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WO2024140950A1 - 一种新型5'-非翻译区元件及其应用 - Google Patents

一种新型5'-非翻译区元件及其应用 Download PDF

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WO2024140950A1
WO2024140950A1 PCT/CN2023/142894 CN2023142894W WO2024140950A1 WO 2024140950 A1 WO2024140950 A1 WO 2024140950A1 CN 2023142894 W CN2023142894 W CN 2023142894W WO 2024140950 A1 WO2024140950 A1 WO 2024140950A1
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WO
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sequence
untranslated region
nucleic acid
acid molecule
artificial
Prior art date
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PCT/CN2023/142894
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French (fr)
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康涛
张文静
张景明
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Themedium Therapeutics Co Ltd
Original Assignee
Themedium Therapeutics Co Ltd
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Publication date
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Definitions

  • the present application generally relates to the field of molecular biology. More specifically, it relates to a novel artificial 5'-untranslated region element (5'-UTR) and an artificial nucleic acid molecule comprising the same, as well as the use of the novel artificial 5'-untranslated region element (5'-UTR) and an artificial nucleic acid molecule comprising the same in protein expression.
  • a novel artificial 5'-untranslated region element (5'-UTR) and an artificial nucleic acid molecule comprising the same, as well as the use of the novel artificial 5'-untranslated region element (5'-UTR) and an artificial nucleic acid molecule comprising the same in protein expression.
  • nucleic acid drugs including therapeutic drugs and preventive drugs
  • the artificial nucleic acid molecule may further include a nucleic acid sequence encoding a signal peptide; further, the nucleic acid molecule may further include a polyadenylic acid sequence or a polyadenylic acid signal sequence.
  • nucleic acid elements can be connected directly or through linkers.
  • the above-mentioned artificial nucleic acid molecule or vector or RNA can encode at least one therapeutic protein or polypeptide, including broad protein molecules such as cytokines, chemokines, interleukins, interferons, growth factors, coagulation factors, anticoagulants, blood factors, bone morphogenic proteins, immunoglobulins and enzymes, etc.
  • therapeutic protein or polypeptide including broad protein molecules such as cytokines, chemokines, interleukins, interferons, growth factors, coagulation factors, anticoagulants, blood factors, bone morphogenic proteins, immunoglobulins and enzymes, etc.
  • Prevention includes: (1) inhibiting the onset of a disease in a subject or patient who may be at risk for and/or susceptible to the disease but does not yet experience or display any or all symptoms or signs of the disease; and/or (2) slowing the onset of symptoms or signs of a disease in a subject or patient who may be at risk for and/or susceptible to the disease but does not yet experience or display any or all symptoms or signs of the disease.
  • Protein refers to a polymer of amino acid residues and includes a wide range of protein molecules such as cytokines, chemokines, interleukins, interferons, growth factors, coagulation factors, anticoagulants, blood factors, bone morphogenic proteins, immunoglobulins, and enzymes.
  • peptides composed of 2 to 10 amino acids oligopeptides (small molecule peptides); peptides composed of 10 to 50 amino acids are called polypeptides; peptides composed of more than 50 amino acids are called proteins. In other words, proteins are sometimes also called polypeptides.
  • Antigenic epitopes also known as antigenic determinants, can be composed of continuous sequences (protein primary structure) or discontinuous protein three-dimensional structures, and are special chemical groups that determine antigenicity. Most antigenic epitopes exist on the surface of antigenic substances, and some exist inside antigenic substances and are exposed only after being treated with enzymes or other methods. A natural antigenic substance can have multiple and multiple determinants. The larger the antigen molecule, the more epitopes there are.
  • the T7 promoter sequence is: TAATACGACTCACTATAGG (SEQ ID No.19); the UTR sequence to be tested is shown in Table 1, and the luciferase reporter gene sequence is:
  • the PCR product was purified by centrifugation on a purification column.
  • Upstream primer CGACGGCCAGAGAATTCGAGCTCGGTACCTCGCGAATACATC (SEQ ID No. 15);
  • Downstream primer GCCGCCCACTCAGACTTTATTCAAAG (SEQ ID No.16).
  • the target mRNA was purified from the transcribed product using NucleoSpin RNA Clean-up (740948.250, Macherey-Nagel) with the following steps:
  • HEK293 cells ATCC cultured on the wall were digested and plated in 96-well plates. Each mRNA to be tested was transfected with lipo3000, and the luciferase activity was detected 24 hours after transfection. The specific steps are as follows:
  • the cells were diluted to 3 ⁇ 10 5 cells/mL with DMEM complete medium, plated into 96-well plates, 100 ⁇ L/well (about 30,000 cells/well), and cultured in a 37°C incubator overnight.
  • the luciferase activity is shown in Figure 1.
  • the luciferase expression levels of UTR2 and UTR4 were more than 2 times higher than that of the control group, and the luciferase expression levels of UTR8 and UTR9 were more than 4 times higher than that of the control group, even reaching nearly 8 times;
  • the luciferase expression levels of UTR10, UTR11 and UTR12 were 2-4 times higher; compared with the control UTR, the luciferase expression level of UTR13 was 4-6 times higher.
  • Example 4 Candidate UTR drives plasma hEPO expression
  • IVTT In vitro transcription
  • This experiment used the forced degradation method to detect the solution stability of each UTR-mRNA to be tested.
  • the UTR-mRNA to be tested was dissolved in a forced degradation solution (500mM CHES, 100mM MgCl2, pH 10), and the UTR-mRNA solution was taken out at different time points (0.5h, 1h, 1.5h, 2h, 3h, 5h, 9h, 24h), and after neutralization and degradation (neutralization solution components: 5 ⁇ L 1M Tris-HCl pH 7 + 1 ⁇ L 500mM EDTA-Na pH 8.0), capillary electrophoresis (Agilent5200) was used for mRNA integrity detection.
  • a forced degradation solution 500mM CHES, 100mM MgCl2, pH 10.
  • the 5'-untranslated region element of the present application can improve the protein expression performance of the nucleic acid molecule containing it by at least 25%, at least 50%, at least 75%, at least 100% or at least 150%.
  • the expression efficiency is improved by at least 50%, at least 100%, at least 150%, at least 200%, at least 250%, at least 300%, at least 350%, at least 400%, at least 500%, at least 600%, at least 700% or at least 800%. Therefore, it can be used to construct artificial nucleic acid molecules with high expression performance and has extremely high application prospects in the development of nucleic acid therapeutic drugs.

