WO2024071039A1

WO2024071039A1 - キメラ抗原受容体（ｃａｒ）を含む誘導性制御性ｔ細胞

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Publication number: WO2024071039A1
Application number: PCT/JP2023/034731
Authority: WO
Inventors: 統久三上; 志文坂口; 周成宮
Original assignee: Regcell Co Ltd; Osaka University NUC
Current assignee: Regcell Co Ltd; University of Osaka NUC
Priority date: 2022-09-26
Filing date: 2023-09-25
Publication date: 2024-04-04
Anticipated expiration: 2025-03-26
Also published as: EP4596684A1; JPWO2024071039A1; CN119948155A

Abstract

本開示は、高い機能性を有し、安定した免疫抑制機能をもつ誘導性制御性Ｔ細胞を含む、Ｔ細胞関連疾患を治療または予防するための医薬組成物を提供し、またキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む誘導性制御性Ｔ細胞を提供する。本開示において、Ｔ細胞関連疾患を治療または予防するための医薬組成物であって、ＣＴＬＡ４陽性、ＮＴ５Ｅ陽性、ＩＴＧＡＥ（ＣＤ１０３）陽性、及びＡＲＥＧ陽性からなる群より選択される少なくとも１つの特徴を有する誘導性制御性Ｔ細胞を有効成分として含有する、医薬組成物が提供される。本開示において、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む誘導性制御性Ｔ細胞が提供される。

Description

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む誘導性制御性Ｔ細胞

　本開示は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む誘導性制御性Ｔ細胞、およびＴ細胞関連疾患を治療または予防するための医薬組成物に関する。

　免疫系に内在するＣＤ２５陽性ＣＤ４陽性制御性Ｔ細胞の重要な特徴として、転写因子ＦｏｘＰ３を特異的に発現しており、ＦｏｘＰ３の欠損あるいは突然変異によって、制御性Ｔ細胞の発生および分化、また抑制機能が障害されることがある。制御性Ｔ細胞はＦｏｘＰ３の他、ＣＴＬＡ４、ＩＬ－１０など多様な遺伝子の発現をもって免疫系を抑制する。ＦｏｘＰ３の安定な発現を始めとする制御性Ｔ細胞の包括的遺伝子発現制御にはＤＮＡ脱メチル化などエピジェネティクな状態が貢献していると考えられており、それらは機能的な制御性Ｔ細胞の表現型と相関がある。

　本発明者らは、自らが開発した誘導性制御性Ｔ細胞において、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を導入することができるかを検討し、これを含ませることによって本開示を完成させ、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む誘導性制御性Ｔ細胞が画期的な医薬として提供し得ることを見出した。本開示で用いられる誘導性制御性Ｔ細胞は、ヒト末梢Ｔ細胞から制御性Ｔ細胞を誘導する際に、ヒト末梢Ｔ細胞から抗ＣＤ３抗体を用いた刺激によって安定な誘導性Ｔ細胞を誘導した後に、休眠培養を施し、再度抗ＣＤ３抗体刺激を行って培養し、さらに休眠培養を施すことによって、生成され、高い抑制性分子の発現と高い抑制機能を有するものである。

　また本発明者らは、このような誘導性制御性Ｔ細胞にさらにキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現および／または保持させ得ることを見出し、医薬として使用可能な、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む誘導性制御性Ｔ細胞を得た。

　したがって、本開示は以下を提供する。
（項目１）
　キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む誘導性制御性Ｔ細胞。
（項目２）
　前記ＣＡＲは前記誘導性制御性Ｔ細胞に発現されたものである、上記項目に記載の誘導性制御性Ｔ細胞。
（項目３）
　ＣＴＬＡ４陽性、ＮＴ５Ｅ陽性、ＩＴＧＡＥ（ＣＤ１０３）陽性、及びＡＲＥＧ陽性からなる群より選択される少なくとも１つの特徴を有する、上記項目のいずれか一項に記載の誘導性制御性Ｔ細胞。
（項目４）
　ＣＴＬＡ４陽性、ＮＴ５Ｅ陽性、ＩＴＧＡＥ（ＣＤ１０３）陽性、及びＡＲＥＧ陽性からなる群より選択される少なくとも２つの特徴を有する、上記項目のいずれか一項に記載の誘導性制御性Ｔ細胞。
（項目５）
　少なくともＣＴＬＡ４陽性である、上記項目のいずれか一項に記載の誘導性制御性Ｔ細胞。
（項目６）
　ＦＯＸＰ３遺伝子のＣＮＳ２部位が脱メチル化されている、上記項目のいずれか一項に記載の誘導性制御性Ｔ細胞。
（項目７）
　ＣＤ４陽性またはＣＤ８陽性である、上記項目のいずれか一項に記載の誘導性制御性Ｔ細胞。
（項目８）
　ヒトの末梢血Ｔ細胞、またはヒト組織由来Ｔ細胞から得られるか、または誘導される、上記項目のいずれか一項に記載の誘導性制御性Ｔ細胞。
（項目８Ａ）
　前記ＣＡＲは第二世代または第三世代のＣＡＲである、上記項目のいずれか一項に記載の誘導性制御性Ｔ細胞。
（項目８Ｂ）
　前記ＣＡＲは第二世代のＣＡＲである、上記項目のいずれか一項に記載の誘導性制御性Ｔ細胞。
（項目８Ｃ）
　前記ＣＡＲは第三世代のＣＡＲである、上記項目のいずれか一項に記載の誘導性制御性Ｔ細胞。
（項目９）
（ａ）末梢血中のＣＤ４陽性Ｔ細胞またはＣＤ８陽性Ｔ細胞を、第一の基礎培地で約１～約５日間刺激する工程と、
（ｂ）工程（ａ）で得られた細胞を、ＩＬ－２を含む培地で少なくとも約１～約３日間休眠培養する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた細胞を、第二の基礎培地で約１～約５日間刺激する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた細胞を、ＩＬ－２を含む培地で少なくとも約１～約３日間休眠培養する工程と、
（ｅ）工程（ａ）～（ｄ）のいずれかにおいて、少なくとも１回ＣＡＲ遺伝子を導入する工程と
を含む方法によって得られる、上記項目のいずれか一項に記載の誘導性制御性Ｔ細胞。
（項目１０）
　Ｔ細胞を含む細胞集団であって、前記細胞集団のＴ細胞における約５０％以上が、上記項目のいずれか一項に記載の誘導性制御性Ｔ細胞である、細胞集団。
（項目１１）
　前記細胞集団中のＴ細胞における約８０％以上が、上記項目のいずれか一項に記載の誘導性制御性Ｔ細胞である、項目１０に記載の細胞集団。
（項目１２）
　前記細胞集団におけるＴ細胞は、制御性Ｔ細胞である、上記項目のいずれか一項に記載の細胞集団。
（項目１３）
　前記細胞集団の約９０％以上がＴ細胞である、上記項目のいずれか一項に記載の細胞集団。
（項目Ａ１）
　キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む誘導性制御性Ｔ細胞を含む、医薬組成物。
（項目Ａ２）
　前記ＣＡＲは前記誘導性制御性Ｔ細胞に発現されたものである、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ａ３）
　前記誘導性制御性Ｔ細胞が、ＣＴＬＡ４陽性、ＮＴ５Ｅ陽性、ＩＴＧＡＥ（ＣＤ１０３）陽性、及びＡＲＥＧ陽性からなる群より選択される少なくとも１つの特徴を有する、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ａ４）
　前記誘導性制御性Ｔ細胞が、ＣＴＬＡ４陽性、ＮＴ５Ｅ陽性、ＩＴＧＡＥ（ＣＤ１０３）陽性、及びＡＲＥＧ陽性からなる群より選択される少なくとも２つの特徴を有する、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ａ５）
　前記誘導性制御性Ｔ細胞が、少なくともＣＴＬＡ４陽性である、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ａ６）
　前記誘導性制御性Ｔ細胞のＦＯＸＰ３遺伝子のＣＮＳ２部位が脱メチル化されている、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ａ７）
　前記誘導性制御性Ｔ細胞が、ＣＤ４陽性またはＣＤ８陽性である、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ａ８）
　前記誘導性制御性Ｔ細胞が、ヒトの末梢血Ｔ細胞、またはヒト組織由来Ｔ細胞から得られるか、または誘導される、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ａ８Ａ）
　前記ＣＡＲは第二世代または第三世代のＣＡＲである、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ａ８Ｂ）
　前記ＣＡＲは第二世代のＣＡＲである、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ａ８Ｃ）
　前記ＣＡＲは第三世代のＣＡＲである、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ａ９）
　前記誘導性制御性Ｔ細胞が、
（ａ）末梢血中のＣＤ４陽性Ｔ細胞またはＣＤ８陽性Ｔ細胞を、第一の基礎培地で約１～約５日間刺激する工程と、
（ｂ）工程（ａ）で得られた細胞を、ＩＬ－２を含む培地で少なくとも約１～約３日間休眠培養する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた細胞を、第二の基礎培地で約１～約５日間刺激する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた細胞を、ＩＬ－２を含む培地で少なくとも約１～約３日間休眠培養する工程と、
（ｅ）工程（ａ）～（ｄ）のいずれかにおいて、少なくとも１回ＣＡＲ遺伝子を導入する工程と
を含む方法によって得られる、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ａ１０）
　Ｔ細胞集団における細胞の約５０％以上が前記誘導性制御性Ｔ細胞であるＴ細胞集団を含む、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ａ１１）
　Ｔ細胞集団における細胞の約８０％以上が前記誘導性制御性Ｔ細胞であるＴ細胞集団を含む、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ａ１２）
　前記Ｔ細胞集団は、制御性Ｔ細胞集団である、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ａ１３）
　前記細胞集団の約９０％以上がＴ細胞である、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ａ１４）
　前記誘導性制御性Ｔ細胞を、投与１回あたり約１０^８～約１０^９個、または約１０^７個／ｋｇ投与されるように含む、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ａ１５）
　Ｔ細胞関連疾患を治療または予防するための、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ａ１６）
　前記Ｔ細胞関連疾患が、自己免疫疾患、アレルギー、移植片拒絶、移植片対宿主病、炎症性疾患、感染症、がん、およびＡＬＳを含む、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ａ１７）
　前記自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス、クローン病、糖尿病（Ｉ型）、栄養障害型表皮水疱症、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン－バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、血管炎、白斑、粘液水腫、悪性貧血、潰瘍性大腸炎、および心筋症を含む、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ａ１８）
　前記医薬組成物は、注射により投与される、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ａ１９）
　前記医薬組成物が患者に投与された場合に、効果がない、または不十分な患者に対して、前記医薬組成物が追加で投与される、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ａ２０）
　前記医薬組成物は、最初の投与から少なくとも約２週間後に追加で投与される、上記項目のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目Ａ２１）
　上記項目のいずれか一項に記載の誘導性制御性Ｔ細胞または上記項目のいずれか一項に記載の細胞集団を含む、Ｔ細胞関連疾患の治療薬であって、該疾患の対象のＴ細胞関連疾患に関し診断を行い、該診断に基づいて前記誘導性制御性Ｔ細胞または前記細胞集団に含まれる適切なＣＡＲを選択する、治療薬。
（項目ＡＡ１）
　キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む誘導性制御性Ｔ細胞の有効量を対象に投与する工程を含む、前記対象において、前記誘導性制御性Ｔ細胞により処置しうる疾患、障害または症状を治療または予防する方法。
（項目ＡＡ２）
　前記ＣＡＲは前記誘導性制御性Ｔ細胞に発現されたものである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目ＡＡ３）
　前記誘導性制御性Ｔ細胞が、ＣＴＬＡ４陽性、ＮＴ５Ｅ陽性、ＩＴＧＡＥ（ＣＤ１０３）陽性、及びＡＲＥＧ陽性からなる群より選択される少なくとも１つの特徴を有する、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目ＡＡ４）
　前記誘導性制御性Ｔ細胞が、ＣＴＬＡ４陽性、ＮＴ５Ｅ陽性、ＩＴＧＡＥ（ＣＤ１０３）陽性、及びＡＲＥＧ陽性からなる群より選択される少なくとも２つの特徴を有する、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目ＡＡ５）
　前記誘導性制御性Ｔ細胞が、少なくともＣＴＬＡ４陽性である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目ＡＡ６）
　前記誘導性制御性Ｔ細胞のＦＯＸＰ３遺伝子のＣＮＳ２部位が脱メチル化されている、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目ＡＡ７）
　前記誘導性制御性Ｔ細胞が、ＣＤ４陽性またはＣＤ８陽性である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目ＡＡ８）
　前記誘導性制御性Ｔ細胞が、ヒトの末梢血Ｔ細胞、またはヒト組織由来Ｔ細胞から得られるか、または誘導される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目ＡＡ８Ａ）
　前記ＣＡＲは第二世代または第三世代のＣＡＲである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目ＡＡ８Ｂ）
　前記ＣＡＲは第二世代のＣＡＲである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目ＡＡ８Ｃ）
　前記ＣＡＲは第三世代のＣＡＲである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目ＡＡ９）
（ａ）末梢血中のＣＤ４陽性Ｔ細胞またはＣＤ８陽性Ｔ細胞を、第一の基礎培地で約１～約５日間刺激する工程と、
（ｂ）工程（ａ）で得られた細胞を、ＩＬ－２を含む培地で少なくとも約１～約３日間休眠培養する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた細胞を、第二の基礎培地で約１～約５日間刺激する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた細胞を、ＩＬ－２を含む培地で少なくとも約１～約３日間休眠培養する工程と、
（ｅ）工程（ａ）～（ｄ）のいずれかにおいて、少なくとも１回ＣＡＲ遺伝子を導入する工程と
を含む方法によって前記誘導性制御性Ｔ細胞を得る工程をさらに包含する、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目ＡＡ１０）
　Ｔ細胞集団における細胞の約５０％以上が前記誘導性制御性Ｔ細胞であるＴ細胞集団を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目ＡＡ１１）
　Ｔ細胞集団における細胞の約８０％以上が前記誘導性制御性Ｔ細胞であるＴ細胞集団を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目ＡＡ１２）
　前記Ｔ細胞集団は、制御性Ｔ細胞集団である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目ＡＡ１３）
　前記細胞集団の約９０％以上がＴ細胞である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目ＡＡ１４）
　前記誘導性制御性Ｔ細胞を、投与１回あたり約１０^８～約１０^９個、または約１０^７個／ｋｇ投与されるように含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目ＡＡ１５）
　前記疾患、障害または症状の治療または予防は、Ｔ細胞関連疾患の治療または予防を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目ＡＡ１６）
　前記疾患、障害または症状が、自己免疫疾患、アレルギー、移植片拒絶、移植片対宿主病、炎症性疾患、感染症、がん、およびＡＬＳを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目ＡＡ１７）
　前記自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス、クローン病、糖尿病（Ｉ型）、栄養障害型表皮水疱症、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン－バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、血管炎、白斑、粘液水腫、悪性貧血、潰瘍性大腸炎、および心筋症を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目ＡＡ１８）
　前記投与は、注射による投与を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目ＡＡ１９）
　前記対象に投与された場合に、効果がない、または不十分な対象に対して、前記誘導性制御性Ｔ細胞を追加で投与することを包含する、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目ＡＡ２０）
　前記誘導性制御性Ｔ細胞は、追加で投与される場合、最初の投与から少なくとも約２週間後に追加で投与される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目ＡＡ２１）
　前記方法は、前記対象において、前記疾患、障害または症状の診断を行い、該診断に基づいて前記誘導性制御性Ｔ細胞または前記細胞集団に含まれる適切なＣＡＲを選択することをさらに含む方法。
（項目ＡＡＡ１）
　キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む誘導性制御性Ｔ細胞の、前記誘導性制御性Ｔ細胞により処置しうる疾患、障害または症状を治療または予防するための医薬の製造のための使用。
（項目ＡＡＡ２）
　前記ＣＡＲは前記誘導性制御性Ｔ細胞に発現されたものである、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目ＡＡＡ３）
　前記誘導性制御性Ｔ細胞が、ＣＴＬＡ４陽性、ＮＴ５Ｅ陽性、ＩＴＧＡＥ（ＣＤ１０３）陽性、及びＡＲＥＧ陽性からなる群より選択される少なくとも１つの特徴を有する、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目ＡＡＡ４）
　前記誘導性制御性Ｔ細胞が、ＣＴＬＡ４陽性、ＮＴ５Ｅ陽性、ＩＴＧＡＥ（ＣＤ１０３）陽性、及びＡＲＥＧ陽性からなる群より選択される少なくとも２つの特徴を有する、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目ＡＡＡ５）
　前記誘導性制御性Ｔ細胞が、少なくともＣＴＬＡ４陽性である、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目ＡＡＡ６）
　前記誘導性制御性Ｔ細胞のＦＯＸＰ３遺伝子のＣＮＳ２部位が脱メチル化されている、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目ＡＡＡ７）
　前記誘導性制御性Ｔ細胞が、ＣＤ４陽性またはＣＤ８陽性である、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目ＡＡＡ８）
　前記誘導性制御性Ｔ細胞が、ヒトの末梢血Ｔ細胞、またはヒト組織由来Ｔ細胞から得られるか、または誘導される、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目ＡＡＡ８Ａ）
　前記ＣＡＲは第二世代または第三世代のＣＡＲである、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目ＡＡＡ８Ｂ）
　前記ＣＡＲは第二世代のＣＡＲである、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目ＡＡＡ８Ｃ）
　前記ＣＡＲは第三世代のＣＡＲである、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目ＡＡＡ９）
　前記誘導性制御性Ｔ細胞が、
（ａ）末梢血中のＣＤ４陽性Ｔ細胞またはＣＤ８陽性Ｔ細胞を、第一の基礎培地で約１～約５日間刺激する工程と、
（ｂ）工程（ａ）で得られた細胞を、ＩＬ－２を含む培地で少なくとも約１～約３日間休眠培養する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた細胞を、第二の基礎培地で約１～約５日間刺激する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた細胞を、ＩＬ－２を含む培地で少なくとも約１～約３日間休眠培養する工程と、
（ｅ）工程（ａ）～（ｄ）のいずれかにおいて、少なくとも１回ＣＡＲ遺伝子を導入する工程と
を含む方法によって得られる、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目ＡＡＡ１０）
　Ｔ細胞集団における細胞の約５０％以上が前記誘導性制御性Ｔ細胞であるＴ細胞集団を含む、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目ＡＡＡ１１）
　Ｔ細胞集団における細胞の約８０％以上が前記誘導性制御性Ｔ細胞であるＴ細胞集団を含む、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目ＡＡＡ１２）
　前記Ｔ細胞集団は、制御性Ｔ細胞集団である、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目ＡＡＡ１３）
　前記細胞集団の約９０％以上がＴ細胞である、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目ＡＡＡ１４）
　前記誘導性制御性Ｔ細胞を、投与１回あたり約１０^８～約１０^９個、または約１０^７個／ｋｇ投与されるように含む、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目ＡＡＡ１５）
　前記疾患、障害または症状はＴ細胞関連疾患を含む、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目ＡＡＡ１６）
　前記疾患、障害または症状が、自己免疫疾患、アレルギー、移植片拒絶、移植片対宿主病、炎症性疾患、感染症、がん、およびＡＬＳを含む、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目ＡＡＡ１７）
　前記自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス、クローン病、糖尿病（Ｉ型）、栄養障害型表皮水疱症、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン－バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、血管炎、白斑、粘液水腫、悪性貧血、潰瘍性大腸炎、および心筋症を含む、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目ＡＡＡ１８）
　前記使用は、注射により投与される、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目ＡＡＡ１９）
　前記使用が患者に投与された場合に、効果がない、または不十分な患者に対して、前記使用が追加で投与される、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目ＡＡＡ２０）
　前記使用は、最初の投与から少なくとも約２週間後に追加で投与される、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目ＡＡＡ２１）
　前記医薬は、前記疾患、障害または症状に関し診断を行い、該診断に基づいて前記誘導性制御性Ｔ細胞または前記細胞集団に含まれる適切なＣＡＲを選択することを特徴とする、使用。
（項目Ｂ１）
　キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む誘導性制御性Ｔ細胞を製造する方法であって、
（ａ）末梢血中のＣＤ４陽性Ｔ細胞またはＣＤ８陽性Ｔ細胞を、第一の基礎培地で約１～約５日間刺激する工程と、
（ｂ）工程（ａ）で得られた細胞を、ＩＬ－２を含む培地で少なくとも約１～約３日間休眠培養する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた細胞を、第二の基礎培地で約１～約５日間刺激する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた細胞を、ＩＬ－２を含む培地で少なくとも約１～約３日間休眠培養する工程と、
（ｅ）工程（ａ）～（ｄ）のいずれかにおいて、少なくとも１回ＣＡＲ遺伝子を導入する工程と
を含む、方法。
（項目Ｂ２）
　前記ＣＡＲ遺伝子の導入が、工程（ａ）～（ｄ）のいずれかにおいて少なくとも計約２回行われる、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ３）
　前記ＣＡＲ遺伝子の導入が、工程（ａ）において少なくとも１回行われる、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ４）
　前記第一の基礎培地が、抗ＣＤ３抗体、ＴＧＦ－β１、ＩＬ－２、レチノイン酸、ＣＤＫ８阻害剤、ＣＤＫ１９阻害剤、ＣＤＫ８／１９阻害剤、及びアスコルビン酸からなる群から選択される少なくとも１つの因子を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ５）
　前記第一の基礎培地が、抗ＣＤ３抗体、ＴＧＦ－β１、ＩＬ－２、レチノイン酸、ＣＤＫ８阻害剤、ＣＤＫ１９阻害剤、ＣＤＫ８／１９阻害剤、及びアスコルビン酸を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ６）
　前記第二の基礎培地が、抗ＣＤ３抗体、ＴＧＦ－β１、ＩＬ－２、レチノイン酸、ＣＤＫ８阻害剤、ＣＤＫ１９阻害剤、及びＣＤＫ８／１９阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つの因子を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ７）
　前記第二の基礎培地が、抗ＣＤ３抗体、ＴＧＦ－β１、ＩＬ－２、レチノイン酸、ＣＤＫ８阻害剤、ＣＤＫ１９阻害剤、及びＣＤＫ８／１９阻害剤を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ８）
　工程（ａ）が、前記ＣＤ４陽性Ｔ細胞またはＣＤ８陽性Ｔ細胞を、前記第一の基礎培地で約３日間刺激する、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ９）
　工程（ｂ）が、工程（ａ）で得られた細胞を、前記ＩＬ－２を含む培地で少なくとも約２日間休眠培養する、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ１０）
　工程（ｃ）が、工程（ｂ）で得られた細胞を、前記第二の基礎培地で約３日間刺激する、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ１１）
　工程（ｄ）が、工程（ｃ）で得られた細胞を、前記ＩＬ－２を含む培地で少なくとも約２日間休眠培養する、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ１２）
　上記項目のいずれか一項に記載の方法によって生成される、誘導性制御性Ｔ細胞または前記誘導性制御性Ｔ細胞を含む細胞集団。

