[go: up one dir, main page]

WO2025062975A1 - 前処理方法、分析方法、プログラムおよび分析システム - Google Patents

前処理方法、分析方法、プログラムおよび分析システム Download PDF

Info

Publication number
WO2025062975A1
WO2025062975A1 PCT/JP2024/030693 JP2024030693W WO2025062975A1 WO 2025062975 A1 WO2025062975 A1 WO 2025062975A1 JP 2024030693 W JP2024030693 W JP 2024030693W WO 2025062975 A1 WO2025062975 A1 WO 2025062975A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sample
analysis
infrared
acidic solution
pretreatment
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/JP2024/030693
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
華奈江 寺本
貴久 荒木
里砂 藤
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shimadzu Corp
Original Assignee
Shimadzu Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shimadzu Corp filed Critical Shimadzu Corp
Publication of WO2025062975A1 publication Critical patent/WO2025062975A1/ja
Pending legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
    • G01N21/31—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry
    • G01N21/35—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry using infrared light
    • G01N21/3563—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry using infrared light for analysing solids; Preparation of samples therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/62—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating the ionisation of gases, e.g. aerosols; by investigating electric discharges, e.g. emission of cathode
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material

Definitions

  • the present invention relates to a pretreatment method, an analysis method, a program, and an analysis system, and more specifically to a pretreatment method, an analysis method, a program, and an analysis system for a sample containing cells.
  • Non-Patent Document 1 discloses a study in which cultured Staphylococcus aureus is suspended in an aqueous ethanol solution contained in a tube together with a sterile metal rod, and then the cells are disrupted by being placed in a vortex mixer, after which the strain is identified by infrared spectroscopy.
  • the present disclosure has been made to solve such problems, and its purpose is to provide a method for pretreatment of samples containing biological cells for infrared spectroscopic analysis that enables cell disruption in a simple manner.
  • the pretreatment method according to the first aspect of the present disclosure is a method for pretreatment of a sample containing biological cells for infrared spectroscopic analysis, and includes the steps of preparing a first acidic solution containing an organic acid and contacting the cells with the first acidic solution.
  • An analytical system includes an infrared spectrophotometer and a mass spectrometer.
  • the infrared spectrophotometer performs infrared spectroscopy analysis of an analytical sample obtained by pretreating a sample containing biological cells by contacting the cells with a first acidic solution containing an organic acid.
  • the mass spectrometer performs mass analysis of the analytical sample.
  • the present invention provides a method for pre-treating samples containing biological cells for infrared spectroscopic analysis that allows for simple cell disruption.
  • FIG. 1 is a schematic diagram illustrating a configuration of an analysis system according to an embodiment.
  • FIG. 1 is a diagram showing an example of an infrared spectrum from Experiment 1.
  • FIG. 1 shows the results of microorganism discrimination based on infrared spectra in Experiment 1.
  • FIG. 13 is a diagram showing an example of an infrared spectrum from Experiment 2.
  • FIG. 13 shows the results of microorganism discrimination based on infrared spectra in Experiment 2.
  • FIG. 13 is a diagram showing an example of an infrared spectrum of Experiment 3.
  • FIG. 13 shows the results of microorganism discrimination based on infrared spectra in Experiment 3.
  • FIG. 13 is a diagram showing an example of an infrared spectrum from Experiment 4.
  • FIG. 13 shows the results of microorganism discrimination based on infrared spectra in Experiment 4.
  • FIG. 13 shows the mass spectrum of Experiment 5.
  • % of a solution means “volume %” unless otherwise specified.
  • the analysis method according to the present embodiment includes the pretreatment method according to the present embodiment.
  • pretreatment refers to preparation of a sample containing biological cells for infrared spectroscopic analysis.
  • the analysis system 100 includes an analysis unit 10 and a control device 4.
  • the analysis unit 10 includes a pre-processing unit 1, an infrared spectrophotometer 2, and a mass spectrometer 3.
  • the pretreatment section 1 is a section that pretreats samples containing biological cells.
  • the pretreatment section 1 is realized by an analyst using laboratory equipment.
  • the pretreatment section 1 is an automatic pretreatment section (not shown) controlled by the control section 4.
  • the automatic pretreatment section may include an autosampler (not shown).
  • a sample containing biological cells cultured in an incubator or the like (not shown) and before being pretreated by the pretreatment section 1 is referred to as a "cultured sample.”
  • a cultured sample corresponds to one embodiment of a “sample.”
  • analytical sample a sample that is subjected to analysis after being pretreated by the pretreatment section 1
  • At least a portion of the analytical sample prepared by the pretreatment section 1 is subjected to infrared spectroscopy analysis in the infrared spectrophotometer 2.
  • a portion of the analytical sample prepared by the pretreatment section 1 may be subjected to mass spectrometry in the mass spectrometer 3.
  • the sample containing biological cells contains microbial cells. This allows for microbial analysis that is useful in industrial, medical, and other fields.
  • the sample containing biological cells may contain cells of organisms other than microorganisms (e.g., animals and plants). This may allow for analytical results that are useful in industrial, medical, and other fields, depending on the type of cells.
  • the sample containing biological cells is a culture sample in which biological cells have been cultured.
  • the sample containing biological cells contains biological cells collected from the environment.
  • the sample containing biological cells is a portion of tissue collected from a living animal or plant.
  • the type of microorganism includes at least one systematic taxonomic classification of the genotype, strain, subspecies, species, genus, and family of the microorganism. Furthermore, the determination of the type of microorganism includes the classification, identification, and discrimination of the type of the microorganism. Hereinafter, the determination of the type of microorganism is also simply referred to as the determination of the microorganism.
  • the infrared spectrophotometer 2 performs infrared spectroscopy of the analytical sample. Specifically, the infrared spectrophotometer 2 irradiates the analytical sample with infrared light and separates the transmitted or reflected light to obtain an infrared spectrum.
  • the infrared spectrophotometer 2 is a Fourier transform infrared spectrophotometer (FT-IR).
  • FT-IR Fourier transform infrared spectrophotometer
  • the infrared spectrum exhibits a shape corresponding to the substances contained in the analytical sample.
  • Microorganism cells contain different types of substances or different amounts of the same type of substance depending on the type of microorganism.
  • composition such a combination of the types and/or amounts of substances contained in a cell is referred to as a "composition.” Since the composition of cells differs for each type of microorganism, different types of microorganisms exhibit infrared spectra with different shapes.
  • the infrared spectrophotometer 2 transmits the acquired infrared spectrum to the control device 4.
  • the mass spectrometer 3 performs mass analysis on the analytical sample. Specifically, the mass spectrometer 3 ionizes the substances contained in the analytical sample, separates the ions S according to the time of flight correlated with the mass-to-charge ratio (m/z), and detects them to obtain a mass spectrum. In one embodiment, the mass spectrometer 3 ionizes the substances in the analytical sample by a matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) method.
  • MALDI matrix-assisted laser desorption/ionization
  • the mass spectrometer 3 is, for example, a MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry).
  • the substances contained in the analytical sample are detected as peaks corresponding to their m/z. Therefore, different types of microorganisms show mass spectra with peaks at different positions.
  • the mass spectrometer 3 transmits the acquired mass spectrum to the control device 4.
  • the control device 4 includes a processor 41 and a memory 42.
  • the control device 4 is a computer.
  • the processor 41 is typically an arithmetic processing unit such as a CPU (Central Processing Unit) or an MPU (Micro Processing Unit).
  • the processor 41 controls the operation of the analysis system 100 by reading and executing a program stored in the memory 42.
  • the processor 41 can automatically perform the analysis method described in this embodiment by executing a program stored in the memory 42 that causes the analysis method described in this embodiment to be performed.
  • Memory 42 is realized by non-volatile memory such as RAM (Random Access Memory), ROM (Read Only Memory) and flash memory. Memory 42 stores programs executed by processor 41, data used by processor 41, etc.
  • the display 43 is composed of, for example, a liquid crystal panel capable of displaying images.
  • the display 43 displays images related to the acceptance of user operation input, and displays the results of processing by the processor 41.
  • the control device 4 receives the infrared spectrum from the infrared spectrophotometer 2 via an input/output interface (not shown). The control device 4 determines the type of microorganism based on the shape of the infrared spectrum. The control device 4 receives the mass spectrum from the mass spectrometer 3 via an input/output interface (not shown). The control device 4 determines the type of microorganism based on the position (m/z) of the peak in the mass spectrum.
  • the control device 4 may be composed of multiple computers. In addition, some or all of the functions of the control device 4 described above may be located in an electronic computer, server, etc. that is physically separated from the analysis unit 10.
  • Non-Patent Document 1 discloses a method of crushing cells suspended in an aqueous ethanol solution using beads and performing infrared spectroscopy.
  • beads crushing method the analyst must perform delicate and skillful tasks such as inserting and removing the beads.
  • components derived from the crushed cells adhere to the beads and are lost when the beads are collected, a large amount of cells must be prepared in order to analyze the components remaining in the ethanol aqueous solution.
  • the bead crushing method had the problem that it was time-consuming and laborious to obtain samples for analysis. This problem was particularly evident when processing multiple samples.
  • the bead crushing method uses beads, it is not easy to implement it in general automated analyzers that perform tasks such as dispensing and adding liquids.
  • the pretreatment method according to this embodiment is a method for pretreatment of a sample containing biological cells for infrared spectroscopic analysis, and includes a "preparation step” of preparing a first acidic solution containing an organic acid, and a “contact step” of contacting the cells with the first acidic solution.
  • the sample may include cells derived from prokaryotes or may include cells derived from eukaryotes.
  • the sample is typically derived from microorganisms and may include unknown microorganisms.
  • Prokaryotes include bacteria and archaea.
  • Bacteria include Escherichia bacteria (such as Escherichia coli), Bacillus bacteria (such as Bacillus subtilis), Lactobacillus bacteria (such as Lactic acid bacteria), Synechocystis bacteria (such as Cyanobacteria), Mycobacteria bacteria (such as Actinomycetes), and the like.
  • Archaea include Methanophilus, Methanococcus, Thermococcus, Phyllococcus, and the like.
  • Eukaryotes include animals, plants, fungi, and protists.
  • Fungi include filamentous fungi, yeasts, mushrooms, molds, and the like, and include chytridiomycota, zygomycota, ascomycota, basidiomycota, glomomycota, microsporidia, and the like.
  • the Ascomycota includes the genus Aspergillus (such as Aspergillus oryzae), the genus Penicillium (such as blue mold), the genus Saccharomyces (such as budding yeast), etc.
  • the sample is a cell (body) of a fungus in the broad sense including the above-mentioned bacteria, archaea, and fungi.
  • the sample to be contacted with the first acidic solution may be in a liquid or solid form. More specifically, the sample may be, for example, a liquid containing a culture solution of bacteria, or a colony of bacteria cultured on a solid medium scooped up with a toothpick or the like.
  • the culture solution of the bacteria contains bacteria and a medium for culturing the bacteria.
  • the amount of bacteria in the sample may be smaller than that in the conventional bead crushing method.
  • the acid is, for example, an organic acid such as formic acid, trifluoroacetic acid, or lactic acid, which is commonly used in biological experiments. These organic acids are easy to obtain, and even if a person skilled in the art uses them in the pretreatment of infrared spectroscopy and mass spectrometry, they do not adversely affect the measurement results.
