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WO2024248042A1 - ＭｕＳＫを標的とする新規化合物及びその用途 - Google Patents

ＭｕＳＫを標的とする新規化合物及びその用途 Download PDF

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WO2024248042A1
WO2024248042A1 PCT/JP2024/019710 JP2024019710W WO2024248042A1 WO 2024248042 A1 WO2024248042 A1 WO 2024248042A1 JP 2024019710 W JP2024019710 W JP 2024019710W WO 2024248042 A1 WO2024248042 A1 WO 2024248042A1
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WO
WIPO (PCT)
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musk
amino acid
molecule
cyclic peptide
seq
Prior art date
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Pending
Application number
PCT/JP2024/019710
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English (en)
French (fr)
Inventor
裕明 菅
ハイデン ピーコック
光博 山田
直也 河上
理 樋口
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Tokyo NUC
National Hospital Organization
Original Assignee
University of Tokyo NUC
National Hospital Organization
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Tokyo NUC, National Hospital Organization filed Critical University of Tokyo NUC
Publication of WO2024248042A1 publication Critical patent/WO2024248042A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Pending legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/12—Cyclic peptides, e.g. bacitracins; Polymyxins; Gramicidins S, C; Tyrocidins A, B or C
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to a novel compound that activates signal transmission at the neuromuscular junction and a therapeutic agent for myasthenia gravis.
  • the present invention also relates to a method for selecting a ubiquitin molecule to which a cyclic peptide pharmacophore has been grafted.
  • Myasthenia gravis is an autoimmune disease in which autoantibodies are directly involved in the pathology. It is characterized by the appearance of generalized muscle weakness and fatigue, and is particularly prone to eye symptoms such as ptosis and diplopia (Non-Patent Document 1). It is believed that in myasthenia gravis, autoantibodies destroy or inhibit the function of several molecules present on the muscle side (signal receiver) at the connection between peripheral nerves and muscles (neuromuscular junction), preventing signals from being transmitted from nerves to muscles, resulting in muscle weakness.
  • autoantibodies The most common molecule targeted by autoantibodies is the acetylcholine receptor (AChR), accounting for approximately 85% of all cases, followed by muscle-specific tyrosine kinase (MuSK) and low-density lipoprotein receptor-related protein 4 (LRP4), which are thought to account for a few percent of all cases. It is also known that there are patients with a seronegative type who are negative for all of these autoantibodies.
  • AChR acetylcholine receptor
  • MoSK muscle-specific tyrosine kinase
  • LRP4 low-density lipoprotein receptor-related protein 4
  • These drugs are intended to treat myasthenia gravis that is positive for anti-acetylcholine receptor antibodies, but neither of them can be used for myasthenia gravis that is not associated with an increased risk of infection with Neisseria meningitidis or complement activation, or for myasthenia gravis other than the anti-acetylcholine receptor antibody positive type.
  • the present invention aims to provide a novel compound that activates signal transmission from nerves to muscles at the neuromuscular junction and a new therapeutic agent for myasthenia gravis.
  • the present invention also aims to provide a new method for selecting ubiquitin molecules to which a cyclic peptide pharmacophore has been grafted.
  • a cyclic peptide or a pharma- ceutically acceptable salt thereof comprising the structure of the following formula (I): -X 1 -Asn-X 2 -Val- (I) (In the above formula, X1 represents Thr or Val, and X2 represents Val or Ile.)
  • X1 represents Thr or Val
  • X2 represents Val or Ile.
  • a cyclic peptide complex or a pharma- ceutically acceptable salt thereof comprising two cyclic peptides according to any one of [1] to [6] above, wherein one cyclic peptide is bound to the other cyclic peptide via a linker.
  • a MuSK-binding domain-grafted ubiquitin molecule complex or a pharma- ceutical acceptable salt thereof comprising two or more (e.g., 2 to 6, preferably 2 to 4) MuSK-binding domain-grafted ubiquitin molecules according to any one of [12] to [15] above, wherein one MuSK-binding domain-grafted ubiquitin molecule is linked to another MuSK-binding domain-grafted ubiquitin molecule via a linker.
  • a pharmaceutical composition or a therapeutic agent for myasthenia gravis comprising as an active ingredient a cyclic peptide according to any one of [1] to [6] above or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, a cyclic peptide complex according to any one of [7] to [11] above or a pharma-ceutical acceptable salt thereof, a MuSK-binding domain-grafted ubiquitin molecule according to any one of [12] to [15] above or a pharma-ceutical acceptable salt thereof, or a MuSK-binding domain-grafted ubiquitin molecule complex according to any one of [16] to [19] above or a pharma-ceutical acceptable salt thereof.
  • a method for treating myasthenia gravis comprising administering a therapeutically effective amount of a cyclic peptide according to any one of [1] to [6] above or a pharma- ceutical acceptable salt thereof, a cyclic peptide complex according to any one of [7] to [11] above or a pharma-ceutical acceptable salt thereof, a MuSK-binding domain-grafted ubiquitin molecule according to any one of [12] to [15] above or a pharma-ceutical acceptable salt thereof, or a MuSK-binding domain-grafted ubiquitin molecule complex according to any one of [16] to [19] above or a pharma-ceutical acceptable salt thereof, or a therapeutic agent or pharmaceutical composition containing the same to a subject in need thereof.
  • [20-4] Use of a cyclic peptide or a pharma- ceutical acceptable salt thereof according to any one of [1] to [6] above, a cyclic peptide complex or a pharma-ceutical acceptable salt thereof according to any one of [7] to [11] above, a MuSK-binding domain-grafted ubiquitin molecule or a pharma-ceutical acceptable salt thereof according to any one of [12] to [15] above, or a MuSK-binding domain-grafted ubiquitin molecule complex or a pharma-ceutical acceptable salt thereof according to any one of [16] to [19] above, for the manufacture of a medicament or a therapeutic agent for myasthenia gravis, in a method for treating myasthenia gravis, or as a medicament or a therapeutic agent for myasthenia gravis.
  • a method for presenting a cyclic peptide having binding activity to a desired molecule (preferably a MuSK molecule) together with two spacer sequences on a loop structure region between the ⁇ 1 domain and the ⁇ 2 domain of a ubiquitin molecule comprising the steps of:
  • the cyclic peptide has a chemical bridge structure for forming an intramolecular cyclic structure
  • the method includes fusing the cyclic peptide to a ubiquitin molecule while retaining its binding activity to a desired molecule (preferably a MuSK molecule) by replacing a chemical crosslinking structure of the cyclic peptide with two amino acid residues constituting the loop structure via a spacer sequence,
  • the method, wherein the spacer sequence consists of a randomly generated amino acid sequence of 0 to 4 residues (preferably 3 or 4 residues).
  • the desired molecule is a MuSK molecule
  • the cyclic peptide and spacer sequence presented on the loop structure region of the ubiquitin molecule have the following structure (B):
  • spacer 3 is a peptide chain consisting of any 0 to 4 (preferably 3 or 4) amino acids
  • spacer 4 is a peptide chain consisting of any 0 to 4 (preferably 3 or 4) amino acids
  • the MuSK binding region is a region present in the cyclic peptide and having MuSK molecule binding activity.
  • the presentation method according to [21] above comprising: [23] The presentation method according to [21] or [22] above, wherein the loop structure region of the ubiquitin molecule is the loop structure region between the ⁇ 1 domain and the ⁇ 2 domain.
  • a method for producing a modified protein comprising fusing a cyclic peptide having binding activity to a desired molecule (preferably a MuSK molecule) together with two spacer sequences onto a loop structure region of a ubiquitin molecule to display the cyclic peptide on the protein, comprising the steps of:
  • the cyclic peptide has a chemical bridge structure for forming an intramolecular cyclic structure, a partial amino acid sequence to be displayed on a protein is selected from the amino acid sequence of the cyclic peptide, and a base sequence corresponding to the partial amino acid sequence is selected; preparing a nucleic acid having a base sequence incorporating a base sequence obtained by selecting a base sequence corresponding to two amino acid residues constituting a loop structure region of a ubiquitin molecule, deleting bases present between the selected base sequences as necessary, and inserting a base sequence corresponding to a partial amino acid sequence of the selected cyclic peptide; translating the nucleic acid;
  • the desired molecule is a MuSK molecule
  • the cyclic peptide and spacer sequence presented on the loop structure region of the ubiquitin molecule have the following structure (B):
  • spacer 3 is a peptide chain consisting of any 0 to 4 (preferably 3 or 4) amino acids
  • spacer 4 is a peptide chain consisting of any 0 to 4 (preferably 3 or 4) amino acids
  • the MuSK binding region is a region present in the cyclic peptide and having MuSK molecule binding activity.
  • a method for screening for a variant protein capable of binding to a desired molecule comprising the steps of: designing an mRNA library containing a base sequence encoding a ubiquitin molecule in which a sequence of a cyclic peptide having binding activity to a desired molecule (preferably a MuSK molecule) and a spacer sequence consisting of a randomly generated amino acid sequence of 0 to 4 residues (preferably 3 or 4 residues) linked upstream and downstream of the sequence of the cyclic peptide are fused to a loop structure region between the ⁇ 1 domain and the ⁇ 2 domain; and preparing a modified protein based on the designed mRNA library according to the production method described in [28] above; A screening method comprising selecting a mutant protein capable of binding to a desired molecule (preferably a mutant protein capable of binding to MuSK) from the mutant proteins obtained using binding ability to the desired molecule (preferably MuSK binding activity) as an index.
  • a mutant protein capable of binding to a desired molecule preferably a mutant protein capable
  • a peptide comprising the structure of the following formula (I) or a pharma- ceutically acceptable salt thereof: -X 1 -Asn-X 2 -Val- (I) (In the above formula, X1 represents Thr or Val, and X2 represents Val or Ile.) [33] The peptide according to [32] above, or a pharma- ceutically acceptable salt thereof, wherein the peptide consists of 8 to 20 amino acid residues. [34] The peptide according to [32] or [33] above, or a pharma- ceutically acceptable salt thereof, which is grafted into a biomolecule.
  • the cyclic peptide and MuSK-binding domain-grafted ubiquitin molecule and their complexes provided by the present invention can directly enhance signals essential for the formation and maintenance of neuromuscular junctions. Therefore, the present invention is advantageous in that it provides a new modality molecule that enables the treatment of myasthenia gravis.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the mechanism of MuSK homodimerization and subsequent clustering of acetylcholine receptors.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing the mechanism of homodimerization of MuSK caused by binding of a MuSK-binding dimeric peptide to the extracellular domain of MuSK, and subsequent clustering of acetylcholine receptors.
  • Figure 3A is a schematic diagram of an approach to generate a library of thioether-cyclic peptides using a flexible in vitro translation (FIT) system and rapidly search for target-binding cyclic peptides by RaPID screening.
  • FIT flexible in vitro translation
  • FIG 3B is a schematic diagram of an approach to graft the pharmacophore region of a specific cyclic peptide selected by RaPID screening onto a scaffold protein by the Lasso grafting method, and to place spacers upstream and downstream of the grafted peptide to generate a library of constructed mRNA fusion proteins.
  • Figure 4 shows the results of a selection of peptide sequences identified from the initial RaPID screen for affinity to MuSK. The progress of affinity selection was expressed as the percentage of mRNA bound to MuSK-bead complexes (Positive) or just beads (Negative) relative to the total number of mRNAs used in each round of affinity selection.
  • FIG. 5 shows SPR sensorgrams of MuSK-binding monomer peptides analyzed by Biacore T200 in the concentration range of 1.6 to 1000 nM. A fitted curve to the measured curve is also shown.
  • FIG. 6-1 is a diagram showing the structures of homodimers of cyclic peptides (MuSK4, MuSK7 and MuSK9).
  • FIG. 6-2 shows the structure of a homodimer of a linear peptide (MuSK1Ac).
  • Figure 7 shows the chemical structure of MuSK7 homodimer (MuSK7 PEG11 dimer) using Bis-Mal-dPEG (trademark) 11 as a linker.
  • FIG. 8 shows the chemical structure of a MuSK7 homodimer into which a palmitoyl group has been introduced.
  • Figure 9A shows that the cyclic peptide complex (MuSK7 PEG11 dimer) of the present invention induces acetylcholine receptor clusters in a concentration-dependent manner at the cultured myotube cell level.
  • Figure 9B shows a dose-response curve of the cyclic peptide complex (MuSK7 PEG11 dimer) of the present invention with respect to the number of acetylcholine receptor clusters.
  • Figure 9C shows the effect of AST-487 on acetylcholine receptor cluster-inducing activity.
  • Figure 10A is a schematic diagram showing the two molecules used in the NanoBiT assay.
  • FIG. 10B shows the results of evaluation using the NanoBiT assay, and is a dose-response curve for MuSK dimerization of the cyclic peptide complex of the present invention (MuSK7-pal).
  • FIG. 11 shows the results of evaluation of the therapeutic effect (body weight change) of the cyclic peptide complex (high dose) of the present invention on myasthenia gravis model animals.
  • FIG. 21 illustrates an approach to generating MET-binding domain-grafted ubiquitin molecules by replacing 0-4 consecutive residues in the ⁇ 1-2 loop with a pharmacophore sequence flanked upstream and downstream with various flanking spacer sequences (randomized 0-3 spacer residues, indicated as X in the diagram).
  • FIG. 21 illustrates an approach to generating MET-binding domain-grafted ubiquitin molecules by replacing 0-4 consecutive residues in the ⁇ 1-2 loop with a pharmacophore sequence flanked upstream and downstream with various flanking spacer sequences (randomized 0-3 spacer residues, indicated as X in the diagram).
  • An example of an amino acid having a functional group (C-2) is 5-hydroxytryptophan (WOH).
  • Examples of the cyclization method using an amino acid having a functional group (C-1) and an amino acid having a functional group (C-2) include the methods described in Yamagishi, Y. et al., ChemBioChem 10, 1469-1472 (2009) and WO 2008/117833.
  • Examples of amino acids having a functional group (D-1) include 2-amino-6-chloro-hexynoic acid, 2-amino-7-chloro-heptynoic acid, and 2-amino-8-chloro-octynoic acid.
  • amino acids having a functional group examples include cysteine, homocysteine, mercaptonorvaline, mercaptonorleucine, 2-amino-7-mercaptoheptanoic acid, and 2-amino-8-mercaptooctanoic acid.
  • Examples of the cyclization method using an amino acid having a functional group (D-1) and an amino acid having a functional group (D-2) include the method described in WO 2012/074129.
  • amino acids (E-1) examples include N-3-chloromethylbenzoyl-L-phenylalanine, N-3-chloromethylbenzoyl-L-tyrosine, N-3-chloromethylbenzoyl-L-tryptophan, and the corresponding D-amino acid derivatives.
  • Examples of (E-2) amino acids include cysteine, homocysteine, mercaptonorvaline, mercaptonorleucine, 2-amino-7-mercaptoheptanoic acid, and 2-amino-8-mercaptooctanoic acid.
  • the cyclization method using an amino acid having a functional group (E-1) and an amino acid having a functional group (E-2) can be carried out with reference to, for example, the cyclization method between (A-1) and (A-2) or the cyclization method between (D-1) and (D-2).
  • a more preferred example of the cyclic peptide of the present invention is a cyclic peptide having the structure of the following formula (IV).
  • Tyr may be D- or L-form, preferably D-form, S represents a thiol group of Cys, the portion referred to as the "variable region” is a peptide chain containing at least the unit structure of formula (I) (the amino acid length can be 4-28, 5-26, 6-18, 10-16, or 11-15), and may be a peptide chain corresponding to -(Z 4 )p-X 1 -Asn-X 2 -Val-(Z 5 )q- in formula (III), and (Z 6 )r is as defined in formula (III).)
  • the "variable region” can be represented by the following formula (V). -(Z 4 )p-X 1 -Asn-X 2 -Val-(Z 5 )q- (V) (In the above formula, X1 and X2 are defined as in formula (I), Z4 and Z5 , and p and q are defined as in formula (III), and specific explanations and preferred embodiments are as explained in formula (III).)
  • cyclic peptide represented by formula (IV) above include those having any of the structures represented by formula (1) (MuSK7/SEQ ID NO:2), formula (2) (MuSK4/SEQ ID NO:3) and formula (3) (MuSK9/SEQ ID NO:4) below.
  • formulas (1) to (3) below the linear structural portion corresponding to (Z 6 )r bonded to Cys in formula (IV) above is omitted. Therefore, in formulas (1) to (3) below, C(Cys) bonded to -SCH 2 - may be bonded to (Z 6 )r (Z 6 and r are as defined in formula (III)).
  • the cyclic peptide of the present invention has high affinity for MuSK and can bind strongly to MuSK, and can be used as a MuSK agonist.
  • the complex containing the cyclic peptide of the present invention binds to the extracellular domain of MuSK, thereby inducing homodimerization of MuSK, thereby selectively inducing downstream MuSK signaling, and thus activating signal transmission from nerve to muscle at the neuromuscular junction. Therefore, unlike the approach that targets anti-acetylcholine receptor autoantibodies that has been studied in the past, the cyclic peptide of the present invention can strongly activate signal transmission at the neuromuscular junction, and is advantageous in that it can provide a treatment and research method different from existing methods.
  • the cyclic peptide of the present invention and a pharma- ceutical acceptable salt thereof are useful as medicines and research reagents, and according to the present invention, a pharmaceutical composition containing the cyclic peptide of the present invention and a pharma- ceutical acceptable salt thereof, and the use of the cyclic peptide of the present invention and a pharma- ceutical acceptable salt thereof as a medicine are provided.
  • a peptide comprising the structure of formula (I) below, or a pharma- ceutically acceptable salt thereof: -X 1 -Asn-X 2 -Val- (I) (In the above formula, X1 represents Thr or Val, and X2 represents Val or Ile.)
  • the lower limit (or more) of the number of amino acid residues in the peptide of the present invention can be, for example, 7, 8, 9, 10, 11, 12 or 13, and the upper limit (or less) can be 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16 or 15. These lower and upper limits can be arbitrarily combined to form a range of the number of amino acid residues forming the peptide, for example, 6 to 30, 7 to 25, 8 to 20, 12 to 18, or 13 to 17.
  • the above-mentioned peptide of the present invention may be a peptide consisting of the same amino acid sequence as the amino acid sequence of the cyclic peptide of the present invention or a part of the amino acid sequence thereof, and is preferably a peptide containing an amino acid sequence constituting a region having MuSK molecule binding activity present in the cyclic peptide of the present invention (i.e., MuSK binding region), more preferably a peptide containing the amino acid sequence YX22SYHTNVVASLKR ( X22 is P or L) (SEQ ID NO: 11).
  • the above-mentioned peptide of the present invention may also be a non-cyclic peptide.
  • the above-mentioned peptides of the present invention can be used by grafting them to a desired biomolecule, such as the MuSK-binding domain-grafted ubiquitin molecule described below.
  • a desired biomolecule such as the MuSK-binding domain-grafted ubiquitin molecule described below.
  • biomolecules to be grafted include bioproteins such as ubiquitin molecules.
  • the above-mentioned peptides of the present invention can be peptides that have binding properties to a desired molecule, and can be grafted to a biomolecule so that the binding properties of the peptide are exerted.
  • the above-mentioned peptides of the present invention are peptides that contain an amino acid sequence that constitutes a region that has MuSK molecule-binding activity present in the cyclic peptide of the present invention, they can be grafted to a biomolecule so that the MuSK binding properties of the peptide are exerted.
  • the above-mentioned peptides of the present invention grafted to a biomolecule are within the scope of the present invention as long as the peptides exhibit binding properties to a desired molecule.
  • the above-mentioned peptides of the present invention can be grafted into a loop structure region between two consecutive domain structures in a protein, such as the ubiquitin molecule described below.
  • the cyclic peptide of the present invention can be suitably produced by a translation synthesis method using a cell-free translation system.
  • the cyclic peptide can be prepared by preparing a nucleic acid encoding the cyclic peptide and translating the nucleic acid in a cell-free translation system.
  • the nucleic acid encoding the cyclic peptide can be appropriately designed by a person skilled in the art using a genetic code used in a translation system of a living organism, a reprogrammed genetic code, or a combination thereof.
  • the nucleic acid may be DNA or RNA.
  • tRNA aminoacylated with a non-natural amino acid can be used to efficiently introduce non-natural amino acids into peptides in addition to natural amino acids.
  • the artificial aminoacyl-tRNA synthetase flexizyme developed by the present inventors, it is possible to aminoacylate a tRNA having any anticodon with any natural or non-natural amino acid. Therefore, using this technology, the genetic code consisting of an mRNA triplet can be reprogrammed to code for an amino acid different from that in the translation system of a living organism (see, for example, WO 2008/059823).
  • the cyclic peptide complex of the present invention comprises two cyclic peptides of the present invention, and has a structure in which one cyclic peptide is bound to the other cyclic peptide via a linker.
  • Agrin binds to the first ⁇ -propeller structure of its receptor, LRP4.
  • MuSK binds to another propeller structure of LRP4 in its extracellular domain (the Ig1 domain, an immunoglobulin-like region). It is believed that the binding of Agrin to LRP4 forms an Agrin-LRP4-MuSK complex, which induces homodimerization of MuSK. It is also known that the formation of this complex, together with the action of the intracellular factor Dok-7, activates the intracellular kinase domain of MuSK, which then activates downstream signal transduction via autophosphorylation of MuSK (Zong Y. et al., GENES & DEVELOPMENT 2012; 26:247-258).
  • the cyclic peptide complex of the present invention can activate signal transmission from nerves to muscles at the neuromuscular junction.
  • the cyclic peptide complex of the present invention is useful as a therapeutic agent for myasthenia gravis caused by abnormal signal transmission at the neuromuscular junction. That is, the cyclic peptide complex of the present invention and a pharma- ceutical acceptable salt thereof are useful as medicines, and the present invention provides a pharmaceutical composition containing the cyclic peptide complex of the present invention and a pharma-ceutical acceptable salt thereof, and the use of the cyclic peptide complex of the present invention and a pharma-ceutical acceptable salt thereof as a medicine.
  • the cyclic peptide complex of the present invention contains two cyclic peptides of the present invention, and as long as one cyclic peptide is bound to the other cyclic peptide via a linker, the above-mentioned effect can be achieved, and the two cyclic peptides may be the same or different. From the viewpoint of further promoting homodimerization of MuSK, it is preferable that the two cyclic peptides in the peptide complex are the same.
  • the linker connecting the two cyclic peptides in the cyclic peptide complex is not particularly limited, and any linker with a structure well known in the field of peptide synthesis as a linker connecting peptides can be used, but from the viewpoint of further promoting homodimerization of MuSK, it is preferable that the length of the linker is 20 ⁇ or more and 100 ⁇ or less.
  • Non-limiting examples of linkers connecting two cyclic peptides in a peptide conjugate include polymers such as polyethylene glycol (PEG), peptides, nucleic acids, sugars, and combinations thereof.
  • Linkers containing PEG include those in which two PEGs are bonded to small molecules having two or more functional groups, and a non-limiting example is a carboxylic acid-modified PEG bonded to the amino group of 2,3-diaminopropionic acid.
  • Linkers containing PEG also include PEGs having two functional groups at both ends, which may be the same or different, and a non-limiting example is a PEG having two maleimide groups at both ends.
  • Linkers containing PEG can be specified as those containing an ethylene glycol structure (-CH 2 O-), and the polymerization number of ethylene glycol may be 2 to 20 or 5 to 15.
  • the peptide complex of the present invention may have at least one saturated hydrocarbon group having 8 to 20 carbon atoms (preferably 12 to 18 or 14 to 18 carbon atoms) as a side chain in order to further improve stability in blood.
  • This saturated hydrocarbon group can be preferably introduced into a linker.
  • the linker is a linker in which two PEGs are bonded to a small molecule having two or more functional groups, a saturated fatty acid is bonded directly or indirectly to the third functional group of the small molecule.
  • a non-limiting example is a linker in which a carboxylic acid-modified PEG is bonded to the amino group of 2,3-diaminopropionic acid, and a saturated fatty acid having 8 to 20 carbon atoms (preferably 12 to 18 or 14 to 18 carbon atoms) is bonded indirectly to the carboxyl group of 2,3-diaminopropionic acid.
  • saturated fatty acids having 8 to 20 carbon atoms include palmitic acid (16 carbon atoms) and myristic acid (14 carbon atoms).
  • the cyclic peptide complex of the present invention can be produced by linking the cyclic peptide of the present invention with a suitable linker.
  • the step of linking the cyclic peptide of the present invention with a linker can be carried out by a person skilled in the art using a known method for linking a linker and a peptide, or a method equivalent thereto, depending on the type of linker used.
  • the linker is a linker in which two PEGs are bonded to a small molecule having two or more functional groups
  • an amino group is introduced in advance at each end of the two PEGs, and the amino group is linked to the carboxyl group at the C-terminus of the cyclic peptide of the present invention by an amide bond to prepare a peptide complex.
  • the linker is a PEG having two functional groups (e.g., maleimide groups) at both ends, which may be the same or different
  • the two functional groups can be chemically bonded to the functional group at the C-terminus of the cyclic peptide of the present invention (e.g., a thiol group of cysteine) to prepare a peptide complex.
  • a peptide complex can be prepared by linking two nucleic acids, one encoding the cyclic peptide of the present invention and the other encoding a linker peptide, and expressing a fusion protein of the cyclic peptide of the present invention and the linker peptide.
  • the MuSK-binding domain-grafted ubiquitin molecule of the present invention is one in which a part or the whole of the loop structure region between the ⁇ 1 domain and the ⁇ 2 domain of the ubiquitin molecule is replaced with a peptide chain containing the MuSK-binding domain.
  • the MuSK-binding domain-grafted ubiquitin molecule of the present invention is also one in which a peptide chain containing the MuSK-binding domain is inserted into the loop structure region between the ⁇ 1 domain and the ⁇ 2 domain of the ubiquitin molecule.
  • a ubiquitin molecule in which the whole of the loop structure region between the ⁇ 1 domain and the ⁇ 2 domain of the ubiquitin molecule is replaced with a peptide of structure (A) is preferred.
  • ubiquitin is a protein that is ubiquitous in eukaryotes, and is known to be highly evolutionarily conserved and thermostable. Ubiquitin also contains two ⁇ -helices and five ⁇ -sheets, specifically, from the N-terminus to the C-terminus, it has ⁇ -helices and ⁇ -sheets in the following order: ⁇ 1 ( ⁇ -sheet 1), ⁇ 2 ( ⁇ -sheet 2), ⁇ 1 ( ⁇ -helix 1), ⁇ 3 ( ⁇ -sheet 3), ⁇ 4 ( ⁇ -sheet 4), ⁇ 2 ( ⁇ -helix 2), and ⁇ 5 ( ⁇ -sheet 5).
  • the regions connecting the ⁇ -sheets and the ⁇ -helices and ⁇ -sheets are called loops, and the ubiquitin molecule of the present invention is characterized in that a peptide chain containing a MuSK binding region is grafted into the loop structure region between ⁇ 1 and ⁇ 2.
  • the ubiquitin molecule to be grafted can be, for example, a protein (human ubiquitin molecule) consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • ⁇ 1 corresponds to the region from amino acid 1 to 6 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • the ⁇ 1- ⁇ 2 loop corresponds to the region from amino acid 7 to 10 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • ⁇ 2 corresponds to the region from amino acid 11 to 17 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the ubiquitin molecule of the present invention will be explained using the case where the ubiquitin molecule to be grafted has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 as an example, but the ubiquitin molecule of the present invention is not limited to this.
  • the ubiquitin molecule to be grafted has the amino acid sequence of SEQ ID NO:1
  • "the entire loop structure region between the ⁇ 1 domain and the ⁇ 2 domain of the ubiquitin molecule is replaced by the peptide of structure (A)” means that the region from amino acid 7 to 10 of the amino acid sequence of SEQ ID NO:1 has a structure replaced by the peptide of structure (A).
  • the ubiquitin molecule of the present invention has a peptide of structure (A) downstream of the 6th amino acid and upstream of the 11th amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO:1 (see FIG. 23).
  • the ubiquitin molecule to be grafted has the amino acid sequence of SEQ ID NO:1
  • "a part of the loop structure region between the ⁇ 1 domain and the ⁇ 2 domain of the ubiquitin molecule is replaced by the peptide of structure (A)” means that any of the following in the amino acid sequence of SEQ ID NO:1 is replaced by the peptide of structure (A): the 7th amino acid, the 8th amino acid, the 9th amino acid, the 10th amino acid, the region from the 7th to the 8th, the region from the 8th to the 9th, the region from the 9th to the 10th, the region from the 7th to the 9th, and the region from the 8th to the 10th.
  • the ubiquitin molecule of the present invention has a peptide of structure (A) downstream of the 7th amino acid and upstream of the 10th amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO:1.
  • the ubiquitin molecule of the present invention has a peptide of structure (A) downstream of the 8th amino acid and upstream of the 9th amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO:1.
  • the ubiquitin molecule to be grafted may be a protein consisting of an amino acid sequence other than the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, so long as its binding activity to MuSK is not hindered.
  • a protein consisting of an amino acid sequence having a sequence identity of 90% or more (preferably 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more) with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 can be used as the ubiquitin molecule to be grafted.
  • identity can be calculated using, for example, a publicly available homology search program such as those described above, for example, the National Center for Biotechnology Information (NCBI) homology algorithm BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) using default parameters.
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • Non-limiting examples of amino acid modifications in the amino acid sequence of SEQ ID NO:1 include substitution mutations of K11M, K11E, K11T, T12L, T12K, P37R, R54S, R54G, S57T, Q62K, and S65T, and the amino acid sequence of SEQ ID NO:1 may have one, two, or three of these mutations.
  • the MuSK-binding domain-grafted ubiquitin molecule of the present invention has high affinity for MuSK and can bind strongly to MuSK, and can be used as a MuSK agonist.
  • the complex containing the ubiquitin molecule of the present invention binds to the extracellular domain of MuSK, thereby inducing homodimerization of MuSK, thereby selectively inducing downstream MuSK signal transduction, and thus activating signal transmission from nerve to muscle at the neuromuscular junction.
  • the grafted ubiquitin molecule complex of the present invention comprises a plurality of ubiquitin molecules of the present invention, and has a structure in which a plurality of grafted ubiquitin molecules are bound to each other via linkers.
  • the grafted ubiquitin molecular complex of the present invention has multiple pharmacophore configurations corresponding to the MuSK binding region, it is believed that each pharmacophore region in the grafted ubiquitin molecular complex binds to the extracellular domain of MuSK, thereby inducing homodimerization of MuSK (FIG. 2). Therefore, it is believed that the grafted ubiquitin molecular complex of the present invention can activate downstream signaling through autophosphorylation of MuSK and induce clustering of acetylcholine receptors. As a result, it is believed that the grafted ubiquitin molecular complex of the present invention can activate signal transmission from nerves to muscles at the neuromuscular junction.
  • the grafted ubiquitin molecule complex of the present invention contains a plurality of ubiquitin molecules of the present invention, and can exert the above-mentioned effect as long as the plurality of ubiquitin molecules of the present invention are linked to each other by a linker, and the plurality of grafted ubiquitin molecules may be the same or different. From the viewpoint of further promoting homodimerization of MuSK, it is preferable that the plurality of grafted ubiquitin molecules in the complex are the same.
  • the linker connecting multiple ubiquitin molecules is not particularly limited, and any linker with a structure well known in the field of peptide synthesis as a linker connecting peptides or proteins can be used, but from the viewpoint of further promoting homodimerization of MuSK, it is preferable that the length of the linker is 20 ⁇ or more and 100 ⁇ or less.
  • Non-limiting examples of linkers connecting multiple ubiquitin molecules in the grafted ubiquitin molecule complex of the present invention include, for example, peptides, polymers such as polyethylene glycol (PEG), nucleic acids, sugars, and combinations thereof.
  • Linkers containing peptides include peptides having a repeating structure of PA (for example, a peptide of A(PA)v, where v is an integer of 6 to 8, preferably 7), and peptides having a repeating structure of EAAAK (for example, a peptide of (EAAAK)x, where x is an integer of 2 to 4, preferably 3).
  • a linker connecting multiple grafted ubiquitin molecules taking a dimer as an example, the C-terminus of one grafted ubiquitin molecule and the N-terminus of the other grafted ubiquitin molecule can be linked by a peptide.
  • a similar structure can be used in the case of a complex of trimers or more. By using such a structure, a complex protein can be expressed from a single nucleic acid containing grafted ubiquitin molecules.
  • the grafted ubiquitin molecule of the present invention can use a linker containing PEG, specifically, the one described in the cyclic peptide complex of the present invention can be used.
  • the grafted ubiquitin molecule complex of the present invention can link the ubiquitin molecule of the present invention via a peptide.
  • the grafted ubiquitin molecule complex of the present invention can be suitably produced by a translation synthesis method using a cell-free translation system.
  • the complex can be prepared by preparing a nucleic acid encoding the grafted ubiquitin molecule complex of the present invention and translating the nucleic acid in a cell-free translation system.
  • the nucleic acid encoding the grafted ubiquitin molecule complex of the present invention can be appropriately designed by a person skilled in the art using a genetic code used in a translation system of a living organism, a reprogrammed genetic code, or a combination thereof.
  • the nucleic acid may be DNA or RNA.
  • the method using a cell-free translation system allows for the efficient introduction of unnatural amino acids into peptides in addition to natural amino acids by using tRNA aminoacylated with unnatural amino acids.
  • the grafted ubiquitin molecule complex of the present invention can also be prepared using a linker other than a peptide.
  • the step of linking the grafted ubiquitin molecule complex of the present invention with a linker can be carried out by a person skilled in the art using a known method for connecting a linker and a peptide, or a method equivalent thereto, depending on the type of linker used. Specifically, it can be prepared according to the procedure described in the method for producing a cyclic peptide complex of the present invention.
  • compositions comprise at least one active ingredient selected from the group consisting of the cyclic peptide of the present invention and a pharma- ceutical acceptable salt thereof, the cyclic peptide complex of the present invention and a pharma-ceutical acceptable salt thereof, the MuSK binding domain-grafted ubiquitin molecule of the present invention and a pharma-ceutical acceptable salt thereof, and the MuSK binding domain-grafted ubiquitin molecule complex of the present invention and a pharma-ceutical acceptable salt thereof (hereinafter, these compounds and their salts are referred to as the "active ingredients of the present invention").
