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WO2024043297A1 - 組成物の製造方法、それにより得られるオリゴ糖含有組成物、及びそれらの利用 - Google Patents

組成物の製造方法、それにより得られるオリゴ糖含有組成物、及びそれらの利用 Download PDF

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WO2024043297A1
WO2024043297A1 PCT/JP2023/030454 JP2023030454W WO2024043297A1 WO 2024043297 A1 WO2024043297 A1 WO 2024043297A1 JP 2023030454 W JP2023030454 W JP 2023030454W WO 2024043297 A1 WO2024043297 A1 WO 2024043297A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
glucan sucrase
composition
amino acid
lactic acid
galactosylcordibiose
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2023/030454
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English (en)
French (fr)
Inventor
淳也 石田
愛弓 市川
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Meiji Co Ltd
Original Assignee
Meiji Co Ltd
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Filing date
Publication date
Application filed by Meiji Co Ltd filed Critical Meiji Co Ltd
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Priority to EP23857405.7A priority patent/EP4578953A1/en
Priority to JP2024542866A priority patent/JPWO2024043297A1/ja
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Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING OR TREATMENT THEREOF
    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/12—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
    • A23C9/13—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using additives
    • A23C9/1307—Milk products or derivatives; Fruit or vegetable juices; Sugars, sugar alcohols, sweeteners; Oligosaccharides; Organic acids or salts thereof or acidifying agents; Flavours, dyes or pigments; Inert or aerosol gases; Carbonation methods
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H3/00—Compounds containing only hydrogen atoms and saccharide radicals having only carbon, hydrogen, and oxygen atoms
    • C07H3/06—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01005—Dextransucrase (2.4.1.5)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a composition containing oligosaccharides such as galactosylcordibiose, oligosaccharide-containing compositions obtained thereby, and uses thereof.
  • Lactose accounts for approximately 99.8% of the carbohydrates in milk, and is obtained in relatively large amounts as a byproduct during the manufacturing process of dairy products.
  • Patent Document 1 relates to the production of oligosaccharides, using galactose and/or lactose as the sugar acceptor and a starch partial hydrolyzate as the sugar donor, and combining these galactose and/or lactose with the starch hydrolyzate.
  • a method is described for producing an oligosaccharide mixture containing galactose molecules in the molecule by allowing a glycosyltransferase to act on a mixed solution. It is also described that the supernatant of a culture of Bacillus macerans (IFO 8490, IAM 1227) can be used as a glycosyltransferase.
  • glycosyltransferases include lactase that uses lactose as a sugar donor and sugar acceptor, and enzymes that use lactose as a sugar acceptor and other sugars as sugar donors.
  • Glucansucrase one of the latter, has the activity of transferring glucose to various sugars using sucrose as a sugar donor.
  • Glucansucrase is known to be expressed by certain microorganisms, and there are several reports regarding its use.
  • Patent Document 2 describes a reaction composition comprising at least water, sucrose, an ⁇ -glucan substrate, and a polypeptide capable of forming at least one ⁇ -1,2 branched chain from the ⁇ -glucan substrate.
  • polypeptide is glucosyltransferase derived from microorganisms such as Fructobacillus tropaeoli.
  • Patent Document 3 describes the use of glycosyltransferases to improve the texture of fermented milk-based products, and describes the glucosyltransferase enzyme derived from Streptococcus salivarius SK126 and its mutants as the glycosyltransferases. ing.
  • Non-Patent Document 1 describes the use of Leuconostoc mesenteroides to obtain trisaccharides from a mixed sugar culture solution of sucrose and lactose.
  • Non-Patent Document 2 is related to glucan synthesis in the genus Lactobacillus, and this document describes the isolation and characteristics of the glucan sucrase gene, enzyme, and the produced glucan from six strains of the genus Lactobacillus. ing.
  • Non-Patent Document 3 relates to the production of glucan using glucan sucrase derived from a strain of Lactobacillus satsumensis isolated from a fermented beverage starter culture.
  • Non-Patent Document 4 relates to two types of glucan sucrases (GtfA and Gtf180) derived from Lactobacillus reuteri. This document describes the structural characteristics of glucosylated lactose derivatives synthesized by enzymes, and states that both enzymes were able to bind glucosyl residues ( ⁇ 1 ⁇ 2) to the reducing glucose unit of lactose. has been done.
  • Patent Document 4 describes an edible composition containing lactic acid bacteria, an enzyme synthesized by the lactic acid bacteria, and an extracellular polysaccharide (EPS) product of the enzyme.
  • Preferred examples of lactic acid bacteria include those of the genus Lactobacillus, and it is stated that EPS is obtained after fermentation with a specific species of lactic acid bacteria that is capable of producing glucan sucrase enzymes.
  • Preferred examples of carbohydrates having a hexose structure include 3-ketotrehalose, 3-ketocodibiose, 3-ketoisomaltose, 3-ketolactose, 3-ketomaltose, 3-ketosucrose, and 3-ketomaltitol. are listed.
  • Patent Document 6 describes an in-vivo lipid regulator containing one or more selected from cordibiose, corditriose, cordibiosyl glucoside, corditetraose, and corditriosyl glucoside as an active ingredient. .
  • galactosylcordibiose an oligosaccharide
  • galactosylcordibiose has a structure in which glucosyl residues are bonded to the glucose unit of lactose
  • the inventors' studies have revealed that it has excellent prebiotic ability. Therefore, it can be expected to be a new functional ingredient in foods, medicines, and cosmetics.
  • galactosylcordibiose in the production of galactosylcordibiose, galactosylcordibiose is isomerized during the process of spray drying a solution containing this sugar and the process of heating concentrating or heat sterilizing the sugar solution. It turns out that there are cases. It is desirable that at least 80% of the galactosylcordibiose is retained even after a process involving heating.
  • the present inventors mixed glucan sucrase, sucrose, and lactose, which is a sugar acceptor in transglycosylation reaction, and performed an enzymatic reaction under appropriate conditions. As a result, it was found that galactosylcordibiose could be obtained in high yield.
  • the present inventors have found that a solution of galactosylcordibiose has high thermal stability on the acidic side, and that the thermal stability tends to decrease when the pH exceeds a specific value.
  • the present invention provides the following [1] An oligosaccharide-containing composition comprising the step of allowing glucan sucrase to act on a composition containing lactose and sucrose to obtain a composition containing galactosylcordibiose. How things are manufactured. [2] The production method according to 1, wherein glucan sucrase is used as lactic acid bacteria or a processed product thereof. [3] The production method according to 2, wherein the lactic acid bacterium is a lactic acid bacterium that constantly expresses glucan sucrase. [4] The production method according to any one of 1 to 3, wherein the glucan sucrase is a bacterial cell-bound type.
  • the lactic acid bacteria or the processed product thereof is any one selected from the group consisting of live bacterial cells, dead bacterial cells, a culture containing bacterial cells, crushed bacterial cells, and a purified product of glucan sucrase. 5.
  • a method for producing an oligosaccharide-containing composition comprising the step of obtaining a composition containing galactosylcordibiose.
  • A a protein consisting of the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to 8;
  • B a protein consisting of an amino acid sequence having high sequence identity with the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to 8 and having glucan sucrase activity;
  • C A protein consisting of an amino acid sequence obtained by substituting, deleting, inserting, and/or adding multiple amino acids in the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to 8, and having glucan sucrase activity.
  • the production method according to 10, wherein the glucan sucrase consists of the following protein (B') or (C').
  • a step of obtaining a composition containing galactosylcordibiose by allowing a lactic acid bacterium expressing glucan sucrase or a treated product thereof to act on a composition containing raw milk and sucrose; and adding a lactic acid bacteria starter to the raw milk.
  • a method for producing fermented milk containing galactosylcodibiose which includes a step of adding and fermenting to obtain fermented milk.
  • An enzyme agent containing glucan sucrase consisting of the following protein (A), (B), or (C).
  • A a protein consisting of the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to 8;
  • B a protein consisting of an amino acid sequence having high sequence identity with the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to 8 and having glucan sucrase activity;
  • C A protein consisting of an amino acid sequence obtained by substituting, deleting, inserting, and/or adding multiple amino acids in the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to 8, and having glucan sucrase activity.
  • the enzyme agent according to 13, wherein the glucan sucrase consists of the following protein (B') or (C').
  • Glucan sucrase is contained as any one selected from the group consisting of live bacterial cells, dead bacterial cells, a culture containing bacterial cells, and crushed bacterial cells of lactic acid bacteria expressing glucan sucrase, 13 or 14.
  • the enzyme agent described in [16] The enzyme preparation according to any one of 13 to 15, used in the production method according to any one of 1 to 12. [17] The enzyme agent according to any one of 13 to 16 for producing glucosyl epilactose. [18] A solution containing galactosylcordibiose and having a pH of less than 7.
  • a composition containing galactosylcordibiose which has a pH of less than 7 when made into a solution with a solid content concentration of 10 to 80%.
  • a composition containing galactosylcordibiose which has the following characteristics. (1) Contains 15-40% galactosylcordibiose based on solid content. (2) Contains 15-45% fructose based on solid content.
  • the present invention provides the following.
  • a method for producing an oligosaccharide-containing composition which includes the step of reacting a composition containing lactose and sucrose with lactic acid bacteria expressing glucan sucrase or a treated product thereof to obtain a composition containing galactosylcordibiose. .
  • the production method according to 1 or 2 wherein the glucan sucrase is a bacterial cell-bound type.
  • the lactic acid bacteria expressing glucan sucrase or a processed product thereof is selected from the group consisting of live bacterial cells, dead bacterial cells, a culture containing bacterial cells, crushed bacterial cells, and a purified product of glucan sucrase.
  • the manufacturing method according to any one of 1 to 7, which is a method for manufacturing a galactosylcodebiose-containing composition, in which galactosylcodebiose is extracted from the obtained composition containing galactosylcodebiose.
  • a manufacturing method including a step of refining.
  • a composition containing galactosylcodibiose obtained by allowing lactic acid bacteria expressing glucan sucrase or a processed product thereof to act on a composition containing lactose and sucrose.
  • a method for producing fermented milk containing galactosylcodibiose which includes a step of adding and fermenting to obtain fermented milk.
  • An enzyme agent containing any one selected from the group consisting of live bacterial cells, dead bacterial cells, a culture containing bacterial cells, and crushed bacterial cells of lactic acid bacteria expressing cell-bound glucan sucrase.
  • the composition containing lactose is raw milk, skim milk, a reduced solution of a dried product containing lactose, skim concentrated milk, whey, milk protein concentrate (MPC), whey protein concentrate (WPC), whey protein isolation 15.
  • the use according to 14 which is any one selected from the group consisting of a milk raw material (WPI), a membrane permeate or membrane retentate derived from a milk raw material, a milk concentrate, and a lactic acid bacteria culture containing lactose.
  • WPI milk raw material
  • a membrane permeate or membrane retentate derived from a milk raw material a milk concentrate
  • a lactic acid bacteria culture containing lactose lactic acid bacteria culture containing lactose.
  • the lactic acid bacterium is a lactic acid bacterium that constantly expresses glucan sucrase.
  • the present invention provides the following.
  • [1] A solution containing galactosylcordibiose and having a pH of less than 7.
  • [3] 1 or 2 obtained by a production method including the step of reacting a composition containing lactose and sucrose with a lactic acid bacterium expressing glucan sucrase or a processed product thereof to obtain a composition containing galactosylcordibiose. or a dried product thereof.
  • a composition containing galactosylcordibiose and glucosyl epilactose are examples of the composition containing galactosylcordibiose and glucosyl epilactose.
  • composition according to 4 further comprising any sugar selected from the group consisting of lactose, fructose, and sucrose, and having a galactosylcordibiose content of 10 to 50% per solid content.
  • 4 or 5 obtained by a production method comprising the step of reacting a composition containing lactose and sucrose with lactic acid bacteria expressing glucan sucrase or a processed product thereof to obtain a composition containing galactosylcordibiose.
  • the composition described in . [7] A composition containing galactosylcordibiose, which has a pH of less than 7 when made into a solution with a solid content concentration of 10 to 80%.
  • 7 or 8 obtained by a production method comprising the step of reacting a composition containing lactose and sucrose with lactic acid bacteria expressing glucan sucrase or a processed product thereof to obtain a composition containing galactosylcordibiose.
  • the composition described in . [10] A composition containing galactosylcordibiose having the following characteristics. (1) Contains 15-40% galactosylcordibiose based on solid content. (2) Contains 15-45% fructose based on solid content. (3) When heated at 120°C for 20 minutes as a solution with a solid content concentration of 12%.
  • the residual rate of galactosylcordibiose is 80% or more
  • a method for producing an oligosaccharide-containing composition [12] Glucosyl epilactose or a composition containing the same.
  • oligosaccharides such as galactosylcodibiose can be efficiently produced using a composition containing sucrose and lactose as raw materials by allowing glucan sucrase to act.
  • by-products such as those produced when producing milk protein concentrate (MPC) can be effectively used.
  • lactic acid bacteria that constantly express glucan sucrase As the lactic acid bacteria that express glucan sucrase, there is no need to add sucrose as an inducer when preparing a crude enzyme solution, and glucan by-products can be prevented. I can do it.
  • a lactic acid bacterium that expresses cell-bound glucan sucrase as the lactic acid bacterium that expresses glucan sucrase, it is possible to prevent glucan sucrase from being secreted into the culture supernatant and diluting it.
  • a solution of galactosylcordibiose or a dried product thereof which has high stability, particularly thermal stability.
  • the present embodiment relates to a method for producing a composition containing an oligosaccharide such as galactosylcordibiose.
  • This production method includes the step of treating a composition containing lactose and sucrose with glucan sucrase, a lactic acid bacterium expressing glucan sucrase, or a treated product thereof to obtain a composition containing galactosylcodebiose.
  • the present invention also relates to an enzyme agent containing lactic acid bacteria expressing glucan sucrase or a processed product thereof.
  • the invention further relates to the use of lactose-containing by-products obtained during the production of dairy products.
  • glucan sucrase refers to an enzyme belonging to the glycoside hydrolase (also called glycosyl hydrolases) family 70 (GH70), unless otherwise specified ((CAZy) databases, and Cantarel et al., Nucleic Acids Res. 37:D233-238, 2009).
  • the lactic acid bacteria used are not particularly limited as long as they produce the desired glucan sucrase.
  • One preferred example is lactic acid bacteria belonging to the Lactobacillaceae family or the Streptococcus family.
  • a taxonomic note on the genus Lactobacillus Description of 23 novel genera, emended description of the genus Lactobacillus Beijerinck 1901, and union of Lactobacillus and Leuconostocaceae. Int J According to the reclassified classification by Syst Evol Microbiol. 2020 Apr; 70(4): 2782-2858.
  • the Lactobacillaceae family includes 31 genera: Genus Lactobacillus, Genus Paralactobacillus, Genus Holzapfelia, Genus Amylolactobacillus, Genus Bombilactobacillus, Genus Companilactobacillus, Genus Rapidilactobacillus ( Genus Lapidilactobacillus, Genus Agrilactobacillus, Genus Schleiferilactobacillus, Genus Loigolactobacillus, Genus Lacticaseibacillus, Genus Latilactobacillus, Genus Dellaglioa.
  • Liquorilactobacillus Liquorilactobacillus, Ligilactobacillus, Lactiplantibacillus, Furfurilactobacillus, Paucilactobacillus, Limosilactobacillus Genus Limosilactobacillus, Genus Fructilactobacillus, Genus Acetilactobacillus, Genus Apilactobacillus, Genus Levilactobacillus, Genus Secundilactobacillus, Genus Lentilactobacillus.
  • lactic acid bacteria belonging to the Lactobacillaceae family lactic acid bacteria belonging to the Lactobacillaceae family excluding lactic acid bacteria belonging to Limosilactobacillus reuteri are used, and preferably lactic acid bacteria belonging to the Lactobacillaceae family excluding lactic acid bacteria belonging to the Limosilactobacillus genus are used.
  • lactic acid bacteria belonging to the Lactobacillaceae family lactic acid bacteria belonging to the genus Liquorilactobacillus are used.
