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WO2024185884A1 - 相補ｄｎａ鎖を増幅する方法 - Google Patents

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WO2024185884A1
WO2024185884A1 PCT/JP2024/008998 JP2024008998W WO2024185884A1 WO 2024185884 A1 WO2024185884 A1 WO 2024185884A1 JP 2024008998 W JP2024008998 W JP 2024008998W WO 2024185884 A1 WO2024185884 A1 WO 2024185884A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
oligo
complementary
strand
sequence
capture
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2024/008998
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
成之 七野
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Immunogeneteqs Inc
Original Assignee
Immunogeneteqs Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Immunogeneteqs Inc filed Critical Immunogeneteqs Inc
Priority to CN202480005250.6A priority Critical patent/CN120693411A/zh
Priority to EP24767249.6A priority patent/EP4682269A1/en
Priority to JP2024558308A priority patent/JP7636848B2/ja
Priority to AU2024231805A priority patent/AU2024231805A1/en
Priority to KR1020257017489A priority patent/KR20250094720A/ko
Publication of WO2024185884A1 publication Critical patent/WO2024185884A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1096—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA cDNA Synthesis; Subtracted cDNA library construction, e.g. RT, RT-PCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/10—Nucleotidyl transfering
    • C12Q2521/107—RNA dependent DNA polymerase,(i.e. reverse transcriptase)

Definitions

  • the present invention relates to a method for amplifying complementary DNA strands that enables high-sensitivity amplification of cDNA from minute amounts of mRNA.
  • RNA-seq analysis Single-cell RNA-seq analysis
  • siRNA-seq analysis Single-cell RNA-seq analysis
  • An international project to create an atlas at the single-cell level in humans was launched in 2016 (Non-Patent Document 1), and is a driving force behind the advancement of understanding biology at an unprecedented resolution.
  • scRNA-seq analysis is particularly useful for elucidating the complex immune mechanisms in pathological conditions.
  • Representative trace samples include tumor-infiltrating T cells contained in biopsy specimens of primary and metastatic lesions taken for diagnostic purposes in cancer patients, and B cells that specifically react to viruses and vaccines against them.
  • CTLs cytotoxic T lymphocytes
  • CD8 + T cells attention is being paid to a method for measuring the extent to which CD8 + T cells with cancer antigen-specific recognition ability are induced (Non-Patent Document 2).
  • TCR T cell receptors
  • BCR B cell receptors
  • Non-Patent Documents 3, 4 it would be ideal to obtain the same amount of mRNA from the cells, but the amount of mRNA contained in T/B cells is significantly lower than that of epithelial cells, tumor cells, macrophages, etc. Therefore, it is becoming increasingly important to develop a method to sensitively amplify mRNA from individual cells derived from a sample for high-resolution scTCR/BCR/RNA-seq analysis of these cells.
  • cDNA amplification methods can be classified according to whether or not mRNA capture and cDNA synthesis are performed on a solid phase.
  • solid-phase systems that capture mRNA in microwells or microdroplets using mRNA capture oligos immobilized on solid-phase beads and synthesize cDNA include the BD Rhapsody system (Patent Document 3), Seq-well system (Non-Patent Document 12), and Nx1-seq system (Patent Document 5, Non-Patent Document 14) from Beckton Dickinson, which use plates with microwells, as well as the Drop-seq method (Non-Patent Document 13), which captures mRNA in microdroplets, and the Nadia system from Dolomite Bio.
  • liquid-phase systems that capture mRNA in microwells or microdroplets using free mRNA capture oligos that are not bound to a solid phase and synthesize cDNA
  • 10X Chromium system Patent Document 4
  • 10X Genomics which encapsulates hydrogel beads containing mRNA capture oligos and a single cell in a microdroplet, melts the hydrogel and dissolves the cell in the microdroplet, and captures mRNA with the free mRNA capture oligos
  • Smart-Seq2 Non-Patent Document 15
  • liquid-phase analysis techniques include combinatorial indexing such as sci-RNA-seq3, which suspends fixed cells in a solution containing a cell membrane permeabilization reagent and mRNA capture oligos, and captures mRNA on the mRNA capture oligos within the fixed cells.
  • combinatorial indexing such as sci-RNA-seq3, which suspends fixed cells in a solution containing a cell membrane permeabilization reagent and mRNA capture oligos, and captures mRNA on the mRNA capture oligos within the fixed cells.
  • TS template switching
  • a primer of several tens of base pairs containing a base sequence such as [guanosine]-[guanosine]-[guanosine] is added to the 3' end of a template switching oligo, which is used to synthesize cDNA from mRNA, to add the desired base sequence to the cDNA end and perform second-strand synthesis
  • Patent Document 1 Non-Patent Document 5, Non-Patent Document 6
  • TdT a polynucleotide sequence consisting of the same bases is added to the synthesized cDNA end using terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT), and second-strand synthesis is performed using a primer that has a complementary sequence to the polynucleotide at the 3' end and a known adapter sequence at the 5' end
  • the TS method has the advantage of having fewer reaction steps, resulting in less loss of cDNA during purification.
  • the TS reaction occurs primarily with mRNA that has a 5' cap structure, making it easier to generate full-length cDNA.
  • the efficiency of the TS reaction is highly dependent on the terminal structure of the mRNA, with the efficiency decreasing in the order of terminal bases G>A>C>U.
  • the efficiency is relatively high (approximately 20%-60%) for full-length cDNA with a cap structure at the 5' end, but is low (several percent-40%) for incomplete-length mRNA without a cap structure, immature mRNA, and partially degraded mRNA, etc., resulting in uneven efficiency that leads to amplification bias (Non-Patent Document 6).
  • the efficiency is lower than the polynucleotide addition efficiency in the TdT method (92-95%, Non-Patent Document 10).
  • the TdT method is more efficient than the TS method, but it has the disadvantage that it is difficult to control the TdT reaction, there are many steps, and when single-stranded DNA is used as a template, the efficiency can be greatly reduced if the end forms a higher-order structure and becomes a recessed end (Non-Patent Document 10), so it is more difficult to synthesize long, full-length cDNA, which is more likely to form a higher-order structure, than with the TS reaction.
  • the TAS-Seq method which the inventors of this application previously developed, is a technology that resolves the difficulty of controlling the TdT reaction in the TdT method (Patent Document 2, Non-Patent Document 11).
  • the TAS-Seq method is a solid-phase cDNA amplification method that captures target nucleic acids on a solid phase and synthesizes cDNA.
  • the nucleotide homopolymer addition reaction by the TdT reaction is controlled to be within a certain range even under various conditions.
  • the TAS-Seq method has excellent detection sensitivity for expressed genes and quantification of cell composition, and is a technology that can more reliably detect intercellular communication that is difficult to detect with conventional technologies.
  • a method for amplifying individual single-cell mRNA from various specimens with high sensitivity and low bias is an important issue in terms of constructing a more advanced and accurate single-cell atlas, capturing tumor-reactive T cells, and capturing B cells with high vaccine responsiveness.
  • the existing TS and TdT methods each have their own unique advantages and disadvantages, and there is no highly sensitive cDNA amplification method that can cover all of the advantages.
  • the TAS-Seq method previously developed by the inventors of the present application also has the problem that, due to the nature of adding a certain amount of terminator nucleotides, a certain amount of cDNA is produced to which a polynucleotide of sufficient length to form a stable complementary strand with the primer used for second strand synthesis is not added. Since the TAS-Seq method is a type of TdT method, it is similar to the general TS method in that it has more steps than the TS method and long full-length cDNA is less easily synthesized than in the TS reaction. In addition, the known TAS-Seq method is a solid-phase cDNA amplification method, and its application to a liquid-phase system is not known.
  • the present invention aims to provide a cDNA amplification method that can comprehensively amplify mRNA with high efficiency and low bias even from very small amounts of cell samples.
  • the cDNA product will decrease, leading to a decrease in the final cDNA amplification efficiency.
  • the TdT method is applied to the product of the TS method without carrying out a step to remove unreacted target RNA capture oligos, as is, according to this common technical knowledge, it is expected that the unreacted target RNA capture oligos and template switching oligos, which are present in much greater quantities than the cDNA product, will be preferentially amplified by the TdT method, resulting in a significant decrease in the efficiency of cDNA amplification. Therefore, there is no method that combines the TS method and the TdT method, and there is no reason to expect that any significant advantage will be obtained that does more than negate the advantages of the two methods.
  • the inventors of the present application decided to carry out a step of removing unreacted target RNA capture oligos as well as unreacted template switching oligos from the products of the TS reaction in a liquid phase system, and then further applied the TdT method to the products. They surprisingly found that the cDNA yield was significantly increased compared to each reaction alone, that the amount of long-stranded cDNA synthesized was greater than that of the TdT reaction alone, and that the amount of short-stranded cDNA synthesized was greater than that of the TS reaction alone.
  • the inventors of the present application discovered that when a reverse transcriptase with terminal transferase activity is used to perform the TAS-Seq step (TdT method) without combining it with a TS reaction, bases such as CCC are added to the ends of the cDNA, reducing the proportion of homopolymer portions (especially polyC) that are too short, and that the TAS-Seq method can be performed efficiently even in a liquid phase system that does not use a solid phase.
  • the present invention which was completed through the above-mentioned intensive research, is a method for amplifying complementary DNA strands, which includes the steps of capturing target RNA and synthesizing complementary DNA strands in a liquid-phase or solid-phase system using a reverse transcriptase with terminal transferase activity, adding bases such as CCC to the ends of the complementary DNA strands, and then performing homopolymer tailing by a TdT reaction in the presence of chain-terminating nucleotide triphosphates.
  • a TS reaction using a template switching oligo, it is a technology that can amplify complementary DNA strands with higher efficiency and lower bias, and includes the following aspects.
  • a target RNA capture step of capturing a target RNA using a target RNA capture oligo containing a target capture portion a complementary strand synthesis step in which a complementary DNA strand having a sequence complementary to the captured RNA is synthesized by performing a reverse transcription reaction using a reverse transcriptase having terminal transferase activity, and an additional sequence consisting of any number of bases is added to the 3' end of at least a part of the complementary DNA; an unreacted oligo removal step for removing target RNA capture oligos that have not captured the target RNA; an RNA degradation step of degrading RNA with an RNA degrading enzyme; a homopolymer addition step in which a reaction is carried out with terminal deoxynucleotidyl transferase in the presence of dATP, dTTP, dCTP or dGTP and a chain-terminating nucleotide triphosphate to add a nucleotide homopolymer to the 3' end
  • the target RNA capture oligo comprises a first adaptor portion on the 5' side of the target capture portion
  • the primer for second strand synthesis comprises a long primer comprising a second adaptor portion on the 5' side of a complementary homopolymer portion
  • a nucleic acid amplification reaction is carried out using a primer targeting the first adaptor and a primer targeting the second adaptor.
  • the primer for second strand synthesis comprises a long primer including a second adapter portion on the 5' side of the complementary homopolymer portion
  • a nucleic acid amplification reaction is carried out using a primer targeting the second adapter and a primer targeting a desired region in the complementary DNA strand.
  • the long primer comprises a molecular barcode portion consisting of a random sequence between the second adapter portion and the complementary homopolymer portion.
  • RNA capture oligo is a free oligo that is not bound to a solid support, and the step of removing the unreacted oligo is carried out by nucleic acid size fractionation.
  • the target RNA capture oligo comprises, from the 5' to 3' side, a first adapter portion, a cell identification barcode portion, and a target capture portion.
  • the target RNA capture oligo is an immobilized oligo bound to a solid support, and the step of removing unreacted oligo is carried out by exonuclease treatment.
  • the target RNA capture oligo comprises a target polyA RNA capture oligo containing a polyT portion as a target capture portion, and the target RNA comprises polyA RNA.
  • a reverse transcription reaction is carried out in the presence of a template switching oligo that contains a sequence at its 3' end that can hybridize to the additional sequence and that contains a switching sequence on the 5' side of the sequence, the template switching oligo is hybridized to the complementary DNA strand to which the additional sequence has been added, and a sequence complementary to the switching sequence is further added to the 3' end of the complementary DNA strand.
  • the template switching oligo comprises an oligonucleotide comprising GGG, GUG or NGG (wherein G and U are ribonucleotide bases, and N is any ribonucleotide base selected from A, U, G and C, which may contain one or more nucleotide analogs) at its 3' end as a sequence hybridizable with the additional sequence, and the switching sequence comprises a second adapter portion.
  • the switching sequence comprises a molecular barcode portion consisting of a random sequence on the 3' side of the second adapter portion.
  • the target RNA capture oligo is a free oligo that is not bound to a solid phase support
  • the unreacted oligo removal step includes removal by nucleic acid size fractionation of the target RNA capture oligo that has not captured the target RNA and the template switching oligo that has not hybridized to a complementary DNA strand.
  • the primer for second strand synthesis comprises a long primer comprising a second adaptor portion on the 5' side of a complementary homopolymer portion, and a short primer which does not comprise a complementary homopolymer portion and comprises the second adaptor portion on its 3' side.
  • the present invention by using a reverse transcriptase having terminal transferase activity, it is possible to comprehensively amplify mRNA from a very small amount of sample with higher efficiency and lower bias than the conventional TAS-Seq method (Patent Document 2, Non-Patent Document 11), and the TAS-Seq method can be efficiently performed even in a liquid phase system without using a solid phase.
  • the yield of both long and short cDNA can be significantly increased.
  • a problem of a decrease in cDNA amplification efficiency is expected both when a purification step for removing unreacted oligos is performed after cDNA synthesis and when it is not performed.
  • the accuracy of therapeutic effect evaluation using expression analysis or TCR analysis, and the separation and identification of rare cells (e.g., cancer cells) by scRNA-seq analysis can be significantly improved compared to conventional methods, so that it can further contribute to suppressing waste of medical resources.
  • 1 is an outline of the steps of a liquid-phase nonTS/TAS-Seq method using a reverse transcriptase having terminal transferase activity, which is one embodiment of the present invention.
  • 1 is an outline of steps of a solid-phase TS/TAS-Seq method using a reverse transcriptase that has terminal transferase activity but does not have strand displacement activity, which is one embodiment of the present invention.
  • 1 is an outline of steps of a solid-phase TS/TAS-Seq method using a reverse transcriptase having terminal transferase activity and strand displacement activity, which is one embodiment of the present invention.
  • 1 is an outline of steps of a liquid-phase TS/TAS-Seq method using a reverse transcriptase that has terminal transferase activity but does not have strand displacement activity, which is one embodiment of the present invention.
  • 1 is an outline of steps of a liquid-phase TS/TAS-Seq method using a reverse transcriptase having terminal transferase activity and strand displacement activity, which is one embodiment of the present invention.
  • Comparison of size distributions of total cDNA amplification products using the TdT and template-switch + TdT methods in a solid-phase system (BD Rhapsody single-cell analysis system).
  • the template-switch + TdT method produces higher yields of long-stranded cDNA.
  • the template-switch + TdT method results in higher cDNA yields and longer cDNA yields.
  • the template-switch + TdT method provides improved separation of cell populations. Comparison of the number of detected genes when the number of reads was changed in each cell subset in single-cell RNA sequencing analysis data using the template-switch method and the template-switch + TdT method in a liquid-phase system (10X Chromium single-cell analysis system). In all cell populations, the template-switch + TdT method was able to detect more genes.
  • the A, T, G, and C that constitute the base sequences of target RNA capture oligos, template switching oligos, primers, adapters, nucleotide homopolymers, etc. include not only the deoxyribonucleotides that constitute DNA (A, T, G, and C of DNA), but also the ribonucleotides that constitute RNA (A, T, G, and C of RNA), and further include the corresponding nucleotide analogs (for example, bridged nucleic acids such as LNA, ENA, and PNA, and modified bases such as Super T (5-hydroxybutynl-2'-deoxyuridine), Super G (8-aza-7-deazaguanosine), deoxyinosine, 5-methyl dC, deoxyuridine, 2,6-diaminopurine, 2-aminopurine, and 2-Amino-dATP).
  • the target RNA capture oligo e.g., the target capture portion, the first adapter portion, the barcode portion, and any other portion
  • the template switching oligo the 3'-end portion capable of hybridizing with the additional sequence, the second adapter portion, the barcode portion, and any other portion
  • the nucleotide homopolymer the second strand synthesis primer (e.g., the complementary homopolymer portion, the second adapter portion, the barcode portion, and any other portion)
  • each primer used in the nucleic acid amplification step may contain one or more monomers (e.g., about 1 to 15, about 1 to 12, or about 1 to several) selected from ribonucleotides and nucleotide analogs.
  • everal means a plurality of 2 to 9.
  • “1 to several” can be 1 to 9, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, or 1 to 2.
  • a primer targeting a certain region X means a primer that hybridizes specifically to this region X or its complementary strand.
  • a primer that targets region X includes a primer that contains a sequence identical to region X or a sequence complementary thereto.
  • primer set in region X which means a primer that hybridizes specifically to region X or its complementary strand, and includes a primer that contains a sequence identical to region X or a sequence complementary thereto.
  • complementary DNA strand and cDNA refer to a DNA strand consisting of a base sequence complementary to a target RNA, and are not limited to a DNA strand consisting of a sequence complementary to an mRNA.
  • oligonucleotide or oligo refers to a single-stranded polynucleotide with a relatively short chain length.
  • the chain length of an oligonucleotide is typically several tens of bases to about 200 bases, for example, about 50 bases to 150 bases, but is not limited to this.
  • terminal transferase activity refers to the activity of terminal deoxynucleotidyl transferase to add nucleotides to the 3' end of a nucleotide chain in a template-independent manner.
  • the 3' end of a single-stranded nucleotide, the 3' overhanging end of a double-stranded nucleotide, and the 3' end of a blunt end of a double-stranded nucleotide are targets for nucleotide addition by the terminal transferase activity.
  • the target RNA includes various RNAs including polyA RNA.
  • PolyA RNA is RNA having a polyA tail at the 3' end, and the most typical example is mRNA.
  • the cells from which the target RNA is derived are not particularly limited, and various cells are the target, such as cells derived from individual mice, various cultured cells, cells derived from healthy individuals, cells derived from cancer patients, and cells derived from patients with various diseases.
  • Cells derived from cancer patients may be cells derived from cancer patients undergoing cancer immunotherapy.
  • Cells derived from healthy individuals or patients may be cells collected from peripheral blood or diseased areas (e.g., tumors).
  • the amplification method of the present invention is used in an analysis method such as transcriptome analysis, cells may be used as samples, or cell nuclei isolated from various cells may be used as samples.
  • the complementary DNA strand amplification method of the present invention includes a target RNA capture step, a complementary strand synthesis step, an unreacted oligo removal step, an RNA degradation step, a homopolymer addition step, a second strand synthesis step, and a nucleic acid amplification step.
  • the amplification method of the present invention includes an embodiment in which the reverse transcription reaction is carried out in the coexistence of a template switching oligo in the complementary strand synthesis step, and a template switching (TS) reaction is carried out, and an embodiment in which the reverse transcription reaction is carried out in the absence of a template switching oligo.
  • TS template switching
  • the former embodiment will be referred to as the TS/TAS-Seq method, and the latter embodiment as the nonTS/TAS-Seq method.
  • the TS/TAS-Seq method is more preferable.
  • the nonTS/TAS-Seq method is preferable when the TS reaction produces significantly undesirable products (for example, strand invasion products by the template switching oligo, cDNA reverse complementary strand products resulting from mispriming to the synthesized cDNA, etc.).
  • the target RNA capture step involves a solid-phase system in which the target RNA is captured by a target RNA capture oligo bound to a solid phase such as beads, and a liquid-phase system in which the target RNA is captured by a free target RNA capture oligo that is not bound to a solid phase.
  • Figure 1 is an overview of the liquid-phase nonTS/TAS-Seq method.
  • Figures 2 to 5 are overviews of the TS/TAS-Seq method, with Figures 2 and 3 showing the solid-phase system and Figures 4 and 5 showing the liquid-phase system.
  • Target RNA capture process (Step 1 in Figures 2 and 3) In the target RNA capture step of the solid-phase TS/TAS-Seq method, the target RNA is captured by a target RNA capture oligo bound to a solid-phase carrier. The target RNA is captured on the solid-phase carrier via the target RNA capture oligo. As described below, the target RNA capture step is carried out in a microwell or microdroplet, or in a solution that does not fall under these.
  • the solid phase carrier may be beads or a plate such as a slide glass.
  • single cell analysis systems using bead solid phase carriers include the BD Rhapsody system (Patent Document 3) from Beckton Dickinson, which uses plates with microwells, the Seq-well system (Non-Patent Document 12), and the Nx1-seq system (Patent Document 5, Non-Patent Document 14), as well as the Drop-seq method (Non-Patent Document 13) that captures mRNA in microdroplets and the Nadia system from Dolomite Bio.