  • the active ingredient of the present invention can induce homodimerization of MuSK, activate downstream signal transduction through autophosphorylation of MuSK, and induce clustering of acetylcholine receptors. Therefore, since the active ingredient of the present invention can activate signal transmission from nerves to muscles at the neuromuscular junction, it can be used as a therapeutic agent for myasthenia gravis caused by abnormal signal transmission at the neuromuscular junction. In other words, the therapeutic agent and pharmaceutical composition of the present invention can be preferably used for the treatment of myasthenia gravis.
  • treatment includes therapeutic treatment and preventive treatment, and means reducing or eliminating the cause of a disease, delaying or stopping the progression of the disease, reducing, alleviating, improving or eliminating the symptoms, and/or suppressing the worsening of the symptoms in a patient with the disease.
  • Myasthenia gravis patients include anti-acetylcholine receptor antibody positive patients, anti-MuSK antibody positive patients, anti-LRP4 antibody positive patients, and antibody negative (seronegative) patients who are negative for all of these autoantibodies.
  • the active ingredient of the present invention activates MuSK and can induce acetylcholine receptor clusters at the postsynaptic site of the neuromuscular junction, and is therefore advantageous in that it can treat not only anti-acetylcholine receptor antibody positive myasthenia gravis, but also anti-MuSK antibody positive myasthenia gravis, anti-LRP4 antibody positive myasthenia gravis, and antibody negative patients.
  • the route of administration is not particularly limited as long as the desired therapeutic effect is obtained, but oral administration or parenteral administration (e.g., intravenous administration, subcutaneous administration) can be selected.
  • the therapeutic agent and pharmaceutical composition of the present invention may be formulated by adding a pharma- ceutical acceptable carrier, etc., in addition to the active ingredient.
  • Dosage forms of pharmaceutical preparations include, for example, liquids (e.g., injections), dispersions, suspensions, tablets, pills, powders, suppositories, powders, fine granules, granules, capsules, syrups, troches, inhalants, ointments, eye drops, nasal drops, ear drops, and poultices.
  • liquids e.g., injections
  • dispersions e.g., suspensions, tablets, pills, powders, suppositories, powders, fine granules, granules, capsules, syrups, troches, inhalants, ointments, eye drops, nasal drops, ear drops, and poultices.
  • pharma- ceutical acceptable carriers for example, known methods described in the General Provisions for Preparations of the Japanese Pharmacopoeia, 18th Edition, etc.
  • the formulation can be carried out in a conventional manner using additives such as excipients, binders, disintegrants, lubricants, solubilizers, solubilization aids, colorants, flavorings, stabilizers, emulsifiers, absorption enhancers, surfactants, pH adjusters, preservatives, wetting agents, dispersants, and antioxidants as appropriate.
  • additives such as excipients, binders, disintegrants, lubricants, solubilizers, solubilization aids, colorants, flavorings, stabilizers, emulsifiers, absorption enhancers, surfactants, pH adjusters, preservatives, wetting agents, dispersants, and antioxidants as appropriate.
  • the additives are not particularly limited, but examples thereof include purified water, saline, phosphate buffer, dextrose, glycerol, ethanol and other medicamentarily acceptable organic solvents, animal and vegetable oils, lactose, mannitol, glucose, sorbitol, crystalline cellulose, hydroxypropyl cellulose, starch, corn starch, silicic anhydride, magnesium aluminum silicate, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, carboxyvinyl polymer, sodium carboxymethylcellulose, sodium polyacrylate, sodium alginate, water-soluble dextran, sodium carboxymethyl starch, pectin, methylcellulose, ethylcellulose, xanthan gum, gum arabic, tragacanth, casein, agar, polyethylene glycol, diglycerin, glycerin, propylene glycol, petrolatum, paraffin, octyldodecyl myristate, isopropyl myri
  • the liquid preparation may contain distilled water for injection, physiological saline, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil, alcohols, etc.
  • the liquid preparation may contain wetting agents, emulsifiers, dispersants, stabilizers, solubilizers, dissolution aids, preservatives, etc.
  • the tablets or pills may be coated with sugar, gastric, or enteric substances, etc.
  • the dosage of the active ingredient in the present invention can be determined depending on the type of active ingredient, the sex, age, and weight of the subject, symptoms, dosage form, and route of administration.
  • the dosage per adult can be determined to be in the range of, for example, 0.0001 mg to 1000 mg/kg body weight, but is not limited to this.
  • the above dosage of the active ingredient can be administered once a day or in 2 to 4 divided doses.
  • the active ingredient of the present invention can be administered not only to humans who require it, but also to non-human mammals (e.g., mice, rats, rabbits, dogs, cats, cows, horses, pigs, sheep, goats, and monkeys).
  • a method for treating myasthenia gravis comprising administering to a subject in need thereof a therapeutically effective amount of at least one selected from the group consisting of the cyclic peptide of the present invention and a pharma- ceutical acceptable salt thereof, the cyclic peptide complex of the present invention and a pharma-ceutical acceptable salt thereof, the MuSK-binding domain-grafted ubiquitin molecule of the present invention and a pharma-ceutical acceptable salt thereof, and the MuSK-binding domain-grafted ubiquitin molecule complex of the present invention and a pharma-ceutical acceptable salt thereof, or a therapeutic agent or pharmaceutical composition containing the same.
  • the present invention also provides the use of at least one selected from the group consisting of the cyclic peptide of the present invention and a pharma- ceutically acceptable salt thereof, the cyclic peptide complex of the present invention and a pharma- ceutically acceptable salt thereof, the MuSK-binding domain-grafted ubiquitin molecule of the present invention and a pharma- ceutically acceptable salt thereof, and the MuSK-binding domain-grafted ubiquitin molecule complex of the present invention and a pharma- ceutical acceptable salt thereof for the manufacture of a therapeutic agent for myasthenia gravis, in a method for treating myasthenia gravis, or as a therapeutic agent for myasthenia gravis.
  • the present invention provides a method for presenting a cyclic peptide together with a nearby spacer sequence on a ubiquitin molecule.
  • the present invention also provides a method for fusing a cyclic peptide to a protein, which is a method for producing a modified protein in which the cyclic peptide is fused to a ubiquitin molecule and the cyclic peptide is presented on the ubiquitin molecule.
  • the cyclic peptide can be fused to a ubiquitin molecule together with a spacer sequence using conventional genetic engineering techniques.
  • the cyclic peptide can have binding activity to a desired molecule, and is preferably a cyclic peptide having binding activity to a MuSK molecule.
  • cyclic peptide it is preferable to use a cyclic peptide selected by an mRNA display method such as the RaPID method or the TRAP method or a phage display method, and it is more preferable to use the mRNA display method.
  • an mRNA display method such as the RaPID method or the TRAP method or a phage display method
  • the base sequence of the partial amino acid sequence to be inserted into the cyclic peptide can be easily determined.
  • a cyclic peptide having MuSK binding activity can be presented on the loop structure of a ubiquitin molecule by the LassoGraft Technology.
  • the LassoGraft Technology is a technology for grafting a cyclic peptide having activity for binding to a pharmaceutical target such as a receptor onto a protein.
  • a pharmaceutical target such as a receptor onto a protein.
  • the internal sequence of only a dozen or so amino acids of a cyclic peptide obtained by the RaPID method is embedded (grafted) into a loop structure on the surface of a protein in the shape of a lasso, thereby imparting the extremely high specificity and affinity of the original cyclic peptide for the pharmaceutical target protein to the base protein.
  • the method of the present invention is characterized in that, when a cyclic peptide having binding activity for a desired molecule (preferably MuSK binding activity) is presented on the loop structure of a ubiquitin molecule, a spacer sequence consisting of a randomly generated amino acid sequence of 0 to 4 residues (preferably 3 or 4 residues) is added to the upstream and downstream sides of the cyclic peptide. That is, one of the two spacer sequences can be placed upstream of the cyclic peptide, and the other spacer sequence can be placed downstream of the cyclic peptide.
  • the cyclic peptide having MuSK binding activity can be selected from the cyclic peptides of the present invention, and preferably can be selected from the cyclic peptides of formulas (1) to (3).
  • the cyclic peptide and spacer sequence presented on the loop structure region of the ubiquitin molecule can be the structure (B) described above.
  • the spacer 3 is preferably a peptide chain consisting of any 3 or 4 amino acids
  • the spacer 4 is preferably a peptide chain consisting of any 3 or 4 amino acids.
  • the MuSK binding region is a region having MuSK molecule binding activity present in the cyclic peptide, and can be selected from, for example, MuSK molecule binding activity regions specified by the cyclic peptides of formulas (1) to (3), and can be a sequence excluding the C-terminal cysteine involved in the cyclic structure.
  • the MuSK binding region is preferably a peptide chain having the amino acid sequence YX 22 SYHTNVVASLKR (X 22 is P or L) (SEQ ID NO: 11).
  • the loop structure region of the ubiquitin molecule is - a loop structure region between the ⁇ 1 domain and the ⁇ 2 domain; - a loop structure region between the ⁇ 2 domain and the ⁇ 1 domain; - a loop structure region between the ⁇ 1 domain and the ⁇ 3 domain; - a loop structure region between the ⁇ 3 domain and the ⁇ 4 domain; It can be either the loop structure region between the ⁇ 4 domain and the ⁇ 2 domain or the loop structure region between the ⁇ 2 domain and the ⁇ 5 domain, and is preferably the loop structure region between the ⁇ 1 domain and the ⁇ 2 domain.
  • the loop structure region between the ⁇ 1 domain and the ⁇ 2 domain of the ubiquitin molecule corresponds to the 7th to 10th amino acid residues based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the ubiquitin molecule from which a cyclic peptide is presented in the method of the present invention is not limited to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • a protein consisting of an amino acid sequence having a sequence identity of 90% or more (preferably 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more) with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, or a protein having a modification selected from the group consisting of deletion, substitution, insertion, and addition of one or more amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, can be used as the ubiquitin molecule from which a cyclic peptide is presented.
  • the substitution or insertion position of the cyclic peptide in a ubiquitin molecule consisting of an amino acid sequence other than the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 can be specified by appropriately aligning the amino acid sequence of the ubiquitin molecule with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the description of the grafted ubiquitin molecule of the present invention can be referred to.
  • a base sequence corresponding to these two amino acid residues that make up the loop structure region between the ⁇ 1 domain and the ⁇ 2 domain of the ubiquitin molecule can be selected, bases present between the selected base sequences can be deleted as necessary, and a nucleic acid having a base sequence incorporating the partial amino acid sequence of the selected cyclic peptide and base sequences corresponding to the spacer sequences upstream and downstream of the selected cyclic peptide can be inserted and incorporated.
  • the method of selecting a base sequence corresponding to two amino acid residues that constitute a loop structure and deleting bases present between the selected base sequences as necessary, and the method of preparing a nucleic acid having a base sequence incorporating a base sequence that is inserted by inserting a base sequence that corresponds to a partial amino acid sequence of a selected cyclic peptide are not particularly limited, and can be carried out by using a conventionally known method.
  • the method of translating the prepared nucleic acid is already well known in the technical field to which the present invention pertains, the nucleic acid can be translated by appropriately applying these well-known methods.
  • the modified protein obtained by the presentation method and production method of the present invention in which a cyclic peptide having binding activity for a desired molecule (preferably MuSK binding activity) is presented on a protein using a ubiquitin molecule as a scaffold, presents the cyclic peptide while maintaining the structure and activity of the cyclic peptide, and can therefore be used as a reagent, medicine, etc. based on the activity of the cyclic peptide. Furthermore, since the modified protein fused with a cyclic peptide exhibits the activity of the cyclic peptide in addition to the activity of ubiquitin itself, it can also be used as a MuSK binding protein that exists stably in the body (e.g., in the blood or tissues).
  • a cyclic peptide having binding activity for a desired molecule preferably MuSK binding activity
  • a method for screening for a binding modified protein (preferably a MuSK-binding modified protein) for a desired molecule comprises designing an mRNA library containing a base sequence encoding a ubiquitin molecule in which a sequence of a cyclic peptide having binding activity for a desired molecule (preferably a cyclic peptide having binding activity for a MuSK molecule) and a spacer sequence consisting of a randomly generated amino acid sequence of 0 to 4 residues (preferably 3 or 4 residues) linked upstream and downstream of the cyclic peptide are fused onto a loop structure region between the ⁇ 1 domain and the ⁇ 2 domain, translating the mRNA from the mRNA library to prepare a modified protein, and selecting a binding modified protein (preferably a MuSK-binding modified protein) for the desired molecule from the obtained modified proteins using MuSK binding activity as an index.
  • a binding modified protein preferably a MuSK-binding modified protein
  • the steps of preparing an mRNA library i.e., preparing a nucleic acid to be translated
  • preparing a modified protein by translating a nucleic acid from the mRNA library can be carried out according to the production method of the present invention.
  • the screening method of the present invention can also be carried out according to the presented method and production method of the present invention.
  • a ubiquitin molecule grafted with a MuSK-binding cyclic peptide (preferably a peptide of structure (B)) has binding activity to MuSK
  • SPR surface plasmon resonance
  • the extracellular domain e.g., amino acids 1-493
  • human MuSK isoform 1 precursor GenBank accession number NP_005583.1
  • the mRNA library corresponding to the thioether-cyclic peptide library was designed to have, in order, an AUG initiation codon encoding L-ClAcTyr or D-ClAcTyr, 8 to 15 NNK random codons encoding random proteinogenic amino acid residues (N is G, C, A, or U; K is G or U), and a UGC codon encoding Cys.
  • N is G, C, A, or U
  • K is G or U
  • a thioether bond was spontaneously formed between the acetyl chloride group of the N-terminal Tyr residue and the sulfhydryl group (thiol group) of the downstream cysteine residue.
  • affinity selection was performed using the RaPID (random non-standard peptides integrated discovery) system in combination with the flexible in vitro translation (FIT) system ( Figure 3A) (Hayashi, Y.; Morimoto, J.; Suga, H., In vitro selection of anti-Akt2 thioether-macrocyclic peptides l leading to isoform-selective inhibitors. ACS Chem Biol 2012, 7 (3), 607-13.; Hipolito, C.J. & Suga, H. Ribosomal production and in vitro selection of natural product-like peptidomimetics: the FIT and RaPID systems. Curr Opin Chem Biol. 16, 196-203, 2012). In this example, cyclic peptides were selected from the D-library.
  • cyclic peptides that bind to MuSK were selected as follows.
  • the mRNA library, ClAc-L-Tyr-tRNA fMet CAU , and ClAc-D-Tyr-tRNA fMet CAU were prepared as previously reported (Hayashi, Y.; Morimoto, J.; Suga, H., In vitro selection of anti-Akt2 thioether-macrocyclic peptides leading to isoform-selective inhibitors. ACS Chem Biol 2012, 7 (3), 607-13.; Hipolito, CJ & Suga, H. Ribosomal production and in vitro selection of natural product-like peptidomimetics: the FIT and RaPID systems. Curr Opin Chem Biol. 16, 196-203, 2012).
  • 1 ⁇ M of the mRNA library was ligated with 1.5 ⁇ M of puromycin linker using T4 RNA ligase at 25° C. for 30 min.
  • the puromycin linker DNA was attached to the 3′-terminal constant region of the mRNA library.
  • the resulting mRNA-puromycin conjugate was translated with 1.2 ⁇ M of the resulting mRNA-puromycin conjugate and 50 ⁇ M of ClAc-L-Tyr-tRNA fMet CAU or ClAc-D-Tyr-tRNA fMet CAU in the methionine-deficient FIT system at 37° C. for 30 min.
  • the reaction was then further incubated at 25° C. for 12 min to promote the formation of mRNA-peptide conjugates.
  • the reaction was further incubated at 37° C. for 30 min in the presence of 16.7 mM EDTA.
  • the product was then reverse transcribed using RNase-H minus reverse transcriptase (Promega) at 42° C. for 1 hour to tag the cyclic peptide to the mRNA-cDNA hybrid.
  • An equal volume of blocking buffer 100 mM Tris-HCl (pH 7.6), 300 mM NaCl, 0.1 v/v % tween-20, 0.2 w/v % bovine serum albumin (acetylated) was then added to the reaction solution.
  • affinity selection was performed on the resulting peptide-mRNA/cDNA conjugate library.
  • the peptide-mRNA/cDNA conjugate library was passed three times through Dynabeads Protein G (Thermo Fisher Scientific) (each pass was performed for 10 minutes at 4°C). This process is called negative selection and removes undesirable bead binding.
  • affinity selection was performed on the peptide-mRNA/cDNA conjugate library for 30 minutes at 4°C using the above beads immobilized with 200-400 nM human MuSK protein (extracellular domain). This process is called positive selection.
  • the cDNA was eluted from the beads by heating at 95°C for 5 min, and a portion of the eluted cDNA was evaluated by quantitative PCR using Sybr Green I and a thermal cycler (LightCycler (Roche)). The remaining cDNA was amplified by PCR and used to transcribe an mRNA library for the next round of affinity selection.
  • Human MuSK protein (extracellular domain) was prepared as a recombinant protein as follows. DNA corresponding to the extracellular domain (1-493 amino acids) was amplified by PCR using a Flexi clone (FXC31275, Promega) encoding human MuSK isoform 1 precursor (NCBI Reference Sequence: NP_005583.1) as a template. XhoI and EcoRI restriction enzyme recognition sequences were added to both the 5' and 3' ends of the amplified DNA sequence, respectively, and used for insertion into the multicloning site of pCAG-Neo hIgG1-Fc plasmid (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • This plasmid (pCAG-Neo hMuSK-Fc) enables the expression of a chimeric protein (hMuSK-Fc: molecular weight is approximately 200 kDa) of secretory human MuSK extracellular domain and human IgG1 Fc in animal cells.
  • pCAG-Neo hMuSK-Fc plasmid was introduced into Expi293F cells (Invitrogen) using ExpiFectamine 293 reagent (Invitrogen), and cultured with shaking in an 8% CO 2 incubator (6 days). Next, the culture supernatant was collected, centrifuged, and sterilized by filtration using a 0.22 ⁇ m filter. The obtained culture supernatant was subjected to Protein G purification, and finally, a purified hMuSK-Fc specimen with a purity of 99.96% (AKTA-FPLC analysis) was obtained.
  • MuSK1 and MuSK1Ac SEQ ID NO: 5
  • MuSK1tr SEQ ID NO: 6
  • MuSK3tr SEQ ID NO: 7
  • MuSK6tr SEQ ID NO: 8
  • MuSK4 SEQ ID NO: 3
  • MuSK7 SEQ ID NO: 2
  • MuSK9 SEQ ID NO: 4
  • MuSK13 SEQ ID NO: 9
  • MuSK13tr SEQ ID NO: 10.
  • the cyclized cyclic peptides were purified by reversed-phase HPLC (Shimadzu Prominence LC-20AP with a Merck Chromolith Prep column, 200 ⁇ 25 mm i.d.). Water containing 0.1 v/v% TFA and acetonitrile containing 0.1 v/v% TFA were used as the mobile phase. The fractions containing the target peptides were identified using MALDI/TOFMS ( ⁇ -cyano4-hydroxycinnamic acid matrix), and then lyophilized. For peptides used in cell tests, the procedure of dissolving the dried peptides in a 50 v/v% acetonitrile-water mixture containing 5 mM HCl and lyophilizing them was repeated 2-3 times.
  • binding kinetics binding affinity (dissociation constant) KD
  • binding affinity dissociation constant
  • the binding affinity of each monomeric peptide, dimeric peptide, monomeric U-body, and dimeric U-body to the target proteins human MuSK, mouse MuSK, and rat MuSK was analyzed by surface plasmon resonance (SPR) at 25°C using a Biacore T200 (Cytiva).
  • SPR surface plasmon resonance
  • Fc-tagged human/mouse/rat MuSK was immobilized on a Protein G chip or Protein A chip (Cytiva) according to the standard immobilization protocol provided by the manufacturer.
  • the running buffer for the monomeric/dimeric peptides contained 0.010 M phosphate, 0.14 M NaCl, 0.0027 M KCl, 0.05% (v/v) Tween 20, and 0.1% (v/v) DMSO.
  • the running buffer for monomeric/dimeric U-bodies contained 0.010 M phosphate, 0.14 M NaCl, 0.0027 M KCl, and 0.05% (v/v) Tween 20.
  • a series of concentrations of each monomeric peptide, dimeric peptide, monomeric U-body, and dimeric U-body were injected for analysis. 1:1 binding fitting analysis was applied on the Biacore evaluation software to determine ka, kd, and KD values.
  • Fc-tagged human MuSK was prepared according to the procedure described in Example 1 (1).
  • Fc-tagged mouse MuSK was prepared by expressing a base sequence encoding an Fc-tagged mouse MuSK extracellular domain (sequence number 34).
  • Fc-tagged rat MuSK was prepared using Recombinant Rat MuSK Fc Chimera Protein (catalog number: 9847-MK-050, R&D Systems), a chimeric protein of rat MuSK and Fc protein.
  • Example 2 Verification of the effectiveness of cyclic peptide complexes against the onset mechanism of myasthenia gravis (1) Preparation of cyclic peptide homodimers
  • a compound was prepared by linking the human MuSK-binding cyclic peptides MuSK4, MuSK7, and MuSK9, and the human MuSK-binding linear peptide MuSK1Ac with two types of linkers to form a homodimer.
  • MuSK1Ac a complex was prepared in which the N-terminus sides were linked together with a linker, and a complex was prepared in which the C-terminus sides were linked together with a linker. Specifically, the following procedure was used for preparation.
  • MuSK1Ac, MuSK4, MuSK7 and MuSK9 were prepared by chemical synthesis. That is, cyclic peptides were synthesized by Fmoc solid-phase peptide synthesis (SPPS) using a Syro Wave automated peptide synthesizer (Biotage) according to a known method (Ito, K. et al. Artificial human Metagonists based on macrocycle scaffolds. Nature Communications 6, 6372, 2015). Specifically, a di-t-butyl-disulfide (StBu) protecting group was introduced at the terminal Cys, and the peptides were prepared on Rink Amide resin.
  • SPPS Fmoc solid-phase peptide synthesis
  • Biotage Syro Wave automated peptide synthesizer
  • a di-t-butyl-disulfide (StBu) protecting group was introduced at the terminal Cys, and the peptides were prepared on Rink Amide resin.
  • the deprotection reaction of the StBu group was monitored by MALDI/TOFMS ( ⁇ -cyano4-hydroxycinnamic acid matrix), and after completion of the reaction was confirmed, the reaction was quenched with TFA.
  • the deprotected cyclic peptide was purified by reversed-phase HPLC (Shimadzu Prominence LC-20AP with a Merck Chromolith Prep column, 200 ⁇ 25 mm i.d.). Water containing 0.1 v/v% TFA and acetonitrile containing 0.1 v/v% TFA were used as the mobile phase.
  • the fractions were lyophilized.
  • the procedure of dissolving the dried peptide in a 50 v/v% acetonitrile-water mixture containing 5 mM HCl and lyophilizing was repeated 2 to 3 times.
  • a different cysteine residue (the carboxyl group forms an acid amide) was introduced downstream of the C-terminal cysteine residue for linking with the linker.
  • a cysteine residue (the amino group is acetylated) for linking with the linker was introduced upstream of the N-terminal D-tyrosine residue.
  • a cysteine residue (the carboxyl group forms an acid amide) for linking with the linker was introduced downstream of the C-terminal glutamic acid residue.
  • Lyophilized cyclic peptide monomers (prepared as above) were then resuspended in 1/1 ACN/(50 mM sodium phosphate buffer, pH 7.5) at a concentration of approximately 2 mg/mL. While stirring, 0.5 equivalents of Bis-Mal-dPEGTM 11 (Quanta Biodesign) or Bis-Mal-dPEGTM 3 (Quanta Biodesign) as a 100 mM solution in DMSO were slowly added dropwise. Consumption of starting material was monitored by UPLC/LCMS and additional reactant was added as necessary (dimerization was complete within 2 h). In the case of MuSK1Ac, MuSK4 and MuSK7, the mixtures were purified directly by HPLC.
  • a homodimer of MuSK7 with palmitoyl group introduced (FIG. 8/MuSK7-pal) was prepared according to the following scheme. That is, a cyclic peptide was prepared by introducing a linker to the carboxyl group of the C-terminal cysteine residue in MuSK7 synthesized in Example 1(2), and a condensation reaction between two molecules of the cyclic peptide and a linking unit having palmitic acid was carried out in the presence of a coupling reagent by a conventional method to obtain a complex. Next, the protecting group (PG) was removed from the obtained complex, and the complex was purified to obtain a homodimer of MuSK7 with palmitoyl group (R) introduced.
  • PG protecting group
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • FBS fetal bovine serum
  • the culture medium was aspirated and the adherent cells were washed with phosphate buffered saline (-; PBS(-)), and Mg 2+ - and Ca 2+ -free HBSS (GIBCO) containing 0.25% trypsin and 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid was added, followed by reaction for 5 minutes in a CO 2 incubator (37°C, 5% CO 2 ).
  • the detached cells were collected and centrifuged at 1000 rpm and 4°C for 5 minutes (Sorvall X4R Pro, Thermo Fisher Scientific).
  • the cells were suspended in new culture medium, and 100 ⁇ L of the cells were seeded in a 96-well plate (BioCoat Collagen I 96-well Black/Clear plate, CORNING) and cultured in a CO2 incubator (37°C, 5% CO2 ) for approximately 72 hours until the cells reached a confluent state.
  • the culture medium was then removed, and the first medium exchange was performed with DMEM containing 2% horse serum (GIBCO) for inducing myotube differentiation. After another 48 hours, the second medium exchange was performed, and the success or failure of differentiation into myotube cells was confirmed the next day by bright field observation using a general-purpose inverted microscope.
  • a 10x objective lens was used for fluorescence image observation, and tiff images of an area equivalent to 1 mm2 were obtained. Three tiff images were obtained per well, and structures with a major axis of 10 ⁇ m or more that showed Alexa-488 fluorescent signals were defined as AChR clusters and measured. The average value between the number of AChR clusters counted in three tiff images from the same well was calculated and depicted on a graph. The results were as shown in Figures 9A and B.
  • the culture medium was removed by suction, and the attached cells were washed with phosphate-buffered saline (PBS(-)), and HBSS (GIBCO) containing 0.25% trypsin and 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid and free of Mg 2+ and Ca 2+ was added, and the cells were reacted for 5 minutes in a CO 2 incubator (37°C, 5% CO 2 ). After collecting the detached cells, they were centrifuged at 1000 rpm and 4°C for 5 minutes (Sorvall X4R Pro, Thermo Fisher Scientific). After removing the supernatant by suction, the cells were suspended in new culture medium and expanded in a new culture vessel.
  • PBS(-) phosphate-buffered saline
  • HBSS HBSS
  • LgBiT (17.6 kDa) and SmBiT are split-type luciferases designed to exert luciferase activity when they form a complex (Dixon, AS et al. ACS Chem. Biol. 2016, 11, 400-8.).
  • the affinity between the two is about 190 ⁇ M, and the amount of luminescence is very small even in the presence of a substrate.
  • the NanoBiT assay is a method that utilizes this property to evaluate the interaction between any two proteins.
  • the NanoBiT assay was adopted as one of the methods to evaluate the MuSK activation ability of MuSK7-pal ( Figure 10A). Specifically, SmBiT or LgBiT was fused downstream of the extracellular domain (1-493 amino acids) of human MuSK cDNA clone (FXC31275, Promega), and a synthetic DNA with six histidines at the C-terminus was prepared and incorporated into EBMulti-Neo plasmid (Fujifilm Wako Pure Chemical).
  • Example 3 Evaluation of therapeutic effect of cyclic peptide complex on myasthenia gravis model animal (1) Evaluation of therapeutic effect on myasthenia gravis model animal (1)
  • A. Purpose The effects of a dimer (MuSK7-pal/Example 2(3)) (high dose) of the cyclic peptide (p7) of formula (1) on various disease parameters in a rat PTMG model using an anti-acetylcholine receptor monoclonal antibody (mAb35) were evaluated.
  • mAb35 anti-acetylcholine receptor monoclonal antibody
  • anti-nicotinic acetylcholine receptor monoclonal antibody (mAb35, National Hospital Organization Nagasaki Kawatana Medical Center) dissolved in PBS (pH 7.4) was intraperitoneally administered at 200 ⁇ g/animal to all animals as a drug for inducing the pathology of myasthenia gravis (day 0).
  • the vehicle used as the solvent for the compound was phosphate buffered saline (PBS) containing 20% hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin and 0.02% polysorbate 80 at pH 7.4 (the same applies to Example 3(2)).
  • the body weight of the animals was measured before antibody administration (pre) and at 0, 9, 24, 33, 48, 57, and 72 hours (hr) after antibody administration.
  • the movement, muscle strength, and grip strength of the animals were evaluated using the following tests.
  • ⁇ Action score> The behavior of the animals was evaluated at 9, 24, 33, 48, 57, and 72 hours (hr) after antibody administration using a 6-level evaluation scale (score).
  • the evaluation criteria were as follows: 0: Normal 1: Decreased grip strength of front and back legs 2: Incomplete paralysis of back legs 3: Complete paralysis of back legs and inability to stand up 4: Moribund 5: Death
  • the average score for each group of rats was calculated. Transport agar (Oriental Yeast Co., Ltd.) and crushed pellet food were placed in cages containing rats with a score of 2 or higher.
  • ⁇ Wire-hang Test> Approximately 30 hours after antibody administration, the muscle strength of the rats was measured using the lid (made of wire mesh) of a plastic cage with a lid (Clean 200-TPX cage; CL-0108-2, CLEA Japan). The rat was left still for 15 minutes or more, and after confirming that it was in a resting state, it was placed on the cage lid. Next, the cage lid was gently shaken about three times so that the rat could grasp the cage lid, and the cage lid was pulled down. The overturned lid was held at a height (approximately 60 cm from the floor) high enough for the rat to climb down easily, but not so high that it would be injured if it fell off. The latency time for the rat to fall off the cage lid was measured. The measurement was carried out for up to 120 seconds.
  • ⁇ Grip Strength Test> Approximately 30 hours after antibody administration, the muscle strength of the rats was measured using a grip strength meter for mice (GRIP STRENGTH METER FOR MICE, MODEL MK-380M, Muromachi Kikai Co., Ltd.). Specifically, the rats were left stationary for 15 minutes or more. After confirming that the rat was in a resting state, the rat's forelimbs were attached to the mouse grip strength meter. The rat's body was then pulled, and the scale on the grip strength meter was read when the rat released the wire mesh (1 The above procedure was repeated once more (second time). If the difference between the first and second measurements was 20% or less, the average was used as the measurement value. If the difference was 20% or more, the above procedure was repeated. The procedure was repeated once more (a third time), and the measurement value was determined as the average of the two closest values out of the three measurements.
  • the movement score measurement results for each group are shown in Figure 12. That is, in the control group A, the score results showed that onset began at 9 hours, peaked at 33 hours, and then decreased. In groups B and C, most individuals did not show onset, and overall the scores showed low values at all measurement points. In group D, all individuals scored 0 at all measurement points, and no onset of the disease was observed.
  • the results of the Grip Strength Test for each group are shown in Figure 14. That is, the average grip strength of the control group A was 142 g ( ⁇ 16.28 SEM), while the grip strength of group B was 467 g ( ⁇ 35.54 SEM), the grip strength of group C was 474 g ( ⁇ 43.03 SEM), and the grip strength of group D was 577 g ( ⁇ 24.89 SEM), which were significantly stronger than the grip strength of group A (one-way analysis of variance (p ⁇ 0.0001) and Dunnett's test (p ⁇ 0.0001)).
  • anti-nicotinic acetylcholine receptor monoclonal antibody (mAb35, National Hospital Organization Nagasaki Kawatana Medical Center) dissolved in PBS (pH 7.4) was intraperitoneally administered at 200 ⁇ g/animal to all animals as a drug for inducing the pathology of myasthenia gravis (day 0).
  • the body weight of the animals was measured before antibody administration (pre) and at 0, 9, 24, 33, 48, 57, and 72 hours (hr) after antibody administration.
  • the movement, muscle strength, and grip strength of the animals were evaluated using the following tests.
  • ⁇ Action score> The behavior of the animals was evaluated at 9, 24, 33, 48, 57, and 72 hours (hr) after antibody administration using a 6-level evaluation scale (score).
  • the evaluation criteria were the same as those in (1) B above.
  • the movement score measurement results for each group are shown in Figure 16. That is, in the control group A, the score results showed that onset began at 24 hours, peaked at 48 hours, and then decreased. In group B, most individuals did not show onset, and overall the scores showed low values at all measurement points. In group B, the scores were significantly lower than group A at all measurement points from 24 hours onwards (Dunn's test). In group C, like group B, most individuals did not show onset, and overall the scores showed low values at all measurement points. In group C, the scores were significantly lower than group A at all measurement points except 9 hours and 57 hours (Dunn's test). In group D, half of the group did not show onset, and overall the scores showed low values compared to the control group. In group D, there was no significant difference between group A and group D at any measurement point (Dunn's test).
  • the results of the Grip Strength Test for each group are shown in Figure 18. That is, the average grip strength of the control group A was 177 g ( ⁇ 60.05 SEM), while the grip strength of group B was 461 g ( ⁇ 27.61 SEM), the grip strength of group C was 476 g ( ⁇ 25.51 SEM), and the grip strength of group D was 452 g ( ⁇ 86.32 SEM). Although the grip strengths of groups B, C, and D were stronger than that of group A, the difference was not statistically significant (Kruskal-Wallis test).
  • Example 2(4) Summary The results of Example 2(4) and the above (1) and (2) demonstrated that MuSK7-pal, one of the cyclic peptides of the present invention, not only has MuSK binding activity but also actually exerts a therapeutic effect in myasthenia gravis model animals.
  • Example 4 Grafting of cyclic peptide pharmacophore sequences onto ubiquitin molecules and evaluation of MuSK binding activity of artificial ubiquitin molecules (1) Verification of the effectiveness of the Lasso grafting method A. Overview The internal sequences of aMD4 and aMD5 (Ito, K. et al., Nat Commun 2015, 6 (1): 6373.), which are MET (hepatic growth factor receptor)-binding macrocyclic peptides, were grafted onto ubiquitin molecules using the Lasso grafting method (Mihara, E.
  • a library was constructed and selected by adding randomized spacer sequences of 0 to 3 amino acid residues to the N-terminus and C-terminus of the pharmacophore sequence of the macrocyclic peptide to be grafted, while leaving the pharmacophore sequence of the macrocyclic peptide unchanged, and the MET binding activity was evaluated.
  • Ubiquitin molecule as a scaffold for the Lasso-grafting method
  • a family of ubiquitin molecule-based ligands was prepared by lasso-grafting pharmacophore sequences to the loop structure region between the ⁇ 1 and ⁇ 2 domains of the ubiquitin molecule ( ⁇ 1- ⁇ 2 loop) (FIG. 19a).
