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WO2025033487A1 - 血清または血清代替物の品質管理方法 - Google Patents

血清または血清代替物の品質管理方法 Download PDF

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Publication number
WO2025033487A1
WO2025033487A1 PCT/JP2024/028394 JP2024028394W WO2025033487A1 WO 2025033487 A1 WO2025033487 A1 WO 2025033487A1 JP 2024028394 W JP2024028394 W JP 2024028394W WO 2025033487 A1 WO2025033487 A1 WO 2025033487A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
serum
probe
fluorescence intensity
fluorophore
fluorescence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/JP2024/028394
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
峻介 冨田
紗綾夏 石原
直 小島
僚二 栗田
久未 森川
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Original Assignee
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST filed Critical National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Publication of WO2025033487A1 publication Critical patent/WO2025033487A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Pending legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/49—Blood

Definitions

  • the present invention relates to a method for controlling the quality of serum or serum substitutes.
  • the present invention relates to a method for evaluating the storage conditions or quality differences between lots of serum or serum substitutes.
  • Serum is an essential supplement for cell culture. It is a highly complex solution that contains millions of proteins, such as growth factors and cytokines, as well as a wide variety of organic and inorganic substances, such as lipids, carbohydrates, vitamins, electrolytes, trace elements, and other undefined components.
  • FBS fetal bovine serum
  • its quality is affected by the process of collection, processing, safety testing, and removal of contaminants, as well as differences in the country of origin, the infrastructure, regulations, and management of the manufacturing company (Non-Patent Document 1).
  • Serum requires strict quality control because it greatly affects cell proliferation, phenotypes, and differentiation.
  • due to its complex composition it is not fully understood which components in serum affect cell culture and how.
  • serum because serum is derived from animals, its performance in supporting cell culture usually varies greatly depending on the lot.
  • manufacturers only provide limited information, such as the content of a small number of protein components, endotoxin tests, virus tests, and the results of proliferation tests for specific cell lines. Therefore, end users must actually culture the desired cells to check the quality of the serum (so-called lot-to-lot verification), which requires a great deal of time and effort.
  • lot checks depend on the state of the cells and the skill of the experimenter, and it is often difficult to achieve reliable and consistent quality control.
  • Serum substitutes with defined compositions have been developed to ensure consistency in quality and eliminate pathogen contamination.
  • most serum substitutes also contain animal-derived components, and there are lot differences, and their quality is prone to deterioration depending on storage conditions.
  • the composition of most commercially available serum substitutes is not disclosed, so just like with serum, it is difficult for end users to confirm their quality.
  • the present invention aims to resolve the problems of the conventional technology and provide an easy, rapid, and consistent quality control technique for serum and serum substitutes, regardless of the state of the cells or the skill of the experimenter.
  • the inventors have succeeded in distinguishing samples containing a wide variety of proteins and samples containing microflora using a cross-reactive sensing method (WO 2018/088510, WO 2020/262413). Based on the above method, the inventors have established a method that can distinguish serum quality with high accuracy.
  • the present invention provides a method for controlling the quality of serum or serum substitute, comprising: (1) dissolving a probe in a plurality of solvents having different ionic strengths and/or pHs, wherein the probe comprises (a) a cationic polymer having at least five primary amino groups per molecule and a weight-average molecular weight of 1,000 to 500,000, and (b) an environmentally responsive fluorophore, the fluorophore being covalently bonded to a portion of the primary amino groups in the cationic polymer; (2) adding an analytical sample containing serum or a serum substitute to the plurality of probe solutions prepared in the step (1); (3) measuring the fluorescence intensity of the plurality of probe solutions to which the analytical sample has been added in the step (2); and (4) comparing the fluorescence intensity pattern obtained in the step (3) with the fluorescence intensity pattern obtained for a reference sample.
  • the environmentally responsive fluorophore is preferably selected from the group consisting of fluorophores having a naphthalenesulfonic acid skeleton, fluorophores having a benzofurazan skeleton, fluorophores having a xanthene skeleton, fluorophores having a pyrene skeleton, and aggregation-induced emission fluorophores.
  • the cationic polymer is preferably a linear or branched polyamino acid, polyallylamine, polyamidoamine, or polyalkyleneimine.
  • the environmentally responsive fluorescent group is covalently bonded to 1 to 50% of the primary amino groups in the cationic polymer.
  • At least a portion of the primary amino groups of the cationic polymer to which the environmentally responsive fluorophore is not covalently bonded is modified with an acyl group or an amino acid.
  • the measurement of fluorescence intensity in (3) above is preferably performed for multiple excitation wavelengths and fluorescence wavelengths.
  • the step (4) allows the evaluation of differences in quality between origins, manufacturers, or lots of the serum or serum substitute.
  • step (4) can be used to evaluate the quality difference due to the storage conditions of the serum or serum substitute.
  • the quality is preferably the ability to support the survival, proliferation, phenotype or differentiation of cultured cells.
  • the method of the present invention does not require comprehensive analysis of the components in serum or serum substitutes or actual cell culture, but rather uses only one or a few types of probes to obtain a fluorescence intensity pattern that reflects the sum of non-specific interactions between all biological components and the probes, making it possible to determine the quality of serum or serum substitutes with high accuracy, ease, and consistency. Therefore, the method of the present invention makes it possible to perform quality control of serum or serum substitutes, for example, by using a serum or serum substitute of guaranteed quality as a reference sample and simply comparing the fluorescence intensity pattern.
  • FIG. 1A shows the change in fluorescence spectrum when human serum was added to 300 nM probe 1 (-None)/20 mM MOPS (pH 7.0)
  • Fig. 1B shows the change in fluorescence intensity when various concentrations of human serum were added to 300 nM probe 1 (-None), probe 2 (-Phe), probe 4 (-Suc) or probe 5 (-Pht)/20 mM MOPS (pH 7.0).
  • FIG. 2 is a graph showing the change in fluorescence intensity (II 0 ) obtained by measuring serum (16 animal species) ⁇ 2 solvent conditions ⁇ 6 probes ⁇ 2 wavelength sets ⁇ 10 times.
  • FIG. 3 shows a heat map representation of the data in FIG.
  • FIG. 4 is a diagram in which the data in FIG. 2 is analyzed by unsupervised principal component analysis, and the obtained principal components up to the second principal component are plotted.
  • FIG. 5 is a diagram in which the data in FIG. 2 is analyzed by supervised linear discriminant analysis and the obtained second discriminant scores are plotted.
  • FIG. 6 is a heat map of the change in fluorescence intensity (II 0 ) obtained by measuring fetal bovine serum (4 producing countries ⁇ 2 lots) ⁇ 2 solvent conditions ⁇ 6 probes ⁇ 2 wavelength sets ⁇ 10 times.
  • FIG. 7 is a diagram in which the data in FIG.
  • FIG. 6 is analyzed by linear discriminant analysis, and the obtained first discriminant scores and second discriminant scores (left) and the obtained first discriminant scores and third discriminant scores (right) are plotted.
  • FIG. 8 is a diagram in which the data in FIG. 6 is analyzed by linear discriminant analysis without distinguishing the lots, and the obtained second discriminant scores are plotted.
  • FIG. 9 is a diagram in which the data in FIG. 2 and FIG. 6 are integrated, analyzed by linear discriminant analysis, and the obtained second discriminant scores are plotted.
  • FIG. 10 is a heat map of the change in fluorescence intensity (II 0 ) obtained by fetal bovine serum (untreated or 7 storage/treatment conditions) ⁇ 2 solvent conditions ⁇ 6 probes ⁇ 2 wavelength sets ⁇ 10 measurements.
  • FIG. 10 is a heat map of the change in fluorescence intensity (II 0 ) obtained by fetal bovine serum (untreated or 7 storage/treatment conditions) ⁇ 2 solvent conditions ⁇ 6 probes ⁇ 2 wavelength sets ⁇ 10 measurements.
  • FIG. 11 is a diagram in which the data in FIG. 10 is analyzed by linear discriminant analysis and the obtained second discriminant scores are plotted.
  • FIG. 12 is a graph showing the increase in cell number in culture of human dermal fibroblasts (NHDF) with fetal bovine serum (untreated or 7 storage/treatment conditions).
  • FIG. 13 shows changes in fluorescence intensity when various concentrations of CDM1 were added to 300 nM of probe 1 (-None) or probe 5 (-Pht)/20 mM MOPS (pH 7.0).
  • FIG. 14 shows microscopic images showing the results of culturing HCN4-EGFP — 409B2 cells with CDM1 containing N2 and B27, either untreated or treated at various temperatures (top: bright field image, bottom: fluorescent image).
  • FIG. 15 is a graph showing the appearance of GFP-positive (HCN4-positive) cells in cultures of HCN4-EGFP — 409B2 cells with CDM1 containing N2 and B27, either untreated or treated at various temperatures.
  • FIG. 16 is a heat map of the change in fluorescence intensity (II 0 ) obtained by CDM1 (untreated or 4 treatment conditions, containing N2/B27) ⁇ 2 solvent conditions ⁇ 6 probes ⁇ 2 wavelength sets ⁇ 10 measurements.
  • FIG. 17 is a diagram in which the data in FIG. 16 is analyzed by principal component analysis, and the obtained principal components up to the second principal component are plotted.
  • FIG. 18 is a diagram in which the data in FIG.
  • FIG. 19 shows changes in fluorescence intensity when various concentrations of KSR were added to 300 nM of probe 1 (-None) or probe 5 (-Pht)/20 mM MOPS (pH 7.0).
  • FIG. 20 shows images of 409B2 cell cultures using KSR with different storage periods (top: stained image of undifferentiated cell colonies, bottom: bright field microscope image of the cells).
  • FIG. 21 is a graph showing the changes (relative values) in the number of colonies and the number of cells in the culture of FIG. FIG.
  • FIG. 22 is a heat map of the change in fluorescence intensity (II 0 ) obtained by KSR (5 storage periods) ⁇ 2 solvent conditions ⁇ 6 probes ⁇ 2 wavelength sets ⁇ 10 measurements.
  • FIG. 23 is a diagram in which the data in FIG. 22 is analyzed by linear discriminant analysis and the obtained second discriminant scores are plotted.
  • 24 is a diagram showing the structural formulas of the probes (probes 1 to 6: -None, -Phe, -Nle, -Suc, -Pht, -Pyr) used in the examples. The numbers in parentheses indicate the ClogP values of the sites where functional groups have been introduced.
  • FIG. 1 the probes
  • FIG. 25 shows changes in fluorescence intensity when various concentrations of yeast extract were added to 300 nM of probe 1 (-None) or probe 5 (-Pht)/20 mM MOPS (pH 7.0).
  • FIG. 26 is a heat map of the change in fluorescence intensity (II 0 ) obtained by yeast extract (2 manufacturers ⁇ 4 autoclave times) ⁇ 2 solvent conditions ⁇ 6 probes ⁇ 2 wavelength sets ⁇ 6 measurements.
  • FIG. 27 is a diagram in which the data in FIG. 26 is analyzed by linear discriminant analysis and the obtained second discriminant scores are plotted.
  • the present invention is a method for controlling the quality of serum or serum substitute, comprising: (1) a step of dissolving a probe in a plurality of solvents having different ionic strengths and/or pHs, wherein the probe comprises (a) a cationic polymer having at least five primary amino groups in one molecule and a weight-average molecular weight of 1,000 to 500,000, and (b) an environmentally responsive fluorophore, and the fluorophore is covalently bonded to a portion of the primary amino groups in the cationic polymer; (2) a step of adding an analytical sample containing serum or a serum substitute to the plurality of probe solutions prepared in the step (1); (3) a step of measuring the fluorescence intensity of the plurality of probe solutions to which the analytical sample has been added in the step (2); and (4) a step of comparing the fluorescence intensity pattern obtained in the step (3) with the fluorescence intensity pattern obtained for a reference sample.
  • the probe used in the method of this embodiment contains (a) a cationic polymer having at least five primary amino groups in one molecule and a weight-average molecular weight of 1,000 to 500,000, and (b) an environmentally responsive fluorophore, and the fluorophore is covalently bonded to some of the primary amino groups in the cationic polymer.
  • the cationic polymer (a) of the probe in this embodiment may be any polymer as long as it has a weight-average molecular weight of 1,000 to 500,000 and at least five primary amino groups in one molecule.
  • polymer means a compound in which two or more monomers, which may be the same or different, are polymerized, and therefore may be a homopolymer or a copolymer.
  • the degree of polymerization of the polymer is not particularly limited, and therefore "polymer” also includes an oligomer in which several monomers (e.g., 3 to 20) are polymerized.
  • the weight average molecular weight of the cationic polymer of the probe in this embodiment is 1,000 to 500,000, preferably 1,500 to 200,000, and particularly preferably 2,000 to 100,000.
  • the cationic polymer of the probe in this embodiment has at least 5, preferably 7 or more, and particularly preferably 10 or more primary amino groups in one molecule of the polymer.
  • the cationic polymer that can be used for the probe is preferably a linear or branched polyamino acid, polyallylamine, polyamidoamine, or polyalkyleneimine. Furthermore, these cationic polymers may be copolymerized with polyethylene glycol.
  • the polyamino acid that can be used for the probe may be a polymer of the same type of amino acid residues, or may be a polymer of different types of amino acid residues.
  • the amino acid residues that make up the polyamino acid may be either L- or D-isomers.
  • polyamino acids include polylysine, polyornithine, random copolymers of lysine and phenylalanine, and random copolymers of lysine and tyrosine.
  • the preferred polyamino acid in this embodiment is polylysine or polyornithine.
  • examples of polyalkyleneimines that can be used for the probe include polyethyleneimine, polypropyleneimine, and polybutyleneimine.
  • the preferred polyalkyleneimine in this embodiment is polyethyleneimine.