  • a spatial transcriptomics platform which uses a plate as a solid-phase support, in which a tissue sample is permeabilized on a plate with aligned and immobilized target capture oligos, and the mRNA released from each cell in the tissue sample is captured by the capture oligos on the plate.
  • a tissue sample is permeabilized on a plate with aligned and immobilized target capture oligos, and the mRNA released from each cell in the tissue sample is captured by the capture oligos on the plate.
  • the material of the beads is not particularly limited, and various materials used for nucleic acid capture carriers in nucleic acid analysis kits and solid-phase particle carriers in immunoassay kits can be used.
  • bead materials include organic polymer beads such as resin beads such as polystyrene and polypropylene, semiconductor beads such as quantum dots (semiconductor nanoparticles) made of semiconductor materials such as cadmium selenide (CdSe), zinc sulfide (ZnS), cadmium sulfide (CdS), zinc selenide (ZnSe), and zinc oxide (ZnO), metal beads such as gold, and polymer beads such as silica beads.
  • organic polymer beads such as resin beads such as polystyrene and polypropylene
  • semiconductor beads such as quantum dots (semiconductor nanoparticles) made of semiconductor materials such as cadmium selenide (CdSe), zinc sulfide (ZnS), cadmium sulfide (C
  • beads made of materials such as cellulose, cellulose derivatives, acrylic resins, glass, silica gel, polystyrene, gelatin, polyvinylpyrrolidone, copolymers of vinyl and acrylamide, divinylbenzene cross-linked polystyrene (see Merrifield Biochemistry 1964,3,1385-1390), polyacrylamide, latex gel, polystyrene, dextran, rubber, silicon, plastic, nitrocellulose, cellulose, natural sponge, silica gel, glass, metal plastic, cellulose, cross-linked dextran (e.g. Sephadex (trade name)), and agarose gel (Sepharose (trade name)). Either non-magnetic or magnetic materials may be used, but magnetic beads are preferred as they are easier to handle.
  • materials such as cellulose, cellulose derivatives, acrylic resins, glass, silica gel, polystyrene, gelatin, polyvinylpyrrolidone, copolymers of vinyl and acrylamide, divinylbenzene
  • the material of the plate is not particularly limited, and various materials used for microarray substrates can be used.
  • a typical example of a material that can be used is glass, but other materials such as silicon and plastic can also be used.
  • the solid-phase carrier that is a plate includes various plate-like solid-phase carriers with flat or uneven surfaces, such as microwell plates with aligned microwells, plates used as substrates for microarrays, and flow cells for sequencers.
  • the target RNA capture oligos are usually immobilized in multiple compartments on the plate (typically aligned and immobilized in spots).
  • One embodiment of the target RNA capture process in a solid-phase system is to extract RNA from an individual cell in a microwell or microdroplet using an scRNA-seq analysis platform using solid-phase beads, and then bring the RNA into contact with a bead carrier to which a target RNA capture oligo is bound, thereby capturing polyA RNA or mRNA as the target RNA on the beads in the microwell or microdroplet.
  • micro in the terms microwell and microdroplet typically means that the volume is about 5 to 100 pl.
  • Examples of general methods of the scRNA-seq analysis platform using solid-phase beads are as described above, and examples include the BD Rhapsody system (Patent Document 3), Seq-well system (Non-Patent Document 12), and Nx1-seq system (Patent Document 5, Non-Patent Document 14) from Beckton Dickinson that use plates with microwells, the Drop-seq method (Non-Patent Document 13) that captures mRNA in microdroplets, and the Nadia system from Dolomite Bio, and these general methods can be preferably used in the present invention.
  • target RNA capture process in a solid-phase system is to use a spatial transcriptomics platform to permeabilize a tissue sample on a plate on which target RNA capture oligos are aligned and immobilized, and capture polyA RNA or mRNA eluted from each cell of the tissue sample with the capture oligos on the plate.
  • a spatial transcriptomics platform to permeabilize a tissue sample on a plate on which target RNA capture oligos are aligned and immobilized, and capture polyA RNA or mRNA eluted from each cell of the tissue sample with the capture oligos on the plate.
  • Stereo-seq system Chien et al. Cell 2022 185, 1777-1792. doi: 10.1016/j.cell.2022.04.003.
  • Another embodiment of the target RNA capture process in a solid-phase system is to prepare a polyA RNA sample or an mRNA sample from a cell sample such as a diseased tissue specimen or a cell suspension, and capture the polyA RNA on a solid-phase carrier by contacting the polyA RNA sample or the mRNA sample with a solid-phase carrier to which a polyA RNA capture oligo is bound.
  • the target RNA is captured in a solution whose volume does not meet the above-mentioned definition of "micro”.
  • the polyA RNA sample or the mRNA sample may be prepared by first extracting total RNA from the cell sample and then extracting the polyA RNA or the mRNA, or the polyA RNA or the mRNA may be extracted directly from the cell sample without first extracting total RNA.
  • the target RNA in the TS/TAS-Seq method includes polyA RNA. Only polyA RNA may be targeted, or RNA other than polyA RNA may also be targeted. That is, in the TS/TAS-Seq method, the target RNA capture oligo may include a target polyA RNA capture oligo, and may also include a target RNA capture oligo that captures RNA other than polyA RNA. In addition to the target RNA capture oligo, a target capture oligo that captures a nucleic acid molecule other than RNA may be further included.
  • RNA capture oligos may be immobilized on the solid phase, and a target capture oligo that captures a nucleic acid molecule other than RNA may be further immobilized.
  • An example of a target capture oligo that captures a nucleic acid molecule other than RNA is an oligonucleotide that captures a labeled oligo DNA in an scRNA-seq analysis technique that uses an oligo DNA labeling antibody in combination, such as TotalSeq by BioLegend.
  • a technique that combines such an oligo DNA labeling antibody with the TdT method is also known (Patent Document 2).
  • a target capture oligo that captures a nucleic acid molecule other than RNA is an oligonucleotide that captures a DNA fragment recombined by Tn5 transposase in a single-cell chromatin structure analysis technique that also uses Tn5 transposase.
  • the solid phase is beads
  • multiple types of capture oligos may be immobilized on one bead, or multiple types of capture oligos may each be immobilized on different beads.
  • the solid phase is a plate, multiple types of capture oligos may be immobilized in one compartment, or multiple types of capture oligos may each be immobilized in different compartments.
  • a typical example of a target polyA RNA capture oligo is an oligonucleotide that contains a polyT portion as the target capture portion, and captures the polyA portion of the target RNA.
  • target RNA capture oligos that capture portions other than polyA include oligonucleotides that contain a random sequence of 6 to 15 bases as the target capture portion, and oligonucleotides that contain a sequence complementary to a desired region in a specific RNA sequence (e.g., the T cell receptor constant region, the B cell receptor constant region, or a region near the 5' end of the RNA) as the target capture portion.
  • the target RNA capture oligo has a 5' end that is directly or indirectly bound to a solid phase support, and a target capture portion at the 3' end.
  • the oligo may contain a first adaptor portion on the 5' side of the target capture portion, i.e., on the solid phase support side.
  • the portion shown as Universal 1 in Figures 2 and 3 is the first adaptor portion.
  • the first adaptor portion is the region where one of the primers is set in the nucleic acid amplification process.
  • the target RNA capture oligo may also include a barcode portion between the first adaptor portion and the target capture portion for identifying an individual solid phase carrier or a position on the solid phase carrier.
  • This barcode portion is a bead identification barcode when the solid phase carrier is a bead, and a compartment identification barcode for identifying which compartment on the plate the solid phase carrier is immobilized in when the solid phase carrier is a plate. That is, the target RNA capture oligo may include, from the 5' side to the 3' side, the first adaptor portion, the bead or compartment identification barcode portion, and the target capture portion.
  • the complementary DNA strand amplified in the nucleic acid amplification step includes a barcode sequence derived from the identification barcode portion.
  • the bead identification barcode portion has the same sequence on the same bead and a different sequence for each bead. This allows cDNA derived from mRNA captured on the same bead to be distinguished from cDNA derived from mRNA captured on other beads. In scRNA-seq analysis, cDNA derived from the same cell can be distinguished from cDNA derived from other cells.
  • Such immobilized polyA RNA capture oligos containing bead identification barcode portions can be prepared by known methods (see, for example, WO 2015/166768 A1).
  • compartment identification barcode portion has the same sequence within the same compartment (spot) on the plate, but has a different sequence for each compartment (spot). This makes it possible to determine, for example, if the sample is a tissue specimen, what kind of mRNA is expressed in which part of the tissue.
  • FIGS 2 and 3 show an embodiment in which the solid phase is a bead, the target RNA capture oligo is a target polyA RNA capture oligo containing a polyT portion as the target capture portion, and mRNA is captured as the target polyA RNA (the polyT portion of the capture oligo is partially omitted in the figures).
  • the capture of one mRNA molecule on one bead carrier is shown, but in reality, a large number of mRNA molecules are captured on one bead carrier.
  • mRNA capture oligo if it contains polyA.
  • A-2. Complementary strand synthesis process (Step 2 in Figures 2 and 3) After the target RNA capture step, the solid phase carrier is washed, and the complementary strand synthesis step is carried out in a state in which the target RNA is captured on the solid phase carrier.
  • a reverse transcriptase having terminal transferase activity is used to carry out a reverse transcription reaction in the presence of a template switching oligo, thereby carrying out the reverse transcription reaction and the template switching reaction simultaneously (in one step).
  • the timing of adding the template switching oligo to the reaction system is not particularly limited, and it may be before, simultaneously with, or after the initiation of the reverse transcription reaction, or it may be added after a certain time has passed during the reverse transcription reaction.
  • the reverse transcription reaction and the template switching reaction themselves can be carried out in the usual manner.
  • Reverse transcriptases with terminal transferase activity are widely known, and various types are commercially available. Representative examples include wild-type MMLV RT, Thermo Fisher Scientific's SuperScript II, SuperScript IV, Maxima H minus reverse transcriptase, Takara Bio's SmartScribe reverse transcriptase, and New England Biolabs' template switching RT.
  • a DNA strand complementary DNA strand, first strand
  • a complementary sequence is synthesized from the target RNA captured on the solid phase carrier.
  • an additional sequence consisting of any number of bases is added to the 3' end of at least a portion of the synthesized complementary DNA by the terminal transferase activity of the reverse transcriptase.
  • the number of bases added is generally within the range of 1 to 5 bases, and it is known that 3 bases are often added, and that when the template RNA is a full-length mRNA with a cap structure at the 5' end, CCC is likely to be added to the 3' end of the cDNA.
  • Template switching oligos are oligonucleotides that contain a sequence at their 3' end that can hybridize with this additional sequence and contain a switching sequence on the 5' side of the sequence. Therefore, in this process, the template switching oligo hybridizes to the complementary DNA strand with the additional sequence added, and the complementary DNA strand extends to the 5' end of the template switching oligo, thereby further adding a complementary strand of the switching sequence to the 3' end of the complementary DNA.
  • the template switching oligo preferably contains an oligonucleotide containing GGG, GUG or NGG (G and U are ribonucleotide bases, N is any ribonucleotide base selected from A, U, G and C, and may contain one or more nucleotide analogs) at the 3' end as a sequence that can hybridize with the additional sequence.
  • Figures 2 and 3 show an example in which the hybridizable 3' end sequence is the ribonucleotide base GGG. Two or more types of template switching oligos with different 3' end sequences may be mixed and used.
  • the switching sequence may include a second adaptor portion.
  • the portion shown in the figure as Universal 2 is the second adaptor portion.
  • the second adaptor portion becomes the region where one of the primers is set in the subsequent nucleic acid amplification process.
  • the length of the molecular barcode is not particularly limited, but is typically about 12 to 30 bases.
  • the molecular barcode may have a structure in which a specific fixed sequence is inserted into the random base sequence to provide resistance to sequence errors.
  • the long primer used as a second-strand synthesis primer in the second-strand synthesis step may also contain a similar molecular barcode portion.
  • the 5' or 3' end (either one or both) of the switching sequence may contain chemical modifications or bases, such as amino modifications, biotin modifications, or C3 spacer modifications, to prevent polymerization of the template switching oligo.
  • Step 2 in Figures 2 and 3 when cDNA is synthesized for the entire length of mRNA on a target RNA capture oligo that has captured a full-length mRNA, CCC is added to the 3' end of the cDNA with a high probability due to the terminal transferase activity of the reverse transcriptase.
  • a template switching oligo with a 3' end sequence of GGG hybridizes to this CCC portion, the DNA-dependent DNA polymerase activity of the reverse transcriptase synthesizes a complementary strand of the switching sequence adjacent to the CCC at the 3' end of the cDNA (template switched cDNA).
  • the complementary strand of the second adaptor, Universal 2 is synthesized, but if a molecular barcode is contained between Universal 2 and rGrGrG of the template switching oligo, the molecular barcode complementary strand + Universal 2 complementary strand are synthesized following the CCC at the 3' end of the cDNA.
  • the end of the mRNA-cDNA hybrid becomes blunt, and any number of bases (indicated by NNN in the diagram) can be added to the 3' end of the cDNA strand by the terminal transferase activity of the reverse transcriptase (although there are cases where no bases are added).
  • any cDNA to which the template switching oligo does not hybridize, or any cDNA to which other bases to which the template switching oligo does not hybridize, are added to the 3' end, remain on the solid phase as cDNA that has not undergone the template switching reaction (Step 2, second row, non-switched cDNA).
  • any number of bases other than CCC are likely to be added to the end of the synthesized cDNA (although in some cases they may not be added), and such cDNA also remains on the solid phase as cDNA that has not undergone the template switching reaction (third row of Step 2, non-switched cDNA).
  • Step 2 of Figure 3 in the hybrid double-stranded template-switched cDNA and mRNA, second strand synthesis proceeds while peeling off the mRNA from the cDNA due to the strand displacement activity of the reverse transcriptase.
  • Reverse transcriptases with terminal transferase activity and strand displacement activity are also known, and various types are commercially available. Representative examples include wild-type MMLV RT, as well as Thermo Fisher Scientific's SuperScript II, SuperScript IV, Maxima H minus reverse transcriptase, Takara Bio's SmartScribe reverse transcriptase, and New England Biolabs' template switching RT.
  • Examples of general exonucleases that specifically decompose single-stranded DNA include Exonuclease I and Exonuclease T. In the present invention, at least one of such general exonucleases can be used. After exonuclease treatment, the solid phase carrier is washed and the process proceeds to the next step.
  • RNA decomposition process (Step 4 in Figures 2 and 3)
  • the mRNA of the mRNA-cDNA hybrid bound to the solid support is degraded with an RNase. If the 3'-terminal sequence of the template switching oligo is a ribonucleotide base, the 3'-terminal portion is also degraded.
  • a general RNase such as RNase H can be used, and alkaline treatment with NaOH solution, KOH solution, etc. can also be used.
  • the solid support can be washed and recovered before proceeding to the homopolymer addition step, or it can be directly proceeded to the homopolymer addition step without washing. As described below, the RNA degradation step and the homopolymer addition step can also be performed simultaneously.
  • Step 4 in Figures 2 and 3 Homopolymer addition process
  • a reaction is carried out with terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) in the presence of dATP, dTTP, dCTP, or dGTP and a chain-terminating nucleotide triphosphate (chain-terminating NTP) to add a nucleotide homopolymer to the 3' end of the complementary DNA strand synthesized on the solid phase (Step 4 in Figures 2 and 3; an example of polyC is shown in the figure).
  • a nucleotide homopolymer is added to both template-switched and non-switched cDNA.
  • a chain-terminating NTP (chain-terminating ATP, chain-terminating TTP, chain-terminating CTP, or chain-terminating GTP) is a nucleotide that has been modified or altered so that the OH group at the 3' position of the nucleotide cannot form a phosphate ester bond with the 5'-phosphate moiety of another nucleotide molecule, and can also be called a nucleotide triphosphate that does not have an OH group at the 3' position (the atomic group bound to the 3' position does not contain an OH group).
  • ddNTPs dideoxynucleotide triphosphates
  • ddNTP derivatives typically ddNTPs modified at the 3' position with an atomic group that does not have an OH group, e.g., ddNTPs modified at the 3' position with an azide group or an amino group, such as 3'-Azido-ddATP, 3'-Azido-ddCTP, 3'-Azido-ddGTP, 3'-Azido-ddTTP, 3'-Azido-ddUTP, 3'-Amino-ddATP, 3'-Amino-ddCTP, 3'-Amino-ddGTP, 3'-Amino-ddTTP, etc.), 3'-deoxyn
  • the base chains of the chain-terminating NTP and the substrate (dNTP) forming the homopolymer used are the same. Since the minimum homopolymer length required for the second strand synthesis reaction, the necessary length of the 3'-terminal homopolymer portion of the primer used for second strand synthesis, and the chain length of the by-product derived from the free primer can be particularly desirably suppressed, it is preferable to perform polyC addition or polyG addition by using, for example, a combination of chain-terminating CTP such as ddCTP + dCTP, or chain-terminating GTP such as ddGTP + dGTP.
  • the cytosine base added to the 3'-end of the cDNA strand for the full-length mRNA during the TS reaction can also be counted as a homopolymer site, so it is particularly preferable to perform polyC addition by using a combination of chain-terminating CTP + dCTP.
  • the amount of chain-terminating NTPs added should be about 1:10 to 1:100 in terms of the ratio to dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, or dGTP), and can be, for example, 1:10 to 1:80, 1:10 to 1:60, 1:10 to 1:40, 1:15 to 1:80, 1:15 to 1:60, or 1:15 to 1:40.
  • the amount of other chain-terminating NTPs used can also be set according to this ratio.
  • the reaction time must be strictly controlled in order to control the chain length of homopolymers, depending on the difference in activity between enzyme lots and the amount of substrates such as primers and cDNA.
  • the homopolymer addition reaction by TdT is carried out in the presence of a chain-terminating NTP, and the chain-terminating NTP is incorporated stochastically to terminate the homopolymer extension reaction, thereby significantly increasing the tolerance to differences in reaction time and enzyme activity caused by TdT.
  • the homopolymer addition reaction with TdT is generally carried out in the presence of a divalent cation, which may include, but is not limited to, divalent metal cations such as Zn 2+ , Cu 2+ , Ni 2+ , Co 2+ , Mn 2+ , Mg 2+ , etc., for example, Co 2+ , Mn 2+ or Mg 2+ .
  • a divalent cation which may include, but is not limited to, divalent metal cations such as Zn 2+ , Cu 2+ , Ni 2+ , Co 2+ , Mn 2+ , Mg 2+ , etc., for example, Co 2+ , Mn 2+ or Mg 2+ .
  • RNA degradation step and the homopolymer addition step are carried out simultaneously.
  • the second strand synthesis primer used in the second strand synthesis step of the TS/TAS-Seq method includes a primer (hereinafter, long primer) that contains a complementary homopolymer portion of a sequence complementary to the nucleotide homopolymer added to the end of the first strand of the complementary DNA and contains a second adapter portion on the 5' side of the complementary homopolymer portion, and a primer (hereinafter, short primer) that does not contain a complementary homopolymer portion and contains a second adapter portion on its 3' side.
  • the template-switched cDNA derived from the full-length mRNA contains a complementary strand of the second adapter (Universal 2) derived from the template switching oligo, so both the long primer and the short primer can hybridize.
  • the primer on the inside is easier to extend, so the figure shows the state of extension from the short primer.
  • the long primer hybridizes to the non-switched complementary DNA strand, and the second strand is extended and synthesized.
  • a DNA double strand consisting of a complementary DNA (first strand) and a second strand is formed on the solid phase. If a molecular barcode is included in the template switching oligo, the molecular barcode is incorporated into the second strand synthesized in this step for the template-switched cDNA first strand.
  • the complementary homopolymer portion is present at the 3' end of the long primer.
  • the length of the complementary homopolymer portion is usually about 6 to 15 bases, for example about 7 to 13 bases, when the homopolymer tail added to the first strand of the complementary DNA is polyC or polyG, and is usually about 15 to 30 bases, for example about 18 to 25 bases, when the homopolymer tail is polyA or polyT.
  • the complementary homopolymer portion may also have an anchor sequence of about 1 to 2 bases added to its 3' end. Adding an anchor sequence can increase the probability that the long primer will anneal to the start point of the homopolymer tail added to the cDNA by TdT.
  • the second adapter contained in the long primer and the short primer is the same as the second adapter contained in the template switching oligo, and will be the region where one of the primers is set in the subsequent nucleic acid amplification process.
  • the long primer may contain a molecular barcode portion consisting of a random sequence.
  • a molecular barcode may be included between the second adapter portion and the complementary homopolymer portion.
  • the molecular barcode included in the switching sequence of the template switching oligo functions.
  • the molecular barcode carried by the long primer functions.
  • the polymerase used in the second strand synthesis step may be a general polymerase such as Taq polymerase used in normal PCR, or a polymerase known as a high-fidelity PCR enzyme or a polymerase with strand displacement activity such as Bst DNA polymerase.
