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WO2024069936A1 - 流体処理カートリッジ並びに核酸の回収及び増幅方法 - Google Patents

流体処理カートリッジ並びに核酸の回収及び増幅方法 Download PDF

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WO2024069936A1
WO2024069936A1 PCT/JP2022/036721 JP2022036721W WO2024069936A1 WO 2024069936 A1 WO2024069936 A1 WO 2024069936A1 JP 2022036721 W JP2022036721 W JP 2022036721W WO 2024069936 A1 WO2024069936 A1 WO 2024069936A1
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WO
WIPO (PCT)
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rotor
flow path
cylinder
switching means
cartridge
Prior art date
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Ceased
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PCT/JP2022/036721
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English (en)
French (fr)
Inventor
ニキータ オベチキン
ディミトリー プザンコフ
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Mirai Genomics
Mirai Genomics KK
Original Assignee
Mirai Genomics
Mirai Genomics KK
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to EP22960995.3A priority patent/EP4597117A1/en
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Ceased legal-status Critical Current

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    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
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    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502738—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by integrated valves
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material

Definitions

  • the present invention relates to a fluid processing cartridge and a method for recovering and amplifying nucleic acid. More specifically, the present invention relates to a fluid processing cartridge suitable for recovering, amplifying, and detecting nucleic acid from a sample, and a method for recovering and amplifying nucleic acid using this cartridge.
  • Patent Document 1 discloses a small, portable amplification and detection device that makes it easier to amplify and detect nucleic acids.
  • Patent Document 1 International Publication No. 2018/123837
  • Patent Document 2 International Publication No. 2002/023776 The entire disclosures of Patent Documents 1 and 2 are expressly incorporated herein by reference.
  • the device described in Patent Document 1 is a device that separately collects nucleic acid from a specimen, and then amplifies and detects the collected nucleic acid.
  • the inventors have come up with a plan to use the sample as is without pretreatment, and to recover nucleic acid from the sample, amplify the recovered nucleic acid, and detect the amplified nucleic acid, all in one device.
  • the nucleic acid recovery, amplification, and detection steps will be carried out automatically and sequentially in chambers connected by a microchannel, and it is envisioned that a carrier such as a filter will be used, taking into account the high efficiency of nucleic acid recovery.
  • Patent Document 2 A device that uses a carrier to recover nucleic acids is known (Patent Document 2).
  • the fluid transfer mechanism between chambers includes a cylinder whose interior is a fluid transfer chamber, and a piston that moves up and down inside the cylinder to reduce or pressurize the interior of the cylinder, and has a switchable flow path at the bottom of the fluid transfer chamber that connects to other chambers.
  • Nucleic acids are recovered from samples while moving fluid between the fluid transfer chamber and other chambers by utilizing the reduced pressure or increased pressure inside the cylinder.
  • the movement of liquid must be performed by the up and down movement of the piston, which has the problem of making the operating mechanism complicated, and it is not envisioned that the amplification and detection of the recovered nucleic acid will be performed within the same device.
  • the problem that the present invention aims to solve is to provide a cartridge that allows the amplification and detection of recovered nucleic acids to be carried out within the same device, has an easy means of transporting liquid, and allows the device in which the cartridge is installed to be made more compact.
  • a fluid processing cartridge having a plurality of liquid storage tanks, a flow path switching means, and a flow path between each of the liquid storage tanks and the flow path switching means, the flow passage switching means includes a rotor and a cylinder in which the rotor can slide while maintaining a close contact state between an outer peripheral surface and an inner peripheral surface of the rotor;
  • the rotor has at least one groove on its outer circumferential surface, which allows a plurality of flow passages in the cylinder to be connected by the rotation or translation of the rotor, and/or the rotor has at least one through hole, which allows a plurality of flow passages in the cylinder to be connected by the rotation or translation of the rotor.
  • the liquid receiving portion is funnel-shaped.
  • the fluid processing cartridge further includes a waste liquid recovery tank connected to the flow path switching means via a flow path, and the waste liquid recovery tank has an exhaust port.
  • [20] The cartridge according to any one of [1] to [19], which is for recovering, amplifying and/or detecting nucleic acid from a sample, and amplification of the nucleic acid is carried out in a reaction vessel.
  • a method comprising recovering and amplifying a nucleic acid, using the cartridge according to any one of [1] to [20].
  • [22] The method according to [21], wherein when nucleic acid amplification is carried out in a reaction chamber, the rotor and cylinder of the flow path switching means are in a position in which at least the reaction chamber is closed, or in a position in which all flow paths are disconnected.
  • the method according to [21] or [22] further comprising a step of detecting the amplified nucleic acid optically, electrically, or by surface plasmon resonance after the nucleic acid amplification step.
  • the present invention provides a cartridge that allows the amplification and detection of recovered nucleic acids to be carried out within the same device, has an easy means for transferring liquid, and allows the device in which the cartridge is mounted to be made more compact. By using this cartridge, the detection of the target nucleic acid can be carried out more reliably.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing an example of a fluid treatment cartridge of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic horizontal cross-sectional view of a flow path switching means included in an example of the fluid treatment cartridge of the present invention.
  • FIG. 3 is a schematic vertical sectional view of a flow path switching means included in an example of the fluid treatment cartridge of the present invention.
  • FIG. 4 is a schematic vertical sectional view of a cylinder and a rotor of an example of a fluid treatment cartridge of the present invention.
  • FIG. 5 is a schematic horizontal sectional view of a flow path switching means included in an example of the fluid treatment cartridge of the present invention.
  • FIG. 6 is a schematic horizontal sectional view of a flow path switching means included in an example of the fluid treatment cartridge of the present invention.
  • FIG. 7 is a schematic horizontal sectional view of a flow path switching means included in an example of the fluid treatment cartridge of the present invention.
  • FIG. 8 is a schematic vertical sectional view of a cylinder and a rotor of an example of a fluid treatment cartridge of the present invention.
  • FIG. 9-1 is a schematic vertical sectional view of a cylinder and a rotor of an example of a fluid treatment cartridge of the present invention.
  • FIG. 9-2 is a schematic vertical sectional view of a cylinder and a rotor of an example of a fluid treatment cartridge of the present invention.
  • the present invention relates to a fluid treatment cartridge, the cartridge having a plurality of liquid storage tanks, a flow path switching means, and flow paths between each of the liquid storage tanks and the flow path switching means.
  • the flow path switching means includes a rotor and a cylinder in which the rotor can slide while maintaining a tight contact between the outer peripheral surface and the inner peripheral surface of the rotor.
  • the rotor can have at least one groove on the outer peripheral surface that can connect the plurality of flow path openings of the cylinder by rotation or translation of the rotor.
  • the rotor can have at least one through hole that can connect the plurality of flow path openings of the cylinder by rotation or translation of the rotor.
  • Figure 1 is a schematic diagram of an example of a fluid treatment cartridge of the present invention.
  • 10 is a flow path switching means
  • 20 to 25 are liquid storage tanks
  • 50 to 57 are flow paths between each liquid storage tank and the flow path switching means.
  • 58 and 59 are flow paths between the waste liquid collection tank and the flow path switching means
  • 60 is a flow path between the reaction tank and the flow path switching means.
  • six liquid storage tanks 20 to 25 are shown as an example, but the number of liquid storage tanks is not particularly limited as long as it is two or more, and may be 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more.
  • 50 to 60 flow paths are shown, but the number of flow paths can be appropriately selected depending on the number of liquid storage tanks, waste liquid collection tanks, and reaction tanks.
  • multiple liquid storage tanks, flow paths, and cylinders can be integrated, and the rotor can be inserted from the cylinder opening side.
  • the opening of the cylinder is located at the bottom of the cartridge (the longitudinal lower surface of the flow path switching means 10). The arrangement of the rotor and cylinder will be described later.
  • the flow path switching means 10 includes a rotor and a cylinder in which the rotor can slide while maintaining a tight contact between the rotor's outer peripheral surface and inner peripheral surface.
  • the rotor and cylinder can slide between each other, meaning that the rotor can rotate in the cylinder and/or that the rotor can move parallel to each other in the cylinder.
  • the flow path switching means consisting of the rotor and cylinder has a vertically elongated cylindrical shape, with the flow path connected to the side peripheral surface. In FIG. 1, both ends are arranged so that they are one above the other, but both ends can also be arranged horizontally or at various oblique angles.
  • the rotor's outer diameter and the cylinder's inner diameter are approximately equal, and that the surfaces of the rotor's outer peripheral surface and the cylinder's inner peripheral surface are smooth enough to maintain a tight contact.
  • various lubricants can be used between the rotor and cylinder to keep them in a tight contact state and to allow rotation and insertion/removal.
  • the rotor can be a solid cylinder or have a cylindrical outer wall with an internal cavity.
  • the rotor can have at least one groove on its outer circumferential surface that can connect the multiple flow path openings of the cylinder depending on the rotational position of the rotor.
