ＭＧＩ　Ｔｅｃｈ）はプラットフォームで配列決定し、約１億５千万から２億リードを得た。シークエンスデータは、ＣｅｌｌＲｅｎｇｅｒ　３．１．０（１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を用いて解析した。
Ｓｅｕｒａｔを用いたクラスタリング解析
　Ｓｅｕｒａｔパッケージ（バージョン４．０．６）を用いたクラスタリング解析は、全細胞を対象とした第１レベルの解析と、細胞種内の第２レベルの高解像度解析の両方で実施された。シングルセルＲＮＡ－ｓｅｑデータセットを単一のＳｅｕｒａｔオブジェクトに結合し、バッチ効果を除去するためにＳＣＴｒａｎｓｆｏｒｍ機能を用いて標準化した。１００遺伝子未満、５０００遺伝子以上、または２０％以上のミトコンドリア含有量を持つ細胞は除外した。Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定を使用して、各クラスターで差次的に発現した遺伝子（ＤＥＧ）を同定し、広い細胞型を定義し、さらに亜集団を特徴付けるために、結果として得られた各細胞型について繰り返した。
サルコイドーシススコアの作成
　サルコイドーシスのバルクＲＮＡシークエンスデータ（ＧＳＥ３２８８７）より非病変部と比べて病変部で上昇している上位１００個の遺伝子を抽出した。それらの遺伝子の平均発現をサルコイドーシススコアとした。
公共データベースを用いたｓｉｎｇｌｅ　ｃｅｌｌ　ＲＮＡ－ｓｅｑデータの解析
　アトピー性皮膚炎、尋常性乾癬（ＨＵＭＡＮ　ＣＥＬＬ　ＡＴＬＡＳ　ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴＡＬ）、環状肉芽腫（ＧＳＥ１５８９２４）、ハンセン病（ＧＳＥ１５１５２８）のデータベースからＳｅｕｒａｔのｓｕｂｓｅｔ機能を用いてＨＬＡ－ＤＲＡ陽性の抗原提示細胞を抽出し、その中のＦＢＰ－１、ＡＣＥ、ＳＴＡＴ１陽性細胞の割合をＤｏｔｐｌｏｔ機能を用いて調べた。
免疫染色
　免疫染色は、ホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織に対して行われた。ＢＯＮＤ　ＲＸ自動免疫染色機（Ｌｅｉｃａ）を用いて染色した。抗原賦活化はＥＲ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ２で４０分行った。切片を、ＣＤ１６３（クローン１０Ｄ６、１：２００；Ｌｅｉｃａ）、ＦＢＰ－１（クローンＥＰＲ４６１９、１：１００；Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）、ＣＤ６８（クローンＰＧ－Ｍ１、１：２００；Ｄａｋｏ）、Ｇ６ＰＤ（１：２０００；Ａｂｃａｍ）、ＴＸＮＲＤ１（クローンＢ－２、１：１００；ＳＡＮＴＡ ＣＲＵＺ）で染色した。二次抗体は、Ｏｐａｌ　ｔｙｒａｍｉｄｅ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（Ａｋｏｙａ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用した。蛍光顕微鏡ＢＺ９０００（キーエンス）を用いて画像を撮影し、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を用いて解析した。
血清ＦＢＰ１の測定
　Ｈｕｍａｎ ＦＢＰ１　ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ＬＳＢｉｏ）を用いて血清のＦＢＰ１濃度を測定した。
インビトロサルコイドーシスモデル
　健常人の末梢血よりリンパ節分離溶液（ナカライ）を用いて末梢血単核球を分離した。ＣＤ１４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて末梢血単核球よりＣＤ１４陽性単球を分離した。単球を１０％ウシ胎児血清入りＲＰＭＩにコンカナバリンＡ（Ｓｉｇｍａ、５μＭ）、ＣＤ４０Ｌ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、３００ｎｇ／ｍｌ）または抗ヒトＣＤ４０抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、１μｇ／ｍｌ）、ＩＦＮγ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、１０ｎｇ／ｍｌ）を加えたものに入れ、０．５ｘ１０５／ウェルで９６ウェル平底プレートに播種した。阻害剤の実験では、フルクトース－１，６－ビスホスファターゼ－１阻害剤（ＦＢＰ－１阻害剤、２，５－ジクロロ－Ｎ－（５－クロロ－２－ベンゾキサゾリル）－ベンゼンスルホンアミド）（Ｃａｙｍａｎ、１００または５００μＭ）、トファシチニブ（Ｓｉｇｍａ、１μＭ）、６－アミノニコチンアミド（６ＡＮ）（Ｓｉｇｍａ、１００μＭ）、ＭＢ０５０３２（Ｃａｙｍａｎ、１０μＭ）、ＭＢ０７７２９（ＴａｒｇｅｔＭｏｌ、１０μＭ）、オーラノフィン（富士フイルム和光純薬、０．１μＭまたは１０μＭ）、ＴＲｉ－１（Ｓｅｌｌｅｃｋ、１μＭまたは１０μＭ）を加えた。あるいは、ｈｏｒｉｚｏｎ社製のＦＢＰ－１遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（製品番号Ｅ－００８７２５－００－００１０）および対照ｓｉＲＮＡを使用した（１μＭ）。メタノールで固定後、ギムザ染色液にて染色し、顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ　ＣＫＫ５３）を用いて撮影し、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を用いて解析した。
遺伝子発現の解析
　Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　は　ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて単離した。ｃＤＮＡは、Ｐｒｉｍｅ　Ｓｃｒｉｐｔ　ＲＴ　ｒｅａｇｅｎｔ　ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いて、トータルＲＮＡ試料から逆転写した。定量的ＲＴ－ＰＣＲは、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）とＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒリアルタイムＰＣＲ装置（Ｒｏｃｈｅ）を用いた。プライマーはすべてグライナー・ジャパンから入手した。プライマー配列は以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001


