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WO2025070791A1 - ヒアルロン酸誘導体、ヒアルロン酸誘導体架橋ゲル、及び医薬組成物 - Google Patents

ヒアルロン酸誘導体、ヒアルロン酸誘導体架橋ゲル、及び医薬組成物 Download PDF

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WO2025070791A1
WO2025070791A1 PCT/JP2024/034816 JP2024034816W WO2025070791A1 WO 2025070791 A1 WO2025070791 A1 WO 2025070791A1 JP 2024034816 W JP2024034816 W JP 2024034816W WO 2025070791 A1 WO2025070791 A1 WO 2025070791A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
hyaluronic acid
group
acid derivative
alkyl
groups
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/JP2024/034816
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
昂平 藪内
徹 勝又
剛 下房地
一成 秋吉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Asahi Kasei Corp
Asahi Chemical Industry Co Ltd
Kyoto University NUC
Original Assignee
Asahi Kasei Corp
Asahi Chemical Industry Co Ltd
Kyoto University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Asahi Kasei Corp, Asahi Chemical Industry Co Ltd, Kyoto University NUC filed Critical Asahi Kasei Corp
Publication of WO2025070791A1 publication Critical patent/WO2025070791A1/ja
Pending legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
    • A61K31/728—Hyaluronic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/20—Polysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
    • C08B37/0024—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid beta-D-Glucans; (beta-1,3)-D-Glucans, e.g. paramylon, coriolan, sclerotan, pachyman, callose, scleroglucan, schizophyllan, laminaran, lentinan or curdlan; (beta-1,6)-D-Glucans, e.g. pustulan; (beta-1,4)-D-Glucans; (beta-1,3)(beta-1,4)-D-Glucans, e.g. lichenan; Derivatives thereof
    • C08B37/0027—2-Acetamido-2-deoxy-beta-glucans; Derivatives thereof
    • C08B37/003—Chitin, i.e. 2-acetamido-2-deoxy-(beta-1,4)-D-glucan or N-acetyl-beta-1,4-D-glucosamine; Chitosan, i.e. deacetylated product of chitin or (beta-1,4)-D-glucosamine; Derivatives thereof

Definitions

  • the present invention relates to a hyaluronic acid derivative, a hyaluronic acid derivative crosslinked gel obtained by crosslinking the hyaluronic acid derivative, and a pharmaceutical composition containing the same.
  • biopharmaceuticals which are pharmaceuticals that contain proteins, peptides, or nucleic acids as active ingredients, have been put to practical use, and their number continues to increase year by year.
  • Biopharmaceuticals can meet unmet medical needs that could not be met by conventional small molecule drugs. However, they have issues such as being difficult to absorb from the digestive tract or mucous membranes, being unstable in the body, and having a short half-life in the blood. For this reason, biopharmaceuticals must be administered frequently by injection, which is a heavy burden for both patients and medical professionals. Therefore, there is a demand for drug substrates (sustained-release drug delivery system substrates) that can encapsulate biopharmaceuticals without compromising their pharmacological activity and gradually release the active ingredients in the body.
  • Patent Documents 1 and 2 propose a sustained-release drug delivery system substrate made of a hyaluronic acid derivative with excellent safety.
  • This hyaluronic acid derivative spontaneously aggregates in an aqueous solution, can efficiently encapsulate drugs, particularly biopharmaceuticals, while maintaining their biological activity, aggregates under physiological salt concentrations (or disperses even under physiological salt concentrations), and has good retention in the blood.
  • This hyaluronic acid derivative can be used as a carrier that can efficiently encapsulate many drugs while maintaining their pharmacological activity, and as a blood sustained-release carrier and targeting carrier with excellent retention in the blood, particularly when using biopharmaceuticals as the active ingredient, and can also be used as a local (e.g., subcutaneous) sustained-release carrier that can sustainably release drugs.
  • Hyaluronic acid is also an important component of joints, and there is a treatment method in which hyaluronic acid is injected into the joint cavity to treat joint diseases. For this treatment, it is easy to inject, but it is desirable for it to remain in the joint cavity for a longer period of time. Therefore, Patent Document 3 proposes hyaluronic acid derivatives modified with various block polymers to achieve both ease of injection and long-term retention.
  • injected hyaluronic acid or its derivatives may gel within the joint cavity, but it is preferable that the volume does not change significantly before and after gelation.
  • the swelling of the hyaluronic acid crosslinked gel is as small as possible.
  • crosslinked hydrogels that allow for the encapsulation of large amounts of growth factors and proteins are preferable.
  • hyaluronic acid is a polysaccharide and highly hydrophilic, so it has a high degree of swelling.
  • the hyaluronic acid derivatives described in Patent Documents 1 to 3 also did not sufficiently suppress swelling due to gelation.
  • the present invention has been made in consideration of the above circumstances, and provides a hyaluronic acid derivative and a hyaluronic acid derivative crosslinked gel that are excellent at suppressing swelling after gelation, as well as a pharmaceutical composition using these.
  • a maleimide group is introduced into at least a portion of the carboxyl groups in the glucuronic acid portion of the hyaluronic acid.
  • R 1 , R 2 , R 3 , and R 4 each independently represent a group selected from the group consisting of a hydrogen atom, a C 1-6 alkyl, a formyl, and a C 1-6 alkylcarbonyl;
  • Z represents a direct bond or a peptide linker consisting of any amino acid residues of 2 to 30;
  • X 1 is a group selected from the group consisting of groups represented by -NR b -R, -NR b -COO-R, -NR b -CO-R, -NR b -CO-NR c -R, -COO-R, -O- COO -R, -S-R, -CO-Y a -S-R, -O -CO -Y b -S-R, -NR b -CO-Y b -S-R, and -S-S-R;
  • R a , R b and R c are each
  • R 1 , R 2 , R 3 , and R 4 each independently represent a group selected from the group consisting of a hydrogen atom, a C 1-6 alkyl, a formyl, and a C 1-6 alkylcarbonyl; Z represents a direct bond or a peptide linker consisting of any amino acid residues of 2 to 30;
  • X2 is a maleimide group;
  • R a is a group selected from the group consisting of a hydrogen atom, a C 1-20 alkyl, an amino C 2-20 alkyl, and a hydroxy C 2-20 alkyl, and the alkyl portion of R a may have a group selected from the group consisting of -O- and -NR f - inserted therein;
  • Y is a C 2-30 alkylene or —(CH 2 CH 2 O) m —CH 2 CH 2 —, the alkylene portion of said Y may optionally have an inserted group selected from the group consisting of —
  • a method for producing a hyaluronic acid derivative crosslinked gel comprising reacting any one of the hyaluronic acid derivatives [1] to [8] above with a crosslinking agent having two or more crosslinkable groups to form a gel.
  • a pharmaceutical composition comprising the hyaluronic acid derivative according to any one of [1] to [8] above.
  • a pharmaceutical composition comprising a hyaluronic acid derivative crosslinked gel, in which the hyaluronic acid derivative according to any one of [1] to [8] above is a gel-like substance chemically crosslinked by a crosslinking agent having two or more crosslinkable groups.
  • the pharmaceutical composition according to the above [17] further comprising an active ingredient.
  • the hyaluronic acid derivative of the above embodiment can provide a hyaluronic acid derivative and a hyaluronic acid derivative crosslinked gel that are excellent in suppressing swelling after gelation, as well as a pharmaceutical composition using these.
  • 1 is an NMR chart of the hyaluronic acid derivative crosslinked gel (HA-C6-Chol-0%-Male) synthesized in Example 2.
  • 1 is an NMR chart of the hyaluronic acid derivative crosslinked gel (HA-C6-Chol-1%-Male) synthesized in Example 2.
  • 1 is an NMR chart of the hyaluronic acid derivative crosslinked gel (HA-C6-Chol-5%-Male) synthesized in Example 2.
  • 1 is an NMR chart of the hyaluronic acid derivative crosslinked gel (HA-C6-Chol-10%-Male) synthesized in Example 2.
  • 1 is an NMR chart of the hyaluronic acid derivative crosslinked gel (HA-C6-Chol-15%-Male) synthesized in Example 2.
  • 1 is an NMR chart of the hyaluronic acid derivative crosslinked gel (HA-C6-Chol-20%-Male) synthesized in Example 2.
  • 1 is an NMR chart of the hyaluronic acid derivative crosslinked gel (HA-C6-Chol-30%-Male) synthesized in Example 2.
  • 1 is an NMR chart of the hyaluronic acid derivative crosslinked gel (HA-C6-Chol-40%-Male) synthesized in Example 2.
  • FIG. 13 shows the results of measuring the encapsulation rate (%) of FITC-insulin in a HAMICH cross-linked gel in which FITC-insulin was encapsulated in Example 3.
  • FIG. 1 is a visible light photograph of the appearance of a HAMICH cross-linked gel in which FITC-insulin is encapsulated in Example 3.
  • 5 shows fluorescence microscopy images of a Cy5-HAMICH crosslinked gel with a cholesteryl group introduction rate of 19% (upper part of FIG. 5) and a Cy5-HAMICH crosslinked gel with a cholesteryl group introduction rate of 0% (lower part of FIG. 5) in Example 4, taken after freeze-drying and after freeze-thawing.
  • 13 shows the results of measuring the release rate (%) of FITC-insulin from HAMICH cross-linked gel in which FITC-insulin was encapsulated in Example 8.
  • FIG. 7 shows the change over time in the degree of swelling (%) from the start of gelation of HAMICH crosslinked gel in Example 10.
  • Fig. 7(A) shows the results for the crosslinked gel of HAMICH (HA-C6-Chol-1%-Male 8.1%) in Test Plot 9-1
  • Fig. 7(B) shows the results for the crosslinked gel of HAMICH (HA-C6-Chol-17%-Male 4.6%) in Test Plot 9-1.
  • C 1-20 alkyl as used herein means a straight or branched chain alkyl group having from 1 to 20 carbon atoms, and includes, for example, "C 1-4 alkyl” such as methyl, ethyl, n-propyl, iso-propyl, n-butyl, sec-butyl, iso-butyl, tert-butyl, and further includes n-pentyl, 3-methylbutyl, 2-methylbutyl, 1-methylbutyl, 1-ethylpropyl, n-hexyl, 4-methylpentyl, 3-methylpentyl, 2-methylpentyl, 1-methylpentyl, 3-ethylbutyl, 2-ethylbutyl, etc.
  • C 1-20 alkyl also includes C 1-12 alkyl having from 1 to 12 carbon atoms, and C 1-6 alkyl having from 1 to 6 carbon atoms.
  • C 1-6 alkylcarbonyl as used herein means an alkylcarbonyl group in which the alkyl moiety is the C 1-6 alkyl as already mentioned, and includes, for example, "C 1-4 alkylcarbonyl” such as acetyl, propionyl, n-propylcarbonyl, iso-propylcarbonyl, n-butylcarbonyl, sec-butylcarbonyl, iso-butylcarbonyl, tert-butylcarbonyl, etc.
  • C 1-4 alkylcarbonyl such as acetyl, propionyl, n-propylcarbonyl, iso-propylcarbonyl, n-butylcarbonyl, sec-butylcarbonyl, iso-butylcarbonyl, tert-butylcarbonyl, etc.
  • amino C2-20 alkyl as used herein means a straight or branched alkyl having from 2 to 20 carbon atoms having an amino group as a substituent, for example, the amino group may be located on a terminal carbon atom of the alkyl group.
  • Amino C2-20 alkyl also includes amino C2-12 alkyl having from 2 to 12 carbon atoms.
  • hydroxyC 2-20 alkyl as used herein means a straight or branched alkyl group having from 2 to 20 carbon atoms having a hydroxy group as a substituent, for example, the hydroxy group may be located on a terminal carbon atom of the alkyl group. HydroxyC 2-20 alkyl also includes hydroxyC 2-12 alkyl having from 2 to 12 carbon atoms.
  • C 2-30 alkylene as used herein means a linear or branched, divalent saturated hydrocarbon group having from 2 to 30 carbon atoms, and includes, for example, ethylene, propylene, and the like, including C 2-20 alkylene having from 2 to 20 carbon atoms, C 2-8 alkylene having from 2 to 8 carbon atoms, and the group "-(CH 2 ) n -" (wherein n is from 2 to 30, preferably from 2 to 20, and more preferably from 2 to 15).
  • C 1-5 alkylene as used herein means a linear or branched, divalent saturated hydrocarbon group having from 1 to 5 carbon atoms and includes, for example, methylene, ethylene, propylene, and the like.
  • swelling degree refers to the degree of increase in volume of a hyaluronic acid derivative crosslinked gel obtained by crosslinking crosslinked hyaluronic acid derivatives under physiological salt concentration or in PBS(-) (in vivo) based on the relationship between osmotic pressure and elastic pressure. Specifically, it is calculated by the following formula.
  • a hyaluronic acid derivative crosslinked gel with a negative swelling degree is a gel whose volume at the time of reaching equilibrium in PBS(-) decreases (shrinks) compared to the volume before gelation (corresponding to the volume immediately after gelation).
  • a hyaluronic acid derivative crosslinked gel with a positive swelling degree is a gel whose volume at the time of reaching equilibrium in PBS(-) increases (swells) compared to the volume immediately after gelation.
  • the smaller the absolute value of the swelling degree the smaller the volume change of the crosslinked gel, and this is preferable.
  • a steryl group has been introduced to at least a portion of the carboxyl groups in the glucuronic acid portion of hyaluronic acid
  • a maleimide group has been introduced to at least a portion of the carboxyl groups in the glucuronic acid portion of the hyaluronic acid or the hydroxyl groups in the N-acetylglucosamine portion.
  • the swelling degree of the hyaluronic acid derivative of this embodiment is preferably 115% or less, more preferably 110% or less, and even more preferably 105% or less.
  • the swelling degree of the hyaluronic acid derivative of this embodiment is preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more.
  • the swelling degree of the hyaluronic acid derivative of this embodiment is particularly preferably 85% or more and 115% or less.
  • steryl group used in this specification is not particularly limited as long as it is a group having a steroid skeleton.
  • Specific examples of steroids include cholesterol, cholestanol, campestanol, ergostanol, stigmastanol, coprostanol, stigmasterol, sitosterol, lanosterol, ergosterol, simiarenolol, bile acid, testosterone, estradiol, progesterone, cortisol, cortisone, aldosterone, corticosterone, deoxycortisterone, etc.
  • Examples of steryl groups include cholesteryl groups, stigmasteryl groups, lanosteryl groups, ergosteryl groups, etc., and among these, cholesteryl groups (particularly cholest-5-en-3 ⁇ -yl groups) are preferred.
  • the steryl group may be directly bound to the hyaluronic acid or may be bound via a linker. All of the linkers that are linked to the steryl groups contained in one molecule of the hyaluronic acid derivative may be the same linker, or they may be linkers of different lengths or types.
  • the "linker” referred to here is a group in which a group reactive with a carboxy group and a group reactive with a steryl group are linked by a linear group (spacer).
  • Examples of the group reactive with a carboxy group and the group reactive with a steryl group include an amino group and a hydroxyl group.
  • the linear group for example, a linear hydrocarbon group, a polyethylene glycol (PEG) chain, any peptide linker that can be introduced by genetic engineering, or a synthetic compound linker can be used.
  • the length of the linker is not particularly limited, and can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the purpose.
  • linear hydrocarbon group C 1-30 alkylene is preferable, C 1-10 alkylene is more preferable, and C 1-6 alkylene is even more preferable.
  • PEG group a group in which the number of linked ethylene glycol groups is 1 to 15 is preferable, a group in which the number is 1 to 10 is more preferable, and a group in which the number is 1 to 5 is even more preferable.
  • the peptide linker is 2 or more amino acids (the upper limit is not particularly limited, but usually 30 or less amino acids, preferably 20 or less amino acids), and particularly preferably 15 amino acids.
  • at least a part of the carboxyl group in the glucuronic acid portion is preferably linked to a steryl group by a linker having a chain-like hydrocarbon group.
  • the introduction rate of steryl group in the hyaluronic acid derivative of this embodiment (hereinafter, sometimes simply referred to as "steryl group introduction rate”) is preferably 0.5% or more, more preferably 1.0% or more, more preferably 5.0% or more, and even more preferably 10% or more.
  • the introduction rate of steryl group in the hyaluronic acid derivative of this embodiment is preferably 30% or less, more preferably 25% or less, even more preferably 20% or less, and even more preferably 15% or less.By the introduction rate of steryl group being within the above range, the swelling degree can be sufficiently small, and when crosslinked gel is formed, a sufficient amount of drug can be contained.
  • the steryl group introduction rate can be measured by 1 H-NMR measurement. That is, it can be calculated based on the following formula using the integral value of the peak derived from the steryl group of the hyaluronic acid derivative in the 1 H-NMR spectrum and the integral value of the peak derived from the acetyl group of N-acetyl-D-glucosamine contained in the hyaluronic acid derivative (COCH 3 , 1.6 ppm to 2.0 ppm, 3H).
  • n H represents the number of hydrogen atoms corresponding to the peak. Specifically, it can be measured, for example, according to the method described in the Examples below.
  • Stepryl group introduction rate] (%) ([peak integral value derived from steryl group] ⁇ 3/n H )/[peak integral value derived from acetyl group of N-acetyl-D-glucosamine] ⁇ 100
  • the maleimide group (N-maleimide group) may be directly bonded to hyaluronic acid or may be bonded via a linker.
  • the linkers that are linked to the maleimide groups contained in one molecule of the hyaluronic acid derivative may all be the same linker, or may be linkers of different lengths or types.
  • the "linker” referred to here is a group in which a group that reacts with a carboxy group and a group that reacts with an NH group in a maleimide group are linked by a chain group.
  • groups that react with a carboxy group include amino groups and hydroxyl groups
  • examples of groups that react with an NH group in a maleimide group include carboxy groups and hydroxyl groups.
  • Examples of the chain group include the same groups as the chain groups in the linker that links the hyaluronic acid derivative and the steryl group.
  • the carboxyl groups in the glucuronic acid portion and the hydroxyl groups in the N-acetylglucosamine portion are linked to the NH group of the maleimide group by a linker having a chain hydrocarbon group.
  • the maleimide group introduction rate in the hyaluronic acid derivative of this embodiment (hereinafter sometimes simply referred to as "maleimide group introduction rate”) is preferably 1.0% or more, more preferably 3.0% or more, even more preferably 4.5% or more, even more preferably 5.0% or more, even more preferably 8.0% or more, and particularly preferably 10% or more.
  • the maleimide group introduction rate in the hyaluronic acid derivative of this embodiment is preferably 25% or less, more preferably 20% or less.
  • the maleimide group introduction rate in the hyaluronic acid derivative of this embodiment, especially the steryl group introduction rate is within the above range, so that the swelling degree can be sufficiently reduced.
  • the maleimide group introduction rate can be measured by 1 H-NMR measurement.
  • the integral value of the peak derived from the cholesteryl group methyl (0.7 ppm) multiplied by 5/3 is subtracted from the integral value of the peak in the vicinity of 1.6 to 2.0 ppm (i.e., [[peak integral value (1.6 to 2.0 ppm)] - [peak integral value (0.7 ppm)] ⁇ 5/3] is used as the integral value (corrected value) of the acetyl group derived from hyaluronic acid to calculate the introduction rate.
  • the cholesteryl group introduction rate (%) is calculated using the following formula.
  • the maleimide group introduction rate (%) can be calculated based on the integral value of the peak derived from the maleimide group and the integral value of the peak derived from the cholesteryl group ( COCH3 , 1.6 ppm to 2.0 ppm, 3H) according to the following formula: Specifically, it can be measured according to the method described in the Examples below.
  • the total of the steryl group introduction rate and the maleimide group introduction rate in the hyaluronic acid derivative of this embodiment is preferably 55% or less, more preferably 45% or less, even more preferably less than 45%, even more preferably 40% or less, and particularly preferably 35% or less.
  • the total of the steryl group introduction rate and the maleimide group introduction rate in the hyaluronic acid derivative of this embodiment is preferably 1.0% or more, more preferably 2.5% or more, and even more preferably 5.0% or more.
  • the volume change at physiological salt concentration (in vivo) after gelation can be made smaller, and when used as a DDS carrier, the crosslinking density can be increased, thereby extending the sustained release period of the drug.
  • hyaluronic acid derivatives include hyaluronic acid derivatives having one or more repeating units represented by the following general formula (I) (hereinafter, sometimes referred to as “repeating unit (I)”) and one or more repeating units represented by the following general formula (II) (hereinafter, sometimes referred to as “repeating unit (II)”):
  • R 1 , R 2 , R 3 , and R 4 are each independently selected from the group consisting of a hydrogen atom, a C 1-6 alkyl, a formyl, and a C 1-6 alkylcarbonyl;
  • Z represents a direct bond or a peptide linker consisting of any amino acid residues of 2 to 30;
  • X1 is represented by the following formula: -NR b -R, -NR b -COO-R, -NR b -CO-R, -NR b -CO-NR c -R, -COO-R, -O-COO-R, -S-R, -CO-Y a -SR, -O-CO-Y b -SR, -NR b -CO-Y b -S-R, and -S-S-R, is a group selected from the group consisting of groups represented by R a , R b and R c are each independently selected from the group
  • R 1 , R 2 , R 3 , and R 4 are each independently selected from the group consisting of a hydrogen atom, a C 1-6 alkyl, a formyl, and a C 1-6 alkylcarbonyl;
  • Z represents a direct bond or a peptide linker consisting of any amino acid residues of 2 to 30;
  • R a is selected from the group consisting of a hydrogen atom, a C 1-20 alkyl, an amino C 2-20 alkyl, and a hydroxy C 2-20 alkyl, wherein the alkyl portion of the group may be interrupted by a group selected from the group consisting of -O- and -NR f -;
  • R f is selected from the group consisting of a hydrogen atom, a C 1-12 alkyl, an amino C 2-12 alkyl, and a hydroxy C 2-12 alkyl, the alkyl portion of which may be inserted with a group selected from the group consisting of -O- and -NH
  • Z is preferably a direct bond.
  • X 1 is preferably -NR b -COO-R.
  • Z may be a peptide linker represented by -NH-[CH(-Z a )-CONH] n-1 -CH(-Z a )-CO-, where n is an integer of 2 to 30, and Z a each independently represents a substituent in an ⁇ -amino acid represented as H 2 N-CH(-Z a )-COOH.
  • the peptide linker is bonded to the carboxy group of the glucuronic acid moiety at the N-terminus and to the group -N(-R a )-Y-X 1 at the C-terminus.
  • amino acids that can be used as amino acid residues of the peptide linker include ⁇ -amino acids, such as natural (L-type) amino acids such as alanine, arginine, asparagine (Asn), aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine (Gly), histidine, isoleucine, leucine (Leu), lysine, methionine, phenylalanine (Phe), proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine, and valine, and D-forms thereof, and all ⁇ -amino acids including synthetic amino acids can be used.
  • examples of Z a include -CH 3 , H 2 NC(NH)NH(CH 2 ) 3 -, and H 2 NCOCH 2 -.
  • n Zs may be the same or different.
  • n is an integer of 2 to 30, preferably 2 to 10, and more preferably 2 to 4.