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Abstract

提供了一种新型5'-非翻译区元件，所述5'-非翻译区元件包括天然高表达基因的5'-非翻译区全长序列；或包括天然高表达基因的5'-非翻译区片段序列，而且该5'-非翻译区片段序列不含有TOP基序位点(比如CTTTT)和uORF序列(开放阅读框上游的AUG)；或包括天然高表达基因的5'-非翻译区片段序列、非结构序列、增强转录序列和Kozac序列，而且该5'-非翻译区片段序列不含有TOP基序位点和uORF序列。还公开了5'-非翻译区元件使得包含其的核酸分子具有极高的蛋白表达性能和表达效率，因此可用于构建高表达性能的人工核酸分子，在核酸类治疗药物的开发中具有应用前景。

Description

一种新型5’-非翻译区元件及其应用
交叉引用
本申请要求于2022年12月29日提交的、申请号为2022117042468、发明名称为“一种新型5’-非翻译区元件及其应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本申请总体上涉及分子生物学领域。更具体地，它涉及一种新型人工5’-非翻译区元件(5’-UTR)及包含其的人工核酸分子，以及新型人工5’-非翻译区元件(5’-UTR)及包含其的人工核酸分子在蛋白表达中的应用。
背景技术
治疗或预防性核酸具有彻底改变疫苗接种、基因疗法、蛋白质替代疗法和其他遗传疾病疗法的潜力。自2000年开始对治疗性核酸的首次临床研究以来，核酸分子的设计及其递送方法的研究已经取得了重大进展。然而，核酸药物(包含治疗性药物和预防性药物)仍面临若干挑战，包括药物递送和成药性等多方面。
在对抗新冠肺炎的过程中，mRNA作为新型疫苗得到了临床和市场的双重验证，并在蛋白质补充疗法、基因编辑、细胞治疗等领域也表现出巨大潜力。mRNA疫苗或药物以mRNA序列的形式导入细胞，利用细胞的蛋白翻译机器产生目的蛋白质以发挥作用。mRNA的5’cap、UTR、polyA尾、CDS、非天然核苷酸修饰等都与mRNA翻译效率和mRNA稳定性密切相关。其中5’UTR的两个重要功能是稳定mRNA分子和协助核糖体亚单位定位起始密码子，因此对调节mRNA翻译效率和mRNA稳定性至关重要。实现5’UTR上述功能的主要机理，比如：(1)5’UTR区域的上游开放阅读框(uORF)可以调节特定基因表达量的高低和表达产物变异体的种类；(2)5’UTR区域的二级结构阻碍核酸酶的5’-3’降解活性；(3)5’UTR区域ACAC非结构短序列对核糖体的亲和活性差异；(4)5’UTR序列长度覆盖几nt至数千nt的范围，为mRNA翻译效率和稳定性提供了另一层面的调控机理多样性。
天然基因UTR有其序列多样性和高级结构多样性，天然高表达基因5’UTR更有其序列和结构的天然优势，为开发可用于疫苗或药物的新型UTR序列提供了更多可能性。
发明内容
本申请首先提供了一种新型人工5’-非翻译区元件，所述5’-非翻译区元件由以下基序可操作性连接而成：转录增强序列(比如AATAA)、Kozac序列(GCCACC)和天然高表达基因的5’-非翻译区全长序列；或转录增强序列、Kozac序列和天然高表达基因 的5’-非翻译区片段序列，该天然高表达基因的5’-非翻译区片段序列不含有TOP基序位点(比如CTTTT或者其他本领域公开的TOP基序位点序列)和uORF序列(开放读码框上游的“ATG”)；或转录增强序列、Kozac序列、非结构序列(比如，只有A、T、C三种核苷酸构成的，理论上无法形成二级结构的核酸链序列)，和天然高表达基因的5’-非翻译区片段序列，该天然高表达基因的5’-非翻译区片段序列不含有TOP基序位点(比如CTTTT或者其他本领域公开的TOP基序位点序列)和uORF序列(开放读码框上游的“AUG”)。上述基序自5’至3’方向的连接顺序可以为：
(1)转录增强序列、天然高表达基因的5’-非翻译区全长序列、Kozac序列；或
(2)转录增强序列、天然高表达基因的5’-非翻译区片段序列去除TOP基序位点(比如CTTTT)和uORF序列(开放读码框上游的AUG)的序列、Kozac序列；或
(3)转录增强序列、天然高表达基因的5’-非翻译区片段序列去除TOP基序位点(比如CTTTT)和uORF序列(开放读码框上游的AUG)的序列、非结构序列、Kozac序列。
上述天然高表达基因可以来自任何种属，可以是哺乳动物如人源的基因，也可以是病毒、细菌等微生物来源的基因。例如，可以是人核糖体蛋白S25、人肌动蛋白β、人血红蛋白亚基α、人血红蛋白亚基β、人补体因子3、人细胞色素B-245α、人TM4SF1基因、人TXNIP基因、人RPS11等基因或上述基因的突变体。在优选实施方案中，本申请选取的5’UTR候选序列主要来源于人源细胞高表达基因，比如核糖体蛋白S25、核糖体蛋白S11、肌动蛋白β、血红蛋白亚基α、血红蛋白亚基β、硫氧还蛋白互作蛋白(thioredoxin interacting protein,TXNIP)、补体因子3、细胞色素B-245α、人跨膜4l6家族成员1(transmembrane-4 L-six family member-1，TM4SF1)等基因。突变体截取自天然基因5’UTR的5’端、3’端或5’与3’端之间的任一区段；突变体长度为50nt至200nt核苷酸；将其中的TOP基序突变为CTTT或CTT或CT或C；将其中ATG的uORF序列突变为ATT或完全删除ATG三个核苷酸；突变体5’端和/或3’端无其他序列或突变体5’端和/或3’端连接非结构核酸序列。
天然高表达基因的5’-非翻译区片段序列截取自天然基因5’UTR的5’端、3’端或5’与3’端之间的任一区段；片段长度50nt至200nt核苷酸；该片段将TOP基序位点突变为CTTT或CTT或CT或C；片段里诸如ATG的uORF序列突变为ATT或完全删除ATG三个核苷酸；片段5’端和/或3’端无其他序列；片段5’端和/或3’端可操作性连接非结构核酸序列，这种连接可以是直接连接也可以通过接头连接。
在本申请提供的新型人工5’-非翻译区元件中，增强转录序列可选自AATAA、ATAAT或AATAAA；Kozac序列选自GCCACC；非结构序列是指只有A、T、C三种核 苷酸构成的，理论上无法形成二级结构的核酸链序列，长度为30nt至50nt，以“AC”为骨架和主要组成的不含“G”的核苷酸序列，例如不含有G，AC含量80％以上，T含量20％以下的序列，优选情况下非结构序列选自CACACCCACTACACCTACACATATCTACTCACCTACACACTAATA(SEQ ID No.21)或CATACCCAAATTTATATCTACATCTAAACCCAATTATTACCC(SEQ ID No.22)或ACCACACACTTATCTACACAACTCAATCC(SEQ ID No.23)或TCCACCCAACCCACTACTAATACCCACAACCCAACACCC(SEQ ID No.24)或AACCCACACACTCACCTACTCATCCA(SEQ ID No.25)，非结构序列更优选为CACACCCACTACACCTACACATATCTACTCACCTACACACTAATA(SEQ ID No.21)。
在本申请的另一方面，还提供了一种人工核酸分子，这种人工核酸分子包含：
至少一个前述的5’-非翻译区元件；
至少一个开放读码框；
至少一个3’-非翻译区元件。
上述人工核酸分子可以包括天然的核苷酸，也可以包括核苷酸模拟物或功能类似物，还可以包括核苷酸的化学修饰形式。