  • Other examples of acids are acids with an acid dissociation constant (pKa) of 0.2 to 5, more preferably 0.2 to 4.
  • the acids with a dissociation constant of 0.2 to 5 overlap in part with the examples of acids above, and are, for example, at least one of trifluoroacetic acid, oxalic acid, glycine, salicylic acid, formic acid, lactic acid, benzoic acid, acetic acid, and butyric acid.
  • the examples of acids above are not limited to these.
  • the organic acid is formic acid.
  • inorganic acids are also used in the same way.
  • the acid contained in the first acidic solution may be one type of acid (pure substance) or a mixture of multiple types of acids.
  • acid refers to a pure substance (e.g., 100% formic acid).
  • a solution in which an acid is diluted to a predetermined concentration using a solvent is referred to as a "first acidic solution.”
  • the solvent typically contains water.
  • the water is preferably pure water, ultrapure water, or ion-exchanged water.
  • the solvent may contain an organic solvent in addition to or instead of water, within the range in which the effects of the pretreatment method according to this embodiment are achieved.
  • the organic solvent is, for example, an organic solvent having polarity.
  • the organic solvent is, for example, acetonitrile, methanol, or ethanol.
  • the preparation step may be a step of preparing a first acidic solution by diluting an acid to a predetermined concentration using a solvent, or a step of placing an already prepared first acidic solution on a laboratory bench or injecting it into an automatic pretreatment device.
  • the preparation step is not particularly limited in its form as long as the first acidic solution can be prepared for contacting the cells with the first acidic solution in the next contact step.
  • the mixing ratio of the first acidic solution and the sample is not limited within the range in which the effect of the pretreatment method according to this embodiment is achieved, but for example, the sample is mixed in a volume ratio of 1/2 or less and 1/1000 or more of the first acidic solution.
  • the amount of components other than cells contained in the sample for example, the liquid medium used for cell culture
  • the sample before mixing with the first acidic solution is centrifuged, the supernatant is removed, the remaining precipitate (cells) is collected, and the collected precipitate is mixed with the first acidic solution. It is further preferable to further centrifuge the precipitate with ultrapure water or the like.
  • the acid content (concentration) and pH of the second acidic solution are almost unchanged from those of the first acidic solution.
  • the first acidic solution and the second acidic solution may be collectively referred to as "acidic solutions”.
  • the first acidic solution is 50-90% trifluoroacetic acid, preferably 60-80% trifluoroacetic acid, and more preferably 65-75% trifluoroacetic acid.
  • the second acidic solution is trifluoroacetic acid at the above concentration containing cells.
  • a specific means for the "contact step” is a means for contacting (e.g. placing) the cells with an object (e.g. cloth) that has been soaked in the first acidic solution.
  • the specific means for the "contact step” is not limited to the extent that the effect of the pretreatment method according to this embodiment is achieved.
  • the second acidic solution preferably further contains acetonitrile.
  • concentration of acetonitrile is, for example, 30% to 70%, preferably 40% to 60%, and more preferably about 50% based on the second acidic solution.
  • the inventors have found that the cell destruction efficiency is further improved by including acetonitrile in the second acidic solution.
  • the analytical sample can be dried uniformly and in a short time after dropping the analytical sample onto the sample plate. This can improve the analytical accuracy.
  • the second acidic solution also contains cell wall components and the like.
  • Cell wall components are not as diverse as cytoplasmic components, and therefore are not suitable for distinguishing microorganisms. If the second acidic solution is subjected to infrared spectroscopy as it is, not only the cytoplasmic components but also the cell wall components are reflected in the infrared spectrum. Therefore, by precipitating the cell wall components by centrifugation and collecting only the supernatant containing the cytoplasmic components and the like, the spectral components corresponding to the cell wall components are removed, while the spectral components corresponding to the cytoplasmic components remain. This results in sharper peaks in the infrared spectrum, improving the accuracy of biological classification.
  • the pretreatment method according to this embodiment preferably further includes a step of dispersing the cells in an ethanol aqueous solution before the "contact step".
  • concentration of ethanol in the ethanol aqueous solution is, for example, 70% to 90% based on the ethanol aqueous solution, preferably 75% to 85% and more preferably about 80%.
  • the ethanol destroys secretions on the cell surface to disperse the cells or shrinks the cells, which makes the cell disruption by the organic acid treatment even more powerful. Therefore, the efficiency of elution of cytoplasmic components can be further improved.
  • the pretreatment method according to this embodiment preferably includes a step of performing centrifugation and removing the supernatant (ethanol) after the step of dispersing the cells in an ethanol aqueous solution.
  • the analytical method according to the embodiment includes a "drying step” in which a predetermined amount of the analytical sample obtained by the pretreatment method according to the embodiment is dropped onto a sample plate and dried to produce a dried product, and an “analysis step” in which an infrared spectrum is obtained by performing infrared spectroscopy on the dried product using Fourier transform infrared spectroscopy. This makes it possible to accurately analyze cytoplasmic components contained in the analytical sample.
  • the analytical method according to the embodiment may further include a step of classifying the organism from which the analytical sample is derived (the organism contained in the culture sample) by cluster analysis of the infrared spectrum. This allows the organism from which the analytical sample is derived to be classified in a simple manner based on the infrared spectrum. As shown in the experimental example described below, the analytical method according to the present embodiment allows for simple pre-processing while obtaining infrared spectra with sufficient accuracy to distinguish microorganisms by cluster analysis. This allows the work of pre-processing and organism identification to be carried out in a short period of time.
  • the analytical method of this embodiment may further include the steps of adding a matrix substance to the analytical sample, and performing mass spectrometry by matrix-assisted laser desorption/ionization on the analytical sample to which the matrix substance has been added to obtain a mass spectrum.
  • the analytical sample pretreated for infrared spectrometry can also be subjected to mass spectrometry. This eliminates the need to newly prepare a sample for mass spectrometry.
  • the results of infrared spectrometry and mass spectrometry can be compared for the same analytical sample obtained by pretreating the same culture sample under the same conditions.
  • the analyst drops a portion of the analytical sample prepared in a container such as a tube onto a sample plate for infrared spectroscopy, and performs infrared spectroscopy.
  • the analyst then adds a matrix solution containing a matrix substance to at least a portion of the analytical sample remaining in the tube, drops a portion of the analytical sample in the tube onto a sample plate for mass spectrometry, and performs mass spectrometry.
  • the analyst may add the matrix solution directly to at least a portion of the analytical sample remaining in the tube, or may dispense a portion of the analytical sample remaining in the tube and add the matrix solution to the dispensed analytical sample.
  • the matrix solution may also be added to a dried material prepared on a sample plate for mass spectrometry, and mass spectrometry may be performed.
  • the sample plate for infrared spectrometry can also be used for mass spectrometry, in other words, when the sample plate for the infrared spectrophotometer 2 and the mass analyzer 3 can be shared, the dried material prepared on the shared sample plate may be subjected to infrared spectrometry, and then the matrix solution may be added and mass spectrometry may be performed.
  • mass spectrometry can be performed simply by adding a matrix solution to the dried material after it has been used in infrared spectroscopic analysis. This eliminates the need to drip new analytical samples onto a sample plate for mass spectrometry.
  • the analysis method further includes a step of displaying the analysis results from infrared spectroscopy and the analysis results from mass spectrometry.
  • the processor 41 displays the infrared spectrum, the organism classification results based on the infrared spectrum, the mass spectrum, the organism classification results based on the mass spectrum, etc. on the display 43.
  • the organism classification results are displayed, for example, in the form of a dendrogram (phylogenetic tree).
  • the analysis method according to the embodiment described above may be performed by an analyst operating the infrared spectrophotometer 2, the mass spectrometer 3, and/or the control device 4.
  • the analysis method may also be performed by the control device 4 controlling the entire analysis system as an automatic analysis system.
  • the processor 41 may execute a predetermined program stored in the memory 42 to inject an analysis sample prepared in the pretreatment unit 1 into the infrared spectrophotometer 2 and the mass spectrometer 3, and control the infrared spectrophotometer 2 and the mass spectrometer 3 to perform the analysis.
  • the analyst can reduce the labor of the analyst compared to when the analyst manually prepares an analysis sample, injects it into the infrared spectrophotometer 2 and the mass spectrometer 3, and operates the infrared spectrophotometer 2 and the mass spectrometer 3. In addition, it becomes easier to perform the analysis accurately and to analyze a large amount of samples.
  • the above four strains are hereinafter referred to simply as paracasei NBRC 15889 paracasei NBRC 3953 tolerans JCM 1171 tolerans NBRC 15906T It is also called.
  • Paracasei subsp. paracasei and paracasei subsp. tolerans are subspecies.
  • Paracasei NBRC 15889 and paracasei NBRC 3953 are different strains of the same subspecies.
  • Tolerans JCM 1171 and tolerans NBRC 15906T are the same strain but purchased from different sources. Specifically, tolerans JCM 1171 was purchased via the RIKEN Institute, and tolerans NBRC 15906T was purchased via the National Institute of Technology and Evaluation. Therefore, the difference between tolerans JCM 1171 and tolerans NBRC 15906T is the difference in gene mutations that occurred during passage in the two institutions.
  • Experiment 1 Pretreatment and analysis in Experiment 1 were carried out as follows. (1) The cells were dispersed in 200 ⁇ L of distilled water to an OD of about 1. (2) 800 ⁇ L of ethanol was added to disperse the cells, and the supernatant obtained by centrifugation was removed. (3) 50 ⁇ L of a 70% formic acid solution was added to redisperse the precipitated cells. (4) 50 ⁇ L of acetonitrile was further added and mixed to prepare a formic acid/acetonitrile mixed aqueous solution. In Experiment 1, the formic acid/acetonitrile mixed aqueous solution corresponds to one example of the “analytical sample”.
  • the absorbance was relatively uniformly higher than in the subsequent experiments 2 to 4, and the peak was not clear. Therefore, it was considered that the spectrum was saturated in the wave number range because the amount of protein in the dried product was too large. In other words, it was considered that in the wave number range, too much light was absorbed, making it difficult to see the peaks showing the characteristics of the microorganisms.
  • Figure 3 is a dendrogram showing the microbial discrimination results obtained by cluster analysis of the infrared spectra in Figure 2.
  • the horizontal axis in Figure 3 represents the distance between each cluster.
  • Each cluster was classified at the level of line L1.
  • the three infrared spectra obtained for each strain are referred to as Strain Name-1, Strain Name-2, and Strain Name-3, respectively.
  • paracasei subsp. paracasei and paracasei subsp. tolerans were separated into different clusters.
  • paracasei subsp. paracasei paracasei NBRC 3953 and paracasei NBRC 15889 were separated into different clusters.
  • experiment 1 subspecies and different strains were separated.
  • paracasei subsp. tolerans could not be separated from tolerans JCM 1171 and tolerans NBRC 15906T.
  • Pretreatment in experiment 2 was carried out as follows. (1) The cells were dispersed in 200 ⁇ L of distilled water to an OD of about 1. (2) 800 ⁇ L of ethanol was added to disperse the cells, and the supernatant obtained by centrifugation was removed. (3) 50 ⁇ L of a 70% formic acid solution was added to redisperse the precipitated cells. (4) 50 ⁇ L of acetonitrile was further added and mixed to prepare a formic acid/acetonitrile mixed aqueous solution. In Experiment 2, the formic acid/acetonitrile mixed aqueous solution corresponds to one example of the “analytical sample”.
  • FIG. 4 is a diagram showing an example of an infrared spectrum obtained as a result of experiment 2.
  • FIG. 4 shows an infrared spectrum obtained by analyzing one dried product of B. tolerans NBRC 15906T.
