[go: up one dir, main page]

WO2024085226A1 - 検出キット及び標的分子の検出方法 - Google Patents

検出キット及び標的分子の検出方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2024085226A1
WO2024085226A1 PCT/JP2023/037861 JP2023037861W WO2024085226A1 WO 2024085226 A1 WO2024085226 A1 WO 2024085226A1 JP 2023037861 W JP2023037861 W JP 2023037861W WO 2024085226 A1 WO2024085226 A1 WO 2024085226A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
well
wells
target molecule
target
detecting
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2023/037861
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
陽介 堀内
涼輔 横田
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Toppan Holdings Inc
Original Assignee
Toppan Holdings Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Toppan Holdings Inc filed Critical Toppan Holdings Inc
Priority to JP2024551856A priority Critical patent/JPWO2024085226A1/ja
Publication of WO2024085226A1 publication Critical patent/WO2024085226A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/34—Measuring or testing with condition measuring or sensing means, e.g. colony counters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/02—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor using a plurality of sample containers moved by a conveyor system past one or more treatment or analysis stations
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/10—Devices for transferring samples or any liquids to, in, or from, the analysis apparatus, e.g. suction devices, injection devices
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N37/00—Details not covered by any other group of this subclass

Definitions

  • the present invention relates to a detection kit and a method for detecting a target molecule.
  • This application claims priority to Japanese Patent Application No. 2022-168341 filed in Japan on October 20, 2022, and Japanese Patent Application No. 2022-168342 filed on October 20, 2022, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • Quantitative detection of target molecules in biological samples is used to detect diseases early and predict the effectiveness of medication.
  • the target molecule is a protein
  • quantification is performed using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) or similar.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • nucleic acid quantification is performed using real-time PCR or similar.
  • Patent Document 1 Patent Document 1, Patent Document 2, and Non-Patent Document 1 describe a technology for performing an enzyme reaction in multiple microcompartments to detect single molecules. These methods are called digital measurement.
  • the sample solution is filled into a reaction vessel (also called a detection device) that has an extremely large number of microcompartments, and divided into each of the microcompartments.
  • the signal from each microcompartment is then binarized, and the number of target molecules contained in the sample solution is measured by determining whether or not they are present in the microcompartment.
  • Digital measurement can significantly improve detection sensitivity and quantitation compared to conventional ELISA, real-time PCR, and other methods.
  • Digital measurement technology distributes target molecules contained in a solution sample one molecule at a time into microcompartments, and then counts the number of microcompartments into which the target molecules are distributed.
  • target molecules also called the target substance
  • conventional digital measurement technology is capable of detecting cells (i.e., the target substance) contained in a solution sample with high accuracy, it is difficult to detect and quantify cytokines (i.e., the target molecules) secreted from each cell with high accuracy.
  • the present invention has been made in consideration of these circumstances, and aims to provide a detection kit that enables highly sensitive detection of target molecules released from a target substance in solution. It also aims to provide a method for detecting target molecules using such a detection kit.
  • one aspect of the present invention includes the following aspects.
  • a detection kit comprising a detection device for target molecules and a sealing liquid used in the detection device, the sealing liquid being a mixture of a lipophilic liquid and a surfactant, the concentration of the surfactant in the sealing liquid being 1% by volume or more and 100% by volume or less with respect to the saturated concentration of the surfactant in the sealing liquid, the detection device comprising a first well plate having a plurality of first wells on one surface and a second well plate having a plurality of second wells on one surface, the first well plate and the second well plate being arranged such that the first wells and the second wells face each other, a flow path through which a fluid flows is formed between the first well plate and the second well plate, and the first wells overlap the second wells in a plan view.
  • a detection kit comprising a detection device for target molecules and a sealing liquid used in the detection device, the sealing liquid being a mixture of a lipophilic liquid and a surfactant, the concentration of the surfactant in the sealing liquid being 1% by volume or more and 100% by volume or less with respect to the saturated concentration of the surfactant in the sealing liquid, the detection device comprising a substrate, a wall material provided on the substrate, and a lid material facing the substrate and in contact with the wall material, the lid material having an inlet and an outlet penetrating in the thickness direction, a flow path through which a fluid flows formed between the top of the wall material and the lid material, and a plurality of first wells surrounded by the substrate and the wall material.
  • a method for detecting a target molecule using the detection kit described in [1-1], comprising the steps of filling each of the first wells with a sample solution containing a target substance and sealing the sample solution in the first wells by isolating them with the sealing liquid; releasing the target molecule from the target substance in one of the first wells in which the target substance is placed; filling the second wells with a buffer and pressing the surface of the second well in the second well plate against the surface of the first well in the first well plate to contact the surface of the second well in the second well plate, distributing the target molecule one molecule at a time to each of the second wells independent of the first well; and causing a reaction between the target molecule and a detection reagent to occur and detecting the target molecule.
  • one embodiment of the present invention includes the following:
  • a method for detecting a target molecule using a detection device comprising a first well plate having a plurality of first wells on one surface thereof and a second well plate having a plurality of second wells on one surface thereof, the first well plate and the second well plate being used with the first well and the second well facing each other, the method comprising the steps of: filling each of the plurality of first wells with a sample solution containing a target substance, and sealing the sample solution in the first well by using a sealing liquid to isolate the first well; obtaining a particulate evaluation object containing the target molecule from the target substance in the first well in which one of the target substances is disposed; filling the second well with a buffer, and contacting a surface of the first well in the first well plate with a surface of the second well in the second well plate, and distributing the evaluation object one by one to each of the second wells independent of the first well; and causing a reaction between the evaluation object and a detection reagent, and detecting the target
  • T d1 / v ... (1)
  • T (unit: sec) is the contact time.
  • d1 (unit: ⁇ m) is the diameter of the evaluation object.
  • v (unit: ⁇ m/sec) is the migration speed of the evaluation substance in the sample solution from the first well to the second well.
  • the present invention provides a detection kit that enables highly sensitive detection of target molecules released from a target substance in a solution. It also provides a method for detecting target molecules using such a detection kit.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a detection kit 500 according to the first embodiment.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view taken along line II-II in FIG.
  • FIG. 3 is a cross-sectional view showing another embodiment of the detection device 100.
  • FIG. 4 is an explanatory diagram of the method for detecting a target molecule according to the first embodiment.
  • FIG. 5 is an explanatory diagram of a method for detecting a target molecule according to the first embodiment.
  • FIG. 6 is an explanatory diagram of a method for detecting a target molecule according to the first embodiment.
  • FIG. 7 is an explanatory diagram of a method for detecting a target molecule according to the first embodiment.
  • FIG. 4 is an explanatory diagram of the method for detecting a target molecule according to the first embodiment.
  • FIG. 5 is an explanatory diagram of a method for detecting a target molecule according to the first embodiment.
  • FIG. 6 is an explanatory diagram of a method for
  • FIG. 8 is an explanatory diagram of a method for detecting a target molecule according to the first embodiment.
  • FIG. 9 is an explanatory diagram of a method for detecting a target molecule according to the first embodiment.
  • FIG. 10 is an explanatory diagram of the method for detecting a target molecule according to the first embodiment.
  • FIG. 11 is a cross-sectional view taken along the arrows and showing a detection device 200 of this embodiment.
  • FIG. 12 is an explanatory diagram of a method for detecting a target molecule according to the second embodiment.
  • FIG. 13 is an explanatory diagram of a method for detecting a target molecule according to the second embodiment.
  • FIG. 14 is an explanatory diagram of a method for detecting a target molecule according to the second embodiment.
  • FIG. 14 is an explanatory diagram of a method for detecting a target molecule according to the second embodiment.
  • FIG. 15 is a schematic perspective view showing a detection device 300 included in the detection kit according to the third embodiment.
  • 16 is a cross-sectional view taken along line XV-XV in FIG.
  • FIG. 17 is an explanatory diagram of a method for detecting a target molecule according to the third embodiment.
  • FIG. 18 is an explanatory diagram of a method for detecting a target molecule according to the third embodiment.
  • FIG. 19 is a schematic cross-sectional view showing a detection device 400 included in the detection kit according to the fourth embodiment.
  • FIG. 20 is an explanatory diagram of a method for detecting a target molecule according to the fourth embodiment.
  • FIG. 21 is an explanatory diagram of a method for detecting a target molecule according to the fourth embodiment.
  • FIG. 20 is an explanatory diagram of a method for detecting a target molecule according to the fourth embodiment.
  • FIG. 22 is an enlarged photograph showing the results of the example.
  • FIG. 23 is an enlarged photograph showing the results of the example.
  • FIG. 24 is an enlarged photograph showing the results of the example.
  • FIG. 25 is an enlarged photograph showing the results of the comparative example.
  • FIG. 26 is an enlarged photograph showing the results of the comparative example.
  • FIG. 27 is an enlarged photograph showing the results of the comparative example.
  • FIG. 28 is an enlarged photograph showing the results of an experimental example.
  • FIG. 29 is an enlarged photograph showing the results of an experimental example.
  • FIG. 30 is an enlarged photograph showing the results of an experimental example.
  • FIG. 31 is an enlarged photograph showing the results of an experimental example.
  • FIG. 32 is an enlarged photograph showing the results of an experimental example.
  • Detection kit 1 is a schematic diagram showing a detection kit 500 of the present embodiment.
  • the detection kit 500 includes a detection device 100 and an oily sealing liquid L2.
  • the sealing liquid L2 is stored in, for example, a storage container 50.
  • the detection kit 500 is used to detect a target molecule contained in a liquid sample.
  • the detection kit 500 may include a detection reagent for detecting the target molecule.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view of the detection device 100 taken along line II-II in FIG.
  • the detection device 100 has a first well plate 11, a second well plate 12, and a wall material 13.
  • the detection device 100 is used as a reaction vessel that contains a sample therein, releases target molecules from a target substance contained in the sample, and performs a detection reaction of the target molecules.
  • the target molecules are released from the target substance contained in the sample in the first well plate 11, and the target molecules that migrate from the first well plate are detected in the second well plate 12.
  • the first well plate 11 and the second well plate 12 are stacked via a wall material 13 so that they can be easily attached and detached.
  • the first well plate 11 is a plate-like member having a rectangular shape in a plan view. "Plan view” refers to a field of view from the normal direction of the top surface of the first well plate 11.
  • first well plate 11 may be abbreviated as “first plate 11”.
  • second well plate 12 may be abbreviated as "second plate 12".
  • the first plate 11 has a plurality of first wells W1 on a well-forming surface 11a facing the inner surface of the detection device 100.
  • the first wells W1 are recesses provided in the well-forming surface 11a of the first plate 11 and open to the well-forming surface 11a.
  • the second plate 12 is a plate-like member that is rectangular in plan view and has the same contour shape as the first plate 11 in plan view.
  • the first plate 11 and the second plate 12 face the first well W1 and the second well W2, and are spaced apart from each other.
  • the second plate 12 has a plurality of second wells W2 on a well-forming surface 12a facing the inner surface of the detection device 100.
  • the second wells W2 are recesses provided in the well-forming surface 12a of the second plate 12 and open to the well-forming surface 12a.
  • the materials of the first plate 11 and the second well plate may or may not be electromagnetically transparent.
  • electromagnetic waves that are the subject of the transparency judgment include X-rays, ultraviolet rays, visible light, and infrared rays.
  • the first plate 11 and the second well plate are electromagnetically transparent, it becomes possible to use the electromagnetic waves to analyze the results of experiments performed with the detection device 100.
  • the fluorescence or phosphorescence that occurs as a result of irradiating electromagnetic waves can be measured via the first plate 11 or the second well plate.
  • electromagnetic transparency refers to the property of being able to transmit electromagnetic waves of various wavelengths, such as radio waves, light, X-rays, and gamma rays.
  • Examples of materials that are electromagnetically transparent include glass and resin.
  • resins include ABS resin, polycarbonate, COC (cycloolefin copolymer), COP (cycloolefin polymer), acrylic resin, polyvinyl chloride, polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyvinyl acetate, PET (polyethylene terephthalate), PEN (polyethylene naphthalate), PC (polycarbonate), silicone resin, fluororesin, and amorphous fluororesin.
  • These resins may contain various additives, or may be polymer alloys in which multiple resins are mixed.
  • the electromagnetic wave transparent material preferably has substantially no autofluorescence. Having substantially no autofluorescence means that the material has no autofluorescence at the wavelength used for sample detection, or if it does have autofluorescence, it is so weak that it does not affect sample detection. For example, if the autofluorescence is about 1/2 or 1/10 of the fluorescence to be detected, it can be said to be so weak that it does not affect sample detection. If the first plate 11 and the second well plate are formed using such a material, the detection sensitivity can be increased in sample detection using electromagnetic waves.
  • An example of a material that is electromagnetically transparent and does not emit autofluorescence is quartz glass.
  • Materials that emit weak autofluorescence and do not interfere with sample detection using electromagnetic waves include low-fluorescence glass, acrylic resin, COC (cycloolefin copolymer), and COP (cycloolefin polymer), etc.
  • the material of the first plate 11 is preferably softer (i.e., has a lower modulus of elasticity) than the material of the second plate 12.
  • silicone resin is preferable as the material of the first plate 11.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • Both the material of the first plate 11 and the material of the second plate 12 may be PDMS.
  • the first plate 11 and the second plate 12 may be a single layer made of only the above material, or may be a laminate of multiple materials.
  • the layer having the well (first well W1 or second well W2) and the layer supporting said layer may be made of different materials.
  • a laminate in which a fluororesin is laminated on a substrate may be used as the material for the first plate 11, and the layer of fluororesin may be processed to form a well array.
  • CYTOP registered trademark
  • Asahi Glass or the like may be used as the fluororesin.
  • the thickness of the second plate 12 can be determined appropriately. When observing the fluorescence from the second plate 12 side using a fluorescent microscope, the thickness of the second plate 12 may be, for example, 5 mm or less, 2 mm or less, or 1.6 mm or less. The thickness of the first plate 11 can be determined appropriately as long as it does not impair the effects of the invention.
  • the first well W1 contains a sample contained inside the detection device 100, and is used as a site for releasing target molecules from a target substance contained in the sample.
  • the second well W2 receives the target molecules released in the first well W1 and functions as a reaction field between the target substance and a detection reagent for the target substance.
  • the first well W1 and the second well W2 may have various shapes.
  • cylindrical shapes such as a cylindrical shape, an elliptical cylindrical shape, and a polygonal cylindrical shape, pyramid shapes such as a cone shape and a pyramid shape, and truncated pyramid shapes such as a truncated cone shape and a truncated pyramid shape can be used.
  • pyramid shapes such as a cone shape and a pyramid shape
  • truncated pyramid shapes such as a truncated cone shape and a truncated pyramid shape
  • the opening diameter gradually decreases in the depth direction of the well.
  • the bottoms of the first well W1 and the second well W2 may be flat or curved (convex or concave).
  • the diameter of the opening of the first well W1 (also called the opening diameter) may be, for example, about 10 to 500 ⁇ m.
  • the diameter of the opening of the second well W2 (also called the opening diameter) may be, for example, about 1 to 100 ⁇ m. It is preferable that the opening diameter of the first well W1 is larger than the opening diameter of the second well W2.
  • the depth of the first well W1 may be, for example, about 5 to 500 ⁇ m.
  • the "depth of the first well W1" refers to the distance from the “imaginary plane that is parallel to and in contact with the well-forming surface 11a" to the "deepest part of the first well W1.”
  • the depth of the second well W2 may be, for example, about 1 to 100 ⁇ m.
  • the "depth of the second well W2" refers to the distance from the “imaginary plane that is parallel to and in contact with the well-forming surface 12a" to the "deepest part of the second well W2.”
  • the detection device 100 has 10 to 10,000 first wells W1.
  • the first wells W1 are arranged so as to overlap with the second wells W2 in a planar view.
  • the first wells W1 may be configured so as to overlap with the second wells W2 in a 1:1 ratio in a planar view, or may be configured so as to overlap with two or more second wells W2 in a planar view.
  • the number of second wells W2 that overlap one first well W1 in a planar view is 1 to 10,000, and preferably 10 to 10,000.
  • the second plate 12 should have a number of second wells W2 formed that satisfies the above number.
  • the first plate 11 and the second plate 12 described above can be manufactured using known injection molding, microimprinting technology, or nanoimprinting technology.
  • the first plate 11 and the second plate 12 can also be manufactured using known photolithography technology by forming wells by etching.
  • the wall material 13 is formed in a closed ring shape in a plan view, and is sandwiched between the first plate 11 and the second plate 12.
  • the wall material 13 functions as a spacer that separates the first plate 11 and the second plate 12 and creates a space between the first plate 11 and the second plate 12.
  • the material of the wall material 13 can be the same as that of the first plate 11 and the second plate 12 described above.
  • the wall material 13 made of such a material can be integrated with the first plate 11 or the second plate 12 by bonding with an adhesive or by welding with a method such as thermal welding, ultrasonic welding, or laser welding.
  • the material of the wall material 13 may be different from that of the first plate 11 and the second plate 12.
  • the wall material 13 may be, for example, a double-sided tape or an adhesive.
  • the base material of the double-sided tape may be plastic or paper.
  • the adhesive may be grease or a rapid-curing adhesive containing a component such as ⁇ -cyanoacrylate.
  • the wall material 13 may be formed simultaneously (i.e., integrally) with either the first plate 11 or the second plate 12 during the manufacturing process, and may be integral with either the first plate 11 or the second plate 12.
  • Figure 3 is a cross-sectional view showing another form of the detection device 100.
  • the first member 110 has a first plate 11, a first lid material 21 that is detachable from the first plate 11, and a first wall material 31 that is sandwiched between the first plate 11 and the first lid material 21.
  • the first lid material 21 has the same contour shape as the first plate 11 when viewed in a plan view.
  • the first lid material 21 has two through holes that penetrate in the thickness direction.
  • the two through holes are provided at one end side and the other end side of the first lid material 21.
  • One of the through holes is an inlet 211 used when injecting liquid into the internal space S1 of the first member 110, and the other through hole is an outlet 212 used when discharging liquid from the internal space S1.
  • liquid includes not only liquid samples, but also detection reagents and sealing liquids.
  • the inlet 211, the internal space S1, and the outlet 212 are connected in this order, and together they form a flow path FC1.
  • a liquid material is appropriately caused to flow through the flow path FC1, and the target substance is sealed in the first well W1.
  • multiple first wells W1 are arranged between the inlet 211 and the outlet 212.
  • a cylindrical injection port 215 is provided on the upper surface 21a of the first lid member 21, surrounding the injection port 211.
  • the injection port 215 is connected to the injection port 211.
  • the injection port 215 is used to connect a syringe, for example, when filling the internal space with a liquid using a syringe filled with the liquid.
  • a cylindrical discharge port 216 is provided on the upper surface 21a of the first lid member 21, surrounding the periphery of the discharge outlet 212.
  • the discharge port 216 is connected to the discharge outlet 212.
  • the discharge port 216 is used, for example, to connect a tube through which the liquid flows when the liquid is extracted from the internal space S1.
  • the second member 120 also has a second plate 12, a second lid material 22 that is detachable from the second plate 12, and a second wall material 32 that is sandwiched between the second plate 12 and the second lid material 22.
  • the second lid material 22 has the same contour shape as the second plate 12 when viewed in a plan view.
  • the second lid member 22 has an inlet 221 and an outlet 222 that penetrate in the thickness direction.
  • the inlet 221, the internal space S2 of the second member 120, and the outlet 222 are connected in this order, and as a whole form a flow path FC2.
  • a liquid buffer is caused to flow through the flow path FC2 and sealed in the second well W2.
  • multiple second wells W2 are arranged between the inlet 221 and the outlet 222.
  • the upper surface 22a of the second lid member 22 is provided with a cylindrical injection port 225 that surrounds the injection port 221 and communicates with the injection port 221.
  • the upper surface 22a is provided with a cylindrical exhaust port 226 that surrounds the exhaust port 212 and communicates with the exhaust port 212.
  • the materials for the first lid material 21 and the second lid material 22 can be the materials exemplified above as the materials for the first plate 11 and the second plate 12.
  • the first lid material 21 and the second lid material 22 can be manufactured by known injection molding.
  • the sealing liquid L2 is a mixture of a lipophilic liquid and a surfactant.
  • a lipophilic liquid so-called oil
  • a fluorine-based oil a silicone-based oil, a hydrocarbon-based oil, or a mixture thereof can be used.
  • the lipophilic liquid may be Sigma's product name "FC-40" (CAS number: 86508-42-1).
  • FC-40 is a fluorinated aliphatic compound (fluorine-based oil) with a specific gravity of 1.85 g/mL at 25°C.
  • the surfactant either an ionic surfactant or a non-ionic surfactant can be used. Furthermore, it is preferable to use a surfactant that can generally be used in biochemical experiments. When cells are used as the target substance, it is preferable to use a surfactant that does not destroy cell membranes or that does not destroy cell membranes easily. When cells are used as the target substance, it is advisable to adjust the concentration of the surfactant in the sealing solution to a concentration that does not cause cell alteration or destruction.
  • Ionic surfactants include anionic surfactants and amphoteric surfactants.
  • anionic surfactant include sodium dodecyl sulfate, sodium cholate, and sodium deoxycholate.
  • Amphoteric detergents include, for example, CHAPS and CHAPSO.
  • CHAPS 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonate
  • CHAPSO 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-2-hydroxypropanesulfonate
  • Triton X-100 has 9 or 10 repeating polyethylene glycol moieties, while Triton X-114 has 7 or 8 repeating polyethylene glycol moieties.
  • the concentration of the surfactant in the sealing liquid L2 is preferably 1% by volume or more and 100% by volume or less, and more preferably 10% by volume or more and 90% by volume or less, relative to the saturated concentration of the surfactant in the sealing liquid.
  • the appropriate surfactant concentration differs depending on the type of lipophilic liquid used in the sealing liquid L2. Therefore, it is advisable to adjust the surfactant concentration by conducting preliminary experiments as appropriate.
  • the sealing liquid L2 may be diluted before use in the detection method described below. Therefore, the detection kit 500 may further include only a lipophilic solution that does not contain a surfactant, which may be used to dilute the sealing liquid L2.
  • Method 1 for detecting target molecules 4 to 9 are explanatory diagrams of the method for detecting a target molecule according to the present embodiment.
  • the method for detecting a target molecule includes the steps of carrying out the following operations.
  • the above-mentioned detection device 100 is used to detect a target molecule contained in a sample in the second well W2 of the detection device 100.
  • a step of adjusting the concentration of a liquid sample containing a target substance to obtain a sample solution A step of sealing the sample solution in a first well independently using a sealing liquid;
  • a step of releasing a target molecule from the target substance in the first well A step of distributing one target molecule per second well;
  • A5 A step of detecting the target molecule.
  • step (A1) Step of adjusting the concentration of a liquid sample containing a target substance to obtain a sample solution
  • the concentration of a liquid sample containing a target substance is adjusted to obtain a sample solution L1.
  • this step may be abbreviated as "step (A1)".
  • each step may be abbreviated in the same manner.
  • Samples include, for example, biological samples or environmental samples.
  • Biological samples are not particularly limited, and examples include serum, plasma, urine, and cell culture fluid.
  • Environmental samples include, for example, river water and industrial wastewater.
  • Biological samples and environmental samples contain target substances that release target molecules to be detected.
  • target substances include DNA, RNA, proteins, viruses, cells, and specific compounds.
  • RNA include miRNA and mRNA.
  • cells include bacteria, yeast, animal cells, plant cells, and insect cells.
  • the sample may contain a reaction reagent for detecting the target substance.
  • the reaction reagent include a buffer substance, an enzyme, a substrate, an antibody, and an antibody fragment.