功能性核苷酸类似物包括但不限于锁核酸LNA、肽核酸PNA或吗啉环寡聚核苷酸核酸模拟物或功能类似物中的一种或一种以上的组合。
核苷酸化学修饰可以位于所述核酸分子的骨架键上。所述骨架键可以通过置换一个或多个氧原子而加以修饰。对所述骨架键的修饰可以包括用硫代磷酸酯键置换至少一个磷酸二酯键。
所述核苷酸化学修饰可以位于核苷上。核苷上的修饰可以位于所述核苷的糖及碱基上。所述核苷上的糖可以选自以下一种或多种：2’-氟代核糖、核糖、2’-脱氧核糖、阿拉伯糖、己糖。
所述核苷酸的化学修饰形式可以选自以下一种或多种：5-甲基胞嘧啶、假尿苷、1-甲基假尿苷、吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧基甲基-尿苷、1-羧基甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷、1-牛磺酸甲基-4-硫代-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿苷、二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、5-氮杂- 胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙酰基胞苷、5-甲酰基胞苷、N4-甲基胞苷、5-羟基甲基胞苷、1-甲基-假异胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假异胞苷、2-硫代-胞苷、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、扎布拉林(zebularine)、5-氮杂-扎布拉林、5-甲基-扎布拉林、5-氮杂-2-硫代-扎布拉林、2-硫代-扎布拉林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-脱氮-2-氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2-氨基嘌呤、7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷、2-甲基硫代-N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷、N6-甘氨酰氨基甲酰腺苷、N6-苏氨酰氨基甲酰腺苷、2-甲基硫代-N6-苏氨酰氨基甲酰腺苷、N6,N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲基硫代-腺嘌呤、2-甲氧基-腺嘌呤、肌苷、1-甲基-肌苷、怀俄苷、怀丁苷、7-脱氮-鸟苷、7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、6-硫代-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷、6-硫代-7-甲基-鸟苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、N2,N2-二甲基鸟苷、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫代-鸟苷、N2-甲基-6-硫代-鸟苷和N2,N2-二甲基-6-硫代-鸟苷。这些修饰，可以是随机的，也可以是在特定位点上。
进一步地，上述人工核酸分子还可以包括编码信号肽的核酸序列；更进一步地，上述核酸分子还可以包括聚腺苷酸序列或聚腺苷酸信号序列。
所有的核酸元件之间，可以直接连接，也可以通过连接子进行连接。
在第三方面，本申请还提供了包含上述人工核酸分子的载体。
在第四方面，本申请还提供了包含上述载体的宿主细胞。
在第五方面，本申请还提供了使用上述人工核酸分子或载体转录获得的RNA，所述RNA可以为自复制RNA(self-amplification RNA)、长链非编码RNA(LncRNA)、环状RNA(circRNA)或mRNA，所述RNA优选为mRNA。
在第六方面，本申请还提供了上述人工核酸分子或载体或RNA编码的蛋白或多肽，所述蛋白或多肽可以是预防性蛋白或多肽，也可以是治疗性蛋白或多肽。
在一种优选情况下，上述人工核酸分子或载体或RNA能够编码至少一种抗原或其片段或其表位，所述抗原选自致病性抗原，例如肿瘤相关抗原或病原微生物抗原。
在另一种优选情况下，上述人工核酸分子或载体或RNA能够编码至少一种治疗性蛋白或多肽，包括广义的蛋白分子诸如细胞因子、趋化因子、白介素、干扰素、生长因子、凝血因子、抗凝剂、血液因子、骨形态形成蛋白、免疫球蛋白和酶等。
本申请还提供了上述人工核酸分子或载体或宿主细胞或RNA或其编码的蛋白或多肽在制备药物中的应用。
本申请还提供了一种药物，所述药物包括上述人工核酸分子或载体或宿主细胞或RNA或其编码的蛋白或多肽以及药学上可接受的载体或辅料。药用辅料是指生产药品和调配处方时使用的赋形剂和附加剂；是除活性成分以外，在安全性方面已进行了合理的评估，且包含在药物制剂中的物质。药用辅料除了赋形、充当载体、提高稳定性外，还具有增溶、助溶、缓控释等重要功能，是可能会影响到药品的质量、安全性和有效性的重要成分。按照作用和用途，药用辅料可分为溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等。
本申请还提供了上述人工核酸分子、载体、宿主细胞、蛋白或多肽在制备上述药物中的应用。
本申请的有益效果：
本申请提供了一种新型的5’-非翻译区元件，与现有技术中公开使用的UTR相比，包含本申请新型UTR的核酸分子在蛋白表达性能方面提高至少25％，至少50％，至少75％，至少100％，至少150％；在表达效率方面提高至少50％，至少100％，至少150％，至少200％，至少250％，至少300％，至少350％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％。
附图说明
图1所示为候选UTR的相对萤光素酶活性检测结果，与对照UTR(图1Ctrl,BNT162b2 5’UTR)和UTR1相比，UTR2和UTR4的萤光素酶表达量高于对照组2倍以上，UTR8和UTR9的萤光素酶表达量高于对照组4倍以上甚至达到近8倍；UTR10、UTR11和UTR12，与对照UTR相比，萤光素酶表达量高出2-4倍；UTR13比对照UTR相比萤光素酶表达量高出4-6倍。
图2中A图所示为候选UTR驱动的血浆hEPO表达量检测。与对照UTR(Ctrl:BNT162b2 5’UTR和HBA1基因的3’UTR)相比，尾静脉注射LNP包载的待测UTR-mRNA至小鼠，6小时后收集血浆，使用ELISA法检测血浆hEPO浓度，UTR8和UTR13分别提升蛋白表达相对浓度近2倍；B图所示候选5’UTR搭配BNT162b2 3’UTR驱动的血浆hEPO表达量检测。Ctrl*代表BNT162b2 5’UTR+3’UTR，在与 BNT162b23’UTR组合的情况下，UTR8和UTR13均提高了蛋白表达相对浓度。
图3所示为候选UTR-mRNA溶液稳定性测试。其中A图为使用毛细管电泳法(Agilent 5200)进行mRNA完整性检测的结果，B图为定量曲线图，结果显示对照及候选UTR mRNA的溶液半衰期相当；其中Ctrl:对照UTR；A图中序号1-8分别代表如下时间点：0.5h、1h、1.5h、2h、3h、5h、9h和24h。
具体实施方式