　ＰＣＲ条件は、９５℃で１０分間の初期酵素活性化、９５℃で１０秒、６０℃で２０秒のサイクルを４５回行った。遺伝子特異的な蛍光は６０℃で測定した。各サンプルについて、二重の試験反応を用いて遺伝子発現を解析し、結果はハウスキーピングであるＡＣＴＢ遺伝子の発現量に対して正規化した。
マウスの飼育
　すべてのマウスは、京都大学大学院医学研究科実験動物研究施設において、特定の病原体を含まない条件下で維持されていた。すべての実験には７－１０週齢の雌マウスを使用した。すべての実験手順は、京都大学動物実験委員会により承認された。
マウス皮膚サルコイドーシスモデル
　７週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（チャールズリバー）に６ＡＮ（２０ｍｇ／ｋｇ）もしくはＰＢＳ（ナカライテスク）を腹腔内投与した。７時間後に麻酔下で２０００個のビーズ（Ｂｉｏ－Ｇｅｌ　Ｐ１０００、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）と２５μｇのコンカナバリンＡを耳介に皮内注射した。毎日、定圧厚さ測定器（テクロック）により耳介厚を測定した。実験４日目にマウスを安楽死させ解析した。
マウス皮膚組織の染色方法
　耳介皮膚を１０％中性緩衝ホルマリン液に２４時間浸した後にパラフィン包埋を行った。５μｍの厚さで切片を作成し、ヘマトキシリン・エオジン染色（Ｓｉｇｍａ）を行った。
マウス皮膚浸潤細胞の解析
　マウス耳介は背側と腹側のシートに分け、１０％子牛胎児血清、１％ペニシリン－ストレプトマイシン、１％ピルビン酸ナトリウム、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．２５ｍｇ／ｍｌ　Ｌｉｂｅｒａｓｅ　ＴＬ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、０．３ｍｇ／ｍｌ　ＤＮａｓｅ　Ｉ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）含むＲＰＭＩ　１６４０中、３７℃で６０分静置した。消化した皮膚シートを４０μｍセルストレーナー（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いてろ過し、単細胞懸濁液とした。
　皮膚から得た単細胞懸濁液を、Ｆｉｘａｂｌｅ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ｄｙｅ　ｅＦｌｕｏｒ（商標）７８０（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色し、死細胞を除外した。次に、抗ＣＤ１６／３２　Ａｂ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で非特異的Ａｂ結合をブロックし、細胞を表面抗原で染色した。下記に記した抗体で表面染色後、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で細胞を固定した。サンプルはＢＤ　ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａセルアナライザー（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で評価し、データはＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて解析した。
抗体一覧
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002