  • the enzyme is selected according to the content of the biochemical reaction in order to carry out a biochemical reaction such as an enzyme reaction on a template nucleic acid related to the target substance.
  • the biochemical reaction on the template nucleic acid is, for example, a reaction in which signal amplification occurs under conditions in which the template nucleic acid is present.
  • an enzyme may be bound to the antibody and detected by an enzyme reaction.
  • the detection enzyme may be HRP, alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, or the like.
  • the reaction reagent is selected according to the detection reaction to be adopted.
  • Specific detection reactions include the Invasive Cleavage Assay (ICA) method, the Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) method (registered trademark), the 5' ⁇ 3' nuclease method (TaqMan (registered trademark) method), and the fluorescent probe method.
  • ICA Invasive Cleavage Assay
  • LAMP Loop-Mediated Isothermal Amplification
  • TaqMan registered trademark
  • fluorescent probe method the fluorescent probe method.
  • the sample may contain a surfactant.
  • the concentration of the sample is adjusted based on the volume of the detection device 100 used so that one target substance M1 is placed in each first well W1.
  • the concentration of the sample should be determined by performing a preliminary experiment using the detection device 100.
  • step (A2) Step of sealing the sample solution in the first wells by sealing liquid
  • the sample solution L1 is filled into each of the first wells W1 independently.
  • this step may be abbreviated as “step (A2)".
  • the detection device 100 is divided into a first member 110 and a second member 120, and the first member 110 is used in this step.
  • a sample solution L1 containing a detection reagent is injected into the internal space S1 from the injection port 211.
  • the sample solution L1 flows through the internal space S1 (also called the flow path FC1), the sample solution L1 fills the first well W1 that opens into the internal space S1.
  • the sample solution L1 that has passed through the flow path FC1 is discharged from the outlet 212.
  • one target substance M1 is filled into one first well W1.
  • the concentration of the sample solution L1 is adjusted so that the number of target substances M1 injected into the internal space S1 is, for example, 1/10 or less of the total number of first wells W1.
  • one first well W1 is filled with one or less target substances M1, i.e., 0 or 1 target substance M1.
  • the means for introducing the target substance M1 into the first well W1 is not particularly limited, and an appropriate means can be selected according to the target substance M1 to be detected.
  • the target substance M1 may be distributed into the first well W1 by its own weight, or may be introduced into the first well W1 by distribution due to diffusion.
  • a substance that captures the target substance M1 (also called a capture material) may be used, and the capture material may be bound to the target substance M1 that does not easily settle under its own weight and then delivered. Furthermore, the efficiency of introducing the target substance M1 into the first well W1 can be improved by fixing the capture material to the first well W1 in advance and allowing the capture material to capture the target substance M1 delivered together with the sample solution.
  • the target substance M1 may be introduced into the first well W1, and the capture object and target substance M1 may be brought into contact in the first well W1.
  • the capture substance is a substance that can capture the target substance M1.
  • the capture substance may be, for example, a conjugate between a solid phase and a substance that specifically binds to the target substance M1.
  • Antibody fragments include Fab, F(ab')2, Fab', single-chain antibodies (scFv), disulfide-stabilized antibodies (dsFv), dimeric V-domain fragments (diabodies), and peptides containing CDRs.
  • the antibodies may be monoclonal or polyclonal. They may also be commercially available antibodies.
  • the specific binding substance when the target substance M1 includes a glycan, the specific binding substance may be a lectin. In addition, when the target substance M1 includes a lipid membrane, the specific binding substance may be a substance that has binding properties to lipid membranes. Examples of substances that have binding properties to lipid membranes include hydrocarbons such as hexanediol and membrane proteins such as transmembrane proteins. Examples of membrane proteins include ⁇ -hemolysin.
  • the solid phase constituting the complement may be a particle, a membrane, a substrate, or the like.
  • the substance that specifically binds to the target substance M1 may be one type, or two or more types. For example, there may be three types, four types, or five or more types.
  • the particles are not particularly limited, and examples thereof include polymer particles, magnetic particles, and glass particles.
  • the particles are preferably surface-treated to avoid non-specific adsorption.
  • particles having functional groups such as carboxyl groups on the surface are preferable to immobilize specific binding substances. More specifically, products such as "Magnosphere LC300" manufactured by JSR Corporation can be used.
  • the method for immobilizing a specific binding substance on a solid phase is not particularly limited, and examples include physical adsorption, chemical binding, avidin-biotin binding, and binding between protein G or protein A and an antibody.
  • Physical adsorption methods include methods in which specific binding substances are fixed to the particle surface by hydrophobic or electrostatic interactions.
  • Chemical bonding methods include those that use crosslinking agents.
  • the specific binding substance can be immobilized on the particle surface by reacting the carboxyl groups of the specific binding substance with a crosslinking agent to form an active ester, and then reacting the hydroxyl groups with the ester groups.
  • cells to which the virus can attach i.e., cells having a virus receptor
  • the capture substance may be used as the capture substance.
  • sealing liquid L2 is injected into the internal space S1 through the injection port 211.
  • the sealing liquid L2 may be the original sealing liquid L2 contained in the storage container 50, or may be a diluted liquid of the sealing liquid L2.
  • the sealing liquid L2 flows in the internal space S1 in the direction of the well formation surface 11a, and displaces the internal space S1 by washing away the sample solution L1 that is not contained in the first well W1 among the sample solution L1 sent to the flow path FC1.
  • the sealing liquid L2 individually seals each of the multiple first wells W1, and the first wells W1 containing the sample solution L1 become independent reaction spaces.
  • the sample solution L1 replaced with the sealing liquid L2 and the excess sealing liquid L2 are discharged from the discharge port 212.
  • step (A3) Step of Releasing Target Molecules from the Target Substance in the First Well
  • the target molecules are released from the target substance M1 distributed to each first well W1.
  • this step may be abbreviated as “step (A3)”.
  • the method for releasing the target molecule from the target substance is selected depending on the type of target substance. For example, if the target substance is DNA or RNA, multiple fragments (i.e., target molecules) may be obtained from one fragment by ultrasonic disruption or enzymatic degradation.
  • the detection device 100 may be heated to separate the individual nucleic acids through thermal denaturation.
  • the target substance is a protein aggregate
  • the aggregates may be loosened by ultrasonic irradiation, an enzyme that breaks down proteins may be used, or a reagent that breaks down protein aggregates may be added.
  • the cell may be disrupted by ultrasound or the cell membrane may be disrupted by applying electrical stimulation.
  • Specific methods include the following: First, beads are placed in the first well W1.
  • the beads may be placed in the first well W1 in advance, or may be added to a solution containing cells and placed in the first well W1 together with the cells.
  • There are no limitations on the size of the beads as long as they do not impair the effects of the invention and are large enough to be placed in the first well W1.
  • the material of the beads may be silica or a magnetic material.
  • the size of the beads is preferably 50 nm to 500 ⁇ m, more preferably 100 nm to 100 ⁇ m, and even more preferably 500 nm to 10 ⁇ m.
  • the first well W1 is isolated by the above-mentioned step (A2) and the cells are cultured. After culturing the cells for a certain period of time, ultrasonic waves are irradiated to the detection device 100. By vibrating the beads in the first well W1, the cell walls of the cells are broken down by the beads, and the contents of the cells can be released into the first well W1.
  • the cell membrane may be dissolved using a reagent that dissolves the cell membrane.
  • a solution containing cells is mixed with a reagent that dissolves cell membranes (also called a cell lysis solution).
  • the solution containing cells and the cell lysis solution may be mixed before being injected into the detection device 100, or may be mixed within the detection device 100.
  • one method is to first inject the solution containing cells into the first well W1, and then inject the cell lysis solution into the first well W1.
  • Possible methods for adding the cell lysis solution to the first well W1 include adding it to the detection device 100 at a flow rate that does not cause the cells placed in the first well W1 to leave the first well W1, or fixing the cells in the first well W1.
  • the method of fixing the cells in the first well W1 may be a method of binding a cell capture substance to the first well W1, or a method of placing particles with a capture substance bound to them in the first well W1.
  • An example of a "capture substance” is an antibody that binds to cells.
  • surfactants or commercially available reagents can be used.
  • the first well W1 is separated in step (A2) and the cell membrane is dissolved by reacting for a certain period of time. This allows the contents of the cells to be released into the first well W1.
  • cells which are the target substance, may be cultured for a certain period of time in the first well W1, and secretions such as cytokines secreted by the cells may be detected as target molecules.
  • step (A4) Step of distributing one target molecule to each second well
  • the target molecule released into the sample solution L1 is distributed one molecule to each second well W2.
  • this step may be abbreviated as “step (A4)”.
  • liquid buffer B is injected into the internal space S2 from the injection port 221 of the second member 120.
  • Buffer B may contain a detection reagent for the target molecule.
  • buffer B flows through the internal space S2 (flow path FC2), buffer B fills the second well W2 that opens into the internal space S2.
  • the buffer B that has passed through flow path FC2 is discharged from outlet 222.
  • sealing liquid L2 is injected into the internal space S2 from the injection port 221.
  • the sealing liquid L2 flows in the internal space S1 in the planar direction of the well formation surface 12a, and displaces the buffer B that is not contained in the second well W2 out of the buffer B sent to the flow path FC2, thereby replacing the internal space S2.
  • the sealing liquid L2 may be the same as the sealing liquid used in step (A2) above.
  • the sealing liquid used in step (A2) and the sealing liquid used in this step may be the same or different.
  • the sealing liquid L2 individually seals each of the multiple second wells W2, and the second wells W2 containing buffer B become independent.
  • the buffer B replaced by the sealing liquid L2 and the excess sealing liquid L2 are discharged from the discharge port 222.
  • first lid material 21 is removed from the first member 110 to form the first plate 11.
  • second lid material 22 is removed from the second member 120 to form the second plate 12.
  • the well formation surfaces 11a and 12a of these well plates are covered with sealing liquid L2.
  • the well-forming surface 11a of the first plate 11 and the well-forming surface 12a of the second plate 12 are placed opposite each other to form the detection device 100.
  • the first well W1 is positioned so as to overlap the second well W2 in a plan view.
  • the first plate 11 and the second plate 12 are pressed against each other with pressure, and the well-forming surface 11a and the well-forming surface 12a are brought into contact.
  • the experimenter may press them directly with their hands, or may use a tool such as a clip or roller.
  • the pressure pressing the first plate 11 and the second plate 12 together may be the experimenter's own strength, or may be applied using a jig such as a weight or clip.
  • the first well W1 and the second well W2 are connected, and the target molecules M2 in the first well W1 diffuse and move to the second well W2.
  • the sealing liquid containing a surfactant effectively facilitates the transfer of material from the first well W1 to the second well W2 in this process.
  • the sealing liquid L2 contains a surfactant
  • the surface tension of the sealing liquid L2 is smaller than when the sealing liquid L2 does not contain a surfactant, and it is believed that the sealing liquid L2 between the first well W1 and the second well W2 is more likely to penetrate.
  • This makes it easier to form a state in which the first well W1 and the second well W2 are connected as shown in FIG. 9, and it is believed that the transfer of material from the first well W1 to the second well W2 is more effective.
  • the target molecule M2 that has migrated to the second well W2 may be dissolved in the sample solution L1 in the second well W2, or may be captured by a target molecule capture substance fixed to the second well W2.
  • the target molecule capture substance is a substance that has a functional group that specifically binds to the target molecule M2, and may be, for example, an antibody if the target molecule M2 is a protein, or a nucleic acid that forms a complementary strand if the target molecule M2 is a nucleic acid.
  • target molecules M2 may be released from the target substance M1 in the first well W1, and the released target molecules M2 may be captured by the capture particles.
  • the capture particles that have captured the target molecules M2 may be moved from the first well W1 to the second well W2, thereby introducing the target molecules M2 into the second well W2.
  • the difference in specific gravity between the sample solution L1 and the capture particles may be utilized to cause the capture particles to settle or float, and the capture particles may be moved from the first well W1 to the second well W2.
  • the behavior of the capture particles may be controlled using magnetic force from outside the detection device 100.
  • step (A5) Step of detecting a target molecule
  • the target molecule M2 is reacted with the detection reagent to detect the target molecule M2.
  • this step may be abbreviated as “step (A5)”.
  • One example of a detection method is to carry out a signal amplification reaction inside the sealed second well W2. Inside the second well W2, the signal derived from the detection reagent is amplified so that it can be detected.
  • Signals include fluorescence, color development, changes in potential, and changes in pH.
  • the signal amplification reaction may be, for example, a biochemical reaction, more specifically, an enzyme reaction.
  • the signal amplification reaction is an isothermal reaction in which a reagent solution containing an enzyme for signal amplification is contained in the second well W2, and the detection device 100 is maintained under constant temperature conditions at which the desired enzyme activity is obtained, for example, at least 60°C, preferably about 66°C, for a predetermined time, for example, at least 10 minutes, preferably about 15 minutes.
  • signal amplification reactions when the target molecule M2 is a nucleic acid, include ICA reactions such as the Invader (registered trademark) method, loop-mediated isothermal amplification (LAMP (registered trademark) method), 5' ⁇ 3' nuclease method (TaqMan (registered trademark) method), and fluorescent probe method. It is believed that these methods can cause a signal amplification reaction even if the solution contains the above-mentioned surfactant (cell lysis solution).
  • Invader registered trademark
  • LAMP loop-mediated isothermal amplification
  • TaqMan registered trademark
  • the solution in the second well W2 may be replaced.
  • the target molecule M2 may be immobilized in the second well W2 and then a detection reagent may be added from the outside.
  • the target molecule may be fixed in the second well W2 by binding a substance that captures the target molecule M2 to the second well W2, or by adding magnetic particles bound to a compound that captures the target molecule M2 to the second well W2 and fixing the magnetic particles by magnetic force.
  • an ICA reaction As a signal amplification reaction, it is particularly preferable to use an ICA reaction.
  • signal amplification proceeds through a cycle of two reactions: (1) complementary binding between nucleic acids, and (2) recognition and cleavage of a triple-stranded structure by an enzyme.
  • the effect of reaction cycle inhibition by contaminants other than the target molecule is small. Therefore, even if various components (contaminants) other than the target molecule are present in the second well W2, the target molecule can be detected with high accuracy by using an ICA reaction.
  • the sample solution L1 contains the reaction reagents and template nucleic acid necessary for the ICA reaction.
  • the biochemical reaction in the reaction step is an ICA reaction
  • the fluorescent substance is released from the quenching substance, thereby emitting a predetermined fluorescent signal in response to the excitation light.
  • Target molecules can also be detected by binding a substance that specifically binds to the target molecule (specific binding substance) to the target molecule and detecting the bound specific binding substance.
  • a substance that specifically binds to the target molecule specifically binding substance
  • the target molecule is a protein
  • it can be detected using ELISA. More specifically, detection can be performed by, for example, sandwich ELISA using the principle of FRET.
  • a first specific binding substance e.g., an antibody
  • a second specific binding substance labeled with a second fluorescent substance i.e., an acceptor
  • a target molecule e.g., an antigen
  • a target molecule e.g., an antigen
  • the distance between the donor and acceptor decreases, and the fluorescence wavelength of the acceptor can be detected by irradiation with the excitation wavelength of the donor.
  • the specific binding substance can be labeled with a nucleic acid fragment, and the nucleic acid fragment can be detected by an ICA reaction.
  • Specific binding substances can be the same as the specific binding molecules for the structures described below, such as antibodies, antibody fragments, and aptamers.
  • the specific binding substance can be directly or indirectly labeled with an enzyme such as horseradish peroxidase (HRP).
  • HRP horseradish peroxidase
  • a known appropriate method can be selected for observing the signal depending on the type of signal to be observed. For example, when performing bright-field observation, white light is irradiated perpendicularly onto the substrate on which the well array is provided. When observing fluorescent signals, excitation light corresponding to the fluorescent substance is irradiated into the well from the bottom side of the well, and the fluorescence emitted by the fluorescent substance is observed. An image of the entire or part of the observed well array is photographed and saved, and the image is processed by a computer system.
  • the detection device 100 configured as described above makes it possible to detect target molecules released from a target substance in a solution with high sensitivity.
  • the above-mentioned method for detecting a target molecule it is possible to analyze a target molecule released from a single target substance. Furthermore, it is possible to analyze the characteristics of the target substance that released the target molecule after detecting the target molecule, for example by analyzing the DNA or RNA of the cell after detecting a cytokine, or by counting the number of specific DNA sequences and then analyzing the entire sequence of that DNA. This makes it possible to detect the target molecule with high accuracy.
  • step (A1) is performed, but step (A1) may be omitted. If step (A1) is not performed, after filling the first wells with the sample solution, a first well W1 in which one target substance M1 is placed may be extracted from among the multiple first wells in step (A3), and the subsequent steps (A4) and (A5) may be performed.
  • [Second embodiment] 10 to 13 are explanatory diagrams of the detection device and the target molecule detection method of the detection kit according to the second embodiment.
  • the same components as those in the first embodiment are denoted by the same reference numerals, and detailed descriptions thereof will be omitted.
  • FIG. 10 is a cross-sectional view taken along an arrow showing a detection device 200 included in the detection kit of this embodiment, and corresponds to FIG.
  • the detection device 200 has a first well plate 15, a second plate 12, and a wall material 13.
  • the detection device 200 is used as a reaction vessel that contains a sample, releases target molecules from a target substance contained in the sample, and performs a detection reaction of the target molecules. In this case, the target molecules are released from the target substance contained in the sample in the first well plate 15, and the target molecules that migrate from the first well plate 15 are detected in the second plate 12.
  • the first well plate 15 and the second plate 12 are stacked via a wall material 13 so that they can be easily attached and detached.
  • the first well plate 15 is a plate-like member having a rectangular shape in a plan view. In the following description, the first well plate 15 may be abbreviated to "first plate 15.”
  • the first plate 15 has a plurality of first wells W1 on a well-forming surface 15a facing the inner surface of the detection device 200.
  • the first wells W1 are recesses provided in the well-forming surface 15a of the first plate 11 and open to the well-forming surface 15a.
  • the first plate 15 has two through holes that penetrate in the thickness direction.
  • the two through holes are provided at one end and the other end of the first plate 15, respectively.
  • One of the through holes is an inlet 151 used to inject liquid into the internal space S of the detection device 200, and the other through hole is an outlet 152 used to discharge liquid from the internal space S.
  • the inlet 151, the internal space S, and the outlet 152 are connected in this order, and together they form a flow path FC.
  • a liquid is appropriately caused to flow through the flow path FC, and the target substance is sealed in the first well W1.
  • the first plate 15 has a plurality of first wells W1 between the inlet 151 and the outlet 152 in a plan view.
  • the upper surface of the first plate 15 may have a cylindrical injection port surrounding the periphery of the inlet 151. Also, the upper surface of the first plate 15 may have a cylindrical injection port surrounding the periphery of the outlet 152.
  • [Method for detecting target molecules] 11 to 13 are explanatory diagrams of the method for detecting a target molecule of this embodiment.
  • the above-mentioned steps (A1) to (A5) are performed using a detection device 200.
  • Step (A1) is common to the first embodiment.
  • a sample solution L1 containing a detection reagent is injected from the injection port 151 into the internal space S (i.e., the flow path FC), and the first well W1 that opens into the internal space S is filled with the sample solution L1.
  • the second well W2 is also filled with the sample solution L1.
  • a sealing liquid L2 containing a surfactant is injected into the internal space S (i.e., the flow path FC) from the injection port 151.
  • the sealing liquid L2 flows in the internal space S in the planar direction of the well formation surface 11a, and washes away the sample solution L1 that is not contained in the first well W1 and the second well W2 in the internal space S, replacing the internal space S.
  • the sealing liquid L2 individually seals each of the multiple first wells W1 and second wells W2 (step (A2)).
  • the sample solution L1 replaced with the sealing liquid L2 and the excess sealing liquid L2 are discharged from the discharge port 152.
  • target molecules are released from the target substance M1 distributed to each first well W1 according to the method described above (step (A3)).
  • the detection device 200 is pressed against both sides of the first plate 15 and the second plate 12, bringing the well-forming surface 15a into contact with the well-forming surface 12a.
  • the first well W1 and the second well W2 are connected, and the target molecules M2 in the first well W1 diffuse and move to the second well W2 (step (A4)).
  • step (A5) a reaction between the target molecule M2 and the detection reagent is caused in the second well W2, and the target molecule M2 is detected.
  • the detection device 200 configured as described above makes it possible to detect target molecules released from a target substance in a solution with high sensitivity.
  • the above-described method for detecting target molecules also makes it possible to detect target molecules with high accuracy.
  • the detection device 200 of this embodiment has an inlet 151 and an outlet 152 in the first plate 15, this is not limited to this.
  • the detection device may have a first plate 11 and a second well plate 16 having an inlet 161 and an outlet 162.
  • the detection device 250 can be used in the same manner as the detection device 200 to carry out a method for detecting a target molecule.
  • FIG. 14 to 17 are explanatory diagrams of the detection device and the target molecule detection method of the detection kit according to the third embodiment.
  • the same components as those in the first embodiment are denoted by the same reference numerals, and detailed descriptions thereof will be omitted.
  • FIG. 14 is a schematic perspective view showing the fluidic device of this embodiment, and Fig. 15 is a cross-sectional view taken along line XV-XV in Fig. 14.
  • the fluidic device 300 has a well plate (also called a substrate) 17, a cover material 23, and a wall material 33.
  • the fluidic device 300 has a plurality of first wells W1 surrounded by the well plate 17 and the wall material 33, and a plurality of second wells W2 each provided on the top surface 17a of the well plate 17 at the bottom of the first wells W1.
  • the well plate 17 is a plate-like member having a rectangular shape in a plan view.
  • a plurality of second wells W2 are provided on an upper surface 17a of the well plate 17.
  • the material of the well plate 17 can be the same as that of the first well plate 11 described above.
  • the wall material 33 is formed in a closed ring shape in a plan view, and is disposed on the upper surface 17a of the well plate 17.
  • the wall material 33 is sandwiched between the well plate 17 and the cover material 23, and is integrated with them to form the fluidic device 300.
  • the space surrounded by the well plate 17, the cover material 23, and the wall material 33 is an internal space S in which a liquid sample is accommodated.
  • the wall material 33 functions as a wall surface of the internal space S, and also functions as a spacer between the well plate 17 and the lid material 23.
  • the internal space S is partitioned by wall material 33, and multiple first wells W1 are formed.
  • the first wells W1 refer to the space surrounded by the well plate 17, the wall material 33, and an imaginary plane that is parallel to and in contact with the top 33a of the wall material 33.
  • Multiple second wells W2 are arranged at the bottom of the first well W1.
  • the material of the wall material 33 can be the same as that of the well plate 17 described above.
  • the wall material 33 made of such a material can be integrated with the well plate 17 and the lid material 23 by bonding with an adhesive or by welding using heat welding, ultrasonic welding, laser welding, or the like.
  • the wall material 33 may be formed integrally with the well plate 17 and may constitute a part of the well plate 17. Similarly, the wall material 33 may be formed integrally with the lid material 23 and may constitute a part of the lid material 23.
  • the lid member 23 has the same contour shape as the well plate 17 in a plan view.
  • a convex portion 239 is provided on the outer edge of the lower surface 23b of the lid member 23.
  • the lid member 23 is connected to the wall material 33 via the convex portion 239.
  • the lid material 23 has two through holes (inlet 231, outlet 232) that penetrate in the thickness direction.
  • the top surface 23a of the lid material 23 is provided with a cylindrical injection port 235 that surrounds the periphery of the injection port 231.
  • the top surface 23a of the lid material 23 is provided with a cylindrical exhaust port 236 that surrounds the periphery of the exhaust port 232.
  • the material for the lid 23 can be the same as that for the first plate 11 described above.