  • Liquorilactobacillus examples include: Liquorilactobacillus aquaticus, Liquorilactobacillus cacaonum, Liquorilactobacillus capillatus, Liquorilactobacillus ghanensis, Liquorilactobacillus hordei, Liquorilactobacillus mali, Liquorilactobacillus nagelii, Liquorilactobacillus oeni, Liquorilactobacillus satsumensis, Liquorilactobacillus sicerae, Liquorilactobacillus sucicola, Liquorilactobacillus uvarum, Liquorilactobacillus vini
  • lactic acid bacteria belonging to the Streptococcus family it is preferable to use lactic acid bacteria belonging to the Streptococcus genus, and more preferably to use lactic acid bacteria belonging to Streptococcus mutans.
  • the lactic acid bacterium Liquorilactobacillus satsumensis is used among the lactic acid bacteria belonging to the genus Liquorilactobacillus.
  • An example of a particularly preferred strain of Liquorilactobacillus satsumensis is strain JCM12392. According to the classification before reorganization, Liquorilactobacillus satsumensis falls under Lactobacillus satsumensis. Therefore, strain JCM12392 is described as Lactobacillus satsumensis in RIKEN BioResource Center, GENERAL CATALOG No. 9, 2012, JAPAN COLLECTION OF MICROORGANISMS, M51. Strain JCM12392 is available from the RIKEN BioResource Center (RIKEN BRC) Japan Collection of Microorganisms (RIKEN BRC-JCM, Japan) under JCM number JCM12392.
  • RIKEN BRC Japan Collection of Microorganisms
  • the lactic acid bacteria used are those that constantly express glucan sucrase.
  • Constantly expressing glucan sucrase means that the gene is expressed without the need for induction by a substrate or the like.
  • a glucan sucrase that is constantly expressed is referred to as a constantly expressed type or constant type, and a glucan sucrase that requires expression induction is referred to as an inducible expression type or inducible type. Whether or not glucan sucrase is constantly expressed can be confirmed by evaluating the mRNA transcription level by qPCR and protein expression level by Western blotting.
  • sucrose is required to express glucan sucrase.
  • sucrose is also a substrate for glucan sucrase, it also participates in the reaction of adding glucose to glucan chains, producing glucan.
  • High molecular weight glucans can make the prepared liquid highly viscous.
  • sucrose is not required during the preparation of lactic acid bacteria expressing glucan sucrase or a processed product thereof, and glucans are not produced.
  • lactic acid bacteria of the genus Leuconostoc are well known as one of the lactic acid bacteria that express glucan sucrase, but the glucan sucrase expressed by the lactic acid bacteria of the genus Leuconostoc is mainly of an inducible type.
  • the lactic acid bacteria used express a cell-bound type of glucan sucrase.
  • a cell-bound type of glucan sucrase it is necessary to confirm the enzyme activity of the bacterial cells and culture supernatant, or to confirm whether the amino acid sequence of the enzyme or its precursor contains a secretion signal. It can be determined by
  • the enzyme can be easily recovered together with the bacterial cells by centrifugation. This is preferable in this respect.
  • glucan sucrases used in this embodiment include glucan sucrases consisting of the following proteins (A), (B), or (C).
  • the glucan sucrase consisting of the protein (A), (B), or (C) below may be in the form of a lactic acid bacterium expressing glucan sucrase or a processed product thereof, and in such a case, the production of the present embodiment may also be carried out. It can be said that glucan sucrase is used in the method.
  • A a protein consisting of the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to 8;
  • B a protein consisting of an amino acid sequence having high sequence identity with the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to 8 and having glucan sucrase activity;
  • C A protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and/or added to the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to 8, and has glucan sucrase activity.
  • the glucan sucrase consists of the following protein (B') or (C').
  • B' An amino acid sequence having high sequence identity with the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 1 to 8, provided that the portion corresponding to positions 450-467, 488-499, and 559-573 of SEQ ID NO: 1 a protein consisting of the same amino acid sequence and having glucan sucrase activity;
  • C' An amino acid sequence obtained by substituting, deleting, inserting, and/or adding one or more amino acids in the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 1 to 8, provided that positions 450-467 of SEQ ID NO: 1 , 488-499, and 559-573 are identical in amino acid sequence, and have glucan sucrase activity.
  • SEQ ID NO: 1 shows the amino acid sequence of GTF21, a constantly expressed and cell-bound glucan sucrase derived from Liquorilactobacillus satsumensis.
  • the parts at positions 450-467, 488-499, and 559-573 are known to be important parts for the activity of glucan sucrase (Non-Patent Document 5: J. Agric. Food Chem. 2011, 59, 4148-4155).
  • SEQ ID NOS: 2-4 show the amino acid sequences of glucan sucrases (GTF68, GTF29, and GFT39, respectively) possessed by L. satsumensis that have sequences other than SEQ ID NO: 1.
  • SEQ ID NO: 5 shows the amino acid sequence of glucan sucrase possessed by Leuconostoc meseteroides (accession number AAB40875).
  • SEQ ID NO: 6 shows the amino acid sequence of glucan sucrase possessed by Leuconostoc citreum (accession number ACY92456).
  • SEQ ID NO: 7 shows the amino acid sequence of glucan sucrase possessed by Streptococcus mutans (accession number AAN58705).
  • SEQ ID NO: 8 shows the amino acid sequence of glucan sucrase possessed by Limosilactobacillus reuteri (accession number AAU08001).
  • sequence identity between each sequence and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is as described below and in FIG. These numbers are calculated by comparing the amino acid sequences of proteins using the BLAST algorithm (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) provided by NCBI (National Center for Biotechnology Information). Calculated by analyzing (BLASTP). Sequence number 2 49% Sequence number 3 62% Sequence number 4 48% Sequence number 5 46% Sequence number 6 45% Sequence number 7 47% Sequence number 8 56%
  • the glucan sucrase used consists of the protein (B) or (C), in which case the glucan sucrase, regardless of the sequence of the other parts, Amino acid (H) corresponding to position 565 of SEQ ID NO: 1, amino acid (D) corresponding to position 566 of SEQ ID NO: 1; Amino acid (S) corresponding to position 567 of SEQ ID NO: 1, One or more, preferably two or more, more preferably three or more, still more preferably all, selected from the amino acid (D) corresponding to position 571 of SEQ ID NO: 1 and the amino acid (Q) corresponding to position 572 of SEQ ID NO: 1.
  • Positions 566 to 567 and 571 to 572 of SEQ ID NO: 1 are important as recognition sites for the acceptor (lactose in the present invention) (Non-Patent Document 5). Positions 565-566 of SEQ ID NO: 1 are highly conserved among glucansucrases.
  • the glucan sucrase used consists of the protein (B) or (C), in which case the glucan sucrase is located at positions 488-493 of SEQ ID NO: 1 (HLSILE), regardless of the sequence of the other parts.
  • HLSILE HLSILE
  • the amino acid (H) corresponding to position 488 of SEQ ID NO: 1 matches the amino acid (E) corresponding to position of SEQ ID NO: 1, regardless of the sequence of other parts.
  • the glucan sucrase used consists of the protein (B) or (C), in which case the glucan sucrase, regardless of the sequence of the other parts, Amino acid (R) corresponding to position 453 of SEQ ID NO: 1, amino acid (D) corresponding to position 455 of SEQ ID NO: 1, Amino acid (A) corresponding to position 456 of SEQ ID NO: 1, and amino acid (D) corresponding to position 458 of SEQ ID NO: 1, One or more selected from, preferably two or more, more preferably three or more, and even more preferably all of them match SEQ ID NO:1.
  • the glucan sucrase used is preferably an enzyme that has the activity of catalyzing the reaction of decomposing sucrose into glucose and fructose and the reaction of adding glucose to glucan chains, and has dextransucrase (EC 2.4.1.5) activity, alternansucrase ( EC 2.4.1.140) activity, reuteransucrase (EC 2.4.1.-) activity, ⁇ -4,6-glucanotransferase (EC 2.4.1.-) activity, ⁇ -1,2-branched dextransucrase (EC 2.4.1.-) ) activity, ⁇ -4,3-glucanotransferase (EC 2.4.1.-) activity, and mutansucrase (EC 2.4.1.372) activity, and preferably has at least dextransucrase ( EC 2.4.1.5) activity is more preferred.
  • whether or not a certain protein has glucansucrase activity is determined by the following factors: dextranssucrase (EC 2.4.1.5) activity, alternansucrase (EC 2.4.1.140) activity, reuteransucrase (EC 2.4.1.-) activity, ⁇ -4,6-glucanotransferase (EC 2.4.1.-) activity, ⁇ -1,2-branched dextransucrase (EC 2.4.1.-) activity, and ⁇ -4,3-glucanotransferase (EC 2.4.1.-) Judgment can be made based on whether or not it has activity. Whether a certain protein has glucan sucrase activity is more preferably determined by whether the protein can have dextransucrase (EC 2.4.1.5) activity.
  • high sequence identity means that the identity value is 45% or more, 46% or more, 47% or more, 48% or more, 49% or more, 50% or more, 56% or more. , 62% or more, preferably 63% or more, 70% or more, more preferably 80% or more, even more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more.
  • identity of amino acid sequences refers to the number of identical amino acids shared between two sequences when the two sequences are aligned in an optimal manner, unless otherwise specified. means percentage.
  • Search and analysis regarding the identity of amino acid sequences can be performed using algorithms or programs well known to those skilled in the art, such as GENETIX (registered trademark) ver. 14 (Genetics Co., Ltd.), BLASTN, BLASTP, BLASTX, and ClustalW. Parameters when using a program can be appropriately set by those skilled in the art, and default parameters for each program may be used. Specific techniques for these analysis methods are also well known to those skilled in the art.
  • the number of substituted amino acids, etc. refers to the number of amino acids substituted, etc.
  • the protein consisting of the amino acid sequence is As long as it has the desired activity, it is not particularly limited, but for glucan sucrase consisting of the sequence SEQ ID NO: 1 consisting of a full-length 1075 amino acid sequence, for example, less than 50% (specifically 537 or less), preferably 37%. or less (specifically 409 or less), more preferably 200 or less, even more preferably 100 or less, even more preferably 50 or less, even more preferably 20 or less, even more preferably 1 to 9. say. If the substitution is with an amino acid with similar properties, there may be a larger number of substitutions. Means for preparing polynucleotides or proteins according to such amino acid sequences are well known to those skilled in the art.
  • the amino acid corresponding to position x (xth from the N-terminus) of a reference sequence is the amino acid that corresponds to , refers to the amino acid corresponding to the amino acid at position x of the reference sequence in sequence S. If the sequence S has one or more amino acids deleted from the reference sequence, the position of this corresponding amino acid in the sequence S will be shifted from the reference sequence and may not be at position x. A person skilled in the art can appropriately determine which amino acid in sequence S corresponds to the amino acid corresponding to position x in the reference sequence.
  • the glucan sucrase used is preferably one that is suitable for mass production of oligosaccharides. Specifically, it is preferable to use a substrate that can sufficiently exhibit its activity even at a high concentration of the substrate. In the mass production of oligosaccharides, from the viewpoint of production efficiency, it is preferable that the production can be carried out efficiently at a higher sucrose concentration.
  • the glucan sucrase used is preferably one whose activity increases with calcium.
  • lactic acid bacteria expressing glucan sucrase or a processed product thereof is not particularly limited as long as it contains glucan sucrase in a state having the desired activity.
  • Preferred examples of lactic acid bacteria expressing glucan sucrase or processed products thereof include live bacterial cells, dead bacterial cells, cultures containing bacterial cells, crushed bacterial cells, and purified products of glucan sucrase. These materials may be in a moist state or may be dried.
  • Preferred examples of lactic acid bacteria expressing glucan sucrase or processed products thereof, which are used in an embodiment in which the glucan sucrase-expressing lactic acid bacteria expresses cell-bound glucan sucrase include live bacterial cells, dead bacterial cells, and bacterial cells. Examples include cultures and crushed bacterial cells.
  • Live bacterial cells can be obtained, for example, by culturing lactic acid bacteria in a commercially available medium, collecting the bacteria from the resulting culture solution, and performing operations such as washing as necessary.
  • the dead bacterial cells can be obtained, for example, by sterilizing a collection of viable bacterial cells by sterilization treatment under conditions that do not inactivate glucan sucrase.
  • a culture containing bacterial cells can be obtained, for example, by culturing lactic acid bacteria in a commercially available medium.
  • the crushed bacterial cells can be obtained, for example, by physically crushing a collection of viable bacterial cells using a homogenizer, ball mill, bead mill, dyno mill, planetary mill, jet mill, French press, cell crusher, etc. It can also be obtained by disrupting the bacterial cell structure by autolysis, enzyme treatment, treatment with chemicals such as surfactants, etc.
  • the degree of purification of the purified product of glucan sucrase is not particularly limited as long as the desired reaction can be performed.
  • the purified product of glucan sucrase may be a highly purified product or a crudely purified product.
  • the purification method is not particularly limited and can be performed using conventional techniques.
  • the origin of the purified glucan sucrase is not particularly limited as long as it can be used as an enzyme to carry out the desired reaction. It may be purified from the cells or culture of lactic acid bacteria, produced and purified as a recombinant, or purified by chemical synthesis.
  • Glucan sucrase a lactic acid bacterium expressing glucan sucrase, or a processed product thereof can be used as a component of an enzyme preparation.
  • glucan sucrase is preferably at least one of a constantly expressed type and a bacterial cell-bound type, and more preferably a constantly expressed type and a bacterial cell-bound type.
  • constantly expressed glucan sucrases and bacterial cell-bound glucan sucrases include glucan sucrases consisting of the proteins (A), (B), or (C) described above.
  • lactic acid bacteria expressing glucan sucrase or a processed product thereof as a component of the enzyme preparation contains glucan sucrase in a state having the desired activity.
  • glucan sucrase itself, it may be live bacterial cells, dead bacterial cells, a culture containing bacterial cells, or crushed bacterial cells. Using this form as a component of an enzyme preparation is particularly suitable when a bacterial cell-bound glucan sucrase is used as a component.
  • Enzyme preparations may contain excipients, buffers, suspending agents, stabilizers, preservatives, preservatives, physiological saline, etc. in addition to glucan sucrase, lactic acid bacteria expressing glucan sucrase, or processed products thereof. good.
  • excipients include starch, dextrin, maltose, trehalose, lactose, D-glucose, sorbitol, D-mannitol, white sugar, glycerol.
  • buffering agents include phosphate, citrate, acetate, and the like.
  • stabilizers include propylene glycol and ascorbic acid.
  • preservatives examples include phenol, benzalkonium chloride, benzyl alcohol, chlorobutanol, methylparaben.
  • preservatives include ethanol, benzalkonium chloride, paraoxybenzoic acid, and chlorobutanol.
  • Glucan sucrase can be produced using lactic acid bacteria or processed products thereof, or can also be produced by other methods. For example, it may be produced by expressing glucan sucrase in a suitable expression system. That is, a suitable host is transformed using a polynucleotide encoding glucan sucrase consisting of the protein (A), (B), or (C) described above, and the resulting transformant is capable of producing glucan sucrase. can be produced.
  • the host include bacteria such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, and lactic acid bacteria, yeast, and filamentous fungi, and can be appropriately selected depending on the type and operability of the recombinant vector.
  • vectors can be used, and examples of such vectors include plasmid vectors, which can be appropriately selected depending on the host, operability, and the like.
  • Glucan sucrase may be produced by chemical synthesis. That is, based on the amino acid sequence information of glucan sucrase consisting of protein (A), (B), or (C) mentioned above, Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method), tBoc method (t-butyloxycarbonyl method) Glucan sucrase can be synthesized according to a chemical synthesis method such as the following method, or can also be synthesized using various commercially available peptide synthesizers.
  • Glucansucrase can be produced by genome editing an organism that has a gene encoding glucansucrase and using the resulting genome-edited organism. Genome editing can upregulate the expression of the gene encoding the glucan sucrase of interest. Examples of genome editing techniques that can be used include ZFN, TALEN, CRISPR/Cas9, and PPR, and those skilled in the art can appropriately select one according to the situation.
  • Enzymes can be used in fields such as food processing. Specific examples include treatment of compositions containing lactose and production of oligosaccharides such as galactosylcordibiose.
  • composition containing lactose and sucrose The manufacturing method of this embodiment uses a composition containing lactose and sucrose.
  • a composition containing lactose and sucrose may be obtained by adding sucrose to a composition containing lactose.
  • the composition containing lactose is preferably a by-product obtained in the manufacturing process of dairy products or milk raw materials, and examples thereof include raw milk, skim milk, reduced liquid of dry matter containing lactose, skim concentrated milk, whey, and milk protein concentrate.