  • the horizontal axis of FIG. 4 indicates the frequency (wave number) of infrared light.
  • the vertical axis indicates absorbance. Referring to FIG. 4, for the wave number range indicated by the frame 93, the saturation observed in FIG. 2 is eliminated, and a peak is detected. This was considered to reflect a decrease in the amount of protein in the dried product.
  • Figure 5 is a dendrogram showing the microbial discrimination results obtained by cluster analysis of the infrared spectra in Figure 4.
  • the horizontal axis of Figure 5 represents the distance between each cluster.
  • Each cluster was classified at the level of line L2.
  • the three infrared spectra obtained for each strain are referred to as Strain Name-1, Strain Name-2, and Strain Name-3, respectively.
  • paracasei subsp. tolerans could not be isolated from JCM 1171 and NBRC 15906T.
  • Experiment 3 was a modification of the pretreatment (4) in Experiment 2. Specifically, in Experiment 2 (4), the sample mixed with acetonitrile was dropped directly onto the sample plate, whereas in Experiment 4 (4), the sample mixed with acetonitrile was centrifuged and the supernatant was dropped onto the sample plate.
  • Pretreatment in experiment 3 was carried out as follows. (1) The cells were dispersed in 200 ⁇ L of distilled water to an OD of about 1. (2) 800 ⁇ L of ethanol was added to disperse the cells, and the supernatant obtained by centrifugation was removed. (3) 50 ⁇ L of a 70% formic acid solution was added to redisperse the precipitated cells. (4) 50 ⁇ L of acetonitrile was further added and mixed to prepare a formic acid/acetonitrile mixed aqueous solution. The formic acid/acetonitrile mixed aqueous solution was then centrifuged (10,000 g, 1 minute) to obtain a supernatant.
  • the supernatant of the formic acid/acetonitrile mixed aqueous solution corresponds to one example of the “analytical sample”.
  • FIG. 6 is a diagram showing an example of an infrared spectrum obtained as a result of Experiment 3.
  • FIG. 6 shows an infrared spectrum obtained by analyzing one dried product of subsp. tolerans NBRC 15906T.
  • the horizontal axis of FIG. 6 indicates the frequency (wave number) of infrared light.
  • the vertical axis indicates absorbance. Referring to FIG. 6, the peak is sharper in the wave number range indicated by the frame 95 than in FIG. 4. This was thought to be because in Experiment 4, cell walls and the like were removed as precipitates in the pretreatment (4).
  • the absorbance in Figure 6 is weaker than in Figure 4.
  • the maximum absorbance in Figure 4 is approximately 0.35
  • the maximum absorbance in Figure 6 is approximately 0.12.
  • the difference in absorbance between Figures 4 and 6 is thought to be due to the reduction in the amount of protein in the analytical sample caused by centrifugation in pretreatment (4). Therefore, since the absorbance of the infrared spectrum in Figure 6 is generally low, it is possible that it contains a relatively large amount of noise.
  • Figure 7 is a dendrogram showing the microbial discrimination results obtained by cluster analysis of the infrared spectra in Figure 6.
  • the horizontal axis in Figure 7 represents the distance between each cluster.
  • Each cluster was classified at the level of line L3.
  • the three infrared spectra obtained for each strain are referred to as Strain Name-1, Strain Name-2, and Strain Name-3, respectively.
  • the pretreatment in Experiment 4 was a modification of (5) of the pretreatment in Experiment 3. Specifically, the amount of the supernatant (analytical sample) of the formic acid/acetonitrile mixed aqueous solution dropped onto the sample plate in (5) was increased from 2 ⁇ L to 10 ⁇ L.
  • Pretreatment in Experiment 4 was carried out as follows. (1) The cells were dispersed in 200 ⁇ L of distilled water to an OD of about 1. (2) 800 ⁇ L of ethanol was added to disperse the cells, and the supernatant obtained by centrifugation was removed. (3) 50 ⁇ L of a 70% formic acid solution was added to redisperse the precipitated cells. (4) 50 ⁇ L of acetonitrile was further added and mixed to prepare a formic acid/acetonitrile mixed aqueous solution. The formic acid/acetonitrile mixed aqueous solution was then centrifuged (10,000 g, 1 minute) to obtain a supernatant.
  • the supernatant of the formic acid/acetonitrile mixed aqueous solution corresponds to one example of the "analytical sample”.
  • FIG. 8 is a diagram showing an example of an infrared spectrum obtained as a result of experiment 4.
  • FIG. 8 shows an infrared spectrum obtained by analyzing one dried product of subsp. tolerans NBRC 15906T.
  • the horizontal axis of FIG. 8 indicates the frequency (wave number) of infrared light.
  • the vertical axis indicates absorbance. Referring to FIG. 8, the peak is sharper than that of FIG. 6 in the wave number range indicated by the frame 96.
  • Figure 9 is a dendrogram showing the results of the discrimination of microorganisms obtained by cluster analysis of the infrared spectra in Figure 8.
  • the horizontal axis in Figure 9 represents the distance between each cluster.
  • Each cluster was classified at the level of line L4.
  • the three infrared spectra obtained for each strain are referred to as Strain Name-1, Strain Name-2, and Strain Name-3, respectively.
  • the distance between the tolerans NBRC 15906T cluster and the tolerans JCM 1171 cluster was smaller than the distance between the paracasei NBRC 3953 cluster and the paracasei NBRC 15889 cluster (distance between clusters of different strains of the same subspecies).
  • the distance between the tolerans NBRC 15906T cluster and the tolerans JCM 1171 cluster was larger than the distance between the paracasei NBRC 3953 cluster and the paracasei NBRC 15889 cluster (distance between clusters of different strains of the same subspecies).
  • the difference in protein sequence between the same strains of the same subspecies is smaller than the difference in protein sequence between different strains of the same subspecies, so the dendrogram in experiment 4 was considered to represent the actual situation more accurately than the dendrogram in experiment 3.
  • the pretreatment method of Experiment 4 was considered to be a method capable of classifying microorganisms more accurately than the pretreatment method of Experiment 3.
  • infrared spectroscopy of the analytical samples prepared by each pretreatment in Experiments 1 to 4 allowed the microorganisms to be identified at the subspecies level. This is believed to reflect the fact that cell disruption for infrared spectroscopy could be performed appropriately using a simple method that does not require bead crushing, and that as a result, infrared spectra with different shapes were obtained for each subspecies.
  • Experiment 5 The analysis of Experiment 5 was carried out as follows. (1) 1 ⁇ L of the supernatant (analysis sample) of the formic acid/acetonitrile mixture prepared in Experiment 4 was dropped onto a sample plate and dried. (2) 1 ⁇ L of CHCA solution was dropped onto the dried product obtained in (1) and dried to obtain a mixed crystal of the sample and the matrix substance.
  • the CHCA solution was prepared by dissolving CHCA in a 40% acetonitrile/10% ethanol aqueous solution containing 1% TFA so that the CHCA concentration was 10 mg/mL.
  • Figure 10 shows the mass spectra obtained as a result of experiment 5.
  • the horizontal axis of Figure 10 indicates m/z, and the vertical axis indicates signal intensity.
  • the mass spectra of the same subspecies of paracasei NBRC 15889, paracasei NBRC 3953, tolerans JCM 1171, and tolerans NBRC 15906T showed similar patterns.
  • a pretreatment method is a method for pretreatment of a sample containing biological cells for infrared spectroscopic analysis, and includes the steps of preparing a first acidic solution containing an organic acid and contacting the cells with the first acidic solution.
  • cells can be disrupted by contacting them with an organic acid without using beads. Therefore, it is possible to provide a pretreatment method for samples containing biological cells for infrared spectroscopic analysis that allows for simple cell disruption.
  • the organic acid includes at least one selected from the group consisting of formic acid, trifluoroacetic acid, and lactic acid.
  • the pretreatment method can be carried out using the organic acid described in paragraph 2, which is easily available and does not adversely affect the measurement results when used by a person skilled in the art in pretreatment of infrared spectrometry and mass spectrometry.
  • the step of contacting the sample with the first acidic solution includes a step of preparing a second acidic solution which is a mixed solution of the sample and the first acidic solution.
  • the pretreatment method described in paragraph 3 ensures that the cells come into contact with the first acidic solution, improving the efficiency of treatment of the cells with the first acidic solution.
  • the concentration of the organic acid is 50% by volume or more and 90% by volume or less based on the first acidic solution or the second acidic solution.
  • the above-mentioned concentration of organic acid can be used to extract cytoplasm particularly efficiently.
  • the second acidic solution further contains acetonitrile.
  • the pretreatment method described in paragraph 5 further improves the efficiency of cell destruction.
  • the analytical sample after the analytical sample is dropped onto the sample plate, the analytical sample can be dried uniformly and in a short time.
  • the pretreatment method according to any one of paragraphs 3 to 5 further includes a step of centrifuging the second acidic solution to remove any precipitate.
  • the preprocessing method described in paragraph 6 makes the peaks in the infrared spectrum sharper, improving the accuracy of organism classification based on the shape of the infrared spectrum.
  • the pretreatment method according to any one of 1 to 6 further includes dispersing the cells in an aqueous ethanol solution prior to the step of contacting the cells with the first acidic solution.
  • concentration of ethanol in the aqueous ethanol solution is 70% by volume or more and 90% by volume or less based on the aqueous ethanol solution.
  • the organism is a microorganism.
  • the pretreatment method described in paragraph 8 makes it possible to carry out microbial analysis, which is useful in the fields of industry, manufacturing, medicine, etc.
  • An analytical method including the steps of: preparing a dried product by dropping a predetermined amount of an analytical sample obtained by pretreating a sample using the pretreatment method described in any one of Items 1 to 8 onto a sample plate and drying the drop; and obtaining an infrared spectrum by performing infrared spectroscopy analysis of the dried product using Fourier transform infrared spectroscopy.
  • the analytical method described in paragraph 9 makes it possible to accurately analyze the cytoplasmic components contained in the analytical sample.
  • the specified amount is 1 ⁇ L or more and 15 ⁇ L or less.
  • the pretreatment method described in paragraph 10 makes it possible to obtain infrared spectra that can identify living organisms.
  • the pretreatment method according to 9 or 10 further includes a step of classifying organisms by performing cluster analysis on the infrared spectra.
  • the analytical method described in paragraph 11 allows for a simple method of classifying the organism from which the analytical sample is derived based on its infrared spectrum.
  • the analytical method according to any one of paragraphs 9 to 11 further includes the steps of adding a matrix substance to the analytical sample, and performing mass spectrometry by matrix-assisted laser desorption/ionization on the analytical sample to which the matrix substance has been added to obtain a mass spectrum.
  • an analytical sample pretreated for infrared spectroscopic analysis can also be subjected to mass spectrometry. This eliminates the need to prepare a new sample for mass spectrometry.
  • the results of infrared spectroscopic analysis and mass spectrometry can be compared for the same analytical sample obtained by pretreating the same culture sample under the same conditions.
  • the step of adding a matrix substance includes a step of adding a matrix solution containing the matrix substance to the dried material on the sample plate.
  • the analytical method described in paragraph 13 can eliminate the need to drip new analytical samples onto a sample plate for mass spectrometry.
  • the analysis method described in 12 or 13 further includes a step of displaying the results of the infrared spectroscopy analysis and the results of the mass spectrometry analysis.
  • An analytical system includes an infrared spectrophotometer and a mass spectrometer.
  • the infrared spectrophotometer performs infrared spectroscopy analysis of an analytical sample obtained by pretreating a sample containing biological cells by contacting the cells with a first acidic solution containing an organic acid.
  • the mass spectrometer performs mass analysis of the analytical sample.
  • cells can be disrupted for infrared spectroscopic analysis by the simple method of contacting them with an organic acid without using beads.
  • the analytical sample pretreated for infrared spectroscopic analysis can also be subjected to mass spectrometry. This eliminates the need to prepare a new sample for mass spectrometry.
  • the results of infrared spectroscopic analysis and mass spectrometry can be compared for the same analytical sample obtained by pretreating the same culture sample under the same conditions.
  • Pretreatment unit 2 Infrared spectrophotometer, 3 Mass spectrometer, 4 Control device, 10 Analysis unit, 41 Processor, 42 Memory, 43 Display, 100 Analysis system, C1, C2, C3, C4 Cluster, S Ion.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)