  • the second strand synthesis step after thermal denaturation as necessary, only one cycle of annealing and extension reaction of the primer for second strand synthesis may be carried out, or cycles may be carried out by thermal cycling reaction. In addition, after one or multiple cycles of reaction, a follow-up reaction may be carried out using a polymerase with strand displacement activity such as Bst DNA polymerase.
  • nucleic acid amplification process (Step 6 in Figures 2 and 3) After the synthesis of the second strand, the solid phase carrier may or may not be washed before proceeding to the nucleic acid amplification step.
  • a nucleic acid amplification reaction is carried out using the double-stranded DNA synthesized on the solid phase carrier as a template (Step 6 in Figures 2 and 3). Since high accuracy is required in this nucleic acid amplification reaction, it is desirable to use a polymerase generally known as a high-accuracy PCR enzyme. Various high-accuracy PCR enzymes are commercially available.
  • the nucleic acid amplification reaction may be carried out directly by adding additional nucleic acid amplification reaction solution to the solid phase carrier without washing it.
  • a nucleic acid amplification reaction can be carried out with a set of primers set for those adaptors.
  • the mRNA expressed in each cell is comprehensively reverse transcribed and amplified, so it is common to carry out total cDNA amplification with a primer set targeting the first and second adaptors.
  • the primer set is typically a set of a primer consisting of the first adaptor sequence and a primer consisting of the second adaptor sequence, but it is acceptable for the primer set to include any additional sequence or modification with biotin or the like on the 5' side.
  • a nucleic acid amplification reaction may be carried out using a primer targeting a desired region in the complementary DNA strand instead of a primer targeting the first adaptor.
  • a nucleic acid amplification reaction can be carried out using a primer targeting the second adaptor and a primer targeting a desired region in the complementary DNA strand (e.g., a primer targeting a TCR constant region).
  • the nucleic acid amplification reaction itself may be carried out as a PCR reaction in the usual manner. If desired, one or more stages of PCR reaction may be carried out.
  • both primers may be bound to spacers such as biotin or amine at their 5' ends, which makes it easier to recover the DNA fragments to be sequenced.
  • Target RNA capture process (Step 1 in Figures 4 and 5)
  • the target RNA is captured by a free target RNA capture oligo that is not bound to a solid-phase carrier.
  • the target RNA capture step can be performed in a microwell or microdroplet, or in a solution that does not fall under these.
  • Liquid-phase analysis techniques include, for example, the 10X Chromium system (Patent Document 4) from 10X Genomics, which encapsulates hydrogel beads containing mRNA capture oligos and a single cell in a microdroplet, melts the hydrogel and dissolves the cell in the microdroplet, and captures the mRNA with the released mRNA capture oligos; Smart-Seq2 (Non-Patent Document 15), which dispenses individual cells or trace amounts of mRNA into a 96-well plate for amplification; and sci-RNA-seq3, which suspends fixed cells in a solution containing a cell membrane permeabilization reagent and mRNA capture oligos, and captures the mRNA on the mRNA capture oligos within the fixed cells.
  • the liquid-phase TS/TAS-Seq method can be applied to any of these known transcriptome analysis techniques.
  • One embodiment of the target RNA capture process in a liquid phase system is to encapsulate target RNA capture oligos in beads made of a material (such as hydrogel) that can melt under mild conditions such as room temperature, encapsulate the beads and cells in a 1:1 ratio in microdroplets or add them to microwells, and then melt the beads and lyse the cells in the microdroplets or microwells to capture target RNA such as mRNA on the target RNA capture oligos.
  • a material such as hydrogel
  • Another embodiment is one in which a target RNA capture oligo is added to a solution containing a cell lysate or RNA extracted from cells, and target RNA such as mRNA is captured on the capture oligo in the solution.
  • This embodiment includes a method in which individual cells or mRNA extracted from them are dispensed into a microwell and target RNA such as mRNA is captured on the target RNA capture oligo in the microwell, a method in which individual cells are trapped in a microdroplet and target RNA is captured on the target RNA capture oligo in the microdroplet, and a method in which target RNA is captured on the target RNA capture oligo in a solution that does not fall into a microvolume.
  • fixed cells are suspended in a solution containing a cell membrane permeation reagent and a target RNA capture oligo, and target RNA such as mRNA is captured on the target RNA capture oligo within the fixed cells.
  • the target RNA also includes polyA RNA in the liquid-phase TS/TAS-Seq method. Only polyA RNA may be targeted, or RNA other than polyA RNA may also be targeted. That is, in the TS/TAS-Seq method, the target RNA capture oligo includes a target polyA RNA capture oligo, and may also include a target RNA capture oligo that captures RNA other than polyA RNA. In addition to the target RNA capture oligo, it may further include a target capture oligo that captures a nucleic acid molecule other than RNA as a target. When capturing the target RNA in a microwell or microdroplet, multiple types of capture oligos may be contained in one microwell or microdroplet, or multiple types of capture oligos may be contained in different microwells or microdroplets.
  • Typical examples of target polyA RNA capture oligos and examples of target RNA capture oligos that capture sites other than polyA are the same as those in the solid-phase TS/TAS-Seq method.
  • Step 1 of Figures 4 and 5 not only full-length mRNAs with a 5' cap structure, but also "non-full-length mRNAs" such as incomplete length mRNAs without a cap structure, immature mRNAs, and partially degraded mRNAs, can be captured by target polyA RNA capture oligos that have a T portion as the target capture portion, as long as they have polyA.
  • the target RNA capture oligo has a target capture portion at the 3' end.
  • the 5' side of the target capture portion may contain a first adapter portion (shown as Universal 1 in Figures 4 and 5) that can be used as a primer setting region in the nucleic acid amplification process, and may contain a cell identification barcode portion between the first adapter portion and the target capture portion for identifying the individual cell from which the target RNA is derived.
  • This cell identification barcode is a barcode that corresponds to the bead identification barcode portion and the compartment identification barcode portion in a solid-phase system.
  • the target RNA capture oligo that will be encapsulated together with one cell in the same microwell or microdroplet has a cell identification barcode with the same sequence, and the sequence of the cell identification barcode differs for each microwell or microdroplet. This makes it possible to distinguish cDNA derived from mRNA captured by the capture oligo in the same microwell or microdroplet from cDNA derived from mRNA captured in another microwell or microdroplet, and thus to distinguish cDNA derived from the same cell from cDNA derived from other cells.
  • Step 2 in Figures 4 and 5 Complementary strand synthesis process
  • the complementary strand synthesis step is continued without purification, etc.
  • a reverse transcriptase with terminal transferase activity and a template switching oligo are added to the reaction solution after the target RNA capture, and the reverse transcription reaction and TS reaction are carried out in one step.
  • the details of this process and the structure of the template switching oligo are the same as in solid-phase TS/TAS-Seq.
  • the first row of Step 2 in Figures 4 and 5 is the template-switched cDNA. cDNA that was synthesized for the entire length of full-length mRNA but to which the template switching oligo did not hybridize (second row of Step 2 in Figures 4 and 5), cDNA that was synthesized for the entire length of non-full-length mRNA and to which the template switching oligo did not hybridize (third row of Step 2), and cDNA whose synthesis stopped midway (fourth row of Step 2) remain in the reaction solution as cDNA that did not undergo the template switching reaction.
  • Step 2 of Figure 5 When a reverse transcriptase that has strand displacement activity in addition to terminal transferase activity is used, as shown in Step 2 of Figure 5, in the hybrid double-stranded template-switched cDNA and mRNA, second-strand synthesis proceeds while peeling off the mRNA from the cDNA due to the strand displacement activity of the reverse transcriptase.
  • Unreacted oligo removal process (Step 3 in Figures 4 and 5)
  • the reaction solution after the completion of complementary strand synthesis can be purified by nucleic acid size fractionation to separate and remove the unreacted target RNA capture oligos with very short chain length from the complementary DNA strand (mRNA-cDNA hybrid).
  • Unreacted template switching oligos can also be removed in one step together with the unreacted capture oligos.
  • Purification methods by nucleic acid size fractionation are well known and can be carried out in the usual manner, such as purification by a silica membrane column or purification using magnetic beads to which DNA is bound.
  • the nucleic acid size fractionation may be combined with removal by exonuclease, which can further increase the efficiency of removing the unreacted oligos.
  • exonuclease A general exonuclease that specifically degrades single-stranded DNA can be used, and examples of such an exonuclease include Exonuclease I and Exonuclease T.
  • Exonuclease can also be removed at the same time by adding exonuclease to the reaction solution after the completion of complementary strand synthesis and performing purification by nucleic acid size fractionation after the reaction.
  • RNA degradation process (Step 4 in Figures 4 and 5) After purification by size fractionation, an RNase is added to the reaction solution to degrade the mRNA of the mRNA-cDNA hybrid in the reaction solution and the 3'-terminal sequence of the template switching oligo (if the sequence is a ribonucleotide base).
  • reagents such as dNTPs, chain-terminating NTPs and TdT may be added to the reaction solution to carry out the next homopolymer addition step, but it is preferable to add RNA enzyme and these reagents to the reaction solution simultaneously or sequentially to carry out RNA degradation and homopolymer addition simultaneously. If an alkaline solution such as NaOH or KOH is used in the RNA degradation step, the reaction solution is neutralized after the degradation reaction with the alkaline solution before carrying out the TdT reaction.
  • an alkaline solution such as NaOH or KOH
  • Step 4 in Figures 4 and 5 A TdT-catalyzed reaction is carried out in the presence of dATP, dTTP, dCTP, or dGTP and a chain-terminating NTP to add a homopolymeric nucleotide to the 3' end of the complementary DNA strand (Step 4 in Figures 4 and 5; an example of polyC is shown in the figure). Details of this step, such as the preferred example of the chain-terminating NTP and the ratio of dNTPs and chain-terminating NTPs added, are the same as those of solid-phase TS/TAS-Seq, except for the points described below.
  • Figure 5 shows an embodiment in which the reverse transcriptase used in the complementary strand synthesis step further has strand displacement activity.
  • the second strand of the template-switched cDNA (the strand indicated by an asterisk in Step 4) is synthesized in the complementary strand synthesis step, a double-stranded DNA consisting of the first and second strands of cDNA is present in the reaction solution at the start of the homopolymer addition step, and both ends of this double-stranded DNA are blunt or have 3' overhanging ends (see the first row of Step 2 in Figure 5). Therefore, in this double-stranded DNA, homopolymers can be added not only to the 3' end of the template-switched first strand of cDNA, but also to the 3' end of the second strand.
  • Second strand synthesis step (Step 5 in Figures 4 and 5)
  • the reaction solution after RNA degradation and homopolymer addition is purified to remove reagents such as RNase and TdT, and then the second strand synthesis step is carried out.
  • the second strand synthesis step of the liquid-phase TS/TAS-Seq is carried out using second strand synthesis primers including a long primer and a short primer, as in the solid-phase system.
  • the composition and preferred conditions of each primer, as well as the details of this step, are the same as those of the solid-phase TS/TAS-Seq, except for the points described below.
  • the second strand (the strand marked with an asterisk) synthesized in the complementary strand synthesis step for the template switched cDNA may also have a homopolymer at the 3' end, so a reaction may occur in which the long primer hybridizes to the homopolymer of this strand and is extended, as shown in the dashed box in Step 5.
  • the DNA strand generated by this extension reaction does not contain the adapter sequence required for PCR amplification at its 5' end, so if primers targeting the first and second adapters are used in the subsequent nucleic acid amplification step, the DNA strand will not be amplified.
  • Step 6 Nucleic acid amplification process
  • the reaction solution is purified as necessary to remove excess primers and reagents such as polymerase, and the nucleic acid amplification step is then carried out.
  • This step in the liquid phase system can be carried out in the same manner as in the solid phase system TS/TAS-Seq.
  • nonTS/TAS-Seq method ( Figure 1) Although an example of a liquid phase system is shown in Fig. 1, a solid phase system can also be used.
  • the reverse transcription reaction is carried out in the absence of a template switching oligo, and terminal transferase is used as the reverse transcriptase.
  • the nonTS/TAS-Seq method can be carried out in the same manner as the TS/TAS-Seq method, except that strand displacement activity is not required.
  • strand displacement activity is not required.
  • Target RNA capture process (Step 1 in Figure 1)
  • the main target RNA is mRNA, which is polyA RNA, and it is generally preferred that the target RNA capture oligo contains a target polyA RNA capture oligo.
  • the TS reaction using CCC addition to cDNA for full-length mRNA is not used in combination, the effects of this method can be obtained even when nonTS/TAS-Seq is performed only for non-polyA RNA. Therefore, in the nonTS/TAS-Seq method, it is not essential that the target RNA capture oligo contains a target polyA RNA capture oligo.
  • Step 2 in Figure 1 In the complementary strand synthesis step, a reverse transcription reaction is carried out in the absence of a template switching oligo using a reverse transcriptase having terminal transferase activity, whereby a complementary DNA strand for the mRNA captured by the immobilized or free target RNA capture oligo is synthesized, and any number of bases are added to the 3'-end of at least a part of the complementary DNA strand.
  • Step 3 in Figure 1 In the case of a solid phase system, the reaction can be carried out in the same manner as in A-3, and in the case of a liquid phase system, the reaction can be carried out in the same manner as in B-3.
  • RNA degradation process (Step 4 in Figure 1)
  • the reaction can be carried out in the same manner as in A-4, and in the case of a liquid phase system, the reaction can be carried out in the same manner as in B-4.
  • Homopolymer addition process (Step 4 in Figure 1)
  • the procedure can be the same as that of A-5, and in the case of a liquid phase system, the procedure can be the same as that of B-5.
  • the homopolymer addition step may be performed after RNA degradation, or RNA degradation and homopolymer addition may be performed simultaneously.
  • Second strand synthesis process (Step 5 in Figure 1)
  • the primers used for second strand synthesis include long primers. Short primers are not necessary.
  • Nucleic acid amplification process (Step 6 in Figure 1) It can be carried out in the same manner as the nucleic acid amplification reaction in the liquid-phase and solid-phase TS/TAS-Seq methods.
  • the complementary DNA strand amplified by the method of the present invention may be subjected to processing such as fragmentation, end repair, A-tailing, and addition of a sequencing adapter in order to be subjected to sequencing by a next-generation sequencer.
  • processing such as fragmentation, end repair, A-tailing, and addition of a sequencing adapter in order to be subjected to sequencing by a next-generation sequencer.
  • processing steps a library of cDNA processed into a sequencing construct is obtained. Ultrasound or enzymes can be used as a fragmentation method.
  • Sequencing constructs can be created using commonly used reagents, and representative examples of the enzymatic method include the NEBNext UltraII FS kit from New England Biolabs and the KAPA HyperPlus kit from KAPA Biosystems, and machines such as Covaris and Bioruptor can be used as ultrasonic fragmentation devices, but other equivalent products can also be used.
  • the sequencing adapter an appropriate adapter can be used depending on the next-generation sequencer to be used.
  • the library may be sequenced using a sequencer generally known as a next-generation sequencer.
  • next-generation sequencers that may be preferably used include Illumina's Novaseq 6000 system, Novaseq X system, Hiseq system, Nextseq system, Nextseq2000 system, Nextseq3000 system, and MiSeq system; MGI's DNBseq T7 system, DNBseq G400 system, and DNBseq G40 system; and Thermo Fisher Scientific's Ion S5/Ion S5 XL system.
  • PBMCs Human peripheral blood mononuclear cells
  • the number of cells was counted using a flow cytometer, and the cells and beads were loaded at an appropriate density into a microwell cartridge according to the Rhapsody specifications, the cells were lysed, and each cell-derived mRNA was trapped on one bead (including a Rhapsody universal adapter as a polyA RNA capture oligo) (target RNA capture step).
  • the Rhapsody universal adapter immobilized on the beads is DNA with the following structure, and CLS1 (cell label section 1) to CLS3 each have 96 known unique sequences consisting of 9 bases, for a total of 288 types, constituting a total of approximately 900,000 bead identification barcodes. In sequence ID No.
  • CLS1 to CLS3 are represented as NNNNNNNNN.
  • Each of the four beads that trapped mRNA was divided into two (a total of eight), four of which were subjected to the TAS-Seq method, and the remaining four were subjected to reverse transcription and cDNA amplification using the cDNA amplification method of the present invention.
  • the polyA RNA capture beads were subjected to reverse transcription as recommended by the manufacturer (complementary strand synthesis step, using a reverse transcriptase with terminal transferase activity and strand displacement activity), and then unreacted polyA RNA capture oligos on the beads were removed by Exonuclease I treatment (unreacted oligo removal step).
  • dCTP and ddCTP as the terminator, mRNA degradation by RNase H and homopolymer addition reaction by TdT were simultaneously performed for 20 minutes.
  • second strand synthesis reaction was performed using a primer with a guanine homopolymer at the 3' end of the universal 2 adaptor sequence and a high-fidelity DNA polymerase.
  • the reaction solution was subjected to 9 cycles of PCR amplification of all cDNA using primers for universal 1 and universal 2 sequences (universal oligo-long, 5'BDWTAv2).
  • primers for universal 1 and universal 2 sequences universal oligo-long, 5'BDWTAv2
  • the cDNA was further amplified by 5 cycles of PCR.
  • the final cDNA amount was measured using a Qubit fluorometer or nanodrop spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific), and the size distribution of cDNA was measured using a MultiNA system (Shimadzu Corporation).
  • the above polyA RNA capture beads were subjected to reverse transcription reaction at 42°C for 30 minutes using the reagents provided by the manufacturer, and then template switching oligo (5'BDWTAv2-TSO) and MgCl2 were added and reverse transcription and template switching reaction were performed at 42°C for 30 minutes (complementary strand synthesis step). Then, unreacted polyA RNA capture oligo on the beads was removed by Exonuclease I treatment (unreacted oligo removal step). Using dCTP and ddCTP as a terminator, mRNA degradation by RNaseH and homopolymer addition reaction by TdT were performed simultaneously for 20 minutes.
  • a second strand synthesis reaction was performed using a primer having a guanine homopolymer at the 3' end of the universal 2 adapter sequence and a highly accurate DNA polymerase.
  • the reaction solution was subjected to 9 cycles of PCR amplification of all cDNA using primers for universal 1 and universal 2 sequences (universal oligo-long, 5'BDWTAv2).
  • primers for universal 1 and universal 2 sequences universal oligo-long, 5'BDWTAv2
  • AmPure XP beads (Beckman Coulter)
  • the cDNA was amplified by five additional cycles of PCR.
  • the final cDNA amount was measured using a Qubit fluorometer or nanodrop spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific), and the cDNA size distribution was measured using a MultiNA system (Shimadzu Corporation).
  • a cDNA synthesis reagent containing a cell lysis reagent and a reverse transcription reagent (a reverse transcriptase with terminal transferase activity and strand displacement activity was used) was simultaneously loaded, but for comparison, samples with and without template switching oligo (10X Chromium-TSO) were prepared.
  • samples with and without template switching oligo (10X Chromium-TSO) were prepared.
  • mRNA from each cell was trapped on a polyA RNA capture oligo (10X Chromium adapter) released from the hydrogel (target RNA capture step), and reverse transcription reaction, or reverse transcription reaction and TS reaction were performed in the microdroplet at 37°C or 53°C for 1 hour (complementary strand synthesis step).
  • the 10X Chromium adapter is a DNA having the following structure, and CB is a known identification barcode consisting of 16 bases and has approximately 900,000 combinations. In sequence number 5 of the sequence table, CB is shown as NNNNNNNNNNNN. ⁇ Structure of 10X Chromium adapter> CTACACGACGCTCTTCCGATCT- (CB) NNNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN (SEQ ID NO: 5)
  • the resulting cDNA solution was used to simultaneously degrade mRNA with RNase H and homopolymer addition reaction with TdT using dCTP and ddCTP as a terminator for 20 minutes.
  • second strand synthesis reaction was carried out using a primer with a guanine homopolymer at the 3' end of the universal 2 adapter sequence and a high fidelity DNA polymerase.
  • the reaction solution was subjected to 9 cycles of PCR amplification of all cDNA using primers for the universal 1 and universal 2 sequences (universal oligo-long, 5'BDWTAv2).
  • the resulting cDNA was further amplified by 5 cycles of PCR.
  • the final cDNA amount was measured using a nanodrop spectrophotometer, and the cDNA size distribution was measured using a MultiNA system.
  • cDNA was purified by nucleic acid size fractionation using Pronex beads (Promega) (unreacted oligo removal step). Total cDNA from 3 samples was amplified by 11 cycles of PCR using 5'BDWTAv2 and 3'WTA primers, and purified by AmPure XP. The remaining three samples were subjected to simultaneous mRNA degradation by RNase H and homopolymer addition by TdT for 20 min using dCTP and ddCTP as a terminator.
  • Second strand synthesis was performed using a primer with a guanine homopolymer at the 3' end of the universal 2 adaptor sequence and a highly accurate DNA polymerase.