A.定义
“预防(prevention)”或“预防(preventing)”包括：(1)抑制受试者或患者的疾病发作，所述受试者或患者可能有患所述疾病的风险和/或易患所述疾病，但尚未经历或表现出所述疾病的任何或所有病状或征状；和/或(2)减慢受试者或患者中的疾病的病状或征状发作，所述受试者或患者可能有患所述疾病的风险和/或易患所述疾病，但尚未经历或表现出所述疾病的任何或所有病状或征状。
“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”包括(1)抑制正经历或表现出疾病的病状或征状的受试者或患者中的所述疾病(例如，阻止所述病状和/或征状的进一步发展)，(2)改善正经历或表现出疾病的病状或征状的受试者或患者中的所述疾病(例如，逆转所述病状和/或征状)，和/或(3)实现正经历或表现出疾病的病状或征状的受试者或患者中的所述疾病的任何可测量的减轻。
“蛋白质”、“多肽”或“肽”是指氨基酸残基的聚合物，包括宽范围的蛋白分子诸如细胞因子、趋化因子、白介素、干扰素、生长因子、凝血因子、抗凝剂、血液因子、骨形态形成蛋白、免疫球蛋白和酶。治疗性蛋白的一些非限制性例子包含下述的治疗性蛋白或其片段、变体或衍生物：用于治疗代谢或内分泌紊乱的治疗性蛋白，其包括酸性鞘磷脂酶，Adipotide，Agalsidase-β，Alglucosidase，α-半乳糖苷酶A，α-葡糖苷酶，α-L-艾杜糖苷酸酶，α-N-乙酰葡糖苷酶，双调蛋白，血管生成素(Ang1，Ang2，Ang3，Ang4，ANGPTL2，ANGPTL3，ANGPTL4，ANGPTL5，ANGPTL6，ANGPTL7)，β动物纤维素，β-葡糖醛酸糖苷酶，骨形态发生蛋白BMPs(BMP1，BMP2，BMP3，BMP4，BMP5，BMP6，BMP7，BMP8a，BMP8b，BMP10，BMP15)，CLN6蛋白，表皮生长因子(EGF)，Epigen，表皮调节素，成纤维细胞生长因子(FGF，FGF-1，FGF-2，FGF-3，FGF-4，FGF-5，FGF-6，FGF-7，FGF-8，FGF-9，FGF-10，FGF-11，FGF-12，FGF-13，FGF-14，FGF-16，FGF-17，FGF-17，FGF-18，FGF-19，FGF-20，FGF-21，FGF-22，FGF-23)，Galsulphase，葛瑞林，葡糖脑苷脂酶，GM-CSF，肝素-结合EGF-样生长因子(HB-EGF)，肝细胞生长因子HGF，Hepcidin，人白蛋白，增加的白蛋白损失，艾度硫酸 酯酶(艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶)，整联蛋白αVβ3，αVβ5和α5β1，艾杜糖醛酸硫酸酯酶，拉罗尼酶，N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶(rhASB；galsulfase，芳基硫酸酯酶A(ARSA)，芳基硫酸酯酶B(ARSB))，N-乙酰葡糖胺-6-硫酸酯酶，神经生长因子(NGF，脑源性神经营养因子(BDNF)，神经营养因子-3(NT-3)，和神经营养因子4/5(NT-4/5)，神经调节蛋白(NRG1，NRG2，NRG3，NRG4)，神经毡蛋白(NRP-1，NRP-2)，肥胖抑制素，血小板衍生生长因子(PDGF(PDFF-A，PDGF-B，PDGF-C，PDGF-D)，TGFβ受体(内皮因子，TGF-β1受体，TGF-β2受体，TGF-β3受体)，血小板生成素(THPO)(巨核细胞生长和发育因子(MGDF))，转化生长因子(TGF(TGF-a，TGF-β(TGFβ1，TGFβ2，和TGFβ3)))，VEGF(VEGF-A，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D，VEGF-E，VEGF-F和PIGF)，奈西立肽，胰蛋白酶，促肾上腺皮质激素(ACTH)，心房钠尿肽(ANP)，胆囊收缩素，胃泌素，瘦蛋白，催产素，生长抑素，加压素(抗利尿激素)，降钙素，Exenatide，生长激素(GH)，生长素，胰岛素，胰岛素样生长因子1IGF-1，Mecasermin rinfabate，IGF-1类似物，美卡舍明，IGF-1类似物，培维索孟，普兰林肽，特立帕肽(人甲状旁腺素残基1-34)，贝卡普勒明，Dibotermin-α(骨形态发生蛋白2)，醋酸组氨瑞林(促性腺素释放激素；GnRH)，奥曲肽，和帕利夫明(角质形成细胞生长因子；KGF)；用于治疗血液病症、循环系统疾病、呼吸系统疾病、癌症或肿瘤疾病、传染病或免疫缺陷的治疗性蛋白，其包括阿替普酶(组织型纤溶酶原激活物；tPA)，阿尼普酶，抗凝血酶III(AT-III)，比伐卢定，达贝泊汀α，屈曲克凝α(活化的蛋白C，促红细胞生成素，依泊汀α，促血红细胞生长素，红细胞生成素，因子IX，因子VIIa，因子VIII，来匹卢定，蛋白质C浓缩剂，瑞替普酶(tPA的缺失突变蛋白)，链激酶，替奈普酶，尿激酶，血管抑素，抗-CD22免疫毒素，地尼白介素-毒素连接物，Immunocyanin，MPS(Metallopanstimulin)，Aflibercept，内皮抑素，胶原酶，人脱氧核糖核酸酶I，链道酶，透明质酸酶，木瓜蛋白酶，L-天冬酰胺酶，Peg-天冬酰胺酶，拉布立酶，人慢性促性腺素(HCG)，人促卵泡激素(FSH)，促黄体素-α，催乳素，α-1-蛋白酶抑制剂，乳糖酶，胰酶(脂肪酶，淀粉酶，蛋白酶)，腺苷脱氨酶(牛培加酶，PEG-ADA)，阿巴他塞，阿来法塞，阿那白滞素，依那西普，白细胞介素-1(IL-1)受体拮抗剂，阿那白滞素，胸腺素，TNF-α拮抗剂，恩夫韦肽，和胸腺素α1；选自佐剂或免疫刺激性蛋白的治疗性蛋白，其包括：人佐剂蛋白，特别是模式识别受体TLR1，TLR2，TLR3，TLR4，TLR5，TLR6，TLR7，TLR8，TLR9，TLR10，TLR11；NOD1，NOD2，NOD3，NOD4，NOD5，NALP1，NALP2，NALP3，NALP4，NALP5，NALP6，NALP6，NALP7，NALP7，NALP8，NALP9，NALP10，NALP11，NALP12，NALP13，NALP14，1IPAF，NAIP，CIITA，RIG-I，MDA5和LGP2，TLR 信号传导的信号转导剂，包括衔接子蛋白，包括例如，Trif和Cardif；小-GTP酶信号传导的组分(RhoA，Ras，Rac1，Cdc42，Rab等)，PIP信号传导的组分(PI3K，Src-激酶等)，MyD88-依赖性信号传导的组分(MyD88，IRAK1，IRAK2，IRAK4，TIRAP，TRAF6等)，MyD88-非依赖性信号传导的组分(TICAM1，TICAM2，TRAF6，TBK1，IRF3，TAK1，IRAK1等)；活化的激酶，包括，例如，Akt，MEKK1，MKK1，MKK3，MKK4，MKK6，MKK7，ERK1，ERK2，GSK3，PKC激酶，PKD激酶，GSK3激酶，JNK，p38MAPK，TAK1，IKK和TAK1；活化的转录因子，包括，例如，NF-κB，c-Fos，c-Jun，c-Myc，CREB，AP-1，Elk-1，ATF2，IRF-3，IRF-7，热休克蛋白，诸如HSP10，HSP60，HSP65，HSP70，HSP75和HSP90，gp96，纤维蛋白原，纤连蛋白的TypIII重复额外结构域A；或补体系统的成分，包括C1q，MBL，C1r，C1s，C2b，Bb，D，MASP-1，MASP-2，C4b，C3b，C5a，C