  • the pharmacophore sequence of aMD4 (YRQFNRRTHEVWNLD; SEQ ID NO: 35) or the pharmacophore sequence of aMD5 (YWYYAWDQTYKAFP; SEQ ID NO: 36) was sandwiched between "G” or "GG” spacers and replaced with the L8-T9 or T9-G10 residues in the ⁇ 1-2 loop (Ub-aMD4_n1-4 and Ub-aMD5_n1-4, naive U-body, FIG. 20a, b).
  • the dissociation constants and binding rate constants of each U-body construct to human MET ectodomain were measured by SPR at 25°C using a Biacore 8K instrument (Cytiva). His- and hFc-tagged human MET ectodomain was purchased from Sino Biological (10692-H03H). The running buffer was HBS-EP+ buffer (Cytiva) containing 0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, and 0.05% Surfactant P20. His- and hFc-tagged human MET ectodomain was immobilized on a series S sensor chip protein G (Cytiva) following the standard immobilization protocol provided by the manufacturer.
  • the dissociation constants of the naive U-body constructs were determined by the multi-cycle method in parallel mode. Eight concentrations of each U-body construct were injected at a flow rate of 30 ⁇ L/min. The resulting binding responses were analyzed using Biacore insight evaluation software and fitted with a steady-state affinity model.
  • the naive U-body bound to MET, but with significantly weaker affinity than that of the parent macrocyclic peptide in all cases (Fig. 20a, b). Furthermore, the naive U-body constructs showed circular dichroism spectra almost identical to those of wild-type Ub, indicating that the scaffold ubiquitin molecule was correctly folded in the naive U-body construct. These results indicate that the decrease in affinity was not due to misfolding, but rather to a change in the conformation of the lasso-grafted pharmacophore. Rather, we speculated that the decrease in binding activity was due to an inappropriate distance between the N-terminal and C-terminal regions of the pharmacophore for lasso-grafting. Taking into account the spacer residues that would affect the macrocyclic active form of the pharmacophore peptide, we hypothesized that the decrease in binding activity could be resolved by optimizing the spacer at the grafting site (see Fig. 3B).
  • flanking spacer sequences by mRNA display method
  • Two types of mRNA libraries encoding aMD4-grafted U-body (Ub-aMD4) or aMD5-grafted U-body (Ub-aMD5) were constructed, and in the construction, 0 to 4 consecutive residues in the ⁇ 1-2 loop were replaced with a pharmacophore sequence flanked upstream and downstream by randomized 0 to 3 spacer residues using various flanking spacer sequences ( Figure 19b and Figure 21).
  • the theoretical diversity of the library was 9.9 x 10 8 , which was lower than the number of practical variants (>10 11 ) translated by the in vitro translation cocktail. Therefore, all possible combinations were comprehensively explored. Specifically, the following procedure was performed.
  • the DNA template for the mRNA library was prepared by assembling DNA oligos in two steps. In the first step, forward and reverse primers were mixed and an extension reaction was performed to obtain double-stranded DNA (the spacer sequence was randomized with NNK codons) encoding the ⁇ 1- ⁇ 2 loop sequence, spacer sequence, and pharmacophore sequence.
  • the extension reaction was performed on a 30 ⁇ L reaction scale using 1 ⁇ KOD One PCR Master Mix -Blue- (Toyobo), 0.3 ⁇ M forward and reverse primers.
  • the extension products were mixed and amplified by PCR to add the constant region.
  • PCR was performed with 1x KOD One PCR Master Mix -Blue- (Toyobo), 10% (v/v) of the mixed extension products, and 0.3 ⁇ M forward and reverse primers in a 300 ⁇ L reaction scale.
  • the PCR products were extracted with phenol/chloroform, precipitated with ethanol, dissolved in water, and used for in vitro transcription at 37°C overnight in a 660 ⁇ L reaction scale.
  • the transcription reaction contained 40 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM spermidine, 0.01% (v/v) Triton X-100, 10 mM DTT, 30 mM MgCl 2 , 5 mM NTP, 30 mM KOH, template DNA solution, 0.1% (v/v) RNasin ribonuclease inhibitor (Promega), and 0.12 ⁇ M T7 RNA polymerase.
  • RNA loading buffer 8M urea, 2 mM Na 2 EDTA-2H 2 O, 2 mM Tris-HCl, pH 7.5
  • the mRNA was purified on a 6% (v/v) polyacrylamide gel containing 8M urea, extracted and precipitated with 0.3M NaCl solution, and dissolved in water to a final concentration of 10 ⁇ M.
  • the mRNA library was covalently linked to puromycin linkers using T4 RNA ligase prior to translation.
  • the translation system used to generate the U-body library selected by mRNA display was 50 mM HEPES-KOH (pH 7.6), 100 mM potassium acetate, 12.3 mM magnesium acetate, 2 mM ATP, 2 mM GTP, 1 mM CTP, 1 mM UTP, 20 mM phosphocreatine, 0.1 mM 10-formyl-5,6,7,8-tetrahydrofolate, 2 mM spermidine, 1 mM dithiothreitol, 1.5 mg/mL E. coli total tRNA, 1.2 ⁇ M E.
  • coli ribosome 0.6 ⁇ M methionyl-tRNA formyltransferase, 2.7 ⁇ M IF1, 0.4 ⁇ M IF2, 1.5 ⁇ M IF3, 0.26 ⁇ M EF-G, 10 ⁇ M EF-Tu, 0.66 ⁇ M EF-Ts, 0.25 ⁇ M RF2, 0.17 ⁇ M RF3, 0.5 ⁇ M RRF, 4 ⁇ g/ml, creatine kinase, 3 ⁇ g/ml myokinase, 0.1 ⁇ M inorganic pyrophosphatase, 0.1 ⁇ M nucleotide diphosphate kinase, 0.1 ⁇ M T7 RNA polymerase, 0.73 ⁇ M AlaRS, 0.03 ⁇ M ArgRS, 0.38 ⁇ M AsnRS, 0.13 ⁇ M AspRS, 0.02 ⁇ M CysRS, 0.06 ⁇ M GlnRS, 0.23 ⁇ M GluRS, 0.09 ⁇ M G
  • reaction mixture was then incubated at 25°C for 7 min. Afterwards, 0.5 ⁇ L of 500 mM EDTA (pH 8.0) was added and further incubated at 37°C for 5 min to induce dissociation of ribosomes from the mRNA-protein conjugates.
  • Reverse transcription was performed at 42°C for 30 min using reverse primers (SSG2an13.R36 for the Ub-aMD4 library and SGS2an13.R36 for the Ub-aMD5 library) and M-MLV reverse transcriptase lacking RNase H activity (Promega).
  • the cDNA-mRNA-protein conjugates were then mixed with 2.5 ⁇ L of Dynabeads Protein G (Thermo Fisher) bearing human IgG1 Fc on the surface and incubated at 4°C for 5 min in triplicate as negative selection.
  • the supernatant from the negative selection was collected and mixed with Dynabeads Protein G immobilized with MET (see (1)B) for 10 minutes at 4°C, after which the beads were washed three times (first round) or six times (second to sixth rounds) with 100 ⁇ L of TBS-T buffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.6).
  • 1 ⁇ L of the eluate was mixed with 19 ⁇ L of 1 ⁇ PCR buffer containing SYBR Green I and KOD DNA polymerase, and the amount of cDNA was quantified by real-time PCR (LightCycler Nano, Roche).
  • the remaining eluate was diluted 8-fold with 1 ⁇ PCR buffer containing KOD DNA polymerase, amplified by PCR, extracted with phenol/chloroform, precipitated with ethanol, dissolved in 40 ⁇ L of 50 mM KCl, and used for in vitro transcription in the same procedure as library preparation.
  • the transcribed mRNA library was precipitated and dissolved in water to a final concentration of 10 ⁇ M. If necessary, the transcribed mRNA library was precipitated and then purified using a 4% (v/v) polyacrylamide gel containing 8 M urea.
  • next-generation sequencer Sequencing using the next-generation sequencer (NGS) was performed as follows:
  • the recovered cDNA was PCR amplified using KOD One PCR Master Mix -Blue- (Toyobo) with 0.5 ⁇ M Rd1T7g10M.F70 and an13Rd2.R49 as primers according to the manufacturer's instructions.
  • the products were carried forward to a second PCR step, where sequence barcodes were placed on each sample using KOD One PCR Master Mix -Blue- and Nextera XT v2 Set (Illumina sequences) primers.
  • the PCR products were then combined, extracted with phenol/chloroform, and column purified using the NucleoSpin kit (TaKaRa) according to the manufacturer's instructions.
  • the concentration of the cDNA samples was measured using the dsDNA HS kit with Qubit (Thermo Fisher).
  • the resulting DNA was appropriately diluted, denatured, and combined with denatured PhiX Control v3 (Illumina).
  • the denatured DNA was sequenced on an Illumina MiSeq instrument using the v3 kit in paired-end read 2x300 cycle mode, and data was collected in fastq format after stitching.
  • mRNA library encoding a part of the amino acid sequence of MuSK7 (YPSYHTNVVASLKR) (SEQ ID NO: 37) was constructed.
  • the ⁇ 1-2 loop (T7-G10) sequence was replaced with "random sequence (3 or 4 amino acids)-YPSYHTNVVASLKR-random sequence (3 or 4 amino acids)" as shown in FIG. 22.
  • the theoretical diversity of the library was 2.8 ⁇ 10 10 variants, which was lower than the practical number of variants (>10 11 ) translated by the in vitro translation cocktail. Therefore, all possible combinations were comprehensively explored.
  • Preparation of the mRNA library and selection using MuSK binding by mRNA display were performed in the same manner as in the above (1) C.
  • Polynucleotides encoding Ub006 to 013 (SEQ ID NOs: 38 to 45), Ub012 homodimer (SEQ ID NO: 54), homotetramer (SEQ ID NO: 56), and ubiquitin dimer (SEQ ID NO: 58) were each cloned into pET22b(+) vector and expressed with a His6 tag attached to the N-terminus.
  • amino acid sequences of the expressed proteins and the polynucleotides encoding them were as follows: ⁇ Amino acid sequences of expressed Ub006-013: Amino acid sequences with "MHHHHHH” added to the N-terminus of SEQ ID NOs: 38-45 ⁇ DNA sequences of expressed Ub006-013: SEQ ID NOs: 46-53 ⁇ Amino acid sequence of the expressed Ub012 homodimer: amino acid sequence of SEQ ID NO:54 with "MHHHHHHAS" added to the N-terminus and "TS” added to the C-terminus. ⁇ DNA sequence of the expressed Ub012 homodimer: SEQ ID NO:55.
  • E. coli BL21-gold (DE3) cells All proteins were expressed in E. coli BL21-gold (DE3) cells (Agilent). The cells were grown in lysogeny broth medium (Miller) containing 100 ⁇ g/mL ampicillin to an OD600 >0.4 and induced with 0.4 mM IPTG for 24 h at 16°C. Cells were lysed by sonication in lysis buffer [50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl (pH 7.6) containing 20 mM imidazole-HCl (pH 7.2)] and proteins were captured on Ni Sepharose 6 Fast Flow (Cytiva).
  • lysis buffer 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl (pH 7.6) containing 20 mM imidazole-HCl (pH 7.2)
  • Sepharose beads were washed with wash buffer [1 M NaCl (pH 7.6) containing 50 mM Tris-HCl, 20 mM imidazole-HCl (pH 7.2)] and the lysis buffer. Proteins were eluted from the Sepharose beads with elution buffer [50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl (pH 7.6) containing 500 mM imidazole-HCl (pH 7.2)].
  • Figure 24 shows the test results by NanoBiT assay.
  • Figure 24 confirms that Ub012 homodimers (dimeric U-bodies) have stronger MuSK dimerization activity than cyclic peptide homodimers (dimeric peptide/MuSK7-pal).
  • Figure 25 shows the results of an evaluation test of AChR cluster formation using myotube cells.
  • Figure 25 confirms that Ub012 homodimers (dimeric U-bodies) have a concentration-dependent promoting effect on AChR cluster formation.
  • Figure 26A shows the test results by NanoBiT assay.
  • Figure 26A confirms that Ub012 homotetramers (tetrameric U-bodies) have stronger MuSK dimerization activity than Ub012 homodimers (dimeric U-bodies).
  • Figure 26B shows the results of an evaluation test of AChR cluster formation using myotube cells.
  • Figure 26B confirms that Ub012 homotetramers (tetrameric U-bodies) have a concentration-dependent promoting effect on AChR cluster formation.
  • a homotetramer of Ub012 (SEQ ID NO: 60) in which the C-terminus and N-terminus of Ub012 are linked with a peptide linker (EAAAK) 3
  • a homotetramer of Ub012 ( ⁇ GG) (SEQ ID NO: 61) in which the C-terminus and N-terminus of a deletion of two amino acid residues (GG) at the C-terminus of Ub012 are linked with a peptide linker (EAAAK) 3 were prepared and used in the following tests.
  • test method Five-week-old female rats (LEW/CrlCrlj, 4 weeks old at the time of delivery, Jackson Laboratory Japan) were divided into three groups (A, B, and C) based on the weight measurement results.
  • anti-nicotinic acetylcholine receptor monoclonal antibody (mAb35, National Hospital Organization Nagasaki Kawatana Medical Center) dissolved in PBS (pH 7.4) was intraperitoneally administered to all animals at 200 ⁇ g/animal as a drug to induce the pathology of myasthenia gravis (day 0).
  • the body weight of the animals was measured before antibody administration (pre) and at 0, 9, 24, 33, 48, 57, and 72 hours (hr) after antibody administration.
  • the movement, muscle strength, and grip strength of the animals were evaluated using the following tests.
  • ⁇ Action score> The behavior of the animals was evaluated at 9, 24, 33, 48, 57, and 72 hours (hr) after antibody administration using a 6-level evaluation scale (score).
  • the evaluation criteria were the same as those in Example 3(1)B.
  • the movement score measurement results for each group are shown in Figure 28. That is, in the control group C, the score results showed that the onset of pathology began at 9 hours, peaked at 48 hours, and then decreased. In groups A and B, the onset of pathology began at 9 hours, just like group C, but the peak scores of groups A and B were lower than the peak score of group C. However, no significant differences were observed between the groups at any of the measurement points (Kruskal-Wallis test).

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Abstract

本発明は、神経筋接合部における神経から筋肉への信号伝達を活性化する新規化合物及び重症筋無力症の新たな治療剤を提供することを目的とする。本発明によれば、式（Ｉ）の構造を含む環状ペプチド若しくはその複合体又はその薬学上許容可能な塩が提供される。 －Ｘ１－Ａｓｎ－Ｘ２－Ｖａｌ－　（Ｉ） （上記式中、Ｘ１はＴｈｒ又はＶａｌを表し、Ｘ２はＶａｌ又はＩｌｅを表す）　本発明によれば、前記環状ペプチド若しくはその複合体又はその薬学上許容可能な塩を有効成分とする重症筋無力症の治療剤が提供される。

Description

ＭｕＳＫを標的とする新規化合物及びその用途 関連出願の参照
　本願は、先行する日本国出願である特願２０２３－８８１２０（出願日：２０２３年５月２９日）の優先権の利益を享受するものであり、その開示内容全体は引用することにより本明細書の一部とされる。
　本発明は、神経筋接合部の信号伝達を活性化する新規化合物及び重症筋無力症の治療剤に関する。本発明はまた、環状ペプチドのファーマコフォアがグラフトされたユビキチン分子を選択する方法に関する。
　重症筋無力症（myasthenia gravis；ＭＧ）は自己抗体が病態に直接関与する疾患として知られている自己免疫疾患のひとつであり、全身の筋力低下、易疲労性が出現し、特に眼瞼下垂、複視などの眼の症状をおこしやすいことも特徴である（非特許文献１）。重症筋無力症は、末梢神経と筋肉の接続部（神経筋接合部）において、筋肉側（信号の受け手）に存在するいくつかの分子が自己抗体により破壊ないし機能阻害され、神経から筋肉に信号が伝わらなくなるために筋力低下が起こると考えられている。自己抗体の標的として最も頻度が高い分子はアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）であり、全体の８５％程度を占め、次に筋特異的チロシンキナーゼ（muscle specific tyrosine kinase；ＭｕＳＫ）及びＬＲＰ４（low-density lipoprotein receptor-related protein 4）であり、全体の数％であると考えられている。また、これら自己抗体がいずれも陰性であるseronegative型の患者が存在することも知られている。
　重症筋無力症に対して汎用されている対症療法はステロイド治療と免疫抑制剤治療である。しかし、患者は治療の代償として様々な副作用を背負わざるを得ず、また治療困難な症例も数多い。最近になり、補体蛋白質Ｃ５を標的としたモノクローナル抗体「エクリズマブ（商品名ソリリス）」が重症筋無力症治療用分子標的薬として上市され、同様の作用機序をもつ環状ペプチド「ジルコプラン」が臨床開発中である（特許文献１及び２参照）。これら薬剤は抗アセチルコリン受容体抗体陽性の重症筋無力症の治療を目的とするものであるが、いずれも髄膜炎菌等の感染リスク増加や補体活性化が関与しない重症筋無力症や、抗アセチルコリン受容体抗体陽性型以外の重症筋無力症には適応できない。
特表２０１９－５１７４７３号公報 特表２０２２－５０８９５２号公報
Gilhus N. E. & Verschuuren J. J, Lancet Neurol. 2015 Oct;14(10):1023-36.
　本発明は、神経筋接合部における神経から筋肉への信号伝達を活性化する新規化合物及び重症筋無力症の新たな治療剤の提供を目的とする。本発明はまた、環状ペプチドのファーマコフォアがグラフトされたユビキチン分子の新たな選択方法の提供を目的とする。
　本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］下記式（Ｉ）の構造を含む、環状ペプチド又はその薬学上許容可能な塩。
－Ｘ１－Ａｓｎ－Ｘ２－Ｖａｌ－　　　（Ｉ）
（上記式中、Ｘ１はＴｈｒ又はＶａｌを表し、Ｘ２はＶａｌ又はＩｌｅを表す）
［２］前記環状ペプチドの環状構造を形成するアミノ酸残基の数が、８～２０個である、上記［１］に記載の環状ペプチド又はその薬学上許容可能な塩。
［３］前記環状ペプチドの環状構造がＮ－ＣＯ－ＣＨ２－Ｓ構造を含む、上記［１］又は［２］に記載の環状ペプチド又はその薬学上許容可能な塩。
［４］前記ＮがＤ－チロシンのアミノ基である、上記［３］に記載の環状ペプチド又はその薬学上許容可能な塩。
［５］前記Ｓがシステインのチオール基である、上記［３］又は［４］に記載の環状ペプチド又はその薬学上許容可能な塩。
［６］前記環状ペプチドが、下記式（１）（配列番号２）、式（２）（配列番号３）及び式（３）（配列番号４）からなる群から選択される構造を有する、上記［１］～［５］のいずれかに記載の環状ペプチド又はその薬学上許容可能な塩。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 （上記式中、システイン残基（Ｃ）のカルボキシル基は酸アミドを形成していてもよい。）
［７］上記［１］～［６］のいずれかに記載の環状ペプチドを二つ含み、かつ、一方の環状ペプチドが他方の環状ペプチドにリンカーにより結合している、環状ペプチド複合体又はその薬学上許容可能な塩。
［８］前記二つの環状ペプチドが同じ環状ペプチドである、上記［７］に記載の環状ペプチド複合体又はその薬学上許容可能な塩。
［９］リンカーの長さが、２０～１００Åである、上記［７］又は［８］に記載の環状ペプチド複合体又はその薬学上許容可能な塩。
［１０］リンカーが、その構造の少なくとも一部としてポリエチレングリコール構造を有する、上記［７］～［９］のいずれかに記載の環状ペプチド複合体又はその薬学上許容可能な塩。
［１１］リンカーが、その側鎖として炭素数８～２０の飽和炭化水素基を少なくとも一つ有する、上記［７］～［１０］のいずれかに記載の環状ペプチド複合体又はその薬学上許容可能な塩。
［１２］ユビキチン分子のβ１ドメインとβ２ドメインとの間のループ構造領域の一部又は全部が、下記構造（Ａ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 （上記式中、
　ＭｕＳＫ結合領域は、ＹＸ２１ＳＹＨＴＮＶＶＡＳＬＫＲ（Ｘ２１はＰ又はＬである）（配列番号１１）のアミノ酸配列からなり、
　スペーサー１が、ＩＱＰＲ（配列番号１２）、ＫＰＧＶ（配列番号１３）、ＷＤＲＧ（配列番号１４）、ＫＰＧＴ（配列番号１５）、ＰＦＧＶ（配列番号１６）、ＹＦＶＧ（配列番号１７）及びＬＥＧＭ（配列番号１８）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなり、
　スペーサー２が、ＩＲＹ、ＭＭＰ、ＱＧＩ、ＦＭＰ、ＴＧＰＱ（配列番号１９）、ＷＮＴＰ（配列番号２０）及びＩＲＰＱ（配列番号２１）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。）
のペプチドにより置換されてなるか、或いはユビキチン分子のβ１ドメインとβ２ドメインとの間のループ構造領域に前記構造（Ａ）のペプチドが挿入されてなる、ＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子又はその薬学上許容可能な塩。
［１３］ユビキチン分子が、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、及び
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が改変されたアミノ酸配列からなるタンパク質
からなる群から選択されるタンパク質である、上記［１２］に記載のＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子又はその薬学上許容可能な塩。
［１４］構造（Ａ）が、下記からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、上記［１２］又は［１３］に記載のＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子又はその薬学上許容可能な塩。