  • the reaction solution was amplified for 11 cycles by PCR using primers for the universal 1 and universal 2 sequences (5'BDWTAv2 and 3'WTA primer), and purified by AmPure XP.
  • the final cDNA amount was measured by Qubit Fluorometer, the relative contents of Actb and Rps3 genes in the cDNA were measured by quantitative real-time PCR (qPCR), and the size distribution of cDNA was measured by MultiNA system.
  • the results of a comparison of representative cDNA distributions are shown in Figure 10.
  • the cDNA amplification method of the present invention which performs both TS and TdT reactions, shows an increased proportion of small cDNAs of 300-700 bp in size overall, suggesting the possibility that the cDNA amplification method of the present invention may capture nucleic acids that are difficult to react with the TS reaction, such as cDNA in which reverse transcription has stopped midway through the mRNA, immature mRNA, and partially degraded mRNA.
  • the obtained sequence data was mapped to the reference sequence (GRCm38-101) to obtain gene expression data for each cell.
  • data obtained with 10X Chromium v3.1 for mouse spleen cells (TS method, accession ID: GSE192930) was downloaded from a public database. The obtained data was downsampled so that the median number of reads per cell was uniform, and the data was again mapped to the reference sequence (GRCm38-101) to obtain gene expression data for each cell.
  • RNA from each cell was trapped in a polyA RNA capture oligo (10X Chromium adapter) released from the hydrogel (target RNA capture step), and reverse transcription and TS reactions were performed in the microdroplet at 53°C for 1 hour (complementary strand synthesis step, using a reverse transcriptase with terminal transferase activity and strand displacement activity).
  • complementary strand synthesis step using a reverse transcriptase with terminal transferase activity and strand displacement activity.
  • the complementary strand synthesis step was completed, the emulsion constituting the microdroplet was broken using the method recommended by 10X, and the cDNA was purified by nucleic acid size fractionation to remove unreacted polyA RNA capture oligo and template switching oligo (unreacted oligo removal step).
  • one of the libraries from each of the three samples was directly amplified by PCR using primers (universal oligo-long, 5'BDWTAv2) for universal 1 and universal 2 sequences for 9 cycles to amplify the entire cDNA.
  • primers universal oligo-long, 5'BDWTAv2
  • the obtained cDNA was further amplified by 5 cycles of PCR.
  • dCTP and ddCTP as a terminator were used, and mRNA degradation by RNaseH and homopolymer addition reaction by TdT were performed simultaneously for 20 minutes.
  • second strand synthesis reaction was performed using a primer with a guanine homopolymer at the 3' end of the universal 2 adapter sequence and a high-fidelity DNA polymerase.
  • the entire cDNA was amplified by PCR using primers (universal oligo-long, 5'BDWTAv2) for universal 1 and universal 2 sequences for 9 cycles.
  • primers universal oligo-long, 5'BDWTAv2
  • AmPure XP beads (Beckman Coulter)
  • the resulting cDNA was further amplified by five cycles of PCR.
  • sequence data was mapped to the human reference sequence using 10X Cell ranger software to obtain gene expression data for each cell.
  • the obtained data was downsampled so that the median number of reads per cell was uniform, and the data was again mapped to the human reference sequence to obtain gene expression data for each cell.
  • Figure 14 shows a comparison of the number of detected genes and the number of reads in various cell populations based on the cell clustering results.
  • the data obtained by the cDNA amplification method of the present invention (10X+TAS-Seq2) showed an increased number of detected genes per cell compared to the data obtained by the TS method alone (10X).
  • One of the major applications of single-cell transcriptome analysis is the separation and identification of cell populations and elucidation of their properties. This demonstrated the usefulness of the liquid-phase single-cell transcriptome analysis of the present invention in the separation and identification of cell populations and elucidation of their properties.
  • the amount of information per cell can be increased by 1.5-2 times compared to the conventional method.
  • the required sequence analysis cost can be reduced to 1/2-1/3 times ( Figure 14).
  • the number of analyzed cells has increased significantly in scRNA-seq analysis from tens of thousands to hundreds of thousands, but the amount of sequence analysis required per cell has not changed, so it is expected that the sequence analysis cost will become a bottleneck in scRNA-seq analysis in the future.
  • the present invention can reduce the sequence analysis cost, which is expected to account for the majority of the scRNA-seq analysis cost in the near future, by 1/2-1/3 times, improving cost-effectiveness and making a significant contribution to industrial use.

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Abstract

ごく微量の細胞サンプルからもmRNAを高い効率かつ低いバイアスで網羅的に増幅できるcDNA増幅方法が開示されている。本発明の相補DNA鎖増幅方法は、ターミナルトランスフェラーゼ活性を有する逆転写酵素を用いて液相系又は固相系で標的RNA捕捉及び相補DNA鎖合成を行い、相補DNA鎖末端にCCC等の塩基を付加した後、連鎖停止ヌクレオチド三リン酸共存下でのTdT反応によりホモポリマーテーリングを実施するステップを含む。テンプレートスイッチング反応をさらに組み合わせることで、より高い効率かつ低いバイアスで相補DNA鎖を増幅することができる。

Description

相補ＤＮＡ鎖を増幅する方法
　本発明は、微量mRNAから高感度にcDNAを増幅することを可能にする、相補DNA鎖を増幅する方法に関する。
　昨今、個々の１細胞など、微量サンプルを用いた網羅的遺伝子発現解析が行われるようになってきている。このような技術は数千～数十万の単位の個々の細胞の性質を網羅的に捉えるsingle-cell RNA-seq解析（scRNA-seq解析）を可能とし、細胞集団内の多様性の有無や、新たな細胞亜集団の同定、病態と相関した特殊な細胞集団の同定につながり、ヒトにおける１細胞レベルのアトラスを作ろうとする国際プロジェクトが2016年よりスタートしている（非特許文献１)など、これまでにない解像度での生物学の理解を推し進める原動力となっている。
　scRNA-seq解析は病態における複雑な免疫機構を解明するのに特に有用で、その代表的な微量サンプルとしては、たとえば、がん患者の診断目的で採取される原発巣・転移巣のバイオプシー検体に含まれる腫瘍浸潤T細胞や、ウイルスやそれらに対するワクチンに特異的に反応するB細胞が挙げられる。抗PD-1抗体などの免疫療法の本質である細胞障害性T細胞（Cytotoxic T Lymphocyte; CTL）の実態がCD8+ T細胞という観点から、がん抗原特異的な認識能を有するCD8+ T細胞がどの程度誘導されているかを測定する方法に注目が集まっている（非特許文献２）。また、2019年からのSARS-CoV2のパンデミック、それらに対する効果的なワクチン開発において、ウイルスに対して強い中和活性を有する抗体産生能の高いB細胞や、抗原特異的に反応するCD4/CD8 T細胞の性質を調べることに注目が集まっている。それらの測定方法の一つとして、T細胞上のT細胞受容体(T Cell Receptor; TCR)や、B細胞上のB細胞受容体（B Cell Receptor; BCR）の配列を解析して、TCR/BCRレパトア（クローンの種類と各クローンの存在頻度）を決定するとともに、同時にscRNA-seq解析を行うことで、抗原特異的なクローンの応答とその細胞の性質の差異を論じるもの(scTCR/BCR/RNA-seq)があり、実際にTCRレパトア変動と抗CD4抗体のがんに対する治療効果が相関することや、SARS-CoV2に対する複数回のワクチン接種に伴いT細胞の種類が変化することも報告されている(非特許文献３, ４)。しかしながら、こうした免疫応答を司る各細胞種の遺伝子発現が同レベルで議論されるためには、細胞のmRNA量が同等に得られることが理想であるものの、T/B細胞の含有mRNA量は、上皮細胞や腫瘍細胞、マクロファージなどと比べて大きく少ない。それゆえ、それら細胞の高解像度なscTCR/BCR/RNA-seq解析のための、検体由来の個々の１細胞由来mRNAを高感度に増幅する方法の開発の重要性はいや増している。
　微量サンプルからのcDNA増幅法には種々の技術が知られている。mRNAの捕捉及びcDNA合成が固相上で行われるか否かでcDNA増幅法を分類すると、固相ビーズ上に固定化したmRNA捕捉オリゴにより、微小ウェル又は微小液滴中でmRNAを捕捉しcDNA合成する固相系の例としては、微小ウェルを有するプレートを用いたBeckton Dickinson社のBD Rhapsodyシステム（特許文献３）、Seq-wellシステム（非特許文献１２）、及びNx1-seqシステム（特許文献５、非特許文献１４）や、微小液滴中でmRNAを捕捉するDrop-seq法（非特許文献１３）及びDolomite Bio社のNadiaシステムが挙げられる。固相に結合していない遊離のmRNA捕捉オリゴにより、微小ウェル又は微小液滴中でmRNAを捕捉しcDNA合成する液相系の例としては、mRNA捕捉オリゴが封入されたハイドロゲルビーズと１細胞を微小液滴中に封入し、微小液滴中でハイドロゲルの融解及び細胞溶解を実施し、遊離したmRNA捕捉オリゴでmRNAを捕捉する10X Genomics社の10X Chromiumシステム（特許文献４）や、96 wellプレートに個々の細胞や微量mRNAを分注して増幅を行うSmart-Seq2（非特許文献１５）が挙げられる。液相系の解析技術のさらなる例として、固定した細胞を細胞膜透過試薬及びmRNA捕捉オリゴが含まれる溶液中に懸濁し、固定細胞内でmRNAをmRNA捕捉オリゴ上に捕捉するsci-RNA-seq3などのcombinatorial indexingが挙げられる。
　また、第２鎖合成反応などの反応様式に着目して微量サンプルからのcDNA増幅法を分類すると、mRNAからcDNAを合成する際に、テンプレートスイッチングオリゴと呼ばれる、その3'末端に [グアノシン]- [グアノシン]- [グアノシン]等の塩基配列を含む数十塩基対のプライマーを添加することにより、cDNA末端に所望の塩基配列を付加するとともに第２鎖合成を行うテンプレートスイッチング(TS)法や(特許文献１、非特許文献５、非特許文献６)、合成したcDNA末端に同一塩基で構成されるポリヌクレオチド配列をターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)により付加した上で、当該ポリヌクレオチドに対し相補的な配列を3'末端に有し、既知のアダプター配列を5'末端に有するプライマーを用いて第２鎖合成を行うTdT法がある(非特許文献７～９)。
　TS法は反応ステップ数が少ないため、精製に伴うcDNAのロスが少ないというメリットの他、TS反応が主に5'キャップ構造を有するmRNAで生じるという性質上完全長cDNAが生成されやすいという長所がある。一方で、TS反応の効率がmRNAの末端構造により大きく依存し、末端塩基がG>A>C>Uの順で効率が低下する、5'末端にキャップ構造を有する完全長cDNAでは効率が比較的高い(約20%-60%の範囲)が、キャップ構造を有しない不完全長mRNAやimmature mRNA、部分的に分解したmRNA等は効率が低い(数%-40%の範囲)など、不均一な効率が増幅バイアスをもたらす(非特許文献６)、さらにTdT法におけるポリヌクレオチド付加効率(92-95%, 非特許文献１０)よりも効率が低い、という欠点がある。
　一方TdT法はTS法とくらべて効率が良いが、TdTの反応制御が困難、ステップ数が多い、また1本鎖DNAを鋳型とした場合、その末端が高次構造を形成し陥没末端となってしまうと効率が大きく低下しうるため(非特許文献１０)、高次構造をより形成しやすい長鎖の完全長cDNAがTS反応よりも合成されにくいという欠点がある。
　TdT法におけるTdTの反応制御の困難さを解決した技術として、本願発明者らが過去に開発したTAS-Seq法がある（特許文献２、非特許文献１１）。TAS-Seq法は、固相上に標的核酸を捕捉してcDNAを合成する固相系のcDNA増幅法であり、TdT反応系に一定量の連鎖停止ヌクレオチド三リン酸を添加し、確率論的にTdT反応を制御することにより、多様な条件下でもTdT反応によるヌクレオチドホモポリマー付加反応が一定範囲内となるよう制御される。結果として、TAS-Seq法は発現遺伝子の検出感度や細胞組成の定量に優れており、従来技術では検出が困難な細胞間コミュニケーションもより確実に検出することができる技術である。
WO 2015/027135 A1 WO 2021/006353 A1 US 2018/0258500 A1 WO 2015/200893 A2 WO 2015/166768 A1
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　様々な検体由来の個々の１細胞由来mRNAを高感度かつバイアス低く増幅する方法は、より高度かつ精度の高い１細胞アトラスの構築や、腫瘍反応性T細胞の捕捉、ワクチン応答性の高いB細胞の捕捉などの観点で重要な課題である。しかしながら、既存のTS法やTdT法は、上述したようにそれぞれ固有の長所・短所を抱えており、すべての長所を網羅することのできる高感度なcDNA増幅法は未だ存在しない。本願発明者らが過去に開発したTAS-Seq法にも、一定量のターミネーターヌクレオチドを添加する性質上、第２鎖合成に用いるプライマーと安定的な相補鎖を形成するのに必要なだけの長さのポリヌクレオチドが付加されないcDNAが一定量出てしまう、という問題点が存在する。TAS-Seq法はTdT法の一種であるから、TS法と比べてステップ数が多い、長鎖の完全長cDNAがTS反応よりも合成されにくいという点は一般的なTS法と同様である。また、公知のTAS-Seq法は固相系のcDNA増幅法であり、液相系への応用は知られていない。
　本発明は、ごく微量の細胞サンプルからもmRNAを高い効率かつ低いバイアスで網羅的に増幅できるcDNA増幅方法を提供することを目的とする。
　TS法とTdT法を組み合わせた場合、反応ステップ数が少ないことによるcDNA収量の増加というTS法の長所が打ち消されること、またTS法のテンプレートスイッチング反応中にcDNAの3'端が露出することで、末端構造がTdT反応にとって好ましい突出末端でなくなりうることにより、TdT法の反応効率の良さという長所が打ち消されることが予想される。また、液相系TS法では通常、精製過程における産物の減少を避けるため、cDNAの合成後、未反応の（標的を捕捉していない）標的RNA捕捉オリゴの除去は実施されない(非特許文献１５)。つまり、液相系TS法において、cDNA合成後に未反応の標的RNA捕捉オリゴを除去する精製工程を実施した場合には、cDNA産物が減少して最終的なcDNA増幅効率の低下を招くという技術常識が存在する。一方で、この技術常識に従い、TS法を実施した産物に対し未反応の標的RNA捕捉オリゴを除去するステップを行わずにそのままTdT法を適用した場合には、cDNA産物よりもはるかに多く存在する未反応の標的RNA捕捉オリゴやテンプレートスイッチングオリゴがTdT法により優先的に増幅され、cDNA増幅効率が大きく低下することが予想される。したがって、TS法とTdT法を組み合わせた手法は見当たらず、長所を打ち消す以上の大きな利点が得られることを期待できる根拠も見当たらない。
　しかしながら、本願発明者らがあえて、TS反応を実施した産物に対し、液相系においても未反応の標的RNA捕捉オリゴとともに未反応のテンプレートスイッチングオリゴを除去する工程を実施した上でTdT法をさらに適用して検討したところ、驚くべきことに、それぞれ単体の反応よりもcDNA収量を大幅に増加させられること、TdT反応単体よりも合成される長鎖cDNAの量が増加すること、TS反応単体よりも合成される短鎖cDNAの量が増加することを見出した。