  • the groove can be provided in a horizontal or vertical direction. It can also be provided with an incline, but considering the operability of the flow path switching means 10, it is preferable to provide the groove in a horizontal or vertical direction.
  • the length and depth of the groove can be appropriately determined taking into account the spacing and dimensions of the multiple flow path openings of the cylinder.
  • Figure 2 shows a schematic diagram of a horizontal cross section of a rotor and a cylinder with a cylindrical outer wall having a cavity inside.
  • a groove is provided horizontally on the outer circumferential surface of the rotor.
  • flow path 1 and flow path 2 are connected at both ends of groove A.
  • Figure B the rotor is rotated and both ends of groove A are not connected to the openings of flow path 1 and flow path 2, and the connection between flow path 1 and flow path 2 is closed.
  • groove A can be used to circulate liquid or gas between flow path 1 and flow path 2.
  • the connection between flow path 1 and flow path 2 is closed, and liquid or gas cannot be circulated using groove A. Note that to break the connection between the two flow paths, the groove only needs to be out of contact with at least one of the two flow paths.
  • Figure 3 shows a schematic diagram of a vertical cross section of a rotor and a cylinder.
  • An example is shown in which grooves are provided vertically on the outer circumferential surface of the rotor.
  • flow paths 3 and 4 are connected at both ends of groove B.
  • the rotor is rotated and both ends of groove B are disconnected from the openings of flow paths 3 and 4, and the connection between flow paths 3 and 4 is closed.
  • groove B can be used to circulate liquid or gas between flow paths 3 and 4.
  • the connection between flow paths 3 and 4 is closed, and liquid or gas cannot circulate using groove B.
  • FIG. 4 shows a schematic diagram of a vertical cross section of a rotor and a cylinder.
  • the rotor shown in FIG. 4 has a cylindrical outer wall with a cavity inside, and is cylindrical, with both ends open. Inside the cylinder, the rotor has an internal space from each opening at the internal end and external end of the cylinder.
  • the internal space of the rotor can be a simple space as shown in FIG. 3, or can have an internal structure separating the two internal spaces as shown in FIG. 4.
  • the internal end of the cylinder can be closed as shown in FIG. 3, or can have a nozzle extending from the internal side of the cylinder into the rotor internal space as shown in FIG. 4, with everything except the nozzle (and, if necessary, the rotor insertion port) being closed.
  • FIG. 4A The tip of the nozzle is open, and the nozzle is connected to the flow path 10 in the cylinder.
  • the flow path 3 is connected to the nozzle via the groove B and the flow path 10 in the cylinder.
  • FIG. 4B shows the rotor rotated to another position, with the groove B disconnected from the flow path 3 and the flow path 10 in the cylinder.
  • the fluid processing cartridge of the present invention can have a carrier in the flow path switching means or in the middle of the flow path between the liquid storage tank and the flow path switching means.
  • the carrier in the flow path switching cartridge can form the internal structure inside the rotor, and the tip of the nozzle extending from the cylinder can be located near the opposing surface of the carrier.
  • Any carrier can be used as long as it can trap nucleic acid in a specimen and elute the trapped nucleic acid.
  • the carrier can be, for example, a glass filter, affinity resin such as a normal phase column or a reverse phase column, gel filtration resin, etc. However, it is not intended to be limited to these.
  • the internal structure in the rotor may include a liquid receiving portion on the outside of the cylinder. There may be a space between the carrier constituting the internal structure and the liquid receiving portion.
  • the liquid receiving portion may have a groove that is a drainage path that can connect the liquid receiving portion to the outside of the rotor.
  • the liquid receiving portion may be funnel-shaped. In view A of FIG. 4, the liquid receiving portion is connected to the groove and groove C, and groove C is connected to flow path 4. View B shows the rotor rotated to another position, with groove C disconnected from flow path 4 and the groove in the cylinder.
  • Figure 5 shows a horizontal cross-sectional schematic diagram of an example of a flow path switching means.
  • Figure C shows the groove downstream of the liquid receiving section, the through hole A, and the flow path 4, all in communication with each other.
  • Figure 5C shows the state in which the groove, through hole A, vertical groove C, and flow path 4 shown in Figure 4 are connected.
  • Figure 5D shows the state in which the rotor is rotated and the opening of the flow path 4 in the cylinder and the through hole A in the rotor are misaligned, cutting off the connection between the flow path 4 and the groove.
  • Figures 6 to 10 show schematic horizontal and vertical cross-sectional views of an example of a flow path switching means in which the rotor is a solid cylinder.
  • Figure 6 shows a through hole B that crosses the rotor, which is a solid cylinder, and flow paths 20 and 21 that can connect to through hole B by rotating.
  • through hole B is connected to flow paths 20 and 21, and in Figure B, the rotor has rotated from the state shown in Figure A, and through hole B is no longer connected to flow paths 20 and 21.
  • Figure 7 shows through-hole C, which branches off and crosses the rotor, which is a solid cylinder, groove D at one end of through-hole C, and flow paths 22-24 that can connect to through-hole C or groove D.
  • flow path 22 and groove D are connected, and through-hole C is connected to flow path 23.
  • the rotor rotates from the state shown in Figure A, and flow path 22 and groove D maintain communication, and through-hole C is connected to flow path 24.
  • the rotor rotates from the state shown in Figure B, and through-hole C is not connected to any of flow paths 22-24.
  • Figures 8 to 9-2 show examples of parallel translation of the rotor inside a cylinder.
  • Figure 8 shows a through hole D that cuts through the rotor, which is a solid cylinder, and flow paths 25 and 26 that can connect to through hole D as the rotor translates parallel (linear motion).
  • through hole D is connected to flow paths 25 and 26, while in Figure B, the rotor has translated from the state shown in Figure A, and through hole D is not connected to flow paths 25 and 26.
  • Figure 9-1 shows through hole E that branches off and crosses the rotor, which is a solid cylinder, a groove E at one end of through hole E, and flow paths 27-29 that can connect to through hole E or groove E.
  • through hole E is not connected to any of flow paths 27-29.
  • the rotor has moved parallel from the state of Figure A, so that flow path 27 is connected to groove E and through hole E is connected to flow path 28.
  • the rotor has moved further parallel from the state of Figure B, so that the connection between flow path 27 and groove E is maintained and through hole E is connected to flow path 29.
  • Figure 9-2 is an example similar to Figure 9-1, and in Figure D, the rotor has moved further parallel from the state of Figure C in Figure 9-1, so that flow path 28 and flow path 29 are connected via groove E.
  • Figure E shows another embodiment of Figure D, in which the rotor rotates from the state shown in Figure C of Figure 9-1, for example, and groove F connects flow paths 28 and 29.
  • the fluid processing cartridge of the present invention determines the flow paths to be connected by rotating or translating the rotor to change the positions of the grooves and through holes of the rotor and the openings of the flow paths of the cylinder shown in Figures 2 to 9-2, and by selecting the stop position, and then circulates liquid between multiple liquid storage tanks to proceed with the desired processing.
  • the rotation or translation of the rotor can be performed by operating the rotor from the outside of the cylinder.
  • the fluid treatment cartridge of the present invention may further have a waste liquid collection tank connected to the flow path switching means via a flow path, and may have an exhaust port in the waste liquid collection tank.
  • the waste liquid collection tank is indicated by 30, and has an exhaust port 31 in the waste liquid collection tank 30.
  • the waste liquid collection tank 30 is connected to the flow path switching means 10 via a flow path 59.
  • the exhaust port 31 is connected to an exhaust cartridge, for example, a suction pump, provided outside the fluid treatment cartridge, and can make the waste liquid collection tank 30 negative pressure, and further make the liquid storage tank connected to the fluid treatment cartridge 10 via the waste liquid collection tank 30 and the flow path 59 and the reaction tank described below negative pressure, and can guide liquid or gas to the waste liquid collection tank 30.
  • the cartridge of the present invention transfers liquid and gas by utilizing the negative pressure caused by exhaust from an exhaust port provided in the waste liquid collection tank 30.
  • the cartridge is positioned so that the exhaust port is located above the waste liquid tank inlet in the waste liquid collection tank. This is to prevent liquid from leaking from the exhaust port.
  • the fluid processing cartridge of the present invention may further include a reaction tank 40 connected to the flow path switching means via a flow path.
  • the reaction tank is used to store a liquid containing nucleic acid that has been processed by the cartridge of the present invention, and to amplify the nucleic acid and detect the amplified nucleic acid.
  • any one or all of the liquid storage tanks 20 to 25 and the reaction tank 40 have an air hole or an air passage leading to the air hole, although not shown.
  • a liquid storage tank having an air hole or an air passage leading to the air hole can be easily guided to the waste liquid collection tank 30 by connecting the waste liquid collection tank 30 and the flow path switching means 10 via a flow path 59, while creating a negative pressure in the tank.
  • a reaction tank 40 having an air hole or an air passage leading to the air hole can be easily guided to the reaction tank 40 by connecting the waste liquid collection tank 30 and the flow path switching means 10 via a flow path 59, while creating a negative pressure in the tank.