  • Preferred examples of peptide linkers include, for example, -Gly-Phe-Leu-Gly-, -Asn-Phe-Phe-, -Phe-Phe-, Phe-Gly- and the like.
  • Y is preferably a group selected from the group consisting of -(CH 2 ) n1 - and -(CH 2 CH 2 O) m1 -CH 2 CH 2 - (wherein n1 is an integer of 2 or more and 20 or less, preferably an integer of 2 or more and 15 or less, more preferably an integer of 2 or more and 12 or less, and even more preferably an integer of 2 or more and 6 or less; m1 is an integer of 1 or more and 4 or less).
  • Y is preferably a group selected from the group consisting of -(CH 2 ) 2 -, -(CH 2 ) 6 -, -(CH 2 ) 8 - and -(CH 2 ) 12 -, and more preferably -(CH 2 ) 6 -.
  • Y is, for example, -CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -S-S-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -, -(CH 2 CH 2 O) 2 -CH 2 CH 2 -S-S-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -, -CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -S-S-(CH 2 CH 2 O) 2 -CH 2 CH 2 -, -(CH 2 CH 2 O) 2 -CH 2 CH 2 -S-S-(CH 2 CH 2 O) 2 -CH 2 CH 2 - etc. may be used.
  • Y a is preferably —CH 2 — or —CH 2 —CH 2 —.
  • Y b is preferably -CH 2 -CH 2 -, -CH(CH 3 )CH 2 -, 2-butene-1,4-diyl, hepta-2,4-diene-1,6-diyl or octa-2,4,6-triene-1,8-diyl, and more preferably -CH 2 -CH 2 - or -CH(CH 3 )CH 2 -.
  • Specific examples of the group "-Z-N(R a )Y-X 1 " include -NH-(CH 2 ) 2 -NH-CO-cholesteryl, -NH-(CH 2 ) 4 -NH-(CH 2 ) 3 -NH-(CH 2 ) 3 -NH-COO-cholesteryl, -NH-(CH 2 ) 3 -NH-(CH 2 ) 4 -NH-(CH 2 ) 3 -NH-COO-cholesteryl, -NH-(CH 2 ) 4 -NH-(CH 2 ) 3 -NH-COO-cholesteryl, -NH-(CH 2 ) 4 -NH-(CH 2 ) 3 -NH-COO-cholesteryl, -NH-(CH 2 ) 4 -NH-(CH 2 ) 3 -NH-COO-cholesteryl, -NH-(CH 2 ) 4 -N(-(CH 2 ) 3 -NH 2 )-COO-cholesteryl, -
  • Preferred groups include "-Z-N(R a )Y-X 1 " in which R a , R b and R c are hydrogen atoms, Y is linear C 2-30 alkylene or -(CH 2 CH 2 O) m -CH 2 CH 2 -, Y a is linear C 1-5 alkylene, or Y b is linear C 2-8 alkylene or linear C 2-8 alkenylene.
  • the repeating unit (I) is particularly preferably a repeating unit in which, in general formula (I), Z is a direct bond, R a is a hydrogen atom or a C 1-6 alkyl, Y is a C 2-30 alkylene or -(CH 2 CH 2 O) m -CH 2 CH 2 -, X 1 is a group represented by -NR b1 -COO-R, R b1 is a hydrogen atom or a C 1-6 alkyl, and R is a steryl group; more preferably a repeating unit in which Z is a direct bond, R a is a hydrogen atom, Y is a C 2-30 alkylene or -(CH 2 CH 2 O) m -CH 2 CH 2 -, X 1 is a group represented by -NR b1 -COO-R, R b1 is a hydrogen atom or a C 1-6 alkyl, and R is a steryl group; It is more preferable that the repeat
  • repeating unit (II) particularly preferred is a repeating unit in which, in general formula (II), Z is a direct bond, R a is a hydrogen atom or a C 1-6 alkyl, Y is a C 2-30 alkylene or -(CH 2 CH 2 O) m -CH 2 CH 2 -, and X 2 is a maleimide group; more preferred is a repeating unit in which Z is a direct bond, R a is a hydrogen atom or a C 1-6 alkyl, Y is a C 2-30 alkylene, and X 2 is a maleimide group; even more preferred is a repeating unit in which Z is a direct bond, R a is a hydrogen atom, Y is a C 2-30 alkylene, and X 2 is a maleimide group; and even more preferred is a repeating unit in which Z is a direct bond, R a is a hydrogen atom, Y is a C 2-10 alkylene, and X 2 is
  • the two or more repeating units (I) contained in one molecule of the hyaluronic acid derivative may all be the same repeating unit, or may be two or more different types of repeating units.
  • the two or more repeating units (II) contained in one molecule of the hyaluronic acid derivative may all be the same repeating unit, or may be two or more different types of repeating units.
  • the ratio of the total number of repeating units (I) and repeating units (II) to the total number of repeating units in the hyaluronic acid derivative of this embodiment is preferably 40% or less, more preferably 35% or less, and even more preferably 30% or less.
  • the ratio of the total number of repeating units (I) and repeating units (II) to the total number of repeating units in the hyaluronic acid derivative of this embodiment is preferably 1.0% or more, more preferably 2.5% or more, and even more preferably 5.0% or more.
  • the volume change after gelation can be made smaller, and the drug encapsulation rate can be increased when used as a DDS carrier.
  • the weight average molecular weight of the hyaluronic acid derivative of the present embodiment is not particularly limited, and is, for example, preferably 1,000 (1k) or more and 1,000,000 (1,000k) or less, more preferably 5k or more and 300k or less, even more preferably 6k or more and 200k or less, and particularly preferably 30k or more and 130k or less.
  • the weight-average molecular weight of the hyaluronic acid derivative of this embodiment is preferably 250 kDa or less, more preferably 200 kDa or less, and even more preferably 150 kDa or less, from the viewpoint of being able to more sufficiently reduce the volume change after gelation and to easily adjust the particle size of the hyaluronic acid crosslinked gel obtained by crosslinking within an appropriate range. From the viewpoint of gelation of the hyaluronic acid derivative, it is preferably 4 kDa or more, more preferably 20 kDa or more, even more preferably 30 kDa or more, and even more preferably 40 kDa or more.
  • the weight-average molecular weight of the hyaluronic acid derivative of this embodiment is particularly preferably 50 kDa or more, and more preferably 90 kDa or more.
  • the molecular weight of the hyaluronic acid derivative can generally be adjusted by using a raw material having a corresponding molecular weight.
  • the weight-average molecular weight Mw and number-average molecular weight Mn of a hyaluronic acid derivative can generally be adjusted by using raw materials having the corresponding molecular weights.
  • the weight average molecular weight Mw and number average molecular weight Mn of the hyaluronic acid derivative can be measured, for example, by size exclusion chromatography multi-angle light scattering detector (SEC-MALS).
  • SEC-MALS size exclusion chromatography multi-angle light scattering detector
  • the weight average molecular weight Mw and number average molecular weight Mn of the hyaluronic acid derivative can be measured according to the method described in the examples below.
  • the hyaluronic acid derivative of this embodiment forms nanoparticles in aqueous solution.
  • the size of the nanoparticles formed by the hyaluronic acid derivative of this embodiment is not particularly limited, but for example, the average particle size is preferably 500nm or less, more preferably 450nm or less, even more preferably 400nm or less, even more preferably 300nm or less, and particularly preferably 250nm or less.
  • the average particle size of the nanoparticles formed by the hyaluronic acid derivative of this embodiment is preferably 10nm or more, more preferably 20nm or more, and even more preferably 50nm or more.
  • the "average particle size of nanoparticles of hyaluronic acid derivatives” refers to the z-average particle size measured by dynamic light scattering.
  • the z-average particle size can be measured by dynamic light scattering using, for example, a solution in which the hyaluronic acid derivative is dissolved in phosphate buffer (10 mM) to give a concentration of 1 mg/mL.
  • the nanoparticles formed by the hyaluronic acid derivative of this embodiment are hollow and can encapsulate various substances inside. For example, by dissolving the target substance to be encapsulated together with the hyaluronic acid derivative in an aqueous solution, nanoparticles with the target substance encapsulated inside and an outer shell made of the hyaluronic acid derivative are formed.
  • the nanoparticles of the hyaluronic acid derivative of this embodiment can encapsulate relatively large substances or substances that are poorly soluble in water well. From these points of view, the hyaluronic acid derivative of this embodiment is suitable as a base material for a drug delivery system, and is particularly preferable as a base material for a sustained-release drug delivery system.
  • the hyaluronic acid derivative of this embodiment can obtain a crosslinked gel by reacting with a crosslinking agent while encapsulating the drug and without denaturing the drug.
  • the hyaluronic acid derivative of the present embodiment can be obtained by, for example, converting the carboxyl group of glucuronic acid to amide, introducing steryl group directly or via a linker to at least a part of the hyaluronic acid, and introducing maleimide group directly or via a linker to the other part of the hyaluronic acid.
  • the introduction rate of steryl group can be controlled by adjusting the amount of the compound having steryl group reacted with the raw material hyaluronic acid or its derivative, and the introduction rate of maleimide group can be controlled by adjusting the amount of the compound having maleimide group reacted with the raw material hyaluronic acid.
  • the compound having steryl group can be reacted with the raw material hyaluronic acid, and the compound having maleimide group can be reacted with the obtained reactant, or the compound having maleimide group can be reacted with the raw material h
  • Methods for introducing maleimide groups or steryl groups into hyaluronic acid as a raw material can be carried out by appropriately modifying the methods described in, for example, JP-A-2021-123597, JP-A-2022-013861, JP-A-2022-044579, etc.
  • Specific examples of methods for converting the carboxy group of glucuronic acid to an amide and introducing a steryl group or maleimide group include a method in which the raw material hyaluronic acid or a derivative thereof is ion-exchanged with a tetraalkylammonium salt (e.g., tetrabutylammonium (TBA) salt), and the hyaluronate is reacted with an amine having a steryl group (particularly a cholesteryl group) in a solvent in the presence of a suitable condensing agent.
  • a tetraalkylammonium salt e.g., tetrabutylammonium (TBA) salt
  • Condensing agents that can be used in the above reaction are not particularly limited, and examples include 4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazine)-4-methylmorpholinium (DMT-MM), N,N'-carbonyldiimidazole (CDI), N,N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC), N-ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroquinoline (EEDQ), 2-benzotriazole-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TBTU).
  • DMT-MM 4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazine)-4-methylmorpholinium
  • CDI N,N'-carbonyldiimidazole
  • DCC N,N'-dicyclohexylcarbodiimide
  • EEDQ N-ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroquinoline
  • DMT-MM is preferred in that the reaction proceeds efficiently even in a mixed solvent of water and an organic solvent.
  • DMT-MM as a condensing agent, it is possible to highly selectively form amide bonds between amino groups and carboxy groups in a system in which many hydroxy groups coexist, while suppressing the formation of ester bonds.
  • the use of this condensing agent can prevent, for example, the reaction of the alcohol solvent with the carboxy groups in the hyaluronic acid portion, or the formation of undesired crosslinks caused by intramolecular or intermolecular bonds between the carboxy groups and hydroxy groups simultaneously present in the hyaluronic acid portion.
  • Solvents used in the steryl group introduction reaction include water, DMSO, methanol, ethanol, propanol, butanol, isopropanol, polyhydric alcohols, acetonitrile, DMF, THF, dichloromethane, chloroform, hexane, diethyl ether, ethyl acetate, and mixed solvents thereof.
  • the polyhydric alcohol may be a dihydric alcohol or a trihydric alcohol. Examples of dihydric alcohols include ethylene glycol, diethylene glycol, propylene glycol, dipropylene glycol, neopentyl glycol, 1,4-butanediol, and 1,6-hexanediol. Examples of trihydric alcohols include glycerin and trimethylolpropane.
  • the pH of the reaction system is preferably under acidic conditions.
  • succinimide groups can be generated by inactivation of the maleimide groups.
  • the starting hyaluronic acid or its derivative may be ion-exchanged with a tetraalkylammonium salt (e.g., tetrabutylammonium (TBA) salt), and the hyaluronic acid salt may be reacted with a spacer moiety in a solvent in the presence of a suitable condensing agent (protection and deprotection reactions may be carried out as necessary), converting the carboxy group (-COOH) of the starting hyaluronic acid or its derivative, and then reacting with a suitable reagent.
  • TSA tetrabutylammonium
  • Reaction modes include dehydrohalogenation reactions, condensation reactions, dehydration reactions, nucleophilic addition reactions such as Michael addition, and oxidative disulfide formation reactions. These are well-known reactions and can be appropriately selected by those skilled in the art to find suitable reaction conditions.
  • the conversion product or reactant may be reacted as an N-hydroxysuccinimide (hereinafter also referred to as "NHS”) ester.
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • Another method is to react the carboxyl group of the raw material hyaluronic acid or its derivative with 2-aminoethyl 2-pyridyl disulfide to prepare a hyaluronic acid derivative in which a spacer having a mercapto group modified with a leaving group is introduced at the end, and then to perform a nucleophilic substitution reaction with thiocholesterol to form a disulfide bond.
  • a method of preparing hyaluronic acid or a derivative thereof in which a part of a spacer has been introduced to the carboxy group, and in which a part of a spacer has been introduced to the steryl group, and then reacting these Some specific examples have been described above, but in addition, when -S-S- is inserted into Y, there is also a method of preparing a hyaluronic acid derivative in which a spacer having a terminal mercapto group has been introduced to the carboxy group of hyaluronic acid, and a steryl group in which a spacer having a terminal mercapto group has been introduced, and then reacting these oxidatively to form a disulfide bond. In this case, one of the mercapto groups can be reacted with 2-mercaptopyridine to form a disulfide, and then substituted with the other mercapto group.
  • the hyaluronic acid derivative of the present embodiment can be gelled by chemical crosslinking. That is, the hyaluronic acid crosslinked gel of the present embodiment is obtained by gelling the hyaluronic acid derivative of the present embodiment by chemical crosslinking using a crosslinking agent having two or more crosslinking groups per molecule.
  • the hyaluronic acid crosslinked gel of this embodiment is obtained by gelling a liquid composition in which the hyaluronic acid derivative of this embodiment and a crosslinking agent are dissolved in a solvent through a chemical crosslinking reaction.
  • the reaction conditions such as the concentration of the hyaluronic acid derivative, the type of crosslinking agent, the crosslinking agent concentration, the type of solvent, the solvent pH, the salt concentration, the temperature, and the time can be appropriately determined.
  • crosslinking agent having groups capable of forming crosslinks (crosslinkable groups) at both ends in the process of gelling the hyaluronic acid derivative of this embodiment
  • the crosslinking agent it is preferable to add the crosslinking agent at a concentration such that the groups can participate in the crosslinking reaction promptly and without excess or deficiency.
  • the maleimide group:SH group ratio is preferably 3:1 to 1:3, and particularly preferably 2:1 to 1:2.
  • the crosslinking agent is not particularly limited as long as it is a compound having two or more crosslinkable groups per molecule.
  • the hyaluronic acid crosslinked gel of this embodiment is preferably a gel-like substance in which the hyaluronic acid derivative of this embodiment is chemically crosslinked using a compound having two or more thiol groups per molecule as a crosslinking agent.
  • examples of compounds having two or more thiol groups per molecule include DTT (dithiothreitol), SH-containing PEG compounds having thiol groups at both ends of a single-chain PEG, and SH-containing PEG compounds having a branched PEG chain with 3 to 8 arms and a thiol group at the end of each arm. With these SH-containing PEG compounds, the molecular weight can be adjusted by adjusting the degree of polymerization of PEG.
  • the larger the molecular weight the greater the mass of the crosslinking agent required to add the molar amount of thiol groups required for crosslinking to the hyaluronic acid derivative, and the greater the degree of swelling.
  • the crosslinking agent used in the production of the hyaluronic acid crosslinked gel of this embodiment is a compound that contains two or more mercapto groups in the same molecule that react with unsaturated bonds in a nucleophilic addition reaction.
  • crosslinking agents include polyethylene glycol dithiol and peptides that contain two or more cysteines.
  • the crosslinking agent used in the production of the hyaluronic acid crosslinked gel of this embodiment is preferably a 2- to 8-arm PEG compound having an SH group at the end of the arms, more preferably a 3- to 6-arm PEG compound having an SH group at the end of the arms, even more preferably a 4-arm PEG compound having an SH group at the end of the arms, even more preferably a 4-arm PEG compound having an SH group at the end of the arms with a weight average molecular weight of 2k to 40k, and particularly preferably a 4-arm PEG compound having an SH group at the end of the arms with a weight average molecular weight of 5k to 20k.
  • the solvent used in the step of gelling the hyaluronic acid derivative is preferably one that can sufficiently dissolve the hyaluronic acid derivative and the crosslinking agent, and is not particularly limited, but it is preferable to use water, dimethyl sulfoxide (DMSO), dimethylacetamide (DMAc), dimethylformamide (DMF), N-methylpyrrolidone (NMP), or a mixed solvent selected from these. It is also possible to mix and use an organic solvent that is miscible with these solvents. Although not particularly limited, examples of miscible organic solvents include methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol, polyhydric alcohols, acetone, acetonitrile, etc. Examples of polyhydric alcohols include the same ones exemplified above, and among them, ethylene glycol is preferred.
  • the basic compound to be used is not particularly limited, but examples include carbonates such as sodium carbonate and sodium bicarbonate, sodium hydroxide and hydroxides such as sodium hydroxide, aqueous ammonia, and amines such as pyridine, triethylamine, ethylenediamine, ethanolamine, diethanolamine, and triethanolamine. Amines are preferably used, and triethanolamine is more preferably used.
  • Hyaluronic acid derivatives form nanoparticles in aqueous solutions as targeting carriers, so that nano-sized microparticle gels can be formed by crosslinking under dilute conditions, and they can be used as sustained release carriers in the blood.
  • Dilute conditions are 10 mg/mL or less, preferably 5 mg/mL or less, and more preferably 1 mg/mL or less.
  • crosslinking under high concentration conditions can form a bulk gel in which the microparticles are crosslinked with each other. This is useful as a subcutaneous sustained release carrier.
  • High concentration conditions are 5 mg/mL or more, preferably 20 mg/mL or more, and more preferably 30 mg/mL.
  • the process may also be carried out in a solvent that allows desolvation, such as supercritical carbon dioxide or PEG.
  • a solvent that allows desolvation such as supercritical carbon dioxide or PEG.
  • the aqueous phase or organic solvent phase in which the hyaluronic acid derivative and crosslinking agent are dissolved is emulsified and dispersed in the solvent of the previous example, and the polymer is concentrated due to desolvation (solvent diffusion), making it possible to obtain a gel with a higher crosslink density.
  • the step of gelling the hyaluronic acid derivative and the subsequent steps may be performed to terminate the crosslinking reaction and to inactivate or wash away remaining crosslinking groups. It is preferable to remove crosslinking groups not involved in the reaction, groups bound to only one end of the crosslinking agent, remaining crosslinking agent, etc. from the standpoint of safety, stability during storage, side reactions with the encapsulated drug, etc. Although not particularly limited, for example, if unreacted crosslinking agent remains, it may be removed by washing with excess water, etc.
  • a grinding step may be carried out after the step of gelling the hyaluronic acid derivative.
  • Grinding methods include grinding using a pestle and mortar and grinding using a mill, with grinding using a mill being preferred.
  • mill grinding devices include rotating disk-type grinding devices such as a centrifugal grinder (manufactured by Nippon Seiki Seisakusho) and an impact mill (manufactured by Dalton Co., Ltd.), screen mill grinding devices such as an atomizer (manufactured by Tokyo Atomizer Mfg. Co., Ltd.), a sample mill (manufactured by Tokyo Atomizer Mfg. Co., Ltd.), a bantam mill (manufactured by Tokyo Atomizer Mfg.
  • SK mill manufactured by Tokken Co., Ltd.
  • jet grinding devices such as an ultra-micro laboratory jet mill (A-O jet mill, Seishin Enterprise Co., Ltd.), and a Rinrex mill (Liquid Gas Co., Ltd.) capable of grinding at ultra-low temperatures, with the SK mill and Rinrex mill being preferred.
  • the hyaluronic acid crosslinked gel of this embodiment may be a gel-like material obtained by chemically crosslinking the hyaluronic acid derivative of this embodiment with a crosslinking agent, or may be a dried material obtained by drying this. Drying methods include, for example, freeze-drying, ventilation drying, drying in a thermostatic chamber, drying under reduced pressure, and hot air circulation drying. The wind speed, drying time, temperature, pressure, and the like are appropriately selected within a range in which the hyaluronic acid derivative gel does not decompose or deteriorate.
  • the dried product of the hyaluronic acid cross-linked gel of this embodiment and the hyaluronic acid cross-linked gel of this embodiment are porous structures in both the dried and swollen states.
  • this allows relatively large components such as cells to be supported, and the dried product can be suitably used as a substrate for cells and tissues used in regenerative medicine and the like.
  • cells for transplantation can be attached and cultured in the dried product, and then transplanted into the target tissue.
  • the dried product and cross-linked gel also function as a scaffold for cell growth in in situ regeneration therapy. For example, by embedding the dried product in tissue within the body, cells that have migrated from the surrounding tissue can be attached using the dried product as a scaffold.
  • the dried product of the hyaluronic acid crosslinked gel of this embodiment and the hyaluronic acid crosslinked gel of this embodiment can control the adhesiveness of cells by changing the introduction rate of the cholesteryl derivative.
  • compositions comprising said hyaluronic acid derivative.
  • hyaluronic acid derivative mainly functions as a carrier of active ingredient.
  • active ingredient such as drug is gradually released from the carrier that comprises hyaluronic acid derivative, and can expect good sustained release.
  • the active ingredient contained in the pharmaceutical composition of this embodiment is not particularly limited as long as it is a pharmaceutical product for humans or animals (a substance administered for the diagnosis, treatment, or prevention of a disease) or a substance used as an active ingredient thereof.
  • the active ingredient may be a water-soluble substance or a poorly soluble substance.
  • Examples of the active ingredient include proteins, peptides, polysaccharides, oligosaccharides, nucleic acids, oligonucleotides, low molecular weight compounds, cells, etc.
  • it may be a complex of protein and nucleic acid, such as a Cas9/gRNA complex.
  • Examples of the pharmaceutical composition of this embodiment include nanoparticles formed from the hyaluronic acid of this embodiment and encapsulating an active ingredient, a dried product of the hyaluronic acid crosslinked gel of this embodiment and a hyaluronic acid crosslinked gel to which transplant cells have been engrafted, a hyaluronic acid crosslinked gel containing a poorly soluble drug, and a dried product thereof.
  • the pharmaceutical composition of the present embodiment may be a dispersible microparticle solution, a precipitated suspension, or a freeze-dried product.
  • a freeze-dried product it may be a precipitated sustained-release preparation that a doctor prepares the administration solution by adding an isotonic solution such as physiological saline before administration.
  • an isotonic solution such as physiological saline before administration.
  • it is considered to be suitable for pharmaceutical compositions containing active ingredients that are unstable in a solution state.