  • the environmentally responsive fluorophore (b) of the probe in this embodiment may be any fluorophore whose fluorescence properties change depending on the environment around the fluorescent molecule.
  • fluorophores include, but are not limited to, fluorophores whose fluorescence properties change depending on the polarity around the fluorescent molecule, fluorophores whose fluorescence properties change depending on the pH around the fluorescent molecule, and fluorophores whose fluorescence properties change depending on the degree of crowding around the fluorescent molecule.
  • Fluorophores whose fluorescent properties change depending on the polarity around the fluorescent molecule include, for example, fluorophores with a naphthalenesulfonic acid skeleton, such as 5-dimethylaminonaphthalene-1-sulfonyl (dansyl), 1-anilinonaphthalene-8-sulfonic acid (ANS), N-methyl-2-anilinonaphthalene-6-sulfonic acid (MANS), and 2-p-toluidinylnaphthalene-6-sulfonic acid (TNS); fluorophores with a benzofurazan skeleton, such as 4-(N,N-dimethylaminosulfonyl)-2,1,3-benzoxadiazole (DBD), 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole (NBD), 4-(aminosulfonyl)-2,1,3-benzoxadiazole (ABD), and 2,1,3-benzoxadiazole-4-ammonium sul
  • Fluorophores whose fluorescent properties change depending on the pH around the fluorescent molecule include, for example, fluorophores with a xanthene skeleton, such as fluorescein, fluorescein isothiocyanate (FITC), 5(6)-carboxyfluorescein (5(6)-FAM), 2'-7'-bis(carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein (BCECF), and seminaphthalodafluorescein (SNARF); fluorophores with a pyrene skeleton, such as trisodium 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonate (HTPS); or fluorescent derivatives thereof.
  • fluorophores with a xanthene skeleton such as fluorescein, fluorescein isothiocyanate (FITC), 5(6)-carboxyfluorescein (5(6)-FAM), 2'-7'-bis(carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein (BCECF
  • AIE aggregation-induced emission fluorophores
  • TPE tetraphenylethylene
  • THBA 10,10',11,11'-tetrahydro-5,5'-bisbenzo[a,d][7]annulenylidene
  • HPS 1,1,2,3,4,5-hexaphenylsilole
  • the preferred environmentally responsive fluorophores in this embodiment may be dansyl, NBD, DBD or TPE or fluorescent derivatives thereof.
  • the probe in this embodiment has an environmentally responsive fluorophore (b) covalently introduced to some of the primary amino groups in the cationic polymer (a).
  • "some” preferably refers to 1 to 50% of the primary amino groups in the cationic polymer molecule, and particularly preferably 5 to 20%.
  • the probe in this embodiment can be synthesized by a conventionally known chemical synthesis method, or the chemical synthesis method described in the examples of WO 2018/088510 or WO 2020/262413, or a chemical synthesis method equivalent thereto.
  • the amino group of the cationic polymer (a) can be prepared by labeling with an environmentally responsive fluorophore (b) activated by an active ester group such as an N-hydroxysuccinimide (NHS) ester group, a pentafluorophenyl (PFP) ester group, or an O-acylisourea group, an isothiocyanate group, or an alkyl halide group.
  • an environmentally responsive fluorophore (b) activated by an active ester group such as an N-hydroxysuccinimide (NHS) ester group, a pentafluorophenyl (PFP) ester group, or an O-acylisourea group, an isothiocyanate group, or an alkyl
  • At least a part of the primary amino groups to which an environmentally responsive fluorophore is not introduced may be modified with a modifying group.
  • a hydrogen atom (H) may be substituted with a monovalent modifying group (X) (-NHX).
  • the modifying group may have either a negative charge or a positive charge, and may preferably be selected from the group consisting of a guanidino group, an acyl group, and an amino acid.
  • amino acid examples include leucine, valine, isoleucine, tyrosine, tryptophan, phenylalanine, serine, asparagine, glutamine, or derivatives thereof.
  • the probe of this embodiment may be modified with one or more modifying groups selected from the above.
  • the modification of an amino group with a modifying group can be carried out by a conventionally known chemical synthesis method.
  • the modification of an amino group with a guanidino group can be carried out by, for example, guanidinylating the amino group using 1H-pyrazole-1-carboxamidine hydrochloride.
  • the modification of an amino group with an acyl group can be carried out by, for example, a nucleophilic acyl substitution reaction using a carboxylic anhydride such as acetic anhydride, phthalic anhydride, or naphthalenedicarboxylic anhydride.
  • the modification of an amino group with an amino acid can be carried out by, for example, dehydration condensation of the carboxyl group of the amino acid and the amino group.
  • the probe in this embodiment can interact non-specifically with any biomolecule.
  • the "biomolecule” targeted by the probe in this embodiment may be any type of compound present in a living body, and may have any molecular weight. Examples of such biomolecules include, but are not limited to, proteins, peptides, amino acids, nucleic acids, nucleotides, lipids, polysaccharides, monosaccharides, vitamins, hormones, etc.
  • the biomolecules targeted by the probe in this embodiment may include not only known biomolecules, but also unknown biomolecules.
  • the probe in this embodiment can preferably interact primarily with proteins and their peptide fragments.
  • the probe in this embodiment can interact non-specifically with any protein and its peptide fragments, regardless of the type of protein or the type of post-translational modification.
  • the above-mentioned probe is dissolved in a plurality of solvents having different ionic strengths and/or pHs.
  • the solvent for dissolving the probe may be an aqueous solvent containing any buffer and/or salt.
  • the buffer include MES, MOPS, EPPS, HEPES, Tris, phosphoric acid, acetic acid, citric acid, boric acid, and glycine.
  • the salt include NaCl, KCl, MgCl 2 , Na 2 SO 4 , K 2 SO 4 , MgSO 4 , NaI, and NaSCN.
  • the pH of the solvent is preferably 4.0 to 10.0, and particularly preferably 5.0 to 7.0.
  • the ionic strength of the solvent is preferably 10 to 500 mM.
  • the concentration of the probe is preferably 0.1 to 100 ⁇ g/mL.
  • two or more types of solvents with different ionic strengths and/or pH conditions can be used, preferably three or more types, and particularly preferably six or more types of solvents with different ionic strengths and/or pH conditions can be used.
  • one type of probe may be used, but it is more preferable to use multiple types of probes, for example, two or more types, preferably three or more types, and particularly preferably six or more types of probes can be used.
  • two types of solvents and three types of probes are used, six types of probe solutions can be prepared, and as a result, six-dimensional data can be obtained for one analytical sample.
  • 15 types of probe solutions can be prepared, and as a result, 15-dimensional data can be obtained for one analytical sample. In this way, by increasing the types of solvents and probes, more multidimensional data can be obtained.
  • an analytical sample containing serum or a serum substitute is added to the multiple probe solutions.
  • the "serum" in this embodiment may be derived from any animal, but is preferably derived from a mammal such as a cow, horse, sheep, goat, pig, rabbit, rat, mouse, or human.
  • the age of the animal from which the serum is derived is not particularly limited, and may be any age, including fetus, newborn, and adult.
  • the country/region of origin of the serum is also not particularly limited. A wide variety of animal-derived sera produced in various countries/regions are commercially available, and the method of this embodiment can analyze any of them.
  • serum replacement is a general term for serum-free supplements used in place of serum in cell culture. Serum replacements generally contain several to several dozens of factors selected from growth factors, cytokines, hormones, etc. Various serum replacements are commercially available, such as N2 supplement (Cell Cult. Neurosci. 1985; pp. 3-43) and improved versions thereof, B27 supplement (J. Neurosci. Res. 1993; 35(5): 567-76) and improved versions thereof, G5 supplement (Int. J. Dev. Neurosci.
  • serum replacements include, but are not limited to, KnockOutTM Serum Replacement (KSR) (Thermo Fisher Scientific), StemSureTM Serum Replacement (SSR) (FUJIFILM Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), XF212 XerumFree (TNC BIO BV), human platelet lysate, plant hydrolysate, corn extract, yeast extract, soybean extract, and the like. Many commercially available serum replacements do not have their specific compositions published, but the method of this embodiment can analyze any of them.
  • KSR KnockOutTM Serum Replacement
  • SSR StemSureTM Serum Replacement
  • TMC BIO BV XF212 XerumFree
  • the analytical sample in this embodiment may consist of only serum or serum substitute, or may be a culture medium containing serum or serum substitute.
  • the final concentration of serum or serum substitute added to the probe solution may be, for example, 0.001 vol% to 99.9 vol%, and preferably 0.01 vol% to 10 vol%. If the concentration of serum or serum substitute in the analytical sample is unknown, the sample may be appropriately diluted in stages and added to the probe solution.
  • the probe interacts non-specifically with any biological molecules contained in the serum or serum substitute.
  • the fluorescence intensity of the multiple probe solutions to which the analytical sample has been added is measured.
  • the fluorescence intensity can be measured at an excitation wavelength of 300 to 500 nm and a fluorescence wavelength of 400 to 700 nm.
  • it is preferable to measure the fluorescence intensity for each measurement target at multiple excitation wavelength/fluorescence wavelength sets e.g., excitation wavelength (nm)/fluorescence wavelength (nm): 340/520, 330/480, 345/505, 360/530, etc.
  • the fluorescence intensity can be measured using, for example, two, three, or four sets of excitation wavelength/fluorescence wavelength.
  • the fluorescence intensity of the probe solution changes depending on the type, amount, and state of the biomolecules contained in the serum or serum substitute, and also on the conditions of the solvent in which the probe is dissolved. Therefore, this step makes it possible to obtain a fluorescence intensity pattern (fluorescence fingerprint) that is unique to the sample.
  • the fluorescence intensity pattern obtained for the analytical sample is compared with the fluorescence intensity pattern obtained for the reference sample.
  • the fluorescence intensity pattern for the reference sample may be obtained by measuring the fluorescence intensity in parallel with the analytical sample, or may be a predetermined fluorescence intensity pattern prepared in advance.
  • the comparison of the fluorescence intensity patterns is preferably performed by compressing the number of dimensions using multivariate analysis such as principal component analysis, linear discriminant analysis, and hierarchical cluster analysis, and compressing and converting the differences between the fluorescent fingerprints into two or three dimensions for comparison.
  • the method of the present embodiment can determine the quality of serum or serum substitutes based only on the difference in the pattern of fluorescence intensity.
  • the "quality" of serum or serum substitutes refers to the ability to support cells when added to a medium and used in culture, specifically, the ability to support characteristics such as survival, proliferation, phenotype, or differentiation of cultured cells. These characteristics can be determined by various activities such as adhesion, movement, division, metabolism, and secretion of growth factors and cytokines, and therefore the ability to support the characteristics of cultured cells can be the ability to support, maintain, or control cellular activities such as adhesion, movement, division, metabolism, and secretion of growth factors and cytokines.
  • the quality of serum or serum substitutes varies greatly depending on the place of origin, manufacturer, lot, etc., but sufficient information is not provided to determine the quality. Furthermore, the quality of serum or serum substitutes deteriorates depending on the temperature and period of storage, but it is very difficult and impractical to individually identify which components have changed to what extent and in what way to cause deterioration in quality.
  • the method of this embodiment obtains a fluorescence intensity pattern (fluorescence fingerprint) that reflects the sum of nonspecific interactions between various biomolecules in serum and the probe, and compares it with the fluorescence intensity pattern for a reference sample, making it possible to detect differences in the overall quality of serum or serum substitutes.
  • a fluorescent fingerprint obtained for a serum or serum substitute currently being used for culture is compared with a fluorescent fingerprint obtained for a serum or serum substitute from a different origin/manufacturer A, B, or C (analytical sample).
  • analytical sample obtained for a serum or serum substitute from origin/manufacturer A is probabilistically closest to the distribution of the fluorescent fingerprint obtained for the reference sample, it can be estimated or identified that the serum or serum substitute from origin/manufacturer A can be used in place of the serum or serum substitute currently being used.
  • a fluorescent fingerprint obtained for a serum or serum substitute (reference sample) currently being used for culture is compared with a fluorescent fingerprint obtained for a serum or serum substitute (analytical sample) from the same place of origin/manufacturer but different lots A, B, or C.
  • a fluorescent fingerprint obtained for serum or serum substitute lot A is probabilistically closest to the distribution of the fluorescent fingerprint obtained for the reference sample, it can be estimated or determined that serum or serum substitute lot A can be used in place of the serum or serum substitute currently being used.
  • a fluorescent fingerprint obtained for serum or serum substitute immediately after purchase is compared with a fluorescent fingerprint obtained for serum or serum substitute (analytical sample) from the same origin/manufacturer/lot but in different storage conditions A, B, or C (e.g., different storage temperature and/or period).
  • A, B, or C e.g., different storage temperature and/or period
  • the method of this embodiment makes it possible to evaluate the quality of serum or serum substitutes without the need to actually culture cells and test their proliferation or differentiation ability. Therefore, the method of this embodiment makes it possible to easily, quickly, and consistently control the quality of serum or serum substitutes, regardless of the state of the cells or the skill of the experimenter.
  • Probe 1 A probe in which tetraphenylethylene (TPE) was introduced into polyethylene glycol-block-poly-L-lysine trifluoroacetate (PEG-b-PLL, Mw: 17200) [number of ethylene glycol repeat units: 104, number of L-lysine trifluoroacetate repeat units: 52] (hereinafter referred to as "-None")
  • Probe 2 A probe obtained by dehydration condensation reaction of the amino group in -None (probe 1) with phenylalanine (hereinafter referred to as "-Phe”)
  • Probe 3 A probe obtained by dehydration condensation reaction of the amino group in -None (probe 1) with norleucine (hereinafter referred to as "-Nle”)
  • Probe 4 A probe obtained by nucleophilic acyl substitution reaction of the amino group in -None (pro
  • probes 1 to 6 (-None, -Phe, -Nle, -Suc, -Pht, -Pyr) are shown in Figure 24.