　さらに、本願発明者らは、ターミナルトランスフェラーゼ活性を有する逆転写酵素を用いて、TS反応を組み合わせずにTAS-Seqのステップ（TdT法）を実施した場合には、cDNA末端へのCCC等の塩基が付加されることでホモポリマー部分（特にポリC）が短すぎるものの割合を低下させ、固相を用いない液相系でもTAS-Seq法を効率よく実施できることを見出した。
　以上の鋭意検討により完成した本願発明は、ターミナルトランスフェラーゼ活性を有する逆転写酵素を用いて液相系又は固相系で標的RNA捕捉及び相補DNA鎖合成を行い、相補DNA鎖末端にCCC等の塩基を付加した後、連鎖停止ヌクレオチド三リン酸共存下でのTdT反応によりホモポリマーテーリングを実施するステップを含む相補DNA鎖増幅方法であり、テンプレートスイッチングオリゴを用いたTS反応をさらに組み合わせることでより高い効率かつ低いバイアスで相補DNA鎖を増幅することができる技術であり、以下の態様を包含する。
[1]　標的捕捉部を含む標的RNA捕捉オリゴにより、標的RNAを捕捉する、標的RNA捕捉工程；
　ターミナルトランスフェラーゼ活性を有する逆転写酵素を用いて逆転写反応を行うことにより、捕捉したRNAと相補的な配列の相補DNA鎖を合成し、少なくとも一部の相補DNAの3'末端に任意の数塩基からなる付加配列を付加する、相補鎖合成工程；
　標的RNAを捕捉していない標的RNA捕捉オリゴを除去する、未反応オリゴ除去工程；
　RNA分解酵素によりRNAを分解する、RNA分解工程；
　dATP、dTTP、dCTP又はdGTPと連鎖停止ヌクレオチド三リン酸との存在下でターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによる反応を行い、前記相補DNA鎖の3'末端にヌクレオチドホモポリマーを付加する、ホモポリマー付加工程；
　前記ヌクレオチドホモポリマーに対し相補的な配列の相補的ホモポリマー部分を含むプライマーを含む第２鎖合成用プライマーを用いて、前記相補DNA鎖に対し第２鎖合成を行い、相補DNA鎖及び第２鎖で構成されるDNA二本鎖を生成する、第２鎖合成工程；及び
　前記DNA二本鎖を鋳型として核酸増幅反応を行う、核酸増幅工程
を含む、相補DNA鎖を増幅する方法。
[2]　標的RNA捕捉オリゴが、標的捕捉部の5'側に第１のアダプター部分を含み、第２鎖合成用プライマーが、相補的ホモポリマー部分の5'側に第２のアダプター部分を含むロングプライマーを含み、核酸増幅工程において、第１のアダプターを標的とするプライマーと、第２のアダプターを標的とするプライマーとを用いて核酸増幅反応を行う、[1]記載の方法。
[3]　第２鎖合成用プライマーが、相補的ホモポリマー部分の5'側に第２のアダプター部分を含むロングプライマーを含み、核酸増幅工程において、第２のアダプターを標的とするプライマーと、相補DNA鎖中の所望の領域を標的とするプライマーとを用いて核酸増幅反応を行う、[1]記載の方法。
[4]　ロングプライマーが、第２のアダプター部分と相補的ホモポリマー部分の間にランダムな配列からなる分子バーコード部分を含む、[2]又は[3]記載の方法。
[5]　ロングプライマーの相補的ホモポリマー部分の鎖長が６～１５塩基である、[2]～[4]のいずれか１項に記載の方法。
[6]　標的RNA捕捉オリゴが、固相担体に結合していない遊離のオリゴであり、未反応オリゴ除去工程が核酸サイズ分画により行われる、[1]～[5]のいずれか１項に記載の方法。
[7]　標的RNA捕捉オリゴが、5'側から3'側に向かって、第１のアダプター部分、細胞識別バーコード部分、及び標的捕捉部を含む、[6]記載の方法。
[8]　標的RNA捕捉オリゴが、固相担体に結合した固相化オリゴであり、未反応オリゴ除去工程がエキソヌクレアーゼ処理により行われる、[1]～[5]のいずれか１項に記載の方法。
[9]　前記固相担体がビーズであり、標的RNA捕捉オリゴが、5'側から3'側に向かって、第１のアダプター部分、ビーズ識別バーコード部分、及び標的捕捉部を含む、[8]記載の方法。
[10]　前記固相担体がプレートであり、標的RNA捕捉オリゴが、プレートの複数箇所の区画に固定化され、5'側から3'側に向かって第１のアダプター部分、区画識別バーコード部分、及び標的捕捉部を含む、[8]記載の方法。
[11]　標的RNA捕捉オリゴが、標的捕捉部としてポリT部分を含む標的ポリA RNA捕捉オリゴを含み、標的RNAがポリA RNAを含む、[1]～[10]のいずれか１項に記載の方法。
[12]　相補鎖合成工程において、前記付加配列とハイブリダイズ可能な配列を3'末端に含み、かつ、該配列の5'側にスイッチング配列を含むテンプレートスイッチングオリゴの共存下で逆転写反応が行われ、前記付加配列が付加された相補DNA鎖にテンプレートスイッチングオリゴをハイブリダイズさせ、該相補DNA鎖の3'末端にスイッチング配列と相補的な配列をさらに付加する、[11]記載の方法。
[13]　テンプレートスイッチングオリゴが、前記付加配列とハイブリダイズ可能な配列としてGGG、GUG又はNGG（G及びUはリボヌクレオチドの塩基、NはA、U、G及びCから選択されるいずれかのリボヌクレオチドの塩基であり、１個以上のヌクレオチドアナログを含んでいてもよい）を3'末端に含むオリゴヌクレオチドを含み、スイッチング配列が第２のアダプター部分を含む、[12]記載の方法。
[14]　スイッチング配列が、第２のアダプター部分の3'側にランダムな配列からなる分子バーコード部分を含む、[13]記載の方法。
[15]　標的RNA捕捉オリゴが、固相担体に結合していない遊離のオリゴであり、未反応オリゴ除去工程が、標的RNAを捕捉していない標的RNA捕捉オリゴ及び相補DNA鎖にハイブリダイズしていないテンプレートスイッチングオリゴの核酸サイズ分画による除去を含む、[12]～[14]のいずれか１項に記載の方法。
[16]　第２鎖合成用プライマーが、相補的ホモポリマー部分の5'側に第２のアダプター部分を含むロングプライマーと、相補的ホモポリマー部分を含まず、第２のアダプター部分をその3'側に含むショートプライマーとを含む、[11]～[15]のいずれか１項に記載の方法。
[17]　ロングプライマーが、第２のアダプター部分と相補的ホモポリマー部分の間にランダムな配列からなる分子バーコード部分を含む、[16]記載の方法。
[18]　相補鎖合成工程において、前記テンプレートスイッチングオリゴの共存下で、鎖置換活性をさらに有する逆転写酵素を用いて逆転写反応が行われ、テンプレートスイッチングオリゴがハイブリダイズした相補DNA鎖に対する第２鎖合成が行われる、[12]～[17]のいずれか１項に記載の方法。
[19]　連鎖停止ヌクレオチド三リン酸が、ddNTP、ddNTPの誘導体、3'-dNTP、又は3'-デオキシ-5-メチルウリジン-5'-三リン酸である、[1]～[18]のいずれか１項に記載の方法。
[20]　ddNTPの誘導体が、OH基を有しない原子団で3'位が修飾されたddNTPである、[19]記載の方法。
[21]　連鎖停止ヌクレオチド三リン酸がddNTPである、[19]記載の方法。
[22]　ホモポリマー付加工程において、dCTP及び連鎖停止CTPを添加してポリC付加を行う、[1]～[21]のいずれか１項に記載の方法。
[23]　RNA分解工程とホモポリマー付加工程が同時に実施される、[1]～[22]のいずれか１項に記載の方法。
　本発明によれば、ターミナルトランスフェラーゼ活性を有する逆転写酵素を用いることにより、従来のTAS-Seq法（特許文献２、非特許文献１１）よりもさらに高い効率かつ低いバイアスで、ごく微量のサンプルからもmRNAを網羅的に増幅でき、固相を用いない液相系でもTAS-Seq法を効率よく実施することができる。TS反応を組み合わせた場合には、長鎖cDNA及び短鎖cDNAのどちらも収量を大幅に増加できる。とりわけ液相系のTS法においては、従来の技術常識より、cDNA合成後に未反応オリゴを除去する精製工程を実施する場合、実施しない場合のどちらにもcDNA増幅効率が低下するという問題が予想されるところであるが、この予想に反し、高い効率と低いバイアスを達成でき、長鎖cDNA及び短鎖cDNAのどちらも収量を大幅に増加できる。本発明の方法によれば、例えば、発現解析やTCR解析を利用した治療効果判定の精度や、scRNA-seq解析による希少細胞(例えばがん細胞)の分離同定を従来法よりもさらに大幅に向上できるので、医療資源の浪費の抑制などにより一層貢献できる。
本発明の１態様である、ターミナルトランスフェラーゼ活性を有する逆転写酵素を用いた液相系nonTS/TAS-Seq法のステップの概略である。 本発明の１態様である、ターミナルトランスフェラーゼ活性を有するが鎖置換活性を持たない逆転写酵素を用いた固相系のTS/TAS-Seq法のステップの概略である。 本発明の１態様である、ターミナルトランスフェラーゼ活性および鎖置換活性を有する逆転写酵素を用いた固相系のTS/TAS-Seq法のステップの概略である。 本発明の１態様である、ターミナルトランスフェラーゼ活性を有するが鎖置換活性を持たない逆転写酵素を用いた液相系のTS/TAS-Seq法のステップの概略である。 本発明の１態様である、ターミナルトランスフェラーゼ活性および鎖置換活性を有する逆転写酵素を用いた液相系のTS/TAS-Seq法のステップの概略である。 固相系（BD Rhapsodyシングルセル解析システム）における、TdT法及びtemplate-switch + TdT法による全cDNA増幅産物の収量の比較。template-switch + TdT法のほうが有意に全cDNA収量が多い。 固相系（BD Rhapsodyシングルセル解析システム）における、TdT法及びtemplate-switch + TdT法による全cDNA増幅産物のサイズ分布の比較。template-switch + TdT法のほうが、長鎖cDNAの収量が多い。 液相系（10X Chromiumシングルセル解析システム）における、TdT法及びtemplate-switch + TdT法による全cDNA増幅産物の収量及びサイズ分布の比較。template-switch + TdT法のほうが、cDNA収量が多く、また長鎖cDNAの収量が多い。 液相系 (Smart-seq2法)における、template-switch法及びtemplate-switch + TdT法による全cDNA増幅産物の収量の比較。template-switch + TdT法のほうが、cDNA収量が有意に多い。 液相系(Smart-seq2法)における、template-switch法及びtemplate-switch + TdT法による全cDNA増幅産物のサイズ分布の比較。template-switch + TdT法のほうが、鎖長の短いcDNAのcDNA全体に占める割合が大きい。 固相系（BD Rhapsodyシングルセル解析システム）における、TdT法、random priming法及びtemplate-switch + TdT法による１細胞RNAシーケンス解析データの、各細胞における検出遺伝子数およびリード数の比較。細胞あたりのリード数分布が同様の条件にて、template-switch + TdT法が最も多くの遺伝子を検出できている。 液相系（10X Chromiumシングルセル解析システム）における、template-switch法及びtemplate-switch + TdT法による１細胞RNAシーケンス解析データの、各細胞における検出遺伝子数およびリード数の比較。細胞あたりのリード数分布が同様の条件にて、template-switch + TdT法の方がより多くの遺伝子を検出できている。 液相系（10X Chromiumシングルセル解析システム）における、template-switch法及びtemplate-switch + TdT法による１細胞RNAシーケンス解析データの、１細胞クラスタリング解析の結果。template-switch + TdT法のほうが細胞集団の分離能が向上している。 液相系（10X Chromiumシングルセル解析システム）における、template-switch法及びtemplate-switch + TdT法による１細胞RNAシーケンス解析データの、各細胞サブセットにおける、リード数を変化させた際の検出遺伝子数の比較。全ての細胞集団で、template-switch + TdT法の方がより多くの遺伝子を検出できている。
　本発明において、標的RNA捕捉オリゴ、テンプレートスイッチングオリゴ、プライマー、アダプター、ヌクレオチドホモポリマー等の塩基配列を構成するA、T、G、Cには、DNAを構成するデオキシリボヌクレオチド（DNAのA、T、G、C）のみならず、RNAを構成するリボヌクレオチド（RNAのA、T、G、C）も包含され、さらには、対応するヌクレオチドアナログ（例えば、LNA, ENA, PNAなどの架橋化核酸（bridged nucleic acid）や、Super T (5-hydroxybutynl-2’-deoxyuridine), Super G (8-aza-7-deazaguanosine), deoxyinosine, 5-methyl dC, deoxyuridine, 2,6-diaminopurine, 2-aminopurine, 2-Amino-dATPなどの修飾塩基など）も包含される。すなわち、標的RNA捕捉オリゴ（例えば、標的捕捉部、第１のアダプター部分、バーコード部分、及びこれら以外の部分のうちのいずれかの部分）、テンプレートスイッチングオリゴ（付加配列とハイブリダイズ可能な3'末端部分、第２のアダプター部分、バーコード部分、及びこれら以外の部分のうちのいずれかの部分）、ヌクレオチドホモポリマー、第２鎖合成用プライマー（例えば、相補的ホモポリマー部分、第２のアダプター部分、バーコード部分、及びこれら以外のうちのいずれかの部分）、並びに、核酸増幅工程において使用する各プライマーには、リボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択される１個以上（例えば１～１５個程度、１～１２個程度、又は１～数個程度）のモノマーが含まれていてもよい。
　本発明において、数個とは２～９個の複数を意味する。１～数個は、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、又は１～２個であり得る。
　本発明において、ある領域Xを標的とするプライマーといった場合、この領域X又はその相補鎖に特異的にハイブリダイズするプライマーを意味する。領域Xを標的とするプライマーには、領域Xと同一の配列又はこれと相補的な配列を含むプライマーが包含される。領域Xに設定したプライマーという語も同様であり、領域X又はその相補鎖に特異的にハイブリダイズするプライマーを意味し、領域Xと同一の配列又はこれと相補的な配列を含むプライマーが包含される。
　本発明において、相補DNA鎖、及びcDNAという語は、標的RNAと相補的な塩基配列からなるDNA鎖を意味し、mRNAと相補的な配列からなるDNA鎖には限定されない。
　本発明において、オリゴヌクレオチド又はオリゴという語は、比較的鎖長の短い一本鎖のポリヌクレオチドを意味する。オリゴヌクレオチドの鎖長は、典型的には数十塩基～200塩基程度、例えば50塩基～150塩基程度であるが、これに限定されない。
　本発明において、ターミナルトランスフェラーゼ活性という語は、terminal deoxynucleotidyl transferaseが有する、ヌクレオチド鎖の3'末端に鋳型非依存的にヌクレオチドを付加する活性を意味する。1本鎖ヌクレオチドの3'末端、２本鎖ヌクレオチドの3'突出末端、及び２本鎖ヌクレオチドの平滑末端のうちの3'末端が、ターミナルトランスフェラーゼ活性によるヌクレオチド付加のターゲットとなる。
　本発明において、標的RNAには、ポリA RNAをはじめとする様々なRNAが包含される。ポリA RNAは、3'末にポリAテールを有するRNAであり、最も典型的な例がmRNAである。標的RNAが由来する細胞は特に限定されず、例えば、マウス個体由来の細胞、各種培養細胞、健常人由来の細胞、がん患者由来の細胞、各種疾患患者由来の細胞など、種々の細胞が対象となる。がん患者由来の細胞は、がん免疫療法を受けているがん患者に由来する細胞であってもよい。健常人や患者に由来する細胞は、末梢血や病変部（例えば腫瘍）から採取された細胞であってよい。本発明の増幅法をトランスクリプトーム解析等の解析法に利用する場合には、細胞をサンプルとして用いてもよいし、種々の細胞より単離した細胞核をサンプルとして用いてもよい。
　本発明の相補DNA鎖増幅法は、標的RNA捕捉工程、相補鎖合成工程、未反応オリゴ除去工程、RNA分解工程、ホモポリマー付加工程、第２鎖合成工程、及び核酸増幅工程を含む。本発明の増幅法には、相補鎖合成工程において、テンプレートスイッチングオリゴの共存下で逆転写反応が実施され、テンプレートスイッチング（TS）反応が行われる態様と、テンプレートスイッチングオリゴの非存在下で逆転写反応を行う態様とが包含される。以下、便宜的に前者の態様をTS/TAS-Seq法、後者の態様をnonTS/TAS-Seq法と呼ぶ。本発明の増幅法の態様としては、TS/TAS-Seq法がより好ましい。nonTS/TAS-Seq法は、TS反応により著しく望ましくない産物(たとえばテンプレートスイッチングオリゴによるstrand invasion産物、合成されたcDNAへのミスプライミングに由来するcDNA逆相補鎖産物等)が生成される場合に好ましい。TS/TAS-Seq法、nonTS/TAS-Seq法いずれも、標的RNA捕捉工程において、ビーズ等の固相に結合した標的RNA捕捉オリゴにより標的RNAを捕捉する固相系、及び、固相に結合していない遊離の標的RNA捕捉オリゴにより標的RNAを捕捉する液相系が包含される。図１は、液相系のnonTS/TAS-Seq法の概略である。図２～５がTS/TAS-Seq法の概略であり、図２及び図３が固相系、図４及び図５が液相系である。
　以下、適宜図面を参照しながら、固相系TS/TAS-Seq法、液相系TS/TAS-Seq法、及びnonTS/TAS-Seq法の順に各工程を説明する。
A. 固相系TS/TAS-Seq法
A-1. 標的RNA捕捉工程（図２、図３のStep 1）
　固相系TS/TAS-Seq法の標的RNA捕捉工程では、固相担体上に結合した標的RNA捕捉オリゴにより標的RNAを捕捉する。標的RNAは、標的RNA捕捉オリゴを介して固相担体上に捕捉される。後述するとおり、標的RNA捕捉工程は、微小ウェル若しくは微小液滴中で、又はこれらに該当しない溶液中で実施される。
　固相担体は、ビーズでもよいし、スライドグラス等のプレートでもよい。ビーズ固相担体を用いた単一細胞解析システムとしては、例えば、微小ウェルを有するプレートを用いたBeckton Dickinson社のBD Rhapsodyシステム（特許文献３）、Seq-wellシステム（非特許文献１２）、及びNx1-seqシステム（特許文献５、非特許文献１４）や、微小液滴中でmRNAを捕捉するDrop-seq法（非特許文献１３）及びDolomite Bio社のNadiaシステムが知られている。また、固相担体としてプレートを用いたシステムとして、標的捕捉オリゴを整列固定化したプレート上で組織サンプルを透過処理し、組織サンプルの各細胞より出てきたmRNAをプレート上の捕捉オリゴにて捕捉する、空間トランスクリプトーム法のプラットフォームも知られており、例えば、Stereo-seqシステム(Chen et al. Cell 2022 185, 1777-1792. doi: 10.1016/j.cell.2022.04.003.)がある。固相系TS/TAS-Seq法は、このような公知技術のいずれにも適用可能である。
　ビーズの材質は特に限定されず、核酸解析キットの核酸捕捉担体やイムノアッセイキットの固相粒子担体に用いられる種々の材質を採用できる。ビーズの材質の例として、ポリスチレン、ポリプロピレン等の樹脂製のビーズ等の有機ポリマー製ビーズ、セレン化カドミウム（CdSe）、硫化亜鉛（ZnS）、硫化カドミウム（CdS）、セレン化亜鉛（ZnSe）、酸化亜鉛（ZnO）等の半導体材料でできた量子ドット（半導体ナノ粒子）等の半導体製ビーズ、金等の金属製ビーズ、シリカ製ビーズなどの重合体ビーズ等を挙げることができる。具体例として、セルロース、セルロース誘導体、アクリル樹脂、ガラス、シリカゲル、ポリスチレン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ビニルおよびアクリルアミドの共重合体、ジビニルベンゼン架橋ポリスチレン等（Merrifield Biochemistry 1964,3,1385-1390参照）、ポリアクリルアミド、ラテックスゲル、ポリスチレン、デキストラン、ゴム、シリコン、プラスチック、ニトロセルロース、セルロース、天然海綿、シリカゲル、ガラス、金属プラスチック、セルロース、架橋デキストラン（例えばSephadex(商品名)）およびアガロースゲル（Sepharose(商品名)）等の材質のビーズを挙げることができる。非磁性体、磁性体のいずれでも良いが、取扱いがより容易な磁性ビーズを好ましく用いることができる。
　プレートの材質も特に限定されず、例えば、マイクロアレイの基板に用いられる種々の材質を採用できる。使用可能な材質の代表的な例としてガラスが挙げられるが、その他、シリコン、プラスチック等も使用できる。プレートである固相担体には、微小ウェルが整列配置されたマイクロウェルプレート、マイクロアレイ等の基板として用いられるプレート、シーケンサーのフローセルなど、表面が平坦な又は凹凸のあるプレート状の様々な固相担体が包含される。固相担体がプレートの場合、標的RNA捕捉オリゴは、通常、プレート上の複数箇所の区画に固定化（典型的には、スポット状に整列固定化）される。
　固相系における標的RNA捕捉工程の実施態様の１つとして、固相ビーズを用いたscRNA-seq解析プラットフォームを用いて、微小ウェルや微小液滴中で個々の１細胞からRNAを抽出し、標的RNA捕捉オリゴが結合したビーズ担体と接触させることにより、微小ウェル又は微小液滴中でビーズ上に標的RNAとしてのポリA RNAないしmRNAを捕捉する態様を挙げることができる。微小ウェル、微小液滴という用語における「微小」という語は、典型的にはボリュームが5～100pl程度であることを意味する。固相ビーズを用いたscRNA-seq解析プラットフォームの一般的な手法の一例は上述の通りであり、微小ウェルを有するプレートを用いたBeckton Dickinson社のBD Rhapsodyシステム（特許文献３）、Seq-wellシステム（非特許文献１２）、及びNx1-seqシステム（特許文献５、非特許文献１４）や、微小液滴中でmRNAを捕捉するDrop-seq法（非特許文献１３）及びDolomite Bio社のNadiaシステムを挙げることができ、本発明においてはこれらの一般的手法を好ましく用いることができる。