  • MPC whey protein concentrate
  • WPI whey protein isolate
  • milk-derived membrane permeate also referred to as permeate
  • membrane retentate also referred to as retentate
  • milk concentrate examples include lactic acid bacteria cultures containing lactose.
  • the reduced solution of dry matter containing lactose is a solution prepared by adjusting a dried matter containing lactose derived from known milk, such as whole milk powder, skim milk powder, whey protein concentrate powder, whey protein isolate powder, to an arbitrary concentration. say.
  • membranes used in the production of dairy raw materials include microfiltration membranes (MF membranes), ultrafiltration membranes (UF membranes), nanofiltration membranes (NF membranes), and reverse osmosis membranes (RO membranes).
  • MF membranes microfiltration membranes
  • UF membranes ultrafiltration membranes
  • NF membranes nanofiltration membranes
  • RO membranes reverse osmosis membranes
  • permeate obtained by MF membrane and UF membrane can be preferably used in the production method of the present invention as a composition containing lactose. This is because permeate, which is produced as a by-product in the production of milk raw materials such as MPC, contains a large amount of lactose.
  • NF membrane or an RO membrane is used, the retentate contains lactose.
  • the lactose-containing composition uses a by-product during the production of dairy products or milk raw materials.
  • by-products include whey when manufacturing cheese and permeate when manufacturing WPC and MPC.
  • permeate the content of acids such as lactic acid is 1% or less, preferably 0.8% or less, more preferably 0.7% or less, so that the pH for optimal conditions for the enzymatic reaction is maintained. This is preferable because no adjustment is required.
  • glucan sucrase has the activity of catalyzing the reaction of decomposing sucrose into glucose and fructose and the reaction of adding glucose to glucan chains.
  • lactose which is the main component of whey or protein membrane concentrated permeate
  • lactose which is the main component of whey or protein membrane concentrated permeate
  • galactosylcordibiose which has a cordibiose skeleton
  • the present invention utilizes such an enzymatic reaction.
  • the concentration of lactose can be set as appropriate as long as the desired product is obtained.
  • the concentration of lactose can be, for example, 3.0% or more, preferably 6.0% or more, more preferably 12% or more, still more preferably 15% or more, and even more preferably 20% or more. % or more. Moreover, it can be 40% or less, may be 30% or less, or may be 17% or less.
  • the concentration of sucrose can be adjusted as appropriate as long as the desired product is obtained.
  • the concentration of sucrose can be, for example, 5.0% or more, preferably 10% or more, more preferably 30% or more, and still more preferably 50%. Moreover, it can be 64% or less, preferably 60% or less, more preferably 56% or less, and still more preferably 52% or less.
  • concentrations and ratios of components are indicated, unless otherwise specified, they are indicated as values based on mass.
  • the ratio of sucrose and lactose can be adjusted as appropriate as long as the desired product can be obtained.
  • the ratio of sucrose to lactose (sucrose: lactose) can be, for example, 0.5:1 to 11:1, preferably 0.7:1 to 9:1, and more preferably 0.8 :1 to 6:1, more preferably 1:1 to 4:1.
  • a lactic acid bacterium expressing glucan sucrase or a processed product thereof When a lactic acid bacterium expressing glucan sucrase or a processed product thereof is allowed to act on a composition containing lactose and sucrose, the concentration of the lactic acid bacterium expressing glucan sucrase or a processed product thereof may be adjusted as appropriate as long as the desired product is obtained. It can be done.
  • lactic acid bacteria expressing glucan sucrase are used as live bacteria, the lactic acid bacteria are cultured under appropriate conditions, collected from the resulting culture solution, washed as necessary, and then diluted to 0.2 to 2 times the original culture solution. A suspension of bacteria by adding a certain amount of buffer can be used as the glucan sucrase-expressing lactic acid bacteria or a processed product thereof.
  • Such a suspension of lactic acid bacteria has a concentration of 1.0 to 25%, preferably 2.0 to 20%, more preferably 3.0 to 18%, and still more preferably 4.0 to 15%. It can be added to the system so that Alternatively, a concentrate obtained by culturing lactic acid bacteria under appropriate conditions and concentrating the culture solution can be used as the glucan sucrase-expressing lactic acid bacteria or a processed product thereof. Such lactic acid bacteria concentrate should be added to the system at a concentration of 0.01 to 10%, preferably 0.05 to 5%, 0.1 to 3%, and 0.2 to 0.6%. I can do it.
  • a system in which lactic acid bacteria expressing glucan sucrase or a processed product thereof acts on a composition containing lactose and sucrose may contain a component that increases the activity of glucan sucrase, or a component that inhibits the activity. Preferably not.
  • the glucan sucrase is a glucan sucrase composed of the above-mentioned proteins (A), (B), or (C)
  • an example of a component that increases glucan sucrase activity is calcium
  • an example of a component that inhibits glucan sucrase is iron ions.
  • glucan sucrase lactic acid bacteria expressing glucan sucrase, or processed products thereof are allowed to act on a composition containing lactose and sucrose.
  • the pH can be from 3.5 to 7.0, preferably from 4.0 to 6.5, more preferably from 4.5 to 6.0.
  • the temperature can be 4-55°C, preferably 20-52°C, more preferably 30-51°C, even more preferably 46-50°C.
  • the time period for which glucan sucrase, or lactic acid bacteria expressing glucan sucrase, or a treated product thereof, is allowed to act on a composition containing lactose and sucrose can be set so as to sufficiently obtain the desired purified product.
  • the time for this is usually 4 to 96 hours, preferably 6 to 80 hours, more preferably 8 to 72 hours, and still more preferably 12 to 64 hours.
  • composition containing galactosylcodibiose, final product includes the step of treating a composition containing lactose and sucrose with glucan sucrase, a lactic acid bacterium expressing glucan sucrase, or a treated product thereof to obtain a composition containing galactosylcordibiose.
  • the production method of the present invention can be implemented for the purpose of producing various oligosaccharide-containing compositions.
  • the desired final product oligosaccharide is, for example, one selected from the group consisting of cordibiose and oligosaccharides having cordibiose as a constituent sugar.
  • cordibiose when referring to an oligosaccharide having cordibiose as a constituent sugar, cordibiose itself is not included.
  • “any” means “at least one" unless otherwise specified.
  • oligosaccharides containing cordibiose as a constituent sugar include galactosylcordibiose, which is a trisaccharide, and tetrasaccharide, in which one molecule of a monosaccharide such as glucose is bonded to galactosylcordibiose.
  • galactosyl cordibiose refers to cordibiose with galactose ⁇ or ⁇ bonded to any of positions 1 to 8 of cordibiose below, unless otherwise specified.
  • galactose can bind to the OH at position 8 in four ways: ⁇ - ⁇ , ⁇ - ⁇ , ⁇ - ⁇ , and ⁇ - ⁇ , and in two ways to the OH at positions 2 to 7. Therefore, it is assumed that there are 18 types of galactosylcodibiose.
  • one of the galactosylcodebioses produced is ⁇ -D-glucopyranosyl-(1 ⁇ 2)-[ ⁇ -D-galactopyranosyl-(1 ⁇ 4)-]D-glucopyranoside).
  • This sugar can also be written as a type of glucosyllactose.
  • glucosyllactose refers to glucose bound to lactose, unless otherwise specified. More specifically, it refers to one selected from those in which glucose is ⁇ - or ⁇ -linked to any of positions 1 to 8 of lactose below.
  • glucose can be bound to the OH at position 1 in four ways: ⁇ - ⁇ , ⁇ - ⁇ , ⁇ - ⁇ , and ⁇ - ⁇ , and to the OH at positions 2 to 7 in two ways. Therefore, 18 types of glucosyllactose are assumed.
  • ⁇ -D-glucopyranosyl-(1 ⁇ 2)-[ ⁇ -D-galactopyranosyl-(1 ⁇ 4)-]D-glucopyranoside is a substance in which glucose is ⁇ -bonded to the OH at position 8 (8 ⁇ form).
  • Glucosyllactose which is not this sugar, can be produced.
  • 17 types of glucosyllactose other than this sugar (1 ⁇ - ⁇ form, 1 ⁇ - ⁇ form, 1 ⁇ - ⁇ form, 1 ⁇ - ⁇ form, 2 ⁇ form, 2 ⁇ form, 3 ⁇ form, 3 ⁇ form, 4 ⁇ form, 4 ⁇ form) 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, or 17 may be produced.
  • the composition obtained by the step of allowing glucansucrase, or a lactic acid bacterium expressing glucansucrase, or a processed product thereof to act on a composition containing lactose and sucrose may contain unreacted lactose in addition to galactosylcordibiose. and may also contain fructose produced from the breakdown of sucrose. The amount of fructose in the resulting composition is usually at least equimolar to that of galactosylcordibiose.
  • the composition may also contain a tetrasaccharide in which one molecule of a monosaccharide such as glucose is bound to the trisaccharide galactosylcordibiose.
  • the production method of the present invention may be explained using an example in which the final product, the oligosaccharide-containing composition, is a galactosylcordibiose-containing composition.
  • the explanation also applies to the case of producing a composition containing a tetrasaccharide in which one molecule of a monosaccharide such as glucose is bound to galactosylcordibiose.
  • a composition containing a tetrasaccharide in which one molecule of a monosaccharide such as glucose is bound to galactosylcordibiose.
  • galactosylcordibiose by appropriately replacing it with a tetrasaccharide in which one molecule of a monosaccharide such as glucose is bound to galactosylcordibiose.
  • the composition obtained by the manufacturing method can be in various forms.
  • the form of the composition may be the obtained reaction liquid as it is, or it may be in the form of a concentrate, frozen product, or dried product after passing through the purification process described below if necessary.
  • the dried product can be in the form of powder or granules.
  • the resulting composition can be used as a sweetener, taste improver, quality improver, stabilizer, anti-discoloration agent, excipient, or functional ingredient described below in the fields of foods, cosmetics, pharmaceuticals, etc. be able to.
  • Foods and drugs include not only those for humans but also those for non-human animals, unless otherwise specified. Unless otherwise specified, food includes general foods, functional foods, and nutritional compositions, as well as therapeutic foods (foods that serve the purpose of treatment. Foods include meals prepared by a doctor and prepared by a nutritionist, etc.). ), diet food, ingredient-adjusted food, nursing care food, and treatment support food. Foods include not only solid foods but also liquid foods, such as beverages, drinks, liquid foods, and soups, unless otherwise specified.
  • the composition can also be used as a functional ingredient.
  • cordibiose and oligosaccharides containing cordibiose as a constituent sugar such as galactosyl cordibiose
  • the composition obtained by the production method of the present invention can be used to promote the growth of Parabacteroides bacteria in the intestinal flora, and thus can be used to promote the growth of Bifidobacterium bacteria in the intestinal flora.
  • composition of The products can be used for the treatment of these diseases, as well as for the treatment of other diseases or conditions that are ameliorated by promoting the growth of Parabacteroides bacteria in the intestine.
  • the composition can be expected to promote mineral absorption and regulate the intestines. It can be used to treat other conditions that are improved by promoting the growth of Bifidobacterium bacteria.
  • composition can be used as a prebiotic or synbiotic.
  • the production method of the present invention includes, in addition to the step of reacting glucan sucrase, or lactic acid bacteria expressing glucan sucrase, or a treated product thereof, on a composition containing lactose and sucrose to obtain a composition containing galactosylcodibiose. It may further include various steps.
  • the manufacturing method may further include a purification step.
  • target components to be purified in the purification step include galactosylcordibiose and tetrasaccharides in which one molecule of monosaccharide such as glucose is bonded to galactosylcordibiose.
  • the purification step may include, for example, treatment with activated carbon, separation by chromatography, treatment with ion exchange resin, filtration, concentration, crystallization, crystal separation, drying, cooling, temperature control, humidity control, and the like.
  • the degree of purification is not particularly limited.
  • the purity of galactosylcodibiose can be 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, 95% or more, 97% or more It can be.
  • the manufacturing method may further include a pH adjustment step.
  • the agent for pH adjustment used in the pH adjustment step is not particularly limited as long as it is suitable for producing foods, medicines, and cosmetics. Examples include organic acids such as citric acid, malic acid, gluconic acid, succinic acid, ascorbic acid, tartaric acid, lactic acid, fumaric acid, inorganic acids such as phosphoric acid, and salts thereof. Adjusting the resulting composition to an appropriate pH may be important for stabilizing the desired components included.
  • the pH can be adjusted to, for example, pH 3.0 to 8.0, may be pH 4.0 to 7.0, or may be pH 4.5 to 6.0.
  • the manufacturing method further includes a sterilization step.
  • the stage of performing the sterilization process is not particularly limited, and the sterilization process may be performed multiple times as necessary.
  • a composition containing lactose and sucrose can be sterilized before acting with glucan sucrase, a lactic acid bacterium expressing glucan sucrase, or a treated product thereof.
  • the resulting composition containing galactosylcordibiose can be sterilized under conditions that inactivate glucan sucrase.
  • the composition may be sterilized before the concentration step.
  • the means for sterilization is not particularly limited as long as it does not affect the target components. Examples include heat sterilization (UHT sterilization, retort sterilization, etc.) and ultraviolet sterilization.
  • a method for producing galactosylcodibiose-containing fermented milk comprising the following steps: An enzyme treatment step in which a lactic acid bacterium expressing glucan sucrase or a treated product thereof is applied to a composition containing raw milk and sucrose to obtain a composition containing galactosylcordibiose; and a lactic acid bacteria starter is added to the raw milk. Fermentation process of adding and fermenting to obtain fermented milk
  • the order of the enzyme treatment step and fermentation step is not particularly limited.
  • a lactic acid bacteria starter may be further added to perform the fermentation treatment step, or after performing the fermentation step, lactic acid bacteria expressing glucan sucrase or a processed product thereof may be further added to produce the enzyme. Processing may be performed. Through such a process, galactosylcordibiose can be contained in fermented milk without external addition.
  • raw milk examples include raw milk, cow's milk, special milk, skim milk, partially skimmed milk, and mixtures of any of these.
  • the lactic acid bacteria used as a starter are not particularly limited as long as they are suitable for producing fermented milk.
  • Lactobacillus delbrueckii is used.
  • Lactobacillus delbrueckii it is preferable to use those classified as Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus.
  • Streptococcus thermophilus may be used. Lactobacillus delbrueckii and Streptococcus thermophilus may be used in combination.
  • a method for producing a milk concentrate containing galactosylcordibiose comprising the following steps: A step of allowing glucan sucrase, or lactic acid bacteria expressing glucan sucrase, or a processed product thereof to act on a composition containing raw material skim concentrated milk and sucrose to obtain skimmed concentrated milk containing galactosylcodibiose; Optionally, drying the obtained skim concentrated milk
  • the milk concentrate obtained in this embodiment for example, concentrated milk (concentrated raw milk, cow's milk, or special milk, The solid content is 25.5% or more and the milk fat content is 7.0% or more), skim concentrated milk (concentrated raw milk, milk or special milk from which the milk fat has been removed) , non-fat milk solids content is 18.5% or more, and the number of bacteria (per 1 g by standard plate culture method) is 100,000 or less), as well as raw milk, milk, or concentrated special milk.
  • ⁇ Embodiment 2 Composition containing galactosylcordibiose etc.> This embodiment relates to a solution containing galactosylcordibiose and a composition containing galactosylcordibiose and glucosyl epilactose, the pH of which is below a certain value.
  • composition (Galactosylcordibiose, pH of solution, content)
  • composition of this embodiment comprises galactosylcordibiose (as previously defined herein).
  • the composition contains ⁇ -D-glucopyranosyl-(1 ⁇ 2)-[ ⁇ -D-galactopyranosyl-(1 ⁇ 4)-]D-glucopyranoside), which is one of galactosylcordibiose. .
  • This ⁇ -D-glucopyranosyl-(1 ⁇ 2)-[ ⁇ -D-galactopyranosyl-(1 ⁇ 4)-]D-glucopyranoside is expressed as 4-galactosylcordibiose or 4'-galactosylcordibiose. Sometimes. It may also be expressed as a type of glucosyllactose (as defined herein).
  • the composition contains a sugar other than this sugar, regardless of whether it contains this ⁇ -D-glucopyranosyl-(1 ⁇ 2)-[ ⁇ -D-galactopyranosyl-(1 ⁇ 4)-]D-glucopyranoside.