  • Probes 1, 2, 4 and 5 (-None, -Phe, -Suc, -Pht) were dissolved in 20 mM MOPS (pH 7.0) to prepare four types of probe solutions (333 nM). Each probe solution was added to a 96-well microplate (Corning, 3650) at 180 ⁇ L/well using an automatic pipetting device (Andrew+, Andrew Alliance). After incubation at 35° C. for 10 minutes, the fluorescence intensity (fluorescence wavelength 480 nm) and fluorescence spectrum (fluorescence wavelength 372 to 700 nm) at an excitation wavelength of 330 nm were measured using a microplate reader (Cytation5, BioTek).
  • the changes in fluorescence intensity at 480 nm for probes 1, 2, 4, and 5 are shown in Figure 2.
  • the fluorescence intensity of probe 1 (-None) increased in a serum concentration-dependent manner when the amount of serum added was 0.075 vol% or less, but began to decrease when the amount exceeded 0.075 vol%.
  • the fluorescence intensity of probe 4 (-Suc) and probe 5 (-Pht) increased monotonically in a serum concentration-dependent manner.
  • the fluorescence intensity of probe 2 (-Phe) hardly changed even when serum was added.
  • Probes 1 to 6 (-None, -Phe, -Nle, -Suc, -Pht, -Pyr) were dissolved in the following two types of buffer solutions: 22.2 mM MOPS (pH 7.0) or 22.2 mM acetic acid (pH 5.0) to prepare 12 types of probe solutions (333 nM). Each probe solution was added to a 96-well half-well microplate (Corning, 3993) at 180 ⁇ L/well using an automatic pipetting device (Andrew+, Andrew Alliance). After incubation at 35° C.
  • the fluorescence intensity (I 0 ) was measured by a microplate reader (Cytation5, BioTek) at the following two sets of excitation wavelength (nm)/fluorescence wavelength (nm): (Ch1) 330/480, (Ch2) 360/530. Then, serum solutions derived from various animals (serum numbers 1 to 16, each 1 vol% serum/pure water) were added at 12 ⁇ L/well using an automatic dispenser, and after incubation at 35° C. for 10 minutes, the fluorescence intensity (I) was measured under the same conditions (final concentrations: 300 nM probe, 0.1 vol% serum, 20 mM buffer). Each measurement (16 sera x 2 solvent conditions x 6 probes x 2 wavelength sets) was repeated 10 times.
  • the fluorescence patterns were analyzed by linear discriminant analysis, and the results of plotting the first and second discriminant scores obtained and the results of plotting the first and third discriminant scores obtained are shown in FIG. 7.
  • the clusters of each fetal bovine serum were distributed without overlapping. Furthermore, when the results were analyzed by the jackknife method and the holdout method, it was confirmed that each fetal bovine serum could be identified with an accuracy of 96% and 88%, respectively.
  • the fluorescence patterns were analyzed by linear discriminant analysis without distinguishing the lots, and the results of plotting up to the second discriminant scores obtained are shown in FIG. 8.
  • the clusters of each producing country were distributed without overlapping. Furthermore, when the results were analyzed by the jackknife method and the holdout method, it was confirmed that each fetal bovine sera could be identified with an accuracy of 96% and 84%, respectively.
  • Fetal bovine serum (serum number 18) was dispensed into microtubes and stored or treated under sealed and light-shielded conditions under the following conditions: (1) 4°C for 2 weeks, (2) 4°C for 4 weeks, (3) 37°C for 1 week, (4) 37°C for 2 weeks, (5) 37°C for 4 weeks, (6) 56°C for 30 minutes, or (7) 56°C for 60 minutes. Then, the samples were analyzed under the same procedures and conditions as in 3 above. Fetal bovine serum (serum number 18) immediately after thawing was used as a control (untreated).
  • a heat map of the measurement results is shown in Figure 10.
  • a unique fluorescence pattern was obtained for each fetal bovine serum stored under different conditions.
  • the fluorescence patterns were analyzed by linear discriminant analysis, and the results up to the second discriminant score obtained are plotted in Figure 11. All sera stored at 4°C were distributed so as to overlap with the control (untreated), whereas sera stored at 37°C or treated at 56°C were distributed without overlapping.
  • the third and fourth discriminant scores were plotted, the clusters of the control (untreated), those stored at 4°C for 2 weeks, and those stored at 4°C for 4 weeks were distributed without overlapping (data not shown).
  • these results were analyzed by the jackknife method and the holdout method, it was confirmed that the storage or treatment conditions of the serum could be identified with an accuracy of 98% and 97%, respectively.
  • NHDF human dermal fibroblasts
  • Probes 1 and 5 were dissolved in 20 mM MOPS (pH 7.0) to prepare two types of probe solutions (400 nM). Each probe solution was added to a 384-well microplate (Corning, 3575) at 45 ⁇ L/well using an automatic pipetting device (Andrew+, Andrew Alliance). After incubation at 35° C. for 10 minutes, the fluorescence intensity at an excitation wavelength of 330 nm (fluorescence wavelength 480 nm) was measured using a microplate reader (Cytation5, BioTek).
  • Cardiac differentiation induction medium 1 (DM/F-12 supplemented with 1% N-2 supplement, 2% B-27 supplement, 1% NEAA, 1% GlutaMAX, 1% PS and 0.1 mM 2-ME) (hereinafter referred to as "CDM1") was prepared, and various concentrations of CDM1/20 mM MOPS (pH 7.0) solutions were added at 15 ⁇ L/well using an automatic dispenser. After incubation at 35 ° C for 10 minutes, the fluorescence intensity was measured under the same conditions (final concentration: 300 nM probe, 0-2 vol% CDM1, 20 mM MOPS (pH 7.0)).
  • the results are shown in Figure 13.
  • the fluorescence intensity of both probe 1 (-None) and probe 5 (-Pht) increased in a CDM1 concentration-dependent manner, and the response was saturated at approximately 1 vol%.
  • N-2 supplement hereinafter simply referred to as "N2”
  • B-27 supplement hereinafter simply referred to as "B27”
  • CDM1 was prepared using untreated or each treated N2 and B27.
  • HCN4-EGFP_409B2 cells (Regen. Ther.
  • the cells were dispersed and collected by trypsinization, and seeded at a density of 1 x 104 cells/well on a PrimeSurfaceTM 96U low-attachment plate using cardiac differentiation induction medium 2 (RPMI1640 supplemented with 1% pyruvic acid, 1% GlutaMAX, 1% ITS-G supplement, 2 mM L-ascorbic acid, 10 mM nicotinamide, 0.2 ⁇ M dexamethasone, 0.5% FBS , 1% PS, and 10 ng/mL bFGF and 10 ng/mL BMP4) (hereinafter referred to as "CDM2"). Thereafter, the medium was replaced with fresh CDM2 every 2 to 3 days.
  • cardiac differentiation induction medium 2 RPMI1640 supplemented with 1% pyruvic acid, 1% GlutaMAX, 1% ITS-G supplement, 2 mM L-ascorbic acid, 10 mM nicotinamide, 0.2 ⁇ M de
  • GFP fluorescence was observed on the 19th or 20th day using a fluorescent microscope (Olympus, IX73). Then, 2 mg/mL collagenase II (Worthington, CLS2) was added to the cells and incubated overnight at room temperature. The cells were dispersed and collected, and GFP-positive (i.e., HCN4-positive) cells were counted using a FACSAriaTM III cell sorter (BD biosciences).
  • Probes 1 to 6 (-None, -Phe, -Nle, -Suc, -Pht, -Pyr) were dissolved in the following two types of buffer solutions: 24 mM MOPS (pH 7.0) or 24 mM acetic acid (pH 5.0) to prepare 12 types of probe solutions (360 nM). Each probe solution was added to a 384-well microplate (Corning, 3575) at 50 ⁇ L/well using an automatic pipetting device (Andrew+, Andrew Alliance). After incubation at 35° C.
  • the fluorescence intensity (I 0 ) was measured by a microplate reader (Cytation5, BioTek) at the following two sets of excitation wavelength (nm)/fluorescence wavelength (nm): (Ch1) 330/480, (Ch2) 360/530. Then, 10 ⁇ L/well of CDM1 solution (3 vol% CDM1/pure water) containing untreated or each heat-treated N2/B27 was added using an automatic dispenser. After incubation at 35° C. for 10 minutes, the fluorescence intensity was measured under the same conditions (final concentrations: 300 nM probe, 0.5 vol% CDM1, 20 mM buffer).
  • the heat map of the measurement results is shown in Figure 16.
  • a unique fluorescence pattern was obtained for each CDM1 containing N2/B27 at different heat treatment temperatures.
  • the fluorescence patterns were analyzed by linear discriminant analysis, and the results up to the second discriminant score obtained are plotted in Figure 17.
  • the clusters moved significantly after treatment at 55°C and 65°C. On the other hand, almost no change was observed between untreated and treated at 45°C, and between treated at 65°C and 75°C.
  • CDM1 containing N2/B27 treated at 45°C which showed almost no change in both differentiation induction ability and fluorescence pattern, was labeled as "Good”
  • CDM1 containing N2/B27 treated at 55°C which showed a large change in fluorescence pattern but almost no change in differentiation induction ability
  • CDM1 containing N2/B27 treated at 65°C and 75°C which almost lost its differentiation induction ability, was labeled as "Unacceptable”.
  • the results were analyzed by linear discriminant analysis, and the results up to the second discriminant score obtained are plotted in Figure 18. The clusters of each performance were distributed without overlapping with each other. Furthermore, when the results were analyzed using the jackknife method and the holdout method, it was confirmed that the differentiation induction performance of CDM1 could be identified with 100% accuracy in both cases.
  • Probes 1 and 5 were dissolved in 20 mM MOPS (pH 7.0) to prepare two types of probe solutions (400 nM). Each probe solution was added to a 384-well microplate (Corning, 3575) at 45 ⁇ L/well using an automatic dispenser (Andrew+, Andrew Alliance). After incubation at 35° C. for 10 minutes, the fluorescence intensity (fluorescence wavelength 480 nm) at an excitation wavelength of 330 nm was measured using a microplate reader (Cytation5, BioTek).
  • the results are shown in Figure 19.
  • the fluorescence intensity of both probe 1 (-None) and probe 5 (-Pht) increased in a KSR concentration-dependent manner, and the response was saturated at approximately 0.1 vol%.
  • 409B2 cells (human iPS cells) were suspended in iPS cell growth medium supplemented with 5 ng/mL bFGF and 10 ⁇ M Y27632, and seeded at a density of 1 ⁇ 10 4 cells/well on a 6-well plate (Corning, 3506) coated with Matrigel (Corning, 356231). Thereafter, the medium was replaced with fresh iPS cell growth medium supplemented with 5 ng/mL bFGF once every 3 days, and the cells were cultured. On the 9th day after seeding, undifferentiated cell colonies were stained using AP Staining Kit (SBI, AP100B-1), and the number of stained colonies was counted.
  • SBI AP Staining Kit
  • 409B2 cells were seeded at a density of 1 ⁇ 10 5 cells/well, and the medium was replaced with fresh iPS cell growth medium supplemented with 5 ng/mL bFGF every day, and the cells were cultured.
  • microscopic images were taken, and the cells were then dispersed by trypsin treatment, recovered, and the cell numbers were counted using a hemocytometer.
  • Figures 20 and 21 The results are shown in Figures 20 and 21.
  • the upper panel shows a stained image of the colonies, and the lower panel shows a bright-field microscopic image of the cells.
  • the left panel shows the change in the number of stained colonies, and the right panel shows the change in cell number (normalized to 1 as the number of colonies in culture using In-date 1).
  • Probes 1 to 6 (-None, -Phe, -Nle, -Suc, -Pht, -Pyr) were dissolved in the following two types of buffer solutions: 24 mM MOPS (pH 7.0) or 24 mM acetic acid (pH 5.0) to prepare 12 types of probe solutions (360 nM). Each probe solution was added to a 384-well microplate (Corning, 3575) at 50 ⁇ L/well using an automatic pipetting device (Andrew+, Andrew Alliance).
  • the heat map of the measurement results is shown in Figure 22.
  • a unique fluorescence pattern was obtained for each KSR with different storage periods.
  • the fluorescence patterns consisting of [-None, pH 7.0 and pH 5.0, Ch1 and Ch2], [-Nle, pH 7.0, Ch1 and Ch2], [-Phe, pH 7.0, Ch1], [-Phe, pH 5.0, Ch1 and Ch2], [-Suc, pH 7.0 and pH 5.0, Ch1], [-Pht, pH 5.0, Ch2], and [-Pyr, pH 7.0 and pH 5.0, Ch1 and Ch2] were analyzed by linear discriminant analysis, and the results up to the second discriminant score obtained are plotted in Figure 23.
  • YE-B Yeast extract powders from different manufacturers (Becton Dickinson and Oxoid) (hereinafter referred to as "YE-B” and “YE-O", respectively) were dissolved in pure water at a concentration of 1%, and 10 mL was added to a 15 mL centrifuge tube and autoclaved at 121°C for 10 to 30 minutes.
  • Probes 1 and 5 (-None, -Pht) were dissolved in 20 mM MOPS (pH 7.0) to prepare two types of probe solutions (1800 nM).