  • a silicone resin is preferable as the material for the lid 23.
  • PDMS can be preferably used as the silicone resin.
  • the inlet 231, the internal space S, and the outlet 232 are connected in this order, and together they form a flow path FC.
  • a liquid is appropriately caused to flow through the flow path FC, and a detection reaction for the target substance is carried out.
  • Method for detecting target molecules 16 and 17 are explanatory diagrams of the method for detecting a target molecule according to this embodiment.
  • the method for detecting a target molecule is carried out using a detection kit including the above-mentioned detection device 300, and includes the steps of carrying out the following operations.
  • (B1) a step of sealing each second well by separating the buffer with a sealing liquid; (B2) a step of filling each of a plurality of first wells with a sample solution containing a target substance and sealing the sample solution in each of the first wells; (B3) a step of releasing a target molecule from the target substance in the first well; (B4) a step of distributing one target molecule per second well; (B5) a step of detecting the target molecule.
  • Step B1 Step of sealing each second well by isolating the buffer with a sealing liquid
  • the second well W2 of the detection device 300 is filled with buffer B, and each second well W2 is sealed by isolating it with a sealing liquid L2 containing a surfactant.
  • (B2) A step of filling each of the first wells with a sample solution containing a target substance and sealing the sample solution separately in the first well. Next, the concentration of the liquid sample containing the target substance is adjusted to obtain a sample solution L1.
  • the sample solution L1 can be prepared in the same manner as in the above-mentioned step (A1). At this time, the sample solution L1 does not contain a surfactant.
  • the prepared sample solution L1 is filled into each of the first wells W1.
  • sample solution L1 is injected into the internal space S from the injection port 231.
  • flow path FC the sample solution L1 pushes out the buffer B in the internal space S, and the first well W1 that opens into the internal space S is filled with the sample solution L1.
  • the sample solution L1 that has passed through the flow path FC is discharged from the outlet 232.
  • the internal space S is filled with the sample solution L1, and then the sealing liquid L21 is sent from the inlet 231 to the flow path FC.
  • the sealing liquid L21 any of the sealing liquids described above can be used.
  • the viscosity of the sealing liquid L21 is lower than the viscosity of the sealing liquid L2.
  • the sealing liquid L21 sent to the flow path FC flows over the first well W1 in the internal space S without entering the first well W1, and displaces the sample solution L1 that is not contained in the first well W1 among the sample solution L1 filled in the internal space S.
  • the sealing liquid L21 seals each of the multiple first wells W1 individually, and the first wells W1 containing the sample solution L1 become independent reaction spaces.
  • the target substance contained in the sample solution L1 is filled independently into each of the first wells W1.
  • the sample solution L1 replaced by the sealing liquid L21 and the excess sealing liquid L21 are discharged from the discharge port 232.
  • the first well W1 may be sealed using only the lipophilic liquid that constitutes the sealing liquid L2.
  • step (B3) Step of Releasing Target Molecules from the Target Substance in the First Well
  • the target molecules M2 are released from the target substance M1 distributed to each of the first wells W1.
  • step (B5) Step of Detecting Target Molecule
  • a reaction between the target molecule M2 and the detection reagent is caused to occur in the second well W2, and the target molecule M2 is detected.
  • a detection kit having a detection device 300 configured as described above can detect target molecules released from a target substance in a solution with high sensitivity.
  • the above-described method for detecting target molecules also makes it possible to detect target molecules with high accuracy.
  • [Fourth embodiment] 18 to 20 are explanatory diagrams of a method for detecting a target molecule according to the fourth embodiment.
  • the method for detecting a target molecule is carried out using a detection kit including a detection device 400, and includes the steps of carrying out the following operations.
  • (C1) A step of preparing a W/O type emulsion in which droplets containing a target substance are dispersed in a lipophilic liquid;
  • (C2) A step of sealing each well by isolating a buffer with a liquid containing a lipophilic liquid;
  • (C3) A step of flowing the emulsion through a flow path and replacing the liquid containing a lipophilic liquid with the emulsion;
  • (C4) A step of releasing target molecules from the target substance in the droplets;
  • (C5) A step of pressurizing the emulsion via a lid material and distributing droplets from the emulsion to each of the first wells independent of each other;
  • (C6) A step of detecting target molecules.
  • FIG. 18 is a schematic cross-sectional view showing a detection device 400.
  • the detection device 400 is a member having the same configuration as the second member 120 shown in the first embodiment, and has a well plate 12, a lid material 22 facing the well plate 12, and a wall material 32 sandwiched between the well plate 12 and the lid material 22.
  • the well plate 12, the lid material 22, and the wall material 32 have the same configuration as the respective members of the second member 120 shown in the first embodiment.
  • the same reference numerals as the second member 120 are used.
  • Well W corresponds to the first well in the present invention.
  • the well plate 12 is a member having the same configuration as the second member 12 described above.
  • the well plate 12 has a plurality of wells W (i.e., first wells).
  • the lid material 22 is the same as the second lid material 22 described above
  • the wall material 32 is the same as the second wall material 32 described above.
  • a W/O type emulsion in which droplets containing a target substance are dispersed in a lipophilic liquid is prepared using a target substance and a sealing liquid (i.e., a mixture of a surfactant and a lipophilic liquid).
  • a sealing liquid i.e., a mixture of a surfactant and a lipophilic liquid.
  • the concentration of the target substance, the concentration of the surfactant, or the amount of surfactant relative to the target substance is adjusted so that each droplet in the emulsion contains 0 or 1 target substance.
  • the target substance is distributed to each droplet in the emulsion.
  • the liquid L3 used for sealing may be the same as the dispersion medium of the emulsion, or it may be different.
  • the dispersion medium of the emulsion is the lipophilic liquid of the sealing liquid used in preparing the emulsion.
  • a fluorine-based oil can be used as the dispersion medium of the emulsion
  • a silicone-based oil can be used as the liquid L3 used for sealing.
  • liquid L3 may or may not contain a surfactant, as long as this does not impair the effects of the invention. If liquid L3 contains a surfactant, liquid L3 may be the same as the sealing liquid described above, or it may be different.
  • step (C3) Step of flowing emulsion into flow path and replacing lipophilic liquid with emulsion
  • emulsion E is injected from the injection port 221, and the emulsion E prepared in step (C1) is flowed into the flow path FC of the detection device 400, replacing the liquid L3 in the flow path FC with the emulsion E.
  • the excess liquid L3 is discharged from the flow path FC while the liquid L3 sealing the well W remains, and the flow path FC is filled with emulsion E.
  • a restriction enzyme can be added to the emulsion to cut the nucleic acid at specific sequences, releasing the target molecule, the nucleic acid, into the emulsion droplets.
  • the cells can be cultured in the emulsion for a certain period of time, causing the secretion, which is the target molecule, to be released into the emulsion droplets.
  • the contents of the cell can be dispersed within the well W by adding a reagent that dissolves the cell membrane to the buffer B in the well W.
  • the reagent that dissolves the cell membrane can be the anionic surfactant mentioned above.
  • step (C6) Step of detecting target molecules
  • a reaction between the target molecules diffused in the wells W and the detection reagent is caused to occur, and the target molecules are detected.
  • the detection reagent may be placed in the wells W in advance.
  • a detection kit having a detection device 400 configured as described above can detect target molecules released from a target substance in a solution with high sensitivity.
  • the above-described method for detecting target molecules also makes it possible to detect target molecules with high accuracy.
  • the method for detecting a target molecule of this embodiment will be described with reference to Figures 4 to 8 and 10.
  • the method for detecting a target molecule includes the steps of performing the following operations.
  • the above-mentioned detection device 100 is used to detect a target molecule contained in a sample in the second well W2 of the detection device 100.
  • (AA1) A step of adjusting the concentration of a liquid sample containing a target substance to obtain a sample solution;
  • (AA2) A step of sealing the sample solution in a first well independently using a sealing liquid;
  • (AA3) A step of obtaining an evaluation substance in the first well;
  • (AA4) A step of distributing one evaluation substance per second well;
  • (AA5) A step of detecting a target molecule.
  • step (AA1) A step of adjusting the concentration of a liquid sample containing a target substance to obtain a sample solution.
  • this step may be abbreviated as "step (AA1)".
  • each step may be abbreviated in the same manner.
  • Step (AA1) differs from step (A1) in the following respects, but is otherwise the same, so explanation will be omitted.
  • the sample may contain a surfactant, and examples of the surfactant include those described in the first embodiment.
  • the concentration of the surfactant is preferably 0.0011 g/L to 55.5 g/L (0.0001 to 5% by volume [v/v]) relative to the total volume of the sample, more preferably 0.0111 g/L to 22.2 g/L (0.001 to 2% by volume [v/v]), and even more preferably 0.111 g/L to 11.1 g/L (0.01 to 1% by volume [v/v]).
  • the surfactant concentration is 55.5 g/L or less relative to the total volume of the sample, it will have less adverse effects on the reaction in the subsequent detection of target molecules.
  • the concentration of the sample is adjusted based on the volume of the fluidic device used so that one target substance M1 is placed in each first well.
  • the concentration of the sample should be determined by conducting a preliminary experiment using the fluidic device.
  • a process for visualizing the target substance may be performed. By performing such a process, it is possible to extract only the first well, which contains only one target substance, in a later process and use it as the measurement subject. Extraction can be performed, for example, by taking a magnified image using a microscope and analyzing the obtained image using known detection software.
  • the target substance is a cell, it may be detected directly using a bright field image of a microscope, or the cells may be stained with a trypan blue solution or the like. If the target substance is a nucleic acid, it may be made to emit light using a known fluorescent staining method or a method such as an ICA reaction, and a well containing one molecule of nucleic acid may be identified based on the fluorescence intensity. If the target substance is a nucleic acid, for example, the nucleic acid may be cut with a restriction enzyme to obtain a nucleic acid fragment as the target molecule.
  • step (AA2) Step of sealing the sample solution in the first wells by sealing liquid
  • the sample solution L1 is filled into each of the first wells W1 independently.
  • this step may be abbreviated as “step (AA2)”.
  • the detection device 100 is divided into a first member 110 and a second member 120, and the first member 110 is used in this step.
  • the process of injecting sample solution L1 containing a detection reagent into internal space S1 from injection port 211 is the same as process (A2), so a description thereof will be omitted.
  • sealing liquid L2 is injected into the internal space S1 from the injection port 211.
  • sealing liquid L2 may be dripped onto the first wells W1 of the first plate 11 to seal each of the first wells W1, or the solution on the first wells W1 may be scraped off with a spatula or the like, and then sealing liquid L2 may be dripped onto the first wells W1 to separate each of the first wells W1.
  • the sealing liquid L2 may be the sealing liquid L2 described above, may be a lipophilic liquid, and may not contain a surfactant.
  • the sealing liquid L2 individually seals each of the multiple first wells W1, and the first wells W1 containing the sample solution L1 become independent reaction spaces.
  • the sample solution L1 replaced with the sealing liquid L2 and the excess sealing liquid L2 are discharged from the discharge port 212.
  • step (AA3) Step of Obtaining Evaluation Objects in First Wells
  • particulate evaluation objects containing target molecules are obtained from the target substance M1 distributed to each first well W1.
  • this step may be abbreviated as “step (AA3)”.
  • the method for obtaining an evaluation item from a target substance is selected depending on the type of target substance in question.
  • the target molecules to be evaluated may be released from the target substance, and the resulting target molecules may be captured by capture particles, which will be described later, to obtain an evaluation item.
  • the target substance is DNA or RNA
  • multiple fragments i.e., the target molecule
  • the target substance is DNA or RNA
  • multiple fragments may be obtained from a single fragment by ultrasonic disruption or enzymatic degradation.
  • the detection device may be heated to separate the individual nucleic acids through thermal denaturation.
  • the target substance is a protein aggregate
  • the aggregates may be loosened by ultrasonic irradiation, an enzyme that breaks down proteins may be used, or a reagent that breaks down protein aggregates may be added.
  • the cell may be disrupted by ultrasound or the cell membrane may be disrupted by applying electrical stimulation.
  • cells which are the target substance, may be cultured in the first well for a certain period of time, and secretions such as cytokines secreted by the cells may be detected as target molecules.
  • the capture particle has a particle and a site to which the target molecule specifically binds.
  • the particles are not particularly limited, and examples include polymer particles, magnetic particles (particles containing a magnetic material), glass particles, etc.
  • the particles are preferably surface-treated to avoid non-specific adsorption.
  • particles having functional groups such as carboxyl groups on the surface are preferred to immobilize specific binding substances. More specifically, products such as "Magnosphere LC300" manufactured by JSR Corporation can be used.
  • the site to which the target molecule specifically binds can be selected from the same group as the specific binding substances described above, depending on the type of target molecule to be captured.
  • the radius of the captured particles is preferably 0.5 ⁇ m or more and 2.5 ⁇ m or less, and more preferably 1 ⁇ m or more and 2 ⁇ m or less.
  • the density of the captured particles may be greater or less than the density of water, where the density of water at 20° C. is 1 g/ml (g/cm 3 ).
  • the density of the captured particles may be, for example, 0.7 g/cm 3 or more and 1.3 g/cm 3 or less, or 0.8 g/cm 3 or more and 1.2 g/cm 3 or less.
  • step (AA4) Step of distributing one molecule of the evaluation substance to each second well
  • the evaluation substance in the sample solution L1 is distributed to each second well W2, one molecule at a time.
  • this step may be abbreviated as “step (AA4)”.
  • Process (AA4) differs from process (A4) in the following respects, but is otherwise the same, so a description of it will be omitted.
  • the first well W1 and the second well W2 are connected as shown in FIG. 10, and the evaluation object E in the first well W1 moves to the second well W2.
  • the evaluation object E contains the target molecule M2.
  • T d1 / v ... (1)
  • T (unit: sec) is the contact time.
  • d1 (unit: ⁇ m) is the diameter of the evaluation object.
  • v (unit: ⁇ m/sec) is the migration speed of the evaluation substance in the sample solution from the first well to the second well)
  • the contact time T is preferably longer than the time represented by the following formula (1)-1.
  • T d2 / v ... (1) - 1 (d2 (unit: ⁇ m) is the distance from the bottom surface of the first well to the surface where the second well is formed when the surface where the first well is formed and the surface where the second well is formed are brought into contact with each other.)
  • the detection device 100 Before the formation surface of the first well is brought into contact with the formation surface of the second well, the detection device 100 may be left stationary and the evaluation object may be moved within the first well toward the formation surface of the first well.
  • the time for leaving the device stationary may also be set according to the depth of the first well W1 using the above-mentioned movement speed v. For example, if the depth of the first well W1 is H, the time for the evaluation object to move to the middle position in the depth direction of the first well W1 can be calculated as H/(2 ⁇ v).
  • the moving speed v in the above formula (1) is a speed represented by the following formula (2).
  • v [2 g r 2
  • g the gravitational acceleration (unit: cm/s 2 )
  • r the radius of the evaluation object (unit: cm)
  • ⁇ the density of the evaluation object (unit: g/cm 3 )
  • ⁇ s the density of the sample solution (unit: g/cm 3 )
  • ⁇ is the viscosity of the sample solution (unit: g/(cm ⁇ s)).
  • the density ⁇ s of the sample solution is the density at 20° C.
  • the density ⁇ s is 0.998 g/cm 3 , and 1 g/cm 3 is used as the approximate value.
  • the physical property values of the sample solution are those of the component with the largest volume ratio among the components that make up the sample solution.
  • an aqueous solution such as a buffer is used as the sample solution.
  • the physical property values of water are used as the physical property values of the sample solution.
  • r can be the radius of the capture particle, and ⁇ can be the density of the capture particle.
  • ⁇ is approximated to 1.05.
  • the short diameter of the cell is measured by taking a magnified image of the cell (magnification: 4-20 times) using a microscope and using image analysis software to measure the short diameter of the cell contained in the image obtained.
  • the "length of the short side" of the "smallest rectangle circumscribing the cell” is taken as the short diameter of the cell.
  • the short diameters of all cells contained in the captured image are measured, and the average value is used as the above r.
  • To calculate the average short diameter of cells measure the short diameters of 10 or more cells according to the method described above. If the number of cells in one enlarged image is less than 10, use multiple enlarged images, measure the short diameters of all cells in each enlarged image until the total number is 10 or more, and calculate the average short diameter.
  • the moving speed v in formula (1) is calculated by substituting the acceleration generated in the captured particle when a magnetic force is applied to the captured particle at the midpoint between the bottom of the first well W1 and the bottom of the second well W2, in place of g in formula (2) above.
  • the acceleration can be calculated by a known method from the magnetic force acting on the captured particle and the physical properties of the captured particle.
  • the evaluation object may be moved by applying a centrifugal force from the first well W1 side to the second well W2 side to the detection device.
  • the moving speed v in formula (1) is calculated by calculating the centrifugal acceleration from the operating conditions (rotation speed, rotation radius) of the centrifuge used, and using the calculated centrifugal acceleration instead of g in formula (2) above.
  • step (AA5) Step of detecting target molecules
  • the target molecules are reacted with the detection reagent to detect the target molecules contained in the evaluation object.
  • this step may be abbreviated as “step (AA5)”.
  • the detection reagent may be placed in the second well W2 in advance, or may be added later.
  • the subject to be evaluated is a cell, it is advisable to culture the cells in the second well W2 for a certain period of time to allow the cells to release the target molecule.
  • the detection method can be the method described in step (A5).
  • the above-described method for detecting target molecules makes it possible to detect target molecules with high accuracy.
  • step (AA1) is performed, but step (AA1) may be omitted. If step (AA1) is not performed, after filling the first wells with the sample solution, a first well W1 in which one target substance M1 is placed may be extracted from among the multiple first wells in step (AA3), and the subsequent steps (A4A) and (AA5) may be performed.
  • the detection device 100 shown in this embodiment is just an example, and detection devices with other configurations can also be used.
  • the detection method for detecting target molecules of this embodiment can be implemented using the detection device 200 described in the second embodiment.
  • [Method for detecting target molecules] 12 to 14 are explanatory diagrams of a method for detecting a target molecule using the detection device 200.
  • the detection device 200 first, the step (AA1) is carried out in the same manner as described above.
  • a sample solution L1 containing a detection reagent is injected into the internal space S (flow path FC) from the injection port 151, and the first well W1 that opens into the internal space S is filled with the sample solution L1.
  • the second well W2 is also filled with the sample solution L1.
  • a sealing liquid L2 containing a surfactant is injected into the internal space S (flow path FC) from the injection port 151.
  • the sealing liquid L2 flows in the internal space S in the planar direction of the well formation surface 11a, and washes away the sample solution L1 that is not contained in the first well W1 and the second well W2 in the internal space S, replacing the internal space S.
  • the sealing liquid L2 individually seals each of the multiple first wells W1 and second wells W2 (step (AA2)).
  • the sample solution L1 replaced with the sealing liquid L2 and the excess sealing liquid L2 are discharged from the discharge port 152.
  • steps (AA3) to (AA5) can be carried out according to the method described above to detect the target molecule.
  • the detection device 200 has an inlet 151 and an outlet 152 in the first plate 15, this is not limited to this.
  • the detection device 200 may have a first plate 11 and a second well plate 16 having an inlet 161 and an outlet 162.
  • the target molecule can be detected with high accuracy.
  • the detection device 100 according to the first embodiment described above was used as the detection device.
  • the first plate 11 and the second plate 12 were produced by injection molding.
  • the first lid member 21 and the second lid member 22 were produced by injection molding. Cycloolefin polymer was used as the forming material.
  • the opening diameter (longer diameter) of the first well was 50 ⁇ m, and the depth of the first well W1 was 50 ⁇ m.
  • the volume of each first well W1 was 98 pL.
  • the opening diameter (longer diameter) of the second well W2 was 10 ⁇ m, and the depth of the second well was 15 ⁇ m.
  • the volume of each second well W2 was 1100 fL.
  • the first plate 11 and the first lid member 21 were attached using double-sided tape (manufactured by Nitto Denko Corporation) to form the first member 110.
  • the second plate 12 and the second lid member 22 were attached using double-sided tape (model number: No. 5610BN, manufactured by Nitto Denko Corporation) to form the second member 120.
  • a cytokine capture antibody (Anti-Mouse IL-2 MAb (Clone JES6-1A12), model number: MAB702-100, R&D Systems, Inc.) was bound to magnetic beads (MS300/Carboxyl, manufactured by JSR Corporation).
  • Magnetic beads bound to cytokine capture antibodies were added to pure water to prepare a magnetic bead solution.
  • the magnetic beads bound to cytokine capture antibodies are the "capture particles.”
  • Example 1A Comparative Example 1A
  • the first member 110 was filled with pure water, and the second member 120 was filled with PBS-T (0.05% by volume of Tween 20).
  • the above-mentioned bead solution was added to the first member 110 so that the amount of capture particles introduced into the first member 110 became 4 ⁇ 10 6 particles.
  • FC-40 containing Tween 20 at a saturated concentration was used as the sealing liquid (sealing liquid 1).
  • FC-40 containing no Tween 20 was used as the sealing liquid (sealing liquid 2).
  • the first plate 11 was removed from the first member 110, and the second plate 12 was removed from the second member 120. 100 ⁇ L of sealing liquid (sealing liquid 1 in Example 1A, sealing liquid 2 in Comparative Example 1A) was added to each well formation surface (State A).
  • the detection device was divided into a first plate 11 and a second plate 12, and 100 ⁇ L of sealing liquid (sealing liquid 1 in Example 1A, sealing liquid 2 in Comparative Example 1A) was added to each well-forming surface.
  • the second lid member 22 was reattached to the second plate 12 to form a second member 120.
  • the first plate 11 and the second plate 12 in state A and the second plate 12 in state B were observed under a microscope.
  • the following equipment was used.
  • Figures 22 to 24 are enlarged photographs showing the results of the working example.
  • Figures 25 to 27 are enlarged photographs showing the results of the comparative example.
  • Figures 22 and 25 are enlarged photographs of the first plate 11 in state A
  • Figures 23 and 26 are enlarged photographs of the second plate 12 in state A
  • Figures 24 and 27 are enlarged photographs of the second plate 12 in state B.
  • Example 1A it was confirmed that beads were present in spots on the second plate 12 in state B, as shown in Figure 24. That is, in the example in which sealing liquid 1 containing a surfactant was used, it is believed that the beads sealed in the first well of the first plate 11 moved to the second well of the second plate 12, resulting in the beads moving in spots to the second well where the first well overlapped.
  • Example 1B Pure water was filled into the first member 110. Next, the above-mentioned magnetic bead solution was added so that the amount of captured particles in the first member 110 became 1 ⁇ 10 6 particles. Furthermore, 500 ⁇ L of FC-40 was filled as a sealing liquid.
  • the second member 120 was filled with 100 ⁇ L of pure water. Then, 200 ⁇ L of FC-40 was filled as a sealing liquid.
  • the first plate 11 was removed from the first member 110, and the second plate 12 was removed from the second member 120. 100 ⁇ L of sealing liquid was added to each well formation surface (state A).
  • the detection device was divided into a first plate 11 and a second plate 12, and 100 ⁇ L of sealing liquid was added to each well-forming surface.
  • the second lid material 22 was reattached to the second plate 12 to form a second member 120.
  • Experimental Example 2B Experimental Example 2 was carried out in the same manner as Experimental Example 1, except that the well-formed surface 11a of the first plate 11 and the well-formed surface 12a of the second plate 12 were bonded together by pressing them against each other for 10 seconds.
  • Experimental Example 3 was carried out in the same manner as Experimental Example 1, except that the well-formed surface 11a of the first plate 11 and the well-formed surface 12a of the second plate 12 were bonded together by pressing them against each other for three minutes.
  • Figures 28 to 32 are enlarged photographs showing the results of the examples.
  • Figure 28 is an enlarged photograph of the first plate 11 in state A
  • Figure 29 is an enlarged photograph of the second plate 12 in state A
  • Figures 30 to 32 are enlarged photographs of the second plate 12 in state B (Figure 30: Experimental Example 1B
  • Figure 31 Experimental Example 2B
  • Figure 32 Experimental Example 3B).
  • the density ⁇ of the trapped particles used was 1.1 g/cm 3 , and the particle radius r of the trapped particles was 1.5 ⁇ m (1.5 ⁇ 10 ⁇ 4 cm).
  • the density ⁇ s of pure water was 1 g/cm 3
  • the viscosity ⁇ was 1 mPa ⁇ s (0.01 g/(cm ⁇ s))
  • the gravitational acceleration was 9.8 ⁇ 10 2 cm/s 2
  • the settling velocity of the trapped particles was calculated to be 0.49 ⁇ m/s from the following formula (2).
  • v [2 g r 2
  • the present invention provides a detection kit that enables highly sensitive detection of target molecules released from a target substance in a solution. It also provides a method for detecting target molecules using such a detection kit.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Automatic Analysis And Handling Materials Therefor (AREA)

