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WO2024096123A1 - 遺伝子が改変された微生物およびその生産方法 - Google Patents

遺伝子が改変された微生物およびその生産方法 Download PDF

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WO2024096123A1
WO2024096123A1 PCT/JP2023/039717 JP2023039717W WO2024096123A1 WO 2024096123 A1 WO2024096123 A1 WO 2024096123A1 JP 2023039717 W JP2023039717 W JP 2023039717W WO 2024096123 A1 WO2024096123 A1 WO 2024096123A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gene
genes
microorganism
modification
group
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2023/039717
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English (en)
French (fr)
Inventor
南部 由美子 西田
大雅 田宮
亮 奥村
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bio Palette Co Ltd
Original Assignee
Bio Palette Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bio Palette Co Ltd filed Critical Bio Palette Co Ltd
Priority to JP2024554605A priority Critical patent/JPWO2024096123A1/ja
Publication of WO2024096123A1 publication Critical patent/WO2024096123A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes

Definitions

  • the present disclosure relates to microorganisms having modifications that do not substantially restore the normal function of the proteins encoded by the genes and/or nucleic acids, and methods for producing such microorganisms.
  • the present disclosure provides: (Item X1) A microorganism, in which at least one gene has been modified such that the modification does not substantially restore a function normally possessed by the protein encoded by said gene.
  • (Item X2) The microorganism described in the above item, wherein the gene is selected from the group consisting of an essential gene, a pharmacological effect-related gene, a morphology-related gene, and a colonization-related gene.
  • the gene is an essential gene and the modification is such that, when an activity normally possessed by a protein encoded by the essential gene is reduced or deleted, the microorganism does not substantially spread in an environment or a subject.
  • the amino acid synthesis enzyme is selected from the group consisting of genes encoding lysine biosynthetic enzymes: dapA, cysK, cysM, pabA, pabB, pabC, glyA, proB, proA, leuB, alr, dadX, serC, argH, hisD, ilvA, leuB, lysA, metB, pheA, proC, thrC, trpC, and tyrA.
  • nucleic acid synthetase is selected from the group consisting of a gene encoding thymidylate synthase (thyA), purK, purN, purT, pyrB, pyrC, pyrD, and pyrE.
  • thyA thymidylate synthase
  • the vitamin synthesis enzyme is selected from the group consisting of thiC, thiE, thiF, thiS, thiG, thiH, ribB, ribC, ribD, nadA, nadB, panC, pdxB, bioH, and metE.
  • the microorganism according to any one of the preceding items, wherein the modification comprises a point mutation in the gene.
  • the modification includes a mutation that generates a stop codon.
  • the modification comprises at least two mutations in the at least one gene.
  • the modification includes at least one mutation in each of at least two types of genes.
  • a method for producing a microorganism having at least one genetic modification comprising the steps of: modifying said at least one gene in said microorganism by converting one or more nucleotides of a target nucleic acid sequence of said gene into another nucleotide or deleting said nucleotide or by inserting one or more nucleotides into said target nucleic acid sequence of said gene; wherein the modification does not substantially restore a function normally possessed by a protein encoded by the gene.
  • the gene is selected from the group consisting of an essential gene, a pharmacological effect-related gene, a morphology-related gene, and a fixation-related gene.
  • amino acid synthesis enzyme is selected from the group consisting of genes encoding lysine biosynthetic enzymes: dapA, cysK, cysM, pabA, pabB, pabC, glyA, proB, proA, leuB, alr, dadX, serC, argH, hisD, ilvA, leuB, lysA, metB, pheA, proC, thrC, trpC, and tyrA.
  • nucleic acid synthetase is selected from the group consisting of a gene encoding thymidylate synthase (thyA), purK, purN, purT, pyrB, pyrC, pyrD, and pyrE.
  • the vitamin synthesis enzyme is selected from the group consisting of thiC, thiE, thiF, thiS, thiG, thiH, ribB, ribC, ribD, nadA, nadB, panC, pdxB, bioH, and metE.
  • the present disclosure makes it possible to modify microorganisms in such a way that their normal functions are not substantially restored, and the modified microorganisms cannot grow unless an external factor that restores their normal functions (which could be, for example, nutrients (essential nutrients) or certain drugs) is provided, making it possible to control and manage the survival and growth of the microorganisms depending on the presence or absence of the external factor.
  • an external factor that restores their normal functions which could be, for example, nutrients (essential nutrients) or certain drugs
  • FIG. 1 is a graph showing the results of non-growth tests of a thyA gene knockout strain, a dapA gene knockout strain, and a double knockout strain of thyA and dapA genes in one embodiment of the present disclosure.
  • microorganisms refers to minute living organisms, including prokaryotes such as bacteria and actinomycetes, eukaryotes such as yeast and mold, lower algae, fungi, viruses, and even individual, separate cells of multicellular organisms such as animals and plants. Microorganisms also include natural microorganisms, as well as those cultured and artificially propagated, mutated microorganisms, and microorganisms artificially modified by transformation or other techniques.
  • modification of a gene means that a nucleotide (e.g., dC) on a DNA strand is converted to another nucleotide (e.g., dT, dA, or dG) or deleted, or that a nucleotide or nucleotide sequence is inserted or added between certain nucleotides on a DNA strand.
  • “modification” includes the substitution or deletion of one or more nucleotides at a targeted site of double-stranded DNA, or the insertion or addition of one or more nucleotides at a targeted site of double-stranded DNA.
  • the double-stranded DNA to be modified is not particularly limited, but is preferably genomic DNA.
  • the "targeted site" of double-stranded DNA means all or a part of the “target nucleotide sequence” that the nucleic acid sequence recognition module specifically recognizes and binds to, or the vicinity of the target nucleotide sequence (either one or both of the 5' upstream and 3' downstream), and the range can be appropriately adjusted between one base and several hundred bases in length depending on the purpose.
  • the term "gene” is interpreted in the broadest sense to mean a character string of nucleic acid or a sequence of a substance that carries it (e.g., nucleotides such as DNA or RNA), and preferably a sequence or a substance that contains a sequence that exerts some function.
  • it also includes adjacent transcriptional regulatory regions such as promoters and enhancers that control the timing and amount of transcription of the transcript as a transcription factor binding site, and adjacent transcriptional regulatory regions such as promoters and enhancers that control the timing and amount of transcription of the transcript as a transcription factor binding site.
  • essential gene refers to a gene or nucleic acid sequence, or a part thereof, whose functional expression is necessary to maintain viability under the target conditions.
  • essential genes can include genes encoding amino acid synthetases, nucleic acid synthetases, and vitamin synthases.
  • Exemplary essential genes include the gene encoding thymidylate synthase (thyA), 5-(carboxyamino)imidazole ribonucleotide synthase (purK), phosphoribosylglycinamide formyltransferase 1 (purN), phosphoribosylglycinamide formyltransferase 2 (purT), aspartate carbamoyltransferase catalytic subunit (as ...
  • thyA thymidylate synthase
  • purK 5-(carboxyamino)imidazole ribonucleotide synthase
  • purN phosphoribosylglycinamide formyltransferase 1
  • purT phosphoribosylglycinamide formyltransferase 2
  • aspartate carbamoyltransferase catalytic subunit as ...
  • nucleic acid synthesis enzymes such as dihydroorotase (pyrC), dihydroorotate dehydrogenase, type 2 (pyrD), and orotate phosphoribosyltransferase (pyrE), as well as the structural genes for thiamine biosynthesis enzymes (phosphomethylpyrimidine synthase: thiC, thiamine phosphate synthase: thiE, sulfur carrier protein: thiS, adenylyltransferase: thiF, sulfur carrier protein: thiS, 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate:thiol sulfurtransferase:thiG, 2-iminoacetate synthase:thiH), 3,4-dihydroxy-2-butanone-4-phosphatesynthase:ribB, riboflavin synthase:ribC, fused diaminohydroxyphosphoribosylaminopyrimidine deaminase/5-amino-6-(
  • vitamin synthesis enzymes such as metE, and amino acid synthesis enzymes involved in the synthesis of one or more amino acids selected from alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamic acid, glutamine, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine, and valine (e.g., genes encoding lysine biosynthetic enzymes (dapA), cysteine synthase (cysteine synthase A:cysK, cysteine synthase B:cysM), aminodeoxychorismate synthase (aminodeoxychorismate synthase subunit 2:pabA, aminodeoxychorismate synthase subunit 3:pabA, aminodeoxychorismate synthase sub
  • the term "medicinal effect-related gene” refers to a gene or nucleic acid sequence, or a part thereof, that can provide some medical or biological benefit to a provided organism (e.g., a human), and examples thereof include Type 1 fimbrin D-mannose specific adhesin (fimH) and Major curlin subunit gene A (csgA).
  • Medicinal effect-related genes include both genes that exert some medicinal effect when knocked out, and genes that exert medicinal effect when expression is improved.
  • Medicinal effect-related genes also include genes or nucleic acid sequences, or parts thereof, that can provide a microorganism or its biological component itself, or a composition containing these, that has functions such as acting on harmful microorganisms in a subject, forming a beneficial microbial flora, maintaining or improving health, and/or activating immunity, such as probiotics, which is a composition containing a biological component (e.g., a whole microorganism or a part thereof).
  • a biological component e.g., a whole microorganism or a part thereof.
  • morphology-related gene refers to a gene or nucleic acid sequence, or a part thereof, that can provide an element (e.g., a protein, a metabolite, etc.) that directly or indirectly determines the morphology of a microorganism, such as bacterial actin-like cytoskeleton protein (cell shape-determining protein: mreB).
  • element e.g., a protein, a metabolite, etc.
  • mreB cell shape-determining protein
  • colonization-related gene refers to a gene or nucleic acid sequence, or a part thereof, that codes for a protein that constitutes a mechanism for adhesion, adhesion, and/or attachment of a microorganism to an organ or cell of a host (e.g., a human), or a gene or nucleic acid sequence, or a part thereof, that codes for a factor that controls the expression of such a gene, such as a DNA-binding transcriptional activator (flhD), a DNA-binding iron uptake regulator (fur), a DNA-binding glucitol operon transcriptional repressor (glucitol operon transcriptional repressor), or a part thereof.
  • flhD DNA-binding transcriptional activator
  • fur DNA-binding iron uptake regulator
  • glucitol operon transcriptional repressor glucitol operon transcriptional repressor
  • sor myristoyl-acyl carrier protein (acp)-dependent acyltransferase (lpxM), DNA-binding transcriptional activator (ntrC), DNA-binding transcriptional repressor (cytR), DNA-binding mal regulon transcriptional repressor (malI), DNA-binding transcriptional dual regulator (DNA -binding transcriptional dual regulator: nagC), DNA-binding transcriptional activator (DNA-binding transcriptional activator: flhC), high-affinity gluconate transporter (High-affinity gluconate transporter: gntT), DNA-binding fructoselysine utilization operon transcriptional repressor (DNA-binding fructoselysine utilization operon transcriptional repressor: frlR), DNA-binding transcriptional repressor (DNA-binding transcriptional repressor: kdgR), DNA Examples of such regulators include DNA-binding transcriptional regulator (oxyR), o
  • function normally possessed by a protein or “activity normally possessed by a protein” refers to a function or activity that a protein can exhibit in an environment in which it normally exists.
  • function normally possessed by a protein is not substantially restored” refers to a situation in which a gene is modified such that the function and/or activity of the protein encoded by the gene is reduced or lost, and the function and/or activity does not subsequently return to the original function and/or activity compared to the protein encoded by the gene that has not been modified.
  • the term “reduced” or “lacking” a protein's function or activity means that, as a result of gene modification, the function and/or activity of the protein encoded by the gene is at least substantially reduced when compared to the function and/or activity of the original protein.
  • the term “reduced” or “lacking” a protein's function or activity includes cases where the function and/or activity is at least about 10% lower, at least about 25% lower, at least about 50% lower, at least about 75% lower, and/or at least about 90% lower than that of the original protein.
  • transmission refers to the movement of the microorganism from a first individual and/or cell to a second individual and/or cell through direct contact or indirectly through air, water, food, drink, objects, etc. Transmission also includes cases involving mobile genetic elements such as plasmids, transposons, and bacteriophages.
  • a microorganism in which at least one gene in the microorganism has been modified such that the function normally possessed by the protein encoded by the gene is not substantially restored.
  • the microorganism of the present disclosure is useful as a technology for preventing the diffusion of a bacterial therapeutic preparation into the environment.
  • the modified microorganism By modifying a microorganism in such a way that the normal function is not substantially restored, the modified microorganism will not have the normal function unless an external factor that restores the normal function (which could be, for example, nutrition (essential nutrients) or a certain type of drug) is provided, so the normal function (which could be, for example, survival, maintenance in a special state, etc.) can be controlled and managed depending on the presence or absence of the external factor, and this can be applied, for example, to environmental control.
  • an external factor that restores the normal function which could be, for example, nutrition (essential nutrients) or a certain type of drug
  • the normal function which could be, for example, survival, maintenance in a special state, etc.
  • auxotroph a microorganism known as an auxotroph. If the auxotrophic microorganism is to survive or grow, the amino acid required for growth must be provided from an external source.
  • the creation of auxotrophic microorganisms is well known, particularly for E. coli.
  • a microorganism when a microorganism is introduced into a target environment, it is desirable to be able to control the introduced microorganism after introduction into the target environment, for example, it is desirable that the introduced microorganism does not spread or spread to environments other than the target environment.
  • Such control can be achieved, for example, by imparting auxotrophy to the microorganism introduced into the target environment.
  • auxotrophy even when auxotrophy is imparted to a microorganism, it is also known that the auxotrophy disappears as the microorganism continues to grow, and this is thought to be due to the occurrence of modifications in the gene or protein modified to impart the auxotrophy that restore the function of the gene or protein.
  • a microorganism in which at least one gene has been modified, and the function normally possessed by the protein encoded by the modified gene is not substantially restored.
  • genes include, but are not limited to, essential genes, drug efficacy-related genes, morphology-related genes, and colonization-related genes.