  • Untreated or autoclaved yeast extract solutions were diluted to various concentrations with 20 mM MOPS (pH 7.0) and added to a 384-well microplate (Corning, 3575) at 50 ⁇ L/well using an automatic dispenser (Assist Plus, Integra Biosciences). After incubation at 35°C for 10 minutes, the fluorescence intensity (fluorescence wavelength 480 nm) at an excitation wavelength of 330 nm was measured using a microplate reader (Synergy H1, Agilent Technologies). 10 ⁇ L/well of 1800 nM probe solution/20 mM MOPS (pH 7.0) solution was added using an automatic dispenser. After incubation at 35°C for 10 minutes, the fluorescence intensity was measured under the same conditions (final concentrations: 300 nM probe, 0-0.3% yeast extract, 20 mM MOPS (pH 7.0)).
  • the results for YE-B are shown in Figure 25.
  • the fluorescence intensity of both probe 1 (-None) and probe 5 (-Pht) increased depending on the concentration of the yeast extract solution, and the response of probe 1 was saturated at approximately 0.10%, and that of probe 5 was saturated at approximately 0.30%.
  • Probes 1 to 6 (-None, -Phe, -Nle, -Suc, -Pht, -Pyr) were dissolved in pure water to prepare 12 types of probe solutions (1800 nM). 0.12% solutions of each yeast extract dissolved in the following two types of buffer solutions: 24 mM MOPS (pH 7.0) or 24 mM acetic acid (pH 5.0) were added to a 384-well microplate (Corning, 3575) at 50 ⁇ L/well using an automatic dispenser (Assist Plus, Integra Biosciences).
  • the fluorescence intensity was measured using a microplate reader (Synergy H1, Agilent Technologies) at the following two sets of excitation wavelength (nm)/fluorescence wavelength (nm): (Ch1) 330/480, (Ch2) 360/530. Then, 10 ⁇ L/well of probe solution (1800 nM probe/pure water) was added using an automatic dispenser. After incubation at 35°C for 10 minutes, the fluorescence intensity was measured under the same conditions (final concentrations: 300 nM probe, 0.1% yeast extract, 20 mM buffer).
  • FIG. 26 A heat map of the measurement results is shown in Figure 26.
  • a unique fluorescence pattern was obtained for each yeast extract solution from different manufacturers and autoclaving times.
  • the fluorescence patterns were analyzed using linear discriminant analysis, and the results up to the second discrimination score were plotted in Figure 27.
  • the clusters of yeast extract solutions from different manufacturers and autoclaving times were distributed without overlapping with each other. Furthermore, when these results were analyzed using the jackknife method, it was confirmed that each yeast extract solution could be identified with 96% accuracy.

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Abstract

（１）イオン強度／ｐＨの異なる複数の溶媒に、プローブを溶解するステップと、ここで、前記プローブが（ａ）カチオン性ポリマーと（ｂ）環境応答性蛍光団とを含み、かつ、前記蛍光団が、前記カチオン性ポリマー中の前記１級アミノ基の一部に共有結合しているものであり；（２）前記ステップ（１）で調製された複数のプローブ溶液に、血清または血清代替物を含有する分析試料を添加するステップと；（３）前記ステップ（２）で分析試料を添加した複数のプローブ溶液の蛍光強度を測定するステップと；（４）前記ステップ（３）により得られた蛍光強度パターンを、参照試料について得られた蛍光強度パターンと比較するステップとを含む、血清または血清代替物の品質を管理する方法を提供する。

Description

血清または血清代替物の品質管理方法
　本発明は、血清または血清代替物の品質を管理する方法に関する。本発明は、特には、血清または血清代替物の保存状態またはロット間での品質の差異を評価する方法に関する。
　血清は、細胞培養のための不可欠なサプリメントである。血清は、増殖因子やサイトカインといった数百万種類のタンパク質に加え、脂質、炭水化物、ビタミン、電解質、微量元素、およびその他の不確定成分など、多種多様な有機物・無機物を含んでなる、非常に複雑な組成からなる溶液である。一般的な細胞培養では、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が主に使用されており、その品質は、採取・加工・安全性試験・汚染物質の除去のようなプロセスに加え、原産国や製造企業のインフラや規制、管理の違いなどの影響を受ける（非特許文献１）。
　血清は、細胞の増殖、形質、分化などを大きく左右するものであるため、厳密な品質管理が求められる。しかし、その組成の複雑さゆえに、血清中のどの成分がどのように細胞培養に影響するのかについては十分に理解されていない。その上、血清は動物由来であるため、ロットによって細胞培養をサポートする性能が大きく異なることが通常である。にもかかわらず、製造企業からは、ごく一部のタンパク質成分の含有量や、エンドトキシン試験、ウイルス試験、特定の細胞株についての増殖試験の結果などの、限定的な情報が提供されるのみである。そのため、エンドユーザーは、目的の細胞を実際に培養して血清の品質を確認（いわゆるロットチェック（ｌｏｔ－ｔｏ－ｌｏｔ　ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ））しなければならず、そのためには多大な時間と労力を要する。さらに、ロットチェックは細胞の状態や実験者のスキルに依存し、信頼に足る一貫性のある品質管理が困難である場合も多い。
　品質の一貫性および病原体汚染の排除の観点から、組成が画定された血清代替物が開発されている。しかし、血清代替物も動物由来成分を含むものが大半であり、ロット差があり、保存の状態によって品質も劣化しやすい。さらに、市販の血清代替物の多くは組成が非公開であるため、エンドユーザーが品質を確認することは、血清同様、やはり困難である。
P. Hawkes et al., "Fetal Bovine Serum - Country of Origin, Geographic Relevance, and Labeling", BioProcess. J., 2019, Vol. 18
　本発明は、従来技術の諸問題を解消し、細胞の状態や実験者のスキルによらず、容易かつ迅速な、一貫性のある血清および血清代替物の品質管理技術を提供することを目的としてなされたものである。
　本発明者らは、交差反応型センシング法により、広範な種類のタンパク質を含有する試料や、微生物叢を含有する試料を判別することに成功している（国際公開第２０１８／０８８５１０号、国際公開第２０２０／２６２４１３号）。本発明者らは、上記方法を基に、血清の品質を高精度で判別できる方法を確立した。
　すなわち、本発明は、一実施形態によれば、（１）イオン強度および／またはｐＨの異なる複数の溶媒に、プローブを溶解するステップと、ここで、前記プローブが、（ａ）１分子中に少なくとも５個の１級アミノ基を有する、重量平均分子量が１，０００～５００，０００であるカチオン性ポリマーと、（ｂ）環境応答性蛍光団とを含み、かつ、前記蛍光団が、前記カチオン性ポリマー中の前記１級アミノ基の一部に共有結合しているものであり、（２）前記ステップ（１）で調製された複数のプローブ溶液に、血清または血清代替物を含有する分析試料を添加するステップと、（３）前記ステップ（２）で分析試料を添加した複数のプローブ溶液の蛍光強度を測定するステップと、（４）前記ステップ（３）により得られた蛍光強度パターンを、参照試料について得られた蛍光強度パターンと比較するステップとを含む、血清または血清代替物の品質を管理する方法を提供するものである。
　前記環境応答性蛍光団は、ナフタレンスルホン酸骨格を有する蛍光団、ベンゾフラザン骨格を有する蛍光団、キサンテン骨格を有する蛍光団、ピレン骨格を有する蛍光団および凝集誘起発光性蛍光団からなる群から選択されることが好ましい。
　前記カチオン性ポリマーは、直鎖状または分岐状のポリアミノ酸、ポリアリルアミン、ポリアミドアミンもしくはポリアルキレンイミンであることが好ましい。
　前記カチオン性ポリマー中の前記１級アミノ基の１～５０％に前記環境応答性蛍光団が共有結合していることが好ましい。
　前記カチオン性ポリマーの前記環境応答性蛍光団が共有結合していない前記１級アミノ基の少なくとも一部が、アシル基またはアミノ酸により修飾されていることが好ましい。
　前記（３）における蛍光強度の測定は、複数の励起波長および蛍光波長について行われることが好ましい。
　前記ステップ（４）により、前記血清もしくは血清代替物の産地、製造元またはロット間での品質の差異が評価され得る。
　あるいは、前記ステップ（４）により、前記血清または血清代替物の保存状態による品質の差異が評価され得る。
　前記品質は、培養細胞の生存、増殖、形質または分化をサポートする性能であることが好ましい。
　本発明に係る方法によれば、血清または血清代替物中の成分の網羅的な分析や実際の細胞培養を必要とせず、わずか１種類または数種類のプローブを用いて、あらゆる生体成分とプローブとの非特異的相互作用の総和を反映した蛍光強度パターンを取得するのみにより、血清または血清代替物の品質を、高精度かつ容易に、一貫性をもって判別することができる。そのため、本発明に係る方法によれば、例えば、品質が保証されている血清または血清代替物を参照試料とし、単に蛍光強度パターンを比較するのみにより、血清または血清代替物の品質管理を行うことが可能となる。
図１Ａは、３００ｎＭのプローブ１（－Ｎｏｎｅ）／２０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）にヒト血清を添加したときの蛍光スペクトルの変化を示す図である。図１Ｂは、３００ｎＭのプローブ１（－Ｎｏｎｅ）、プローブ２（－Ｐｈｅ）、プローブ４（－Ｓｕｃ）またはプローブ５（－Ｐｈｔ）／２０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）に種々の濃度のヒト血清を添加したときの蛍光強度の変化を示す図である。 図２は、血清（１６動物種）×２溶媒条件×６プローブ×２波長セット×１０測定により得られた蛍光強度の変化量（Ｉ－Ｉ０）を示すグラフである。 図３は、図２のデータのヒートマップ表示および図２のデータの教師なしの階層的クラスター分析によって得られた系統樹を示す図である。 図４は、図２のデータを教師なしの主成分分析により解析し、得られた第二主成分までをプロットした図である。 図５は、図２のデータを教師ありの線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアまでをプロットした図である。 図６は、ウシ胎児血清（４生産国×２ロット）×２溶媒条件×６プローブ×２波長セット×１０測定により得られた蛍光強度の変化量（Ｉ－Ｉ０）のヒートマップである。 図７は、図６のデータを線形判別分析により解析し、得られた第一判別スコアおよび第二判別スコア（左）ならびに得られた第一判別スコアおよび第三判別スコア（右）をプロットした図である。 図８は、ロットを区別せずに図６のデータを線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアまでをプロットした図である。 図９は、図２および図６のデータを統合し、線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアまでをプロットした図である。 図１０は、ウシ胎児血清（未処理または７保存／処理条件）×２溶媒条件×６プローブ×２波長セット×１０測定により得られた蛍光強度の変化量（Ｉ－Ｉ０）のヒートマップである。 図１１は、図１０のデータを線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアまでをプロットした図である。 図１２は、ウシ胎児血清（未処理または７保存／処理条件）を用いたヒト皮膚由来線維芽細胞（ＮＨＤＦ）の培養における細胞数の増加を示すグラフである。 図１３は、３００ｎＭのプローブ１（－Ｎｏｎｅ）またはプローブ５（－Ｐｈｔ）／２０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）に種々の濃度のＣＤＭ１を添加したときの蛍光強度の変化を示す図である。 図１４は、未処理または種々の温度で処理されたＮ２およびＢ２７を含有するＣＤＭ１を用いてＨＣＮ４－ＥＧＦＰ＿４０９Ｂ２細胞を培養した結果を示す顕微鏡像である（上：明視野像、下：蛍光像）。 