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WO2024005105A1 - ヒト細胞を測定する方法 - Google Patents

ヒト細胞を測定する方法 Download PDF

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Publication number
WO2024005105A1
WO2024005105A1 PCT/JP2023/024068 JP2023024068W WO2024005105A1 WO 2024005105 A1 WO2024005105 A1 WO 2024005105A1 JP 2023024068 W JP2023024068 W JP 2023024068W WO 2024005105 A1 WO2024005105 A1 WO 2024005105A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
human
cells
sequence
human cells
genomic dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2023/024068
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English (en)
French (fr)
Inventor
風和 小川
雅子 大澤
拓郎 秋谷
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sekisui Medical Co Ltd
Original Assignee
Sekisui Medical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sekisui Medical Co Ltd filed Critical Sekisui Medical Co Ltd
Priority to JP2024530934A priority Critical patent/JPWO2024005105A1/ja
Publication of WO2024005105A1 publication Critical patent/WO2024005105A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/06—Quantitative determination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring human cells.
  • This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2022-106625 filed in Japan on June 30, 2022, the contents of which are incorporated herein.
  • MSCs Mesenchymal stem cells
  • HLA human leukocyte antigen
  • MSCs with different HLA are administered to a patient, they can be protected from attack (rejection) by T cells. Furthermore, MSCs are easy to establish and culture, have high proliferative capacity, and can be cryopreserved. Due to these characteristics, it is possible to perform treatment by administering allogeneic MSC to a patient, regardless of HLA matching or mismatching.
  • PK/PD pharmacokinetic/pharmacodynamic screening tests in the exploration stage, safety tests, pharmacology tests, and pharmacokinetic tests in the non-clinical stage of the development of regenerative medicine products whose main components are human cells such as MSCs
  • qPCR Quantitative PCR
  • the target gene to be amplified is a gene that exists in human cells and does not exist in non-human animals.
  • a multicopy gene such as Alu sequence or long interspersed repeat sequence-1 (LINE-1) is used.
  • Patent Document 1 one "human Alu model sequence" representing the consensus sequences of 46 human Alu subfamilies is identified, and this human Alu model sequence is used to select PCR primer/probe candidates for Alu detection.
  • a primer/probe set consisting of an oligonucleotide sequence that specifically hybridizes to the human Alu sequence and that can minimize dimer formation is selected using unique criteria.
  • human genomic DNA in a test sample can be detected and/or quantified with high sensitivity by performing quantitative real-time PCR using the Alu detection PCR primers and probes obtained in this way.
  • Patent Document 2 discloses a technique for detecting human cells transplanted or administered to non-human animals. More specifically, a quantitative PCR probe is disclosed that includes a sequence capable of hybridizing to an oligonucleotide consisting of a sequence of 10 to 35 consecutive bases in a predetermined base sequence derived from the human LINE-1 gene, and a label portion. ing.
  • Patent Document 3 discloses a general method for correcting the amount of genomic DNA in qPCR.
  • the cell number of human cells in qPCR is quantified as the copy number of the target gene, but in this case, the copy number of the target gene is well-known, for example, the copy number of the RNaseP gene in the genome.
  • the amount of genomic DNA is corrected from the quantitative values of those genes. Based on the conversion method described above, in qPCR, the number of copies of a gene or the amount of genomic DNA is used as a unit.
  • Non-Patent Document 1 discloses the extraction recovery rate of genomic DNA for each tissue. Although qPCR requires extraction and purification of genomic DNA from tissues, it has been disclosed that the recovery rate of genomic DNA varies depending on the tissue.
  • qPCR has the problem that it is necessary to extract and purify genomic DNA from tissues, and since the recovery rate of genomic DNA varies depending on the tissue, it is necessary to correct the recovery rate by extracting genomic DNA. Furthermore, since the amount of genomic DNA is corrected using genomic DNA as an internal standard, quantitative PCR uses the number of copies of a gene or the amount of genomic DNA as a unit. However, since human cell preparations exert therapeutic effects on the cells themselves, it is ideal to evaluate the distribution in the body of non-human animals based on the number of cells rather than the number of gene copies or the amount of genomic DNA.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and its purpose is to provide a method for quantifying human cells that does not require recovery rate correction by genomic DNA extraction or correction of the amount of genomic DNA by quantifying internal standards, etc. Make it one.
  • a method for measuring human cells comprising: a preparation step of preparing a sample containing a non-human animal component derived from non-human animal cells and human cells; a lysis step of lysing cell membranes in the sample; an assay step of performing a hybridization assay on the human cell-specific nucleic acid sequence;
  • a method of measuring human cells including: [2] The method for measuring human cells according to [1], wherein the human cell-specific nucleic acid sequence is a human-specific repeat sequence. [3] The human cell according to [2], wherein the human-specific repeat sequence contains at least one selected from the group consisting of an Alu sequence and a long interspersed repeat sequence-1 (LINE-1). How to measure.
  • [4] The method for measuring human cells according to any one of [1] to [3], wherein the nucleic acid probe used in the hybridization assay does not hybridize with genomic DNA of a non-human animal.
  • the non-human animal component and the cell membrane of the human cell are lysed by any method selected from the group consisting of physical methods, chemical methods, enzymatic methods, and combinations thereof. , the method for measuring human cells according to any one of [1] to [4].
  • [6] The method for measuring human cells according to any one of [1] to [5], wherein the hybridization assay is a PALSAR method or a dual hybridization method.
  • the genomic DNA contained in the non-human animal cells and the human cells is further processed by any method selected from the group consisting of physical methods, chemical methods, enzymatic methods, and combinations thereof.
  • the method for measuring human cells according to [7], wherein the fragment length of the genomic DNA obtained by fragmenting the genomic DNA is 50 to 600 bp.
  • the human cell quantification method of the present invention does not require recovery rate correction by genomic DNA extraction or correction of the amount of genomic DNA by quantification of an internal standard or the like. Furthermore, the human cell quantification method of the present invention can directly measure the number of human cells in a sample.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of quantifying human cells in the mouse kidney matrix of Example 1-1.
  • the results of quantifying human cells in the mouse lung matrix of Example 1-2 are shown in Table 3, Table 4, and FIG. 1B.
  • It is a graph showing the results of examination of target genes and target sequences. It is a graph showing the results of mouse cross-reactivity for each target gene. It is a graph showing the results of comparison of detection methods in hybridization methods.
  • It is a graph showing the results of examination of genomic DNA fragmentation processing conditions.
  • It is a graph showing the results of examination of genomic DNA fragmentation processing conditions.
  • It is a graph showing the results of examination of genomic DNA fragmentation processing conditions.
  • It is a graph showing the results of examination of genomic DNA fragmentation processing conditions.
  • It is a graph showing the quantitative results of human cells.
  • DNA means deoxyribonucleic acid.
  • RNA means ribonucleic acid.
  • ⁇ When a numerical range is expressed using “ ⁇ ”, the numerical range includes the numbers on both sides of “ ⁇ ”.
  • the method for measuring human cells of the present invention is a method for measuring human cells, and includes a preparation step of preparing a sample containing a non-human animal component derived from a non-human animal cell and a human cell, and a step of preparing a sample containing a cell membrane in the sample.
  • the method includes a lysis step of lysing the human cell, and an assay step of performing a hybridization assay on the human cell-specific nucleic acid sequence.
  • a sample containing human cells and non-human animal components derived from non-human animal cells is prepared for carrying out the present invention.
  • non-human animal components derived from the non-human animal cells include, but are not limited to, the non-human animal cells themselves as well as proteins, nucleic acids, lipids, etc. contained in the non-human animal cells.
  • the method for measuring human cells of the present invention can measure human cells even when non-human animal components derived from these non-human animal cells and human cells coexist.
  • the human cells may be any type of human-derived cells such as human stem cells, human cancer cells, human somatic cells, human germ cells, etc., but human stem cells are preferable, and human mesenchymal cells are preferable. Particularly preferred examples include human stem cells such as stem cells, human hematopoietic stem cells, human neural stem cells, human iPS cells, human ES cells, and human somatic cell-derived embryonic stem cells.
  • the non-human animal cell is not particularly limited as long as it is a non-human animal cell.
  • the non-human animals include non-human mammals such as mice, rats, guinea pigs, dogs, rabbits, pigs, goats, and cows.
  • the non-human animal is preferably a rodent such as a mouse, rat, or guinea pig.
  • mammals monkeys
  • primates monkeys
  • non-human hominid animals such as chimpanzees, bonobos, gorillas and orangutans, gibbons such as white-handed gibbons and dwarf gibbons, and long-tailed macaques such as long-tailed macaques, baboons, macaques and proboscis monkeys. Examples include family animals.
  • a hybridization assay is performed on a nucleic acid sequence specific to human cells. It differs depending on the combination with human cells. For example, if human cells and rodent cells are mixed in a sample, the Alu sequence can be said to be a nucleic acid sequence specific to human cells, but if human cells and chimpanzee cells are mixed in the sample, the Alu sequence is the same. Even if it is an Alu sequence, it may not be said to be a human cell-specific nucleic acid sequence. Conversely, when Alu sequences are employed as nucleic acid sequences specific to human cells, non-human primates are necessarily excluded from non-human animals. On the other hand, when adopting long interspersed repeat sequence-1 (LINE-1), some families, such as the Ta family, are human-specific, so non-human primates are added to non-human animals. Is possible.
  • LINE-1 long interspersed repeat sequence-1
  • samples containing non-human animal components derived from non-human animal cells and human cells include biological samples derived from xenograft model animals prepared by transplanting human cells into non-human animals; but not limited to.
  • the human cell-specific nucleic acid sequence (hereinafter sometimes referred to as "target sequence” or “target gene”) is preferably a human-specific repeat sequence, such as Alu sequence and long interspersed repeat sequence-1 ( At least one selected from the group consisting of LINE-1) is preferred.
  • target sequence a human-specific repeat sequence
  • Alu sequence and long interspersed repeat sequence-1 At least one selected from the group consisting of LINE-1 is preferred.
  • any family may be used as the target sequence in the present invention.
  • a sequence common to multiple families, a so-called consensus sequence may be targeted.
  • Alu sequences are one of the genetic elements found in the genomes of primates including humans, and are also referred to as Alu elements. Alu's name comes from the fact that it was first characterized by the restriction endonuclease activity of Arthrobacter luteus. The Alu sequence is the most frequently found transposon in the human genome, and is a multicopy gene with over 1 million copies scattered throughout the human genome. Alu sequences are highly conserved among primate genomes, and although they have the disadvantage of not being able to distinguish between humans and non-human primates, they can, for example, distinguish between humans and rodents, humans and artiodactyls, etc. Therefore, it is also useful in the human cell quantification method of the present invention.
  • LINE-1 is one of the long interspersed nuclear elements (LINE).
  • LINEs are a group of non-LTR retrotransposons that are widely found in the genomes of many eukaryotes.
  • LINE is a multicopy gene that occupies approximately 21.1% of the total human genome, and each LINE is approximately 7000 base pairs (bp) in length.
  • the Ta family including Ta-1 and Ta-0 is human-specific, so it is possible to distinguish between humans and non-human primates by designing probes.
  • SVA SINE-VNTR-Alu
  • SVA_A SVA_B
  • SVA_C SVA_D
  • SVA_E SVA_F
  • SVA_F human-specific. Can be used to differentiate primates.
  • the method for lysing the cell membrane in the sample is not particularly limited, but any method selected from the group consisting of physical methods, chemical methods, enzymatic methods, and combinations thereof is preferred.
  • Physical methods include, for example, mechanical disruption techniques (dounce, polytron, mortar and pestle homogenization, etc.), freeze-thaw lysis, osmotic shock, sonication, and the like.
  • chemical methods include surfactant solubilization.
  • enzymatic methods include methods of bursting cell membranes by hydrolyzing cell membrane lining proteins with proteolytic enzymes, acids, alkalis, and the like.
  • the nucleic acid probe used does not hybridize with genomic DNA of a non-human animal. Note that a nucleic acid probe is used in the hybridization assay.
  • the PALSAR Probe Alternation Link Self-Assembly Reaction
  • the dual hybridization method is preferable.
  • the dual hybridization method is a method that uses two sequence-specific oligonucleotide probes.
  • the two probes are designed to bind to adjacent sequences in the target sequence.
  • the first probe is immobilized on a solid phase carrier such as a plate or beads, and is a probe for capturing a target.
  • the end of the second probe is modified with a label such as biotin.
  • the two probes hybridize to the target DNA or RNA, and the target is detected by reacting the fluorescent substance with the label.
  • the PALSAR method (for example, Japanese Patent No. 4,616,881) uses two types of DNA probes prepared in advance and each consisting of three mutually complementary regions. Labels are attached to these two types of DNA probes, and by repeating a self-assembly reaction through hybridization, they combine in a honeycomb-like shape to form a large DNA mass, which becomes an amplification signal. When this large DNA block binds to the gene to be detected, the amplified signal can be captured and the presence of the detected gene can be confirmed.
  • Japanese Patent No. 4,616,881 discloses a method of amplifying the signal of the dual hybridization method using the PALSAR method.