［結果］
サルコイドーシス病変におけるペントースリン酸経路の活性化
　サルコイドーシスの皮膚病変の１細胞ＲＮＡシークエンスを行うことにより、サルコイドーシスにおいて増加しているマクロファージ（ＴＲＥＭ２マクロファージ）を見出した（図１、２）。サルコイドーシス特異的マクロファージは、アンギオテンシン転換酵素（ＡＣＥ）、リゾチーム（ＬＹＺ）、ＳＴＡＴ１といったサルコイドーシス特異的遺伝子を発現していた（図３）。サルコイドーシス特異的マクロファージでは、フルクトース－１，６－ビスホスファターゼ１（ＦＢＰ－１）といった今までに報告されていない分子の発現が上昇していた（図３）。
　サルコイドーシスの皮膚病変をＦＢＰ－１で免疫染色すると、サルコイドーシスの肉芽腫に一致して染色されたが、正常皮膚では全く染色されなかった（図４）。過去に報告された１細胞ＲＮＡシークエンスのデータを解析したところ、環状肉芽腫（ＧＡ）およびハンセン病の皮膚マクロファージにおいてＦＢＰ－１の発現が見られたが、健常皮膚、アトピー性皮膚炎、乾癬の皮膚では発現していなかった（図５）。次にタンパク発現においても、ＦＢＰ－１の発現は環状肉芽腫および肺・心臓・リンパ節サルコイドーシスの肉芽腫でも確認されたが、アトピー性皮膚炎および乾癬の病変では確認されなかった（図６、７）。
　ＦＢＰ－１はグルコース代謝経路のうち、ペントースリン酸回路に作用するので（図８）、ペントースリン酸回路に関連する酵素の発現についてクラスタリング解析を行った。その結果、サルコイドーシス特異的マクロファージでは、グルコースフォスフェートイソメラーゼ（ＧＰＩ）、グルコース－６－リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤ）、６－ホスホグルコン酸脱水素酵素（６ＰＧＤ）およびチオレドキシン還元酵素１（ＴＸＮＲＤ１）の発現も上昇していることが確認された（図９、図１０）。これらは、ペントースリン酸経路においてＦＢＰ－１の下流で作用する酵素である。また、免疫染色においてもＦＢＰ－１陽性細胞に一致してＧ６ＰＤ陽性細胞が見られた（図１１）。サルコイドーシスの病変においてＦＢＰ１、ＴＸＮＲＤ１で免疫染色すると、サルコイドーシスの肉芽腫に一致して染色され、ＦＢＰ１は類上皮細胞に、ＴＸＮＲＤ１は巨細胞特異的に染色された（図１２）。また、サルコイドーシス患者では血清のＦＢＰ１濃度が高いことが確認できた（図１３）。これらの結果は、肉芽腫のマクロファージではペントースリン酸経路が活性化しており、新たな診断マーカーとして使用できる可能性を示唆した。
サルコイドーシスモデルにおけるペントースリン酸経路の阻害
　インビトロのサルコイドーシスモデルとして、ヒト末梢血単球をコンカナバリンＡとＩＦＮγ、ＣＤ４０Ｌと培養し巨細胞形成を誘導するものが従来から知られている（図１４）。このモデルにおいてもＦＢＰ－１やＧ６ＰＤといったペントースリン酸回路に関連する遺伝子が上昇していた（図１５）。そのため、ＦＢＰ－１阻害剤、Ｇ６ＰＤおよび６ＰＧＤ阻害剤（６ＡＮ）またはトファシチニブ（ＪＡＫ阻害剤）の存在下で巨細胞形成を誘導したところ、巨細胞形成は抑制された（図１６）。ただし、低濃度のＦＢＰ－１阻害剤（１００μＭ）では、対照との差異は見られなかった。すでにヒトにおいて別疾患で臨床試験が行われており全身投与が可能なＦＢＰ１阻害剤（ＭＢ０５０３２（１０μＭ）、ＭＢ０７２２９（１０μＭ））またはＴＸＮＲＤ阻害剤（オーラノフィン（０．１μＭ）、ＴＲｉ－１（０．１μＭ））の存在下でも、巨細胞形成は抑制された（図１７、１８）。また、ＦＢＰ－１遺伝子に対するｓｉＲＮＡの存在下で、ＦＢＰ－１遺伝子の発現および巨細胞形成は抑制された（図１９）。ＧＰＩ阻害剤である２－デオキシ－Ｄ－グルコースを使用しても、同様に巨細胞形成は抑制された。