図１５は、未処理または種々の温度で処理されたＮ２およびＢ２７を含有するＣＤＭ１を用いたＨＣＮ４－ＥＧＦＰ＿４０９Ｂ２細胞の培養におけるＧＦＰ陽性（ＨＣＮ４陽性）細胞の出現率を示すグラフである。 図１６は、ＣＤＭ１（未処理または４処理条件Ｎ２／Ｂ２７含有）×２溶媒条件×６プローブ×２波長セット×１０測定により得られた蛍光強度の変化量（Ｉ－Ｉ０）のヒートマップである。 図１７は、図１６のデータを主成分分析により解析し、得られた第二主成分までをプロットした図である。 図１８は、分化誘導性能（Ｇｏｏｄ、ＡｃｃｅｐｔａｂｌｅまたはＵｎａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）でラベルされた図１６のデータを線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアまでをプロットした図である。 図１９は、３００ｎＭのプローブ１（－Ｎｏｎｅ）またはプローブ５（－Ｐｈｔ）／２０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）に種々の濃度のＫＳＲを添加したときの蛍光強度の変化を示す図である。 図２０は、保存期間が異なるＫＳＲを用いた４０９Ｂ２細胞の培養の画像である（上：未分化細胞コロニーの染色像、下：細胞の明視野顕微鏡像）。 図２１は、図２０の培養におけるコロニー数および細胞数の変化（相対値）を示すグラフである。 図２２は、ＫＳＲ（５保存期間）×２溶媒条件×６プローブ×２波長セット×１０測定により得られた蛍光強度の変化量（Ｉ－Ｉ０）のヒートマップである。 図２３は、図２２のデータを線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアまでをプロットした図である。 図２４は、実施例において使用したプローブ（プローブ１～６：－Ｎｏｎｅ、－Ｐｈｅ、－Ｎｌｅ、－Ｓｕｃ、－Ｐｈｔ、－Ｐｙｒ）の構造式を示す図である。括弧内の数値は官能基を導入した部位のＣｌｏｇＰ値を示す。 図２５は、３００ｎＭのプローブ１（－Ｎｏｎｅ）またはプローブ５（－Ｐｈｔ）／２０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）に種々の濃度の酵母エキスを添加したときの蛍光強度の変化を示す図である。 図２６は、酵母エキス（２メーカー×４オートクレーブ時間）×２溶媒条件×６プローブ×２波長セット×６測定により得られた蛍光強度の変化量（Ｉ－Ｉ０）のヒートマップである。 図２７は、図２６のデータを線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアまでをプロットした図である。
　以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は本明細書中に説明した実施形態に限定されるものではない。
　本発明は、第一の実施形態によれば、（１）イオン強度および／またはｐＨの異なる複数の溶媒に、プローブを溶解するステップと、ここで、前記プローブが、（ａ）１分子中に少なくとも５個の１級アミノ基を有する、重量平均分子量が１，０００～５００，０００であるカチオン性ポリマーと、（ｂ）環境応答性蛍光団とを含み、かつ、前記蛍光団が、前記カチオン性ポリマー中の前記１級アミノ基の一部に共有結合しているものであり、（２）前記ステップ（１）で調製された複数のプローブ溶液に、血清または血清代替物を含有する分析試料を添加するステップと、（３）前記ステップ（２）で分析試料を添加した複数のプローブ溶液の蛍光強度を測定するステップと、（４）前記ステップ（３）により得られた蛍光強度パターンを、参照試料について得られた蛍光強度パターンと比較するステップとを含む、血清または血清代替物の品質を管理する方法である。
　最初に、本実施形態の方法において使用するプローブについて説明する。本実施形態の方法において使用するプローブは、（ａ）１分子中に少なくとも５個の１級アミノ基を有する、重量平均分子量が１，０００～５００，０００であるカチオン性ポリマーと、（ｂ）環境応答性蛍光団とを含み、かつ、前記蛍光団が、前記カチオン性ポリマー中の前記１級アミノ基の一部に共有結合しているものである。
　本実施形態におけるプローブのカチオン性ポリマー（ａ）は、重量平均分子量が１，０００～５００，０００であり、当該ポリマー１分子中に少なくとも５個の１級アミノ基を有するものであれば、任意のものであってよい。ここで、「ポリマー」とは、同一であっても異なってもよい２以上のモノマーが重合された化合物を意味し、したがって、ホモポリマーであってもよいし、コポリマーであってもよい。また、ポリマーの重合度も特に限定されず、したがって、「ポリマー」には、数個（例えば３～２０個）のモノマーが重合したオリゴマーも含まれる。
　本実施形態におけるプローブのカチオン性ポリマーの重量平均分子量は、１，０００～５００，０００であり、好ましくは１，５００～２００，０００であり、特に好ましくは２，０００～１００，０００である。
　本実施形態におけるプローブのカチオン性ポリマーは、当該ポリマー１分子中に少なくとも５個、好ましくは７個以上、特に好ましくは１０個以上の１級アミノ基を有する。
　本実施形態において、プローブに用いることができるカチオン性ポリマーは、好ましくは、直鎖状または分岐状のポリアミノ酸、ポリアリルアミン、ポリアミドアミンもしくはポリアルキレンイミンである。さらに、これらのカチオン性ポリマーを、ポリエチレングリコールとのコポリマーとしてもよい。
　本実施形態において、プローブに用いることができるポリアミノ酸は、同種類のアミノ酸残基が重合されたものであってもよいし、異なる種類のアミノ酸残基が重合されたものであってもよい。また、ポリアミノ酸を構成するアミノ酸残基は、Ｌ体またはＤ体のいずれであってもよい。ポリアミノ酸の例としては、ポリリジン、ポリオルニチン、リジンとフェニルアラニンのランダムコポリマー、リジンとチロシンのランダムコポリマーなどが挙げられる。本実施形態における好ましいポリアミノ酸は、ポリリジンまたはポリオルニチンである。
　本実施形態において、プローブに用いることができるポリアルキレンイミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリプロピレンイミン、ポリブチレンイミンなどが挙げられる。本実施形態における好ましいポリアルキレンイミンは、ポリエチレンイミンである。
　本実施形態におけるプローブの環境応答性蛍光団（ｂ）は、蛍光分子周辺の環境に応じて蛍光特性が変化する蛍光団であれば、任意のものであってよい。そのような蛍光団としては、例えば、蛍光分子周辺の極性に応じて蛍光特性が変化する蛍光団や、蛍光分子周辺のｐＨに応じて蛍光特性が変化する蛍光団や、蛍光分子周辺の混雑度に応じて蛍光特性が変化する蛍光団などが挙げられるが、これらに限定されない。
　蛍光分子周辺の極性に応じて蛍光特性が変化する蛍光団としては、例えば、５－ジメチルアミノナフタレン－１－スルホニル（ダンシル）、１－アニリノナフタレン－８－スルホン酸（ＡＮＳ）、Ｎ－メチル－２－アニリノナフタレン－６－スルホン酸（ＭＡＮＳ）、２－ｐ－トルイジニルナフタレン－６－スルホン酸（ＴＮＳ）のような、ナフタレンスルホン酸骨格を有する蛍光団；４－（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノスルホニル）－２，１，３－ベンゾキサジアゾール（ＤＢＤ）、７－ニトロ－２，１，３－ベンゾキサジアゾール（ＮＢＤ）、４－（アミノスルホニル）－２，１，３－ベンゾキサジアゾール（ＡＢＤ）、２，１，３－ベンゾキサジアゾール－４－スルホン酸アンモニウム（ＳＢＤ）のような、ベンゾフラザン骨格を有する蛍光団；またはそれらの蛍光性誘導体などが挙げられる。
　蛍光分子周辺のｐＨに応じて蛍光特性が変化する蛍光団としては、例えば、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、５（６）－カルボキシフルオレセイン（５（６）－ＦＡＭ）、２’－７’－ビス（カルボキシエチル）－５（６）－カルボキシフルオレセイン（ＢＣＥＣＦ）、セミナフタロダフルオレセイン（ＳＮＡＲＦ）のような、キサンテン骨格を有する蛍光団；８－ヒドロキシピレン－１，３，６－トリスルホン酸三ナトリウム（ＨＴＰＳ）のような、ピレン骨格を有する蛍光団；またはそれらの蛍光性誘導体などが挙げられる。
　蛍光分子周辺の混雑度に応じて蛍光特性が変化する蛍光団としては、例えば、テトラフェニルエチレン（ＴＰＥ）、１０，１０’ ，１１，１１’－テトラヒドロ－５，５’－ビジベンゾ［ａ，ｄ］［７］アヌレニリデン（ＴＨＢＡ）、１，１，２，３，４，５－ヘキサフェニルシロール（ＨＰＳ）などの凝集誘起発光性（ＡＩＥ）蛍光団またはそれらの蛍光性誘導体などが挙げられる。
　本実施形態における好ましい環境応答性蛍光団は、ダンシル、ＮＢＤ、ＤＢＤもしくはＴＰＥまたはそれらの蛍光性誘導体であってよい。
　本実施形態におけるプローブは、カチオン性ポリマー（ａ）中の１級アミノ基の一部に環境応答性蛍光団（ｂ）が共有結合により導入されてなる。ここで、「一部」とは、カチオン性ポリマー分子中の１級アミノ基のうちの１～５０％であることが好ましく、特に好ましくは５～２０％である。
　本実施形態におけるプローブは、従来公知の化学合成方法や、国際公開第２０１８／０８８５１０号または国際公開第２０２０／２６２４１３号の実施例において記載する化学合成方法およびそれに準ずる化学合成方法により合成することができる。具体的には、例えば、カチオン性ポリマー（ａ）のアミノ基を、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）エステル基やペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）エステル基、Ｏ－アシルイソウレア基などの活性エステル基、イソチオシアネート基またはハロゲン化アルキル基などにより活性化された環境応答性蛍光団（ｂ）により標識化することにより調製すればよい。
　本実施形態におけるプローブは、環境応答性蛍光団が導入されていない１級アミノ基の少なくとも一部が修飾基により修飾されていてもよい。言い換えれば、環境応答性蛍光団が導入されていない１級アミノ基（－ＮＨ２）の少なくとも一部において、水素原子（Ｈ）が一価の修飾基（Ｘ）により置換されていてよい（－ＮＨＸ）。修飾基は、負電荷または正電荷のいずれを有するものであってよく、好ましくは、グアニジノ基、アシル基およびアミノ酸からなる群から選択され得る。また、アミノ酸としては、例えば、ロイシン、バリン、イソロイシン、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、セリン、アスパラギン、グルタミン、またはそれらの誘導体などが挙げられる。本実施形態におけるプローブは、上記から選択される１または複数の修飾基により修飾されてよい。
　修飾基によるアミノ基の修飾は、従来公知の化学合成方法により行うことができる。グアニジノ基によるアミノ基の修飾は、例えば、１Ｈ－ピラゾール－１－カルボキサミジン塩酸塩を用いて、アミノ基をグアニジニル化することができる。アシル基によるアミノ基の修飾は、例えば、無水酢酸、無水フタル酸、ナフタレンジカルボン酸無水物などのカルボン酸無水物を用いた求核アシル置換反応により行うことができる。アミノ酸によるアミノ基の修飾は、例えば、アミノ酸のカルボキシル基とアミノ基との脱水縮合により行うことができる。
　本実施形態におけるプローブは、任意の生体分子と非特異的に相互作用することができる。本実施形態におけるプローブが対象とする「生体分子」は、生体内に存在する任意の種類の化合物であってよく、任意の分子量を有するものであってよい。そのような生体分子としては、例えば、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、ヌクレオチド、脂質、多糖、単糖、ビタミン、ホルモンなどが挙げられるが、これらに限定されない。また、本実施形態におけるプローブが対象とする生体分子には、既知の生体分子のみならず、未知の生体分子が含まれ得る。
　本実施形態におけるプローブは、好ましくは、主としてタンパク質およびそのペプチド断片と相互作用し得る。本実施形態におけるプローブは、任意のタンパク質およびそのペプチド断片に対して、その種類や翻訳後修飾の種類に関係なく、非特異的に相互作用することができる。
　本実施形態の方法では、イオン強度および／またはｐＨの異なる複数の溶媒に、上記プローブを溶解する。プローブを溶解するための溶媒は、任意のバッファーおよび／または塩を含む水性溶媒であってよい。バッファーとしては、例えば、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ、リン酸、酢酸、クエン酸、ホウ酸、グリシンなどが挙げられる。塩としては、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、Ｎａ２ＳＯ４、Ｋ２ＳＯ４、ＭｇＳＯ４、ＮａＩ、ＮａＳＣＮなどが挙げられる。本実施形態において、溶媒のｐＨは、好ましくは４．０～１０．０であり、特に好ましくは５．０～７．０である。また、本実施形態において、溶媒のイオン強度は、１０～５００ｍＭであることが好ましい。また、本実施形態におけるプローブの濃度は、０．１～１００μｇ／ｍＬであることが好ましい。
　本実施形態の方法では、溶媒は、例えば２種類以上の異なるイオン強度および／またはｐＨ条件のものを使用することができ、好ましくは３種類以上、特に好ましくは６種類以上の異なるイオン強度および／またはｐＨ条件のものを使用することができる。また、本実施形態の方法では、１種類のプローブを用いてもよいが、多種類のプローブを用いることがより好ましく、例えば２種類以上、好ましくは３種類以上、特に好ましくは６種類以上のプローブを用いることができる。例えば、２種類の溶媒と３種類のプローブを用いれば、６種類のプローブ溶液を調製することができ、その結果、１つの分析試料について６次元のデータを得ることができる。例えば、５種類の溶媒と３種類のプローブを用いれば、１５種類のプローブ溶液を調製することができ、その結果、１つの分析試料について１５次元のデータを得ることができる。このように、溶媒の種類とプローブの種類を増やすことにより、より多次元のデータを得ることができる。
　次いで、複数のプローブ溶液に対して、血清または血清代替物を含有する分析試料を添加する。
　本実施形態における「血清」は、任意の動物由来のものであってよいが、好ましくは、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウサギ、ラット、マウス、ヒトなどの哺乳動物由来である。血清が由来する動物の年齢は特に限定されず、胎児、新生児および成体を含む任意の年齢であり得る。血清の原産国／地域も特に限定されない。様々な国／地域で生産された多種多様な動物由来の血清が市販されており、本実施形態の方法は、それらのいずれをも分析の対象とすることができる。
　「血清代替物」とは、細胞培養において血清に代えて用いられる無血清サプリメントの総称である。血清代替物は、一般的に、増殖因子、サイトカイン、ホルモンなどから選択される数種類～数十種類の因子を含む。種々の血清代替物が市販されており、例えば、Ｎ２サプリメント（Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９８５；ｐｐ．３－４３）およびその改良品、Ｂ２７サプリメント（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．１９９３；３５（５）：５６７－７６）およびその改良品、Ｇ５サプリメント（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９８４；２（６）：５７５－８４）およびその改良品、Ｇｉｂｃｏ（商標）ＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（サーモフィッシャー・サイエンティフィック）、ＳｔｅｍＳｕｒｅ（商標）血清代替品（ＳＳＲ）（富士フイルム和光純薬）、ＸＦ２１２　ＸｅｒｕｍＦｒｅｅ（ＴＮＣ　ＢＩＯ　ＢＶ）、ヒト血小板溶解物、植物加水分解物、トウモロコシ抽出物、酵母抽出物、大豆抽出物などが挙げられるが、これらに限定されない。市販の血清代替物には具体的な組成が公表されていないものも多いが、本実施形態の方法は、それらのいずれをも分析の対象とすることができる。