  • the reaction tank 40 can have an exhaust port similar to the exhaust port provided in the waste liquid collection tank 30, although not shown. Fluids and/or gases may be transferred to the reaction tank 40 by exhausting air from this exhaust port to create a negative pressure inside the reaction tank 40.
  • the fluid treatment cartridge of the present invention has grooves and through-holes in a number that corresponds to the number of liquid storage tanks and the presence or absence of a waste liquid collection tank or carrier.
  • the cartridge of this embodiment has a plurality of liquid storage tanks, including one specimen suspension tank, two cleaning liquid tanks, one elution liquid tank, one reaction liquid tank, and one mixing tank, as well as one waste liquid tank and one reaction tank.
  • Step 1 (supporting step) Liquid: specimen suspension tank ⁇ flow path switching means (nozzle ⁇ filter) ⁇ waste tank Gas: vent hole of specimen suspension tank ⁇ specimen suspension tank
  • the rotor of the flow path switching means is in a position where the flow path from the specimen suspension tank communicates with the flow path in the cylinder (corresponding to flow path 10 in FIG. 4) and the nozzle via the groove of the flow path switching means.
  • This flow path connection is the arrangement from flow path 3 in FIG. 4A to the nozzle.
  • this flow path connection which is in a position where the through hole communicating with the waste tank from below the liquid receiving part communicates with the flow path via the groove, corresponds to the arrangement in FIG. 4A and FIG. 5C.
  • the inside of the waste tank is under negative pressure, and the liquid flows from the specimen suspension tank through the flow path into the flow path switching means, passes through the filter in the flow path switching means, and reaches the waste tank under negative pressure via the flow path between the flow path switching means and the waste tank. If the liquid from the specimen suspension tank contains nucleic acid, the nucleic acid is trapped in the filter.
  • Step 2 cleaning step
  • Liquid cleaning liquid tank ⁇ flow path switching means (nozzle ⁇ filter) ⁇ waste liquid tank
  • Gas cleaning liquid tank vent ⁇ cleaning liquid tank
  • the rotor of the flow path switching means rotates, and the flow path from the cleaning liquid tank is in a position where it communicates with the flow path in the cylinder (corresponding to flow path 10 in FIG. 4) and the nozzle via the groove of the flow path switching means, and also in a position where it communicates with the through hole that communicates with the waste liquid tank from below the liquid receiving part.
  • the flow path that connects to the groove of the flow path switching means is a flow path from the cleaning liquid tank
  • the height of the flow path and the groove or the position on the outer periphery are different from those in step 1 (in step 1, the flow path that connects to the groove of the flow path switching means is a flow path from the specimen suspension tank), but it is the same as the arrangement shown in FIG. 4A and FIG. 5C.
  • the cleaning liquid in the cleaning liquid tank flows from the cleaning liquid tank through the flow path into the nozzle in the flow path switching means, passes through the nozzle and the filter, and reaches the waste liquid tank in a negative pressure state via the flow path between the lower part of the liquid receiving part and the waste liquid tank.
  • the cleaning liquid from the cleaning liquid tank washes the filter.
  • Step 3 (drying step) Gas: cleaning liquid tank vent hole ⁇ flow path switching means (nozzle ⁇ filter) ⁇ waste liquid tank After one or two cleaning steps are completed, the position of the flow path switching means is returned to the same position as in step 2, and outside air is taken in through the cleaning liquid tank vent hole, which passes through the filter in the flow path switching means and reaches the waste liquid tank under negative pressure. This dries the filter.
  • Step 4 (Elution Step) Liquid: eluent tank ⁇ flow path switching means (nozzle ⁇ filter) ⁇ mixing tank Gas: mixing tank ⁇ flow path switching means ⁇ waste tank
  • the rotor of the flow path switching means rotates, and the flow path from the eluent tank is in a position where it communicates with the flow path in the cylinder (corresponding to the flow path 10 in FIG. 4) and the upper part of the nozzle via the groove of the flow path switching means, and the opening from the lower part of the liquid receiving part is in a position where it communicates with the through hole communicating with the mixing tank.
  • This flow path connection is the embodiment shown in FIG. 4A and FIG.
  • the gas also flows from the mixing tank to the waste tank via the flow path switching means.
  • the flow path from the mixing tank is in a position where it communicates with the groove of the rotor, and the groove is in a position where it communicates with the flow path communicating with the waste tank.
  • This flow path connection corresponds to the state shown in FIG. 2A.
  • the eluent in the eluent tank flows from the eluent tank through the flow path into the nozzle, passes through the filter, and reaches the mixing tank.
  • the eluent from the eluent tank elutes and washes the nucleic acid trapped in the filter.
  • gas is sucked from the mixing tank via the flow path switching means into a waste tank under negative pressure.
  • Step 5 (reaction solution supply step) Liquid: reaction liquid tank ⁇ flow path switching means ⁇ mixing tank Gas: mixing tank ⁇ flow path switching means ⁇ waste liquid tank
  • step 5 the rotor of the flow path switching means rotates, and the flow path from the reaction liquid tank is in a position where it communicates with the groove of the flow path switching means, and the groove of the flow path switching means is in a position where it communicates with the flow path to the mixing tank.
  • This flow path connection corresponds to the state shown in FIG. 2A.
  • this positioning is a position where the flow path from the mixing tank, which becomes the gas flow path, communicates with the groove of the flow path switching means, and also a positioning where the groove of the flow path switching means communicates with the flow path that connects to the waste liquid tank.
  • This flow path connection also corresponds to the state shown in FIG. 2A.
  • Step 6 (Reactor Filling Step) Liquid: mixing tank ⁇ flow path switching means ⁇ reaction tank Gas: reaction tank ⁇ flow path switching means ⁇ waste liquid tank
  • the rotor of the flow path switching means rotates, and the flow path from the mixing tank is in a position where it communicates with the groove of the flow path switching means, and the groove of the flow path switching means is in a position where it communicates with the flow path to the reaction tank.
  • This flow path connection corresponds to the state shown in FIG. 2A.
  • this positioning is a position where the flow path from the exhaust port of the reaction tank, which becomes the gas flow path, communicates with the groove of the flow path switching means, and also a positioning where the groove of the flow path switching means communicates with the flow path that connects to the waste liquid tank.
  • This flow path connection corresponds to the state shown in FIG. 3A.
  • the mixed reaction solution transferred to the reaction tank is then subjected to a process in which the nucleic acids in the solution are amplified.
  • the flow path switching means can have a groove and through hole structure and position such that the rotor and cylinder are positioned such that at least the reaction vessel is closed, or all the flow paths are disconnected via the flow path switching means.
  • the mixed reaction liquid is transferred to the reaction vessel, at least the reaction vessel can be closed, or all the flow paths can be disconnected via the flow path switching means.
  • the liquid is then subjected to a process of amplifying nucleic acid. By closing at least the reaction vessel or disconnecting all the flow paths, nucleic acid amplification can be performed while avoiding contamination of the reaction vessel, and subsequent detection can also be performed.
  • the cartridge of the present invention can be used for the recovery, amplification and/or detection of nucleic acids from a sample.
  • the present invention includes a method for amplifying a target nucleic acid in a specimen using the above-described fluid treatment cartridge of the present invention, which method may also include detection of the amplified nucleic acid in the nucleic acid amplification.
  • the nucleic acid to be amplified is not particularly limited, and can be, for example, RNA or DNA.
  • the nucleic acid amplification reaction can be an isothermal amplification reaction or a thermocycling amplification reaction of nucleic acid.
  • the isothermal amplification reaction can be, for example, the LAMP method or the SmartAmp method.
  • the thermocycling amplification reaction can be a PCR amplification reaction.
  • the nucleic acid amplification enzyme is not particularly limited, but may be, for example, an enzyme for isothermal amplification reaction of nucleic acid or an enzyme for thermocycle amplification reaction.
  • the isothermal amplification reaction of nucleic acid may be, for example, the LAMP method or the SmartAmp method of nucleic acid, and may be an enzyme for amplification reaction of nucleic acid using a strand displacement reaction.
  • the polymerase which is an enzyme for nucleic acid amplification reactions having strand displacement activity, can be any known enzyme.
  • the polymerase described in WO 2004/040019 can be mentioned, but is not intended to be limited thereto.
  • the polymerase having strand displacement activity can also be DNA polymerase (Aac), which is disclosed in WO 2009/054510 (Japanese Patent No. 4450867).
  • any of those that are normal, mesophilic, or thermostable can be suitably used.
  • this polymerase may be either a natural form or a mutant with an artificial mutation.
  • Such a polymerase includes DNA polymerase.
  • DNA polymerase includes mutants of DNA polymerase derived from thermophilic Bacillus bacteria such as Bacillus stearothermophilus (hereinafter referred to as "B.st”) and Bacillus caldotenax (hereinafter referred to as "B.ca”) that lack 5' ⁇ 3' exonuclease activity, and Klenow fragment of DNA polymerase I derived from Escherichia coli (E.