　本開示において、上記の１つまたは複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供され得ることが意図される。なお、本開示のさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。

　なお、上記した以外の本開示の特徴及び顕著な作用・効果は、以下の発明の実施形態の項及び図面を参照することで、当業者にとって明確となる。

　本開示の制御性Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を効率的に機能させることができ、機能性の高い制御性Ｔ細胞として、様々な免疫疾患、自己免疫病などの炎症性疾患の治療や予防などに用い得る。

　また本開示によれば、本開示の誘導性制御性Ｔ細胞に対してレンチウイルスを用いて効率的に機能し得る態様で遺伝子導入を行うことができるため、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）遺伝子に限らず、任意の遺伝子についても、同様の手法で誘導性制御性Ｔ細胞への遺伝子導入が可能となる。

図１は、マウス誘導性制御性Ｔ細胞（マウス高機能安定型ｉＴｒｅｇ（ＨＳＦ　ｉＴｒｅｇ）細胞ともいう）の一実施形態の作製法の概略と、その誘導性制御性Ｔ細胞におけるフローサイトメトリーの結果である。図１ＡはマウスＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞から各種刺激方法によってｉＴｒｅｇ細胞を誘導する際のプロトコル概略を示す。図１Ｂは、図１Ａで作製したｉＴｒｅｇ細胞および活性Ｔ細胞、活性化ｎＴｒｅｇ細胞における、ＦｏｘＰ３、ＣＤ２５の発現をフローサイトメトリー法で解析した結果である。図２は、図１の本開示のｉＴｒｅｇ（図中、ＳＦ－ｉＴｒｅｇ）の一実施形態に係る作製法に基づき、マウスＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞またはエフェクターＴ細胞からＳＦ－ｉＴｒｅｇを作製した際のＦｏｘＰ３発現をフローサイトメトリー法で、またＴｒｅｇ特異的脱メチル化領域の脱メチル化状態をバイサルファイト法で、それぞれ解析した結果を示す図である。図３は、図１の各細胞について網羅的遺伝子発現パターンをＲＮＡシーケンス法で解析した一実施形態の結果である。図３ＡはＰＣＡ解析プロットを、図３ＢはＴｒｅｇ関連遺伝子のヒートマップを示す。図４は、図１の各細胞のｉｎ　ｖｉｔｒｏ抑制能を解析した一実施形態の結果である。マウスＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞をCell　Trace　Violet試薬で染色し、図１の各細胞と一定の比率で抗マウスＣＤ３抗体＋ＭＨＣ－ＩＩ陽性細胞またはDynabeads　T-activator（ベリタス）（５μＬ／ｗｅｌｌ）存在下で３日間混合培養し、Cell　Trace　Violet強度をフローサイトメトリー法で解析した。図５は、図１の一回刺激ＣＤ２８抗体未使用群および本開示のｉＴｒｅｇについて野生型マウスに投与し、２週間後に移入した制御性Ｔ細胞のＦｏｘｐ３発現を解析した一実施形態の結果である。図６は、ＲＡＧ２欠損マウスにマウスＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞を移入して大腸炎モデルを作成し、本開示のｉＴｒｅｇ細胞を投与して治療効果を解析した一実施形態の結果である。図６Ａは体重（ｇ）の変化を、図６Ｂは大腸組織のＨＥ染色画像を、図６Ｃはリンパ節Ｔ細胞におけるＣＤ６９発現をフローサイトメトリー法での解析結果を示す。図７は、ヒトクローン病患者由来の本開示のｉＴｒｅｇの一実施形態の解析結果を示す図である。図７Ａは、ヒトクローン病患者由来ＣＤ４陽性Ｔ細胞から本開示の誘導性制御性Ｔ細胞（図ではＨＳＦ－ｉＴｒｅｇ）を作製し、ＦＯＸＰ３、ＣＴＬＡ４、Ｈｅｌｉｏｓの発現をフローサイトメトリー法で解析した結果である。通常のｎＴｒｅｇ（ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性Ｔ細胞）を刺激した細胞、および通常のｉＴｒｅｇ（Conventional　iTreg:ＣＤ４陽性Ｔ細胞をＩＬ－２とＴＧＦ－β１の存在下で３日間ＣＤ３／ＣＤ２８刺激した細胞）を比較した。図７Ｂは、図７Ａの各細胞のｉｎ　ｖｉｔｒｏ抑制能の解析結果である。ヒトＣＤ４陽性Ｔ細胞をCell　Trace　Violet試薬で染色し、図１の各細胞と一定の比率でTreg　Suppression　Inspector（Miltenyi　Biotec）（５μＬ／ｗｅｌｌ）存在下で３日間混合培養し、Cell　Trace　Violet強度をフローサイトメトリー法で解析した。図８は、ヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞から作製した本開示のｉＴｒｅｇ（ＨＳＦ　ｉＴｒｅｇ）細胞の一実施形態の表現型解析（フローサイトメトリー）を示す図である。ヒトＣＤ８陽性Ｔ細胞から高機能誘導性制御性Ｔ細胞を作製し、ＦＯＸＰ３、ＣＴＬＡ４、Ｈｅｌｉｏｓの発現をフローサイトメトリー法で解析した。図９の上部に示した模式図は、ヒトＣＤ４陽性Ｔ細胞から高機能誘導性制御性Ｔ細胞（ＨＳＦ－ｉＴｒｅｇ）を作製するプロセスと、その過程中でＣＡＲ発現ウイルスベクター搭載レンチウイルスを感染させるタイミングを示した図である。矢印で示すようにＤａｙ１、Ｄａｙ２、Ｄａｙ４、Ｄａｙ８のタイミングでレンチウイルス（Ｌｅｎｔｉ－ＣＤ１９　ＣＡＲ　（ｓｃＦｖ－ＣＤ２８，　ＦＭＣ６３）　Ｖｉｒａｌ　Ｐａｒｔｉｃｌｅ，Ｃａｔ．　Ｎｏ．：　ＶＰ－ＣＡＲ－ＬＣ６１）を全培養液量の２０分の１量添加して、最終日にＦＯＸＰ３およびＣＡＲの発現をＦＣＭ解析した。図９の下部に示した図は、Day13におけるFOXP3およびCAR遺伝子の発現を示す。一次刺激期間に遺伝子を導入することで高効率にＣＡＲを発現させることができることが示された。図１０は、本開示の一実施形態において、実施例７のＤａｙ１導入サンプルについてＣＴＬＡ４の発現をＦＣＭ解析した結果を示す。ＣＡＲを発現したＨＳＦ－ｉＴｒｅｇ細胞集団においても高いＣＴＬＡ４発現が確認された。図１１はヒトＣＤ４陽性Ｔ細胞から高機能誘導性制御性Ｔ細胞（ＨＳＦ－ｉＴｒｅｇ）を作製するプロセスにおいて、上記のタイミングでレンチウイルス（Ｌｅｎｔｉ－ＨＬＡ－Ａ２　ＣＡＲ　（ｓｃＦｖ－２８ζ，　ＢＢ７．２）－ＶＰ　（ＶＰ－ＣＡＲ－ＬＣ８０９）またはＬｅｎｔｉ－ＥｐＣＡＭ　ＣＡＲ　（ｓｃＦｖ－２８ζ，　Ｍ１３－５７）－ＶＰ　（ＶＰ－ＣＡＲ－ＬＣ８４７））をそれぞれ全培養液量の５０分の１量または２５分の１量で添加して、最終日にＣＡＲ（ＧＦＰ）、ＦＯＸＰ３およびＣＴＬＡ４の発現をＦＣＭ解析した結果を示す。一次刺激期間に遺伝子を導入することでどの種類のＣＡＲであってもＴｒｅｇの性質や誘導効率を損なうことなく高効率に発現させることができるが示された。