3a，C4a，C5b，C6，C7，C8，C9，CR1，CR2，CR3，CR4，C1qR，C1INH，C4bp，MCP，DAF，H，I，P和CD59，或诱导的靶基因，包括，例如，β-防卫素，细胞表面蛋白；或人佐剂蛋白，包括trif，flt-3配体，Gp96或纤连蛋白，诱导或增强先天性免疫应答的细胞因子，包括IL-1α，IL1β，IL-2，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-12，IL-13，IL-15，IL-16，IL-17，IL-18，IL-21，IL-23，TNFα，IFNα，IFNβ，IFNγ，GM-CSF，G-CSF，M-CSF；趋化因子，包括IL-8，IP-10，MCP-1，MIP-1α，RANTES，嗜酸性粒细胞趋化因子，CCL21；由巨噬细胞释放的细胞因子，包括IL-1，IL-6，IL-8，IL-12和TNF-α；以及IL-1R1和IL-1α；细菌(佐剂)蛋白，特别是细菌热休克蛋白或伴侣蛋白，包括Hsp60，Hsp70，Hsp90，Hsp100；来自革兰氏阴性细菌的OmpA(外膜蛋白)；细菌孔蛋白，包括OmpF；细菌毒素，包括来自百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)的百日咳毒素(PT)，来自百日咳博德特氏菌的百日咳腺苷酸环化酶毒素CyaA和CyaC，来自百日咳毒素的PT-9K/129G突变体，来自百日咳博德特氏菌的百日咳腺苷酸环化酶毒素CyaA和CyaC，破伤风毒素，霍乱毒素(CT)，霍乱毒素B-亚基，来自霍乱毒素的CTK63突变体，来自CT的CTE112K突变体，大肠杆菌(Escherichia coli)热不稳定性肠毒素(LT)，来自热不稳定性肠毒素的B亚基(LTB)，具有减少的毒性的大肠杆菌热不稳定性肠毒素突变体，包括LTK63，LTR72；苯酚可溶性调控蛋白；来自幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)的嗜中性粒细胞活化蛋白(HP-NAP)；表面活性蛋白D；来自布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)的外表面蛋白A脂蛋白，来自结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的Ag38(38kDa抗原)；来自细菌菌毛的蛋白；霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的肠毒素CT，来自革兰氏阴性细菌的菌毛的菌毛蛋白，和表面活性蛋白A和细菌鞭毛蛋白，原生动物(佐剂)蛋白，特别是来自克鲁斯锥虫(Trypanosoma cruzi)的Tc52，来自 Trypanosoma gondii的PFTG，原生动物热休克蛋白，来自利什曼原虫属物种(Leishmania spp.)的LeIF，来自刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)的肌动蛋白抑制蛋白样蛋白，病毒(佐剂)蛋白，特别是呼吸道合胞病毒融合糖蛋白(F-蛋白)，来自MMT病毒的包膜蛋白，小鼠白血病病毒蛋白，野生型麻疹病毒的血凝素蛋白，真菌(佐剂)蛋白，特别是真菌免疫调节性蛋白(FIP；LZ-8)；以及钥孔血蓝蛋白(KLH)，OspA；用于激素替代疗法的治疗性蛋白，特别是雌激素，孕酮或黄体酮，和睾酮；用于将体细胞重新编程为多能或全能干细胞的治疗性蛋白，特别是Oct-3/4，Sox基因家族(Sox1，Sox2，Sox3和Sox15)，Klf家族(Klf1，Klf2，Klf4和Klf5)，Myc家族(c-myc，L-myc和N-myc)，Nanog和LIN28；和选自用于治疗癌症或肿瘤疾病的抗体的治疗性抗体，特别是131T-托西莫单抗，3F8，8H9，阿巴扶单抗，阿德木单抗，Afutuzumab，Alacizumab pegol，阿仑珠单抗，Amatuximab，AME-133v，AMG102，麻安莫单抗，阿泊珠单抗，巴土昔单抗，贝妥莫单抗，贝利木单抗，贝伐珠单抗，比伐单抗-DM1，Blinatumomab，Brentuximab vedotin，Cantuzumab，美坎珠单抗，Cantuzumab ravtansine，卡罗单抗喷地肽，Carlumab，卡妥索单抗，西妥昔单抗，Citatuzumab bogatox，Cixutumumab，Clivatuzumab tetraxetan，CNTO328，CNTO95，Conatumumab，Dacetuzumab，Dalotuzumab，地舒单抗，地莫单抗，Drozitumab，Ecromeximab，依决洛单抗，Elotuzumab，Elsilimomab，Enavatuzumab，Ensituximab，依帕珠单抗，Ertumaxomab，Ertumaxomab，Etaracizumab，Farletuzumab，FBTA05，Ficlatuzumab，Figitumumab，Flanvotumab，Galiximab，Galiximab，Ganitumab，GC1008，吉妥珠单抗，吉妥珠单抗奥佐米星，Girentuximab，Glemnbatumumab vedotin，GS6624，HuC242-DM4，HuHMFG1，HuN901-DM1，替伊莫单抗，Icrucumab，ID09C3，Indatuximab ravtansine，伊珠单抗奥佐米星，Intetumumab，Ipilimumab，Iratumumab，Labetuzumab，雷克萨单抗，林妥珠单抗，Lorvotuzumab mertansine，Lucatumumab，鲁昔单抗，Mapatumumab，Matuzumab，MDX-060，MEDI 522，米妥莫单抗，Mogamulizumab，MORab-003，MORab-009，Moxetumomab pasudotox，MT103，他那可单抗，Naptumomab estafenatox，Narnatumab，Necitumumab，尼妥珠单抗，尼妥珠单抗，Olaratumab，Onartuzumab，Oportuzumab monatox，Oregovomab，Oregovomab，PAM4，帕尼单抗，Patritumab，Pemtumomab，帕妥珠单抗，普立昔单抗，Racotumomab，Radretumab，雷莫芦单抗，Rilotumumab，利妥昔单抗，Robatumumab，Samalizumab，SGN-30，SGN-40，西罗珠单抗，Siltuximab，Tabalumab，Tacatuzumab tetraxetan，帕他普莫单抗，Tenatumomab，Teprotumumab，TGN1412，Ticilimumab(＝tremelimumab)，Tigatuzumab，TNX-650，托西莫单抗，曲妥珠单抗，TRBS07，Tremelimumab，TRU-016，TRU-016，Tucotuzumab  