  • the concentration of the hyaluronic acid derivative in the pharmaceutical composition is preferably 1 mg/mL or more and 200 mg/mL or less, more preferably 4 mg/mL or more and 100 mg/mL or less, even more preferably 4 mg/mL or more and 50 mg/mL or less, and particularly preferably 4 mg/mL or more and 12 mg/mL or less.
  • composition of this embodiment is not limited to the forms already described, and may be in the form of nanoparticles, microparticles, solutions, emulsions, suspensions, gels, micelles, implants, powders, or films. Powders may be produced by grinding solids obtained by freeze-drying or spray-drying, or from dried precipitates.
  • the pharmaceutical composition of this embodiment may be administered orally, parenterally, intranasally, intravaginally, intraocularly, subcutaneously, intravenously, intramuscularly, intradermally, intraperitoneally, intracerebrally, or intraorally.
  • the pharmaceutical composition of this embodiment is not limited to injections, and may be a patch preparation, a microneedle preparation, a topical ointment, an eye drop, a spray, an inhalant, or the like.
  • the HA derivatives were analyzed by SEC-MALS using an Optilab refractive index monitor equipped with a Wyatt Dawn NEON multi-angle light scattering detector and an isocratic HPLC system (Waters).
  • SEC-MALS buffer 10 mM phosphate buffer, pH 7.4
  • the separation step was carried out in SEC-MALS buffer using a G4000SWXL column (Tosoh) at a flow rate of 0.5 mL/min.
  • Data analysis was carried out using the refractive index concentration coefficient dn/dc value of hyaluronic acid (0.153, literature value) and Astra software (Wyatt Technology).
  • HA derivatives were characterized by DLS analysis using an ELSZ-2000 (Otsuka Electronics Co., Ltd.) in a solution of the same solvent as SEC (10 mM phosphate buffer, pH 7.4).
  • ELSZ-2000 Oleuka Electronics Co., Ltd.
  • SEC 10 mM phosphate buffer, pH 7.4
  • the measured autocorrelation function was performed by the cumulant method.
  • the hydrodynamic diameter of the HA derivatives was analyzed using the Stokes-Einstein equation.
  • HA derivative cross-linking gelation test HA derivative cross-linking gelation test
  • SH groups SH groups at the termini of four arms
  • the HA derivative and PEGSH were completely dissolved separately in a solvent (10 mM phosphate buffer, pH 7.4), and then both were poured into one vial while cooling to 5°C, and incubated at 37°C for 30 minutes. The vial was inverted over time from the start of incubation to check whether the sample flowed and dropped. Samples that did not show flow within 5 minutes or 30 minutes from the start of incubation were classified as gels, and samples that flowed even after 30 minutes from the start of incubation were classified as sols. All samples were classified as either gels or sols.
  • HA derivative crosslinked gel Two precursor solutions (phosphate buffer solution of HA derivative and phosphate buffer solution of PEGSH) were poured into a disk-shaped silicone rubber mold (diameter 6 mm, depth 1 mm) placed on a polytetrafluoroethylene membrane while cooling to 5° C. The mold was then covered with a silicone cover sheet and incubated at 37° C. for 30 minutes. After incubation, the sample was transferred to a glass vial. The molar ratio of maleimide groups to thiol groups was 1.1:1.
  • FBS fetal bovine serum
  • HA derivative (HA-C6-Chol-Male, sometimes referred to as "HAMICH") was prepared in which a steryl group and a maleimide group were introduced into at least a portion of the carboxyl groups in the glucuronic acid portion of hyaluronic acid.
  • Cholesteryl 6-aminohexylcarbamate hydrochloride (Chol-C6 hydrochloride) and tetrabutylammonium salt of hyaluronic acid (HA-TBA) were synthesized as described in Examples 1 and 2 of US Pat. No. 5,999,333.
  • HA-Na sodium hyaluronate
  • DMT-MM 4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride
  • HA-TBA was completely dissolved in DMSO (1% w/v), then N-(5-aminopentyl)maleimide dissolved in DMSO was added and stirred at room temperature for 5 min. Subsequently, DMT-MM was added to the mixture and stirred at room temperature overnight.
  • the obtained reaction solution was dialyzed (Spectrapore 4, molecular weight cut-off (MWCO): 12 kDa to 14 kDa, manufactured by Spectrum Laboratories) against a DMSO solution, a 0.15 M NaCl aqueous solution, and ultrapure water in that order, and the obtained dialysate was freeze-dried to obtain the target products (HA-C6-Chol-1%-Male 15% to HA-C6-Chol-40%-Male 15%) shown in Table 1 as white solids.
  • MWCO molecular weight cut-off
  • a hyaluronic acid derivative in which the maleimide group was modified but not modified with Chol was produced in the same manner as above, except that Chol hydrochloride was not reacted.
  • the target product (HA-C6-Chol-0%-Male) shown in Table 1 was obtained as a white solid.
  • each compound was confirmed by 1 H NMR measurement.
  • HAMICH was dissolved in 0.02N DCI/DMSO.
  • the degree of maleimide (maleimide group introduction rate) of each HA derivative was 15%.
  • NMR charts of each compound are shown in Figure 1A (Chol-0%) to Figure 1H (Chol-40%).
  • the z-average particle size (nm) of each HAMICH was measured. The measurement results are shown in Table 2.
  • the degree of association of each HAMICH was calculated from the absolute molecular weight measured by GPC-MALS analysis and the theoretical average molecular weight per unit. The results are shown in Table 2.
  • HAMICH the particle size decreased depending on the introduction rate of cholesteryl groups up to 20%, but when the introduction rate of cholesteryl groups increased to 40%, the particle size increased, indicating that the introduction rate of cholesteryl groups affects the particle size of HA derivative nanoparticles. Furthermore, in HAMICH that was not modified with cholesteryl (0%), there was almost no association because the hydrophobic interactions of the steryl groups did not work.
  • Example 2 The HAMICH prepared in Example 1 was chemically cross-linked using a cross-linking agent 4arm-PEGSH to prepare a HAMICH cross-linked gel.
  • each HAMICH prepared in Example 1 was dissolved in 10 mM phosphate buffer (pH 7.4) to the concentrations shown in Table 3 to prepare a HAMICH solution.
  • 4arm-PEGSH (Mw: 10,000) was dissolved in 10 mM phosphate buffer (pH 7.4) to a concentration of 20 mg/mL to prepare a PEGSH solution.
  • the two solutions were mixed in a silicon mold 1 mm thick and 6 mm in diameter so that the molar ratio of the maleimide groups modified with hyaluronic acid and the SH groups derived from 4arm-PEGSH was 1.1:1.0 to produce a HAMICH crosslinked gel at 37°C.
  • the final concentration of the hyaluronic acid derivative was set to 7 mg/mL.
  • HA-C6-Chol-MA we prepared an HA derivative (HA-C6-Chol-MA, sometimes referred to as "HAMA") in which steryl and methacryl groups were introduced into at least a portion of the carboxyl groups in the glucuronic acid portion of hyaluronic acid.
  • Cholesteryl 6-aminohexylcarbamate hydrochloride (Chol-C6 hydrochloride) and tetrabutylammonium salt of hyaluronic acid (HA-TBA) were synthesized as described in Examples 1 and 2 of US Pat. No. 5,999,333.
  • HA-Na sodium hyaluronate
  • a cation exchange resin Dowex (registere
  • HA-TBA was completely dissolved in DMSO (1% w/v), then 2-aminoethyl methacrylate hydrochloride (Fujifilm Wako Co., Ltd., product number 510-51961) dissolved in DMSO was added and stirred at room temperature for 5 minutes. DMT-MM was then added to the mixture and stirred overnight at room temperature.
  • the HA product was purified by dialysis (MWCO: 12-14 kDa) against DMSO, then against 0.150 M NaCl, and finally against distilled water. The purified HA solution was filtered through a 0.22 ⁇ m membrane filter and lyophilized to dryness.
  • Comparative Example 2 The HAMA prepared in Comparative Example 1 was chemically crosslinked using a crosslinking agent, 4arm-PEGSH, to prepare a HAMA crosslinked gel.
  • each HAMA prepared in Comparative Example 1 was dissolved in 10 mM phosphate buffer (pH 7.4) to the concentrations shown in Table 5 to prepare a HAMA solution.
  • 4arm-PEGSH (NOF Corp., Mw: 10,000) was dissolved in 10 mM phosphate buffer (pH 7.4) to a concentration of 50 mg/mL to prepare a PEGSH solution.
  • both solutions to 5°C they were mixed in a silicon mold 1 mm thick and 6 mm in diameter so that the molar ratio of the methacryl groups modified on the hyaluronic acid to the SH groups derived from the 4arm-PEGSH was 1.1:1.0, producing a HAMA crosslinked gel at 37°C.
  • the final concentration of the hyaluronic acid derivative was set to 7 mg/mL.
  • HAMA with methacrylic groups (HA-C6-Chol-3%-MA, HA-C6-Chol-19%-MA) was still insufficiently gelled 30 minutes after the start of gelling, and gelling was not complete even 24 hours after the start of gelling.
  • Example 3 Fluorescently labeled insulin (FITC-insulin) was encapsulated in the HAMICH crosslinked gel produced in Example 2, and the encapsulation rate was examined.
  • HAMICH crosslinked gels (6 mm diameter, 1 mm thickness) produced under conditions where the final concentration of the hyaluronic acid derivative was 7 mg/mL were immersed in 1 mL of FITC-insulin solution (a solution dissolved in PBS to give 250 ⁇ g/mL FITC-insulin) and incubated at 25°C, and the encapsulation rate (%) of FITC-insulin in the gel was calculated by quantifying the fluorescence intensity of the supernatant over time.
  • the encapsulation rates (%) 1 hour, 8 hours, and 24 hours after the start of incubation are shown in Table 6 and Figure 3.
  • Figure 4 also shows the appearance of each gel after encapsulation.
  • the HAMICH cross-linked gel into which cholesteryl groups had been introduced had a higher encapsulation rate of FITC-insulin than the HAMICH cross-linked gel without cholesteryl groups.
  • the encapsulation rate of FITC-insulin was also affected by the introduction rate of cholesteryl groups, and the best encapsulation rate was achieved after 8 and 24 hours of incubation when the introduction rate of cholesteryl groups was 5 to 10%.
  • Figure 4 clearly shows that the cross-linked gel without chol was weakly colored by FITC, even when observed visually.
  • Examples 2 and 3 show that by using the hyaluronic acid derivative of this embodiment, rapid gelation can be achieved, and furthermore, it is possible to obtain a novel crosslinked gel that can simultaneously suppress volume changes in the body and encapsulate large amounts of protein.
  • the crosslinked gel obtained from the hyaluronic acid derivative of this embodiment is capable of encapsulating large amounts of cytokines necessary for regeneration or cell differentiation, and is expected to be applied to regenerative medicine applications in which the release of these cytokines is used to control cell adhesion and differentiation.
  • Example 4 We prepared crosslinked gels of hyaluronic acid derivatives modified with both maleimide and steryl groups, and examined whether the crosslinked gels became porous even in the swelling equilibrium state after freeze-drying and freeze-thawing.
  • Cy5-HAMICH a fluorescent Cy5-modified hyaluronic acid derivative
  • Cy5 modification was performed by adding 0.02 equivalents of Cy5-amine (Funakoshi Co., Ltd., product number: BP-22559) to the HA-TBA unit and 0.03 equivalents of DMT-MM as a condensation agent.
  • a fluorescent Cy5-modified hyaluronic acid derivative (Cy5-HAMICH) was also produced in the same manner as above, with no cholesteryl group introduced (introduction rate 0%) and with a maleimide group introduction rate of 7%.
  • the freeze-thaw process was carried out as follows. First, the Cy5-modified HA derivative crosslinked gel was left at room temperature (25°C) or 5°C for 30 minutes, then left at -20°C for 1 hour, and then left at -78°C for 24 hours to carry out the freeze-drying process. It was then thawed by incubating it in a water bath at 25°C.
  • Example 5 In the same manner as in Example 2, the HAMICH prepared in Example 1 was chemically crosslinked using a crosslinking agent 4arm-PEGSH to prepare a HAMICH crosslinked gel.
  • each HAMICH produced in Example 1 was dissolved in 10 mM phosphate buffer (pH 7.4) to a concentration of 10 mg/mL to prepare a HAMICH solution. Only HA-C6-Chol-20%-Male 15% was dissolved to a concentration of 25 mg/mL.
  • 4arm-PEGSH (Mw: 10,000) was dissolved in 10 mM phosphate buffer (pH 7.4) to a concentration of 20 mg/mL to prepare a PEGSH solution. After cooling both solutions to 5°C, they were poured into a single vial and mixed, and an inverted vial test was performed to verify the gel or sol.
  • HAMICH into which cholesteryl groups and maleimide groups have been introduced, gelled sufficiently and formed a crosslinked gel within 1 to 30 minutes from the start of gelation (mixing of HAMICH solution and PEGSH solution) in all test plots 5-1 to 5-30, regardless of the introduction rate of cholesteryl groups.
  • Example 6 In the same manner as in Example 5, the HAMICH prepared in Example 1 was chemically crosslinked using a crosslinking agent 4arm-PEGSH to prepare a HAMICH crosslinked gel.
  • HAMICH H-C6-Chol-15%-Male15%) with a cholesteryl group introduction rate of 15% produced in Example 1 was dissolved in 10 mM phosphate buffer (pH 7.4) to a concentration of 10 mg/mL to prepare a HAMICH solution.
  • 4arm-PEGSH Mw: 10,000
  • 10 mM phosphate buffer pH 7.4
  • HAMICH which contains 15% cholesteryl groups and 15% maleimide groups, was fully gelled and a crosslinked gel was formed 30 minutes after the start of gelation (mixing of HAMICH solution and PEGSH solution) in all test plots 6-1 to 6-2.
  • hyaluronic acid derivatives in which steryl groups and maleimide groups are combined and introduced into hyaluronic acid can gel at various concentrations. It was also suggested that the amount of drug encapsulated in the HAMICH crosslinked gel formed can be changed by changing the gel concentration.
  • Example 7 The hyaluronic acid derivative modified with both maleimide and steryl groups was analyzed by gel permeation chromatography using multi-angle light scattering (GPC-MALS) to calculate the absolute molecular weight of the aggregate in 10 mM phosphate buffer (pH 7.4).
  • GPC-MALS multi-angle light scattering
  • MALS detectors measure scattering signals from polymers or particles in a sample at different scattering angles ⁇ .
  • the basic light scattering equation (Anderson et al, Analytical Chemistry, 2003, vol. 75, p. 4279-4291) is shown below, where R ⁇ is the excess Rayleigh ratio, K is an optical constant that depends, among other things, on the specific refractive index increment (dn/dc), c is the solute concentration, M is the molecular weight, Rg is the radius of gyration, and ⁇ is the wavelength of the incident light. Calculation of molecular weight and radius of gyration from light scattering data requires extrapolation to zero angle (Wyatt, Analytica Chimica Acta, 1993, vol. 272(1), p. 1-40).
  • Example 8 An in vitro insulin release test was carried out on the HAMICH crosslinked gel containing fluorescently labeled insulin (FITC-insulin) obtained in Example 3.
  • FITC-insulin-encapsulated HAMICH crosslinked gels obtained in Example 3 were each immersed in 1 mL of 10% FBS-containing PBS (pH 7.4) at 37°C and incubated, and the fluorescence intensity of the supernatant was quantified over time to calculate the release rate (%) of FITC-insulin released from each gel.
  • Figure 6 shows the release rates (%) from the start of immersion to 21 days for the HAMICH crosslinked gels modified with cholesteryl groups (HA-C6-Chol-1%-Male 15%, HA-C6-Chol-5%-Male 15%, HA-C6-Chol-10%-Male 15%, and HA-C6-Chol-20%-Male 15%).
  • the crosslinked gel obtained from the hyaluronic acid derivative of this embodiment gels quickly and undergoes limited volume changes in the body. In addition, it can encapsulate large amounts of active ingredients such as proteins and has excellent long-term sustained release properties for the encapsulated substances. In view of these, the hyaluronic acid derivative of this embodiment and the crosslinked gel obtained from it are expected to be applied to regenerative medicine.
  • the crosslinked gel obtained from the hyaluronic acid derivative of this embodiment can encapsulate large amounts of cytokines necessary for regeneration or cell differentiation, and by subsequently releasing these, it is possible to control cell adhesion and differentiation.
  • Example 9 The target product (HA-C6-Chol-1%-Male 8.1%) of Test Plot 9-1 shown in Table 10 was obtained as a white solid in the same manner as in Example 1, except that hyaluronic acid sodium salt (HA-Na) with a weight average molecular weight of 35 kDa (purchased from Bloomage Biotechnology Japan) was used as the starting material hyaluronic acid sodium salt (HA-Na).
  • HA-Na hyaluronic acid sodium salt
  • HA-Na hyaluronic acid sodium salt
  • the structure of the obtained synthetic product was confirmed by 1 H NMR measurement.
  • the HA derivative of Test Plot 9-1 had a Chol introduction rate of 1.3% and a maleimide group introduction rate of 8.1%.
  • hyaluronic acid sodium salt (HA-Na) with a weight average molecular weight of 35 kDa was used as a raw material, and after introducing cholesteryl and methacryl groups in the same manner as in Comparative Example 1 with the composition shown in Table 10, the maleimide group was modified in the same manner as in Example 1 to obtain the target substance (HA-C6-Chol-17%-Male 4.6%) of Test Area 9-2 described in Table 10 as a white solid.
  • the structure of the obtained synthetic product was confirmed by 1 H NMR measurement.
  • the HA derivative of Test Area 9-2 had a Chol introduction rate of 17.4%, a maleimide group introduction rate of 4.6%, and a methacryl group introduction rate of 9.7%.
  • Example 10 The HAMICH prepared in Example 9 was chemically cross-linked using a cross-linking agent, 4arm-PEGSH, to prepare a HAMICH cross-linked gel.
  • a cross-linking agent 4arm-PEGSH
  • HAMICH from test area 9-1 was dissolved in 10 mM phosphate buffer (pH 7.4) to a concentration of 14 mg/mL to prepare a HAMICH solution.
  • 4arm-PEGSH (Mw: 10,000) was dissolved in 10 mM phosphate buffer (pH 7.4) to a concentration of 7 mg/mL to prepare a PEGSH solution.
  • PEGSH solution After cooling both solutions to 5°C, they were mixed in a silicon mold 1 mm thick and 6 mm in diameter so that the molar ratio of the maleimide groups modified with hyaluronic acid and the SH groups derived from 4arm-PEGSH was 1.1:1.0, producing a HAMICH crosslinked gel at 37°C. This was carried out under conditions such that the final concentration of the hyaluronic acid derivative was 7 mg/mL.
  • HAMICH from test area 9-2 was dissolved in 10 mM phosphate buffer (pH 7.4) to a concentration of 30 mg/mL to prepare a HAMICH solution.
  • 4arm-PEGSH (Mw: 10,000) was dissolved in 10 mM phosphate buffer (pH 7.4) to a concentration of 13 mg/mL to prepare a PEGSH solution.
  • PEGSH solution After cooling both solutions to 5°C, they were mixed in a silicon mold 1 mm thick and 6 mm in diameter so that the molar ratio of the maleimide groups modified with hyaluronic acid and the SH groups derived from 4arm-PEGSH was 1.1:1.0 to produce a HAMICH crosslinked gel at 37°C. This was carried out under conditions such that the final concentration of the hyaluronic acid derivative was 20 mg/mL.
  • HAMICH into which cholesteryl and maleimide groups have been introduced, gelled sufficiently and formed a cross-linked gel within 1 to 30 minutes from the start of gelation (mixing of HAMICH solution and PEGSH solution), regardless of the introduction rate of the maleimide groups. It was predicted that as the introduction rate of the maleimide groups decreased, the number of cross-linking points would decrease and gelation would become more difficult, but these results show that by introducing steryl and maleimide groups in combination into hyaluronic acid, it became possible to achieve rapid gelation that was difficult with hyaluronic acid derivatives into which steryl and methacryl groups had been introduced, regardless of the range of the introduction rate of the maleimide groups.
  • HAMICH modified with both maleimide groups and steryl groups showed a small degree of swelling, regardless of the introduction rate of maleimide groups, and exhibited the characteristic property of suppressing volume increase in the body after gelation.
  • HA derivative of Comparative Test 4-1 (HA-C6-Chol-19%) and the HA derivative of Comparative Test 4-2 were each chemically crosslinked using the crosslinker 4arm-PEGSH to prepare a HA derivative (unmodified maleimide) crosslinked gel.
  • each HA derivative (maleimide unmodified) produced in Comparative Tests 4-1 and 4-2 was dissolved in 10 mM phosphate buffer (pH 7.4) at a concentration of 14 mg/mL to prepare an HA derivative solution.
  • 4arm-PEGSH (Mw: 10,000) was dissolved in 10 mM phosphate buffer (pH 7.4) at a concentration of 7 mg/mL to prepare a PEGSH solution.
  • the hyaluronic acid derivative of this embodiment can provide a hyaluronic acid derivative that undergoes little volume change after gelation and is capable of sustained release of active ingredients.