  • This hybridization does not require a nucleic acid synthase, reacts quickly (30 seconds to 30 minutes), and proceeds at a constant temperature (40°C to 70°C), allowing both target DNA and RNA to react quickly. It has the characteristic of being able to be detected with high sensitivity.
  • the target nucleic acid is separated into single strands by heat denaturation, and then a DNA probe having a sequence specific to the target nucleic acid is hybridized with the target nucleic acid separated into single strands by a nucleic acid synthase. Perform an elongation reaction of complementary nucleic acid. In this way, a DNA probe is hybridized to a target nucleic acid in the PALSAR method or dual hybridization method, but the reaction mechanism is completely different.
  • a fragmentation step may be included as a step of fragmenting the genomic DNA.
  • the genomic DNA contained in the non-human animal cells and the human cells is fragmented by any method selected from the group consisting of physical methods, chemical methods, enzymatic methods, and combinations thereof.
  • Physical methods include, for example, mechanical disruption techniques (dounce, polytron, mortar and pestle homogenization, etc.), freeze-thaw lysis, osmotic shock, sonication, and the like.
  • chemical methods include methods of partial hydrolysis using acids, alkalis, and the like.
  • enzymatic methods include methods using endonucleases.
  • Examples of the endonuclease include deoxyribonuclease I (DNase I), deoxyribonuclease II (DNase II), Micrococcal Nuclease, Turbo Nuclease, and restriction enzymes.
  • Examples of the restriction enzymes include BamHI, EcoRI, EcoRV, HindIII, HaeIII, BglII, MspI, TaqI-v2, and the like. Restriction enzymes are endonucleases that recognize and cut specific DNA sequences.
  • the enzyme used when using an enzymatic method is not particularly limited, but DNase I is preferred.
  • the amount used when DNase I is used to fragment genomic DNA is not particularly limited, but is preferably 0.0001 to 0.1 U/well, more preferably 0.001 to 0.025 U/well, and 0.005 ⁇ 0.01U/well is more preferable.
  • 1 unit is defined as the amount of enzyme that completely degrades 1 ⁇ g of plasmid vector pBR322 DNA in a total reaction volume of 50 ⁇ L at 37° C. for 10 minutes. Complete degradation is defined as the degradation of a DNA fragment into tetranucleotides or less.
  • the length of the genomic DNA fragment in this case is preferably 50 to 1000 bp, more preferably 50 to 600 bp, even more preferably 150 to 600 bp, and even more preferably 150 to 300 bp.
  • measurements are performed based on the "Guidelines for the validation of drug concentration analysis methods (ligand binding methods) in biological samples in drug development” published by the Pharmaceuticals and Medical Devices Agency (PMDA). The reliability of the law was evaluated.
  • Target sequence and nucleic acid probe used In the examples of the present invention, three types of target sequences having different target genes and base sequences were used. A description of each target sequence and the capture and assist probe combinations used to detect the target sequence are provided below.
  • Alu array (1) This sequence targets 43 bp of the "human Alu model sequence" described in International Publication No. 2018/101375.
  • a nucleic acid probe CP-Alu sequence (1) having a complementary base sequence to the 5' side of the Alu sequence (1) was used as a capture probe, and a nucleic acid probe CP-Alu sequence (1) having a complementary base sequence to the 5' side of the Alu sequence (1) was used as an assist probe to the 3' side of the Alu sequence (1).
  • An AP-Alu sequence (1) having a base sequence in which a poly A chain was added to a complementary base sequence was used.
  • Base sequence of Alu sequence (1) 5'-GCAGGAGAATCGCTTGAACCCGGGAGGCGGAGGTTGCAGTGAG-3' (base part is SEQ ID NO: 1)
  • Alu array (2) “Technical Guidance on the Quality of Regenerative Medicine Products (Human Cell Processed Products), Nonclinical Tests, and Clinical Tests” released by the Pharmaceuticals and Medical Devices Agency (PMDA) (June 14, 2016)
  • PMDA Pharmaceuticals and Medical Devices Agency
  • a nucleic acid probe CP-Alu sequence (2) having a complementary base sequence to the 3' side of the Alu sequence (2) was used as a capture probe, and a nucleic acid probe CP-Alu sequence (2) having a complementary base sequence to the 3' side of the Alu sequence (2) was used as an assist probe to the 5' side of the Alu sequence (2).
  • An AP-Alu sequence (2) having a complementary base sequence with a poly A chain added was used.
  • LINE-1 sequence A 30 bp target sequence designed with reference to the human cell quantitative PCR probe described in International Publication No. 2019/240073.
  • a nucleic acid probe CP-LINE-1 sequence having a base sequence complementary to the 3' side of the LINE-1 sequence was used as a capture probe, and a nucleic acid probe CP-LINE-1 sequence having a base sequence complementary to the 5' side of the LINE-1 sequence was used as an assist probe.
  • An AP-LINE-1 sequence having a base sequence with a poly A chain added to the base sequence was used.
  • Example 1-1 Examination of human cell quantification in mouse kidney matrix 1.
  • Materials (1) Biological sample HEK293 cells were used as human cells to be measured.
  • a mouse kidney Jackson Laboratory Japan was used as a non-human animal sample.
  • the mice used were C57BL/6J male, week old RETIRE mice.
  • Target sequence Alu sequence (1) (SEQ ID NO: 1) was used as the target sequence.
  • Results The results of quantifying human cells in a mouse kidney matrix using the method for quantifying human cells of the present invention are shown in Table 1, Table 2, and FIG. 1A. From FIG. 1, a signal was obtained that depended on the number of human cells in the sample. The correlation coefficient (r) between the number of human cells and the signal was 0.9990, and a highly correlated calibration curve could be created. Furthermore, the %RE of the calibration curve sample with respect to the created calibration curve was -11.3 to 8.5%, which was within the LBA guideline standards. The %CV, %RE, and %TE of the QC sample were also within the standards, and it can be said that this is a highly robust quantitative method that meets the LBA guideline standards.
  • Example 1-2 Examination of human cell quantification in mouse lung matrix 1.
  • Materials (1) Biological sample HEK293 cells were used as human cells to be measured.
  • mouse lung Jackson Laboratory Japan
  • the mice used were C57BL/6J male, week old RETIRE mice.
  • Target sequence Alu sequence (1) (SEQ ID NO: 1) was used as the target sequence.
  • QC samples were prepared to have a cell number of 1.2 ⁇ 10 4 , 2.4 ⁇ 10 4 , 1.2 ⁇ 10 5 , 6 ⁇ 10 5 , 1.2 ⁇ 10 6 cells/g of lung, and The sample names were LLOQ, LQC, MQC, HQC, and ULOQ. In addition, three series of QC samples were prepared, and each series was serially diluted.
  • Example 1-1 was carried out using the same procedures as (5) to (8) of Example 1-1.
  • Example 2 Examination of target genes and target sequences in human cell quantification 1.
  • Materials (1) Biological sample HEK293 cells were used as human cells to be measured.
  • a mouse kidney Jackson Laboratory Japan was used as a non-human animal sample.
  • Target sequences Alu sequence (2) (SEQ ID NO: 4) and LINE-1 sequence (SEQ ID NO: 7) were used as target sequences.
  • Results Tables 5, 6, and FIG. 2 show the results of examining target genes and target sequences for human cell quantification using the method of the present invention. From Table 5, when Alu sequence (2) is used as the target sequence, an accurate calibration curve that meets the guideline standards can be created in the quantitative range of 1.2 ⁇ 10 4 to 1.2 ⁇ 10 6 cells/g of kidney. was completed. On the other hand, from Table 6, when the LINE-1 sequence was used as the target sequence, an accurate calibration curve within the guideline standards was obtained in the quantitative range of 2.4 ⁇ 10 4 to 1.2 ⁇ 10 6 cells/g of kidney. Ta.
  • the quantification range of the Alu sequence (1) used as the target sequence in Example 1-1 is 6 ⁇ 10 3 to 6 ⁇ 10 5 cells/g of kidney, and although the quantification range differs depending on the target sequence, it is It can be said that human cells can be accurately quantified by using the target sequence.
  • Target sequence Alu sequence (1) SEQ ID NO: 1
  • LINE-1 sequence SEQ ID NO: 7
  • the ultrasonic parameters were PIP 50W, DF 20%, CPB 200cpb, and the treatment time was 60 minutes.
  • the extracted mouse genome was also sonicated in the same manner.
  • Capture probes for each target sequence were prepared in the same manner as in Example 1-1 (3) and Example 2 (3).
  • Target sequence Alu sequence (1) (SEQ ID NO: 1) was used as the target sequence.
  • Target sequence Alu sequence (1) (SEQ ID NO: 1) was used as the target sequence.
  • Target sequence Alu sequence (1) (SEQ ID NO: 1) was used as the target sequence.
  • Base sequence of Alu sequence (1) 5'-GCAGGAGAATCGCTTGAACCCGGGAGGCGGAGGTTGCAGTGAG-3' (base part is SEQ ID NO: 1)
  • Method 1 Lysis treatment of mouse kidney and human cells
  • Mouse kidney and human cells were respectively prepared and treated with Direct PCR Lysis Reagent (Tail) (Viagen Biotech, product number: 102-T) and proteinase K solution (Kanto Kagaku Co., Ltd., product number: 102-T). No. 34060-96) was used for the dissolution treatment.
  • FIGS. 6A and 6B Results Regarding the genome fragmentation method using both enzyme treatment and ultrasonic treatment, the results of examining the amount of enzyme are shown in FIGS. 6A and 6B. From FIG. 6A, changes in the signal were observed depending on the amount of enzyme. The amount of enzyme with the highest signal value was 0.0075 U/well.
  • Figure 6B which shows the electrophoresis of the samples after fragmentation treatment, the fragment length of each sample is around 200 bp with an enzyme amount of 0.001 to 0.01 U/well, and 200 bp with an enzyme amount of 0.025 to 0.1 U/well. The amount was around 100 bp, or it could not be visually observed due to electrophoresis. From this, it was found that even when fragmentation was performed using an enzyme, better signals could be detected by adjusting the amount of enzyme so that the fragment chain length was around 200 bp.
  • Example 6-2 Examination of human cell quantification using genome fragmentation treatment combined with enzymes and ultrasound in mouse kidney matrix
  • Method 1 Lysis treatment of mouse kidney and human cells
  • Mouse kidney and human cells were respectively prepared and treated with Direct PCR Lysis Reagent (Tail) (Viagen Biotech, product number: 102-T) and proteinase K solution (Kanto Kagaku Co., Ltd., product number: 102-T). No. 34060-96) was used for the dissolution treatment.
  • QC samples had cell numbers of 7.5 ⁇ 10 3 , 1.5 ⁇ 10 4 , 7.5 ⁇ 10 4 , 3.75 ⁇ 10 5 , 7.5 ⁇ 10 5 cells/g of kidney (final cell number 6 ⁇ 10 3 , 1.2 ⁇ 10 3 , 6 ⁇ 10 4 , 3 ⁇ 10 5 , 6 ⁇ 10 5 cells/kidney g), and each sample name was changed to LLOQ, LQC, MQC, HQC, It was set as ULOQ. Three series of QC samples were prepared, and each series was serially diluted.
  • PK/PD pharmacokinetics/pharmacodynamics
  • 5" means that the base is 5-methylcytosine
  • L means that the 2' and 4' carbons of deoxyribose are modified with a crosslink
  • NH2 means that the 5' end or 3' end of the polynucleotide is modified with an amino group
  • Biotin means that the 5' end of the polynucleotide is labeled with biotin.