celmoleukin，Ublituximab，Urelumab，维妥珠单抗，维妥珠单抗(IMMU-106)，Volociximab，伏妥莫单抗，WX-G250，zalutumumab和他珠单抗；用于治疗免疫病症的抗体，特别是依法利珠单抗，依帕珠单抗，Etrolizumab，Fontolizumab，Ixekizumab，美泊利单抗，Milatuzumab，汇集的免疫球蛋白，普立昔单抗，利妥昔单抗，Rontalizumab，卢利珠单抗，Sarilumab，维多珠单抗，Visilizumab，Reslizumab，阿达木单抗，Aselizumab，Atinumab，Atlizumab，贝利木单抗，Besilesomab，BMS-945429，Briakinumab，Brodalumab，卡那单抗，卡那单抗，培舍珠单抗，厄利珠单抗，Fezakinumab，戈利木单抗，Gomiliximab，英夫利昔单抗，Mavrilimumab，那他珠单抗，Ocrelizumab，奥度莫单抗，奥法木单抗，Ozoralizumab，Pexelizumab，罗维珠单抗，SBI-087，SBI-087，Secukinumab，Sirukumab，他利珠单抗，托珠单抗，Toralizumab，TRU-015，TRU-016，优特克单抗，优特克单抗，维帕莫单抗，阿佐莫单抗，Sifalimumab，鲁昔单抗，和Rho(D)免疫球蛋白；用于治疗传染病的抗体，特别是阿非莫单抗，CR6261，埃巴单抗，Efungumab，艾韦单抗，非维珠单抗，Foravirumab，Ibalizumab，Libivirumab，Motavizumab，奈巴库单抗，Tuvirumab，乌珠单抗，巴土昔单抗，Pagibaximab，帕利珠单抗，Panobacumab，PRO140，瑞非韦鲁，Raxibacumab，瑞加韦单抗，司韦单抗，Suvizumab，和替非珠单抗；用于治疗血液病症的抗体，特别是阿昔单抗，阿托木单抗，依库珠单抗，美泊利单抗和Milatuzumab；用于免疫调节的抗体，特别是抗胸腺细胞球蛋白，巴利昔单抗，西地珠单抗，达利珠单抗，Gavilimomab，伊诺莫单抗，莫罗莫那-CD3，莫罗莫那-CD3，奥度莫单抗和Siplizumab；用于治疗糖尿病的抗体，特别是Gevokizumab，Otelixizumab和Teplizumab；用于治疗阿尔茨海默病的抗体，特别是Bapineuzumab，Crenezumab，Gantenerumab，Ponezumab，R1450和Solanezumab；用于治疗哮喘的抗体，特别是Benralizumab，Enokizumab，Keliximab，Lebrikizumab，奥马珠单抗，Oxelumab，Pascolizumab和Tralokinumab；用于治疗多种病症的抗体，特别是Blosozumab，CaroRx，Fresolimumab，Fulranumab，Romosozumab，司他莫单抗，Tanezumab和雷珠单抗；用于治疗多种病症的促红细胞生成素(EPO)、粒细胞集落刺激因子(G‐CSF)、α‐半乳糖苷酶A、α‐L‐艾杜糖醛酸酶、促甲状腺素α、N‐乙酰基半乳糖胺‐4‐硫酸酯酶(rhASB)、阿法链道酶、组织型纤溶酶原激活物(TPA)Activase、葡糖脑苷脂酶、干扰素(IF)β‐1α、干扰素β‐1b、干扰素γ、干扰素α、TNF‐α、IL‐1至IL‐36、人生长激素(rHGH)、人胰岛素(BHI)、人绒毛膜促性腺激素α、达依泊汀α、促卵泡激素(FSH)和因子VIII、抗体及抗体衍生物如双特异性抗体、多特异性抗体、ADC等。肽(peptide)是α-氨基酸以肽键连接在一起而形成的化合物，它也是蛋白质水解的中间产物。一般肽中含有的氨基酸的数目为二到九，根据肽中氨基酸的 数量的不同，肽有多种不同的称呼：分别叫二肽、三肽、四肽、五肽等。由三个或三个以上氨基酸分子组成的肽叫多肽，它们的分子量低于10,000Da，能透过半透膜，不被三氯乙酸及硫酸铵所沉淀。也有文献把由2～10个氨基酸组成的肽称为寡肽(小分子肽)；10～50个氨基酸组成的肽称为多肽；由50个以上的氨基酸组成的肽就称为蛋白质，换言之，蛋白质有时也被称为多肽。
抗原(antigen，缩写Ag)是指能引起抗体生成的物质，是任何可诱发免疫反应的物质。外来分子可经过B细胞上免疫球蛋白的辨识或经抗原呈现细胞的处理并与主要组织相容性复合体结合成复合物再活化T细胞，引发连续的免疫反应。
抗原表位又称抗原决定簇，它可以是由连续序列(蛋白质一级结构)组成或由不连续的蛋白质三维结构组成，决定抗原性的特殊化学基团。抗原表位大多存在于抗原物质的表面，有些存在于抗原物质的内部，须经酶或其他方式处理后才暴露出来。一个天然抗原物质可有多种和多个决定簇。抗原分子越大，表位的数目越多。
肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen,TAA)，是指在肿瘤细胞或正常细胞上存在的抗原分子，包括：胚胎性蛋白、糖蛋白抗原、鳞状细胞抗原等，常用于临床肿瘤的诊断。肿瘤相关抗原并非肿瘤细胞所特有，正常细胞可微量合成，而在肿瘤细胞增殖时高度表达，因此称为“相关抗原”。来源于同一组织类型的肿瘤，在不同个体中具有相同的肿瘤相关抗原。
病原微生物是指可以侵犯人体，引起感染甚至传染病的微生物，或称病原体。病原体中，以细菌和病毒的危害性最大。病原微生物指朊毒体、真菌、细菌、螺旋体、支原体、立克次体、衣原体、病毒。病原微生物抗原是指来源于病原体，并具有引发免疫反应功能的物质。
为了更加清楚地描述本申请的目的、特征以及优势，以下将结合附图和具体实施方式对本申请进行详细描述，但下文详细描述的本申请的实施方式，仅仅是为了对本申请的内容进行举例说明，并不对本申请构成任何限定。
实施例1构建UTR-萤光素酶报告基因检测系统的DNA质粒模板
T7启动子序列、待测5’-UTR序列、萤光素酶报告基因序列或hEPO基因序列、3’UTR序列由金斯瑞公司合成并克隆至puc57质粒载体的xbaI/BamHI位点。
其中，T7启动子序列为：TAATACGACTCACTATAGG(SEQ ID No.19)；待测UTR序列如表1所示，萤光素酶报告基因序列为：
atggaagacgccaaaaacataaagaaaggcccggcgccattctatccgctggaagatggaaccgctggagagcaactgcataaggctatgaagagatacgccctggttcctggaacaattgcttttacagatgcacatatcgaggtggacatcacttacgctgagtacttcgaaatgt ccgttcggttggcagaagctatgaaacgatatgggctgaatacaaatcacagaatcgtcgtatgcagtgaaaactctcttcaattctttatgccggtgttgggcgcgttatttatcggagttgcagttgcgcccgcgaacgacatttataatgaacgtgaattgctcaacagtatgggcatttcgcagcctaccgtggtgttcgtttccaaaaaggggttgcaaaaaattttgaacgtgcaaaaaaagctcccaatcatccaaaaaattattatcatggattctaaaacggattaccagggatttcagtcgatgtacacgttcgtcacatctcatctacctcccggttttaatgaatacgattttgtgccagagtccttcgatagggacaagacaattgcactgatcatgaactcctctggatctactggtctgcctaaaggtgtcgctctgcctcatagaactgcctgcgtgagattctcgcatgccagagatcctatttttggcaatcaaatcattccggatactgcgattttaagtgttgttccattccatcacggttttggaatgtttactacactcggatatttgatatgtggatttcgagtcgtcttaatgtatagatttgaagaagagctgtttctgaggagccttcaggattacaagattcaaagtgcgctgctggtgccaaccctattctccttcttcgccaaaagcactctgattgacaaatacgatttatctaatttacacgaaattgcttctggtggcgctcccctctctaaggaagtcggggaagcggttgccaagaggttccatctgccaggtatcaggcaaggatatgggctcactgagactacatcagctattctgattacacccgagggggatgataaaccgggcgcggtcggtaaagttgttccattttttgaagcgaaggttgtggatctggataccgggaaaacgctgggcgttaatcaaagaggcgaactgtgtgtgagaggtcctatgattatgtccggttatgtaaacaatccggaagcgaccaacgccttgattgacaaggatggatggctacattctggagacatagcttactgggacgaagacgaacacttcttcatcgttgaccgcctgaagtctctgattaagtacaaaggctatcaggtggctcccgctgaattggaatccatcttgctccaacaccccaacatcttcgacgcaggtgtcgcaggtcttcccgacgatgacgccggtgaacttcccgccgccgttgttgttttggagcacggaaagacgatgacggaaaaagagatcgtggattacgtcgccagtcaagtaacaaccgcgaaaaagttgcgcggaggagttgtgtttgtggacgaagtaccgaaaggtcttaccggaaaactcgacgcaagaaaaatcagagagatcctcataaaggccaagaagggcggaaagatcgccgtgtaa(SEQ ID No.20)；hEPO基因序列为NCBI Gene:2056；3’-UTR序列如表4所示。
本申请中使用的5’-UTR序列如表1所示：
表1.新型人工5’-非翻译区元件


实施例2 UTR-萤光素酶报告基因mRNA合成与纯化
以带有候选UTR的DNA质粒(实施例1获得)为模板，通过PCR的方式扩增线性DNA作为mRNA体外转录模板，PCR反应条件如表2所示，mRNA体外转录条件如表3所示。
表2.线性DNA模板PCR扩增反应条件
95℃，30秒；95℃15秒，68℃15秒，72℃90秒，30个循环；72℃5分钟，6℃Hold。
纯化柱离心法纯化PCR产物。
上游引物：CGACGGCCAGAGAATTCGAGCTCGGTACCTCGCGAATACATC(SEQ ID No.15)；
下游引物：GCCGCCCACTCAGACTTTATTCAAAG(SEQ ID No.16)。
表3.mRNA体外转录(IVT)反应条件
转录后的产物采用NucleoSpin RNA Clean-up(740948.250，Macherey-Nagel)纯化出目的mRNA，操作步骤如下：
1)40μL IVT产物加60μL无酶水，将样品总体积补至100μL；
2)300μL Buffer RA1加300μL无水乙醇混匀，加入上述100μL样品中，吹吸混匀，加于纯化柱上，8000g离心30s，弃流出液；
3)加700μL Buffer RA3于纯化柱上，8000g离心30s，弃流出液；
4)加350μL Buffer RA3于纯化柱上，8000g离心2min，弃流出液；
5)纯化柱放于1.5mL无菌无酶离心管上，纯化柱上加50μL无酶水，13000g离心1min，转移流出液至新的1.5mL无菌无酶离心管，即为目的mRNA溶液。
实施例3 mRNA转染和萤光素酶活性检测
贴壁培养的HEK293细胞(ATCC)消化铺板于96孔板，使用lipo3000转染各待测mRNA，转染24小时后检测萤光素酶活性。具体步骤如下：
1)贴壁培养的HEK293细胞用PBS洗细胞2遍，加入1mL 0.25％胰酶37℃培养箱消化约1min，加入培养基(DMEM+10％FBS)终止消化；
2)300g离心5min，收集细胞，重悬于培养基(DMEM+10％FBS)，台盼蓝计数活细胞；
3)细胞用DMEM完全培养基稀释至3×105cells/mL，铺细胞至96孔板，100μL/孔(约30000个细胞/孔)，于37℃培养箱培养过夜。
4)1：1混合mRNA转染稀释液和lipo3000转染稀释液形成lipo3000-mRNA复合物。取10uL lipo3000-mRNA复合物加入96孔细胞培养板，每组3个复孔(l00ng mRNA/孔)，将培养板放回37℃CO2培养箱中继续培养24h。
5)加入与待测细胞等体积并平衡至室温的One-LiteTM检测试剂(100μL),室温放置1min使细胞充分裂解，于酶标仪上震荡3min后检测萤光素酶活性。
萤光素酶活性如图1所示，与对照UTR(图1Ctrl,BNT162b2 5’UTR)和UTR1相比，UTR2和UTR4的萤光素酶表达量高于对照组2倍以上，UTR8和UTR9的萤光素酶表达量高于对照组4倍以上甚至达到近8倍；UTR10、UTR11和UTR12，与对照UTR相比，萤光素酶表达量高出2-4倍；UTR13与对照UTR相比萤光素酶表达量高出4-6倍。
实施例4候选UTR驱动血浆hEPO表达
使用体外转录(In vitro transcription,IVT)合成制备各待测UTR-hEPO-mRNA，经过柱纯化后进行LNP包载。首先将脂质成分和RNA分别溶解在油相和水相中以达到1:3的体积比。脂质成分包括ALC-0315(键凯科技，C10201)、DSPC(艾伟拓，S01005)、胆固醇(艾伟拓，CHO-HP/O01001)和ALC-0159(键凯科技，3295)溶解在乙醇中(各组分摩尔比50：10：38.5：1.5)，mRNA稀释于10mM柠檬酸钠(J.T.Baker，3647-01)。使用微流控混合器(microfluidic mixing device)以12ml/min流速将制备好的溶液混合，获得LNP。将LNP包载的待测UTR-hEPO-mRNA以尾静脉注射至ICR小鼠，6小时后收集血浆，使用ELISA法(Human Erythropoietin ELISA Kit,Elabscience,E-EL-H3640c)检测血浆hEPO浓度。
结果如图2A所示,与对照UTR(图2A Ctrl,BNT162b2 5’UTR)相比，UTR8和UTR13表现出更高的hEPO小鼠体内表达量。为了测试UTR8和UTR13与不同3’UTR序列的适配性，发明人使用BNT162b2的3’UTR序列替换了图2A中使用的HBA1基因的3’UTR，并把带有BNT162b2 3’UTR的三条序列名称里加注了“星号”以示区别，分别命名为Ctrl*、UTR8*和UTR13*。如图2B所示,与对照UTR(图2B Ctrl*,BNT162b2 5’UTR和3’UTR)相比，UTR8*和UTR13*报告载体表现出更高的hEPO小鼠体内表达量。综合图2数据，在hEPO动物模型场景下，作为5’UTR序列元件的 UTR8和UTR13分别搭配两种不同的3’UTR序列时，都表现出了比对照UTR更优的性能。
表4.本实验中使用的3’UTR序列
实施例5候选UTR-mRNA溶液稳定性测试