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Abstract

本発明は、ゲル化後の生体内での膨潤抑制に優れるヒアルロン酸誘導体及びヒアルロン酸誘導体架橋ゲル、並びに、これらを用いた医薬組成物を提供する。本発明は、ヒアルロン酸のグルクロン酸部分中のカルボキシル基の少なくとも一部にステリル基が導入されており、かつ、前記ヒアルロン酸のグルクロン酸部分中のカルボキシル基又はＮ－アセチルグルコサミン部分中の水酸基の少なくとも一部にマレイミド基が導入されている、ヒアルロン酸誘導体、及び、前記ヒアルロン酸誘導体が、２以上の架橋性基を有する架橋剤により化学架橋されたゲル状物である、ヒアルロン酸誘導体架橋ゲルに係る。

Description

ヒアルロン酸誘導体、ヒアルロン酸誘導体架橋ゲル、及び医薬組成物
　本発明は、ヒアルロン酸誘導体、当該ヒアルロン酸誘導体を架橋して得られたヒアルロン酸誘導体架橋ゲル、及びこれらを含む医薬組成物に関する。
　本願は、２０２３年９月２７日に日本に出願された特願２０２３－１６６３４６号、及び、２０２３年１２月４日に日本に出願された特願２０２３－２０４７９６号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　近年、タンパク質やペプチド、核酸を活性成分とする医薬品であるバイオ医薬品が実用化されており、その数は年々増え続けている。バイオ医薬品は、従来の低分子医薬では満たすことができなかった未充足医療ニーズを満たすことができる。しかしながら、消化管乃至粘膜等からは吸収されにくい上、体内では不安定で血中半減期が短いという課題がある。そのため、バイオ医薬品は注射による頻回投与が必要であり、患者と医療関係者いずれにとっても負担が大きい。そこで、薬理活性を損なうことなくバイオ医薬品をカプセル化して生体内で徐々に有効成分を放出することができる薬物基材（徐放性ドラッグデリバリーシステム基材）が求められている。
　このような背景から、特許文献１及び特許文献２では、安全性に優れたヒアルロン酸誘導体からなる徐放性ドラッグデリバリーシステム基材が提案されている。このヒアルロン酸誘導体は、水溶液中で自発的に会合し、薬物、特にバイオ医薬品を、その生物活性を維持したまま効率よく封入することができ、生理食塩濃度下で凝集し（或いは、生理食塩濃度下でも分散し）、なおかつ血中滞留性が良好である。このヒアルロン酸誘導体は、特にバイオ医薬品を有効成分として使用する場合に、薬理活性を維持したまま多くの薬物を効率よく封入できる担体、及び血中滞留性に優れた血中徐放キャリア並びにターゲティングキャリアとして用いることができ、薬物を持続的に徐放できる局所（例えば、皮下等）徐放キャリアにもなり得るとされている。
　また、ヒアルロン酸は、関節の重要な成分であり、関節疾患の治療としてヒアルロン酸を関節腔内に注入される治療方法がある。当該治療用途には、注入が容易であるが、関節腔内ではより長期間滞留することが望まれている。そこで、特許文献３では、注入の容易性と長期滞留性の両方を達成するために、各種のブロックポリマーで修飾したヒアルロン酸誘導体が提案されている。
国際公開第２０１０／０５３１４０号 国際公開第２００４／０４６２００号 国際公開第２００３／０８７０１９号
　関節疾患への治療に用いられる場合、注入されたヒアルロン酸やその誘導体は、関節腔内でゲル化され得るが、ゲル化の前後で体積が大きく変動しないことが好ましい。また、徐放性ドラッグデリバリーシステム基材に使用する場合も、製品設計の点から、ヒアルロン酸架橋ゲルの膨潤はできるだけ小さいことが好ましい。さらに、多量の成長因子やタンパクの封入を可能にする架橋ハイドロゲルが好ましい。しかしながら、ヒアルロン酸は、タンパク質は封入できないことに加えて、多糖類であり、親水性が高いため、膨潤度が高い。また、特許文献１～３に記載のヒアルロン酸誘導体も、ゲル化による膨潤抑制は不十分であった。
　本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、ゲル化後の膨潤抑制に優れるヒアルロン酸誘導体及びヒアルロン酸誘導体架橋ゲル、並びに、これらを用いた医薬組成物を提供する。
　すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
［１］　ヒアルロン酸のグルクロン酸部分中のカルボキシル基の少なくとも一部にステリル基が導入されており、かつ、前記ヒアルロン酸のグルクロン酸部分中のカルボキシル基又はＮ－アセチルグルコサミン部分中の水酸基の少なくとも一部にマレイミド基が導入されている、ヒアルロン酸誘導体。
［２］　前記ヒアルロン酸のグルクロン酸部分中のカルボキシル基の少なくとも一部にマレイミド基が導入されている、前記［１］のヒアルロン酸誘導体。
［３］　前記ヒアルロン酸誘導体に対する前記ステリル基の導入率と前記マレイミド基の導入率の合計が、４５％未満である、前記［１］又は［２］のヒアルロン酸誘導体。
［４］　前記ヒアルロン酸誘導体に対する前記ステリル基の導入率が、０．５％以上３０％以下である、前記［１］～［３］のいずれかのヒアルロン酸誘導体。
［５］　前記ヒアルロン酸誘導体に対する前記マレイミド基の導入率が、１．０％以上２５％以下である、前記［１］～［４］のいずれかのヒアルロン酸誘導体。
［６］　下記一般式（Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
［一般式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミル及びＣ１－６アルキルカルボニルからなる群より選択される基であり；
　Ｚは、直接結合、又は２個以上３０個以下の任意のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを表し；
　Ｘ１は、－ＮＲｂ－Ｒ、－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ、－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｒ、－ＮＲｂ－ＣＯ－ＮＲｃ－Ｒ、－ＣＯＯ－Ｒ、－Ｏ－ＣＯＯ－Ｒ、－Ｓ－Ｒ、－ＣＯ－Ｙａ－Ｓ－Ｒ、－Ｏ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、及び－Ｓ－Ｓ－Ｒで表される基からなる群より選択される基であり；
　Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキル及びヒドロキシＣ２－２０アルキルからなる群より選択される基であり、前記Ｒａ、前記Ｒｂ及び前記Ｒｃのアルキル部分は、－Ｏ－及び－ＮＲｆ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
　前記Ｒｆは、水素原子、Ｃ１－１２アルキル、アミノＣ２－１２アルキル及びヒドロキシＣ２－１２アルキルからなる群より選択される基であり、前記Ｒｆのアルキル部分は、－Ｏ－及び－ＮＨ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
　Ｒは、ステリル基であり；
　Ｙは、Ｃ２－３０アルキレン、又は－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－であり、前記Ｙのアルキレン部分は、－Ｏ－、－ＮＲｇ－及び－Ｓ－Ｓ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
　Ｒｇは、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキル及びヒドロキシＣ２－２０アルキルからなる群より選択される基であり、前記Ｒｇのアルキル部分は、－Ｏ－及び－ＮＨ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
　Ｙａは、Ｃ１－５アルキレンであり；
　Ｙｂは、Ｃ２－８アルキレン又はＣ２－８アルケニレンであり；
　ｍは、１以上１００以下の整数である。］
で表される繰り返し単位を１以上有しており、下記一般式（ＩＩ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
［一般式（ＩＩ）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミル及びＣ１－６アルキルカルボニルからなる群より選択される基であり；
　Ｚは、直接結合、又は２個以上３０個以下の任意のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを表し；
　Ｘ２は、マレイミド基であり；
　Ｒａは、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキル及びヒドロキシＣ２－２０アルキルからなる群より選択される基であり、前記Ｒａのアルキル部分は、－Ｏ－及び－ＮＲｆ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
　Ｙは、Ｃ２－３０アルキレン、又は－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－であり、前記Ｙのアルキレン部分は、－Ｏ－、－ＮＲｇ－及び－Ｓ－Ｓ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
　Ｒｇは、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキル及びヒドロキシＣ２－２０アルキルからなる群より選択される基であり、前記Ｒｇのアルキル部分は、－Ｏ－及び－ＮＨ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
　ｍは、１以上１００以下の整数である。］
で表される繰り返し単位を１以上有している、前記［１］～［５］のいずれかのヒアルロン酸誘導体。
［７］　前記ステリル基はコレステリル基である、前記［１］～［６］のいずれかのヒアルロン酸誘導体。
［８］　濃度が１ｍｇ／ｍＬでリン酸緩衝液（１０ｍＭ）に溶解されたヒアルロン酸誘導体の動的光散乱法で算出される平均粒子径が、２５０ｎｍ以下である、前記［１］～［７］のいずれかのヒアルロン酸誘導体。
［９］　前記［１］～［８］のいずれかのヒアルロン酸誘導体を、２以上の架橋性基を有する架橋剤と反応させてゲル化させる、ヒアルロン酸誘導体架橋ゲルの製造方法。
［１０］　前記架橋性基が、チオール基である、前記［９］のヒアルロン酸誘導体架橋ゲルの製造方法。
［１１］　前記［１］～［８］のいずれかのヒアルロン酸誘導体が、２以上の架橋性基を有する架橋剤により化学架橋されたゲル状物である、ヒアルロン酸誘導体架橋ゲル。
［１２］　前記架橋性基が、チオール基である、前記［１１］のヒアルロン酸誘導体架橋ゲル。
［１３］　膨潤度が１１５％以下である、前記［１１］又は［１２］のヒアルロン酸誘導体架橋ゲル。
［１４］　前記［１］～［８］のいずれかのヒアルロン酸誘導体を、２以上の架橋性基を有する架橋剤により化学架橋されたゲル状物の乾燥物である、ヒアルロン酸誘導体架橋ゲル乾燥物。
［１５］　多孔質構造体である、前記［１４］のヒアルロン酸誘導体架橋ゲル乾燥物。
［１６］　前記［１］～［８］のいずれかのヒアルロン酸誘導体を含む、医薬組成物。
［１７］　前記［１］～［８］のいずれかのヒアルロン酸誘導体が、２以上の架橋性基を有する架橋剤により化学架橋されたゲル状物である、ヒアルロン酸誘導体架橋ゲルを含む、医薬組成物。
［１８］　さらに、有効成分を含む、前記［１７］の医薬組成物。
　上記態様のヒアルロン酸誘導体によれば、ゲル化後の膨潤抑制に優れるヒアルロン酸誘導体及びヒアルロン酸誘導体架橋ゲル、並びに、これらを用いた医薬組成物を提供することができる。
実施例２で合成されたヒアルロン酸誘導体架橋ゲル（ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－０％－Ｍａｌｅ）のＮＭＲチャートである。 実施例２で合成されたヒアルロン酸誘導体架橋ゲル（ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－１％－Ｍａｌｅ）のＮＭＲチャートである。 実施例２で合成されたヒアルロン酸誘導体架橋ゲル（ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－５％－Ｍａｌｅ）のＮＭＲチャートである。 実施例２で合成されたヒアルロン酸誘導体架橋ゲル（ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－１０％－Ｍａｌｅ）のＮＭＲチャートである。 実施例２で合成されたヒアルロン酸誘導体架橋ゲル（ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－１５％－Ｍａｌｅ）のＮＭＲチャートである。 実施例２で合成されたヒアルロン酸誘導体架橋ゲル（ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－２０％－Ｍａｌｅ）のＮＭＲチャートである。 実施例２で合成されたヒアルロン酸誘導体架橋ゲル（ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－３０％－Ｍａｌｅ）のＮＭＲチャートである。 実施例２で合成されたヒアルロン酸誘導体架橋ゲル（ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－４０％－Ｍａｌｅ）のＮＭＲチャートである。 実施例２において、コレステリル基の導入率が異なるＨＡＭＩＣＨ架橋ゲルについて、ゲル化開始からの膨潤度（％）の経時的変化を示した図である。図２（Ａ）はヒアルロン酸濃度が７．０ｍｇ／ｍＬで製造したＨＡＭＩＣＨ架橋ゲルの結果であり、図２（Ｂ）はヒアルロン酸濃度が１６．７ｍｇ／ｍＬで製造したＨＡＭＩＣＨ架橋ゲルの結果である。 実施例３において、ＦＩＴＣ－ｉｎｓｕｌｉｎを封入したＨＡＭＩＣＨ架橋ゲルのＦＩＴＣ－ｉｎｓｕｌｉｎの封入率（％）を測定した結果を示した図である。 実施例３において、ＦＩＴＣ－ｉｎｓｕｌｉｎを封入したＨＡＭＩＣＨ架橋ゲルの外観の可視光写真である。 実施例４において、コレステリル基導入率１９％のＣｙ５－ＨＡＭＩＣＨ架橋ゲル（図５の上段）と、コレステリル基導入率０％のＣｙ５－ＨＡＭＩＣＨ架橋ゲル（図５の下段）の、凍結乾燥処理後及び凍結融解処理後の蛍光顕微鏡画像である。 実施例８において、ＦＩＴＣ－ｉｎｓｕｌｉｎを封入したＨＡＭＩＣＨ架橋ゲルからのＦＩＴＣ－ｉｎｓｕｌｉｎの放出率（％）を測定した結果を示した図である。 実施例１０において、ＨＡＭＩＣＨ架橋ゲルのゲル化開始からの膨潤度（％）の経時的変化を示した図である。図７（Ａ）は試験区９－１のＨＡＭＩＣＨ（ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－１％－Ｍａｌｅ８．１％）の架橋ゲルの結果であり、図７（Ｂ）は試験区９－１のＨＡＭＩＣＨ（ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－１７％－Ｍａｌｅ４．６％）の架橋ゲルの結果である。
　以下、本発明の実施形態（以下、「本実施形態」という。）について詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で様々な変形が可能である。
　以下、本明細書において使用される用語を説明する。
　本明細書において使用される「Ｃ１－２０アルキル」という用語は、炭素数１以上２０以下の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基を意味し、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉｓｏ－プロピル、ｎ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｉｓｏ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル等の「Ｃ１－４アルキル」が含まれ、さらに、ｎ－ペンチル、３－メチルブチル、２－メチルブチル、１－メチルブチル、１－エチルプロピル、ｎ－ヘキシル、４－メチルペンチル、３－メチルペンチル、２－メチルペンチル、１－メチルペンチル、３－エチルブチル、２－エチルブチル等が含まれる。Ｃ１－２０アルキルには、炭素数が１以上１２以下のＣ１－１２アルキル、炭素数が１以上６以下のＣ１－６アルキル基も含まれる。
　本明細書において使用される「Ｃ１－６アルキルカルボニル」という用語は、アルキル部分が既に言及したＣ１－６アルキルであるアルキルカルボニル基を意味し、例えば、アセチル、プロピオニル、ｎ－プロピルカルボニル、ｉｓｏ－プロピルカルボニル、ｎ－ブチルカルボニル、ｓｅｃ－ブチルカルボニル、ｉｓｏ－ブチルカルボニル、ｔｅｒｔ－ブチルカルボニル等の「Ｃ１－４アルキルカルボニル」が含まれる。
　本明細書において使用される「アミノＣ２－２０アルキル」という用語は、置換基としてアミノ基を有する炭素数２以上２０以下の直鎖状又は分岐鎖状のアルキルを意味し、例えば、アミノ基はアルキル基の末端の炭素原子上に位置していてもよい。アミノＣ２－２０アルキルには、炭素数が２以上１２以下のアミノＣ２－１２アルキルも含まれる。
　本明細書において使用される「ヒドロキシＣ２－２０アルキル」という用語は、置換基としてヒドロキシ基を有する炭素数２以上２０以下の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基を意味し、例えば、ヒドロキシ基はアルキル基の末端の炭素原子上に位置していてもよい。ヒドロキシＣ２－２０アルキルには、炭素数が２以上１２以下のヒドロキシＣ２－１２アルキルも含まれる。
　本明細書において使用される「Ｃ２－３０アルキレン」という用語は、炭素数２以上３０以下の直鎖状又は分岐鎖状の２価の飽和炭化水素基を意味し、例えば、エチレン、プロピレン等を含み、炭素数が２以上２０以下のＣ２－２０アルキレン、炭素数が２以上８以下のＣ２－８アルキレン、基「－（ＣＨ２）ｎ－」（ここで、ｎは２以上３０以下であり、２以上２０以下が好ましく、２以上１５以下がより好ましい。）を含む。
　本明細書において使用される「Ｃ１－５アルキレン」という用語は、炭素数１以上５以下の直鎖状又は分岐鎖状の２価の飽和炭化水素基を意味し、例えば、メチレン、エチレン、プロピレン等を含む。
　本明細書で言及する用語「Ｃ２－８アルケニレン」とは、炭素数２以上８以下の直鎖状又は分岐鎖状の、１以上の二重結合を含む、２価の飽和炭化水素基を意味し、例えば、－ＣＨ＝ＣＨ－、－Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ－、２－ブテン－１，４－ジイル、ヘプタ－２，４－ジエン－１，６－ジイル、オクタ－２，４，６－トリエン－１，８－ジイル等を含む。幾何異性が存在する場合は、それぞれの異性体及びそれらの混合物も含まれる。
　本願明細書において、「膨潤度」とは、架橋したヒアルロン酸誘導体を架橋したヒアルロン酸誘導体架橋ゲルが、生理塩濃度下又はＰＢＳ（－）中（生体内）で、浸透圧と弾性圧の関係から、増大した体積の程度を意味する。具体的には、下記式で算出される。膨潤度がマイナス値のヒアルロン酸誘導体架橋ゲルは、ゲル化前の体積（ゲル化直後の体積に相当）よりも、ＰＢＳ（－）中で平衡状態に達した時点の体積が減少する（収縮する）ゲルである。膨潤度がプラス値のヒアルロン酸誘導体架橋ゲルは、ゲル化直後よりも、ＰＢＳ（－）中で平衡状態に達した時点の体積が増大する（膨潤する）ゲルである。ヒアルロン酸誘導体架橋化ゲルにおいては、膨潤度の絶対値が小さいほど、架橋ゲルの体積変化が小さく、好ましい。
［膨潤度（％）］＝（［ゲル化後のＰＢＳ（－）下に浸漬され平衡状態に達したヒアルロン酸含有組成物の体積（ｍｍ３）］／［ゲル化前のヒアルロン酸含有組成物の体積（ｍｍ３）］）×１００（％）
≪ヒアルロン酸誘導体≫
　本実施形態のヒアルロン酸誘導体は、ヒアルロン酸のグルクロン酸部分中のカルボキシル基の少なくとも一部にステリル基が導入されており、かつ、前記ヒアルロン酸のグルクロン酸部分中のカルボキシル基又はＮ－アセチルグルコサミン部分中の水酸基の少なくとも一部にマレイミド基が導入されている。
　本実施形態のヒアルロン酸誘導体が、ゲル化後の膨潤が抑制されている理由は明らかではないが、以下のように推察される。ヒアルロン酸の親水性基であるカルボキシル基や水酸基に、疎水性基であるステリル基とマレイミド基を組み合わせて導入することにより、分子全体の親水性が低下するため、膨潤が抑制されると推察される。また、ヒアルロン酸に導入される疎水性基として、特にステリル基とマレイミド基の組み合わせを用いることにより、１秒間～３０分間という比較的短い時間でゲル化が進行することも、膨潤抑制に寄与していると推察される。特に、ステリル基が修飾されていないマレイミド基のみが修飾されたヒアルロン酸誘導体では膨潤抑制が乏しいことから、ステリル基の疎水性相互作用が強固に働くことで生じる弾性圧による膨潤抑制効果の寄与も考えられる。芳香環のようなπ－πスタッキングによる強固な相互作用を有する官能基で修飾されたヒアルロン酸誘導体も、本実施形態のヒアルロン酸誘導体と同様に、ゲル化後の膨潤抑制に優れている可能性がある。
　本実施形態のヒアルロン酸誘導体の膨潤度は、１１５％以下が好ましく、１１０％以下がより好ましく、１０５％以下がさらに好ましい。本実施形態のヒアルロン酸誘導体の膨潤度は、８５％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上がさらに好ましい。本実施形態のヒアルロン酸誘導体の膨潤度は、８５％以上１１５％以下が特に好ましい。
［ステリル基］
　本明細書において使用される「ステリル基」という用語は、ステロイド骨格を有する基であれば特に制限されない。ここでステロイドとしては、具体的には、コレステロール、コレスタノール、カンペスタノール、エルゴスタノール、スチグマスタノール、コプロスタノール、スチグマステロール、シトステロール、ラノステロール、エルゴステロール、シミアレノール、胆汁酸、テストステロン、エストラジオール、プロゲストロン、コルチゾール、コルチゾン、アルドステロン、コルチコステロン、デオキシコルチステロン等が挙げられる。ステリル基としては、コレステリル基、スチグマステリル基、ラノステリル基、エルゴステリル基等が挙げられ、中でも、コレステリル基（特に、コレスタ－５－エン－３β－イル基）が好ましい。
　ヒアルロン酸誘導体において、ステリル基は、ヒアルロン酸に対して直接的に結合していてもよく、リンカーを介して結合されていてもよい。一分子のヒアルロン酸誘導体に含まれる、ステリル基と連結させるリンカーは、全て同じリンカーであってもよく、長さや種類の異なるリンカーであってもよい。
　ここでいう「リンカー」は、カルボキシ基と反応する基と、ステリル基と反応する基とが、鎖状基（スペーサー）で連結された基である。カルボキシ基と反応する基やステリル基と反応する基としては、アミノ基や水酸基等が挙げられる。当該鎖状基としては、例えば、鎖状の炭化水素基、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖、遺伝子工学により導入し得る任意のペプチドリンカー、又は合成化合物リンカーを用いることができる。リンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することが可能である。鎖状の炭化水素基としては、Ｃ１－３０アルキレンが好ましく、Ｃ１－１０アルキレンがより好ましく、Ｃ１－６アルキレンがさらに好ましい。ＰＥＧ基としては、エチレングリコール基の連結個数が、１個以上１５個以下である基が好ましく、１個以上１０個以下である基がより好ましく、１個以上５個以下である基がさらに好ましい。ペプチドリンカーとしては、２アミノ酸以上（上限は特に限定されないが、通常、３０アミノ酸以下、好ましくは２０アミノ酸以下）であり、特に好ましくは１５アミノ酸である。本実施形態のヒアルロン酸誘導体としては、グルクロン酸部分中のカルボキシル基の少なくとも一部がステリル基と、鎖状の炭化水素基を有するリンカーで連結されていることが好ましい。
［ステリル基導入率］
　本実施形態のヒアルロン酸誘導体におけるステリル基の導入率（以下、単に「ステリル基導入率」と称する場合がある）は、０．５％以上が好ましく、１．０％以上がより好ましく、５．０％以上がより好ましく、１０％以上がよりさらに好ましい。本実施形態のヒアルロン酸誘導体におけるステリル基導入率は、３０％以下が好ましく、２５％以下がより好ましく、２０％以下がさらに好ましく、１５％以下がよりさらに好ましい。ステリル基導入率が上記範囲内であることにより、膨潤度を十分に小さくすることができ、また、架橋ゲルを形成した際に、十分な薬物量を内包させることができる。
　ステリル基導入率は、１Ｈ－ＮＭＲ測定により測定することができる。すなわち、１Ｈ－ＮＭＲスペクトルにおけるヒアルロン酸誘導体のステリル基に由来するピークの積分値と、ヒアルロン酸誘導体に含まれるＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンのアセチル基に由来するピーク（ＣＯＣＨ３、１．６ｐｐｍ以上２．０ｐｐｍ以下、３Ｈ）の積分値と、を用いて、以下の式に基づいて計算することができる。なお、式中、ｎＨは、ピークに対応する水素原子の数を表す。具体的には、例えば後述する実施例に記載した方法に従って測定することができる。
　［ステリル基導入率］（％）
＝（［ステリル基に由来するピーク積分値］×３／ｎＨ）／［Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンのアセチル基に由来するピーク積分値］×１００
［マレイミド基］
　ヒアルロン酸誘導体において、マレイミド基（Ｎ－マレイミド基）は、ヒアルロン酸に対して直接的に結合していてもよく、リンカーを解して結合されていてもよい。一分子のヒアルロン酸誘導体に含まれる、マレイミド基と連結させるリンカーは、全て同じリンカーであってもよく、長さや種類の異なるリンカーであってもよい。