Abstract

この検出キットは、標的分子の検出デバイスと、検出デバイスに用いられる封止液と、を有し、封止液は、親油性液体と、界面活性剤との混合液であり、封止液における界面活性剤の濃度は、封止液における界面活性剤の飽和濃度に対して、１体積％以上１００体積％以下であり、検出デバイスは、一面に複数の第１ウェルを有する第１ウェルプレートと、一面に複数の第２ウェルを有する第２ウェルプレートと、を備え、第１ウェルプレートと第２ウェルプレートとは、第１ウェルと第２ウェルとを対向させて配置され、第１ウェルプレートと第２ウェルプレートとの間には、流体が流れる流路が形成され、第１ウェルは、平面視で第２ウェルと重なる。

Description

検出キット及び標的分子の検出方法
　本発明は、検出キット及び標的分子の検出方法に関する。
　本願は、２０２２年１０月２０日に日本に出願された特願２０２２－１６８３４１、及び２０２２年１０月２０日に特願２０２２－１６８３４２号について優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　生体試料中の標的分子を定量的に検出することにより、疾患の早期発見や投薬の効果予測が行われている。例えば、標的分子がタンパク質である場合、定量は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）等により行われている。また、標的分子が核酸である場合、定量はリアルタイムＰＣＲ法等により行われている。
　近年、疾患をより早期に発見する等の目的で、上述のような標的分子をより精度よく検出するニーズが高まっている。標的分子を精度よく検出する手法として、例えば、特許文献１、特許文献２及び非特許文献１には、多数の微小区画内で酵素反応を行い、単分子検出する技術が記載されている。これらの手法はデジタル計測と呼ばれている。
　デジタル計測では、極めて多数の微小区画を有する反応容器（検出デバイスともいう）に充填し、各微少区画に試料溶液を分割する。そして、各微小区画からの信号を２値化し、試料溶液に含まれる標的分子が微少区画内に存在するか否かのみを判別して、標的分子の分子数を計測する。デジタル計測によれば、従来のＥＬＩＳＡやリアルタイムＰＣＲ法等と比較して、検出感度及び定量性を格段に向上させることができる。
特許第５５５１７９８号公報 特表２０１４－５０３８３１号公報
Kim S. H., et al., Large-scale femtoliter droplet array for digital counting of single biomolecules., Lab on a Chip, 12 (23), 4986-4991, 2012.
　デジタル計測技術では、溶液試料中に含まれる標的分子を微小区画に１分子ずつ分配し、標的分子が分配された微小区画の数を計測する。しかし、上述のように標的分子をより精度よく検出するニーズが高まっているなか、標的分子の発生源（標的物質ともいう）に遡り、標的物質から放出される標的分子の量を検出し、定量することが求められていた。例えば、従来のデジタル計測技術では、溶液試料に含まれる細胞（つまり、標的物質）を高精度に検出することは可能であるが、さらに各細胞から分泌されるサイトカイン（つまり、標的分子）を高精度に検出し定量することは困難であった。
　本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであって、溶液中の標的物質から放出される標的分子を高感度で検出可能とする検出キットを提供することを目的とする。また、このような検出キットを用いた標的分子の検出方法を提供することを合わせて目的とする。
　上記方法において、微小区画内に存在する標的分子を再度別の微小区画に分配することが出来れば、標的物質から放出される標的分子、又は標的物質を構成していた標的分子を詳細に解析できる。しかし、微小区画内に存在する物質は、別の微小区画に移動させにくく、改善が求められていた。発明者らは、上記観点から鋭意検討し、発明を完成させた。
　上記の課題を解決するため、本発明の一態様は、以下の態様を包含する。
［１－１］標的分子の検出デバイスと、前記検出デバイスに用いられる封止液と、を有し、前記封止液は、親油性液体と、界面活性剤との混合液であり、前記封止液における前記界面活性剤の濃度は、前記封止液における前記界面活性剤の飽和濃度に対して、１体積％以上１００体積％以下であり、前記検出デバイスは、一面に複数の第１ウェルを有する第１ウェルプレートと、一面に複数の第２ウェルを有する第２ウェルプレートと、を備え、前記第１ウェルプレートと前記第２ウェルプレートとは、前記第１ウェルと前記第２ウェルとを対向させて配置され、前記第１ウェルプレートと前記第２ウェルプレートとの間には、流体が流れる流路が形成され、前記第１ウェルは、平面視で前記第２ウェルと重なる検出キット。
［１－２］標的分子の検出デバイスと、前記検出デバイスに用いられる封止液と、を有し、前記封止液は、親油性液体と、界面活性剤との混合液であり、前記封止液における前記界面活性剤の濃度は、前記封止液における前記界面活性剤の飽和濃度に対して、１体積％以上１００体積％以下であり、前記検出デバイスは、基板と、前記基板上に設けられた壁材と、前記基板に対向し前記壁材に接する蓋材と、を備え、前記蓋材は、厚さ方向に貫通する注入口及び排出口を有し、前記壁材の頂部と前記蓋材との間には、流体が流れる流路が形成され、前記基板と前記壁材とで囲まれた複数の第１ウェルを有する検出キット。
［１－３］前記検出デバイスは、前記基板の上面であって、前記第１ウェルの底部にそれぞれ設けられた複数の第２ウェルを有する［１－２］に記載の検出キット。
［１－４］前記界面活性剤の濃度は、１０体積％以上９０体積％以下である［１－１］から［１－３］のいずれか１項に記載の検出キット。
［１－５］［１－１］に記載の検出キットを用いた標的分子の検出方法であって、標的物質を含む試料溶液を複数の前記第１ウェル毎に充填すると共に、前記封止液によって前記試料溶液を前記第１ウェルに独立させて封止する工程と、複数の前記第１ウェルのうち、１つの前記標的物質が配置された第１ウェルにおいて前記標的物質から前記標的分子を放出させる工程と、前記第２ウェルにバッファーを充填するとともに、前記第１ウェルプレートにおける前記第１ウェルの形成面に、前記第２ウェルプレートにおける前記第２ウェルの形成面を押し付けて接触させ、前記第１ウェルから互いに独立した前記第２ウェル毎に前記標的分子を１分子ずつ分配する工程と、前記標的分子と検出試薬との反応を生じさせ、前記標的分子を検出する工程と、を有する標的分子の検出方法。
［１－６］［１－２］に記載の検出キットを用いた標的分子の検出方法であって、標的物質と前記封止液とを用い、前記親油性液体中に前記標的物質を含む液滴が分散したＷ／Ｏ型のエマルションを調整する工程と、親油性液体を含む液体によって前記第１ウェル毎にバッファーを独立させて封止する工程と、前記流路に前記エマルションを流動させ、前記液体と前記エマルションとを置換する工程と、前記液滴中の前記標的物質から前記標的分子を放出させる工程と、前記蓋材を介して前記エマルションを加圧し、前記エマルションから互いに独立した前記第１ウェル毎に前記液滴を分配する工程と、前記標的分子と検出試薬との反応を生じさせ、前記標的分子を検出する工程と、を有する標的分子の検出方法。
［１－７］［１－３］に記載の検出キットを用いた標的分子の検出方法であって、前記封止液によって前記第２ウェル毎にバッファーを独立させて封止する工程と、標的物質を含む試料溶液を複数の前記第１ウェル毎に充填すると共に、前記試料溶液を前記第１ウェルに独立させて封止する工程と、複数の前記第１ウェルのうち、１つの前記標的物質が配置された第１ウェルにおいて前記標的物質から前記標的分子を放出させる工程と、前記蓋材を介して前記試料溶液を加圧し、前記第１ウェルから互いに独立した前記第２ウェル毎に前記標的分子を１分子ずつ分配する工程と、前記標的分子と検出試薬との反応を生じさせ、前記標的分子を検出する工程と、を有する標的分子の検出方法。
　もう一つの側面として、本発明の一態様は、以下の態様を包含する。
［２－１］検出デバイスを用いた標的分子の検出方法であって、前記検出デバイスは、一面に複数の第１ウェルを有する第１ウェルプレートと、一面に複数の第２ウェルを有する第２ウェルプレートと、を備え、前記第１ウェルプレートと前記第２ウェルプレートとは、前記第１ウェルと前記第２ウェルとを対向させて用いられ、標的物質を含む試料溶液を複数の前記第１ウェル毎に充填すると共に、封止液によって前記試料溶液を前記第１ウェルに独立させて封止する工程と、１つの前記標的物質が配置された第１ウェルにおいて、前記標的物質から前記標的分子を含む粒子状の評価物を得る工程と、前記第２ウェルにバッファーを充填するとともに、前記第１ウェルプレートにおける前記第１ウェルの形成面と、前記第２ウェルプレートにおける前記第２ウェルの形成面とを接触させ、前記第１ウェルから互いに独立した前記第２ウェル毎に前記評価物を１つずつ分配する工程と、前記評価物と検出試薬との反応を生じさせ、前記評価物に含まれる標的分子を検出する工程と、を有し、前記分配する工程において、下記式（１）で表される接触時間より長く、前記第１ウェルの形成面と前記第２ウェルの形成面とを接触させる標的分子の検出方法。
　Ｔ＝ｄ１／ｖ…（１）
（Ｔ（単位：ｓｅｃ）は、接触時間である。
　ｄ１（単位：μｍ）は、前記評価物の直径である。
ｖ（単位：μｍ／ｓｅｃ）は、前記試料溶液において前記評価物が前記第１ウェルから前記第２ウェルに移動する移動速度である。）
［２－２］前記分配する工程において、下記式（１）－１で表される接触時間より長く、前記第１ウェルの形成面と前記第２ウェルの形成面とを接触させる［２－１］に記載の標的分子の検出方法。
　Ｔ＝ｄ２／ｖ…（１）－１
（ｄ２（単位：μｍ）は、前記第１ウェルの形成面と前記第２ウェルの形成面とを接触させたときの、前記第１ウェルの底面から前記第２ウェルの形成面まで距離である。）
［２－３］前記評価物を得る工程において、前記標的物質から放出させた前記標的分子と、前記標的分子が特異的に結合する部位を有する捕捉粒子とを反応させ、前記評価物を得る［２－１］又は［２－２］に記載の標的分子の検出方法。
［２－４］前記分配する工程は、前記検出デバイスを静置して行われ、前記移動速度は、下記式（２）で表される速度である［２－１］から［２－３］のいずれか１項に記載の標的分子の検出方法。
　ｖ＝［２ｇ・ｒ２・｜ρ－ρｓ｜］／９η…（２）
（ｇは重力加速度（単位：ｃｍ／ｓ２）、ｒは前記評価物の半径（単位：ｃｍ）、ρは前記評価物の密度（単位：ｇ／ｃｍ３）、ρｓは試料溶液の密度（単位：ｇ／ｃｍ３）、ηは試料溶液の粘度（単位：ｇ／（ｃｍ・ｓ）を示す。）
［２－５］前記捕捉粒子が磁性材料を含み、前記分配する工程は、前記検出デバイスの外部から前記捕捉粒子に磁力を作用させて行われる［２－３］に記載の標的分子の検出方法。
［２－６］前記分配する工程は、前記検出デバイスに遠心力を加えて行われる［２－１］から［２－３］のいずれか１項に記載の標的分子の検出方法。
　本発明によれば、溶液中の標的物質から放出される標的分子を高感度で検出可能とする検出キットを提供することができる。また、このような検出キットを用いた標的分子の検出方法を提供することができる。
図１は、第１実施形態の検出キット５００を示す模式図である。 図２は、図１の線分ＩＩ－ＩＩにおける矢視断面図である。 図３は、検出デバイス１００の別形態を示す断面図である。 図４は、第１実施形態の標的分子の検出方法の説明図である。 図５は、第１実施形態の標的分子の検出方法の説明図である。 図６は、第１実施形態の標的分子の検出方法の説明図である。 図７は、第１実施形態の標的分子の検出方法の説明図である。 図８は、第１実施形態の標的分子の検出方法の説明図である。 図９は、第１実施形態の標的分子の検出方法の説明図である。 図１０は、第１実施形態の標的分子の検出方法の説明図である。 図１１は、本実施形態の検出デバイス２００を示す矢視断面図である。 図１２は、第２実施形態の標的分子の検出方法の説明図である。 図１３は、第２実施形態の標的分子の検出方法の説明図である。 図１４は、第２実施形態の標的分子の検出方法の説明図である。 図１５は、第３実施形態に係る検出キットが有する検出デバイス３００を示す概略斜視図である。 図１６は、図１５の線分ＸＶ－ＸＶにおける矢視断面図である。 図１７は、第３実施形態の標的分子の検出方法の説明図である。 図１８は、第３実施形態の標的分子の検出方法の説明図である。 図１９は、第４実施形態に係る検出キットが有する検出デバイス４００を示す概略断面図である。 図２０は、第４実施形態の標的分子の検出方法の説明図である。 図２１は、第４実施形態の標的分子の検出方法の説明図である。 図２２は、実施例の結果を示す拡大写真である。 図２３は、実施例の結果を示す拡大写真である。 図２４は、実施例の結果を示す拡大写真である。 図２５は、比較例の結果を示す拡大写真である。 図２６は、比較例の結果を示す拡大写真である。 図２７は、比較例の結果を示す拡大写真である。 図２８は、実験例の結果を示す拡大写真である。 図２９は、実験例の結果を示す拡大写真である。 図３０は、実験例の結果を示す拡大写真である。 図３１は、実験例の結果を示す拡大写真である。 図３２は、実験例の結果を示す拡大写真である。
［第１実施形態］
　以下、場合により図面を参照しつつ、第１実施形態について詳細に説明する。なお、図面中、同一又は相当部分には同一又は対応する符号を付し、重複する説明は省略する。各図における寸法比は、説明のため誇張している部分があり、必ずしも実際の寸法比とは一致しない。
［検出キット］
　図１は、本実施形態の検出キット５００を示す模式図である。検出キット５００は、検出デバイス１００と、油性の封止液Ｌ２とを備える。封止液Ｌ２は、例えば保存容器５０に保存されている。検出キット５００は、液状の試料に含まれる標的分子の検出に用いられる。検出キット５００は、標的分子を検出する検出試薬を含んでいてもよい。
≪検出デバイス≫
　図２は、図１の線分ＩＩ－ＩＩにおける検出デバイス１００の矢視断面図である。
　検出デバイス１００は、第１ウェルプレート１１、第２ウェルプレート１２及び壁材１３を有する。検出デバイス１００は、内部に試料を収容し、試料に含まれる標的物質から標的分子を放出させると共に、標的分子の検出反応を行う反応容器として用いられる。その際、第１ウェルプレート１１において、試料に含まれる標的物質から標的分子を放出させ、第２ウェルプレート１２において、第１ウェルプレートから移動する標的分子を検出する。
　第１ウェルプレート１１と第２ウェルプレート１２とは、壁材１３を介して着脱自在に積層されている。
＜第１ウェルプレート、第２ウェルプレート＞
　第１ウェルプレート１１は、平面視矩形を呈する板状部材である。「平面視」とは、第１ウェルプレート１１の上面の法線方向からの視野を指す。以下の説明においては、第１ウェルプレート１１を「第１プレート１１」と略称することがある。同様に、第２ウェルプレート１２を「第２プレート１２」と略称することがある。
　第１プレート１１は、検出デバイス１００の内面に向いたウェル形成面１１ａに、複数の第１ウェルＷ１を有する。第１ウェルＷ１は、第１プレート１１のウェル形成面１１ａに設けられた凹部であり、ウェル形成面１１ａに開口している。
　第２プレート１２は、平面視矩形を呈する板状部材であり、平面視で第１プレート１１と同じ輪郭形状を呈している。第１プレート１１と第２プレート１２とは、第１ウェルＷ１と第２ウェルＷ２とを対向させ且つ、互いに離間している。
　第２プレート１２は、検出デバイス１００の内面に向いたウェル形成面１２ａに、複数の第２ウェルＷ２を有する。第２ウェルＷ２は、第２プレート１２のウェル形成面１２ａに設けられた凹部であり、ウェル形成面１２ａに開口している。
　第１プレート１１及び第２ウェルプレートの材料は、電磁波透過性を有するものであってもよく、有しないものであってもよい。ここで、透過性判断の対象である電磁波としては、Ｘ線、紫外線、可視光線及び赤外線等が挙げられる。第１プレート１１及び第２ウェルプレートが電磁波透過性を有する場合、検出デバイス１００で行った実験結果を解析するために、電磁波を利用することが可能になる。例えば、電磁波を照射した結果生じる蛍光又は燐光等を、第１プレート１１又は第２ウェルプレートを介して計測することができる。なお、「電磁波透過性」とは、電波・光・Ｘ線・ガンマ線など、種々の波長の電磁波を透過可能である性質を意味する。
　電磁波透過性を有する材料としては、例えば、ガラス及び樹脂等が挙げられる。樹脂としては、例えば、ＡＢＳ樹脂、ポリカーボネート、ＣＯＣ（シクロオレフィンコポリマー）、ＣＯＰ（シクロオレフィンポリマー）、アクリル樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ酢酸ビニル、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）、ＰＥＮ（ポリエチレンナフタレート）、ＰＣ（ポリカーボネート）、シリコーン樹脂、フッ素樹脂、及びアモルファスフッ素樹脂等が挙げられる。これらの樹脂は、各種添加剤を含んでいてもよく、複数の樹脂が混合されたポリマーアロイであってもよい。
　電磁波透過性を有する材料は、自家蛍光を実質的に有しないことが好ましい。自家蛍光を実質的に有しないとは、材料が、試料検出に使用する波長の自家蛍光を全く有しないか、有していても試料検出に影響を与えないほど微弱であることを意味する。例えば、検出対象の蛍光に比べて１／２以下又は１／１０以下程度の自家蛍光であれば、試料検出に影響を与えないほど微弱であるといえる。このような材料を用いて第１プレート１１及び第２ウェルプレートを形成すると、電磁波を利用した試料検出において、検出の感度を高めることができる。
　電磁波透過性を有し、かつ自家蛍光を発しない材料としては、例えば、石英ガラスが挙げられる。自家蛍光が微弱であり、電磁波を用いた試料検出に支障がない素材としては、低蛍光ガラス、アクリル樹脂、ＣＯＣ（シクロオレフィンコポリマー）及びＣＯＰ（シクロオレフィンポリマー）等が挙げられる。
　第１プレート１１の材料は、第２プレート１２の材料よりも柔らかい（つまり、弾性率が低い）ことが好ましい。上述した材料の中では、例えば、第１プレート１１の材料としてはシリコーン樹脂が好ましい。シリコーン樹脂としては、例えばＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）を好適に用いることができる。第１プレート１１と第２プレート１２との材料をいずれもＰＤＭＳとしてもよい。
　第１プレート１１及び第２プレート１２は、上記材料のみを用いた単層の構成であってもよく、複数の材料の積層体であってもよい。積層体を加工して第１プレート１１及び第２ウェルプレートを形成する場合、ウェル（第１ウェルＷ１又は第２ウェルＷ２）を有する層と、当該層を支持する層とは別の材料であってもよい。例えば、基板の上にフッ素樹脂を積層した積層体を第１プレート１１の材料とし、当該フッ素樹脂の層を加工してウェルアレイを形成してもよい。第２プレート１２についても同様である。フッ素樹脂としては、例えばＣＹＴＯＰ（登録商標）（旭硝子）等を用いることができる。
　第２プレート１２の厚さは、適宜決定することが出来る。第２プレート１２第２プレート１２側から蛍光顕微鏡を用いて蛍光を観察する場合には、第２プレート１２の厚さは、例えば５ｍｍ以下であってもよく、２ｍｍ以下であってもよく、１．６ｍｍ以下であってもよい。第１プレート１１の厚さは、発明の効果を損なわない範囲で、適宜決定することができる。
（第１ウェル及び第２ウェル）
　第１ウェルＷ１は、検出デバイス１００の内部に収容した試料を収容し、試料に含まれる標的物質から、標的分子を放出させる場として用いられる。
　また、第２ウェルＷ２は、第１ウェルＷ１で放出された標的分子を収容し、標的物質と、標的物質の検出試薬との反応場として機能する。
（ウェルの形状）
　第１ウェルＷ１及び第２ウェルＷ２の形状は、種々の形状を採用することができる。例えば円筒形、楕円筒形、多角筒形等の筒形、円錐形及び角錐形等の錘形；並びに円錐台及び角錐台等の錘台形を例示できる。第１ウェルＷ１及び第２ウェルＷ２が錐形又は錘台形の場合、開口径がウェルの深さ方向に漸減する形状であるとよい。
　第１ウェルＷ１及び第２ウェルＷ２の底部は、平坦であってもよく、曲面（凸面や凹面）であってもよい。
　第１ウェルＷ１の平面視形状が円形の場合、第１ウェルＷ１の開口部の直径（開口径ともいう）は、例えば１０～５００μｍ程度であってもよい。第２ウェルＷ２の平面視形状が円形の場合、第２ウェルＷ２の開口部の直径（開口径ともいう）は、例えば１～１００μｍ程度であってもよい。第１ウェルＷ１の開口径は、第２ウェルＷ２の開口径よりも大きいことが好ましい。
　第１ウェルＷ１の深さは、例えば５～５００μｍ程度であってもよい。「第１ウェルＷ１の深さ」とは、「ウェル形成面１１ａと平行であってウェル形成面１１ａに接する仮想平面」から「第１ウェルＷ１の最深部」までの距離を指す。
　また、第２ウェルＷ２の深さは、例えば１～１００μｍ程度であってもよい。「第２ウェルＷ２の深さ」とは、「ウェル形成面１２ａと平行であってウェル形成面１２ａに接する仮想平面」から「第２ウェルＷ２の最深部」までの距離を指す。
（ウェルの数）
　検出デバイス１００は、第１ウェルＷ１を１０～１００００個有する。また、検出デバイス１００において、第１ウェルＷ１は、平面視で第２ウェルＷ２と重なって配置される。このとき、第１ウェルＷ１は、平面視で第２ウェルＷ２と１：１で重なる構成であってもよく、平面視で２以上の第２ウェルＷ２と重なる構成であってもよい。
　１つの第１ウェルＷ１と平面視で重なる第２ウェルＷ２の個数は１～１００００個であり、１０～１００００個であると好ましい。すなわち、第２プレート１２は、上記個数を満たす数の第２ウェルＷ２が形成されているとよい。
　上述の第１プレート１１及び第２プレート１２は、公知の射出成形、マイクロインプリンティング技術やナノインプリンティング技術を用いて製造することができる。また、第１プレート１１及び第２プレート１２は、公知のフォトリソグラフィ技術を用い、エッチングでウェルを形成することで製造することもできる。
＜壁材＞
　壁材１３は、平面視で閉環状に形成され、第１プレート１１と第２プレート１２とに挟持されている。壁材１３は、第１プレート１１と第２プレート１２とを離間させ、第１プレート１１と第２プレート１２との間の空間を生み出すスペーサとして機能する。
　壁材１３の材料は、上述した第１プレート１１及び第２プレート１２と同じ材料を採用することができる。このような材料で形成された壁材１３は、接着剤による接着；又は熱溶着、超音波溶着及びレーザー溶着等による溶着により、第１プレート１１又は第２プレート１２と一体とすることができる。
　また壁材１３の材料は、第１プレート１１及び第２プレート１２とは異なっていてもよい。壁材１３は、例えば両面テープや接着剤でもよい。両面テープの基材は、プラスチックでもよく、紙材でもよい。接着剤は、グリスでもよく、α－シアノアクリレートなどの成分を有する急速硬化性の接着剤でもよい。
　なお、壁材１３は、第１プレート１１及び第２プレート１２のいずれか一方の製造時に同時に（つまり一体的に）形成され、第１プレート１１又は第２プレート１２と一体であってもよい。
　検出デバイス１００は、使用に際し、第１プレート１１及び第２プレート１２に分離して用いる。図３は、検出デバイス１００の別形態を示す断面図である。
　第１部材１１０は、第１プレート１１と、第１プレート１１と着脱自在の第１蓋材２１と、第１プレート１１と第１蓋材２１とに挟持された第１壁材３１と、を有する。