本实验采用强制降解的方法检测各待测UTR-mRNA的溶液稳定性。具体地，将待测UTR-mRNA溶解于强制降解溶液中(500mM CHES，100mM MgCl2，pH 10)，分别于不同时间点(0.5h、1h、1.5h、2h、3h、5h、9h、24h)取出UTR-mRNA溶液，中和降解后(中和液组分：5μL 1M Tris-HCl pH 7+1μL 500mM EDTA-Na pH 8.0)，使用毛细管电泳(Agilent5200)进行mRNA完整性检测。
结果如图3所示，UTR8和UTR13与对照UTR mRNA的溶液半衰期相当。说明候选UTR并不影响mRNA的半衰期，但可以提高mRNA蛋白表达量。
以上对本申请做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本申请的机理、内容并加以实施，并不能以此限制本申请的保护范围，凡根据本申请的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本申请的保护范围内。
工业实用性
与现有技术中公开的UTR相比，本申请的5’-非翻译区元件能够使得包含其的核酸分子在蛋白表达性能方面提高至少25％、至少50％、至少75％、至少100％或至少150％， 在表达效率方面提高至少50％、至少100％、至少150％、至少200％、至少250％、至少300％、至少350％、至少400％、至少500％、至少600％、至少700％或至少800％，因此，可用于构建高表达性能的人工核酸分子，在核酸类治疗药物的开发中具有极高的应用前景。

Claims (22)

  1. 一种新型人工5’-非翻译区元件，其特征在于所述元件由以下基序可操作性连接而成：
    (1)增强转录序列、Kozac序列和天然高表达基因的5’-非翻译区全长序列；或
    (2)增强转录序列、Kozac序列和天然高表达基因的5’-非翻译区片段序列，而且该5’-非翻译区片段序列不含有TOP基序位点和uORF序列；或
    (3)增强转录序列、Kozac序列、非结构序列和天然高表达基因的5’-非翻译区片段序列，而且该5’-非翻译区片段序列不含有TOP基序位点和uORF序列。
  2. 根据权利要求1所述的新型人工5’-非翻译区元件，其特征在于各基序自5’至3’方向的连接顺序为：
    (1)增强转录序列、天然高表达基因的5’-非翻译区全长序列和Kozac序列；或
    (2)增强转录序列、天然高表达基因的5’-非翻译区片段序列去除TOP基序位点和uORF序列的序列和Kozac序列；或
    (3)增强转录序列、天然高表达基因的5’-非翻译区片段序列去除TOP基序位点和uORF序列的序列、非结构序列和Kozac序列。
  3. 根据权利要求1或2任一项所述的新型人工5’-非翻译区元件，其特征在于天然高表达基因选自哺乳动物、细菌或病毒的天然高表达基因。
  4. 根据权利要求3所述的新型人工5’-非翻译区元件，其特征在于天然高表达基因选自核糖体蛋白S25、肌动蛋白β、血红蛋白亚基α、血红蛋白亚基β、补体因子3、细胞色素B-245α、人TM4SF1基因、人TXNIP基因、人RPS11等基因或上述基因的突变体。
  5. 根据权利要求4所述的新型人工5’-非翻译区元件，其特征在于突变体截取自天然基因5’UTR的5’端、3’端或5’与3’端之间的任一区段；突变体长度50nt至200nt核苷酸；并将其中的TOP基序突变为CTTT或CTT或CT或C；并将其中ATG的uORF序列突变为ATT或完全删除ATG三个核苷酸；突变体5’端和/或3’端无其他序列或突变体5’端和/或3’端连接非结构核酸序列。
  6. 根据权利要求1所述新型人工5’-非翻译区元件，其特征在于5’-非翻译区片段序列截取自天然基因5’UTR的5’端、3’端或5’与3’端之间的任一区段；片段长度50nt至200nt核苷酸；片段中TOP基序位点突变为CTTT或CTT或CT或C或完全删除TOP基序序列；片段里uORF序列突变为ATT或完全删除ATG三个核苷酸；片段5’端和/或3’端无其他序列或片段5’端和/或3’端连接非结构核酸序列。
  7. 根据权利要求1所述新型人工5’-非翻译区元件，其特征在于增强转录序列选自AATAA、ATAAT或AATAAA。
  8. 根据权利要求1所述新型人工5’-非翻译区元件，其特征在于Kozac序列为GCCACC。
  9. 根据权利要求1所述新型人工5’-非翻译区元件，其特征在于非结构序列长度30nt至50nt，其中AC含量80％以上，T含量20％以下，序列中不含有G；非结构序列优选为CACACCCACTACACCTACACATATCTACTCACCTACACACTAATA(SEQ ID No.21)或CATACCCAAATTTATATCTACATCTAAACCCAATTATTACCC(SEQ ID No.22)或ACCACACACTTATCTACACAACTCAATCC(SEQ ID No.23)或TCCACCCAACCCACTACTAATACCCACAACCCAACACCC(SEQ ID No.24)或AACCCACACACTCACCTACTCATCCA(SEQ ID No.25)；非结构序列更优选为CACACCCACTACACCTACACATATCTACTCACCTACACACTAATA(SEQ ID No.21)。
  10. 根据权利要求1所述的新型人工5’-非翻译区元件，其特征在于所述新型人工5’-非翻译区元件全长50nt及以上，均由天然核苷酸组成。
  11. 一种人工核酸分子，所述人工核酸分子包含：
    (1)至少一个权利要求1至10任一项所述的新型人工5’-非翻译区元件；
    (2)至少一个开放读码框；
    (3)至少一个3’-非翻译区元件。
  12. 根据权利要求11所述的人工核酸分子，其特征在于所述人工核酸分子还包括编码信号肽的核酸序列。
  13. 根据权利要求11所述的人工核酸分子，其特征在于所述人工核酸分子还包括聚腺苷酸序列或聚腺苷酸信号序列。
  14. 根据权利要求11至13任一项所述的人工核酸分子，其特征在于各元件之间可以直接连接也可以通过连接子连接。
  15. 根据权利要求11至13任一项所述的人工核酸分子，其特征在于与不含有权利要求1所述的新型人工5’-非翻译区元件相比表达效率提高至少50％，至少100％，至少150％，至少200％，至少250％，至少300％，至少350％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％。
  16. 包含权利要求11-15任一项所述的人工核酸分子的载体。
  17. 包含权利要求11-15任一项所述的人工核酸分子或权利要求16所述的载体的宿主细胞。
  18. 权利要求11至15任一项所述的人工核酸分子或权利要求16所述的载体编码的蛋白或多肽。
  19. 根据权利要求18所述的蛋白或多肽，其特征在于所述蛋白或多肽为预防性蛋白或多 肽或治疗性蛋白或多肽。
  20. 权利要求11至15任一项所述的人工核酸分子或权利要求16所述的载体或权利要求17所述的宿主细胞或权利要求18至19任一项所述的蛋白或多肽在制备药物中的应用。
  21. 包含权利要求11至15任一项所述的人工核酸分子或权利要求16所述的载体或权利要求17所述的宿主细胞或权利要求18至19任一项所述的蛋白或多肽的药物。
  22. 根据权利要求21所述的药物，还包括药学上可接受的载体或辅料。
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