　ここでいう「リンカー」は、カルボキシ基と反応する基と、マレイミド基中のＮＨ基と反応する基とが、鎖状基で連結された基である。カルボキシ基と反応する基としては、アミノ基や水酸基等が挙げられ、マレイミド基のＮＨ基と反応する基としては、カルボキシ基や水酸基等が挙げられる。当該鎖状基としては、前記のヒアルロン酸誘導体とステリル基とを連結させるリンカー中の鎖状基と同様の基が挙げられる。本実施形態のヒアルロン酸誘導体としては、グルクロン酸部分中のカルボキシル基及びＮ－アセチルグルコサミン部分中の水酸基の少なくとも一部がマレイミド基のＮＨ基と、鎖状の炭化水素基を有するリンカーで連結されていることが好ましい。
［マレイミド基導入率］
　本実施形態のヒアルロン酸誘導体におけるマレイミド基の導入率（以下、単に「マレイミド基導入率」と称する場合がある）は、１．０％以上が好ましく、３．０％以上がより好ましく、４．５％以上がさらに好ましく、５．０％以上がよりさらに好ましく、８．０％以上がよりさらに好ましく、１０％以上が特に好ましい。本実施形態のヒアルロン酸誘導体におけるマレイミド基導入率は、２５％以下が好ましく、２０％以下がより好ましい。本実施形態のヒアルロン酸誘導体におけるマレイミド基導入率はなかでも、ステリル基導入率が上記範囲内であることにより、膨潤度を十分に小さくすることができる。
　マレイミド基導入率は、１Ｈ－ＮＭＲ測定により測定することができる。１Ｈ－ＮＭＲスペクトルは、本実施形態のヒアルロン酸誘導体を、重溶媒０．０２Ｎ　ＤＣｌ　ＤＭＳＯ－ｄ６／Ｄ２Ｏ混液（２Ｎ　ＤＣｌ　Ｄ２Ｏ：ＤＭＳＯ－ｄ６＝１：９９）に溶解させた溶液を測定して得られる。１Ｈ－ＮＭＲスペクトルにおけるヒアルロン酸誘導体のグルコサミン部分のアセチル基由来のピーク（ＣＯＣＨ３、１．６～２．０ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値と、コレステリル基中のメチル基由来のピーク（ＣＨ３、０．７ｐｐｍ；３Ｈ）の積分値、及びマレイミド基に由来するピーク（－ＣＨ＝ＣＨ－、６．９ｐｐｍ；２Ｈ）の積分値とにより、下記に示す式からヒアルロン酸ユニットに対するコレステリル基とマレイミド基の導入率を算出する。なお、グルコサミン部分のアセチル基由来のピークが含まれる１．６～２．０ｐｐｍ付近のピークにはコレステリル基由来のピーク（５Ｈ）が重なっているため、１．６～２．０ｐｐｍ付近のピークの積分値からコレステリル基メチル由来のピーク（０．７ｐｐｍ）の積分値を５／３倍にした値を差し引いて算出した値（すなわち、〔［ピーク積分値（１．６～２．０ｐｐｍ）］－［ピーク積分値（０．７ｐｐｍ）］×５／３〕をヒアルロン酸由来のアセチル基の積分値（修正後の値）として、導入率の計算に使用する。まず、次の式により、コレステリル基導入率（％）を算出する。
［コレステリル基導入率（％）］
＝［コレステリル基に由来するピーク積分値（０．７ｐｐｍ）］／［Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン部分のアセチル基に由来するピーク積分値（１．６～２．０ｐｐｍ、修正後の値）］×１００（％）
　さらに、マレイミド基導入率（％）を、マレイミド基に由来するピークの積分値と、コレステリル基に由来するピーク（ＣＯＣＨ３、１．６ｐｐｍ以上２．０ｐｐｍ以下、３Ｈ）の積分値と、を用いて、以下の式に基づいて算出することができる。具体的には、後述する実施例に記載した方法に従って測定することができる。
［マレイミド基導入率（％）］
＝（［マレイミド基に由来するピーク積分値］×３）／（［コレステリル基に由来するピーク積分値］×２）×［コレステリル基導入率（％）］
　本実施形態のヒアルロン酸誘導体におけるステリル基導入率とマレイミド基導入率の合計は、５５％以下が好ましく、４５％以下がより好ましく、４５％未満がさらに好ましく、４０％以下がよりさらに好ましく、３５％以下が特に好ましい。本実施形態のヒアルロン酸誘導体におけるステリル基導入率とマレイミド基導入率の合計は、１．０％以上が好ましく、２．５％以上がより好ましく、５．０％以上がさらに好ましい。ヒアルロン酸誘導体におけるステリル基導入率とマレイミド基導入率の合計単位数が前記範囲内であることで、ゲル化後の生理塩濃度下（生体内）における体積変化をより小さくすることができ、また、ＤＤＳキャリアとして用いた場合、架橋密度を高めることができるため、薬物の徐放期間を延長することができる。
　好ましいヒアルロン酸誘導体として具体的には、例えば、下記一般式（Ｉ）で表される繰り返し単位（以下、「繰り返し単位（Ｉ）」と称する場合がある）を１以上有しており、かつ下記一般式（ＩＩ）で表される繰り返し単位（以下、「繰り返し単位（ＩＩ）」と称する場合がある）を１以上有するヒアルロン酸誘導体等が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
（一般式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミル及びＣ１－６アルキルカルボニルからなる群より選択され；
　Ｚは、直接結合、又は２個以上３０個以下の任意のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを表し；
　Ｘ１は、以下の式：
　－ＮＲｂ－Ｒ、
　－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ、
　－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｒ、
　－ＮＲｂ－ＣＯ－ＮＲｃ－Ｒ、
　－ＣＯＯ－Ｒ、
　－Ｏ－ＣＯＯ－Ｒ、
　－Ｓ－Ｒ、
　－ＣＯ－Ｙａ－Ｓ－Ｒ、
　－Ｏ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、
　－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、及び
　－Ｓ－Ｓ－Ｒ、
で表される基からなる群より選択される基であり；
　Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキル及びヒドロキシＣ２－２０アルキルからなる群より選択され、ここで当該基のアルキル部分は、－Ｏ－及び－ＮＲｆ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
　Ｒｆは、水素原子、Ｃ１－１２アルキル、アミノＣ２－１２アルキル及びヒドロキシＣ２－１２アルキルからなる群より選択され、当該基のアルキル部分は－Ｏ－及び－ＮＨ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
　Ｒは、ステリル基であり；
　Ｙは、Ｃ２－３０アルキレン、又は－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ここで、当該アルキレンは、－Ｏ－、－ＮＲｇ－及び－Ｓ－Ｓ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
　Ｒｇは、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキル及びヒドロキシＣ２－２０アルキルからなる群より選択され、当該基のアルキル部分は－Ｏ－及び－ＮＨ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
　Ｙａは、Ｃ１－５アルキレンであり；
　Ｙｂは、Ｃ２－８アルキレン又はＣ２－８アルケニレンであり；
　ｍは、１以上１００以下の整数である。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
（一般式（ＩＩ）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミル及びＣ１－６アルキルカルボニルからなる群より選択され；
　Ｚは、直接結合、又は２個以上３０個以下の任意のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを表し；
　Ｒａは、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキル及びヒドロキシＣ２－２０アルキルからなる群より選択され、ここで当該基のアルキル部分は、－Ｏ－及び－ＮＲｆ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
　Ｒｆは、水素原子、Ｃ１－１２アルキル、アミノＣ２－１２アルキル及びヒドロキシＣ２－１２アルキルからなる群より選択され、当該基のアルキル部分は－Ｏ－及び－ＮＨ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
　Ｘ２は、マレイミド基であり；
　Ｙは、Ｃ２－３０アルキレン、又は－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－であり、ここで、当該アルキレンは、－Ｏ－、－ＮＲｇ－及び－Ｓ－Ｓ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
　Ｒｇは、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキル及びヒドロキシＣ２－２０アルキルからなる群より選択され、当該基のアルキル部分は－Ｏ－及び－ＮＨ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
　ｍは、１以上１００以下の整数である。）
［繰り返し単位（Ｉ）］
　一般式（Ｉ）中の基「－Ｚ－Ｎ（Ｒａ）Ｙ－Ｘ１」は、以下の式：
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－ＮＨ－Ｒ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－ＮＨ－ＣＯＯ－Ｒ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯＯ－Ｒ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－ＣＯＯ－Ｒ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－ＣＯＯ－Ｒ、
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－Ｏ－ＣＯＯ－Ｒ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＯＯ－Ｒ、
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－Ｓ－Ｒ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｓ－Ｒ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ（Ｒ８）－ＣＨ２－Ｓ－Ｒ；
　　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－ＮＨＣＯ－ＣＨ（Ｒ８）－ＣＨ２－Ｓ－Ｒ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨＣＯ－ＣＨ（Ｒ８）－ＣＨ２－Ｓ－Ｒ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ（Ｒ８）－ＣＨ２－Ｓ－Ｒ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－Ｓ－Ｓ－Ｒ；及び
　－Ｚ－ＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ
（ここで、ｍｚは、２以上３０以下の整数であり、Ｒ８は、水素原子又はメチル基であり、Ｒ及びｍは、本明細書で既に定義したとおりである。）
で表される基からなる群より選択される基を含む。
　当該基としては、
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－ＮＨ－ＣＯＯ－Ｒ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯＯ－Ｒ；及び
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍｚ－Ｓ－Ｓ－Ｒ
（ここで、ｍｚ、Ｒ、及びｍは、本明細書で既に定義したとおりである。）
からなる群より選択される基が好ましい。
（Ｚ）
　一般式（Ｉ）において、Ｚは直接結合であることが好ましい。また、別の態様において、Ｚがペプチドリンカーである場合に、Ｘ１は－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒであることが好ましい。さらに、別の態様において、Ｚは、－ＮＨ－［ＣＨ（－Ｚａ）－ＣＯＮＨ］ｎ－１－ＣＨ（－Ｚａ）－ＣＯ－で表されるペプチドリンカーであってもよく、ここで、ｎは２以上３０以下の整数であり、Ｚａは、それぞれ独立に、Ｈ２Ｎ－ＣＨ（－Ｚａ）－ＣＯＯＨとして表されるα－アミノ酸中の置換基を表す。当該ペプチドリンカーは、Ｎ末端にてグルクロン酸部分のカルボキシ基に結合し、Ｃ末端にて基－Ｎ（－Ｒａ）－Ｙ－Ｘ１に結合する。当該ペプチドリンカーのアミノ酸残基として利用できるアミノ酸の例としてはα－アミノ酸、例えばアラニン、アルギニン、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン（Ｌｅｕ）、リジン、メチオニン、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンといった天然型（Ｌ型）のアミノ酸、それらのＤ体等が挙げられ、合成されたアミノ酸を含む全てのα－アミノ酸を用いることができる。すなわち、Ｚａとしては、例えば、－ＣＨ３、Ｈ２ＮＣ（ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）３－、Ｈ２ＮＣＯＣＨ２－等が挙げられる。また、ｎ個のＺは、同一でも異なっていてもよい。ｎは、２以上３０以下の整数であるが、２以上１０以下が好ましく、２以上４以下がより好ましい。ペプチドリンカーの好ましい例としては、例えば、－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－、－Ａｓｎ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－、－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－、Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－等が挙げられる。
（Ｙ）
　一般式（Ｉ）において、Ｙは－（ＣＨ２）ｎ１－及び－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ１－ＣＨ２ＣＨ２－（ここで、ｎ１は、２以上２０以下の整数であり、２以上１５以下の整数が好ましく、２以上１２以下の整数がより好ましく、２以上６以下の整数がさらに好ましい。ｍ１は、１以上４以下の整数である）からなる群より選択される基が好ましい。具体的には、－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）６－、－（ＣＨ２）８－、－（ＣＨ２）１２－、又は、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２－ＣＨ２ＣＨ２－が好ましい。また、純水中乃至低塩濃度下では高い溶解性を実現させつつ、生理食塩濃度下では高い沈殿形成能を示させるという観点からは、Ｙは－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）６－、－（ＣＨ２）８－及び－（ＣＨ２）１２－からなる群より選択される基が好ましく、－（ＣＨ２）６－がより好ましい。
　Ｙは、例えば、－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｓ－Ｓ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２－ＣＨ２ＣＨ２－Ｓ－Ｓ－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｓ－Ｓ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２－ＣＨ２ＣＨ２－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２－ＣＨ２ＣＨ２－Ｓ－Ｓ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２－ＣＨ２ＣＨ２－等であってもよい。
（Ｙａ）
　Ｙａとしては、－ＣＨ２－又は－ＣＨ２－ＣＨ２－が好ましい。
（Ｙｂ）
　Ｙｂとしては、－ＣＨ２－ＣＨ２－、－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２－、２－ブテン－１，４－ジイル、ヘプタ－２，４－ジエン－１，６－ジイル又はオクタ－２，４，６－トリエン－１，８－ジイルが好ましく、－ＣＨ２－ＣＨ２－又は－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２－がより好ましい。
　基「－Ｚ－Ｎ（Ｒａ）Ｙ－Ｘ１」の具体例としては、－ＮＨ－（ＣＨ２）２－ＮＨ－ＣＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）４－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（ＣＨ２）４－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）４－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）４－Ｎ（－（ＣＨ２）３－ＮＨ２）－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（ＣＨ２）４－Ｎ（－（ＣＨ２）３－ＮＨ２）－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（ＣＨ２）４－Ｎ（－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ２）－ＣＯＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（ＣＨ２）４－Ｎ（－（ＣＨ２）３－ＮＨ２）－ＣＯ－ＮＨ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（ＣＨ２）４－Ｎ（－（ＣＨ２）３－ＮＨ２）－ＣＯ－コレステリル、－ＮＨ－（ＣＨ２）３－ＮＨ－（ＣＨ２）４－Ｎ（－（ＣＨ２）３－ＮＨ２）－コレステリル等が挙げられる。好ましい基「－Ｚ－Ｎ（Ｒａ）Ｙ－Ｘ１」としては、Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃが、水素原子であり、Ｙが、直鎖状のＣ２－３０アルキレン又は－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－であり、Ｙａが、直鎖状のＣ１－５アルキレンであるか、又はＹｂが、直鎖状のＣ２－８アルキレン若しくは直鎖状のＣ２－８アルケニレンである。
　繰り返し単位（Ｉ）としては、特に、一般式（Ｉ）中、Ｚが直接結合であり、Ｒａが水素原子又はＣ１－６アルキルであり、ＹがＣ２－３０アルキレン又は－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－であり、Ｘ１が－ＮＲｂ１－ＣＯＯ－Ｒで表される基であり、Ｒｂ１が水素原子又はＣ１－６アルキルであり、Ｒはステリル基である繰り返し単位であることが好ましく；Ｚが直接結合であり、Ｒａが水素原子であり、ＹがＣ２－３０アルキレン又は－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－であり、Ｘ１が－ＮＲｂ１－ＣＯＯ－Ｒで表される基であり、Ｒｂ１が水素原子又はＣ１－６アルキルであり、Ｒがステリル基である繰り返し単位であることがより好ましく；Ｚが直接結合であり、Ｒａが水素原子であり、ＹがＣ２－３０アルキレン又は－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－であり、Ｘ１が－ＮＲｂ１－ＣＯＯ－Ｒで表される基であり、Ｒｂ１が水素原子又はＣ１－６アルキルであり、Ｒがコレステリル基である繰り返し単位であることがさらに好ましく；Ｚが直接結合であり、Ｒａが水素原子であり、－Ｙ－Ｘ１－が－（ＣＨ２）２－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル、－（ＣＨ２）４－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル、－（ＣＨ２）５－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル、－（ＣＨ２）６－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル、－（ＣＨ２）１２－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル、又は－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２－ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリルである繰り返し単位であることがよりさらに好ましく；が直接結合であり、Ｒａが水素原子であり、－Ｙ－Ｘ１－が－（ＣＨ２）２－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル、－（ＣＨ２）４－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル、－（ＣＨ２）５－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリル、又は－（ＣＨ２）６－ＮＨ－ＣＯＯ－コレステリルである繰り返し単位であることが特に好ましい。
　繰り返し単位（ＩＩ）としては、特に、一般式（ＩＩ）中、Ｚが直接結合であり、Ｒａが水素原子又はＣ１－６アルキルであり、ＹがＣ２－３０アルキレン又は－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－であり、Ｘ２がマレイミド基である繰り返し単位であることが好ましく；Ｚが直接結合であり、Ｒａが水素原子又はＣ１－６アルキルであり、ＹがＣ２－３０アルキレンであり、Ｘ２がマレイミド基である繰り返し単位であることがより好ましく；Ｚが直接結合であり、Ｒａが水素原子であり、ＹがＣ２－３０アルキレンであり、Ｘ２がマレイミド基である繰り返し単位であることがさらに好ましく；Ｚが直接結合であり、Ｒａが水素原子であり、ＹがＣ２－１０アルキレンであり、Ｘ２がマレイミド基である繰り返し単位であることがさらに好ましい。
　本実施形態のヒアルロン酸誘導体において、一分子のヒアルロン酸誘導体に含まれている２以上の繰り返し単位（Ｉ）は、全て同一の繰り返し単位であってもよく、互いに異なる２種以上の繰り返し単位であってもよい。
　本実施形態のヒアルロン酸誘導体において、一分子のヒアルロン酸誘導体に含まれている２以上の繰り返し単位（ＩＩ）は、全て同一の繰り返し単位であってもよく、互いに異なる２種以上の繰り返し単位であってもよい。
　本実施形態のヒアルロン酸誘導体の繰り返し単位の全単位数に対して、繰り返し単位（Ｉ）及び繰り返し単位（ＩＩ）の合計単位数の割合は、４０％以下が好ましく、３５％以下がより好ましく、３０％以下がさらに好ましい。本実施形態のヒアルロン酸誘導体の繰り返し単位の全単位数に対して、繰り返し単位（Ｉ）及び繰り返し単位（ＩＩ）の合計単位数の割合は、１．０％以上が好ましく、２．５％以上がより好ましく、５．０％以上がさらに好ましい。ヒアルロン酸誘導体における繰り返し単位（Ｉ）及び繰り返し単位（ＩＩ）の合計単位数が前記範囲内であることで、ゲル化後の体積変化をより小さくすることができ、また、ＤＤＳキャリアとして用いた場合の薬物の封入率を高めることができる。
［重量平均分子量Ｍｗ］
　本実施形態のヒアルロン酸誘導体の重量平均分子量は、特に限定はされず、例えば、１，０００（１ｋ）以上１，０００，０００（１，０００ｋ）以下が好ましく、５ｋ以上３００ｋ以下がより好ましく、６ｋ以上２００ｋ以下がさらに好ましく、３０ｋ以上１３０ｋ以下が特に好ましい。
　本実施形態のヒアルロン酸誘導体の重量平均分子量は、ゲル化後の体積変化をより十分に低減させやすい点や、架橋により得られるヒアルロン酸架橋ゲルの粒子サイズなどが適切な範囲内の調整しやすい点から、２５０ｋＤａ以下が好ましく、２００ｋＤａ以下がより好ましく、１５０ｋＤａ以下がさらに好ましい。また、ヒアルロン酸誘導体のゲル化という観点では、４ｋＤａ以上が好ましく、２０ｋＤａ以上がより好ましく、３０ｋＤａ以上がさらに好ましく、４０ｋＤａ以上がよりさらに好ましい。本実施形態のヒアルロン酸誘導体の重量平均分子量は、特に、５０ｋＤａ以上が好ましく、９０ｋＤａ以上がより好ましい。ヒアルロン酸誘導体の分子量は、一般的には、対応する分子量を有する原料を使用することにより調節することができる。
　ヒアルロン酸誘導体の重量平均分子量Ｍｗ及び数平均分子量Ｍｎは、一般的には、対応する各分子量を有する原料を使用することにより調節することができる。
　ヒアルロン酸誘導体の重量平均分子量Ｍｗ及び数平均分子量Ｍｎは、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー多角度光散乱検出器（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）により測定することができる。ヒアルロン酸誘導体の重量平均分子量Ｍｗ及び数平均分子量Ｍｎは、具体的には、後述する実施例に記載された方法に従って測定することができる。
［ナノ微粒子の平均粒子径（ｎｍ）］