Abstract

赤外分光分析のための、生物の細胞を含む試料の前処理方法であって、有機酸を含む第１酸性溶液を準備するステップと、細胞を、第１酸性溶液と接触させるステップとを備える。

Description

前処理方法、分析方法、プログラムおよび分析システム
　本発明は、前処理方法、分析方法、プログラムおよび分析システムに関し、より特定的には、細胞を含む試料についての前処理方法、分析方法、プログラムおよび分析システムに関する。
　赤外分光分析は、化学工業の分野における、材料の分析および完成品の品質管理などにおいて重要な役割を果たしている。近年では、赤外分光分析をバイオの分野に適用する研究も行なわれている。非特許文献１には、培養した黄色ブドウ球菌を、チューブに滅菌金属棒と共に収容されるエタノール水溶液に懸濁し、ボルテックスミキサーにかけることにより、細胞を破砕して、赤外分光分析による株の識別を行なう研究が開示されている。
Performance　Evaluation　of　the　IR　Biotyper(R)　System　for　Clinical　Microbiology:　Application　for　Detection　of　Staphylococcus　aureus　Sequence　Type　8　Strains，Jung　Sung　Hong　et　al.，Antibiotics，7　July　2022，11(7)，909.
　以上のように、従来の赤外分光分析のための細胞破砕法は、細胞を収容したチューブに滅菌金属棒（ビーズとも呼ばれる）を加えてボルテックスミキサーにかける必要があるので、手間と時間とがかかるという課題があった。
　本開示は、かかる課題を解決するためになされたものであり、その目的は、簡易な方法で細胞破砕が可能な、赤外分光分析のための、生物の細胞を含む試料の前処理方法を提供することである。
　本開示の第１の局面に係る前処理方法は、赤外分光分析のための、生物の細胞を含む試料の前処理方法であって、有機酸を含む第１酸性溶液を準備するステップと、細胞を、第１酸性溶液と接触させるステップとを備える。
　本開示の他の局面に係る分析システムは、赤外分光光度計と、質量分析計とを備える。赤外分光光度計は、生物の細胞を含む試料を、細胞を有機酸を含む第１酸性溶液と接触させる前処理を行なうことによって得られた分析試料を赤外分光分析する。質量分析計は、分析試料を質量分析する。
　本発明によれば、簡易な方法で細胞破砕が可能な、赤外分光分析のための、生物の細胞を含む試料の前処理方法を提供することができる。
実施形態に係る分析システムの構成を示す概略図である。 実験１の赤外スペクトルの一例を示す図である。 実験１の赤外スペクトルに基づく微生物の判別結果を示す図である。 実験２の赤外スペクトルの一例を示す図である。 実験２の赤外スペクトルに基づく微生物の判別結果を示す図である。 実験３の赤外スペクトルの一例を示す図である。 実験３の赤外スペクトルに基づく微生物の判別結果を示す図である。 実験４の赤外スペクトルの一例を示す図である。 実験４の赤外スペクトルに基づく微生物の判別結果を示す図である。 実験５のマススペクトルを示す図である。
　以下、本開示の一実施形態（以下「本実施形態」と記す。）について説明する。ただし、本実施形態はこれに限定されるものではない。本明細書において「Ａ～Ｚ」という形式の表記は、範囲の上限下限（すなわちＡ以上Ｚ以下）を意味し、Ａにおいて単位の記載がなく、Ｚにおいてのみ単位が記載されている場合、Ａの単位とＺの単位とは同じである。
　また、本明細書において、溶液の「％」は特に断らない限り、「体積％」を意味する。
　以下に、本実施形態について図面を参照して詳細に説明する。なお、以下では図中の同一または相当部分には同一の符号を付して、その説明は原則的に繰返さないものとする。
　［１．分析システムの構成］
　まず、本実施形態に係る分析方法を実施する分析システム１００の一例を示す。本実施形態に係る分析方法は、本実施形態に係る前処理方法を含む。なお、本明細書において、特に説明のない限り、「前処理」とは、赤外分光分析のための、生物の細胞を含む試料の調製を示す。
　図１を参照して、分析システム１００は、分析部１０と、制御装置４とを含む。分析部１０は、前処理部１と、赤外分光光度計２と、質量分析計３とを含む。
　前処理部１は、生物の細胞を含む試料の前処理をする部である。一実施例において、前処理部１は、分析者が実験機器を用いて実現する。他の実施例において、前処理部１は、制御装置４によって制御される自動前処理装置（図示せず）である。自動前処理装置はオートサンプラ（図示せず）を含んでもよい。以下、インキュベータ等（図示せず）において培養された生物の細胞を含む試料で、前処理部１によって前処理される前の試料を「培養試料」と呼ぶ。本明細書において、培養試料は「試料」の一実施例に対応する。また、前処理部１によって前処理された後の、分析に供される試料を「分析試料」と呼ぶ。前処理部１によって調製された分析試料の少なくとも一部は、赤外分光光度計２において赤外分光分析される。前処理部１によって調製された分析試料の一部は、質量分析計３において質量分析されてもよい。
　一実施例において、生物の細胞を含む試料は、微生物の細胞を含む。これにより、産業、工業、医療等の分野で有用である、微生物の分析を行なうことができる。他の実施例において、生物の細胞を含む試料は、微生物以外の生物（たとえば動物、植物）の細胞を含んでもよい。これにより、細胞の種類に応じて、産業、工業、医療等の分野に有用な分析結果を得られる可能性がある。
　一実施例において、生物の細胞を含む試料は、生物の細胞を培養した培養試料である。他の実施例において、生物の細胞を含む試料は、環境中から採取した生物の細胞を含む。さらに他の実施例において、生物の細胞を含む試料は、動物または植物の生体から採取された組織の一部である。
　本明細書において、特に説明しない限り、微生物の種類とは、微生物のジェノタイプ、株、亜種、種、属および科の少なくとも１つの系統分類学の分類を含む。また、微生物の種類の判別は当該微生物の種類に関しての、分類、同定および識別を含む。以下、微生物の種類の判別を、単に微生物の判別とも記載する。
　赤外分光光度計２は、分析試料を赤外分光分析する。具体的には、赤外分光光度計２は、分析試料に赤外光を照射し、透過光または反射光を分光することで赤外スペクトルを得る。一実施例において、赤外分光光度計２は、フーリエ変換赤外分光光度計（ＦＴ－ＩＲ：Fourier　transform　infrared　spectrometer）である。当該赤外スペクトルは、分析試料中に含まれる物質に応じた形状を示す。微生物の細胞は、微生物の種類によって、異なる種類の物質を含んだり、同じ種類の物質を異なる量含む。以下、このような細胞に含まれる物質の種類および／または量の組み合わせを「組成」と称する。このように微生物の種類毎に細胞の組成が異なるので、異なる種類の微生物は異なる形状の赤外スペクトルを示す。赤外分光光度計２は、取得した赤外スペクトルを制御装置４に送信する。
　質量分析計３は、分析試料を質量分析する。具体的には、質量分析計３は、分析試料に含まれる物質をイオン化し、当該イオンＳを質量電荷比（ｍ／ｚ）に相関する飛行時間に応じて分離したのち検出することでマススペクトルを得る。一実施例において、質量分析計３は、分析試料中の物質をマトリクス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ：Matrix-Assisted　Laser　Desorption/Ionization）法によりイオン化する。質量分析計３は、たとえば、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ（Matrix-Assisted　Laser　Desorption/Ionization　Time-of-Flight　Mass　Spectrometry）である。マススペクトルにおいて、分析試料に含まれる物質はそのｍ／ｚに対応するピークとして検出される。したがって、異なる種類の微生物は異なる位置にピークを有するマススペクトルを示す。質量分析計３は、取得したマススペクトルを制御装置４に送信する。
　制御装置４は、プロセッサ４１と、メモリ４２とを含む。一実施例において、制御装置４はコンピュータである。プロセッサ４１は、典型的には、ＣＰＵ（Central　Processing　Unit）またはＭＰＵ（Micro　Processing　Unit）などの演算処理部である。プロセッサ４１は、メモリ４２に記憶されたプログラムを読み出して実行することで、分析システム１００の動作を制御する。たとえば、プロセッサ４１は、メモリ４２に記憶された本実施形態に記載の分析方法を実施させるプログラムを実行することにより、本実施形態に記載の分析方法を自動で実施することができる。
　メモリ４２は、ＲＡＭ（Random　Access　Memory）、ＲＯＭ（Read　Only　Memory）およびフラッシュメモリなどの不揮発性メモリによって実現される。メモリ４２は、プロセッサ４１によって実行されるプログラム、またはプロセッサ４１によって用いられるデータなどを記憶する。
　ディスプレイ４３は、例えば画像を表示可能な液晶パネルで構成される。ディスプレイ４３は、ユーザの操作入力の受け付けに関する画像を表示し、プロセッサ４１による処理の結果を表示する。
　制御装置４は、図示しない入出力インターフェイスを介して、赤外分光光度計２から赤外スペクトルを受信する。制御装置４は、赤外スペクトルの形状に基づいて、微生物の種類を判別する。制御装置４は、図示しない入出力インターフェイスを介して、質量分析計３からマススペクトルを受信する。制御装置４は、マススペクトルのピークの位置（ｍ／ｚ）に基づいて、微生物の種類を判別する。
　制御装置４は、複数のコンピュータで構成されてもよい。また、上記した制御装置４の機能の一部または全部は、分析部１０と物理的に離れた電子計算機、サーバ等に配置してもよい。
　［２．従来の前処理方法］
　赤外分光分析は、従来、材料系の分野で用いられることが多く、たとえば化学製品（たとえばプラスチック製品）の分析に用いられている。当該分野において、赤外分光分析前の試料（化学製品等）の前処理としては、たとえば、試料の界面を拭くなどの処理が行なわれる。しかし、赤外分光分析を用いて細胞の組成を分析するためには、試料である細胞を溶かす、試料である細胞の内容物を抽出する等の処理が必要となる。たとえば、非特許文献１には、エタノール水溶液中に懸濁した細胞をビーズを用いて破砕して、赤外分光分析を行なう方法が開示されている。
　しかしながら、ビーズを用いた従来の前処理方法（以下、「ビーズ破砕法」とも称する）では、分析者はビーズの出し入れといった繊細で習熟を要する作業を行なうことが必要である。また、試料中の細胞の種類によっては、１つの試料に対し、ビーズ破砕を数回（たとえば２，３回）繰り返す必要がある場合もあり、さらに煩雑になる。したがって、１つの試料を前処理するために長い時間（たとえば２０～３０分）がかかる。加えて、破砕した細胞由来の成分がビーズに付着して、ビーズの回収時に失われてしまうため、エタノール水溶液中に残った成分で分析するためには、多量の細胞を準備する必要がある。たとえば、赤外分光分析用の１つの試料を作製するためには、エタノール水溶液に白金耳のループに山盛りの細胞を加える必要がある。そのためには、たとえば固体培地上で充分な量のコロニーを形成するまで細胞を培養する作業、および／または、白金耳のループを山盛りにするまでコロニーを拾い集める作業が必要である。以上のように、従来のビーズ破砕法は手間と時間がかかる方法であった。
　以上のように、ビーズ破砕法は、分析用の試料を得るために手間と時間がかかるという課題があった。このような課題は、特に多検体処理を行なう場合に顕著であった。
　また、ビーズ破砕法は、ビーズを使用することから、液体の分注、添加などの作業を行なう一般的な自動分析装置において実施することも容易ではなかった。
　［３．実施形態に係る前処理方法］
　以上のような課題を鑑みて、発明者らは、試料の前処理を試行錯誤した結果、細胞を有機酸と接触させることにより効率よく細胞を破砕する方法を見いだした。
　本実施形態に係る前処理方法は、赤外分光分析のための、生物の細胞を含む試料の前処理方法であって、有機酸を含む第１酸性溶液を準備する「準備ステップ」と、細胞を、第１酸性溶液と接触させる「接触ステップ」とを備える。
　（３－１．細胞の種類）
　試料は、原核生物由来の細胞を含んでもよく、真核生物由来の細胞を含んでもよい。試料は典型的には微生物由来であり、未知の微生物を含んでもよい。原核生物には、細菌および古細菌が含まれる。細菌としては、エスケリキア属細菌（大腸菌等）、バシラス属細菌（枯草菌等）、ラクトバシラス属細菌（乳酸菌等）、シネコシスティス属細菌（シアノバクテリア等）、マイコバクテリア属細菌（放線菌等）等が含まれる。古細菌としては、メタノフィルス属、メタノコッカス属、サーモコッカス属、フィロコッカス属等が含まれる。真核生物には、動物、植物、菌類および原生生物が含まれる。菌類には、糸状菌、酵母、キノコ、カビ等が含まれ、ツボカビ門、接合菌門、子嚢菌門、担子菌門、グロムス菌門、微胞子虫門等が含まれる。子嚢菌門には、アスペルキルス属（コウジカビ等）、ペニシリウム属（アオカビ等）、サッカロマイセス属（出芽酵母等）等が含まれる。一実施例において、試料は、上記に記載した細菌、古細菌、菌類を含む広義の菌の細胞（菌体）である。
　これらの細胞は、次に示す２つのステップによって破壊され、細胞質成分が溶出される。
　（３－２．準備ステップ）