　固相系における標的RNA捕捉工程の別の実施態様として、空間トランスクリプトーム法のプラットフォームを用いて、標的RNA捕捉オリゴを整列固定化したプレート上で組織サンプルを透過処理し、組織サンプルの各細胞より溶出したポリA RNAないしmRNAをプレート上の捕捉オリゴにて捕捉する態様を挙げることができる。例えば、Stereo-seqシステム(Chen et al. Cell 2022 185, 1777-1792. doi: 10.1016/j.cell.2022.04.003.)がある。ボリュームが上記した微小の定義に当てはまらない溶液中にて、標的RNAの捕捉が行われる態様である。
　固相系における標的RNA捕捉工程の実施態様のさらに別の態様として、病変部組織検体や細胞懸濁液等の細胞試料よりポリA RNA試料ないしmRNA試料を調製し、ポリA RNA捕捉オリゴが結合した固相担体とポリA RNA試料ないしmRNA試料とを接触させることにより、固相担体上にポリA RNAを捕捉する態様を挙げることができる。ボリュームが上記した微小の定義に当てはまらない溶液中にて、標的RNAの捕捉が行われる態様である。この態様において、ポリA RNA試料ないしmRNA試料の調製は、まず細胞試料よりtotal RNAを抽出してからポリA RNAないしmRNAの抽出を行ってもよいし、細胞試料からtotal RNAの抽出を経ず直接的にポリA RNAないしmRNAを抽出してもよい。
　TS/TAS-Seq法における標的RNAには、ポリA RNAが含まれる。ポリA RNAのみを標的としてもよいし、ポリA RNA以外のRNAも併せて標的としてもよい。すなわち、TS/TAS-Seq法では、標的RNA捕捉オリゴは、標的ポリA RNA捕捉オリゴを含み、ポリA RNA以外のRNAを捕捉する標的RNA捕捉オリゴも含んでいてよい。また、標的RNA捕捉オリゴに加えて、RNA以外の核酸分子を標的として捕捉する標的捕捉オリゴをさらに含んでいてもよい。固相上には、１種類又は２種類以上の標的RNA捕捉オリゴが固定化されていてよいし、RNA以外の核酸分子を捕捉する標的捕捉オリゴがさらに固定化されていてもよい。RNA以外の核酸分子を捕捉する標的捕捉オリゴの例としては、BioLegend社のTotalSeqのような、オリゴDNA標識抗体を併用したscRNA-seq解析技術における、標識オリゴDNAを捕捉するオリゴヌクレオチドを挙げることができる。このようなオリゴDNA標識抗体とTdT法を組み合わせた技術も公知である（特許文献２）。また、RNA以外の核酸分子を捕捉する標的捕捉オリゴの別の例として、Tn5 transposaseを併用した1細胞クロマチン構造解析技術における、Tn5 transposaseにより組み替えられたDNA断片を捕捉するオリゴヌクレオチドを挙げることができる。複数種類の捕捉オリゴを組み合わせて用いる態様では、固相がビーズである場合、１個のビーズ上に複数種類の捕捉オリゴが固定化されていてもよいし、複数種類の捕捉オリゴがそれぞれ異なるビーズ上に固定化されていてもよい。固相がプレートの場合には、１つの区画に複数種類の捕捉オリゴが固定化されていてもよいし、複数種類の捕捉オリゴがそれぞれ異なる区画に固定化されていてもよい。
　標的ポリA RNA捕捉オリゴの典型例は、標的捕捉部としてポリT部分を含むオリゴヌクレオチドであり、標的RNAのポリA部分を捕捉する。ポリA以外の部位を捕捉する標的RNA捕捉オリゴの例としては、６～１５塩基のランダムな配列を標的捕捉部として含むオリゴヌクレオチドや、特定のRNA配列中の所望の領域（例えば、T細胞受容体定常領域、B細胞受容体定常領域、RNAの5'末端近傍領域など）に対して相補的な配列を標的捕捉部として含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。
　標的RNA捕捉オリゴは、5'末端が固相担体に直接又は間接的に結合しており、3'末端に標的捕捉部を有する。該オリゴは、標的捕捉部の5'側、すなわち固相担体側に第１のアダプター部分を含んでいてよい。図２、図３中でUniversal 1として示されている部分が第１のアダプター部分である。第１のアダプター部分は、核酸増幅工程においてプライマーの一方を設定する領域となる。
　また、標的RNA捕捉オリゴは、第１のアダプター部分と標的捕捉部の間に、個々の固相担体ないしは固相担体上の位置を識別するためのバーコード部分を含んでいてよい。このバーコード部分とは、固相担体がビーズである場合にはビーズ識別バーコードであり、固相担体がプレートである場合には、プレート上のどの区画に固定化されているかを識別するための区画識別バーコードである。すなわち、標的RNA捕捉オリゴは、5'側から3'側に向かって、第１のアダプター部分、ビーズ又は区画識別バーコード部分、及び標的捕捉部を含んでいてよい。そのようなバーコード部分を含む態様においては、核酸増幅工程で増幅される相補DNA鎖には、識別バーコード部分に由来するバーコード配列が含まれることになる。ビーズ識別バーコード部分は、同一のビーズ上では同一の配列であり、ビーズごとに異なる配列を有する。これにより、同じビーズ上に捕捉されたmRNAに由来するcDNAを、他のビーズ上に捕捉されたmRNAに由来するcDNAと区別することができる。scRNA-seq解析においては、同じ細胞に由来するcDNAを、他の細胞に由来するcDNAと区別することができる。そのようなビーズ識別バーコード部分を含む、固相化されたポリA RNA捕捉オリゴは、公知の方法で調製することができる（例えば、WO 2015/166768 A1など参照）。また、区画識別バーコード部分は、プレート上の同一の区画（スポット）内では同一の配列であり、区画（スポット）ごとに異なる配列を有する。これにより、例えばサンプルが組織標本である場合に、組織のどの部位でどのようなmRNAが発現しているかを把握することができる。
　１つのビーズ上、ないし１つの区画内には、通常、多数の標的RNA捕捉オリゴ分子が固定化される。図２、図３には、固相がビーズであり、標的RNA捕捉オリゴが標的捕捉部としてポリT部分を含む標的ポリA RNA捕捉オリゴであり、標的ポリA RNAとしてmRNAを捕捉する態様を示している（図中、捕捉オリゴのポリT部分は一部省略）。便宜的に、１個のビーズ担体上に１分子のmRNAを捕捉した様子が示されているが、実際には１個のビーズ担体上に多数のmRNA分子が捕捉される。5'キャップ構造を有する完全長mRNAだけではなく、キャップ構造を有しない不完全長mRNAやimmature mRNA、部分的に分解したmRNA等の「完全長ではないmRNA」も、ポリAを有していれば、標的ポリA RNA捕捉オリゴにより固相上に捕捉される。
A-2. 相補鎖合成工程（図２、図３のStep 2）
　標的RNA捕捉工程の後、固相担体を洗浄し、固相担体上に標的RNAが捕捉された状態で相補鎖合成工程を実施する。TS/TAS-Seqにおける相補鎖合成工程では、ターミナルトランスフェラーゼ活性を有する逆転写酵素を使用し、テンプレートスイッチングオリゴの共存下で逆転写反応を行うことにより、逆転写反応とテンプレートスイッチング反応を同時に（ワンステップで）実施する。反応系内にテンプレートスイッチングオリゴを添加するタイミングは特に限定されず、逆転写反応の開始前、開始と同時、又は開始後であってよく、逆転写反応中一定時間が経過したあと添加してもよい。逆転写反応及びテンプレートスイッチング反応自体は常法通りに行うことができる。
　ターミナルトランスフェラーゼ活性を有する逆転写酵素は広く知られており、種々のものが市販されている。代表的な例として、野生型MMLV RTのほか、Thermo Fisher Scientific社SuperScript II, SuperScript IV, Maxima H minus reverse transcriptase, Takara Bio社 SmartScribe reverse transcriptase, New England Biolabs社template switching RT等を挙げることができる。
　逆転写反応により、固相担体上に捕捉された標的RNAから、これと相補的な配列のDNA鎖（相補DNA鎖、第１鎖）が合成される。次いで、逆転写酵素のターミナルトランスフェラーゼ活性により、合成された相補DNAのうちの少なくとも一部の3'末端に、任意の数塩基からなる付加配列が付加される。ターミナルトランスフェラーゼ活性による3'末端への鋳型非依存の塩基付加反応では、付加される塩基数は一般に１～５塩基の範囲内であり、３塩基付加されることが多いこと、鋳型となるRNAが5'末端にキャップ構造を有する完全長mRNAの場合には、cDNAの3'末端にCCCが付加されやすいことが知られている。テンプレートスイッチングオリゴは、この付加配列とハイブリダイズ可能な配列をその3'末端に含んでおり、かつ、該配列の5'側にスイッチング配列を含むオリゴヌクレオチドである。そのため、この工程では、付加配列が追加された相補DNA鎖にテンプレートスイッチングオリゴがハイブリダイズし、テンプレートスイッチングオリゴの5'末端まで相補DNA鎖が伸長することにより、相補DNAの3'末端にさらにスイッチング配列の相補鎖が付加される。
　テンプレートスイッチングオリゴは、付加配列とハイブリダイズ可能な配列としてGGG、GUG又はNGG（G及びUはリボヌクレオチドの塩基、NはA、U、G及びCから選択されるいずれかのリボヌクレオチドの塩基であり、１個以上のヌクレオチドアナログを含んでいてもよい）を3'末端に含むオリゴヌクレオチドを含んでいることが好ましい。図２、図３では、当該ハイブリダイズ可能な3'末端配列がリボヌクレオチド塩基のGGGである例を示している。当該3'末端配列が異なる２種以上のテンプレートスイッチングオリゴを混合して使用してもよい。
　スイッチング配列は、第２のアダプター部分を含んでいてよい。図中にUniversal 2として示した部分が第２のアダプター部分である。第２のアダプター部分は、後の核酸増幅工程においてプライマーの一方を設定する領域となる。
　スイッチング配列は、第２のアダプター部分の3'側（テンプレートスイッチングオリゴにおいて、第２のアダプター部分と上記3'末端配列との間）にランダムな配列からなる分子バーコード部分を含んでいてよい。後の核酸増幅工程で増幅されたDNA分子は、同一の2本鎖cDNAに由来するDNAであれば同一の分子バーコードを有し、別の2本鎖cDNAに由来するDNAであれば互いに異なる分子バーコードを有することになる。異なる分子バーコードを有するDNAのみを数えることで、出発時のcDNA分子数の推定や、異なるcDNA間のPCR増幅効率の差の補正が可能となる。分子バーコードの鎖長は特に限定されないが、典型的には12塩基～30塩基程度である。分子バーコードは、シークエンスエラーに耐性を持たせるため、ランダム塩基配列中に特定の固定配列が挿入された構成にしてもよい。後述するとおり、第２鎖合成工程で第２鎖合成用プライマーとして用いるロングプライマーも、同様の分子バーコード部分を含み得る。
　スイッチング配列の5'末端や3'末端（いずれか一方、又は両方）には、テンプレートスイッチングオリゴの重合を防止するための化学修飾や塩基、例えばアミノ修飾、ビオチン修飾、C3スペーサー修飾などを含んでいてもよい。
　図２、図３のStep 2の１段目に示すように、完全長mRNAを捕捉した標的RNA捕捉オリゴ上で、mRNAの全長に対してcDNAが合成されると、cDNAの3'末端には、逆転写酵素のターミナルトランスフェラーゼ活性により高い確率でCCCが付加される。このCCC部分に、3'末端配列がGGGであるテンプレートスイッチングオリゴがハイブリダイズした場合には、逆転写酵素が有するDNA依存的DNAポリメラーゼ活性により、cDNAの3'末端のCCCに連続してスイッチング配列の相補鎖が合成される（テンプレートスイッチされたcDNA）。図示した例では、第２のアダプターであるUniversal 2の相補鎖が合成されているが、テンプレートスイッチングオリゴのUniversal 2とrGrGrGの間に分子バーコードが含まれている場合には、cDNAの3'末端のCCCに続けて分子バーコード相補鎖＋Universal 2相補鎖が合成される。スイッチング配列の相補鎖が合成される結果、mRNA-cDNAハイブリッドの末端が平滑になるので、cDNA鎖の3'末端には、逆転写酵素のターミナルトランスフェラーゼ活性によりさらに任意の数塩基（図中ではNNNで示す）が付加され得る（付加しない場合もある）。
　完全長mRNAの全長に対してcDNAが合成され、3'末端にCCCが付加された後に、テンプレートスイッチングオリゴがハイブリダイズしなかったもの、あるいは3'末端にテンプレートスイッチングオリゴがハイブリダイズしない他の塩基が付加されたものは、テンプレートスイッチング反応を受けなかったcDNAとして固相上に残る（Step 2の２段目、non-switched cDNA）。
　完全長ではないmRNAを捕捉した標的RNA捕捉オリゴ上では、合成されたcDNA末端にCCC以外の任意の数塩基（NNN）が付加されやすい（付加しない場合もある）ので、このようなcDNAもテンプレートスイッチング反応を受けなかったcDNAとして固相上に残る（Step 2の３段目、non-switched cDNA）。
　完全長mRNAを捕捉しても、cDNA合成が途中でとまった場合には、mRNA-cDNAハイブリッドのcDNA末端が陥没末端となる。この場合、cDNA末端への塩基付加は起こらないため、テンプレートスイッチング反応を受けずに固相上に残る（Step 2の４段目、non-switched cDNA）。
　相補鎖合成工程において、ターミナルトランスフェラーゼ活性に加え、鎖置換活性をさらに有する逆転写酵素を用いることも可能である。この場合、図３のStep 2に示すように、テンプレートスイッチされたcDNAとmRNAのハイブリッド二本鎖では、逆転写酵素の鎖置換活性により、mRNAをcDNAから剥がしながら第２鎖合成が進む。
　ターミナルトランスフェラーゼ活性及び鎖置換活性を有する逆転写酵素も公知であり、種々のものが市販されている。代表的な例として、野生型MMLV RTのほか、Thermo Fisher Scientific社SuperScript II, SuperScript IV, Maxima H minus reverse transcriptase, Takara Bio社 SmartScribe reverse transcriptase, New England Biolabs社template switching RTを挙げることができる。
A-3. 未反応オリゴ除去工程（図２、図３のStep 3）
　相補鎖合成工程の後、固相担体を洗浄して未反応オリゴ除去工程に進む。本工程では、固相上に残存する、標的RNAを捕捉していない標的RNA捕捉オリゴ（未反応の捕捉オリゴ）を除去する。固相系では、反応液中に残存する、相補DNA鎖にハイブリダイズしていないテンプレートスイッチングオリゴ（未反応のテンプレートスイッチングオリゴ）は固相の洗浄により除去されるので、固相上の未反応の捕捉オリゴをエキソヌクレアーゼ処理により分解除去する。一本鎖DNAを特異的に分解する一般的なエキソヌクレアーゼの例として、Exonuclease IやExonuclease Tを挙げることができる。本発明ではそのような一般的なエキソヌクレアーゼの少なくとも1種を用いることができる。エキソヌクレアーゼ処理後、固相担体を洗浄して次の工程に進む。
A-4. RNA分解工程（図２、図３のStep 4）
　RNA分解工程では、固相担体上に結合しているmRNA-cDNAハイブリッドのmRNAをRNA分解酵素で分解する。テンプレートスイッチングオリゴの3'末端配列がリボヌクレオチド塩基の場合、当該3'末端部分も分解される。本工程では、RNase Hなどの一般的なRNA分解酵素を利用できるし、NaOH溶液、KOH溶液などによるアルカリ処理も利用できる。RNAの分解後は、固相担体を洗浄、回収してからホモポリマー付加工程に進んでもよいし、洗浄せずにそのままホモポリマー付加工程に進んでもよい。後述するように、RNA分解工程とホモポリマー付加工程を同時に行なうこともできる。
A-5. ホモポリマー付加工程（図２、図３のStep 4）
　ホモポリマー付加工程では、dATP、dTTP、dCTP、又はdGTPと連鎖停止ヌクレオチド三リン酸（連鎖停止NTP）との存在下でターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）による反応を行ない、固相上に合成された相補DNA鎖の3'末端にヌクレオチドホモポリマーを付加する（図２、図３のStep 4; 図にはポリCの例を示す）。テンプレートスイッチされたcDNA、及びスイッチされなかったcDNAの両者に対し、ヌクレオチドホモポリマーが付加される。連鎖停止NTP（連鎖停止ATP、連鎖停止TTP、連鎖停止CTP、又は連鎖停止GTP）とは、この分野で周知の通り、ヌクレオチドの3'位のOH基が、他のヌクレオチド分子の5'-リン酸部分との間でリン酸エステル結合を形成できないように修飾ないし改変されたヌクレオチドであり、3'位のOH基を有しない（3'位に結合する原子団にOH基を含まない）ヌクレオチド三リン酸ともいうことができる。本発明においても使用可能な一般的な連鎖停止NTPの具体例として、ジデオキシヌクレオチド三リン酸（ddNTP）(ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP, ddUTP), ddNTPの誘導体（典型的には、OH基を有しない原子団で3'位が修飾されたddNTPであり、例えば、3'-Azido-ddATP, 3'-Azido-ddCTP, 3'-Azido-ddGTP, 3'-Azido-ddTTP, 3'-Azido-ddUTP, 3'-Amino-ddATP, 3'-Amino-ddCTP, 3'-Amino-ddGTP, 3'-Amino-ddTTP等の、アジド基若しくはアミノ基で3'位が修飾されたddNTP）, 3'-デオキシヌクレオチド三リン酸（3'-dNTP）(3’-dATP, 3’-dCTP, 3’-dGTP, 3’-dTTP, 3’-dUTP) , 3'-デオキシ-5-メチルウリジン-5'-三リン酸が挙げられ、例えばddNTP、又はアジド基で3'位が修飾されたddNTP、特にddNTPであってよいが、これらに限定されない。使用する連鎖停止NTP及びホモポリマーを形成する基質（dNTP）は、両者の塩基鎖を揃えることが望ましい。第２鎖合成反応に必要な最低ホモポリマー長、第２鎖合成に用いるプライマーの3’末端ホモポリマー部分の必要長、フリープライマー由来副産物の鎖長を特に望ましく抑えられることから、例えばddCTP等の連鎖停止CTP＋dCTP、又はddGTP等の連鎖停止GTP＋dGTPの組み合わせにより、ポリC付加又はポリG付加を行なうことが好ましい。TS反応を併用するTS/TAS-Seq法では、TS反応時に完全長mRNAに対するcDNA鎖の3'末端に付加されるシトシン塩基もホモポリマー部位として数えることができることから、連鎖停止CTP＋dCTPの組み合わせによりポリC付加を行うことが特に好ましい。
　連鎖停止NTPの添加量は、例えばddNTPを用いる場合、dNTP（dATP、dTTP、dCTP、又はdGTP）に対する比率でddNTP:dNTP＝1:10～1:100程度であればよく、例えば1:10～1:80、1:10～1:60、1:10～1:40、1:15～1:80、1:15～1:60、又は1:15～1:40の比率で用いることができる。他の連鎖停止NTPもこの比率に準じて使用量を設定できる。連鎖停止NTPの非共存下でTdT反応を行なう従来のTdT法の場合、ホモポリマーの鎖長を制御するために、酵素のロット間の活性の違いや、プライマーやcDNAなど基質の量の差異に応じて反応時間を厳密に制御する必要がある。一方、本願発明者らが開発したTAS-Seq法では、連鎖停止NTPの共存下でTdTによるホモポリマー付加反応を行なうことにより、確率論的に連鎖停止NTPが取り込まれてホモポリマー伸長反応が停止するので、TdTによる反応時間の差異や酵素活性の差異に対する許容量が大幅に増大する。
　TdTによるホモポリマー付加反応は、一般に、2価カチオンの存在下で行なわれる。使用可能な2価カチオンとしては、Zn2+、Cu2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Mg2+などの２価金属カチオンが挙げられ、例えばCo2+、Mn2+又はMg2+であってよいが、これらに限定されない。
　連鎖停止NTP添加により、TdTによる反応時間等の差異に対する許容量が大幅に増大するため、TdT反応液にRNase Hを添加してRNA分解反応とホモポリマー付加反応を同時に行うことができる。従って、本発明の１つの態様において、RNA分解工程とホモポリマー付加工程は同時に実施される。
A-6. 第２鎖合成工程（図２、図３のStep 5）
　ホモポリマー付加反応の後、固相担体を洗浄して第２鎖合成工程に進む。TS/TAS-Seq法の第２鎖合成工程で使用する第２鎖合成用プライマーは、相補DNA第１鎖の末端に付加されたヌクレオチドホモポリマーに対し相補的な配列の相補的ホモポリマー部分を含み、かつ、該相補的ホモポリマー部分の5'側に第２のアダプター部分を含むプライマー（以下、ロングプライマー）と、相補的ホモポリマー部分を含まず、第２のアダプター部分をその3'側に含むプライマー（以下、ショートプライマー）とを含む。完全長mRNAに由来するテンプレートスイッチされたcDNAには、テンプレートスイッチングオリゴに由来する第２のアダプター（Universal 2）の相補鎖が含まれているので、ロングプライマー及びショートプライマーの両者がハイブリダイズ可能である。一般に、内側にあるプライマーの方が伸長しやすいため、図にはショートプライマーから伸長する様子を示している。スイッチされなかった相補DNA鎖にはロングプライマーがハイブリダイズし、第２鎖が伸長合成される。第２鎖合成により、固相上には、相補DNA（第１鎖）及び第２鎖で構成されるDNA二本鎖が形成される。テンプレートスイッチングオリゴに分子バーコードが含まれていた場合には、テンプレートスイッチされたcDNA第１鎖に対して本工程で合成される第２鎖に分子バーコードが組み込まれる。