（Ｕｂ００６）ＩＱＰＲＹＰＳＹＨＴＮＶＶＡＳＬＫＲＩＲＹ（配列番号２２）
（Ｕｂ００７）ＫＰＧＶＹＰＳＹＨＴＮＶＶＡＳＬＫＲＭＭＰ（配列番号２３）
（Ｕｂ００８）ＷＤＲＧＹＰＳＹＨＴＮＶＶＡＳＬＫＲＱＧＩ（配列番号２４）
（Ｕｂ００９）ＫＰＧＴＹＰＳＹＨＴＮＶＶＡＳＬＫＲＦＭＰ（配列番号２５）
（Ｕｂ０１０）ＰＦＧＶＹＰＳＹＨＴＮＶＶＡＳＬＫＲＴＧＰＱ（配列番号２６）
（Ｕｂ０１１）ＹＦＶＧＹＰＳＹＨＴＮＶＶＡＳＬＫＲＷＮＴＰ（配列番号２７）
（Ｕｂ０１２）ＬＥＧＭＹＬＳＹＨＴＮＶＶＡＳＬＫＲＩＲＰＱ（配列番号２８）
（Ｕｂ０１３）ＬＥＧＭＹＰＳＹＨＴＮＶＶＡＳＬＫＲＩＲＰＱ（配列番号２９）
［１５］前記ループ構造領域が、ユビキチン分子の第７番目のアミノ酸残基から第１０番目のアミノ酸残基までの領域である、上記［１２］～［１４］のいずれかに記載のＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子又はその薬学上許容可能な塩。
［１６］上記［１２］～［１５］のいずれかに記載のＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子を二つ以上（例えば２～６個、好ましくは２～４個）含み、かつ、一方のＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子が他方のＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子にリンカーにより結合している、ＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子複合体又はその薬学上許容可能な塩。
［１７］前記二つ以上のＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子が同じ分子である、上記［１６］に記載のＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子複合体又はその薬学上許容可能な塩。
［１８］リンカーの長さが、２０～１００Åである、上記［１６］又は［１７］に記載のＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子複合体又はその薬学上許容可能な塩。
［１９］リンカーが、ペプチド鎖である、上記［１６］～［１８］のいずれかに記載のＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子複合体又はその薬学上許容可能な塩。
［２０］上記［１］～［６］のいずれかに記載の環状ペプチド若しくはその薬学上許容可能な塩、上記［７］～［１１］のいずれかに記載の環状ペプチド複合体若しくはその薬学上許容可能な塩、上記［１２］～［１５］のいずれかに記載のＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子若しくはその薬学上許容可能な塩、又は上記［１６］～［１９］のいずれかに記載のＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子複合体若しくはその薬学上許容可能な塩を有効成分とする、医薬組成物又は重症筋無力症の治療剤。
［２０－１］上記［１］～［６］のいずれかに記載の環状ペプチド若しくはその薬学上許容可能な塩、上記［７］～［１１］のいずれかに記載の環状ペプチド複合体若しくはその薬学上許容可能な塩、上記［１２］～［１５］のいずれかに記載のＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子若しくはその薬学上許容可能な塩、又は上記［１６］～［１９］のいずれかに記載のＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子複合体若しくはその薬学上許容可能な塩、の治療上の有効量を、或いはそれを含む治療剤又は医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、重症筋無力症の治療方法。
［２０－２］医薬として使用するための、上記［１］～［６］のいずれかに記載の環状ペプチド若しくはその薬学上許容可能な塩、上記［７］～［１１］のいずれかに記載の環状ペプチド複合体又はその薬学上許容可能な塩、上記［１２］～［１５］のいずれかに記載のＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子若しくはその薬学上許容可能な塩、又は上記［１６］～［１９］のいずれかに記載のＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子複合体若しくはその薬学上許容可能な塩。
［２０－３］重症筋無力症の治療に用いるための、上記［２０－２］に記載の環状ペプチド若しくはその薬学上許容可能な塩、上記環状ペプチド複合体又はその薬学上許容可能な塩、上記ＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子若しくはその薬学上許容可能な塩、又はＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子複合体若しくはその薬学上許容可能な塩。
［２０－４］医薬若しくは重症筋無力症の治療剤の製造のための、重症筋無力症の治療方法における、又は、医薬若しくは重症筋無力症の治療剤としての、上記［１］～［６］のいずれかに記載の環状ペプチド若しくはその薬学上許容可能な塩、上記［７］～［１１］のいずれかに記載の環状ペプチド複合体又はその薬学上許容可能な塩、上記［１２］～［１５］のいずれかに記載のＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子若しくはその薬学上許容可能な塩、又は上記［１６］～［１９］のいずれかに記載のＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子複合体若しくはその薬学上許容可能な塩の使用。
［２１］所望の分子（好ましくはＭｕＳＫ分子）に結合活性を有する環状ペプチドを、２つのスペーサー配列とともに、ユビキチン分子のβ１ドメインとβ２ドメインとの間のループ構造領域上に提示する方法であって、
　環状ペプチドは、分子内環状構造を形成するための化学架橋構造を有し、
　環状ペプチドの化学架橋構造を、スペーサー配列を介して前記ループ構造を構成する２つのアミノ酸残基に置き換えることにより、前記環状ペプチドを、所望の分子（好ましくはＭｕＳＫ分子）に対する結合活性を保持したままユビキチン分子に融合させることを含み、
　スペーサー配列は、ランダムに生成された０～４残基（好ましくは３又は４残基）のアミノ酸配列からなる、方法。
［２２］所望の分子がＭｕＳＫ分子であり、かつ、ユビキチン分子のループ構造領域上に提示される環状ペプチド及びスペーサー配列が、下記構造（Ｂ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 （上記式中、スペーサー３は、０～４個（好ましくは３又は４個）の任意のアミノ酸からなるペプチド鎖であり、スペーサー４は、０～４個（好ましくは３又は４個）の任意のアミノ酸からなるペプチド鎖であり、ＭｕＳＫ結合領域は前記環状ペプチドに存在するＭｕＳＫ分子結合活性を有する領域である。）
を有する、上記［２１］に記載の提示方法。
［２３］ユビキチン分子のループ構造領域が、β１ドメインとβ２ドメインとの間のループ構造領域である、上記［２１］又は［２２］に記載の提示方法。
［２４］ループ構造領域を構成する前記２つのアミノ酸残基が、ユビキチン分子の第７番目のアミノ酸残基及び第１０番目のアミノ酸残基である、上記［２３］に記載の提示方法。
［２５］前記ＭｕＳＫ結合領域が、ＹＸ２２ＳＹＨＴＮＶＶＡＳＬＫＲ（Ｘ２２はＰ又はＬである）（配列番号１１）のアミノ酸配列を有するペプチド鎖である、上記［２２］～［２４］のいずれかに記載の提示方法。
［２６］所望の分子（好ましくはＭｕＳＫ分子）に結合活性を有する環状ペプチドを、２つのスペーサー配列とともに、ユビキチン分子のループ構造領域上に融合させて環状ペプチドをタンパク質上に提示させた改変タンパク質の製造方法であって、
　環状ペプチドは、分子内環状構造を形成するための化学架橋構造を有し、
　環状ペプチドのアミノ酸配列から、タンパク質上に提示させる部分アミノ酸配列を選択し、該部分アミノ酸配列に相当する塩基配列を選択し、
　ユビキチン分子のループ構造領域を構成する２つのアミノ酸残基に相当する塩基配列を選択し、該選択された塩基配列間に存在する塩基を必要に応じて削除し、選択された環状ペプチドの部分アミノ酸配列に相当する塩基配列を挿入して組み込んだ塩基配列を有する核酸を準備し、
　該核酸を翻訳することを含み、
　スペーサー配列は、ランダムに生成された０～４残基（好ましくは３又は４残基）のアミノ酸配列からなる、製造方法。
［２７］所望の分子がＭｕＳＫ分子であり、かつ、ユビキチン分子のループ構造領域上に提示される環状ペプチド及びスペーサー配列が、下記構造（Ｂ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 （上記式中、スペーサー３は、０～４個（好ましくは３又は４個）の任意のアミノ酸からなるペプチド鎖であり、スペーサー４は、０～４個（好ましくは３又は４個）の任意のアミノ酸からなるペプチド鎖であり、ＭｕＳＫ結合領域は前記環状ペプチドに存在するＭｕＳＫ分子結合活性を有する領域である。）
を有する、上記［２６］に記載の製造方法。
［２８］ユビキチン分子のループ構造領域が、β１ドメインとβ２ドメインとの間のループ構造領域である、上記［２６］又は［２７］に記載の製造方法。
［２９］ループ構造領域を構成する前記２つのアミノ酸残基が、ユビキチン分子の第７番目のアミノ酸残基及び第１０番目のアミノ酸残基である、上記［２８］に記載の製造方法。
［３０］前記ＭｕＳＫ結合領域が、ＹＸ２２ＳＹＨＴＮＶＶＡＳＬＫＲ（Ｘ２２はＰ又はＬである）（配列番号１１）のアミノ酸配列を有するペプチド鎖である、上記［２７］～［２９］のいずれかに記載の製造方法。
［３１］所望の分子に対する結合性改変タンパク質（好ましくはＭｕＳＫ結合性の改変タンパク質）のスクリーニング方法であって、
　所望の分子（好ましくはＭｕＳＫ分子）に結合活性を有する環状ペプチドの配列と、前記環状ペプチドの配列の上流及び下流に連結する、ランダムに生成された０～４残基（好ましくは３又は４残基）のアミノ酸配列からなるスペーサー配列とが、β１ドメインとβ２ドメインとの間のループ構造領域上に融合されたユビキチン分子をコードする塩基配列を含むｍＲＮＡライブラリーをデザインし、デザインしたｍＲＮＡライブラリーに基づいて上記［２８］に記載の製造方法に従って改変タンパク質を調製し、
　所望の分子に対する結合性（好ましくはＭｕＳＫ結合活性）を指標に得られた改変タンパク質から所望の分子に対する結合性の改変タンパク質（好ましくはＭｕＳＫ結合性の改変タンパク質）を選択することを含む、スクリーニング方法。
［３２］下記式（Ｉ）の構造を含む、ペプチド又はその薬学上許容可能な塩。
－Ｘ１－Ａｓｎ－Ｘ２－Ｖａｌ－　　　（Ｉ）
（上記式中、Ｘ１はＴｈｒ又はＶａｌを表し、Ｘ２はＶａｌ又はＩｌｅを表す）
［３３］前記ペプチドが、８～２０個のアミノ酸残基からなる、上記［３２］に記載のペプチド又はその薬学上許容可能な塩。
［３４］生体分子中にグラフトされた、上記［３２］又は［３３］に記載のペプチド又はその薬学上許容可能な塩。
　本発明により提供される環状ペプチド及びＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子並びにそれらの複合体は神経筋接合部の形成及び維持に必須のシグナルを直接亢進することができる。従って、本発明は重症筋無力症の治療を可能とする新規モダリティ分子を提供する点で有利な発明である。
図１は、ＭｕＳＫのホモ二量体化と、それに引きつづくアセチルコリン受容体のクラスター化のメカニズムを模式的に示した図である。 図２は、ＭｕＳＫ結合二量体ペプチドのＭｕＳＫ細胞外領域への結合によるＭｕＳＫのホモ二量体化と、それに引きつづくアセチルコリン受容体のクラスター化のメカニズムを模式的に示した図である。 図３Ａは、フレキシブルインビトロ翻訳（ＦＩＴ）システムを用いてチオエーテル－環状ペプチドのライブラリーを生成させ、ＲａＰＩＤスクリーニングにより標的に結合する環状ペプチドを迅速に探索するアプローチの模式図である。図３Ｂは、ＲａＰＩＤスクリーニングにより選択された特殊環状ペプチドのファーマコフォア領域をラッソ・グラフト法により足場タンパク質にグラフトするとともに、移植ペプチドの上流及び下流のスペーサーを配置し、構築されたｍＲＮＡ融合タンパク質のライブラリーを作製するアプローチの模式図である。 図４は、ＭｕＳＫへの親和性のための最初のＲａＰＩＤスクリーニングから同定されたペプチド配列の選択結果を示した図である。アフィニティー選択の進捗状況を、各ラウンドのアフィニティー選択で使用したｍＲＮＡ総数に対する、ＭｕＳＫ－ビーズ複合体（Positive）に結合したｍＲＮＡ数の割合（％）又は単なるビーズ（Negative）に結合したｍＲＮＡ数の割合（％）として表した。 図５は、Ｂｉａｃｏｒｅ　Ｔ２００で分析したＭｕＳＫ結合モノマーペプチドのＳＰＲセンサーグラムを１．６～１０００ｎＭの濃度範囲で表示した図である。測定した曲線にフィッティングした曲線を併せて示す。 図６－１は、環状ペプチド（ＭｕＳＫ４、ＭｕＳＫ７及びＭｕＳＫ９）のホモ二量体の構造を示した図である。 図６－２は、鎖状ペプチド（ＭｕＳＫ１Ａｃ）のホモ二量体の構造を示した図である。 図７は、リンカーとしてＢｉｓ－Ｍａｌ－ｄＰＥＧ（商標名）１１を使用したＭｕＳＫ７のホモ二量体（MuSK7 PEG11 dimer）の化学構造を示した図である。 図８は、パルミトイル基が導入された、ＭｕＳＫ７のホモ二量体の化学構造を示した図である。 図９Ａは、本発明の環状ペプチド複合体（MuSK7 PEG11 dimer）が培養筋管細胞レベルで濃度依存的にアセチルコリン受容体のクラスターを誘導することを示す図である。図９Ｂは、アセチルコリン受容体のクラスターの個数に関する本発明の環状ペプチド複合体（MuSK7 PEG11 dimer）の用量応答曲線である。図９Ｃはアセチルコリン受容体クラスター誘導活性に及ぼすAST-487の影響を示した図である。 図１０Ａは、ＮａｎｏＢｉＴアッセイに用いた２つの分子を模式的に示した図である。２つのヒトＭｕＳＫの細胞外領域（Extracellular portion of human MuSK）が相互作用することにより、ＬｇＢｉＴ及びＳｍＢｉＴが結合して発光酵素が形成され、基質添加により発光を観察することができる。図１０Ｂは、ＮａｎｏＢｉＴアッセイを用いた評価結果であり、本発明の環状ペプチド複合体（ＭｕＳＫ７－ｐａｌ）の、ＭｕＳＫ二量体化に関する用量応答曲線である。 図１１は、重症筋無力症モデル動物に対する本発明の環状ペプチド複合体（高用量）の治療効果の評価結果（体重変化）を示した図である。 図１２は、重症筋無力症モデル動物に対する本発明の環状ペプチド複合体（高用量）の治療効果の評価結果（動作スコア）を示した図である。 図１３は、重症筋無力症モデル動物に対する本発明の環状ペプチド複合体（高用量）の治療効果の評価結果（Hanging Wire Testの落下潜時（Latency））を示した図である。 図１４は、重症筋無力症モデル動物に対する本発明の環状ペプチド複合体（高用量）の治療効果の評価結果（握力）を示した図である。 図１５は、重症筋無力症モデル動物に対する本発明の環状ペプチド複合体（低用量）の治療効果の評価結果（体重変化）を示した図である。 図１６は、重症筋無力症モデル動物に対する本発明の環状ペプチド複合体（低用量）の治療効果の評価結果（動作スコア）を示した図である。 図１７は、重症筋無力症モデル動物に対する本発明の環状ペプチド複合体（低用量）の治療効果の評価結果（Hanging Wire Testの落下潜時（Latency））を示した図である。 図１８は、重症筋無力症モデル動物に対する本発明の環状ペプチド複合体（低用量）の治療効果の評価結果（握力）を示した図である。 図１９ａは、ＲａＰＩＤシステムで得られたＭＥＴ結合大環状ペプチド（MET-binding macrocyclic peptide）（ａＭＤ４及びａＭＤ５）をユビキチン分子（β１－β２ループ）へラッソ・グラフト（Lasso-grafting）するアプローチを模式的に示した図である。図１９ｂは、ａＭＤ４及びａＭＤ５をユビキチン分子へラッソ・グラフトする際にこれらファーマコフォア配列（pharmacophore）の上流及び下流に０～３アミノ酸残基のスペーサー配列（spacer）を付加してグラフトする戦略を模式的に示した図である。図１９ｃはｍＲＮＡディスプレイ戦略の模式図であり、ピューロマイシンを介してｍＲＮＡと結合した翻訳産物（ａＭＤ４又はａＭＤ５をラッソ・グラフトしたユビキチン分子）を模式的に示した図である。なお、結合活性領域をグラフトして得られたユビキチン分子を本明細書ではＵボディ（U-body）といい、ユビキチン分子をＵｂと省略することがある。 図２０は、ａＭＤ４（図２０ａ）又はａＭＤ５（図２０ｂ）をラッソ・グラフトしたユビキチン分子の選択結果（選択後の回収ライブラリーにおいて占める割合（Population）％、ＳＰＲで測定したＫＤ値を示した図である。「KD w/mutation」はユビキチン分子内に変異（野生型ユビキチン分子に対する変異）を有するＵボディのＫＤ値を示す。ユビキチン分子ごとに近傍スペーサー配列（Flanking spacers）を示した。なお、アミノ酸変異に関する表記は、左から、変異前のアミノ酸残基、変異位置、変異後のアミノ酸残基を意味する。 図２１は、ＭＥＴ結合性領域をグラフト化したユビキチン分子を作製する際に、β１－２ループ内の０～４の連続した残基を、様々なフランキングスペーサー配列（ランダム化した０～３スペーサー残基、図中Ｘと表示）を用いて、上流及び下流をフランキングしたファーマコフォア配列と置換するアプローチを説明する図である。 図２２は、ＭｕＳＫ結合性領域をグラフト化したユビキチン分子を作製する際に、β１－２ループ内の第７番目のアミノ酸残基から第１０番目のアミノ酸残基を、様々なフランキングスペーサー配列（ランダム化した３又は４残基のスペーサー残基、図中Ｘと表示）を用いて、上流及び下流をフランキングしたファーマコフォア配列（ＭｕＳＫ７）と置換するアプローチを説明する図である。 図２３は、図２２で示したＭｕＳＫ結合性領域をグラフトしたユビキチン分子のフランキングスペーサー配列の最適化をするために行なったＲａＰＩＤスクリーニングから同定されたペプチド配列の選択結果を示した図である。アフィニティー選択の進捗状況を、各ラウンド（round）のアフィニティー選択で使用したｍＲＮＡ総数に対する、ＭｕＳＫ－ビーズ複合体（Positive）に結合したｍＲＮＡ数の割合（recovery rate）（％）又は単なるビーズ（Negative）に結合したｍＲＮＡ数の割合（recovery rate）（％）として表した。 図２４は、ＮａｎｏＢｉＴアッセイを用いた評価結果であり、本発明のＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子（Ｕｂ０１２）のホモ二量体（Dimeric U-bodies）、環状ペプチド複合体（Dimeric peptide／ＭｕＳＫ７－ｐａｌ）及びユビキチン分子の二量体（Dimeric Ub）の、ＭｕＳＫ二量体化に関する用量応答曲線を示した図である。 図２５は、筋管細胞を用いたＡＣｈＲクラスター形成の評価試験結果であり、本発明のＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子（Ｕｂ０１２）のホモ二量体（Dimeric U-bodies）及びユビキチン分子の二量体（Dimeric Ub）がアセチルコリン受容体のクラスター誘導に及ぼす濃度依存的影響を示した図である。 図２６Ａは、ＮａｎｏＢｉＴアッセイを用いた評価結果であり、本発明のＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子（Ｕｂ０１２）のホモ二量体（Dimeric U-bodies）及びホモ四量体（Tetrameric U-bodies）の、ＭｕＳＫ二量体化に関する用量応答曲線を示した図である。図２６Ｂは、筋管細胞を用いたＡＣｈＲクラスター形成の評価試験結果であり、本発明のＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子（Ｕｂ０１２）のホモ四量体（tetrameric U-bodies）がアセチルコリン受容体のクラスター誘導に及ぼす濃度依存的影響を示した図である。 図２７Ａは、重症筋無力症モデル動物に対する本発明のＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子（Ｕｂ０１２）のホモ四量体の治療効果の評価結果（体重変化）を示した図である（実施例４（６））。図２７Ｂは、Ｕｂ０１２のＣ末端ＧＧ欠失体のホモ四量体の治療効果の評価結果（体重変化）を示した図である（実施例４（６））。 図２８Ａは、重症筋無力症モデル動物に対する本発明のＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子（Ｕｂ０１２）のホモ四量体の治療効果の評価結果（動作スコア）を示した図である（実施例４（６））。図２８Ｂは、Ｕｂ０１２のＣ末端ＧＧ欠失体のホモ四量体の治療効果の評価結果（動作スコア）を示した図である（実施例４（６））。 図２９は、重症筋無力症モデル動物に対する本発明のＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子（Ｕｂ０１２）のホモ四量体の治療効果の評価結果（Hanging Wire Testの落下潜時（Latency））を示した図である（実施例４（６））。 図３０は、重症筋無力症モデル動物に対する本発明のＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子（Ｕｂ０１２）のホモ四量体の治療効果の評価結果（握力）を示した図である（実施例４（６））。
発明の具体的説明
［定義］
　本明細書中、「薬学上許容可能な塩」とは、例えば、医薬として許容される塩基や酸との塩を含むものである。薬理学的に許容可能な塩の非限定的な具体例としては、無機酸（塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、リン酸等）の付加塩、有機酸（ｐ－トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、ｐ－ブロモフェニルスルホン酸、カルボン酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、酢酸等）の付加塩、無機塩基（水酸化アンモニウム又はアルカリ若しくはアルカリ土類金属水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩等）の付加塩、及びアミノ酸の付加塩等が挙げられる。
［環状ペプチド］
　本発明の環状ペプチドは前記式（Ｉ）のユニット構造をその構造の一部とするものである。式（Ｉ）には以下の４通りの構造が含まれる。
　－Ｔｈｒ－Ａｓｎ－Ｖａｌ－Ｖａｌ－　　（Ｉａ）（配列番号３０）
　－Ｔｈｒ－Ａｓｎ－Ｉｌｅ－Ｖａｌ－　　（Ｉｂ）（配列番号３１）
　－Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｖａｌ－Ｖａｌ－　　（Ｉｃ）（配列番号３２）
　－Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｉｌｅ－Ｖａｌ－　　（Ｉｄ）（配列番号３３）
　本明細書において、「環状ペプチド」とは、６以上のアミノ酸により形成される環状構造を分子内に少なくとも有することを意味する。環状ペプチドの分子構造は、環状構造以外に、アミノ酸がペプチド結合により連結した鎖状構造を有していてもよく、また、ペプチド構造以外の構造を有していてもよい。本明細書において、「環状構造」とは、直鎖状ペプチドにおいて、４アミノ酸残基以上離れた２つのアミノ酸が直接に、又はリンカー等を介して結合することによって分子内に形成される閉環構造を意味する。本明細書において、「４アミノ酸残基以上離れた」とは、閉環構造を形成する２つのアミノ酸の間に存在するアミノ酸残基の個数が、少なくとも４であることを意味する。
　本願明細書においてアミノ酸配列により特定されたペプチドは、特に言及がない限り、向かって左側がＮ末端であり、右側がＣ末端である。また本願明細書においてペプチド中のＮ末端からＣ末端に向けてのアミノ酸の順序又は位置関係を「下流」ということがあり、Ｃ末端からＮ末端に向けてのアミノ酸の順序又は位置関係を「上流」ということがある。
　環状構造における閉環構造は特に限定されないが、２つのアミノ酸が、必要に応じてリンカー等を介して共有結合することにより形成される。２つのアミノ酸間の共有結合としては、例えば、ジスルフィド結合、ペプチド結合、アルキル結合、アルケニル結合、エステル結合、チオエステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ホスホネートエーテル結合、アゾ結合、Ｃ－Ｓ－Ｃ結合、Ｃ－Ｎ－Ｃ結合、Ｃ＝Ｎ－Ｃ結合、アミド結合、ラクタム架橋、カルバモイル結合、尿素結合、チオ尿素結合、アミン結合、及びチオアミド結合等が挙げられる。また、２つのアミノ酸間の共有結合は、２つのアミノ酸の側鎖同士、２つのアミノ酸の主鎖同士、又は、２つのアミノ酸の側鎖と主鎖との結合等により形成されてもよい。２つのアミノ酸がアミノ酸の主鎖において結合する場合、ペプチド結合により閉環構造が形成される。
　環状構造は、直鎖状ペプチドのＮ末端とＣ末端のアミノ酸の結合に限られず、末端のアミノ酸と末端以外のアミノ酸との結合、又は末端以外のアミノ酸同士の結合により形成されてもよい。環状構造を形成のために結合するアミノ酸の一方が末端アミノ酸で、他方が非末端アミノ酸である場合、環状ペプチドは、環状構造に直鎖のペプチドが尾のように付いた構造を有する。環状構造に直鎖のペプチドが尾のように付いた構造を有する場合、直鎖状ペプチドにおける環状構造を構成するアミノ酸のＣ末端に直鎖のペプチドが結合していることが好ましい。換言すれば、直鎖状ペプチドにおけるＮ末端と、Ｃ末端以外のアミノ酸とが結合して環状構造を形成することが好ましい。
　環状構造を形成するアミノ酸としては、天然アミノ酸に加え、人工のアミノ酸変異体及び／又は誘導体を含み、例えば、天然タンパク質性Ｌ－アミノ酸、非天然アミノ酸、及びアミノ酸の特徴として当業界で公知の特性を有する化学的に合成された化合物等が挙げられる。
　タンパク質性アミノ酸（proteinogenic amino acids）は、当業界で周知の以下の３文字表記又は１文字表記により特定することができる。
アラニン：Ａｌａ　Ａ
アルギニン：Ａｒｇ　Ｒ
アスパラギン：Ａｓｎ　Ｎ
アスパラギン酸：Ａｓｐ　Ｄ
システイン：Ｃｙｓ　Ｃ
グルタミン：Ｇｌｎ　Ｑ
グルタミン酸：Ｇｌｕ　Ｅ
グリシン：Ｇｌｙ　Ｇ
ヒスチジン：Ｈｉｓ　Ｈ
イソロイシン：Ｉｌｅ　Ｉ
ロイシン：Ｌｅｕ　Ｌ
リシン：Ｌｙｓ　Ｋ
メチオニン：Ｍｅｔ　Ｍ
フェニルアラニン：Ｐｈｅ　Ｆ
プロリン：Ｐｒｏ　Ｐ
セリン：Ｓｅｒ　Ｓ
トレオニン：Ｔｈｒ　Ｔ
トリプトファン：Ｔｒｐ　Ｗ
チロシン：Ｔｙｒ　Ｙ
バリン：Ｖａｌ　Ｖ
　非タンパク質性アミノ酸（non-proteinogenic amino acids）としては、タンパク質性アミノ酸以外の天然又は非天然のアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸としては、例えば、主鎖の構造が天然型と異なるアミノ酸（α，α－二置換アミノ酸（α－メチルアラニン等）、Ｎ－アルキルアミノ酸、Ｄ－アミノ酸、β－アミノ酸、γ－アミノ酸、δ－アミノ酸、及びα－ヒドロキシ酸等）；側鎖の構造が天然型と異なるアミノ酸（ノルロイシン、及びホモヒスチジン等）；側鎖に余分なメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸、ホモフェニルアラニン、及びホモヒスチジン等）；及び、側鎖中のカルボン酸官能基がスルホン酸基で置換されているアミノ酸（システイン酸等）等が挙げられる。非天然アミノ酸の具体例としては、国際公開第２０１５／０３００１４号に記載のアミノ酸が挙げられる。
　環状構造を形成するアミノ酸残基の数は６以上であれば特に限定されないが、その下限値（以上）は例えば、７、８、９、１０、１１、１２又は１３とすることができ、その上限値（以下）は、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６又は１５とすることができる。これらの下限値及び上限値は任意に組み合わせて環状構造を形成するアミノ酸残基の数の範囲とすることができ、例えば、６以上３０以下、７以上２５以下、８以上２０以下、１２以上１８以下、１３以上１７以下とすることができる。
　本発明において、環状ペプチドは、リン酸化、メチル化、アセチル化、アデニリル化、ＡＤＰリボシル化、糖鎖付加、ポリエチレングリコールの付加、及び脂肪酸の付加等の１種又は２種以上の修飾が加えられたものであってもよく、他のペプチド及び／又はタンパク質と融合させたものであってもよい。また、環状ペプチドは、適当なリンカーを介して、ビオチン化されていてもよい。
　また、本発明において、環状ペプチドは、１つの環状構造を有する環状ペプチド２つがリンカー構造を介して結合している、分子内に２つの環状構造を有する二量体であってもよく、分子内でラクタム構造を形成した分子内ラクタムブリッジ構造を有していてもよい。分子内ラクタムブリッジ構造は、環状ペプチドを構成するアミノ酸の側鎖同士が結合することによって形成されてよく、例えば、Ｌｙｓの側鎖のアミノ基と、Ａｓｐ又はＧｌｕの側鎖のカルボキシル基が結合して、ペプチド結合を形成することにより、分子内ラクタム構造が形成されてもよい。そのような環状ペプチドは、分子内にブリッジ構造として、もう１つの環状構造を有する。Ｌｙｓに代えて、例えば、ＤＡＰ、ＤＡＢ、又はＯｒｎがＡｓｐ又はＧｌｕと結合していてもよい。なお、本明細書中、上記式（Ｉ）で表される構造を有する環状構造を含む環状ペプチド２つが、リンカー構造を介して結合している環状ペプチドの二量体は、後述するように「環状ペプチド複合体」と称する。
　本発明の環状ペプチドの好ましい例として、下記式（ＩＩ）の構造を含む環状ペプチドが挙げられる。
（Ｚ１）ｍ－Ｘ１－Ａｓｎ－Ｘ２－Ｖａｌ－（Ｚ２）ｎ　　　（ＩＩ）
（上記式中、Ｘ１及びＸ２は式（Ｉ）で定義した内容と同義であり、Ｚ１は任意のアミノ酸を表し、Ｚ２は任意のアミノ酸を表し、ｍは１以上の整数であり、ｎは１以上の整数である）
　上記式（ＩＩ）は、式（Ｉ）で表される構造のＮ末端側に（Ｚ１）ｍが結合し、Ｃ末端側に（Ｚ２）ｎが結合した構造である。式（ＩＩ）において、（Ｚ１）ｍ及び（Ｚ２）ｎを構成するアミノ酸はそれぞれ独立して任意のアミノ酸を表す。（Ｚ１）ｍの１個のアミノ酸と、（Ｚ２）ｎの１個のアミノ酸とは直接、又はリンカー等を介して結合することにより、環状構造を形成することが好ましい。この環状構造は、Ｎ末端のＺ１がＣ末端のＺ２と結合して形成されていてもよく、Ｎ末端のＺ１が非Ｃ末端のＺ２と結合して形成されていてもよく、非Ｎ末端のＺ１がＣ末端のＺ２と結合して形成されていてもよく、非Ｎ末端のＺ１が非Ｃ末端のＺ２と結合して形成されていてもよい。
　非末端のＺ１又はＺ２が結合に関わることにより、環状ペプチドは環状構造に直鎖のペプチドが尾のように付いた構造を有する。本発明においては、好ましくは、Ｎ末端のＺ１が、非Ｃ末端のＺ２と結合して環状構造を形成してもよい。また、Ｚ１とＺ２とがリンカーを介して環状構造を形成してもよい。
　ｍ及びｎについては、その合計値（ｍ＋ｎ）は２以上の整数であるが、ｍ＋ｎの下限値（以上）は例えば、２、３、４、５、６、７、８又は９とすることができ、その上限値（以下）は、２６、２１、１６、１５、１４、１３、１２又は１１とすることができる。これらの下限値及び上限値は任意に組み合わせてｍ＋ｎの数値範囲とすることができ、例えば、２～２６、３～２４、４～１６、８～１４、９～１３とすることができる。
　（Ｚ１）ｍ及び（Ｚ２）ｎは、環状構造の形成に関わるアミノ酸以外に、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ等の分岐鎖側鎖を有するアミノ酸、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ等の側鎖に水酸基を有するアミノ酸、塩基性アミノ酸や芳香族アミノ酸を含んでいてもよく、Ｌｅｕ又はＳｅｒを含むことが好ましい。
　環状ペプチドは、Ｎ－ＣＯ－ＣＨ２－Ｓ構造（すなわち、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－Ｓ－構造）を有していることが好ましく、Ｎ－ＣＯ－ＣＨ２－Ｓ構造により環状構造を形成していてもよい。当該環状構造は、環状構造を形成する前のペプチドのＮ末端のアミノ基に結合した、水素原子が脱離基Ｌで置換されたアセチル基と、Ｃ末端側のシステイン（Ｃｙｓ）におけるチオール基との結合により形成されることが好ましい。脱離基Ｌは、例えば、塩素原子、臭素原子、フッ素原子、ヨウ素原子等のハロゲン原子が挙げられる。水素原子が脱離基Ｌで置換されたアセチル基は、特に限定されず、例えば、クロロアセチル基等が挙げられる。Ｎ－ＣＯ－ＣＨ２－Ｓ構造により環状構造を形成した、式（ＩＩ）の構造を有する環状ペプチドとしては、例えば、下記式（ＩＩＩ）で表されるペプチドにおいて、ＬＣＨ２ＣＯ－と、Ｃｙｓのチオール基（ＨＳ－）とが結合することにより環状構造が形成される場合が挙げられる。
ＬＣＨ２ＣＯ－（Ｚ３）－（Ｚ４）ｐ－Ｘ１－Ａｓｎ－Ｘ２－Ｖａｌ－（Ｚ５）ｑ－Ｃｙｓ－（Ｚ６）ｒ　　　（ＩＩＩ）
（上記式中、Ｘ１及びＸ２は式（Ｉ）で定義した内容と同義であり、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５及びＺ６は任意のアミノ酸を表し、ｐはｍ－１の整数であり、ｑはｎ－１の整数であり、ｒは０又は１以上の整数を表す。ｍ及びｎは式（ＩＩ）で定義した内容と同義である。）
　式（ＩＩＩ）において、Ｚ３、（Ｚ４）ｐ、（Ｚ５）ｑ及び（Ｚ６）ｒを構成するアミノ酸はそれぞれ独立して任意のアミノ酸を表す。ＬＣＨ２ＣＯ－と、Ｃｙｓのチオール基（ＨＳ－）とが結合することにより式（ＩＩＩ）のペプチドは環状構造を形成する。
　ｐ及びｑについては、その合計値（ｐ＋ｑ）は０以上の整数であるが、ｐ＋ｑの下限値（以上）は例えば、０、１、２、３、４、５、６又は７とすることができ、その上限値（以下）は、２４、１９、１４、１３、１２、１１、１０又は９とすることができる。これらの下限値及び上限値は任意に組み合わせてｐ＋ｑの数値範囲とすることができ、例えば、０～２４、１～２２、２～１４、６～１２、７～１１とすることができる。
　ｒは０以上の整数であれば特に限定されないが、その下限値（以上）は例えば、１、２、３、４、５又は６とすることができ、その上限値（以下）は、２０、１５、１４、１３、１２、１１又は１０とすることができる。これらの下限値及び上限値は任意に組み合わせてｒの数値範囲とすることができ、例えば、０～２０又は１～１５とすることができる。本明細書において、ｒが０である場合には、環状ペプチドは（Ｚ６）ｒを有さず、また、ｒが１以上の整数である場合には、環状ペプチドにおける（Ｒ６）ｒは、アミノ酸がペプチド結合により連結した鎖状構造に相当する。
　Ｚ３は、Ｔｙｒであることが好ましく、Ｄ体であってもＬ体であってよい。
　（Ｚ４）ｐ及び（Ｚ５）ｑは、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ等の分岐鎖側鎖を有するアミノ酸、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ等の側鎖に水酸基を有するアミノ酸、塩基性アミノ酸や芳香族アミノ酸を含んでいてもよく、Ｌｅｕ又はＳｅｒを含むことが好ましい。
　Ｚ６は、独立して、Ｇｌｙ又はＳｅｒであることが好ましい。（Ｚ６）ｒの例としては、例えば、（－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－）ｒａ（ｒａは０～１０の整数であり、ｒａが２以上の場合には－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－からなる繰り返し構造を表し、但し、Ｃ末端は－Ｓｅｒである）で表される構造が挙げられる。
　環状ペプチドにおける環状構造は、Ｎ－ＣＯ－ＣＨ２－Ｓ構造により形成される環状構造以外のものであってもよい。例えば、下記表１に示す官能基１を有するアミノ酸と、対応する官能基２を有するアミノ酸が環状化した環状ペプチドとすることができる。この態様において、例えば上記式（ＩＩ）で表される構造を環状構造として含む場合、少なくとも１つのＺ１が官能基１を有するアミノ酸であり、かつ、少なくとも１つのＺ２が対応する官能基２を有するアミノ酸であってもよく、或いは、少なくとも１つのＺ１が官能基２を有するアミノ酸であり、かつ、少なくとも１つのＺ２が対応する官能基１を有するアミノ酸であってもよい。
　官能基１と官能基２は、Ｎ末端とＣ末端に配置してもよいし（どちらがＮ末端側となってもよい）、一方を末端アミノ酸に、他方を非末端アミノ酸に配置してもよいし、両方を非末端アミノ酸に配置してもよい。官能基１と官能基２により形成される結合が、環状ペプチドにおける分子環状構造を形成するための化学架橋構造となる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
 　表１の化学構造式中、Ｘ１は脱離基であり、Ａｒは置換基を有していてもよい芳香環である。脱離基としては、例えば、塩素原子、臭素原子、フッ素原子、ヨウ素原子等のハロゲン原子が挙げられる。