  • glucosyllactose Specifically, the composition contains 17 types of glucosyllactose other than this sugar (1 ⁇ - ⁇ form, 1 ⁇ - ⁇ form, 1 ⁇ - ⁇ form, 1 ⁇ - ⁇ form, 2 ⁇ form, 2 ⁇ form, 3 ⁇ form, 3 ⁇ form, 4 ⁇ body, 4 ⁇ body, 5 ⁇ body, 5 ⁇ body, 6 ⁇ body, 6 ⁇ body, 7 ⁇ body, 7 ⁇ body, 8 ⁇ body). , 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, or 17.
  • the content of galactosylcodibiose in the composition is not particularly limited.
  • the solid content can be 10% or more, 15% or more, preferably 20% or more, more preferably 25% or more, and still more preferably 30% or more. preferable.
  • the upper limit is not particularly limited, but may be, for example, 100%, 99% or less, 80% or less, 70% or less, or 50% or less. It may be 40% or less.
  • the content of galactosylcordibiose in the composition can be 10 to 50% based on solid content, more preferably 15 to 40%, and even more preferably 30 to 40%.
  • the content or concentration of a component when expressed numerically, the value is based on mass, unless otherwise specified.
  • the composition is a solution (sugar solution) with a pH of less than 7.
  • it has a pH of less than 7 when made into a solution with a solid content concentration of 10 to 80%.
  • the pH can be, for example, 2 or more, 2.5 or more, 3 or more, preferably 3 or more and 6 or less, and more preferably 4 or more and 6 or less. This range is because galactosylcordibiose has higher thermal stability.
  • the pH of the solution can, if appropriate, be determined based on a 12% solids concentration of the solution.
  • pH can be measured by the usual measuring method in this field.
  • the composition is a concentrate, frozen product, or dried product containing galactosylcordibiose, which has a pH of less than 7 when made into a solution (aqueous solution) with a solid content concentration of 10 to 80%.
  • dried product refers to a solution obtained by drying the solution until the water content is 7% or less, preferably 5% or less.
  • the water content can be measured by an official method for measuring the water content of sugars in the food field or the Japanese Agriculture, Forestry and Fisheries Standards (JAS). Examples of dry products include powders and granules.
  • the pH can be, for example, 2 or more, 2.5 or more, and 3 or more. It is preferably 3 or more and 6 or less, more preferably 4 or more and 6 or less. This range is because galactosylcordibiose has higher thermal stability.
  • the pH of the solution can, if appropriate, be determined based on a 12% solids concentration of the solution.
  • the solid content concentration refers to the concentration of solid content dissolved in a solution.
  • Solids concentration can be measured by conventional methods in the art. Solids concentration can be expressed as Brix value or sugar content, where appropriate. Brix value and sugar content can be measured using known measuring methods as appropriate, and are generally measured using commercially available equipment (for example, digital refractometer brand name "RX-5000 ⁇ " (manufactured by Atago Corporation)). can do.
  • High thermal stability means that the residual rate of galactosylcordibiose when heated as a solution with a solid content concentration of 12% at 120 ° C. for 20 minutes is 80% or more, preferably 90% or more, More preferably, it is 95% or more.
  • the solid content concentration of the solution is not particularly limited, but is, for example, 10% or more, preferably 30% or more, and more preferably 50% or more. , more preferably 60 or more.
  • the upper limit is not particularly limited, but may be, for example, 80% or less, 78% or less, or 76% or less.
  • the solid content is mainly composed of sugars, but may contain components other than sugars. Examples of components other than sugars include enzymes used in the production method described below and agents for adjusting pH. Components other than sugars have a small contribution and may be ignored.
  • composition In addition to galactosylcordibiose, the composition also contains glucosyl epilactose, more specifically glucosyl epilactose ( ⁇ -D-Glcp-(1 ⁇ 2)-[ ⁇ -D-Galp-(1 ⁇ 4)-]D- Manp). This sugar is sometimes written as 2-glucosyl epilactose.
  • glucosyl epilactose refers to a trisaccharide having the following structure, unless otherwise specified.
  • composition may further contain the aforementioned ⁇ -D-glucopyranosyl-(1 ⁇ 2)-[ ⁇ -D-galactopyranosyl-(1 ⁇ 4)-]D-glucopyranoside, and may also include Regardless of whether or not it may contain glucosyllactose other than this sugar.
  • Glucosyl epilactose is a novel compound discovered by the present inventors to be produced in a solution of heat-treated galactosylcodibiose.
  • Glucosyl epilactose can be produced by adjusting a composition containing galactosylcodibiose to pH 7 or higher and then heating it at 100°C or higher, preferably 110°C or higher.
  • the content of glucosyl epilactose is not particularly limited, but is, for example, 5% or less, preferably 3% or less, more preferably 1% or less, and even more preferably 0.1% based on solid content. % or less.
  • the lower limit is not particularly limited, but is, for example, 0.001% or more, 0.01% or more, or 0.05% or more per solid content.
  • the mass ratio of galactosylcodibiose to glucosyl epilactose is not particularly limited, but is, for example, 99.99:0.01 to 80: 20, and may be 99.9:0.1 to 85:15, or may be 99:1 to 90:10.
  • composition may also further contain any sugar selected from the group consisting of lactose, fructose, and sucrose.
  • any means “at least one” unless otherwise specified.
  • the content of fructose is not particularly limited, but may be contained in an amount of, for example, 5% or more, preferably 15% or more, more preferably 20% or more, and even more preferably 30% or more based on the solid content. .
  • the upper limit is not particularly limited, but is, for example, 45% or less, 40% or less, or 35% or less based on solid content.
  • the purity of galactosylcodibiose is high, the content of fructose should be small, and it is preferable that it is not included.
  • the mass ratio of galactosylcodibiose to fructose is not particularly limited, but is, for example, from 15 to 40:15 to 45, and from 17 to 37:17. 37, or 20-35:25-40.
  • the content of lactose is not particularly limited, but may be contained, for example, at 30% or less, preferably at 25% or less, more preferably at 20% or less, even more preferably at 15% or less, based on solid content.
  • the lower limit is not particularly limited, but is, for example, 1% or more, 5% or more, or 10% or more based on solid content.
  • the purity of galactosylcodibiose is high, the content of lactose should be small, and it is preferable that it is not contained.
  • the mass ratio of galactosylcordibiose to lactose is not particularly limited, but is, for example, 15-40:15-30, 17-37:17- 37, or 20-35:20-25.
  • the content of sucrose is not particularly limited, but per solid content, for example, 30% or less, preferably 25% or less, more preferably 20% or less, still more preferably 15% or less, It may be contained in an amount of 10% or less, 5% or less, 1% or less, 0.5% or less, 0.2% or less, or 0.1% or less.
  • the lower limit is not particularly limited, but may be, for example, 0.01% or more, 0.5% or more, 1% or more, 5% or more, or 10% or more per solid content.
  • all of the sucrose may be used for the reaction and may be below the detection limit.
  • the mass ratio of galactosylcordibiose to sucrose is not particularly limited, but is, for example, 15-40:15-30, 17-37 : may be from 17 to 37, or from 20 to 35: from 20 to 25.
  • composition may also contain a tetrasaccharide in which one molecule of a monosaccharide such as glucose is bound to the trisaccharide galactosylcordibiose.
  • One of the preferred embodiments is a composition containing galactosylcordibiose having the following characteristics. (1) Contains 15-40% galactosylcordibiose based on solid content. (2) Contains 15-45% fructose based on solid content. (3) When heated at 120°C for 20 minutes as a solution with a solid content concentration of 12%. The residual rate of galactosylcodibiose is 80% or more
  • the above composition may further have the following characteristics. (4) Contains 5-30% lactose per solid content
  • the above composition may further have the following characteristics instead of (3) or in addition.
  • (6) pH is less than 7 when made into a solution with a solid content concentration of 10 to 80%
  • Such a composition has high stability and is suitable for processing. It can also be expected to be suitable for long-term storage and distribution. Furthermore, it can be useful because it has excellent taste and is lower in calories than the same amount of sucrose.
  • the composition can be in various forms.
  • One of the preferred embodiments is a solution.
  • the composition is produced by the production method described below, that is, by treating a composition containing lactose and sucrose with glucan sucrase, a lactic acid bacterium expressing glucan sucrase, or a processed product thereof, and producing galactosylcodibiose. It may also be a solution (sometimes referred to as a reactant) obtained by a manufacturing method including a step of obtaining a composition containing the compound.
  • the solution can be concentrated, frozen, or dried.
  • dried product refers to a solution obtained by drying the solution until the water content is 7% or less, preferably 5% or less.
  • the water content can be measured by an official method for measuring the water content of sugars in the food field or the Japanese Agriculture, Forestry and Fisheries Standards (JAS). Examples of dry products include powders and granules.
  • compositions containing galactosylcordibiose can be used as sweeteners, taste improvers, quality improvers, stabilizers, anti-discoloration agents, excipients, or functional ingredients described below in foods, cosmetics, pharmaceuticals, etc. It can be used in the field.
  • the description in the (Applications) section of ⁇ Method for producing a composition containing galactosylcordibiose, etc.> above applies as is to the composition of this embodiment.
  • Glucosyl epilactose which may be included in the composition of one embodiment, is expected to be useful as a precursor of epilactose, which has been reported to be a promising prebiotic (Non-Patent Document 5, listed below). Therefore, the composition is used not only to obtain glucosyl epilactose but also to obtain a precursor of epilactose.
  • the composition containing galactosylcordibiose of this embodiment can be produced by various methods.
  • glucan sucrase, or a lactic acid bacterium expressing glucan sucrase, or a processed product thereof is allowed to act on a composition containing lactose and sucrose to obtain a composition containing galactosylcodebiose.
  • Examples include manufacturing methods including steps.
  • the method for producing the composition of this embodiment may further include a pH adjustment step. If the pH is less than 7, it is not necessary to adjust it, but such a step of checking the pH can also be called a pH adjustment step.
  • the agent for pH adjustment used in the pH adjustment step is not particularly limited as long as it is suitable for producing foods, medicines, and cosmetics. Examples include organic acids such as citric acid, malic acid, gluconic acid, succinic acid, ascorbic acid, tartaric acid, lactic acid, fumaric acid, inorganic acids such as phosphoric acid, and salts thereof. Adjusting the resulting composition to an appropriate pH may be important for stabilizing the desired components included.
  • the pH can be adjusted to less than 7, for example. This is because if the pH is less than 7, galactosylcordibiose has high thermal stability.
  • the pH can be, for example, 2 or more, 2.5 or more, 3 or more, preferably 3 or more and 6 or less, and more preferably 4 or more and 6 or less. This range is because galactosylcordibiose has higher thermal stability.
  • the pH of the solution can, if appropriate, be determined based on a 12% solids concentration of the solution.
  • Example 1 Production of galactosylcordibiose using lactose
  • Lactobacillus satsumensis JCM12392 was cultured overnight at 30°C using a commercially available MRS liquid medium, and then cooled to 10°C or lower to terminate the culture.
  • Example 2 Production of galactosylcodibiose using whey powder
  • the enzymatic reaction was carried out under the same enzyme reaction conditions as shown in Example 1 except that 20 w/w% of whey powder (Meiji Co., Ltd.) (containing 75% lactose) was added instead of lactose.
  • Example 3 Purification of trisaccharide and tetrasaccharide fractions
  • a fraction consisting of trisaccharides containing 4'-galactosylcordibiose as a main component, and a fraction consisting of 4'-galactosylcordibiose with an additional 1 glucose A molecularly bound tetrasaccharide fraction was obtained ( Figure 2).
  • Example 4 Lactase treatment and structural analysis of fractionated purified product
  • the purified trisaccharide fraction was lyophilized and dissolved in phosphate-citrate buffer at pH 6.5 at a concentration of 10%. 0.1% lactase (product name: GODO-YNL, Godo Shusei Co., Ltd.) was added thereto, and an enzymatic reaction was performed at 40°C.
  • lactase product name: GODO-YNL, Godo Shusei Co., Ltd.
  • an enzymatic reaction was performed at 40°C.
  • LCMS analysis using an amide column BEH Amide, Waters
  • cordibiose a disaccharide in which glucose is linked to each other through ⁇ -1,2 bonds; elution time was 7.75 minutes
  • Example 5 Fermented milk containing galactosylcodibiose
  • Lactobacillus satsumensis JCM12392 activated and cultured in a commercially available MRS liquid medium was subcultured at 1% into the following medium, and the pH was adjusted to 6.4 in a jar fermenter. After culturing at 30°C for 27 hours while keeping the pH constant with sodium hydroxide, the culture was incubated at 10°C. The culture was completed by cooling to the following temperature.
  • Liquorilactobacillus satsumensis concentrate a concentrate of bacteria that produces the amino acid sequence of enzyme protein: SEQ ID NO:1 with a 15-fold concentration of bacteria is obtained. It was made into an enzyme solution.
  • Raw milk is prepared by mixing 500.0 g of raw milk, 53.2 g of skim milk powder, 23.0 g of fresh cream, 403.6 g of tap water, and 50 g of sucrose.
  • the raw milk is heat sterilized at a temperature of 95°C, and the heat sterilized raw milk is cooled. Thereafter, 0.5% Liquorilactobacillus satsumensis concentrate (enzyme solution) is inoculated into the raw milk, and after fermentation is performed under static conditions at 48°C for 18 hours, Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus are added as lactic acid bacteria starters.
  • the amount of lactic acid bacteria starter added was 20 g.
  • the raw milk to which the lactic acid bacteria starter was added was filled into a cup container (capacity: 100 ml, made of plastic).
  • the raw milk filled in a cup container is left to ferment in a fermentation chamber at a temperature of 43° C. until the lactic acid acidity reaches 0.7%.
  • Example 6 Evaluation of thermal stability of aqueous solution
  • a buffer solution of each pH 100 mM citrate phosphate buffer for pH 3 to 6, 100 mM phosphate buffer for pH 6 to pH 8
  • the purified fractionated galactosylcodibiose obtained in Example 3 was purified. It was dissolved at 12°Bx (12wt%). This was heat-treated for 20 minutes at 60°C, 80°C, 100°C, and 120°C using an autoclave apparatus, and the residual rate of galactosylcodebiose was evaluated.
  • Figure 5 shows the peak areas for each temperature treatment condition, with the 60°C heat treatment condition where no attenuation was observed in galactosylcordibiose at any pH being taken as 100.
  • Example 7 Identification of new sugar
  • the molecular structure of the compound produced by the heat treatment was estimated by an LC/MS method using an amide column (ACQUITY UPLC BEH Amide Column, 130 angstrom, 1.7 ⁇ m, 2.1 mm x 100 mm, Waters).
  • the purified fractionated galactosylcodibiose solution obtained in Example 3 was heat-treated, and 0.1% ⁇ -galactosidase (lactase) GODO-YNL was added to the generated compound (lower of Figure 6).
  • the enzymatic reaction was then carried out at 40°C.
  • the compound produced by heat treatment is glucosyl epilactose ( ⁇ -D-Glcp-(1 ⁇ 2)-[ ⁇ -D-Galp-(1 ⁇ 4)-]D-Manp).
  • Non-Patent Document 5 Prebiotic properties of epilactose. J Dairy Sci. 2008 Dec;91 (12):4518-26.).
  • Example 8 Preparation of pH-adjusted sugar solution and its dried product
  • the obtained sugar solution having a pH of 7 or less can be dried by a conventional method to prepare a powder.
  • the present invention provides foods containing oligosaccharides such as galactosylcodibiose and methods for producing the foods. Furthermore, the present invention can be expected to improve the nutrition of various people, ensure healthy lifestyles, and promote welfare.