　さらに、巨細胞形成後にＦＢＰ－１阻害剤、６ＡＮまたはトファシチニブを投与し、３日後に分析したところ、巨細胞は減少していた（図２０）。ただし、低濃度のＦＢＰ－１阻害剤（１００μＭ）では、対照との差異は見られなかった。オーラノフィン（１０μＭ）またはＴＲｉ－１（１０μＭ）を使用しても、同様に巨細胞は減少していた（図２１）。
　これらの結果は、サルコイドーシスの治療効果が示唆されているＪＡＫ阻害剤と同様に、ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤を、サルコイドーシスなどの肉芽腫形成疾患の予防および治療に用いることができることを示唆する。
皮膚炎症誘導マウスにおけるペントースリン酸経路の阻害
　マウスにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に懸濁した６ＡＮ（２０ｍｇ／Ｋｇ）を腹腔内投与し、その後にコンカナバリンＡとビーズを皮内注射し、皮膚の炎症およびマクロファージの集積を調べた。ＤＭＳＯ（溶媒）投与群と６ＡＮ投与群では皮下に肉芽腫の形成を認めた。しかしながら、６ＡＮ群では肉芽腫の大きさがＤＭＳＯ群より優位に減少した（図２２）。６ＡＮ投与群では、非投与群と比較して耳介膨張（図２３）が抑制された。また、耳介に浸潤している細胞を比較したところ、６ＡＮ投与群でマクロファージの集積が減弱していた（図２４）。これらの結果は、ペントースリン酸経路の阻害により皮膚における炎症、肉芽腫形成が抑制されることを示唆し、ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤を、サルコイドーシスなどの肉芽腫形成疾患の予防および治療に用いることができることを示唆する。
サルコイドーシスモデルにおけるペントースリン酸経路の阻害
　インビトロのサルコイドーシスモデルにおいて、様々な濃度のＦＢＰ－１阻害剤ＭＢ０７８０３の存在下で巨細胞形成を誘導した。結果を図２５に示す。巨細胞形成は用量依存的に抑制され、ＩＣ５０は１２ｎＭであった。
　インビトロのサルコイドーシスモデルにおいて、様々な濃度のＦＢＰ－１阻害剤ＭＢ０６３２２の存在下で巨細胞形成を誘導した。結果を図２６に示す。巨細胞形成は用量依存的に抑制され、ＩＣ５０は６．８μＭであった。
　また、インビトロのサルコイドーシスモデルにおける巨細胞形成について、ＦＢＰ－１阻害剤ＭＢ０５０３２、ＭＢ０７２２９またはＭＢ０７８０３のＩＣ５０を測定した。結果を図２７に示す。ＭＢ０５０３２およびＭＢ０７２２９のＩＣ５０は１００μＭ以上、ＭＢ０７８０３のＩＣ５０は１０～２０ｎＭであった。
皮膚炎症誘導マウスにおけるペントースリン酸経路の阻害
　マウスにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に懸濁したＭＢ０７８０３（６０ｍｇ／Ｋｇ）を腹腔内投与し、その後にコンカナバリンＡとビーズを皮内注射し、皮膚の炎症およびマクロファージの集積を調べた。ＤＭＳＯ（溶媒）投与群とＭＢ０７８０３投与群では皮下に肉芽腫の形成を認めた。しかしながら、ＭＢ０７８０３群では肉芽腫の大きさがＤＭＳＯ群より減少した（図２８）。これらの結果はＭＢ０７８０３がマウスモデルにおいても肉芽腫を抑制することを示している。
　本開示に従って、肉芽腫または肉芽腫を伴う疾患を処置および／または予防すること、および、対象が肉芽腫を有するか否かを判定することができ、医療分野で有用である。