　本実施形態のヒアルロン酸誘導体は、水溶液中においてナノ微粒子を形成する。本実施形態のヒアルロン酸誘導体が形成するナノ微粒子の大きさは、特に限定されるものではないが、例えば、平均粒子径が、５００ｎｍ以下が好ましく、４５０ｎｍ以下がより好ましく、４００ｎｍ以下がさらに好ましく、３００ｎｍ以下がよりさらに好ましく、２５０ｎｍ以下が特に好ましい。本実施形態のヒアルロン酸誘導体が形成するナノ微粒子の平均粒子径は、１０ｎｍ以上が好ましく、２０ｎｍ以上がより好ましく、５０ｎｍ以上がさらに好ましい。
　本願明細書において、「ヒアルロン酸誘導体のナノ微粒子の平均粒子径」は動的光散乱法により測定されたｚ平均粒子径である。動的光散乱法によるｚ平均粒子径の測定は、例えば、ヒアルロン酸誘導体を、濃度が１ｍｇ／ｍＬになるようにリン酸緩衝液（１０ｍＭ）に溶解させた溶液により測定することができる。
　本実施形態のヒアルロン酸誘導体が形成するナノ微粒子は、中空であり、内部に各種の物質を封入させることができる。例えば、水溶液中に、ヒアルロン酸誘導体と共に封入する目的の物質を溶解させておくことにより、当該目的物質が内部に封入された、外殻がヒアルロン酸誘導体からなるナノ微粒子が形成される。本実施形態のヒアルロン酸誘導体のナノ微粒子は、比較的大きい物質や、水に難溶性の物質であっても、良好に封入可能である。これらの点から、本実施形態のヒアルロン酸誘導体は、ドラッグデリバリーシステム基材として良好であり、特に徐放性ドラッグデリバリーシステム基材として好ましい。
　本実施形態のヒアルロン酸誘導体は、薬物を封入させたまま、薬物を変性させないまま架橋剤と反応して架橋ゲルを取得することができる。
［ヒアルロン酸誘導体の製造方法］
　本実施形態のヒアルロン酸誘導体は、例えば、グルクロン酸のカルボキシ基をアミドに変換し、少なくとも一部に直接又はリンカーを介してステリル基を導入し、他の一部に直接又はリンカーを介してマレイミド基を導入することで得られる。原料のヒアルロン酸又はその誘導体に対して、反応させるステリル基を有する化合物の配合量を調整することで、ステリル基導入率を制御することができ、反応させるマレイミド基を有する化合物の配合量を調整することで、マレイミド基導入率を制御することができる。原料となるヒアルロン酸に、ステリル基を有する化合物を反応させ、得られた反応物にマレイミド基を有する化合物を反応させてもよく、原料となるヒアルロン酸に、マレイミド基を有する化合物を反応させ、得られた反応物にステリル基を有する化合物を反応させてもよく、原料となるヒアルロン酸に、マレイミド基を有する化合物とステリル基を有する化合物を一緒に反応系へ添加して反応させてもよい。原料となるヒアルロン酸に、マレイミド基やステリル基を導入する方法は、例えば、特開２０２１―１２３５９７号公報、特開２０２２－０１３８６１号公報、特開２０２２－０４４５７９号公報等に記載の方法を適宜改変して実施することができる。
　グルクロン酸のカルボキシ基をアミドに変換して、ステリル基又はマレイミド基を導入する方法として具体的には、例えば、原料のヒアルロン酸又はその誘導体を、テトラアルキルアンモニウム塩（例えば、テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩）にイオン交換し、適当な縮合剤存在下、溶媒中で当該ヒアルロン酸塩と、ステリル基（特に、コレステリル基）を導入したアミンと、を反応させる方法が挙げられる。
　上記の反応において使用することができる縮合剤は特に限定されず、例えば、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン）－４－メチルモルホリウム（ＤＭＴ－ＭＭ）、Ｎ，Ｎ’－カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ－エトキシカルボニル－２－エトキシ－１，２－ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）、２－ベンゾトリアゾール－１，１，３，３－テトラメチルウロニウム４フッ化ホウ酸塩（ＴＢＴＵ）、３，４－ジヒドロ－３－ヒドロキシ－４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジン（ＨＯＤｈｂｔ）、ベンゾトリアゾール－１－オキシ－トリス－ピロリジノ－ホスホニウム６フッ化リン酸塩（ＰｙＢＯＰ）、ベンゾトリアゾール－１－イル－オキシ－トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム　ヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）等が挙げられる。
　特に、限定はされないが、ＤＭＴ－ＭＭは水及び有機溶媒の混合溶媒中でも反応が高効率に進む点において好ましい。また、ＤＭＴ－ＭＭを縮合剤として使用することにより、多数のヒドロキシ基が共存する系において、エステル結合形成を抑えつつ、高選択的にアミノ基とカルボキシ基によるアミド結合形成を行うことができる。この縮合剤の使用により、例えば、溶媒であるアルコールがヒアルロン酸部分のカルボキシ基と反応することや、ヒアルロン酸部分に同時に存在するカルボキシ基とヒドロキシ基とが、分子内又は分子間で結合して、望まない架橋を形成してしまうことを防ぐことができる。
　ステリル基導入反応において用いる溶媒としては、水、ＤＭＳＯ、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、イソプロパノール、多価アルコール、アセトニトリル、ＤＭＦ、ＴＨＦ、ジクロロメタン、クロロホルム、ヘキサン、ジエチルエーテル、酢酸エチル、及びこれらの混合溶媒等が挙げられる。多価アルコールとしては、２価のアルコールであってもよく、３価のアルコールであってもよい。２価のアルコールとしては、例えば、エチレングリコール、ジエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ネオペンチルグリコール、１，４－ブタンジオール、１，６－ヘキサンジオール等が挙げられる。３価のアルコールとしては、例えば、グリセリン、トリメチロールプロパン等が挙げられる。
　ステリル基導入反応において、反応系のｐＨは、酸性条件下であることが好ましい。塩基性条件下では、マレイミド基の失活によりスクシンイミド基が生成され得る。
　或いは、原料のヒアルロン酸又はその誘導体を、テトラアルキルアンモニウム塩（例えば、テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩）にイオン交換し、適当な縮合剤存在下、溶媒中で当該ヒアルロン酸塩とスペーサー部分を反応させ（この際、必要に応じて保護及び脱保護反応を行ってもよい）、原料のヒアルロン酸又はその誘導体のカルボキシ基（－ＣＯＯＨ）を変換し、その後に適当な試薬と反応させてもよい。カルボキシ基から誘導される基と、反応試薬の組み合わせの例を以下に示す。
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂＨ　＋　Ｈａｌ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂＨ　＋　Ｈａｌ－ＣＯＯＲ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂＨ　＋　ＨＯＣＯ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂＨ　＋　Ｈａｌ－ＣＯ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯＯＨ　＋　ＨＮＲｃ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯ－ＮＲｃＨ　＋　Ｈａｌ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂＨ　＋　ＨＯＣＯ－ＮＲｃ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂＨ　＋　Ｈａｌ－ＣＯ－ＮＲｃ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＣＯＯＨ　＋　ＨＯ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＯＨ　＋　Ｈａｌ－ＣＯＯ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＯＣＯＯＨ　＋　ＨＯ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＯＣＯＯＨ　＋　Ｈａｌ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＯＣＯ－Ｈａｌ　＋　ＨＯ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＳＨ　＋　Ｈａｌ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－Ｈａｌ　＋　ＨＳ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＣＯ－Ｙａ－Ｈａｌ　＋　ＨＳ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＣＯ－Ｙａ－ＳＨ　＋　Ｈａｌ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ＝ＣＨ２　＋　ＨＳ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯ－ＣＨ（ＣＨ３）＝ＣＨ２　＋　 ＨＳ－Ｒ；
－ＣＯＮＲａ－Ｙ－ＳＨ　＋　ＨＳ－Ｒ；
－ＣＯＺ－ＯＨ　＋　ＨＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ；
－ＣＯＺ－ＮＲａ－Ｙ－ＮＲｂＨ　＋　Ｈａｌ－ＣＯＯ－Ｒ
（式中、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｙ、Ｙａ、Ｙｂ、及びＺは本明細書で既に定義したとおりであり、Ｈａｌは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子及びヨウ素からなる群より選択されるハロゲン原子を表す）。
　反応様式としては、脱ハロゲン化水素反応、縮合反応、脱水反応、マイケル付加等の求核付加反応、酸化的なジスルフィド形成反応等が挙げられ、これらは周知な反応であり、当業者が適宜選択し、好ましい反応条件を見出して行うことができる。変換体又は反応物がカルボキシ基を有する場合は、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド（以下、「ＮＨＳ」とも称す）エステルとし、反応させてもよい。
　また、原料のヒアルロン酸又はその誘導体のカルボキシ基に、２－アミノエチル２－ピリジルジスルフィドを反応させて、末端に脱離基で修飾されたメルカプト基を有するスペーサーが導入されたヒアルロン酸誘導体を調製し、これにチオコレステロールを求核置換反応させてジスルフィド結合を形成する方法が挙げられる。
　さらに、ヒアルロン酸又はその誘導体のカルボキシ基にスペーサーの一部を導入したものと、ステリル基にスペーサーの一部を導入したものを調製し、これらを反応させる方法も挙げられる。具体例の一部は上述したが、さらに、Ｙに－Ｓ－Ｓ－が挿入されている場合は、ヒアルロン酸のカルボキシ基に、末端にメルカプト基を有するスペーサーが導入されたヒアルロン酸誘導体と、末端にメルカプト基を有するスペーサーが導入されたステリル基をそれぞれ調製し、これらを酸化的に反応させてジスルフィド結合を形成させる方法も挙げられる。このとき、一方のメルカプト基を２－メルカプトピリジンと反応させてジスルフィドとした後に、他方のメルカプト基と置換させることもできる。
　また、ヒアルロン酸誘導体を調製後、さらに他の置換基を導入してもよい。例えば、ヒアルロン酸誘導体におけるカルボキシ基の０．１％以上９５．０％以下、好ましくは１０％以上６０％以下を、－ＣＯ－Ｘｚ、［ここで、Ｘｚは、以下の基：
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－Ｏ－ＣＯ－Ｃ（Ｒ１７）＝ＣＨ２；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ（Ｒ１７）－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－ＮＨ－ＣＯ－Ｃ（Ｒ１７）＝ＣＨ２；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）－（ＣＨ２）３－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｒ－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（Ｒ１７）－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（ＮＨ２）－ＣＨ２－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（ＮＨ２）－（ＣＨ２）２－ＳＨ；
　－ＮＨ－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）４－ＣＯ－ＮＨ－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）－（ＣＨ２）３－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－Ｃ（Ｒ１７）＝ＣＨ２；
　－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ（Ｒ１７）－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－Ｃ（Ｒ１７）＝ＣＨ２；
　－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）－（ＣＨ２）３－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－（ＣＨ２）ｒ－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（Ｒ１７）－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（ＮＨ２）－ＣＨ２－ＳＨ；
　－ＮＨ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ（ＮＨ２）－（ＣＨ２）２－ＳＨ；
　－ＮＨ－ＣＨ（ＣＯ２Ｈ）－（ＣＨ２）－ＳＨ；
　－ＮＨ－ＣＨ（ＣＯ２Ｈ）－（ＣＨ２）２－ＳＨ；及び
　－ＮＨ－ＣＨ（ＣＯ２Ｈ）－（ＣＨ２）２－ＣＯＮＨ－ＣＨ（ＣＯＮＨ－ＣＨ２－ＣＯ２Ｈ）－ＣＨ２－ＳＨ
（ここで、Ｒ１７は、水素原子又はＣ１－６アルキル基であり、ｐ１は２以上１０以下の整数、ｑは１以上２００以下の整数、ｒは１以上３以下の整数を、それぞれ表す）からなる群より選択される］
に変換することで、分子内或いは他分子を含めた分子間で化学的に架橋させてゲル化することもできる。
≪ヒアルロン酸架橋ゲル≫
　本実施形態のヒアルロン酸誘導体は、化学架橋によりゲル化させることができる。すなわち、本実施形態のヒアルロン酸架橋ゲルは、本実施形態のヒアルロン酸誘導体を、一分子当たり２以上の架橋性基を有する架橋剤を用いて化学架橋によりゲル化させて得られたゲルである。
　本実施形態のヒアルロン酸架橋ゲルは、本実施形態のヒアルロン酸誘導体と架橋剤とを溶媒に溶解させた液状組成物を化学架橋反応によりゲル化させることにより得られる。化学架橋反応において、ヒアルロン酸誘導体濃度、架橋剤の種類、架橋剤濃度、溶媒の種類、溶媒ｐＨ、塩濃度、温度、時間等の反応条件は、適宜決定することができる。例えば、化学架橋時の架橋剤の濃度、及び、ヒアルロン酸誘導体や架橋剤への架橋形成が可能な基の導入率を高くすることにより、生成するゲルの架橋密度を高くすることが可能である。
　本実施形態のヒアルロン酸誘導体をゲル化させる工程における架橋剤濃度は、架橋形成が可能な基（架橋性基）を両端に有するものを使用する場合、当該基が過不足なく速やかに架橋反応に関与できるような濃度で添加することが好ましい。例えば、マレイミド基はチオール基と縮合反応により結合するため、一分子当たり２個以上のチオール（ＳＨ）基を有する化合物を架橋剤として用いてマイケル付加反応により架橋する場合は、マレイミド基：ＳＨ基＝３：１～１：３が好ましく、２：１～１：２が特に好ましい。
　架橋剤としては、一分子当たり２個以上の架橋性基を有している化合物であれば、特に限定されるものではない。本実施形態のヒアルロン酸架橋ゲルとしては、一分子当たり２個以上のチオール基を有する化合物を架橋剤として、本実施形態のヒアルロン酸誘導体を化学架橋されたゲル状物であることが好ましい。一分子当たり２個以上のチオール基を有する化合物としては、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）、１本鎖ＰＥＧの両末端にチオール基を有するＳＨ含有ＰＥＧ化合物、３腕以上８腕以下を有する分岐状のＰＥＧ鎖であって、各腕の末端にチオール基を有するＳＨ含有ＰＥＧ化合物等が挙げられる。これらのＳＨ含有ＰＥＧ化合物では、ＰＥＧの重合度を調節することによって、分子量を調整することができる。
　ゲル化においては、ヒアルロン酸誘導体と架橋剤とを溶媒に溶解させた液状組成物の固形分濃度が高いほど、浸透圧が高くなり、ゲル化時に膨潤しやすい傾向にある。このため、その他の反応条件が同じ場合には、ヒアルロン酸誘導体の濃度が高いほど、得られた架橋ゲルの膨潤度が高くなりやすい。同様に、その他の反応条件が同じ場合には、架橋剤の濃度が高いほど、得られた架橋ゲルの膨潤度が高くなりやすい。また、一分子当たりの架橋性基の数が同数である架橋剤の場合、分子量が大きいほど、架橋に必要なモル量のチオール基をヒアルロン酸誘導体に添加するための架橋剤の質量が多くなるため、膨潤度が高くなりやすい。
　本実施形態のヒアルロン酸架橋ゲルの製造において用いられる架橋剤としては、不飽和結合と求核付加反応で反応するメルカプト基を２つ以上同一分子に含む化合物が挙げられる。当該架橋剤としては、例えば、ポリエチレングリコールジチオール、システインを２つ以上含むペプチド等が挙げられる。
　本実施形態のヒアルロン酸架橋ゲルの製造において用いられる架橋剤としては、腕の先端にＳＨ基を有する２腕以上８腕以下のＰＥＧ化合物であることが好ましく、腕の先端にＳＨ基を有する３腕以上６腕以下のＰＥＧ化合物であることがより好ましく、腕の先端にＳＨ基を有する４腕のＰＥＧ化合物であることがさらに好ましく、腕の先端にＳＨ基を有する４腕の重量平均分子量が２ｋ～４０ｋのＰＥＧ化合物がよりさらに好ましく、腕の先端にＳＨ基を有する４腕の重量平均分子量が５ｋ～２０ｋのＰＥＧ化合物が特に好ましい。
　ヒアルロン酸誘導体をゲル化させる工程における溶媒は、ヒアルロン酸誘導体及び架橋剤を充分に溶解することができるものが好ましく、特に限定されないが、水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）及びこれらから選択される混合溶媒を用いることが好ましい。また、これらの溶媒に混和する有機溶媒を混合して使用することも可能である。特に限定されないが、混和する有機溶媒としては例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、多価アルコール、アセトン、アセトニトリル等が挙げられる。多価アルコールとしては、前記において例示されたものと同様のものが挙げられ、中でも、エチレングリコールが好ましい。
　また、架橋反応時のタンパク質又はペプチドの安定性向上、反応速度の向上の為に塩基性化合物を添加することが好ましい。用いる塩基性化合物としては特に限定されるものではないが、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムなどの炭酸塩、水酸化ナトリウム、水酸化ナトリウムなどの水酸化物、アンモニア水、ピリジン、トリエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン等のアミン類が挙げられ、好ましくはアミン類が用いられ、さらに好ましくは、トリエタノールアミンが用いられる。
　ヒアルロン酸誘導体は、ターゲティングキャリアとして水溶液中においてナノ微粒子を形成するため、希薄な条件化において架橋することにより、ナノサイズの微粒子ゲルを形成することができ、血中徐放キャリアとして用いることができる。希薄な条件とは１０ｍｇ／ｍＬ以下であり、好ましくは５ｍｇ／ｍＬ以下、さらに好ましくは１ｍｇ／ｍＬ以下である。一方、高濃度な条件下において架橋することにより、微粒子同士が架橋した、バルク状のゲルを形成することができる。これは皮下徐放型のキャリアとして有用である。高濃度な条件とは５ｍｇ／ｍＬ以上であり、好ましくは２０ｍｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは３０ｍｇ／ｍＬである。
　ヒアルロン酸誘導体をゲル化させる工程は、バルクで行ってもよく、エマルション中や噴霧液滴中等の不連続相中で行ってもよい。例えば、Ｗ／Ｏエマルション中で行う場合は、ヒアルロン酸誘導体や架橋剤等を溶解させた水相を、水に混和しない溶媒中に乳化し、ゲル化反応を行えばよい。水に混和しない溶媒とは、特に限定されないが、例えばヘキサン、クロロホルム、ジクロロメタン、酢酸エチル、中鎖脂肪酸トリグリセリド（ＭＣＴ）、流動パラフィン、大豆油等が挙げられる。乳化を安定化するための界面活性剤を添加してもよい。また、例えば、超臨界二酸化炭素中やＰＥＧ中等の脱溶媒が可能な溶媒中で行ってもよい。この場合は、ヒアルロン酸誘導体や架橋剤等を溶解させた水相や有機溶媒相を、前例の溶媒中に乳化、分散することで、脱溶媒（溶媒拡散）に伴うポリマーの濃縮が成されることから、より高い架橋密度のゲルを得ることが可能になる。
　ヒアルロン酸誘導体をゲル化させる工程、及びその後に、架橋反応を停止する操作及び残存した架橋性基を失活若しくは洗浄する操作を行ってもよい。反応に関与しなかった架橋性基、架橋剤の片端のみが結合した基、残存した架橋剤等は、安全性の観点、保存中安定性の観点、封入される薬物との副反応等の観点から除去した方が好ましい。特に限定されないが、例えば、未反応の架橋剤が残存している場合は、過剰の水等で洗浄することで除去してもよい。
　ヒアルロン酸誘導体をゲル化させる工程の後に、粉砕工程を行ってもよい。粉砕方法としては、乳棒と乳鉢を用いる粉砕やミルを用いる粉砕が挙げられるが、ミルを用いる粉砕が好ましい。ミル粉砕装置としては、遠心式粉砕機（日本精機製作所製）及びインパクトミル（ダルトン社製）等の回転円板型の粉砕装置、アトマイザー（東京アトマイザー製造社製）、サンプルミル（東京アトマイザー製造社製）、バンタムミル（東京アトマイザー製造社製）、及びＳＫミル（トッケン社製）等のスクリーンミルの粉砕装置、超微少量ラボジェットミル（Ａ－Ｏジェットミル、セイシン企業）等のジェット粉砕装置、並びに、超低温での粉砕が可能なリンレックスミル（リキッドガス株式会社）等が挙げられるが、ＳＫミル及びリンレックスミルが好ましい。
　本実施形態のヒアルロン酸架橋ゲルは、本実施形態のヒアルロン酸誘導体を架橋剤により化学架橋して得られたゲル状物であってもよく、これを乾燥させた乾燥物であってもよい。乾燥方法としては、例えば、凍結乾燥、通風乾燥、恒温槽中での乾燥、減圧乾燥、熱風循環式乾燥等が挙げられる。風速、乾燥時間、温度、圧力等はヒアルロン酸誘導体のゲルが分解や変質を生じない範囲で適宜選択される。
　本実施形態のヒアルロン酸架橋ゲルの乾燥物及び本実施形態のヒアルロン酸架橋ゲルは、乾燥状態及び膨潤状態の何れにおいても多孔質構造体である。例えば、このため、細胞などの比較的大きな成分も担持させることができ、当該乾燥物は、再生医療等に用いられる細胞や組織の基材としても好適に用いることができる。例えば、移植用の細胞を当該乾燥物内に接着させて培養し、これを目的の組織内に移植することができる。また、当該乾燥物及び架橋ゲルは、ｉｎ　ｓｉｔｕ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ療法における細胞が生育するための足場としても機能する。例えば、当該乾燥物を生体内の組織に埋め込むことにより、周辺組織から移動してきた細胞が当該乾燥物を足場として生着できる。
　本実施形態のヒアルロン酸架橋ゲルの乾燥物及び本実施形態のヒアルロン酸架橋ゲルは、コレステリル誘導体の導入率を変更することで、細胞の接着性を制御し得る。
≪医薬組成物≫
　本実施形態の医薬組成物は、前記ヒアルロン酸誘導体を含む。本実施形態の医薬組成物において、ヒアルロン酸誘導体は主に有効成分の担体として機能する。当該医薬組成物を生体内に投与した際には、ヒアルロン酸誘導体を含む担体から、薬物等の有効成分が徐々に遊離し、良好な徐放性を期待できる。
＜有効成分＞
　本実施形態の医薬組成物に含まれる有効成分は、ヒト、動物用の医薬品（病気の診断、治療、又は予防のために投与される物質）又はその有効成分として使用される物質であれば、特に限定されるものではない。当該有効成分は、水溶性物質であってもよく、難溶性物質であってもよい。当該有効成分としては、例えば、タンパク質、ペプチド、多糖類、オリゴ糖、核酸、オリゴヌクレオチド、低分子化合物、細胞等が挙げられる。また、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体のような、タンパク質と核酸の複合体であってもよい。
　本実施形態の医薬組成物としては、例えば、本実施形態のヒアルロン酸から形成されており、有効成分が封入されているナノ粒子や、本実施形態のヒアルロン酸架橋ゲルの乾燥物及びヒアルロン酸架橋ゲルに移植用細胞を生着させたもの、難溶性薬物等を包含させたヒアルロン酸架橋ゲル及びその乾燥物等が挙げられる。
＜形態＞
　本実施形態の医薬組成物は、分散性微粒子溶液であってもよく、沈殿性懸濁液であってもよく、凍結乾燥体であってもよい。また、凍結乾燥体の場合は、医師が投与前に生理食塩水等の等張液を加えて投与液を用事調製するタイプの沈殿型の徐放製剤となりうる。この場合、溶液状態では不安定な活性成分を含む医薬組成物に適していると考えられる。