  • DNA polymerases used in nucleic acid amplification reactions include Vent DNA polymerase, Vent (Exo-) DNA polymerase, DeepVent DNA polymerase, DeepVent (Exo-) DNA polymerase, ⁇ 29 phage DNA polymerase, MS-2 phage DNA polymerase, Z-Taq DNA polymerase, Pfu DNA polymerase, Pfu turbo DNA polymerase, KOD DNA polymerase, 9°Nm DNA polymerase, Therminator DNA polymerase, and Taq DNA polymerase.
  • RNA When the nucleic acid to be amplified is RNA, a reverse transcriptase can be used in addition to the DNA polymerase, or a DNA polymerase that also has reverse transcription activity can be used as the DNA polymerase.
  • the reverse transcriptase is not particularly limited as long as it has cDNA synthesis activity using RNA as a template, and examples of the reverse transcriptase include reverse transcriptases of various origins, such as avian myeloblastosis virus reverse transcriptase (AMVRTase), Rous-associated virus 2 reverse transcriptase (RAV-2RTase), and Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (MMLVRTase).
  • AMVRTase avian myeloblastosis virus reverse transcriptase
  • RAV-2RTase Rous-associated virus 2 reverse transcriptase
  • MMLVRTase Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase
  • the primer is appropriately selected depending on the enzyme used for the nucleic acid amplification reaction.
  • the enzyme for the nucleic acid amplification reaction is an enzyme for the nucleic acid amplification reaction using a strand displacement reaction
  • examples of the primers include those described in International Publication No. 2004/040019, Japanese Patent Application Publication No. 2009-171935, Japanese Patent Application Publication No. 2011-50380, etc.
  • the method of the present invention may further include a step in which, after the nucleic acid amplification operation, the amplified nucleic acid is optically detected, electrically detected, or detected by surface plasmon resonance.
  • the amplified nucleic acid may be detected by using a fluorogenic primer as the primer and labeling the fluorogenic primer.
  • the amplified nucleic acid may be detected by using an exciton effect by using an exciton primer or an exciton probe in the amplification reaction.
  • the method of optically detecting the nucleic acid may be a method using an intercalating dye.
  • the nucleic acid amplification reaction it is preferable to carry out the nucleic acid amplification reaction by the SmartAmp method or the LAMP method, and to detect the labeling with an exciton primer or an exciton probe.
  • nucleic acid melting curve can be drawn, and the melting curve can be used to determine the properties of the amplified product, such as whether it is a false positive or true positive.
  • the present invention is useful in fields related to the recovery, amplification, and detection of nucleic acids from samples.

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Abstract

本発明は、複数の液体収容槽、流路切替手段、及び各液体収容槽と流路切替手段との間の流路を有する、流体処理カートリッジに関する。流路切替手段は、ローターと、ローター外周面と内周面が密着状態を維持しながらローターが摺動可能なシリンダーを含み、ローターは外周面に、ローターの回転または平行移動により、シリンダーが有する複数の流路口を連絡可能にする少なくとも１つのグルーブを有する、及び／またはローターは、ローターの回転または平行移動により、シリンダーが有する複数の流路口を連絡可能にする少なくとも１つの貫通孔を有する。本発明は、このカートリッジを用いる、核酸の回収及び増幅方法。本発明は、検体から回収した核酸の増幅及び検出までを同じ装置内で実施でき、かつ液体の移送手段が容易な、装置をよりコンパクトにすることができるカートリッジ並びに核酸の回収及び増幅方法を提供する。

Description

流体処理カートリッジ並びに核酸の回収及び増幅方法
　本発明は、流体処理カートリッジ並びに核酸の回収及び増幅方法に関する。より詳細には、本発明は、検体からの核酸の回収、増幅、検出用に適した流体処理カートリッジ並びにこのカートリッジを用いる核酸の回収及び増幅方法に関する。
　ＣＯＶＩＤ－１９の蔓延に伴って、ウイルス中の核酸を回収し、増幅し、検出して、ウイルス感染の有無を簡便にかつ確実に判定する技術に対する要求は日々高まっている。また、ＣＯＶＩＤ－１９の問題を解消した後にも、人類は様々なウイルスや細菌による疾病に直面していることから、同様の技術に対する要求は依然として存在する。
　核酸を増幅し、検出する技術は、ＰＣＲ法の出現と、その後のＰＣＲ法以外の様々な方法の発展により、方法論としてはほぼ確立され、実験室のみならず、病院の検査室などにおいても簡便に行われるようになってきた。しかし、それでも、ウイルス等の生体試料からの核酸回収をマニュアル操作で行った後に、核酸の増幅と検出を既存の増幅検出装置を用いて行うことが多かった。しかし、ＣＯＶＩＤ－１９の蔓延に伴って、既存の方法及び装置を用いて、保健所や検査会社に検体を持ち込んでの対応では深刻な自体に対応できないことは明らかである。多量の検体を、場所を選ばず短時間にかつ簡易に処理して、ウイルス感染の有無を、確実に判定することはできないのが現状である。
　特許文献１には、核酸の増幅と検出をより簡易に行える、携帯可能な小型の増幅検出装置が開示されている。
特許文献１：国際公開第２０１８／１２３８３７号
特許文献２：国際公開第２００２／０２３７７６号
特許文献１及び２の全記載は、ここに特に開示として援用される。
　特許文献１に記載の装置では、検体から核酸を別途回収した後、回収した核酸を増幅及び検出する装置である。しかし、この装置を用いる方法では、検体から核酸を別途回収する必要があり、検体から一度にウイルスの検出はできない。
　これに対し、本発明者らは、検体を前処理することなくそのまま用いて、検体からの核酸の回収、回収した核酸の増幅、及び増幅した核酸の検出を１つの装置で行うことを企画した。この装置では、上記核酸の回収、増幅、検出の工程を、マイクロ流路で連絡したチャンバにおいて逐次自動で実施すること、核酸の回収効率が高いことを考慮して、フィルターなどの担体を用いて行うことを想定する。