　相補的ホモポリマー部分は、ロングプライマーの3'末端側に存在する。相補的ホモポリマー部分の鎖長は、相補DNA第１鎖に付加されたホモポリマーテイルがポリC又はポリGである場合には通常6～15塩基程度、例えば7～13塩基程度であり、ホモポリマーテイルがポリA又はポリTである場合には通常15～30塩基程度、例えば18～25塩基程度である。また、相補的ホモポリマー部分は、その3'末端に1～2塩基程度のアンカー配列が付加されていてもよい。アンカー配列を付加することで、TdTによりcDNAに付加されたホモポリマーテイルの開始点にロングプライマーがアニーリングする確率を高めることができる。アンカー配列は、相補的ホモポリマー部分がポリGの場合はHまたはHN (H = A, T又はC; N = any base (A, T, C又はG))、ポリCの場合はDまたはDN（D = A, T又はG; N = any base (A, T, C又はG)）、ポリAの場合はBまたはBN（B = T, G又はC; N = any base (A, T, C又はG)）、ポリTの場合はVまたはVN（V = A, G又はC; N = any base (A, T, C又はG)）を用いることができる。
　ロングプライマー及びショートプライマーに含まれる第２のアダプターは、テンプレートスイッチングオリゴに含まれる第２のアダプターと同じであり、後の核酸増幅工程においてプライマーの一方を設定する領域となる。
　ロングプライマーは、テンプレートスイッチングオリゴと同様に、ランダムな配列からなる分子バーコード部分を含んでいてよい。ロングプライマーにおいては、第２のアダプター部分と相補的ホモポリマー部分の間に分子バーコードが含まれうる。テンプレートスイッチされたcDNAに由来する増幅産物においては、テンプレートスイッチングオリゴのスイッチング配列内に含まれる分子バーコードが機能する。スイッチされなかったcDNAに由来する増幅産物においては、ロングプライマーに持たせた分子バーコードが機能する。
　第２鎖合成工程で使用するポリメラーゼは、通常のPCRに使用されるTaqポリメラーゼのような一般的なポリメラーゼでもよいし、高正確性PCR酵素として知られているポリメラーゼやBst DNA polymerase等の鎖置換活性のあるポリメラーゼを使用してもよい。
　第２鎖合成工程では、必要に応じて熱変性後、第２鎖合成用プライマーのアニーリングと伸長反応を１サイクルのみ実施してもよいし、サーマルサイクリング反応によりサイクル実施してもよい。また、１サイクル又は複数サイクルの反応を実施したのち、Bst DNA polymerase等の鎖置換活性のあるポリメラーゼにより後追い反応を実施してもよい。
A-7. 核酸増幅工程（図２、図３のStep 6）
　第２鎖合成後、固相担体を洗浄して、又は洗浄せずに核酸増幅工程に進む。核酸増幅工程では、固相担体上に合成されたDNA２本鎖を鋳型として核酸増幅反応を行なう（図２、図３のStep 6）。この核酸増幅反応では高い正確性が求められるため、一般に高正確性PCR酵素として知られているポリメラーゼを用いることが望ましい。高正確性PCR酵素は種々のものが市販されている。本工程では、固相担体を洗浄せずに核酸増幅反応液を追加添加することにより、そのまま核酸増幅反応を実施してもよい。
　第１のアダプターと第２のアダプターを採用する態様では、それらのアダプターに設定したプライマーのセットで核酸増幅反応を行なうことができる。scRNA-seq解析の場合は各細胞中で発現しているmRNAを網羅的に逆転写して増幅するので、第１及び第２のアダプターを標的とするプライマーセットで全cDNA増幅を行なうのが一般的である。この場合のプライマーセットは、典型的には、第１のアダプター配列からなるプライマーと、第２のアダプター配列からなるプライマーとのセットであるが、5'側に任意の付加配列やビオチン等による修飾を含んでいても差し支えない。
　あるいは、第１のアダプターを標的とするプライマーに代えて、相補DNA鎖中の所望の領域を標的とするプライマーを用いて核酸増幅反応を実施してもよい。T細胞受容体（TCR）レパトア解析におけるTCR可変領域ライブラリーの調製のように、固相担体上で合成された相補DNA分子のうちで特定の領域のみを増幅できればよい場合には、第２のアダプターを標的とするプライマーと、相補DNA鎖中の所望の領域を標的とするプライマー（例えば、TCR定常領域を標的とするプライマー）とを用いて核酸増幅反応を実施することができる。
　核酸増幅反応自体は常法通りにPCRを実施すればよい。所望により、１段階又は２段階以上のPCR反応を実施してよい。例えば、第１及び第２のアダプターを標的とするプライマーセットを使用して数サイクルの1st PCRを行い、増副産物のサイズセレクション及び精製を行ったのち、同じ部位を標的とするプライマーセット、又は、第２のアダプターを標的とするプライマーと、第１のアダプターよりも内側の部分領域を標的とするプライマーとのセットを用いて数十サイクルの2nd PCRを行い、増副産物のサイズセレクション及び精製を再度行うことにより、全cDNAの増副産物を得ることができる。2nd PCRでは、両プライマーの5'末端にビオチンやアミン等のスペーサーを結合させたものを使用してもよく、これにより、配列解析対象のDNA断片の回収が容易になる。
B. 液相系TS/TAS-Seq法
B-1. 標的RNA捕捉工程（図４、図５のStep 1）
　液相系TS/TAS-Seq法の標的RNA捕捉工程では、固相担体上に結合していない遊離の標的RNA捕捉オリゴにより標的RNAを捕捉する。液相系においても、標的RNA捕捉工程は、微小ウェル若しくは微小液滴中で、又はこれらに該当しない溶液中で実施できる。
　液相系の解析技術としては、例えば、mRNA捕捉オリゴが封入されたハイドロゲルビーズと１細胞を微小液滴中に封入し、微小液滴中でハイドロゲルの融解及び細胞溶解を実施し、遊離したmRNA捕捉オリゴでmRNAを捕捉する10X Genomics社の10X Chromiumシステム（特許文献４）、96 wellプレートに個々の細胞や微量mRNAを分注して増幅を行うSmart-Seq2（非特許文献１５）、固定した細胞を細胞膜透過試薬及びmRNA捕捉オリゴが含まれる溶液中に懸濁し、固定細胞内でmRNAをmRNA捕捉オリゴ上に捕捉するsci-RNA-seq3などが知られている。液相系TS/TAS-Seq法は、このような公知のトランスクリプトーム解析技術のいずれにも適用可能である。
　液相系における標的RNA捕捉工程の実施態様の１つとして、室温などの穏やかな条件で融解可能な材料（ハイドロゲルなど）でできたビーズ内に標的RNA捕捉オリゴを封入し、該ビーズと細胞を１：１で微小液滴中に封入又は微小ウェル内に添加し、微小液滴中又は微小ウェル内でビーズ融解と細胞溶解を実施してmRNA等の標的RNAを標的RNA捕捉オリゴ上に捕捉する態様を挙げることができる。
　別の実施態様として、細胞溶解物ないし細胞から抽出したRNAを含む溶液中に標的RNA捕捉オリゴを添加し、溶液中でmRNA等の標的RNAを捕捉オリゴ上に捕捉する態様を挙げることができる。この態様には、個々の細胞又はこれより抽出したmRNAを微小ウェルに分注し、微小ウェル内で標的RNA捕捉オリゴ上にmRNA等の標的RNAを捕捉する方法や、個々の細胞を微小液滴中にトラップし、微小液滴中で標的RNA捕捉オリゴ上に標的RNAを捕捉する方法、さらには、微小ボリュームに該当しない溶液中で標的RNA捕捉オリゴ上に標的RNAを捕捉する方法が包含される。
　さらに別の実施態様として、細胞膜透過試薬及び標的RNA捕捉オリゴが含まれる溶液中に固定した細胞を懸濁し、固定細胞内でmRNA等の標的RNAを標的RNA捕捉オリゴ上に捕捉する態様を挙げることができる。
　固相系で説明したとおり、液相系のTS/TAS-Seq法においても、標的RNAにはポリA RNAが含まれる。ポリA RNAのみを標的としてもよいし、ポリA RNA以外のRNAも併せて標的としてもよい。すなわち、TS/TAS-Seq法では、標的RNA捕捉オリゴは、標的ポリA RNA捕捉オリゴを含み、ポリA RNA以外のRNAを捕捉する標的RNA捕捉オリゴも含んでいてよい。また、標的RNA捕捉オリゴに加えて、RNA以外の核酸分子を標的として捕捉する標的捕捉オリゴをさらに含んでいてもよい。微小ウェル又は微小液滴中で標的RNAを捕捉する場合には、１個の微小ウェル又は微小液滴中に複数種類の捕捉オリゴが含まれていてもよいし、複数種類の捕捉オリゴがそれぞれ異なる微小ウェル又は微小液滴中に含まれていてもよい。
　標的ポリA RNA捕捉オリゴの典型例、ポリA以外の部位を捕捉する標的RNA捕捉オリゴの例は、固相系TS/TAS-Seq法と同様である。図４、図５のStep 1に示すように、5'キャップ構造を有する完全長mRNAだけではなく、キャップ構造を有しない不完全長mRNAやimmature mRNA、部分的に分解したmRNA等の「完全長ではないmRNA」も、ポリAを有していれば、標的捕捉部としておりT部分を有する標的ポリA RNA捕捉オリゴにより捕捉される。
　標的RNA捕捉オリゴは、3'末端に標的捕捉部を有する。標的捕捉部の5'側には、核酸増幅工程においてプライマー設定領域として利用できる第１のアダプター部分（図４、図５中ではUniversal 1として示す）が含まれていてよく、第１のアダプター部分と標的捕捉部との間に、標的RNAが由来する個々の細胞を識別するための細胞識別バーコード部分を含んでいてよい。この細胞識別バーコードは、固相系におけるビーズ識別バーコード部分及び区画識別バーコード部分に相当するバーコードである。同一の微小ウェル又は微小液滴中に１細胞と共に封入されることになる標的RNA捕捉オリゴは、同一配列の細胞識別バーコードを有しており、微小ウェルごと又は微小液滴ごとに細胞識別バーコードの配列が異なる。これにより、同じ微小ウェル又は微小液滴中で捕捉オリゴにより捕捉されたmRNAに由来するcDNAを、別の微小ウェル又は微小液滴中で捕捉されたmRNAに由来するcDNAと区別することができ、ひいては、同じ細胞に由来するcDNAを他の細胞に由来するcDNAと区別することができる。
B-2. 相補鎖合成工程（図４、図５のStep 2）
　液相系では、標的RNA捕捉工程の後、精製等を行わずそのまま続けて相補鎖合成工程に進む。標的RNA捕捉後の反応液に、ターミナルトランスフェラーゼ活性を有する逆転写酵素及びテンプレートスイッチングオリゴを添加し、逆転写反応及びTS反応をワンステップで実施する。
　本工程の詳細、テンプレートスイッチングオリゴの構造は、固相系TS/TAS-Seqと同じである。図４、図５のStep 2の1段目が、テンプレートスイッチされたcDNAである。完全長mRNAの全長に対して合成されたが、テンプレートスイッチングオリゴがハイブリダイズしなかったcDNA（図４、図５のStep 2の2段目）、完全長ではないmRNAの全長に対して合成され、テンプレートスイッチングオリゴがハイブリダイズしなかったcDNA（Step 2の3段目）、及び途中で合成がとまったcDNA（Step 2の4段目）は、テンプレートスイッチング反応を受けなかったcDNAとして反応液中に残る。
　ターミナルトランスフェラーゼ活性に加え、鎖置換活性をさらに有する逆転写酵素を用いた場合には、図５のStep 2に示すように、テンプレートスイッチされたcDNAとmRNAのハイブリッド二本鎖において、逆転写酵素の鎖置換活性により、mRNAをcDNAから剥がしながら第２鎖合成が進む。固相系と異なる点として、合成された第２鎖の3'末端とcDNA鎖の5'末端が平滑になるので、第２鎖の3'末端にも逆転写酵素のターミナルトランスフェラーゼ活性により塩基が付加され得る（付加しない場合もある）。
B-3. 未反応オリゴ除去工程（図４、図５のStep 3）
　液相系の場合、相補鎖合成が終了した反応液を核酸サイズ分画により精製することで、鎖長がごく短い未反応の標的RNA捕捉オリゴを、相補DNA鎖（mRNA-cDNAハイブリッド）から分離除去できる。未反応のテンプレートスイッチングオリゴも、未反応の捕捉オリゴと同時にワンステップで除去できる。核酸サイズ分画による精製法は周知であり、シリカメンブレンカラムによる精製や、DNAが結合する磁気ビーズを用いた精製など、常法どおりに実施できる。当該工程では、核酸サイズ分画にエキソヌクレアーゼによる除去を組み合わせてもよく、これにより未反応オリゴの除去効率をより一層高めることができる。一本鎖DNAを特異的に分解する一般的なエキソヌクレアーゼを使用することができ、その例として、Exonuclease IやExonuclease Tを挙げることができる。相補鎖合成が終了した反応液中にエキソヌクレアーゼを添加して反応後、核酸サイズ分画による精製を行うことで、エキソヌクレアーゼも同時に除去することができる。
B-4. RNA分解工程（図４、図５のStep 4）
　サイズ分画による精製後の反応液にRNA分解酵素を添加し、反応液中のmRNA-cDNAハイブリッドのmRNA、及びテンプレートスイッチングオリゴの3'末端配列（当該配列がリボヌクレオチド塩基である場合）を分解する。
　RNA分解酵素を添加してRNAを分解した後、dNTP、連鎖停止NTP及びTdT等の試薬を反応液に添加して次のホモポリマー付加工程を実施してもよいが、RNA分解酵素とこれらの試薬を同時に又は順次に反応液に添加し、RNA分解とホモポリマー付加を同時に実施することが好ましい。RNA分解工程にNaOH, KOH等のアルカリ溶液を用いた場合は、アルカリ溶液による分解反応後に反応液を中和してからTdT反応を実施する。
B-5. ホモポリマー付加工程（図４、図５のStep 4）
　dATP、dTTP、dCTP、又はdGTPと連鎖停止NTPとの存在下でTdTによる反応を行い、相補DNA鎖の3'末端にヌクレオチドホモポリマーを付加する（図４、図５のStep 4; 図にはポリCの例を示す）。連鎖停止NTPの好ましい例、dNTPと連鎖停止NTPの添加比率等、本工程の詳細は、以下に記載した点の他は固相系TS/TAS-Seqと同じである。
　図５は、相補鎖合成工程で使用する逆転写酵素が鎖置換活性をさらに有する場合の態様である。この態様では、相補鎖合成工程において、テンプレートスイッチされたcDNAに対する第２鎖（Step 4のアスタリスクで示したストランド）が合成されるため、ホモポリマー付加工程の開始時にcDNA第１鎖及び第２鎖で構成されるDNA二本鎖が反応液中に存在し、このDNA二本鎖は両末端が平滑末端又は3'突出末端となっている（図５、Step 2の１段目参照）。そのため、該DNA二本鎖においては、テンプレートスイッチされたcDNA第１鎖の3'末端だけではなく、第２鎖の3'末端にもホモポリマーが付加されうる。
B-6. 第２鎖合成工程（図４、図５のStep 5）
　RNA分解及びホモポリマー付加後の反応液を精製してRNA分解酵素及びTdT等の試薬を除去し、第２鎖合成工程に進む。液相系TS/TAS-Seqの第２鎖合成工程は、固相系と同様に、ロングプライマー及びショートプライマーを含む第２鎖合成用プライマーを用いて実施する。各プライマーの構成及び好ましい条件、本工程の詳細は、以下に記載した点の他は固相系TS/TAS-Seqと同じである。
　固相系と異なる点として、図５に示した鎖置換活性をさらに有する逆転写酵素を用いる場合の態様では、テンプレートスイッチされたcDNAに対し相補鎖合成工程で合成された第２鎖（アスタリスクのストランド）も3'末端にホモポリマーを有しうるため、Step 5に破線囲みで示した様に、このストランドのホモポリマーにロングプライマーがハイブリダイズして伸長する反応も起こりうる。この伸長反応により生じたDNA鎖は、その5'末端側にPCR増幅に必要なアダプター配列を含まないため、次の核酸増幅工程で第１及び第２のアダプターを標的とするプライマーを使用した場合は当該DNA鎖は増幅されない。
B-7. 核酸増幅工程（図４、図５のStep 6）
　第２鎖合成後、必要に応じて反応液を精製して過剰プライマー及びポリメラーゼ等の試薬を除去し、核酸増幅工程に進む。液相系における本工程は、固相系TS/TAS-Seqと同様に実施することができる。
C. nonTS/TAS-Seq法（図１）
　図１には液相系の例を示したが、固相系でも実施可能である。相補鎖合成工程において、テンプレートスイッチングオリゴの非存在下で逆転写反応を行うこと、逆転写酵素としてターミナルトランスフェラーゼ活性を有するものを使用し、鎖置換活性は不要であること以外は、TS/TAS-Seq法と同様にして実施できる。以下、TS/TAS-Seq法と異なる点を中心にnonTS/TAS-Seq法の各工程を説明する。
C-1. 標的RNA捕捉工程（図１のStep 1）
　nonTS/TAS-Seq法でも、主たる標的RNAはポリA RNAであるmRNAであり、標的RNA捕捉オリゴが標的ポリA RNA捕捉オリゴを含むことが一般に好ましい。もっとも、完全長mRNAに対するcDNAへのCCC付加を利用したTS反応を併用しないため、非ポリA RNAのみを対象としてnonTS/TAS-Seqを実施した場合にも本方法の効果を得ることができる。従って、nonTS/TAS-Seq法では、標的RNA捕捉オリゴが標的ポリA RNA捕捉オリゴを含むことは必須的ではない。
C-2. 相補鎖合成工程（図１のStep 2）
　相補鎖合成工程では、ターミナルトランスフェラーゼ活性を有する逆転写酵素を使用し、テンプレートスイッチングオリゴの非存在下で逆転写反応を行う。これにより、固相化された又は遊離の標的RNA捕捉オリゴに捕捉されたmRNAに対する相補DNA鎖が合成され、少なくとも一部の相補DNA鎖の3'末端に任意の数塩基が付加される。
C-3. 未反応オリゴ除去工程（図１のStep 3）
　固相系の場合はA-3と同様にして、液相系の場合はB-3と同様にして実施できる。
C-4. RNA分解工程（図１のStep 4）
　固相系の場合はA-4と同様にして、液相系の場合はB-4と同様にして実施できる。
C-5. ホモポリマー付加工程（図１のStep 4）
　固相系の場合はA-5と同様にして、液相系の場合はB-5と同様にして実施できる。nonTS/TAS-Seq法においても、RNA分解後にホモポリマー付加工程を実施してもよいし、RNA分解とホモポリマー付加を同時に実施してもよい。
C-6. 第２鎖合成工程（図１のStep 5）
　第２鎖合成用プライマーは、ロングプライマーを含むものを使用する。ショートプライマーは不要である。
C-7.核酸増幅工程（図１のStep 6）
　液相系及び固相系のTS/TAS-Seq法における核酸増幅反応と同様にして実施できる。
　nonTS/TAS-Seq及びTS/TAS-Seqを包含する本発明の方法により増幅した相補DNA鎖は、次世代シークエンサーによるシークエンシングに供するために、断片化、末端修復、A-tailing、シークエンス用アダプターの付加等の加工を行ってよい。これらの加工により、シークエンス用コンストラクトに加工されたcDNAのライブラリーが得られる。断片化手段としては、超音波や酵素を用いることができる。シークエンス用コンストラクトの作成は、一般的に用いられる試薬を用いることができ、酵素法の代表的なものとしてはNew England Biolabs社のNEBNext UltraII FS kitや、KAPA Biosystems社のKAPA HyperPlus kit、超音波断片化装置としてはCovarisやBioruptorなどの機械を用いることができるが、その他の同等品でも使用可能である。シークエンス用アダプターは、使用する次世代シークエンサーに応じて適当なアダプターを用いればよい。
　ライブラリーのシークエンシングは、一般に次世代シークエンサーと呼ばれるシークエンサーを用いて実施すればよい。好ましく使用できる次世代シークエンサーの具体例としては、イルミナ社のNovaseq 6000システム、Novaseq Xシステム、Hiseqシステム、Nextseqシステム、Nextseq2000システム、Nextseq3000システム、及びMiSeqシステム；MGI社のDNBseq T7システム, DNBseq G400システム, 及びDNBseq G40システム；サーモフィッシャーサイエンティフィック社のIon S5/Ion S5 XLシステム等が挙げられる。
　以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
１．固相担体を用いたscRNA-seq解析系でのTdT法（TAS-Seq法）と本発明cDNA増幅法との比較（図６、図７）
　BD Rhapsodyシステム（Beckton Dickinson）により調製した、固相ビーズ上にトラップされたシングルセルトランスクリプトームライブラリーを、TdT法（TAS-Seq法、特許文献２及び非特許文献１１）及び本発明によるcDNA増幅法（Template-switch + TdT法、又はTemplate-switch + TAS-Seq法）によりそれぞれ増幅した。使用したプライマーの配列は下記表１に示す。
　ヒト末梢血単核球 (PBMC) はLONZA社より調整後凍結保存したものを入手して用いた。凍結ヒトPBMCを37℃のウォーターバスで速やかに解凍し、懸濁液に対し9 mlの予め温めたRPMI1640/5%FBSを添加し転倒混和、遠心後上清を除去し、再度RPMI1640/5%FBSで洗浄した。フローサイトメーターで細胞数を計測し、Rhapsodyの仕様書に従いマイクロウェルカートリッジに適切な密度で細胞・ビーズをロードし、細胞を溶解、各々１つの細胞由来mRNAを１つのビーズ上(ポリA RNA捕捉オリゴとして、Rhapsody universal adapterを含む)でトラップした（標的RNA捕捉工程）。なお、ビーズ上に固相化されたRhapsody universal adapterは、下記の構造を有するDNAであり、CLS1（cell label section 1）～CLS3には、９塩基からなる各９６種の既知固有配列、合計２８８種が採用されており、全体で約90万通りのビーズ識別バーコード部分を構成している。配列表の配列番号１には、CLS1～CLS3をNNNNNNNNNとして示す。
＜Rhapsody universal adapterの構造＞
ACACGACGCTCTTCCGATCT-[none or A or GT or TCA]-(CLS1)-GTGA-(CLS2)-GACA-(CLS3)-NNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT（配列番号１）
　mRNAをトラップしたビーズ4本をそれぞれ2つに分け(合計8本)、４つはTAS-Seq法により、残り４つは本発明cDNA増幅法により逆転写～cDNA増幅を実施した。