　第１蓋材２１は、平面視で第１プレート１１と同じ輪郭形状を呈している。
　第１蓋材２１には、厚さ方向に貫通する２つの貫通孔を有する。２つの貫通孔は、第１蓋材２１の一端側と他端側とにそれぞれ設けられている。一方の貫通孔は、第１部材１１０の内部空間Ｓ１に液状物を注入する際に用いる注入口２１１であり、他方の貫通孔は、内部空間Ｓ１から液状物を排出させる際に用いる排出口２１２である。
　ここで、「液状物」には、液状の試料の他、検出試薬や封止液も該当する。
　注入口２１１、内部空間Ｓ１及び排出口２１２は、この順に連通し、全体として流路ＦＣ１を形成している。第１部材１１０では、流路ＦＣ１に液状物を適宜流動させて、標的物質を第１ウェルＷ１に封止する。平面視において、注入口２１１と排出口２１２との間に、複数の第１ウェルＷ１が配置されている。
　第１蓋材２１の上面２１ａには、注入口２１１の周囲を囲む筒状の注入ポート２１５が設けられている。注入ポート２１５は、注入口２１１と連通している。注入ポート２１５は、例えば、液状物を充填したシリンジを用いて内部空間に液状物を充填する際、シリンジの接続に用いる。
　同様に、第１蓋材２１の上面２１ａには、排出口２１２の周囲を囲む筒状の排出ポート２１６が設けられている。排出ポート２１６は、排出口２１２と連通している。排出ポート２１６は、例えば、内部空間Ｓ１から液状物を抜き出す際に、液状物が流動するチューブの接続に用いる。
　また、第２部材１２０は、第２プレート１２と、第２プレート１２と着脱自在の第２蓋材２２と、第２プレート１２と第２蓋材２２とに挟持された第２壁材３２と、を有する。
　第２蓋材２２は、平面視で第２プレート１２と同じ輪郭形状を呈している。
　第２蓋材２２には、厚さ方向に貫通する注入口２２１と排出口２２２を有する。注入口２２１、第２部材１２０の内部空間Ｓ２及び排出口２２２は、この順に連通し、全体として流路ＦＣ２を形成している。第２部材１２０では、流路ＦＣ２に液状のバッファーを流動させて第２ウェルＷ２に封入する。平面視において、注入口２２１と排出口２２２との間に、複数の第２ウェルＷ２が配置されている。
　第２蓋材２２の上面２２ａには、注入口２２１の周囲を囲み注入口２２１と連通する筒状の注入ポート２２５が設けられている。また、上面２２ａには、排出口２１２の周囲を囲み排出口２１２と連通する筒状の排出ポート２２６が設けられている。
　第１蓋材２１及び第２蓋材２２の材料は、上述した第１プレート１１及び第２プレート１２の材料として例示した材料を採用することができる。第１蓋材２１及び第２蓋材２２は、公知の射出成形にて製造することができる。
≪封止液≫
　封止液Ｌ２は、親油性液体と、界面活性剤との混合液である。親油性液体（いわゆる、オイル）としては、フッ素系オイル、シリコーン系オイル、炭化水素系オイル又はこれらの混合物等を使用することができる。
　親油性液体として、より具体的には、シグマ社製の商品名「ＦＣ－４０」（ＣＡＳ番号：８６５０８－４２－１）等を用いることができる。ＦＣ－４０はフッ素化脂肪族化合物（フッ素系オイル）であり、２５℃における比重が１．８５ｇ／ｍＬである。
　界面活性剤としては、イオン性界面活性剤、非イオン性（ノニオン性）界面活性剤のいずれも用いることができる。また、界面活性剤は、一般に生化学実験用として使用可能な界面活性剤が好ましい。細胞を標的物質にする場合は、細胞膜を破壊しない又は細胞膜を破壊しにくい界面活性剤が好ましい。なお、細胞を標的物質にする場合、封止液における界面活性剤の濃度を細胞の変質や破砕が生じない濃度に調整するとよい。
　イオン性界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤及び両性界面活性剤が挙げられる。
　陰イオン性界面活性剤としては、例えばドデシル硫酸ナトリウム、コール酸ナトリウム及びデオキシコール酸ナトリウム等が挙げられる。
　両性界面活性剤としては、例えばＣＨＡＰＳ及びＣＨＡＰＳＯが挙げられる。
　ＣＨＡＰＳ：3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonate
　ＣＨＡＰＳＯ：3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-2-hydroxypropanesulfonate
　非イオン性界面活性剤としては、例えば、下記の化合物が挙げられる。
　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００（ポリエチレングリコール－ｔｅｒｔ－オクチルフェニルエーテル（ｎ＝約１０））、
　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１１４（ポリエチレングリコール－ｔｅｒｔ－オクチルフェニルエーテル）
　Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ－４０（オクチルフェノキシポリ（エチレンオキシ）エタノール）、
　Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート）、
　Ｔｗｅｅｎ４０（ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミタート）
　Ｔｗｅｅｎ６０（ポリオキシエチレンソルビタンモノステアラート）
　Ｔｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）
　Ｔｗｅｅｎ８５（ポリオキシエチレンソルビタントリオレアート）
　Ｂｒｉｊ－３５（ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル）
　Ｂｒｉｊ－５８（ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル
　n-Octyl-β-D-glucoside
　Octyl glucoside
　Octyl thioglucoside
　サーフロンＳ－３８６（フッ素系界面活性剤、ＡＧＣセイミケミカル株式会社製）
　００８－ＦｌｕｏｒｏＳｕｒｆａｃｔａｎｔ（フッ素系界面活性剤、RAN Biotechnologies社製）
　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００は、ポリエチレングリコール部分の繰り返し数が９又は１０であり、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１１４は、ポリエチレングリコール部分の繰り返し数が７又は８である。
　封止液Ｌ２における界面活性剤の濃度は、封止液における界面活性剤の飽和濃度に対して、１体積％以上１００体積％以下が好ましく、１０体積％以上９０体積％以下がより好ましい。封止液Ｌ２に用いる親油性液体の種類に応じて、さらに適切な界面活性剤の濃度は異なる。そのため、適宜予備実験を行い界面活性剤の濃度を調整するとよい。
　封止液Ｌ２は、後述する検出方法において希釈して用いてもよい。そのため、検出キット５００は、界面活性剤を含まない親油性溶液のみをさらに付属し、封止液Ｌ２の希釈に用いることとしてもよい。
［標的分子の検出方法１］
　図４～９は、本実施形態の標的分子の検出方法の説明図である。標的分子の検出方法は、以下の操作を行う工程を含む。標的分子の検出方法においては、上記検出デバイス１００を用い、試料に含まれる検出デバイス１００の第２ウェルＷ２において標的分子を検出する。
（Ａ１）標的物質を含む液状の試料の濃度を調整し、試料溶液を得る工程
（Ａ２）封止液によって試料溶液を第１ウェルに独立させて封止する工程
（Ａ３）第１ウェルにおいて標的物質から標的分子を放出させる工程
（Ａ４）第２ウェル毎に標的分子を１分子ずつ分配する工程
（Ａ５）標的分子を検出する工程
（Ａ１）標的物質を含む液状の試料の濃度を調整し、試料溶液を得る工程
　まず、標的物質を含む液状の試料の濃度を調整し、試料溶液Ｌ１を得る。以下、本工程を「工程（Ａ１）」と略記することがある。以下の説明では、各工程について同様に略記することがある。
　試料は、例えば、生体試料又は環境試料を含む。生体試料としては、特に制限されず、血清、血漿、尿、及び細胞培養液等が挙げられる。また、環境試料としては、例えば、河川の水及び工場排水等が挙げられる。
　生体試料及び環境試料は、検出対象である標的分子を放出する標的物質を含む。標的物質としては、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ウイルス、細胞、及び特定化合物等が挙げられる。ＲＮＡとしては、ｍｉＲＮＡ及びｍＲＮＡ等が挙げられる。また、細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、植物細胞、及び昆虫細胞等が挙げられる。
　試料は、標的物質を検出する反応試薬を含んでいてもよい。反応試薬としては、緩衝物質、酵素、基質、抗体、及び抗体断片等が挙げられる。酵素は、例えば標的物質が核酸である場合には、標的物質に関連する鋳型核酸に対する酵素反応等の生化学的反応を行うために、生化学的反応の内容に対応して選択される。鋳型核酸に対する生化学的反応は、例えば、鋳型核酸が存在する条件下でシグナル増幅が起こるような反応である。
　また、タンパク質を検出する場合、抗体に酵素を結合させ、酵素反応で検出してもよい。検出酵素はＨＲＰやＡｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、βガラクトシダーゼなどを使用してもよい。
　反応試薬は、採用する検出反応に応じて選択される。具体的な検出反応としては、Ｉｎｖａｓｉｖｅ　Ｃｌｅａｖａｇｅ　Ａｓｓａｙ（ＩＣＡ）法、ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）法（商標登録）、５’→３’ヌクレアーゼ法（ＴａｑＭａｎ（登録商標）法）、及び蛍光プローブ法等が挙げられる。
　試料は、界面活性剤を含んでいてもよい。界面活性剤としては、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００（ポリエチレングリコールモノ－４－オクチルフェニルエーテル（ｎ＝約１０）ともいう）、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ－４０（オクチルフェノキシポリ（エチレンオキシ）エタノールともいう）及びＴｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラートともいう）等が挙げられる。
　試料の濃度は、用いる検出デバイス１００の容積に基づいて、第１ウェルＷ１毎に１個の標的物質Ｍ１が配置される濃度に調整する。試料の濃度は、検出デバイス１００を用いて、予備実験を行い、決定するとよい。
（Ａ２）封止液によって試料溶液を第１ウェルに独立させて封止する工程
　次いで、試料溶液Ｌ１を複数の第１ウェルＷ１毎に独立して充填する。以下、本工程を「工程（Ａ２）」と略記することがある。検出デバイス１００は、第１部材１１０、第２部材１２０に分割しておき、本工程では第１部材１１０を用いる。
　まず、図４に示すように、注入口２１１から内部空間Ｓ１に、検出試薬を含む試料溶液Ｌ１を注入する。試料溶液Ｌ１が内部空間Ｓ１（流路ＦＣ１ともいう）を流動すると、内部空間Ｓ１に開口している第１ウェルＷ１に試料溶液Ｌ１が充填される。
　内部空間Ｓ１及び全ての第１ウェルＷ１が試料溶液Ｌ１で充填された後、流路ＦＣ１を通過した試料溶液Ｌ１は排出口２１２から排出される。
　このとき、試料溶液Ｌ１の濃度をあらかじめ調整しておくことにより、１つの第１ウェルＷ１に１つの標的物質Ｍ１が充填される。具体的には、内部空間Ｓ１の容積（言い換えれば、内部空間Ｓ１に注入される試料溶液Ｌ１の体積）と、第１ウェルＷ１の総数とが既知の場合、内部空間Ｓ１に注入される標的物質Ｍ１の数が、例えば第１ウェルＷ１の総数の１／１０以下になるように試料溶液Ｌ１の濃度を調整する。この操作により、１つの第１ウェルＷ１に１つ以下、すなわち、０個又は１個の標的物質Ｍ１が充填される。
　標的物質Ｍ１を第１ウェルＷ１に導入する手段は、特に制限されず、検出対象である標的物質Ｍ１に応じた適切な手段を選択することができる。例えば、標的物質Ｍ１を自重により第１ウェルＷ１に分配してもよいし、拡散による分配で第１ウェルＷ１に導入してもよい。
　また、標的物質Ｍ１を捕捉する物質（捕捉物ともいう）を利用し、自重で沈降しにくい標的物質Ｍ１に捕捉物を結合させて送液してもよい。さらに、予め第１ウェルＷ１に捕捉物を固定しておき、試料溶液と共に送液された標的物質Ｍ１を捕捉物に捕捉させることで、標的物質Ｍ１の第１ウェルＷ１への導入効率を向上させることもできる。
　または、捕捉物を第１ウェルＷ１に導入した後に、標的物質Ｍ１を第１ウェルＷ１に導入し、第１ウェルＷ１で捕捉物と標的物質Ｍ１とを接触させてもよい。
　捕捉物は、標的物質Ｍ１を捕捉することができる物質である。捕捉物は、例えば、固相と標的物質Ｍ１に対する特異的結合物質との結合体であってもよい。
　特異的結合物質としては、抗体、抗体断片、及びアプタマー等が挙げられる。抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド安定化抗体（ｄｓＦｖ）、２量化体Ｖ領域断片（Ｄｉａｂｏｄｙ）、及びＣＤＲを含むペプチド等が挙げられる。抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。また、市販の抗体であってもよい。
　また、標的物質Ｍ１が糖鎖を含む場合、特異的結合物質は、レクチンであってもよい。また、標的物質Ｍ１が脂質膜を含む場合、特異的結合物質は、脂質膜に結合性を有する物質であってもよい。脂質膜に結合性を有する物質としては、例えば、ヘキサンジオール等の炭化水素及び膜貫通タンパク質等の膜タンパク質が挙げられる。膜タンパク質としては、例えばα－ヘモリシン等が挙げられる。
　補足物を構成する固相としては、粒子、膜及び基板等が挙げられる。また、標的物質Ｍ１に対する特異的結合物質は１種類でもよいし、２種類以上であってもよい。例えば３種類であってもよいし、４種類であってもよいし、５種類以上であってもよい。
　粒子としては、特に制限されず、ポリマー粒子、磁気粒子及びガラス粒子等が挙げられる。粒子は、非特異的な吸着を避けるための表面処理が施された粒子が好ましい。また、特異的結合物質を固定するために、表面にカルボキシル基等の官能基を有する粒子が好ましい。より具体的には、ＪＳＲ社製の商品名「Ｍａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ　ＬＣ３００」等を用いることができる。
　特異的結合物質を固相に固定する方法としては、特に制限されず、物理吸着による方法、化学結合による方法、アビジン－ビオチンの結合を利用する方法、及びプロテインＧ又はプロテインＡと抗体との結合を利用する方法等が挙げられる。
　物理吸着による方法としては、疎水的相互作用又は静電的相互作用により、特異的結合物質を粒子表面に固定する方法が挙げられる。
　化学結合による方法としては、架橋剤を使用する方法が挙げられる。例えば、粒子の表面が水酸基を有する場合、特異的結合物質が有するカルボキシル基に架橋剤を反応させて活性エステル化した後、水酸基とこのエステル基とを反応させることにより、特異的結合物質を粒子表面に固定することができる。
　特異的結合物質による標的物質Ｍ１の認識能を阻害しないよう、特異的結合物質と粒子表面との間にスペーサを設けることが好ましい。
　また、例えば標的物質Ｍ１としてウイルスを用いる場合、ウイルスが付着することができる細胞（すなわち、ウイルス受容体を有する細胞）を、捕捉物として用いてもよい。
　次いで、図５に示すように、注入口２１１から内部空間Ｓ１に、封止液Ｌ２を注入する。封止液Ｌ２は、保存容器５０に入っている封止液Ｌ２の原液でもよく、封止液Ｌ２を希釈した液でもよい。
　封止液Ｌ２は、内部空間Ｓ１においてウェル形成面１１ａの面方向に流動し、流路ＦＣ１に送液された試料溶液Ｌ１のうち、第１ウェルＷ１に収容されていない試料溶液Ｌ１を押し流して、内部空間Ｓ１を置換する。
　これにより、封止液Ｌ２は、複数の第１ウェルＷ１をそれぞれ個別に封止し、試料溶液Ｌ１を収容した第１ウェルＷ１は独立した反応空間となる。封止液Ｌ２で置換された試料溶液Ｌ１及び余剰の封止液Ｌ２は、排出口２１２から排出される。
（Ａ３）第１ウェルにおいて標的物質から標的分子を放出させる工程
　次いで、第１ウェルＷ１毎に分配した標的物質Ｍ１から、標的分子を放出させる。以下、本工程を「工程（Ａ３）」と略記することがある。
　標的物質から標的分子を放出させる方法は、対象となる標的物質の種類に応じて選択される。例えば、標的物質がＤＮＡやＲＮＡである場合は、超音波破砕又は酵素分解により、１つのフラグメントから複数のフラグメント（つまり、標的分子）を得てもよい。
　標的物質が、核酸同士のハイブリダイゼーションによる会合体である場合は、検出デバイス１００を加熱し、熱変性により各核酸を分離させてもよい。
　標的物質がタンパク質の凝集体である場合は、超音波照射により凝集体をほぐしてもよく、タンパク質を分解する酵素を用いてもよく、タンパク質凝集を解除する試薬を添加してもよい。
　標的物質が細胞であれば、細胞を超音波で破砕してもよく、電気刺激を与えて細胞膜を破砕してもよい。
　具体的な方法としては、以下のような方法が挙げられる。
　まず、第１ウェルＷ１にビーズを配置する。ビーズは、第１ウェルＷ１に予め配置していてよく、細胞を含む溶液に加え細胞と第１ウェルＷ１に配置してもよい。ビーズは、発明の効果を阻害せず、また第１ウェルＷ１に配置可能な大きさであれば制限はない。ビーズの材料は、シリカでもよく、磁性を帯びた材料であってもよい。
　ビーズの大きさは、５０ｎｍ～５００μｍであると好ましく、１００ｎｍ～１００μｍであるとより好ましく、５００ｎｍ～１０μｍであるとさらに好ましい。
　第１ウェルＷ１には、少なくとも１０個以上のビーズが配置されると好ましい。
　次に、標的物質である細胞とビーズとの両方が第１ウェルＷ１に入っている状態で、上記工程（Ａ２）により第１ウェルＷ１を独立させ、細胞を培養する。一定時間細胞を培養した後、検出デバイス１００に超音波を照射する。ビーズを第１ウェルＷ１内で振動させることで細胞の細胞壁をビーズにより破砕し、細胞の内容物を第１ウェルＷ１内に放出させることができる。
　また、標的物質Ｍ１が細胞であれば、細胞膜を溶解する試薬を用い、細胞膜を溶解させてもよい。
　具体的な方法としては、以下のような方法が挙げられる。
　まず、細胞を含む溶液と細胞膜を溶解する試薬（細胞溶解液ともいう）とを混ぜる。細胞を含む溶液と細胞溶解液とは、検出デバイス１００に注入する前に混合してもよく、検出デバイス１００内で混合してもよい。
　細胞を含む溶液と細胞溶解液とを検出デバイス１００内で混合する場合、まず、細胞を含む溶液を第１ウェルＷ１に注入した後、細胞溶解液を第１ウェルＷ１に注入する方法が挙げられる。第１ウェルＷ１に細胞溶解液を加える方法としては、第１ウェルＷ１に配置した細胞が第１ウェルＷ１から出ない流速で検出デバイス１００に加える、又は細胞を第１ウェルＷ１内に固定しておく等の方法が考えられる。
　細胞を第１ウェルＷ１内に固定する方法としては、第１ウェルＷ１に細胞の捕捉物を結合させる方法であってよいし、補足物が結合した粒子を第１ウェルＷ１内に配置する方法であってもよい。「捕捉物」としては、細胞と結合する抗体が挙げられる。補足物が結合した粒子を用いる場合、粒子として磁性ビーズを用い、第１ウェルＷ１に細胞溶解液を加える際に、磁力により粒子を第１ウェルＷ１内に留めておくとよい。
　細胞溶解液としては、界面活性剤や市販の試薬などを用いることができる。
　第１ウェルＷ１内に細胞と細胞溶解液を加えた後、工程（Ａ２）により第１ウェルＷ１を独立させ、一定時間反応させることで細胞膜を溶解させる。これにより、細胞の内容物を第１ウェルＷ１内に放出させることができる。
　また、第１ウェルＷ１において標的物質である細胞を一定時間培養し、細胞から分泌されるサイトカインなどの分泌物を標的分子として検出することとしてもよい。
（Ａ４）第２ウェル毎に標的分子を１分子ずつ分配する工程
　次いで、試料溶液Ｌ１に放出された標的分子を、第２ウェルＷ２毎に１分子ずつ分配する。以下、本工程を「工程（Ａ４）」と略記することがある。
　まず、図６に示すように、第２部材１２０の注入口２２１から内部空間Ｓ２に、液状のバッファーＢを注入する。バッファーＢは、標的分子の検出試薬を含んでいるとよい。バッファーＢが内部空間Ｓ２（流路ＦＣ２）を流動すると、内部空間Ｓ２に開口している第２ウェルＷ２にバッファーＢが充填される。
　内部空間Ｓ２及び全ての第２ウェルＷ２がバッファーＢで充填された後、流路ＦＣ２を通過したバッファーＢは排出口２２２から排出される。
　次いで、図７に示すように、注入口２２１から内部空間Ｓ２に、封止液Ｌ２を注入する。封止液Ｌ２は、内部空間Ｓ１においてウェル形成面１２ａの面方向に流動し、流路ＦＣ２に送液されたバッファーＢのうち、第２ウェルＷ２に収容されていないバッファーＢを押し流して、内部空間Ｓ２を置換する。
　封止液Ｌ２としては、上記工程（Ａ２）で用いた封止液と同じものを用いることができる。工程（Ａ２）で用いる封止液と、本工程で用いる封止液とは、同じであってもよく異なっていてもよい。工程（Ａ２）で用いる封止液と、本工程で用いる封止液とが異なる場合、いずれか一方の封止液に界面活性剤が含まれていればよい。
　これにより、封止液Ｌ２は、複数の第２ウェルＷ２をそれぞれ個別に封止し、バッファーＢが収容された第２ウェルＷ２が独立する。封止液Ｌ２で置換されたバッファーＢ及び余剰の封止液Ｌ２は、排出口２２２から排出される。
　次いで、第１部材１１０から第１蓋材２１を取り外し、第１プレート１１とする。また、第２部材１２０から第２蓋材２２を取り外し、第２プレート１２とする。これらのウェルプレートのウェル形成面１１ａ及び１２ａは、封止液Ｌ２で覆われている。
　次いで、図８に示すように、第１プレート１１のウェル形成面１１ａと、第２プレート１２のウェル形成面１２ａとを対向させて重ね合わせ、検出デバイス１００を形成する。このとき、第１ウェルＷ１は、平面視で第２ウェルＷ２と重なって配置される。
　さらに、検出デバイス１００において、第１プレート１１と第２プレート１２とを加圧し相互に押し付け、ウェル形成面１１ａとウェル形成面１２ａとを接触させる。第１プレート１１と第２プレート１２と押し付ける際は、実験者が手で直接押してもよく、クリップやローラーなどの器具を用いて押してもよい。また、第１プレート１１と第２プレート１２とを押し付ける圧力は、実験者自身の力によるものであってもよく、重りやクリップなどの治具を用いたものであってもよい。
　これにより、図９に示すように、第１ウェルＷ１と第２ウェルＷ２とが連通し、第１ウェルＷ１内の標的分子Ｍ２が、第２ウェルＷ２に拡散して移動する。
　発明者らは、封止液が界面活性剤を含むことにより、本工程における第１ウェルＷ１から第２ウェルＷ２への物質移動が効果的に進むことを確認した。図８に示すように第１プレート１１と第２プレート１２とを押し付ける場合、封止液Ｌ２に界面活性剤が含まれると、界面活性剤を含まない場合と比べて封止液Ｌ２の表面張力が小さく、第１ウェルＷ１と第２ウェルＷ２との間の封止液Ｌ２が貫通しやすいと考えられる。これにより、図９に示すように第１ウェルＷ１と第２ウェルＷ２とが連通した状態を形成しやすく、第１ウェルＷ１から第２ウェルＷ２への物質移動が効果的に進むと考えられる。