　（Ａ－１）の官能基を有するアミノ酸としては、例えば、クロロアセチル化したアミノ酸を用いることができる。クロロアセチル化アミノ酸としては、N-chloroacetyl-L-alanine、N-chloroacetyl-L-phenylalanine、N-chloroacetyl-L-tyrosine、N-chloroacetyl-L-tryptophan、N-3-(2-chloroacetamido)benzoyl-L-phenylalanine、N-3-(2-chloroacetamido)benzoyl-L-tyrosine、N-3-(2-chloroacetamido)benzoyl-L-tryptophan、β-N-chloroacetyl-L-diaminopropanoic  acid、γ-N-chloroacetyl-L-diaminobutyric  acid、δ-N-chloroacetyl-L-ornithine、ε-N-chloroacetyl-L-lysine、及びこれらに対応するＤ－アミノ酸誘導体等が挙げられる。（Ａ－１）の官能基を有するアミノ酸としては、N-chloroacetyl-L-tyrosine、及びN-chloroacetyl-D-tyrosineが好適に用いられる。
　（Ａ－２）の官能基を有するアミノ酸としては、例えばcysteine、homocysteine、mercaptonorvaline、mercaptonorleucine、2-amino-7-mercaptoheptanoic acid、及び2-amino-8-mercaptooctanoic acid等が挙げられる。（Ａ－２）の官能基を有するアミノ酸としては、cysteineが好適に用いられる。
　（Ａ－１）の官能基を有するアミノ酸と（Ａ－２）の官能基を有するアミノ酸による環状化方法は、例えば、Kawakami, T. et al., Nature Chemical Biology 5, 888-890 (2009)；Yamagishi, Y. et al., ChemBioChem 10, 1469-1472 (2009)；Sako, Y. et al., Journal of American Chemical Society 130, 7932-7934 (2008)；Goto, Y. et al., ACS Chemical Biology 3, 120-129 (2008)；Kawakami T. et al, Chemistry & Biology 15, 32-42 (2008)、及び国際公開第２００８／１１７８３３号等に記載された方法が挙げられる。
　（Ｂ－１）の官能基を有するアミノ酸としては、例えば、propargylglycine、homopropargylglycine、2-amino-6-heptynoic acid、2-amino-7-octynoic acid、及び2-amino-8-nonynoic acid等が挙げられる。4-pentynoyl化や5-hexynoyl化したアミノ酸を用いてもよい。4-pentynoyl化アミノ酸としては、例えば、N-(4-pentenoyl)-L-alanine、N-(4-pentenoyl)-L-phenylalanine、N-(4-pentenoyl)-L-tyrosine、N-(4-pentenoyl)-L-tryptophan、N-3-(4-pentynoylamido)benzoyl-L-phenylalanine、N-3-(4-pentynoylamido)benzoyl-L-tyrosine、N-3-(4-pentynoylamido)benzoyl-L-tryptophan、β-N-(4-pentenoyl)-L-diaminopropanoic  acid、γ-N-(4-pentenoyl)-L-diaminobutyric  acid、σ-N-(4-pentenoyl)-L-ornithine、ε-N-(4-pentenoyl)-L-lysine、及びこれらに対応するＤ－アミノ酸誘導体等が挙げられる。5-hexynoyl化アミノ酸としては、4-pentynoyl化アミノ酸として例示した化合物において、4-pentynoyl基が、5-hexynoyl基に置換されたアミノ酸が挙げられる。
　（Ｂ－２）の官能基を有するアミノ酸としては、例えば、azidoalanine、2-amino-4-azidobutanoic acid、azidoptonorvaline、azidonorleucine、2-amino-7-azidoheptanoic acid、及び2-amino-8-azidooctanoic acid等が挙げられる。azidoacetyl化や3-azidopentanoyl化したアミノ酸を用いることもできる。azidoacetyl化アミノ酸としては、例えば、N-azidoacetyl-L-alanine、N-azidoacetyl-L-phenylalanine、N-azidoacetyl-L-tyrosine、N-azidoacetyl-L-tryptophan、N-3-(4-pentynoylamido)benzoyl-L-phenylalanine、N-3-(4-pentynoylamido)benzoyl-L-tyrosine、N-3-(4-pentynoylamido)benzoyl-L-tryptophan、β-N-azidoacetyl-L-diaminopropanoic acid、γ-N-azidoacetyl-L-diaminobutyric acid、σ-N-azidoacetyl-L-ornithine、ε-N-azidoacetyl-L-lysine、及びこれらに対応するＤ－アミノ酸誘導体等が挙げられる。3-azidopentanoyl化アミノ酸としては、azidoacetyl化アミノ酸として例示した化合物において、azidoacetyl基が、3-azidopentanoyl基に置換されたアミノ酸が挙げられる。
　（Ｂ－１）の官能基を有するアミノ酸と（Ｂ－２）の官能基を有するアミノ酸による環状化方法は、例えば、Sako, Y. et al., Journal of American Chemical Society 130, 7932-7934 (2008)、及び国際公開第２００８／１１７８３３号等に記載された方法が挙げられる。
　（Ｃ－１）の官能基を有するアミノ酸としては、例えば、N-(4-aminomethyl-benzoyl)-phenylalanine (AMBF)及び3-aminomethyltyrosine等が挙げられる。
　（Ｃ－２）の官能基を有するアミノ酸としては、例えば、5-hydroxytryptophan(WOH)等が挙げられる。
　（Ｃ－１）の官能基を有するアミノ酸と（Ｃ－２）の官能基を有するアミノ酸による環状化方法は、例えば、Yamagishi, Y. et al., ChemBioChem 10, 1469-1472 (2009)及び国際公開第２００８／１１７８３３号に記載された方法等が挙げられる。
　（Ｄ－１）の官能基を有するアミノ酸としては、例えば、2-amino-6-chloro-hexynoic acid、2-amino-7-chloro-heptynoic acid、及び2-amino-8-chloro-octynoic acid等が挙げられる。
　（Ｄ－２）の官能基を有するアミノ酸としては、例えばcysteine、homocysteine、mercaptonorvaline、mercaptonorleucine、2-amino-7-mercaptoheptanoic acid、及び2-amino-8-mercaptooctanoic acid等が挙げられる。
　（Ｄ－１）の官能基を有するアミノ酸と（Ｄ－２）の官能基を有するアミノ酸による環状化方法は、例えば、国際公開第２０１２／０７４１２９号に記載された方法等が挙げられる。
　（Ｅ－１）のアミノ酸としては、例えば、N-3-chloromethylbenzoyl-L-phenylalanine、N-3-chloromethylbenzoyl-L-tyrosine、N-3-chloromethylbenzoyl-L-tryptophan、及びこれらに対応するＤ－アミノ酸誘導体等が挙げられる。
　（Ｅ－２）のアミノ酸としては、例えば、cysteine、homocysteine、mercaptonorvaline、 mercaptonorleucine、2-amino-7-mercaptoheptanoic acid、及び2-amino-8-mercaptooctanoic acid等が挙げられる。
　（Ｅ－１）の官能基を有するアミノ酸と（Ｅ－２）の官能基を有するアミノ酸による環状化方法は、例えば、（Ａ－１）と（Ａ－２）の環状化方法や（Ｄ－１）と（Ｄ－２）の環状化方法を参考にして行うことができる。
　本発明の環状ペプチドのより好ましい例として、下記式（ＩＶ）の構造を有する環状ペプチドが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 （上記式中、ＴｙｒはＤ体であってもよく、Ｌ体であってもよく、好ましくはＤ体であり、Ｓは、Ｃｙｓのチオール基を意味し、「Variable region」と称される部分は、式（Ｉ）のユニット構造を少なくとも含むペプチド鎖であり（アミノ酸長は４～２８、５～２６、６～１８、１０～１６又は１１～１５とすることができる）、式（ＩＩＩ）の－（Ｚ４）ｐ－Ｘ１－Ａｓｎ－Ｘ２－Ｖａｌ－（Ｚ５）ｑ－に相当するペプチド鎖であってもよく、（Ｚ６）ｒは式（ＩＩＩ）で定義した内容と同義である）
　本明細書及び図面においては、上記構造における－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－で表される構造は、「Ａｃ」と表記されることがある。
　上記式（ＩＶ）において、「Variable region」は、下記式（Ｖ）で表すことができる。
　－（Ｚ４）ｐ－Ｘ１－Ａｓｎ－Ｘ２－Ｖａｌ－（Ｚ５）ｑ－　　　（Ｖ）
（上記式中、Ｘ１及びＸ２は式（Ｉ）で定義した内容と同義であり、Ｚ４及びＺ５並びにｐ及びｑは式（ＩＩＩ）で定義した内容と同義であり、具体的な説明及び好ましい態様は式（ＩＩＩ）において説明した通りである。）
　上記式（ＩＶ）で表される環状ペプチドの好適な具体例としては、下記式（１）（ＭｕＳＫ７／配列番号２）、式（２）（ＭｕＳＫ４／配列番号３）及び式（３）（ＭｕＳＫ９／配列番号４）で表される構造のいずれかを有するものが挙げられる。但し、下記式（１）～（３）において、上記式（ＩＶ）のＣｙｓに結合する（Ｚ６）ｒに該当する直鎖状構造部分は省略している。したがって、下記式（１）～（３）中、－ＳＣＨ２－に結合するＣ（Ｃｙｓ）には、（Ｚ６）ｒが結合していてもよい（Ｚ６及びｒは、式（ＩＩＩ）で定義した内容と同義である）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　また、上記式（１）～（３）中、Ｃ（Ｃｙｓ）のカルボキシル基（－Ｃ（＝Ｏ）－ＯＨ）は酸アミド（－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ２）を形成していてもよい。このような化合物は下記式（１ａ）、（２ａ）及び（３ａ）である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　本発明における環状ペプチドは、ＭｕＳＫと高い親和性を有し、ＭｕＳＫと強力に結合することができ、ＭｕＳＫアゴニストとして使用することができる。また後述するように、本発明の環状ペプチドを含む複合体は、ＭｕＳＫの細胞外ドメインに結合することにより、ＭｕＳＫのホモ二量体化を引き起こし、それにより下流のＭｕＳＫシグナル伝達を選択的に誘導するため、神経筋接合部における神経から筋肉への信号伝達を活性化できる。このため本発明の環状ペプチドは、従来研究されてきた抗アセチルコリン受容体自己抗体を標的とするアプローチと異なり、神経筋接合部の信号伝達を強力に活性化できるため、既存の手法とは異なる治療法及び研究法を提供できる点で有利である。すなわち、本発明の環状ペプチド及びその薬学上許容可能な塩は医薬及び研究試薬として有用であり、本発明によれば、本発明の環状ペプチド及びその薬学上許容可能な塩を含む医薬組成物と、医薬品としての本発明の環状ペプチド及びその薬学上許容可能な塩の使用が提供される。
　本発明の別の態様によれば、下記式（Ｉ）の構造を含む、ペプチド又はその薬学上許容可能な塩が提供される。
－Ｘ１－Ａｓｎ－Ｘ２－Ｖａｌ－　　　（Ｉ）
（上記式中、Ｘ１はＴｈｒ又はＶａｌを表し、Ｘ２はＶａｌ又はＩｌｅを表す）
　上記の本発明のペプチドのアミノ酸残基の個数の下限値（以上）は例えば、７、８、９、１０、１１、１２又は１３とすることができ、その上限値（以下）は、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６又は１５とすることができる。これらの下限値及び上限値は任意に組み合わせて上記ペプチドを形成するアミノ酸残基の数の範囲とすることができ、例えば、６以上３０以下、７以上２５以下、８以上２０以下、１２以上１８以下、１３以上１７以下とすることができる。
　上記の本発明のペプチドは本発明の環状ペプチドのアミノ酸配列と同じアミノ酸配列又はその一部のアミノ酸配列からなるペプチドとすることができ、好ましくは本発明の環状ペプチドに存在するＭｕＳＫ分子結合活性を有する領域（すなわち、ＭｕＳＫ結合領域）を構成するアミノ酸配列を含むペプチド、より好ましくはＹＸ２２ＳＹＨＴＮＶＶＡＳＬＫＲ（Ｘ２２はＰ又はＬである）（配列番号１１）のアミノ酸配列を含むペプチドとすることができる。上記の本発明のペプチドはまた、非環状ペプチドとすることができる。
　上記の本発明のペプチドは、後述のＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子のように、所望の生体分子にグラフトして使用することができる。グラフト対象の生体分子としてはユビキチン分子等の生体タンパク質が挙げられる。上記の本発明のペプチドは所望分子に対する結合性を有するペプチドとすることができるところ、該ペプチドによる結合性が発揮されるように生体分子にグラフトすることができ、上記の本発明のペプチドが本発明の環状ペプチドに存在するＭｕＳＫ分子結合活性を有する領域を構成するアミノ酸配列を含むペプチドである場合には、該ペプチドによるＭｕＳＫ結合性が発揮されるように生体分子にグラフトすることができる。生体分子にグラフトされた上記の本発明のペプチドは、該ペプチドによる、所望分子に対する結合性が発揮される限りにおいて、本発明の範囲である。生体分子中へのグラフトについては、例えば、後述のユビキチン分子のように、タンパク質中の２つの連続するドメイン構造の間のループ構造領域に上記の本発明のペプチドをグラフトすることができる。
［環状ペプチドの製造方法］
　本発明の環状ペプチドは、無細胞翻訳系による翻訳合成法により好適に製造できる。具体的には、環状ペプチドをコードする核酸を調製し、当該核酸を無細胞翻訳系で翻訳することによって調製することができる。環状ペプチドをコードする核酸は、生体の翻訳系で用いられる遺伝暗号、リプログラミングした遺伝暗号、又はこれらの組み合わせを用いて、当業者が適宜設計することができる。核酸は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。
　無細胞翻訳系を用いる方法によれば、非天然アミノ酸でアミノアシル化したｔＲＮＡを使用して、天然アミノ酸に加え、非天然アミノ酸をペプチドに効率よく導入することができる。例えば、本発明者らが開発した人工アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素フレキシザイムを用いれば、任意の天然又は非天然のアミノ酸で、任意のアンチコドンを有するｔＲＮＡをアミノアシル化することが可能である。従って、この技術を用いて、ｍＲＮＡのトリプレットからなる遺伝暗号が、生体の翻訳系とは異なるアミノ酸をコードするように、リプログラミングすることができる（例えば、国際公開第２００８／０５９８２３号参照）。
［環状ペプチド複合体］
　本発明の環状ペプチド複合体は、二つの、本発明の環状ペプチドを含み、一方の環状ペプチドが他方の環状ペプチドにリンカーにより結合してした構造を有している。
　図１に示すように、Ａｇｒｉｎはその受容体であるＬＲＰ４の一番目のβプロペラ構造と結合する。ＭｕＳＫはその細胞外ドメイン（イムノグロブリン様領域であるＩｇ１領域）においてＬＲＰ４の別のプロペラ構造と結合するため、ＡｇｒｉｎのＬＲＰ４への結合によりＡｇｒｉｎ－ＬＲＰ４－ＭｕＳＫ複合体が成立し、ＭｕＳＫのホモ二量体化が引き起こされていると考えられている。また、この複合体が成立するとともに細胞内因子であるＤｏｋ－７が作用することでＭｕＳＫの細胞内のキナーゼ領域が活性状態に遷移し、ＭｕＳＫの自己リン酸化を介して下流のシグナル伝達を活性化することが知られている（Zong Y. et al., GENES & DEVELOPMENT 2012; 26:247-258）。また、ＭｕＳＫの下流シグナル伝達が活性化されることにより、後シナプス部位にアセチルコリン受容体のクラスターが形成されることが知られている（Xing G. et al., Neurosci Lett, 2020 Jul 13;731:135013.）。本発明の環状ペプチド複合体は、ＭｕＳＫ結合領域を有する環状ペプチドを２つ有する構成を備えるため、環状ペプチド複合体中のそれぞれの環状ペプチドがＭｕＳＫの細胞外ドメインにそれぞれ結合し、ＭｕＳＫのホモ二量体化を誘導できると考えられる（図２）。従って、本発明の環状ペプチド複合体は、ＭｕＳＫの自己リン酸化を介して下流のシグナル伝達を活性化し、アセチルコリン受容体のクラスター化を誘導できると考えられる。その結果、本発明の環状ペプチド複合体は、神経筋接合部における神経から筋肉への信号伝達を活性化できると考えられる。このため、本発明の環状ペプチド複合体は、神経筋接合部の信号伝達の異常に起因する重症筋無力症の治療剤として有用であるといえる。すなわち、本発明の環状ペプチド複合体及びその薬学上許容可能な塩は医薬として有用であり、本発明によれば、本発明の環状ペプチド複合体及びその薬学上許容可能な塩を含む医薬組成物と、医薬品としての本発明の環状ペプチド複合体及びその薬学上許容可能な塩の使用が提供される。
　本発明の環状ペプチド複合体は、二つの本発明の環状ペプチドを含み、一方の環状ペプチドが他方の環状ペプチドにリンカーにより結合していれば上記作用を奏することができ、二つの環状ペプチドは、同一であってもよく、異なっていてもよい。ＭｕＳＫのホモ二量体化を一層促進する観点から、ペプチド複合体中の二つの環状ペプチドは同一であることが好ましい。
　環状ペプチド複合体における、二つの環状ペプチドを繋ぐリンカーとしては、特に限定されず、ペプチド合成分野においてペプチド同士を繋ぐリンカーとして周知の構造のものを採用することができるが、ＭｕＳＫのホモ二量体化をより促進する観点から、リンカーの長さは２０Å以上１００Å以下とすることが好ましい。
　ペプチド複合体における、二つの環状ペプチドを繋ぐリンカーの非限定的な例示としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のポリマー、ペプチド、核酸、糖、及びこれらの組合せが挙げられる。ＰＥＧを含むリンカーとしては、２以上の官能基を有する小分子に、２つのＰＥＧがそれぞれ結合したものが挙げられ、非限定的な例示としては、２，３－ジアミノプロピオン酸のアミノ基にカルボン酸変性ＰＥＧが結合したものが挙げられる。ＰＥＧを含むリンカーとしてはまた、同一又は異なってもよい２つの官能基を両端に有するＰＥＧが挙げられ、非限定的な例示としては、２つのマレイミド基を両端に有するＰＥＧが挙げられる。ＰＥＧを含むリンカーはエチレングリコール構造（－ＣＨ２Ｏ－）を含むものとして特定することができ、エチレングリコールの重合数は、２～２０又は５～１５であってもよい。
　本発明のペプチド複合体は、血中安定性をより向上させる観点から、側鎖として炭素数８～２０（好ましくは炭素数１２～１８又は１４～１８）の飽和炭化水素基を少なくとも一つ有していてもよい。この飽和炭化水素基は、好ましくはリンカーに導入することができる。例えば、リンカーが、２以上の官能基を有する小分子に、２つのＰＥＧがそれぞれ結合したリンカーである場合は、該小分子の３つ目の官能基に直接又は間接的に飽和脂肪酸を結合させたものが挙げられ、非限定的な例示としては、２，３－ジアミノプロピオン酸のアミノ基にカルボン酸変性ＰＥＧが結合したリンカーにおいて、２，３－ジアミノプロピオン酸のカルボキシル基に間接的に炭素数８～２０（好ましくは炭素数１２～１８又は１４～１８）の飽和脂肪酸を結合させたものが挙げられる。炭素数８～２０の飽和脂肪酸の非限定的な例示としては、パルミチン酸（炭素数１６）、ミリスチル酸（炭素数１４）が挙げられる。
［環状ペプチド複合体の製造方法］
　本発明の環状ペプチド複合体は、本発明の環状ペプチドを適当なリンカーにより連結することで、製造することができる。本発明の環状ペプチドをリンカーで連結する工程は、使用するリンカーの種類に応じて、リンカーとペプチドをつなぐ公知の方法、又はそれに準ずる方法を用いて、当業者が実施することができる。例えば、リンカーが、２以上の官能基を有する小分子に、２つのＰＥＧがそれぞれ結合したリンカーである場合は、２つのＰＥＧのそれぞれの末端に予めアミノ基を導入しておき、このアミノ基と、本発明の環状ペプチドのＣ末端のカルボキシル基とをアミド結合により連結することによりペプチド複合体を調製することができる。また、リンカーが、同一又は異なってもよい２つの官能基（例えば、マレイミド基）を両端に有するＰＥＧである場合は、当該２つの官能基と、本発明の環状ペプチドのＣ末端の官能基（例えば、システインのチオール基）とを化学的に結合させることによりペプチド複合体を調製することができる。さらに、リンカーがペプチドである場合は、２つの、本発明の環状ペプチドをコードする核酸と、リンカーペプチドをコードする核酸とを連結し、本発明の環状ペプチドとリンカーペプチドの融合タンパク質を発現させて、ペプチド複合体を調製することもできる。
［ＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子］
　本発明のＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子は、ユビキチン分子のβ１ドメインとβ２ドメインとの間のループ構造領域の一部又は全部が、ＭｕＳＫ結合領域を含むペプチド鎖により置換されてなるものである。本発明のＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子はまた、ユビキチン分子のβ１ドメインとβ２ドメインとの間のループ構造領域に、ＭｕＳＫ結合領域を含むペプチド鎖が挿入されてなるものである。本発明においては、ユビキチン分子のβ１ドメインとβ２ドメインとの間のループ構造領域の全部が、構造（Ａ）のペプチドにより置換されてなるユビキチン分子が好ましい。
　ここでユビキチンは真核生物において普遍的に存在するタンパク質であり、進化的に保存性が高く、熱安定であることが知られている。ユビキチンはまた、２つのαヘリックス及び５つのβシートを含んでおり、具体的にはＮ末端からＣ末端の方向にβ１（βシート１）、β２（βシート２）、α１（αヘリックス１）、β３（βシート３）、β４（βシート４）、α２（αヘリックス２）及びβ５（βシート５）の順でαヘリックス及びβシートを有している。βシートの間及びαヘリックスとβシートの間をつなぐ領域はループと呼ばれ、本発明のユビキチン分子はβ１とβ２との間のループ構造領域にＭｕＳＫ結合領域を含むペプチド鎖がグラフトされていることを特徴とする。
　グラフト対象のユビキチン分子（すなわち足場となるユビキチン分子）は、例えば、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質（ヒトユビキチン分子）とすることができる。β１は配列番号１のアミノ酸配列の１番から６番までの領域に対応し、β１－β２ループは配列番号１のアミノ酸配列の７番から１０番までの領域に対応し、β２は配列番号１のアミノ酸配列の１１番から１７番までの領域に対応する。以下、グラフト対象のユビキチン分子が配列番号１のアミノ酸配列である場合を例として本発明のユビキチン分子を説明するが、本発明のユビキチン分子はこれに限定されるものではない。
　グラフト対象のユビキチン分子が配列番号１のアミノ酸配列の場合、「ユビキチン分子のβ１ドメインとβ２ドメインとの間のループ構造領域の全部が構造（Ａ）のペプチドにより置換されてなる」とは、配列番号１のアミノ酸配列の７番から１０番までの領域が前記構造（Ａ）のペプチドに置き換えられた構造を有していることを意味する。この場合、本発明のユビキチン分子は、配列番号１のアミノ酸配列において、６番目のアミノ酸の下流、かつ、１１番目のアミノ酸の上流に、構造（Ａ）のペプチドが存在することになる（図２３参照）。
　グラフト対象のユビキチン分子が配列番号１のアミノ酸配列の場合、「ユビキチン分子のβ１ドメインとβ２ドメインとの間のループ構造領域の一部が構造（Ａ）のペプチドにより置換されてなる」とは、配列番号１のアミノ酸配列の７番目のアミノ酸、８番目のアミノ酸、９番目のアミノ酸、１０番目のアミノ酸、７番目から８番目までの領域、８番目から９番目までの領域、９番目から１０番目までの領域、７番目から９番目までの領域、及び８番目から１０番目までの領域のいずれかが前記構造（Ａ）のペプチドに置き換えられた構造を有していることを意味する。例えば、配列番号１のアミノ酸配列の８番目から９番目の領域が構造（Ａ）のペプチドに置き換えられた場合、本発明のユビキチン分子は、配列番号１のアミノ酸配列において、７番目のアミノ酸の下流、かつ、１０番目のアミノ酸の上流に、構造（Ａ）のペプチドが存在することになる。
　グラフト対象のユビキチン分子が配列番号１のアミノ酸配列の場合、「ユビキチン分子のβ１ドメインとβ２ドメインとの間のループ構造領域に構造（Ａ）のペプチドが挿入されてなる」とは、配列番号１のアミノ酸配列の６番目のアミノ酸と７番目のアミノ酸の間、７番目のアミノ酸と８番目のアミノ酸の間、８番目のアミノ酸と９番目のアミノ酸の間、９番目のアミノ酸と１０番目のアミノ酸の間、及び１０番目のアミノ酸と１１番目のアミノ酸の間のいずれかに前記構造（Ａ）のペプチドが挿入された構造を有していることを意味する。例えば、配列番号１のアミノ酸配列の８番目のアミノ酸と９番目のアミノ酸の間に構造（Ａ）のペプチドが挿入された場合、本発明のユビキチン分子は、配列番号１のアミノ酸配列において、８番目のアミノ酸の下流、かつ、９番目のアミノ酸の上流に、構造（Ａ）のペプチドが存在することになる。
　グラフト対象のユビキチン分子は、ＭｕＳＫへの結合活性が妨げられない限り、配列番号１のアミノ酸配列以外のアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。本発明においては例えば、配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上（好ましくは、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をグラフト対象のユビキチン分子とすることができる。ここで「同一性」は、例えば、比較する配列同士を適切に整列（アライメント）させたときの同一性の程度であり、前記配列間のアミノ酸の正確な一致の出現率（％）を意味する。同一性の算出にあたっては、例えば、配列におけるギャップの存在及びアミノ酸の性質が考慮される（Wilbur, Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:726-730（1983））。前記アライメントは、例えば、任意のアルゴリズムの利用により行うことができ、具体的には、ＢＬＡＳＴ（Basic local alignment search tool)（Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990））、ＦＡＳＴＡ（Peasron et al., Methods in Enzymology 183:63-69 (1990）)、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ（Meth. Enzym., 164, 765 (1988））などの公に利用可能な相同性検索ソフトウェアを使用することができる。また、同一性の算出は、例えば、前記のような公に利用可能な相同性検索プログラムを用いて行うことができ、例えば、米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）において、デフォルトのパラメーターを用いることによって算出することができる。
　本発明においてはまた、配列番号１のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸について欠失、置換、挿入及び付加からなる群から選択される改変を有するタンパク質をグラフト対象のユビキチン分子とすることができる。改変されるアミノ酸の個数は、部位突然変異誘発法などの公知の方法により生じる程度の変異数、或いは、天然に生じる程度の変異数とすることができる。改変されるアミノ酸の個数はまた、例えば、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、１～２個又は１個である。前記改変が複数個の場合、改変の種類は同一であっても異なっていてもよい。すなわち前記改変は、複数の同種の改変（例えば、複数の置換）であってもよいし、複数の異種の改変（例えば、１個以上の欠失と１個以上の置換の組合せ）であってもよい。
　配列番号１のアミノ酸配列におけるアミノ酸の改変は保存的改変（例えば、保存的変異）であってもよい。「保存的改変」又は「保存的変異」は、タンパク質の機能を実質的に改変しないように、１個又は複数個のアミノ酸を改変し、又は変異させることを意味する。前記アミノ酸の置換はまた、保存的置換であってもよい。「保存的置換」は、タンパク質の機能を実質的に改変しないように、１個又は複数個のアミノ酸を、別のアミノ酸及び／又はアミノ酸誘導体に置換することを意味する。保存的置換において、置換されるアミノ酸と置換後のアミノ酸とは、例えば、性質及び／又は機能が類似していることをいい、疎水性及び親水性の指標、極性、電荷などの化学的性質、或いは二次構造などの物理的性質が類似していることが好ましい。このように、性質及び／又は機能が類似するアミノ酸又はアミノ酸誘導体は、当該技術分野において公知である。非制限的な例を挙げると以下の通りである。非極性アミノ酸（疎水性アミノ酸）としては、例えば、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性アミノ酸（中性アミノ酸）は、例えば、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷を有するアミノ酸（塩基性アミノ酸）は、例えば、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられ、負電荷を有するアミノ酸（酸性アミノ酸）は、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
　配列番号１のアミノ酸配列におけるアミノ酸の改変（好ましくは置換、より好ましくは保存的改変又は保存的置換）はまた、β１－β２ループ（配列番号１のアミノ酸配列の７番目から１０番目の領域）以外の領域（すなわち配列番号１のアミノ酸配列の１番目から６番目の領域及び１１番目以降の領域）に存在するものとすることができ、好ましくは、β１（配列番号１のアミノ酸配列の１番目から６番目の領域）及びβ１－β２ループ（配列番号１のアミノ酸配列の７番目から１０番目の領域）以外の領域（すなわち配列番号１のアミノ酸配列の１１番目以降の領域）に存在するものとすることができ、より好ましくは、β１（配列番号１のアミノ酸配列の１番目から６番目の領域）、β１－β２ループ（配列番号１のアミノ酸配列の７番目から１０番目の領域）及びβ２（配列番号１のアミノ酸配列の１１番目から１７番目の領域）以外の領域（すなわち配列番号１のアミノ酸配列の１８番目以降の領域）に存在するものとすることができる。
　配列番号１のアミノ酸配列におけるアミノ酸の改変の位置の非制限的な例としては、１１番目（Ｋ）、１２番目（Ｔ）、３７番目（Ｐ）、５４番目（Ｒ）、５７番目（Ｓ）、６２番目（Ｑ）及び６５番目（Ｓ）が挙げられ、１１番目（Ｋ）、５４番目（Ｒ）及び５７番目（Ｓ）が好ましい。配列番号１のアミノ酸配列は、上記改変位置のうち１つ、２つ又は３つの位置で改変（好ましくは置換変異）を有していてもよい。
　配列番号１のアミノ酸配列におけるアミノ酸の改変の非制限的な例としては、Ｋ１１Ｍ、Ｋ１１Ｅ、Ｋ１１Ｔ、Ｔ１２Ｌ、Ｔ１２Ｋ、Ｐ３７Ｒ、Ｒ５４Ｓ、Ｒ５４Ｇ、Ｓ５７Ｔ、Ｑ６２Ｋ及びＳ６５Ｔの置換変異が挙げられ、配列番号１のアミノ酸配列はこれらのうち１つ、２つ又は３つの変異を有していてもよい。
　配列番号１のアミノ酸配列におけるアミノ酸の改変の位置の別の非制限的な例としては、７５番目（Ｇ）及び７６番目（Ｇ）が挙げられ、上記改変位置のうち１つ又は２つの位置で改変（好ましくは欠失）を有していてもよい。
　配列番号１のアミノ酸配列以外のアミノ酸配列からなるユビキチン分子における、構造（Ａ）のペプチドの置換又は挿入位置は、グラフト対象のユビキチン分子のアミノ酸配列を、配列番号１のアミノ酸配列と適切に整列（アライメント）させることにより特定することができる。すなわち、グラフト対象のユビキチン分子のアミノ酸配列を、前述の相同性検索ソフトウェア又はプログラムなどを用いて配列番号１のアミノ酸配列と整列させ、配列番号１のアミノ酸配列の１番目から６番目の位置に相当する領域をβ１とし、配列番号１のアミノ酸配列の７番目から１０番目の位置に相当する領域をβ１－β２ループ構造とし、配列番号１のアミノ酸配列の１１番目から１７番目の位置に相当する領域をβ２とすることができる。
　ユビキチン分子へグラフトする構造（Ａ）を有するペプチドは２つのスペーサー領域に挟まれたＭｕＳＫ結合領域からなる。ＭｕＳＫ結合領域は、ＹＸ２１ＳＹＨＴＮＶＶＡＳＬＫＲ（Ｘ２１はＰ又はＬである）のアミノ酸配列（配列番号１１）からなり、式（１）のＭｕＳＫ７に由来する配列である。スペーサー１は、ＩＱＰＲ（配列番号１２）、ＫＰＧＶ（配列番号１３）、ＷＤＲＧ（配列番号１４）、ＫＰＧＴ（配列番号１５）、ＰＦＧＶ（配列番号１６）、ＹＦＶＧ（配列番号１７）及びＬＥＧＭ（配列番号１８）からなる群から選択することができ、スペーサー２は、ＩＲＹ、ＭＭＰ、ＱＧＩ、ＦＭＰ、ＴＧＰＱ（配列番号１９）、ＷＮＴＰ（配列番号２０）及びＩＲＰＱ（配列番号２１）からなる群から選択することができる。
　本発明によると、両端に数アミノ酸残基のスペーサー領域が存在するＭｕＳＫ結合領域をグラフトしたユビキチン分子は、意外にもＭｕＳＫ結合領域のみをグラフトしたユビキチン分子と比較して高いＭｕＳＫ結合活性を有していた。ＭｕＳＫ結合活性の観点からＭｕＳＫ結合領域は下記表２の１～７のいずれかの組合せでその上流及び下流にスペーサー配列１及び２を有していることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　構造（Ａ）のペプチドの非限定的な例としては、下記のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。
（Ｕｂ００６）ＩＱＰＲＹＰＳＹＨＴＮＶＶＡＳＬＫＲＩＲＹ（配列番号２２）
（Ｕｂ００７）ＫＰＧＶＹＰＳＹＨＴＮＶＶＡＳＬＫＲＭＭＰ（配列番号２３）
（Ｕｂ００８）ＷＤＲＧＹＰＳＹＨＴＮＶＶＡＳＬＫＲＱＧＩ（配列番号２４）
（Ｕｂ００９）ＫＰＧＴＹＰＳＹＨＴＮＶＶＡＳＬＫＲＦＭＰ（配列番号２５）
（Ｕｂ０１０）ＰＦＧＶＹＰＳＹＨＴＮＶＶＡＳＬＫＲＴＧＰＱ（配列番号２６）
（Ｕｂ０１１）ＹＦＶＧＹＰＳＹＨＴＮＶＶＡＳＬＫＲＷＮＴＰ（配列番号２７）
（Ｕｂ０１２）ＬＥＧＭＹＬＳＹＨＴＮＶＶＡＳＬＫＲＩＲＰＱ（配列番号２８）
（Ｕｂ０１３）ＬＥＧＭＹＰＳＹＨＴＮＶＶＡＳＬＫＲＩＲＰＱ（配列番号２９）
　構造（Ａ）のペプチドをグラフトされたユビキチン分子がＭｕＳＫへの結合活性を有するかは後記実施例に従って行うことができる。例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用して、センサーチップ上に固定化されたＭｕＳＫに対する該分子の結合動態を定量測定することができ、ＳＰＲによる結合親和性ＫＤが例えば１μＭ以下又は５００ｎＭ以下の場合にＭｕＳＫへの結合活性を有すると判定することができる。なお、ＭｕＳＫ分子としては、ヒトＭｕＳＫアイソフォーム１前駆体（Human MuSK isoform 1 precursor）（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿００５５８３．１）の細胞外領域（例えば、１－４９３アミノ酸）を用いることができる。
　本発明の好ましい態様によれば、
　ユビキチン分子のβ１ドメインとβ２ドメインとの間のループ構造領域の一部又は全部が前記構造（Ａ）のペプチドにより置換されてなるか、或いはユビキチン分子のβ１ドメインとβ２ドメインとの間のループ構造領域に前記構造（Ａ）のペプチド（好ましくは前記Ｕｂ００６～０１３のいずれかのペプチド）が挿入されてなる、ＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子であって、
　前記ユビキチン分子が
　配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質、
　配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、或いは
　配列番号１のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸について欠失、置換、挿入及び付加からなる群から選択される改変を有するタンパク質
である、ＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子が提供される。