　以下、本開示を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本開示の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。

　以下に本明細書において特に使用される用語の定義および／または基本的技術内容を適宜説明する。

　本明細書において、「約」とは、後に続く数値の±１０％を意味する。例えば、「約２０」は、「１８～２２」を含むものとする。数値の範囲は、両端点の間の全ての数値および両端点の数値を含む。範囲に関する「約」は、その範囲の両端点に適用される。したがって、例えば、「約２０～３０」は、「１８～３３」を含むものとする。

　本明細書において、遺伝子名およびその産物を表記する際には、通常の用法とは異なり、すべて大文字で表記する場合には、遺伝子とタンパク質の両方を指すことがある。例えば、ＦＯＸＰ３遺伝子、ＦＯＸＰ３タンパク質と使い分けすることもあり、ＦｏｘＰ３と表記する場合には、当該遺伝子またはタンパク質の概念と実体の両方（全体）を指す。

　本明細書において、「制御性Ｔ細胞（Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｔ　ｃｅｌｌ）」とは、ＦｏｘＰ３発現が陽性のＴ細胞である。本明細書において、「Ｔｒｅｇ」とも称される場合がある。Ｔｒｅｇは内因性制御性Ｔ細胞（Ｎａｔｕｒａｌｌｙ　Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ　Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｔ　ｃｅｌｌ：ｎＴｒｅｇ）、誘導性制御性Ｔ細胞（Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｔ　ｃｅｌｌ：ｉＴｒｅｇ）などがある。制御性Ｔ細胞は、通常、種々の機能（例えば、免疫抑制機能）を有し得る。

　本明細書において、「誘導性制御性Ｔ細胞（Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｔ　ｃｅｌｌ、ｉＴｒｅｇ）」とは、制御性Ｔ細胞のうち、ＩＫＺＦ２（Ｈｅｌｉｏｓ）の発現が陰性であるものをいう。ｉＴｒｅｇは、通常、ナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞等などから分化誘導することによって得られる。

　本明細書において、「内因性制御性Ｔ細胞（Ｎａｔｕｒａｌｌｙ　Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ　Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｔ　ｃｅｌｌ、ｎＴｒｅｇ）」とは、制御性Ｔ細胞のうち、ＩＫＺＦ２（Ｈｅｌｉｏｓ）、及びＣＴＬＡ４の発現が陽性のものをいう。通常、生体内に存在する細胞である。

　本明細書において、「末梢Ｔ細胞」とは、胸腺外に存在するＴ細胞をいい、末梢血液、リンパ節、その他組織から取得することができる。本明細書において「末梢Ｔ細胞」というとき、細胞群に末梢Ｔ細胞が含まれていればよく、Ｔ細胞が単離されている必要はない。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）などＴ細胞の他にも種々のリンパ球を含む細胞画分を用いてもよい。

　本明細書において「フローサイトメトリー」とは、液体中に懸濁する細胞，個体およびその他の生物粒子の粒子数，個々の物理的・化学的・生物学的性状を計測する技術をいう。この技術を用いた装置は、「フローサイトメーター」という。本開示において、細胞マーカー（例えば、ＦｏｘＰ３、ＣＴＬＡ４、Ｈｅｌｉｏｓ、ＣＤ１０３など）の「陽性」「陰性」は、当該分野において通常使用されるように、フローサイトメトリーによって定められる。より詳細には、フローサイトメトリーでは、細胞を一列に並べて流し、分光学的手法により細胞の数をカウントする。例えば、蛍光や発光酵素によって標識された細胞にレーザー光を照射し、これによって細胞から発せられる蛍光又は発光信号をフォトダイオード等の検出器で検出することで、標的細胞の数をカウントする。また、検出器での検出結果をコンピュータに取り込んで、二次元プロットを生成して表示することもできる。これにより、標的細胞の有無、及びその数等を容易に把握できる。

　本明細書において、「脱メチル化」とは、代表的にメチル化しているアデニン（例えば、６位；ｍ６Ａ、１位；ｍ１Ａ）やシトシン（例えば、５位；ｍ５Ｃ、３位；ｍ３Ｃ）のメチル化修飾が取り除かれることをいう。脱メチル化は、当該分野で公知の手法を用いて特定することができ、例えば、バイサルファイト法などを用いて測定することができる。

　本明細書において、「細胞集団」とは、２以上の細胞を含む集団であり、例えば、平面的に細胞同士が集まった状態のものであってもよく、３次元的に細胞同士が接着して構成された細胞塊であってもよい。また、「細胞集団」は、単一種の細胞により形成されていてもよいし、複数種の細胞が含まれていてもよい。

　本明細書において、「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」とは、抗原特異性を細胞（たとえばＴｒｅｇ）に付与できる改変された受容体をいう。ＣＡＲはまた、人工Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、またはキメラ免疫受容体として知られている。好ましくは、本開示のＣＡＲは、抗原に結合することが可能な少なくとも１つの細胞外ドメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内ドメインを含む。本明細書において使用される場合、Ｔ細胞と組み合わせて使用されるとき、ＣＡＲ－Ｔ細胞などと呼ばれることがある。使用され得るＣＡＲとしては、第一世代、第二世代および第三世代などがありえる。ここで、「第一世代ＣＡＲ」とは、腫瘍関連抗原に特異的なモノクローナル抗体可変領域のＶＨ鎖とＶＬ鎖を直列につないだもの（ｓｃＦｖ）とＴ細胞受容体のζ鎖を組み合わせたものをいう。「第二世代ＣＡＲ」とは、この第一世代キＣＡＲにＴ細胞活性化のために重要とされているＣＤ２８（ＰＩ３Ｋに関連する）、４－１ＢＢ（ＴＲＡＦｓに関連する）などの共刺激因子を一つ組み込んだものをいう。「第三世代ＣＡＲ」とは、この第一世代ＣＡＲにＴ細胞活性化のために重要とされているＣＤ２８（ＰＩ３Ｋに関連する）、４－１ＢＢ（ＴＲＡＦｓに関連する）などの共刺激因子を複数組み込んだものをいう。

　本明細書において「Ｔ細胞関連疾患」とは、Ｔ細胞の状態が直接または間接に関連する任意の疾患、障害または症状をいう。従って、Ｔ細胞関連疾患は、本開示の誘導性制御性Ｔ細胞により治療または予防が期待される。Ｔ細胞関連疾患としては、自己免疫疾患、アレルギー、移植片拒絶、移植片対宿主病、炎症性疾患、感染症、がん、およびＡＬＳなどを挙げることができる。また一実施形態において、自己免疫疾患としては、これらに限定されないが、アジソン病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、クローン病、糖尿病（Ｉ型）、栄養障害型表皮水疱症、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン－バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、血管炎、白斑、粘液水腫、悪性貧血、潰瘍性大腸炎、心筋症、拡張型心筋症（ＤＣＭ）、周産期心筋症（ＰＰＣＭ）、特発性心筋症、シャーガス心筋症、シャーガス巨大結腸、シャーガス巨大食道、シャーガス神経障害、良性前立腺肥大、硬皮症、乾癬、レイノー症候群、子癇前症、心筋炎、緑内障、高血圧症、肺高血圧症、悪性高血圧症、アルツハイマー病、全身性強皮症、多発性筋炎、混合性結合組織病、抗リン脂質抗体症候群、顕微鏡的多発血管炎、多発血管炎性肉芽腫症、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症、半月体形成性糸球体腎炎、臓器特異性自己免疫疾患、バセドウ病、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性胆管炎、自己免疫性膵炎、グッドパスチャー症候群、自己免疫性溶血性貧血、巨赤芽球性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、原発性硬化性胆管炎、結節性多発動脈炎、高安動脈炎、巨細胞性動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、成人スティル病、ベーチェット病、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎などを挙げることができる。

　本明細書において「誘導性制御性Ｔ細胞により処置しうる疾患、障害または症状」はこれにより治療または予防され得る任意の疾患、障害または症状を含む、一般に制御性Ｔ細胞が少しでも有効である任意の疾患、障害または症状が含まれるが、これに限定されず、通常の制御性Ｔ細胞が効果を示していない場合でも、誘導性制御性Ｔ細胞では効果がありえることからこれらも包含されることが理解される。

　（好ましい実施形態）
　以下に本開示の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本開示のよりよい理解のために提供されるものであり、本開示の範囲は以下の記載に限定されるべきでない。したがって、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本開示の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本開示の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができる。

　＜キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む誘導性制御性Ｔ細胞およびその利用＞
　一つの局面において、本開示は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む誘導性制御性Ｔ細胞、ならびにその製造法、使用法、およびその他関連技術を提供する。

　本開示は、高機能安定型誘導性制御性Ｔ細胞（高機能安定型ｉＴｒｅｇ、ＨＳＦ　ｉＴｒｅｇともいう。）を利用するものである。

　本開示の一つの局面において、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む誘導性制御性Ｔ細胞は、治療または予防するための医薬組成物として提供される。本開示で使用される誘導性制御性Ｔ細胞は、ＣＴＬＡ４陽性、ＮＴ５Ｅ陽性、ＩＴＧＡＥ（ＣＤ１０３）陽性、及びＡＲＥＧ陽性からなる群より選択される少なくとも１つの特徴を有する。本開示の一実施形態において、本開示の誘導性制御性Ｔ細胞は、ＣＴＬＡ４陽性、ＮＴ５Ｅ陽性、ＩＴＧＡＥ（ＣＤ１０３）陽性、及びＡＲＥＧ陽性からなる群より選択される少なくとも２つの特徴を有することもできる。また本開示の一実施形態において、本開示における誘導性制御性Ｔ細胞は少なくともＣＴＬＡ４陽性であってもよい。限定を意図するものではないが、本開示における誘導性制御性Ｔ細胞はＣＤ４陽性またはＣＤ８陽性であってもよい。

　一つの実施形態において、ＣＡＲは誘導性制御性Ｔ細胞に発現されたものである。一つの実施形態において、ＣＡＲはその遺伝子が誘導性制御性Ｔ細胞に含まれたものである。使用されるＣＡＲは任意の形態であり得、第一世代、第二世代および第三世代のいずれもが好適に利用され得る。理論に束縛されることを望まないが、本開示において使用されるとき、対象となるｉＴｒｅｇとの相対的関係により、適切な刺激強度を有することが有利であり得るがこれに限定されない。この観点から、第二世代または第三世代が好ましくあり得るがこれに限定されない。ある実施形態では第二世代が有利であり、別の実施形態では第三世代が有利であり得る。ｉＴｒｅｇとの相性を別途検討し、適切な刺激強度（例えば刺激強度の指標として栄養代謝状態、リン酸化の強度などをｉｎ　ｖｉｔｒｏで測定してもよく、結果としてのＦＯＸＰ３発現安定性をｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏで測定してもよい）に応じて選択してもよいが、本開示はこれに限定されない。

　制御性Ｔ細胞におけるＦｏｘＰ３の発現については、ＣＤ４陽性Ｔ細胞をＩＬ２とＴＧＦβを含む培地中、抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体の存在下で培養し、その後ＩＬ２及びＴＧＦβを含む培地にて培養することによって試験管内での誘導が可能である。また末梢Ｔ細胞から制御性Ｔ細胞を誘導する方法がいくつか知られているものの、誘導性制御性Ｔ細胞におけるＦｏｘＰ３の発現は不安定であり、ＦｏｘＰ３以外の多くの機能的分子発現については確認されていない。

　近年、誘導性制御性Ｔ細胞においてアスコルビン酸を培地中に添加する手法（Kasahara　et　al.　Int.　Immunol.　(2017)　29(10):457-469）、ＣＤ２８抗体刺激を使用しない手法（Mikami　et　al.　Proc　Natl　Acad　Sci　U　S　A.　(2020）117(22):12258-12268.）によってＤＮＡ脱メチル化誘導を引き起こす培養方法が開発されている。しかしこの手法で作製された誘導性制御性Ｔ細胞においても機能的分子の発現は確認されておらず、十分な免疫抑制活性が得られていない。臨床においても誘導性制御性Ｔ細胞を使用した臨床試験が１件、ＧＶＨＤを対象に実施されているが、使用された細胞の制御性Ｔ細胞の割合は低く、現時点でＧＶＨＤの予防など有効性は認められていない（MacMillan　et　al.,　Blood　Adv.　(2021)　5(5):1425-1436）。