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Abstract

乳製品の製造に伴う副産物を有効に利用する方法を提供する。また優れたプレバイオティクス能を有するガラクトシルコージビオースを製造する方法を提供することを課題とする。加熱した場合であっても、ガラクトシルコージビオースの少なくとも８０％が保たれる、ガラクトシルコージビオースを含む溶液及び組成物を提供することを課題とする。乳糖、及びショ糖を含む組成物に、グルカンスクラーゼを作用させ、ガラクトシルコージビオースを含む組成物を得る工程を含む、オリゴ糖含有組成物の製造方法を提供する。膜結合型のグルカンスクラーゼを定常的に発現する乳酸菌を用いることが好ましい。ｐＨが７未満である、ガラクトシルコージビオースを含む溶液、及びガラクトシルコージビオースを含む組成物であって、固形分濃度１０～８０％の溶液としたときのｐＨが７未満である、組成物とする。

Description

組成物の製造方法、それにより得られるオリゴ糖含有組成物、及びそれらの利用
　本発明は、ガラクトシルコージビオース等のオリゴ糖を含有する組成物の製造方法、それにより得られるオリゴ糖含有組成物、及びそれらの利用に関する。
　乳糖は、牛乳の糖質の約99.8%を占め、乳製品の製造過程で副産物として比較的多く得られる。乳糖の利用に関し、特許文献１は、オリゴ糖の製造に関するものであり、ガラクトース及び又は乳糖を糖受容体、デンプン部分加水分解物を糖供与体とし、これらガラクトース及び又は乳糖とデンプン加水分解物との混液に、糖転移酵素を作用させ、ガラクトース分子を分子中に含有するオリゴ糖混合物を製造する方法が記載されている。そして、糖転移酵素として、バチルス・マセランス（ＩＦＯ　８４９０、ＩＡＭ　１２２７）等の培養液の上澄液を用いうることが記載されている。
　一方、糖転移酵素としては、乳糖を糖供与体及び糖受容体とするラクターゼや、乳糖を糖受容体とし、他の糖を糖供与体とする酵素などが知られている。後者の一つであるグルカンスクラーゼは、ショ糖を糖供与体として様々な糖に対してグルコースを転移する活性を有する。グルカンスクラーゼは、ある種の微生物が発現することが知られており、その利用に関して幾つかの報告がある。例えば、特許文献２には、少なくとも水、ショ糖、α－グルカン基質、及びα－グルカン基質から少なくとも１つのα－１，２分岐鎖を形成することができるポリペプチドを含む反応組成物について記載されており、このポリペプチドの例として、フルクトバシラス・トロパエオリ等の微生物由来のグルコシルトランスフェラーゼが挙げられている。特許文献３には、発酵乳ベースの製品のテクスチャーを改善するために糖転移酵素を用いることが記載されており、糖転移酵素として、Streptococcus salivarius SK126由来のグルコシルトランスフェラーゼ酵素とその変異体が記載されている。
　また、グルカンスクラーゼを発現する乳酸菌が知られている。例えば、非特許文献１には、Leuconostoc mesenteroidesを用い、ショ糖と乳糖の混合糖培養液から三糖類を得ることについて記載されている。また、非特許文献２は、Lactobacillus属におけるグルカン合成に関するものであり、この文献には、Lactobacillus属の6種類の菌株からのグルカンスクラーゼ遺伝子、酵素、及び生成したグルカンの単離と特性が記載されている。また非特許文献３は、発酵飲料スターター培養物から単離したLactobacillus satsumensisの菌株由来のグルカンスクラーゼによるグルカンの生産に関する。この文献には、この菌株により、ショ糖から主にα-(1→６）結合のＤ－グルコース単位からなる水溶性デキストランと、α－（１→６）結合とα－（１→３）結合の両方のＤ－グルコースユニットを含む、水に溶解しないグルカンが産生されたことが記載されている。さらに非特許文献４は、Lactobacillus reuteri由来の２種類のグルカンスクラーゼ（GtfA及びGtf180）に関する。この文献には、酵素により合成されたグルコシル化乳糖誘導体の構造的特徴が記載されており、両酵素により、乳糖の還元性グルコースユニットにグルコシル残基（α1→2）が結合できたことが記載されている。また、特許文献４には、乳酸菌、該乳酸菌によって合成される酵素、及び該酵素の細胞外多糖類（ＥＰＳ）産物を含有する食用の組成物が記載されている。乳酸菌の好ましい例として、Lactobacillus属の乳酸菌が挙げられており、ＥＰＳは、グルカンスクラーゼ酵素を産生可能である特定の種の乳酸菌による発酵の後に得られるものであることが記載されている。
　他方、コージビオースを構成糖とするガラクトシルコージビオースは、乳糖のグルコースユニットにグルコシル残基が結合した構造を有する。コージビオース及びコージビオースを構成糖とするオリゴ糖に関しては、特許文献５には、分子内にケトアルドヘキソース構造を有する糖質を有効成分として含有する抗炎症剤が記載されており、分子内にケトアルドヘキソース構造を有する糖質の好ましい例として、３－ケトトレハロース、３－ケトコージビオース、３－ケトイソマルトース、３－ケトラクトース、３－ケトマルトース、３－ケトスクロース、及び３－ケトマルチトールが挙げられている。また特許文献６には、コージビオース、コージトリオース、コージビオシルグルコシド、コージテトラオース及びコージトリオシルグルコシドから選ばれる一種又は二種以上を有効成分として含有する生体内脂質調節剤が記載されている。
特開昭４８－９８０９３号公報 ＷＯ２０１７／０９１５３３（特表２０１９－５０５１７１号公報） ＷＯ２０２０／００９８９３ ＷＯ２００４／０１３３４３（特表２００５－５３４３１５号公報） ＷＯ２０１７／０１８３３６（特許第６７２９９１３号公報） 特開２００５－２８１１８８号公報（特許第４７４６２８１号公報）
清酒及び米麹汁中の糖類について.日本釀造協會雜誌 53 (11), 859-854, (1958) Glucan synthesis in the genus Lactobacillus: isolation and characterization of glucansucrase genes, enzymes and glucan products from six different strains-Microbiology (2004), 150, 3681-3690 The production of glucans via glucansucrases from Lactoacillus satsumensis isolated from a fermented beverage starter culture. Gregory L Cote et al., Appl. Microbiol. Biotechnol.(2013) Aug;97(16):7265-73 Structural characterization of glucosylated lactose derivatives synthesized by the Lactobacillus reuteri GtfA and Gtf180 glucansucrase enzymes. Carbohydrate Research 449 (2017) 59-64
　生乳から、チーズ、及び乳タンパク質濃縮物（ＭＰＣ）を製造する際、前者ではホエイ、後者では膜透過液が副産物として発生する。これらは主に乳糖、及びミネラルを含み、家畜飼料などとして利用される場合があるものの、消費量は限定的だといえる。近年では資源の有効活用の観点から、チーズや乳原料製造に伴うこれら副産物の有効活用が以前にも増して求められている。副産物の有効活用の一つとして、副産物中の乳糖に糖転移酵素を作用させ、オリゴ糖を製造することが考えられる。
　一方、オリゴ糖の一つであるガラクトシルコージビオースは、乳糖のグルコースユニットにグルコシル残基が結合した構造を有するが、本発明者らの検討により、優れたプレバイオティクス能を有することが見いだされ、食品、医薬品、及び化粧品における新しい機能性成分として期待できる。しかし、その製造方法についてはほとんど報告がない。
　また本発明者らの検討によると、ガラクトシルコージビオースの製造において、この糖を含む溶液を噴霧乾燥する工程や糖液を加熱濃縮又は加熱殺菌する工程で、ガラクトシルコージビオースが異性化される場合があることが判明した。加熱を伴う工程を経た場合であっても、ガラクトシルコージビオースの少なくとも８０％は保たれていることが望ましい。
　本発明者らは、グルカンスクラーゼと、ショ糖、及び糖転移反応における糖受容体である乳糖とを混合し、適切な条件で酵素反応を行った。その結果、ガラクトシルコージビオースを高収率で得られることを見出した。
　また本発明者らは、ガラクトシルコージビオースの溶液は、酸性側で熱安定性が高く、ｐＨが特定の値を上回ると熱安定性が下がる傾向を見出した。またガラクトシルコージビオースの異性化により生成する糖の化学構造を特定した。
　本発明は、一態様において、以下を提供する
［１］　乳糖、及びショ糖を含む組成物に、グルカンスクラーゼを作用させ、ガラクトシルコージビオースを含む組成物を得る工程
を含む、オリゴ糖含有組成物の製造方法。
［２］　グルカンスクラーゼが、乳酸菌又はその処理物として用いられる、１に記載の製造方法。
［３］　乳酸菌が、グルカンスクラーゼを定常的に発現する乳酸菌である、２に記載の製造方法。
［４］　グルカンスクラーゼが、菌体結合型である、１から３のいずれか１項に記載の製造方法。
［５］　グルカンスクラーゼが、デキストランスクラーゼ活性を有するものである、１から４のいずれか１項に記載の製造方法。
［６］　乳酸菌又はその処理物が、生菌体、死菌体、菌体を含む培養物、菌体破砕物、及びグルカンスクラーゼの精製物からなる群より選択されるいずれかである、２から５のいずれか１項に記載の製造方法。
［７］　グルカンスクラーゼ、又はグルカンスクラーゼを発現する乳酸菌又はその処理物が、ラクトバチラシエ(Lactobacillaceae)科に属する乳酸菌に由来する、１から６のいずれか１項に記載の製造方法。
［８］　グルカンスクラーゼ、又はグルカンスクラーゼを発現する乳酸菌又はその処理物が、リクオリラクトバチルス(Liquorilactobacillus)属に属する乳酸菌に由来する、１から７のいずれか１項に記載の製造方法。
［９］　グルカンスクラーゼ、又はグルカンスクラーゼを発現する乳酸菌又はその処理物が、リクオリラクトバチルス・サツメンシス(Liquorilactobacillus satsumensis)に属する乳酸菌に由来する、１から８のいずれか１項に記載の製造方法。
［１０］　乳糖、及びショ糖を含む組成物に、
下記(A)、（B）、又は(C)のタンパク質からなるグルカンスクラーゼを作用させ、
ガラクトシルコージビオースを含む組成物を得る工程
を含む、オリゴ糖含有組成物の製造方法。
(A)配列番号1～8のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質;
(B)配列番号1～8のいずれか１に記載のアミノ酸配列と高い配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつグルカンスクラーゼ活性を有するタンパク質；
(C)配列番号1～8のいずれか１に記載のアミノ酸配列において複数個のアミノ酸を置換、欠失、挿入、及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、かつグルカンスクラーゼ活性を有するタンパク質。
［１１］　グルカンスクラーゼが、下記(B')、又は(C')のタンパク質からなる、１０に記載の製造方法。
(B')配列番号1～8に記載のアミノ酸配列と高い配列同一性を有するアミノ酸配列であって、ただし、配列番号1の位置450-467、488-499、及び559-573に相当する部分は同一であるアミノ酸配列からなり、かつグルカンスクラーゼ活性を有するタンパク質；
(C')配列番号1～8に記載のアミノ酸配列において複数個のアミノ酸を置換、欠失、挿入、及び/又は付加したアミノ酸配列であって、ただし、配列番号1の位置450-467、488-499、及び559-573に相当する部分の配列は同一であるアミノ酸配列からなり、かつグルカンスクラーゼ活性を有するタンパク質。
［１２］　原料乳、及びショ糖を含む組成物に、グルカンスクラーゼを発現する乳酸菌又はその処理物を作用させ、ガラクトシルコージビオースを含有する組成物を得る工程；及び
　原料乳に、乳酸菌スターターを添加して発酵させ、発酵乳を得る工程
を含む、ガラクトシルコージビオース含有発酵乳の製造方法。
［１３］　下記(A)、（B）、又は(C)のタンパク質からなるグルカンスクラーゼを含む、酵素剤。
(A)配列番号1～8のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質;
(B)配列番号1～8のいずれか１に記載のアミノ酸配列と高い配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつグルカンスクラーゼ活性を有するタンパク質；
(C)配列番号1～8のいずれか１に記載のアミノ酸配列において複数個のアミノ酸を置換、欠失、挿入、及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、かつグルカンスクラーゼ活性を有するタンパク質。
［１４］　グルカンスクラーゼが、下記 (B')、又は(C')のタンパク質からなる、１３に記載の酵素剤。
(B')配列番号1～8に記載のアミノ酸配列と高い配列同一性を有するアミノ酸配列であって、ただし、配列番号1の位置450-467、488-499、及び559-573に相当する部分は同一であるアミノ酸配列からなり、かつグルカンスクラーゼ活性を有するタンパク質；
(C')配列番号1～8に記載のアミノ酸配列において複数個のアミノ酸を置換、欠失、挿入、及び/又は付加したアミノ酸配列であって、ただし、配列番号1の位置450-467、488-499、及び559-573に相当する部分の配列は同一であるアミノ酸配列からなり、かつグルカンスクラーゼ活性を有するタンパク質。
［１５］　グルカンスクラーゼが、グルカンスクラーゼを発現する乳酸菌の、生菌体、死菌体、菌体を含む培養物、菌体破砕物からなる群より選択されるいずれかとして含まれる、１３又は１４に記載の、酵素剤。
［１６］　１から１２のいずれか１項の製造方法に用いる、１３から１５のいずれか１項に記載の酵素剤。
［１７］　グルコシルエピラクトースを製造するための、１３から１６のいずれか１項に記載の酵素剤。
［１８］　ｐＨが７未満である、ガラクトシルコージビオースを含む溶液。
［１９］　ガラクトシルコージビオースを含む組成物であって、固形分濃度１０～８０％の溶液としたときのｐＨが７未満である、組成物。
［２０］　フルクトースを、固形物あたり１０％以上含む、１８に記載の溶液、又は１９に記載の組成物。
［２１］　１から１２のいずれか１項に記載の製造方法により得られる、１８に記載の溶液、又は１９若しくは２０に記載の組成物。
［２２］　以下の特徴を有する、ガラクトシルコージビオースを含む組成物。
（１）ガラクトシルコージビオースを、固形分あたり１５～４０％含む
（２）フルクトースを固形分あたり１５～４５％含む
（３）固形分濃度１２％の溶液として１２０℃、２０分加熱したときのガラクトシルコージビオースの残存率が、８０％以上である
［２３］　グルコシルエピラクトース、又はそれを含む組成物。
［２４］　１から１２のいずれか１項に記載の製造方法であって、得られた組成物のｐＨを７未満に調整する工程をさらに含む、製造方法。
［２５］　１から１２及び２４のいずれか１項に記載のオリゴ糖含有組成物の製造方法であって、オリゴ糖含有組成物が、ガラクトシルコージビオースとフルクトースを含む、製造方法。
［２６］　１から１２、２４及び２５のいずれか１項に記載のオリゴ糖含有組成物の製造方法であって、オリゴ糖含有組成物が、ガラクトシルコージビオースを、固形分あたり１０％以上１００％以下含む、製造方法。
［２７］　１から１２、及び２４から２６のいずれか１項に記載のオリゴ糖含有組成物の製造方法であって、オリゴ糖含有組成物が、さらに、フルクトースを固形分あたり１％以上含むものである、製造方法。
［２８］　１から１２、及び２４から２７のいずれか１項に記載のオリゴ糖含有組成物の製造方法であって、オリゴ糖含有組成物が、ガラクトシルコージビオースと乳糖との質量比（ガラクトシルコージビオース：乳糖）が、１５～４０：１５～３０である、製造方法。
［２９］　１から１２、２４から２８のいずれか１項に記載のオリゴ糖含有組成物の製造方法であって、オリゴ糖含有組成物が、グルコシルエピラクトースを含む、製造方法。
［３０］　１８に記載の溶液、又は１９から２３のいずれか１項に記載のオリゴ糖含有組成物を製造するための、１から６、及び２４から２９のいずれか１項に記載の製造方法。
　本発明は、一態様において、以下を提供する。
［１］　乳糖、及びショ糖を含む組成物に、グルカンスクラーゼを発現する乳酸菌又はその処理物を作用させ、ガラクトシルコージビオースを含む組成物を得る工程
を含む、オリゴ糖含有組成物の製造方法。
［２］　乳酸菌が、グルカンスクラーゼを定常的に発現する乳酸菌である、１に記載の製造方法。
［３］　グルカンスクラーゼが、菌体結合型である、１又は２に記載の製造方法。