　本実施形態の医薬組成物が分散性微粒子溶液又は沈殿性懸濁液である場合、医薬組成物中のヒアルロン酸誘導体の濃度は、１ｍｇ／ｍＬ以上２００ｍｇ／ｍＬ以下が好ましく、４ｍｇ／ｍＬ以上１００ｍｇ／ｍＬ以下がより好ましく、４ｍｇ／ｍＬ以上５０ｍｇ／ｍＬ以下がさらに好ましく、４ｍｇ／ｍＬ以上１２ｍｇ／ｍＬ以下が特に好ましい。
　本実施形態の医薬組成物は、既に述べた形態に限定されることはなく、ナノ微粒子、ミクロ微粒子、溶液、エマルジョン、懸濁液、ゲル、ミセル、インプラント、粉末、又はフィルムの形態にあってもよい。粉末は、凍結乾燥又は噴霧乾燥により得た固体を粉砕して製造してもよく、沈殿物を乾燥したものから製造してもよい。
　本実施形態の医薬組成物は、経口、腸管外、鼻腔内、膣内、眼内、皮下、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、脳内又は口腔内の経路を経て投与されてよい。また、本実施形態の医薬組成物は、注射剤に限定されることはなく、貼付製剤やマイクロニードル製剤、塗り薬、点眼薬、噴霧薬、吸入薬等であってもよい。
　以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を実施例に制限することを意図したものではない。
　実施例及び比較例で製造したヒアルロン酸誘導体の各物性の測定方法及び評価方法は以下のとおりである。特に記載のない限り、すべての実験は、３回繰り返して実行された。
＜１Ｈ ＮＭＲ測定＞
　１Ｈ ＮＭＲ測定は、特に記載のない限り、溶媒として０．０２Ｎ ＤＣｌ／ｄ６－ＤＭＳＯを使用して、４００ＭＨｚ－ＮＭＲ器具（ＪＮＭ－ＥＣＳ４００、ＪＥＯＬ社製）を設置したＪＥＯＬ ＪＮＭ－Ａ４００分光計（ＪＥＯＬ社製）を用いて実施した。
＜多角度レーザー散乱と組み合わせたサイズ排除クロマトグラフィー測定＞
　ＨＡ誘導体は、Ｗｙａｔｔ Ｄａｗｎ ＮＥＯＮ多角光散乱検出器及びアイソクラティックＨＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ社製）を備えたＯｐｔｉｌａｂ屈折率モニターを使用するＳＥＣ－ＭＡＬＳによって分析した。まず、ＨＡ誘導体を、ＳＥＣ－ＭＡＬＳ緩衝液（１０ｍＭ リン酸バッファー、ｐＨ７．４）中で１．０ｍｇ／ｍＬに希釈した。分離ステップは、Ｇ４０００ＳＷＸＬカラム（Ｔｏｓｏｈ社製）を使用し、流速０．５ｍＬ／分でＳＥＣ－ＭＡＬＳ緩衝液中で実行された。データ分析は、ヒアルロン酸の屈折率濃度係数ｄｎ／ｄｃ値（０．１５３、文献値）とＡｓｔｒａソフトウェア（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を使用して実行された。
＜動的光散乱（ＤＬＳ）法による平均粒子径の測定＞
　ＨＡ誘導体は、ＳＥＣと同じ溶媒（１０ｍＭ リン酸バッファー、ｐＨ７．４）の溶液中で、ＥＬＳＺ－２０００（大塚電子社製）を使用したＤＬＳ分析によって特性評価された。測定された自己相関関数は、キュムラント法によって実行された。ＨＡ誘導体の流体力学的直径は、Ｓｔｏｋｅｓ－Ｅｉｎｓｔｅｉｎ方程式を使用して分析された。
＜逆さバイアル試験（ＨＡ誘導体架橋ゲル化試験）＞
　ＨＡ誘導体架橋ゲルは、マレイミド基とチオール基の間のマイケル付加反応を介して架橋することによって調製された。ゲル化のための架橋剤としては、特に記載のない限り、４腕の末端にＳＨ基を有するＰＥＧ化合物である４ａｒｍ－ＰＥＧＳＨ（分子量＝１×１０４ｇ／ｍｏｌ、日油社製）を用いた。
　ＨＡ誘導体のゲル化能力は、バイアルを逆さにした際の状態に基づいて分析した。具体的には、ＨＡ誘導体とＰＥＧＳＨを、溶媒（１０ｍＭ リン酸バッファー、ｐＨ７．４）に別々に完全に溶解させた後、５℃に冷却しながら両者を１つのバイアルに注ぎ、３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベート開始から経時的にバイアルを逆さにして、サンプルが流れて落下するかを確認した。インキュベート開始から５分間以内又は３０分間以内に流れを示さなかったサンプルはゲルであると分類し、インキュベート開始から３０分経過しても流れてしまうサンプルはゾルであると分類した。全てのサンプルは、ゲル又はゾルのいずれかであると分類された。
＜ＨＡ誘導体架橋ゲルの調製＞
　ポリテトラフルオロエチレン膜上に設置した円盤状シリコーンゴム型（直径６ｍｍ、深さ１ｍｍ）に、５℃に冷却しながら、２種の前駆体溶液（ＨＡ誘導体のリン酸バッファー溶液及びＰＥＧＳＨのリン酸バッファー溶液）を注入した。続いて、シリコンカバーシートを用いてモールドを覆い、３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、サンプルをガラスバイアルに移した。マレイミド基とチオール基のモル比は１．１：１であった。
＜ハイドロゲルの膨潤＞
　ＨＡ誘導体架橋ゲル（φ＝６ｍｍ、厚さ＝１．０ｍｍ）を、事前に秤量した複製ガラスバイアル（ｎ＝４）の底に置いた。ＨＡ誘導体架橋ゲルを含むバイアルの初期重量を初期質量として測定した。その後、１ｍＬのＰＢＳを加え、３７℃でインキュベートした。１、１２、及び２４時間の時点で、各バイアルから緩衝液を注意深く除去し、バイアルの重量を量って膨潤した質量を測定した。次いで、新鮮なＰＢＳを加えて、除去した溶液を置き換えた。元のヒドロゲルの質量（Ｗ０）と膨潤したヒドロゲル（ＷＳ）の質量は、総質量から空のバイアルの質量を差し引くことによって計算された。ＨＡ誘導体架橋ゲルの質量膨潤率（Ｑ）は、膨潤した質量を初期質量で割ることによって計算された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000007
＜ＨＡ誘導体架橋ゲルへのタンパク質の封入と放出の実験＞
　ＨＡ誘導体架橋ゲル（φ＝６ｍｍ、厚さ＝１．０ｍｍ）を前記と同様に作製し、ＰＢＳに浸漬させた。平衡膨潤に達した後、ＨＡ誘導体架橋ゲルを、ＦＩＴＣ－インシュリン（１００μｇ／ｍＬ）ＰＢＳ溶液に３７℃で浸漬した。その後、当該ゲル上の特定の点のサンプル（溶液２００μＬ）を回収し、その蛍光強度を、ＤｅＮｏｖｉｘ ＤＳ－１１ ＦＸ＋分光光度計蛍光計（「フルオロタンパク質」モジュール）を使用して測定した。ＦＩＴＣ－インシュリンのローディング効率は、蛍光強度の減少から推定された。
　血清存在下でのＨＡ誘導体からのＦＩＴＣ－インシュリンのｉｎ　ｖｉｔｒｏ放出試験も評価した。ＦＩＴＣ－インシュリンと複合体化したＨＡ誘導体架橋ゲル（φ＝６ｍｍ、厚さ＝１ｍｍ）を、１ｍＬの１０％　ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に３７℃で浸漬した。次に、サンプル（当該ゲルの上清の２００μＬ）を特定の回数収集し、前記と同様にして、蛍光強度とＦＩＴＣ－インシュリンのローディング効率を測定した。
［実施例１］
　ヒアルロン酸のグルクロン酸部分中のカルボキシル基の少なくとも一部にステリル基及びマレイミド基が導入されているＨＡ誘導体（ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－Ｍａｌｅ、「ＨＡＭＩＣＨ」と称することがある）を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　コレステリル６－アミノヘキシルカーバメート塩酸塩（Ｃｈｏｌ－Ｃ６塩酸塩）及びヒアルロン酸のテトラブチルアンモニウム塩（ＨＡ－ＴＢＡ）の調製は、特許文献１の実施例１及び実施例２に記載の通りに合成した。
　具体的には、ＨＡ－ＴＢＡは、出発原料であるヒアルロン酸ナトリウム塩（ＨＡ－Ｎａ）（平均分子量＝１２０ｋＤａ、ブルーメージバイオテクノロジージャパンから購入）を、陽イオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ（登録商標） ５０ＷＸ－８－４００、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用いてＨＡを変換し、縮合剤として４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（国産化学社製）用いてＮ－（５－アミノペンチル）マレイミド塩酸塩と反応させることにより得た。
　ＨＡ－ＴＢＡを、ＤＭＳＯ（１％ｗ／ｖ）に完全に溶解させ、次にＤＭＳＯに溶解させたＮ－（５－アミノペンチル）マレイミドを加え、室温で５分間撹拌した。続いて、ＤＭＴ－ＭＭを混合物に添加し、室温で一晩撹拌した。供給モル比は、１００：２０：２４（ＨＡのグルクロン酸：ＤＭＴ－ＭＭ：Ｎ－（５－アミノペンチル）マレイミド塩酸塩、ｘ＝２０）であった。
　次に、コレステリル－６－アミノヘキシルカルバメートを同様の手順で反応させた。供給モル比は、１００：ｘ：１．２ｘ（ＨＡのグルクロン酸：ＤＭＴ－ＭＭ：コレステリル－６－アミノヘキシルカルバメート、ｘ＝１．２、５、１０、１６、２２、３１又は４４）であった。
　得られた反応溶液を、ＤＭＳＯ溶液、０．１５Ｍ ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析（スペクトラポア４、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋＤａ～１４ｋＤａ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）し、得られた透析液を凍結乾燥して、表１に記載の目的物（ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－１％－Ｍａｌｅ１５％～ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－４０％－Ｍａｌｅ１５％）を白色固体として得た。
　比較対照として、Ｃｈｏｌ塩酸塩を反応させなかった以外は前記と同様の方法で、Ｃｈｏｌ未修飾のマレイミド基が修飾されたヒアルロン酸誘導体を製造した。表１に記載の目的物（ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－０％－Ｍａｌｅ）を白色固体として得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　各合成物は、１Ｈ ＮＭＲ測定により構造を確認した。ＮＭＲ分析のために、ＨＡＭＩＣＨを、０．０２Ｎ ＤＣｌ／ＤＭＳＯに溶解したものを用いた。１Ｈ ＮＭＲ測定の結果、各ＨＡ誘導体のマレイミド化度（マレイミド基導入率）は、１５％であった。各合成物のＮＭＲチャートを図１Ａ（Ｃｈｏｌ－０％）～図１Ｈ（Ｃｈｏｌ－４０％）に示す。
　各ＨＡＭＩＣＨのｚ平均粒子径（ｎｍ）を測定した。測定結果を表２に示す。また、ＧＰＣ－ＭＡＬＳ解析で測定された絶対分子量と、１ユニット当たりの理論平均分子量より、各ＨＡＭＩＣＨの会合度を算出した。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　ＨＡＭＩＣＨでは、コレステリル基の導入率が２０％までは、導入率依存的に粒子サイズは小さくなったが、コレステリル基の導入率が４０％まで高くなると、粒子サイズは大きくなっており、コレステリル基の導入率がＨＡ誘導体ナノ粒子の粒子サイズに影響を与えることが示された。また、コレステリル未修飾（０％）のＨＡＭＩＣＨでは、ステリル基の疎水性相互作用が働かないため、ほとんど会合していなかった。
［実施例２］
　実施例１で製造したＨＡＭＩＣＨを架橋剤４ａｒｍ－ＰＥＧＳＨを用いて化学架橋させてＨＡＭＩＣＨ架橋ゲルを製造した。
　まず、実施例１で製造した各ＨＡＭＩＣＨを、それぞれ１０ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ７．４）に表３に記載の濃度となるように溶解させて、ＨＡＭＩＣＨ溶液を調製した。別の容器に、１０ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ７．４）に２０ｍｇ／ｍＬの濃度で４ａｒｍ－ＰＥＧＳＨ（Ｍｗ：１０，０００）を溶解させ、ＰＥＧＳＨ溶液を調製した。両液を５℃に冷却した後に、厚み１ｍｍ、直径６ｍｍΦのシリコンモールド内で、ヒアルロン酸に修飾されたマレイミド基と４ａｒｍ－ＰＥＧＳＨ由来のＳＨ基のモル比が１．１：１．０となるように、両液を混合させて、３７℃でＨＡＭＩＣＨ架橋ゲルを製造した。この時、何れの場合もヒアルロン酸誘導体の終濃度を７ｍｇ／ｍＬになるような条件で実施した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　コレステリル基及びマレイミド基が導入されているＨＡＭＩＣＨは、８種ともいずれも、コレステリル基の導入率にかかわらず、ゲル化開始（ＨＡＭＩＣＨ溶液とＰＥＧＳＨ溶液の混合）から１～３０分間で、十分にゲル化し、架橋ゲルが形成されていた。後記比較例２に示すように、メタクリル基が導入されたＨＡＭＡ（ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－３％－ＭＡ、ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－１９％－ＭＡ）では、ステリル基とメタクリル基を導入したヒアルロン酸誘導体ではゲル化は困難であった。これらの結果から、ステリル基とマレイミド基を組み合わせてヒアルロン酸に導入することによって、ステリル基とメタクリル基を導入したヒアルロン酸誘導体では困難なほど迅速なゲル化が可能になることがわかった。
　さらに、ゲル化後からのＰＢＳ中での体積変化を測定し、膨潤度を調べた。測定結果を図２（Ａ）に示す。また、ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－０％－Ｍａｌｅとコレステリル基の導入率が２０％のＨＡＭＩＣＨ（ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－２０％－Ｍａｌｅ）について、ヒアルロン酸誘導体の終濃度を１６．７ｍｇ／ｍＬした以外は同じ条件でゲル化反応を行い、ゲル化開始からの体積変化を測定し、膨潤度を調べた。測定結果を図２（Ｂ）に示す。図２に示すように、コレステリル基未修飾のＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－０％－Ｍａｌｅでは時間経過とともにゲルの膨潤が見られた。これに対し、マレイミド基とステリル基の両方で修飾されたＨＡＭＩＣＨでは、マレイミド基のみで修飾されたＨＡＭＩＣＨよりも、膨潤度が小さく、ゲル化後の生体内における体積増大が抑えられるという特徴的な性質を示した。
［比較例１］
　ヒアルロン酸のグルクロン酸部分中のカルボキシル基の少なくとも一部にステリル基及びメタクリル基が導入されているＨＡ誘導体（ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－ＭＡ、「ＨＡＭＡ」と称することがある）を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　コレステリル６－アミノヘキシルカーバメート塩酸塩（Ｃｈｏｌ－Ｃ６塩酸塩）及びヒアルロン酸のテトラブチルアンモニウム塩（ＨＡ－ＴＢＡ）の調製は、特許文献１の実施例１及び実施例２に記載の通りに合成した。
　具体的には、ＨＡ－ＴＢＡは、出発原料であるヒアルロン酸ナトリウム塩（ＨＡ－Ｎａ）（平均分子量＝１２０ｋＤａ、ブルーメージバイオテクノロジージャパンから購入）を、陽イオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ（登録商標） ５０ＷＸ－８－４００、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用いてＨＡを変換し、縮合剤として４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（国産化学社製）用いてメタクリル酸２－アミノエチル塩酸塩（富士フィルム和光社製、製品番号５１０－５１９６１）と反応させることにより得た。
　ＨＡ－ＴＢＡを、ＤＭＳＯ（１％ｗ／ｖ）に完全に溶解させ、次にＤＭＳＯに溶解させたメタクリル酸２－アミノエチル塩酸塩（富士フィルム和光社製：製品番号５１０－５１９６１）を加え、室温で５分間撹拌した。続いて、ＤＭＴ－ＭＭを混合物に添加し、室温で一晩撹拌した。供給モル比は、１００：２０：２４（ＨＡのグルクロン酸：ＤＭＴ－ＭＭ：メタクリル酸２－アミノエチル塩酸塩、ｘ＝２０）であった。
　次に、コレステリル－６－アミノヘキシルカルバメートを同様の手順で反応させた。供給モル比は、１００：ｘ：１．２ｘ（ＨＡのグルクロン酸：ＤＭＴ－ＭＭ：コレステリル－６－アミノヘキシルカルバメート、ｘ＝２．０、１９）であった。
　ＨＡ生成物を、ＤＭＳＯに対して、次に０．１５０Ｍ ＮａＣｌに対して、最後に蒸留水に対して、透析（ＭＷＣＯ：１２～１４ｋＤａ）することによって精製した。精製したＨＡ溶液を、０．２２μｍメンブレンフィルターで濾過し、乾燥するまで凍結乾燥した。
　その後、メタクリル酸２－アミノエチル塩酸塩を、表４に示すＨＡ－ＴＢＡユニットに対する比率で、各溶液に添加した。次に、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）（国産化学社製）を、ＨＡ－ＴＢＡユニットに対して、表４に示す比率で各溶液に添加して、一晩攪拌した。その後、Ｃｈｏｌ－Ｃ６塩酸塩を、ＨＡ－ＴＢＡユニットに対して表４に示す比率で各溶液に添加した。
　次に、ＤＭＴ－ＭＭを、ＨＡ－ＴＢＡユニットに対して表４に示す比率で加え、室温でさらに一晩撹拌した。最後に、反応溶液を、ＤＭＳＯ溶液、０．１５Ｍ ＮａＣｌ水溶液、超純水の順で透析（スペクトラポア４、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋＤａ～１４ｋＤａ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）し、得られた透析液を凍結乾燥して、表４に記載の目的物（ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－ＭＡ）を白色固体として得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
［比較例２］
　比較例１で製造したＨＡＭＡを、架橋剤４ａｒｍ－ＰＥＧＳＨを用いて化学架橋させて、ＨＡＭＡ架橋ゲルを製造した。
　まず、比較例１で製造した各ＨＡＭＡを、それぞれ１０ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ７．４）に表５に記載の濃度となるように溶解させて、ＨＡＭＡ溶液を調製した。別の容器に、１０ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ７．４）に５０ｍｇ／ｍＬの濃度で４ａｒｍ－ＰＥＧＳＨ（日油社製、Ｍｗ：１０，０００）を溶解させ、ＰＥＧＳＨ溶液を調製した。両液を５℃に冷却した後に、厚み１ｍｍ、直径６ｍｍΦのシリコンモールド内で、ヒアルロン酸に修飾されたメタクリル基と４ａｒｍ－ＰＥＧＳＨ由来のＳＨ基のモル比が１．１：１．０となるように、両液を混合させて、３７℃でＨＡＭＡ架橋ゲルを製造した。この時、何れの場合もヒアルロン酸誘導体の終濃度を７ｍｇ／ｍＬになるような条件で実施した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　メタクリル基が導入されたＨＡＭＡ（ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－３％－ＭＡ、ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－１９％－ＭＡ）は、いずれも、ゲル化開始から３０分経過した時点ではまだゲル化が不十分であり、ゲル化開始２４時間後にもゲル化が完了していなかった。
［比較例３］
　さらに、比較例２と同様な方法で、メタクリル基が導入されたＨＡＭＡ（ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－１９％－ＭＡ）について、ヒアルロン酸誘導体の終濃度が２５ｍｇ／ｍＬになること以外は同じ条件で１００ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させた４ａｒｍ－ＰＥＧＳＨ（日油社製、Ｍｗ：１０，０００）を用いて、架橋を試みた。その結果、当該ＨＡＭＡは、高濃度の条件でも架橋しなかった。
［実施例３］
　実施例２で製造したＨＡＭＩＣＨ架橋ゲルに、蛍光標識インシュリン（ＦＩＴＣ－ｉｎｓｕｌｉｎ）を封入し、封入率を調べた。
　実施例２において、ヒアルロン酸誘導体の終濃度を７ｍｇ／ｍＬとした条件で製造したＨＡＭＩＣＨ架橋ゲル（６ｍｍφ、厚み１ｍｍ）を、１ｍＬのＦＩＴＣ－ｉｎｓｕｌｉｎ溶液（２５０μｇ／ｍＬ ＦＩＴＣ－ｉｎｓｕｌｉｎとなるようにＰＢＳに溶解させた溶液）に２５℃で浸漬させてインキュベートし、経時的に上澄みの蛍光強度を定量することによって、ゲル内へのＦＩＴＣ－ｉｎｓｕｌｉｎの封入率（％）を算出した。インキュベート開始から１時間経過後と８時間経過後及び２４時間経過後の封入率（％）の結果を表６及び図３に示す。また、図４には、封入後の各ゲルの様子を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　表６に示すように、コレステリル基を導入していないＨＡＭＩＣＨ架橋ゲルよりも、コレステリル基が導入されているＨＡＭＩＣＨ架橋ゲルのほうが、ＦＩＴＣ－ｉｎｓｕｌｉｎの封入率が高かった。また、コレステリル基の導入率によって、ＦＩＴＣ－ｉｎｓｕｌｉｎの封入率が影響を受けており、８時間及び２４時間インキュベート後では、コレステリル基の導入率が５～１０％で最も封入率が良好であった。図４から、目視においても、ｃｈｏｌ未導入の架橋ゲルはＦＩＴＣ由来の着色が弱いことが明確に示された。これらの結果から、本実施形態のヒアルロン酸誘導体はタンパク質等の有効成分の封入効率に優れていること、また、ステリル基の導入率を最適化することでより多量の有効成分を封入できること、が示された。
　実施例２～３の結果より、本実施形態のヒアルロン酸誘導体を用いることにより、迅速なゲル化を達成することができ、さらに、生体内での体積変化を抑制することと、タンパク質を多量に封入することを両立できる新規架橋ゲルを得ることが可能である。
　以上を鑑みて、本実施形態のヒアルロン酸誘導体から得られる架橋ゲルは、再生又は細胞分化に必要なサイトカインを多量に内包することができ、これらを放出することによって細胞の接着や分化の制御などを行う再生医療用途への応用が期待される。
［実施例４］
　マレイミド基とステリル基の両方で修飾したヒアルロン酸誘導体の架橋ゲルを製造し、凍結乾燥及び凍結融解によって架橋ゲルが膨潤平衡状態でも多孔質となるかを検証した。
　まず、実施例１と同様な方法で、コレステリル基の導入率が１９％、マレイミド基の導入率が１１％であり、蛍光Ｃｙ５を修飾したヒアルロン酸誘導体（Ｃｙ５－ＨＡＭＩＣＨ）を製造した。Ｃｙ５修飾は、Ｃｙ５－ａｍｉｎｅ（フナコシ社製、製品番号：ＢＰ－２２５５９）を用いて、ＨＡ－ＴＢＡユニットに対して０．０２等量、縮合剤としてＤＭＴ－ＭＭを０．０３等量添加することにより行った。また、コレステリル基を導入させず（導入率０％）、マレイミド基の導入率が７％であり、蛍光Ｃｙ５を修飾したヒアルロン酸誘導体（Ｃｙ５－ＨＡＭＩＣＨ）も前記と同様に製造した。次いで、各Ｃｙ５－ＨＡＭＩＣＨについて、実施例３と同様にして、マレイミド基：ＳＨ基＝１．１：１．０（モル比）の割合で架橋剤を添加してゲル化させて、架橋ゲル（直径８ｍｍφ、厚み１ｍｍ）を製造した。製造後、ＰＢＳ下で１時間静置したものを、凍結融解処理した。
　凍結融解処理は、次の通りに行った。まず、Ｃｙ５修飾ＨＡ誘導体架橋ゲルを、２５℃常温から５℃で３０分間静置し、その後－２０℃で１時間静置した後、－７８℃で２４時間静置することで、凍結乾燥処理を行った。その後、２５℃の水浴中でインキュベートすることにより、融解させた。
　各架橋ゲルについて、２光子レーザー顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を用いて、凍結乾燥処理後と融解処理後の蛍光顕微鏡画像を取得した。各架橋ゲルの蛍光顕微鏡画像を図５に示す。コレステリル基導入率１９％のＣｙ５－ＨＡＭＩＣＨ架橋ゲル（図５の上段）では、表面に直径が数十μｍの細孔が網目構造のように多数形成されている多孔質構造を有することが確認された。これに対して、コレステリル基導入率０％のＣｙ５－ＨＡＭＩＣＨ架橋ゲル（図５の下段）では、このような細孔が観察されなかった。これらの結果から、本実施形態のヒアルロン酸誘導体架橋ゲルは、細胞が浸潤して再生を促す足場として有用であると考えられた。
［実施例５］
　実施例２と同様の方法で、実施例１で製造したＨＡＭＩＣＨを架橋剤４ａｒｍ－ＰＥＧＳＨを用いて化学架橋させてＨＡＭＩＣＨ架橋ゲルを製造した。
　まず、実施例１で製造した各ＨＡＭＩＣＨを、それぞれ１０ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ７．４）に１０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように溶解させて、ＨＡＭＩＣＨ溶液を調製した。ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－２０％－Ｍａｌｅ１５％のみ、２５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように溶解した。別の容器に、１０ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ７．４）に２０ｍｇ／ｍＬの濃度で４ａｒｍ－ＰＥＧＳＨ（Ｍｗ：１０，０００）を溶解させ、ＰＥＧＳＨ溶液を調製した。両液を５℃に冷却した後に、両者を１つのバイアルに注いで混合させて、逆さバイアル試験を実施し、ゲル又はゾルの検証を行った。この時、ヒアルロン酸誘導体と４ａｒｍ－ＰＥＧＳＨの終濃度を表７になるように、ヒアルロン酸誘導体と４ａｒｍ－ＰＥＧＳＨの溶液を混合する前に、１０ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ７．４）を４ａｒｍ－ＰＥＧＳＨの溶液に適宜加えて実施した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　コレステリル基及びマレイミド基が導入されているＨＡＭＩＣＨは、試験区５－１～５－３０のいずれも、コレステリル基の導入率にかかわらず、ゲル化開始（ＨＡＭＩＣＨ溶液とＰＥＧＳＨ溶液の混合）から１～３０分間で、十分にゲル化し、架橋ゲルが形成されていた。これらの結果から、ステリル基とマレイミド基を組み合わせてヒアルロン酸に導入されたヒアルロン酸誘導体は、様々な濃度でゲル化が可能であることが示された。また、形成されるＨＡＭＩＣＨ架橋ゲルは、ゲル濃度によって薬物の封入量も変更出来ることが示唆された。