  • the essential gene may be a gene or nucleic acid sequence, or a portion thereof, that will prevent the microorganism from substantially spreading in the environment or subject if the activity normally possessed by the protein encoded by the essential gene is reduced or eliminated, and examples of the essential gene include, but are not limited to, genes encoding amino acid synthetases, nucleic acid synthetases, and vitamin synthases.
  • the medicinal effect-related gene may be a gene or nucleic acid sequence, or a portion thereof, that can provide some medical or biological benefit to a provided organism (e.g., a human), such as, but not limited to, Type 1 fimbrin D-mannose specific adhesin (fimH) and Majorcurlin subunit gene A (csgA).
  • the medicinal effect-related gene also includes a gene or nucleic acid sequence, or a portion thereof, that can provide a microorganism or its biological component itself, or a composition containing the same, such as a probiotic, that has a function of acting on harmful microorganisms in a subject, forming a beneficial microbial flora, maintaining or improving health, and/or activating immunity.
  • the morphology-related gene may be a gene or nucleic acid sequence, or a part thereof, that can provide an element (e.g., a protein, a metabolite, etc.) that directly or indirectly determines the morphology of a microorganism, such as, but not limited to, a bacterial actin-like cytoskeleton protein (cell shape-determining protein: mreB).
  • an element e.g., a protein, a metabolite, etc.
  • mreB cell shape-determining protein
  • examples of colonization-related genes include genes or nucleic acid sequences, or parts thereof, that code for proteins that constitute mechanisms for adhesion, adhesion, and/or attachment of microorganisms to organs or cells of a host (e.g., human), or genes or nucleic acid sequences, or parts thereof, that code for factors that control the expression of such genes, such as DNA-binding transcriptional activator (flhD), DNA-binding iron uptake regulator (Ferric uptake regulator (fur), DNA-binding glucitol operon transcriptional repressor (g ...
  • ssor srlR
  • myristoyl-acyl carrier protein acp-dependent acyltransferase
  • DNA-binding transcriptional activator ntrC
  • DNA-binding transcriptional repressor cytR
  • DNA-binding mal regulon transcriptional repressor malI
  • DNA-binding transcriptional dual regulator DNA-bin ding transcriptional dual regulator (nagC)
  • DNA-binding transcriptional activator flhC
  • high-affinity gluconate transporter gntT
  • DNA-binding fructoselysine utilization operon transcriptional repressor frlR
  • DNA-binding transcriptional repressor kdgR
  • DNA-binding transcriptional regulator examples include, but are not limited to, DNA-binding transcriptional regulator (oxyR), osmolarity sensor protein (envZ), flagellar filament structural protein (fliC), tagatose 6-phosphate kinase (gatZ
  • the amino acid synthesis enzyme may include an enzyme involved in the synthesis of one or more amino acids selected from alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamic acid, glutamine, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine, and valine.
  • amino acids selected from alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamic acid, glutamine, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine, and valine.
  • Exemplary amino acid synthesis enzymes include genes encoding lysine biosynthetic enzymes (dapA), cysteine synthase (cysteine synthase A: cysK, cysteine synthase B: cysM), aminodeoxychorismate synthase (aminodeoxychorismate synthase subunit 2: pabA, aminodeoxychorismate synthase subunit 1: pabB), aminodeoxychorismate lyase (aminodeoxychorismate lyase: pabC), serine hydroxymethyltransferase (serine hydroxymethyltransferase: glyA), and glutamate synthase (glyA).
  • glutamate 5-kinase proB
  • glutamate-5-semialdehyde dehydrogenase proA
  • 3-isopropylmalate dehydrogenase leuB
  • alanine racemase 1 alr, alanine racemase 2 (dadX)
  • phosphoserine/phosphohydroxythreonine aminotransferase serC
  • arginine Argininosuccinate lyase argH
  • histidinol dehydrogenase hisD
  • threonine deaminase ilvA
  • diaminopimelate decarboxylase lysA
  • O-succinylhomoserine(thiol)-lyase metalB
  • fused chorismate mutase/prephenate dehydratase FCH
  • the nucleic acid synthetase may be an enzyme involved in the synthesis of any nucleic acid. In one embodiment of the present disclosure, such a nucleic acid synthetase may be modified to produce a microorganism that is auxotrophic for the nucleic acid that is involved in the synthesis of the nucleic acid synthetase.
  • the nucleic acid synthetase may be, for example, a gene encoding thymidylate synthase (thyA), 5-(carboxyamino)imidazole ribonucleotide synthase (purK), phosphoribosylglycinamide formyltransferase 1 (purN), phosphoribosylglycinamide formyltransferase 2 (purN), or a gene encoding thymidylate synthase (thyA).
  • thyA thymidylate synthase
  • purK 5-(carboxyamino)imidazole ribonucleotide synthase
  • purN phosphoribosylglycinamide formyltransferase 1
  • purN phosphoribosylglycinamide formyltransferase 2
  • thyA a gene encoding thymidylate syntha
  • purT ormyltransferase 2
  • purT aspartate carbamoyltransferase catalytic subunit
  • pyrC dihydroorotase
  • pyrD dihydroorotate dehydrogenase
  • orotate phosphoribosyltransferase pyrE
  • the vitamin synthesis enzyme can be, for example, an enzyme involved in the synthesis of one or more vitamins selected from vitamin A group, vitamin B group, vitamin C group, vitamin D group, vitamin E group, and vitamin K group.
  • a vitamin synthesis enzyme can be modified to produce a microorganism that is auxotrophic for a vitamin whose synthesis is involved in the vitamin synthesis enzyme.
  • the vitamin synthesis enzyme can be, for example, a structural gene for a thiamine biosynthetic enzyme (phosphomethylpyrimidine synthase: thiC, thiamine phosphate synthase: thiE, sulfur carrier protein: thiS, adenylyltransferase: thiF, sulfur carrier protein thiS: thiG, 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate: thi ol sulfurtransferase: thiG, 2-iminoacetate synthase: thiH), 3,4-dihydroxy-2-butanone-4-phosphate synthase (ribB), riboflavin synthase (ribC), diaminohydroxyphosphoribosylaminopyrimidine deaminase/5-amino-6-(5-phosphoribosylamino)uracil reductase (fu sed diaminohydroxyphosphoribosylaminopyrimidine deaminase/5
  • the modification of at least one gene in the microorganism of the present disclosure can be achieved by standard molecular biology techniques.
  • the modification can include a point mutation in the gene, and a method for site-specifically and precisely modifying a target double-stranded polynucleotide can be, for example, a method of contacting a target double-stranded polynucleotide with a Cas protein and a guide RNA, or a method of contacting a target double-stranded polynucleotide with a complex of a Cas protein and a nucleic acid base conversion enzyme and a guide RNA.
  • a complex is formed between the Cas9 protein and the guide RNA and binds to the target double-stranded polynucleotide.
  • the Cas9 protein modifies the base sequence in the target polynucleotide by not cleaving the target double-stranded polynucleotide or by cleaving only one strand, i.e., without causing a double-stranded cleavage.
  • the modification is preferably performed in single-base units.
  • the specific and precise modification of the single base unit is preferably performed using a nucleic acid base conversion enzyme in the complex.
  • the nucleic acid base conversion enzyme include deaminases.
  • deaminases that can be used include cytosine deaminase, cytidine deaminase, adenosine deaminase, and the like.
  • the complex in one embodiment may contain an Indel formation inhibitor such as uracil DNA glycosylase inhibitor (UGI) to inhibit Indel formation.
  • UBI uracil DNA glycosylase inhibitor
  • the specific and precise modification of the single base unit can also be achieved by using a method using a complex of a nucleic acid sequence recognition module and DNA glycosylase.
  • a complex of a nucleic acid sequence recognition module and DNA glycosylase is expressed from an expression vector or RNA molecule introduced into a cell
  • the nucleic acid sequence recognition module specifically recognizes and binds to a target nucleotide sequence in a double-stranded DNA of interest (e.g., genomic DNA)
  • the action of the DNA glycosylase linked to the nucleic acid sequence recognition module causes an abasic reaction in the sense or antisense strand of the targeted site (which can be appropriately adjusted within a range of several hundred bases including all or part of the target nucleotide sequence or their vicinity), resulting in an abasic site (AP site) in one strand of the double-stranded DNA.
  • the base excision repair (BER) system in the cell is activated, and first, an AP endonuclease recognizes the AP site and cuts the phosphate bond of one strand of DNA, and an exonuclease removes the abasic nucleotide. Next, a DNA polymerase inserts a new nucleotide using the opposite strand DNA as a template, and finally, a DNA ligase repairs the splice. When a repair error occurs at any stage of this BER, various mutations are introduced.
  • the CRISPR-Cas system recognizes the sequence of a double-stranded DNA of interest using a guide RNA complementary to the target nucleotide sequence, and therefore any sequence can be targeted simply by synthesizing an oligo-RNA and/or oligo-DNA capable of specifically hybridizing with the target nucleotide sequence. Moreover, at the targeted site, the double-stranded DNA is unwound to generate a single-stranded region and an adjacent region having a loosened double-stranded DNA structure, so that a nucleic acid base conversion enzyme or DNA glycosylase can be efficiently acted on the targeted site specifically without combining a factor that changes the structure of the double-stranded DNA.
  • a CRISPR-Cas system that does not have at least one DNA cleavage ability of Cas (CRISPR-mutant Cas) or a CRISPR-Cas system that does not have both DNA cleavage abilities of Cas (CRISPR-mutant Cas) can be preferably used as the nucleic acid sequence recognition module.
  • the nucleic acid sequence recognition module of the present disclosure using CRISPR-mutant Cas is provided as a complex of an RNA molecule consisting of a guide RNA complementary to a target nucleotide sequence and a tracrRNA required for recruiting the mutant Cas protein, and the mutant Cas protein.
  • the modification can be performed in any environment, in vivo or in vitro. In one embodiment, the modification can also be performed outside the body, i.e., ex vivo or in vitro.
  • the modification of at least one gene in the microorganism of the present disclosure can include a mutation that generates a stop codon using the techniques described above. This can reduce or eliminate the function or activity normally possessed by the protein encoded by the gene.
  • the modification of at least one gene in the microorganism of the present disclosure can include at least two, three, four, five, six, seven, or eight mutations in a gene. By creating at least two mutations in a gene, it is possible to ensure that the function normally possessed by the protein encoded by the gene is not substantially restored.
  • the modification of at least one gene in a microorganism is preferably performed by base editing, preferably single base editing.
  • base editing preferably single base editing.
  • a growth curve is drawn using the turbidity in a liquid medium to which growth essential substances (nucleic acid or amino acid) are not added for an essential gene-deficient E. coli strain produced using recombinant DNA technology, no growth is observed for a certain period of time from the start of culture.
  • growth essential substances nucleic acid or amino acid
  • Sci Transl Med. 2019 Jan 16;11(475):eaau7975 and Nat Biotechnol. 2018 Oct;36(9):857-864 show that the strain does not grow for at least 16 hours.
  • the present inventors have found through the process of this disclosure that when an E. coli strain produced using recombinant DNA technology that lacks a single essential gene is cultured for more than 100 hours, growth is observed.
  • the modification of at least one gene in the microorganism of the present disclosure can include at least one mutation in each of at least two genes, for example, the at least two genes can be independently selected from the group consisting of essential genes, drug efficacy-related genes, morphology-related genes, and colonization-related genes.
  • the modification of at least one gene in the microorganism of the present disclosure can include at least two mutations in each of at least two genes.
  • the present disclosure can, for example and without limitation, target biosynthetic genes for two independent growth-essential substances that are not physiologically complementary to one another, introduce a stop codon into each gene sequence, and create a dual biosynthetic gene knockout edited strain using base editing technology.
  • the present disclosure provides a modified microorganism that simultaneously meets two conditions: that it grows well in vivo, but cannot grow after excretion from the body.
  • the significance of dually deleting the functions of two genes is that even if a double mutant strain in which two stop codons are introduced into one gene is created, if one bypass pathway is complemented or substituted, the effect of imparting non-growth may disappear all at once, and this possibility is prevented as much as possible.
  • the frequency of mutations in microorganisms is about once per 10 6 to 10 7 colony forming units (CFU)
  • the probability of dual reversion mutations in two genes or mutations in alternative genes is theoretically about once per 10 12 to 10 14 CFU.
  • the number of bacteria expected to be administered in one clinical trial is a maximum of 10 9 to 10 10 CFU, it is impossible for dual mutations to occur in two genes at the same time, or the possibility can be reduced to an extremely low level.
  • the essential gene to be modified is a biosynthetic gene or a gene related thereto in the target microorganism, and that the two genes are not functionally complementary. This makes it possible to artificially create a situation in which a dual function-deficient strain of two genes cannot grow and dies in a normal environment, and it is possible to impose a condition in which the growth of the target microorganism is completely dependent on the simultaneous supply of two growth essential substances from the surrounding environment.
  • the place of survival can be limited so that the microorganism can survive only in an environment in which a nucleic acid-related substance derived from the living organism, an essential amino acid-related substance derived from food, or an essential vitamin-related substance is present.
  • the incidence of reversion mutations can be measured by any method.
  • the microorganism of the present disclosure is, for example, Escherichia coli, Lactococcus lactis, Bacteroidetes, Firmicutes, Actinobacteria, Proteobacteria, Members of the phyla Fusobacteria or Verrucomicrobia and the genera Bacteroides, Alistipes, Faecalibacterium, Parabacteroides, Prevotella, Roseburia, Ruminococcus, Clostridium, Oscillibacter, Gemmiger, Barnesiella, Dialister, Parasutterella, Phascolarctosporum, and the like.
  • Bifidobacterium animalis Bifidobacterium breve, Streptococcus cristatus, Streptococcus gordonii, Streptococcus mutans, Streptococcus salivarius, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Porphyromonas gingivalis, Clostridium acetobutylicum, Clostridium butyricum, Clostridium sporogenes, Clostridium cocleatum, Clostridium saccharogumia, Clostridium spiroforme, Clostridium innocuum, Clostridium ramosum, Clostridium hathewayi, Clostridium saccharolyticum, Clostridium Sindens, Clostridium sp.