Claims (11)

  1. 　肉芽腫を予防および／または処置するための、ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤を含む組成物。
  2. 　ペントースリン酸経路に関連する酵素が、フルクトース－１，６－ビスホスファターゼ－１（ＦＢＰ－１）またはチオレドキシン還元酵素１（ＴＸＮＲＤ１）である、請求項１に記載の組成物。
  3. 　ペントースリン酸経路に関連する酵素がＴＸＮＲＤ１である、請求項２に記載の組成物。
  4. 　ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤が、オーラノフィン、ＴＲｉ－１、ケトシンまたはＬＣＳ３である、請求項３に記載の組成物。
  5. 　ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤が、オーラノフィンまたはＴＲｉ－１である、請求項３に記載の組成物。
  6. 　ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤がＴＸＮＲＤ１に対するｓｉＲＮＡである、請求項３に記載の組成物。
  7. 　ペントースリン酸経路に関連する酵素がＦＢＰ－１である、請求項２に記載の組成物。
  8. 　ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤がＭＢ０７２２９またはＭＢ０７８０３である、請求項７に記載の組成物。
  9. 　ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤がＦＢＰ－１に対するｓｉＲＮＡである、請求項７に記載の組成物。
  10. 　肉芽腫が、サルコイドーシス、環状肉芽腫、抗酸菌感染症またはクローン病における肉芽腫である、請求項１～９のいずれかに記載の組成物。
  11. 　肉芽腫を伴う疾患を処置および／または予防するための、ペントースリン酸経路に関連する酵素の阻害剤を含む組成物。
PCT/JP2024/045701 2023-12-25 2024-12-24 肉芽腫または肉芽腫を伴う疾患を処置および／または予防するための組成物および対象が肉芽腫を有するか否かを判定するための方法およびキット Pending WO2025142929A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2023-218324 2023-12-25
JP2023218324 2023-12-25

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2025142929A1 true WO2025142929A1 (ja) 2025-07-03

Family

ID=96217925

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2024/045701 Pending WO2025142929A1 (ja) 2023-12-25 2024-12-24 肉芽腫または肉芽腫を伴う疾患を処置および／または予防するための組成物および対象が肉芽腫を有するか否かを判定するための方法およびキット

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2025142929A1 (ja)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2024005979A (ja) * 2022-06-30 2024-01-17 国立大学法人京都大学 肉芽腫または肉芽腫を伴う疾患を処置および／または予防するための組成物および対象が肉芽腫を有するか否かを判定するための方法およびキット

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2024005979A (ja) * 2022-06-30 2024-01-17 国立大学法人京都大学 肉芽腫または肉芽腫を伴う疾患を処置および／または予防するための組成物および対象が肉芽腫を有するか否かを判定するための方法およびキット