　本実施形態における分析試料は、血清または血清代替物のみからなってもよいし、血清または血清代替物を含有する培地などであってもよい。プローブ溶液に添加される血清または血清代替物の最終濃度は、例えば０．００１ｖｏｌ％～９９．９ｖｏｌ％であってよく、好ましくは０．０１ｖｏｌ％～１０ｖｏｌ％であってよい。分析試料中の血清または血清代替物の濃度が未知の場合には、試料を適宜段階希釈してプローブ溶液に添加してもよい。
　本ステップにおいて、プローブは、血清または血清代替物に含まれるあらゆる生体分子に対して、非特異的に相互作用する。
　次いで、分析試料を添加した複数のプローブ溶液の蛍光強度を測定する。本実施形態の方法では、励起波長３００～５００ｎｍ、蛍光波長４００～７００ｎｍにおいて蛍光強度を測定することができる。また、本実施形態の方法では、各測定対象につき、複数の励起波長／蛍光波長のセット（例えば、励起波長（ｎｍ）／蛍光波長（ｎｍ）：３４０／５２０、３３０／４８０、３４５／５０５、３６０／５３０など）における蛍光強度を測定することが好ましく、例えば２セット、３セット、または４セットの励起波長／蛍光波長により蛍光強度を測定することができる。
　プローブ溶液の蛍光強度は、血清または血清代替物に含まれる生体分子の種類、量、状態などに応じて変化し、さらに、プローブを溶解する溶媒の条件によっても変化する。そのため、本ステップにより、試料に固有の蛍光強度のパターン（蛍光フィンガープリント）を得ることができる。
　次いで、分析試料について得られた蛍光強度パターンを、参照試料について得られた蛍光強度パターンと比較する。参照試料についての蛍光強度パターンは、分析試料と並行して蛍光強度の測定を行うことにより取得してもよいし、予め準備された所定の蛍光強度パターンであってもよい。蛍光強度パターンの比較は、好ましくは、主成分分析、線形判別分析、階層的クラスター分析などの多変量解析により次元数を圧縮し、蛍光フィンガープリント間の差異を２次元または３次元に圧縮変換して比較することができる。
　本実施形態の方法は、蛍光強度のパターンの違いのみに基づいて、血清または血清代替物の品質を判定することができる。ここで、血清または血清代替物の「品質」とは、培養において培地に添加されて使用された場合に細胞をサポートする性能、具体的には、培養細胞の生存、増殖、形質または分化などの特性をサポートする性能をいう。これらの特性は、接着、運動、分裂、代謝、成長因子やサイトカインの分泌などの種々の活性により決定され得、したがって、培養細胞の特性をサポートする性能とは、接着、運動、分裂、代謝、成長因子やサイトカインの分泌などの細胞の活性を支援、維持または制御する性能であり得る。通常、血清または血清代替物の品質は、産地、製造元、ロットなどにより大きく異なるが、品質を判断するために足る情報は提供されない。さらに、血清または血清代替物の品質は、保存の温度や期間によって劣化するが、どの成分がどの程度どのように変化した場合に品質の劣化がみられるかを個々に特定することは非常に困難であり、実際的ではない。これに対し、本実施形態の方法では、血清中の種々の生体分子とプローブとの非特異的相互作用の総和を反映した蛍光強度パターン（蛍光フィンガープリント）を取得し、参照試料についての蛍光強度パターンと比較することにより、血清または血清代替物の総合的な品質の差異を検出することができる。
　したがって、特定の実施形態では、例えば、現在培養に使用している血清または血清代替物（参照試料）について得られた蛍光フィンガープリントと、異なる産地／製造元Ａ、ＢまたはＣの血清もしくは血清代替物（分析試料）について得られた蛍光フィンガープリントを比較する。その結果、産地／製造元Ａの血清または血清代替物について得られた蛍光フィンガープリントと、参照試料について得られた蛍光フィンガープリントの分布との距離が確率的に最も近ければ、現在使用中の血清または血清代替物に代えて産地／製造元Ａの血清または血清代替物を用いることができると推定または特定することができる。
　別の特定の実施形態では、例えば、現在培養に使用している血清または血清代替物（参照試料）について得られた蛍光フィンガープリントと、同じ産地／製造元であるが異なるロットＡ、ＢまたはＣの血清もしくは血清代替物（分析試料）について得られた蛍光フィンガープリントを比較する。その結果、ロットＡの血清または血清代替物について得られた蛍光フィンガープリントと、参照試料について得られた蛍光フィンガープリントの分布との距離が確率的に最も近ければ、現在使用中の血清または血清代替物に代えてロットＡの血清または血清代替物を用いることができると推定または特定することができる。
　別の特定の実施形態では、例えば、購入直後の血清または血清代替物（参照試料）について得られた蛍光フィンガープリントと、同じ産地／製造元／ロットであるが異なる保存状態（例えば保存の温度および／または期間が異なる）Ａ、ＢまたはＣの血清もしくは血清代替物（分析試料）について得られた蛍光フィンガープリントを比較する。その結果、保存状態Ａの血清または血清代替物について得られた蛍光フィンガープリントと、参照試料について得られた蛍光フィンガープリントの分布との距離が確率的に最も近ければ、保存状態Ａの血清または血清代替物の品質は劣化していないと推定または特定することができる。
　本実施形態の方法は、細胞を実際に培養して増殖能や分化能を試験する必要なしに、血清または血清代替物の品質を評価することができる。そのため、本実施形態の方法によれば、容易かつ迅速に、細胞の状態や実験者のスキルに左右されない一貫性のある血清または血清代替物の品質管理が可能となる。
　以下に実施例を挙げ、本発明についてさらに説明する。なお、これらは本発明を何ら限定するものではない。
＜１．材料および試薬＞
（１－１）プローブ
　本実施例では、国際公開第２０２０／２６２４１３号の実施例において合成した非特異的蛍光プローブを用いた。
　プローブ１：　ポリエチレングリコール－ｂｌｏｃｋ－ポリ－Ｌ－リジントリフルオロ酢酸塩（ＰＥＧ－ｂ－ＰＬＬ、Ｍｗ：１７２００）［エチレングリコール繰り返しユニット数：１０４、Ｌ－リジントリフルオロ酢酸塩繰り返しユニット数：５２］に対してテトラフェニルエチレン（ＴＰＥ）を導入したプローブ　（以下、「－Ｎｏｎｅ」と表記する）
　プローブ２：　－Ｎｏｎｅ（プローブ１）中のアミノ基のフェニルアラニンとの脱水縮合反応により得られたプローブ　（以下、「－Ｐｈｅ」と表記する）
　プローブ３：　－Ｎｏｎｅ（プローブ１）中のアミノ基のノルロイシンとの脱水縮合反応により得られたプローブ　（以下、「－Ｎｌｅ」と表記する）
　プローブ４：　－Ｎｏｎｅ（プローブ１）中のアミノ基の無水コハク酸との求核アシル置換反応により得られたプローブ　（以下、「－Ｓｕｃ」と表記する）
　プローブ５：　－Ｎｏｎｅ（プローブ１）中のアミノ基の無水フタル酸との求核アシル置換反応により得られたプローブ　（以下、「－Ｐｈｔ」と表記する）
　プローブ６：　－Ｎｏｎｅ（プローブ１）中のアミノ基の２，３－ピラジンジカルボン酸無水物との求核アシル置換反応により得られたプローブ　（以下、「－Ｐｙｒ」と表記する）
　プローブ１～６（－Ｎｏｎｅ、－Ｐｈｅ、－Ｎｌｅ、－Ｓｕｃ、－Ｐｈｔ、－Ｐｙｒ）の構造式を図２４に示す。
（１－２）血清
　本実施例で用いた血清を表１に示す。
　表１．血清
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  
（１－３）血清代替物
　本実施例で用いた血清代替物を表２に示す。
　表２．血清代替物
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  
（１－４）培地および試薬
　本実施例で用いた培地および試薬を表３に示す。
　表３．培地および試薬
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
  
＜２．ヒト血清によるプローブの蛍光変化＞
　プローブ１、２、４および５（－Ｎｏｎｅ、－Ｐｈｅ、－Ｓｕｃ、－Ｐｈｔ）を２０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）に溶解し、４種類のプローブ溶液（３３３ｎＭ）を調製した。各プローブ溶液を、自動分注装置（Ａｎｄｒｅｗ＋、Ａｎｄｒｅｗ　Ａｌｌｉａｎｃｅ）を用いて、９６穴マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３６５０）に１８０μＬ／ウェルで加えた。３５℃で１０分間インキュベートした後、マイクロプレートリーダー（Ｃｙｔａｔｉｏｎ５，ＢｉｏＴｅｋ）により、励起波長３３０ｎｍにおける蛍光強度（蛍光波長４８０ｎｍ）および蛍光スペクトル（蛍光波長３７２～７００ｎｍ）を測定した。その後、自動分注装置を用いて種々の濃度のヒト血清（血清番号１３）／２０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）溶液を２０μＬ／ウェルで加え、３５℃で１０分間インキュベートした後、同条件にて蛍光強度および蛍光スペクトルを測定した（終濃度：３００ｎＭプローブ、０～０．５ｖｏｌ％ヒト血清、２０ｍＭ　ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０））。
　０～０．０７５ｖｏｌ％のヒト血清を添加したときのプローブ１（－Ｎｏｎｅ）の蛍光スペクトル変化を図１に示す。プローブ１（－Ｎｏｎｅ）の蛍光強度は血清濃度依存的に増大し、０．０７５ｖｏｌ％のヒト血清におけるプローブ１（－Ｎｏｎｅ）の４６０ｎｍ蛍光強度は、０ｖｏｌ％のヒト血清における蛍光強度と比較して約６３倍に増加した。
　プローブ１、２、４および５（－Ｎｏｎｅ、－Ｐｈｅ、－Ｓｕｃ、－Ｐｈｔ）の４８０ｎｍ蛍光強度変化を図２に示す。プローブ１（－Ｎｏｎｅ）の蛍光強度は、血清添加量が０．０７５ｖｏｌ％以下の範囲では血清濃度依存的に増大したが、０．０７５ｖｏｌ％を超えると減少に転じた。プローブ４（－Ｓｕｃ）およびプローブ５（－Ｐｈｔ）の蛍光強度は、血清濃度依存的に単調に増大した。プローブ２（－Ｐｈｅ）の蛍光強度は、血清を添加してもほとんど変化しなかった。これらの結果から、非特異的蛍光プローブが血清に対して多様な応答を示すことが示唆された。
＜３．異なる動物種の血清の識別＞
　プローブ１～６（－Ｎｏｎｅ、－Ｐｈｅ、－Ｎｌｅ、－Ｓｕｃ、－Ｐｈｔ、－Ｐｙｒ）を、以下の２種類のバッファー溶液：２２．２ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）または２２．２ｍＭの酢酸（ｐＨ５．０）に溶解し、１２種類のプローブ溶液（３３３ｎＭ）を調製した。各プローブ溶液を、自動分注装置（Ａｎｄｒｅｗ＋、Ａｎｄｒｅｗ　Ａｌｌｉａｎｃｅ）を用いて、９６穴ハーフウェルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３９９３）に１８０μＬ／ウェルで加えた。３５℃で１０分間インキュベートした後、マイクロプレートリーダー（Ｃｙｔａｔｉｏｎ５，ＢｉｏＴｅｋ）により、以下の２セットの励起波長（ｎｍ）／蛍光波長（ｎｍ）にて蛍光強度（Ｉ０）を測定した：（Ｃｈ１）３３０／４８０、（Ｃｈ２）３６０／５３０。その後、自動分注装置を用いて種々の動物由来の血清溶液（血清番号１～１６、各１ｖｏｌ％血清／純水）を１２μＬ／ウェルで加え、３５℃で１０分間インキュベートした後、同条件にて蛍光強度（Ｉ）を測定した（終濃度：３００ｎＭプローブ、０．１ｖｏｌ％血清、２０ｍＭバッファー）。各測定（１６血清×２溶媒条件×６プローブ×２波長セット）を１０回反復して行った。
　結果を図２に示す。血清を添加する前後の蛍光強度の変化量（Ｉ－Ｉ０）を、以下の式に基づいて正規化した：ｚ＝（ｘ－μ）／σ（ｚは正規化された値、ｘは蛍光強度の変化量の生データ、μは母集団の平均、σは母集団の標準偏差）。図中、エラーバーは標準偏差を示す。各プローブの蛍光強度は、血清の種類や溶媒条件に応じて異なる変化を示し、異なる動物種の血清ごとに固有の蛍光パターンが得られた。
　上記データを教師なしの階層的クラスター分析により解析して得られた樹形図を図３に示す。すべての動物種由来の血清がクラスター化された。これらの結果から、非特異的蛍光プローブを用いて血清が由来する動物種を識別できる可能性が示された。
　同データを教師なしの主成分分析により解析し、得られた第二主成分までをプロットした結果を図４に示す。ウシ科およびネズミ目に対応するメタクラスター（点線で示す）が存在し、また、ローラシア獣上目と真主齧上目が区別された（破線で示す）。これらの結果から、蛍光パターンが動物の系統に関する情報を反映していることが示唆された。
　同データを教師ありの線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアまでをプロットした結果を図５に示す。各動物由来血清のクラスターは、それぞれ重なることなく分布した。さらに、この結果をジャックナイフ法およびホールドアウト法によって解析したところ、いずれも１００％の精度で各動物由来血清を識別できることが確認された。
＜４．異なる産地およびロットのウシ胎児血清の識別＞
　米国、オーストラリア、アイルランドおよびチリ産のウシ胎児血清（血清番号１８～２１）（各２ロット）を、上記３と同様の手順および条件により分析した。測定結果（４生産国×２ロット×２溶媒条件×６プローブ×２波長セット）のヒートマップを図６に示す。各プローブの蛍光強度は、ウシ胎児血清の種類や溶媒条件に応じて異なる変化を示し、異なる産地およびロットのウシ胎児血清ごとに固有の蛍光パターンが得られた。また、蛍光パターンを線形判別分析により解析し、得られた第一判別スコアおよび第二判別スコアをプロットした結果と、得られた第一判別スコアおよび第三判別スコアをプロットした結果を図７に示す。各ウシ胎児血清のクラスターは、それぞれ重なることなく分布した。さらに、この結果をジャックナイフ法およびホールドアウト法によって解析したところ、それぞれ９６％および８８％の精度で各ウシ胎児血清を識別できることが確認された。また、ロットを区別することなく蛍光パターンを線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアまでをプロットした結果を図８に示す。各生産国のクラスターは、それぞれ重なることなく分布した。さらに、この結果をジャックナイフ法およびホールドアウト法によって解析したところ、それぞれ９６％および８４％の精度で各ウシ胎児血清を識別できることが確認された。
　さらに、ここで得られたデータ（血清番号１８～２１×２ロット×２溶媒条件×６プローブ×２波長セット）を、上記３で得られたデータ（血清番号１～１６×２溶媒条件×６プローブ×２波長セット）と統合し、線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアまでをプロットした結果を図９に示す。ウシ血清がクラスターを形成していることから、産地やロットが異なっていても、ウシ血清に共通する性質が蛍光パターンに反映されていることが明らかになった。
＜５．異なる条件で保存されたウシ胎児血清の識別＞
　ウシ胎児血清（血清番号１８）をマイクロチューブに分注し、密閉・遮光した状態で、以下の条件にて保存または処理した：（１）４℃で２週間、（２）４℃で４週間、（３）３７℃で１週間、（４）３７℃で２週間、（５）３７℃で４週間、（６）５６℃で３０分間、または（７）５６℃で６０分間。その後、上記３と同様の手順および条件により分析した。解凍直後のウシ胎児血清（血清番号１８）を対照（未処理）とした。