［４］　グルカンスクラーゼを発現する乳酸菌又はその処理物が、生菌体、死菌体、菌体を含む培養物、菌体破砕物、及びグルカンスクラーゼの精製物からなる群より選択されるいずれかである、１から３のいずれか１項に記載の製造方法。
［５］　グルカンスクラーゼを発現する乳酸菌又はその処理物が、ラクトバチラシエ(Lactobacillaceae)科に属する乳酸菌に由来する、１から４のいずれか１項に記載の製造方法。
［６］　グルカンスクラーゼを発現する乳酸菌又はその処理物が、リクオリラクトバチルス(Liquorilactobacillus)属に属する乳酸菌に由来する、１から５のいずれか１項に記載の製造方法。
［７］　グルカンスクラーゼを発現する乳酸菌又はその処理物が、リクオリラクトバチルス・サツメンシス(Liquorilactobacillus satsumensis)に属する乳酸菌に由来する、１から６のいずれか１項に記載の製造方法。
［８］　ガラクトシルコージビオース含有組成物の製造方法である、１～７のいずれか１項に記載の製造方法であって、得られたガラクトシルコージビオースを含む組成物から、ガラクトシルコージビオースを精製する工程を含む、製造方法。
［９］　乳糖、及びショ糖を含む組成物に、グルカンスクラーゼを発現する乳酸菌又はその処理物を作用させて得られる、ガラクトシルコージビオースを含む組成物。
［１０］　原料乳、及びショ糖を含む組成物に、グルカンスクラーゼを発現する乳酸菌又はその処理物を作用させ、ガラクトシルコージビオースを含有する組成物を得る工程；及び
　原料乳に、乳酸菌スターターを添加して発酵させ、発酵乳を得る工程
を含む、ガラクトシルコージビオース含有発酵乳の製造方法。
［１１］　菌体結合型のグルカンスクラーゼを発現する乳酸菌の、生菌体、死菌体、菌体を含む培養物、菌体破砕物からなる群より選択されるいずれかを含む、酵素剤。
［１２］　乳酸菌が、グルカンスクラーゼを定常的に発現する乳酸菌である、１１に記載の酵素剤。
［１３］　乳糖を含む組成物を処理するための、１１又は１２に記載の酵素剤。
［１４］　ガラクトシルコージビオースを含む組成物を得るための原料としての、乳糖を含む組成物及びショ糖の使用。
［１５］　乳糖を含む組成物が、生乳、脱脂乳、乳糖を含む乾燥物の還元液、脱脂濃縮乳、ホエイ、乳タンパク質濃縮物（ＭＰＣ）、ホエイタンパク質濃縮物（ＷＰＣ）、ホエイタンパク質単離物（ＷＰＩ）、乳原料由来の膜透過液又は膜保持液、乳濃縮物、乳糖を含む乳酸菌培養物からなる群より選択されるいずれかである、１４に記載の使用。
［１６］　グルカンスクラーゼを発現する乳酸菌又はその処理物によりガラクトシルコージビオースを得るための、１４又は１５に記載の使用。
［１７］　乳酸菌が、グルカンスクラーゼを定常的に発現する乳酸菌である、１６に記載の使用。
［１８］　グルカンスクラーゼが、菌体結合型である、１６又は１７に記載の製造方法。
　本発明は、一態様において、以下を提供する。
［１］　ｐＨが７未満である、ガラクトシルコージビオースを含む溶液。
［２］　溶液中の固形分濃度が１０～８０％である、１に記載の溶液。
［３］　乳糖、及びショ糖を含む組成物に、グルカンスクラーゼを発現する乳酸菌又はその処理物を作用させ、ガラクトシルコージビオースを含む組成物を得る工程を含む製造方法により得られる、１又は２に記載の溶液又はその乾燥物。
［４］　ガラクトシルコージビオース、及びグルコシルエピラクトースを含む、組成物。
［５］　乳糖、フルクトース、及びショ糖からなる群より選択されるいずれかの糖をさらに含み、固形分あたりのガラクトシルコージビオースの含有量が１０～５０％である、４に記載の組成物。
［６］　乳糖、及びショ糖を含む組成物に、グルカンスクラーゼを発現する乳酸菌又はその処理物を作用させ、ガラクトシルコージビオースを含む組成物を得る工程を含む製造方法により得られる、４又は５に記載の組成物。
［７］　ガラクトシルコージビオースを含む組成物であって、固形分濃度１０～８０％の溶液としたときのｐＨが７未満である、組成物。
［８］　フルクトースを、固形物あたり１０％以上含む、７に記載の組成物。
［９］　乳糖、及びショ糖を含む組成物に、グルカンスクラーゼを発現する乳酸菌又はその処理物を作用させ、ガラクトシルコージビオースを含む組成物を得る工程を含む製造方法により得られる、７又は８に記載の組成物。
［１０］　以下の特徴を有する、ガラクトシルコージビオースを含む組成物。
（１）ガラクトシルコージビオースを、固形分あたり１５～４０％含む
（２）フルクトースを固形分あたり１５～４５％含む
（３）固形分濃度１２％の溶液として１２０℃、２０分加熱したときのガラクトシルコージビオースの残存率が、８０％以上である
［１１］　乳糖、及びショ糖を含む組成物に、グルカンスクラーゼを発現する乳酸菌又はその処理物を作用させ、ガラクトシルコージビオースを含む組成物を得る工程、及び
　得られた組成物のｐＨを７未満に調整する工程、
を含む、オリゴ糖含有組成物の製造方法。
［１２］　グルコシルエピラクトース、又はそれを含む組成物。
　グルカンスクラーゼを作用させ、本発明の一態様の製造方法により、ショ糖、及び乳糖を含む組成物を原料として効率的にガラクトシルコージビオース等のオリゴ糖が製造できる。
　本発明の一態様の製造方法により、乳タンパク質濃縮物（ＭＰＣ）を製造する際等の副産物を有効に利用できる。
　グルカンスクラーゼを発現する乳酸菌として、グルカンスクラーゼを定常的に発現する乳酸菌を用いる態様により、粗酵素液を調製する場合に誘導物質であるショ糖を添加する必要がなく、グルカンの副生を防ぐことができる。
　グルカンスクラーゼを発現する乳酸菌として、菌体結合型のグルカンスクラーゼを発現する乳酸菌を用いる態様により、グルカンスクラーゼが培養上清に分泌されず、希薄化することを防ぐことができる。
　本発明の一態様により、安定性、特に熱安定性の高い、ガラクトシルコージビオースの溶液又はその乾燥物が提供される。
ショ糖と乳糖の混合物にグルカンスクラーゼを作用することで得た酵素反応液のクロマトグラム 酵素反応液、並びに分画精製後の3糖画分及び4糖画分のクロマトグラム 3糖画分に対するラクターゼ処理によるコージビオースの生成 加熱処理した後の、各pHのガラクトシルコージビオース溶液のクロマトグラム 加熱処理した後のガラクトシルコージビオースの残存率 ガラクトシルコージビオースの異性化により生成する糖の分析 本発明の一態様に用いられるグルカンスクラーゼのアミノ酸配列。下線は、目的の酵素活性のために重要な部位を示す。 本発明の一態様に用いられるグルカンスクラーゼのアミノ酸配列。
＜実施形態１：ガラクトシルコージビオース等を含む組成物の製造方法＞
　本実施形態は、ガラクトシルコージビオース等のオリゴ糖を含有する組成物の製造方法に関する。この製造方法は、乳糖、及びショ糖を含む組成物に、グルカンスクラーゼ、又は、グルカンスクラーゼを発現する乳酸菌又はその処理物を作用させ、ガラクトシルコージビオースを含む組成物を得る工程を含む。本発明はまた、グルカンスクラーゼを発現する乳酸菌又はその処理物を含む、酵素剤に関する。本発明はさらに、乳製品の製造過程で得られる乳糖を含む副産物の利用に関する。
［乳酸菌、又はその処理物］
（乳酸菌、グルカンスクラーゼ）
　本実施形態の製造方法は、グルカンスクラーゼ、又はグルカンスクラーゼを発現する乳酸菌又はその処理物を用いる。本発明に関し、グルカンスクラーゼとは、特に記載した場合を除き、glycoside hydrolase(glycosyl hydrolasesとも呼ばれる)family 70 (GH70)に属する酵素をいう（(CAZy) databases、及びCantarel et al., Nucleic Acids Res. 37:D233-238, 2009参照）。
　用いる乳酸菌は、目的のグルカンスクラーゼを産生するものであれば特に限定されない。好ましい例の一つは、ラクトバチラシエ（Lactobacillaceae）科、又はストレプトコッカス（Streptococcus）科に属する乳酸菌である。なお、本発明に関し、乳酸菌について説明するときは、特に記載した場合を除き、Zheng J, Wittouck S, Salvetti E, Franz CMAP, Harris HMB, Mattarelli P, O'Toole PW, Pot B, Vandamme P, Walter J, Watanabe K, Wuyts S, Felis GE, Ganzle MG, Lebeer S.: A taxonomic note on the genus Lactobacillus: Description of 23 novel genera, emended description of the genus Lactobacillus Beijerinck 1901, and union of Lactobacillaceae and Leuconostocaceae. Int J Syst Evol Microbiol. 2020 Apr; 70(4): 2782-2858による再分類された分類に従っている。
　Lactobacillaceae科には、下記の31属が含まれる：
　ラクトバチルス(Lactobacillus)属、パララクトバチルス(Paralactobacillus)属、ホルザプフェリア(Holzapfelia)属、アミロアクトバチルス(Amylolactobacillus)属、ボンビラクトバチルス(Bombilactobacillus)属、コンパニラクトバチルス(Companilactobacillus)属、ラピディラクトバチルス(Lapidilactobacillus)属、アグリラクトバチルス(Agrilactobacillus)属、シェライフェリラクトバチルス(Schleiferilactobacillus)属、ロイゴラクトバチルス(Loigolactobacilus)属、ラクチカゼイバチルス(Lacticaseibacillus)属、ラチラクトバチルス(Latilactobacillus)属、デラグリオア(Dellaglioa)属、リクオリラクトバチルス(Liquorilactobacillus)属、リギラクトバチルス(Ligilactobacillus)属、ラクチプランティバチルス(Lactiplantibacillus)属、フルフリラクトバチルス(Furfurilactobacillus)属、パウシルラクトバチルス(Paucilactobacillus)属、リモシラクトバチルス(Limosilactobacillus)属、フルクチラクトバチルス(Fructilactobacillus)属、アセティラクトバチルス(Acetilactobacillus)属、アピラクトバチルス(Apilactobacillus)属、レビラクトバチルス(Levilactobacillus)属、セクンディラクトバチルス(Secundilactobacillus)属、レンティラクトバチルス(Lentilactobacillus)属、ペディオコッカスPediococcus 属、コンビビナ(Convivina)属、ロイコノストック(Leuconostoc)属、フルクトバチルス(Fructobacillus)属、オエノコッカス(Oenococcus)属、ワイセラ(Weissella)属。
　好ましい態様においては、Lactobacillaceae科に属する乳酸菌のうち、Limosilactobacillus reuteriに属する乳酸菌を除いたLactobacillaceae科に属する乳酸菌が用いられ、好ましくはLimosilactobacillus属に属する乳酸菌を除いたLactobacillaceae科に属する乳酸菌が用いられる。別の好ましい態様においては、Lactobacillaceae科に属する乳酸菌のうち、Liquorilactobacillus属に属する乳酸菌が用いられる。
　Liquorilactobacillus属に属する乳酸菌の例として、下記が挙げられる：
　Liquorilactobacillus aquaticus、Liquorilactobacillus cacaonum、Liquorilactobacillus capillatus、Liquorilactobacillus ghanensis、Liquorilactobacillus hordei、Liquorilactobacillus mali、Liquorilactobacillus nagelii、Liquorilactobacillus oeni、
Liquorilactobacillus satsumensis、Liquorilactobacillus sicerae、Liquorilactobacillus sucicola、Liquorilactobacillus uvarum、Liquorilactobacillus vini
　Streptococcus科に属する乳酸菌を用いる場合、Streptococcus属に属する乳酸菌を用いることが好ましく、Streptococcus mutansに属する乳酸菌を用いることがより好ましい。
　特に好ましい態様においては、Liquorilactobacillus属に属する乳酸菌のうち、Liquorilactobacillus satsumensisである乳酸菌が用いられる。特に好ましいLiquorilactobacillus satsumensisの株の例は、JCM12392株である。なお、Liquorilactobacillus satsumensisは再編成前の分類にしたがえば、ラクトバチルス・サツメンシス（Lactobacillus satsumensis）に該当する。したがって、JCM12392株は、RIKEN BioResource Center, GENERAL CATALOG No.9, 2012, JAPAN COLLECTION OF MICROORGANISMS, M51では、Lactobacillus satsumensisと表記されている。JCM12392株は、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター(RIKEN  BRC)微生物材料開発室(Japan  Collection  of  Microorganisms)(RIKEN  BRC-JCM、日本)から、JCM番号JCM12392の下で入手することができる。
　別の観点からは、用いる乳酸菌は、グルカンスクラーゼを定常的に発現する乳酸菌であることが好ましい。グルカンスクラーゼを定常的に発現するとは、基質等による誘導を要さず、遺伝子が発現することを指す。定常的に発現するグルカンスクラーゼを、定常発現型又は定常型、発現誘導が必要なグルカンスクラーゼを誘導発現型又は誘導型という。グルカンスクラーゼを定常的に発現するかどうかは、qPCRによるmRNA転写レベル評価及びウェスタンブロッティングによるタンパク質発現量評価により確認できる。
　オリゴ糖の製造方法に使用するためにグルカンスクラーゼを発現する乳酸菌又はその処理物を調製する際、誘導型のグルカンスクラーゼの場合は、グルカンスクラーゼを発現させるためにショ糖を必要とする。このときショ糖は、グルカンスクラーゼの基質でもあるため、グルコースをグルカン鎖に付加する反応にも関与し、グルカンが生成される。高分子のグルカンは、調製された液を高粘度にすることがある。定常型の場合は、グルカンスクラーゼを発現する乳酸菌又はその処理物の調製の際にショ糖を要さず、グルカンが生成されない点で好ましい。
　グルカンスクラーゼを定常的に発現する乳酸菌の例として、Liquorilactobacillus satsumensisが挙げられる。一方、グルカンスクラーゼを発現する乳酸菌の一つとして、Leuconostoc属の乳酸菌が良く知られているが、Leuconostoc属の乳酸菌が発現するグルカンスクラーゼは主として誘導型である。
　別の観点からは、用いる乳酸菌は、菌体結合型のグルカンスクラーゼを発現するものであることが好ましい。菌体結合型のグルカンスクラーゼを発現するかどうかは、菌体及び培養上清それぞれの酵素活性を確認すること、又は酵素若しくはその前駆体のアミノ酸配列に分泌シグナルを含むか否かを確認することにより、判断できる。
　オリゴ糖の製造方法に使用するためにグルカンスクラーゼを発現する乳酸菌又はその処理物を調製する際、菌体結合型のグルカンスクラーゼの場合は、遠心分離により菌体と一緒に酵素を容易に回収できる点で好ましい。
　なお、前掲非特許文献４に記載のLactobacillus reuteri由来の２種類のグルカンクラーゼ（GtfA及びGtf180）は、分泌型である。
　本実施形態に用いられるグルカンスクラーゼの例として、下記(A)、（B）、又は(C)のタンパク質からなるグルカンスクラーゼが挙げられる。下記(A)、（B）、又は(C)のタンパク質からなるグルカンスクラーゼは、グルカンスクラーゼを発現する乳酸菌又はその処理物の形態であってもよく、そのような場合も、本実施態様の製造方法において、グルカンスクラーゼが用いられているといえる。
(A)配列番号1～8のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質;
(B)配列番号1～8のいずれか１に記載のアミノ酸配列と高い配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつグルカンスクラーゼ活性を有するタンパク質；