　本開示においては、ＦｏｘＰ３の発現が安定であり、有利には、免疫抑制作用を安定的に保持する誘導性制御性Ｔ細胞を有効成分として含有する医薬組成物を提供することができ、このような誘導性制御性Ｔ細胞は、例えば、本願明細書の他の箇所で説明する誘導性制御性Ｔ細胞を製造する方法によって製造することができる。例えば、本開示は、誘導性制御性Ｔ細胞が、（ａ）末梢血中のＣＤ４陽性Ｔ細胞またはＣＤ８陽性Ｔ細胞を、第一の基礎培地で約１～約５日間刺激する工程と、（ｂ）工程（ａ）で得られた細胞を、ＩＬ－２を含む培地で少なくとも約１～約３日間休眠培養する工程と、（ｃ）工程（ｂ）で得られた細胞を、第二の基礎培地で約１～約５日間刺激する工程と、（ｄ）工程（ｃ）で得られた細胞を、ＩＬ－２を含む培地で少なくとも約１～約３日間休眠培養する工程とを含む方法によって得られる、医薬組成物を提供することができる。本開示のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む誘導性制御性Ｔ細胞は、このような方法において、ＣＡＲを導入する工程を含ませることで生成され得る。

　本開示における誘導性制御性Ｔ細胞は誘導性制御性Ｔ細胞特異的脱メチル化状態を有している。得られた制御性Ｔ細胞が、制御性Ｔ細胞特異的脱メチル化状態にあることは、例えばＦｏｘＰ３の遺伝子（ＦＯＸＰ３（すべて斜体字））のＣＮＳ２部位が脱メチル化されていることにより確認することができる。このような脱メチル化状態は、安定型の指標となり得るため、本開示における誘導性制御性Ｔ細胞は、脱メチル化状態を確認することで安定型の誘導性制御性Ｔ細胞であることを示すことができる。

　本明細書において、本開示における誘導性制御性Ｔ細胞の免疫抑制活性または免疫抑制作用は、例えば、レスポンダーＴ細胞におけるCell　Trace　Violet強度を測定することによって確認することができる。本開示における誘導性制御性Ｔ細胞は免疫抑制活性または免疫抑制作用を安定的に提供することができ、例えば、本開示の誘導性制御性Ｔ細胞は少なくとも約２週間にわたって免疫抑制活性または免疫抑制作用を提供することができる。後述の実施例において示されるように、本開示における誘導性制御性Ｔ細胞は従来の制御性Ｔ細胞（誘導性および内因性を含む）よりも高い免疫抑制作用を有することができる。そのため、本開示における誘導性制御性Ｔ細胞は機能性あるいは高機能の誘導性制御性Ｔ細胞ということもできる。

　一実施形態において、本開示における誘導性制御性Ｔ細胞はＦｏｘＰ３を安定的に発現することができる。そのため、本開示における誘導性制御性Ｔ細胞は安定型誘導性制御性Ｔ細胞ということもできる。本開示における誘導性制御性Ｔ細胞は、一側面において、高機能で安定型であり、高機能安定型誘導性制御性Ｔ細胞（ＨＳＦ　ｉＴｒｅｇ）ということができる。

　本開示の一実施形態において、本開示の誘導性制御性Ｔ細胞におけるマーカーが陽性か否かについては、フローサイトメトリーによる陽性率測定によって行うことができる。例えば、フローサイトメーターで解析し、基準以上の抗原発現量を示す細胞の割合から陽性か否かを判定することができる。細胞表面マーカーの発現強度に応じて、陰性、弱陽性、中陽性、強陽性（弱陽性、中陽性、および強陽性をまとめて「陽性」とする）などと区分することもできる。例えば、機器の設定に応じて、各マーカーの蛍光強度中央値／陰性対照の蛍光強度中央値（アイソタイプコントロール抗体による染色）の値が、５未満、５以上１０未満、１０以上３０未満、３０以上の場合に、それぞれ陰性、弱陽性、中陽性、強陽性とすることもできる。そのような判定は（フローサイトメトリーによる陽性率測定）で例示されるように判定することができるが、本開示はこれに限定されない。

　本開示の一実施形態において、本開示における誘導性制御性Ｔ細胞は任意の細胞から誘導することができるが、好ましくはヒトの末梢血Ｔ細胞、またはヒト組織由来Ｔ細胞から誘導して得ることができる。

　本開示の一実施形態において、本開示は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むＴ細胞集団における細胞の約５０％以上が、本明細書の他の箇所に説明した誘導性制御性Ｔ細胞であるＴ細胞集団を含むことができる。一実施形態において、本開示の細胞集団は、細胞集団中のＴ細胞における約６０％以上、約６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９７％以上、または約９９％以上が、本願明細書の他の箇所に記載された誘導性制御性Ｔ細胞とすることができる。

　本開示の一実施形態において、本開示の細胞集団におけるＴ細胞は、制御性Ｔ細胞とすることができる。この場合、本開示の細胞集団の制御性Ｔ細胞において、約６０％以上、約６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９７％以上、または約９９％以上が、本願明細書の他の箇所に記載された誘導性制御性Ｔ細胞とすることができる。

　本開示の一実施形態において、本開示の細胞集団は、Ｔ細胞以外の細胞を含んでいてもよいが、好ましくは、本開示の細胞集団の約６０％以上、約６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９７％以上、または約９９％以上がＴ細胞であってもよく、好ましくは、約９０％以上がＴ細胞であってもよい。

　本開示の一局面において、本開示のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む誘導性制御性Ｔ細胞または細胞集団を含む医薬組成物が提供される。また他の局面において、本開示の誘導性制御性Ｔ細胞または細胞集団を含む再生医療用材料または製品が提供される。この医薬組成物や再生医療用材料または製品は、自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギーで使用されることができる。これらの医薬、再生医療用材料または製品は、培地、その他の当該分野で使用される任意の添加物質とともに使用されることができる。このような培地としては、細胞の培養に用いられる動物細胞培養用基礎培地へ必要な因子を添加した培地を用いることができる。このような培地の例は本明細書の他の個所に詳述されている。培地に添加される成分についても、その例は本明細書の他の個所に詳述されている。このような製品として提供される場合は、ＤＭＳＯなどを含んでいてもよい。

　一実施形態において、本開示の医薬組成物は、Ｔ細胞関連疾患を治療または予防するために使用することができ、Ｔ細胞関連疾患としては、自己免疫疾患、アレルギー、移植片拒絶、移植片対宿主病、炎症性疾患、感染症、がん、およびＡＬＳなどを挙げることができる。また一実施形態において、自己免疫疾患としては、これらに限定されないが、アジソン病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、クローン病、糖尿病（Ｉ型）、栄養障害型表皮水疱症、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン－バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、血管炎、白斑、粘液水腫、悪性貧血、潰瘍性大腸炎、心筋症、拡張型心筋症（ＤＣＭ）、周産期心筋症（ＰＰＣＭ）、特発性心筋症、シャーガス心筋症、シャーガス巨大結腸、シャーガス巨大食道、シャーガス神経障害、良性前立腺肥大、硬皮症、乾癬、レイノー症候群、子癇前症、心筋炎、緑内障、高血圧症、肺高血圧症、悪性高血圧症、アルツハイマー病、全身性強皮症、多発性筋炎、混合性結合組織病、抗リン脂質抗体症候群、顕微鏡的多発血管炎、多発血管炎性肉芽腫症、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症、半月体形成性糸球体腎炎、臓器特異性自己免疫疾患、バセドウ病、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性胆管炎、自己免疫性膵炎、グッドパスチャー症候群、自己免疫性溶血性貧血、巨赤芽球性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、原発性硬化性胆管炎、結節性多発動脈炎、高安動脈炎、巨細胞性動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、成人スティル病、ベーチェット病、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎などを挙げることができる。

　一実施形態において、本開示の医薬組成物は、種々の用量・用法によって投与することができるが、好ましくは注射によって投与される。一実施形態において、本開示の医薬組成物は、本明細書の他の箇所で説明される誘導性制御性Ｔ細胞が、投与１回あたり約１０^８～約１０^９個、または約１０^７個／ｋｇ投与されるように含むことができる。

　一実施形態において、本開示の医薬組成物は、患者に投与された場合に、効果がない、または不十分な患者に対して、さらに追加で投与することもできる。効果がない、または不十分かどうかについては、例えば対象疾患における炎症の抑制の程度を指標に判断することもできる。一実施形態において、追加の投与を行う場合には、最初の投与から少なくとも約１週間後、約２週間後、約３週間後、または約４週間後に投与することができる。

　＜誘導性制御性Ｔ細胞の製法＞
　本開示における誘導性制御性Ｔ細胞を製造する方法は、高機能で、安定型の誘導性制御性Ｔ細胞を製造することができる新規の方法であり、本明細書において以下に詳細に説明する。

　本開示の一局面において、誘導性制御性Ｔ細胞を製造する方法であって、（ａ）末梢血中のＣＤ４陽性Ｔ細胞またはＣＤ８陽性Ｔ細胞を、第一の基礎培地で約１～約５日間刺激する工程と、（ｂ）工程（ａ）で得られた細胞を、ＩＬ－２を含む培地で少なくとも約１～約３日間休眠培養する工程と、（ｃ）工程（ｂ）で得られた細胞を、第二の基礎培地で約１～約５日間刺激する工程と、（ｄ）工程（ｃ）で得られた細胞を、ＩＬ－２を含む培地で少なくとも約１～約３日間休眠培養する工程とを含む、方法が提供される。本開示においては、ＣＤ４陽性Ｔ細胞およびＣＤ８陽性Ｔ細胞のいずれを原料として用いても本開示における誘導性制御性Ｔ細胞を製造することができ、（ｅ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をこのＴ細胞に導入する工程を包含することで、ＣＡＲを導入することができる。一実施形態において、本開示における誘導性制御性Ｔ細胞は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞およびＣＤ８陽性Ｔ細胞の混合細胞を原料として製造することもできる。

　一実施形態において、本開示の方法は、ヒト末梢Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体刺激の存在下でＴＧＦβおよびＩＬ－２を含む培地で培養する工程、抗ＣＤ３抗体非存在下でＩＬ－２を含む培地で培養する工程、再度抗ＣＤ３抗体刺激の存在下でＴＧＦβおよびＩＬ－２を含む培地で培養する工程を含む、ヒト末梢Ｔ細胞（ＣＤ４陽性Ｔ細胞またはＣＤ８陽性Ｔ細胞を含む）から制御性Ｔ細胞を製造する方法とすることもできる。

　本明細書において、「抗ＣＤ３抗体刺激」とは、細胞上のＣＤ３受容体に特異的な刺激を与えることを意味する。ＣＤ３刺激としては、例えば抗ＣＤ３アゴニスト抗体が例示される。抗ＣＤ３アゴニスト抗体は、研究用試薬として市販されている製品を用いても、常套方法にて作成してもよい。抗ＣＤ３抗体は、例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウシなどの動物由来、及びヒト由来のものを使用できる。

　一実施形態において、各工程で使用する培地にはさらにレチノイン酸および／またはアスコルビン酸を含んでいてもよい。好ましくは培地にはアスコルビン酸を含むことができる。一実施形態において、培地にはさらにＣＤＫ８阻害剤、ＣＤＫ１９阻害剤、及び／またはＣＤＫ８／１９阻害剤を含んでいてもよい。好ましくは培地にはＣＤＫ８阻害剤、ＣＤＫ１９阻害剤、及び／またはＣＤＫ８／１９阻害剤を含むことができる。

　本開示の一実施形態において、前記第一の基礎培地および前記第二の基礎培地は、それぞれ独立して、抗ＣＤ３抗体、ＴＧＦ－β１、ＩＬ－２、レチノイン酸、ＣＤＫ８阻害剤、ＣＤＫ１９阻害剤、ＣＤＫ８／１９阻害剤、及びアスコルビン酸からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つまたは全部の因子を含むこともできる。また他の実施形態において、前記第一の基礎培地および前記第二の基礎培地は、それぞれ独立して、抗ＣＤ３抗体、ＴＧＦ－β１、ＩＬ－２、レチノイン酸、ＣＤＫ８阻害剤、ＣＤＫ１９阻害剤、ＣＤＫ８／１９阻害剤、及びアスコルビン酸を含むこともできる。これらの各成分として含まれる濃度としては、当該分野で使用される通常の濃度であることができる。一実施形態において、使用され得るＣＤＫ８阻害剤、ＣＤＫ１９阻害剤、及び／またはＣＤＫ８／１９阻害剤の濃度は、当該分野で使用され得る任意の適切な濃度であってよく、例えばＳｅｎｅｘｉｎＡを用いる場合には、約０．１μＭ以上、約０．５μＭ以上、約１μＭ以上、約２μＭ以上、約３μＭ以上、約４μＭ以上、約５μＭ以上、約６μＭ以上、約７μＭ以上、約８μＭ以上、約９μＭ以上、約１０μＭ以上、約１２μＭ以上、約１４μＭ以上、約１６μＭ以上、約１８μＭ以上、約２０μＭ以上などとすることができるが、これらの濃度に限られるものではなく、適宜当業者は他の培地組成に応じて変更することができる。

　一実施形態において、本開示では、ヒトの末梢Ｔ細胞から制御性Ｔ細胞を製造する。末梢Ｔ細胞には、ナイーブ制御性Ｔ細胞、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、ＣＤ８陽性Ｔ細胞などが含まれている。複数種類のＴ細胞を含む培養物から制御性Ｔ細胞を誘導しても、これらの細胞からＣＤ４陽性Ｔ細胞やＣＤ８陽性Ｔ細胞など特定の細胞を単離した上で制御性Ｔ細胞を誘導してもよい。また、特定の抗原に特異的なＴ細胞を単離した上で制御性Ｔ細胞を誘導してもよい。したがって、本開示の誘導性制御性Ｔ細胞は、ＣＤ４陽性のもの、ＣＤ８陽性のものを包含する。なお、本明細書において「ＣＤ４陽性」あるいは「ＣＤ４＋」という場合、特に断りがなければＣＤ４陽性ＣＤ８陰性のシングルポジティブ細胞をいうものとする。また、本開示における製法においてはＣＤ４陽性またはＣＤ８陽性のいずれかのＴ細胞を原料として使用することができ、誘導性制御性Ｔ細胞が生成した後も、特別な操作をしない限り、ＣＤ４陽性またはＣＤ８陽性の特徴が維持されることができる。本開示でキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む誘導性制御性Ｔ細胞でも、同様の性質が維持されることから好ましい。