  • Clostridium bolteae Clostridium indolis, Clostridium lavalense, Clostridium asparagiforme, Clostridium symbiosum, Clostridiales bacterium, Fusobacterium nucleatum, Blautia hydrogenotrophic a, Blautia stercoris, Blautia wexlerae, Blautia producta, Blautia coccoides, Blautia hansenii, Blautia faecis, Blautia glucea, Blautia luti, Blautia schinkii, Megasphaera massiliensis, Megasp haera elsdenii, Megasphaera cerevisiae, Megasphaera indica, Megasphaera paucivorans, Megasphaera sueciensis, Megasphaera micronuciformis, Megasphaera hexanoica, Eubacterium contortum, Eubacte rium fissicaten
  • the microorganisms of the present disclosure can inhabit the gut, oral cavity, and/or skin of a subject, e.g., of a genus that constitutes at least about 0.1%, at least about 0.5%, at least about 1%, at least about 5%, at least about 10%, at least about 20%, at least about 30%, or at least about 40% of the total culturable microorganisms in the feces of the subject.
  • the microorganisms in the gut or feces of a subject can be analyzed by any technique known in the art, including 16S ribosomal sequencing.
  • Bacteroides is the most naturally abundant genus in the human gut, and exemplary Bacteroides species include B. acidifaciens, B.
  • amylophilus B. asaccharolyticus, B. spp. ... B. barnesiaes, B. bivius, B. buccae, B. buccalis, B. caccae, B. caecicola, B. caecigallinarum, B. capillosus, B. capillus, B. cellulosilyticus, B. cellulosolvens, B. chinchilla, B. clarus, B. coagulans, B. coprocola, B. coprophilus, B. coprosuis, B. corporis, B. denticola, B. disiens, B. distasonis, B. dorei, B. eggerthii, B.
  • reticulothermitis B. rodentium, B. ruminicola, B. salanitronis, B. salivosus, B. saliersiae, B. B. sartorii, B. sediment, B. splanchnicus, B. stercoris, B. stercoris, B. succinogenes, B. suis, B. tectus, B. termitidis, B. thetaiotaomicron, B. ureformis, B. uniformis, B. ureolyticus, B. veroralis, B.
  • bacteria that may be present include B. vulgatus, B. xylanisolvens, B. xylanolyticus, and B.
  • bacteria that may be present in the oral cavity include Streptococcus gordonii, Streptococcus mutans, and Streptococcus salivarius, and examples of bacteria that may be present in the skin include Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis.
  • the microorganisms of the disclosure are capable of stably colonizing the human gut, oral cavity, and/or skin.
  • the microorganisms of the disclosure are capable of colonizing the gut of a subject with, for example, increased abundance, stability, or ease of initial colonization in the gut compared to the same or similar microorganisms that have not been modified.
  • the microorganism of the present disclosure may further include a gene related to a therapeutic agent.
  • a gene related to a therapeutic agent may be one that the microorganism originally has, or a gene that exerts a desired effect may be introduced as is or with a partial modification.
  • the gene related to a therapeutic agent may be a type 1 fimbrin D-mannose specific adhesin (fimH) or the like.
  • the microorganism of the present disclosure may further include a gene related to a diagnostic agent.
  • a gene related to a diagnostic agent may be one that the microorganism originally has, or a gene that exerts a desired effect may be introduced as is or with a partial modification.
  • the gene related to a diagnostic agent may be a bacterial actin-like cytoskeleton protein (cell shape-determining protein (mreB)) or the like.
  • the microorganism of the present disclosure may further include a gene related to a colonization property.
  • a gene related to a colonization property may be one that the microorganism originally has, or a gene that exerts a desired effect may be introduced as is or with a partial modification.
  • the gene associated with fixation can be the DNA-binding transcriptional activator flhD.
  • the effect of a stop codon introduced as a result of single base editing can inhibit functional expression of the target protein.
  • a microorganism contains genes or nucleic acids encoding multiple proteins, it is contemplated that open reading frames encoding two or more of the proteins can be present, for example, in a single operon.
  • the microorganisms of the present disclosure may be utilized as therapeutic preparations, and such therapeutic preparations may, for example, comprise a therapeutically effective amount of the microorganisms of the present disclosure, for example, at least about 0.01%, about 0.05%, about 0.1%, about 0.2%, about 0.3%, about 0.4%, about 0.5%, about 0.6%, about 0.7%, about 0.8%, about 0.9%, about 1.0%, about 1.5%, about 2.0%, or less by weight of the microorganism.
  • a method for producing a microorganism having at least one modified gene comprising modifying the at least one gene in the microorganism by converting or deleting one or more nucleotides of a target nucleic acid sequence of the gene to another nucleotide, or by inserting one or more nucleotides into the target nucleic acid sequence of the gene, the modification not substantially restoring a function normally possessed by a protein encoded by the gene.
  • the method of the present disclosure may comprise any of the features described elsewhere herein.
  • Short Protocols in Molecular Biology A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Ausubel, F. M. (1995). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Innis, M. A. et al. (1995). PCR Strategies, Academic Press; Ausubel, F. M. (1999). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, and annual updates; Sninsky, J. J. et al. (1999).
  • gene synthesis and fragment synthesis services such as GeneArt, GenScript, Integrated DNA Technologies (IDT) can be used, and other references include, for example, Gait, M. J. (1985). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Gait, M. J. (1990). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein, F. (1991). Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Adams, R. L. et al. (1992). The Biochemistry of the Nucleic Acids, Chapman &Hall; Shabarova, Z. et al. (1994).
  • Example 1 Non-proliferative Test Culture medium and culture conditions This example was carried out using LB Broth, Miller (LB liquid medium) (Nacalai Tesque, Inc.). Liquid culture of the knockout strain was carried out using LB liquid medium supplemented with a final concentration of 10 mM thymidine (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) or 100 ⁇ g/mL 2,6-diaminopimelic acid (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) at 37°C under shaking conditions at 200 rpm. Static culture was carried out using LB agar medium supplemented with a final concentration of 3 mM thymidine or 100 ⁇ g/mL 2,6-diaminopimelic acid.
  • ATCC American type culture collection
  • genome-edited strains strains were created in which the genes encoding thymidylate synthase (thyA) involved in nucleic acid synthesis and 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate synthase (dapA) involved in essential amino acid synthesis were knocked out by genome editing (Table 1).
  • Non-growth test 0.5 mL of the strain cultured overnight in LB liquid medium containing each additive was inoculated into 20 mL of freshly prepared medium. If the amount of bacteria cultured overnight was insufficient, 1 mL of the overnight cultured bacterial solution was inoculated into 40 mL of freshly prepared medium. The strain was cultured at 37°C with a rotation culture at 200 rpm until the turbidity OD600 of the bacterial solution reached 1.5 or more.
  • the cells were collected by centrifugation (20° C., 3,000 rpm, 15 min), washed with 10 mL of phosphate buffered saline (PBS solution), and then resuspended in 1.5 mL of PBS solution, and the turbidity OD 600 of the cell suspension was measured.
  • PBS solution phosphate buffered saline
  • 1 mL of the collected bacterial liquid was smeared on 10 LB agar plates at 100 ⁇ L each and cultured at 37°C.
  • 1 mL of the collected bacterial liquid of only the dapA knockout strain was diluted 2-fold with PBS solution, and 100 ⁇ L each was smeared on 20 LB agar plates and cultured at 37°C.
  • the remaining liquid of the smeared bacterial solution was diluted 107 times with PBS solution, and 100 ⁇ L of each was smeared on LB agar medium containing each additive. After overnight incubation at 37° C., the total number of bacteria in the smeared bacterial solution was calculated from the number of colonies that appeared.
  • Results Total number of bacteria in the recovered bacterial solution The total number of bacteria of the genome-edited bacteria subjected to the non-growth test is shown in Table 2. Each strain had 1 x 10 10 cfu or more.