(C)配列番号1～8のいずれか１に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸を置換、欠失、挿入、及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、かつグルカンスクラーゼ活性を有するタンパク質。
　一態様では、グルカンスクラーゼは、下記(B')、又は(C')のタンパク質からなる。
(B')配列番号1～8に記載のアミノ酸配列と高い配列同一性を有するアミノ酸配列であって、ただし、配列番号1の位置450-467、488-499、及び559-573に相当する部分は同一であるアミノ酸配列からなり、かつグルカンスクラーゼ活性を有するタンパク質；
(C')配列番号1～8に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸を置換、欠失、挿入、及び/又は付加したアミノ酸配列であって、ただし、配列番号1の位置450-467、488-499、及び559-573に相当する部分の配列は同一であるアミノ酸配列からなり、かつグルカンスクラーゼ活性を有するタンパク質。
　配列番号1には、Liquorilactobacillus satsumensis由来の、定常発現型であり、かつ菌体結合型であるグルカンスクラーゼであるGTF21のアミノ酸配列が示されている。この配列において、位置450-467、488-499、及び559-573の部分は、グルカンスクラーゼの活性のために重要な部分であることが知られている（非特許文献5：J. Agric. Food Chem. 2011, 59, 4148-4155）。
　配列番号2-4には、L. satsumensisが有する、グルカンスクラーゼ(それぞれ、GTF68、GTF29、GFT39)であって、配列番号1以外の配列を有するもののアミノ酸配列を示す。
　配列番号5には、Leuconostoc meseteroidesが有する、グルカンスクラーゼのアミノ酸配列を示す（アクセッション番号AAB40875）。
　配列番号6には、Leuconostoc citreumが有する、グルカンスクラーゼのアミノ酸配列を示す（アクセッション番号ACY92456）。
　配列番号7には、Streptococcus mutansが有する、グルカンスクラーゼのアミノ酸配列を示す（アクセッション番号AAN58705）。
　配列番号8には、Limosilactobacillus reuteriが有する、グルカンスクラーゼのアミノ酸配列を示す（アクセッション番号AAU08001）。
　各配列と、配列番号1のアミノ酸配列との配列同一性(identity)は、下記及び図8に記載のとおりである。これらの数値は、具体的には、NCBI(米国生物工学情報センター）が提供するBLASTアルゴリズム（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）により、タンパク質のアミノ酸配列同士を比較解析する(BLASTP)ことによって算出した。
配列番号2　49％
配列番号3　62％
配列番号4　48％
配列番号5　46％
配列番号6　45％
配列番号7　47％
配列番号8　56％
　配列番号1の位置559-573の部分は、非特許文献5における保存配列４に相当する。一態様では、用いられるグルカンスクラーゼは、（B）、又は(C)のタンパク質からなり、このとき、グルカンスクラーゼは、他の部分の配列に関わらず、
配列番号1の位置565に相当するアミノ酸（H）、
配列番号1の位置566に相当するアミノ酸（D）、
配列番号1の位置567に相当するアミノ酸（S）、
配列番号1の位置571に相当するアミノ酸（D）、及び
配列番号1の位置572に相当するアミノ酸（Q）から選択される１以上、好ましくは２以上、より好ましくは３以上、さらに好ましくはすべてが、配列番号1と一致している。配列番号1の位置566～567、及び571～572は、アクセプター（本発明においてはラクトース）の認識部位として重要である(非特許文献5)。配列番号1の位置565～566は、グルカンスクラーゼ間で高く保存されている。
　配列番号1の位置488-499の部分は、非特許文献5における保存配列３に相当する。一態様では、用いられるグルカンスクラーゼは、（B）、又は(C)のタンパク質からなり、このとき、グルカンスクラーゼは、他の部分の配列に関わらず、配列番号1の位置488～493（HLSILE）から選択される１以上、好ましくは２以上、より好ましくは３以上、さらに好ましくはすべてが、配列番号1と一致している。特に好ましい態様では、他の部分の配列に関わらず、配列番号1の位置488に相当するアミノ酸(H)と配列番号1の位置に相当するアミノ酸(E)が一致している。
　配列番号1の位置450-467の部分は、非特許文献5における保存配列２に相当する。一態様では、用いられるグルカンスクラーゼは、（B）、又は(C)のタンパク質からなり、このとき、グルカンスクラーゼは、他の部分の配列に関わらず、
配列番号1の位置453に相当するアミノ酸（R）、
配列番号1の位置455に相当するアミノ酸（D）、
配列番号1の位置456に相当するアミノ酸（A）、及び
配列番号1の位置458に相当するアミノ酸（D）、
から選択される１以上、好ましくは２以上、より好ましくは３以上、さらに好ましくはすべてが、配列番号1と一致している。
　用いられるグルカンスクラーゼは、ショ糖をグルコースとフルクトースに分解する反応、及びグルコースをグルカン鎖に付加する反応を触媒する活性を有する酵素であることが好ましく、dextransucrase (EC 2.4.1.5)活性、alternansucrase (EC 2.4.1.140)活性、reuteransucrase (EC 2.4.1.-)活性、α-4,6-glucanotransferase (EC 2.4.1.-)活性、α-1,2-branched dextransucrase (EC 2.4.1.-)活性、及びα-4,3-glucanotransferase (EC 2.4.1.-)活性、mutansucrase(EC 2.4.1.372)活性からなる群より選択されるいずれかを有する酵素であることが好ましく、少なくともdextransucrase (EC 2.4.1.5)活性を有するものがより好ましい。
　本発明に関し、あるタンパク質がグルカンスクラーゼ活性を有するか否かは、そのタンパク質がdextransucrase (EC 2.4.1.5)活性 、alternansucrase (EC 2.4.1.140)活性、reuteransucrase (EC 2.4.1.-)活性、α-4,6-glucanotransferase (EC 2.4.1.-)活性、α-1,2-branched dextransucrase (EC 2.4.1.-)活性、及びα-4,3-glucanotransferase (EC 2.4.1.-)活性を有しうる否かにより判断することができる。あるタンパク質がグルカンスクラーゼ活性を有するか否かは、そのタンパク質が、dextransucrase (EC 2.4.1.5)活性を有しうるか否かで判断することがより好ましい。
　グルカンスクラーゼのアミノ酸配列に関し、高い配列同一性（identity）とは、同一性の値が、45%以上、46％以上、47％以上、48％以上、49％以上、50%以上、56％以上、62％以上、好ましくは63%以上、70%以上、より好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上、さらに好ましくは95％以上、さらに好ましくは98％以上であることをいう。
　本発明に関し、アミノ酸配列について同一性（identity）というときは、特に記載した場合を除き、2つの配列を最適の態様で整列させた場合に、2つの配列間で共有する一致したアミノ酸の個数の百分率を意味する。アミノ酸配列の同一性に関する検索・解析は、当業者には周知のアルゴリズム又はプログラム、例えば、GENETIX(登録商標) ver.14(株式会社ゼネティックス)、BLASTN、BLASTP、BLASTX、ClustalWにより行うことができる。プログラムを用いる場合のパラメーターは、当業者であれば適切に設定することができ、また各プログラムのデフォルトパラメーターを用いてもよい。これらの解析方法の具体的な手法もまた、当業者には周知である。
　本発明に関し、1若しくは複数のアミノ酸を置換、欠失、挿入、及び/又は付加したアミノ酸配列というときの置換等されるアミノ酸の個数は、特に記載した場合を除き、そのアミノ酸配列からなるタンパク質が目的の活性を有する限り、特に限定されないが、全長1075個のアミノ酸配列からなる配列番号1の配列からなるグルカンスクラーゼに関しては、例えば50％未満（具体的には537個以下）、好ましくは37%以下（具体的には409個以下）、より好ましくは200個以下、さらに好ましくは100個以下、さらに好ましくは50個以下、さらに好ましくは20個以下、さらに好ましくは1～9個であることをいう。性質の似たアミノ酸への置換であれば、さらに多くの個数の置換等がありうる。このようなアミノ酸配列に係るポリヌクレオチド又はタンパク質を調製するための手段は、当業者にはよく知られている。
　本発明に関し、あるアミノ酸配列Sにおいて、基準となる配列（例えば配列番号1）の位置x（N末端からx番目）に相当するアミノ酸とは、配列Sと基準となる配列を整列させた場合に、配列Sにおいて基準となる配列の位置xのアミノ酸に対応するアミノ酸を指す。配列Sにおけるこの対応するアミノ酸の位置は、配列Sが、基準となる配列において1若しくは複数のアミノ酸を欠失等したものである場合には、基準となる配列とは位置ずれて、配列Sにおいては位置xではない場合がある。基準となる配列の位置xに相当するアミノ酸が配列Sにおいてどのアミノ酸に該当するかは、当業者であれば、適切に判断できる。
　別の観点からは、用いるグルカンスクラーゼは、オリゴ糖の大量製造に適しているものが好ましい。具体的には、基質が高濃度であっても活性を十分に発揮することができるものが好ましい。オリゴ糖類の大量製造では、生産効率の観点から、より高いショ糖濃度で効率よく実施できることが好ましい。
　別の観点からは、用いるグルカンスクラーゼは、カルシウムにより活性が上昇するものが好ましい。
（処理物）
　グルカンスクラーゼを発現する乳酸菌又はその処理物は、グルカンスクラーゼを目的の活性を有する状態で含む限り、その形態は特に限定されない。好ましいグルカンスクラーゼを発現する乳酸菌又はその処理物の例として、生菌体、死菌体、菌体を含む培養物、菌体破砕物、及びグルカンスクラーゼの精製物が挙げられる。これらのものは、水分を含んだ状態であってもよく、乾燥物であってもよい。
　グルカンスクラーゼを発現する乳酸菌として菌体結合型のグルカンスクラーゼを発現するものを用いる態様で使用する、グルカンスクラーゼを発現する乳酸菌又はその処理物の好ましい例として、生菌体、死菌体、菌体を含む培養物、菌体破砕物が挙げられる。
　生菌体は、例えば、市販の培地で乳酸菌を培養し、得られた培養液から集菌し、必要に応じ、洗浄等の操作を行うことにより得られる。死菌体は、例えば、生菌体の集菌物を、グルカンスクラーゼが失活しない条件での殺菌処理により、殺菌して得られる。菌体を含む培養物は、例えば、市販の培地で乳酸菌を培養することにより得られる。菌体破砕物は、例えば、生菌体の集菌物を、ホモゲナイザー、ボールミル、ビーズミル、ダイノミル、遊星ミル、ジェットミル、フレンチプレス、細胞破砕機等を使用して物理的に破砕することにより、また自己消化、酵素処理、界面活性剤等の薬剤処理等により菌体構造を破砕することにより得られる。
　グルカンスクラーゼの精製物における精製の程度は、目的の反応を行える限り、特に限定されない。グルカンスクラーゼの精製物は、高純度に精製したものであってもよく、粗精製物であってもよい。精製の方法は特に限定されず、従来技術により行うことができる。またグルカンスクラーゼの精製物は、酵素として用いて目的の反応が行える限り、由来は特に限定されない。乳酸菌の菌体や培養物から精製したもの、組換え体として製造して精製したもの、化学合成して精製したものであってもよい。
（酵素剤）
　グルカンスクラーゼ、又はグルカンスクラーゼを発現する乳酸菌又はその処理物は、酵素剤の成分とすることができる。酵素剤の成分とする場合、グルカンスクラーゼは、定常発現型及び菌体結合型のすくなくとも一方であることが好ましく、定常発現型及び菌体結合型であることがより好ましい。定常発現型及び菌体結合型であるグルカンスクラーゼの例として、上述した(A)、（B）、又は(C)のタンパク質からなるグルカンスクラーゼが挙げられる。
　従来の酵素剤の有効成分が酵素自体であるのに対して、一態様での酵素剤の成分としてのグルカンスクラーゼを発現する乳酸菌又はその処理物は、グルカンスクラーゼを目的の活性を有する状態で含む限り、グルカンスクラーゼ自体ではなく、生菌体、死菌体、菌体を含む培養物、菌体破砕物であってもよい。このような形態で酵素剤の成分とすることは、菌体結合型のグルカンスクラーゼを成分とする場合に特に適している。
　酵素剤は、グルカンスクラーゼ、又はグルカンスクラーゼを発現する乳酸菌又はその処理物のほか、賦形剤、緩衝剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水などを含んでいてもよい。賦形剤の例として、デンプン、デキストリン、マルトース、トレハロース、乳糖、D-グルコース、ソルビトール、D-マンニトール、白糖、グリセロールが挙げられる。緩衝剤の例として、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等が挙げられる。安定剤の例として、プロピレングリコール、アスコルビン酸が挙げられる。保存剤の例として、フェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベンが挙げられる。防腐剤の例として、エタノール、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノールが挙げられる。
（グルカンスクラーゼの製造方法）
 グルカンスクラーゼは、乳酸菌又はその処理物を用いて製造することができ、また他の方法により製造することもできる。例えば、グルカンスクラーゼを好適な発現系に発現させることにより、製造してもよい。すなわち、上述した(A)、（B）、又は(C)のタンパク質からなるグルカンスクラーゼをコードするポリヌクレオチドを用いて適した宿主を形質転換し、そして得られた形質転換体により、グルカンスクラーゼを生産させることができる。宿主としては、例えば、大腸菌、枯草菌、乳酸菌などの細菌、酵母、糸状菌などを挙げることができ、組換えベクターの種類や操作性などに応じて適宜選択することができる。形質転換の際、ベクターを用いることができ、そのようなベクターとしては、例えば、プラスミドベクターなどを挙げることができ、宿主や操作性などに応じて適宜選択することができる。
  グルカンスクラーゼは、化学合成により製造してもよい。すなわち、上述した(A)、（B）、又は(C)のタンパク質からなるグルカンスクラーゼのアミノ酸配列情報に基づいて、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ－ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法に従って、グルカンスクラーゼを合成することができ、また各種の市販のペプチド合成機を利用して合成することもできる。
　グルカンスクラーゼは、グルカンスクラーゼをコードする遺伝子を有する生物をゲノム編集し、得られたゲノム編集生物を用いて製造することができる。ゲノム編集により、目的のグルカンスクラーゼをコードする遺伝子の発現を上方に制御することができる。用いることができるゲノム編集技術として、ZFN、TALEN、CRISPR／Cas9、及びPPR等が挙げることができ、当業者であれば状況に応じて適宜選択することができる。
　酵素剤は、食品加工等の分野で利用することができる。具体例として、乳糖を含む組成物の処理、ガラクトシルコージビオース等のオリゴ糖の製造が挙げられる。
［乳糖、ショ糖を含む組成物］
　本実施形態の製造方法は、乳糖、及びショ糖を含む組成物を用いる。
　乳糖、及びショ糖を含む組成物は、乳糖を含む組成物に、ショ糖を添加することにより得たものであってもよい。乳糖を含む組成物は、乳製品又は乳原料の製造過程で得られる副産物が好ましく、その例として、生乳、脱脂乳、乳糖を含む乾燥物の還元液、脱脂濃縮乳、ホエイ、乳タンパク質濃縮物（ＭＰＣ）、ホエイタンパク質濃縮物（ＷＰＣ）、ホエイタンパク質単離物（ＷＰＩ）、乳由来の膜透過液（パーミエイトともいう。）又は膜保持液（リテンテートということもある。）、乳濃縮物、乳糖を含む乳酸菌培養物が挙げられる。乳糖を含む乾燥物の還元液とは、全粉乳、脱脂粉乳、ホエイタンパク質濃縮物粉、ホエイタンパク質単離物粉などの公知の乳由来の乳糖を含む乾燥物を任意の濃度に調整した液をいう。
　乳原料製造等に用いられる膜の例として、精密濾過膜（ＭＦ膜）、限外濾過膜（ＵＦ膜）、ナノフィルトレーション膜（ＮＦ膜）、逆浸透膜（ＲＯ膜）が挙げられる。これらのうち、ＭＦ膜、ＵＦ膜により得られるパーミエイトを、乳糖を含む組成物として、本発明の製造方法に好ましく使用できる。ＭＰＣ等の乳原料の製造において副生されるパーミエイトは、乳糖を多く含むからである。ＮＦ膜、ＲＯ膜が用いられる場合は、リテンテートが乳糖を含む。