　一実施形態において、本開示の方法において抗体は、培地へ添加しても、培養容器の内壁や、不溶性担体表面に固定化したものを用いてもよい。不溶性担体は、抗ＣＤ３抗体を物理的又は化学的に結合できる部材であって、水溶液に対して不溶なものを用いることができる。抗ＣＤ３抗体を物理的に吸着可能な素材として、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリプロピレンなどの合成樹脂やガラスなどがあげられる。不溶性担体の形状は特に限定されず、例えば、プレート形状やビーズ形状、容器形状などが採用できる。抗ＣＤ３抗体量は使用する抗体の力価や由来により変動するが、制御性Ｔ細胞の誘導のための十分な刺激を与えられるよう適宜設定すればよい。

　一実施形態において、本開示の方法では、細胞の培養には、動物細胞培養用基礎培地へ必要な因子を添加した培地を用いることができる。本開示の方法において用い得る動物細胞培養用基礎培地としては、例えば、Iscove's　modified　Eagle's　Medium培地、Ham's　F12培地、MEM　Zinc　Option培地、IMEM　Zinc　Option培地、IMDM培地、Medium　199培地、Eagle's　Minimum　Essential　Medium（EMEM）培地、αMEM培地、Dulbecco's　modified　Eagle's　Medium（DMEM）培地、RPMI　1640培地、Fischer's培地、およびこれらの混合培地または一部組成を改変した培地などが包含される。

　基礎培地には、血清（例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ））が含有されていてもよいし、または無血清でもよい。無血清培地には必要に応じて、例えば、アルブミン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、トランスフェリン、アポトランスフェリン、KnockOut　Serum　Replacement（KSR）（ES細胞培養時の血清代替物）（Thermo　Fisher　Scientific）、Ｎ２サプリメント（Thermo　Fisher　Scientific）、Ｂ２７サプリメント（Thermo　Fisher　Scientific）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール、３’－チオールグリセロール、モノチオグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよい。基礎培地にはまた、脂質（例えば、chemically　defined　lipid　concentrate）、アミノ酸、Ｌ－グルタミン、GlutaMAX（Thermo　Fisher　Scientific）、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、ビタミン類（例えば、ニコチンアミド、アスコルビン酸）、増殖因子、抗生物質（例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシン）、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、およびこれらの同等物などの１つ以上の物質も含有しうる。

　１つの実施態様において、基礎培地としては血清およびHEPES（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic　acid）を含むＲＰＭＩ　１６４０培地が例示される。

　本開示の方法において、細胞の培養は一般的な動物細胞培養条件下で行えば良い。培養温度は、以下に限定されないが、約３０～４０℃、好ましくは約３７℃である。培養は、好適にはＣＯ_２含有空気の雰囲気下で培養が行われ、ＣＯ_２濃度は、好ましくは約２～５％である。

　本開示の方法において、抗ＣＤ３抗体は培地中にそのまま添加されても、あるいは培養容器の内壁や、不溶性担体表面に固定化したものを用いてもよい。抗ＣＤ３抗体量は使用する抗体の力価や由来により変動するが、制御性Ｔ細胞の誘導のための十分な刺激を与えられるよう適宜設定すればよい。

　使用されるＴＧＦβとしては、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３が例示され、例えばＴＧＦβ１である。ＴＧＦβの濃度は当業者が適宜定めれば良く特に限定されない。ＴＧＦβとしてＴＧＦβ１またはＴＧＦβ３を用いる場合、培地中の濃度は特に限定されないが０．２５～２５ｎｇ／ｍＬ、例えば約１０ｎｇ／ｍＬとすればよい。

　使用される培地中のＩＬ－２の濃度は限定されないが、約５Ｕ／ｍＬ～約５００Ｕ／ｍＬ、例えば約１００Ｕ／ｍＬとすることができる。

　本開示において使用される培地には、さらにレチノイン酸および／またはアスコルビン酸を添加してもよい。好ましくは培地にはアスコルビン酸を含む。アスコルビン酸の濃度は限定されないが、約１～約１００μｇ／ｍＬ、例えば約１０μｇ／ｍＬである。

　本開示において使用される培地には、さらにＣＤＫ８阻害剤、ＣＤＫ１９阻害剤、及び／またはＣＤＫ８／１９阻害剤を添加してもよい。ＣＤＫ８阻害剤、ＣＤＫ１９阻害剤、及び／またはＣＤＫ８／１９阻害剤としては任意のものを使用することができるが、例えば、4-[1-(2-メチル-1H-ベンゾイミダゾール-5-イル)-1H-イミダゾ[4,5-c]ピリジン-2-イル]-1,2,5-オキサジアゾール-3-アミン、3-{1-[1-(4-メトキシフェニル)ピペリジン-4-イル]-4-メチル-1H-イミダゾ[4,5-c]ピリジン-2-イル}ピラジン-2-アミン又はそれらの塩、水和物、溶媒和物等、または米国特許第8598344、WO2013/001310、WO2013/040153、WO2013/116786、WO2014/029726、WO2014/063778、WO2014/072435、WO2014/090692、WO2014/106606、WO2014/123900、WO2014/154723、WO2014/194245、WO2015/049325、WO2015/100420、WO2015/144290、WO2015/159937、WO2015/159938、WO2016/009076、またはWO2018/139660などに記載される化合物などが挙げられる。一つの例としては、ＳｅｎｅｘｉｎＡまたはＡＳ２８６３６１９が例示されるが、本開示はこれに限定されない。使用され得るＣＤＫ８阻害剤、ＣＤＫ１９阻害剤、及び／またはＣＤＫ８／１９阻害剤の濃度は、当該分野で使用され得る任意の適切な濃度であってよく、上記文献に記載される任意の適切な濃度であってもよく、適宜当業者は他の培地組成に応じて変更することができる。

　本開示の方法においては、ヒト末梢Ｔ細胞を、ＴＧＦβおよびＩＬ－２を含む培地で抗ＣＤ３抗体刺激することによって、制御性Ｔ細胞を誘導し、また抗ＣＤ３抗体を含まないＩＬ－２含有培地で休眠培養実施後に再度抗ＣＤ３抗体で刺激することで、高い免疫抑制機能を有する制御性Ｔ細胞を誘導することができる。得られた誘導性制御性Ｔ細胞が、高い免疫抑制機能を持つことは、例えばＲＮＡシーケンス法による網羅的遺伝子発現解析、インビトロにおける細胞増殖抑制試験により確認することができる。

　本開示の一実施形態において、（ａ）末梢血中のＣＤ４陽性Ｔ細胞またはＣＤ８陽性Ｔ細胞を、第一の基礎培地で約１～約５日間刺激する工程での培養日数は、当業者が適宜設定することができ、特に限定されるものではないが、例えば約３日とすることもできる。

　また一実施形態において、工程（ｂ）の休眠培養工程での培養日数は、当業者が適宜設定することができ、特に限定されるものではないが、例えば約２日とすることもできる。

　また一実施形態において、工程（ｃ）の第二の基礎培地における培養工程での培養日数は、当業者が適宜設定することができ、特に限定されるものではないが、例えば約３日とすることもできる。

　また一実施形態において、工程（ｄ）の休眠培養工程での培養日数は、当業者が適宜設定することができ、特に限定されるものではないが、例えば約２日とすることもできる。一実施形態において、ＩＬ－２の存在下で、無刺激状態で培養することによって、誘導された制御性Ｔ細胞特異的脱メチル化状態を有する制御性Ｔ細胞を増殖させることができる。培地がアスコルビン酸をさらに含んでいてもよいこと、またさらにＩＬ－２を含む培地で培養することによって誘導された制御性Ｔ細胞の安定した制御性Ｔ細胞培養物を得ることができる。

　得られた制御性Ｔ細胞を含む細胞培養物から制御性Ｔ細胞を単離するには、制御性Ｔ細胞に特有な細胞表面マーカーに基づいて常套方法により細胞を単離すればよく、例えばセルソーターによりＦｏｘＰ３陽性分画を取り出せばよい。また、所望により特定の抗原特性を有する制御性Ｔ細胞を単離してもよい。

　本発明の方法によって得られる誘導性制御性Ｔ細胞は、ヒトの炎症性疾患、例えば自己免疫疾患やアレルギーの治療に用いることが期待される。

　（フローサイトメトリーによる陽性率測定）
　一実施形態において、フローサイトメトリーによる陽性率測定は以下のようにして行うことができる。

　準備
・Fixation/Permeabilization　Concentrate（以下、Buffer）（eBio　Science、00-5123-43）
・Fixation/Permeabilization　Diluent（以下、Diluent）（eBio　Science、00-5223-56）
・Permeabilization　Buffer（10×）（eBio　Science、00-833-56）
・FOXP3　Monoclonal　Antibody　(236A/E7),　PE（以下、抗FOXP3抗体）（eBio　Science、12-4777-42）
・Mouse　IgG1　kappa　Isotype　Control　(P3.6.2.8.1),　PE（以下、PEコントロール）（eBio　Science）
・BV421,Mouse,Anti-Human,CD152（以下、抗CTLA4抗体）（BD）
・BV421　Mouse　IgG2a,　k　Isotype　Control（以下、BV421コントロール）（BD）
・CD4　Monoclonal　Antibody　(RPA-T4),　APC (以下、抗CD4抗体)（eBio　Science）
・Mouse　IgG1　kappa　Isotype　Control　(P3.6.2.8.1),　APC（以下、APCコントロール）（eBio　Science）
・D-PBS（ナカライテスク、14249-95）
・FBS（HyClone、SH30084.03）
・0.5　mol/l-EDTA溶液（pH　8.0）（ナカライテスク、06894-14）
・MilliQ水
・遠心機
・安全キャビネット
・マイクロピペット（P200、P1000）
・5　mLポリスチレン　ラウンド・チューブ（以下、専用チューブ）（Falcon、352008）
・ナイロンメッシュ（65　μm）（共進理工、PP-65N）

　試薬調製
※Fixation　Buffer（1サンプル当たり100　μL使用）
　BufferとDiluentを1：3の割合で混合する。
※Perm　Buffer
　Permeabilization　Buffer（10×）をMilliQ水で10倍希釈する。
※FACS　Bufer（500　mL調製の場合）
D-PBS　　　　　　　　　489　mL
FBS　　　　　　　　　　10　mL（終濃度2%）
0.5　mol/l　EDTA溶液　　　1　mL（終濃度1　mM）
　以上の試薬は調製後、4℃または氷上で保管する。

　方法
（１）1.5　mLチューブにFACS　Buferを500　μL添加する。
（２）（１）のチューブに1x10⁶個の最終製品を添加し、マイクロピペットでやさしく懸濁する。
（３）遠心機で500×g、4℃、5分間遠心する。
（４）上清をアスピレーターで除去後、Fixation　Bufferを100　μL添加しやさしくピペッティングする。→泡立てないように注意する。
（５）氷上遮光で30分以上静置により固定する。→45分でもよい。
（６）固定後、チューブにPerm　Bufferを1　mL添加しやさしくピペッティングする。
（７）新しい1.5　mLチューブをサンプル数分準備する。
（８）サンプルをコントロール用と抗体染色用に500　μLずつ分注する。
（９）遠心機で500×g、4℃、5分間遠心する。
（１０）遠心中に抗FOXP3抗体（原液濃度＝0.05mg/ml）、抗CTLA4抗体（Lot:0030269原液濃度＝0.2mg/ml）抗CD4抗体（原液濃度＝0.1mg/ml）をPerm　Bufferで100倍希釈で調製する（以下、抗体調製液）。コントロールサンプル用に、PEコントロール（原液濃度＝0.1mg/ml）、BV421コントロール（原液濃度＝0.2mg/ml）APCコントロール（原液濃度＝0.1mg/ml）を対応する色素の抗体と同濃度で調整する（以下コントロール液）
＊工程内管理試験においてはCTLA4の染色は実施しない。
（１１）上清をアスピレーターで除去後、抗体染色サンプルに抗体調製液を、コントロールサンプルにコントロール液をそれぞれ100　μL添加しやさしくピペッティングする。→泡立てないように注意する。
（１２）氷上遮光で60分静置により固定する。
（１３）染色中に測定機器の立ち上げを実施する。
（１４）染色後、FACS　Buferを1　mL添加しやさしくピペッティングする。
（１５）遠心機で500×g、4℃、5分間遠心する。→上清をアスピレーターで除去後、（１４）及び（１５）をもう一度繰り返して洗浄する。
（１６）上清をアスピレーターで除去後、FACS　Buferを500　μL添加しやさしくピペッティングする。
（１７）専用チューブにナイロンメッシュをピンセットで載せ、懸濁液をフィルトレーションする。
（１８）任意のフローサイトメーター機器で解析する。データ回収細胞数は１００００個以上とする。標的抗原陽性率算出においては、コントロールサンプルの陽性率が５％以下となるように基準線を引き、基準以上の抗原発現量を示す細胞の割合を陽性率とする。

　備考
・固定及び染色で使用する試薬類は「Foxp3　/　Transcription　Factor　Staining　Buffer　Set」（Cat.：00-5523）として3本セットでの購入も可能である。
・機器の設定等は一般的・科学的見地から明確に正常な測定を実施できていないと判断できる程度に逸脱していない限りにおいて、任意の設定で問題無い。明確な逸脱とは対象となる細胞集団の各種シグナルが設定された蛍光threshold値を下回る場合、コントロールサンプルまたは測定対象サンプルの各種シグナル値が機器で正常に測定できる限界値を下回る、または上回る場合、などである。

　(免疫抑制活性測定）
　本開示の細胞は、免疫抑制活性を有し得る。免疫抑制活性は、種々の手法で測定することができる。

　一実施形態において、実施例に記載されるように、レスポンダーＴ細胞が起こす免疫反応による細胞増殖を測定することで抑制されるかを判定することができる。好ましくは、本開示では、ｉｎ　ｖｉｖｏモデルを用いて実証することが望ましい。例えば実施例に記載されるように、大腸炎モデルマウスの場合、本開示の誘導性制御性Ｔ細胞を投与した大腸炎モデルマウスから、投与一定期間後に組織を回収し、当該組織において免疫抑制が確認されるか否かによってその活性を測定することができる。組織における免疫抑制の確認は種々の手法によって達成することができ、例えば組織の染色解析によって免疫抑制の有無を確認することもできる。

　＜キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）＞
　本開示の一つの局面において、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む誘導性制御性Ｔ細胞が提供される。本開示の誘導性制御性Ｔ細胞が含むＣＡＲは、ＣＡＲとしての機能を発揮し得る限り、タンパク質として含んでいてもよく、あるいはＣＡＲを発現する核酸分子を含むこともできる。１つの実施形態において、本開示のＣＡＲは、誘導性制御性Ｔ細胞に発現されたものとすることができる。