　第１酸性溶液と接触される試料は、液体状であってもよいし、固形であってもよい。より具体的には、試料は、たとえば菌の培養液を含む液であってもよいし、固形培地上で培養した菌のコロニーを爪楊枝等ですくい取ったものであってもよい。当該菌の培養液は、菌と、菌を培養するための培地とを含む。なお試料内の菌の量は、従来のビーズ破砕法に比べて少量であってもよい。
　酸は、たとえば生物実験で一般的に用いられる酸である、ギ酸、トリフルオロ酢酸、乳酸等の有機酸である。これらの有機酸は、入手が容易であり、当業者が赤外分光分析および質量分析の前処理に使用しても測定結果に悪影響を与えない。酸の他の例は、酸解離定数（ｐＫａ）が０．２以上５以下の酸であり、より好ましくは解離定数が０．２以上４以下の酸である。解離定数が０．２以上５以下の酸とは、一部上記の酸の例と重複するが、たとえば、トリフルオロ酢酸、シュウ酸、グリシン、サリチル酸、ギ酸、乳酸、安息香酸、酢酸、および、酪酸の少なくとも１つの酸である。なお、以上の酸の例示は、当然ながら、これに限定されるものではない。一実施例において、有機酸はギ酸である。また、後述するように、無機酸も同様に用いられる。また、第１酸性溶液に含まれる酸は、１種類の酸（純物質）であっても、複数の種類の酸の混合物であってもよい。
　本明細書において、「酸」は純物質（たとえば１００％ギ酸）を示す。また、酸を溶媒を用いて所定の濃度に希釈した溶液を、「第１酸性溶液」と称する。当該溶媒は、典型的には水を含む。水は、好ましくは、純水、超純水、または、イオン交換水である。当該溶媒は、本実施形態に係る前処理方法の効果が奏される範囲で、水に加え、または、水に代えて、有機溶媒を含んでもよい。当該有機溶媒はたとえば極性を有する有機溶媒である。当該有機溶媒はたとえばアセトニトリル、メタノールまたはエタノールである。
　なお、準備ステップは、酸を溶媒を用いて所定の濃度に希釈して第１酸性溶液を作製するステップであってもよいし、既に作製された第１酸性溶液を実験台の上に置いたり、自動前処理装置に注入したりするステップであってもよい。以上のように、準備ステップは、次の接触ステップにおいて、細胞と第１酸性溶液とを接触させるために第１酸性溶液が準備できれば特にその態様は限定されない。
　（３－３．接触ステップ）
　「接触ステップ」の具体的な手段として、典型的には、試料と第１酸性溶液とを混合する手段が用いられる。本明細書において、試料と第１酸性溶液との混合溶液を「第２酸性溶液」と称する。試料と第１酸性溶液とを混合することにより、第１酸性溶液中に細胞を分散させることができる。これにより、細胞と第１酸性溶液とを確実に接触することができるので、細胞に対する第１酸性溶液の処理の効率が向上する。
　第１酸性溶液と試料との混合比率は、本実施形態に係る前処理方法の効果が奏される範囲で限定されないが、たとえば、体積比で第１酸性溶液の１／２以下、１／１０００以上の試料が混合される。ただし、一般には、第１酸性溶液と混合する際に、試料に含まれる細胞以外の成分（たとえば細胞の培養に用いた液体培地）の量ができるだけ少なくなるように調製される。具体的には、たとえば、第１酸性溶液と混合する前の試料を遠心分離し、上清を除去し、残った沈殿物（細胞）を回収し、回収した沈殿物を第１酸性溶液と混合する。また、当該沈殿物をさらに超純水等で遠心洗浄しておくとさらに好ましい。以上の理由により、第２酸性溶液における酸の含有割合（濃度）、および、ｐＨは、第１酸性溶液からほぼ変化しない。以下、第１酸性溶液および第２酸性溶液を、「酸性溶液」と総称する場合もある。
　酸性溶液における酸の濃度は、たとえば、５０～９０体積％であり、好ましくは６０～８０体積％であり、より好ましくは６５～７５体積％である。
　一実施例において、第１酸性溶液は５０～９０％ギ酸であり、好ましくは６０～８０％ギ酸であり、より好ましくは６５～７５％ギ酸である。この実施例において、第２酸性溶液は、細胞を含む、上記の濃度のギ酸である。
　一実施例において、第１酸性溶液は５０～９０％トリフルオロ酢酸であり、好ましくは６０～８０％トリフルオロ酢酸であり、より好ましくは６５～７５％トリフルオロ酢酸である。この実施例において、第２酸性溶液は、細胞を含む、上記の濃度のトリフルオロ酢酸である。
　一実施例において、第１酸性溶液は５０～９０％乳酸であり、好ましくは６０～８０％乳酸であり、より好ましくは６５～７５％乳酸である。この実施例において、第２酸性溶液は、細胞を含む、上記の濃度の乳酸である。
　当該濃度の有機酸を用いることで、細胞質を特に効率よく抽出できる。
　酸性溶液が正しく混合されているかは、たとえばｐＨメータにより、当該酸性溶液の水素イオン指数（ｐＨ）を測定することにより、確認できる。
　「接触ステップ」の具体的な手段の他の例は、第１酸性溶液を染みこませた物体（たとえば布）に、細胞を接触（たとえば載置）させる手段である。このように、「接触ステップ」の具体的な手段は、本実施形態に係る前処理方法の効果が奏される範囲で限定されない。
　本実施形態に係る前処理方法によれば、細胞を有機酸を含む第１酸性溶液と接触させることによって、ビーズを用いずとも、赤外分光分析のための細胞破砕を行なうことができる。したがって、簡易な方法で、赤外分光分析のための細胞破砕を行なうことができる。
　より詳細には、本実施形態に係る前処理方法によれば、遠心分離、ボルテックスミキサーによる攪拌（以下、単に「ボルテックス」と称する）等の単純な実験技術により、短時間に多種類の試料を前処理することが可能である。また、一度のギ酸処理で、細胞壁および細胞膜を破砕することが可能である。したがって、数分（たとえば５分）での前処理が可能である。また、ビーズに細胞由来の成分が付着して失われるなどのロスもないため、分析に必要となる菌体の量がビーズ破砕法より少ない。したがって、固体培地で、菌を培養する場合も、ビーズ破砕法ほど多くの量の菌を掬う必要はない。また、たとえば、液体培地で所定量まで培養した培養試料の一部を分注して、前処理することも可能である。したがって、簡便かつ短時間に培養試料を作製することが可能である。
　以上のように、本実施形態に係る前処理は、一般的な赤外分光分析の前処理と異なり、試料（細胞）に有機酸を接触させることにより、破砕する。これにより、ビーズを用いずとも、単純な液体の混合、分注等の操作によって、細胞を効率よく破砕することが可能である。その結果、本実施形態に係る前処理は、一般的な自動前処理装置でも実施可能である。一般的な自動前処理装置を用いれば、多種類の生物の細胞について、一度に分析することがさらに容易になる。
　（３－４．その他の態様）
　第２酸性溶液は、好ましくはアセトニトリルをさらに含む。アセトニトリルの濃度は、第２酸性溶液を基準として、たとえば３０％～７０％、好ましくは４０％～６０％、さらに好ましくは約５０％である。以上のように第２酸性溶液にアセトニトリルを含むことにより、細胞の破壊効率がさらに向上することを発明者らは見いだしたまた、第２酸性溶液にアセトニトリルを含むことにより、分析試料を試料プレートに滴下したのち、分析試料を均一かつ短時間で乾燥させることができる。これにより、分析精度を向上させることができる。
　本実施形態に係る前処理方法は、好ましくは、第２酸性溶液を遠心分離し、沈殿を除去するステップをさらに含む。一実施例において、分析者は、チューブ等の容器に収容された第２酸性溶液を遠心分離にかけた後、得られた上清を他の容器に回収し、当該上清を赤外分光分析および／または質量分析に供する。発明者らは、以上のように沈殿を除去するステップによって、赤外スペクトルのピークが鋭利になり、赤外スペクトルの形状に基づく生物の分類の精度が向上することを見いだした。以上のように沈殿の除去により赤外分光分析の結果が向上することは、以下のように説明される。第２酸性溶液には、細胞質成分に加え、細胞壁成分等も含まれている。細胞壁成分は、細胞質成分に比べ、それほど多様でないことから、微生物の判別に適していない。第２酸性溶液をそのまま赤外分光分析した場合、細胞質成分だけではなく、細胞壁成分も赤外スペクトルに反映されてしまう。そこで、遠心分離により細胞壁成分を沈殿させ、細胞質成分等を含む上清だけを回収することにより、細胞壁成分に対応するスペクトル成分が除去される一方で、細胞質成分に対応するスペクトル成分が残る。したがって、赤外スペクトルのピークが鋭利になり、生物の分類の精度も向上する。
　本実施形態に係る前処理方法は、好ましくは、「接触ステップ」の前に、細胞をエタノール水溶液に分散させるステップをさらに含む。当該エタノール水溶液におけるエタノールの濃度は、たとえばエタノール水溶液を基準として７０％以上９０％以下であり、好ましくは７５％以上８５％以下であり、さらに好ましくは約８０％である。当該濃度のエタノール水溶液を用いることにより、菌体の不活化と、菌体洗浄とを効率よく行なえる。具体的には、エタノールが細胞表面の分泌物を破壊して細胞を分散させたり、細胞を収縮（shrink）させたりすることにより、有機酸処理による細胞破砕をさらに強力にできる。したがって、細胞質成分の溶出効率がさらに向上できる。なお、本実施形態に係る前処理方法は、好ましくは、細胞をエタノール水溶液に分散させるステップの後に、遠心分離を行ない、上清（エタノール）を除去するステップを含む。
　実施形態に係る前処理方法は、分析者が通常の実験機器を用いて実施してもよいし、コンピュータが実施してもよい。たとえば、プロセッサ４１が、メモリ４２に格納される所定のプログラムを実行することにより、自動前処理装置である前処理部１を制御して、実施形態に係る前処理方法を実施してもよい。自動前処理装置が前処理を行なう場合、分析者が手動で前処理を行なう場合よりも、分析者の手間が省ける。また、前処理を正確に実施すること、および、多量の試料を前処理することがさらに容易になる。
　［４．実施形態に係る分析方法］
　実施形態に係る分析方法は、実施形態に係る前処理方法によって得られた分析試料を、試料プレートに所定量滴下し乾燥することによって、乾燥物を作製する「乾燥ステップ」と、乾燥物について、フーリエ変換赤外分光法による赤外分光分析を行なうことにより赤外線スペクトルを取得する「分析ステップ」とを含む。これにより、分析試料中に含まれていた細胞質成分を精度良く分析することが可能である。
　乾燥ステップの一実施例において、分析試料は試料プレートの各ウェルに、所定量ずつ滴下される。当該所定量は、たとえば、１μＬ以上１５μＬ以下の間で定めれられる１つの数値であり、好ましくは８μＬ以上１２μＬ以下であり、さらに好ましくは約１０μＬである。以上のような量の分析試料を試料プレート上に設置することにより、生物を判別可能な赤外スペクトルを得ることができる。
　実施形態に係る分析方法は、赤外線スペクトルをクラスタ解析することにより、分析試料が由来する生物（培養試料中に含まれていた生物）を分類するステップをさらに含んでもよい。これにより、赤外線スペクトルに基づいて、分析試料が由来する生物を簡易な方法で分類できる。なお、後述する実験例に示すように、本実施形態に係る分析方法は、前処理が簡易である一方で、クラスタ解析により微生物を判別できる精度を有する赤外スペクトルを得ることができる。これにより、短時間で前処理および生物の判別の作業を進めることができる。
　本実施形態の分析方法は、分析試料にマトリクス物質を加えるステップと、マトリクス物質を加えた分析試料に対し、マトリクス支援レーザ脱離イオン化法の質量分析を行なうことによりマススペクトルを取得するステップとをさらに含んでもよい。このように構成すれば、赤外分光分析用に前処理された分析試料を、質量分析にも供することができる。したがって、質量分析用の試料を新たに調製する手間が省ける。また、同一培養試料を同一条件で前処理した同一分析試料についての赤外分光分析の結果と、質量分析の結果とを比較することができる。
　一実施例において、分析者は、チューブ等の容器内で作製された分析試料の一部を赤外分光分析用の試料プレートに滴下し、赤外分光分析を行なう。そして、分析者は、チューブに残る分析試料の少なくとも一部にマトリクス物質を含むマトリクス溶液を加え、当該チューブ内の分析試料の一部を質量分析用の試料プレートに滴下し、質量分析を行なう。分析者は、チューブに残る分析試料の少なくとも一部に直接マトリクス溶液を加えてもよいし、チューブに残る分析試料の一部を分注し、分注した分析試料にマトリクス溶液を加えてもよい。また質量分析用の試料プレート上に作製された乾燥物に、上記マトリクス溶液を加えて、質量分析を行なってもよい。特に、赤外分光分析用の試料プレートを質量分析においても用いることが可能である場合、換言すると、赤外分光光度計２と質量分析装置３の試料プレートが共用できる場合、当該共用の試料プレート上に作製された乾燥物について赤外分光分析を行なった後に、マトリクス溶液を加えて、質量分析を行なってもよい。この場合、赤外分光分析に用いた後の乾燥物に対してマトリクス溶液を加えるだけで、質量分析を行なうことができる。したがって、質量分析のために、質量分析用の試料プレートに新たに分析試料を滴下する手間を省くことができる。
　実施形態に係る分析方法は、マススペクトルに基づいて、分析試料が由来する生物を分類するステップをさらに含んでもよい。これにより、マススペクトルに基づいて、析試料が由来する生物を簡易な方法で分類できる。また、赤外分光分析による生物の分類結果と質量分析による生物の分類結果とを比較することができる。