　TAS-Seq法は、上記のポリA RNA捕捉ビーズをメーカー推奨の通りに逆転写反応を行ない（相補鎖合成工程、ターミナルトランスフェラーゼ活性及び鎖置換活性を有する逆転写酵素を使用）、その後、Exonuclease I処理により、ビーズ上の未反応のポリA RNA捕捉オリゴを除去した（未反応オリゴ除去工程）。dCTPおよびターミネーターとしてddCTPを用い、RNaseHによるmRNA分解と、TdTによるホモポリマー付加反応を20分間同時に実施した。ビーズを洗浄後、第２鎖合成反応をuniversal 2アダプター配列の3'末端にグアニンホモポリマーを有するプライマー及び高正確DNAポリメラーゼを用いて実施した。反応液に対し、universal 1及びuniversal 2配列に対するプライマー(universal oligo-long, 5'BDWTAv2)を用いたPCRにて全cDNAを9サイクル増幅した。AmPure XPビーズを用いたサイズセレクション後、5サイクルのPCRにより追加で増幅した。最終的なcDNA量をQubit fluorometerまたはnanodrop分光光度計（サーモフィッシャーサイエンティフィック）により、またcDNAのサイズ分布をMultiNAシステム (島津製作所)により測定した。
　本発明cDNA増幅法は、上記のポリA RNA捕捉ビーズをメーカー提供試薬等を用いて42℃30分逆転写反応を行ない、その後テンプレートスイッチングオリゴ(5'BDWTAv2-TSO)及びMgCl2を添加しさらに42℃30分逆転写及びテンプレートスイッチング反応を実施した（相補鎖合成工程）、その後、Exonuclease I処理により、ビーズ上の未反応のポリA RNA捕捉オリゴを除去した（未反応オリゴ除去工程）。dCTPおよびターミネーターとしてddCTPを用い、RNaseHによるmRNA分解と、TdTによるホモポリマー付加反応を20分間同時に実施した。ビーズを洗浄後、第２鎖合成反応をuniversal 2アダプター配列の3'末端にグアニンホモポリマーを有するプライマー及び高正確DNAポリメラーゼを用いて実施した。反応液に対し、universal 1 及びuniversal 2配列に対するプライマー(universal oligo-long, 5'BDWTAv2)を用いたPCRにて全cDNAを9サイクル増幅した。AmPure XPビーズ(Beckman Coulter)を用いたサイズセレクション後、5サイクルのPCRにより追加で増幅した。最終的なcDNA量をQubit fluorometerまたはnanodrop分光光度計（Thermo Fisher Scientific）により、またcDNAのサイズ分布をMultiNAシステム (島津製作所)により測定した。
　cDNA収量の比較結果を図６に示す。TdT反応のみ実施する従来のTdT法(TAS-Seq法)よりも、TS/TdT反応の両者を実施する本発明cDNA増幅法では有意により多くのcDNAが得られていた。
　cDNAサイズ分布の比較結果を図７に示す。TdT反応のみ実施する従来のTdT法(TAS-Seq法)よりも、TS/TdT反応の両者を実施する本発明cDNA増幅法では、1000-2000塩基対(bp)におけるピークが高くなっており、長い完全長cDNAがより多く合成されていることが示唆される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
２．液相系scRNA-seq解析系でのTdT法と本発明cDNA増幅法との比較（図８）
　ヒトPBMC検体を上記１．と同様の手法で取得し、細胞をカウント後、10X Genomics社Chromium v3.1試薬を用いてChromiumの仕様書に従いマイクロ流路系に適切な密度で細胞をロードし、各細胞とハイドロゲルビーズを微小液滴中に封入した。なお、Chromiumへの細胞ロードの際に、細胞溶解試薬および逆転写試薬等を含むcDNA合成試薬（逆転写酵素はターミナルトランスフェラーゼ活性及び鎖置換活性を有するものを使用）を同時にロードするが、比較のためにテンプレートスイッチングオリゴ(10X Chromium-TSO)を入れた検体と入れない検体を用意した。細胞を溶解後、各々１つの細胞由来mRNAをハイドロゲルより遊離したポリA RNA捕捉オリゴ(10X Chromium adapter)にトラップし（標的RNA捕捉工程）、そのまま微小液滴内で逆転写反応、または逆転写反応およびTS反応を37℃または53℃で1時間実施した(相補鎖合成工程)。相補鎖合成工程終了後、微小液滴を構成するエマルジョンを10X社推奨の手法にて壊し、核酸サイズ分画によりcDNAを精製することで未反応のポリA RNA捕捉オリゴおよびテンプレートスイッチングオリゴを除去した(未反応オリゴ除去工程)。なお、10X Chromium adapterは、下記の構造を有するDNAであり、CBは、16塩基からなる約90万通りの既知の識別バーコードである。配列表の配列番号５には、CBをNNNNNNNNNNNNNNNNとして示す。
＜10X Chromium adapterの構造＞
CTACACGACGCTCTTCCGATCT- (CB) NNNNNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN（配列番号５）
　得られたcDNA溶液をもとに、dCTPおよびターミネーターとしてddCTPを用い、RNaseHによるmRNA分解と、TdTによるホモポリマー付加反応を20分間同時に実施した。TdT反応液を精製後、第２鎖合成反応をuniversal 2アダプター配列の3'末端にグアニンホモポリマーを有するプライマー及び高正確DNAポリメラーゼを用いて実施した。反応液に対し、universal 1 及びuniversal 2配列に対するプライマー(universal oligo-long, 5'BDWTAv2)を用いたPCRにて全cDNAを9サイクル増幅した。AmPure XPビーズ(Beckman Coulter)を用いたサイズセレクション後、得られたcDNAをさらに5サイクルのPCRにより追加で増幅した。最終的なcDNA量をnanodrop分光光度計により、またcDNAのサイズ分布をMultiNAシステムにより測定した。
　cDNA収量およびサイズ分布の比較結果を図８に示す。TdT反応のみ実施する従来のTdT法よりも、TS/TdT反応の両者を実施する本発明cDNA増幅法ではより多くのcDNAが得られ、また1000-2000塩基対(bp)におけるピークが高くなっており、長い完全長cDNAがより多く合成されていることが示唆される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
３．液相系cDNA増幅系でのTS法と本発明cDNA増幅法との比較（図９、図１０）
　NIH3T3細胞を培養し、TRIzol reagent (Thermo Fisher Scientific)を用いてtotal RNAを抽出した。Total RNA 10ng(6検体)を用い、ポリA RNA捕捉オリゴ(BioEcoP-dT25-adapter)を加え(標的RNA捕捉工程)、Smart-seq2法(Picelli S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nat Protoc. 2014 Jan;9(1):171-81.)を用いて逆転写反応およびTS反応を42℃で1時間実施した(相補鎖合成工程、ターミナルトランスフェラーゼ活性及び鎖置換活性を有する逆転写酵素を使用)。相補鎖合成工程終了後、Pronex beads(Promega)を用いて核酸サイズ分画によりcDNAを精製した（未反応オリゴ除去工程）。3検体はそのまま全cDNAを11サイクルのPCRにより、5'BDWTAv2および3'WTA primerを用いて増幅し、AmPure XPにより精製した。残りの3検体は、dCTPおよびターミネーターとしてddCTPを用い、RNaseHによるmRNA分解と、TdTによるホモポリマー付加反応を20分間同時に実施した。TdT反応液を精製後、第２鎖合成反応をuniversal 2アダプター配列の3'末端にグアニンホモポリマーを有するプライマー及び高正確DNAポリメラーゼを用いて実施した。反応液に対し、universal 1 及びuniversal 2配列に対するプライマー(5'BDWTAv2および3'WTA primer)を用いたPCRにて全cDNAを11サイクル増幅し、AmPure XPにより精製した。最終的なcDNA量をQubit Fluorometerにより、またcDNA中のActb, Rps3遺伝子の相対的な含有量につき定量リアルタイムPCR(qPCR)で、またcDNAのサイズ分布をMultiNAシステムにより測定した。
　cDNA収量の比較結果を図９に示す。TS法(Smart-seq2法)のみでの増幅よりも、TS/TdT反応の両者を実施する本発明cDNA増幅法では、有意に全cDNA収量が約3倍、Rps3, Actb遺伝子の収量が増加しており、cDNA合成効率が大幅に上昇していることが示唆される。
　代表的なcDNA分布の比較結果を図１０に示す。TS法(Smart-seq2法)のみでの増幅よりも、TS/TdT反応の両者を実施する本発明cDNA増幅法では、300-700bpのサイズの小さいcDNAの全体に占める割合が増加していることが認められ、逆転写がmRNAの途中で停止したcDNAや、immatureなmRNA、部分的に分解したmRNAなどのTS反応がかかりにくい核酸が本発明cDNA増幅法では捉えられている可能性が示唆される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
４．固相担体を用いたscRNA-seq解析でのTdT法、random priming法と本発明cDNA増幅法との検出遺伝子数の比較（図１１）
　8週齢のマウス脾臓を摘出し、赤血球溶血バッファー(3 ml ACK buffer (155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA)を満たした6-wellプレートの上においた70μmストレーナーの上で優しく脾臓をすりつぶし、細胞懸濁液を回収した。懸濁液に対し7 mlのDMEM/5%FBSを添加し転倒混和、遠心後上清を除去し、再度DMEM/5%FBSで洗浄した。取得した細胞を用い、TdT法（TAS-Seq法）、本発明cDNA増幅法、およびBD Rhapsodyキット付属のrandom primingによるcDNA増幅を実施した。逆転写酵素はターミナルトランスフェラーゼ活性及び鎖置換活性を有するものを使用した。得られたcDNAよりシーケンスライブラリを作成後、Illumina Novaseq 6000にてシーケンスを実施した。シーケンスライブラリ作成に用いたプライマー配列を表４に示す。得られたシーケンスデータをリファレンス配列(GRCm38-101)にマッピングし、細胞毎の遺伝子発現データを得た。また比較のために、公共データベースよりマウス脾臓細胞の10X Chromium v3.1で取得したデータ(TS法、accession ID: GSE192930)をダウンロードした。得られたデータにつき、細胞あたりのリード数の中央値が均一となるようにシーケンスデータをダウンサンプリングし、再度リファレンス配列(GRCm38-101)にマッピングし、細胞毎の遺伝子発現データを得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　検出遺伝子数およびリード数の比較結果を図１１に示す。本発明cDNA増幅法で得られたデータ(TAS-Seq2)では、他の手法と比較してより多くの遺伝子が検出されることが見出された。これより、本発明の増幅法の、固相系シングルセルトランスクリプトーム解析における有用性が示された。
５．液相系を用いたscRNA-seq解析でのTS法と本発明cDNA増幅法との検出遺伝子数の比較（図１２－図１４）
　ヒトPBMC検体（3検体）を上記１．と同様の手法で取得し、細胞をカウント後、10X Genomics社Chromium v3.1試薬を用いてChromiumの仕様書に従いマイクロ流路系に適切な密度で細胞をロードし、各細胞とハイドロゲルビーズを微小液滴中に封入した。1検体につき、2ライブラリーを作成した。細胞を溶解後、各々１つの細胞由来mRNAをハイドロゲルより遊離したポリA RNA捕捉オリゴ(10X Chromium adapter)にトラップし（標的RNA捕捉工程）、そのまま微小液滴内で逆転写反応およびTS反応を53℃で1時間実施した(相補鎖合成工程、ターミナルトランスフェラーゼ活性及び鎖置換活性を有する逆転写酵素を使用)。相補鎖合成工程終了後、微小液滴を構成するエマルジョンを10X社推奨の手法にて壊し、核酸サイズ分画によりcDNAを精製することで未反応のポリA RNA捕捉オリゴおよびテンプレートスイッチングオリゴを除去した(未反応オリゴ除去工程)。得られたcDNA溶液をもとに、3検体それぞれ由来のライブラリーのうちの１つはそのままuniversal 1及びuniversal 2配列に対するプライマー(universal oligo-long, 5'BDWTAv2)を用いたPCRにて全cDNAを9サイクル増幅した。AmPure XPビーズ(Beckman Coulter)を用いたサイズセレクション後、得られたcDNAをさらに5サイクルのPCRにより追加で増幅した。残りの3検体それぞれ由来のライブラリのうちのもう１つに関しては、dCTPおよびターミネーターとしてddCTPを用い、RNaseHによるmRNA分解と、TdTによるホモポリマー付加反応を20分間同時に実施した。TdT反応液を精製後、第２鎖合成反応をuniversal 2アダプター配列の3'末端にグアニンホモポリマーを有するプライマー及び高正確DNAポリメラーゼを用いて実施した。反応液に対し、universal 1 及びuniversal 2配列に対するプライマー(universal oligo-long, 5'BDWTAv2)を用いたPCRにて全cDNAを9サイクル増幅した。AmPure XPビーズ(Beckman Coulter)を用いたサイズセレクション後、得られたcDNAをさらに5サイクルのPCRにより追加で増幅した。
　得られたcDNAよりシーケンスライブラリを作成後、Illumina Novaseq 6000にてシーケンスを実施した。シーケンスライブラリ作成に用いたプライマー配列を表５に示す。得られたシーケンスデータをヒトリファレンス配列に10X社Cell rangerソフトウェアを用いてマッピングし、細胞毎の遺伝子発現データを得た。得られたデータにつき、細胞あたりのリード数の中央値が均一となるようにシーケンスデータをダウンサンプリングし、再度ヒトリファレンス配列にマッピングし、細胞毎の遺伝子発現データを得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　検出遺伝子数およびリード数の比較結果を図１２に示す。本発明cDNA増幅法で得られたデータ(10XTAS-Seq2)では、TS法のみのデータ(10X)と比較して、各由来が同一の3サンプルそれぞれにおいて、より多くの遺伝子が検出されることが見出された。
　細胞のクラスタリング結果を図１３に示す。本発明cDNA増幅法で得られたデータ(10X+TAS-Seq2)では、TS法のみのデータ(10X)と比較して、UMAP空間上における、異なった性質を有する各種細胞集団の分離が向上していることが見出された。
　細胞のクラスタリング結果に基づいた、各種細胞集団中における、検出遺伝子数とリード数の比較を図１４に示す。検出されたすべての細胞集団において、本発明cDNA増幅法で得られたデータ(10X+TAS-Seq2)では、TS法のみのデータ(10X)と比較して、細胞あたり検出遺伝子数が増加していることが見出された。シングルセルトランスクリプトーム解析の大きな用途の一つは、細胞集団の分離同定とその性質の解明であることから、本発明の、液相系シングルセルトランスクリプトーム解析を用いた細胞集団の分離同定と性質の解明における有用性が示された。
　また、本発明によれば、解析費用が同額の場合、１細胞当たりの情報量を、従来法に比べて1.5-2倍に増大できる。その一方、従来法と同程度の1細胞あたりの情報量を得る場合には、必要とされるシーケンス分析費用を1/2-1/3倍とすることができる(図１４)。とくに昨今scRNA-seq解析では解析細胞数が従来の数万から数十万へと、細胞スループットが大きく増大しつつあるものの、１細胞あたりに必要とされるシーケンス解析量は変化がないので、今後シーケンス分析費用がscRNA-seq解析のボトルネックとなることが予想される。本発明は、近い将来scRNA-seq解析費用の大部分を占めると予想されるシーケンス解析費用を1/2-1/3倍に削減でき、費用対効果を上昇させ、産業上の利用に関して大きく寄与するものと考えられる。

Claims (23)

  1. 　標的捕捉部を含む標的RNA捕捉オリゴにより、標的RNAを捕捉する、標的RNA捕捉工程；
    　ターミナルトランスフェラーゼ活性を有する逆転写酵素を用いて逆転写反応を行うことにより、捕捉したRNAと相補的な配列の相補DNA鎖を合成し、少なくとも一部の相補DNAの3'末端に任意の数塩基からなる付加配列を付加する、相補鎖合成工程；
    　標的RNAを捕捉していない標的RNA捕捉オリゴを除去する、未反応オリゴ除去工程；
    　RNA分解酵素によりRNAを分解する、RNA分解工程；
    　dATP、dTTP、dCTP又はdGTPと連鎖停止ヌクレオチド三リン酸との存在下でターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによる反応を行い、前記相補DNA鎖の3'末端にヌクレオチドホモポリマーを付加する、ホモポリマー付加工程；
    　前記ヌクレオチドホモポリマーに対し相補的な配列の相補的ホモポリマー部分を含むプライマーを含む第２鎖合成用プライマーを用いて、前記相補DNA鎖に対し第２鎖合成を行い、相補DNA鎖及び第２鎖で構成されるDNA二本鎖を生成する、第２鎖合成工程；及び
    　前記DNA二本鎖を鋳型として核酸増幅反応を行う、核酸増幅工程
    を含む、相補DNA鎖を増幅する方法。
  2. 　標的RNA捕捉オリゴが、標的捕捉部の5'側に第１のアダプター部分を含み、第２鎖合成用プライマーが、相補的ホモポリマー部分の5'側に第２のアダプター部分を含むロングプライマーを含み、核酸増幅工程において、第１のアダプターを標的とするプライマーと、第２のアダプターを標的とするプライマーとを用いて核酸増幅反応を行う、請求項１記載の方法。
  3. 　第２鎖合成用プライマーが、相補的ホモポリマー部分の5'側に第２のアダプター部分を含むロングプライマーを含み、核酸増幅工程において、第２のアダプターを標的とするプライマーと、相補DNA鎖中の所望の領域を標的とするプライマーとを用いて核酸増幅反応を行う、請求項１記載の方法。
  4. 　ロングプライマーが、第２のアダプター部分と相補的ホモポリマー部分の間にランダムな配列からなる分子バーコード部分を含む、請求項２又は３記載の方法。
  5. 　ロングプライマーの相補的ホモポリマー部分の鎖長が６～１５塩基である、請求項２又は３記載の方法。
  6. 　標的RNA捕捉オリゴが、固相担体に結合していない遊離のオリゴであり、未反応オリゴ除去工程が核酸サイズ分画により行われる、請求項１記載の方法。
  7. 　標的RNA捕捉オリゴが、5'側から3'側に向かって、第１のアダプター部分、細胞識別バーコード部分、及び標的捕捉部を含む、請求項６記載の方法。
  8. 　標的RNA捕捉オリゴが、固相担体に結合した固相化オリゴであり、未反応オリゴ除去工程がエキソヌクレアーゼ処理により行われる、請求項１記載の方法。
  9. 　前記固相担体がビーズであり、標的RNA捕捉オリゴが、5'側から3'側に向かって、第１のアダプター部分、ビーズ識別バーコード部分、及び標的捕捉部を含む、請求項８記載の方法。
  10. 　前記固相担体がプレートであり、標的RNA捕捉オリゴが、プレートの複数箇所の区画に固定化され、5'側から3'側に向かって第１のアダプター部分、区画識別バーコード部分、及び標的捕捉部を含む、請求項８記載の方法。
  11. 　標的RNA捕捉オリゴが、標的捕捉部としてポリT部分を含む標的ポリA RNA捕捉オリゴを含み、標的RNAがポリA RNAを含む、請求項１記載の方法。
  12. 　相補鎖合成工程において、前記付加配列とハイブリダイズ可能な配列を3'末端に含み、かつ、該配列の5'側にスイッチング配列を含むテンプレートスイッチングオリゴの共存下で逆転写反応が行われ、前記付加配列が付加された相補DNA鎖にテンプレートスイッチングオリゴをハイブリダイズさせ、該相補DNA鎖の3'末端にスイッチング配列と相補的な配列をさらに付加する、請求項１１記載の方法。
  13. 　テンプレートスイッチングオリゴが、前記付加配列とハイブリダイズ可能な配列としてGGG、GUG又はNGG（G及びUはリボヌクレオチドの塩基、NはA、U、G及びCから選択されるいずれかのリボヌクレオチドの塩基であり、１個以上のヌクレオチドアナログを含んでいてもよい）を3'末端に含むオリゴヌクレオチドを含み、スイッチング配列が第２のアダプター部分を含む、請求項１２記載の方法。
  14. 　スイッチング配列が、第２のアダプター部分の3'側にランダムな配列からなる分子バーコード部分を含む、請求項１３記載の方法。
  15. 　標的RNA捕捉オリゴが、固相担体に結合していない遊離のオリゴであり、未反応オリゴ除去工程が、標的RNAを捕捉していない標的RNA捕捉オリゴ及び相補DNA鎖にハイブリダイズしていないテンプレートスイッチングオリゴの核酸サイズ分画による除去を含む、請求項１２記載の方法。
  16. 　第２鎖合成用プライマーが、相補的ホモポリマー部分の5'側に第２のアダプター部分を含むロングプライマーと、相補的ホモポリマー部分を含まず、第２のアダプター部分をその3'側に含むショートプライマーとを含む、請求項１２記載の方法。
  17. 　ロングプライマーが、第２のアダプター部分と相補的ホモポリマー部分の間にランダムな配列からなる分子バーコード部分を含む、請求項１６記載の方法。
  18. 　相補鎖合成工程において、前記テンプレートスイッチングオリゴの共存下で、鎖置換活性をさらに有する逆転写酵素を用いて逆転写反応が行われ、テンプレートスイッチングオリゴがハイブリダイズした相補DNA鎖に対する第２鎖合成が行われる、請求項１２記載の方法。
  19. 　連鎖停止ヌクレオチド三リン酸が、ddNTP、ddNTPの誘導体、3'-dNTP、又は3'-デオキシ-5-メチルウリジン-5'-三リン酸である、請求項１記載の方法。
  20. 　ddNTPの誘導体が、OH基を有しない原子団で3'位が修飾されたddNTPである、請求項１９記載の方法。
  21. 　連鎖停止ヌクレオチド三リン酸がddNTPである、請求項１９記載の方法。
  22. 　ホモポリマー付加工程において、dCTP及び連鎖停止CTPを添加してポリC付加を行う、請求項１記載の方法。
  23. 　RNA分解工程とホモポリマー付加工程が同時に実施される、請求項１記載の方法。
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