　本明細書に開示されるＣＡＲは、抗原に結合することが可能な少なくとも１つの細胞外ドメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内ドメインを含む。

　キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、膜貫通ドメインを介してＴ細胞シグナル伝達ドメインに連結された抗体の抗原結合性ドメイン（例えば、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ））を含有する、人工的に構築されたハイブリッドタンパク質またはポリペプチドである。ＣＡＲの特徴として、ＭＨＣによらず、モノクローナル抗体の抗原結合特性を活用して、選択された標的に向かってＴ細胞の特異性および反応性を再指向させることが挙げられる。ＭＨＣによらない抗原認識は、ＣＡＲを発現するＴ細胞に、抗原プロセシングと無関係に抗原を認識する能力を与えることができる。

　ＣＡＲの細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインには、例えば、Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメイン、Ｔ細胞共刺激シグナル伝達ドメイン、またはその両方が含まれ得る。Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインとは、Ｔ細胞受容体の細胞内ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータタンパク質の細胞内部分などを含む、ＣＡＲの一部分を指す。共刺激シグナル伝達ドメインとは、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要とされる、抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子である共刺激分子の細胞内ドメインを含む、ＣＡＲの一部分を指す。

　（細胞外ドメイン）
　一実施形態では、本明細書に開示される誘導性制御性Ｔ細胞において使用されるＣＡＲは、抗原結合性ドメインまたはその部分を含む。抗原結合性ドメインまたはその部分は、標的細胞の表面のリガンドの型および数に応じて適宜選択することができ、例えば、抗原結合性ドメインは、特定の疾患状態と関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択され得る。したがって、本開示のＣＡＲ中の抗原結合性ドメインに対するリガンドとして作用し得る細胞表面マーカーの例として、組織特異的マーカー、細胞腫特異的マーカー、ウイルス、細菌および寄生生物感染、自己免疫疾患、ならびに癌細胞と関連するものを挙げることができる。

　一実施形態において、本開示のＣＡＲの抗原結合性ドメイン部分は、（１）ＭＨＣ　ｃｌａｓｓ　Ｉ、およびＭＨＣ　ｃｌａｓｓ　ＩＩなどを含むアロ抗原；（２）ＴＳＨＲ（ｔｈｙｒｏｉｄ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＤＳＧ３（ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ　３）、およびＣｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ８などを含む細胞外自己抗原；（３）Ｇｌｉａｄｉｎ、およびＡｒａ　ｈ２などを含む外来抗原；（４）ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ６８、ＭＳＬＮ（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）、およびＭａｄＣａｍ１（ｍｕｃｏｓａｌ　ｖａｓｃｕｌａｒ　ａｄｄｒｅｓｓｉｎ　ｃｅｌｌ　ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ　１）などを含むターゲティング分子を含む抗原を標的化することができるが、本開示のＣＡＲの抗原結合性ドメイン部分が標的化し得る抗原はこれらに限定されない。

　一実施形態において、標的化される所望の抗原に応じて、本開示のＣＡＲは、所望の抗原標的に対して特異的な抗原結合ドメインを含むように改変することができる。例えば、ＣＤ１９が標的抗原である場合、ＣＤ１９に対する抗体が、ＣＡＲ中への抗原結合ドメインとして使用され得る。

　（膜貫通ドメイン）
　本明細書に開示される誘導性制御性Ｔ細胞において使用されるＣＡＲは、細胞外ドメインに融合された１または複数の膜貫通ドメインを含むことができる。

　一実施形態では、細胞外ドメインに由来するリンカードメインが膜貫通ドメインに連結していてもよい。膜貫通ドメインは、天然または合成のものであってもよく、天然の膜貫通ドメインとしては、任意の膜結合型または膜貫通タンパク質に由来し得る。本開示において特に使用される膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ２７１、ＴＮＦＲＳＦ１９などに由来し得る。

　一実施形態において、本明細書に開示される誘導性制御性Ｔ細胞において使用されるＣＡＲは、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間、または細胞内ドメインと膜貫通ドメインとの間に、スペーサードメインを配置することもできる。スペーサードメインは、好ましくは、抗原とのＣＡＲの結合を促進し、細胞中へのシグナル伝達を増強する配列を有することができる。

　（細胞内ドメイン）
　ＣＡＲの細胞質シグナル伝達ドメイン（または細胞内シグナル伝達ドメイン）は、ＣＡＲが発現している免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つの活性化に関与する。「エフェクター機能」は、細胞の特殊化された機能を意味し、例えば、Ｔｒｅｇにおいて、エフェクター機能は、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＴＧＦ－βなどの免疫抑制性サイトカインの分泌、またはＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４などの阻害性分子、ＩＬ－２受容体などの競合性サイトカイン受容体の発現を含む、抑制活性または制御活性であり得る。細胞内シグナル伝達ドメインは、エフェクター機能シグナルを伝達し、そして、ＣＡＲを発現する細胞に、特殊化された機能を実施するように指示する、タンパク質の部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫細胞エフェクター機能を惹起または遮断するシグナルを伝達するのに十分な所定のタンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインの任意の完全な、変異型の、または切断型の部分を含み得る。

　一実施形態において、ＣＡＲに用いられる細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、抗原受容体結合後のシグナル伝達を惹起する、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）および共受容体の細胞質シグナル伝達配列が挙げられる。

　（拒絶反応に関連するアロ抗原、アレルゲンおよびハプテン）
本明細書に開示される誘導性制御性Ｔ細胞において使用されるＣＡＲは、拒絶反応に関連するアロ抗原、アレルゲンおよびハプテンに関連するものを挙げることができる。

　＜キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む誘導性制御性Ｔ細胞の製法＞
　本開示の一局面において、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む誘導性制御性Ｔ細胞を製造する方法であって、（ａ）末梢血中のＣＤ４陽性Ｔ細胞またはＣＤ８陽性Ｔ細胞を、第一の基礎培地で約１～約５日間刺激する工程と、（ｂ）工程（ａ）で得られた細胞を、ＩＬ－２を含む培地で少なくとも約１～約３日間休眠培養する工程と、（ｃ）工程（ｂ）で得られた細胞を、第二の基礎培地で約１～約５日間刺激する工程と、（ｄ）工程（ｃ）で得られた細胞を、ＩＬ－２を含む培地で少なくとも約１～約３日間休眠培養する工程と、（ｅ）工程（ａ）～（ｄ）のいずれかにおいて、少なくとも１回ＣＡＲ遺伝子を導入する工程とを含む、方法が提供される。一実施形態において、本開示のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む誘導性制御性Ｔ細胞を製造する方法においては、本開示の誘導性制御性Ｔ細胞を製造する際に、ＣＡＲ遺伝子を導入することによって行うことができる。

　一実施形態において、ＣＡＲ遺伝子の導入は、上記工程（ａ）～（ｄ）のいずれかにおいて、少なくとも計２回行うこともでき、このようにすることで、ＣＡＲを安定的に発現させることができ得る。１つの実施形態において、ＣＡＲ遺伝子の導入は、上記工程（ａ）において少なくとも１回行うことができる。

　本開示の一実施形態において、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む誘導性制御性Ｔ細胞を製造する方法は、誘導性制御性Ｔ細胞を製造する方法の１または複数の特徴を備えることができる。

　＜キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む誘導性制御性Ｔ細胞の医薬用途＞
　本開示の一局面において、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む誘導性制御性Ｔ細胞を含む、医薬組成物が提供される。本開示の一実施形態において、本開示における誘導性制御性Ｔ細胞は、上述した誘導性制御性Ｔ細胞の１または複数の特徴を備えることができる。

　また一局面において、本開示の誘導性制御性Ｔ細胞または細胞集団を含む、Ｔ細胞関連疾患の治療薬であって、該疾患の対象のＴ細胞関連疾患に関し診断を行い、該診断に基づいて前記誘導性制御性Ｔ細胞または前記細胞集団に含まれる適切なＣＡＲを選択する、治療薬が提供される。

　本開示の別の局面では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む誘導性制御性Ｔ細胞またはこれを含む細胞集団の有効量を対象に投与する工程を含む、前記対象において、前記誘導性制御性Ｔ細胞により処置しうる疾患、障害または症状を治療または予防する方法が提供される。本開示の一実施形態において、本開示における誘導性制御性Ｔ細胞は、上述した誘導性制御性Ｔ細胞の１または複数の特徴を備えることができる。

　本開示の方法は、誘導性制御性Ｔ細胞により処置しうる疾患、障害または症状であれば任意の疾患、障害または症状を治療または予防の対象とすることができる。一般に制御性Ｔ細胞が少しでも有効である任意の疾患、障害または症状であれば対象とすることができるが、これに限定されず、通常の制御性Ｔ細胞が効果を示していない場合でも、誘導性制御性Ｔ細胞では効果がありえることからこれらも包含されることが理解される。

　本開示のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む誘導性制御性Ｔ細胞を含む医薬組成物は、自己免疫疾患、アレルギー、移植片拒絶、移植片対宿主病、炎症性腸疾患などの慢性炎症性疾患、または対象のウイルス、細菌、寄生生物による慢性感染などの処置または予防のため医薬組成物として使用することができる。

　一実施形態において、本開示のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む誘導性制御性Ｔ細胞を含む医薬組成物は細胞治療に用いることができる。細胞治療において、本開示のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む誘導性制御性Ｔ細胞は、医薬組成物として、または本開示のＣＡＲを発現する治療的に有効な細胞集団の製剤として、それを必要としている対象に注入され得る。対象における注入されたＴｒｅｇ細胞は、その対象の炎症性免疫反応を抑制し、または処置中の障害の影響および／もしくは症状を少なくとも低下させることができ得る。対象は、その細胞が取得された同じ対象であってもよいし（自家細胞治療）、またはその細胞が、同じ種の別の対象由来であってもよい（同種細胞治療）。

　一実施形態において、本開示のＣＡＲを含むＴｒｅｇ細胞またはその集団は、当業者に公知の技術を用いて、対象への投与のために製剤化され得る。一実施形態において、本開示のＣＡＲを含む治療的に有効なＴｒｅｇ細胞またはその集団を含む製剤は、薬学的に許容される賦形剤（担体または希釈剤）を含み得る。製剤に含まれる賦形剤は、例えば、本開示のＣＡＲの抗原結合ドメインの性質に依存して、異なる目的をもつ。一般的に用いられる賦形剤の例には、非限定的に、以下：食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、注射用水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組合せ、安定化剤、可溶化剤および界面活性剤、緩衝剤および保存剤、等張化剤、増量剤、ならびに潤滑剤が挙げられる。

　本開示のＣＡＲを含む治療的に有効なＴｒｅｇ細胞またはその集団を含む製剤は、当業者に公知の様式および技術を用いて、対象に投与され得る。例示的には、静脈内注射が挙げられるが、それに限定されない。他の様式には、非限定的に、腫瘍内、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、動脈内、髄内、心臓内、関節内（関節）、滑液嚢内（関節液区域）、頭蓋内、脊髄内、および髄腔内（髄液）などが挙げられる。

　（一般技術）
　本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．（１９８９）．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ　Ｅｄ．（２００１）；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．（１９８９）．　Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；　Ｉｎｎｉｓ，　Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：　Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．　（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；　Ｉｎｎｉｓ，　Ｍ．Ａ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ　Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｗｉｌｅｙ，　ａｎｄ　ａｎｎｕａｌ　ｕｐｄａｔｅｓ；　Ｓｎｉｎｓｋｙ，　Ｊ．Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９９）．　ＰＣＲ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｆｏｒ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。

　人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えばＧｅｎｅＡｒｔ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）などの遺伝子合成やフラグメント合成サービスを用いることもでき、その他、例えば、Ｇａｉｔ，　Ｍ．Ｊ．（１９８５）．　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ；　Ｇａｉｔ，　Ｍ．Ｊ．（１９９０）．　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ；　Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，　Ｆ．（１９９１）．　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ；　Ａｄａｍｓ，　Ｒ．Ｌ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９２）．　Ｔｈｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ，　Ｃｈａｐｍａｎ　＆　Ｈａｌｌ；　Ｓｈａｂａｒｏｖａ，　Ｚ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ，　Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；　Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，　Ｇ．Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９６）．　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　ｉｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ；　Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，　Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．　Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。

　本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも１つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「２つの値」の「範囲内」と明記した場合、その範囲には２つの値自体も含む。
　本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。

　以上、本開示を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本開示を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本開示を限定する目的で提供したのではない。従って、本開示の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、請求の範囲によってのみ限定される。

　以下の実施例において、グルタミン不含RPMI1640（10%　FCS　(v/v),　60　μg/mL　penicillin　G,　100　μg/mL　streptomycin,　10　mM　HEPESを含有）を基礎培地として用いた。必要に応じて30～300mg/LのL-グルタミンを培地に添加して使用した。

　バイサルファイトシーケンス
　誘導された細胞よりゲノムDNAを取得し、MethylEasy　Xceed　Rapid　DNA　Bisulphite　Modification　Kit　(Human　Genetic　Signatures)を用いて処理後、制御性T細胞に特徴的な遺伝子の脱メチル化について、調べた。各遺伝子の脱メチル化の解析は、既知の方法およびプライマーを用いた(Floess　et　al.(2007)　PloS　Biology　Volume　5,　Issue　2,　e38、およびOhkura　et　al.(2012)　Immunity　37(5)　785-799)。

　また、ヒトＦｏｘｐ３　ＣＮＳ２領域の解析においてはフォワード側に5'-TTGGGTTAAGTTTGTTGTAGGATAG-3'（配列番号１）、リバース側に5'-ATCTAAACCCTATTATCACAACCCC-3'（配列番号２）を用いた。

　マウスＴ細胞の画分の取得
　Ｆｏｘｐ３－ｅＧＦＰ（ｅＦｏｘ）レポーターマウス(Ito　et　al.(2014)　Science　346,　363-368)を用いた。Foxp3-eGFP(eFox)レポーターマウスのリンパ節細胞を得、FACSAriaII　(BD)によりＣＤ４^＋ＧＦＰ^＋細胞をソートすることによって内在性制御性Ｔ細胞（ｎＴｒｅｇ）画分を得た。ＣＤ４^＋ＧＦＰ^－ＣＤ４４^ｌｏｗＣＤ６２Ｌ^ｈｉｇｈ細胞をソートしてナイーブＴ細胞画分を得た。さらにＣＤ４^＋ＧＦＰ^－ＣＤ４４^ｈｉｇｈＣＤ６２Ｌ^ｌｏｗ細胞画分を得、エフェクター／メモリーＴ細胞として用いた。