  • Non-growth test results The results of confirming the non-growth of the thyA gene knockout strains (BP2037, BP2040, BP2043), dapA gene knockout strains (BP2067, BP2088, BP2239), and thyA and dapA gene double knockout strains (BP2230, BP2233) are shown in Figure 1.
  • the revertant appearance rate was calculated from the number of colonies that appeared on the LB agar medium (Table 3) ( Figure 1).
  • the revertant mutant occurrence rate was calculated from the number of colonies that appeared after 72 hours of culture. As a result, it was proven that the revertant mutant occurrence rate was reduced in the thyA-dapA double knockout strains (BP2230, BP2233) in which a stop codon was replaced at one site each in two genes with different physiological functions, compared to the thyA or dapA knockout strains (BP2037, BP2040, BP2067, BP2088) in which one amino acid was replaced with a stop codon.
  • microorganism disclosed herein can ensure the quality and safety of bacterial preparations and prevent their transmission and/or spread to the environment and humans, and is therefore expected to have a wide range of applications in the medical field.
  • SEQ ID NO:1 Nucleic acid sequence of thyA
  • SEQ ID NO:2 Amino acid sequence of thyA
  • SEQ ID NO:3 Nucleic acid sequence of dapA
  • SEQ ID NO:4 Amino acid sequence of dapA

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Abstract

本開示は、細菌製剤の利用において環境中やヒトへの伝播および／または拡散を防止することに関する。より詳細には、本開示は、微生物であって、該微生物における少なくとも１つの遺伝子が改変されており、該改変は、該遺伝子によってコードされるタンパク質が通常有する機能が実質的に回復しないものである、微生物、に関する。

Description

遺伝子が改変された微生物およびその生産方法
　本開示は、遺伝子および／または核酸によってコードされるタンパク質が通常有する機能が実質的に回復しない改変を有する微生物、およびその微生物を生産する方法に関する。
　近年、種々の感染症や潰瘍性大腸炎、癌等の幅広い疾患を対象として、その治療や予防のために、単数または複数の細菌からなる製剤を医薬品として開発する試みが行われており、数多くの細菌種が試験されている。このような細菌製剤では、もともとの細菌がもつ遺伝子を改変して目的の形質を付与する場合もあり、このような利用の場合には、臨床利用においては細菌製剤の品質および安全性を担保し、環境中やヒトへの伝播および／または拡散を防止する必要がある。
　したがって、本開示は以下を提供する。
（項目Ｘ１）
　微生物であって、該微生物における少なくとも１つの遺伝子が改変されており、該改変は、該遺伝子によってコードされるタンパク質が通常有する機能が実質的に回復しないものである、微生物。
（項目Ｘ２）
　前記遺伝子が、必須遺伝子、薬効関連遺伝子、形態関連遺伝子、および定着性関連遺伝子からなる群から選択される、上記項目に記載の微生物。
（項目Ｘ３）
　前記遺伝子が必須遺伝子であり、前記改変は、該必須遺伝子によってコードされるタンパク質が通常有する活性が低減または欠損した場合に、前記微生物が、環境または対象において実質的に伝播しない改変である、上記項目のいずれか一項に記載の微生物。
（項目Ｘ４）
　前記必須遺伝子が、アミノ酸合成酵素、核酸合成酵素、およびビタミン合成酵素をコードする遺伝子からなる群から選択される、上記項目のいずれか一項に記載の微生物。
（項目Ｘ５）
　前記アミノ酸合成酵素が、リジン生合成酵素をコードする遺伝子（ｄａｐＡ）、ｃｙｓＫ、ｃｙｓＭ、ｐａｂＡ、ｐａｂＢ、ｐａｂＣ、ｇｌｙＡ、ｐｒｏＢ、ｐｒｏＡ、ｌｅｕＢ、ａｌｒ、ｄａｄＸ、ｓｅｒＣ、ａｒｇＨ、ｈｉｓＤ、ｉｌｖＡ、ｌｅｕＢ、ｌｙｓＡ、ｍｅｔＢ、ｐｈｅＡ、ｐｒｏＣ、ｔｈｒＣ、ｔｒｐＣ、およびｔｙｒＡからなる群から選択される、上記項目のいずれか一項に記載の微生物。
（項目Ｘ６）
　前記核酸合成酵素が、チミジル酸合成酵素をコードする遺伝子（ｔｈｙＡ）、ｐｕｒＫ、ｐｕｒＮ、ｐｕｒＴ、ｐｙｒＢ、ｐｙｒＣ、ｐｙｒＤ、およびｐｙｒＥからなる群から選択される、上記項目のいずれか一項に記載の微生物。
（項目Ｘ７）
　前記ビタミン合成酵素が、ｔｈｉＣ、ｔｈｉＥ、ｔｈｉＦ、ｔｈｉＳ、ｔｈｉＧ、ｔｈｉＨ、ｒｉｂＢ、ｒｉｂＣ、ｒｉｂＤ、ｎａｄＡ、ｎａｄＢ、ｐａｎＣ、ｐｄｘＢ、ｂｉｏＨ、およびｍｅｔＥからなる群から選択される、上記項目のいずれか一項に記載の微生物。
（項目Ｘ８）
　前記改変が、前記遺伝子における点変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の微生物。
（項目Ｘ９）
　前記改変が、終止コドンを生じさせる変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の微生物。
（項目Ｘ１０）
　前記改変が、前記少なくとも１つの遺伝子における少なくとも２ヶ所の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の微生物。
（項目Ｘ１１）
　前記改変が、少なくとも２種の遺伝子におけるそれぞれ少なくとも１ヶ所の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の微生物。
（項目Ｘ１２）
　前記改変が、少なくとも２種の遺伝子におけるそれぞれ少なくとも２ヶ所の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の微生物。
（項目Ｘ１３）
　前記少なくとも２種の遺伝子が、必須遺伝子、薬効関連遺伝子、形態関連遺伝子、および定着性関連遺伝子からなる群からそれぞれ独立して選択される、上記項目のいずれか一項に記載の微生物。
（項目１）
　少なくとも１つの遺伝子が改変された微生物を生産する方法であって、
　該少なくとも１つの遺伝子を改変する工程であって、該微生物内において、該遺伝子の標的核酸配列の１またはそれ以上のヌクレオチドを他のヌクレオチドに変換し、もしくは欠失させ、または該遺伝子の標的核酸配列に１またはそれ以上のヌクレオチドを挿入する、改変する工程、
を含み、該改変は、該遺伝子によってコードされるタンパク質が通常有する機能が実質的に回復しないものである、方法。
（項目２）
　前記遺伝子が、必須遺伝子、薬効関連遺伝子、形態関連遺伝子、および定着性関連遺伝子からなる群から選択される、上記項目に記載の方法。
（項目３）
　前記遺伝子が必須遺伝子であり、前記改変は、該必須遺伝子によってコードされるタンパク質が通常有する活性が低減または欠損した場合に、前記微生物が、環境または対象において実質的に伝播しない改変である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目４）
　前記必須遺伝子が、アミノ酸合成酵素、核酸合成酵素、およびビタミン合成酵素からなる群から選択される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
　前記アミノ酸合成酵素が、リジン生合成酵素をコードする遺伝子（ｄａｐＡ）、ｃｙｓＫ、ｃｙｓＭ、ｐａｂＡ、ｐａｂＢ、ｐａｂＣ、ｇｌｙＡ、ｐｒｏＢ、ｐｒｏＡ、ｌｅｕＢ、ａｌｒ、ｄａｄＸ、ｓｅｒＣ、ａｒｇＨ、ｈｉｓＤ、ｉｌｖＡ、ｌｅｕＢ、ｌｙｓＡ、ｍｅｔＢ、ｐｈｅＡ、ｐｒｏＣ、ｔｈｒＣ、ｔｒｐＣ、およびｔｙｒＡからなる群から選択される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
　前記核酸合成酵素が、チミジル酸合成酵素をコードする遺伝子（ｔｈｙＡ）、ｐｕｒＫ、ｐｕｒＮ、ｐｕｒＴ、ｐｙｒＢ、ｐｙｒＣ、ｐｙｒＤ、およびｐｙｒＥからなる群から選択される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
　前記ビタミン合成酵素が、ｔｈｉＣ、ｔｈｉＥ、ｔｈｉＦ、ｔｈｉＳ、ｔｈｉＧ、ｔｈｉＨ、ｒｉｂＢ、ｒｉｂＣ、ｒｉｂＤ、ｎａｄＡ、ｎａｄＢ、ｐａｎＣ、ｐｄｘＢ、ｂｉｏＨ、およびｍｅｔＥからなる群から選択される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
　前記改変が、前記遺伝子における点変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
　前記改変が、終止コドンを生じさせる変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
　前記改変が、前記少なくとも１つの遺伝子における少なくとも２ヶ所の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
　前記改変が、少なくとも２種の遺伝子におけるそれぞれ少なくとも１ヶ所の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
　前記改変が、少なくとも２種の遺伝子におけるそれぞれ少なくとも２ヶ所の変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
　前記少なくとも２種の遺伝子が、必須遺伝子、薬効関連遺伝子、形態関連遺伝子、および定着性関連遺伝子からなる群からそれぞれ独立して選択される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
　本開示において、上記の１つまたは複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供され得ることが意図される。なお、本開示のさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
　なお、上記した以外の本開示の特徴及び顕著な作用・効果は、以下の発明の実施形態の項及び図面を参照することで、当業者にとって明確となる。
　本開示により、微生物に対して、通常有する機能が実質的に回復しない改変を施すことができ、またこれにより、改変微生物はその通常有する機能が回復する外的要因（例えば、栄養（必須栄養素）、ある種の薬剤であり得る）が提供されない限り、増殖できないため、その外的要因の有無で微生物の生存や増殖を制御・管理することができる。
図１は、本開示の一実施形態における、ｔｈｙＡ　遺伝子ノックアウト株、ｄａｐＡ遺伝子ノックアウト株、ｔｈｙＡおよびｄａｐＡ遺伝子の二重ノックアウト株の非増殖性試験結果を示すグラフである。
　以下、本開示を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本開示の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
　以下に本明細書において特に使用される用語の定義および／または基本的技術内容を適宜説明する。
　本明細書において、「約」とは、後に続く数値の±１０％を意味する。
　本明細書において、「微生物」とは、微小な生物を指し、例えば、細菌や放線菌などの原核生物、酵母やカビなどの真核生物、下等藻類、真菌、ウイルス等の他、動物や植物などの多細胞生物であっても個々に別々に存在する細胞も含まれる。また微生物には、天然の微生物のほか、それらを培養して人為的に増殖させたもの、それらが突然変異したもの、または形質転換その他の手法によって、人為的に改変した微生物等も含まれる。
　本明細書において、遺伝子の「改変」とは、ＤＮＡ鎖上のあるヌクレオチド（例えば、ｄＣ）が、他のヌクレオチド（例えば、ｄＴ、ｄＡ又はｄＧ）に変換されるか、欠失すること、あるいはＤＮＡ鎖上のあるヌクレオチド間にヌクレオチドもしくはヌクレオチド配列が挿入もしくは付加されることを意味する。本明細書における「改変」には、二本鎖ＤＮＡの標的化した部位の１以上のヌクレオチドの置換、欠失、または二本鎖ＤＮＡの標的化した部位への１以上のヌクレオチドの挿入もしくは付加を含む。ここで、改変される二本鎖ＤＮＡは特に制限されないが、好ましくはゲノムＤＮＡである。また、二本鎖ＤＮＡの「標的化した部位」とは、核酸配列認識モジュールが特異的に認識して結合する「標的ヌクレオチド配列」の全部もしくは一部、又はそれと該標的ヌクレオチド配列の近傍（５’上流及び３’下流のいずれか一方又は両方）を意味し、その範囲は目的に応じて、１塩基～数百塩基長の間で適宜調節することができる。
　本明細書において「遺伝子」とは最広義に解釈され、核酸の文字列またはそれを担う物質（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなどのヌクレオチド）の配列をいい、好ましくは、なんらかの機能を発揮する配列または配列を含む物質であって、例えば、タンパク質をコードするもののほか、転写因子結合部位として、転写産物の転写時期と生産量を制御するプロモーターやエンハンサーなどの隣接した転写調節領域、転写因子結合部位として、転写産物の転写時期と生産量を制御するプロモーターやエンハンサーなどの隣接した転写調節領域なども包含される。
　本明細書において、「必須遺伝子」とは、目的の条件下で生存能を維持するために機能発現が必要な遺伝子または核酸配列、またはその一部をいい、例えば必須遺伝子には、アミノ酸合成酵素、核酸合成酵素、およびビタミン合成酵素などをコードする遺伝子を挙げることができる。例示的な必須遺伝子としては、チミジル酸合成酵素をコードする遺伝子（thyA）、5-(カルボキシアミノ)イミダゾールリボヌクレオチド合成酵素(5-(carboxyamino)imidazole　ribonucleotide　synthase:　purK)、ホスホリボシルグリシンアミド　ホルミルトランスフェラーゼ　1　(phosphoribosylglycinamide　formyltransferase　1:　purN)、ホスホリボシルグリシンアミド　ホルミルトランスフェラーゼ　2　(phosphoribosylglycinamide　formyltransferase　2:　purT)、アスパラギン酸カルバモイルトランスフェラーゼ触媒サブユニット(aspartate　carbamoyltransferase　catalytic　subunit:　pyrB)、ジヒドロオロターゼ（dihydroorotase:　pyrC）、ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ、タイプ　2　(dihydroorotate　dehydrogenase,　type　2:　pyrD)、オロチン酸ホスホリボシル基転移酵素(orotate　phosphoribosyltransferase:　pyrE)などの核酸合成酵素をコードする遺伝子、チアミン生合成酵素の構造遺伝子（phosphomethylpyrimidine　synthase:thiC, thiamine　phosphate　synthase: thiE, sulfur　carrier　protein:thiS,adenylyltransferase: thiF, sulfur　carrier　protein thiS: thiS, 1-deoxy-D-xylulose　5-phosphate:thiol　sulfurtransferase:thiG, 2-iminoacetate　synthase: thiH）、３，４－ジヒドロキシ－２－ブタノン－４－リン酸シンターゼ（3,4-dihydroxy-2-butanone-4-phosphatesynthase: ribB）、リボフラビン合成酵素（riboflavin　synthase: ribC）、ジアミノヒドロキシホスホリボシルアミノピリミジンデアミナーゼ／５－アミノ－６－（５－ホスホリボシルアミノ）ウラシルレダクターゼ（fused　diaminohydroxyphosphoribosylaminopyrimidine　deaminase/5-amino-6-(5-phosphoribosylamino)uracil　reductase:ribD）、キノリン酸シンターゼ（quinolinate synthase: nadA）、アスパラギン酸オキシダーゼ（L-aspartate oxidase:nadB）、パントテン酸合成酵素（pantothenate　synthetase: panC）、エリスロン酸－４－リン酸デヒドロゲナーゼ（erythronate-4-phosphate　dehydrogenase:pdxB）、ピメロイルアシルキャリアタンパク質メチルエステルエステラーゼ（pimeloyl-acyl　carrier　protein　methyl　ester　esterase:bioH）、およびコバラミン非依存性ホモシステイントランスメチラーゼ（cobalamin-independent　homocysteine　transmethylase:metE）などのビタミン合成酵素をコードする遺伝子、およびアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンから選択される１または複数のアミノ酸の合成に関与するアミノ酸合成酵素（例えばリジン生合成酵素をコードする遺伝子（dapA）、システイン合成酵素（cysteine　synthase　A:cysK、cysteine　synthase　B: cysM）、アミノデオキシコリスミ酸合成酵素（aminodeoxychorismate　synthase　subunit　2:pabA、aminodeoxychorismate　synthase　subunit　1: pabB）アミノデオキシコリスミ酸リアーゼ（aminodeoxychorismate　lyase:pabC）、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（serine　hydroxymethyltransferase : glyA）、グルタミン酸５－キナーゼ（glutamate　5-kinase: proB）グルタミン酸－５－セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（glutamate-5-semialdehyde dehydrogenase: proA）、３－イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（3-isopropylmalatedehydrogenase: leuB）、アラニンラセマーゼ（alanine racemase 1 : alr、alanine racemase 2 :dadX）、ホスホセリン／ホスホヒドロキシスレオニンアミノトランスフェラーゼ（phosphoserine/phosphohydroxythreonineaminotransferase : serC）、アルギニノコハク酸リアーゼ（argininosuccinate　lyase : argH）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（histidinol　dehydrogenase:hisD）、スレオニンデアミナーゼ（threonine　deaminase:　ilvA）、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ（diaminopimelate　decarboxylase:　lysA）、ｏ－サクシニルホモセリン（チオール）－リアーゼ（O-succinylhomoserine(thiol)-lyase　/　O-succinylhomoserine　lyase:　metB）、コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドラターゼ（fused　chorismate　mutase/prephenate　dehydratase:　pheA）、ピロリン－５－カルボン酸レダクターゼ（pyrroline-5-carboxylate　reductase:　proC）、スレオニン合成酵素（threonine　synthase:　thrC）、インドール－３－グリセロールリン酸シンターゼ（fused　indole-3-glycerol　phosphate　synthase/phosphoribosylanthranilate　isomerase:　trpC）、およびコリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドロゲナーゼ（fused　chorismate　mutase/prephenate　dehydrogenase:　tyrA））などを挙げることができる。