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Abstract

ヒト細胞を測定する方法であって、非ヒト動物細胞に由来する非ヒト動物成分及びヒト細胞を含む試料を準備する準備工程と、前記試料中の細胞膜を溶解する溶解工程と、前記ヒト細胞に特異的な核酸配列に対してハイブリダイゼーションアッセイを行うアッセイ工程と、を含む、ヒト細胞を測定する方法。前記ヒト細胞を測定する方法は、ゲノムＤＮＡ抽出による回収率補正及び内部標準等の定量によるゲノムＤＮＡ量の補正を必要としない。

Description

ヒト細胞を測定する方法
　本発明は、ヒト細胞を測定する方法に関する。
　本願は、２０２２年６月３０日に、日本に出願された特願２０２２－１０６６２５号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：ＭＳＣ）は、組織再生や免疫調整等の作用を有し、さまざまな疾患への臨床応用が試みられている。
　ＭＳＣは、種々のサイトカインや液性因子を産生し、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ（ｎａｔｕｒａｌ　ｋｉｌｌｅｒ）細胞、単球及び樹状細胞等の免疫担当細胞に対して抑制的に、制御性Ｔ細胞に対して促進的に作用する。さらに、炎症部位や組織傷害部位に集積しやすい性質もある。ＭＳＣはＨＬＡ（ｈｕｍａｎ　ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　ａｎｔｉｇｅｎ）分子を発現しているものの、その発現レベルは低く、共刺激分子であるＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０等を発現していないため、非自己Ｔ細胞を刺激しない。この性質により、ＨＬＡの異なるＭＳＣを患者に投与しても、Ｔ細胞による攻撃（拒絶）から免れることができる。さらに、ＭＳＣは、樹立及び培養が容易であり、増殖能が高く、凍結保存することが可能である。これらの特徴により、ＨＬＡの一致・不一致を問わず、他家由来のＭＳＣを患者に投与する治療が可能である。
　一般に、医薬品の有効性・安全性を評価する試験は、非臨床試験と臨床試験に大別される。非臨床試験の結果、有効性が期待でき、安全性にも問題がないと考えられた場合にヒトで行うのが臨床試験である。非臨床試験は、有効性と安全性を評価・証明するための科学的データを提供するものであり、臨床試験へと進むために必要であるとともに臨床における有効性と安全性を裏づけるために重要である。非臨床試験では、通常、動物を用いて医薬品の薬効薬理作用、生体内での動態、有害な作用などが調べられる。
　ＭＳＣ等のヒト細胞を主成分とする再生医療等製品開発の、探索段階における薬物動態・薬力学（ＰＫ／ＰＤ）スクリーニング試験、非臨床段階における安全性試験、薬理試験及び薬物動態試験においては、ヒト細胞が投与された非ヒト動物におけるヒト細胞の体内分布を確認することが必要となる。非ヒト動物におけるヒト細胞の体内分布を計測するための技術としては、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ：ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＰＣＲ）が普及している。
　この場合、増幅対象の標的遺伝子は、ヒト細胞中に存在し、かつ、非ヒト動物には存在しない遺伝子である。このような標的遺伝子としては、Ａｌｕ配列や長鎖散在反復配列－１（ＬＩＮＥ－１）等のマルチコピー遺伝子が用いられる。
　特許文献１には、４６のヒトＡｌｕサブファミリーのコンセンサス配列を代表する一つの「ヒトＡｌｕモデル配列」を同定し、このヒトＡｌｕモデル配列を用いてＡｌｕ検出用ＰＣＲプライマー・プローブ候補を選択する。次に、ヒトＡｌｕ配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド配列であって、且つ、ダイマーの形成を最小限に抑え得るオリゴヌクレオチド配列からなるプライマー・プローブセットを、独自のクライテリアを用いて選択する。このようにして得られたＡｌｕ検出用ＰＣＲプライマー・プローブを用いて定量リアルタイムＰＣＲを行うことにより、被験試料中のヒトゲノムＤＮＡを高感度に検出及び／又は定量することができることが開示されている。
　特許文献２には、ヒト以外の動物に移植又は投与されたヒト細胞を検出するための技術が開示されている。より詳細には、ヒトＬＩＮＥ－１遺伝子に由来する所定の塩基配列中の連続する１０～３５塩基の配列からなるオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な配列と、標識部分を含む、定量ＰＣＲプローブが開示されている。
　特許文献３には、ｑＰＣＲにおける一般的なゲノムＤＮＡ量の補正方法が開示されている。一般的に、ｑＰＣＲにおけるヒト細胞の細胞数は、標的遺伝子のコピー数として定量されるが、その際、標的遺伝子のコピー数は、例えばＲＮａｓｅＰ遺伝子等、ゲノム中のコピー数がよく知られている遺伝子を内部標準として、それらの遺伝子の定量値から、ゲノムＤＮＡ量を補正する。以上のような換算方法から、ｑＰＣＲでは遺伝子のコピー数やゲノムＤＮＡ量が単位として用いられる。
　非特許文献１には、組織毎のゲノムＤＮＡの抽出回収率が開示されている。ｑＰＣＲには、組織からゲノムＤＮＡを抽出し精製する必要があるが、組織によりゲノムＤＮＡの回収率に差があることが開示されている。
国際公開第２０１８／１０１３７５号 国際公開第２０１９／２４００７３号 国際公開第２０２１／０６５８７７号
Ｓｐｉｃｋｌｅｒ，Ｃ．、外６名、"Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　Ｍｕｒｉｎｅ　Ｏｒｇａｎ　ＤＮＡ　ｂｙ　ＰＣＲ"、２０２２年６月１０日閲覧、Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ、インターネット<URL:https://www.criver.com/sites/default/files/resource-files/SP-WRIB-20-Sensitive-Detection-of-Human-Cells-in-Murine-Organ-DNA-by-qPCR.pdf>
　ｑＰＣＲには、組織からゲノムＤＮＡを抽出し精製する必要があり、組織によりゲノムＤＮＡの回収率に差があるため、ゲノムＤＮＡ抽出による回収率補正を実施する必要があるという問題がある。また、ゲノムＤＮＡを内部標準としてゲノムＤＮＡ量を補正することから、定量ＰＣＲでは遺伝子のコピー数やゲノムＤＮＡ量が単位として用いられる。しかし、ヒト細胞製剤は、細胞そのものが治療効果を発揮するため、遺伝子のコピー数やゲノムＤＮＡ量ではなく、細胞の個数で非ヒト動物の体内分布を評価することが理想的である。
　本発明は上記実情に鑑みてなされたものであり、ゲノムＤＮＡ抽出による回収率補正及び内部標準等の定量によるゲノムＤＮＡ量の補正を必要としない、ヒト細胞の定量方法を提供することを目的のひとつとする。
［１］　ヒト細胞を測定する方法であって、
　非ヒト動物細胞に由来する非ヒト動物成分及びヒト細胞を含む試料を準備する準備工程と、
　前記試料中の細胞膜を溶解する溶解工程と、
　前記ヒト細胞に特異的な核酸配列に対してハイブリダイゼーションアッセイを行うアッセイ工程と、
を含む、ヒト細胞を測定する方法。
［２］　前記ヒト細胞に特異的な核酸配列がヒトに特異的な反復配列である、［１］に記載のヒト細胞を測定する方法。
［３］　前記ヒトに特異的な反復配列が、Ａｌｕ配列及び長鎖散在反復配列－１（ＬＩＮＥ－１）からなる群から選択される少なくとも１種を含む、［２］に記載のヒト細胞を測定する方法。
［４］　前記ハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いる核酸プローブが非ヒト動物のゲノムＤＮＡとハイブリダイズしない、［１］～［３］のいずれかに記載のヒト細胞を測定する方法。
［５］　前記溶解工程において、前記非ヒト動物成分及び前記ヒト細胞の細胞膜を、物理的方法、化学的方法、酵素的方法及びこれらの組合せからなる群から選択されるいずれかの方法で溶解する、［１］～［４］のいずれかに記載のヒト細胞を測定する方法。
［６］　前記ハイブリダイゼーションアッセイがＰＡＬＳＡＲ法又はデュアルハイブリダイゼーション法である、［１］～［５］のいずれかに記載のヒト細胞を測定する方法。
［７］　前記溶解工程の後に、さらに、前記非ヒト動物細胞及び前記ヒト細胞に含まれるゲノムＤＮＡを、物理的方法、化学的方法、酵素的方法及びこれらの組合せからなる群から選択されるいずれかの方法で断片化する断片化工程を含む、［１］～［６］のいずれかに記載のヒト細胞を測定する方法。
［８］　前記ゲノムＤＮＡを断片化して得られるゲノムＤＮＡの断片長が５０～６００ｂｐである、［７］に記載のヒト細胞を測定する方法。
［９］　前記ヒト細胞の数を計測するための、［１］～［８］のいずれかに記載のヒト細胞を測定する方法。
　本発明のヒト細胞の定量方法は、ゲノムＤＮＡ抽出による回収率補正及び内部標準等の定量によるゲノムＤＮＡ量の補正を必要としない。
　また、本発明のヒト細胞の定量方法は、試料中のヒト細胞の数を直接計測することができる。
実施例１－１のマウス腎臓マトリクスにおけるヒト細胞の定量結果を示すグラフである。 実施例１－２のマウス肺マトリクスにおけるヒト細胞の定量結果を表３、表４及び図１Ｂに示した。 標的遺伝子及び標的配列の検討結果を示すグラフである。 標的遺伝子ごとのマウス交差反応性の結果を示すグラフである。 ハイブリダイゼーション法における検出方法比較の結果を示すグラフである。 ゲノムＤＮＡの断片化処理条件の検討結果を示すグラフである。 ゲノムＤＮＡの断片化処理条件の検討結果を示すグラフである。 ゲノムＤＮＡの断片化処理条件の検討結果を示すグラフである。 ゲノムＤＮＡの断片化処理条件の検討結果を示すグラフである。 ヒト細胞の定量結果を示すグラフである。
　以下、本発明の実施形態を詳細に説明するが、本発明は後述する実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない限り、種々の変形が可能である。
　本発明において、「測定する」は「検出する」又は「定量する」の意味で使用される。同様に、「測定」は「検出」又は「定量」の意味で使用される。定量する行為には、必然的に、検出する行為が含まれる。
　ＤＮＡはデオキシリボ核酸（Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ）を意味する。
　ＲＮＡはリボ核酸（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ）を意味する。
　数値範囲を「～」を用いて表す場合、その数値範囲は「～」の両側の数値を含む。
　本発明のヒト細胞を測定する方法は、ヒト細胞を測定する方法であり、非ヒト動物細胞に由来する非ヒト動物成分及びヒト細胞を含む試料を準備する準備工程と、前記試料中の細胞膜を溶解する溶解工程と、前記ヒト細胞に特異的な核酸配列に対してハイブリダイゼーションアッセイを行うアッセイ工程と、を含む。
　準備工程では、本発明を実施するための、非ヒト動物細胞に由来する非ヒト動物成分及びヒト細胞を含む試料を準備する。
　前記非ヒト動物細胞に由来する非ヒト動物成分としては、例えば、非ヒト動物細胞そのもののほか、非ヒト動物細胞に含まれていたタンパク質、核酸、脂質等が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のヒト細胞の測定方法は、これらの非ヒト動物細胞に由来する非ヒト動物成分とヒト細胞とが混在する場合であっても、ヒト細胞を測定することができる。
　前記ヒト細胞は、ヒト幹細胞、ヒトがん細胞、ヒト体細胞、ヒト生殖細胞等のヒト由来の細胞であればどのような種類の細胞であってもよいが、ヒト幹細胞が好ましく、ヒト間葉系幹細胞、ヒト造血幹細胞、ヒト神経幹細胞、ヒトｉＰＳ細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒト体細胞由来胚性幹細胞等のヒト幹細胞を特に好適に例示することができる。
　前記非ヒト動物細胞は、非ヒト動物の細胞であれば特に限定されない。
　前記非ヒト動物の例としては、マウス、ラット、ギニアピッグ（モルモット）、イヌ、ウサギ、ブタ、ヤギ及びウシ等の非ヒト哺乳動物が挙げられる。前記非ヒト動物としては、マウス、ラット及びギニアピッグ等のげっ歯類動物が好ましい。
　また、前記非ヒト動物からは、ヒト（学名：ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ）以外の霊長類（サル）を除くことが好ましい。前記ヒト以外の霊長類としては、ヒト以外のヒト上科（Ｈｏｍｉｎｏｉｄｅａ）動物が挙げられ、より具体的にはチンパンジー、ボノボ、ゴリラ及びオランウータン等のヒト以外のヒト科動物、シロテテナガザル及びフクロテナガザル等のテナガザル科動物、並びにオナガザル、ヒヒ、マカク及びテングザル等のオナガザル科動物が挙げられる。
　本発明のヒト細胞の定量方法では、ヒト細胞に特異的な核酸配列に対してハイブリダイゼーションアッセイを行うが、ここでいうヒト細胞に特異的な核酸配列とは、試料中の非ヒト動物細胞とヒト細胞との組合せによって異なってくる。例えば、ヒト細胞とげっ歯類細胞が試料中に混在している場合、Ａｌｕ配列はヒト細胞に特異的な核酸配列といえるが、ヒト細胞とチンパンジー細胞が試料中に混在している場合、同じＡｌｕ配列であってもヒト細胞に特異的な核酸配列とは言えない場合がある。逆に、ヒト細胞に特異的な核酸配列としてＡｌｕ配列を採用する場合、非ヒト動物からはヒト以外の霊長類が必然的に除かれる。これに対し、長鎖散在反復配列－１（ＬＩＮＥ－１）を採用する場合、例えばＴａファミリー等、一部のファミリーはヒト特異的であることから、ヒト以外の霊長類を非ヒト動物に加えることが可能である。
　前記非ヒト動物細胞に由来する非ヒト動物成分及びヒト細胞を含む試料としては、例えば、非ヒト動物にヒト細胞を移植して作製された異種移植モデル動物由来の生体試料が挙げられるが、これに限定されない。
　前記ヒト細胞に特異的な核酸配列（以下「標的配列」や「標的遺伝子」という場合がある。）がヒトに特異的な反復配列が好ましく、例えば、Ａｌｕ配列及び長鎖散在反復配列－１（ＬＩＮＥ－１）からなる群から選択される少なくとも１種が好ましい。
　上記に例示した反復配列には、各配列において複数のファミリーが存在するが、本発明においてはどのファミリーを標的配列としてもよい。また、複数のファミリーに共通する配列、いわゆるコンセンサスな配列を標的としてもよい。
　Ａｌｕ配列は、ヒトをはじめとする霊長類のゲノムに見られる遺伝因子の一つであり、Ａｌｕ要素とも称される。Ａｌｕの名称は、アルスロバクター・ルテウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｌｕｔｅｕｓ）の制限エンドヌクレアーゼ活性により最初に特徴づけられたことに因む。
　Ａｌｕ配列はヒトゲノム中に最も頻繁にみられるトランスポゾンであり、ヒトゲノム全体では１００万以上のコピーが散在するマルチコピー遺伝子である。Ａｌｕ配列は霊長類ゲノム間で高度に保存されており、ヒトとヒト以外の霊長類を区別できないという欠点はあるが、例えば、ヒトとげっ歯類、ヒトと偶蹄類などを区別することはできるため、本発明のヒト細胞の定量方法においても有用である。
　ＬＩＮＥ－１は長鎖散在反復配列（ＬＩＮＥ：Ｌｏｎｇ　Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｅｌｅｍｅｎｔ）のひとつである。ＬＩＮＥは、非ＬＴＲ型レトロトランスポゾンの一群であり、多くの真核生物のゲノムに広く見られる。ＬＩＮＥはヒトゲノムでは全体のおよそ２１．１％を占めるマルチコピー遺伝子であり、それぞれの長さはおおよそ７０００塩基対（ｂｐ）程度である。中でも、Ｔａ－１及びＴａ－０を含むＴａファミリーはヒト特異的であることから、プローブの設計により、ヒトとヒト以外の霊長類を区別することが可能である。
　ＳＶＡ（ＳＩＮＥ－ＶＮＴＲ－Ａｌｕ）は、レトロトランスポゾンの中でも最も近年進化した反復配列である。霊長類の中でも類人猿に特異的な配列である。ヒトゲノム上に約３０００コピー存在する。ＳＶＡ＿Ａ、ＳＶＡ＿Ｂ、ＳＶＡ＿Ｃ、ＳＶＡ＿Ｄ、ＳＶＡ＿Ｅ及びＳＶＡ＿Ｆの６つのファミリーが存在するが、中でもＳＶＡ＿Ｅ及びＳＶＡ＿Ｆはヒト特異的であることから、プローブの設計、投与する細胞数の検討により、ヒトとヒト以外の霊長類の区別に用いられうる。
　前記溶解工程において、前記試料中の細胞膜を溶解する方法は、特に限定されないが、物理的方法、化学的方法、酵素的方法及びこれらの組合せからなる群から選択されるいずれかの方法が好ましい。
　物理的方法としては、例えば、機械的破砕技術（ダウンス、ポリトロン、乳鉢と乳棒によるホモジナイズなど）、凍結融解溶解、浸透圧ショック、超音波処理等が挙げられる。
　化学的方法としては、例えば、界面活性剤可溶化等が挙げられる。
　酵素的方法としては、例えば、細胞膜裏打ちタンパク質をタンパク質分解酵素や酸・アルカリ等により加水分解して細胞膜をバーストさせる方法などが挙げられる。
　前記溶解工程のより具体的な手順については、後述する実施例に記載している。
　前記ハイブリダイゼーションアッセイにおいては、用いる核酸プローブが非ヒト動物のゲノムＤＮＡとハイブリダイズしないことが好ましい。なお、ハイブリダイゼーションアッセイにおいては核酸プローブを用いる。
　前記ハイブリダイゼーションアッセイの方法としては、ＰＡＬＳＡＲ（Ｐｒｏｂｅ　Ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ　Ｌｉｎｋ　Ｓｅｌｆ－Ａｓｓｅｍｂｌｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法又はデュアルハイブリダイゼーション法が好ましい。
　デュアルハイブリダイゼーション法は、２つの配列特異的オリゴヌクレオチドプローブを使用する方法である。２つのプローブは、標的配列中の隣接する配列に結合するように設計されている。第一のプローブは、プレートやビーズ等の固相担体に固定されており、標的を捕捉するためのプローブである。第二のプローブの末端には、例えばビオチン等の標識物が修飾されている。上記２つのプローブが標的とするＤＮＡ、ＲＮＡにハイブリダイゼーションし、標識物に蛍光物質を反応させることで、標的を検出する。
　デュアルハイブリダイゼーション法によるＡｌｕ配列の検出方法の詳細は後述する実施例に記載した。他の標的遺伝子の場合は適宜プローブを変更することにより対応可能である。
　ＰＡＬＳＡＲ法（例えば、特許第４６１６８８１号公報）では、あらかじめ用意した互いに相補的な３つの領域からなる２種類のＤＮＡプローブを用いる方法である。この２種類のＤＮＡプローブに標識物を付け、それらがハイブリダイゼーションによる自己集合反応を繰り返すことにより蜂の巣のような形で結合して大きなＤＮＡの塊となり、これが増幅シグナルとなる。そして、検出したい遺伝子にこの大きなＤＮＡの塊が結合することによって、その増幅したシグナルを捕捉して検出遺伝子の存在が確認できる。例えば、特許第４６１６８８１号公報では、上記デュアルハイブリダイゼーション法のシグナルを、ＰＡＬＳＡＲ法を用いて増幅する方法が開示されている。このハイブリダイゼーションには核酸合成酵素を必要とせず、短時間に反応し（３０秒から３０分）、一定の温度で反応が進み（４０℃から７０℃）、標的とするＤＮＡ、ＲＮＡのどちらも高感度に検出できるという特徴がある。一方、定量ＰＣＲ法においては、熱変性により標的核酸を１本鎖に分離した後、標的核酸に特異的な配列をもつＤＮＡプローブをハイブリダイゼーションさせ、核酸合成酵素により１本鎖に分離した標的核酸に相補的な核酸の伸長反応を行う。このようにＰＡＬＳＡＲ法又はデュアルハイブリダイゼーション法においてもＤＮＡプローブを標的核酸にハイブリダイゼーションを行うが、その反応機構は全く異なる。
　ＰＡＬＳＡＲ法によるＡｌｕ配列及びＬＩＮＥ－１配列の検出方法の詳細は、後述する実施例に記載した。他の標的遺伝子の場合は適宜プローブを変更することにより対応可能である。
　前記溶解工程の後に、ゲノムＤＮＡを断片化する工程として断片化工程を含んでもよい。
　前記断片化工程では、前記非ヒト動物細胞及び前記ヒト細胞に含まれるゲノムＤＮＡを、物理的方法、化学的方法、酵素的方法及びこれらの組合せからなる群から選択されるいずれかの方法で断片化することが好ましい。
　物理的方法としては、例えば、機械的破砕技術（ダウンス、ポリトロン、乳鉢と乳棒によるホモジナイズなど）、凍結融解溶解、浸透圧ショック、超音波処理等が挙げられる。
　化学的方法としては、例えば、酸・アルカリ等により部分加水分解する方法などが挙げられる。
　酵素的方法としては、例えば、エンドヌクレアーゼを用いる方法が挙げられる。
　前記エンドヌクレアーゼとしては、デオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮａｓｅ　Ｉ）、デオキシリボヌクレアーゼＩＩ（ＤＮａｓｅ　ＩＩ）、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｌ　Ｎｕｃｌｅａｓｅ、Ｔｕｒｂｏ　Ｎｕｃｌｅａｓｅ、制限酵素等が挙げられる。前記制限酵素としては、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＢｇｌＩＩ、ＭｓｐＩ、ＴａｑＩ－ｖ２等が挙げられる。制限酵素は特定のＤＮＡ配列を認識して切断するエンドヌクレアーゼである。酵素的方法を用いる場合の酵素は、特に限定されないが、ＤＮａｓｅ　Ｉが好ましい。ゲノムＤＮＡの断片化にＤＮａｓｅ　Ｉを使用する場合の使用量は、特に限定されないが、０．０００１～０．１Ｕ／ｗｅｌｌが好ましく、０．００１～０．０２５Ｕ／ｗｅｌｌがより好ましく、０．００５～０．０１Ｕ／ｗｅｌｌがさらに好ましい。なお、１ユニットは、反応全容量５０ μＬ中、３７ ℃、１０分間で１ μｇのプラスミドベクターｐＢＲ３２２のＤＮＡを完全に分解する酵素量として定義される。ＤＮＡ断片がテトラヌクレオチド以下に分解されることを完全な分解と定義する。
　ゲノムＤＮＡを断片化することにより、より高感度でヒト細胞を検出でき、定量精度も向上する。
　この場合のゲノムＤＮＡ断片長は、５０～１０００ｂｐが好ましく、５０～６００ｂｐがより好ましく、１５０～６００ｂｐがさらに好ましく、１５０～３００ｂｐがいっそう好ましい。
　以下では実施例によって本発明をより具体的に説明するが、本発明の範囲は実施例によって何ら限定されるものではない。
　本発明の実施例の一部では、独立行政法人医薬品医療機器総合機構（ＰＭＤＡ）より発表された「医薬品開発における生体試料中薬物濃度分析法（リガンド結合法）のバリデーションに関するガイドライン」に基づき、測定法の信頼性を評価した。
［標的配列と使用する核酸プローブ］
 本発明の実施例においては、標的遺伝子及び塩基配列の異なる３種類の標的配列を使用した。各標的配列の説明及び標的配列を検出するために使用した捕捉プローブとアシストプローブの組合せを、以下に示す。
１．Ａｌｕ配列（１）
　国際公開第２０１８／１０１３７５号に記載された「ヒトＡｌｕモデル配列」の内、４３ｂｐを標的とした配列である。
　捕捉プローブとして、Ａｌｕ配列（１）の５’側に対して相補的な塩基配列を持つ核酸プローブＣＰ－Ａｌｕ配列（１）を、アシストプローブとして、Ａｌｕ配列（１）の３’側に対して相補的な塩基配列にポリＡ鎖を付加した塩基配列を持つＡＰ－Ａｌｕ配列（１）を、それぞれ使用した。
〈Ａｌｕ配列（１）の塩基配列〉
　5’-GCAGGAGAATCGCTTGAACCCGGGAGGCGGAGGTTGCAGTGAG-3’（塩基部分は配列番号１）
〈ＣＰ－Ａｌｕ配列（１）の塩基配列〉
　5’-CGGGTTCAAGCGATTCTCCTGC-(NH2)-3’（塩基部分は配列番号２）
〈ＡＰ－Ａｌｕ配列（１）の塩基配列〉
　5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACTCACTGCAACCTCCGCCTCC-3’（塩基部分は配列番号３）
２．Ａｌｕ配列（２）
　独立行政法人医薬品医療機器総合機構（ＰＭＤＡ）より発表された「再生医療等製品（ヒト細胞加工製品）の品質、非臨床試験及び臨床試験の実施に関する技術的ガイダンス」（平成２８年６月１４日）に記載されたＡｌｕ－ＰＣＲプローブ３０ｂｐの内、ヒトゲノム上で高い相同性が確認された１９ｂｐを標的とした配列である。
　捕捉プローブとして、Ａｌｕ配列（２）の３’側に対して相補的な塩基配列を持つ核酸プローブＣＰ－Ａｌｕ配列（２）を、アシストプローブとして、Ａｌｕ配列（２）の５’側に対して相補的な塩基配列にポリＡ鎖を付加した塩基配列を持つＡＰ－Ａｌｕ配列（２）をそれぞれ使用した。
〈Ａｌｕ配列（２）の塩基配列〉
　5’-ATCTCGGCTCACTGCAAGC-3’（塩基部分は配列番号４）
〈ＣＰ－Ａｌｕ配列（２）の塩基配列〉
　5’-(NH2)-GCTTGCAGTGAG-3’（塩基部分は配列番号５）
〈ＡＰ－Ａｌｕ配列（２）の塩基配列〉
　5’-5(L)5(L)G(L)A(L)G(L)A(L)T(L)AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’（塩基部分は配列番号６）
※（Ｌ）＝ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ：ロック核酸）、５＝５－Ｍｅｔｈｙｌ－Ｃｙｔｏｓｉｎｅに置換されていることを示す。
３．ＬＩＮＥ－１配列
　国際公開第２０１９／２４００７３号に記載されたヒト細胞定量ＰＣＲプローブを参考に設計した、３０ｂｐの標的配列である。捕捉プローブとして、ＬＩＮＥ－１配列の３’側に対して相補的な塩基配列を持つ核酸プローブＣＰ－ＬＩＮＥ－１配列を、アシストプローブとして、ＬＩＮＥ－１配列の５’側に対して相補的な塩基配列にポリＡ鎖を付加した塩基配列を持つＡＰ－ＬＩＮＥ－１配列をそれぞれ使用した。
〈ＬＩＮＥ－１配列の塩基配列〉
　５’-AATGCTAGATGACACATTAGTGGGTGCAGC-3’（塩基部分は配列番号７）
〈ＣＰ－ＬＩＮＥ－１配列の塩基配列〉
　5’-(NH2)-GCTGCACCCACTAATGT-3’（塩基部分は配列番号８）
〈ＡＰ－ＬＩＮＥ－１配列の塩基配列〉
　5’-GTCAT(L)5(L)T(L)A(L)G(L)CATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’（塩基部分は配列番号９）
※（Ｌ）＝ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ：ロック核酸）、５＝５－Ｍｅｔｈｙｌ－Ｃｙｔｏｓｉｎｅに置換されていることを示す。
［実施例１－１］
　マウス腎臓マトリクスにおけるヒト細胞定量の検討
　１．材料
（１）生体試料
　測定対象のヒト細胞として、ＨＥＫ２９３細胞を用いた。また、非ヒト動物試料としてマウス腎臓（ジャクソン・ラボラトリー・ジャパン社）を使用した。マウスはＣ５７ＢＬ／６Ｊ系統のオス、週齢ＲＥＴＩＲＥを用いた。
（２）標的配列
　標的配列としてＡｌｕ配列（１）（配列番号１）を用いた。
　２．方法
（１）マウス腎臓及びヒト細胞の溶解処理
　マウス腎臓及びヒト細胞をそれぞれ調製し、ＤｉｒｅｃｔＰＣＲ　Ｌｙｓｉｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔａｉｌ）（Ｖｉａｇｅｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社、製品番号：１０２－Ｔ）及びプロテイナーゼＫ溶液（関東化学社、製品番号：３４０６０－９６）を用いて溶解処理を実施した。