　ヒトＴ細胞の画分の取得
　ヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞をクローン病患者のＰＢＭＣより単離した。濃縮したＰＢＭＣから、CliniMACS　CD4　GMP　MicroBeadsを用いて製品プロトコルに従い精製した。

　（実施例１：マウス高機能安定型制御性Ｔ細胞の作製法）
　マウスＣＤ４陽性Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体（１０μｇ／ｍｌ濃度の抗体をウェル当たり１００μＬ添加し、室温で６０分間静置することで容器へ固相化）、ｈＩＬ－２（１００Ｕ／ｍｌ）、ｈＴＧＦβ１（２．５ｎｇ／ｍｌ）、レチノイン酸（１μＭ）、ＳｅｎｅｘｉｎＡ（５μＭ）を含む基礎培地で３日間刺激した。その後ｈＩＬ－２（１００Ｕ／ｍｌ）を含む基礎培地で２日間休眠培養した。２日後に同様に培地交換し、さらに２日間休眠培養した。２日後に再度抗ＣＤ３抗体（１０μｇ／ｍｌ濃度の抗体をウェル当たり１００μＬ添加し、室温で６０分間静置することで容器へ固相化）、ｈＩＬ－２（１００Ｕ／ｍｌ）、ｈＴＧＦβ１（２．５ｎｇ／ｍｌ）、レチノイン酸（１μＭ）、ＳｅｎｅｘｉｎＡ（５μＭ）、アスコルビン酸（１０μｇ／ｍｌ）を含む基礎培地で２日間刺激した。その後ｈＩＬ－２（１００Ｕ／ｍｌ）を含む基礎培地で２日間休眠培養した。２日後に同様に培地交換し、さらに２日間休眠培養した。２日後に得られた制御性Ｔ細胞のＦｏｘＰ３、ＣＤ２５の発現をフローサイトメトリー法（図１）で、Ｔｒｅｇ特異的脱メチル化領域の脱メチル化状態をバイサルファイト法（図２）で、網羅的遺伝子発現パターンをＲＮＡ－ｓｅｑ法（図３）で、それぞれ解析した。

　従来の誘導性制御性Ｔ細胞（conventional　iTreg）では機能的分子（この場合図３より例えばＣＴＬＡ４、Ｅｎｔｐｄ１、Ｎｔ５ｅ、Ｉｔｇａｅなど）の発現が不十分であり、ＦｏｘＰ３誘導効率も低いが、本願の作成法で得られた高機能な誘導性制御性Ｔ細胞は、ＦｏｘＰ３および機能的遺伝子（この場合、図３より例えばＣＴＬＡ４、Ｅｎｔｐｄ１、Ｎｔ５ｅ、Ｉｔｇａｅなど）を高く発現し、Ｔｒｅｇに特徴的な脱メチル化状態を有していることが確認できた（図１～３）。

　（実施例２：制御性Ｔ細胞のＩｎ　ｖｉｔｒｏ抑制活性）
　実施例１と同じ実験系により制御性Ｔ細胞を得た。Cell　Trace　Violet標識したレスポンダーＴ細胞（５×１０^４）、作製した制御性Ｔ細胞（５×１０^４）を、抗ＣＤ３抗体（１μｇ／ｍｌ）＋抗原提示細胞（ＭＨＣ－ＩＩ陽性細胞：１×１０^４）、またはDynabeads　T-activator（ベリタス）（５μＬ／ｗｅｌｌ）存在下で３日間混合培養し、Cell　Trace　Violet強度をフローサイトメトリー法で解析した。レスポンダーＴ細胞が免疫反応を起こすと細胞増殖のためにCell　Trace　Violet強度は複数の弱いピークを示すが、この免疫反応が抑制されるとCell　Trace　Violet強度は単独の強いピークのまま保持される。本願の作成法で得られた制御性Ｔ細胞は、レスポンダーＴ細胞の免疫反応を強く抑制することが確認された。したがって、得られた制御性Ｔ細胞は既存の制御性Ｔ細胞集団に比べて高い抑制機能を持つことが確認された（図４）。

　（実施例３：制御性Ｔ細胞の生体内安定性）
　Thy1.2／eFoxレポーターマウスから実施例１の方法で制御性Ｔ細胞を作製し、Ｆｏｘｐ３陽性細胞（２×１０^５個）をＦＡＣＳにより分離し、Ｔｈｙ１．１／野生型マウスに尾静脈投与した。２週間後に移入したＴｈｙ１．２細胞をリンパ節から回収し、Ｆｏｘｐ３発現を解析した（図５）。ＣＤ２８刺激なしで誘導し、安定化培養を行った制御性Ｔ細胞は、ｉｎ　ｖｉｖｏにおいて２週間経過後もＦｏｘｐ３を安定に発現していることが確認された。

　（実施例４：大腸炎モデルに対する抑制効果）
　ＲＡＧ欠損マウスに野生型マウス由来ＣＤ４５ＲＢ高発現ＣＤ４陽性ナイーブＴ細胞を２ｘ１０^５個投与することで大腸炎モデルを作製した。１週間後に実施例１の方法で作製した高機能安定型ｉＴｒｅｇ細胞を２ｘ１０^５個投与し、経時的に体重変化を測定した（図６Ａ）。その後、投与後１ヶ月において大腸組織およびリンパ節を回収し、大腸組織のＨＥ染色解析（図６Ｂ）、リンパ節Ｔ細胞におけるＣＤ６９発現解析（図６Ｃ：フローサイトメトリー法）を実施した。その結果、高機能安定型ｉＴｒｅｇの投与は大腸炎を抑制している事が確認できた。また、投与量としてマウス一匹（約２０ｇ）あたり２ｘ１０^５個での治療効果が確認され、１ｘ１０^７個／ｋｇでの有効性が確認出来た。

　（実施例５：ヒト末梢Ｔ細胞から制御性Ｔ細胞の製造）
　クローン病患者由来ＣＤ４陽性Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体（１０μｇ／ｍｌ濃度の抗体をウェル当たり１００μＬ添加し、室温で６０分間静置することで容器へ固相化）、ｈＩＬ－２（１００Ｕ／ｍｌ）、ｈＴＧＦβ１（１０ｎｇ／ｍｌ）、レチノイン酸（１μＭ）、ＳｅｎｅｘｉｎＡ（５μＭ）を含む基礎培地で３日間刺激した。その後ｈＩＬ－２（１００Ｕ／ｍｌ）を含む基礎培地で２日間休眠培養した。２日後に同様に培地交換し、さらに２日間休眠培養した。２日後に再度抗ＣＤ３抗体（１０μｇ／ｍｌ濃度の抗体をウェル当たり１００μＬ添加し、室温で６０分間静置することで容器へ固相化）、ｈＩＬ－２（１００Ｕ／ｍｌ）、ｈＴＧＦβ１（１０ｎｇ／ｍｌ）、レチノイン酸（１μＭ）、ＳｅｎｅｘｉｎＡ（５μＭ）、アスコルビン酸（１０μｇ／ｍｌ）を含む基礎培地で２日間刺激した。その後ｈＩＬ－２（１００Ｕ／ｍｌ）を含む基礎培地で２日間休眠培養した。２日後に同様に培地交換し、さらに２日間休眠培養した。２日後に得られた制御性Ｔ細胞のＦｏｘＰ３、ＣＴＬＡ４の発現をフローサイトメトリー法により解析した（図７Ａ）。

　従来の誘導性制御性Ｔ細胞（conventional　iTreg）では機能的分子（この場合CTLA4）の発現が不十分であり、ＦｏｘＰ３誘導効率も低いが、本願の作成法で得られた高機能な誘導性制御性Ｔ細胞は、ＦｏｘＰ３およびＣＴＬＡ４を発現する細胞を多く含む集団である事が確認できる。

　（実施例６：制御性Ｔ細胞のＩｎ　ｖｉｔｒｏ抑制活性）
　実施例１と同じ実験系により制御性Ｔ細胞を得た。Cell　Trace　Violet標識したレスポンダーＴ細胞（５×１０^４）、作製した制御性Ｔ細胞（５×１０^４）を、Treg　Suppression　Inspector（Miltenyi　Biotec）（５μＬ／ｗｅｌｌ）存在下で３日間混合培養し、Cell　Trace　Violet強度をフローサイトメトリー法で解析した。レスポンダーＴ細胞が免疫反応を起こすと細胞増殖のためにCell　Trace　Violet強度は複数の弱いピークを示すが、この免疫反応が抑制されるとCell　Trace　Violet強度は単独の強いピークのまま保持される。本願の作成法で得られた制御性Ｔ細胞は、レスポンダーＴ細胞の免疫反応を強く抑制することが確認された。したがって、得られた制御性Ｔ細胞は既存の制御性Ｔ細胞集団に比べて高い抑制機能を持つことが確認された。

　（実施例７：ＣＤ８陽性ヒト末梢Ｔ細胞からの制御性Ｔ細胞の製造）
　ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体（１０μｇ／ｍｌ濃度の抗体をウェル当たり１００μＬ添加し、室温で６０分間静置することで容器へ固相化）、ｈＩＬ－２（１００Ｕ／ｍｌ）、ｈＴＧＦβ１（１０ｎｇ／ｍｌ）、レチノイン酸（１μＭ）、ＳｅｎｅｘｉｎＡ（５μＭ）を含む基礎培地で３日間刺激した。その後ｈＩＬ－２（１００Ｕ／ｍｌ）を含む基礎培地で２日間休眠培養した。２日後に同様に培地交換し、さらに２日間休眠培養した。２日後に再度抗ＣＤ３抗体（１０μｇ／ｍｌ濃度の抗体をウェル当たり１００μＬ添加し、室温で６０分間静置することで容器へ固相化）、ｈＩＬ－２（１００Ｕ／ｍｌ）、ｈＴＧＦβ１（１０ｎｇ／ｍｌ）、レチノイン酸（１μＭ）、ＳｅｎｅｘｉｎＡ（５μＭ）、アスコルビン酸（１０μｇ／ｍｌ）を含む基礎培地で２日間刺激した。その後ｈＩＬ－２（１００Ｕ／ｍｌ）を含む基礎培地で２日間休眠培養した。２日後に同様に培地交換し、さらに２日間休眠培養した。２日後に得られた制御性Ｔ細胞のＦｏｘＰ３、ＣＴＬＡ４、Ｈｅｌｉｏｓの発現をフローサイトメトリー法により解析した（図８）。

　ＣＤ８陽性Ｔ細胞から誘導性制御性Ｔ細胞を作製した場合にも、Ｈｅｌｉｏｓ陰性であり、ＦｏｘＰ３およびＣＴＬＡ４を発現する細胞を多く含む集団であることが確認できた。

　（実施例７：誘導性制御性Ｔ細胞へのキメラ抗原受容体の導入）
　本実施例では、ヒトＣＤ４陽性Ｔ細胞から高機能誘導性制御性Ｔ細胞（ＨＳＦ－ｉＴｒｅｇ）を作製するプロセスと、過程中でＣＡＲ発現ウイルスベクター搭載レンチウイルスを感染させるタイミングの検討を行った。
　（材料および方法）
　詳細なプロトコールは、図９（上）に示す。ここでは、ヒトＣＤ４陽性Ｔ細胞から高機能誘導性制御性Ｔ細胞（ＨＳＦ－ｉＴｒｅｇ）を作製するプロセスと、過程中でＣＡＲ発現ウイルスベクター搭載レンチウイルスを感染させるタイミングを示した。
　本実施例では、ヒトＣＤ４陽性Ｔ細胞から高機能誘導性制御性Ｔ細胞（ＨＳＦ－ｉＴｒｅｇ）を作製した。図９の上部の模式図に示したとおり、ＨＳＦ－ｉＴｒｅｇの製造過程中に、ＣＡＲ発現ウイルスベクター搭載レンチウイルスを感染させた。図９中の矢印で示したタイミングでレンチウイルス（Ｌｅｎｔｉ－ＣＤ１９　ＣＡＲ　（ｓｃＦｖ－ＣＤ２８，　ＦＭＣ６３）　Ｖｉｒａｌ　Ｐａｒｔｉｃｌｅ，Ｃａｔ．　Ｎｏ．：　ＶＰ－ＣＡＲ－ＬＣ６１）を全培養液量の２０分の１量添加して、最終日にＦＯＸＰ３およびＣＡＲの発現をＦＣＭ解析した。

　（結果）
　結果を図９下部に示す。図９（上）において矢印で示されるタイミングでレンチウイルス（Ｌｅｎｔｉ－ＣＤ１９　ＣＡＲ　（ｓｃＦｖ－ＣＤ２８，　ＦＭＣ６３）　Ｖｉｒａｌ　Ｐａｒｔｉｃｌｅ，Ｃａｔ．　Ｎｏ．：　ＶＰ－ＣＡＲ－ＬＣ６１）を全培養液量の２０分の１量添加して、最終日にＦＯＸＰ３およびＣＡＲの発現をＦＣＭ解析したところ、図１１（下）に示されるように、Ｄａｙ１３におけるＦＯＸＰ３およびＣＡＲ遺伝子の発現を示す。一次刺激期間に遺伝子を導入することで高効率にＣＡＲを発現させることができることが実証された。図９下部にＤａｙ１導入サンプルについてＣＴＬＡ４の発現についてＦＣＭ解析を行った結果を示す。示されるように、Ｄａｙ１３におけるＦＯＸＰ３およびＣＡＲ遺伝子の発現を示し、ＣＡＲを発現したＨＳＦ－ｉＴｒｅｇ細胞集団においても高いＣＴＬＡ４発現が確認された。一次刺激期間に遺伝子を導入することで高効率にＣＡＲを発現させることができた。

　（実施例８：ＣＡＲ　Ｔｒｅｇにおける機能的分子の発現解析）
　本実施例では、実施例７のＤａｙ１導入サンプルについてＣＴＬＡ４の発現をＦＣＭ解析した。その結果、ＣＡＲを発現したＨＳＦ－ｉＴｒｅｇ細胞集団においても高いＣＴＬＡ４発現が確認できた。

　例としてＩＴＧＡＥがコードするＣＤ１０３分子の発現をフローサイトメトリー法で解析すると、本願の作製法で得られた誘導性制御性Ｔ細胞は他の制御性Ｔ細胞集団と比較して、ＣＤ１０３発現が高いことが確認できる。総合的な考察として、本願の作製法で得られた誘導性制御性Ｔ細胞は既存の制御性Ｔ細胞と比較して、高い抑制能を発揮することが期待できる。