　測定結果のヒートマップを図１０に示す。異なる保存条件のウシ胎児血清ごとに固有の蛍光パターンが得られた。蛍光パターンを線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアまでをプロットした結果を図１１に示す。４℃で保存した血清はいずれも対照（未処理）と重なるように分布したのに対し、３７℃で保存または５６℃で処理した血清はそれぞれ重なることなく分布した。第三判別スコアおよび第四判別スコアをプロットした場合には、対照（未処理）、４℃で２週間保存、および４℃で４週間保存のクラスターがそれぞれ重なることなく分布した（データは省略）。さらに、この結果をジャックナイフ法およびホールドアウト法によって解析したところ、それぞれ９８％および９７％の精度で血清の保存または処理条件を識別できることが確認された。
　続いて、上記条件（１）～（７）で保存または処理された血清および対照（未処理）の血清を用いてヒト皮膚由来線維芽細胞（ＮＨＤＦ）（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ　ＧｍｂＨ）を培養し、各血清の細胞の増殖をサポートする性能を比較した。Ｄ－ＭＥＭに懸濁したＮＨＤＦ（４×１０４細胞／ｍＬ）を４８ウェルプレート（ＡＧＣテクノガラス）に２００μＬ／ウェルずつ添加し、各血清を２２．２μＬ／ウェルずつ添加した。３７℃、５％ＣＯ２条件下で４８時間培養した後、Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８（同仁化学研究所）を用いて生細胞数を計測した。
　結果を図１２に示す。４５０ｎｍの吸光度の上昇（ΔＡｂｓ４５０）が大きいほど生細胞数が多く、細胞の増殖能力および生存能力が高いと解釈される。グラフは、ΔＡｂｓ４５０の平均値±標準誤差（ｎ＝６）を示す。一元配置ＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙ事後検定の結果、未処理の血清に対して、３７℃で１週間（ｐ＝０．０３６２）、３７℃で２週間（ｐ＝０．００８３）、３７℃で４週間（ｐ≦０．０００１）、および５６℃で３０分間の血清（ｐ＝０．００２８）が有意差を示した（図中、＊）。一方、未処理の血清と、４℃で保存された血清との間には差異が見られなかった。
　以上の結果から、保存条件の違いによるウシ胎児血清の細胞増殖に対する性能の変化が蛍光パターンに反映されていることが示され、非特異的蛍光プローブを用いて血清の細胞増殖に対する性能の変化を検出できる可能性が示された。
＜６．分化誘導用の血清代替物によるプローブの蛍光変化＞
　プローブ１および５（－Ｎｏｎｅ、－Ｐｈｔ）を２０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）に溶解し、２種類のプローブ溶液（４００ｎＭ）を調製した。各プローブ溶液を、自動分注装置（Ａｎｄｒｅｗ＋、Ａｎｄｒｅｗ　Ａｌｌｉａｎｃｅ）を用いて、３８４穴マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３５７５）に４５μＬ／ウェルで加えた。３５℃で１０分間インキュベートした後、マイクロプレートリーダー（Ｃｙｔａｔｉｏｎ５，ＢｉｏＴｅｋ）により、励起波長３３０ｎｍにおける蛍光強度（蛍光波長４８０ｎｍ）を測定した。心筋分化誘導培地１（１％のＮ－２　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、２％のＢ－２７　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、１％のＮＥＡＡ、１％のＧｌｕｔａＭＡＸ、１％のＰＳおよび０．１ｍＭの２－ＭＥが添加されたＤＭ／Ｆ－１２）（以下、「ＣＤＭ１」と記載する）を調製し、自動分注装置を用いて種々の濃度のＣＤＭ１／２０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）溶液を１５μＬ／ウェルで加えた。３５℃で１０分間インキュベートした後、同条件にて蛍光強度を測定した（終濃度：３００ｎＭプローブ、０～２ｖｏｌ％　ＣＤＭ１、２０ｍＭ　ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０））。
　結果を図１３に示す。Ｙ軸は、ＣＤＭ１を添加する前後の蛍光強度の変化量（Ｉ－Ｉ０）の平均値±標準誤差（ｎ＝３）を示す。プローブ１（－Ｎｏｎｅ）およびプローブ５（－Ｐｈｔ）のいずれもＣＤＭ１の濃度依存的に蛍光強度が増大し、約１ｖｏｌ％で応答が飽和した。
＜７．異なる条件で処理された分化誘導用の血清代替物の識別＞
　Ｎ－２　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（以下、単に「Ｎ２」と記載する）およびＢ－２７　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（以下、単に「Ｂ２７」と記載する）をそれぞれマイクロチューブに分注し、密閉・遮光した状態で、以下の条件にて処理した：４５℃、５５℃、６５℃または７５℃で３０分間。未処理または各処理後のＮ２およびＢ２７を用いて、ＣＤＭ１を調製した。ＨＣＮ４－ＥＧＦＰ＿４０９Ｂ２細胞（Ｒｅｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．２０２２；２１：２３９－２４９）（ＨＣＮ４遺伝子座にＥＧＦＰをノックインしたＢＡＣベクターを導入した４０９Ｂ２細胞（ヒトｉＰＳ細胞））をマウス胎児線維芽細胞馴化培地（ＭＥＦ－ＣＭ）に懸濁し、Ｇｅｌｔｒｅｘ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック，Ａ１４１３３０２）上に播種した。翌日、１００ｎｇ／ｍＬのＮｏｇｇｉｎおよび３．３μＭのＣＨＩＲ９９０２１を添加したＣＤＭ１に培地を交換し、３日目までフレッシュなＣＤＭ１に交換した。４日目に、３．３μＭのＣＨＩＲ９９０２１および５μＭのＩＷＰ－２を添加したＣＤＭ１に培地を交換した。５日目に、トリプシン処理により細胞を分散して回収し、心筋分化誘導培地２（１％のピルビン酸、１％のＧｌｕｔａＭＡＸ、１％のＩＴＳ－Ｇ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、２ｍＭのＬ－アスコルビン酸、１０ｍＭのニコチンアミド、０．２μＭのデキサメサゾン、０．５％のＦＢＳ、１％のＰＳおよび１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４が添加されたＲＰＭＩ１６４０）（以下、「ＣＤＭ２」と記載する）を用いてＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（商標）９６Ｕ低接着プレートに１×１０４細胞／ウェルの密度で播種した。その後、２～３日ごとにフレッシュなＣＤＭ２に培地を交換した。１９または２０日目に蛍光顕微鏡（オリンパス，ＩＸ７３）によりＧＦＰ蛍光を観察した。その後、細胞に２ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＩＩ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ，ＣＬＳ２）を加え、室温で一晩インキュベートした。細胞を分散して回収し、ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）ＩＩＩセルソーター（ＢＤ　ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、ＧＦＰ陽性（すなわちＨＣＮ４陽性）細胞を計測した。
　蛍光顕微鏡観察の結果を図１４に、ＧＦＰ陽性細胞の定量結果を図１５に示す。Ｎ２／Ｂ２７の加熱処理温度の上昇にしたがってＧＦＰ陽性細胞が減少した。これらの結果から、加熱処理によりＮ２およびＢ２７の分化誘導性能が劣化していることが確認された。
　プローブ１～６（－Ｎｏｎｅ、－Ｐｈｅ、－Ｎｌｅ、－Ｓｕｃ、－Ｐｈｔ、－Ｐｙｒ）を、以下の２種類のバッファー溶液：２４ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）または２４ｍＭの酢酸（ｐＨ５．０）に溶解し、１２種類のプローブ溶液（３６０ｎＭ）を調製した。各プローブ溶液を、自動分注装置（Ａｎｄｒｅｗ＋、Ａｎｄｒｅｗ　Ａｌｌｉａｎｃｅ）を用いて、３８４穴マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３５７５）に５０μＬ／ウェルで加えた。３５℃で１０分間インキュベートした後、マイクロプレートリーダー（Ｃｙｔａｔｉｏｎ５，ＢｉｏＴｅｋ）により、以下の２セットの励起波長（ｎｍ）／蛍光波長（ｎｍ）にて蛍光強度（Ｉ０）を測定した：（Ｃｈ１）３３０／４８０、（Ｃｈ２）３６０／５３０。その後、自動分注装置を用いて未処理または各加熱処理後のＮ２／Ｂ２７を含有するＣＤＭ１溶液（３ｖｏｌ％ＣＤＭ１／純水）を１０μＬ／ウェルで加えた。３５℃で１０分間インキュベートした後、同条件にて蛍光強度を測定した（終濃度：３００ｎＭプローブ、０．５ｖｏｌ％ＣＤＭ１、２０ｍＭバッファー）。
　測定結果のヒートマップを図１６に示す。異なる加熱処理温度のＮ２／Ｂ２７を含有するＣＤＭ１ごとに固有の蛍光パターンが得られた。蛍光パターンを線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアまでをプロットした結果を図１７に示す。５５℃および６５℃処理によりクラスターが大きく移動した。一方、未処理および４５℃処理の間、ならびに６５℃処理および７５℃処理の間ではほとんど変化が見られなかった。分化誘導性能および蛍光パターンともにほとんど変化しなかった４５℃処理のＮ２／Ｂ２７を含有するＣＤＭ１を「Ｇｏｏｄ」、蛍光パターンには大きな変化が見られたが分化誘導性能はほとんど変化しなかった５５℃処理のＮ２／Ｂ２７を含有するＣＤＭ１を「Ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ」、分化誘導性能がほとんど消失した６５℃および７５℃処理のＮ２／Ｂ２７を含有するＣＤＭ１を「Ｕｎａｃｃｅｐｔａｂｌｅ」とラベルし、線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアまでをプロットした結果を図１８に示す。各性能のクラスターはそれぞれ重なることなく分布した。さらに、この結果をジャックナイフ法およびホールドアウト法によって解析したところ、いずれも１００％の精度でＣＤＭ１の分化誘導性能を識別できることが確認された。
　以上の結果から、分化誘導培養に基づいて検出できなかったわずかなＣＤＭ１の品質劣化も蛍光パターンに反映されることが示され、非特異的蛍光プローブを用いてＮ２およびＢ２７の品質を高精度に判別できることが示された。
＜８．細胞増殖用の血清代替物によるプローブの蛍光変化＞
　プローブ１および５（－Ｎｏｎｅ、－Ｐｈｔ）を２０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）に溶解し、２種類のプローブ溶液（４００ｎＭ）を調製した。各プローブ溶液を、自動分注装置（Ａｎｄｒｅｗ＋、Ａｎｄｒｅｗ　Ａｌｌｉａｎｃｅ）を用いて、３８４穴マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３５７５）に４５μＬ／ウェルで加えた。３５℃で１０分間インキュベートした後、マイクロプレートリーダー（Ｃｙｔａｔｉｏｎ５，ＢｉｏＴｅｋ）により、励起波長３３０ｎｍにおける蛍光強度（蛍光波長４８０ｎｍ）を測定した。自動分注装置を用いて種々の濃度のＫＳＲ／２０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）溶液を１５μＬ／ウェルで加えた。３５℃で１０分間インキュベートした後、同条件にて蛍光強度を測定した（終濃度：３００ｎＭプローブ、０～０．１ｖｏｌ％ＫＳＲ、２０ｍＭ　ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０））。
　結果を図１９に示す。Ｙ軸は、ＫＳＲを添加する前後の蛍光強度の変化量（Ｉ－Ｉ０）の平均値±標準誤差（ｎ＝３）を示す。プローブ１（－Ｎｏｎｅ）およびプローブ５（－Ｐｈｔ）のいずれもＫＳＲの濃度依存的に蛍光強度が増大し、約０．１ｖｏｌ％で応答が飽和した。
＜９．保存期間が異なる細胞増殖用の血清代替物の識別＞
　－８０℃で保存されたメーカー指定の使用期限内のＫＳＲ（Ｉｎ－ｄａｔｅ１、Ｉｎ－ｄａｔｅ２、Ｉｎ－ｄａｔｅ３）および使用期限切れのＫＳＲ（Ｅｘｐｉｒｅｄ１（使用期限から約４年経過）、Ｅｘｐｉｒｅｄ２（使用期限から約１２年経過））を用いて、２０％のＫＳＲ、１％のＮＥＡＡ、１％のＧｌｕｔａＭＡＸ、１％のＰＳおよび０．１ｍＭの２－ＭＥが添加されたＤＭ／Ｆ－１２（以下、「ｉＰＳ細胞増殖培地」と記載する）を調製した。４０９Ｂ２細胞（ヒトｉＰＳ細胞）を、５ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦおよび１０μＭのＹ２７６３２を添加したｉＰＳ細胞増殖培地に懸濁し、マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３５６２３１）でコートされた６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３５０６）に１×１０４細胞／ウェルの密度で播種した。その後、３日に１回、５ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加したフレッシュなｉＰＳ細胞増殖培地により培地交換して培養した。播種後９日目にＡＰ　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（ＳＢＩ，ＡＰ１００Ｂ－１）を用いて未分化細胞コロニーを染色し、染色されたコロニーの数をカウントした。細胞数の計測のためには、１×１０５細胞／ウェルの密度で４０９Ｂ２細胞を播種し、毎日、５ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加したフレッシュなｉＰＳ細胞増殖培地により培地交換して培養した。播種後４日目に顕微鏡像を取得し、その後、トリプシン処理により細胞を分散して回収し、血球計算版により細胞数をカウントした。
　結果を図２０および２１に示す。図２０において、上のパネルがコロニーの染色像、下のパネルが細胞の明視野顕微鏡像を示す。図２１において、左のパネルが染色されたコロニー数の変化、右のパネルが細胞数の変化（Ｉｎ－ｄａｔｅ１を用いた培養におけるコロニー数を１として正規化）を示す。統計解析の結果、Ｅｘｐｉｒｅｄ１のＫＳＲを用いた培養において有意に増殖が抑制されたことが示された（平均値±標準偏差、ｎ＝４、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１，＊＊＊Ｐ＜０．００１，＊＊Ｐ＜０．０１，＊Ｐ＜０．０５、一元配置ＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙ事後検定）。