　核酸の回収を、担体を用いて行う装置が知られている(特許文献２)。この装置は、複数の試薬溶液などを格納する複数のチャンバとチャンバの間で流体を移動するための機構を有する。チャンバ間の流体移動機構は、内部が流体移動チャンバである筒状体と筒状体内を上下して筒状体の内部を減圧または加圧にするピストンを備え、流体移動チャンバの底部に他のチャンバと接続する切り換え可能な流路を有し、筒状体の内部の減圧または加圧を利用して、流体移動チャンバとその他のチャンバの間で流体を移動しながら検体からの核酸の回収を行う。しかし、この装置では、液体の移動はピストンの上下動で行う必要があり、作動機構が複雑になるという課題があるとともに、回収した核酸の増幅及び検出を同じ装置内で行うことは想定していない。
　本発明が解決すべき課題は、回収した核酸の増幅及び検出までを同じ装置内で実施でき、かつ液体の移送手段が容易で、カートリッジを実装する装置をよりコンパクトにすることができるカートリッジを提供することにある。
　本発明は、以下の通りである。
［１］
　複数の液体収容槽、流路切替手段、及び各液体収容槽と流路切替手段との間の流路を有する、流体処理カートリッジであって、
　流路切替手段は、ローターと、ローター外周面と内周面が密着状態を維持しながらローターが摺動可能なシリンダーを含み、
　ローターは外周面に、ローターの回転または平行移動により、シリンダーが有する複数の流路口を連絡可能にする少なくとも１つのグルーブを有する、及び／または
　ローターは、ローターの回転または平行移動により、シリンダーが有する複数の流路口を連絡可能にする少なくとも１つの貫通孔を有する、
　前記カートリッジ。
［２］
　前記グルーブは、ローター内部からの貫通孔の開口を有する、［１］に記載のカートリッジ。
［３］
　前記ローターは、中実円筒であるか、または内部に空洞を有する円筒状外壁を有し、前記貫通孔は、中実円筒を貫通する孔であるか、円筒状外壁を貫通する孔である、［１］または［２］に記載のカートリッジ。
［４］
　複数の液体収容槽、流路及びシリンダーは一体物であり、ローターは、シリンダー開口から挿入可能である、［１］～［３］のいずれか１項に記載のカートリッジ。
［５］
　前記ローターの両末端が開口であり、前記ローターは、各開口からの内部空間を有し、２つ又はそれ以上の内部空間を隔てる内部構造部を有する、［１］～［４］のいずれか１項に記載のカートリッジ。
［６］
　前記シリンダーは、シリンダー内部側末端は閉鎖されているか、またはシリンダー内部側からローター内部空間に延在するノズルを有し、ノズル以外は閉鎖されており、ノズルの先端は開口であり、ノズルはシリンダーの流路に連絡可能である、［１］～［５］のいずれか１項に記載のカートリッジ。
［７］
　前記流体処理カートリッジは、流路切替手段内または液体収容槽と流路切替手段との間の流路途中に担体を有する、［１］～［６］のいずれか１項に記載のカートリッジ。
［８］
　前記ローターの両末端が開口であり、前記ローターが、各開口からの内部空間を有し、２つ又はそれ以上の内部空間を隔てる内部構造部を有する場合に、
　流路切替手段内の担体は、ローター内部の前記内部構造部に含まれる、［７］に記載のカートリッジ。
［９］
　前記ローターの両末端が開口であり、前記ローターが、各開口からの内部空間を有し、２つ又はそれ以上の内部空間を隔てる内部構造部を有する場合に、
　前記内部構造部は、シリンダー外部側に液体受領部を含み、かつ液体受領部はローター外へ連絡可能な排出路を有する、［５］～［８］のいずれか１項に記載のカートリッジ。
［１０］
　液体受領部は漏斗状である、［９］に記載のカートリッジ。
［１１］
　前記流体処理カートリッジは、流路切替手段と流路を介して接続する廃液回収槽をさらに有し、かつ廃液回収槽内に排気口を有する、［１］～［１０］のいずれか１項に記載のカートリッジ。
［１２］
　前記流体処理カートリッジ使用時に、排気口は、廃液回収槽内の廃液槽注入口より上方に位置する、［１１］に記載のカートリッジ。
［１３］
　前記流体処理カートリッジ使用時に、液体収容槽及び流路内の液体流通及び排気は、前記排気口からの排気により生じる陰圧により行われる、［１１］または［１２］に記載のカートリッジ。
［１４］
　前記流体処理カートリッジは、流路切替手段と流路を介して接続する反応槽をさらに有する、［１］～［１３］のいずれか１項に記載のカートリッジ。
［１５］
　複数の液体収容槽の少なくとも一部及び反応槽は、通気孔または通気孔に通じる通気路を有し、前記流体処理カートリッジ使用時に、液体収容槽の通気孔への連絡口は、液体収容槽の上方に位置する、［１］～［１４］のいずれか１項に記載のカートリッジ。
［１６］
　流路切替手段において、ローターとシリンダーの位置関係が、少なくとも反応槽が閉鎖される位置を有する、［１］～［１５］のいずれか１項に記載のカートリッジ。
［１７］
　流路切替手段において、ローターとシリンダーの位置関係が、全ての流路が流路切替手段を介して非接続状態となるグルーブ及び貫通孔の構造及び位置を有する、［１］～［１６］のいずれか１項に記載のカートリッジ。
［１８］
　前記ローターは、１または２以上のグルーブ及び１または２以上の貫通孔を有する、［１］～［１７］のいずれか１項に記載のカートリッジ。
［１９］
　前記複数の液体収容槽は、１つまたは２以上の検体懸濁槽、１つまたは２以上の洗浄液槽、１つまたは２以上の溶離液槽、１つまたは２以上の混合槽であり、前記流体処理カートリッジは、１つまたは複数の廃液槽及び１つまたは複数の反応槽をさらに有する、［１］～［１８］のいずれか１項に記載のカートリッジ。
［２０］
　前記カートリッジは、検体からの核酸の回収、増幅及び／又は検出用であり、核酸の増幅が反応槽で実施される、［１］～［１９］のいずれか１項に記載のカートリッジ。
［２１］
　［１］～［２０］のいずれか１項に記載のカートリッジを用いる、核酸の回収及び増幅を含む方法。
［２２］
　核酸の増幅が反応槽で実施されるときには、流路切替手段のローターとシリンダーは、少なくとも反応槽が閉鎖される位置をとる、または全ての流路が非接続状態となる位置をとる、［２１］に記載の方法。
［２３］
　核酸増幅操作後に、増幅された核酸は、光学的に検出される、電気的に検出される、または表面プラズモン共鳴により検出される工程をさらに含む、［２１］または［２２］に記載の方法。
　本発明によれば、回収した核酸の増幅及び検出までを同じ装置内で実施でき、かつ液体の移送手段が容易で、カートリッジを実装する装置をよりコンパクトにすることができるカートリッジを提供することができる。このカートリッジを用いることで、目的核酸の検出をより確実におこなうことができる。
図１は、本発明の流体処理カートリッジの一例の概略模式図を示す。 図２は、本発明の流体処理カートリッジの一例が有する流路切替手段の水平断面概略説明図を示す。 図３は、本発明の流体処理カートリッジの一例が有する流路切替手段の垂直断面概略説明図を示す。 図４は、本発明の流体処理カートリッジの一例のシリンダー及びローターの垂直断面概略説明図を示す。 図５は、本発明の流体処理カートリッジの一例が有する流路切替手段の水平断面概略説明図を示す。 図６は、本発明の流体処理カートリッジの一例が有する流路切替手段の水平断面概略説明図を示す。 図７は、本発明の流体処理カートリッジの一例が有する流路切替手段の水平断面概略説明図を示す。 図８は、本発明の流体処理カートリッジの一例のシリンダー及びローターの垂直断面概略説明図を示す。 図９－１は、本発明の流体処理カートリッジの一例のシリンダー及びローターの垂直断面概略説明図を示す。 図９－２は、本発明の流体処理カートリッジの一例のシリンダー及びローターの垂直断面概略説明図を示す。
＜流体処理カートリッジ＞
　本発明は、流体処理カートリッジに関し、このカートリッジは、複数の液体収容槽、流路切替手段、及び各液体収容槽と流路切替手段との間の流路を有する。流路切替手段は、ローターと、ローター外周面と内周面が密着状態を維持しながらローターが摺動可能なシリンダーを含む。ローターは外周面に、ローターの回転または平行移動により、シリンダーが有する複数の流路口を連絡可能な少なくとも１つのグルーブを有することができる。ローターは、ローターの回転または平行移動により、シリンダーが有する複数の流路口を連絡可能な少なくとも１つの貫通孔を有することができる。
　本発明の流体処理カートリッジを図１に基づいて以下に説明する。図１は、本発明の流体処理カートリッジの一例の概略模式図である。
　図１において、１０が流路切替手段であり、２０～２５が液体収容槽であり、５０～５７が各液体収容槽と流路切替手段との間の流路である。５８、５９は廃液回収槽と流路切替手段との間の流路であり、６０は、反応槽と流路切替手段との間の流路である。図１においては、一例として２０～２５の６個の液体収容槽を示すが、液体収容槽の数は２個以上であれば、特に限定はなく２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上であっても良い。図１には、５０～６０の流路を示すが、流路の数は、液体収容槽、廃液回収槽、反応槽の数に応じて、適宜選択できる。本発明のカートリッジにおいて、複数の液体収容槽、流路及びシリンダーは一体物であることができ、ローターはシリンダー開口側から挿入可能である。例えば、シリンダーの開口は、カートリッジの底部（流路切替手段１０の長手方向下側の面）に配置される。ローターとシリンダーの配置については後述する。