　実施形態に係る分析方法は、赤外分光分析による分析結果と質量分析による分析結果とを表示するステップをさらに備える。一実施例において、プロセッサ４１は、赤外スペクトル、赤外スペクトルに基づく生物の分類結果、マススペクトル、マススペクトルに基づく生物の分類結果等をディスプレイ４３に表示する。生物の分類結果は、たとえば、デンドログラム（系統樹）の形式で表示される。このように構成すれば、赤外分光分析による分析結果と質量分析による分析結果とを容易に比較検討できる。
　上記した実施形態に係る分析方法は、分析者が赤外分光光度計２、質量分析計３および／または制御装置４を操作することによって実施されてもよい。また、制御装置４が、分析システム全体を自動分析システムとして制御することによって実施されてもよい。たとえば、プロセッサ４１が、メモリ４２に格納される所定のプログラムを実行することにより、赤外分光光度計２および質量分析計３に前処理部１において調製された分析試料を注入し、赤外分光光度計２および質量分析計３を制御して分析を実施してもよい。自動分析システムを用いる場合、分析者が手動で分析試料を作製し、赤外分光光度計２および質量分析計３に注入し、赤外分光光度計２および質量分析計３を操作する場合よりも、分析者の手間が省ける。また、分析を正確に実施すること、および、多量の試料を分析することがさらに容易になる。
　［５．本実施形態に係る前処理方法および分析方法の一実施例］
　以下に、本実施形態に係る前処理方法および分析方法の一実施例を説明する。
（１）菌体が含まれるマイクロチューブ（１．５ｍＬ程度の容量）に２００μＬの蒸留水を加え、ＯＤ＝１になる程度に菌体を分散させる。
（２）エタノールを８００μＬ添加し、混合する。
（３）遠心分離によって菌体を沈殿させ、上清を除去する。
（４）７０％程度のギ酸を準備する（準備ステップ）。当該ギ酸を２５μＬ添加し、菌体を分散させる（接触ステップ）。
（５）アセトニトリルを２５μＬ添加し、分散する。
（６）（５）で作製した分析試料のうち２～１０μＬを試料プレートに滴下し、乾燥させる（乾燥ステップ）。
（７）（６）で作製した乾燥物を赤外分光光度計２を用いて赤外分光分析する（分析ステップ）。
（８）（５）で作製した分析試料のうち１μＬを試料プレートに滴下し、乾燥させる。乾燥後、マトリクス溶液をさらに滴下し、乾燥させ、試料とマトリクス物質との混合結晶を作製する。
（９）（８）で作製した混合結晶を質量分析計３を用いて質量分析する。
（１０）赤外分光分析の結果、および、質量分析の結果をディスプレイ４３に表示させ、分析結果を確認する。
　［６．実験例］
　次に、実験例を挙げて本実施形態に係る前処理方法およびその効果をより詳細に説明するが、本実施形態に係る前処理方法は実験例に限定されるものではない。
　実験例においては、以下の４種類の菌株の乳酸菌が用いられた。
Lacticaseibacillus　paracasei　subsp.　paracasei　NBRC　15889
Lacticaseibacillus　paracasei　subsp.　paracasei　NBRC　3953
Lacticaseibacillus　paracasei　subsp.　tolerans　JCM　1171
Lacticaseibacillus　paracasei　subsp.　tolerans　NBRC　15906T
上記４種類の菌株は、以下単に、
paracasei　NBRC　15889
paracasei　NBRC　3953
tolerans　JCM　1171
tolerans　NBRC　15906T
とも称する。
　paracasei　subsp.　paracaseiとparacasei　subsp.　toleransは亜種である。paracasei　NBRC　15889とparacasei　NBRC　3953とは同一亜種の異なる株である。tolerans　JCM　1171とtolerans　NBRC　15906Tとは同一株であるが購入先が異なるものである。具体的には、tolerans　JCM　1171は、理化学研究所経由で購入し、tolerans　NBRC　15906Tについては独立行政法人製品評価技術基盤機構経由で購入した。したがって、tolerans　JCM　1171とtolerans　NBRC　15906Tとの差は、当該２つの機関において継代する中で起こった遺伝子変異の差である。
　以下の実験においては、ＭＲＳ寒天培地を用いて３５℃において２４時間それぞれ培養した細胞を使用した。
　（６－１．実験１）
　実験１における前処理および分析は、次のように行なった。
（１）２００μＬの蒸留水にＯＤ＝１程度になるように菌体を分散させた。
（２）８００μＬのエタノールを加えて菌体を分散し、遠心分離により得られた上清を除去した。
（３）５０μＬの７０％ギ酸水溶液を加えて沈殿した菌体を再分散させた。
（４）５０μＬのアセトニトリルをさらに加えて混合し、ギ酸／アセトニトリル混合水溶液を作製した。実験１において当該ギ酸／アセトニトリル混合水溶液は「分析試料」の一実施例に対応する。
（５）各菌株のギ酸／アセトニトリル混合水溶液を試料プレートの３つのウェルに１０μＬずつ滴下し、乾燥物を作製した。
（６）（５）の結果得られた乾燥物を赤外分光光度計によって分析した。
（１）～（４）までに要した時間は、約５分であった。
　実験１における赤外分光分析の分析条件は以下の通りである。
微分点数：３１点
波数範囲：６５０～１３００ｃｍ－１
規格化：Ｖｅｃｔｏｒ　Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ
類似度：Ｅｕｃｌｉｄｅａｎ
クラスタ解析：Ｗａｒｄ法
　図２は、実験１の結果得られた赤外スペクトルの一例を示す図である。図２は、tolerans　NBRC　15906Tの１つの乾燥物を分析して得られた赤外スペクトルを示す。図２の横軸は赤外光の振動数（波数）を示す。縦軸は、吸光度を示す。図２を参照して、分析試料中の物質の組成を反映する赤外スペクトルが得られた。しかしながら、枠９１で示す波数範囲について、続く実験２～４の場合よりも吸光度が比較的一様に高く、ピークが明瞭でなかった。したがって、当該波数範囲については、乾燥物中のタンパク質量が多すぎるため、スペクトルが飽和していると考えられた。換言すると、当該波数範囲において、光が吸収され過ぎて、微生物の特徴を示すピークが見えにくくなっていると考えられた。
　図３は、図２の赤外スペクトルをクラスタ解析した結果得られた、微生物の判別結果を示すデンドログラムである。図３の横軸は各クラスタの距離を表す。各クラスタは線Ｌ１の水準で分類を行った。菌株ごとに得られた３つの赤外スペクトルをそれぞれ、菌株名－１、菌株名－２、菌株名－３と記載する。
　図３を参照して、　paracasei　NBRC　3953の３つの赤外スペクトルは全てクラスタＣ１に、　paracasei　NBRC　15889の３つの赤外スペクトルは全てクラスタＣ３に、tolerans　JCM　1171とtolerans　NBRC　15906Tとは全てクラスタＣ２に分類された（枠９２参照）。
　以上のように、paracasei　subsp.　paracaseiとparacasei　subsp.　toleransとは異なるクラスタに分離できていた。また、paracasei　subsp.　paracaseiについては、paracasei　NBRC　3953とparacasei　NBRC　15889とを異なるクラスタに分離できていた。以上のように、実験１においては、亜種、および、異なる株については、分離することができた。
　一方で、paracasei　subsp.　toleransについて、tolerans　JCM　1171とtolerans　NBRC　15906Tとは分離できなかった。
　（６－２．実験２）
　実験２における前処理は、実験１における前処理の（５）を改変したものである。具体的には、（５）において試料プレートに滴下するギ酸／アセトニトリル混合水溶液（分析試料）の量を１０μＬから２μＬに減少させたものである。
　実験２における前処理は次のように行なった。
（１）２００μＬの蒸留水にＯＤ＝１程度になるように菌体を分散させた。
（２）８００μＬのエタノールを加えて菌体を分散し、遠心分離により得られた上清を除去した。
（３）５０μＬの７０％ギ酸水溶液を加えて沈殿した菌体を再分散させた。
（４）５０μＬのアセトニトリルをさらに加えて混合し、ギ酸／アセトニトリル混合水溶液を作製した。実験２において当該ギ酸／アセトニトリル混合水溶液は「分析試料」の一実施例に対応する。
（５）２μＬのギ酸／アセトニトリル混合水溶液を試料プレートに滴下し、乾燥物を作製した。
（６）（５）の結果得られた乾燥物を赤外分光光度計によって分析した。
（１）～（４）までに要した時間は、約５分であった。
　実験２における赤外分光分析の分析条件は以下の通りである。
微分点数：３１点
波数範囲：６５０～１３００ｃｍ－１
規格化：Ｖｅｃｔｏｒ　Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ
類似度：Ｅｕｃｌｉｄｅａｎ
クラスタ解析：Ｗａｒｄ法
　図４は、実験２の結果得られた赤外スペクトルの一例を示す図である。図４は、tolerans　NBRC　15906Tの１つの乾燥物を分析して得られた赤外スペクトルを示す。図４の横軸は赤外光の振動数（波数）を示す。縦軸は、吸光度を示す。図４を参照して、枠９３で示す波数範囲について、図２において観察された飽和が解消されて、ピークが検出されている。これは、乾燥物中のタンパク質量が減少したことを反映していると考えられた。
　図５は、図４の赤外スペクトルをクラスタ解析した結果得られた、微生物の判別結果を示すデンドログラムである。図５の横軸は距離を各クラスタの距離を表す。各クラスタは線Ｌ２の水準で分類を行った。菌株ごとに得られた３つの赤外スペクトルをそれぞれ、菌株名－１、菌株名－２、菌株名－３と記載する。
　図５を参照して、paracasei　NBRC　3953の３つの赤外スペクトルは全てクラスタＣ４に、　paracasei　NBRC　15889の３つの赤外スペクトルは全てクラスタＣ３に分類された。tolerans　JCM　1171およびtolerans　NBRC　15906Tの各々の赤外スペクトルはクラスタＣ１またはクラスタＣ２に分類された（枠９４参照）以上のように、実験２においては、亜種、および、異なる株については、分離することができた。
　一方で、paracasei　subsp.　toleransについて、JCM　1171とNBRC　15906Tとはやはり分離できなかった。
　（６－３．実験３）
　実験３における前処理は実験２における前処理の（４）を改変したものである。具体的には、実験２の（４）においてはアセトニトリルを混合した試料をそのまま試料プレートに滴下したが、実験４の（４）においてはアセトニトリルを混合した試料を遠心分離し、上清を試料プレートに滴下した。
　実験３における前処理は次のように行なった。
（１）２００μＬの蒸留水にＯＤ＝１程度になるように菌体を分散させた。
（２）８００μＬのエタノールを加えて菌体を分散し、遠心分離により得られた上清を除去した。
（３）５０μＬの７０％ギ酸水溶液を加えて沈殿した菌体を再分散させた。
（４）５０μＬのアセトニトリルをさらに加えて混合してギ酸／アセトニトリル混合水溶液を作製した。そして、ギ酸／アセトニトリル混合水溶液を遠心分離し（１００００ｇ、１分）、上清を得た。実験３において当該ギ酸／アセトニトリル混合水溶液の上清は「分析試料」の一実施例に対応する。
（５）２μＬのギ酸／アセトニトリル混合水溶液の上清を試料プレートに滴下し、乾燥物を作製した。
（６）（５）の結果得られた乾燥物を赤外分光光度計によって分析した。
（１）～（４）までに要した時間は、約５分であった。
　実験３における赤外分光分析の分析条件は以下の通りである。
微分点数：３点
波数範囲：６５０～１３００ｃｍ－１
規格化：Ｖｅｃｔｏｒ　Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ
類似度：Ｅｕｃｌｉｄｅａｎ
クラスタ解析：Ｗａｒｄ法
　図６は、実験３の結果得られた赤外スペクトルの一例を示す図である。図６は、subsp.　tolerans　NBRC　15906Tの１つの乾燥物を分析して得られた赤外スペクトルを示す。図６の横軸は赤外光の振動数（波数）を示す。縦軸は、吸光度を示す。図６を参照して、枠９５で示す波数範囲について図４よりもピークが鋭くなっている。これは、実験４においては、前処理（４）において細胞壁などが沈殿として除去されたためであると考えられた。
　一方で、図６においては吸光度が、図４よりも弱い。たとえば、図４においては吸光度の最大値がそれぞれ約０．３５であるのに対し、図６の吸光度の最大値は約０．１２である。図４と図６との吸光度の大きさの差は、前処理（４）において遠心分離を行なったことにより、分析試料中のタンパク質の量が減少したからであると考えられる。したがって、図６の赤外スペクトルについては、吸光度が全体に低いことから、ノイズを比較的多く含んでいる可能性が考えられた。
　図７は、図６の赤外スペクトルをクラスタ解析した結果得られた、微生物の判別結果を示すデンドログラムである。図７の横軸は距離を各クラスタの距離を表す。各クラスタは線Ｌ３の水準で分類を行った。菌株ごとに得られた３つの赤外スペクトルをそれぞれ、菌株名－１、菌株名－２、菌株名－３と記載する。
　図７を参照して、　paracasei　NBRC　3953の３つの赤外スペクトルは全てクラスタＣ２に、paracasei　NBRC　15889の３つの赤外スペクトルは全てクラスタＣ１に分類された。また、tolerans　NBRC　15906Tの３つの赤外スペクトルは全てクラスタＣ３に、tolerans　NBRC　15906Tの３つの赤外スペクトルは全てクラスタＣ４に分類された。以上のように、実験３においては、亜種、異なる株に加え、購入先が異なる同一株についても分離することができた。換言すると、同一株をそれぞれ経代する中で生じたわずかな遺伝子の差を有する菌株同士についても分類することができた。