　第２ウェルＷ２に移動した標的分子Ｍ２は、第２ウェルＷ２内の試料溶液Ｌ１に溶けていてもよく、第２ウェルＷ２に固定されている標的分子捕捉物質に捕捉されていてもよい。標的分子捕捉物質は、標的分子Ｍ２と特異的に結合する官能基を有する物質であり、例えば標的分子Ｍ２がタンパク質であれば抗体、標的分子Ｍ２が核酸であれば、相補鎖を組む核酸であってもよい。
　また、標的分子捕捉物質を有する粒子（以下、捕捉粒子）を第１ウェルＷ１に配置した状態で、第１ウェルＷ１において標的物質Ｍ１から標的分子Ｍ２を放出させ、放出された標的分子Ｍ２を、捕捉粒子に捕捉させてもよい。標的分子Ｍ２を捕捉した捕捉粒子を第１ウェルＷ１から第２ウェルＷ２に移動させることで、第２ウェルＷ２に標的分子Ｍ２を導入することができる。
　上述のような捕捉粒子を用いる場合、試料溶液Ｌ１と捕捉粒子との比重差を利用して捕捉粒子を沈降または浮上させ、捕捉粒子を第１ウェルＷ１から第２ウェルＷ２に移動させることとしてもよい。また、捕捉粒子に磁性ビーズを用いる場合、検出デバイス１００の外部から磁力を用いて捕捉粒子の挙動を制御してもよい。
（Ａ５）標的分子を検出する工程
　次いで、標的分子Ｍ２と検出試薬との反応を生じさせ、標的分子Ｍ２を検出する。以下、本工程を「工程（Ａ５）」と略記することがある。
　検出方法としては、例えば、封止された第２ウェルＷ２の内部でシグナル増幅反応を行う方法が挙げられる。第２ウェルＷ２の内部において、検出試薬由来のシグナルが検出されるようにシグナルを増幅させる。
　シグナルとしては、蛍光、発色、電位変化、及びｐＨ変化等が挙げられる。
　シグナル増幅反応は、例えば生化学反応、より具体的には酵素反応であってもよい。一例として、シグナル増幅反応は、シグナル増幅のための酵素を含んだ試薬液が第２ウェルＷ２内に収容された状態で、検出デバイス１００を、所望の酵素活性が得られる一定温度条件下、例えば６０℃以上、好ましくは約６６℃で、所定時間、例えば少なくとも１０分間、好ましくは約１５分間、維持する等温反応である。
　シグナル増幅反応の例としては、具体的には、標的分子Ｍ２が核酸である場合は、インベーダー（登録商標）法等のＩＣＡ反応や、ループ介在等温増幅法（ＬＡＭＰ法（商標登録））、５’→３’ヌクレアーゼ法（ＴａｑＭａｎ（登録商標）法）、蛍光プローブ法等が挙げられる。これらの方法であれば、溶液中に上述した界面活性剤（細胞溶解液）が含まれていても、シグナル増幅反応を生じさせることができると考えられる。
　また、シグナル増幅反応の際、細胞溶解液が反応を阻害する場合には、第２ウェルＷ２内の溶液を置換してもよい。その場合、標的分子Ｍ２を第２ウェルＷ２内に固定した上で外部から検出試薬を加えてもよい。
　標的分子を第２ウェルＷ２内に固定する方法としては、第２ウェルＷ２内に標的分子Ｍ２を捕捉する物質を結合させてもよく、標的分子Ｍ２を捕捉する化合物が結合した磁性粒子を第２ウェルＷ２に加えておき、磁力で磁性粒子を固定することしてもよい。
　シグナル増幅反応としては、ＩＣＡ反応を用いることが特に好ましい。ＩＣＡ反応は、（１）核酸同士の相補的結合と、（２）酵素による三重鎖構造の認識および切断との２つの反応のサイクルによってシグナル増幅が進行する。このようなシグナル増幅反応においては、標的分子以外の夾雑物による反応サイクル阻害の影響が小さい。したがって、第２ウェルＷ２内に標的分子以外の様々な成分（夾雑物）が存在する場合でも、ＩＣＡ反応を用いることにより、標的分子を精度よく検出することができる。
　例えば、シグナル増幅反応にＩＣＡ反応を用いる場合、試料溶液Ｌ１は、ＩＣＡ反応に必要な反応試薬及び鋳型核酸を含む。反応工程における生化学反応がＩＣＡ反応である場合、標的分子が存在する第２ウェルＷ２では、蛍光物質が消光物質から遊離することによって、励起光に対応して所定の蛍光シグナルを発する。
　また、標的分子の検出は、標的分子に特異的に結合する物質（特異的結合物質）を標的分子に結合させ、結合した特異的結合物質を検出することによっても、行うことができる。例えば、標的分子がタンパク質である場合、ＥＬＩＳＡを用いて検出することができる。より具体的には、検出は、例えばＦＲＥＴの原理を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより、行ってもよい。
　ＦＲＥＴの原理を用いたサンドイッチ法を行う場合は、まず、第１の蛍光物質（つまりドナー）で標識した第１の特異的結合物質（例えば抗体）と、第１の蛍光物質の蛍光波長と重複する吸光波長を有する第２の蛍光物質（つまりアクセプター）で標識した第２の特異的結合物質を準備する。
　続いて、標的分子（例えば抗原）を、第１の特異的結合物質と第２の特異的結合物質の両方と接触させ、複合体を形成させる。複合体が形成されると、ドナーとアクセプターの距離が近づき、ドナーの励起波長の照射によりアクセプターの蛍光波長を検出することができるようになる。あるいは、特異的結合物質を核酸断片で標識しておき、核酸断片をＩＣＡ反応により検出してもよい。
　特異的結合物質としては、後述する構造体に対する特異的結合分子と同様のもの、例えば抗体、抗体断片及びアプタマー等を使用することができる。標的分子に結合した特異的結合物質を検出するために、特異的結合物質を、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）等の酵素により、直接的又は間接的に標識してもよい。２以上の特異的結合物質を使用する場合は、各々の特異的結合分子を、互いに識別可能に標識することができる。
　シグナルの観察方法は、観察するシグナルの種類に応じて公知の適切な方法を選択することができる。例えば、明視野観察を行う場合は、ウェルアレイが設けられた基材に対して垂直方向に白色光を照射する。蛍光シグナルを観察する場合は、蛍光物質に対応する励起光をウェルの底側からウェル内へ照射し、蛍光物質が発する蛍光を観察する。観察されたウェルアレイの全体又は一部の画像を撮影して保存し、コンピューターシステムによる画像処理を行う。
　以上のような構成の検出デバイス１００によれば、溶液中の標的物質から放出される標的分子を高感度で検出可能となる。
　また、以上のような標的分子の検出方法によれば、１つの標的物質から放出される標的分子を解析することができる。さらに、例えばサイトカインを検出した後、細胞のＤＮＡやＲＮＡを解析する、または特定のＤＮＡ配列数をカウントした後、そのＤＮＡの全体の配列を解析するなど、標的分子の検出後に標的分子を放出した標的物質の特性を解析できる。これらにより、標的分子の検出を高精度で実施可能となる。
　なお、本実施形態においては、工程（Ａ１）を行うこととしたが、工程（Ａ１）はなくてもよい。工程（Ａ１）を行わない場合、試料溶液を第１ウェルに充填した後、工程（Ａ３）において複数の第１ウェルのうち、１つの標的物質Ｍ１が配置された第１ウェルＷ１を抽出し、以降の工程（Ａ４）及び（Ａ５）を行うとよい。
［第２実施形態］
　図１０～１３は、第２実施形態に係る検出キットが有する検出デバイス、標的分子の検出方法の説明図である。本実施形態において第１実施形態と共通する構成要素については同じ符号を付し、詳細な説明は省略する。
［検出デバイス］
　図１０は、本実施形態の検出キットが有する検出デバイス２００を示す矢視断面図であり、図２に対応する図である。
　検出デバイス２００は、第１ウェルプレート１５、第２プレート１２、壁材１３を有する。検出デバイス２００は、内部に試料を収容し、試料に含まれる標的物質から標的分子を放出させると共に、標的分子の検出反応を行う反応容器として用いられる。その際、第１ウェルプレート１５において、試料に含まれる標的物質から標的分子を放出させ、第２プレート１２において、第１ウェルプレート１５から移動する標的分子を検出する。
　第１ウェルプレート１５と第２プレート１２とは、壁材１３を介して着脱自在に積層されている。
＜第１ウェルプレート＞
　第１ウェルプレート１５は、平面視矩形を呈する板状部材である。以下の説明においては、第１ウェルプレート１５を「第１プレート１５」と略称することがある。
　第１プレート１５は、検出デバイス２００の内面に向いたウェル形成面１５ａに、複数の第１ウェルＷ１を有する。第１ウェルＷ１は、第１プレート１１のウェル形成面１５ａに設けられた凹部であり、ウェル形成面１５ａに開口している。
　第１プレート１５は、厚さ方向に貫通する２つの貫通孔を有する。２つの貫通孔は、第１プレート１５の一端側と他端側とにそれぞれ設けられている。一方の貫通孔は、検出デバイス２００の内部空間Ｓに液状物を注入する際に用いる注入口１５１であり、他方の貫通孔は、内部空間Ｓから液状物を排出させる際に用いる排出口１５２である。
　注入口１５１、内部空間Ｓ及び排出口１５２はこの順に連通し、全体として流路ＦＣを形成している。検出デバイス２００では、流路ＦＣに液状物を適宜流動させて、標的物質を第１ウェルＷ１に封止する。第１プレート１５は、平面視において注入口１５１と排出口１５２との間に複数の第１ウェルＷ１を有する。
　第１プレート１５の上面には、注入口１５１の周囲を囲む筒状の注入ポートを有していてもよい。また、第１プレート１５の上面には、排出口１５２の周囲を囲む筒状の注入ポートを有していてもよい。
［標的分子の検出方法］
　図１１～１３は、本実施形態の標的分子の検出方法の説明図である。本実施形態の標的分子の検出方法においては、検出デバイス２００を用いて上述の工程（Ａ１）～工程（Ａ５）を行う。工程（Ａ１）については、第１実施形態と共通する。
　次いで、図１１に示すように、注入口１５１から内部空間Ｓ（つまり流路ＦＣ）に、検出試薬を含む試料溶液Ｌ１を注入し、内部空間Ｓに開口している第１ウェルＷ１に試料溶液Ｌ１を充填する。このとき、第２ウェルＷ２にも試料溶液Ｌ１が充填される。
　次いで、図１２に示すように、注入口１５１から内部空間Ｓ（つまり流路ＦＣ）に、界面活性剤を含む封止液Ｌ２を注入する。封止液Ｌ２は、内部空間Ｓにおいてウェル形成面１１ａの面方向に流動し、内部空間Ｓにおいて第１ウェルＷ１及び第２ウェルＷ２に収容されていない試料溶液Ｌ１を押し流し、内部空間Ｓを置換する。
　これにより、封止液Ｌ２は、複数の第１ウェルＷ１及び第２ウェルＷ２をそれぞれ個別に封止する（工程（Ａ２））。封止液Ｌ２で置換された試料溶液Ｌ１及び余剰の封止液Ｌ２は、排出口１５２から排出される。
　次いで、上述した方法に従って、第１ウェルＷ１毎に分配した標的物質Ｍ１から、標的分子を放出させる（工程（Ａ３））。
　次いで、検出デバイス２００を第１プレート１５と第２プレート１２との両側から相互に押し付け、ウェル形成面１５ａとウェル形成面１２ａとを接触させる。
　これにより、第１実施形態において図９で示したように、第１ウェルＷ１と第２ウェルＷ２とが連通し、第１ウェルＷ１内の標的分子Ｍ２が、第２ウェルＷ２に拡散して移動する（工程（Ａ４））。
　次いで、第２ウェルＷ２において標的分子Ｍ２と検出試薬との反応を生じさせ、標的分子Ｍ２を検出する（工程（Ａ５））。
　以上のような構成の検出デバイス２００によれば、溶液中の標的物質から放出される標的分子を高感度で検出可能となる。
　また、以上のような標的分子の検出方法によっても、標的分子の検出を高精度で実施可能となる。
　なお、本実施形態の検出デバイス２００は、第１プレート１５に注入口１５１と排出口１５２とを有することとしたが、これに限らない。図１３に示す検出デバイス２５０のように、第１プレート１１と、注入口１６１と排出口１６２とを有する第２ウェルプレート１６とを有することとしてもよい。
　検出デバイス２５０は、検出デバイス２００と同様に使用して標的分子の検出方法を実施することができる。
［第３実施形態］
　図１４～１７は、第３実施形態に係る検出キットが有する検出デバイス、標的分子の検出方法の説明図である。本実施形態において第１実施形態と共通する構成要素については同じ符号を付し、詳細な説明は省略する。
［流体デバイス］
　図１４は、本実施形態の流体デバイスを示す概略斜視図である。図１５は、図１４の線分ＸＶ－ＸＶにおける矢視断面図である。
　流体デバイス３００は、ウェルプレート（基板ともいう）１７、蓋材２３、壁材３３を有する。流体デバイス３００は、ウェルプレート１７と壁材３３とで囲まれた複数の第１ウェルＷ１と、ウェルプレート１７の上面１７ａであって、第１ウェルＷ１の底部にそれぞれ設けられた複数の第２ウェルＷ２と、を有する。
（ウェルプレート）
　ウェルプレート１７は、平面視矩形を呈する板状部材である。ウェルプレート１７の上面１７ａには、複数の第２ウェルＷ２が設けられている。
　ウェルプレート１７の材料は、上述の第１ウェルプレート１１と同じ材料を用いることができる。
（壁材）
　壁材３３は、平面視で閉環状に形成され、ウェルプレート１７の上面１７ａに配置されている。壁材３３は、ウェルプレート１７と蓋材２３とに挟持され、一体となることで流体デバイス３００を形成する。ウェルプレート１７と蓋材２３と壁材３３とで囲まれた空間は、液状の試料が収容される内部空間Ｓである。
　壁材３３は、内部空間Ｓの壁面として機能する上、ウェルプレート１７と蓋材２３との間のスペーサとして機能する。
　内部空間Ｓは、壁材３３によって区画され、複数の第１ウェルＷ１が形成されている。第１ウェルＷ１とは、ウェルプレート１７と、壁材３３と、壁材３３の頂部３３ａと平行であって頂部３３ａに接する仮想平面と、で囲まれた空間を指す。第１ウェルＷ１の底部には、複数の第２ウェルＷ２が配置している。
　壁材３３の材料は、上述したウェルプレート１７と同じ材料を採用することができる。このような材料で形成された壁材３３は、接着剤による接着、又は熱溶着、超音波溶着、レーザー溶着等による溶着により、ウェルプレート１７及び蓋材２３と一体化することができる。
　なお、壁材３３は、ウェルプレート１７と一体的に形成され、ウェルプレート１７の一部を構成していてもよい。同様に、壁材３３は蓋材２３と一体的に形成され、蓋材２３の一部を構成していてもよい。
（蓋材）
　蓋材２３は、平面視でウェルプレート１７と同じ輪郭形状を呈している。蓋材２３の下面２３ｂの外縁部には、凸状部２３９が設けられている。蓋材２３は、凸状部２３９を介して壁材３３と接続している。
　蓋材２３には、厚さ方向に貫通する２つの貫通孔（注入口２３１、排出口２３２）を有する。蓋材２３の上面２３ａには、注入口２３１の周囲を囲む筒状の注入ポート２３５が設けられている。同様に、蓋材２３の上面２３ａには、排出口２３２の周囲を囲む筒状の排出ポート２３６が設けられている。
　蓋材２３の材料は、上述の第１プレート１１と同じ材料を採用することができる。蓋材２３の材料としてはシリコーン樹脂が好ましい。シリコーン樹脂としては、例えばＰＤＭＳを好適に用いることができる。
　注入口２３１、内部空間Ｓ及び排出口２３２はこの順に連通し、全体として流路ＦＣを形成している。流体デバイス３００では、流路ＦＣに液状物を適宜流動させて、標的物質の検出反応を行う。
［標的分子の検出方法］
　図１６～１７は、本実施形態の標的分子の検出方法の説明図である。標的分子の検出方法は、上述の検出デバイス３００を含む検出キットを用いて実施し、以下の操作を行う工程を含む。
（Ｂ１）封止液によって第２ウェル毎にバッファーを独立させて封止する工程
（Ｂ２）標的物質を含む試料溶液を複数の第１ウェル毎に充填すると共に、試料溶液を第１ウェルに独立させて封止する工程
（Ｂ３）第１ウェルにおいて標的物質から標的分子を放出させる工程
（Ｂ４）第２ウェル毎に標的分子を１分子ずつ分配する工程
（Ｂ５）標的分子を検出する工程
（Ｂ１）封止液によって第２ウェル毎にバッファーを独立させて封止する工程
　図１６に示すように、まず、検出デバイス３００の第２ウェルＷ２にバッファーＢを充填し、界面活性剤を含む封止液Ｌ２により第２ウェルＷ２毎に独立させて封止する。
（Ｂ２）標的物質を含む試料溶液を複数の第１ウェル毎に充填すると共に、試料溶液を第１ウェルに独立させて封止する工程
　次いで、標的物質を含む液状の試料の濃度を調整し試料溶液Ｌ１を得る。試料溶液Ｌ１は、上述の工程（Ａ１）と同様に調製することができる。このとき、試料溶液Ｌ１は界面活性剤を含んでいない。調製した試料溶液Ｌ１を、第１ウェルＷ１毎に充填する。
　まず、図１６に示すように、注入口２３１から内部空間Ｓに、試料溶液Ｌ１を注入する。試料溶液Ｌ１が内部空間Ｓ（流路ＦＣ）を流動すると、試料溶液Ｌ１は内部空間ＳのバッファーＢを押し出し、内部空間Ｓに開口している第１ウェルＷ１に試料溶液Ｌ１が充填される。
　内部空間Ｓ及び全ての第１ウェルＷ１が試料溶液Ｌ１で充填された後、流路ＦＣを通過した試料溶液Ｌ１は排出口２３２から排出される。
　次いで、図１７に示すように、内部空間Ｓに試料溶液Ｌ１を充填した後、注入口２３１から流路ＦＣに封止液Ｌ２１を送液する。封止液Ｌ２１としては、封止液として上述したものを用いることができる。封止液Ｌ２１の粘度は、封止液Ｌ２の粘度よりも低い。
　流路ＦＣに送液された封止液Ｌ２１は、内部空間Ｓにおいて第１ウェルＷ１に入り込むこと無く第１ウェルＷ１の上を流動し、内部空間Ｓに充填された試料溶液Ｌ１のうち、第１ウェルＷ１に収容されていない試料溶液Ｌ１を押し流して置換する。
　これにより、封止液Ｌ２１は、複数の第１ウェルＷ１をそれぞれ個別に封止し、試料溶液Ｌ１を収容した第１ウェルＷ１は、独立した反応空間となる。試料溶液Ｌ１に含まれる標的物質は、第１ウェルＷ１毎に独立して充填される。封止液Ｌ２１で置換された試料溶液Ｌ１及び余剰の封止液Ｌ２１は、排出口２３２から排出される。
　なお、第１ウェルＷ１の封止は、封止液Ｌ２を構成する親油性液体のみを用いて行ってもよい。
（Ｂ３）第１ウェルにおいて標的物質から標的分子を放出させる工程
　次いで、上述した工程（Ａ３）と同様にして、第１ウェルＷ１毎に分配した標的物質Ｍ１から、標的分子Ｍ２を放出させる。
（Ｂ４）第２ウェル毎に標的分子を１分子ずつ分配する工程
　次いで、検出デバイス３００を蓋材２３とウェルプレート１７との両側から相互に押し付けて加圧する。これにより、封止液Ｌ２を挟んで独立していた第１ウェルＷ１と第２ウェルＷ２とが連通し、第１ウェルＷ１内の標的分子Ｍ２が、第２ウェルＷ２に拡散して移動する。
（Ｂ５）標的分子を検出する工程
　次いで、上述した工程（Ａ５）と同様にして、第２ウェルＷ２において標的分子Ｍ２と検出試薬との反応を生じさせ、標的分子Ｍ２を検出する。
　以上のような構成の検出デバイス３００を有する検出キットによれば、溶液中の標的物質から放出される標的分子を高感度で検出可能となる。
　また、以上のような標的分子の検出方法によっても、標的分子の検出を高精度で実施可能となる。
［第４実施形態］
　図１８～２０は、第４実施形態に係る標的分子の検出方法の説明図である。標的分子の検出方法は、検出デバイス４００を含む検出キットを用いて実施し、以下の操作を行う工程を含む。
（Ｃ１）親油性液体中に標的物質を含む液滴が分散したＷ／Ｏ型のエマルションを調整する工程
（Ｃ２）親油性液体を含む液体によってウェル毎にバッファーを独立させて封止する工程
（Ｃ３）流路にエマルションを流動させ、親油性液体を含む液体とエマルションとを置換する工程
（Ｃ４）液滴中の標的物質から標的分子を放出させる工程
（Ｃ５）蓋材を介してエマルションを加圧し、エマルションから互いに独立した第１ウェル毎に液滴を分配する工程
（Ｃ６）標的分子を検出する工程
　図１８は、検出デバイス４００を示す概略断面図である。図１８に示すように、検出デバイス４００は、第１実施形態で示した第２部材１２０と同じ構成の部材であり、ウェルプレート１２と、ウェルプレート１２に対向する蓋材２２と、ウェルプレート１２と蓋材２２とに挟持された壁材３２と、を有する。ウェルプレート１２、蓋材２２及び壁材３２は、第１実施形態で示した第２部材１２０の各部材と同様の構成である。図１８においては、第２部材１２０と同じ符号を用いて示している。
　ウェルプレート１２が有するウェルについては、符号「Ｗ」で示している。ウェルＷは、本発明における第１ウェルに該当する。
　ウェルプレート１２は上述の第２部材１２と同じ構成の部材である。ウェルプレート１２は、複数のウェルＷ（つまり第１ウェル）を有する。
　同様に、蓋材２２は上述の第２蓋材２２、壁材３２は上述の第２壁材３２と同じ構成の部材である。
（Ｃ１）親油性液体中に標的物質を含む液滴が分散したＷ／Ｏ型のエマルションを調整する工程
　まず、標的物質と封止液（すなわち界面活性剤と親油性液体との混合液）を用い、親油性液体中に標的物質を含む液滴が分散したＷ／Ｏ型のエマルションを調整する。Ｗ／Ｏ型のエマルションにおけるＷａｔｅｒ－ｉｎ－ｏｉｌドロップレット（液滴）の調整は、例えば、微生物培養やデジタルＰＣＲ法において用いられている、公知の方法を採用することができる。
　エマルションの調整時には、標的物質の濃度、界面活性剤の濃度又は標的物質に対する界面活性剤の量等を調整し、エマルションに含まれる液滴１つに標的物質が０または１つ含まれるように調整する。すなわち、本工程では、エマルションに含まれる液滴毎に標的物質を分配する。
（Ｃ２）親油性液体を含む液体によってウェル毎にバッファーを独立させて封止する工程
　次いで、図１９に示すように、検出デバイス４００のウェルＷにバッファーＢを充填し、親油性液体を含む液体Ｌ３によりウェルＷ毎に独立させて封止する。
　封止に用いる液体Ｌ３は、エマルションの分散媒と同じであってもよく、異なっていてもよい。エマルションの分散媒は、エマルションの調製に用いる封止液の親油性液体である。例えば、エマルションの分散媒としてフッ素系オイルを用い、封止に用いる液体Ｌ３としてシリコーン系オイルを用いることができる。
　また、液体Ｌ３には、発明の効果を損なわない限り、界面活性剤を含んでいてもよく、含まなくてもよい。液体Ｌ３が界面活性剤を含む場合、液体Ｌ３は上述の封止液と同じであってもよく、異なっていてもよい。
（Ｃ３）流路にエマルションを流動させ、親油性液体とエマルションとを置換する工程
　次いで、注入口２２１からエマルションＥを注入し、検出デバイス４００の流路ＦＣに工程（Ｃ１）で作製したエマルションＥを流動させ、流路ＦＣ内の液体Ｌ３とエマルションＥとを置換する。これにより、ウェルＷを封止する液体Ｌ３は残存したまま、余剰の液体Ｌ３が流路ＦＣから排出され、流路ＦＣ内にエマルションＥを充填する。
（Ｃ４）液滴中の標的物質から標的分子を放出させる工程
　次いで、エマルションＥに含まれる液滴において、液滴毎に分配した標的物質から、標的分子を放出させる。
　標的分子を放出させる方法としては、以下の方法を採用することができる。
　標的物質がＤＮＡやＲＮＡである場合、エマルション内に制限酵素を入れて、特定配列ごとに核酸を切断することで、エマルションの液滴内に標的分子である核酸を放出させることができる。
　標的物質が細胞からの分泌物の場合、エマルション内で細胞を一定時間培養することで、エマルションの液滴内に標的分子である分泌物を放出させることができる。
（Ｃ５）蓋材を介してエマルションを加圧し、エマルションから互いに独立した第１ウェル毎に液滴を分配する工程
　次いで、図２０に示すように、検出デバイス４００を蓋材２２とウェルプレート１２との両側から相互に押し付けて加圧する。これにより、エマルションＥ内の液滴Ｄが、ウェルＷに移動して合一する。液滴Ｄ内に存在する標的物質及び標的分子は、ウェルＷ内のバッファーＢに拡散する。
　標的物質が細胞内の物質である場合、ウェルＷ内のバッファーＢに細胞膜を溶かす試薬を含ませておくと、細胞の内容物をウェルＷ内に分散させることができる。細胞膜を溶かす試薬としては、上述の陰イオン性界面活性剤が挙げられる。
（Ｃ６）標的分子を検出する工程
　次いで、上述した工程（Ａ５）と同様にして、ウェルＷに拡散した標的分子と検出試薬との反応を生じさせ、標的分子を検出する。検出試薬は、予めウェルＷに配置しておくとよい。
　以上のような構成の検出デバイス４００を有する検出キットによれば、溶液中の標的物質から放出される標的分子を高感度で検出可能となる。