　流路切替手段１０は、ローターと、ローター外周面と内周面が密着状態を維持しながらローターが摺動可能なシリンダーを含む。ローターとシリンダーとが摺動可能であるとは、シリンダー中でローターが回転可能であること、及び／又はシリンダー中でローターが平行移動可能であることを意味する。ローター及びシリンダーからなる流路切替手段は縦長円筒形状で、側周面に流路が接続されており、図１では、両末端が上下になるように配置されているが、両末端が水平や様々な角度の斜めの位置に配置することもできる。ローター外周面とシリンダー内周面が密着状態を維持するために、ローター外径とシリンダー内径は略等しく、かつローター外周面の表面とシリンダー内周面の表面は密着状態を維持できる程度に平滑であることが好ましい。また、この間にはシリンダーとローターを密着状態にし、かつ、回転や抜き差しもできるように様々な潤滑油を使用することができる。
　ローターは、中実円筒であるか、または内部に空洞を有する円筒状外壁を有するものであることができる。ローターは外周面に、ローターの回転位置により、シリンダーが有する複数の流路口を連絡可能な少なくとも１つのグルーブ（溝）を有することができる。グルーブは、水平方向に設けられるか、あるいは垂直方向に設けることができる。傾斜を付けて設けることもできるが、流路切替手段１０の操作性を考慮すると、水平方向または垂直方向に設けることが好ましい。グルーブの長さ及び深さは、シリンダーが有する複数の流路口の間隔及び寸法を考慮して、適宜決定できる。
　図２に、内部に空洞を有する円筒状外壁を有するローター及びシリンダーの水平断面概略説明図を示す。グルーブがローター外周面に水平方向に設けられた例を示す。図Ａでは、グルーブＡの両末端で流路１と流路２が連絡されている。図Ｂは、ローターを回転し、グルーブＡの両末端が流路１の開口及び流路２の開口と非接続状態であり、流路１と流路２との連絡が閉鎖された状態である。図ＡではグルーブＡを使用して、流路１と流路２の間で液体または気体を流通させることができる。図Ｂの状態では流路１と流路２の間の連絡は閉鎖されており、グルーブＡを使用した液体または気体の流通はできない。なお、２つの流路の間の接続を断つには、グルーブは、２つの流路の少なくとも１つと非接触であればよい。
　図３に、ローター及びシリンダーの垂直断面概略説明図を示す。グルーブがローター外周面に垂直方向に設けられた例を示す。図Ａでは、グルーブＢの両末端で流路３と流路４が連絡されている。図Ｂは、ローターを回転し、グルーブＢの両末端が流路３の開口及び流路４の開口と非接続状態であり、流路３と流路４との連絡が閉鎖された状態である。図Ａの状態ではグルーブＢを使用して、流路３と流路４の間で液体または気体を流通させることができる。図Ｂの状態では流路３と流路４の間の連絡は閉鎖されており、グルーブＢを使用した液体または気体の流通はできない。
　図４に、ローター及びシリンダーの垂直断面概略説明図を示す。図４に示す、内部に空洞を有する円筒状外壁を有するローターは、円筒形であり、両末端は開口である。シリンダー内においては、ローターのシリンダー内部側末端及び外部側末端が開口であり、ローターは各開口からの内部空間を有する。ローターの内部空間は、図３に示すように単なる空間であることもできるし、図４に示すように、２つの内部空間を隔てる内部構造部を有することもできる。シリンダーは、図３に示すように、シリンダー内部側末端は閉鎖されているか、または図４に示すようにシリンダー内部側からローター内部空間に延在するノズルを有することができ、ノズル（さらに、必要に応じてローターの挿入口）以外は閉鎖されている。ノズルの先端は開口であり、ノズルはシリンダー内の流路１０に連絡する。図４の図Ａでは、流路３がグルーブＢ及びシリンダー内の流路１０を介して、ノズルまで連絡している。図Ｂは、ローターが別の位置に回転した図であり、グルーブＢと流路３及びシリンダー内の流路１０の接続が切断された状態を示す。
　本発明の流体処理カートリッジは、流路切替手段内または液体収容槽と流路切替手段との間の流路途中に担体を有することができる。流路切替カートリッジ内の担体は、ローター内部の内部構造部を構成することができ、かつシリンダーから伸びたノズル先端が担体の対向する面の近くに位置することができる。担体は、検体中の核酸をトラップし、かつトラップした核酸を溶出させることができるものであれば良い。担体は、例えば、ガラスフィルター、順相カラム、逆相カラムなどのＡｆｆｉｎｉｔｙ樹脂、ゲル濾過樹脂などであることができる。但し、これら限定される意図ではない。
　ローター内の内部構造部は、シリンダー外部側に液体受領部を含むことができる。内部構造部を構成する担体と液体受領部との間は空間を有することができる。液体受領部は、液体受領部からローター外の連絡可能な排出路である溝を有することができる。液体受領部は漏斗状であることができる。図４の図Ａでは、液体受領部は溝及びグルーブＣと接続し、かつグルーブＣは流路４と接続する。図Ｂは、ローターが別の位置に回転した図であり、グルーブＣと流路４及びシリンダー内の溝の接続が切断された状態を示す。
　図４のＡの状態では、カートリッジ使用時には、ノズルが重力軸（図４の紙面内上下方向）の上方に来るようにカートリッジが設置され、流体処理が行われる。流路３から供給された液体は、ノズル先端から流出し、流出した液体は担体に落下し、担体を通過して、液体受領部に達し、液体受領部から溝及び貫通孔Ａを介して流路４に流出する。流路４の先は、図示されていないが、陰圧とした廃液回収槽であり、ノズルを包含するローター上部空間と液体受領部と担体の間の空間は密閉空間であり、廃液回収槽からの陰圧によって、液体は廃液回収槽方向に移動する。
　図５には、流路切替手段の一例の水平断面概略説明図を示す。図Ｃには、液体受領部の下流の溝、貫通孔Ａ及び流路４を示し、これらが連通した状態である。図５の図Ｃは、図４に示した、溝、貫通孔Ａ、垂直方向のグルーブＣ及び流路４が接続された状態を示す図である。図５の図Ｄは、ローターを回転し、シリンダーの流路４の開口とローターの貫通孔Ａの位置が不整合であり、流路４と溝との連絡が切断された状態である。
　図６～１０には、ローターが中実円筒である流路切替手段の例の水平断面概略説明図及び垂直断面概略説明図を示す。図６には、中実円筒であるローターを横切る貫通孔Ｂと、回転することで貫通孔Ｂと接続し得る流路２０及び２１を示す。図Ａでは貫通孔Ｂと流路２０及び２１が連通しており、図Ｂでは、図Ａの状態からローターが回転し、貫通孔Ｂと流路２０及び２１は連通していない。
　図７には、中実円筒であるローターを枝分かれして横切る貫通孔Ｃと、貫通孔Ｃの一末端にあるグルーブＤと、貫通孔Ｃ又はグルーブＤと接続し得る流路２２～２４を示す。図Ａでは流路２２とグルーブＤが連通し、かつ貫通孔Ｃと流路２３が連通している。図Ｂでは、図Ａの状態からローターが回転し、流路２２とグルーブＤは連通を維持し、かつ貫通孔Ｃと流路２４が連通している。図Ｃでは、図Ｂの状態からローターが回転し、貫通孔Ｃは流路２２～２４の何れとも連通していない。
　図８～９－２には、シリンダー中でローターが平行移動する場合の例を示す。図８は、中実円筒であるローターを横切る貫通孔Ｄと、ローターが平行移動（直線運動）することで貫通孔Ｄと接続し得る流路２５及び２６を示す。図Ａでは貫通孔Ｄと流路２５及び２６が連通しており、図Ｂでは、図Ａの状態からローターが平行移動し、貫通孔Ｄと流路２５及び２６は連通していない。
　図９－１には、中実円筒であるローターを枝分かれして横切る貫通孔Ｅと、貫通孔Ｅの一末端にあるグルーブＥと、貫通孔Ｅ又はグルーブＥと接続し得る流路２７～２９を示す。図Ａでは貫通孔Ｅは流路２７～２９の何れとも連通していない。図Ｂでは、図Ａの状態からローターが平行移動し、流路２７とグルーブＥは連通し、かつ貫通孔Ｅと流路２８が連通している。図Ｃでは、図Ｂの状態からローターがさらに平行移動し、流路２７とグルーブＥの連通が維持され、かつ貫通孔Ｅと流路２９が連通している。図９－２は、図９－１と同様の例であり、図Ｄは、図９－１の図Ｃの状態からローターがさらに平行移動し、流路２８と流路２９がグルーブＥを介して連通している。図Ｅは、図Ｄの別の態様であり、例えば図９－１の図Ｃの状態からローターが回転し、グルーブＦによって流路２８と２９を接続している。
　本発明の流体処理カートリッジは、図２～９－２に示されたローターのグルーブ及び貫通孔とシリンダーの流路の開口との位置を、ローターを回転または平行移動させ、停止位置を選択することで、連通させたい流路を決定し、その上で、複数の液体収容槽間で、液体を流通させ、所望の処理を進めることができる。ローターの回転または平行移動は、シリンダー外部側からローターを操作することにより行うことができる。
　本発明の流体処理カートリッジは、さらに、流路切替手段と流路を介して接続する廃液回収槽を有し、かつ廃液回収槽内に排気口を有することができる。図１において、廃液回収槽は３０で示され、廃液回収槽３０内に排気口３１を有する。廃液回収槽３０は、流路５９を介して流路切替手段１０に接続する。排気口３１は、流体処理カートリッジの外部に設けられた排気カートリッジ、例えば、吸引ポンプと接続され、廃液回収槽３０を陰圧とし、さらに廃液回収槽３０と流路５９を介して流体処理カートリッジ１０と接続する液体収容槽内及び後述する反応槽内を陰圧として、廃液回収槽３０にまで液体または気体を導くことができる。排気カートリッジを用いて廃液回収槽３０を陰圧とし、廃液回収槽３０と連通する液体収容槽を、流路切替手段を用いて選択することで、複数の液体収容槽及び反応槽を用いた、液体及び気体の移送を含む液体処理を容易に簡便に行うことができる。本発明のカートリッジは、廃液回収槽３０に設けた排気口からの排気による陰圧を利用して液体及び気体の移送をすることが特徴の１つである。カートリッジ使用時に、排気口は、廃液回収槽内の廃液槽注入口より上方に位置するように、カートリッジは配置される。排気口からの液漏れを防止するためである。
　本発明の流体処理カートリッジは、流路切替手段と流路を介して接続する反応槽４０をさらに有することができる。反応槽は、本発明のカートリッジで処理された核酸を含有する液体を格納し、核酸を増幅及び増幅した核酸を検出するために用いられる。