　また、Ｈｅｌｉｏｓの発現をフローサイトメトリー法により解析することができる。
　従来の誘導性制御性Ｔ細胞（conventional　iTreg）では機能的分子（例えば、この場合ＣＴＬＡ４）の発現が不十分であり、ＦｏｘＰ３誘導効率も低い。一方で内在性制御性Ｔ細胞（ｎＴｒｅｇ）ではＣＴＬＡ４、ＦｏｘＰ３を発現しており、ｎＴｒｅｇマーカー分子として代表的なＨｅｌｉｏｓを発現している。一方、本願の作成法で得られたCARを発現する高機能な誘導性制御性Ｔ細胞（ＣＡＲ　Ｔｒｅｇ）はＨｅｌｉｏｓ陰性であり、ＦｏｘＰ３およびＣＴＬＡ４を発現する細胞を多く含む集団であることが確認できる。

　（実施例９：ＣＡＲ　Ｔｒｅｇの抗原特異性の評価）
　ＣＤ１９陽性細胞またはｈＣＤ１９リコンビナントタンパク質を用いて作成したＣＡＲ発現制御性Ｔ細胞を刺激し、刺激されたＣＡＲ発現制御性Ｔ細胞のＦＯＸＰ３、ＣＴＬＡ４発現をフローサイトメトリーによって解析する。

　（実施例１０：ＣＡＲ　Ｔｒｅｇの免疫抑制機能の評価）
　ＣＤ１９陽性細胞に対する免疫抑制能をＩｎ　ｖｉｔｒｏで評価する。ＣＤ１９陽性細胞とＣＡＲ発現制御性Ｔ細胞を共培養し、ＣＤ１９陽性細胞の免疫学的性質をフローサイトメトリーによって評価する。

　（実施例１１：ヒトＣＤ４陽性Ｔ細胞から高機能誘導性制御性Ｔ細胞（ＨＳＦ－ｉＴｒｅｇ）のＦＣＭ解析）
　本実施例では、ヒトＣＤ４陽性Ｔ細胞から高機能誘導性制御性Ｔ細胞（ＨＳＦ－ｉＴｒｅｇ）のＦＣＭ解析を行った。

　具体的には、図１１に示すように、ヒトＣＤ４陽性Ｔ細胞から高機能誘導性制御性Ｔ細胞（ＨＳＦ－ｉＴｒｅｇ）を作製し、ここで、上記実施例に記載のタイミングでレンチウイルス（Ｌｅｎｔｉ－ＨＬＡ－Ａ２　ＣＡＲ（ｓｃＦｖ－２８ζ，ＢＢ７．２）－ＶＰ（ＶＰ－ＣＡＲ－ＬＣ８０９）またはＬｅｎｔｉ－ＥｐＣＡＭ　ＣＡＲ（ｓｃＦｖ－２８ζ，Ｍ１３－５７）－ＶＰ（ＶＰ－ＣＡＲ－ＬＣ８４７））をそれぞれ全培養液量の５０分の１量または２５分の１量で添加して、最終日にＣＡＲ（ＧＦＰ）、ＦＯＸＰ３およびＣＴＬＡ４の発現をＦＣＭ解析した。

　（結果）
　図１１に示すように、一次刺激期間に遺伝子を導入することでどの種類のＣＡＲであっても本開示のＴｒｅｇの性質や誘導効率を損なうことなく高効率に発現させることができるが示された。

　（注記）
　以上のように、本開示の好ましい実施形態を用いて本開示を例示してきたが、本開示は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願及び他の文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本出願は、日本国に２０２２年９月２６日に出願された特願２０２２－１５２８８２に対して優先権を主張するものであり、その全体が本願において参考として援用される。

　本開示の細胞集団は様々な免疫疾患、自己免疫病などの炎症性疾患の治療や予防に用いることができる。また本開示の細胞集団を作製する方法により末梢Ｔ細胞から高い機能性を持つ制御性Ｔ細胞を安定に誘導することが可能となり、医療分野への応用が期待できる。

　配列番号１：実施例において用いたフォワードプライマー
　配列番号２：実施例において用いたリバースプライマー

Claims

　キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む誘導性制御性Ｔ細胞。
　前記ＣＡＲは前記誘導性制御性Ｔ細胞に発現されたものである、請求項１に記載の誘導性制御性Ｔ細胞。
　ＣＴＬＡ４陽性、ＮＴ５Ｅ陽性、ＩＴＧＡＥ（ＣＤ１０３）陽性、及びＡＲＥＧ陽性からなる群より選択される少なくとも１つの特徴を有する、請求項１または２に記載の誘導性制御性Ｔ細胞。
　ＣＴＬＡ４陽性、ＮＴ５Ｅ陽性、ＩＴＧＡＥ（ＣＤ１０３）陽性、及びＡＲＥＧ陽性からなる群より選択される少なくとも２つの特徴を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の誘導性制御性Ｔ細胞。
　少なくともＣＴＬＡ４陽性である、請求項１～４のいずれか一項に記載の誘導性制御性Ｔ細胞。
　ＦＯＸＰ３遺伝子のＣＮＳ２部位が脱メチル化されている、請求項１～５のいずれか一項に記載の誘導性制御性Ｔ細胞。
　ＣＤ４陽性またはＣＤ８陽性である、請求項１～６のいずれか一項に記載の誘導性制御性Ｔ細胞。
　ヒトの末梢血Ｔ細胞、またはヒト組織由来Ｔ細胞から得られるか、または誘導される、請求項１～７のいずれか一項に記載の誘導性制御性Ｔ細胞。
　（ａ）末梢血中のＣＤ４陽性Ｔ細胞またはＣＤ８陽性Ｔ細胞を、第一の基礎培地で約１～約５日間刺激する工程と、
（ｂ）工程（ａ）で得られた細胞を、ＩＬ－２を含む培地で少なくとも約１～約３日間休眠培養する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた細胞を、第二の基礎培地で約１～約５日間刺激する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた細胞を、ＩＬ－２を含む培地で少なくとも約１～約３日間休眠培養する工程と、
（ｅ）工程（ａ）～（ｄ）のいずれかにおいて、少なくとも１回ＣＡＲ遺伝子を導入する工程と
を含む方法によって得られる、請求項１～８のいずれか一項に記載の誘導性制御性Ｔ細胞。
　Ｔ細胞を含む細胞集団であって、前記細胞集団のＴ細胞における約５０％以上が、請求項１～９のいずれか一項に記載の誘導性制御性Ｔ細胞である、細胞集団。
　前記細胞集団中のＴ細胞における約８０％以上が、請求項１～９のいずれか一項に記載の誘導性制御性Ｔ細胞である、請求項１０に記載の細胞集団。
　前記細胞集団におけるＴ細胞は、制御性Ｔ細胞である、請求項１０または１１に記載の細胞集団。
　前記細胞集団の約９０％以上がＴ細胞である、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の細胞集団。
　キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む誘導性制御性Ｔ細胞を含む、医薬組成物。
　前記ＣＡＲは前記誘導性制御性Ｔ細胞に発現されたものである、請求項１４に記載の医薬組成物。
　前記誘導性制御性Ｔ細胞が、ＣＴＬＡ４陽性、ＮＴ５Ｅ陽性、ＩＴＧＡＥ（ＣＤ１０３）陽性、及びＡＲＥＧ陽性からなる群より選択される少なくとも１つの特徴を有する、請求項１４または１５に記載の医薬組成物。
　前記誘導性制御性Ｔ細胞が、ＣＴＬＡ４陽性、ＮＴ５Ｅ陽性、ＩＴＧＡＥ（ＣＤ１０３）陽性、及びＡＲＥＧ陽性からなる群より選択される少なくとも２つの特徴を有する、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
　前記誘導性制御性Ｔ細胞が、少なくともＣＴＬＡ４陽性である、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
　前記誘導性制御性Ｔ細胞のＦＯＸＰ３遺伝子のＣＮＳ２部位が脱メチル化されている、請求項１４～１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
　前記誘導性制御性Ｔ細胞が、ＣＤ４陽性またはＣＤ８陽性である、請求項１４～１９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
　前記誘導性制御性Ｔ細胞が、ヒトの末梢血Ｔ細胞、またはヒト組織由来Ｔ細胞から得られるか、または誘導される、請求項１４～２０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
　前記誘導性制御性Ｔ細胞が、
（ａ）末梢血中のＣＤ４陽性Ｔ細胞またはＣＤ８陽性Ｔ細胞を、第一の基礎培地で約１～約５日間刺激する工程と、
（ｂ）工程（ａ）で得られた細胞を、ＩＬ－２を含む培地で少なくとも約１～約３日間休眠培養する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた細胞を、第二の基礎培地で約１～約５日間刺激する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた細胞を、ＩＬ－２を含む培地で少なくとも約１～約３日間休眠培養する工程と、
（ｅ）工程（ａ）～（ｄ）のいずれかにおいて、少なくとも１回ＣＡＲ遺伝子を導入する工程と
を含む方法によって得られる、請求項１４～２１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
　Ｔ細胞集団における細胞の約５０％以上が前記誘導性制御性Ｔ細胞であるＴ細胞集団を含む、請求項１４～２２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
　Ｔ細胞集団における細胞の約８０％以上が前記誘導性制御性Ｔ細胞であるＴ細胞集団を含む、請求項１４～２３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
　前記Ｔ細胞集団は、制御性Ｔ細胞集団である、請求項２３または２４に記載の医薬組成物。
　前記細胞集団の約９０％以上がＴ細胞である、請求項２３～２５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
　前記誘導性制御性Ｔ細胞を、投与１回あたり約１０^８～約１０^９個、または約１０^７個／ｋｇ投与されるように含む、請求項１４～２６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
　Ｔ細胞関連疾患を治療または予防するための、請求項１４～２７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
　前記Ｔ細胞関連疾患が、自己免疫疾患、アレルギー、移植片拒絶、移植片対宿主病、炎症性疾患、感染症、がん、およびＡＬＳを含む、請求項２８に記載の医薬組成物。
　前記自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス、クローン病、糖尿病（Ｉ型）、栄養障害型表皮水疱症、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン－バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、血管炎、白斑、粘液水腫、悪性貧血、潰瘍性大腸炎、および心筋症を含む、請求項２９に記載の医薬組成物。
　前記医薬組成物は、注射により投与される、請求項１４～３０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
　前記医薬組成物が患者に投与された場合に、効果がない、または不十分な患者に対して、前記医薬組成物が追加で投与される、請求項１４～３１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
　前記医薬組成物は、最初の投与から少なくとも約２週間後に追加で投与される、請求項３２に記載の医薬組成物。
　請求項１～９のいずれか一項に記載の誘導性制御性Ｔ細胞または請求項１０～１３のいずれか一項に記載の細胞集団を含む、Ｔ細胞関連疾患の治療薬であって、該疾患の対象のＴ細胞関連疾患に関し診断を行い、該診断に基づいて前記誘導性制御性Ｔ細胞または前記細胞集団に含まれる適切なＣＡＲを選択する、治療薬。
　キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む誘導性制御性Ｔ細胞を製造する方法であって、
（ａ）末梢血中のＣＤ４陽性Ｔ細胞またはＣＤ８陽性Ｔ細胞を、第一の基礎培地で約１～約５日間刺激する工程と、
（ｂ）工程（ａ）で得られた細胞を、ＩＬ－２を含む培地で少なくとも約１～約３日間休眠培養する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた細胞を、第二の基礎培地で約１～約５日間刺激する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた細胞を、ＩＬ－２を含む培地で少なくとも約１～約３日間休眠培養する工程と、
（ｅ）工程（ａ）～（ｄ）のいずれかにおいて、少なくとも１回ＣＡＲ遺伝子を導入する工程と
を含む、方法。
　前記ＣＡＲ遺伝子の導入が、工程（ａ）～（ｄ）のいずれかにおいて少なくとも計約２回行われる、請求項３５に記載の方法。
　前記ＣＡＲ遺伝子の導入が、工程（ａ）において少なくとも１回行われる、請求項３５または３６に記載の方法。
　前記第一の基礎培地が、抗ＣＤ３抗体、ＴＧＦ－β１、ＩＬ－２、レチノイン酸、ＣＤＫ８阻害剤、ＣＤＫ１９阻害剤、ＣＤＫ８／１９阻害剤、及びアスコルビン酸からなる群から選択される少なくとも１つの因子を含む、請求項３５～３７のいずれか一項に記載の方法。
　前記第一の基礎培地が、抗ＣＤ３抗体、ＴＧＦ－β１、ＩＬ－２、レチノイン酸、ＣＤＫ８阻害剤、ＣＤＫ１９阻害剤、ＣＤＫ８／１９阻害剤、及びアスコルビン酸を含む、請求項３５～３８のいずれか一項に記載の方法。
　前記第二の基礎培地が、抗ＣＤ３抗体、ＴＧＦ－β１、ＩＬ－２、レチノイン酸、ＣＤＫ８阻害剤、ＣＤＫ１９阻害剤、及びＣＤＫ８／１９阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つの因子を含む、請求項３５～３９のいずれか一項に記載の方法。
　前記第二の基礎培地が、抗ＣＤ３抗体、ＴＧＦ－β１、ＩＬ－２、レチノイン酸、ＣＤＫ８阻害剤、ＣＤＫ１９阻害剤、及びＣＤＫ８／１９阻害剤を含む、請求項３５～４０のいずれか一項に記載の方法。
　工程（ａ）が、前記ＣＤ４陽性Ｔ細胞またはＣＤ８陽性Ｔ細胞を、前記第一の基礎培地で約３日間刺激する、請求項３５～４１のいずれか一項に記載の方法。
　工程（ｂ）が、工程（ａ）で得られた細胞を、前記ＩＬ－２を含む培地で少なくとも約２日間休眠培養する、請求項３５～４２のいずれか一項に記載の方法。
　工程（ｃ）が、工程（ｂ）で得られた細胞を、前記第二の基礎培地で約３日間刺激する、請求項３５～４３のいずれか一項に記載の方法。
　工程（ｄ）が、工程（ｃ）で得られた細胞を、前記ＩＬ－２を含む培地で少なくとも約２日間休眠培養する、請求項３５～４４のいずれか一項に記載の方法。
　請求項３５～４５のいずれか一項に記載の方法によって生成される、誘導性制御性Ｔ細胞または前記誘導性制御性Ｔ細胞を含む細胞集団。