（１－１）マウス腎臓の調製
ＤｉｒｅｃｔＰＣＲ　Ｌｙｓｉｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ　（Ｔａｉｌ）とプロテイナーゼＫ溶液は１００：１の比率で混合し、溶解反応試薬として調製した。マウス腎臓をチューブに秤量後、組織重量が２００ｍｇ／ｍＬとなるよう溶解反応試薬を添加し、よく懸濁した。
（１－２）ヒト細胞の調製
　凍結保存液中のＨＥＫ２９３細胞を流水にて融解し、チューブに２５０μＬ分注した。遠心し、上清を除去後、等量の１×ＰＢＳを添加し、ピペッティングにて細胞表面に残存した凍結保存液を洗浄した。再度遠心、上清を除去後、１×ＰＢＳを２０μＬ添加し、ＴＣ２０ＴＭ全自動セルカウンター（ＢＩＯ　ＲＡＤ社、製品番号：１４５０１０１Ｊ１）を用いて細胞数を計測した。計測結果より、全量に対し１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう、ＤｉｒｅｃｔＰＣＲ　Ｌｙｓｉｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔａｉｌ）を添加した。また、全量１／１００量のプロテイナーゼＫ溶液を添加し、よく懸濁した。
（１－３）溶解処理
　１，０００ｒｐｍにてチューブを振盪しながら、５５℃で１６時間反応させた。一旦取り出して懸濁後、１，０００ｒｐｍ、８５℃にて４５分間反応させ、プロテイナーゼＫを失活させた。
（２）超音波によるゲノムＤＮＡ断片化処理
　溶解処理したマウス腎臓とＨＥＫ２９３細胞を混合し、超音波破砕装置Ｃｏｖａｒｉｓ　Ｆｏｃｕｓｅｄ－ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｔｏｒ　Ｍ２２０（Ｃｏｖａｒｉｓ社、製品番号：Ｍ２２０）を用いて、ゲノムＤＮＡの断片化処理を実施した。
（２－１）サンプル調製
　ＲＮａｓｅ　Ｆｒｅｅ　Ｗａｔｅｒにて１０倍希釈した溶解済みマウス腎臓に、溶解処理したＨＥＫ２９３細胞溶液を９：１で混合し、ヒト細胞・マウス腎臓混合サンプルを調整した。希釈率を考慮し、上記サンプルの細胞数を計算すると、容量換算で１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、組織重量換算で６×１０６ｃｅｌｌｓ／腎臓ｇであった。
（２－２）超音波処理
ｍｉｃｒｏＴＵＢＥ－５０　ＡＦＡ　Ｆｉｂｅｒ　Ｓｃｒｅｗ－Ｃａｐ（Ｃｏｖａｒｉｓ社、製品番号：５２０１６６）に上記サンプルを５５μＬ分注し、Ｃｏｖａｒｉｓ　Ｆｏｃｕｓｅｄ－ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｔｏｒ　Ｍ２２０にて超音波処理を実施した。超音波の各パラメーターはＰＩＰ　５０Ｗ、ＤＦ　２０％、ＣＰＢ　２００ｃｐｂに設定し、処理時間は１５分とした。
（３）捕捉プローブの調製
　担体であるＭｉｃｒｏＰｌｅｘＴＭ　Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ（Ｌｕｍｉｎｅｘ社、製品番号：ＬＣ１００２２－０１）に、核酸プローブＣＰ－Ａｌｕ配列（１）（配列番号２）を、３’末端のＮＨ２修飾を介して結合させることにより捕捉プローブを調製した。
（４）検量線サンプル及びＱＣサンプルの調製
　上記（２）で断片化処理したヒト細胞・マウス腎臓混合サンプルを、ＲＮａｓｅ　Ｆｒｅｅ　Ｗａｔｅｒにて１０倍希釈した溶解済みマウス腎臓マトリクスにて段階希釈し、検量線サンプル及びＱＣサンプルを調製した。検量線サンプルは、細胞数６×１０３、１.２×１０４、２.４×１０４、６×１０４、１.２×１０５、２.４×１０５、６×１０５ｃｅｌｌｓ／腎臓ｇとなるよう調製した。ＱＣサンプルは、細胞数６×１０３、１.２×１０４、６×１０４、２.４×１０５、６×１０５ｃｅｌｌｓ／腎臓ｇとなるよう調製し、各サンプル名をＬＬＯＱ、ＬＱＣ、ＭＱＣ、ＨＱＣ、ＵＬＯＱとした。ＱＣサンプルは３系列調製し、１系列ごとに段階希釈した。
（５）捕捉プローブへの標的核酸の捕捉（１ｓｔ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ反応）
　上記（４）で調製した検量線サンプル、ＱＣサンプル及びブランクサンプル５μＬに、１ｓｔ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ反応液を１５μＬ加えて計２０μＬとし、９５℃で２分間反応させた後、４７℃で１８時間反応させた。
（５－１）１ｓｔ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ反応液の組成
　上記（３）で担体へ固定した捕捉プローブ０．４μＬ（８００個）、
　５Ｍ　ＴＭＡＣ（テトラメチルアンモニウムクロリド）６．０μＬ、
　１０×ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ［５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４０ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、８．０％　Ｎ－ラウロイルサルコシンナトリウム］　３．０μＬ、
　６．６７％　ＰＥＧ２００００（ポリエチレングリコール）　３．０μＬ、
　ＲＮａｓｅ　Ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ　１．６μＬ、
　５００ｆｍｏｌ／ｍＬアシストプローブ（ＡＰ－Ａｌｕ配列（１）（配列番号３））　１μＬ。
（６）非標的配列ゲノム断片の洗浄
　１ｓｔ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ反応終了後の反応液を遠心し、上清を除去した。１×ＰＢＳ－ＴＰ（０．０５％　Ｔ）　［１×ＰＢＳ　［１３７ｍＭ　Ｓｏｄｉｕｍ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅ、８．１ｍＭ　Ｄｉｓｏｄｉｕｍ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、２．６８ｍＭ　Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅ、１．４７ｍＭ　Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　Ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎｐｈｏｓｐｈａｔｅ］、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０、１．５　ｐｐｍ　ＰｒｏＣｌｉｎ３００］で１回洗浄した後、再度遠心し、上清を除去した。
（７）ＰＡＬＳＡＲ反応によるシグナル増幅
　上清除去後の各ウェルに対し、ＰＡＬＳＡＲ反応液を５０μＬ加え、４２℃で１時間反応させた。本実施例１に使用する自己凝集可能な一対のプローブ（シグナル増幅用プローブともいう）の配列は、５’末端がビオチンで標識された以下のＨＣＰ－１及びＨＣＰ－２である。
　〈ＨＣＰ－１の塩基配列〉
　5’-(Biotin)-CAACAATCAGGACGATACCGATGAAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’（塩基部分は配列番号１０）
　〈ＨＣＰ－２の塩基配列〉
　5’-(Biotin)-GTCCTGATTGTTGCTTCATCGGTATCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’（塩基部分は配列番号１１）
（７－１）ＰＡＬＳＡＲ反応液の組成
　Ｎｕｃｌｅａｓｅ－Ｆｒｅｅ　Ｗａｔｅｒ　２０．６８μＬ、
　６．６７％　ＰＥＧ２００００（ポリエチレングリコール）３．０μＬ、
　５Ｍ　ＴＭＡＣ　１５．０μＬ、
　１０×ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ［５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４０ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、８％　Ｎ－ラウロイルサルコシンナトリウム］　８．０μＬ、
　２０ｐｍｏｌ／μＬ　ＨＣＰ－１　１．７５μＬ、
　２０ｐｍｏｌ／μＬ　ＨＣＰ－２　１．５８μＬ
（８）蛍光検出
　ＰＡＬＳＡＲ反応終了後の反応液を、１×ＰＢＳ－ＴＰ（０．０２％　Ｔ）［１×ＰＢＳ［１３７ｍＭ　Ｓｏｄｉｕｍ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅ、８．１ｍＭ　Ｄｉｓｏｄｉｕｍ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、２．６８ｍＭ　Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅ、１．４７ｍＭ　Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　Ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎｐｈｏｓｐｈａｔｅ］、０．０２％　Ｔｗｅｅｎ２０、１．５ｐｐｍ　ＰｒｏＣｌｉｎ３００］で１回洗浄した。
　その後、検出試薬［ＳＡ－ＰＥ（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－Ｒ－Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ、Ｐｒｏｚｙｍｅ社製）　５μｇ／ｍＬ］を５０μＬ加えて２５℃の遮光下で１時間静置した後、１×ＰＢＳ－ＴＰ（０．０２％　Ｔ）で２回洗浄した。その後、１×ＰＢＳ－ＴＰ（０．０２％　Ｔ）を７５μＬ加えて、Ｌｕｍｉｎｅｘ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｕｍｉｎｅｘ社製）でビーズ及びＳＡ－ＰＥ複合体からの蛍光を測定し、ヒト細胞ゲノムのシグナルを検出した。
　３．結果
　本発明のヒト細胞の定量方法による、マウス腎臓マトリクスにおけるヒト細胞の定量結果を表１、表２及び図１Ａに示した。
　図１より、試料中のヒト細胞数に依存したシグナルが得られた。ヒト細胞数とシグナルの相関係数（ｒ）は、０．９９９０であり、相関性の高い検量線を作成することができた。また、作成した検量線に対する検量線サンプルの％ＲＥは－１１．３～８．５％と、ＬＢＡガイドライン基準内の値を示した。ＱＣサンプルの％ＣＶ、％ＲＥ及び％ＴＥも基準内であり、ＬＢＡガイドライン基準を満たした堅牢性の高い定量法であると言える。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
［実施例１－２］
　マウス肺マトリクスにおけるヒト細胞定量の検討
　１．材料
（１）生体試料
　測定対象のヒト細胞として、ＨＥＫ２９３細胞を用いた。また、非ヒト動物試料としてマウス肺（ジャクソン・ラボラトリー・ジャパン社）を使用した。マウスはＣ５７ＢＬ／６Ｊ系統のオス、週齢ＲＥＴＩＲＥを用いた。
（２）標的配列
　標的配列としてＡｌｕ配列（１）（配列番号１）を用いた。
　２．方法
（１）マウス肺及びヒト細胞の溶解処理
　実施例１－１と同様の手順で、マウス肺及びＨＥＫ２９３細胞の溶解処理を実施した。
（２）超音波によるゲノムＤＮＡ断片化処理
　　実施例１－１と同様の手順で、マウス肺マトリクスに混合したＨＥＫ２９３細胞のゲノムＤＮＡを断片化した。
（３）捕捉プローブの調製
　実施例１－１と同様の手順で、捕捉プローブを調製した。
（４）検量線サンプル及びＱＣサンプルの調製
　上記（２）で断片化処理を実施したヒト細胞・マウス肺混合サンプルを、ＲＮａｓｅ　Ｆｒｅｅ　Ｗａｔｅｒにて１０倍希釈した溶解済みマウス肺マトリクスにて段階希釈し、検量線サンプル及びＱＣサンプルを調製した。検量線サンプルは、細胞数が１.２×１０４、２.４×１０４、６×１０４、１.２×１０５、２.４×１０５、６×１０５、１.２×１０６ｃｅｌｌｓ／肺ｇとなるよう調製した。ＱＣサンプルは、細胞数が１.２×１０４、２.４×１０４、１.２×１０５、６×１０５、１.２×１０６ｃｅｌｌｓ／肺ｇとなるよう調製し、各サンプル名をＬＬＯＱ、ＬＱＣ、ＭＱＣ、ＨＱＣ、ＵＬＯＱとした。また、ＱＣサンプルは３系列調製し、１系列ごとに段階希釈した。
　以下、実施例１－１の（５）～（８）と同様の手順で本実施例を実施した。
　３．結果
　本発明のヒト細胞の定量方法による、マウス肺マトリクスにおけるヒト細胞の定量結果を表３、表４及び図１Ｂに示した。
　実施例１－１のマウス腎臓と同様、検量線サンプルとＱＣサンプル両方において、ＬＢＡガイドライン基準を満たした。以上から、非ヒト動物試料に関して、組織の種類に関係なく、本発明方法は堅牢性の高い定量法であると言える。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
［実施例２］
　ヒト細胞定量における標的遺伝子及び標的配列の検討
　１．材料
（１）生体試料
　測定対象のヒト細胞として、ＨＥＫ２９３細胞を用いた。また、非ヒト動物試料としてマウス腎臓（ジャクソン・ラボラトリー・ジャパン社）を使用した。
（２）標的配列
標的配列としてＡｌｕ配列（２）（配列番号４）及びＬＩＮＥ－１配列（配列番号７）を用いた。
　２．方法
（１）マウス腎臓及びヒト細胞の溶解処理
　実施例１－１と同様の手順で、マウス腎臓及びＨＥＫ２９３細胞の溶解処理を実施した。
（２）超音波によるゲノムＤＮＡ断片化処理
　実施例１－１と同様の手順で、マウス腎臓マトリクスに混合したＨＥＫ２９３細胞のゲノムＤＮＡを断片化した。
（３）捕捉プローブの調製
　実施例１－１と同様の手順で、核酸プローブＣＰ－Ａｌｕ配列（２）（配列番号５）及びＣＰ－ＬＩＮＥ－１配列（配列番号８）を、５’末端のＮＨ２修飾を介して担体にそれぞれ結合させ、捕捉プローブを調製した。