　複数の液体収容槽の少なくとも一部及び反応槽は、通気孔または通気孔に通じる通気路を有することができる。図１に示す態様においては、液体収容槽２０～２５のいずれか１つまたは全ての液体収容槽及び反応槽４０は、図示されていないが、通気孔または通気孔に通じる通気路を有する。通気孔または通気孔に通じる通気路を有する液体収容槽は、廃液回収槽３０と流路５９を介して流路切替手段１０と接続することで、槽内を陰圧として、廃液回収槽３０にまで液体または気体を容易に導くことができる。通気孔または通気孔に通じる通気路を有する反応槽４０は、廃液回収槽３０と流路５９を介して流路切替手段１０と接続することで、槽内を陰圧として、反応槽４０にまで液体または気体を容易に導くことができる。或いは、反応槽４０は、図示されていないが、廃液回収槽３０に設けられた排気口と同様の排気口を有することができる。この排気口から排気して反応槽４０内を陰圧にすることにより、反応槽４０へ流体及び／又は気体を移送してもよい。
　本発明の流体処理カートリッジは、液体収容槽の数及び廃液回収槽や担体の有無に応じた数のグルーブ及び貫通孔を有する。
　以下、ローター内部に担体であるフィルターを有する本発明の流体処理カートリッジを例に、その構成及び作動についてさらに説明する。この態様のカートリッジは、複数の液体収容槽として、１つの検体懸濁槽、２つの洗浄液槽、１つの溶離液槽、１つの反応液槽、１つの混合槽を有し、さらに、１つの廃液槽及び１つの反応槽を有する。
工程１（担持工程）
液体：検体懸濁槽→流路切替手段（ノズル→フィルター）→廃液槽
気体：検体懸濁槽の通気孔→検体懸濁槽
　工程１では、流路切替手段のローターが、検体懸濁槽からの流路が流路切替手段のグルーブを介してシリンダー内の流路（図４の流路１０に相当する）及びノズルに連通する位置である。この流路接続は、図４Ａの流路３からノズルに至る配置である。さらに、液体受領部の下方から廃液槽に連絡する貫通孔と流路がグルーブを介して連通する位置を取るこの流路接続は、図４Ａ及び図５Ｃの配置に相当する。廃液槽内は陰圧になっており、液体は、検体懸濁槽から流路を介して流路切替手段に流入し、流路切替手段内のフィルターを通過し、流路切替手段と廃液槽との間の流路を介して陰圧状態の廃液槽に至る。検体懸濁槽からの液体が核酸を含む場合、フィルターに核酸がトラップされる。
工程２（洗浄工程）
液体：洗浄液槽→流路切替手段（ノズル→フィルター）→廃液槽
気体：洗浄液槽の通気孔→洗浄液槽
　工程２では、流路切替手段のローターが回転して、洗浄液槽からの流路が流路切替手段のグルーブを介してシリンダー内の流路（図４の流路１０に相当する）及びノズルに連通する位置になり、かつ、液体受領部の下方から廃液槽に連絡する貫通孔と連通する位置を取る。この流路接続は、流路切替手段のグルーブに接続する流路が洗浄液槽からの流路であることから、流路及びグルーブの高さまたは外周上の位置は工程１と異なる（工程１では流路切替手段のグルーブに接続する流路は検体懸濁槽からの流路である）が、図４Ａ及び図５Ｃに示す配置と同様である。これにより、洗浄液槽内の洗浄液は、洗浄液槽から流路を介して流路切替手段内のノズルに流入し、ノズルからフィルターを通過して、液体受領部の下方から廃液槽との間の流路を介して陰圧状態の廃液槽に至る。洗浄液槽からの洗浄液がフィルターを洗浄する。
　２つの洗浄液槽を用いる場合には、２つの異なる洗浄液槽を用いて上記操作を繰り返すことで、洗浄をより徹底することができる。但し、流路切替手段の位置取りは、図４Ａ及び図５Ｃに示す配置であるが、工程１及び工程２の１回目とは、流路及びグルーブの高さまたは外周上の位置は異なる。
工程３（乾燥工程）
気体：洗浄液槽の通気孔→流路切替手段（ノズル→フィルター）→廃液槽
　１回または２回の洗浄工程終了後に、流路切替手段の位置は、工程２と同じ位置にして、さらに洗浄液槽の通気孔から外気を取り入れ、外気は流路切替手段内のフィルターを通過して、陰圧状態の廃液槽に至る。これにより、フィルターが乾燥される。
工程４（溶離工程）
液体：溶離液槽→流路切替手段（ノズル→フィルター）→混合槽
気体：混合槽→流路切替手段→廃液槽
　工程４では、流路切替手段のローターが回転、溶離液槽からの流路が流路切替手段のグルーブを介してシリンダー内の流路（図４の流路１０に相当する）及びノズルの上方に連通する位置になり、かつ、液体受領部の下方からの開口と混合槽に連絡する貫通孔とが連通する位置を取る。この流路接続は、工程１～３とは、流路及びグルーブの高さまたは外周上の位置は異なるが、図４Ａ及び図５Ｃに示す態様である。さらに、この工程では、気体も流路切替手段を経由して、混合槽から廃液槽に流れる。混合槽からの流路がローターのグルーブに連通する位置であり、同グルーブが廃液槽に連絡する流路と連通する位置になる。この流路接続は、図２Ａに示す状態に相当する。これにより、溶離液槽内の溶離液は、溶離液槽から流路を介してノズルに流入し、フィルターを通過して、混合槽に至る。溶離液槽からの溶離液がフィルターにトラップされた核酸を溶離洗浄する。さらに、混合槽からは気体が流路切替手段を経由して陰圧状態の廃液槽に吸引される。
工程５（反応液供給工程）
液体：反応液槽→流路切替手段→混合槽
気体：混合槽→流路切替手段→廃液槽
　工程５では、流路切替手段のローターが回転、反応液槽からの流路が流路切替手段のグルーブに連通する位置になり、かつ、流路切替手段の同グルーブと混合槽への流路とが連通する位置を取る。この流路接続は、図２Ａに示す状態に相当する。さらに、この位置取りは、気体の流路となる、混合槽からの流路が流路切替手段のグルーブに連通する位置であり、かつ、流路切替手段の同グルーブが廃液槽に連絡する流路と連通する位置取りでもある。この流路接続も、図２Ａに示す状態に相当する。これにより、反応液槽内の反応液は、反応液槽から流路及び流路切替手段を介して混合槽に至る。混合槽内では、溶離液、反応液及び溶離された核酸が混合される。さらに、混合槽からは気体が流路切替手段を経由して陰圧の廃液槽に吸引される。
工程６（反応槽充填工程）
液体：混合槽→流路切替手段→反応槽
気体：反応槽→流路切替手段→廃液槽
　工程６では、流路切替手段のローターが回転、混合槽からの流路が流路切替手段のグルーブに連通する位置になり、かつ、流路切替手段の同グルーブと反応槽への流路とが連通する位置を取る。この流路接続は、図２Ａに示す状態に相当する。さらにこの位置取りは、気体の流路となる、反応槽の排気口からの流路が流路切替手段のグルーブに連通する位置であり、かつ流路切替手段の同グルーブが廃液槽に連絡する流路とが連通する位置取りでもある。この流路接続は、図３Ａに示す状態に相当する。これにより、混合槽内の反応液は、混合液槽から流路を介して流路切替手段のグルーブを経由して、反応槽に至る。混合槽からの混合反応液が反応槽に移送される。さらに、反応槽からは気体が流路切替手段を経由して陰圧状態の廃液槽に吸引される。
　反応槽に移送された混合反応液は、その後、液内の核酸が増幅する工程に供される。
　流路切替手段は、ローターとシリンダーの位置関係が、少なくとも反応槽が閉鎖される位置を有し、または全ての流路が流路切替手段を介して非接続状態となるグルーブ及び貫通孔の構造及び位置を有することができる。混合反応液が反応槽に移送された後に、少なくとも反応槽が閉鎖され、あるいは流路切替手段を介して全ての流路を非接続状態とすることができる。その後に、液内の核酸が増幅する工程に供される。少なくとも反応槽が閉鎖され、あるいは全ての流路を非接続状態とすることで、反応槽へのコンタミを回避しつつ核酸増幅を行うことができ、さらにその後の検出も行うことができる。
　本発明のカートリッジは、検体からの核酸の回収、増幅及び／又は検出に用いることができる。
＜核酸増幅方法＞
　本発明は、上記本発明の流体処理カートリッジを用いる、検体の目的核酸を増幅する方法を包含し、この方法は、核酸増幅に増幅核酸の検出を含むこともできる。
　増幅されるべき核酸は、特に制限はないが、例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡであることができる。核酸増幅反応は、核酸の等温増幅反応またはサーモサイクル増幅反応であることができる。等温増幅反応は、例えば、ＬＡＭＰ法またはＳｍａｒｔＡｍｐ法である。サーモサイクル増幅反応は、ＰＣＲ増幅反応であることができる。
　核酸増幅用酵素は、特に制限されないが、例えば、核酸の等温増幅反応用酵素またはサーモサイクル増幅反応用酵素であることができる。核酸の等温増幅反応は、例えば、核酸のＬＡＭＰ法またはＳｍａｒｔＡｍｐ法であることができ、鎖置換反応を利用した核酸の増幅反応用酵素であることができる。
　鎖置換活性を有する核酸増幅反応用酵素であるポリメラーゼは、公知の酵素を利用できる。例えば、国際公開第２００４／０４００１９号に記載のポリメラーゼを挙げることができるが、これに限定される意図ではない。鎖置換活性を有するポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ（Ａａｃ）であることもでき、国際公開第２００９／０５４５１０号（日本特許第４４５０８６７号）に開示されている。