　本明細書において、「薬効関連遺伝子」とは、提供された生物（例えばヒト）に対して、何らかの医学的または生物学的な利益を提供することができる遺伝子または核酸配列、またはその一部をいい、例えば、Ｉ型線毛Ｄ－マンノース特異的アドヘシン（Type　1　fimbrin　D-mannose　specific　adhesin：fimH）、カーリー線毛主要サブユニット（Major　curlin　subunit　gene　A：csgA）などを挙げることができる。薬効関連遺伝子には、ノックアウトすることで何らかの薬効が発揮される遺伝子、および発現を向上されることで薬効が発揮される遺伝子の双方が含まれる。また薬効関連遺伝子には、プロバイオティクスなどの、生物学的成分（例えば、微生物全体またはその一部）を含む組成物であって、対象内において有害微生物に作用する、有用微生物フローラを形成する、健康状態を維持または向上する、および/または免疫力を賦活する等の機能を有する微生物またはその生物学的成分自体、あるいはこれらを含む組成物を提供することができる遺伝子または核酸配列、またはその一部も含まれる。
　本明細書において、「形態関連遺伝子」とは、微生物が有する形態を直接または間接的に決定づける要素（例えば、タンパク質、代謝物など）を提供し得る遺伝子または核酸配列、またはその一部をいい、例えば、細菌のアクチン様細胞骨格タンパク質（Cell　shape-determining　protein：mreB）などを挙げることができる。
　本明細書において、「定着性関連遺伝子」とは、宿主（例えばヒト）の器官や細胞において微生物が接着し、粘着し、および／または付着などするための機構を構成するタンパク質をコードする遺伝子または核酸配列、またはその一部、またはそのような遺伝子の発現を制御する因子をコードする遺伝子または核酸配列、またはその一部をいい、例えば、ＤＮＡ結合型転写活性化因子（DNA-binding　transcriptional　activator：ｆｌｈＤ）、ＤＮＡ結合型鉄獲得調節因子（Ferric　uptake　regulator：ｆｕｒ）、ＤＮＡ結合型グルシトールオペロン転写抑制因子(glucitol　operon　transcriptional　repressor：ｓｒｌＲ)、ミリストイル化アシルキャリアプロテイン依存的アシル基転移酵素（Myristoyl-acyl　carrier　protein　(acp)-dependent　acyltransferase：ｌｐｘＭ）、ＤＮＡ結合型転写活性化因子（DNA-binding　transcriptional　activator：ｎｔｒＣ）、ＤＮＡ結合型転写抑制因子（DNA-binding　transcriptional　repressor：ｃｙｔＲ）、ＤＮＡ結合型マルトースレギュロン転写抑制因子（DNA-binding　mal　regulon　transcriptional　repressor：ｍａｌＩ）、ＤＮＡ結合型転写デュアル調節因子（DNA-binding　transcriptional　dual　regulator：ｎａｇＣ）、ＤＮＡ結合型転写活性化因子（DNA-binding　transcriptional　activator：ｆｌｈＣ）、高親和型グルコン酸輸送体（High-affinity　gluconate　transporter：ｇｎｔＴ）、ＤＮＡ結合型フルクトースリシンオペロン転写抑制因子（DNA-binding　fructoselysine　utilization　operon　transcriptional　repressor：ｆｒｌＲ）、ＤＮＡ結合型転写抑制因子（DNA-binding　transcriptional　repressor：ｋｄｇＲ）、ＤＮＡ結合型転写調節因子（DNA-binding　transcriptional　regulator：ｏｘｙＲ）、センサーキナーゼ（osmolarity　sensor　protein：ｅｎｖＺ）、鞭毛構成因子（flagellar　filament　structural　protein：ｆｌｉＣ）、タガトース6リン酸キナーゼ（Tagatose　6-phosphate　kinase：ｇａｔＺ）、ＤＮＡ結合型転写調節因子（DNA-binding　transcriptional　regulator：ｏｍｐＲ）、およびロイシン応答調節タンパク質（Leucine-responsive　regulatory　protein：ｌｒｐ）などを挙げることができる。
　本明細書において、「タンパク質が通常有する機能」または「タンパク質が通常有する活性」とは、あるタンパク質が通常存在する環境において発揮し得る機能または活性をいう。また「タンパク質が通常有する機能が実質的に回復しない」とは、遺伝子が改変された結果、当該遺伝子がコードするタンパク質の機能および／または活性が低減または欠損し、その後当該機能および／または活性が、当該改変がされていない遺伝子によってコードされるタンパク質と比較して、元の機能および／または活性に戻らないことをいう。
　本明細書において、タンパク質の機能または活性が「低減する」または「欠損する」とは、遺伝子が改変された結果、当該遺伝子がコードするタンパク質の機能および／または活性が、元のタンパク質の機能および／または活性と比較した場合に、少なくとも実質的に低下していることをいう。タンパク質の機能または活性が「低減する」または「欠損する」とは、元のタンパク質の機能および／または活性よりも、少なくとも約１０％低い、少なくとも約２５％低い、少なくとも約５０％低い、少なくとも約７５％低い、および／または少なくとも約９０％低い場合を含む。
　本明細書において、微生物が「伝播」するとは、直接的な接触を介して、または空気や水、飲食物、物体などを介して間接的に、微生物が第一の個体および／または細胞から、第二の個体および／または細胞へ移ることをいう。伝播には、プラスミド、トランスポゾン、バクテリオファージ等の可動性遺伝因子が関与する場合も含まれる。
　（好ましい実施形態）
　以下に本開示の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本開示のよりよい理解のために提供されるものであり、本開示の範囲は以下の記載に限定されるべきでない。したがって、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本開示の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本開示の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができる。
　本開示の一局面において、微生物であって、該微生物における少なくとも１つの遺伝子が改変されており、該改変は、該遺伝子によってコードされるタンパク質が通常有する機能が実質的に回復しないものである、微生物が提供される。本開示の微生物は、細菌治療製剤の環境中への拡散防止技術として有用である。
　通常有する機能が実質的に回復しない改変が微生物に施されることにより、その改変微生物は、その通常有する機能を回復される外的要因（例えば、栄養（必須栄養素）、ある種の薬剤であり得る）が提供されない限り通常有する機能を有せないことになるため、通常有する機能（例えば、生存、特殊状態での維持等であり得る）をその外的要因の有無で制御・管理することができ、例えば、環境におけるコントロールに応用することができる。
　改変微生物の細菌製剤としての利用については、２０２０年にゲノム編集技術の利用により得られた医薬品関連生物の取り扱いが通知されており、この通知では、カルタヘナ法の規制対象外と判断された場合であっても（すなわち、最終的に得られた生物に細胞外で加工した核酸が含まれない場合でも）、生物多様性への影響が生ずる恐れがあると判断された場合、生物多様性に対する影響を防止するために必要な措置を執ることが求められている。生物多様性に対する影響とは、対象生物が体外排出される際、競合する生物との優位性の有無、または、影響を受ける可能性のある野生動植物等の有無を評価することである。こうしたリスクを特定し予め届け出ることが、臨床試験開始の要件に課される可能性がある。このため、ゲノム編集技術を利用した微生物製剤を臨床試験の開始のみならず、実臨床で活用されるためには、体外排出後の非増殖性に関する情報（生残条件、生残時間等）を明示できるようにすることが最も現実的と考えられる。
　一つの例として、限定を意図しないが、本開示では、微生物の増殖に必要なアミノ酸を産生する能力を除去すると、栄養要求株として知られる微生物を生じる。その栄養要求性の微生物を生存させ、または増殖させる場合には、増殖に必要なアミノ酸を外部から与える必要がある。栄養要求性微生物の作製は、特に大腸菌についてよく知られている。
　一つの例として、限定を意図しないが、本開示では、微生物を目的の環境に導入する場合、標的環境への導入後に、導入された微生物を制御できることが望ましく、例えば、導入された微生物が標的環境以外の環境に伝播や拡散しないことが望ましい。このような制御は、例えば、標的環境に導入する微生物に栄養要求性を付与することによって達成することができる。その一方で、微生物に栄養要求性を付与した場合であっても、その微生物が増殖を繰り返す過程において、その栄養要求性が消失することも知られており、これは栄養要求性を付与するために改変した遺伝子やタンパク質において、その遺伝子やタンパク質の機能を回復する改変が生じてしまうことに起因すると考えられる。
　本開示の一実施形態において、少なくとも１つの遺伝子が改変された微生物において、当該改変された遺伝子によってコードされるタンパク質が通常有する機能が実質的に回復しない微生物を提供することができ、このような遺伝子としては、必須遺伝子、薬効関連遺伝子、形態関連遺伝子、および定着性関連遺伝子を挙げることができるが、これらの遺伝子に限られない。
　一実施形態において、必須遺伝子としては、必須遺伝子によってコードされるタンパク質が通常有する活性が低減または欠損した場合に、当該微生物が環境または対象において実質的に伝播しないような遺伝子または核酸配列、またはその一部を挙げることができ、例えば、アミノ酸合成酵素、核酸合成酵素、およびビタミン合成酵素などをコードする遺伝子を挙げることができるが、これらに限られるものではない。
　一実施形態において、薬効関連遺伝子としては、提供された生物（例えばヒト）に対して、何らかの医学的または生物学的な利益を提供することができる遺伝子または核酸配列、またはその一部を挙げることができ、例えば、I型線毛D-マンノース特異的アドヘシン（Type 1 fimbrin D-mannose specific adhesin：fimH）、カーリー線毛主要サブユニット（Majorcurlin subunit gene A：csgA）などを挙げることができるが、これらに限られるものではない。薬効関連遺伝子には、プロバイオティクスなどの、生物学的成分（例えば、微生物全体またはその一部）を含む組成物であって、対象内において有害微生物に作用する、有用微生物フローラを形成する、健康状態を維持または向上する、および/または免疫力を賦活する等の機能を有する微生物またはその生物学的成分自体、あるいはこれらを含む組成物を提供することができる遺伝子または核酸配列、またはその一部も含まれる。
　一実施形態において、形態関連遺伝子としては、微生物が有する形態を直接または間接的に決定づける要素（例えば、タンパク質、代謝物など）を提供し得る遺伝子または核酸配列、またはその一部を挙げることができ、例えば、細菌のアクチン様細胞骨格タンパク質（Cell　shape-determining　protein：mreB）などを挙げることができるが、これらに限られるものではない。
　一実施形態において、定着性関連遺伝子としては、宿主（例えばヒト）の器官や細胞において微生物が接着し、粘着し、および／または付着などするための機構を構成するタンパク質をコードする遺伝子または核酸配列、またはその一部、またはそのような遺伝子の発現を制御する因子をコードする遺伝子または核酸配列、またはその一部を挙げることができ、例えば、ＤＮＡ結合型転写活性化因子（DNA-binding　transcriptional　activator：ｆｌｈＤ）、ＤＮＡ結合型鉄獲得調節因子（Ferric　uptake　regulator：ｆｕｒ）、ＤＮＡ結合型グルシトールオペロン転写抑制因子(glucitol　operon　transcriptional　repressor：ｓｒｌＲ)、ミリストイル化アシルキャリアプロテイン依存的アシル基転移酵素（Myristoyl-acyl　carrier　protein　(acp)-dependent　acyltransferase：ｌｐｘＭ）、ＤＮＡ結合型転写活性化因子（DNA-binding　transcriptional　activator：ｎｔｒＣ）、ＤＮＡ結合型転写抑制因子（DNA-binding　transcriptional　repressor：ｃｙｔＲ）、ＤＮＡ結合型マルトースレギュロン転写抑制因子（DNA-binding　mal　regulon　transcriptional　repressor：ｍａｌＩ）、ＤＮＡ結合型転写デュアル調節因子（DNA-binding　transcriptional　dual　regulator：ｎａｇＣ）、ＤＮＡ結合型転写活性化因子（DNA-binding　transcriptional　activator：ｆｌｈＣ）、高親和型グルコン酸輸送体（High-affinity　gluconate　transporter：ｇｎｔＴ）、ＤＮＡ結合型フルクトースリシンオペロン転写抑制因子（DNA-binding　fructoselysine　utilization　operon　transcriptional　repressor：ｆｒｌＲ）、ＤＮＡ結合型転写抑制因子（DNA-binding　transcriptional　repressor：ｋｄｇＲ）、ＤＮＡ結合型転写調節因子（DNA-binding　transcriptional　regulator：ｏｘｙＲ）、センサーキナーゼ（osmolarity　sensor　protein：ｅｎｖＺ）、鞭毛構成因子（flagellar　filament　structural　protein：ｆｌｉＣ）、タガトース6リン酸キナーゼ（Tagatose　6-phosphate　kinase：ｇａｔＺ）、ＤＮＡ結合型転写調節因子（DNA-binding　transcriptional　regulator：ｏｍｐＲ）、およびロイシン応答調節タンパク質（Leucine-responsive　regulatory　protein：ｌｒｐ）などを挙げることができるが、これらに限られるものではない。
　一実施形態において、アミノ酸合成酵素としては、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンから選択される１または複数のアミノ酸の合成に関与する酵素を挙げることができる。例示的なアミノ酸合成酵素としては、リジン生合成酵素をコードする遺伝子（dapA）、システイン合成酵素（cysteine　synthase　A: cysK、cysteine　synthase　B: cysM）、アミノデオキシコリスミ酸合成酵素（aminodeoxychorismate　synthase　subunit　2:pabA、aminodeoxychorismate　synthase　subunit　1: pabB）アミノデオキシコリスミ酸リアーゼ（aminodeoxychorismate　lyase:pabC）、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（serine　hydroxymethyltransferase : glyA）、グルタミン酸５－キナーゼ（glutamate　5-kinase: proB）グルタミン酸－５－セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（glutamate-5-semialdehyde　dehydrogenase : proA）、３－イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（3-isopropylmalate　dehydrogenase:leuB）、アラニンラセマーゼ（alanine　racemase　1 : alr、alanine　racemase　2 : dadX）、ホスホセリン／ホスホヒドロキシスレオニンアミノトランスフェラーゼ（phosphoserine/phosphohydroxythreonine　aminotransferase: serC）、アルギニノコハク酸リアーゼ（argininosuccinate　lyase : argH）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（histidinol　dehydrogenase: hisD）、スレオニンデアミナーゼ（threonine　deaminase: ilvA）、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ（diaminopimelate　decarboxylase:lysA）、ｏ－サクシニルホモセリン（チオール）－リアーゼ（O-succinylhomoserine(thiol)-lyase /O-succinylhomoserine　lyase: metB）、コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドラターゼ（fused　chorismate　mutase/prephenate　dehydratase:pheA）、ピロリン－５－カルボン酸レダクターゼ（pyrroline-5-carboxylate　reductase: proC）、スレオニン合成酵素（threonine　synthase:thrC）、インドール－３－グリセロールリン酸シンターゼ（fused　indole-3-glycerol　phosphate　synthase/phosphoribosylanthranilate　isomerase:trpC）、およびコリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドロゲナーゼ（fused　chorismate　mutase/prephenate　dehydrogenase:tyrA）を挙げることができる。本開示の一実施形態において、このようなアミノ酸合成酵素に改変を行うことで、当該アミノ酸合成酵素が合成に関与するアミノ酸に対して栄養要求性が生じるような微生物を生産することができる。