　プローブ１～６（－Ｎｏｎｅ、－Ｐｈｅ、－Ｎｌｅ、－Ｓｕｃ、－Ｐｈｔ、－Ｐｙｒ）を、以下の２種類のバッファー溶液：２４ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）または２４ｍＭの酢酸（ｐＨ５．０）に溶解し、１２種類のプローブ溶液（３６０ｎＭ）を調製した。各プローブ溶液を、自動分注装置（Ａｎｄｒｅｗ＋、Ａｎｄｒｅｗ　Ａｌｌｉａｎｃｅ）を用いて、３８４穴マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３５７５）に５０μＬ／ウェルで加えた。３５℃で１０分間インキュベートした後、マイクロプレートリーダー（Ｃｙｔａｔｉｏｎ５，ＢｉｏＴｅｋ）により、以下の２セットの励起波長（ｎｍ）／蛍光波長（ｎｍ）にて蛍光強度を測定した：（Ｃｈ１）３３０／４８０、（Ｃｈ２）３６０／５３０。その後、自動分注装置を用いてＫＳＲ溶液（０．０２ｖｏｌ％ＫＳＲ／純水）を１０μＬ／ウェルで加えた。３５℃で１０分間インキュベートした後、同条件にて蛍光強度を測定した（終濃度：３００ｎＭプローブ、０．０２ｖｏｌ％ＫＳＲ、２０ｍＭバッファー）。
　測定結果のヒートマップを図２２に示す。異なる保存期間のＫＳＲごとに固有の蛍光パターンが得られた。［－Ｎｏｎｅ，ｐＨ７．０およびｐＨ５．０，Ｃｈ１およびＣｈ２］、［－Ｎｌｅ，ｐＨ７．０，Ｃｈ１およびＣｈ２］、［－Ｐｈｅ，ｐＨ７．０，Ｃｈ１］、［－Ｐｈｅ，ｐＨ５．０，Ｃｈ１およびＣｈ２］、［－Ｓｕｃ，ｐＨ７．０およびｐＨ５．０，Ｃｈ１］、［－Ｐｈｔ，ｐＨ５．０，Ｃｈ２］、［－Ｐｙｒ，ｐＨ７．０およびｐＨ５．０，Ｃｈ１およびＣｈ２］で構成される蛍光パターンを線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアまでをプロットした結果を図２３に示す。異なる保存期間のＫＳＲのクラスターは、それぞれ重なることなく分布した。さらに、この結果をジャックナイフ法およびホールドアウト法によって解析したところ、それぞれ９７％および９３％の精度で各ＫＳＲを識別できることが確認された。
　以上の結果から、増殖培養に基づいて検出できなかったＫＳＲの品質劣化も蛍光パターンに反映されることが示され、非特異的蛍光プローブを用いてＫＳＲの品質を高精度に判別できることが示された。
＜１０．異なる条件で処理された細胞増殖用の血清代替物の識別＞
　異なるメーカー（べクトン・ディッキンソンおよびオクソイド）の酵母エキス粉末（以下、それぞれ「ＹＥ－Ｂ」および「ＹＥ－Ｏ」と記載する）を１％の濃度で純水に溶解し、１０ｍＬを１５ｍＬ遠心管に加え、１２１℃で１０～３０分間オートクレーブ処理した。プローブ１および５（－Ｎｏｎｅ、－Ｐｈｔ）を２０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）に溶解し、２種類のプローブ溶液（１８００ｎＭ）を調製した。未処理または３０分間オートクレーブ処理後の酵母エキス溶液を２０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）により種々の濃度に希釈し、自動分注装置（Ａｓｓｉｓｔ　Ｐｌｕｓ，Ｉｎｔｅｇｒａ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、３８４穴マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３５７５）に５０μＬ／ウェルで加えた。３５℃で１０分間インキュベートした後、マイクロプレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ　Ｈ１，Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により、励起波長３３０ｎｍにおける蛍光強度（蛍光波長４８０ｎｍ）を測定した。自動分注装置を用いて１８００ｎＭのプローブ溶液／２０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）溶液を１０μＬ／ウェルで加えた。３５℃で１０分間インキュベートした後、同条件にて蛍光強度を測定した（終濃度：３００ｎＭプローブ、０～０．３％酵母エキス、２０ｍＭ　ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０））。
　ＹＥ－Ｂ（図中、単に「ＹＥ」と記載する）についての結果を図２５に示す。Ｙ軸は、プローブを添加する前後の蛍光強度の変化量（Ｉ－Ｉ０）の平均値±標準誤差（ｎ＝３）を示す。プローブ１（－Ｎｏｎｅ）およびプローブ５（－Ｐｈｔ）のいずれも酵母エキス溶液の濃度依存的に蛍光強度が増大し、プローブ１は約０．１０％で、プローブ５は約０．３０％で応答が飽和した。
　プローブ１～６（－Ｎｏｎｅ、－Ｐｈｅ、－Ｎｌｅ、－Ｓｕｃ、－Ｐｈｔ、－Ｐｙｒ）を、純水に溶解し、１２種類のプローブ溶液（１８００ｎＭ）を調製した。以下の２種類のバッファー溶液：２４ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）または２４ｍＭの酢酸（ｐＨ５．０）に溶解した０．１２％の各酵母エキス溶液を、自動分注装置（Ａｓｓｉｓｔ　Ｐｌｕｓ，Ｉｎｔｅｇｒａ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、３８４穴マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３５７５）に５０μＬ／ウェルで加えた。３５℃で１０分間インキュベートした後、マイクロプレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ　Ｈ１，Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により、以下の２セットの励起波長（ｎｍ）／蛍光波長（ｎｍ）にて蛍光強度を測定した：（Ｃｈ１）３３０／４８０、（Ｃｈ２）３６０／５３０。その後、自動分注装置を用いてプローブ溶液（１８００ｎＭ　プローブ／純水）を１０μＬ／ウェルで加えた。３５℃で１０分間インキュベートした後、同条件にて蛍光強度を測定した（終濃度：３００ｎＭプローブ、０．１％酵母エキス、２０ｍＭバッファー）。
　測定結果のヒートマップを図２６に示す。異なるメーカーおよびオートクレーブ時間の酵母エキス溶液ごとに固有の蛍光パターンが得られた。蛍光パターンを線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアまでをプロットした結果を図２７に示す。異なるメーカーおよびオートクレーブ時間の酵母エキス溶液のクラスターは、それぞれ重なることなく分布した。さらに、この結果をジャックナイフ法によって解析したところ、９６％の精度で各酵母エキス溶液を識別できることが確認された。
　以上の結果から、メーカー間での酵母エキスの品質の差異や、オートクレーブ時間の違いによる酵母エキスの品質の変化が蛍光パターンに反映されることが示され、非特異的蛍光プローブを用いて酵母エキスの品質を高精度に判別できることが示された。
 

Claims (9)

  1. 　（１）イオン強度および／またはｐＨの異なる複数の溶媒に、プローブを溶解するステップと、ここで、前記プローブが、
    　　（ａ）１分子中に少なくとも５個の１級アミノ基を有する、重量平均分子量が１，０００～５００，０００であるカチオン性ポリマーと、
    　　（ｂ）環境応答性蛍光団と
    を含み、かつ、前記蛍光団が、前記カチオン性ポリマー中の前記１級アミノ基の一部に共有結合しているものであり、
    　（２）前記ステップ（１）で調製された複数のプローブ溶液に、血清または血清代替物を含有する分析試料を添加するステップと、
    　（３）前記ステップ（２）で分析試料を添加した複数のプローブ溶液の蛍光強度を測定するステップと、
    　（４）前記ステップ（３）により得られた蛍光強度パターンを、参照試料について得られた蛍光強度パターンと比較するステップと
    を含む、血清または血清代替物の品質を管理する方法。
  2. 　前記環境応答性蛍光団が、ナフタレンスルホン酸骨格を有する蛍光団、ベンゾフラザン骨格を有する蛍光団、キサンテン骨格を有する蛍光団、ピレン骨格を有する蛍光団および凝集誘起発光性蛍光団からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記カチオン性ポリマーが、直鎖状または分岐状のポリアミノ酸、ポリアリルアミン、ポリアミドアミンもしくはポリアルキレンイミンである、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　前記カチオン性ポリマー中の前記１級アミノ基の１～５０％に前記環境応答性蛍光団が共有結合している、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　前記カチオン性ポリマーの前記環境応答性蛍光団が共有結合していない前記１級アミノ基の少なくとも一部が、アシル基またはアミノ酸により修飾されている、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　前記ステップ（３）における蛍光強度の測定が、複数の励起波長および蛍光波長について行われる、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　前記ステップ（４）により、前記血清もしくは血清代替物の産地、製造元またはロット間での品質の差異が評価される、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　前記ステップ（４）により、前記血清または血清代替物の保存状態による品質の差異が評価される、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　前記品質が、培養細胞の生存、増殖、形質または分化をサポートする性能である、請求項７または８に記載の方法。
     
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06292570A (ja) * 1987-01-09 1994-10-21 Medi Cult As 新規な細胞株及びこれを用いる供試培地の品質試験方法
US20150168371A1 (en) * 2012-06-05 2015-06-18 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Serum sample quality determination
WO2018088510A1 (ja) * 2016-11-11 2018-05-17 国立研究開発法人産業技術総合研究所 タンパク質を含有する試料の分析方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06292570A (ja) * 1987-01-09 1994-10-21 Medi Cult As 新規な細胞株及びこれを用いる供試培地の品質試験方法
US20150168371A1 (en) * 2012-06-05 2015-06-18 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Serum sample quality determination
WO2018088510A1 (ja) * 2016-11-11 2018-05-17 国立研究開発法人産業技術総合研究所 タンパク質を含有する試料の分析方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MAITI JYOTIRMAY; BISWAS SUMAN; CHAUDHURI ANKUR; CHAKRABORTY SANDIPAN; CHAKRABORTY SIBANI; DAS RANJAN: "Environment sensitive fluorescent analogue of biologically active oxazoles differentially recognizes human serum albumin and bovine serum albumin: Photophysical and molecular modeling studies", SPECTROCHIMICA ACTA PART A: MOLECULAR AND BIOMOLECULAR SPECTROSCOPY, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 175, 21 December 2016 (2016-12-21), AMSTERDAM, NL, pages 191 - 199, XP029895815, ISSN: 1386-1425, DOI: 10.1016/j.saa.2016.12.032 *
RYUICHI EGUCHI, RAPHAEL , RINA EBATA , SAYURI KATO , MANAMI SUDA , RYOSUKE MATSUZAKA , MOTOI YAMAZAKI , TAKETOSHI WATANABE: "Exploration of growth factors and effects of serum on animal cell culture", KAGAKU TO SEIBUTSU - CHEMISTRY AND BIOLOGY, GAKKAI SHUPPAN SENTA / JAPAN SCIENTIFIC SOCIETIES PRESS, JP, vol. 50, no. 5, 1 January 2012 (2012-01-01), JP , pages 383 - 384, XP009560792, ISSN: 0453-073X, DOI: 10.1271/kagakutoseibutsu.50.383 *
S. TOMITA, ET AL.: "The use of an enzyme-based sensor array to fingerprint proteomic signatures of sera from different mammalian species", ANALYTICAL SCIENCES FEBRUARY, vol. 32, 1 January 2016 (2016-01-01), pages 237 - 240, XP055501078 *
SHUNSUKE TOMITA, ISHIHARA SAYAKA, KURITA RYOJI: "Environment-Sensitive Turn-On Fluorescent Polyamino Acid: Fingerprinting Protein Populations with Post-Translational Modifications", APPLIED MATERIALS & INTERFACES, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, US, vol. 9, no. 27, 19 June 2017 (2017-06-19), US , pages 22970 - 22976, XP055501084, ISSN: 1944-8244, DOI: 10.1021/acsami.7b05360 *
SHUNSUKE TOMITA, NIWA OSAMU, KURITA RYOJI: "Artificial Modification of an Enzyme for Construction of Cross-Reactive Polyion Complexes To Fingerprint Signatures of Proteins and Mammalian Cells", ANALYTICAL CHEMISTRY, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, vol. 88, no. 18, 22 August 2016 (2016-08-22), pages 9079 - 9086, XP055501080, DOI: 10.1021/acs.analchem.6b02010 *

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