　（６－４．実験４）
　実験４における前処理は実験３における前処理の（５）を改変したものである。具体的には、（５）において試料プレートに滴下するギ酸／アセトニトリル混合水溶液の上清（分析試料）の量を２μＬから１０μＬに増加させたものである。
　実験４における前処理は次のように行なった。
（１）２００μＬの蒸留水にＯＤ＝１程度になるように菌体を分散させた。
（２）８００μＬのエタノールを加えて菌体を分散し、遠心分離により得られた上清を除去した。
（３）５０μＬの７０％ギ酸水溶液を加えて沈殿した菌体を再分散させた。
（４）５０μＬのアセトニトリルをさらに加えて混合してギ酸／アセトニトリル混合水溶液を作製した。そして、ギ酸／アセトニトリル混合水溶液を遠心分離し（１００００ｇ、１分）、上清を得た。実験４において当該ギ酸／アセトニトリル混合水溶液の上清は「分析試料」の一実施例に対応する。
（５）１０μＬのギ酸／アセトニトリル混合水溶液の上清を試料プレートに滴下し、乾燥物を作製した。
（６）（５）の結果得られた乾燥物を赤外分光光度計によって分析した。
（１）～（４）までに要した時間は、約５分であった。
　実験４における赤外分光分析の分析条件は以下の通りである。
微分点数：３点
波数範囲：６５０～１３００ｃｍ－１
規格化：Ｖｅｃｔｏｒ　Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ
類似度：Ｅｕｃｌｉｄｅａｎ
クラスタ解析：Ｗａｒｄ法
　図８は、実験４の結果得られた赤外スペクトルの一例を示す図である。図８は、subsp.　tolerans　NBRC　15906Tの１つの乾燥物を分析して得られた赤外スペクトルを示す。図８の横軸は赤外光の振動数（波数）を示す。縦軸は、吸光度を示す。図８を参照して、枠９６で示す波数範囲について図６よりもさらにピークが鋭くなっている。これは、実験４においては、前処理（５）において試料プレートに滴下する分析試料（細胞壁などが除去されたギ酸／アセトニトリル混合水溶液の上清）の量を増やした結果、分析試料中に含まれる細胞質のタンパク質などの量も増大したことを反映していると考えられた。その結果、図８においては、図６よりノイズが減少した鋭利なピークが観察されたと考えられる。
　図９は、図８の赤外スペクトルをクラスタ解析した結果得られた、微生物の判別結果を示すデンドログラムである。図９の横軸は距離を各クラスタの距離を表す。各クラスタは線Ｌ４の水準で分類を行った。菌株ごとに得られた３つの赤外スペクトルをそれぞれ、菌株名－１、菌株名－２、菌株名－３と記載する。
　図９を参照して、paracasei　NBRC　3953の３つの赤外スペクトルは全てクラスタＣ３に、paracasei　NBRC　15889の３つの赤外スペクトルは全てクラスタＣ４に分類された。また、tolerans　NBRC　15906Tの３つの赤外スペクトルは全てクラスタＣ２に、　tolerans　NBRC　JCM　1171の３つの赤外スペクトルは全てクラスタＣ１に分類された。以上のように、実験４においては、亜種、異なる株に加え、購入先が異なる同一株についても分離することができた。換言すると、同一株をそれぞれ経代する中で生じたわずかな遺伝子の差を有する菌株同士についても分類することができた。
　また、実験４においては、　paracasei　NBRC　3953のクラスタとparacasei　NBRC　15889のクラスタの距離（同一亜種の異なる株間のクラスタの距離）より、tolerans　NBRC　15906Tのクラスタとtolerans　JCM　1171のクラスタとの距離（同一亜種の同一株間のクラスタの距離）の方が小さくなっていた。一方で、図７の実験３においては、　paracasei　NBRC　3953のクラスタとparacasei　NBRC　15889のクラスタの距離（同一亜種の異なる株間のクラスタの距離）より、tolerans　NBRC　15906Tのクラスタとtolerans　JCM　1171のクラスタとの距離（同一亜種の同一株間のクラスタの距離）の方が大きくなっていた。一般に、同一亜種の同一株間のタンパク質配列の差の方が、同一亜種の異なる株間のタンパク質配列の差の方より小さいため、実験４のデンドログラムの方が、実験３のデンドログラムより、実態を正確に表していると考えられた。換言すると、図７および図９を参照すれば、実験４の前処理方法は実験３の前処理方法より、さらに、微生物を正確に分類できる方法であると考えられた。
　以上のように、実験１～４の各々の前処理で作製した分析試料を赤外分光分析した結果、微生物が亜種レベルで判別できた。これは、ビーズ破砕を用いない簡易な方法で、赤外分光分析のための細胞破砕を適切に行なうことができたこと、および、その結果亜種毎に異なる形状の赤外スペクトルを得られたことを反映していると考えられる。
　（６－５．実験５）
　実験５では、実験４の（４）で作製したるギ酸／アセトニトリル混合水溶液の上清（分析試料）にマトリクス溶液を加えて質量分析を行なった。
　実験５の分析は、次のように行なった。
（１）実験４で作製したギ酸／アセトニトリル混合液の上清（分析試料）を１μＬずつ試料プレートに滴下し、乾燥させた。
（２）（１）の結果得られた乾燥物に、ＣＨＣＡ溶液を１μＬ滴下して乾燥させ、試料とマトリクス物質との混合結晶を得た。当該ＣＨＣＡ溶液は、ＣＨＣＡが１０ｍｇ／ｍＬとなるように１％ＴＦＡを含む４０％アセトニトリル１０％エタノール水溶液にＣＨＣＡを溶解させたものである。
（３）（２）の結果得られた混合結晶を、ＭＡＬＤＩ－８０２０（株式会社島津製作所製）で分析し、マススペクトルを得た。そして、当該マススペクトルのリボソームタンパク質に対応するピークに基づいて微生物を判別した。
　図１０は、実験５の結果得られたマススペクトルを示す図である。図１０の横軸はｍ／ｚを示し、縦軸は信号強度を示す。図１０を参照して、paracasei　NBRC　15889、paracasei　NBRC　3953、tolerans　JCM　1171、および、tolerans　NBRC　15906Tの中で、同じ亜種同士のマススペクトルは似たパターンを示していた。
　さらに、マススペクトル中のリボソームタンパク質に対応するピークに基づいて各試料の同定を試みたところ、亜種レベルで正しく同定することができた。
　以上のように、実験４で示した前処理を行なった結果、赤外分光分析および質量分析の双方において、亜種レベルで正しく判別できる分析試料を作製できた。したがって、ビーズ破砕を用いない簡易な方法で、赤外分光分析および質量分析のための適切な前処理を行なうことができたと考えられる。
　［態様］
　上述した複数の例示的な実施形態は、以下の態様の具体例であることが当業者により理解される。
　（第１項）一態様に係る前処理方法は、赤外分光分析のための、生物の細胞を含む試料の前処理方法であって、有機酸を含む第１酸性溶液を準備するステップと、細胞を、第１酸性溶液と接触させるステップとを備える。
　第１項に記載の前処理方法によれば、ビーズを用いずに、有機酸に接触させることで細胞破砕が可能である。したがって、簡易な方法で細胞破砕が可能な、赤外分光分析のための、生物の細胞を含む試料の前処理方法を提供することができる。
　（第２項）第１項に記載の前処理方法において、有機酸は、ギ酸、トリフルオロ酢酸および乳酸からなる群より選ばれる少なくとも１つを含む。
　第２項に記載の前処理方法によれば、第２項に記載の、入手が容易であり、当業者が赤外分光分析および質量分析の前処理に使用しても測定結果に悪影響を与えない有機酸を使用して、前処理方法を実施することができる。
　（第３項）第１または２項に記載の前処理方法において、第１酸性溶液と接触させるステップは、試料と第１酸性溶液との混合溶液である第２酸性溶液を作製するステップを含む。
　第３項に記載の前処理方法によれば、細胞と第１酸性溶液とを確実に接触することができるので、細胞に対する第１酸性溶液の処理の効率が向上する。
　（第４項）第３項に記載の前処理方法において、有機酸の濃度は、第１酸性溶液または第２酸性溶液を基準として、５０体積％以上９０体積％以下である。
　第４項に記載の前処理方法によれば、上記濃度の有機酸を用いることで、細胞質を特に効率よく抽出できる。
　（第５項）第３または４項に記載の前処理方法において、第２酸性溶液は、アセトニトリルをさらに含む。
　第５項に記載の前処理方法によれば、細胞の破壊効率がさらに向上する。また、分析試料を試料プレートに滴下したのち、分析試料を均一かつ短時間で乾燥させることができる。
　（第６項）第３～５項のいずれか１項に記載の前処理方法において、第２酸性溶液を遠心分離し、沈殿を除去するステップをさらに含む。
　第６項に記載の前処理方法によれば、赤外スペクトルのピークが鋭利になり、赤外スペクトルの形状に基づく生物の分類の精度が向上する。
　（第７項）第１～６のいずれか１項に記載の前処理方法において、第１酸性溶液と接触させるステップの前に、細胞をエタノール水溶液に分散させるステップをさらに備える。エタノール水溶液におけるエタノールの濃度は、エタノール水溶液を基準として７０体積％以上９０体積％以下である。
　第７項に記載の前処理方法によれば、当該濃度のエタノール水溶液を用いることにより、菌体の不活化と、菌体洗浄とを効率よく行なえる。
　（第８項）第１～７のいずれか１項に記載の前処理方法において、生物は、微生物である。
　第８項に記載の前処理方法によれば、産業、工業、医療等の分野で有用である、微生物の分析を行なうことができる。
　（第９項）第１～８のいずれか１項に記載の前処理方法において試料を前処理して得られた分析試料を、試料プレートに所定量滴下し乾燥することによって、乾燥物を作製するステップと、乾燥物について、フーリエ変換赤外分光法による赤外分光分析を行なうことにより赤外線スペクトルを取得するステップとを含む、分析方法。
　第９項に記載の分析方法によれば、分析試料中に含まれていた細胞質成分を精度良く分析することが可能である。
　（第１０項）第９項に記載の分析方法において、所定量は、１μＬ以上１５μＬ以下である。
　第１０項に記載の前処理方法によれば、生物を判別可能な赤外スペクトルを得ることができる。
　（第１１項）第９または１０項に記載の前処理方法において、赤外線スペクトルをクラスタ解析することにより、生物を分類するステップをさらに含む。
　第１１項に記載の分析方法によれば、赤外線スペクトルに基づいて、分析試料が由来する生物を簡易な方法で分類できる。
　（第１２項）第９～１１のいずれか１項に記載の分析方法において、分析試料にマトリクス物質を加えるステップと、マトリクス物質を加えた分析試料に対し、マトリクス支援レーザ脱離イオン化法の質量分析を行なうことによりマススペクトルを取得するステップとをさらに含む。
　第１２項に記載の分析方法によれば、赤外分光分析用に前処理された分析試料を、質量分析にも供することができる。したがって、質量分析用の試料を新たに調製する手間が省ける。また、同一培養試料を同一条件で前処理した同一分析試料についての赤外分光分析の結果と、質量分析の結果とを比較することができる。
　（第１３項）第１２項に記載の分析方法において、マトリクス物質を加えるステップは、試料プレート上の乾燥物に、マトリクス物質を含むマトリクス溶液を加えるステップを含む、請求項１２に記載の分析方法。
　第１３項に記載の分析方法によれば、質量分析のために、質量分析用の試料プレートに新たに分析試料を滴下する手間を省くことができる。
　（第１４項）第１２または１３項に記載の分析方法において、赤外分光分析による分析結果と質量分析による分析結果とを表示するステップをさらに備える。
　第１４項に記載の分析方法によれば、赤外分光分析による分析結果と質量分析による分析結果とを容易に比較検討できる。
　（第１５項）コンピュータによって実行されることにより、コンピュータに第９～１４のいずれか１項に記載の分析方法を実施させる、プログラム。
　第１５項に記載のプログラムによれば、本実施形態に記載の分析方法を自動で実施することができる。
　（第１６項）他の態様に係る分析システムは、赤外分光光度計と、質量分析計とを備える。赤外分光光度計は、生物の細胞を含む試料を、細胞を有機酸を含む第１酸性溶液と接触させる前処理を行なうことによって得られた分析試料を赤外分光分析する。質量分析計は、分析試料を質量分析する。
　第１６項に記載の分析システムによれば、ビーズを用いずに、有機酸に接触させという簡易な方法で、赤外分光分析のための細胞破砕ができる。そして、赤外分光分析用に前処理された分析試料を、質量分析にも供することができる。したがって、質量分析用の試料を新たに調製する手間が省ける。また、同一培養試料を同一条件で前処理した同一分析試料についての赤外分光分析の結果と、質量分析の結果とを比較することができる。
　今回開示された実施の形態はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて請求の範囲によって示され、請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
　１　前処理部、２　赤外分光光度計、３　質量分析計、４　制御装置、１０　分析部、４１　プロセッサ、４２　メモリ、４３　ディスプレイ、１００　分析システム、Ｃ１，Ｃ２，Ｃ３，Ｃ４　クラスタ、Ｓ　イオン。