　本発明のＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子は、ＭｕＳＫと高い親和性を有し、ＭｕＳＫと強力に結合することができ、ＭｕＳＫアゴニストとして使用することができる。また後述するように、本発明のユビキチン分子を含む複合体は、ＭｕＳＫの細胞外ドメインに結合することにより、ＭｕＳＫのホモ二量体化を引き起こし、それにより下流のＭｕＳＫシグナル伝達を選択的に誘導するため、神経筋接合部における神経から筋肉への信号伝達を活性化できる。このため本発明のＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子は、従来研究されてきた抗アセチルコリン受容体自己抗体を標的とするアプローチと異なり、神経筋接合部の信号伝達を強力に活性化できるため、既存の手法とは異なる治療法及び研究法を提供できる点で有利である。すなわち、本発明のＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子及びその薬学上許容可能な塩は医薬及び研究試薬として有用であり、本発明によれば、本発明のＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子及びその薬学上許容可能な塩を含む医薬組成物と、医薬品としての本発明のＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子及びその薬学上許容可能な塩の使用が提供される。
［グラフト化ユビキチン分子の製造方法］
　本発明のＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子は、無細胞翻訳系による翻訳合成法により好適に製造できる。本発明のユビキチン分子をコードする核酸を調製し、当該核酸を無細胞翻訳系で翻訳することによって調製することができる。本発明のユビキチン分子をコードする核酸は、生体の翻訳系で用いられる遺伝暗号、リプログラミングした遺伝暗号、又はこれらの組み合わせを用いて、当業者が適宜設計することができる。核酸は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。
　無細胞翻訳系を用いる方法によれば、非天然アミノ酸でアミノアシル化したｔＲＮＡを使用して、天然アミノ酸に加え、非天然アミノ酸をペプチドに効率よく導入することができることは前述の通りである。
［グラフト化ユビキチン分子複合体］
　本発明のグラフト化ユビキチン分子複合体は、複数の本発明のユビキチン分子を含み、複数のグラフト化ユビキチン分子が互いにリンカーにより結合してした構造を有している。
　前記の通り、Ａｇｒｉｎはその受容体であるＬＲＰ４の一番目のβプロペラ構造と結合し、ＬＲＰ４の別のβプロペラ構造結合しているＭｕＳＫのホモ二量体化を引き起こし、ＭｕＳＫの自己リン酸化を介して下流のシグナル伝達を活性化することが知られている（図１参照）。また、ＭｕＳＫの下流シグナル伝達が活性化されることにより、後シナプス部位にアセチルコリン受容体のクラスターが形成されることが知られている。本発明のグラフト化ユビキチン分子複合体は、ＭｕＳＫ結合領域に相当するファーマコフォアの複数構成を備えるため、グラフト化ユビキチン分子複合体中のそれぞれのファーマコフォア領域がＭｕＳＫの細胞外ドメインにそれぞれ結合し、ＭｕＳＫのホモ二量体化を誘導できると考えられる（図２）。従って、本発明のグラフト化ユビキチン分子複合体は、ＭｕＳＫの自己リン酸化を介して下流のシグナル伝達を活性化し、アセチルコリン受容体のクラスター化を誘導できると考えられる。その結果、本発明のグラフト化ユビキチン分子複合体は、神経筋接合部における神経から筋肉への信号伝達を活性化できると考えられる。このため、本発明のグラフト化ユビキチン分子複合体は、神経筋接合部の信号伝達の異常に起因する重症筋無力症の治療剤として有用であるといえる。すなわち、本発明のグラフト化ユビキチン分子複合体及びその薬学上許容可能な塩は医薬として有用であり、本発明によれば、本発明のグラフト化ユビキチン分子複合体及びその薬学上許容可能な塩を含む医薬組成物と、医薬品としての本発明のグラフト化ユビキチン分子複合体及びその薬学上許容可能な塩の使用が提供される。
　本発明のグラフト化ユビキチン分子複合体は、複数の本発明のユビキチン分子を含み、複数の本発明のユビキチン分子が互いにリンカーにより結合していれば上記作用を奏することができ、当該複数のグラフト化ユビキチン分子は、同一であってもよく、異なっていてもよい。ＭｕＳＫのホモ二量体化を一層促進する観点から、複合体中の複数のグラフト化ユビキチン分子は同一であることが好ましい。
　本発明のグラフト化ユビキチン分子複合体において、複数のユビキチン分子を繋ぐリンカーとしては、特に限定されず、ペプチド合成分野においてペプチド又はタンパク質同士を繋ぐリンカーとして周知の構造のものを採用することができるが、ＭｕＳＫのホモ二量体化をより促進する観点から、リンカーの長さは２０Å以上１００Å以下とすることが好ましい。
　本発明のグラフト化ユビキチン分子複合体における、複数のユビキチン分子を繋ぐリンカーの非限定的な例示としては、例えば、ペプチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のポリマー、核酸、糖、及びこれらの組合せが挙げられる。ペプチドを含むリンカーとしては、ＰＡの繰り返し構造を有するペプチド（例えば、Ａ（ＰＡ）ｖのペプチドであり、ｖは６～８の整数、好ましくは７である）や、ＥＡＡＡＫの繰り返し構造を有するペプチド（例えば、（ＥＡＡＡＫ）ｘのペプチドであり、ｘは２～４の整数、好ましくは３である）が挙げられる。複数のグラフト化ユビキチン分子を繋ぐリンカーとしてペプチドを使用する場合、二量体を例に説明すると、一方のグラフト化ユビキチン分子のＣ末端と他方のグラフト化ユビキチン分子のＮ末端とをペプチドで連結することができる。三量体以上の複合体の場合も同様の構造とすることができる。このような構造とすることで、グラフト化ユビキチン分子を一本の核酸から複合体タンパク質を発現させることができる。本発明のグラフト化ユビキチン分子はこれ以外にＰＥＧを含むリンカーを用いることができ、具体的には本発明の環状ペプチド複合体において記載したものを使用することができる。
［グラフト化ユビキチン分子複合体の製造方法］
　本発明のグラフト化ユビキチン分子複合体は、本発明のユビキチン分子をペプチドにより連結することができる。この場合、本発明のグラフト化ユビキチン分子複合体は、無細胞翻訳系による翻訳合成法により好適に製造できる。本発明のグラフト化ユビキチン分子複合体をコードする核酸を調製し、当該核酸を無細胞翻訳系で翻訳することによって調製することができる。本発明のグラフト化ユビキチン分子複合体をコードする核酸は、生体の翻訳系で用いられる遺伝暗号、リプログラミングした遺伝暗号、又はこれらの組み合わせを用いて、当業者が適宜設計することができる。核酸は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。
　無細胞翻訳系を用いる方法によれば、非天然アミノ酸でアミノアシル化したｔＲＮＡを使用して、天然アミノ酸に加え、非天然アミノ酸をペプチドに効率よく導入することができることは前述の通りである。
　本発明のグラフト化ユビキチン分子複合体は、ペプチド以外のリンカーを用いて調製することもできる。本発明のグラフト化ユビキチン分子複合体をリンカーで連結する工程は、使用するリンカーの種類に応じて、リンカーとペプチドをつなぐ公知の方法、又はそれに準ずる方法を用いて、当業者が実施することができる。具体的には本発明の環状ペプチド複合体の製造方法において記載した手順に従って調製することができる。
［医薬組成物］
　本発明の治療剤及び医薬組成物は、本発明の環状ペプチド及びその薬学上許容可能な塩、本発明の環状ペプチド複合体及びその薬学上許容可能な塩、本発明のＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子及びその薬学上許容可能な塩、並びに本発明のＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子複合体及びその薬学上許容可能な塩（以下、これらの化合物及びそれらの塩を「本発明の有効成分」という）からなる群から選択される少なくとも１つを有効成分として含んでなるものである。
　前述の通り、本発明の有効成分は、ＭｕＳＫのホモ二量体化を誘導し、ＭｕＳＫの自己リン酸化を介して下流のシグナル伝達を活性化し、アセチルコリン受容体のクラスター化を誘導できると考えられる。従って、本発明の有効成分は神経筋接合部における神経から筋肉への信号伝達を活性化できるため、神経筋接合部の信号伝達の異常に起因する重症筋無力症の治療剤として用いることができる。すなわち、本発明の治療剤及び医薬組成物は、好ましくは、重症筋無力症の治療に用いることができる。本明細書で「治療」とは、治療的処置及び予防的処置を含み、疾患を有する患者において、疾患の原因を軽減又は除去すること、その進行を遅延又は停止させること、その症状を軽減、緩和、改善又は除去すること、及び／又は、その症状の悪化を抑制することを意味する。
　重症筋無力症患者には、抗アセチルコリン受容体抗体陽性型の患者、抗ＭｕＳＫ抗体陽性型の患者、抗ＬＲＰ４抗体陽性型の患者、及びこれら自己抗体がいずれも陰性である抗体陰性型（seronegative型）の患者が存在する。本発明の有効成分はＭｕＳＫを活性化させ、神経筋接合部の後シナプス部位にアセチルコリン受容体のクラスターを誘導することができるため、抗アセチルコリン受容体抗体陽性型の重症筋無力症のみならず、抗ＭｕＳＫ抗体陽性型の重症筋無力症及び抗ＬＲＰ４抗体陽性型の重症筋無力症並びに抗体陰性型の患者について治療可能である点で有利である。
　本発明の有効成分を対象に投与する場合、所望の治療効果が得られる限り、投与経路は特に限定されるものではないが、経口投与又は非経口投与（例えば、静脈内投与、皮下投与）を選択することができる。本発明の治療剤及び医薬組成物は、上記有効成分に加えて、薬学上許容される担体等を加えて製剤化してもよい。
　医薬製剤の剤形としては、例えば、液剤（例えば注射剤）、分散剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、粉末剤、坐剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤、吸入剤、軟膏剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、及びパップ剤等が挙げられる。これらの製剤は、当分野で通常行われている手法（例えば、第十八改正日本薬局方 製剤総則等に記載の公知の方法）により、薬学上許容される担体を用いて製剤化することができる。
　製剤化は、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、溶解剤、溶解補助剤、着色剤、矯味矯臭剤、安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、湿潤剤、分散剤、及び抗酸化剤等の添加剤を適宜使用して、常法により行うことができる。添加剤は、特に限定されるものではないが、例えば、精製水、食塩水、リン酸緩衝液、デキストロース、グリセロール、エタノール等の医薬的に許容可能な有機溶剤、動植物油、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、ソルビトール、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、コーンスターチ、無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、トラガント、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ミリスチン酸オクチルドデシル、ミリスチン酸イソプロピル、高級アルコール、ステアリルアルコール、ステアリン酸、及びヒト血清アルブミン等が挙げられる。
　液剤は、注射用蒸留水、生理食塩水、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、及びアルコール類等を含んでもよい。液剤は、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解剤、溶解補助剤、及び防腐剤等を加えてもよい。錠剤又は丸剤は、糖衣、胃溶性、及び腸溶性物質等で被覆されたコート錠等であってもよい。
　本発明における有効成分の投与量は、有効成分の種類や、投与対象の性別、年齢及び体重、症状、剤形及び投与経路等に依存して決定できる。本発明において有効成分を重症筋無力症の治療を目的として投与する場合の成人１回あたりの投与量は、例えば、０．０００１ｍｇ～１０００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で決定することができるが、これに限定されるものではない。また、上記投与量の有効成分を１日１回で又は２～４回に分けて投与することができる。本発明の有効成分は、それを必要とするヒトのみならず、ヒト以外の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、サル）に対しても投与することができる。
　本発明によれば、治療上の有効量の本発明の環状ペプチド及びその薬学上許容可能な塩、本発明の環状ペプチド複合体及びその薬学上許容可能な塩、本発明のＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子及びその薬学上許容可能な塩、並びに本発明のＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子複合体及びその薬学上許容可能な塩からなる群から選択される少なくとも１つ、或いはそれを含む治療剤又は医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、重症筋無力症の治療方法が提供される。
　本発明によればまた、重症筋無力症の治療剤の製造のための、重症筋無力症の治療方法における、或いは、重症筋無力症の治療剤としての、本発明の環状ペプチド及びその薬学上許容可能な塩、本発明の環状ペプチド複合体及びその薬学上許容可能な塩、本発明のＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子及びその薬学上許容可能な塩、並びに本発明のＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子複合体及びその薬学上許容可能な塩からなる群から選択される少なくとも１つの使用が提供される。
［環状ペプチドの提示方法及び環状ペプチドが提示されたユビキチン分子の製造方法］
　本発明においては、環状ペプチドを近傍スペーサー配列とともにユビキチン分子上に提示する方法が提供される。本発明においてはまた、環状ペプチドをタンパク質に融合させる方法として、環状ペプチドをユビキチン分子に融合させて環状ペプチドをユビキチン分子上に提示させた改変タンパク質の製造方法も提供される。スペーサー配列とともに環状ペプチドをユビキチン分子に融合させるためには、通常の遺伝子工学技術を用いて行うことができる。環状ペプチドは、所望の分子に結合活性を有するものとすることができ、好ましくはＭｕＳＫ分子に結合活性を有する環状ペプチドである。
　環状ペプチドとしては、ＲａＰＩＤ法やＴＲＡＰ法のようなｍＲＮＡディスプレイ法又はファージディスプレイ法により選択される環状ペプチドを用いることが好ましく、ｍＲＮＡディスプレイ法によることがより好ましい。ｍＲＮＡディスプレイ法等によれば、環状ペプチドのうち、挿入すべき部分アミノ酸配列の塩基配列は容易に理解することができる。
　本発明の提示方法及び製造方法においては、ラッソ・グラフト法（LassoGraft Technology）によりＭｕＳＫ結合活性を有する環状ペプチドをユビキチン分子のループ構造上に提示させることができる。ラッソ・グラフト法は、受容体などの医薬標的に結合する活性を持った環状ペプチドをタンパク質に移植する技術である。本発明の提示方法及び製造方法の実施に当たっては、Mihara, E. et al., Nat Commun 2021, 12:1543.及び特許第６５９８３４４号を参照することができる。この技術によると、ＲａＰＩＤ法で得られる環状ペプチドのわずか十数アミノ酸の内部配列を、投げ縄（ラッソ）状にタンパク質の表面のループ構造のなかに埋め込む（グラフト）ことにより、元の環状ペプチドが持っていた医薬標的タンパク質に対する極めて高い特異性と親和性をそっくり土台となるタンパク質に賦与することができる。
　本発明の方法は、所望の分子に対する結合活性（好ましくはＭｕＳＫ結合活性）を有する環状ペプチドをユビキチン分子のループ構造上に提示させる際に、環状ペプチドの上流側及び下流側それぞれにランダムに生成された０～４残基（好ましくは３又は４残基）のアミノ酸配列からなるスペーサー配列を付加することを特徴とする。すなわち、２つのスペーサーのうち１つのスペーサー配列を環状ペプチドの上流に配置し、他方のスペーサー配列を環状ペプチドの下流に配置することができる。また、ＭｕＳＫ結合活性を有する環状ペプチドは本発明の環状ペプチドから選択することができ、好ましくは式（１）～（３）の環状ペプチドから選択することができる。
　本発明の方法の好ましい態様においては、所望の分子がＭｕＳＫ分子である場合、ユビキチン分子のループ構造領域上に提示される環状ペプチド及びスペーサー配列は前記構造（Ｂ）とすることができる。構造（Ｂ）中、スペーサー３は、好ましくは３又は４個の任意のアミノ酸からなるペプチド鎖であり、スペーサー４は、好ましくは３又は４個の任意のアミノ酸からなるペプチド鎖である。ＭｕＳＫ結合領域は環状ペプチドに存在するＭｕＳＫ分子結合活性を有する領域であり、例えば、式（１）～（３）の環状ペプチドで特定されるＭｕＳＫ分子結合活性領域から選択することができ、環状構造に関わるＣ末端のシステインを除いた配列とすることができる。ＭｕＳＫ結合領域は好ましくは、ＹＸ２２ＳＹＨＴＮＶＶＡＳＬＫＲ（Ｘ２２はＰ又はＬである）のアミノ酸配列（配列番号１１）を有するペプチド鎖である。
　本発明の提示方法及び製造方法において、ユビキチン分子のループ構造領域は、
・β１ドメインとβ２ドメインとの間のループ構造領域、
・β２ドメインとα１ドメインとの間のループ構造領域、
・α１ドメインとβ３ドメインとの間のループ構造領域、
・β３ドメインとβ４ドメインとの間のループ構造領域、
・β４ドメインとα２ドメインとの間のループ構造領域及び
・α２ドメインとβ５ドメインとの間のループ構造領域
のいずれかとすることができ、好ましくは、β１ドメインとβ２ドメインとの間のループ構造領域である。
　ユビキチン分子のβ１ドメインとβ２ドメインとの間のループ構造領域は、配列番号１のアミノ酸配列を基準にすると第７番目から第１０番目のアミノ酸残基に相当する。ここで、本発明の方法において環状ペプチドが提示されるユビキチン分子は配列番号１のアミノ酸配列に限定されるものではない。すなわち、配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上（好ましくは、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、又は、配列番号１のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸について欠失、置換、挿入及び付加からなる群から選択される改変を有するタンパク質を、環状ペプチドが提示されるユビキチン分子とすることができる。また、その場合、配列番号１のアミノ酸配列以外のアミノ酸配列からなるユビキチン分子における、環状ペプチドの置換又は挿入位置は、そのユビキチン分子のアミノ酸配列を、配列番号１のアミノ酸配列と適切に整列（アライメント）させることにより特定することができる。本発明の方法において、配列番号１のアミノ酸配列以外のアミノ酸配列からなるユビキチン分子について実施する場合には、本発明のグラフト化ユビキチン分子における記載を参照することができる。
　本発明の提示方法及び製造方法においては、β１ドメインとβ２ドメインとの間のループ構造領域を構成する２つのアミノ酸残基としてユビキチン分子の第７番目のアミノ酸残基及び第１０番目のアミノ酸残基を選択することができる。この場合、環状ペプチドをユビキチン分子状に提示させた改変タンパク質の塩基配列は次のように調製することができる。すなわち、ユビキチン分子をコードする塩基配列において、ユビキチン分子のβ１ドメインとβ２ドメインとの間のループ構造領域を構成するこれら２つのアミノ酸残基に相当する塩基配列を選択し、該選択された塩基配列間に存在する塩基を必要に応じて削除し、選択された環状ペプチドの部分アミノ酸配列並びにその上流及び下流のスペーサー配列に相当する塩基配列を挿入して組み込んだ塩基配列を有する核酸を準備することができる。
　本発明において、ループ構造を構成する２つのアミノ酸残基に相当する塩基配列を選択し、該選択された塩基配列間に存在する塩基を必要に応じて削除する方法や、選択された環状ペプチドの部分アミノ酸配列に相当する塩基配列を挿入して組み込んだ塩基配列を有する核酸を準備する方法は、特に限定されるものではなく、従来公知の方法を援用して実施することができる。また、準備された核酸の翻訳方法は、本発明の属する技術分野において、既に周知な事項であるので、それら周知な方法を適宜適用して、核酸の翻訳を行えばよい。
　本発明の提示方法及び製造方法により得られる、ユビキチン分子を足場として、所望の分子に対する結合活性（好ましくはＭｕＳＫ結合活性）を有する環状ペプチドをタンパク質上に提示させた改変タンパク質は、環状ペプチドの構造と活性を保持させた状態で環状ペプチドを提示するので、環状ペプチドの活性に基づいた試薬、医薬等として用いることができる。また、環状ペプチドが融合された改変タンパク質は、ユビキチン自体が有している活性に加え、環状ペプチドの有する活性を示すため、生体内（例えば、血中、組織中）で安定して存在するＭｕＳＫ結合性タンパク質として用いることも可能である。
［スクリーニング方法］
　後記実施例に示される通り、ランダムに生成されたスペーサー配列とＭｕＳＫ結合領域との組合せをデザインし（図２２及び２３参照）、そのアミノ酸配列をコードするｍＲＮＡのライブラリーを作製し、ｍＲＮＡライブラリーからｍＲＮＡを翻訳して改変タンパク質を調製し、ＭｕＳＫ結合活性を指標にして、得られた改変タンパク質からＭｕＳＫ結合性の改変タンパク質を選択することで、ＭｕＳＫ結合性の改変タンパク質をスクリーニングすることができる。すなわち、本発明によれば、所望の分子に結合活性を有する環状ペプチド（好ましくはＭｕＳＫ分子に結合活性を有する環状ペプチド）の配列と、前記環状ペプチドの上流及び下流に連結する、ランダムに生成された０～４残基（好ましくは３又は４残基）のアミノ酸配列からなるスペーサー配列とが、β１ドメインとβ２ドメインとの間のループ構造領域上に融合されたユビキチン分子をコードする塩基配列を含むｍＲＮＡのライブラリーをデザインし、ｍＲＮＡライブラリーからｍＲＮＡを翻訳して改変タンパク質を調製し、ＭｕＳＫ結合活性を指標にして、得られた改変タンパク質から所望の分子に対する結合性改変タンパク質（好ましくはＭｕＳＫ結合性の改変タンパク質）を選択することを含む、所望の分子に対する結合性改変タンパク質（好ましくはＭｕＳＫ結合性の改変タンパク質）のスクリーニング方法が提供される。ｍＲＮＡライブラリーの作製（すなわち翻訳すべき核酸の準備）と、ｍＲＮＡライブラリーから核酸を翻訳して改変タンパク質を調製する工程は本発明の製造方法に従って実施することができる。これ以外についても本発明のスクリーニング方法は本発明の提示方法及び製造方法に従って実施することができる。
　本発明のスクリーニング方法においてＭｕＳＫ結合性の改変タンパク質をスクリーニングする場合、ＭｕＳＫ結合性の環状ペプチド（好ましくは構造（Ｂ）のペプチド）をグラフトされたユビキチン分子がＭｕＳＫへの結合活性を有するかは後記実施例に従って行うことができる。例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用して、センサーチップ上に固定化されたＭｕＳＫに対する該分子の結合動態を定量測定することができ、ＳＰＲによる結合親和性ＫＤが例えば１μＭ以下又は５００ｎＭ以下の場合にＭｕＳＫへの結合活性を有すると判定することができる。なお、ＭｕＳＫ分子としては、ヒトＭｕＳＫアイソフォーム１前駆体（Human MuSK isoform 1 precursor）（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿００５５８３．１）の細胞外領域（例えば、１－４９３アミノ酸）を用いることができる。
　以下の例に基づき本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
実施例１：環状ペプチドの調製及びＭｕＳＫ結合活性の評価
（１）環状ペプチドのライブラリーの調製及びＭｕＳＫに結合する環状ペプチドの選択
　２つのチオエーテル－環状ペプチドライブラリー（Ｌ－ライブラリー及びＤ－ライブラリー）は、フレキシブルインビトロ翻訳（ＦＩＴ）システムを用いて構築した。以前に報告された方法を用いて、Ｌ－ライブラリー、及びＤ－ライブラリーに、それぞれ、Ｎ－（２－クロロアセチル）－Ｌ－チロシン（Ｌ－ＣｌＡｃＴｙｒ）、及びＮ－（２－クロロアセチル）－Ｄ－チロシン（Ｄ－ＣｌＡｃＴｙｒ）を導入した（Kawakami, T.; Murakami, H.; Suga, H., Messenger RNA-programmed incorporation of multiple N-methyl-amino acids into linear and cyclic peptides. Chem Biol 2008, 15 (1), 32-42.; Morimoto, J.; Hayashi, Y.; Suga, H., Discovery of macrocyclic peptides armed with a mechanism-based warhead: isoform-selective inhibition of human deacetylase SIRT2. Angew Chem Int Ed Engl 2012, 51 (14), 3423-7.; Goto, Y.; Katoh, T.; Suga, H., Flexizymes for genetic code reprogramming. Nat Protoc 2011, 6 (6), 779-90.; Hayashi, Y.; Morimoto, J.; Suga, H., In vitro selection of anti-Akt2 thioether-macrocyclic peptides leading to isoform-selective inhibitors. ACS Chem Biol 2012, 7 (3), 607-13.）。
　チオエーテル－環状ペプチドライブラリーに対応するｍＲＮＡライブラリーは、順に、Ｌ－ＣｌＡｃＴｙｒ又はＤ－ＣｌＡｃＴｙｒをコードするＡＵＧ開始コドン、ランダムなタンパク質性アミノ酸残基をコードする８～１５個のＮＮＫランダムコドン（ＮはＧ、Ｃ、Ａ又はＵ；ＫはＧ又はＵ）、ＣｙｓをコードするＵＧＣコドンを持つようにデザインされた。なお、イン・ビトロでの翻訳の後、Ｎ末端にあるＴｙｒ残基のアセチルクロライド基と、下流のシステイン残基のスルフヒドリル基（チオール基）との間で、チオエーテル結合が自然に形成された。
　ヒトＭｕＳＫに結合する環状ペプチドの選択（以下、「アフィニティー選択」ともいう。）は、ＲａＰＩＤ（random  non-standard  peptides  integrated  discovery）システムを、フレキシブルインビトロ翻訳（ＦＩＴ）システムと組み合わせて用いて行った（図３Ａ）（Hayashi, Y.; Morimoto, J.; Suga, H., In vitro selection of anti-Akt2 thioether-macrocyclic peptides leading to isoform-selective inhibitors. ACS Chem Biol 2012, 7 (3), 607-13.; Hipolito, C.J. & Suga, H. Ribosomal production and in vitro selection of natural product-like peptidomimetics: the FIT and RaPID systems. Curr Opin Chem Biol. 16, 196-203, 2012）。本実施例ではＤ－ライブラリーについて環状ペプチドの選択を行った。
　より詳細には、以下のようにして、環状ペプチドのライブラリーの調製、及びＭｕＳＫに結合する環状ペプチドの選択を行った。
　ｍＲＮＡライブラリー、並びに、ClAc-L-Tyr-tRNAfMet CAU、及びClAc-D-Tyr-tRNAfMet CAUは以前に報告されたように調製した（Hayashi,  Y.;  Morimoto, J.; Suga, H., In vitro selection of anti-Akt2 thioether-macrocyclic peptides leading to isoform-selective inhibitors. ACS Chem Biol 2012, 7 (3), 607-13.; Hipolito, C.J. & Suga, H. Ribosomal production and in vitro selection of natural product-like peptidomimetics: the FIT and RaPID systems. Curr Opin Chem Biol. 16, 196-203, 2012）。
　１μＭのｍＲＮＡライブラリーを、Ｔ４　ＲＮＡリガーゼを用いて１．５μＭのピューロマイシンリンカーと２５℃で３０分間連結した。上記ピューロマイシンリンカーのＤＮＡは、ｍＲＮＡライブラリーの３’末端定常領域に結合した。フェノール－クロロホルム抽出及びエタノール沈殿による精製後、１．２μＭの得られたｍＲＮＡ－ピューロマイシンコンジュゲートと、５０μＭのClAc-L-Tyr-tRNAfMet CAU、又はClAc-D-Tyr-tRNAfMet CAUとを用いて、メチオニン欠損ＦＩＴ系で、３７℃で３０分間翻訳した。次いで、反応物を２５℃で１２分間更にインキュベートすることで、ｍＲＮＡ－ペプチドコンジュゲートの形成を促進した。更に、１６．７ｍＭ　ＥＤＴＡの存在下で、３７℃で３０分間インキュベートした。続いて、生成物をＲＮａｓｅ－Ｈマイナス型逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、４２℃で１時間逆転写することにより、環状ペプチドをｍＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドにタグ付けした。その後、反応液に等量のBlocking buffer（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．６），３００ｍＭ　ＮａＣｌ、０．１ｖ／ｖ％　ｔｗｅｅｎ－２０、０．２ｗ／ｖ％　ウシ血清アルブミン（アセチル化処理済））を加えた。
　次いで、得られたペプチド－ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡコンジュゲートライブラリーに対して、アフィニティー選択を行った。まず、対照選択として、ペプチド－ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡコンジュゲートライブラリーをDynabeads Protein G（Thermo Fisher Scientific）に対して３回通過させた（各通過は、４℃の条件下、１０分間行った。）。このプロセスはネガティブ選択と呼ばれるものであり、望ましくないビーズ結合を除去するものである。次いで、ペプチド－ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡコンジュゲートライブラリーに対して、上記のビーズに２００～４００ｎＭのヒトＭｕＳＫタンパク質（細胞外領域）を固定化したものを用いて、４℃の条件下、３０分間アフィニティー選択を行った。このプロセスは、ポジティブ選択と呼ばれる。
　９５℃で５分間加熱することにより、ｃＤＮＡをビーズから溶出させ、溶出したｃＤＮＡの一部を、Ｓｙｂｒ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ及びサーマルサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ））を用いた定量的ＰＣＲにより評価した。残りのｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、次のラウンドのアフィニティー選択に用いるｍＲＮＡライブラリーを転写するために用いた。
　ヒトＭｕＳＫタンパク質（細胞外領域）は組換えタンパク質として以下のように調製した。ヒトＭｕＳＫアイソフォーム１前駆体（Human MuSK isoform 1 precursor）（NCBI Reference Sequence：ＮＰ＿００５５８３．１）をコードするＦｌｅｘｉクローン（ＦＸＣ３１２７５、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を鋳型として、細胞外領域（１－４９３アミノ酸）に相当するＤＮＡをＰＣＲ法により増幅した。増幅されたＤＮＡ配列の５’末端と３’末端の双方には、それぞれ、ＸｈｏＩとＥｃｏＲＩ制限酵素認識配列が付加されており、ｐＣＡＧ－Ｎｅｏ　ｈＩｇＧ１－Ｆｃプラスミド（富士フイルム和光純薬社）のマルチクローニングサイトへの挿入時に利用した。本プラスミド（ｐＣＡＧ－Ｎｅｏ　ｈＭｕＳＫ－Ｆｃ）は動物細胞における分泌性ヒトＭｕＳＫ細胞外領域及びヒトＩｇＧ１　Ｆｃのキメラタンパク質（ｈＭｕＳＫ－Ｆｃ：分子量はおよそ２００ｋＤａ）の発現を可能にする。実際には、ExpiFectamine 293 reagent（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を利用し、ｐＣＡＧ－Ｎｅｏ　ｈＭｕＳＫ－ＦｃプラスミドをＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に遺伝子導入し、８％ＣＯ２インキュベーター内で振盪培養（６日間）を行った。次に、培養上清を回収し、遠心処理後、０．２２μｍフィルターで濾過滅菌を行った。得られた培養上清はＰｒｏｔｅｉｎ　Ｇ精製に供され、最終的に９９．９６％純度（ＡＫＴＡ－ＦＰＬＣ分析）のｈＭｕＳＫ－Ｆｃ精製標品を得た。
　ライブラリーの調製、ネガティブ選択、及びポジティブ選択を１つのラウンドとして、当該ラウンドを４回行った。４回のラウンドの後、ｃＤＮＡの有意な濃縮が観察された（ポジティブ選択においてＭｕＳＫタンパク質（細胞外領域）をビーズ上に固定化しなかった場合との比較に対して）（図４）。回収したｃＤＮＡを、ＰＣＲにより増幅し、カラム（ヌクレオスピン（Ｍａｃｈｅｒｙ－Ｎａｇｅｌ））を用いて精製した後、ハイスループットシーケンサー（ＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ））を用いて配列決定した。データ分析は、ソフトウェア（ＣＬＣシーケンスビューア７（Ｑｉａｇｅｎ））を用いて行った。
　ＲａＰＩＤシステムによって選択された、ＭｕＳＫに結合する環状ペプチド等の構造の一例を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 （上記式中、配列番号は以下の通りである。ＭｕＳＫ１及びＭｕＳＫ１Ａｃ：配列番号５、ＭｕＳＫ１ｔｒ：配列番号６、ＭｕＳＫ３ｔｒ：配列番号７、ＭｕＳＫ６ｔｒ：配列番号８、ＭｕＳＫ４：配列番号３、ＭｕＳＫ７：配列番号２、ＭｕＳＫ９：配列番号４、ＭｕＳＫ１３：配列番号９、ＭｕＳＫ１３ｔｒ：配列番号１０。）
（２）環状ペプチドの化学合成
　配列が決定された環状ペプチドの中から、Ｌ－ライブラリー及びＤ－ライブラリーにおいて存在割合の高い配列（ＭｕＳＫ１、ＭｕＳＫ１Ａｃ、ＭｕＳＫ４、ＭｕＳＫ７及びＭｕＳＫ９）を選択し、化学合成により調製した。すなわち、公知の方法に準拠して、Ｓｙｒｏ　Ｗａｖｅ自動化ペプチド合成機（Ｂｉｏｔａｇｅ）を用い、Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によって環状ペプチドの合成を行った（Ito, K. et al. Artificial human Met agonists based on macrocycle scaffolds. Nature Communications 6, 6372, 2015）。各ペプチドの自動合成後、得られた生成物に対し、Ｎ末端クロロアセチルキャップをクロロ酢酸の最終カップリングで導入した。９２．５％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、２．５％のＴＩＰＳ（トリイソプロピルシラン）、２．５％のＥＤＴ（エタンジチオール）、２．５％の水の溶液によって、３時間かけてペプチドを樹脂から切断した。氷冷エーテルからペプチド生成物を沈殿させた。氷冷エーテルで３倍希釈し、次いでペレットを４／１　ＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏ（７５μｍｏｌスケールで３０ｍＬ）に懸濁させた。６０μＬのトリエチルアミン（又はｐＨ＞８になる量）を加え、４２℃で反応させた（１時間程度）。環化反応はMALDI/TOFMS（α-cyano4-hydroxycinnamic acid matrix）でモニターし、反応終了を確認した後、ＴＦＡで反応をクエンチした。
　環化した環状ペプチドは逆相ＨＰＬＣ（Shimadzu Prominence LC-20AP with a Merck Chromolith Prep column, 200 × 25 mm i.d.）で精製した。移動相として０．１ｖ／ｖ％ＴＦＡを含む水、０．１ｖ／ｖ％ＴＦＡを含むアセトニトリルを使用した。MALDI/TOFMS（α-cyano4-hydroxycinnamic acid matrix）によって目的ペプチドを含む画分を明らかにした後、その画分を凍結乾燥させた。また、細胞試験に用いるペプチドにおいては、「乾燥したペプチドを５ｍＭ　ＨＣｌを含む５０ｖ／ｖ％アセトニトリル－水混合液に溶かして凍結乾燥」という操作を２～３回行った。