（４）検量線サンプルの調製
　上記（２）で断片化処理を実施したヒト細胞・マウス腎臓混合サンプルを、ＲＮａｓｅ　Ｆｒｅｅ　Ｗａｔｅｒにて１０倍希釈した溶解済みマウス腎臓マトリクスにて段階希釈し、検量線サンプルを調製した。Ａｌｕ配列（２）を標的配列とする場合、細胞数１.２×１０４、２.４×１０４、６×１０４、１.２×１０５、２.４×１０５、６×１０５、１.２×１０６ｃｅｌｌｓ／腎臓ｇとなるよう調製した。ＬＩＮＥ－１配列を標的配列とする場合は、細胞数２.４×１０４、６×１０４、１.２×１０５、２.４×１０５、６×１０５、１.２×１０６ｃｅｌｌｓ／腎臓ｇとなるよう調製した。
（５）捕捉プローブへの標的核酸の捕捉（１ｓｔ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ反応）
　上記（４）で調製した検量線サンプル及びブランクサンプル５μＬに、１ｓｔ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ反応液を１５μＬ加えて計２０μＬとし、９５℃で２分間反応させた後、Ａｌｕ配列（２）を標的配列とする場合は３３℃で、ＬＩＮＥ－１配列を標的配列とする場合は４０℃で、それぞれ１８時間反応させた。１ｓｔ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ反応液の組成は実施例１－１と同様であり、アシストプローブとしてＡＰ－Ａｌｕ配列（２）（配列番号６）及びＡＰ－ＬＩＮＥ－１配列（配列番号９）をそれぞれ使用した。捕捉プローブとアシストプローブの組合せは、［標的配列と使用する核酸プローブ］に記載の通りに添加した。
（６）非標的配列ゲノム断片の洗浄
　実施例１－１と同様の手順で、非標的配列ゲノム断片の洗浄を行った。
（７）ＰＡＬＳＡＲ反応によるシグナル増幅
　上清除去後のサンプルに対し、ＰＡＬＳＡＲ反応液を５０μＬ加え、Ａｌｕ配列（２）を標的配列とする場合は３３℃で、ＬＩＮＥ－１配列を標的配列とする場合は４０℃で、それぞれ１時間反応させた。自己凝集可能な一対のプローブとしては、ＨＣＰ－１（配列番号１０）及びＨＣＰ－２（配列番号１１）を使用した。
（８）蛍光検出
実施例１－１と同様の手順で、ヒト細胞ゲノムをシグナルとして検出した。
　３．結果
　本発明方法による、ヒト細胞の定量における標的遺伝子及び標的配列の検討結果を表５、表６及び図２に示した。表５より、Ａｌｕ配列（２）を標的配列とした場合、定量範囲１.２×１０４～１.２×１０６ｃｅｌｌｓ／腎臓ｇにおいて、ガイドライン基準をクリアした正確な検量線を作成することができた。一方、表６より、ＬＩＮＥ－１配列を標的配列とした場合、定量範囲２.４×１０４～１.２×１０６ｃｅｌｌｓ／腎臓ｇにおいて、同じくガイドライン基準内の正確な検量線が得られた。実施例１－１で標的配列として使用したＡｌｕ配列（１）の定量範囲は６×１０３～６×１０５ｃｅｌｌｓ／腎臓ｇであり、標的配列ごとに定量範囲は異なるものの、ヒト反復遺伝子を標的配列とすることで、ヒト細胞を正確に定量可能であると言える。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
［実施例３］
　マウス抽出ゲノムを用いたマウス交差反応性の検討
　１．材料
（１）生体試料
　ヒト細胞の測定対象として、ＨＥＫ２９３細胞を用いた。また、マウス抽出ゲノムとして、Ｍｏｕｓｅ　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、製品番号：Ｇ３０９１）を用いた。マウス抽出ゲノムのゲノム濃度は２００ｎｇ／μＬである。
（２）標的配列
　標的配列としてＡｌｕ配列（１）（配列番号１）、ＬＩＮＥ－１配列（配列番号７）を用いた。
　２．方法
（１）ヒト細胞の溶解処理
　実施例１－１と同様の手順で、ＨＥＫ２９３細胞を溶解処理した。
（２）超音波によるゲノムＤＮＡ断片化処理
　溶解処理したＨＥＫ２９３細胞溶液１３０μＬを、ｍｉｃｒｏＴＵＢＥ－１３０　ＡＦＡ　Ｆｉｂｅｒ　Ｓｃｒｅｗ－Ｃａｐ（Ｃｏｖａｒｉｓ社、製品番号：５２０１６６）に分注し、Ｃｏｖａｒｉｓ　Ｆｏｃｕｓｅｄ－ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｔｏｒ　Ｍ２２０にて超音波処理を実施した。超音波の各パラメーターは、ＰＩＰ　５０Ｗ、ＤＦ　２０％、ＣＰＢ　２００ｃｐｂとし、処理時間は６０分とした。マウス抽出ゲノムに関しても同様に超音波処理した。
（３）捕捉プローブの調製
　実施例１－１（３）及び実施例２（３）と同様の手順で、各標的配列に対する捕捉プローブを調製した。
（４）ヒト細胞サンプルの調製
　上記（２）で断片化処理を実施した１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬヒト細胞溶液は、０．０１％　Ｔｗｅｅｎ　２０水溶液にて１００、４０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう希釈した。
（５）捕捉プローブへの標的配列の捕捉（１ｓｔ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ反応）
　上記（４）で調製したヒト細胞サンプル、マウス抽出ゲノム及びブランクサンプル５μＬに、１ｓｔ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ反応液を１５μＬ加えて計２０μＬとし、９５℃で２分間反応させた後、各温度で１８時間反応させた。ヒト細胞サンプルは、各標的配列測定系においてＳ／Ｎ比２．０以上の定量下限付近とし、Ａｌｕ配列（１）、ＬＩＮＥ－１配列の順に１００、４０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬのヒト細胞サンプルをそれぞれ使用した。また、１ｓｔ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ反応液は実施例１－１と同様の組成であり、捕捉プローブとアシストプローブは［標的配列と使用する核酸プローブ］に記載の通りの組合せで添加した。
　以下、実施例１－１及び２の（６）～（８）と同様の手順で本実施例を実施した。
　３．結果
　本発明方法における、標的遺伝子ごとのマウス交差反応性の結果を表７及び図３に示した。Ａｌｕ配列（１）、ＬＩＮＥ－１配列共に、マウス抽出ゲノムを測定対象とした場合のシグナル値はＢＬ値と同程度であり、定量下限付近のヒト細胞サンプルのシグナル値と比較して低い値であった。以上から、本発明において使用する標的遺伝子に関して、マウスとの交差反応性は非常に低いことが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
［実施例４］
　ハイブリダイゼーション法における検出方法の検討
　１．材料
（１）生体試料
　測定対象のヒト細胞として、ＨＥＫ２９３細胞を用いた。また、非ヒト動物試料としてマウス腎臓（ジャクソン・ラボラトリー・ジャパン社）を使用した。
（２）標的配列
　標的配列としてＡｌｕ配列（１）（配列番号１）を用いた。
　２．方法
（１）マウス腎臓及びヒト細胞の溶解処理
　実施例１－１と同様の手順で、マウス腎臓及びＨＥＫ２９３細胞の溶解処理を実施した。
（２）超音波によるゲノムＤＮＡ断片化処理
　実施例１－１と同様の手順で、マウス腎臓マトリクスに混合したＨＥＫ２９３細胞のゲノムＤＮＡを断片化した。
（３）捕捉プローブの調製
　実施例１－１（３）と同様の手順で、捕捉プローブを調製した。
（４）ヒト細胞サンプルの調製
　上記（２）で断片化処理を実施したヒト細胞・マウス腎臓混合サンプルを、ＲＮａｓｅ　Ｆｒｅｅ　Ｗａｔｅｒにて１０倍希釈した溶解済みマウス腎臓マトリクスにて段階希釈し、細胞数６×１０３、６×１０４、６×１０５ｃｅｌｌｓ／腎臓ｇとなるようサンプルを調製した。
（５）捕捉プローブへの標的配列の捕捉（１ｓｔ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ反応）
　上記（４）で調製したヒト細胞サンプル及びブランクサンプル５μＬに、１ｓｔ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ反応液を１５μＬ加えて計２０μＬとし、９５℃で２分間反応させた後、９５℃で１８時間反応させた。１ｓｔ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ反応液は実施例１－１と同様の組成である。アシストプローブは、ＰＡＬＳＡＲ法にて検出するサンプルに関してはＡＰ－Ａｌｕ配列（１）（配列番号３）を、デュアルハイブリダイゼーション法にて検出するサンプルに関してはＡＰ－Ａｌｕ配列（１）－５’Ｂｉｏｔｉｎ（配列番号１２）をそれぞれ使用した。ＡＰ－Ａｌｕ配列（１）－５’Ｂｉｏｔｉｎは、５’末端がビオチンで標識された核酸プローブである。
〈ＡＰ－Ａｌｕ配列（１）－５’Ｂｉｏｔｉｎの塩基配列〉
　5’-(Biotin)-CTCACTGCAACCTCCGCCTCC-3’（塩基部分は配列番号１２）
　ＰＡＬＳＡＲ法にて検出するサンプルに関しては、以下、実施例１－１の（６）～（８）と同様の手順で実施した。また、デュアルハイブリダイゼーション法にて検出するサンプルに関しては、以下、実施例１－１の（８）と同様の手順で実施した。
　３．結果
　本発明のヒト細胞の定量方法における、ハイブリダイゼーション法における検出方法比較の結果を表８及び図４に示した。デュアルハイブリダイゼーション法によって検出した場合、６０００ｃｅｌｌｓ／腎臓ｇのサンプルをＳ／Ｎ比２．１で測定可能であった。これに対し、ＰＡＬＳＡＲ法を用いて検出した場合、デュアルハイブリダイゼーション法に比べてＳ／Ｎ比２．８とシグナル値は高く、より細胞数の少ないサンプルでも測定可能であることが示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
［実施例５］
　断片化処理条件の検討
　１．材料
（１）生体試料
　測定対象のヒト細胞として、ＨＥＫ２９３細胞を用いた。また、非ヒト動物試料としてマウス腎臓（ジャクソン・ラボラトリー・ジャパン社）を使用した。
（２）標的配列
　標的配列としてＡｌｕ配列（１）（配列番号１）を用いた。
　２．方法
（１）マウス腎臓及びヒト細胞の溶解処理
　実施例１－１と同様の手順で、マウス腎臓及びＨＥＫ２９３細胞の溶解処理を実施した。
（２）超音波によるゲノムＤＮＡ断片化処理
　溶解処理したマウス腎臓とＨＥＫ２９３細胞を混合し、超音波破砕装置Ｃｏｖａｒｉｓ　Ｆｏｃｕｓｅｄ－ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｔｏｒ　Ｍ２２０（Ｃｏｖａｒｉｓ社、製品番号：Ｍ２２０）を用いて、ゲノムＤＮＡの断片化処理を実施した。
（２－１）サンプル調製
　実施例１－１と同様の手順で、ヒト細胞・マウス腎臓混合サンプルを調製した。
（２－２）超音波処理
　ｍｉｃｒｏＴＵＢＥ－５０　ＡＦＡ　Ｆｉｂｅｒ　Ｓｃｒｅｗ－Ｃａｐ（Ｃｏｖａｒｉｓ社、製品番号：５２０１６６）に上記サンプルを５５μＬずつ分注し、Ｃｏｖａｒｉｓ　Ｆｏｃｕｓｅｄ－ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｔｏｒ　Ｍ２２０にて超音波処理を実施した。超音波処理条件は、表９の通り合計７条件とした。また比較のため、超音波処理による断片化を実施しないサンプルも準備した。
（３）捕捉プローブの調製
　実施例１－１（３）と同様の手順で、捕捉プローブを調製した。
（４）ヒト細胞サンプルの調製
　上記（２）で断片化処理を実施したヒト細胞・マウス腎臓混合サンプルを、ＲＮａｓｅ　Ｆｒｅｅ　Ｗａｔｅｒにて１０倍希釈した溶解済みマウス腎臓マトリクスにて希釈し、細胞数６×１０４ｃｅｌｌｓ／腎臓ｇとなるようサンプルを調製した。
（５）捕捉プローブへの標的配列の捕捉（１ｓｔ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ反応）
　上記（４）で調製したヒト細胞サンプル及びブランクサンプル５μＬに、１ｓｔ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ反応液を１５μＬ加えて計２０μＬとし、９５℃で２分間反応させた後、９５℃で１８時間反応させた。１ｓｔ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ反応液は実施例１－１と同様の組成であり、アシストプローブとしてＡＰ－Ａｌｕ配列（１）（配列番号３）を使用した。
　以下、実施例１－１の（６）～（８）と同様の手順で本実施例を実施した。
（９）超音波処理したヒト細胞ゲノムＤＮＡの電気泳動
　上記（２）で断片化処理を実施したＨＥＫ２９３細胞・マウス腎臓混合サンプルから、エタノール沈殿によりゲノムＤＮＡを抽出・精製し、Ｅ－ＧｅｌＴＭ　Ｐｏｗｅｒ　Ｓｎａｐ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ社、製品番号：Ｇ８３００）を用いて、アガロース電気泳動にて各超音波処理条件におけるゲノムＤＮＡの断片長を検証した。
　３．結果
　本発明のヒト細胞の定量方法における、ゲノムＤＮＡの断片化処理条件の検討結果を表１０及び図５Ａ、５Ｂに示した。表１０の断片長（ｂｐ）は、表９及び図５Ｂの電気泳動結果（ｂｐ）を参照した。断片化処理を実施しなかった比較例に比べ、断片化処理を実施した条件１～７ではシグナル値が上昇しており、ゲノムＤＮＡの断片長が短くなるほどその上昇効果は高かった。また、条件６と条件７を比較すると、処理時間のより長い条件７の方がシグナル値は高いことから、超音波処理によるゲノムＤＮＡの断片化がより均一に施されることで、より高感度に定量可能であることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　ゲノム断片化処理方法として酵素と超音波処理を併用した方法についての実施例を以下に示した。