　また、以上のような標的分子の検出方法によっても、標的分子の検出を高精度で実施可能となる。
［第５実施形態］
　図４～８及び１０を用いて、本実施形態の標的分子の検出方法を説明する。標的分子の検出方法は、以下の操作を行う工程を含む。標的分子の検出方法においては、上記検出デバイス１００を用い、試料に含まれる検出デバイス１００の第２ウェルＷ２において標的分子を検出する。
（ＡＡ１）標的物質を含む液状の試料の濃度を調整し、試料溶液を得る工程
（ＡＡ２）封止液によって試料溶液を第１ウェルに独立させて封止する工程
（ＡＡ３）第１ウェルにおいて評価物を得る工程
（ＡＡ４）第２ウェル毎に評価物を１つずつ分配する工程
（ＡＡ５）標的分子を検出する工程
（ＡＡ１）標的物質を含む液状の試料の濃度を調整し、試料溶液を得る工程
以下、本工程を「工程（ＡＡ１）」と略記することがある。以下の説明では、各工程について同様に略記することがある。工程（ＡＡ１）は、工程（Ａ１）と以下の点が異なるが、それ以外は同一であるため説明を省略する。
　試料は、界面活性剤を含んでいてもよく、界面活性剤としては、第１実施形態に記載のものが挙げられる。界面活性剤の濃度は、試料の総体積に対し０．００１１ｇ／Ｌ以上５５．５ｇ／Ｌ以下（０．０００１～５体積比％［ｖ／ｖ］）であることが好ましく、０．０１１１ｇ／Ｌ以上２２．２ｇ／Ｌ以下（０．００１～２体積比％［ｖ／ｖ］）であることがより好ましく、０．１１１ｇ／Ｌ以上１１．１ｇ／Ｌ以下（０．０１～１体積比％［ｖ／ｖ］）であることがさらに好ましい。
　界面活性剤の濃度が試料の総体積に対し５５．５ｇ／Ｌ以下であると、後に行う標的分子の検出における反応への悪影響が少ない。
　試料の濃度は、用いる流体デバイスの容積に基づいて、第１ウェル毎に１個の標的物質Ｍ１が配置される濃度に調整する。試料の濃度は、流体デバイスを用いて、予備実験を行い、決定するとよい。　
　投入する標的物質の濃度を事前に調整する他に、標的物質を可視化する処理を行ってもよい。このような処理を行うことで、後の工程において１つのみ標的物質が入っている第１ウェルのみを抽出し、測定対象とすることも可能である。抽出は、例えば顕微鏡を用いた拡大画像の撮像と、得られた画像を公知の検出ソフトにより解析することで行うことができる。
　標的物質が細胞であれば顕微鏡の明視野画像でそのまま検出したり、トリパンブルー溶液などで細胞を染色したりしてもよい。標的物質が核酸であれば、公知の蛍光染色方法や、ＩＣＡ反応などの方法により発光させ、蛍光強度から核酸が１分子入っているウェルと特定してもよい。標的物質が核酸の場合、例えば核酸を制限酵素で切断することで、標的分子として核酸の断片が得られる。
（ＡＡ２）封止液によって試料溶液を第１ウェルに独立させて封止する工程
　次いで、試料溶液Ｌ１を複数の第１ウェルＷ１毎に独立して充填する。以下、本工程を「工程（ＡＡ２）」と略記することがある。検出デバイス１００は、第１部材１１０と第２部材１２０に分割しておき、本工程では第１部材１１０を用いる。
　図４に示すように、注入口２１１から内部空間Ｓ１に、検出試薬を含む試料溶液Ｌ１を注入する工程については、工程（Ａ２）と同じであるため説明を省略する。
　次いで、図５に示すように、注入口２１１から内部空間Ｓ１に、封止液Ｌ２を注入する。その他、第１蓋材２１を取り除いた後、第１プレート１１の第１ウェルＷ１上に封止液Ｌ２を垂らして、各第１ウェルＷ１を封止してもよいし、第１ウェルＷ１上の溶液をヘラなどで掻き切ってから封止液Ｌ２を垂らして各第１ウェルＷ１を独立させてもよい。
　封止液Ｌ２としては、上述の封止液Ｌ２を用いてもよく、親油性液体であってよく、界面活性剤を含んでいなくてもよい。
　これにより、封止液Ｌ２は、複数の第１ウェルＷ１をそれぞれ個別に封止し、試料溶液Ｌ１を収容した第１ウェルＷ１は、独立した反応空間となる。封止液Ｌ２で置換された試料溶液Ｌ１及び余剰の封止液Ｌ２は、排出口２１２から排出される。
（ＡＡ３）第１ウェルにおいて評価物を得る工程
　次いで、第１ウェルＷ１毎に分配した標的物質Ｍ１から、標的分子を含む粒子状の評価物を得る。以下、本工程を「工程（ＡＡ３）」と略記することがある。
　標的物質から評価物を得る方法は、対象となる標的物質の種類に応じて選択される。
　例えば、標的物質から評価対象である標的分子を放出させ、得られた標的分子を後述の捕捉粒子で捕捉することで評価物を得ることとしてもよい。
　例えば、標的物質がＤＮＡやＲＮＡである場合は、超音波破砕や酵素分解により、１つのフラグメントから複数のフラグメント（つまり標的分子）を得てもよい。
　標的物質が、核酸同士のハイブリダイゼーションによる会合体である場合は、検出デバイスを加熱し、熱変性により各核酸を分離させてもよい。
　標的物質がタンパク質の凝集体である場合は、超音波照射により凝集体をほぐしてもよく、タンパク質を分解する酵素を用いてもよく、タンパク質凝集を解除する試薬を添加してもよい。
　標的物質が細胞であれば、細胞を超音波で破砕してもよく、電気刺激を与えて細胞膜を破砕してもよい。
　また、第１ウェルにおいて標的物質である細胞を一定時間培養し、細胞から分泌されるサイトカインなどの分泌物を標的分子として検出することとしてもよい。
　捕捉粒子は、粒子と、標的分子が特異的に結合する部位と、を有する。
　粒子としては、特に制限されず、ポリマー粒子、磁気粒子（磁性材料を含む粒子）、ガラス粒子等が挙げられる。粒子は、非特異的な吸着を避けるための表面処理が施された粒子が好ましい。また、特異的結合物質を固定化するために、表面にカルボキシル基等の官能基を有する粒子が好ましい。より具体的には、ＪＳＲ社製の商品名「Ｍａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ　ＬＣ３００」等を用いることができる。
　標的分子が特異的に結合する部位としては、上述した特異的結合物質と同様の群から、捕捉する標的分子の種類に応じて選択することができる。
　捕捉粒子の半径は、０．５μｍ以上２．５μｍ以下であると好ましく、１μｍ以上２μｍ以下であるとより好ましい。
　捕捉粒子の密度は、２０℃における水の密度を１ｇ／ｍｌ（ｇ／ｃｍ３））としたとき、水の密度よりも大きくてもよく、小さくてもよい。捕捉粒子の密度は、例えば、０．７ｇ／ｃｍ３以上１．３ｇ／ｃｍ３以下であってもよく、０．８ｇ／ｃｍ３以上１．２ｇ／ｃｍ３以下であってもよい。
（ＡＡ４）第２ウェル毎に評価物を１分子ずつ分配する工程
　次いで、試料溶液Ｌ１中の評価物を、第２ウェルＷ２毎に１分子ずつ分配する。以下、本工程を「工程（ＡＡ４）」と略記することがある。
　工程（ＡＡ４）は、以下の点で工程（Ａ４）と異なるがその他の点では共通するため、その説明を省略する。
　工程（Ａ４）で説明する操作によりにより、図１０に示すように、第１ウェルＷ１と第２ウェルＷ２とが連通し、第１ウェルＷ１内の評価物Ｅが、第２ウェルＷ２に移動する。評価物Ｅは標的分子Ｍ２を含む。
　発明者の検討により、本工程においてウェル形成面１１ａとウェル形成面１２ａとの接触時間が短いと、評価物を第２ウェルＷ２に移動させることができないことが分かった。一方、種々の試料や評価物を用いる上で、評価物を適切に移動させるためには、適切な指標が必要である。また、ウェル形成面１１ａとウェル形成面１２ａとを接触させたまま長時間放置すると、いずれ評価物が第１ウェルＷ１から第２ウェルＷ２に移動するとも考えられるが、作業効率を考えると適切な時間管理が必要となる。
　以上を踏まえ発明者が検討したところ、ウェル形成面１１ａとウェル形成面１２ａとを、下記式（１）で表される接触時間Ｔより長い時間接触させることにより、適切に評価物を移動させることができることが分かった。
　Ｔ＝ｄ１／ｖ　…（１）
（Ｔ（単位：ｓｅｃ）は、接触時間である。
　ｄ１（単位：μｍ）は、評価物の直径である。
　ｖ（単位：μｍ／ｓｅｃ）は、試料溶液において評価物が第１ウェルから第２ウェルに移動する移動速度である）
　また、接触時間Ｔは、下記式（１）－１で表される時間より長く接触させることが好ましい。
　Ｔ＝ｄ２／ｖ　…（１）－１
（ｄ２（単位：μｍ）は、第１ウェルの形成面と第２ウェルの形成面とを接触させたときの、第１ウェルの底面から第２ウェルの形成面まで距離である。）
　なお、第１ウェルの形成面と第２ウェルの形成面とを接触させる前に、検出デバイス１００を静置し、第１ウェル内で評価物を第１ウェルの形成面側に移動させてもよい。この場合の静置時間についても、上記移動速度ｖを用い、第１ウェルＷ１の深さに応じて設定するとよい。例えば、第１ウェルＷ１の深さをＨとした場合、第１ウェルＷ１の深さ方向の中間位置まで評価物が移動する時間は、Ｈ／（２・ｖ）として求めることができる。
　また、上記接触時間Ｔの上限値については、求めた接触時間Ｔの２倍（２Ｔ）であれば十分な時間を確保できていると判断できる。接触時間は、２Ｔを超えていても問題無い。
　検出デバイスを静置して評価物を移動させる場合、上記式（１）中の移動速度ｖは、下記式（２）で表される速度である。
　ｖ＝［２ｇ・ｒ２・｜ρ－ρｓ｜］／９η　…（２）
（ｇは重力加速度（単位：ｃｍ／ｓ２）、ｒは前記評価物の半径（単位：ｃｍ）、ρは前記評価物の密度（単位：ｇ／ｃｍ３）、ρｓは試料溶液の密度（単位：ｇ／ｃｍ３）、ηは試料溶液の粘度（単位：ｇ／（ｃｍ・ｓ）を示す。）
　評価物の密度が試料溶液の密度よりも大きい場合（ρ＞ρｓ）、第２ウェルを重力方向下方として検出デバイスを静置し、式（２）から移動速度を求める。
　評価物の密度が試料溶液の密度よりも小さい場合（ρ＜ρｓ）、第２ウェルを重力方向上方として検出デバイスを静置し、上式（２）から移動速度を求める。
　試料溶液の密度ρｓは、２０℃における密度である。密度ρｓを水の密度で近似する場合、密度ρｓは０．９９８ｇ／ｃｍ３であり、近似値として１ｇ／ｃｍ３を用いる。
　試料溶液の粘度ηは、２０℃における粘度である。また、粘度ηについて、１ｇ／（ｃｍ・ｓ）＝１００ｍＰａ／ｓである。粘度ηを水の粘度で近似する場合、粘度ηは、１ｍＰａ・ｓ＝０．０１ｇ／（ｃｍ・ｓ）である。
　なお、試料溶液の物性値は、試料溶液を構成する各成分のうち、最も体積比が大きい成分の物性値を採用する。例えば、生体試料を試料溶液の場合、試料溶液にはバッファー等の水溶液を用いる。この場合、試料溶液の物性値としては、水の物性値を採用する。
　評価物が、標的分子を捕捉させた捕捉粒子である場合、ｒは捕捉粒子の半径、ρは捕捉粒子の密度を採用することができる。
　評価物が、細胞である場合、ｒは細胞の短径を採用する。また、ρは近似値として１．０５を用いる。
　細胞の短径は、評価前に、顕微鏡を用いて細胞の拡大画像（拡大倍率：４～２０倍）を撮像し、画像解析ソフトを用いて得られた画像に含まれる細胞の短径を測定する。このとき、「細胞に外接する矩形のうち最小の矩形」の「短辺の長さ」を、細胞の短径とする。撮像した画像に含まれる全ての細胞について短径を測定し、平均値を上記ｒとして採用する。
　細胞の短径の平均値を求めるにあたり、上記方法に従って１０個以上の細胞について短径を測定する。一つの拡大画像に含まれる細胞の数が１０個未満である場合、複数の拡大画像を用い、合計数が１０個以上となるまで、それぞれの拡大画像に含まれる全ての細胞の短径を測定し、短径の平均値を算出する。
　捕捉粒子に磁性材料を用いた場合、検出デバイス１００の外部から捕捉粒子に磁力を作用させて評価物を移動させるとよい。この場合、式（１）中の移動速度ｖは、第１ウェルＷ１の底部と第２ウェルＷ２の底部との中点において、捕捉粒子に磁力を作用させたときに捕捉粒子に生じる加速度を、上記式（２）のｇの代わりに用いて求める。加速度は、捕捉粒子に作用する磁力と、捕捉粒子の物性値とから公知の方法で算出することができる。
　検出デバイスに対し、第１ウェルＷ１側から第２ウェルＷ２側に向かう遠心力を加えることで評価物を移動させてもよい。この場合、式（１）中の移動速度ｖは、用いる遠心機の運転条件（回転数、回転半径）から遠心加速度を求め、求められた遠心加速度を上記式（２）のｇの代わりに用いて求める。
（ＡＡ５）標的分子を検出する工程
　次いで、標的分子と検出試薬との反応を生じさせ、評価物に含まれる標的分子を検出する。以下、本工程を「工程（ＡＡ５）」と略記することがある。
　検出試薬は、予め第２ウェルＷ２内に配置しておいてもよく、事後的に添加してもよい。
　評価物が細胞である場合、第２ウェルＷ２において細胞を一定期間培養し、細胞から標的分子を放出させるとよい。
　検出方法としては、工程（Ａ５）に記載の方法で行うことができる。　
　以上のような標的分子の検出方法によれば、高精度で標的分子を検出可能となる。
　なお、本実施形態においては、工程（ＡＡ１）を行うこととしたが、工程（ＡＡ１）はなくてもよい。工程（ＡＡ１）を行わない場合、試料溶液を第１ウェルに充填した後、工程（ＡＡ３）において複数の第１ウェルのうち、１つの標的物質Ｍ１が配置された第１ウェルＷ１を抽出し、以降の工程（Ａ４Ａ）及び（ＡＡ５）を行うとよい。
　また、本実施形態で示した検出デバイス１００は一例であって、他の構成の検出デバイスを用いることもできる。例えば、第２実施形態で説明した検出デバイス２００を用いて本実施形態の標的分子の検出方法を実施することができる。
［標的分子の検出方法］
　図１２～１４は、検出デバイス２００を用いた標的分子の検出方法の説明図である。検出デバイス２００を用いる場合、まず工程（ＡＡ１）については上記と同様に行う。
　次いで、図１１に示すように、注入口１５１から内部空間Ｓ（流路ＦＣ）に、検出試薬を含む試料溶液Ｌ１を注入し、内部空間Ｓに開口している第１ウェルＷ１に試料溶液Ｌ１を充填する。このとき、第２ウェルＷ２にも試料溶液Ｌ１が充填される。
　次いで、図１２に示すように、注入口１５１から内部空間Ｓ（流路ＦＣ）に、界面活性剤を含む封止液Ｌ２を注入する。封止液Ｌ２は、内部空間Ｓにおいてウェル形成面１１ａの面方向に流動し、内部空間Ｓにおいて第１ウェルＷ１及び第２ウェルＷ２に収容されていない試料溶液Ｌ１を押し流し、内部空間Ｓを置換する。
　これにより、封止液Ｌ２は、複数の第１ウェルＷ１及び第２ウェルＷ２をそれぞれ個別に封止する（工程（ＡＡ２））。封止液Ｌ２で置換された試料溶液Ｌ１及び余剰の封止液Ｌ２は、排出口１５２から排出される。
　以後、上述した方法に従って工程（ＡＡ３）～（ＡＡ５）を行うことで、標的分子を検出することができる。
　なお、検出デバイス２００は、第１プレート１５に注入口１５１と排出口１５２とを有することとしたが、これに限らない。図１４に示す検出デバイス２５０のように、第１プレート１１と、注入口１６１と排出口１６２とを有する第２ウェルプレート１６とを有することとしてもよい。
　このような検出デバイス２００、２５０を用いて標的分子の検出方法を行っても、高精度で標的分子を検出できる。
　次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
（検出デバイスの製造）
　本実施例においては、検出デバイスとして、上述の第１実施形態に係る検出デバイス１００を用いた。まず、第１プレート１１と第２プレート１２を射出成形で作製した。同様に、第１蓋材２１、第２蓋材２２を射出成形で作製した。形成材料はシクロオレフィンポリマーを用いた。
　第１プレート１１において、第１ウェルの開口径（長径）は５０μｍであり、第１ウェルＷ１の深さは５０μｍであった。第１ウェルＷ１の１つあたりの体積は９８ｐＬであった。
　第２プレート１２において、第２ウェルＷ２の開口径（長径）は１０μｍであり、第２ウェルの深さは１５μｍであった。第２ウェルＷ２の１つあたりの体積は、１１００ｆＬであった。
　両面テープ（日東電工株式会社製）を用い、第１プレート１１と第１蓋材２１とを貼り付け、第１部材１１０とした。同様に、両面テープ（型番：Ｎｏ．５６１０ＢＮ、日東電工株式会社製）を用い、第２プレート１２と第２蓋材２２とを貼り付け、第２部材１２０とした。
（捕捉粒子及び捕捉粒子溶液の調製）
　磁性ビーズ（ＭＳ３００／Ｃａｒｂｏｘｙｌ、ＪＳＲ株式会社製）にサイトカイン捕捉抗体（Anti-Mouse IL-2 MAb (Clone JES6-1A12)、型番：MAB702-100、R&D Systems, Inc）を結合させた。
　サイトカイン捕捉抗体が結合した磁性ビーズを純水に加え、磁性ビーズ溶液を調製した。サイトカイン捕捉抗体が結合した磁性ビーズは「捕捉粒子」に該当する。
　本実施例においては、第１プレート１１から第２プレート１２への捕捉粒子の移動を確認することにより、本発明の効果を確認する簡易評価を行った。
（実施例１Ａ、比較例１Ａ）
　第１部材１１０に純水を充填した。第２部材１２０にはＰＢＳ－Ｔ（０．０５体積％のＴｗｅｅｎ２０）を充填した。
　次いで、第１部材１１０への捕捉粒子の投入量が４×１０６個になるように上述のビーズ溶液を加えた。
　次いで、封止液を第１部材１１０に５００μＬ充填し、第１ウェルＷ１内にビーズを封止した（図５参照）。同様に封止液を第２部材１２０に５００μＬ充填し、第２ウェルＷ２を封止した。
　実施例においては、Ｔｗｅｅｎ２０を飽和濃度で含むＦＣ－４０を封止液（封止液１）として用いた。
　比較例においては、Ｔｗｅｅｎ２０を含まないＦＣ－４０を封止液（封止液２）として用いた。
　第１部材１１０から第１プレート１１、第２部材１２０から第２プレート１２をそれぞれ外した。各ウェル形成面に、封止液（実施例１Ａでは封止液１、比較例１Ａでは封止液２）を１００μＬ添加した（状態Ａ）。
　第１プレート１１のウェル形成面１１ａが鉛直下向き、第２プレート１２のウェル形成面１２ａが鉛直上向きの状態で、それぞれのウェル形成面を接触させ検出デバイスとし、両ウェルプレートを相互に６秒間押し付けて貼り合わせた（図８及び９参照）。両ウェルプレートの加圧は、実験者の指で挟み込むことにより行った。この操作において、捕捉粒子は第１ウェルＷ１から第２ウェルＷ２に移動すると考えられる。
　検出デバイスを、第１プレート１１と第２プレート１２とに分け、それぞれのウェル形成面に封止液（実施例１Ａでは封止液１、比較例１Ａでは封止液２）を１００μＬ添加した。第２プレート１２に第２蓋材２２を貼り直し、第２部材１２０とした。
　さらに、第２部材１２０の注入口２２１からＦＣ－４０のみを２００μＬ加えた（状態Ｂ）。
　状態Ａの第１プレート１１、第２プレート１２、状態Ｂの第２プレート１２について、顕微鏡で観察した。使用した装置は、以下の通りであった。
　顕微鏡：ＢＺ－８００（キーエンス社製）
　対物レンズ：ＣＦＩ　プランアポクロマート　Ｌａｍｂｄａ　１０Ｘ（ニコン社製）
　図２２～２４は、実施例の結果を示す拡大写真である。図２５～２７は、比較例の結果を示す拡大写真である。図２２及び２５は、状態Ａの第１プレート１１の拡大写真、図２３及び２６は、状態Ａの第２プレート１２の拡大写真、図２４及び２７は、状態Ｂの第２プレート１２の拡大写真である。
　実験の結果、実施例１Ａにおいては、図２４に示すように、状態Ｂの第２プレート１２において斑にビーズが存在していること確認できた。すなわち、界面活性剤を含む封止液１を用いた実施例においては、第１プレート１１の第１ウェルに封止されていたビーズが、第２プレート１２の第２ウェルに移動した結果、第１ウェルが重なった位置の第２ウェルに斑にビーズが移動したものと考えられる。
　対して、比較例１Ａにおいては、図２７に示すように、状態Ｂの第２プレート１２においてビーズの移動がほぼ確認できなかった。
　以上の結果から、本発明が有用であることが確かめられた。
［実験例１Ｂ］
　第１部材１１０に純水を充填した。次いで、第１部材１１０への捕捉粒子の投入量が１×１０６個になるように上述の磁性ビーズ溶液を加えた。さらに、封止液としてＦＣ－４０を５００μＬ充填した。
　第２部材１２０に純水１００μＬを充填した。次いで、封止液としてＦＣ－４０を２００μＬ充填した。
　第１部材１１０から第１プレート１１、第２部材１２０から第２プレート１２をそれぞれ外した。各ウェル形成面に、封止液を１００μＬ添加した（状態Ａ）。
　第１プレート１１のウェル形成面１１ａが鉛直下向き、第２プレート１２のウェル形成面１２ａが鉛直上向きの状態で、それぞれのウェル形成面を接触させ検出デバイスとし、両ウェルプレートを相互に６秒間押し付けて貼り合わせた（図８及び１０参照）。両ウェルプレートの加圧は、実験者の指で挟み込むことにより行った。
　検出デバイスを、第１プレート１１と第２プレート１２とに分け、それぞれのウェル形成面に封止液を１００μＬ添加した。第２プレート１２に第２蓋材２２を貼り直し、第２部材１２０とした。
　さらに、第２部材１２０の注入口２２１からＦＣ－４０のみを２００μＬ加えた（状態Ｂ）。
［実験例２Ｂ］
　第１プレート１１のウェル形成面１１ａと、第２プレート１２のウェル形成面１２ａとを相互に１０秒間押し付けて貼り合わせたこと以外は実験例１と同様にして、実験例２を行った。
［実験例３Ｂ］
　第１プレート１１のウェル形成面１１ａと、第２プレート１２のウェル形成面１２ａとを相互に３分間押し付けて貼り合わせたこと以外は実験例１と同様にして、実験例３を行った。
［評価］
　状態Ａの第１プレート１１、第２プレート１２、状態Ｂの第２プレート１２について、顕微鏡で観察した。使用した装置は、以下の通りであった。
　顕微鏡：ＢＺ－８００（キーエンス社製）
　対物レンズ：ＣＦＩ　プランアポクロマート　Ｌａｍｂｄａ　１０Ｘ（ニコン社製）
　図２８～３２は、実施例の結果を示す拡大写真である。図２８は、状態Ａの第１プレート１１の拡大写真、図２９は、状態Ａの第２プレート１２の拡大写真、図３０～３２は、状態Ｂの第２プレート１２の拡大写真である（図３０：実験例１Ｂ、図３１：実験例２Ｂ、図３２：実験例３Ｂ）。
　実験の結果、第１プレート１１のウェル形成面１１ａと、第２プレート１２のウェル形成面１２ａとを６秒接触させた実験例１Ｂにおいてはほとんど捕捉粒子の移動が確認できなかった。対して、１０秒接触させた実験例２Ｂにおいては捕捉粒子の移動が確認できた。３分接触させた実験例３Ｂでは、第１ウェルの配置に対応した形で斑に捕捉粒子が移動していることが確認できた。
　使用した捕捉粒子の密度ρは、１．１ｇ／ｃｍ３、捕捉粒子の粒子半径ｒは、１．５μｍ（１．５×１０－４ｃｍ）であった。純水の密度ρｓは１ｇ／ｃｍ３、粘度ηは１ｍＰａ・ｓ（０．０１ｇ／（ｃｍ・ｓ））であり、重力加速度を９．８×１０２ｃｍ／ｓ２としたとき、下記式（２）から捕捉粒子の沈降速度は０．４９μｍ／ｓと算出された。
　ｖ＝［２ｇ・ｒ２・｜ρ－ρｓ｜］／９η　…（２）
（ｇは重力加速度（単位：ｃｍ／ｓ２）、ｒは捕捉粒子の半径（単位：ｃｍ）、ρは捕捉粒子の密度（単位：ｇ／ｃｍ３）、ρｓは試料溶液の密度（単位：ｇ／ｃｍ３）、ηは試料溶液の粘度（単位：ｇ／（ｃｍ・ｓ）を示す。）
　第１ウェルから第２ウェルまで捕捉粒子が完全に移動するための最短距離を捕捉粒子の直径３μｍとすると、沈降にかかる最短時間は６．１秒（＝３／０．４９）と算出された。本発明に基づくと、この計算結果は、実験例１Ｂにおいてほとんど捕捉粒子の移動が確認できなかったという結果を支持する。
　以上の結果から、本発明が有用であることが確かめられた。
　本発明によれば、溶液中の標的物質から放出される標的分子を高感度で検出可能とする検出キットを提供することができる。また、このような検出キットを用いた標的分子の検出方法を提供することができる。
　１１，１５…第１ウェルプレート、１２，１６…第２ウェルプレート、１３…壁材、２１…第１蓋材、２２…第２蓋材、１００，２００，２５０，３００…検出デバイス、１１０…第１部材、１２０…第２部材、１５１，１６１，２１１，２２１…注入口、１５２，１６２，２１２，２２２…排出口、ＦＣ，ＦＣ１，ＦＣ２…流路、Ｌ１…試料溶液、Ｌ２…封止液、Ｌ３…親油性液体を含む液体、Ｍ１…標的物質、Ｍ２…標的分子、Ｗ１…第１ウェル、Ｗ２…第２ウェル