　一実施形態において、核酸合成酵素としては、任意の核酸の合成に関与する酵素を挙げることができる。本開示の一実施形態において、このような核酸合成酵素に改変を行うことで、当該核酸合成酵素が合成に関与する核酸に対して栄養要求性が生じるような微生物を生産することができる。一実施形態において、核酸合成酵素としては、例えば、チミジル酸合成酵素をコードする遺伝子（thyA）、5-(カルボキシアミノ)イミダゾールリボヌクレオチド合成酵素(5-(carboxyamino)imidazole　ribonucleotide　synthase:　purK)、ホスホリボシルグリシンアミド　ホルミルトランスフェラーゼ　1　(phosphoribosylglycinamide　formyltransferase　1:　purN)、ホスホリボシルグリシンアミド　ホルミルトランスフェラーゼ　2　(phosphoribosylglycinamide　formyltransferase　2:　purT)、アスパラギン酸カルバモイルトランスフェラーゼ触媒サブユニット(aspartate　carbamoyltransferase　catalytic　subunit:　pyrB)、ジヒドロオロターゼ（dihydroorotase:　pyrC）、ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ、タイプ　2　(dihydroorotate　dehydrogenase,　type　2:　pyrD)、オロチン酸ホスホリボシル基転移酵素(orotate　phosphoribosyltransferase:　pyrE)を挙げることができる。
　一実施形態において、ビタミン合成酵素としては、例えばビタミンＡ群、ビタミンＢ群、ビタミンＣ群、ビタミンＤ群、ビタミンＥ群、およびビタミンＫ群などから選択される１または複数のビタミンの合成に関与する酵素を挙げることができる。本開示の一実施形態において、このようなビタミン合成酵素に改変を行うことで、当該ビタミン合成酵素が合成に関与するビタミンに対して栄養要求性が生じるような微生物を生産することができる。一実施形態において、ビタミン合成酵素としては、例えば、チアミン生合成酵素の構造遺伝子（phosphomethylpyrimidine　synthase: thiC, thiamine　phosphate　synthase:thiE, sulfur　carrier　protein: thiS, adenylyltransferase: thiF, sulfur　carrier　proteinthiS: thiG, 1-deoxy-D-xylulose　5-phosphate:thiol　sulfurtransferase: thiG,2-iminoacetate　synthase: thiH）、３，４－ジヒドロキシ－２－ブタノン－４－リン酸シンターゼ（3,4-dihydroxy-2-butanone-4-phosphate　synthase:ribB）、リボフラビン合成酵素（riboflavin synthase: ribC）、ジアミノヒドロキシホスホリボシルアミノピリミジンデアミナーゼ／５－アミノ－６－（５－ホスホリボシルアミノ）ウラシルレダクターゼ（fused　diaminohydroxyphosphoribosylaminopyrimidine　deaminase/5-amino-6-(5-phosphoribosylamino)uracil　reductase:ribD）、キノリン酸シンターゼ（quinolinate　synthase: nadA）、アスパラギン酸オキシダーゼ（L-aspartate　oxidase:nadB）、パントテン酸合成酵素（pantothenate　synthetase: panC）、エリスロン酸－４－リン酸デヒドロゲナーゼ（erythronate-4-phosphatedehydrogenase: pdxB）、ピメロイルアシルキャリアタンパク質メチルエステルエステラーゼ（pimeloyl-acyl　carrier　protein　methyl　ester　esterase:bioH）、およびコバラミン非依存性ホモシステイントランスメチラーゼ（cobalamin-independent　homocysteine　transmethylase:metE）を挙げることができる。
　一実施形態において、本開示の微生物における少なくとも１つの遺伝子の改変は、標準的な分子生物学の手法を利用することができる。一実施形態において、改変は遺伝子における点変異を含むことができ、標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的にかつ正確に修飾するための方法として、例えば標的二本鎖ポリヌクレオチドと、Ｃａｓタンパク質と、ガイドＲＮＡとを接触させる方法、または標的二本鎖ポリヌクレオチドと、Ｃａｓタンパク質と核酸塩基変換酵素との複合体と、ガイドＲＮＡとを接触させる方法などを用いることができる。このような方法では、Ｃａｓ９タンパク質とガイドＲＮＡとが複合体を形成し、標的二本鎖ポリヌクレオチドに結合する。ここで、Ｃａｓ９タンパク質は、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを切断しないか又は一方の鎖のみを切断して、すなわち、二本鎖切断を起こすことなく、標的ポリヌクレオチド内の塩基配列を修飾する。一実施形態において、修飾は好ましくは一塩基単位で行われる。
　一実施形態において、上記の一塩基単位の特異的かつ正確な修飾（一塩基編集）は、好ましくは、複合体中の核酸塩基変換酵素を用いて行われる。核酸塩基変換酵素としては、デアミナーゼ（脱アミノ化酵素）が挙げられる。デアミナーゼとしては、例えば、シトシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ等を使用することができる。一実施形態における複合体は、係る核酸塩基変換酵素に加えて、Ｉｎｄｅｌ形成を阻害するため、ｕｒａｃｉｌ　ＤＮＡ　ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＵＧＩ）といったＩｎｄｅｌ形成阻害因子を含んでいてもよい。
　一実施形態において、上記の一塩基単位の特異的かつ正確な修飾（一塩基編集）は、核酸配列認識モジュールとＤＮＡグリコシラーゼとの複合体を用いた手法を利用することもでき、細胞内に導入された発現ベクター又はＲＮＡ分子から、核酸配列認識モジュールとＤＮＡグリコシラーゼとの複合体が発現すると、該核酸配列認識モジュールが目的の二本鎖ＤＮＡ（例、ゲノムＤＮＡ）内の標的ヌクレオチド配列を特異的に認識して結合し、該核酸配列認識モジュールに連結されたＤＮＡグリコシラーゼの作用により、標的化された部位（標的ヌクレオチド配列の全部もしくは一部又はそれらの近傍を含む数百塩基の範囲内で適宜調節できる）のセンス鎖もしくはアンチセンス鎖で脱塩基反応が起こり、二本鎖ＤＮＡの一方の鎖に無塩基部位（ＡＰ部位）が生じる。すると、細胞内の塩基除去修復（ＢＥＲ）系が作動し、まずＡＰエンドヌクレアーゼがＡＰ部位を認識してＤＮＡ片鎖のリン酸結合を切断し、エキソヌクレアーゼが脱塩基されたヌクレオチドを除去する。次にＤＮＡポリメラーゼが反対鎖ＤＮＡを鋳型として新たにヌクレオチドを挿入し、最後にＤＮＡリガーゼが繋ぎ目を修復する。このＢＥＲのいずれかの段階で修復ミスが起こることにより、種々の変異が導入される。上述のように、酵素活性を失っているがＡＰ部位への結合能を保持する変異ＡＰエンドヌクレアーゼを併用することにより、細胞内のＢＥＲ機構が阻害され、修復ミスの頻度、したがって変異導入効率を向上させることができる。
　ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、標的ヌクレオチド配列に対して相補的なガイドＲＮＡにより目的の二本鎖ＤＮＡの配列を認識するので、標的ヌクレオチド配列と特異的にハイブリッド形成し得るオリゴＲＮＡおよび／またはオリゴＤＮＡを合成するだけで、任意の配列を標的化することができ、しかも標的化された部位において、二本鎖ＤＮＡをほどいて一本鎖構造の領域と、それに隣接する緩んだ二本鎖ＤＮＡ構造をとる領域とを生成するため、二本鎖ＤＮＡの構造を変化させる因子を組み合わせることなく、標的化された部位特異的に核酸塩基変換酵素やＤＮＡグリコシラーゼを効率よく作用させることができる。したがって、本開示のより好ましい実施態様においては、核酸配列認識モジュールとして、Ｃａｓの少なくとも１つのＤＮＡ切断能を持たないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム（ＣＲＩＳＰＲ－変異Ｃａｓ）、またはＣａｓの両方のＤＮＡ切断能を持たないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム（ＣＲＩＳＰＲ－変異Ｃａｓ）を好ましく用いることができる。
　ＣＲＩＳＰＲ－変異Ｃａｓを用いた本開示の核酸配列認識モジュールは、標的ヌクレオチド配列と相補的なガイドＲＮＡと、変異Ｃａｓタンパク質のリクルートに必要なｔｒａｃｒＲＮＡとからなるＲＮＡ分子と変異Ｃａｓタンパク質との複合体として提供される。
　一実施形態において、改変はｉｎ　ｖｉｖｏ又はｉｎ　ｖｉｔｒｏの任意の環境で行うことができる。一実施形態において、改変は、生体外、すなわちｅｘ　ｖｉｖｏ又はｉｎ　ｖｉｔｒｏで行うこともできる。
　本開示の一実施形態において、本開示の微生物における少なくとも１つの遺伝子の改変は、上記のような手法により、終止コドンを生じさせる変異を含むことができる。これにより、当該遺伝子がコードするタンパク質が通常有する機能または活性を低減または欠損させることができる。
　本開示の一実施形態において、本開示の微生物における少なくとも１つの遺伝子の改変は、ある１つの遺伝子において少なくとも２ヶ所、３ヶ所、４ヶ所、５ヶ所、６ヶ所、７ヶ所、または８ヶ所の変異を含むことができる。ある１つの遺伝子において少なくとも２ヶ所の変異を生じさせることで、当該遺伝子によってコードされるタンパク質が通常有する機能が実質的に回復しないものとすることができる。
　本開示の一実施形態において、微生物における少なくとも１つの遺伝子の改変は、塩基編集、好ましくは一塩基編集によって行うことが好ましい。遺伝子組換え技術を利用して作出した必須遺伝子欠損大腸菌株を対象に、生育必須物質（核酸またはアミノ酸）を添加しない液体培地中の濁度を指標にした生育曲線を描くと、培養開始から一定時間は生育が見られない。例えば、Sci　Transl　Med.　2019　Jan　16;11(475):eaau7975およびNat　Biotechnol.　2018　Oct;36(9):857-864において、少なくとも１６時間まで生育しないことが示されている。しかし、遺伝子組換え技術を利用して作出した単―の必須遺伝子を欠損させた大腸菌株を１００時間以上培養すると、生育が見られることを本発明者らは本開示の過程を通じて見出している。
　本開示の一実施形態において、本開示の微生物における少なくとも１つの遺伝子の改変は、少なくとも２種の遺伝子におけるそれぞれ少なくとも１ヶ所の変異を含むことができ、例えば少なくとも２種の遺伝子は、必須遺伝子、薬効関連遺伝子、形態関連遺伝子、および定着性関連遺伝子からなる群からそれぞれ独立して選択されることができる。他の実施形態において、本開示の微生物における少なくとも１つの遺伝子の改変は、少なくとも２種の遺伝子におけるそれぞれ少なくとも２ヶ所の変異を含むことができる。少なくとも２種の遺伝子においてそれぞれ少なくとも１ヶ所または少なくとも２ヶ所の変異を生じさせることで、１種の遺伝子を改変させた場合と比較して、当該遺伝子によってコードされるタンパク質が通常有する機能が復帰するような変異が生じる割合を減少させることができる。理論に縛られるものではないが、これは１種の遺伝子にのみ変異を加えた場合は、他の経路によって相補されて機能が復帰する可能性があるものの、２種の遺伝子に変異を導入することにより、他の経路による相補的な機能の復帰を回避することができると考えられる。
　一実施形態において、本開示は、例えば、これに限られないが、生理的に補完関係にない独立した２つの生育必須物質の生合成遺伝子を対象に、各遺伝子配列内に終止コドンを導入し、デュアル生合成遺伝子ノックアウト編集株を塩基編集技術により作出することができる。
　一実施形態において、本開示によれば、生体内では良好に増殖するが、体外排出後では生育できないという２つの条件を同時に満たすことを実現する改変微生物を提供することができる。理論に縛られるものではないが、２遺伝子をデュアルに機能欠損させることの意義は、１遺伝子内に２つの終止コドンを導入するダブル変異株を作出しても、１つのバイパス経路が補完もしくは代替すれば、非増殖性の付与効果が一度に消失してしまう可能性があり、この可能性を限りなく阻止することにある。微生物の突然変異発生頻度は、１０６から１０７コロニー形成単位（ＣＦＵ）につき１回程度であるため、２遺伝子にデュアルに復帰変異や代替遺伝子に変異が入る確率は、理論上、１０１２から１０１４ＣＦＵにつき１回程度である。１回の臨床想定投与菌数が最大１０９から１０１０ＣＦＵであることを踏まえると、２遺伝子にデュアル変異が同時に入ることはあり得ない、もしくは、可能性は限りなく低くできる。
　一実施形態において、改変の対象となる必須遺伝子は、対象微生物がその生合成遺伝子もしくはその関連遺伝子を有し、２遺伝子が機能的に補完関係にないことが好ましい。これにより、２遺伝子のデュアル機能欠損株が、通常の環境下では生育できず死滅する状況を作為的に作り出すことが可能であり、対象微生物の生育のためには周辺環境から２つの生育必須物質の同時補給に完全に依存する条件を課すことができる。例えば、生体の腸内環境を志向する場合、生体由来の核酸関連物質、食事由来の必須アミノ酸関連物質や必須ビタミン関連物質が存在する環境下においてのみ、当該微生物が生存できるように生存の場を限定できる。他の実施形態において、体外排出後の環境中には存在しないか、仮に存在したとしても対象微生物が長期間生育できないことが成立する生育必須物質およびその生合成遺伝子を選択することも好ましい。
　復帰変異の出現率は任意の手法で測定することができるが、例えば、一実施形態において、復帰変異の出現率は以下の計算式によって算出することができる。
（復帰変異株出現率）＝（培地に出現したコロニー数）／（培地に塗抹した菌液の総菌数）
　一実施形態において、本開示の微生物は、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ）、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅ）、アクチノ細菌（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、プロテオ細菌（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、フソバクテリア門（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ）又はウェルコミクロビウム門（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ）の門のメンバー及びバクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、アリスティペス（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）、フィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、パラバクテロイデス（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、ロセブリア（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、オシリバクター（Ｏｓｃｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ）、ジェミガー（Ｇｅｍｍｉｇｅｒ）、バルネシエラ（Ｂａｒｎｅｓｉｅｌｌａ）、ディアリスター（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ）、パラステレラ（Ｐａｒａｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、ファスコラークトバクテリウム（Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サテレラ（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、ブラウティア（Ｂｌａｕｔｉａ）、パラプレボテラ（Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、コプロコッカス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ）、オドリバクター（Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ）、スピロプラズマ（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ）、アナエロスティペス（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ）、アッケルマンシア（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ）、ラクトバチラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アッカーマンシア（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ）、メガスファエラ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）、ユーバクテリウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バリアトリクス（Ｂａｒｉａｔｒｉｃｕｓ）、エリュシペラトクロスチリジウム（Ｅｒｙｓｉｐｅｌａｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードフラボニフラクター（Ｐｓｅｕｄｏｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ）、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）、エリシペロトリクス科細菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ）オシロスピラ科細菌（Ｏｓｃｉｌｌｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）、フィーカリカテナ（Ｆａｅｃａｌｉｃａｔｅｎａ）属の細菌、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｃｏｃｕｓ　ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｈｉｒａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｎｄｔｉｉ、Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｇａｓｓｅｒｉ、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ　ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐｐ．、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｎｉｍａｌｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｒｅｖｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｃｒｉｓｔａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　aｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｃｏｃｌｅａｔｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓａｃｃｈａｒｏｇｕｍｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐｉｒｏｆｏｒｍｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｉｎｎｏｃｕｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｒａｍｏｓｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｈａｔｈｅｗａｙｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｃｉｎｄｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｂｏｌｔｅａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｉｎｄｏｌｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｌａｖａｌｅｎｓｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ａｓｐａｒａｇｉｆｏｒｍｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｓｙｍｂｉｏｓｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａ　ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｂｌａｕｔｉａ　ｓｔｅｒｃｏｒｉｓ、Ｂｌａｕｔｉａ　ｗｅｘｌｅｒａｅ、Ｂｌａｕｔｉａ　ｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｂｌａｕｔｉａ　ｃｏｃｃｏｉｄｅｓ、Ｂｌａｕｔｉａ　ｈａｎｓｅｎｉｉ、Ｂｌａｕｔｉａ　ｆａｅｃｉｓ、Ｂｌａｕｔｉａ　ｇｌｕｃｅｒａｓｅａ、Ｂｌａｕｔｉａ　ｌｕｔｉ、Ｂｌａｕｔｉａ　ｓｃｈｉｎｋｉｉ、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ　ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ　ｅｌｓｄｅｎｉｉ、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ　ｉｎｄｉｃａ、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ　ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ　ｓｕｅｃｉｅｎｓｉｓ、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ　ｍｉｃｒｏｎｕｃｉｆｏｒｍｉｓ、Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ　ｈｅｘａｎｏｉｃａ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｃｏｎｔｏｒｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｉｓｓｉｃａｔｅｎａ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｅｃｔａｌｅ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｃａｌｌａｎｄｅｒｉ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈａｌｌｉｉ、Ｂａｒｉａｔｒｉｃｕｓ　ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｈａｄｒｕｓ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｂｕｔｙｒａｔｉｃｕｓ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｒｈａｍｎｏｓｉｖｏｒａｎｓ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ　ｃａｃｃａｅ、Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ　ｃｏｌｉｈｏｍｉｎｉｓ、Ｆａｅｃａｌｉｃａｔｅｎａ　ｆｉｓｓｉｃａｔｅｎａ、Ｆａｅｃａｌｉｃａｔｅｎａ　ｃｏｎｔｏｒｔａ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌａｔｏｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｒａｍｏｓｕｍ、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｍｅｒｄａｅ、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｇｏｌｄｓｔｅｉｎｉｉ、Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ　ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ　ｃｅｌｌｉｃｏｌａ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ　ｃｌａｕｓｓｅｎｉｉ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ　ｄａｍｎｏｓｕｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｔｈａｎｏｌｉｄｕｒａｎｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ　ｉｎｏｐｉｎａｔｕｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ　ｐａｒｖｕｌｕｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｔｉｌｅｓｉｉ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ　ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ　ｆａｅｃｉｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ　ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ　ｃｅｃｉｃｏｌａ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ　ｉｎｕｌｉｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｃｏｐｒｏｃｏｌａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｓｐ．、Ｐｓｅｕｄｏｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ　ｃａｐｉｌｌｏｓｕｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ　ｓｐ．、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．、Ｏｓｃｉｌｌｏｓｐｉｒａｃｅａｅ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｏｓｃｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ　ｖａｌｅｒｉｃｉｇｅｎｅｓ、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｒｅｕｔｅｒｉなどが挙げられる。
　一実施形態において、本開示の微生物は、対象の腸内、口腔、および／または皮膚などに生息することができ、例えば、対象の糞便中の全培養可能微生物の少なくとも約０．１％、少なくとも約０．５％、少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％超を構成する属のものである。対象の腸又は糞便中の微生物は、１６Ｓリボソーム配列決定を含む当技術分野で公知の任意の技術によって分析することができる。例えばバクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）は、ヒト腸内で最も天然に豊富な属であり、例示的なバクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）種としては、Ｂ．アシジファシエンス（Ｂ．ａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．アミロフィルス（Ｂ．ａｍｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アサッカロリチクス（Ｂ．ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、Ｂ．バルネシアエス（Ｂ．ｂａｒｎｅｓｉａｅｓ）、Ｂ．ビビウス（Ｂ．ｂｉｖｉｕｓ）、Ｂ．ブッカエ（Ｂ．ｂｕｃｃａｅ）、Ｂ．ブッカリス（Ｂ．ｂｕｃｃａｌｉｓ）、Ｂ．カッカエ（Ｂ．ｃａｃｃａｅ）、Ｂ．カエシコラ（Ｂ．ｃａｅｃｉｃｏｌａ）、Ｂ．カエシガリナルム（Ｂ．ｃａｅｃｉｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、Ｂ．カピロサス（Ｂ．ｃａｐｉｌｌｏｓｕｓ）、Ｂ．カピルス（Ｂ．ｃａｐｉｌｌｕｓ）、Ｂ．セルロシリチクス（Ｂ．ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓ）、Ｂ．セルロソルベンス（Ｂ．ｃｅｌｌｕｌｏｓｏｌｖｅｎｓ）、Ｂ．チンチラ（Ｂ．ｃｈｉｎｃｈｉｌｌａ）、Ｂ．クラルス（Ｂ．ｃｌａｒｕｓ）、Ｂ．コアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．コプロコラ（Ｂ．ｃｏｐｒｏｃｏｌａ）、Ｂ．コプロフィルス（Ｂ．ｃｏｐｒｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．コプロスイス（Ｂ．ｃｏｐｒｏｓｕｉｓ）、Ｂ．コルポリス（Ｂ．ｃｏｒｐｏｒｉｓ）、Ｂ．デンチコラ（Ｂ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、Ｂ．ジシエンス（Ｂ．ｄｉｓｉｅｎｓ）、Ｂ．ジスタソニス（Ｂ．ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ）、Ｂ．ドレイ（Ｂ．ｄｏｒｅｉ）、Ｂ．エゲルチイ（Ｂ．ｅｇｇｅｒｔｈｉｉ）、Ｂ．エンドドンタリス（Ｂ．ｅｎｄｏｄｏｎｔａｌｉｓ）、Ｂ．ファエシチンチラエ（Ｂ．ｆａｅｃｉｃｈｉｎｃｈｉｌｌａｅ）、Ｂ．ファエシス（Ｂ．ｆａｅｃｉｓ）、Ｂ．フィネゴルジイ（Ｂ．ｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ）、Ｂ．フルクスス（Ｂ．ｆｌｕｘｕｓ）、Ｂ．フォルシスス（Ｂ．ｆｏｒｓｙｔｈｕｓ）、Ｂ．フラギリス（Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）、Ｂ．フルコスス（Ｂ．ｆｕｒｃｏｓｕｓ）、Ｂ．ガラクツロニクス（Ｂ．ｇａｌａｃｔｕｒｏｎｉｃｕｓ）、Ｂ．ガリナセウム（Ｂ．ｇａｌｌｉｎａｃｅｕｍ）、Ｂ．ガリナルム（Ｂ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、Ｂ．ギンギバリス（Ｂ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、Ｂ．ゴルドステイニイ（Ｂ．ｇｏｌｄｓｔｅｉｎｉｉ）、Ｂ．グラシリス（Ｂ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）、Ｂ．グラミニソルベンス（Ｂ．ｇｒａｍｉｎｉｓｏｌｖｅｎｓ）、Ｂ．ヘルコゲネス（Ｂ．ｈｅｌｃｏｇｅｎｅｓ）、Ｂ．ヘパリノリチクス（Ｂ．ｈｅｐａｒｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）、Ｂ．ヒペルメガス（Ｂ．ｈｙｐｅｒｍｅｇａｓ）、Ｂ．インテルメジウス（Ｂ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、Ｂ．インテスチナリス（Ｂ．ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、Ｂ．ジョンソニイ（Ｂ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、Ｂ．レビイ（Ｂ．ｌｅｖｖｉ）、Ｂ．ロエシェイイ（Ｂ．ｌｏｅｓｃｈｅｉｉ）、Ｂ．ルチ（Ｂ．ｌｕｔｉ）、Ｂ．マカカエ（Ｂ．ｍａｃａｃａｅ）、Ｂ．マシリエンシス（Ｂ．ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、Ｂ．メラニノゲニクス（Ｂ．ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ）、Ｂ．メルダエ（Ｂ．ｍｅｒｄａｅ）、Ｂ．ミクロフスス（Ｂ．ｍｉｃｒｏｆｕｓｕｓ）、Ｂ．ムルアチアシヅス（Ｂ．ｍｕｌｔｉａｃｉｄｕｓ）、Ｂ．ノドスス（Ｂ．ｎｏｄｏｓｕｓ）、Ｂ．ノルジイ（Ｂ．ｎｏｒｄｉｉ）、Ｂ．オクラセウス（Ｂ．ｏｃｈｒａｃｅｕｓ）、Ｂ．オレイシプレヌス（Ｂ．ｏｌｅｉｃｉｐｌｅｎｕｓ）、Ｂ．オラリス（Ｂ．ｏｒａｌｉｓ）、Ｂ．オリス（Ｂ．ｏｒｉｓ）、Ｂ．オウロルム（Ｂ．ｏｕｌｏｒｕｍ）、Ｂ．オバタス（Ｂ．ｏｖａｔｕｓ）、Ｂ．パウロサッカロリチクス（Ｂ．ｐａｕｒｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、Ｂ．ペクチノフィルス（Ｂ．ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．ペントサセウス（Ｂ．ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）、Ｂ．プレベイウス（Ｂ．ｐｌｅｂｅｉｕｓ）、Ｂ．ニューモシンテス（Ｂ．ｐｎｅｕｍｏｓｉｎｔｅｓ）、Ｂ．ポリプラグマツス（Ｂ．ｐｏｌｙｐｒａｇｍａｔｕｓ）、Ｂ．プラエアクツス（Ｂ．ｐｒａｅａｃｕｔｕｓ）、Ｂ．プロピオニシファシエンス（Ｂ．ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．プトレジニス（Ｂ．ｐｕｔｒｅｄｉｎｉｓ）、Ｂ．ピオゲネス（Ｂ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｂ．レチキュロテルミチス（Ｂ．ｒｅｔｉｃｕｌｏｔｅｒｍｉｔｉｓ）、Ｂ．ロデンチウム（Ｂ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ）、Ｂ．ルミニコラ（Ｂ．ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ）、Ｂ．サラニトロニス（Ｂ．ｓａｌａｎｉｔｒｏｎｉｓ）、Ｂ．サリボスス（Ｂ．ｓａｌｉｖｏｓｕｓ）、Ｂ．サリエルシアエ（Ｂ．ｓａｌｙｅｒｓｉａｅ）、Ｂ．サルトリイ（Ｂ．ｓａｒｔｏｒｉｉ）、Ｂ．セジメント（Ｂ．ｓｅｄｉｍｅｎｔ）、Ｂ．スプランクニクス（Ｂ．ｓｐｌａｎｃｈｎｉｃｕｓ）、Ｂ．ステルコリロソリス（Ｂ．ｓｔｅｒｃｏｒｉｒｏｓｏｒｉｓ）、Ｂ．ステルコリス（Ｂ．ｓｔｅｒｃｏｒｉｓ）、Ｂ．スシノゲネス（Ｂ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、Ｂ．スイス（Ｂ．ｓｕｉｓ）、Ｂ．テクツス（Ｂ．ｔｅｃｔｕｓ）、Ｂ．テルミチジス（Ｂ．ｔｅｒｍｉｔｉｄｉｓ）、Ｂ．テタイオタオミクロン（Ｂ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）、Ｂ．ウレフォルミス（Ｂ．ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．ウレオリチクス（Ｂ．ｕｒｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）、Ｂ．ベロラリス（Ｂ．ｖｅｒｏｒａｌｉｓ）、Ｂ．ブルガツス（Ｂ．ｖｕｌｇａｔｕｓ）、Ｂ．キシラニソルベンス（Ｂ．ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ）、Ｂ．キシラノリチクス（Ｂ．ｘｙｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）又はＢ．ズーグレオフォンナンス（Ｂ．ｚｏｏｇｌｅｏｆｏｎｎａｎｓ）を挙げることができる。また口腔細菌としてはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｌｉｖａｒｉｕｓなどを、皮膚常在菌としてはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓなどをそれぞれ挙げることができる。
　一実施形態において、本開示の微生物は、ヒト腸内、口腔、および／または皮膚で安定にコロニー形成することができる。本開示の微生物は、例えば、改変されていない同一のまたは類似の微生物と比較して、腸内において増加した存在量、安定性、または初期コロニー形成の容易さで対象の腸内にコロニー形成することができる。