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANONYMOUS: "MB07229 | CAS#882755-95-5 | FBPase inhibitor | MedKoo", THE WAYBACK MACHINE, INTERNET ARCHIVE [ONLINE], 19 May 2022 (2022-05-19), pages 1 - 2, XP093330900, Retrieved from the Internet <URL:https://web.archive.org/web/20220519125338/https://www.medkoo.com/products/40402> *
ANONYMOUS: "MB-07803 | CAS#882757-24-6 | FBPase inhibitor | MedKoo", THE WAYBACK MACHINE, INTERNET ARCHIVE [ONLINE], 17 May 2022 (2022-05-17), pages 1 - 2, XP093330905, Retrieved from the Internet <URL:https://web.archive.org/web/20220517043621/https://www.medkoo.com/products/13199> *
ATIA, ABOU HUSSIEN, SWEED, SWEED, ABO KHALIL: "Auranofin attenuatesSchistosoma mansoniegg-induced liver granuloma and fibrosis in mice", JOURNAL OF HELMINTHOLOGY., CAMBRIDGE UNIV. PRESS, UK, vol. 97, 1 January 2023 (2023-01-01), UK , pages e95 - e95-10, XP009563866, ISSN: 0022-149X, DOI: 10.1017/S0022149X23000792 *
KRAAIJVANGER RAISA, JANSSEN BONáS MONTSE, VORSELAARS ADRIANE D. M., VELTKAMP MARCEL: "Biomarkers in the Diagnosis and Prognosis of Sarcoidosis: Current Use and Future Prospects", FRONTIERS IN IMMUNOLOGY, FRONTIERS MEDIA, LAUSANNE, CH, vol. 11, 14 July 2020 (2020-07-14), Lausanne, CH , XP093330911, ISSN: 1664-3224, DOI: 10.3389/fimmu.2020.01443 *
NAKAMIZO SATOSHI, SUGIURA YUKI, ISHIDA YOSHIHIRO, UEKI YOKO, YONEKURA SATORU, TANIZAKI HIDEAKI, DATE HIROSHI, YOSHIZAWA AKIHIKO, M: "Activation of the pentose phosphate pathway in macrophages is crucial for granuloma formation in sarcoidosis", THE JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION, AMERICAN SOCIETY FOR CLINICAL INVESTIGATION, US, vol. 133, no. 23, 1 December 2023 (2023-12-01), US , XP093330898, ISSN: 1558-8238, DOI: 10.1172/JCI171088 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7595028B2 (ja) 代謝性疾患の治療および予防
Cao et al. Human colonic epithelial cells detect and respond to C5a via apically expressed C5aR through the ERK pathway
US20070154482A1 (en) Methods and compositions for the treatment and diagnosis of diseases characterized by vascular leak, hypotension, or a procoagulant state
Cen et al. Osteopontin blockade attenuates renal injury after ischemia reperfusion by inhibiting NK cell infiltration
US20100028922A1 (en) Identification and characterization of hcv replicon variants with reduced susceptibility to benzofurans, and methods related thereto
JP2018506528A (ja) Ｉｂｄにおける治療標的及びバイオマーカー
Zhao et al. PGF2α facilitates pathological retinal angiogenesis by modulating endothelial FOS‐driven ELR+ CXC chemokine expression
Kang et al. NLRC3 silencing accelerates the invasion of hepatocellular carcinoma cell via IL‐6/JAK2/STAT3 pathway activation
WO2018025923A1 (ja) 抗ｈｔｌｖ－１剤、ｈｔｌｖ－１関連脊髄症（ｈａｍ／ｔｓｐ）治療薬
Wang et al. Pyruvate kinase M2 nuclear translocation regulate ferroptosis-associated acute lung injury in cytokine storm
WO2014167529A1 (en) Methods and compositions for preventing and treating atherosclerosis
US20130012429A1 (en) Anti-viral therapy
WO2013181691A1 (en) A method of treatment and compositions useful therefor, screening and prognostic agents and uses therefor
JP2024005979A (ja) 肉芽腫または肉芽腫を伴う疾患を処置および／または予防するための組成物および対象が肉芽腫を有するか否かを判定するための方法およびキット
Huang et al. Folate alleviated skin inflammation and fibrosis resulting from impaired homocysteine metabolism
JP7175526B2 (ja) 細胞遊走調節に関する疾患の予防・治療剤および肺間質の疾患の疾患活動性判定・予後評価
Dong et al. Classical swine fever virus NS4B protein interacts with MAVS and inhibits IL-8 expression in PAMs
WO2025142929A1 (ja) 肉芽腫または肉芽腫を伴う疾患を処置および／または予防するための組成物および対象が肉芽腫を有するか否かを判定するための方法およびキット
CN118681017A (zh) 一种fbxo22表达抑制剂在制备抑制rps5泛素化的制剂中的应用
WO2015035941A1 (en) Use of annexin a3 as a diagnostic and prognostic biomarker and therapeutic target for treating hepatocellular carcinoma
WO2022123062A1 (en) Blocking caspase and/or fasl for preventing fatal outcome in covid-19 patients
Deng et al. QKI deficiency in macrophages protects mice against JEV infection by regulating cell migration and antiviral response
Hong et al. MiR-21-3p promotes hepatocellular carcinoma progression through regulating Smad7/Yap1
US20210164982A1 (en) Pharmaceutical use of actinin-4 involved in induction of cervical cancer
WO2025225410A1 (ja) 肝線維化、肝硬変、及び肝がんの予防又は治療剤、並びに類洞内圧バイオマーカー

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 24912816

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1