Claims (16)

  1. 　赤外分光分析のための、生物の細胞を含む試料の前処理方法であって、
    　有機酸を含む第１酸性溶液を準備するステップと、
    　前記細胞を、前記第１酸性溶液と接触させるステップとを備える、前処理方法。
  2. 　前記有機酸は、ギ酸、トリフルオロ酢酸および乳酸からなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、請求項１に記載の前処理方法。
  3. 　前記第１酸性溶液と接触させるステップは、前記試料と前記第１酸性溶液との混合溶液である第２酸性溶液を作製するステップを含む、請求項１または２に記載の前処理方法。
  4. 　前記有機酸の濃度は、前記第１酸性溶液または前記第２酸性溶液を基準として、５０体積％以上９０体積％以下である、請求項３に記載の前処理方法。
  5. 　前記第２酸性溶液は、アセトニトリルをさらに含む、請求項３に記載の前処理方法。
  6. 　前記第２酸性溶液を遠心分離し、沈殿を除去するステップをさらに含む、請求項３に記載の前処理方法。
  7. 　前記第１酸性溶液と接触させるステップの前に、前記細胞をエタノール水溶液に分散させるステップをさらに備え、
    　前記エタノール水溶液におけるエタノールの濃度は、前記エタノール水溶液を基準として７０体積％以上９０体積％以下である、請求項１または２に記載の前処理方法。
  8. 　前記生物は、微生物である、請求項１または２に記載の前処理方法。
  9. 　請求項１に記載の前処理方法によって前記試料を前処理して得られた分析試料を、試料プレートに所定量滴下し乾燥することによって、乾燥物を作製するステップと、
    　前記乾燥物について、フーリエ変換赤外分光法による赤外分光分析を行なうことにより赤外線スペクトルを取得するステップとを含む、分析方法。
  10. 　前記所定量は、１μＬ以上１５μＬ以下である、請求項９に記載の分析方法。
  11. 　前記赤外線スペクトルをクラスタ解析することにより、前記生物を分類するステップをさらに含む、請求項９または１０に記載の分析方法。
  12. 　前記分析試料にマトリクス物質を加えるステップと、
    　前記マトリクス物質を加えた前記分析試料に対し、マトリクス支援レーザ脱離イオン化法の質量分析を行なうことによりマススペクトルを取得するステップとをさらに含む、請求項１１に記載の分析方法。
  13. 　前記マトリクス物質を加えるステップは、前記試料プレート上の前記乾燥物に、前記マトリクス物質を含むマトリクス溶液を加えるステップを含む、請求項１２に記載の分析方法。
  14. 　赤外分光分析による分析結果と質量分析による分析結果とを表示するステップをさらに備える、請求項１２に記載の分析方法。
  15. 　コンピュータによって実行されることにより、前記コンピュータに請求項１２に記載の分析方法を実施させる、プログラム。
  16. 　赤外分光光度計と、
    　質量分析計とを備え、
    　前記赤外分光光度計は、生物の細胞を含む試料を、前記細胞を有機酸を含む第１酸性溶液と接触させる前処理を行なうことによって得られた分析試料を赤外分光分析し、
    　前記質量分析計は、前記分析試料を質量分析する、分析システム。
PCT/JP2024/030693 2023-09-19 2024-08-28 前処理方法、分析方法、プログラムおよび分析システム Pending WO2025062975A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2023-150746 2023-09-19
JP2023150746 2023-09-19

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2025062975A1 true WO2025062975A1 (ja) 2025-03-27

Family

ID=95072789

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2024/030693 Pending WO2025062975A1 (ja) 2023-09-19 2024-08-28 前処理方法、分析方法、プログラムおよび分析システム

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2025062975A1 (ja)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015521035A (ja) * 2012-05-01 2015-07-27 オクソイド・リミテッド 微生物学的分析用の装置及び方法
CN110687191A (zh) * 2019-10-22 2020-01-14 宁波大学 基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱与ftir光谱联用的微生物鉴定和分型方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015521035A (ja) * 2012-05-01 2015-07-27 オクソイド・リミテッド 微生物学的分析用の装置及び方法
CN110687191A (zh) * 2019-10-22 2020-01-14 宁波大学 基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱与ftir光谱联用的微生物鉴定和分型方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DOKE, KOHEI: "The latest microbial monitoring technology -Supports species identification and Strain identification-", A TECHNICAL JOURNAL ON FOOD CHEMISTRY & CHEMICALS, SHOKUHIN KAGAKU SHINBUNSHA, TOKYO, JP, vol. 39, no. 6, 1 June 2023 (2023-06-01), JP , pages 10 - 15, XP009562213, ISSN: 0911-2286 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Duportet et al. The biological interpretation of metabolomic data can be misled by the extraction method used
Bader MALDI‐TOF‐MS‐based species identification and typing approaches in medical mycology
Freiwald et al. Phylogenetic classification and identification of bacteria by mass spectrometry
De Bruyne et al. Bacterial species identification from MALDI-TOF mass spectra through data analysis and machine learning
Lecellier et al. Differentiation and identification of filamentous fungi by high-throughput FTIR spectroscopic analysis of mycelia
Amantonico et al. Single-cell MALDI-MS as an analytical tool for studying intrapopulation metabolic heterogeneity of unicellular organisms
Qi et al. Single cell neurometabolomics
Cameron et al. Rapid evaporative ionisation mass spectrometry (REIMS) provides accurate direct from culture species identification within the genus Candida
CN108507845B (zh) 一种飞行时间质谱系统微生物样本前处理的试剂盒
Stübiger et al. Characterization of yeasts and filamentous fungi using MALDI lipid phenotyping
US8980577B2 (en) Mass spectrometric identification of hyphal fungi
WO2014128629A1 (en) Method to identify bacterial species by means of gas chromatography/mass spectrometry in biological samples
Hlaing et al. Raman spectroscopic identification of single bacterial cells at different stages of their lifecycle
CN107621500A (zh) 氨基酸与肉碱串联质谱衍生化检测法
CN103245716A (zh) 基于小分子代谢物质谱分析的快速高灵敏度微生物鉴定方法
Chun et al. A consolidative synopsis of the MALDI-TOF MS accomplishments for the rapid diagnosis of microbial plant disease pathogens
CN116682494A (zh) 一种监测发酵过程中微生物群落结构的方法
WO2025062975A1 (ja) 前処理方法、分析方法、プログラムおよび分析システム
Levasseur-Garcia et al. An infrared diagnostic system to detect causal agents of grapevine trunk diseases
Farouk et al. Fast detection of bacterial contamination in fresh produce using FTIR and spectral classification
CN110887921B (zh) 一种高效快速分析杜仲叶及其发酵产物特征挥发性成分的方法
Adt et al. FTIR spectroscopic discrimination of Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces bayanus strains
Gorre et al. Introducing a Cell-Free approach for the identification of brewing yeast (Saccharomyces cerevisiae) strains using MALDI-TOF MS
Tao et al. Detection of pathogenic Verticillium spp. using matrix‐assisted laser desorption/ionization time‐of‐flight mass spectrometry
JP2011147403A (ja) 細菌検査装置及び細菌検査方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 24868055

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1