　一実施形態において、本開示の微生物は、治療用の関連遺伝子をさらに含むことができる。このような治療用の関連遺伝子は微生物がもとからもっているものでもよく、または所望の効果を発揮する遺伝子をそのまま、または一部改変して導入することもできる。一実施形態において、治療用の関連遺伝子は、Ｉ型線毛Ｄ－マンノース特異的アドヘシン（Type　1　fimbrin　D-mannose　specific　adhesin：fimH）などを挙げることができる。一実施形態において、本開示の微生物は、診断用の関連遺伝子をさらに含むことができる。このような診断用の関連遺伝子は微生物がもとからもっているものでもよく、または所望の効果を発揮する遺伝子をそのまま、または一部改変して導入することもできる。一実施形態において、診断用の関連遺伝子は、細菌のアクチン様細胞骨格タンパク質（Cell　shape-determining　protein：mreB）などを挙げることができる。一実施形態において、本開示の微生物は、定着性に関連する遺伝子をさらに含むことができる。このような定着性に関連する遺伝子は微生物がもとからもっているものでもよく、または所望の効果を発揮する遺伝子をそのまま、または一部改変して導入することもできる。一実施形態において、定着性に関連する遺伝子は、ＤＮＡ結合型転写活性化因子（DNA-binding　transcriptional　activator）ｆｌｈＤなどを挙げることができる。
　一実施形態において、一塩基編集の結果として導入される終止コドンの影響によって、標的タンパク質の機能的発現を阻害することができる。微生物が複数のタンパク質をコードする遺伝子又は核酸を含む場合、タンパク質の２つ以上をコードするオープンリーディングフレームは、例えば、単一のオペロンに存在し得ることが意図される。
　本開示の一実施形態において、本開示の微生物は、治療用製剤として利用することもでき、そのような治療用製剤は、例えば治療上有効の量の本開示の微生物を、例えば微生物の重量比で、少なくとも約０．０１％、約０．０５％、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１．０％，約１．５％、約２．０％、約３．０％、約４．０％、約５．０％、約６．０％、約７．０％、約８．０％、約９．０％、約１０．０％、約１１．０％、約１２．０％、約１３．０％、約１４．０％、約１５．０％、約１６．０％、約１７．０％、約１８．０％、約１９．０％、約２０．０％、約２５．０％、約３０．０％、約３５．０％、約４０．０％、約４５．０％、約５０．０％またはそれ以上含むことが可能である。
　本開示の他の局面において、少なくとも１つの遺伝子が改変された微生物を生産する方法であって、該少なくとも１つの遺伝子を改変する工程であって、該微生物内において、該遺伝子の標的核酸配列の１またはそれ以上のヌクレオチドを他のヌクレオチドに変換し、もしくは欠失させ、または該遺伝子の標的核酸配列に１またはそれ以上のヌクレオチドを挿入する、改変する工程、を含み、該改変は、該遺伝子によってコードされるタンパク質が通常有する機能が実質的に回復しないものである、方法が提供される。本開示の一実施形態において、本開示の方法は、本明細書の他の箇所で説明した任意の特徴を備えることができる。
　（一般技術）
　本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．（１９８９）．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ　Ｅｄ．（２００１）；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．（１９８９）．　Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；　Ｉｎｎｉｓ，　Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：　Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．　（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；　Ｉｎｎｉｓ，　Ｍ．Ａ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ　Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｗｉｌｅｙ，　ａｎｄ　ａｎｎｕａｌ　ｕｐｄａｔｅｓ；　Ｓｎｉｎｓｋｙ，　Ｊ．Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９９）．　ＰＣＲ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｆｏｒ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
　人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えばＧｅｎｅＡｒｔ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）などの遺伝子合成やフラグメント合成サービスを用いることもでき、その他、例えば、Ｇａｉｔ，　Ｍ．Ｊ．（１９８５）．　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ；　Ｇａｉｔ，　Ｍ．Ｊ．（１９９０）．　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ；　Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，　Ｆ．（１９９１）．　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ；　Ａｄａｍｓ，　Ｒ．Ｌ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９２）．　Ｔｈｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ，　Ｃｈａｐｍａｎ　＆　Ｈａｌｌ；　Ｓｈａｂａｒｏｖａ，　Ｚ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ，　Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；　Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，　Ｇ．Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９６）．　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　ｉｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ；　Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，　Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．　Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
　本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも１つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「２つの値」の「範囲内」と明記した場合、その範囲には２つの値自体も含む。
　本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
　以上、本開示を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本開示を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本開示を限定する目的で提供したのではない。従って、本開示の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、請求の範囲によってのみ限定される。
（実施例１：非増殖性試験）
　培地および培養条件
　本実施例は、ＬＢ　Ｂｒｏｔｈ，　Ｍｉｌｌｅｒ（ＬＢ液体培地）（ナカライテスク株式会社）を用いて実施した。ノックアウト株の液体培養は、最終濃度１０　ｍＭ　チミジン（東京化成工業株式会社）または１００μｇ／ｍＬ　２，６－ジアミノピメリン酸（東京化成工業株式会社）を添加したＬＢ液体培地を使用し、３７℃、２００ｒｐｍ振盪条件下にて培養した。静置培養は、最終濃度　３ｍＭチミジンまたは１００μｇ／ｍＬ　２，６－ジアミノピメリン酸を添加したＬＢ寒天培地を用いて実施した。
　供試菌株
　野生株として、Ａｍｅｒｉｃａｎ　ｔｙｐｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　（ＡＴＣＣ）より入手したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＡＴＣＣ　４７０７６株を使用した。ゲノム編集株として、核酸合成に関与するｔｈｙｍｉｄｙｌａｔｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ（ｔｈｙＡ）、必須アミノ酸合成に関与する４－ｈｙｄｒｏｘｙ－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｄｉｐｉｃｏｌｉｎａｔｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ（ｄａｐＡ）をコードする各遺伝子をゲノム編集によりノックアウトした株を作出した（表１）。
　非増殖性試験
　各添加物を含有したＬＢ液体培地にて一晩培養した菌株０．５ｍＬを新しく調製した培地２０ｍＬに植菌した。一晩培養した菌量が十分でない場合は、一晩培養した菌液１ｍＬを新しく調製した培地４０ｍＬに植菌した。３７℃、２００ｒｐｍ旋回培養にて菌液の濁度ＯＤ６００が１．５以上になるまで培養した。
　菌体を遠心分離（２０℃，３，０００ｒｐｍ，１５分間）により集菌後、１０ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ溶液）を用いて洗浄した。さらに、２ｍＬのＰＢＳ溶液にて菌体を洗浄後、１．５ｍＬのＰＢＳ溶液に菌体を再懸濁し、菌液の濁度ＯＤ６００を測定した。
　回収した菌液のうち１ｍＬを１００μＬずつ１０枚のＬＢ寒天培地へ塗抹し、３７℃にて培養した。ｄａｐＡノックアウト株のみ回収した菌液のうち１ｍＬをＰＢＳ溶液にて２倍希釈後、１００μＬずつ２０枚のＬＢ寒天培地へ塗抹し、３７℃にて培養した。
　塗抹した菌液の総菌数を確認するため、塗抹した菌液の残液をＰＢＳ溶液にて１０７倍に希釈後、各１００μＬを各添加物含有ＬＢ寒天培地へ塗抹した。３７℃にて一晩培養後、出現したコロニー数より塗抹菌液の総菌数を算出した。
　復帰変異出現率は、下記の計算式により算出した。
（復帰変異株出現率）＝（ＬＢ寒天培地に出現したコロニー数）／（塗抹した菌液の総菌数）
　この試験に供する菌液の総菌数は、１０１０　ｃｆｕ以上となるものを使用した。
　結果
回収菌液の総菌数
　非増殖性試験へ供したゲノム編集菌の総菌数を表２に示した。各菌株とも１×１０１０ｃｆｕ以上であった。
　非増殖性試験結果
　ｔｈｙＡ遺伝子ノックアウト株（ＢＰ２０３７，　ＢＰ２０４０，　ＢＰ２０４３）、ｄａｐＡ遺伝子ノックアウト株（ＢＰ２０６７，　ＢＰ２０８８，　ＢＰ２２３９）、ｔｈｙＡおよびｄａｐＡ遺伝子の二重ノックアウト株（ＢＰ２２３０，　ＢＰ２２３３）の非増殖性を確認した結果を図１に示した。またＬＢ寒天培地上に出現したコロニー数（表３）より、復帰変株出現率を算出した（図１）。
　培養７２時間後に出現したコロニー数より復帰変異株出現率を算出した結果、１アミノ酸を終止コドンに置換したｔｈｙＡまたはｄａｐＡノックアウト株（ＢＰ２０３７，　ＢＰ２０４０，　ＢＰ２０６７，　ＢＰ２０８８）に比べ、生理的機能の異なる２つの各遺伝子内に終止コドンを各１ヶ所ずつ置換したｔｈｙＡ－ｄａｐＡ二重ノックアウト株（ＢＰ２２３０，　ＢＰ２２３３）株の方が復帰変異株出現率の減少が証明された。
　（注記）
　以上のように、本開示の好ましい実施形態を用いて本開示を例示してきたが、本開示は、請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願及び他の文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本出願は、日本国特許庁に２０２２年１１月４日に出願された特願２０２２－１７７７０３に対して優先権主張を伴うものであり、その内容は、本願においてすべての内容が参考として援用される。
　本開示の微生物によって、細菌製剤の品質および安全性を担保し、環境中やヒトへの伝播および／または拡散を防止することが可能になるため、医療分野において幅広い応用が期待できる。
配列番号１：ｔｈｙＡの核酸配列
配列番号２：ｔｈｙＡのアミノ酸配列
配列番号３：ｄａｐＡの核酸配列
配列番号４：ｄａｐＡのアミノ酸配列

Claims (26)

  1. 　微生物であって、該微生物における少なくとも１つの遺伝子が改変されており、該改変は、該遺伝子によってコードされるタンパク質が通常有する機能が実質的に回復しないものである、微生物。
  2. 　前記遺伝子が、必須遺伝子、薬効関連遺伝子、形態関連遺伝子、および定着性関連遺伝子からなる群から選択される、請求項１に記載の微生物。
  3. 　前記遺伝子が必須遺伝子であり、前記改変は、該必須遺伝子によってコードされるタンパク質が通常有する活性が低減または欠損した場合に、前記微生物が、環境または対象において実質的に伝播しない改変である、請求項１または２に記載の微生物。
  4. 　前記必須遺伝子が、アミノ酸合成酵素、核酸合成酵素、およびビタミン合成酵素をコードする遺伝子からなる群から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の微生物。
  5. 　前記アミノ酸合成酵素が、リジン生合成酵素をコードする遺伝子（ｄａｐＡ）、ｃｙｓＫ、ｃｙｓＭ、ｐａｂＡ、ｐａｂＢ、ｐａｂＣ、ｇｌｙＡ、ｐｒｏＢ、ｐｒｏＡ、ｌｅｕＢ、ａｌｒ、ｄａｄＸ、ｓｅｒＣ、ａｒｇＨ、ｈｉｓＤ、ｉｌｖＡ、ｌｅｕＢ、ｌｙｓＡ、ｍｅｔＢ、ｐｈｅＡ、ｐｒｏＣ、ｔｈｒＣ、ｔｒｐＣ、およびｔｙｒＡからなる群から選択される、請求項４に記載の微生物。
  6. 　前記核酸合成酵素が、チミジル酸合成酵素をコードする遺伝子（ｔｈｙＡ）、ｐｕｒＫ、ｐｕｒＮ、ｐｕｒＴ、ｐｙｒＢ、ｐｙｒＣ、ｐｙｒＤ、およびｐｙｒＥからなる群から選択される、請求項４に記載の微生物。
  7. 　前記ビタミン合成酵素が、ｔｈｉＣ、ｔｈｉＥ、ｔｈｉＦ、ｔｈｉＳ、ｔｈｉＧ、ｔｈｉＨ、ｒｉｂＢ、ｒｉｂＣ、ｒｉｂＤ、ｎａｄＡ、ｎａｄＢ、ｐａｎＣ、ｐｄｘＢ、ｂｉｏＨ、およびｍｅｔＥからなる群から選択される、請求項４に記載の微生物。
  8. 　前記改変が、前記遺伝子における点変異を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の微生物。
  9. 　前記改変が、終止コドンを生じさせる変異を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の微生物。
  10. 　前記改変が、前記少なくとも１つの遺伝子における少なくとも２ヶ所の変異を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の微生物。
  11. 　前記改変が、少なくとも２種の遺伝子におけるそれぞれ少なくとも１ヶ所の変異を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の微生物。
  12. 　前記改変が、少なくとも２種の遺伝子におけるそれぞれ少なくとも２ヶ所の変異を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の微生物。
  13. 　前記少なくとも２種の遺伝子が、必須遺伝子、薬効関連遺伝子、形態関連遺伝子、および定着性関連遺伝子からなる群からそれぞれ独立して選択される、請求項１１または請求項１２に記載の微生物。
  14. 　少なくとも１つの遺伝子が改変された微生物を生産する方法であって、
    　該少なくとも１つの遺伝子を改変する工程であって、該微生物内において、該遺伝子の標的核酸配列の１またはそれ以上のヌクレオチドを他のヌクレオチドに変換し、もしくは欠失させ、または該遺伝子の標的核酸配列に１またはそれ以上のヌクレオチドを挿入する、改変する工程、
    を含み、該改変は、該遺伝子によってコードされるタンパク質が通常有する機能が実質的に回復しないものである、方法。
  15. 　前記遺伝子が、必須遺伝子、薬効関連遺伝子、形態関連遺伝子、および定着性関連遺伝子からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
  16. 　前記遺伝子が必須遺伝子であり、前記改変は、該必須遺伝子によってコードされるタンパク質が通常有する活性が低減または欠損した場合に、前記微生物が、環境または対象において実質的に伝播しない改変である、請求項１４または１５に記載の方法。
  17. 　前記必須遺伝子が、アミノ酸合成酵素、核酸合成酵素、およびビタミン合成酵素からなる群から選択される、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 　前記アミノ酸合成酵素が、リジン生合成酵素をコードする遺伝子（ｄａｐＡ）、ｃｙｓＫ、ｃｙｓＭ、ｐａｂＡ、ｐａｂＢ、ｐａｂＣ、ｇｌｙＡ、ｐｒｏＢ、ｐｒｏＡ、ｌｅｕＢ、ａｌｒ、ｄａｄＸ、ｓｅｒＣ、ａｒｇＨ、ｈｉｓＤ、ｉｌｖＡ、ｌｅｕＢ、ｌｙｓＡ、ｍｅｔＢ、ｐｈｅＡ、ｐｒｏＣ、ｔｈｒＣ、ｔｒｐＣ、およびｔｙｒＡからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
  19. 　前記核酸合成酵素が、チミジル酸合成酵素をコードする遺伝子（ｔｈｙＡ）、ｐｕｒＫ、ｐｕｒＮ、ｐｕｒＴ、ｐｙｒＢ、ｐｙｒＣ、ｐｙｒＤ、およびｐｙｒＥからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
  20. 　前記ビタミン合成酵素が、ｔｈｉＣ、ｔｈｉＥ、ｔｈｉＦ、ｔｈｉＳ、ｔｈｉＧ、ｔｈｉＨ、ｒｉｂＢ、ｒｉｂＣ、ｒｉｂＤ、ｎａｄＡ、ｎａｄＢ、ｐａｎＣ、ｐｄｘＢ、ｂｉｏＨ、およびｍｅｔＥからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
  21. 　前記改変が、前記遺伝子における点変異を含む、請求項１４～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 　前記改変が、終止コドンを生じさせる変異を含む、請求項１４～２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 　前記改変が、前記少なくとも１つの遺伝子における少なくとも２ヶ所の変異を含む、請求項１４～２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 　前記改変が、少なくとも２種の遺伝子におけるそれぞれ少なくとも１ヶ所の変異を含む、請求項１４～２２のいずれか一項に記載の方法。
  25. 　前記改変が、少なくとも２種の遺伝子におけるそれぞれ少なくとも２ヶ所の変異を含む、請求項１４～２２のいずれか一項に記載の方法。
  26. 　前記少なくとも２種の遺伝子が、必須遺伝子、薬効関連遺伝子、形態関連遺伝子、および定着性関連遺伝子からなる群からそれぞれ独立して選択される、請求項２４または請求項２５に記載の方法。
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