（３）環状ペプチドの評価
　上述のようにして得られた環状ペプチド（ＭｕＳＫ１、ＭｕＳＫ１Ａｃ、ＭｕＳＫ４、ＭｕＳＫ７及びＭｕＳＫ９）について、ＭｕＳＫに対する親和性の評価（結合活性試験）を行った。
　Ｆｃタグを介してセンサーチップ上に固定化されたＭｕＳＫに対する環状ペプチドの結合動態（結合親和性（解離定数）ＫＤ）について、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用した定量測定を行うことにより、ＭｕＳＫと環状ペプチドとの結合の強度を評価した。
　各単量体ペプチド、二量体ペプチド、単量体Ｕボディ及び二量体Ｕボディの標的タンパク質ヒトＭｕＳＫ、マウスＭｕＳＫ及びラットＭｕＳＫに対する結合親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ　Ｔ２００（Ｃｙｔｉｖａ）を用いて２５℃で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により分析した。メーカーが提供する標準固定化プロトコルに従って、Ｆｃタグ付きヒト／マウス／ラットＭｕＳＫをプロテインＧチップ又はプロテインＡチップ（Ｃｙｔｉｖａ）に固定化した。モノマー／ダイマーペプチド用のランニングバッファーは、０．０１０Ｍ　リン酸、０．１４Ｍ　ＮａＣｌ、０．００２７Ｍ　ＫＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）　Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％（ｖ／ｖ）　ＤＭＳＯを含んでいた。モノマー／ダイマーＵボディのランニングバッファーは、０．０１０Ｍ　リン酸、０．１４Ｍ　ＮａＣｌ、０．００２７Ｍ　ＫＣｌ及び０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ　２０を含んでいた。各単量体ペプチド、二量体ペプチド、単量体Ｕボディ及び二量体Ｕボディの一連の濃度を分析対象として注入した。Ｂｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェア上で１：１バインドフィッティング解析を適用し、ｋａ、ｋｄ、ＫＤ値を決定した。
　なお、Ｆｃタグ付きヒトＭｕＳＫは実施例１（１）に記載した手順で調製した。またＦｃタグ付きマウスＭｕＳＫは、Ｆｃタグ付きマウスＭｕＳＫ細胞外ドメイン（配列番号３４）をコードする塩基配列を発現させて用いた。またＦｃタグ付きラットＭｕＳＫは、ラットＭｕＳＫとFcタンパク質とのキメラタンパク質であるRecombinant Rat MuSK Fc Chimera Protein（カタログ番号：9847-MK-050、R&D Systems社）を用いた。
　各ペプチドのヒトＭｕＳＫに対するＳＰＲ応答を図５に、ヒトＭｕＳＫに対する結合親和性ＫＤを表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　図５及び表３に示さる通り、いずれのペプチドもＭｕＳＫに対して高い結合活性を有していた。
実施例２：重症筋無力症の発症メカニズムに対する環状ペプチド複合体の有効性の検証
（１）環状ペプチドホモ二量体の調製
　本実施例では、ヒトＭｕＳＫ結合性環状ペプチドであるＭｕＳＫ４、ＭｕＳＫ７及びＭｕＳＫ９並びにヒトＭｕＳＫ結合性鎖状ペプチドであるＭｕＳＫ１Ａｃそれぞれについて２種類のリンカーで連結してホモ二量体化した化合物を調製した。ＭｕＳＫ１ＡｃについてはＮ末端側同士をリンカーで連結させた複合体と、Ｃ末端同士をリンカーで連結させた複合体を調製した。具体的には以下の手順で調製した。
　まず、ＭｕＳＫ１Ａｃ、ＭｕＳＫ４、ＭｕＳＫ７及びＭｕＳＫ９については、化学合成により調製した。すなわち、公知の方法に準拠して、Ｓｙｒｏ　Ｗａｖｅ自動化ペプチド合成機（Ｂｉｏｔａｇｅ）を用い、Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によって環状ペプチドの合成を行った（Ito, K. et al. Artificial human Met agonists based on macrocycle scaffolds. Nature Communications 6, 6372, 2015）。具体的には、末端Ｃｙｓにジ－ｔ－ブチル－ジスルフィド（ＳｔＢｕ）保護基を導入し、リンクアミド樹脂上にペプチドを調製した。各ペプチドの自動合成後、得られた生成物に対し、Ｎ末端クロロアセチルキャップをクロロ酢酸の最終カップリングで導入した。８８％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、５％のフェノール、５％の水、２％のＴＩＰＳの溶液によって、３時間かけてペプチドを樹脂から切断した。氷冷エーテルからペプチド生成物を沈殿させた。氷冷エーテルで３倍希釈し、次いでペレットを４／１　ＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏ（７５μｍｏｌスケールで３０ｍＬ）に懸濁させた。６０μＬのトリエチルアミン（又はｐＨ＞８になる量）を加え、４２℃で反応させた（１時間程度）。環化反応はMALDI/TOFMS（α-cyano4-hydroxycinnamic acid matrix）でモニターし、反応終了を確認した後、ＴＦＡで反応をクエンチした。その後、ｐＨを確認し、水酸化ナトリウムでｐＨを約７に調整した。１．２ｍＬのトリブチルホスフィン（７５μｍｏｌスケール用）を２回に分けて添加した。最初は０．６ｍＬ、２時間後に０．６ｍＬを加えた。末端ＣｙｓからのＳｔＢｕ基の還元的開裂を完了させるために、常温で合計４時間激しく攪拌した。
　ＳｔＢｕ基の脱保護反応はMALDI/TOFMS（α-cyano4-hydroxycinnamic acid matrix）でモニターし、反応終了を確認した後ＴＦＡで反応をクエンチした。脱保護された環状ペプチドは逆相ＨＰＬＣ（Shimadzu Prominence LC-20AP with a Merck Chromolith Prep column, 200×25 mm i.d.）で精製した。移動相として０．１ｖ／ｖ％ＴＦＡを含む水、０．１ｖ／ｖ％ＴＦＡを含むアセトニトリルを使用した。MALDI/TOFMS（α-cyano4-hydroxycinnamic acid matrix）によって目的ペプチドを含む画分を明らかにした後、その画分を凍結乾燥させた。また、細胞試験に用いるペプチドにおいては、「乾燥したペプチドを５ｍＭ　ＨＣｌを含む５０ｖ／ｖ％アセトニトリル－水混合液に溶かして凍結乾燥」という操作を２～３回行った。
　複合体作成の連結処理に用いるＭｕＳＫ４、ＭｕＳＫ７及びＭｕＳＫ９については、Ｃ末端のシステイン残基の下流に、リンカーとの連結用の別のシステイン残基（カルボキシル基は酸アミドを形成している）を導入した。Ｎ末端同士をリンカーで連結させるＭｕＳＫ１Ａｃについては、Ｎ末端のＤ－チロシン残基の上流に、リンカーとの連結用のシステイン残基（アミノ基はアセチル化されている）を導入した。Ｃ末端同士をリンカーで連結させるＭｕＳＫ１Ａｃについては、Ｃ末端のグルタミン酸残基の下流に、リンカーとの連結用のシステイン残基（カルボキシル基は酸アミドを形成している）を導入した。
　次に、凍結乾燥した環状ペプチド単量体（上記のように調製）を１／１　ＡＣＮ／（５０ｍＭ　リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５）に約２ｍｇ／ｍＬの濃度で再懸濁させた。撹拌しながら、ＤＭＳＯ中の１００ｍＭ溶液としてＢｉｓ－Ｍａｌ－ｄＰＥＧ（商標名）１１（Quanta Biodesign社）又はＢｉｓ－Ｍａｌ－ｄＰＥＧ（商標名）３（Quanta Biodesign社）を０．５等量ずつゆっくりと滴下した。ＵＰＬＣ／ＬＣＭＳで出発物質の消費量を確認し、必要に応じて反応物質を追加した（二量体化は２時間以内に完了）。ＭｕＳＫ１Ａｃ、ＭｕＳＫ４及びＭｕＳＫ７の場合、混合物を直接ＨＰＬＣで精製した。ＭｕＳＫ９の場合、溶液から二量体が析出した。反応後、遠心分離して沈殿物を単離した。得られたペレットを１００％ＤＭＳＯに再溶解し、ＨＰＬＣにロードして、常法に従って精製した。参考までに、調製した環状ペプチドホモ二量体の構造を図６－１及び図６－２に示す。また、リンカーとしてＢｉｓ－Ｍａｌ－ｄＰＥＧ（商標名）１１を使用したＭｕＳＫ７のホモ二量体の化学構造を図７に示す。
（２）環状ペプチドホモ二量体のＭｕＳＫ結合活性の評価
　上記（１）に記載された手順に従って得られたＭｕＳＫ１Ａｃ、ＭｕＳＫ４、ＭｕＳＫ７及びＭｕＳＫ９それぞれのホモ二量体（１０種類）について、ヒトＭｕＳＫに対する親和性の評価（結合活性試験）を行った。評価試験は実施例１（３）に記載された手順に従って行った。結果は表４に示す通りであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
（３）パルミトイル基が導入された環状ペプチドホモ二量体の調製
　パルミトイル基が導入された、ＭｕＳＫ７のホモ二量体（図８／ＭｕＳＫ７－ｐａｌ）は以下のスキームに従って調製した。すなわち、実施例１（２）で合成したＭｕＳＫ７において、Ｃ末端のシステイン残基のカルボキシル基にリンカーを導入した環状ペプチドを準備し、カップリング試薬の存在下、該環状ペプチド２分子と、パルミチン酸を有する連結ユニットとの縮合反応を常法にて行い、複合体を得た。次いで得られた複合体から保護基（ＰＧ）を外し、精製して、パルミトイル基（Ｒ）が導入されたＭｕＳＫ７のホモ二量体を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
（４）パルミトイル基が導入された環状ペプチドホモ二量体のＭｕＳＫ結合活性の評価
　上記（３）に記載された手順に従って得られた、パルミトイル基が導入されたＭｕＳＫ７のホモ二量体（ＭｕＳＫ７－ｐａｌ）について、ヒト、ラット及びマウスのＭｕＳＫに対する親和性の評価（結合活性試験）を行った。試験は実施例１（３）に記載された手順に従って行った。結果は表５に示す通りであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
（５）アセチルコリン受容体のクラスター化に及ぼす効果の評価
ア　筋管細胞の培養 
　マウス筋芽細胞由来培養細胞株Ｃ２Ｃ１２（ＣＲＬ－１７７２）は American Type Culture Collectionより購入、使用した。継代培養にはDulbecco’s Modified Eagle Medium（ＤＭＥＭ, high glucose, GlutaMAX supplement, pyruvate; ＧＩＢＣＯ社）に２０％ウシ胎児血清（fetal bovine serum; FBS; ＧＩＢＣＯ社）を加えて使用した。 継代時には培養液を吸引除去後、付着細胞をリン酸緩衝生理食塩水（phosphate buffered saline (－); ＰＢＳ（－））で洗浄し、０．２５％トリプシン、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸を含むＭｇ２＋、Ｃａ２＋不含ＨＢＳＳ（ＧＩＢＣＯ社）を加え、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で５分間反応させた。剥離した細胞を回収後、１０００ｒｐｍ、４℃で５分遠心した（Sorvall X4R Pro, Thermo fisher scientific社）。上清を吸引除去した後、新たな培養液に浮遊させ、１００μＬを９６ウェルプレート（BioCoat Collagen I 96-well Black/Clear plate, ＣＯＲＮＩＮＧ社）に播種し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で７２時間を目安にコンフルエント状態に達するまで培養した。引き続き、培養液を除去し、筋管細胞分化誘導用の２％馬血清（ＧＩＢＣＯ社）を含むＤＭＥＭによる１回目の培地交換を行った。さらに４８時間後に２回目の培地交換を行い、翌日筋管細胞への分化誘導の成否を汎用倒立型顕微鏡での明視野観察により確認した。
イ　ＡＣｈＲクラスターの誘導とその定量的解析
　環状ペプチドＭｕＳＫ７のホモ二量体（MuSK7 PEG11 dimer）を適量加えた分化用培地を９６ウェルプレート（NunclonΔSurface, 167008, Ｎｕｎｃ社）にて予め用意し、Ｍｙｏｔｕｂｅへの分化誘導過程における２回目の培地交換時に１００μＬ／ウェルで使用した。環状ペプチドＭｕＳＫ７のホモ二量体の添加から２０時間後に培地を除去し、ＰＢＳ（－）で洗浄後、４％ホルムアルデヒドを含むＰＢＳ（－）による細胞固定処理を室温にて１５分間実施した。その後、１％ＢＳＡ－ＰＢＳ（－）で数回洗浄した後、蛍光標識済みのα－バンガロトキシン（α－Ｂｔｘ，　Alexa Fluor 488 conjugate; Invitrogen社）を終濃度１００ｎＭにて１％ＢＳＡ－ＰＢＳ（－）に添加し、これをウェルに加えた後、室温及び遮光下で３０分間静置した。１％ＢＳＡ－ＰＢＳ（－）で数回細胞を洗浄した後、全ウェルに１００μＬのＰＢＳ（－）を加え、蛍光イメージング装置による蛍光観察に供した。蛍光標識されたＡＣｈＲクラスターの観察にはＥＶＯＳ　Ｍ７０００　イメージングシステム（Thermo fisher scientific社）を使用した。蛍光画像観察時には１０倍の対物レンズを使用し、１ｍｍ２に相当するエリアのｔｉｆｆ画像を取得した。１ウェルにつき３つのｔｉｆｆ画像を取得し、Ａｌｅｘａ－４８８の蛍光シグナルを示す長径１０μｍ以上の構造物をＡＣｈＲクラスターと定義して計測した。同一ウェル由来の３つのｔｉｆｆ画像にてカウントされたＡＣｈＲクラスター数間の平均値を算出し、グラフ上に描出した。結果は図９Ａ及びＢに示される通りであった。環状ペプチドＭｕＳＫ７のホモ二量体の添加量の増加に伴い、ｐＭオーダーから１μＭの濃度域にて用量依存的にＡＣｈＲクラスター数が増加しており、すなわち、アセチルコリン受容体のクラスターが誘導されていることがわかる。一方、化合物濃度が１μＭを超えると、逆にクラスター数は減少傾向となった。このベル形状の用量応答曲線は、環状ペプチドＭｕＳＫ７のホモ二量体のホモダイマー構造の特性を反映しているものと推測する。以上から、ヒトＭｕＳＫ結合性環状ペプチドのホモ二量体は筋細胞レベルでアセチルコリン受容体のクラスター化を促進することが確認された。
ウ　ＭｕＳＫ阻害剤を利用したＭｕＳＫアゴニストの薬効評価
　Kinexus社（カナダ）がオープンリソースとして公開しているKinaseNETデータベース（http://www.kinasenet.ca/）にてＭｕＳＫ阻害剤候補を探索し、３種類のチロシンキナーゼ阻害剤（ＡＳＴ－４８７、Ｆｏｒｅｔｉｎｉｂ及びＳｏｒａｆｅｎｉｂ）を同定した。次に、Ｃ２Ｃ１２由来myotubeに１０ｐＭの組み換えラットａｇｒｉｎタンパク質（５５０－ＡＧ，Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍ社）単独、或いは、各種チロシンキナーゼ阻害剤（３ｎＭ）を同時添加した群をそれぞれ用意し、化合物添加２０時間後にＡｇｒｉｎ誘導性ＡｃｈＲクラスターの検出と観察を行なった（Crizotinib、Linifanib、AST-1306、Dovitinib及びBMS-754807の5種類は非MuSK阻害性チロシンキナーゼ阻害剤として使用）。その結果、Ａｇｒｉｎと同時にＡＴＳ－４８７を添加した群では１ｎＭの低濃度域でもＡＣｈＲクラスター形成が全く認められなかった。ＦｏｒｅｔｉｎｉｂとＳｏｒａｆｅｎｉｂの２種類はＡＳＴ－４８７と比較するとＭｕＳＫ阻害効果は低いと推測された。一方、他の５種類のチロシンキナーゼ阻害剤（Crizotinib、Linifanib、AST-1306、Dovitinib及びBMS-754807）に至ってはＡＣｈＲクラスター数がネガティブ対照群（ＤＭＳＯのみ）と同等であった。以上より、ＡＳＴ－４８７がＭｕＳＫ選択性を示すチロシンキナーゼ阻害剤であることが細胞レベルで初めて証明された。
　次に、環状ペプチドＭｕＳＫ７のホモ二量体のＡＣｈＲクラスター誘導活性に及ぼすＡＳＴ－４８７の影響を調べた。結果は（図９Ｃ）に示される通りであった。ＡＳＴ－４８７非存在下では環状ペプチドＭｕＳＫ７のホモ二量体によるＡＣｈＲクラスター形成が認められたものの、ＡＳＴ－４８７存在下ではＡＣｈＲクラスターは検出できなかった。すなわち、天然ＭｕＳＫ活性化因子であるＡｇｒｉｎと同様に、環状ペプチドＭｕＳＫ７のホモ二量体によるＡＣｈＲクラスター誘導プロセスはＭｕＳＫキナーゼ活性に依存していることが細胞レベルで実証された。
（６）ＭｕＳＫ二量体化活性の評価（ＮａｎｏＢｉＴアッセイ）
ア　非筋肉株細胞の培養
　Expi293細胞はThermo fisher scientific社より購入し、使用した。継代培養にはＤＭＥＭ（high glucose, GlutaMAX supplement, pyruvate; GIBCO社）に１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＧＩＢＣＯ社）を加えて使用した。継代時には培養液を吸引除去後、付着細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（－））で洗浄し、０．２５％トリプシン、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸を含むＭｇ２＋、Ｃａ２＋不含ＨＢＳＳ（ＧＩＢＣＯ社）を加え、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で５分間反応させた。剥離した細胞を回
収後、１０００ｒｐｍ、４℃で５分遠心した（Sorvall X4R Pro, Thermo fisher scientific社）。上清を吸引除去した後、新たな培養液に浮遊させ、新しい培養容器にて拡大培養を行なった。
イ　ＭｕＳＫアゴニストに関するＭｕＳＫ二量体化活性の評価
　ＬｇＢｉＴ（１７．６ｋＤａ）とＳｍＢｉＴ（１１アミノ酸）は両者が複合体形成した際にルシフェラーゼ活性を発揮するようにデザインされたｓｐｌｉｔ型ルシフェラーゼである（Dixon, A.S. et al. ACS Chem. Biol. 2016, 11, 400-8.）。定常状態では両者の親和性は１９０μＭ程度とされ、基質存在下でも発光量はごく僅かである。一方、両者が近接すると、ルシフェラーゼ活性を示す複合体を形成する。この性質を利用し、任意の２つのタンパク質間の相互作用を評価する手法がＮａｎｏＢｉＴアッセイである。受容体型チロシンキナーゼであるＭｕＳＫの活性化にはＭｕＳＫ２分子間の二量体化がその活性化の要件１つであると推測されるため、ＭｕＳＫ７－ｐａｌのＭｕＳＫ活性化能を評価する手法の１つとして、ＮａｎｏＢｉＴアッセイを採用した（図１０Ａ）。具体的には、ヒトＭｕＳＫ　ｃＤＮＡクローン（ＦＸＣ３１２７５，Ｐｒｏｍｅｇａ社）の細胞外領域（１－４９３アミノ酸）の下流にＳｍＢｉＴ或いはＬｇＢｉＴを融合させ、Ｃ末端に６個のヒスチジンを配置した合成ＤＮＡを作成し、ＥＢＭｕｌｔｉ－Ｎｅｏプラスミド（富士フイルム和光純薬社）に組み込んだ。ＦｕＧＥＮＥ６（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を利用し、ＭｕＳＫ－ＳｍＢｉＴ及びＭｕＳＫ－ＬｇＢｉＴの２種類の発現プラスミドをＥｘｐｉ２９３細胞に同時に遺伝子導入し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で４８－７２時間培養後、その培養上清を回収した。次に、被験化合物であるＭｕＳＫ７－ｐａｌ溶液を任意の希釈倍率で複数調製した。回収した培養上清５０μＬとＭｕＳＫアゴニスト希釈溶液５０μＬを９６ウェルマイクロプレート（白色、Ｎｕｎｃ社）にそれぞれ添加し、振盪装置にセットした（inVitro Shaker Mix-EVR, ＴＡＩＴＥＣ社）。次いで、室温にて１５分間振盪した（２００ｒｐｍ）。Nano-Glo Live Cell Assay（Promega社）のマニュアルに従い、付属のバッファーと基質からなる基質溶液２５μＬを各ウェルに添加後、速やかに、ウェル中のルシフェラーゼ発光をGloMax Navigator（Ｐｒｏｍｅｇａ社）により検出した（測定時間は０．５秒／ウェル）。結果は図１０Ｂに示される通りであった。ＭｕＳＫ７－ｐａｌの添加量の増加に伴い、ｐＭオーダーから４０ｎＭの濃度域にて用量依存的に発光量が増加しており、すなわち、ＭｕＳＫの二量体化が促進されていることがわかる。一方、化合物濃度が４０ｎＭを超えると、逆にＭｕＳＫ二量体化は減少傾向となった。このベル形状の用量応答曲線は、ＭｕＳＫ７－ｐａｌのホモダイマー構造の特性を反映しているものと推測する。以上の結果と上記（５）の結果を合わせると、ヒトＭｕＳＫ結合性環状ペプチドのホモ二量体は、ＭｕＳＫキナーゼ活性依存性のアセチルコリン受容体クラスター化を促進することが確認された。
実施例３：環状ペプチド複合体の重症筋無力症モデル動物に対する治療効果の評価
（１）重症筋無力症モデル動物に対する治療効果の評価（１）
ア　目的
　抗アセチルコリン受容体モノクローナル抗体（ｍＡｂ３５）を用いたラットＰＴＭＧモデルにおける各種疾患パラメーターに対して式（１）の環状ペプチド（ｐ７）の二量体（ＭｕＳＫ７－ｐａｌ／実施例２（３））（高用量）が及ぼす影響を評価した。
イ　試験方法
　５週齢の雌性ラット（ｎ＝２０、ＬＥＷ／ＣｒｌＣｒｌｊ、搬入時は４週齢、ジャクソン・ラボラトリー・ジャパン社）を、体重測定結果を指標にして、４群（Ａ群、Ｂ群、Ｃ群及びＤ群）に群分けを実施した。ビヒクルをＡ群に、ビヒクルに溶解させた被験化合物ＭｕＳＫ７－ｐａｌをＢ群（３ｍｇ／ｋｇ）、Ｃ群（２ｍｇ／ｋｇ）及びＤ群（１ｍｇ／ｋｇ）に、それぞれ静脈内投与した（０日）。静脈投与の２時間後に、重症筋無力症の病態惹起薬剤として、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解させた抗ニコチン性アセチルコリン受容体モノクローナル抗体（ｍＡｂ３５、国立病院機構長崎川棚医療センター）を２００μｇ／匹で全ての動物に腹腔内投与した（０日）。なお、化合物の溶媒であるビヒクルは、２０％ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン及び０．０２％ポリソルベート８０を含有する、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）であった（実施例３（２）においても同様）。
　次いで、動物の体重（Ｂｏｄｙ　ｗｅｉｇｈｔ）を、抗体投与前（ｐｒｅ）と、抗体投与後０、９、２４、３３、４８、５７、７２時間（ｈｒ）の時点で測定した。動物の動作、筋力及び握力を以下の試験で評価した。
＜動作スコア＞
　動物の動作を抗体投与後９、２４、３３、４８、５７、７２時間（ｈｒ）の各時点に６段階の評価基準（スコア／Ｓｃｏｒｅ）にて評価した。評価基準は以下の通りであった。
０：正常
１：前肢、後肢の握力の低下
２：後肢の不完全な麻痺
３：後肢の完全な麻痺及び立ち上がり不可
４：瀕死
５：死亡
　各群のラットのスコアの平均値を算出した。なお、スコア２以上と判断されたラットがいるケージには、トランスポートアガー（オリエンタル酵母工業社）とペレットの餌を砕き入れた。
＜Ｗｉｒｅ－ｈａｎｇ　Ｔｅｓｔ＞
　抗体投与後約３０時間後に、蓋付プラスチックケージ（クリーン２００－ＴＰＸケージ；ＣＬ－０１０８－２、日本クレア社）の蓋（金網製）を用いてラットの筋力を測定した。具体的には、ラットを１５分間以上静置し、安静状態になっていることを確認してケージ蓋に乗せた。次いで、ラットがケージ蓋に掴まるようにケージ蓋を軽く３度程度振り、ケージ蓋をひっくり返した。ひっくり返した蓋は、ラットが容易に降りられないほど高く、かつ落ちてもケガをしない高さ（床から約６０ｃｍ）に保持した。ラットがケージ蓋から落下するまでの潜時を最長１２０秒まで測定した。
＜Ｇｒｉｐ　Ｓｔｒｅｎｇｔｈ　Ｔｅｓｔ＞
　抗体投与後約３０時間後に、マウス握力計（GRIP STRENGTH METER FOR MICE、MODEL MK-380M、室町機械社）を用いてラットの筋力を測定した。具体的には、ラットを１５分間以上静置し、安静状態になっていることを確認してラット前肢をマウス握力計にしがみつかせた。次いで、ラットの体躯を引っ張り、ラットが金網を離した時点での握力計の目盛を読み取った（１回目）。上記手順をもう一度繰り返して行った（２回目）。１回目と２回目での測定値の差が２０％以下の場合はその平均値を測定値とした。２０％以上の場合は上記手順を更にもう１度行い（３回目）、３回分の測定値のうち値が近い２回分の平均値を測定値とした。
ウ　結果
　各群の体重測定結果は図１１に示される通りであった。すなわち、コントロールのＡ群の体重変化は、０ｈｒから５７ｈｒまで体重減少がみられ、その後わずかに増加した。Ｂ群及びＣ群においても、Ａ群と同様の体重変化がみられたが、体重減少の程度はＡ群に比べて緩やかであった。Ｄ群においては他の群で見られたような顕著な体重減少が殆どみられなかった。
　各群の動作スコア測定結果は図１２に示される通りであった。すなわち、コントロールのＡ群のスコア結果は、９ｈｒから発症がみられ始め、３３ｈｒでピークに達し、その後減衰した。Ｂ群及びＣ群ではほとんどの個体で発症がみられず、全体としていずれの測定ポイントにおいてもスコアは低値を示した。Ｄ群においては、全ての個体がいずれの測定ポイントにおいてもスコアが０となり、病態発症が認められなかった。
　各群のＨａｎｇｉｎｇ　Ｗｉｒｅ　Ｔｅｓｔにおける落下潜時（Ｌａｔｅｎｃｙ）の測定結果は図１３に示される通りであった。すなわち、コントロールのＡ群の平均落下潜時は０．０秒（±０．００　ＳＥＭ）と試験開始と同時にすぐに落下した。被験化合物各投与群の平均落下潜時は、Ｂ群では１７．６秒（±１０．４６　ＳＥＭ）、Ｃ群では２９．２秒（±２２．８９　ＳＥＭ）、Ｄ群では６９．６秒（±２３．７８　ＳＥＭ）とＡ群の落下潜時に比べて長く、Ｂ群及びＤ群ではＡ群と比較し有意に長かった（Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定）。
　各群のＧｒｉｐ　Ｓｔｒｅｎｇｔｈ　Ｔｅｓｔの握力測定結果は図１４に示される通りであった。すなわち、コントロールのＡ群の平均握力は１４２ｇ（±１６．２８　ＳＥＭ）である一方で、Ｂ群の握力は４６７ｇ（±３５．５４　ＳＥＭ）、Ｃ群の握力は４７４ｇ（±４３．０３　ＳＥＭ）、Ｄ群の握力は５７７ｇ（±２４．８９　ＳＥＭ）とＡ群の握力に比べて有意に強かった（一元配置分散分析（ｐ＜０．０００１）及びＤｕｎｎｅｔｔ検定（ｐ＜０．０００１））。
エ　考察
　上記ウの通り、コントロール群（Ａ群）で認められた重症筋無力症様症状がＢ群及びＣ群では軽度になり、Ｄ群ではほとんど認められず抑制されていたことから、全ての被験化合物において重症筋無力症の症状に対する薬効が確認され、特にＤ群でその効果が顕著であった。
（２）重症筋無力症モデル動物に対する治療効果の評価（２）
ア　目的
　抗アセチルコリン受容体モノクローナル抗体（ｍＡｂ３５）を用いたラットＰＴＭＧモデルにおける各種疾患パラメーターに対してＭｕＳＫ７－ｐａｌ（実施例２（３））（低用量）が及ぼす影響を評価した。
イ　試験方法
　５週齢の雌性ラット（ｎ＝２４、ＬＥＷ／ＣｒｌＣｒｌｊ、搬入時は４週齢、ジャクソン・ラボラトリー・ジャパン社）を、体重測定結果を指標にして、４群（Ａ群、Ｂ群、Ｃ群及びＤ群）に群分けを実施した。ビヒクルをＡ群に、ビヒクルに溶解させた被験化合物ＭｕＳＫ７－ｐａｌをＢ群（０．５ｍｇ／ｋｇ）、Ｃ群（０．２５ｍｇ／ｋｇ）及びＤ群（０．１ｍｇ／ｋｇ）に、それぞれ静脈内投与した（０日）。静脈投与の２時間後に、重症筋無力症の病態惹起薬剤として、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解させた抗ニコチン性アセチルコリン受容体モノクローナル抗体（ｍＡｂ３５、国立病院機構長崎川棚医療センター）を２００μｇ／匹で全ての動物に腹腔内投与した（０日）。
　次いで、動物の体重（Ｂｏｄｙ　ｗｅｉｇｈｔ）を、抗体投与前（ｐｒｅ）と、抗体投与後０、９、２４、３３、４８、５７、７２時間（ｈｒ）の時点で測定した。動物の動作、筋力及び握力を以下の試験で評価した。
＜動作スコア＞
　動物の動作を抗体投与後９、２４、３３、４８、５７、７２時間（ｈｒ）の各時点に６段階の評価基準（スコア／Ｓｃｏｒｅ）にて評価した。評価基準は上記（１）イと同様であった。
＜Ｗｉｒｅ－ｈａｎｇ　Ｔｅｓｔ＞
　抗体投与後約３０時間後に、Ｗｉｒｅ－ｈａｎｇ　Ｔｅｓｔを実施した。実施手順は上記（１）イと同様であった。
＜Ｇｒｉｐ　Ｓｔｒｅｎｇｔｈ　Ｔｅｓｔ＞
　抗体投与後約３０時間後に、Ｇｒｉｐ　Ｓｔｒｅｎｇｔｈ　Ｔｅｓｔを実施した。実施手順は上記（１）イと同様であった。
ウ　結果
　各群の体重測定結果は図１５に示される通りであった。すなわち、コントロールのＡ群の体重変化は、０ｈｒから５７ｈｒまで体重減少がみられ、その後わずかに増加した。Ｂ群、Ｃ群及びＤ群においても、Ａ群と同様の体重変化がみられたが、体重減少の程度はＡ群に比べて緩やかであった。
　各群の動作スコア測定結果は図１６に示される通りであった。すなわち、コントロールのＡ群のスコア結果は、２４ｈｒから発症がみられ始め、４８ｈｒでピークに達し、その後減衰した。Ｂ群ではほとんどの個体で発症がみられず、全体としていずれの測定ポイントにおいてもスコアは低値を示した。Ｂ群ではＡ群に比べて２４ｈｒ以降全ての測定ポイントにおいてスコアが有意に低かった（Ｄｕｎｎ検定）。Ｃ群ではＢ群同様ほとんどの個体で発症がみられず、いずれの測定ポイントにおいてもスコアは低値を示した。Ｃ群では９ｈｒ及び５７ｈｒを除く測定ポイントにおいてＡ群に比べてスコアが有意に低かった（Ｄｕｎｎ検定）。Ｄ群においては、群の半数では発症がみられず、全体としてコントロール群に比べてスコアは低値を示した。Ｄ群ではいずれの測定ポイントにおいてもＡ群との間に有意な差は認められなかった（Ｄｕｎｎ検定）。
　各群のＨａｎｇｉｎｇ　Ｗｉｒｅ　Ｔｅｓｔにおける落下潜時（Ｌａｔｅｎｃｙ）の測定結果は図１７に示される通りであった。すなわち、コントロールのＡ群の平均落下潜時は２０．０秒（±２０．００　ＳＥＭ）であったが、一部の動物を除く全ての個体が試験開始と同時にすぐに落下した。被験化合物各投与群の平均落下潜時は、Ｂ群では１１．３秒（±３．９１　ＳＥＭ）、Ｃ群では３２．３秒（±１８．０４　ＳＥＭ）、Ｄ群では２５．３秒（±１９．０７　ＳＥＭ）とＢ群ではＡ群に比べて落下潜時が短かったが、試験開始と同時にすぐに落下した動物は動物番号Ｄ－０１を除いてみられなかったものの、統計的に有意には至らなかった（Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定；Ｈ（３）＝６．６３，ｎ．ｓ．）。
　各群のＧｒｉｐ　Ｓｔｒｅｎｇｔｈ　Ｔｅｓｔの握力測定結果は図１８に示される通りであった。すなわち、コントロールのＡ群の平均握力は１７７ｇ（±６０．０５　ＳＥＭ）である一方で、Ｂ群の握力は４６１ｇ（±２７．６１　ＳＥＭ）、Ｃ群の握力は４７６ｇ（±２５．５１　ＳＥＭ）、Ｄ群の握力は４５２ｇ（±８６．３２　ＳＥＭ）であった。Ｂ群、Ｃ群及びＤ群の握力はＡ群の握力に比べて強かったものの、統計的には有意には至らなかった（Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定）。
エ　考察
　上記ウの通り、コントロール群（Ａ群）で認められた重症筋無力症様症状について、体重減少や筋力の低下が被験化合物投与群でもみられたものの、動作スコアにおいては、Ｄ群では軽度、Ｂ群及びＣ群では抑制されていたことから、全ての被験化合物において重症筋無力症の症状に対する薬効が確認された。
（３）まとめ
　実施例２（４）並びに上記（１）及び（２）の結果から、本発明の環状ペプチドの１つであるＭｕＳＫ７－ｐａｌがＭｕＳＫ結合活性を有するのみならず、重症筋無力症モデル動物において実際に治療効果を奏することが示された。
実施例４：環状ペプチドファーマコフォア配列のユビキチン分子へのグラフト化及び人工ユビキチン分子のＭｕＳＫ結合活性の評価
（１）  ラッソ・グラフト法の有効性の検証
ア　概要
　ＭＥＴ（肝増殖因子受容体）結合性の大環状ペプチドであるａＭＤ４及びａＭＤ５（Ito, K. et al., Nat Commun 2015, 6 (1): 6373.）の内部配列をラッソ・グラフト法（Mihara, E. et al., Nat Commun 2021, 12:1543.）によりユビキチン分子へグラフトしたところ、大環状ペプチドがグラフトされたユビキチン分子のＭＥＴ結合活性は、元の大環状ペプチドのＭＥＴ結合活性と比較して弱いことが確認された。そこで、グラフトする大環状ペプチドのファーマコフォア配列のＮ末端側及びＣ末端側に０～３アミノ酸残基のランダム化したスペーサー配列を付加し、一方で、大環状ペプチドのファーマコフォア配列はそのままにして、ライブラリーの作製及び選択を行ってＭＥＴ結合活性を評価した。具体的には以下の手順で行った。
イ　ラッソ・グラフト法の足場としてのユビキチン分子
　ファーマコフォア配列をユビキチン分子のβ１ドメインとβ２ドメインとの間のループ構造領域（β１－β２ループ）にラッソ・グラフティングしたユビキチン分子ベースのリガンドのファミリーを調製した（図１９ａ）。ａＭＤ４のファーマコフォア配列（ＹＲＱＦＮＲＲＴＨＥＶＷＮＬＤ；配列番号３５）又はａＭＤ５のファーマコフォア配列（ＹＷＹＹＡＷＤＱＴＹＫＡＦＰ；配列番号３６）を「Ｇ」又は「ＧＧ」スペーサーで挟み、β１－２ループ内のＬ８－Ｔ９残基又はＴ９－Ｇ１０残基と置き換えた（Ｕｂ－ａＭＤ４＿ｎ１－４及びＵｂ－ａＭＤ５＿ｎ１－４、ナイーブＵボディ，図２０ａ、ｂ）。
　各Ｕボディ構築物のヒトＭＥＴエクトドメインに対する解離定数及び結合速度定数は、Ｂｉａｃｏｒｅ８Ｋ装置（Ｃｙｔｉｖａ社）を用いて２５℃でＳＰＲにより測定した。Ｈｉｓ－＆ｈＦｃタグ付きヒトＭＥＴエクトドメインは、Ｓｉｎｏ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社から購入した（１０６９２－Ｈ０３Ｈ）。ランニングバッファーは、０．０１Ｍ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７．４、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、３ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０５％　Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ　Ｐ２０を含むＨＢＳ－ＥＰ＋バッファー（Ｃｙｔｉｖａ社）であった。Ｈｉｓ－及びｈＦｃタグ付きヒトＭＥＴエクトドメインは、メーカーが提供する標準的な固定化プロトコルに従って、シリーズＳセンサチッププロテインＧ（Ｃｙｔｉｖａ社）に固定化された。ナイーブＵボディ構築物の解離定数は、パラレルモードでのマルチサイクル法により決定した。各Ｕボディ構築物の８種類の濃度を３０μＬ／ｍｉｎの流速で注入した。得られた結合応答は、Ｂｉａｃｏｒｅ　ｉｎｓｉｇｈｔ評価ソフトウェアを用いて解析し、定常状態アフィニティモデルでフィッティングした。
　その結果、ナイーブＵボディはＭＥＴに結合したが、その親和性はすべてのケースで親大環状ペプチドのそれよりも大幅に弱かった（図２０ａ、ｂ）。また、ナイーブＵボディ構築物は野生型Ｕｂとほぼ同じ円偏光二色性スペクトルを示したことから、ナイーブＵボディ構築物では足場であるユビキチン分子が正しく折りたたまれていることがわかった。これらの結果は、この親和性低下はミスフォールディングによるものではなく、ラッソ・グラフトしたファーマコフォアのコンフォメーションが変化したためであることを示している。むしろ、この結合活性の低下は、ファーマコフォアのＮ－末端領域とＣ－末端領域の距離がラッソ・グラフティングにおいて不適切であることに起因するのではないかと推測した。ファーマコフォアペプチドの大環状活性型に影響を与えるであろうスペーサー残基を考慮し、グラフト化部位のスペーサーを最適化することによって、結合活性の低下を解決できるのではないかと考えた（図３Ｂ参照）。
ウ　ｍＲＮＡディスプレイ法によるフランクスペーサー配列の最適化
　ファーマコフォアの近傍配列の最適化を行うために、ｍＲＮＡディスプレイ法を用いて、ユビキチン足場上において結合能力に優れた新しい近傍スペーサー配列を再選択した（図１９ｂ、ｃ）。aMD4-grafted U-body（Ub-aMD4）又はaMD5-grafted U-body（Ub-aMD5）をコードする２種類のｍＲＮＡライブラリーを構築し、構築に当たっては、様々なフランキングスペーサー配列を用いて、β１－２ループ内の０～４の連続した残基を、ランダム化した０～３スペーサー残基で上流及び下流をフランキングしたファーマコフォア配列と交換した（図１９ｂ及び図２１）。ライブラリーの理論的多様性は９．９×１０８個であり、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳カクテルで翻訳された実用的なバリアント数（＞１０１１）を下回っていた。したがって、すべての可能な組み合わせが網羅的に探索された。具体的には以下の手順で行った。
ｍＲＮＡライブラリーの調製
　ｍＲＮＡライブラリーのＤＮＡテンプレートは、２つのステップでＤＮＡオリゴを組み立てることで調製した。第一段階として、フォワードプライマーとリバースプライマーを混合し、伸長反応を行い、β１－β２ループ配列、スペーサー配列、ファーマコフォア配列をコードする二本鎖ＤＮＡ（スペーサー配列はＮＮＫコドンでランダム化している）を得た。伸長反応は、1×KOD One PCR Master Mix -Blue-（東洋紡）、０．３μＭのフォワードプライマーとリバースプライマーで、３０μＬの反応スケールで行った。