［実施例６］
　実施例５と同様の方法で、実施例１で製造したＨＡＭＩＣＨを架橋剤４ａｒｍ－ＰＥＧＳＨを用いて化学架橋させてＨＡＭＩＣＨ架橋ゲルを製造した。
　まず、実施例１で製造したコレステリル基の導入率が１５％のＨＡＭＩＣＨ（ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－１５％－Ｍａｌｅ１５％）を、１０ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ７．４）に１０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように溶解させて、ＨＡＭＩＣＨ溶液を調製した。別の容器に、１０ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ７．４）に７０ｍｇ／ｍＬの濃度で４ａｒｍ－ＰＥＧＳＨ（Ｍｗ：１０，０００）を溶解させ、ＰＥＧＳＨ溶液を調製した。両液を５℃に冷却した後に、両者を１つのバイアルに注いで混合させて、逆さバイアル試験によりゲル又はゾルの検証を行った。この時、ヒアルロン酸誘導体と４ａｒｍ－ＰＥＧＳＨの終濃度を表８になるように、ヒアルロン酸誘導体と４ａｒｍ－ＰＥＧＳＨの溶液を混合する前に、１０ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ７．４）を４ａｒｍ－ＰＥＧＳＨの溶液に適宜加えて実施した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　コレステリル基が１５％及びマレイミド基が１５％導入されているＨＡＭＩＣＨは、試験区６－１～６－２のいずれも、ゲル化開始（ＨＡＭＩＣＨ溶液とＰＥＧＳＨ溶液の混合）から３０分間で、十分にゲル化し、架橋ゲルが形成されていた。これらの結果から、ステリル基とマレイミド基を組み合わせてヒアルロン酸に導入されたヒアルロン酸誘導体は、様々な濃度でゲル化が可能であることが示された。また、形成されるＨＡＭＩＣＨ架橋ゲルは、ゲル濃度によって薬物の封入量も変更出来ることが示唆された。
［実施例７］
　マレイミド基とステリル基の両方で修飾したヒアルロン酸誘導体について、多角度光散乱法によるゲルパーミエーションクロマトグラフ（ＧＰＣ－ＭＡＬＳ）に供して分析することにより、１０ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ７．４）中での会合体の絶対分子量を算出した。
　ＭＡＬＳ検出器は、異なる散乱角θにおけるサンプル中のポリマー又は粒子からの散乱シグナルを測定する。基本的な光散乱式（Ａｎｄｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ，　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　２００３，　ｖｏｌ．７５，　ｐ．４２７９－４２９１）を下記に示す。式中、Ｒθが過剰なレイリー比であり、Ｋは光学定数であり、とりわけ、特定の屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）に依存し、ｃは溶質濃度であり、Ｍは分子量であり、Ｒｇは旋回半径であり、λは入射光の波長である。光散乱データからの分子量及び旋回半径の計算は、ゼロ角への外挿を要する（Ｗｙａｔｔ，　Ａｎａｌｙｔｉｃａ　Ｃｈｉｍｉｃａ　Ａｃｔａ，　１９９３，　ｖｏｌ．２７２（１），　ｐ．１－４０）。これは、（Ｋｃ／Ｒθ）１／２をｓｉｎ２（θ／２）の関数としていわゆるデバイプロットにプロットすることにより行われる。一般に、分子量は縦座標の切片から算出でき、旋回半径は曲線の初期傾斜から算出できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000018
　今回、ＲＩ検出器及びＭＡＬＳ検出器からのシグナルを収集し、計算を行うために、ＡＳＴＲＡ８（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）ソフトウェアを用いて解析を実施した。計算された分子量、例えば、絶対重量平均分子量Ｍｗ（絶対値）は、屈折率濃度係数ｄｎ／ｄｃをヒアルロン酸の文献値である０．１５３を用いて導き出された。測定条件及びその算出結果を以下に示す。
（測定条件）
装置　：ＳＥＣ－Ｍｕｌｔｉ　Ｄｅｔｅｃｔｏｒシステム
カラム　：Ｇ４０００ＳＷＸＬ（Ｔｏｓｏｈ社製）
ＭＡＬＳ　：ＤＷＡＮ　ＮＥＯＮ（Ｗｙａｔｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）
レーザー波長　：６６１ｎｍ
ＲＩ　：Ｏｐｔｉｌａｂ（ＮＥＯＮ社製）
溶離液　：１０ｍＭ　ＰＢ、ｐＨ７．４
流速　：０．５ｍＬ／分
打ち込み量　：５０μＬ
濃度　：１．０ｍｇ／ｍＬ
温度　：２５℃
解析ソフトウェア　：ＡＳＴＲＡ８（Ｗｙａｔｔ社製）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
　これらの結果より、コレステロールを駆動力とした会合体形成が示唆され、架橋剤非存在下においても、コレステロール及びマレイミド基で修飾されたヒアルロン酸誘導体の会合体が形成されることが示された。薬物を予めヒアルロン酸誘導体の会合体からなるナノ粒子に封入しておき、その後架橋反応を行いゲル化させることによって、ゲル化や架橋反応が薬物に与える影響を抑えられることが期待される。この方法により、架橋剤との反応性の高い薬物であっても、薬物の安定性を損なわずに薬物が封入された架橋ゲルが得られる。このヒアルロン酸誘導体の会合体への薬物封入は、インシュリンのような小さい分子量のものから、ＩＬ－４などの分子量の大きなサイトカインなどにも適用できると考えられた。
［実施例８］
　実施例３で取得した蛍光標識インシュリン（ＦＩＴＣ－ｉｎｓｕｌｉｎ）を封入したＨＡＭＩＣＨ架橋ゲルのｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるインシュリン放出試験を実施した。
　実施例３において取得した、５種類のＦＩＴＣ－ｉｎｓｕｌｉｎ封入ＨＡＭＩＣＨ架橋ゲルを、それぞれ、１ｍＬの１０％　ＦＢＳ含有ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に３７℃で浸漬させて、インキュベートし、経時的に上澄みの蛍光強度を定量することによって、各ゲルから放出されたＦＩＴＣ－ｉｎｓｕｌｉｎの放出率（％）を算出した。コレステリル基で修飾したＨＡＭＩＣＨ架橋ゲル（ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－１％－Ｍａｌｅ１５％、ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－５％－Ｍａｌｅ１５％、ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－１０％－Ｍａｌｅ１５％、及びＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－２０％－Ｍａｌｅ１５％）について、浸漬開始から２１日後までの放出率（％）の結果を図６に示す。
　コレステロールが未修飾の架橋ゲル（ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－０％－Ｍａｌｅ１５％）では、浸漬開始から１日後には、内包されていたＦＩＴＣ－ｉｎｓｕｌｉｎの全量が上澄みに放出されていた（放出率１００％）。これに対して、コレステリル基で修飾したＨＡＭＩＣＨ架橋ゲルは、図６に示すように、浸漬開始から２１日目でもＦＩＴＣ－ｉｎｓｕｌｉｎの放出率は１００％に達しておらず、ＦＩＴＣ－ｉｎｓｕｌｉｎの徐放期間が長期にわたった。これらの結果から、本実施形態のヒアルロン酸誘導体から得られる架橋ゲルは、タンパク質等の有効成分の封入効率に優れるだけではなく、徐放性能にも優れていることが示された。
　以上の実施例が示すように、本実施形態のヒアルロン酸誘導体から得られる架橋ゲルは、ゲル化が迅速であり、生体内での体積変化が抑制されていることに加えて、タンパク質等の有効成分を多量に封入することができ、かつ封入物の長期徐放性にも優れている。これらを鑑みて、本実施形態のヒアルロン酸誘導体及びこれから得られる架橋ゲルは、再生医療用途への応用が期待される。本実施形態のヒアルロン酸誘導体から得られる架橋ゲルは、再生又は細胞分化に必要なサイトカインを多量に内包させることができ、その後これらを放出することによって、細胞の接着や分化の制御などを行うことができる。
［実施例９］
　出発原料であるヒアルロン酸ナトリウム塩（ＨＡ－Ｎａ）として重量平均分子量３５ｋＤａのヒアルロン酸ナトリウム塩（ＨＡ－Ｎａ）（ブルーメージバイオテクノロジージャパンから購入）を用いたことを除いて、実施例１と同様の方法で、表１０に記載の試験区９－１の目的物（ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－１％－Ｍａｌｅ８．１％）を白色固体として得た。得られた合成物は、１Ｈ ＮＭＲ測定により構造を確認した。その結果、試験区９－１のＨＡ誘導体は、Ｃｈｏｌ導入率が１．３％、マレイミド基導入率が８．１％であった。
　また、重量平均分子量３５ｋＤａのヒアルロン酸ナトリウム塩（ＨＡ－Ｎａ）を原料とし、表１０の組成で、比較例１と同様にしてコレステリル基とメタクリル基を導入した後、実施例１と同様にしてマレイミド基を修飾し、表１０に記載の試験区９－２の目的物（ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－１７％－Ｍａｌｅ４．６％）を白色固体として得た。得られた合成物は、１Ｈ ＮＭＲ測定により構造を確認した。その結果、試験区９－２のＨＡ誘導体は、Ｃｈｏｌ導入率が１７．４％、マレイミド基導入率が４．６％、メタクリル基導入率が９．７％であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
［実施例１０］
　実施例９で製造したＨＡＭＩＣＨを架橋剤４ａｒｍ－ＰＥＧＳＨを用いて化学架橋させて、ＨＡＭＩＣＨ架橋ゲルを製造した。
　まず、試験区９－１のＨＡＭＩＣＨを、１０ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ７．４）に１４ｍｇ／ｍＬの濃度となるように溶解させて、ＨＡＭＩＣＨ溶液を調製した。別の容器に、１０ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ７．４）に７ｍｇ／ｍＬの濃度で４ａｒｍ－ＰＥＧＳＨ（Ｍｗ：１０，０００）を溶解させ、ＰＥＧＳＨ溶液を調製した。両液を５℃に冷却した後に、厚み１ｍｍ、直径６ｍｍΦのシリコンモールド内で、ヒアルロン酸に修飾されたマレイミド基と４ａｒｍ－ＰＥＧＳＨ由来のＳＨ基のモル比が１．１：１．０となるように両液を混合させて、３７℃でＨＡＭＩＣＨ架橋ゲルを製造した。この時、ヒアルロン酸誘導体の終濃度を７ｍｇ／ｍＬになるような条件で実施した。
　同様に、試験区９－２のＨＡＭＩＣＨを、１０ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ７．４）に３０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように溶解させて、ＨＡＭＩＣＨ溶液を調製した。別の容器に、１０ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ７．４）に１３ｍｇ／ｍＬの濃度で４ａｒｍ－ＰＥＧＳＨ（Ｍｗ：１０，０００）を溶解させ、ＰＥＧＳＨ溶液を調製した。両液を５℃に冷却した後に、厚み１ｍｍ、直径６ｍｍΦのシリコンモールド内で、ヒアルロン酸に修飾されたマレイミド基と４ａｒｍ－ＰＥＧＳＨ由来のＳＨ基のモル比が１．１：１．０となるように、両液を混合させて、３７℃でＨＡＭＩＣＨ架橋ゲルを製造した。この時、ヒアルロン酸誘導体の終濃度を２０ｍｇ／ｍＬになるような条件で実施した。
　コレステリル基及びマレイミド基が導入されているＨＡＭＩＣＨは、マレイミド基の導入率にかかわらず、ゲル化開始（ＨＡＭＩＣＨ溶液とＰＥＧＳＨ溶液の混合）から１～３０分間で、十分にゲル化し、架橋ゲルが形成されていた。マレイミド基の導入率が低下すると架橋点が減少し、ゲル化しにくくなることが予想されたが、これらの結果から、ステリル基とマレイミド基を組み合わせてヒアルロン酸に導入することによって、マレイミド基の導入率の範囲にかかわらず、ステリル基とメタクリル基を導入したヒアルロン酸誘導体では困難なほど迅速なゲル化が可能になることがわかった。
　さらに、ゲル化開始からのＰＢＳ中での体積変化を測定し、膨潤度を調べた。試験区９－１のＨＡＭＩＣＨの測定結果を図７（Ａ）に、試験区９－２のＨＡＭＩＣＨの測定結果を図７（Ｂ）に、それぞれ示す。図７に示すように、マレイミド基とステリル基の両方で修飾されたＨＡＭＩＣＨでは、マレイミド基の導入率に寄らず、膨潤度が小さく、ゲル化後の生体内における体積増大が抑えられるという特徴的な性質を示した。
［比較例４］
　マレイミドを修飾していないヒアルロン酸誘導体のゲル化を調べた。
　まず、マレイミドを修飾していないヒアルロン酸誘導体を合成した。具体的には、重量平均分子量３５ｋＤａ又は１００ｋＤａのヒアルロン酸ナトリウム塩（ＨＡ－Ｎａ）を原料とし、表１１の組成で、実施例１と同様にしてコレステリル基を導入し、比較試験区４－１の目的物（ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－１９％）及び比較試験区４－２の目的物（ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－４０％）を、それぞれ白色固体として得た。コレステリル６－アミノヘキシルカーバメート塩酸塩（Ｃｈｏｌ－Ｃ６塩酸塩）及びヒアルロン酸のテトラブチルアンモニウム塩（ＨＡ－ＴＢＡ）は、特許文献１の実施例１及び実施例２に記載の通りに合成した。その結果、表１１に記載の目的物（ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－１９％及びＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－４０％）を白色固体として得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
　続いて、比較試験区４－１のＨＡ誘導体（ＨＡ－Ｃ６－Ｃｈｏｌ－１９％）及び比較試験区４－２のＨＡ誘導体を、それぞれ、架橋剤４ａｒｍ－ＰＥＧＳＨを用いて化学架橋させて、ＨＡ誘導体（マレイミド未修飾）架橋ゲルの調製を行った。
　まず、比較試験区４－１及び４－２で製造した各ＨＡ誘導体（マレイミド未修飾）を、それぞれ、１０ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ７．４）に１４ｍｇ／ｍＬの濃度となるように溶解させて、ＨＡ誘導体溶液を調製した。別の容器に、１０ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ７．４）に７ｍｇ／ｍＬの濃度で４ａｒｍ－ＰＥＧＳＨ（Ｍｗ：１０，０００）を溶解させ、ＰＥＧＳＨ溶液を調製した。両液を５℃に冷却した後に、厚み１ｍｍ、直径６ｍｍΦのシリコンモールド内で、ヒアルロン酸誘導体の分子量と４ａｒｍ－ＰＥＧＳＨ由来のＳＨ基のモル比が１．１：１．０となるように、両液を混合させて、３７℃で架橋ゲルを調整した。この時、ヒアルロン酸誘導体の終濃度を７ｍｇ／ｍＬになるような条件で実施した。その結果、２４時間経過しても、ゲル化が生じなかった。本比較試験区は何れも、逆さバイアル試験でも同様な結果で、ゲル化が生じないことも確認した。
　本実施形態のヒアルロン酸誘導体によれば、ゲル化後の体積変化が小さく、かつ有効成分を徐放可能なヒアルロン酸誘導体を提供することができる。

Claims (18)

  1. 　ヒアルロン酸のグルクロン酸部分中のカルボキシル基の少なくとも一部にステリル基が導入されており、かつ、前記ヒアルロン酸のグルクロン酸部分中のカルボキシル基又はＮ－アセチルグルコサミン部分中の水酸基の少なくとも一部にマレイミド基が導入されている、ヒアルロン酸誘導体。
  2. 　前記ヒアルロン酸のグルクロン酸部分中のカルボキシル基の少なくとも一部にマレイミド基が導入されている、請求項１に記載のヒアルロン酸誘導体。
  3. 　前記ヒアルロン酸誘導体に対する前記ステリル基の導入率と前記マレイミド基の導入率の合計が、４５％未満である、請求項１に記載のヒアルロン酸誘導体。
  4. 　前記ヒアルロン酸誘導体に対する前記ステリル基の導入率が、０．５％以上３０％以下である、請求項１に記載のヒアルロン酸誘導体。
  5. 　前記ヒアルロン酸誘導体に対する前記マレイミド基の導入率が、１．０％以上２５％以下である、請求項１に記載のヒアルロン酸誘導体。
  6. 　下記一般式（Ｉ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［一般式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミル及びＣ１－６アルキルカルボニルからなる群より選択される基であり；
    　Ｚは、直接結合、又は２個以上３０個以下の任意のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを表し；
    　Ｘ１は、－ＮＲｂ－Ｒ、－ＮＲｂ－ＣＯＯ－Ｒ、－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｒ、－ＮＲｂ－ＣＯ－ＮＲｃ－Ｒ、－ＣＯＯ－Ｒ、－Ｏ－ＣＯＯ－Ｒ、－Ｓ－Ｒ、－ＣＯ－Ｙａ－Ｓ－Ｒ、－Ｏ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、－ＮＲｂ－ＣＯ－Ｙｂ－Ｓ－Ｒ、及び－Ｓ－Ｓ－Ｒで表される基からなる群より選択される基であり；
    　Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキル及びヒドロキシＣ２－２０アルキルからなる群より選択される基であり、前記Ｒａ、前記Ｒｂ及び前記Ｒｃのアルキル部分は、－Ｏ－及び－ＮＲｆ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
    　前記Ｒｆは、水素原子、Ｃ１－１２アルキル、アミノＣ２－１２アルキル及びヒドロキシＣ２－１２アルキルからなる群より選択される基であり、前記Ｒｆのアルキル部分は、－Ｏ－及び－ＮＨ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
    　Ｒは、ステリル基であり；
    　Ｙは、Ｃ２－３０アルキレン、又は－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－であり、前記Ｙのアルキレン部分は、－Ｏ－、－ＮＲｇ－及び－Ｓ－Ｓ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
    　Ｒｇは、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキル及びヒドロキシＣ２－２０アルキルからなる群より選択される基であり、前記Ｒｇのアルキル部分は、－Ｏ－及び－ＮＨ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
    　Ｙａは、Ｃ１－５アルキレンであり；
    　Ｙｂは、Ｃ２－８アルキレン又はＣ２－８アルケニレンであり；
    　ｍは、１以上１００以下の整数である。］
    で表される繰り返し単位を１以上有しており、下記一般式（ＩＩ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     ［一般式（ＩＩ）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１－６アルキル、ホルミル及びＣ１－６アルキルカルボニルからなる群より選択される基であり；
    　Ｚは、直接結合、又は２個以上３０個以下の任意のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを表し；
    　Ｘ２は、マレイミド基であり；
    　Ｒａは、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキル及びヒドロキシＣ２－２０アルキルからなる群より選択される基であり、前記Ｒａのアルキル部分は、－Ｏ－及び－ＮＲｆ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
    　Ｙは、Ｃ２－３０アルキレン、又は－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－であり、前記Ｙのアルキレン部分は、－Ｏ－、－ＮＲｇ－及び－Ｓ－Ｓ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
    　Ｒｇは、水素原子、Ｃ１－２０アルキル、アミノＣ２－２０アルキル及びヒドロキシＣ２－２０アルキルからなる群より選択される基であり、前記Ｒｇのアルキル部分は、－Ｏ－及び－ＮＨ－からなる群より選択される基が挿入されていてもよく；
    　ｍは、１以上１００以下の整数である。］
    で表される繰り返し単位を１以上有している、請求項１に記載のヒアルロン酸誘導体。
  7. 　前記ステリル基はコレステリル基である、請求項１に記載のヒアルロン酸誘導体。
  8. 　濃度が１ｍｇ／ｍＬでリン酸緩衝液（１０ｍＭ）に溶解されたヒアルロン酸誘導体の動的光散乱法で算出されるｚ平均粒子径が、２５０ｎｍ以下である、請求項１に記載のヒアルロン酸誘導体。
  9. 　請求項１～８のいずれか一項に記載のヒアルロン酸誘導体を、２以上の架橋性基を有する架橋剤と反応させてゲル化させる、ヒアルロン酸誘導体架橋ゲルの製造方法。
  10. 　前記架橋性基が、チオール基である、請求項９に記載のヒアルロン酸誘導体架橋ゲルの製造方法。
  11. 　請求項１～８のいずれか一項に記載のヒアルロン酸誘導体が、２以上の架橋性基を有する架橋剤により化学架橋されたゲル状物である、ヒアルロン酸誘導体架橋ゲル。
  12. 　前記架橋性基が、チオール基である、請求項１１に記載のヒアルロン酸誘導体架橋ゲル。
  13. 　膨潤度が１１５％以下である、請求項１１に記載のヒアルロン酸誘導体架橋ゲル。
  14. 　請求項１～８のいずれか一項に記載のヒアルロン酸誘導体を、２以上の架橋性基を有する架橋剤により化学架橋されたゲル状物の乾燥物である、ヒアルロン酸誘導体架橋ゲル乾燥物。
  15. 　多孔質構造体である、請求項１４に記載のヒアルロン酸誘導体架橋ゲル乾燥物。
  16. 　請求項１～８のいずれか一項に記載のヒアルロン酸誘導体を含む、医薬組成物。
  17. 　請求項１～８のいずれか一項に記載のヒアルロン酸誘導体が２以上の架橋性基を有する架橋剤により化学架橋されたゲル状物であるヒアルロン酸誘導体架橋ゲルを含む、医薬組成物。
  18. 　さらに、有効成分を含む、請求項１７に記載の医薬組成物。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2008136536A1 (ja) * 2007-05-01 2008-11-13 National University Corporation Tokyo Medical And Dental University 化学架橋ヒアルロン酸誘導体を含むハイブリッドゲルおよびそれを用いた医薬組成物
WO2010053140A1 (ja) * 2008-11-05 2010-05-14 国立大学法人 東京医科歯科大学 ヒアルロン酸誘導体、およびその医薬組成物
WO2021086072A1 (ko) * 2019-10-31 2021-05-06 부산대학교 산학협력단 공중합체를 이용한 광가교형 생분해성 조직접착제 제조
WO2022108264A1 (ko) * 2020-11-20 2022-05-27 주식회사 에스엔비아 광가교형 공중합 히알루론산 스펀지 및 이의 제조방법

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008136536A1 (ja) * 2007-05-01 2008-11-13 National University Corporation Tokyo Medical And Dental University 化学架橋ヒアルロン酸誘導体を含むハイブリッドゲルおよびそれを用いた医薬組成物
WO2010053140A1 (ja) * 2008-11-05 2010-05-14 国立大学法人 東京医科歯科大学 ヒアルロン酸誘導体、およびその医薬組成物
WO2021086072A1 (ko) * 2019-10-31 2021-05-06 부산대학교 산학협력단 공중합체를 이용한 광가교형 생분해성 조직접착제 제조
WO2022108264A1 (ko) * 2020-11-20 2022-05-27 주식회사 에스엔비아 광가교형 공중합 히알루론산 스펀지 및 이의 제조방법

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