［実施例６－１］
　酵素量の検討
　１．材料
（１）生体試料
　測定対象のヒト細胞として、ＨＥＫ２９３細胞を用いた。また、非ヒト動物試料としてマウス腎臓（ジャクソン・ラボラトリー・ジャパン社）を使用した。マウスはＣ５７ＢＬ／６Ｊ系統の８週齢オスを用いた。
（２）標的配列
　標的配列としてＡｌｕ配列（１）（配列番号１）を用いた。
〈Ａｌｕ配列（１）の塩基配列〉
　5’-GCAGGAGAATCGCTTGAACCCGGGAGGCGGAGGTTGCAGTGAG-3’（塩基部分は配列番号１）
　２．方法
（１）マウス腎臓及びヒト細胞の溶解処理
　マウス腎臓及びヒト細胞をそれぞれ調製し、ＤｉｒｅｃｔＰＣＲ　Ｌｙｓｉｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔａｉｌ）（Ｖｉａｇｅｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社、製品番号：１０２－Ｔ）及びプロテイナーゼＫ溶液（関東化学社、製品番号：３４０６０－９６）を用いて溶解処理を実施した。
（１－１）マウス腎臓の調製
ＤｉｒｅｃｔＰＣＲ　Ｌｙｓｉｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ　（Ｔａｉｌ）とプロテイナーゼＫ溶液は１００：１の比率で混合し、溶解反応試薬として調製した。マウス腎臓をチューブに秤量後、組織重量が２００ｍｇ／ｍＬとなるよう溶解反応試薬を添加し、よく懸濁した。
（１－２）ヒト細胞の調製
　凍結保存液中のＨＥＫ２９３細胞を流水にて融解し、チューブに２５０μＬ分注した。遠心し、上清を除去後、等量の１×ＰＢＳを添加し、ピペッティングにて細胞表面に残存した凍結保存液を洗浄した。再度遠心、上清を除去後、１×ＰＢＳを２０μＬ添加し、ＴＣ２０ＴＭ全自動セルカウンター（ＢＩＯ　ＲＡＤ社、製品番号：１４５０１０１Ｊ１）を用いて細胞数を計測した。計測結果より、全量に対し１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう、ＤｉｒｅｃｔＰＣＲ　Ｌｙｓｉｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔａｉｌ）を添加した。また、全量１／１００量のプロテイナーゼＫ溶液を添加し、よく懸濁した。
（１－３）溶解処理
　１，０００ｒｐｍにてチューブを振盪しながら、５５℃で１６時間反応させた。一旦取り出して懸濁後、１，０００ｒｐｍ、８５℃にて４５分間反応させ、プロテイナーゼＫを失活させた。
（２）酵素及び超音波併用によるゲノムＤＮＡ断片化処理
（２－１）サンプル調製
　ＲＮａｓｅ　Ｆｒｅｅ　Ｗａｔｅｒにて８倍希釈した溶解済みマウス腎臓にて、溶解処理したＨＥＫ２９３細胞溶液を段階希釈して、細胞数７．５×１０３、７．５×１０４、７．５×１０５ｃｅｌｌｓ／腎臓ｇ（最終的な細胞数が６×１０３、６×１０４、６×１０５ｃｅｌｌｓ／腎臓ｇ）となるよう調製した。
（２－２）酵素処理
　溶液全量１０μＬ中、終濃度が１×ＤＮａｓｅ　Ｉ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ及び、ＤＮａｓｅ　Ｉ（ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社、製品番号：Ｍ０３０３Ｓ）濃度が０．００１、０．００２５、０．００５、０．００７５、０．０１、０．０２５、０．０５、０．０７５、０．１Ｕ／ｗｅｌｌとなるように各酵素ミックスを調製した。９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、製品番号：７００７）に各酵素ミックス１０ｕＬ及び、（２－１）にて調製したヒト細胞・マウス腎臓混合サンプルを６０μＬ添加し、３７℃で３０分インキュベートした。インキュベート後、０．５Ｍ　ＥＤＴＡを各ウェルに５μＬずつ添加し、酵素反応を停止させた。
（２－３）超音波処理
　酵素処理後のプレート上のサンプルを超音波装置ＰＩＸＵＬ　Ｍｕｌｔｉ－Ｓａｍｐｌｅ　Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ（アクティブ・モティフ社）にセットし、超音波処理を行った。装置のパラメーターは、Ｐｕｌｓｅ　５０、ＰＲＦ　１．００、Ｂｕｒｓｔ　ｒａｔｅ　２０．００、処理時間は１２０分とした。
（３）捕捉プローブの調製
　担体であるＭｉｃｒｏＰｌｅｘＴＭ　Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ（Ｌｕｍｉｎｅｘ社、製品番号：ＬＣ１００２２－０１）に、核酸プローブＣＰ－Ａｌｕ配列（１）（配列番号２）を、３’末端のＮＨ２修飾を介して結合させることにより捕捉プローブを調製した。
〈ＣＰ－Ａｌｕ配列（１）の塩基配列〉
　5’-CGGGTTCAAGCGATTCTCCTGC-(NH2)-3’（塩基部分は配列番号２）
（４）捕捉プローブへの標的核酸の捕捉（１ｓｔ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ反応）
　上記（２）で断片化処理した各サンプル１０μＬに、１ｓｔ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ反応液を１５μＬ加えて計２５μＬとし、９５℃で２分間反応させた後、４７℃で１８時間反応させた。
（４－１）１ｓｔ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ反応液の組成
　上記（３）で担体へ固定した捕捉プローブ０．４μＬ（８００個）、
　５Ｍ　ＴＭＡＣ（テトラメチルアンモニウムクロリド）７．５μＬ、
　１０×ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ［５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４０ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、８．０％　Ｎ－ラウロイルサルコシンナトリウム］　３．７５μＬ、
　２０％　ＰＥＧ２００００（ポリエチレングリコール）　１．２５μＬ、
　ＲＮａｓｅ　Ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ　１．６μＬ、
　１ｐｍｏｌ／μＬアシストプローブ（ＡＰ－Ａｌｕ配列（１）（配列番号３））　０．５μＬ。
〈ＡＰ－Ａｌｕ配列（１）の塩基配列〉
5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACTCACTGCAACCTCCGCCTCC-3’（塩基部分は配列番号３）
（５）非標的配列ゲノム断片の洗浄
　１ｓｔ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ反応終了後の反応液を遠心し、上清を除去した。１×ＰＢＳ－ＴＰ（０．０２％　Ｔ）　［１×ＰＢＳ　［１３７ｍＭ　Ｓｏｄｉｕｍ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅ、８．１ｍＭ　Ｄｉｓｏｄｉｕｍ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、２．６８ｍＭ　Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅ、１．４７ｍＭ　Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　Ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎｐｈｏｓｐｈａｔｅ］、０．０２％　Ｔｗｅｅｎ２０、１．５　ｐｐｍ　ＰｒｏＣｌｉｎ３００］で１回洗浄した後、再度遠心し、上清を除去した。
（６）ＰＡＬＳＡＲ反応によるシグナル増幅
　上清除去後の各ウェルに対し、ＰＡＬＳＡＲ反応液を５０μＬ加え、４２℃で１時間反応させた。本実施例１に使用する自己凝集可能な一対のプローブ（シグナル増幅用プローブともいう）の配列は、５’末端がビオチンで標識された以下のＨＣＰ－１及びＨＣＰ－２である。
　〈ＨＣＰ－１の塩基配列〉
　5’-(Biotin)-CAACAATCAGGACGATACCGATGAAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’（塩基部分は配列番号１０）
　〈ＨＣＰ－２の塩基配列〉
　5’-(Biotin)-GTCCTGATTGTTGCTTCATCGGTATCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’（塩基部分は配列番号１１）
（６－１）ＰＡＬＳＡＲ反応液の組成
　Ｎｕｃｌｅａｓｅ－Ｆｒｅｅ　Ｗａｔｅｒ　２２．４３μＬ、
　２０％　ＰＥＧ２００００（ポリエチレングリコール）１．２５μＬ、
　５Ｍ　ＴＭＡＣ　１５．０μＬ、
　１０×ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ［５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４０ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、８％　Ｎ－ラウロイルサルコシンナトリウム］　８．０μＬ、
　２０ｐｍｏｌ／μＬ　ＨＣＰ－１　１．７５μＬ、
　２０ｐｍｏｌ／μＬ　ＨＣＰ－２　１．５８μＬ
（７）蛍光検出
　ＰＡＬＳＡＲ反応終了後の反応液を、１×ＰＢＳ－ＴＰ（０．０２％　Ｔ）［１×ＰＢＳ［１３７ｍＭ　Ｓｏｄｉｕｍ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅ、８．１ｍＭ　Ｄｉｓｏｄｉｕｍ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、２．６８ｍＭ　Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅ、１．４７ｍＭ　Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　Ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎｐｈｏｓｐｈａｔｅ］、０．０２％　Ｔｗｅｅｎ２０、１．５ｐｐｍ　ＰｒｏＣｌｉｎ３００］で１回洗浄した。
　その後、検出試薬［ＳＡ－ＰＥ（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－Ｒ－Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ、Ｐｒｏｚｙｍｅ社製）　２．５μｇ／ｍＬ］を５０μＬ加えて２５℃の遮光下で３０分静置した後、１×ＰＢＳ－ＴＰ（０．０２％　Ｔ）で２回洗浄した。その後、１×ＰＢＳ－ＴＰ（０．０２％　Ｔ）を７５μＬ加えて、Ｌｕｍｉｎｅｘ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｕｍｉｎｅｘ社製）でビーズ及びＳＡ－ＰＥ複合体からの蛍光を測定し、ヒト細胞ゲノムのシグナルを検出した。
　３．結果
　酵素処理と超音波処理を併用したゲノム断片化方法について、酵素量の検討結果を図６Ａ及び図６Ｂに示した。
　図６Ａより、酵素量に応じてシグナルに変化がみられた。最もシグナル値の高い酵素量は０．００７５Ｕ／ｗｅｌｌであった。また、断片化処理後のサンプルを電気泳動した図６Ｂより、各サンプルの断片長は、０．００１～０．０１Ｕ／ｗｅｌｌの酵素量で２００ｂｐ前後、０．０２５～０．１Ｕ／ｗｅｌｌの酵素量で１００ｂｐ前後、あるいは泳動上目視できない結果となった。これより、酵素を使用した断片化を行った場合においても、断片鎖長を２００ｂｐ前後となるよう酵素量を調整することで、より良好なシグナルを検出できることがわかった。
［実施例６－２］
　マウス腎マトリクスにおける酵素及び超音波併用ゲノム断片化処理によるヒト細胞定量の検討
　　１．材料
（１）生体試料
　測定対象のヒト細胞として、ＨＥＫ２９３細胞を用いた。また、非ヒト動物試料としてマウス腎臓（ジャクソン・ラボラトリー・ジャパン社）を使用した。マウスはＣ５７ＢＬ／６Ｊ系統の８週齢オスを用いた。
（２）標的配列
　標的配列としてＡｌｕ配列（１）（配列番号１）を用いた。
　２．方法
（１）マウス腎臓及びヒト細胞の溶解処理
　マウス腎臓及びヒト細胞をそれぞれ調製し、ＤｉｒｅｃｔＰＣＲ　Ｌｙｓｉｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔａｉｌ）（Ｖｉａｇｅｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社、製品番号：１０２－Ｔ）及びプロテイナーゼＫ溶液（関東化学社、製品番号：３４０６０－９６）を用いて溶解処理を実施した。
（１－１）マウス腎臓の調製
ＤｉｒｅｃｔＰＣＲ　Ｌｙｓｉｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ　（Ｔａｉｌ）とプロテイナーゼＫ溶液は１００：１の比率で混合し、溶解反応試薬として調製した。マウス腎臓をチューブに秤量後、組織重量が２００ｍｇ／ｍＬとなるよう溶解反応試薬を添加し、よく懸濁した。
（１－２）ヒト細胞の調製
　凍結保存液中のＨＥＫ２９３細胞を流水にて融解し、チューブに２５０μＬ分注した。遠心し、上清を除去後、等量の１×ＰＢＳを添加し、ピペッティングにて細胞表面に残存した凍結保存液を洗浄した。再度遠心、上清を除去後、１×ＰＢＳを２０μＬ添加し、ＴＣ２０ＴＭ全自動セルカウンター（ＢＩＯ　ＲＡＤ社、製品番号：１４５０１０１Ｊ１）を用いて細胞数を計測した。計測結果より、全量に対し１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう、ＤｉｒｅｃｔＰＣＲ　Ｌｙｓｉｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔａｉｌ）を添加した。また、全量１／１００量のプロテイナーゼＫ溶液を添加し、よく懸濁した。