　第二段階として、伸長産物を混合し、ＰＣＲにより増幅して定常領域を付加した。ＰＣＲは、1×KOD One PCR Master Mix -Blue-（東洋紡）、混合した伸長産物１０％（ｖ／ｖ）、０．３μＭフォワードプライマー及びリバースプライマーで、３００μＬの反応スケールで実施した。ＰＣＲ産物はフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させ、水に溶解させ、６６０μＬの反応スケールにて、３７℃で一晩、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写に使用した。転写反応には、４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭスペルミジン、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００、１０ｍＭ　ＤＴＴ、３０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、５ｍＭ　ＮＴＰ、３０ｍＭ　ＫＯＨ、テンプレートＤＮＡ溶液、０．１％（ｖ／ｖ）RNasin ribonuclease inhibitor（Ｐｒｏｍｅｇａ）、０．１２μＭ　Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼを含んでいた。さらに、７６μＬ　ＤＮａｓｅ緩衝液（４００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１００ｍＭ　ＭｇＳＯ４，１０ｍＭ　ＣａＣｌ２）及び２０μＬ　ＲＱ１　ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ　ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えた後、３７℃で１時間反応させた。得られたｍＲＮＡ転写物は、１３２μＬ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），８９μＬ　３Ｍ　ＮａＣｌ，７８５μＬ　イソプロパノールを加えて沈殿させ、その後遠心分離した。７０％（ｖ／ｖ）エタノールで洗浄後、ペレットを１５０μＬの水に溶解させ、等量の２×ＲＮＡローディングバッファー（８Ｍ尿素、２ｍＭ　Ｎａ２ＥＤＴＡ－２Ｈ２Ｏ，２ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ７．５）を添加した。ｍＲＮＡは、８Ｍ尿素を含む６％（ｖ／ｖ）ポリアクリルアミドゲルで精製し、０．３Ｍ　ＮａＣｌ溶液で抽出、沈殿させ、最終濃度１０μＭまで水に溶解させた。ｍＲＮＡライブラリーは、翻訳前にＴ４　ＲＮＡリガーゼを用いてピューロマイシンリンカーに共有結合させた。
ｍＲＮＡディスプレイによる選択
　Ｕボディライブラリーの生成に用いた翻訳系は、５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、１００ｍＭ酢酸カリウム、１２．３ｍＭ酢酸マグネシウム、２ｍＭ　ＡＴＰ、２ｍＭ　ＧＴＰ、１ｍＭ　ＣＴＰ、１ｍＭ　ＵＴＰ、２０ｍＭ　クレアチンリン酸、０．１ｍＭ　１０－ホルミル－５，６，７，８－テトラヒドロ葉酸、２ｍＭ　スペルミジン、１ｍＭ　ジチオスレイトール、　１．５ｍｇ／ｍＬ　大腸菌全ｔＲＮＡ、１．２μＭ　大腸菌リボソーム、０．６μＭ　メチオニル－ｔＲＮＡ　ホルミルトランスフェラーゼ，２．７μＭ　ＩＦ１，０．４μＭ　ＩＦ２，１．５μＭ　ＩＦ３，０．２６μＭ　ＥＦ－Ｇ、１０μＭ　ＥＦ－Ｔｕ、０．６６μＭ　ＥＦ－Ｔｓ、０．２５μＭ　ＲＦ２、０．１７μＭ　ＲＦ３、０．５μＭ　ＲＲＦ、４μｇ／ｍｌ、クレアチンキナーゼ、３μｇ／ｍｌミオキナーゼ、０．１μＭ　無機ピロホスファターゼ、０．１μＭ　ヌクレオチド二リン酸キナーゼ、０．１μＭ　Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼ、０．７３μＭ　ＡｌａＲＳ、０．０３μＭ　ＡｒｇＲＳ、０．３８μＭ　ＡｓｎＲＳ、０．１３μＭ　ＡｓｐＲＳ，０．０２μＭ　ＣｙｓＲＳ，０．０６μＭ　ＧｌｎＲＳ，０．２３μＭ　ＧｌｕＲＳ，０．０９μＭ　ＧｌｙＲＳ，０．０２μＭ　ＨｉｓＲＳ，０．４０μＭ　ＩｌｅＲＳ，０．０４μＭ　ＬｅｕＲＳ，０．１１μＭ　ＬｙｓＲＳ，０．０３μＭ　ＭｅｔＲＳ、０．６８μＭ　ＰｈｅＲＳ、０．１６μＭ　ＰｒｏＲＳ、０．０４μＭ　ＳｅｒＲＳ、０．０９μＭ　ＴｈｒＲＳ、０．０３μＭ　ＴｒｐＲＳ、０．０２μＭ　ＴｙｒＲＳ及び０．０２μＭ　ＶａｌＲＳ、０．５ｍＭの各Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＶａｌ、並びにピューロマイシンリンカーに結合させた１．５μＭ　ｍＲＮＡライブラリーである。Ｕｂ－ｂｏｄｙライブラリーは、２．５μＬの翻訳系で３７℃、３０分間翻訳した。
　次に、反応混合物を２５℃で７分間インキュベートした。その後、０．５μＬの５００ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を加え、さらに３７℃で５分間インキュベートし、ｍＲＮＡ－タンパク質結合体からのリボソームの解離を誘導した。リバースプライマー（Ｕｂ－ａＭＤ４ライブラリーにはＳＳＧ２ａｎ１３．Ｒ３６、Ｕｂ－ａＭＤ５ライブラリーにはＳＧＳ２ａｎ１３．Ｒ３６）及びＲＮａｓｅ　Ｈ活性を欠くＭ－ＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて４２℃で３０分間、逆転写を実施した。次に、ｃＤＮＡ－ｍＲＮＡ－タンパク質結合体を、ヒトＩｇＧ１　Ｆｃを表面に有するDynabeads Protein G（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ）２．５μＬと混合し、４℃で５分間インキュベートすることをネガティブセレクションとして３回行った。ネガティブセレクションの上清を回収し、ＭＥＴ（（１）イ参照）を固定化したDynabeads Protein Gと４℃で１０分間混合した後、１００μＬのＴＢＳ－Ｔバッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０，ｐＨ７．６）でビーズを３回（第１ラウンド）又は６回（第２～第６ラウンド）洗浄した。
　次に、１００μＬの１×ＰＣＲバッファー［１２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０），２．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２，６ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４，１０ｍＭ　ＫＣｌ，０．５ｍＭ　ｄＮＴＰ，０．００１％（ｗ／ｖ）　ＡｃＢＳＡ，０．１％（ｖ／ｖ）　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００、０．２５μＭ　Ｔ７Ｇ１０Ｕｂ６．Ｆ６３、及び０．２５μＭリバースプライマー（Ｕｂ－ａＭＤ４ライブラリーはＳＳＧ２ａｎ１３．Ｒ３６であり、Ｕｂ－ａＭＤ５ライブラリーはＳＧＳ２ａｎ１３．Ｒ３６である）］１μＬをビーズに添加し、混合物を９５℃で５分間加熱することによりｃＤＮＡを溶出した。溶出液１μＬを、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ＩとＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼを含む１×ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ　１９μＬと混合し、リアルタイムＰＣＲ（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ　Ｎａｎｏ，Ｒｏｃｈｅ）でｃＤＮＡの量を定量した。残りの溶出液は、ＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼを含む１×ＰＣＲバッファーで８倍に希釈し、ＰＣＲで増幅し、フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させ、５０ｍＭ　ＫＣｌ　４０μＬに溶解させ、ライブラリー調製と同様の手順でイン・ビトロ転写に用いた。転写されたｍＲＮＡライブラリーは沈殿させ、最終濃度が１０μＭになるように水に溶解させた。必要に応じて、転写されたｍＲＮＡライブラリーを沈殿後、８Ｍ尿素を含む４％（ｖ／ｖ）ポリアクリルアミドゲルを用いて精製した。
　６回の選択を繰り返した後、すべてのｃＤＮＡライブラリーの全領域を次世代シークエンサーで塩基配列を決定した。次世代シーケンサー（ＮＧＳ）による配列決定は以下のように行った。
　回収したｃＤＮＡを、KOD One PCR Master Mix -Blue-（東洋紡）を用い、０．５μＭ　Ｒｄ１Ｔ７ｇ１０Ｍ．Ｆ７０とａｎ１３Ｒｄ２．Ｒ４９をプライマーとして、製造者の指示に従ってＰＣＲ増幅した。生成物を２回目のＰＣＲ工程に進め、KOD One PCR Master Mix -Blue-とNextera XT v2 Set（イルミナ社の配列）プライマーを用いて、各サンプルにシーケンスバーコードを設置した。その後、ＰＣＲ産物を併せ、フェノール／クロロホルムで抽出し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎキット（ＴａＫａＲａ）を用いてメーカーの指示に従いカラム精製を行った。ｃＤＮＡサンプルの濃度は、ｄｓＤＮＡ　ＨＳキットを用いてＱｕｂｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて測定した。得られたＤＮＡを適切に希釈し、変性させ、変性ＰｈｉＸ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｖ３（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）と併せた。変性したＤＮＡを、ｖ３キットを用いてイルミナのＭｉＳｅｑ装置でペアエンドリード２×３００サイクルモードでシーケンスし、スティッチング処理後にｆａｓｔｑフォーマットでデータを収集した。
　配列解析の結果、親大環状ペプチドのＭＥＴ結合活性に匹敵するＭＥＴ結合活性を有するＵボディが得られた（図２０ａ、ｂ）。
エ　考察
　このように、環状ペプチドのファーマコフォアをユビキチン分子にグラフトする際には、ファーマコフォア配列の上流及び下流にランダム化したスペーサー配列を導入し、ｍＲＮＡディスプレイ法によりスペーサー配列の最適化を行いつつ選択を行うことが有効であることが示された。
（２）環状ペプチドのユビキチン分子へのグラフト化及びＭｕＳＫに結合するグラフト化ユビキチン分子（Ｕボディ）の選択
　上記（１）の知見を元にして、ＭｕＳＫ７（実施例１（１））のファーマコフォアをユビキチン分子のβ１－２ループにラッソ・グラフティングすることを検討した。ファーマコフォアの上流及び下流に近接するスペーサー配列の最適化は以下のように行った。すなわち、ファーマコフォアの近傍配列の最適化を行うために、ｍＲＮＡディスプレイ法を用いて、ユビキチン足場上において結合能力に優れた新しい近傍スペーサー配列を再選択した。ＭｕＳＫ７のアミノ酸配列の一部（ＹＰＳＹＨＴＮＶＶＡＳＬＫＲ）（配列番号３７）をコードするｍＲＮＡライブラリーを構築した。構築に当たっては図２２のように、β１－２ループ（Ｔ７－Ｇ１０）配列を「ランダム配列（３又は４アミノ酸）－ＹＰＳＹＨＴＮＶＶＡＳＬＫＲ－ランダム配列（３又は４アミノ酸）」と置換した。ライブラリーの理論的多様性は２．８×１０１０個であり、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳カクテルで翻訳された実用的なバリアント数（＞１０１１）を下回っていた。したがって、すべての可能な組み合わせが網羅的に探索された。ｍＲＮＡライブラリーの調製及びｍＲＮＡディスプレイによるＭｕＳＫ結合性を指標にした選択は上記（１）ウの手順と同様にして行った。
　６回のラウンドごとのrecovery rate（％）は図２３に示される通りである。また、６回の選択を繰り返した後、すべてのｃＤＮＡライブラリーの全領域を次世代シークエンサーで塩基配列を決定した。次世代シークエンスによる配列決定は上記（１）ウの手順と同様にして行った。
　配列解析の結果、以下のＭｕＳＫ結合領域（スペーサー領域含む）がグラフト化されたユビキチン分子（配列番号３８～４５）（以下、単にＵｂ００６～０１３ということがある）が得られた。
（Ｕｂ００６）ＩＱＰＲＹＰＳＹＨＴＮＶＶＡＳＬＫＲＩＲＹ（配列番号２２）
（Ｕｂ００７）ＫＰＧＶＹＰＳＹＨＴＮＶＶＡＳＬＫＲＭＭＰ（配列番号２３）
（Ｕｂ００８）ＷＤＲＧＹＰＳＹＨＴＮＶＶＡＳＬＫＲＱＧＩ（配列番号２４）
（Ｕｂ００９）ＫＰＧＴＹＰＳＹＨＴＮＶＶＡＳＬＫＲＦＭＰ（配列番号２５）
（Ｕｂ０１０）ＰＦＧＶＹＰＳＹＨＴＮＶＶＡＳＬＫＲＴＧＰＱ（配列番号２６）
（Ｕｂ０１１）ＹＦＶＧＹＰＳＹＨＴＮＶＶＡＳＬＫＲＷＮＴＰ（配列番号２７）
（Ｕｂ０１２）ＬＥＧＭＹＬＳＹＨＴＮＶＶＡＳＬＫＲＩＲＰＱ（配列番号２８）
（Ｕｂ０１３）ＬＥＧＭＹＰＳＹＨＴＮＶＶＡＳＬＫＲＩＲＰＱ（配列番号２９）
（３）ＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子の調製
　Ｕｂ００６～０１３並びにＵｂ０１２のホモ二量体及びホモ四量体を組換え微生物から発現させて調製した。Ｕｂ０１２のホモ二量体及びホモ四量体は、それぞれＵｂ０１２のＣ末端とＮ末端とをペプチドリンカー（Ａ（ＰＡ）７）で連結して作製した。複合体に関しては対照としてユビキチン分子の二量体を調製した。具体的には一方のユビキチン分子のＣ末端と他方のユビキチン分子のＮ末端とをペプチドリンカー（Ａ（ＰＡ）７）で連結してユビキチン分子の二量体を調製した。
　Ｕｂ００６～０１３（配列番号３８～４５）をコードするポリヌクレオチド、Ｕｂ０１２のホモ二量体（配列番号５４）をコードするポリヌクレオチド、ホモ四量体（配列番号５６）をコードするポリヌクレオチド並びにユビキチン分子の二量体（配列番号５８）をコードするポリヌクレオチドをそれぞれｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクターにクローニングし、Ｎ末端にＨｉｓ６－ｔａｇを付けて発現させた。発現させたタンパク質のアミノ酸配列とそれをコードするポリヌクレオチドは以下の通りであった。
・発現させたＵｂ００６～０１３のアミノ酸配列：配列番号３８～４５のＮ末端に「ＭＨＨＨＨＨＨ」を付加したアミノ酸配列
・発現させたＵｂ００６～０１３のＤＮＡ配列：配列番号４６～５３
・発現させたＵｂ０１２のホモ二量体のアミノ酸配列：配列番号５４のＮ末端に「ＭＨＨＨＨＨＨＡＳ」を付加し、Ｃ末端に「ＴＳ」を付加したアミノ酸配列
・発現させたＵｂ０１２のホモ二量体のＤＮＡ酸配列：配列番号５５
・発現させたＵｂ０１２のホモ四量体のアミノ酸配列：配列番号５６のＮ末端に「ＭＨＨＨＨＨＨＡＳ」を付加し、Ｃ末端に「ＴＳ」を付加したアミノ酸配列
・発現させたＵｂ０１２のホモ四量体のＤＮＡ酸配列：配列番号５７
・発現させたユビキチン分子のホモ二量体のアミノ酸配列：配列番号５８のＮ末端に「ＭＨＨＨＨＨＨＡＳ」を付加し、Ｃ末端に「ＴＳ」を付加したアミノ酸配列
・発現させたユビキチン分子のホモ二量体のＤＮＡ酸配列：配列番号５９
　すべてのタンパク質は、大腸菌ＢＬ２１－ｇｏｌｄ（ＤＥ３）細胞（Ａｇｉｌｅｎｔ）で発現させた。この細胞は、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むLysogeny broth medium（Miller）でＯＤ６００＞０．４まで増殖させ、１６℃で２４時間０．４ｍＭ　ＩＰＴＧで誘導した。細胞を溶解バッファー［５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２０ｍＭ　イミダゾール－ＨＣｌ（ｐＨ７．２）を含有する１５０ｍＭ　ＮａＣｌ（ｐＨ７．６）で超音波処理により溶解させ、Ni Sepharose 6 Fast Flow（Cytiva）によりタンパク質を捕捉した。セファロースビーズを洗浄バッファー［５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２０ｍＭ　イミダゾール－ＨＣｌ（ｐＨ７．２）を含有する１Ｍ　ＮａＣｌ（ｐＨ７．６）］及び前記溶解バッファーで洗浄した。タンパク質をセファロースビーズから溶出バッファー［５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５００ｍＭ　イミダゾール－ＨＣｌ（ｐＨ７．２）を含有する１５０ｍＭ　ＮａＣｌ（ｐＨ７．６）］で溶出させた。
　Ｕｂ００６～０１３並びにＵｂ０１２のホモ二量体及びホモ四量体はさらに、AKTA avant 25（Cytiva）又はAKTA pure（Cytiva）システム上のSuperdex 75 increase 10/300 GL（Cytiva）又はHiLoad 16/600 Superdex 200 pg（Cytiva）カラム［ランニングバッファー：５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ（ｐＨ７．６）］によるサイズ排除クロマトグラフで精製した。精製されたタンパク質は、さらなる用途のために－８０℃で保存された。タンパク質の濃度は、NanoDrop 2000c又はNanoDrop One C分光光度計（Thermo Fisher Scientific）を用いて測定した２８０ｎｍの紫外線吸光度によって決定した。
（４）ＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子及びその複合体のＭｕＳＫに対する結合親和性の評価（インビトロ試験）
　上述のようにして得られたＵボディ及びその複合体について、ヒト、ラット及びマウスのＭｕＳＫに対する親和性の評価（結合活性試験）を行った。試験は実施例１（３）に記載された手順に従って行った。但し、Ｕボディの複合体についてはＢｉａｃｏｒｅ　８Ｋ（Ｃｙｔｉｖａ）を用いて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析を行った。結果は表６に示す通りであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
（５）Ｕボディ及びその複合体のアセチルコリン受容体のクラスター化に及ぼす効果の評価（細胞レベル試験）
　Ｕボディ及びその複合体について、アセチルコリン受容体のクラスター化に対する効果の評価を行った。マウス筋芽細胞由来培養細胞株Ｃ２Ｃ１２を用いたＡＣｈＲクラスター形成の評価試験は実施例２（５）に記載された手順に従って行った。またＮａｎｏＢｉＴアッセイによる評価試験は実施例２（６）に記載された手順に従って行った。結果は図２４～２６に示される通りであった。
　図２４はＮａｎｏＢｉＴアッセイによる試験結果を示す。図２４から、Ｕｂ０１２のホモ二量体（Dimeric U-bodies）が環状ペプチドのホモ二量体（Dimeric peptide／ＭｕＳＫ７－ｐａｌ）と比較して強いＭｕＳＫ二量体化活性を有することが確認された。図２５は筋管細胞を用いたＡＣｈＲクラスター形成の評価試験結果を示す。図２５から、Ｕｂ０１２のホモ二量体（dimeric U-body）が濃度依存的なＡＣｈＲクラスター形成の促進効果を有することが確認された。図２６ＡはＮａｎｏＢｉＴアッセイによる試験結果を示す。図２６ＡからＵｂ０１２のホモ四量体（Tetrameric U-bodies）がＵｂ０１２のホモ二量体（Dimeric U-bodies）と比較して強いＭｕＳＫ二量体化活性を有することが確認された。図２６Ｂは筋管細胞を用いたＡＣｈＲクラスター形成の評価試験結果を示す。図２６Ｂから、Ｕｂ０１２のホモ四量体（tetrameric U-bodies）が濃度依存的なＡＣｈＲクラスター形成の促進効果を有することが確認された。
（６）重症筋無力症モデル動物に対するＵボディ複合体の治療効果の評価
ア　目的
　抗アセチルコリン受容体モノクローナル抗体（ｍＡｂ３５）を用いたラットＰＴＭＧモデルにおける各種疾患パラメーターに対してＵボディ複合体（四量体）が及ぼす影響を評価した。本実施例では、Ｕｂ０１２のＣ末端とＮ末端とをペプチドリンカー（ＥＡＡＡＫ）３で連結したＵｂ０１２のホモ四量体（配列番号６０）と、Ｕｂ０１２のＣ末端の２アミノ酸残基（ＧＧ）の欠失体のＣ末端とＮ末端とをペプチドリンカー（ＥＡＡＡＫ）３で連結したＵｂ０１２（ΔＧＧ）のホモ四量体（配列番号６１）を作製し、以下の試験に用いた。
イ　試験方法
　５週齢の雌性ラット（ＬＥＷ／ＣｒｌＣｒｌｊ、搬入時は４週齢、ジャクソン・ラボラトリー・ジャパン社）を、体重測定結果を指標にして、３群（Ａ群、Ｂ群及びＣ群）に群分けを実施した。ビヒクルに溶解させた被験化合物（Ｕｂ０１２の四量体（ＥＡＡＡＫ）３）をＡ群（５ｍｇ／ｋｇ）（ｎ＝５）に、ビヒクルに溶解させた被験化合物（Ｕｂ０１２（ΔＧＧ）の四量体（ＥＡＡＡＫ）３）をＢ群（５ｍｇ／ｋｇ）（ｎ＝５）に、及びビヒクルをＣ群（ｎ＝５）に、それぞれ静脈内投与した（０日）。静脈投与の２時間後に、重症筋無力症の病態惹起薬剤として、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解させた抗ニコチン性アセチルコリン受容体モノクローナル抗体（ｍＡｂ３５、国立病院機構長崎川棚医療センター）を２００μｇ／匹で全ての動物に腹腔内投与した（０日）。
　次いで、動物の体重（Ｂｏｄｙ　ｗｅｉｇｈｔ）を、抗体投与前（ｐｒｅ）と、抗体投与後０、９、２４、３３、４８、５７、７２時間（ｈｒ）の時点で測定した。動物の動作、筋力及び握力を以下の試験で評価した。
＜動作スコア＞
　動物の動作を抗体投与後９、２４、３３、４８、５７、７２時間（ｈｒ）の各時点に６段階の評価基準（スコア／Ｓｃｏｒｅ）にて評価した。評価基準は実施例３（１）イと同様であった。
＜Ｗｉｒｅ－ｈａｎｇ　Ｔｅｓｔ＞
　抗体投与後約３０時間後に、Ｗｉｒｅ－ｈａｎｇ　Ｔｅｓｔを実施した。実施手順は実施例３（１）イと同様であった。
＜Ｇｒｉｐ　Ｓｔｒｅｎｇｔｈ　Ｔｅｓｔ＞
　抗体投与後約３０時間後に、Ｇｒｉｐ　Ｓｔｒｅｎｇｔｈ　Ｔｅｓｔを実施した。実施手順は実施例３（１）イと同様であった。
ウ　結果
　各群の体重測定結果は図２７に示される通りであった。すなわち、コントロールのＣ群の体重変化は、０ｈｒから５７ｈｒまで体重減少がみられた。Ａ群及びＢ群においてもＣ群と同様の体重変化がみられたが、体重減少の程度はＣ群に比べて有意に緩やかであった（Ｔｕｋｅｙ検定；Ａ群及びＢ群：０ｈｒ＞３３ｈｒ，４８ｈｒ，５７ｈｒ，ｐ＜０．０５）。
　各群の動作スコア測定結果は図２８に示される通りであった。すなわち、コントロールのＣ群のスコア結果は、９ｈｒから病態発症がみられ始め、４８ｈｒでピークに達し、その後減衰した。Ａ群及びＢ群ではＣ群と同様に９ｈｒから病態発症がみられたが、Ａ群及びＢ群のピーク時のスコアはＣ群のピーク時のスコアに比べて低かった。但し、いずれの測定ポイントにおいても群間で有意な差は認められなかった（Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定）。
　各群のＨａｎｇｉｎｇ　Ｗｉｒｅ　Ｔｅｓｔにおける落下潜時（Ｌａｔｅｎｃｙ）の測定結果は図２９に示される通りであった。すなわち、コントロールのＣ群の平均落下潜時は０．２秒（±０．２０　ＳＥＭ）と５例中４例が試験開始と同時に直ぐに落下した。一方、Ａ群及びＢ群の平均落下潜時はそれぞれ２５．２秒（±２３．７２　ＳＥＭ）、２６．８秒（±２３．４６ＳＥＭ）と２例以上は試験開始と同時に直ぐに落下しない個体がおり、平均落下潜時もコントロール群に比べてわずかに長かったものの、統計的に群間で有意な差は認められなかった（Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定；Ｈ（９）＝１３．２０，ｎ．ｓ．）。
　各群のＧｒｉｐ　Ｓｔｒｅｎｇｔｈ　Ｔｅｓｔの握力測定結果は図３０に示される通りであった。すなわち、コントロールのＣ群の平均握力は８９ｇ（±２２．２４　ＳＥＭ）であった。一方、Ａ群及びＢ群の握力はそれぞれ２３３ｇ（±６５．１６　ＳＥＭ）、２６４ｇ（±１１１．１０　ＳＥＭ）とＣ群に比べて強かったものの、統計的に有意な群間差は認められなかった（Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定；Ｈ（９）＝８．７２，ｎ．ｓ．）。
エ　考察
　上記ウの通り、コントロール群（Ｃ群）で認められた重症筋無力症様症状について、体重減少、スコア上昇、筋力の低下といった重症筋無力症様症状が被験化合物投与群でもみられた。但し、統計的に有意な差は認められなかったものの、Ａ群及びＢ群の病態はコントロール群に比べて明らかに軽度であったことから、２つの被験化合物について重症筋無力症の症状に対する薬効が確認された。

Claims (34)

  1. 　下記式（Ｉ）の構造を含む、環状ペプチド又はその薬学上許容可能な塩。
    －Ｘ１－Ａｓｎ－Ｘ２－Ｖａｌ－　　　（Ｉ）
    （上記式中、Ｘ１はＴｈｒ又はＶａｌを表し、Ｘ２はＶａｌ又はＩｌｅを表す）
  2. 　前記環状ペプチドの環状構造を形成するアミノ酸残基の数が、８～２０個である、請求項１に記載の環状ペプチド又はその薬学上許容可能な塩。
  3. 　前記環状ペプチドの環状構造がＮ－ＣＯ－ＣＨ２－Ｓ構造を含む、請求項１又は２に記載の環状ペプチド又はその薬学上許容可能な塩。
  4. 　前記Ｎがチロシンのアミノ基である、請求項３に記載の環状ペプチド又はその薬学上許容可能な塩。
  5. 　前記Ｓがシステインのチオール基である、請求項３又は４に記載の環状ペプチド又はその薬学上許容可能な塩。
  6. 　前記環状ペプチドが、下記式（１）（配列番号２）、式（２）（配列番号３）及び式（３）（配列番号４）からなる群から選択される構造を有する、請求項１又は３に記載の環状ペプチド又はその薬学上許容可能な塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （上記式中、システイン残基（Ｃ）のカルボキシル基は酸アミドを形成していてもよい。）
  7. 　請求項１に記載の環状ペプチドを二つ含み、かつ、一方の環状ペプチドが他方の環状ペプチドにリンカーにより結合している、環状ペプチド複合体又はその薬学上許容可能な塩。
  8. 　前記二つの環状ペプチドが同じ環状ペプチドである、請求項７に記載の環状ペプチド複合体又はその薬学上許容可能な塩。
  9. 　リンカーの長さが、２０～１００Åである、請求項７又は８に記載の環状ペプチド複合体又はその薬学上許容可能な塩。
  10. 　リンカーが、その構造の少なくとも一部としてポリエチレングリコール構造を有する、請求項９に記載の環状ペプチド複合体又はその薬学上許容可能な塩。
  11. 　リンカーが、その側鎖として炭素数８～２０の飽和炭化水素基を少なくとも一つ有する、請求項７又は１０に記載の環状ペプチド複合体又はその薬学上許容可能な塩。
  12. 　ユビキチン分子のβ１ドメインとβ２ドメインとの間のループ構造領域の一部又は全部が、下記構造（Ａ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （上記式中、
    　ＭｕＳＫ結合領域は、ＹＸ２１ＳＹＨＴＮＶＶＡＳＬＫＲ（Ｘ２１はＰ又はＬである）（配列番号１１）のアミノ酸配列からなり、
    　スペーサー１が、ＩＱＰＲ（配列番号１２）、ＫＰＧＶ（配列番号１３）、ＷＤＲＧ（配列番号１４）、ＫＰＧＴ（配列番号１５）、ＰＦＧＶ（配列番号１６）、ＹＦＶＧ（配列番号１７）及びＬＥＧＭ（配列番号１８）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなり、
    　スペーサー２が、ＩＲＹ、ＭＭＰ、ＱＧＩ、ＦＭＰ、ＴＧＰＱ（配列番号１９）、ＷＮＴＰ（配列番号２０）及びＩＲＰＱ（配列番号２１）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。）
    のペプチドにより置換されてなるか、或いはユビキチン分子のβ１ドメインとβ２ドメインとの間のループ構造領域に前記構造（Ａ）のペプチドが挿入されてなる、ＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子又はその薬学上許容可能な塩。
  13. 　ユビキチン分子が、
    （ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質、
    （ｂ）配列番号１のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、及び
    （ｃ）配列番号１のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が改変されたアミノ酸配列からなるタンパク質
    からなる群から選択されるタンパク質である、請求項１２に記載のＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子又はその薬学上許容可能な塩。
  14. 　構造（Ａ）が、下記からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１２又は１３に記載のＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子又はその薬学上許容可能な塩。
    （Ｕｂ００６）ＩＱＰＲＹＰＳＹＨＴＮＶＶＡＳＬＫＲＩＲＹ（配列番号２２）
    （Ｕｂ００７）ＫＰＧＶＹＰＳＹＨＴＮＶＶＡＳＬＫＲＭＭＰ（配列番号２３）
    （Ｕｂ００８）ＷＤＲＧＹＰＳＹＨＴＮＶＶＡＳＬＫＲＱＧＩ（配列番号２４）
    （Ｕｂ００９）ＫＰＧＴＹＰＳＹＨＴＮＶＶＡＳＬＫＲＦＭＰ（配列番号２５）
    （Ｕｂ０１０）ＰＦＧＶＹＰＳＹＨＴＮＶＶＡＳＬＫＲＴＧＰＱ（配列番号２６）
    （Ｕｂ０１１）ＹＦＶＧＹＰＳＹＨＴＮＶＶＡＳＬＫＲＷＮＴＰ（配列番号２７）
    （Ｕｂ０１２）ＬＥＧＭＹＬＳＹＨＴＮＶＶＡＳＬＫＲＩＲＰＱ（配列番号２８）
    （Ｕｂ０１３）ＬＥＧＭＹＰＳＹＨＴＮＶＶＡＳＬＫＲＩＲＰＱ（配列番号２９）
  15. 　前記ループ構造領域が、ユビキチン分子の第７番目のアミノ酸残基から第１０番目のアミノ酸残基までの領域である、請求項１２又は１３に記載のＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子又はその薬学上許容可能な塩。
  16. 　請求項１２又は１３に記載のＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子を二つ以上含み、かつ、一方のＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子が他方のＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子にリンカーにより結合している、ＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子複合体又はその薬学上許容可能な塩。
  17. 　前記二つ以上のＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子が同じ分子である、請求項１６に記載のＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子複合体又はその薬学上許容可能な塩。
  18. 　リンカーの長さが、２０～１００Åである、請求項１６又は１７に記載のＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子複合体又はその薬学上許容可能な塩。
  19. 　リンカーが、ペプチド鎖である、請求項１６又は１８に記載のＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子複合体又はその薬学上許容可能な塩。
  20. 　請求項１に記載の環状ペプチド若しくはその薬学上許容可能な塩、請求項７に記載の環状ペプチド複合体若しくはその薬学上許容可能な塩、請求項１２に記載のＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子若しくはその薬学上許容可能な塩、又は請求項１６に記載のＭｕＳＫ結合領域グラフト化ユビキチン分子複合体若しくはその薬学上許容可能な塩を有効成分として含む、医薬組成物又は重症筋無力症の治療剤。
  21. 　所望の分子（好ましくはＭｕＳＫ分子）に結合活性を有する環状ペプチドを、２つのスペーサー配列とともに、ユビキチン分子のループ構造領域上に提示する方法であって、
    　環状ペプチドは、分子内環状構造を形成するための化学架橋構造を有し、
    　環状ペプチドの化学架橋構造を、スペーサー配列を介して前記ループ構造を構成する２つのアミノ酸残基に置き換えることにより、前記環状ペプチドを、所望の分子（好ましくはＭｕＳＫ分子）に対する結合活性を保持したままユビキチン分子に融合させることを含み、
    　スペーサー配列は、ランダムに生成された０～４残基のアミノ酸配列からなる、方法。
  22. 　所望の分子がＭｕＳＫ分子であり、かつ、ユビキチン分子のループ構造領域上に提示される環状ペプチド及びスペーサー配列が、下記構造（Ｂ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （上記式中、スペーサー３は、０～４個の任意のアミノ酸からなるペプチド鎖であり、スペーサー４は、０～４個の任意のアミノ酸からなるペプチド鎖であり、ＭｕＳＫ結合領域は前記環状ペプチドに存在するＭｕＳＫ分子結合活性を有する領域である。）
    を有する、請求項２１に記載の提示方法。
  23. 　ユビキチン分子のループ構造領域が、β１ドメインとβ２ドメインとの間のループ構造領域である、請求項２１又は２２に記載の提示方法。
  24. 　ループ構造領域を構成する前記２つのアミノ酸残基が、ユビキチン分子の第７番目のアミノ酸残基及び第１０番目のアミノ酸残基である、請求項２３に記載の提示方法。
  25. 　前記ＭｕＳＫ結合領域が、ＹＸ２２ＳＹＨＴＮＶＶＡＳＬＫＲ（Ｘ２２はＰ又はＬである）（配列番号１１）のアミノ酸配列を有するペプチド鎖である、請求項２２に記載の提示方法。
  26. 　所望の分子（好ましくはＭｕＳＫ分子）に結合活性を有する環状ペプチドを、２つのスペーサー配列とともに、ユビキチン分子のループ構造領域上に融合させて環状ペプチドをタンパク質上に提示させた改変タンパク質の製造方法であって、
    　環状ペプチドは、分子内環状構造を形成するための化学架橋構造を有し、
    　環状ペプチドのアミノ酸配列から、タンパク質上に提示させる部分アミノ酸配列を選択し、該部分アミノ酸配列に相当する塩基配列を選択し、
    　ユビキチン分子のループ構造領域を構成する２つのアミノ酸残基に相当する塩基配列を選択し、該選択された塩基配列間に存在する塩基を必要に応じて削除し、選択された環状ペプチドの部分アミノ酸配列に相当する塩基配列を挿入して組み込んだ塩基配列を有する核酸を準備し、
    　該核酸を翻訳することを含み、
    　スペーサー配列は、ランダムに生成された０～４残基のアミノ酸配列からなる、製造方法。
  27. 　所望の分子がＭｕＳＫ分子であり、かつ、ユビキチン分子のループ構造領域上に提示される環状ペプチド及びスペーサー配列が、下記構造（Ｂ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     （上記式中、スペーサー３は、０～４個の任意のアミノ酸からなるペプチド鎖であり、スペーサー４は、０～４個の任意のアミノ酸からなるペプチド鎖であり、ＭｕＳＫ結合領域は前記環状ペプチドに存在するＭｕＳＫ分子結合活性を有する領域である。）
    を有する、請求項２６に記載の製造方法。
  28. 　ユビキチン分子のループ構造領域が、β１ドメインとβ２ドメインとの間のループ構造領域である、請求項２６又は２７に記載の製造方法。
  29. 　ループ構造領域を構成する前記２つのアミノ酸残基が、ユビキチン分子の第７番目のアミノ酸残基及び第１０番目のアミノ酸残基である、請求項２８に記載の製造方法。
  30. 　前記ＭｕＳＫ結合領域が、ＹＸ２２ＳＹＨＴＮＶＶＡＳＬＫＲ（Ｘ２２はＰ又はＬである）（配列番号１１）のアミノ酸配列を有するペプチド鎖である、請求項２７に記載の製造方法。
  31. 　所望の分子に対する結合性改変タンパク質（好ましくはＭｕＳＫ結合性の改変タンパク質）のスクリーニング方法であって、
    　所望の分子（好ましくはＭｕＳＫ分子）に結合活性を有する環状ペプチドの配列と、前記環状ペプチドの配列の上流及び下流に連結する、ランダムに生成された０～４残基のアミノ酸配列からなるスペーサー配列とが、β１ドメインとβ２ドメインとの間のループ構造領域上に融合されたユビキチン分子をコードする塩基配列を含むｍＲＮＡライブラリーをデザインし、デザインしたｍＲＮＡライブラリーに基づいて請求項２８に記載の製造方法に従って改変タンパク質を調製し、
    　所望の分子に対する結合性（好ましくはＭｕＳＫ結合活性）を指標に、得られた改変タンパク質から所望の分子に対する結合性の改変タンパク質（好ましくはＭｕＳＫ結合性の改変タンパク質）を選択する
    ことを含む、スクリーニング方法。
  32. 　下記式（Ｉ）の構造を含む、ペプチド又はその薬学上許容可能な塩。
    －Ｘ１－Ａｓｎ－Ｘ２－Ｖａｌ－　　　（Ｉ）
    （上記式中、Ｘ１はＴｈｒ又はＶａｌを表し、Ｘ２はＶａｌ又はＩｌｅを表す）
  33. 　前記ペプチドが、８～２０個のアミノ酸残基からなる、請求項３２に記載のペプチド又はその薬学上許容可能な塩。
  34. 　生体分子中にグラフトされた、請求項３２又は３３に記載のペプチド又はその薬学上許容可能な塩。
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