　鎖置換活性を有する核酸増幅反応に用いられるポリメラーゼとしては、常温性、中温性、もしくは耐熱性のいずれのものも好適に使用できる。また、このポリメラーゼは、天然体もしくは人工的に変異を加えた変異体のいずれであってもよい。このようなポリメラーゼとしては、ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、以下「Ｂ．ｓｔ」という）、バチルス・カルドテナックス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ、以下「Ｂ．ｃａ」という）等の好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異体、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント等が挙げられる。核酸増幅反応において使用するＤＮＡポリメラーゼとしては、さらに、Ｖｅｎｔ　ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（Ｅｘｏ－）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ　ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ（Ｅｘｏ－）ＤＮＡポリメラーゼ、Φ２９ファージＤＮＡポリメラーゼ、ＭＳ－２ファージＤＮＡポリメラーゼ、Ｚ－Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ　ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ　ｔｕｒｂｏ　ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼ、９°Ｎｍ　ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。
　増幅されるべき核酸がＲＮＡである場合は、ＤＮＡポリメラーゼに加えて逆転写酵素を併用するか、またはＤＮＡポリメラーゼとして、逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼを用いることもできる。逆転写酵素は、ＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡ合成活性を有するものであれば特に限定されず、例えば、トリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素（ＡＭＶＲＴａｓｅ）、ラウス関連ウイルス２逆転写酵素（ＲＡＶ－２ＲＴａｓｅ）、モロニーネズミ白血病ウイルス由来逆転写酵素（ＭＭＬＶ　ＲＴａｓｅ）等、種々の起源の逆転写酵素が挙げられる。逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼとして、例えば、ＢｃａＢＥＳＴ　ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ（ｅｘｏ－）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼ等を挙げることができる。
　プライマーは、核酸の増幅反応用酵素に応じて適宜選択される。核酸の増幅反応用酵素が、鎖置換反応を利用した核酸の増幅反応用酵素である場合は、国際公開第２００４／０４００１９号、特開２００９－１７１９３５号公報、特開２０１１－５０３８０号公報などに記載のプライマーを挙げることができる。
　本発明の方法は、核酸増幅操作後に、増幅された核酸は、光学的に検出される、電気的に検出される、または表面プラズモン共鳴により検出される工程をさらに含むことができる。増幅された核酸の検出は、プライマーとしてフルオロジェニックプライマーを用い、フルオロジェニックプライマーの標識を用いて行うことができる。増幅された核酸の検出は、増幅反応においてエキシトンプライマーまたは、エキシトンプローブを用いて、エキシトン効果を用いておこうことができる。核酸を光学的に検出する方法は、インターカレート色素を利用した方法でもよい。
　本発明の方法において、核酸増幅反応をＳｍａｒｔＡｍｐ法またはＬＡＭＰ法で行い、エキシトンプライマーまたはエキシトンプローブで標識検出することが好ましい。或いは、核酸増幅反応をＰＣＲ法で行い、エキシトンプライマーまたはエキシトンプローブで標識検出することが好ましい。
　核酸増幅反応に引き続き、核酸融解曲線を描き、融解曲線により、偽陽性や真の陽性の判定など、増幅産物の性質について判定することもできる。
　本発明は、検体からの核酸の回収や増幅及び検出に関係する分野に有用である。
１０　流路切替手段
２０～２５　液体収容槽
３０　廃液回収槽
３１　排気口
４０　反応槽
５０～６０　流路 

Claims (23)

  1. 　複数の液体収容槽、流路切替手段、及び各液体収容槽と流路切替手段との間の流路を有する、流体処理カートリッジであって、
    　流路切替手段は、ローターと、ローター外周面と内周面が密着状態を維持しながらローターが摺動可能なシリンダーを含み、
    　ローターは外周面に、ローターの回転または平行移動により、シリンダーが有する複数の流路口を連絡可能にする少なくとも１つのグルーブを有する、及び／または
    　ローターは、ローターの回転または平行移動により、シリンダーが有する複数の流路口を連絡可能にする少なくとも１つの貫通孔を有する、
    　前記カートリッジ。
  2. 　前記グルーブは、ローター内部からの貫通孔の開口を有する、請求項１に記載のカートリッジ。
  3. 　前記ローターは、中実円筒であるか、または内部に空洞を有する円筒状外壁を有し、前記貫通孔は、中実円筒を貫通する孔であるか、円筒状外壁を貫通する孔である、請求項１または２に記載のカートリッジ。
  4. 　複数の液体収容槽、流路及びシリンダーは一体物であり、ローターは、シリンダー開口から挿入可能である、請求項１～３のいずれか１項に記載のカートリッジ。
  5. 　前記ローターの両末端が開口であり、前記ローターは、各開口からの内部空間を有し、２つ又はそれ以上の内部空間を隔てる内部構造部を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載のカートリッジ。
  6. 　前記シリンダーは、シリンダー内部側末端は閉鎖されているか、またはシリンダー内部側からローター内部空間に延在するノズルを有し、ノズル以外は閉鎖されており、ノズルの先端は開口であり、ノズルはシリンダーの流路に連絡可能である、請求項１～５のいずれか１項に記載のカートリッジ。
  7. 　前記流体処理カートリッジは、流路切替手段内または液体収容槽と流路切替手段との間の流路途中に担体を有する、請求項１～６のいずれか１項に記載のカートリッジ。
  8. 　前記ローターの両末端が開口であり、前記ローターが、各開口からの内部空間を有し、２つ又はそれ以上の内部空間を隔てる内部構造部を有する場合に、
    　流路切替手段内の担体は、ローター内部の前記内部構造部に含まれる、請求項７に記載のカートリッジ。
  9. 　前記ローターの両末端が開口であり、前記ローターが、各開口からの内部空間を有し、２つ又はそれ以上の内部空間を隔てる内部構造部を有する場合に、
    　前記内部構造部は、シリンダー外部側に液体受領部を含み、かつ液体受領部はローター外へ連絡可能な排出路を有する、請求項５～８のいずれか１項に記載のカートリッジ。
  10. 　液体受領部は漏斗状である、請求項９に記載のカートリッジ。
  11. 　前記流体処理カートリッジは、流路切替手段と流路を介して接続する廃液回収槽をさらに有し、かつ廃液回収槽内に排気口を有する、請求項１～１０のいずれか１項に記載のカートリッジ。
  12. 　前記流体処理カートリッジ使用時に、排気口は、廃液回収槽内の廃液槽注入口より上方に位置する、請求項１１に記載のカートリッジ。
  13. 　前記流体処理カートリッジ使用時に、液体収容槽及び流路内の液体流通及び排気は、前記排気口からの排気により生じる陰圧により行われる、請求項１１または１２に記載のカートリッジ。
  14. 　前記流体処理カートリッジは、流路切替手段と流路を介して接続する反応槽をさらに有する、請求項１～１３のいずれか１項に記載のカートリッジ。
  15. 　複数の液体収容槽の少なくとも一部及び反応槽は、通気孔または通気孔に通じる通気路を有し、前記流体処理カートリッジ使用時に、液体収容槽の通気孔への連絡口は、液体収容槽の上方に位置する、請求項１～１４のいずれか１項に記載のカートリッジ。
  16. 　流路切替手段において、ローターとシリンダーの位置関係が、少なくとも反応槽が閉鎖される位置を有する、請求項１～１５のいずれか１項に記載のカートリッジ。
  17. 　流路切替手段において、ローターとシリンダーの位置関係が、全ての流路が流路切替手段を介して非接続状態となるグルーブ及び貫通孔の構造及び位置を有する、請求項１～１６のいずれか１項に記載のカートリッジ。
  18. 　前記ローターは、１または２以上のグルーブ及び１または２以上の貫通孔を有する、請求項１～１７のいずれか１項に記載のカートリッジ。
  19. 　前記複数の液体収容槽は、１つまたは２以上の検体懸濁槽、１つまたは２以上の洗浄液槽、１つまたは２以上の溶離液槽、１つまたは２以上の混合槽であり、前記流体処理カートリッジは、１つまたは複数の廃液槽及び１つまたは複数の反応槽をさらに有する、請求項１～１８のいずれか１項に記載のカートリッジ。
  20. 　前記カートリッジは、検体からの核酸の回収、増幅及び／又は検出用であり、核酸の増幅が反応槽で実施される、請求項１～１９のいずれか１項に記載のカートリッジ。
  21. 　請求項１～２０のいずれか１項に記載のカートリッジを用いる、核酸の回収及び増幅を含む方法。
  22. 　核酸の増幅が反応槽で実施されるときには、流路切替手段のローターとシリンダーは、少なくとも反応槽が閉鎖される位置をとる、または全ての流路が非接続状態となる位置をとる、請求項２１に記載の方法。
  23. 　核酸増幅操作後に、増幅された核酸は、光学的に検出される、電気的に検出される、または表面プラズモン共鳴により検出される工程をさらに含む、請求項２１または２２に記載の方法。
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