（１－３）溶解処理
　１，０００ｒｐｍにてチューブを振盪しながら、５５℃で１６時間反応させた。一旦取り出して懸濁後、１，０００ｒｐｍ、８５℃にて４５分間反応させ、プロテイナーゼＫを失活させた。
（２）酵素及び超音波併用によるゲノムＤＮＡ断片化処理
（２－１）サンプル調製
　ＲＮａｓｅ　Ｆｒｅｅ　Ｗａｔｅｒにて８倍希釈した溶解済みマウス腎臓にて、溶解処理したＨＥＫ２９３細胞溶液を段階希釈して、細胞数７．５×１０３、１．５×１０４、３．７５×１０４、７．５×１０４、１．５×１０５、３．７５×１０５、７．５×１０５ｃｅｌｌｓ／腎臓ｇ（最終的な細胞数が６×１０３、１．２×１０３、３×１０４、６×１０４、１．２×１０５、３×１０５、６×１０５ｃｅｌｌｓ／腎臓ｇ）となるよう検量線サンプルを調製した。ＱＣサンプルは、細胞数７．５×１０３、１.５×１０４、７．５×１０４、３．７５×１０５、７．５×１０５ｃｅｌｌｓ／腎臓ｇ（最終的な細胞数が６×１０３、１.２×１０３、６×１０４、３×１０５、６×１０５ｃｅｌｌｓ／腎臓ｇ）となるよう調製し、各サンプル名をＬＬＯＱ、ＬＱＣ、ＭＱＣ、ＨＱＣ、ＵＬＯＱとした。ＱＣサンプルは３系列調製し、１系列ごとに段階希釈した。
（２－２）酵素処理
　溶液全量１０μＬ中、終濃度が１×ＤＮａｓｅ　Ｉ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ及び、ＤＮａｓｅ　Ｉ濃度が０．００７５Ｕ／ｗｅｌｌとなるように酵素ミックスを調製した。９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、製品番号：７００７）に酵素ミックス１０μＬ、（２－１）にて調製したヒト細胞・マウス腎臓混合サンプルを６０μＬ添加し、３７℃で３０分インキュベートした。インキュベート後、０．５Ｍ　ＥＤＴＡを各ウェルに５μＬずつ添加し、酵素反応を停止させた。
（２－３）超音波処理
　酵素処理後のプレート上のサンプルを超音波装置ＰＩＸＵＬ　Ｍｕｌｔｉ－Ｓａｍｐｌｅ　Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ（アクティブ・モティフ社）にセットし、超音波処理を行った。装置のパラメーターは、Ｐｕｌｓｅ　５０、ＰＲＦ　１．００、Ｂｕｒｓｔ　ｒａｔｅ　２０．００、処理時間は１２０分とした。
（３）捕捉プローブの調製
　担体であるＭｉｃｒｏＰｌｅｘＴＭ　Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ（Ｌｕｍｉｎｅｘ社、製品番号：ＬＣ１００２２－０１）に、核酸プローブＣＰ－Ａｌｕ配列（１）（配列番号２）を、３’末端のＮＨ２修飾を介して結合させることにより捕捉プローブを調製した。
（４）捕捉プローブへの標的核酸の捕捉（１ｓｔ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ反応）
　上記（２）で断片化処理した各サンプル１０μＬに、１ｓｔ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ反応液を１５μＬ加えて計２５μＬとし、９５℃で２分間反応させた後、４７℃で１８時間反応させた。
（４－１）１ｓｔ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ反応液の組成
　上記（３）で担体へ固定した捕捉プローブ０．４μＬ（８００個）、
　５Ｍ　ＴＭＡＣ（テトラメチルアンモニウムクロリド）７．５μＬ、
　１０×ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ［５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４０ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、８．０％　Ｎ－ラウロイルサルコシンナトリウム］　３．７５μＬ、
　２０％　ＰＥＧ２００００（ポリエチレングリコール）　１．２５μＬ、
　ＲＮａｓｅ　Ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ　１．６μＬ、
　１ｐｍｏｌ／μＬアシストプローブ（ＡＰ－Ａｌｕ配列（１）（配列番号３））　０．５μＬ。
（５）非標的配列ゲノム断片の洗浄
　１ｓｔ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ反応終了後の反応液を遠心し、上清を除去した。１×ＰＢＳ－ＴＰ（０．０２％　Ｔ）　［１×ＰＢＳ　［１３７ｍＭ　Ｓｏｄｉｕｍ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅ、８．１ｍＭ　Ｄｉｓｏｄｉｕｍ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、２．６８ｍＭ　Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅ、１．４７ｍＭ　Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　Ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎｐｈｏｓｐｈａｔｅ］、０．０２％　Ｔｗｅｅｎ２０、１．５　ｐｐｍ　ＰｒｏＣｌｉｎ３００］で１回洗浄した後、再度遠心し、上清を除去した。
（６）ＰＡＬＳＡＲ反応によるシグナル増幅
　上清除去後の各ウェルに対し、ＰＡＬＳＡＲ反応液を５０μＬ加え、４２℃で１時間反応させた。自己凝集可能な一対のプローブ（シグナル増幅用プローブともいう）の配列は、５’末端がビオチンで標識された以下のＨＣＰ－１及びＨＣＰ－２である。
　〈ＨＣＰ－１の塩基配列〉
　5’-(Biotin)-CAACAATCAGGACGATACCGATGAAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’（塩基部分は配列番号１０）
　〈ＨＣＰ－２の塩基配列〉
　5’-(Biotin)-GTCCTGATTGTTGCTTCATCGGTATCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’（塩基部分は配列番号１１）
（６－１）ＰＡＬＳＡＲ反応液の組成
　Ｎｕｃｌｅａｓｅ－Ｆｒｅｅ　Ｗａｔｅｒ　２２．６μＬ、
　２０％　ＰＥＧ２００００（ポリエチレングリコール）１．２５μＬ、
　５Ｍ　ＴＭＡＣ　１５．０μＬ、
　１０×ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ［５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４０ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、８％　Ｎ－ラウロイルサルコシンナトリウム］　８．０μＬ、
　２０ｐｍｏｌ／μＬ　ＨＣＰ－１　１．７５μＬ、
　２０ｐｍｏｌ／μＬ　ＨＣＰ－２　１．４μＬ
（７）蛍光検出
　ＰＡＬＳＡＲ反応終了後の反応液を、１×ＰＢＳ－ＴＰ（０．０２％　Ｔ）［１×ＰＢＳ［１３７ｍＭ　Ｓｏｄｉｕｍ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅ、８．１ｍＭ　Ｄｉｓｏｄｉｕｍ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、２．６８ｍＭ　Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅ、１．４７ｍＭ　Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　Ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎｐｈｏｓｐｈａｔｅ］、０．０２％　Ｔｗｅｅｎ２０、１．５ｐｐｍ　ＰｒｏＣｌｉｎ３００］で１回洗浄した。
　その後、検出試薬［ＳＡ－ＰＥ（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－Ｒ－Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ、Ｐｒｏｚｙｍｅ社製）　２．５μｇ／ｍＬ］を５０μＬ加えて２５℃の遮光下で３０分静置した後、１×ＰＢＳ－ＴＰ（０．０２％　Ｔ）で２回洗浄した。その後、１×ＰＢＳ－ＴＰ（０．０２％　Ｔ）を７５μＬ加えて、Ｌｕｍｉｎｅｘ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｕｍｉｎｅｘ社製）でビーズ及びＳＡ－ＰＥ複合体からの蛍光を測定し、ヒト細胞ゲノムのシグナルを検出した。
　３．結果
　マウス腎マトリクスにおける酵素及び超音波併用ゲノム断片化処理によるヒト細胞の定量結果を図７、表１１及び表１２に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　図７より、試料中のヒト細胞数に依存したシグナルが得られた。ヒト細胞数とシグナルの相関係数は、ｒ＝０．９９９７であり、相関性の高い検量線を作成することができた。また、作成した検量線の％ＲＥは－６．３～５．０％と、ガイドライン基準内の値を示した。さらに、ＱＣサンプルの％ＣＶ、％ＲＥ及び％ＴＥも基準内であった。
　以上より、本発明における測定法は、断片化方法が異なっても、ガイドライン基準を満たす堅牢性の高い定量法であることが示唆された。
　本発明のヒト細胞の定量方法を用いることにより、ヒト細胞を主成分とする再生医療等製品開発の、探索段階における薬物動態・薬力学（Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ／Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ（ＰＫ／ＰＤ））スクリーニング試験、非臨床段階における安全性試験、薬理試験及び薬物動態試験において、薬物が投与された非ヒト動物生体試料中の薬物濃度を、ゲノム抽出による回収率の補正を実施することなく、ヒト細胞数を直接、正確に測定することが出来る。
［配列一覧］
　以下の表に、本明細書中に開示したポリヌクレオチド配列を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　表中、「５」は塩基が５－メチルシトシンであることを意味し、（Ｌ）はデオキシリボースの２’及び４’の炭素が架橋で修飾されていることを意味する。また、（ＮＨ２）はポリヌクレオチドの５’末端又は３’末端がアミノ基で修飾されていることを意味し、（Ｂｉｏｔｉｎ）はポリヌクレオチドの５’末端がビオチン標識されていることを意味する。

Claims (9)

  1. 　ヒト細胞を測定する方法であって、
    　非ヒト動物細胞に由来する非ヒト動物成分及びヒト細胞を含む試料を準備する準備工程と、
    　前記試料中の細胞膜を溶解する溶解工程と、
    　前記ヒト細胞に特異的な核酸配列に対してハイブリダイゼーションアッセイを行うアッセイ工程と、
    を含む、ヒト細胞を測定する方法。
  2. 　前記ヒト細胞に特異的な核酸配列がヒトに特異的な反復配列である、請求項１に記載のヒト細胞を測定する方法。
  3. 　前記ヒトに特異的な反復配列が、Ａｌｕ配列及び長鎖散在反復配列－１（ＬＩＮＥ－１）からなる群から選択される少なくとも１種を含む、請求項２に記載のヒト細胞を測定する方法。
  4. 　前記ハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いる核酸プローブが非ヒト動物のゲノムＤＮＡとハイブリダイズしない、請求項１又は２に記載のヒト細胞を測定する方法。
  5. 　前記溶解工程において、前記非ヒト動物成分及び前記ヒト細胞の細胞膜を、物理的方法、化学的方法、酵素的方法及びこれらの組合せからなる群から選択されるいずれかの方法で溶解する、請求項１又は２に記載のヒト細胞を測定する方法。
  6. 　前記ハイブリダイゼーションアッセイがＰＡＬＳＡＲ法又はデュアルハイブリダイゼーション法である、請求項１又は２に記載のヒト細胞を測定する方法。
  7. 　前記溶解工程の後に、さらに、前記非ヒト動物細胞及び前記ヒト細胞に含まれるゲノムＤＮＡを、物理的方法、化学的方法、酵素的方法及びこれらの組合せからなる群から選択されるいずれかの方法で断片化する断片化工程を含む、請求項１又は２に記載のヒト細胞を測定する方法。
  8. 　前記ゲノムＤＮＡを断片化して得られるゲノムＤＮＡの断片長が５０～６００ｂｐである、請求項７に記載のヒト細胞を測定する方法。
  9. 　前記ヒト細胞の数を計測するための、請求項１又は２に記載のヒト細胞を測定する方法。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018101375A1 (ja) * 2016-11-30 2018-06-07 国立大学法人秋田大学 ヒトゲノムｄｎａ検出方法
WO2019240073A1 (ja) * 2018-06-11 2019-12-19 武田薬品工業株式会社 定量ｐｃｒプローブ

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018101375A1 (ja) * 2016-11-30 2018-06-07 国立大学法人秋田大学 ヒトゲノムｄｎａ検出方法
WO2019240073A1 (ja) * 2018-06-11 2019-12-19 武田薬品工業株式会社 定量ｐｃｒプローブ

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