Claims (13)

  1. 　標的分子の検出デバイスと、
    　前記検出デバイスに用いられる封止液と、を有し、
    　前記封止液は、親油性液体と、界面活性剤との混合液であり、
    　前記封止液における前記界面活性剤の濃度は、前記封止液における前記界面活性剤の飽和濃度に対して、１体積％以上１００体積％以下であり、
    　前記検出デバイスは、一面に複数の第１ウェルを有する第１ウェルプレートと、
    　一面に複数の第２ウェルを有する第２ウェルプレートと、を備え、
    　前記第１ウェルプレートと前記第２ウェルプレートとは、前記第１ウェルと前記第２ウェルとを対向させて配置され、
    　前記第１ウェルプレートと前記第２ウェルプレートとの間には、流体が流れる流路が形成され、
    　前記第１ウェルは、平面視で前記第２ウェルと重なる検出キット。
  2. 　標的分子の検出デバイスと、
    　前記検出デバイスに用いられる封止液と、を有し、
    　前記封止液は、親油性液体と、界面活性剤との混合液であり、
    　前記封止液における前記界面活性剤の濃度は、前記封止液における前記界面活性剤の飽和濃度に対して、１体積％以上１００体積％以下であり、
    　前記検出デバイスは、基板と、
    　前記基板上に設けられた壁材と、
    　前記基板に対向し前記壁材に接する蓋材と、を備え、
    　前記蓋材は、厚さ方向に貫通する注入口及び排出口を有し、
    　前記壁材の頂部と前記蓋材との間には、流体が流れる流路が形成され、
    　前記基板と前記壁材とで囲まれた複数の第１ウェルを有する検出キット。
  3. 　前記検出デバイスは、前記基板の上面であって、前記第１ウェルの底部にそれぞれ設けられた複数の第２ウェルを有する請求項２に記載の検出キット。
  4. 　前記界面活性剤の濃度は、１０体積％以上９０体積％以下である請求項１から３のいずれか１項に記載の検出キット。
  5. 　請求項１に記載の検出キットを用いた標的分子の検出方法であって、
    　標的物質を含む試料溶液を複数の前記第１ウェル毎に充填すると共に、前記封止液によって前記試料溶液を前記第１ウェルに独立させて封止する工程と、
    　複数の前記第１ウェルのうち、１つの前記標的物質が配置された第１ウェルにおいて前記標的物質から前記標的分子を放出させる工程と、
    　前記第２ウェルにバッファーを充填するとともに、前記第１ウェルプレートにおける前記第１ウェルの形成面に、前記第２ウェルプレートにおける前記第２ウェルの形成面を押し付けて接触させ、前記第１ウェルから互いに独立した前記第２ウェル毎に前記標的分子を１分子ずつ分配する工程と、
    　前記標的分子と検出試薬との反応を生じさせ、前記標的分子を検出する工程と、を有する標的分子の検出方法。
  6. 　請求項２に記載の検出キットを用いた標的分子の検出方法であって、
    　標的物質と前記封止液とを用い、前記親油性液体中に前記標的物質を含む液滴が分散したＷ／Ｏ型のエマルションを調整する工程と、
    　親油性液体を含む液体によって前記第１ウェル毎にバッファーを独立させて封止する工程と、
    　前記流路に前記エマルションを流動させ、前記液体と前記エマルションとを置換する工程と、
    　前記液滴中の前記標的物質から前記標的分子を放出させる工程と、
    　前記蓋材を介して前記エマルションを加圧し、前記エマルションから互いに独立した前記第１ウェル毎に前記液滴を分配する工程と、
    　前記標的分子と検出試薬との反応を生じさせ、前記標的分子を検出する工程と、を有する標的分子の検出方法。
  7. 　請求項３に記載の検出キットを用いた標的分子の検出方法であって、
    　前記封止液によって前記第２ウェル毎にバッファーを独立させて封止する工程と、
    　標的物質を含む試料溶液を複数の前記第１ウェル毎に充填すると共に、前記試料溶液を前記第１ウェルに独立させて封止する工程と、
    　複数の前記第１ウェルのうち、１つの前記標的物質が配置された第１ウェルにおいて前記標的物質から前記標的分子を放出させる工程と、
    　前記蓋材を介して前記試料溶液を加圧し、前記第１ウェルから互いに独立した前記第２ウェル毎に前記標的分子を１分子ずつ分配する工程と、
    　前記標的分子と検出試薬との反応を生じさせ、前記標的分子を検出する工程と、を有する標的分子の検出方法。
  8. 　検出デバイスを用いた標的分子の検出方法であって、
    　前記検出デバイスは、一面に複数の第１ウェルを有する第１ウェルプレートと、一面に複数の第２ウェルを有する第２ウェルプレートと、を備え、前記第１ウェルプレートと前記第２ウェルプレートとは、前記第１ウェルと前記第２ウェルとを対向させて用いられ、
    　標的物質を含む試料溶液を複数の前記第１ウェル毎に充填すると共に、封止液によって前記試料溶液を前記第１ウェルに独立させて封止する工程と、
    　１つの前記標的物質が配置された第１ウェルにおいて、前記標的物質から前記標的分子を含む粒子状の評価物を得る工程と、
    　前記第２ウェルにバッファーを充填するとともに、前記第１ウェルプレートにおける前記第１ウェルの形成面と、前記第２ウェルプレートにおける前記第２ウェルの形成面とを接触させ、前記第１ウェルから互いに独立した前記第２ウェル毎に前記評価物を１つずつ分配する工程と、
    　前記評価物と検出試薬との反応を生じさせ、前記評価物に含まれる標的分子を検出する工程と、を有し、
    　前記分配する工程において、下記式（１）で表される接触時間より長く、前記第１ウェルの形成面と前記第２ウェルの形成面とを接触させる標的分子の検出方法。
    　Ｔ＝ｄ１／ｖ　…（１）
    （Ｔ（単位：ｓｅｃ）は、接触時間である。）
    　ｄ１（単位：μｍ）は、前記評価物の直径である。
    　ｖ（単位：μｍ／ｓｅｃ）は、前記試料溶液において前記評価物が前記第１ウェルから前記第２ウェルに移動する移動速度である。）
  9. 　前記分配する工程において、下記式（１）－１で表される接触時間より長く、前記第１ウェルの形成面と前記第２ウェルの形成面とを接触させる請求項８に記載の標的分子の検出方法。
    　Ｔ＝ｄ２／ｖ　…（１）－１
    （ｄ２（単位：μｍ）は、前記第１ウェルの形成面と前記第２ウェルの形成面とを接触させたときの、前記第１ウェルの底面から前記第２ウェルの形成面まで距離である。）
  10. 　前記評価物を得る工程において、前記標的物質から放出させた前記標的分子と、前記標的分子が特異的に結合する部位を有する捕捉粒子とを反応させ、前記評価物を得る請求項８又は９に記載の標的分子の検出方法。
  11. 　前記分配する工程は、前記検出デバイスを静置して行われ、
    　前記移動速度は、下記式（２）で表される速度である請求項８に記載の標的分子の検出方法。
    　ｖ＝［２ｇ・ｒ２・｜ρ－ρｓ｜］／９η　…（２）
    （ｇは重力加速度（単位：ｃｍ／ｓ２）、ｒは前記評価物の半径（単位：ｃｍ）、ρは前記評価物の密度（単位：ｇ／ｃｍ３）、ρｓは試料溶液の密度（単位：ｇ／ｃｍ３）、ηは試料溶液の粘度（単位：ｇ／（ｃｍ・ｓ）を示す。）
  12. 　前記捕捉粒子が磁性材料を含み、
    　前記分配する工程は、前記検出デバイスの外部から前記捕捉粒子に磁力を作用させて行われる請求項１０に記載の標的分子の検出方法。
  13. 　前記分配する工程は、前記検出デバイスに遠心力を加えて行われる請求項８に記載の標的分子の検出方法。
PCT/JP2023/037861 2022-10-20 2023-10-19 検出キット及び標的分子の検出方法 Ceased WO2024085226A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2024551856A JPWO2024085226A1 (ja) 2022-10-20 2023-10-19

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2022168341 2022-10-20
JP2022168342 2022-10-20
JP2022-168341 2022-10-20
JP2022-168342 2022-10-20

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2024085226A1 true WO2024085226A1 (ja) 2024-04-25

Family

ID=90737764

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2023/037861 Ceased WO2024085226A1 (ja) 2022-10-20 2023-10-19 検出キット及び標的分子の検出方法

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JPWO2024085226A1 (ja)
WO (1) WO2024085226A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN120908103A (zh) * 2025-10-11 2025-11-07 山东省农业科学院 一种用于sers检测的检测平台及其构建方法、一种sers检测方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011506998A (ja) * 2007-12-17 2011-03-03 ハイ−チング ゴング マイクロ流体デバイス
WO2015115635A1 (ja) * 2014-01-31 2015-08-06 凸版印刷株式会社 生体分子解析キット及び生体分子解析方法
WO2017043530A1 (ja) * 2015-09-08 2017-03-16 凸版印刷株式会社 生体物質検出方法
JP2018031631A (ja) * 2016-08-23 2018-03-01 パナソニックＩｐマネジメント株式会社 マイクロ流体チップ、微生物検出装置及び微生物検出方法
WO2019098301A1 (ja) * 2017-11-17 2019-05-23 凸版印刷株式会社 標的分子の検出方法
JP2022159046A (ja) * 2021-03-31 2022-10-17 東レ株式会社 分析用チップ、分析方法及び分析用チップの製造方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011506998A (ja) * 2007-12-17 2011-03-03 ハイ−チング ゴング マイクロ流体デバイス
WO2015115635A1 (ja) * 2014-01-31 2015-08-06 凸版印刷株式会社 生体分子解析キット及び生体分子解析方法
WO2017043530A1 (ja) * 2015-09-08 2017-03-16 凸版印刷株式会社 生体物質検出方法
JP2018031631A (ja) * 2016-08-23 2018-03-01 パナソニックＩｐマネジメント株式会社 マイクロ流体チップ、微生物検出装置及び微生物検出方法
WO2019098301A1 (ja) * 2017-11-17 2019-05-23 凸版印刷株式会社 標的分子の検出方法
JP2022159046A (ja) * 2021-03-31 2022-10-17 東レ株式会社 分析用チップ、分析方法及び分析用チップの製造方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN120908103A (zh) * 2025-10-11 2025-11-07 山东省农业科学院 一种用于sers检测的检测平台及其构建方法、一种sers检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2024085226A1 (ja) 2024-04-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112105912B (zh) 用于单生物纳米颗粒分析的方法和设备
CN1173776C (zh) 在微规模流体性设备里的高通过量的筛选分析系统
TWI790272B (zh) 粒子分離系統及方法
EP2352590B1 (en) Microfluidic multiplexed cellular and molecular analysis device and method
US10718776B2 (en) Method for detecting biological substance
US9244065B1 (en) Systems, devices, and methods for agglutination assays using sedimentation
JP2023106482A (ja) 標的分子の検出方法
US9079179B2 (en) Microfluidic device comprising sensor
SE531948C2 (sv) Analysanordning för vätskeprover innefattande filter i direkt kontakt med projektioner
CN105992948A (zh) 使用磁珠的微流体免疫试验的方法和系统
JP5720129B2 (ja) 粒子固定用構造体、粒子解析装置、及び解析方法
JP2012013550A (ja) 粒子固定用構造体、粒子解析装置、及び解析方法
Kim et al. A particle-based microfluidic fluorescent lateral flow assay for rapid and sensitive detection of SARS-CoV-2 antibody
WO2024085226A1 (ja) 検出キット及び標的分子の検出方法
EP4428533A1 (en) Method for detecting target substance
JP2007120399A (ja) マイクロ流体チップおよびマイクロ総合分析システム
JP2017049151A (ja) 生体物質検出方法
WO2019131606A1 (ja) 検査デバイス
JP2012013551A (ja) 粒子固定用構造体、粒子解析装置、及び解析方法
JP2024129127A (ja) ウェルに液体を導入する方法
Stephens et al. Mass-producible microporous silicon membranes for specific leukocyte subset isolation, immunophenotyping, and personalized immunomodulatory drug screening in vitro
EP4607203A1 (en) Detection device and method for detecting target molecules
US20240238788A1 (en) Fluid device, detection kit, and method for detecting target substance
US20250352999A1 (en) Fluidic device, and method for detecting target molecule
JP2006125990A (ja) 生体物質検査デバイスおよびマイクロリアクタ

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 23879869

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2024551856

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 23879869

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1