　好ましい態様では、乳糖を含む組成物として、乳製品又は乳原料を製造する際の副産物を用いる。副産物の例として、チーズを製造する際のホエイ、ＷＰＣやＭＰＣを製造する際のパーミエイトが挙げられる。パーミエイトを用いる際には、乳酸などの酸の含有量が１％以下、好ましくは０．８％以下、より好ましくは０．７％以下であると、酵素反応の至適条件とするためのｐＨ調整を要しない点で好ましい。
［グルカンスクラーゼを発現する乳酸菌又はその処理物の作用］
（酵素反応）
　一般に、グルカンスクラーゼは、ショ糖をグルコースとフルクトースに分解する反応、及びグルコースをグルカン鎖に付加する反応を触媒する活性を有する。本発明者らの検討によると、グルカンスクラーゼをショ糖に作用させる反応において、ホエイやタンパク質膜濃縮透過液の主成分である乳糖をアクセプターとして共存させた場合、コージビオース骨格を有するガラクトシルコージビオースが製造できる。本発明は、このような酵素反応を利用する。
　この反応では、α-1,2結合で糖転移が行われ、ガラクトシルコージビオース（α-D-glucopyranosyl-(1→2)-[β-D-galactopyranosyl-(1→4)-]D-glucopyranoside）が生成する。なお、前掲非特許文献３では、Lactobacillus satsumensisの菌株由来のグルカンスクラーゼにより生成する高分子グルカンの構造が研究されている。この文献ではα-1,3及び1,6結合での糖転移については記載されているが、グルコース転移によるα-1,2結合の形成能は記載されていない。
（反応条件）
　乳糖、及びショ糖を含む組成物に、グルカンスクラーゼ、又はグルカンスクラーゼを発現する乳酸菌又はその処理物を作用させる際の、乳糖の濃度は、目的の生産物が得られる限り適宜とすることができる。乳糖の濃度は、例えば３．０％以上とすることができ、好ましくは６．０％以上であり、より好ましくは１２％以上であり、さらに好ましくは１５％以上であり、さらにより好ましくは２０％以上である。また４０％以下とすることができ、３０％以下であってもよく、１７％以下であってもよい。
　乳糖、及びショ糖を含む組成物に、グルカンスクラーゼ、又はグルカンスクラーゼを発現する乳酸菌又はその処理物を作用させる際の、ショ糖の濃度は、目的の生産物が得られる限り適宜とすることができる。ショ糖の濃度は、例えば５．０％以上とすることができ、好ましくは１０％以上であり、より好ましくは３０％以上であり、さらに好ましくは５０％である。また６４％以下とすることができ、好ましくは６０％以下であり、より好ましくは５６％以下であり、さらに好ましくは５２％以下である。なお、本発明に関し、成分の濃度や比を示すときは、特に記載した場合を除き、質量に基づく値として示している。
　ショ糖と乳糖の比は、目的の生産物が得られる限り適宜とすることができる。ショ糖と乳糖の比（ショ糖：乳糖）は、例えば０．５：１～１１：１とすることができ、好ましくは０．７：１～９：１であり、より好ましくは０．８：１～６：１であり、さらに好ましくは１：１～４：１である。
　乳糖、及びショ糖を含む組成物に、グルカンスクラーゼを発現する乳酸菌又はその処理物を作用させる際の、グルカンスクラーゼを発現する乳酸菌又はその処理物の濃度は、目的の生産物が得られる限り適宜とすることができる。グルカンスクラーゼを発現する乳酸菌を生菌として用いる場合、乳酸菌を適切な条件で培養し、得られた培養液から集菌し、必要に応じ洗浄した後、元の培養液の０．２～２倍量の緩衝液を加えて菌を懸濁したものを、ここでいうグルカンスクラーゼを発現する乳酸菌又はその処理物として使用できる。このような乳酸菌の懸濁液は、１．０～２５％となるように、好ましくは２．０～２０％、より好ましくは３．０～１８％、さらに好ましくは４．０～１５％となるように、系に添加することができる。あるいは、乳酸菌を適切な条件で培養し、培養液を濃縮した濃縮物を、ここでいうグルカンスクラーゼを発現する乳酸菌又はその処理物として使用できる。このような乳酸菌の濃縮物は、０．０１～１０％、好ましくは０，０５～５％、０．１～３％、０．２～０．６％となるように、系に添加することができる。
　乳糖、及びショ糖を含む組成物に、グルカンスクラーゼを発現する乳酸菌又はその処理物を作用させる系は、グルカンスクラーゼの活性を上昇させる成分を含んでいてもよく、また活性を阻害する成分を含まないことが好ましい。グルカンスクラーゼが上述の(A)、（B）、又は(C)のタンパク質からなるグルカンスクラーゼである場合、グルカンスクラーゼが活性を上昇させる成分の例としてカルシウム、活性を阻害する成分の例として鉄イオンが挙げられる。
　グルカンスクラーゼ、又はグルカンスクラーゼを発現する乳酸菌又はその処理物を、乳糖、ショ糖を含む組成物に作用させる際の、温度などの条件は、当業者であれば適宜設定できる。
　ｐＨは、ｐＨ３．５～７．０とすることができ、好ましくはｐＨ４．０～６．５であり、より好ましくはｐＨ４．５～６．０である。
　温度は、４～５５℃とすることができ、好ましくは２０～５２℃であり、より好ましくは３０～５１℃であり、さらに好ましくは４６～５０℃である。
　グルカンスクラーゼ、又はグルカンスクラーゼを発現する乳酸菌又はその処理物を、乳糖、ショ糖を含む組成物に作用させる時間は、目的の精製物が十分に得られるように設定することができる。このための時間は、通常、４～９６時間であり、好ましくは６～８０時間であり、より好ましくは８～７２時間であり、さらに好ましくは１２～６４時間である。
［ガラクトシルコージビオースを含む組成物、最終生産物］
　本発明の製造方法は、乳糖、及びショ糖を含む組成物に、グルカンスクラーゼ、又はグルカンスクラーゼを発現する乳酸菌又はその処理物を作用させ、ガラクトシルコージビオースを含む組成物を得る工程を含む。
　本発明の製造方法は、種々のオリゴ糖含有組成物を製造する目的で実施できる。目的とする最終生産物であるオリゴ糖は、例えば、コージビオース及びコージビオースを構成糖とするオリゴ糖からなる群より選択されるいずれかである。本発明に関し、コージビオースを構成糖とするオリゴ糖というとき、コージビオース自体は含まない。なお、本発明に関し、「いずれか」というときは、特に記載した場合を除き、「少なくとも一つ」の意味で用いている。
　コージビオースを構成糖とするオリゴ糖の例として、3糖であるガラクトシルコージビオース、及びガラクトシルコージビオースにグルコースなどの単糖が１分子結合した4糖が挙げられる。本発明に関し、ガラクトシルコージビオースとは、特に記載した場合を除き、下記コージビオースの１～８の位置のいずれかに、ガラクトースがα又はβ結合したものをいう。理論的には、8の位置のOHには、α-α、α-β、β-α、β-βの４とおり、2～7の位置のOHには２とおりで、ガラクトースが結合しうるので、ガラクトシルコージビオースは、18種類想定される。
　好ましい態様において、製造されるガラクトシルコージビオースの一つは、α-D-glucopyranosyl-(1→2)-[β-D-galactopyranosyl-(1→4)-]D-glucopyranoside）である。この糖は、グルコシルラクトースの１種としても表記できる。
　本発明に関し、グルコシルラクトースとは、特に記載した場合を除き、グルコースがラクトースに結合したものをいう。より詳細には、下記ラクトースの1～8の位置のいずれかに、グルコースがα又はβ結合したものから選択されるいずれかをいう。理論的には、1の位置のOHには、α-α、α-β、β-α、β-βの４とおり、２～７の位置のOHには２とおりで、グルコースが結合しうるので、グルコシルラクトースは、18種類想定される。ぞれぞれ、1α-α体、1α-β体、1β-α体、1β-β体、2α体、2β体、3α体、3β体、4α体、4β体、5α体、5β体、6α体、6β体、7α体、7β体、8α体、8β体と称する。α-D-glucopyranosyl-(1→2)-[β-D-galactopyranosyl-(1→4)-]D-glucopyranosideは、8の位置のOHに対してグルコースがα結合したもの（8α体）である。
　一態様では、上述のα-D-glucopyranosyl-(1→2)-[β-D-galactopyranosyl-(1→4)-]D-glucopyranoside（8α体）が製造されるか否かに関わらず、この糖ではないグルコシルラクトースが製造されうる。詳細には、この糖以外のグルコシルラクトースの１７種類（1α-α体、1α-β体、1β-α体、1β-β体、2α体、2β体、3α体、3β体、4α体、4β体、5α体、5β体、6α体、6β体、7α体、7β体、8β体）のうち、いずれか１つが製造される場合があり、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個が製造される場合があり得る。
（組成物に含有される糖）
　乳糖、及びショ糖を含む組成物にグルカンスクラーゼ、又はグルカンスクラーゼを発現する乳酸菌又はその処理物を作用させる工程により得られる組成物は、ガラクトシルコージビオース以外に、未反応の乳糖を含むことがあり、またショ糖の分解により生じたフルクトースを含みうる。得られる組成物中のフルクトースは、通常、ガラクトシルコージビオースと等モル以上である。組成物はまた、3糖であるガラクトシルコージビオースにグルコースなどの単糖が１分子結合した4糖を含みうる。
　なお本発明及び実施態様の説明において、本発明の製造方法を、最終生産物であるオリゴ糖含有組成物が、ガラクトシルコージビオース含有組成物である場合を例に説明することがあるが、その説明は、ガラクトシルコージビオースに対してグルコースなどの単糖が１分子結合した4糖を含有する組成物を製造する場合にも当てはまる。当業者であれば、ガラクトシルコージビオースを、適宜、ガラクトシルコージビオースに対してグルコースなどの単糖が１分子結合した4糖に読み替えて理解することができる。
（形態、その他）
　製造方法により得られる組成物は、種々の形態とすることができる。組成物の形態は、得られた反応液のままでもよく、必要に応じ後述する精製工程を経た後、濃縮物、凍結物、乾燥物としてもよい。乾燥物は、粉末状、顆粒状とすることができる。
（用途）
　得られる組成物は、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、又は後述の機能性の成分として、食品、化粧品、及び医薬品等の分野で利用することができる。食品及び医薬品は、特に記載した場合を除き、ヒトのためのもののみならず、ヒト以外の動物のためのものを含む。食品は、特に記載した場合を除き、一般食品、機能性食品、栄養組成物を含み、また治療食（治療の目的を果たすもの。医師が食事箋を出し、それに従い栄養士等が作成した献立に基づいて調理されたもの。）、食事療法食、成分調整食、介護食、治療支援用食品を含む。食品は、特に記載した場合を除き、固形物のみならず、液状のもの、例えば飲料、ドリンク剤、流動食、及びスープを含む。
　組成物は、機能性成分としても利用できる。本発明者らの検討によると、コージビオース、及びガラクトシルコージビオース等のコージビオースを構成糖とするオリゴ糖は、腸内での細菌叢におけるParabacteroides属細菌の増殖を促進でき、また腸内での細菌叢におけるBifidobacterium属細菌の増殖を促進できる。したがって、本発明の製造方法により得られる組成物は、腸内での細菌叢におけるParabacteroides属細菌の増殖を促進するため、腸内での細菌叢におけるBifidobacterium属細菌の増殖を促進するために使用できる。また、Parabacteroides属細菌の増殖促進を通じ、炎症、肥満、糖代謝異常、多発性硬化症（MS）、肝脂肪症、がん、及び慢性閉塞性肺疾患（COPD）の処置が期待できることから、組成物は、これらの疾患の処置のため、また腸内のParabacteroides属細菌の増殖促進により改善される、それら以外の疾患又は状態の処置のために使用できる。さらに腸内での細菌叢におけるBifidobacterium属細菌の増殖の促進を通じ、ミネラルの吸収促進、及び整腸が期待できることから、組成物は、ミネラルの吸収促進のため、整腸のため、及び腸内のBifidobacterium属細菌の増殖促進により改善される、それら以外の状態の処置のために使用できる。
　また、組成物は、プレバイオティクス又はシンバイオティクスとして使用できる。
［特定の実施態様］
（他の工程）
　本発明の製造方法は、乳糖、及びショ糖を含む組成物に、グルカンスクラーゼ、又はグルカンスクラーゼを発現する乳酸菌又はその処理物を作用させ、ガラクトシルコージビオースを含む組成物を得る工程以外に、様々な工程をさらに含みうる。
　製造方法は、精製工程をさらに含んでよい。精製工程における精製の目的成分の例として、ガラクトシルコージビオース、及びガラクトシルコージビオースに、グルコースなどの単糖が１分子結合した4糖が挙げられる。
　精製工程は、例えば、活性炭による処理、クロマトグラムによる分離、イオン交換樹脂による処理、ろ過、濃縮、結晶化、結晶分離、乾燥、冷却、調温、調湿等の手段のいずれかを含みうる。
　精製工程を実施する場合、精製の程度は特に限定されない。例えば、ガラクトシルコージビオースの純度は、30 %以上とすることができ、40 %以上、50 %以上、60 %以上、70 %以上、80 %以上、90 %以上、95 %以上、97 %以上でありうる。
　製造方法は、ｐＨ調整工程をさらに含んでよい。ｐＨ調整工程で用いられるｐＨ調整のための剤は、食品、医薬品、化粧品製造に適したものであれば特に限定されない。例として、クエン酸、リンゴ酸、グルコン酸、コハク酸、アスコルビン酸、酒石酸、乳酸、フマル酸等の有機酸、リン酸等の無機酸及びそれらの塩類が挙げられる。得られる組成物を適切なｐＨに調整することは、含まれる目的の成分の安定化のために重要である場合がある。
　ｐＨは、例えばｐＨ３．０～８．０に調整することができ、ｐＨ４．０～７．０としてもよく、ｐＨ４．５～６．０としてもよい。
　製造方法は、殺菌工程をさらに含むことが好ましい。殺菌工程を実施する段階は、特に限定されず、また必要に応じ、複数回の殺菌工程を実施してよい。例えば、乳糖、及びショ糖を含む組成物を、グルカンスクラーゼ、又はグルカンスクラーゼを発現する乳酸菌又はその処理物を作用させる前に、殺菌することができる。またグルカンスクラーゼを発現する乳酸菌又はその処理物を作用させた後、得られたガラクトシルコージビオースを含む組成物を、グルカンスクラーゼを失活させる条件で殺菌することができる。得られたガラクトシルコージビオースを含む組成物を濃縮する場合は、濃縮工程の前に組成物を殺菌してもよい。
　殺菌のための手段は、目的の成分に影響を与えない限り、特に限定されない。例として、加熱殺菌（ＵＨＴ殺菌、レトルト殺菌等）、紫外線殺菌が挙げられる。
（適応例）
　一実施態様として、下記の工程を含む、ガラクトシルコージビオース含有発酵乳の製造方法を実施できる：
　原料乳、及びショ糖を含む組成物に、グルカンスクラーゼを発現する乳酸菌又はその処理物を作用させ、ガラクトシルコージビオースを含有する組成物を得る、酵素処理工程；及び
　原料乳に、乳酸菌スターターを添加して発酵させ、発酵乳を得る、発酵工程
　酵素処理工程と発酵工程の順は、特に限定されない。例えば、酵素処理工程を行った後に、さらに乳酸菌スターターを添加して発酵処理工程を行ってもよく、また発酵工程を行った後に、さらにグルカンスクラーゼを発現する乳酸菌又はその処理物を添加して酵素処理を行ってもよい。このような工程により、発酵乳に、ガラクトシルコージビオースを外添することなく、含ませることができる。
　原料乳の例として、生乳、牛乳、特別牛乳、脱脂乳及び部分脱脂乳、並びにこれらのいずれかの混合物が挙げられる。
　スターターとして用いる乳酸菌は、発酵乳の製造に適している限り、特に限定されない。好ましくは、Lactobacillus delbrueckiiを用いる。Lactobacillus delbrueckiiのうち、Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricusに分類されるものを用いることが好ましい。また、Streptococcus thermophilusを用いてもよい。Lactobacillus delbrueckiiとStreptococcus thermophilusを組み合わせて用いてもよい。
　一実施態様として、下記の工程を含む、ガラクトシルコージビオース含有乳濃縮物の製造方法を実施できる：
　原料脱脂濃縮乳、及びショ糖を含む組成物に、グルカンスクラーゼ、又はグルカンスクラーゼを発現する乳酸菌又はその処理物を作用させ、ガラクトシルコージビオースを含有する脱脂濃縮乳を得る工程；
　所望により、得られた脱脂濃縮乳を乾燥する工程
　本実施態様で得られる乳濃縮物の例として、例えば、「乳及び乳製品の成分規格等に関する厚生省省令」に規定される濃縮乳（生乳、牛乳又は特別牛乳を濃縮したものであって、乳固形分が２５．５％以上であり、乳脂肪分が７．０％以上であるもの）、脱脂濃縮乳（生乳、牛乳又は特別牛乳から乳脂肪分を除去したものを濃縮したものであって、無脂乳固形分が１８．５％以上であり、細菌数（標準平板培養法で１ｇ当たり）が１００，０００以下であるもの。）のほか、生乳、牛乳又は特別牛乳を濃縮したものであって、乳固形分が２５．５％未満であるもの（省令外濃縮乳）、生乳、牛乳又は特別牛乳から乳脂肪分を除去したものを濃縮したものであって、無脂乳固形分が１８．５％未満であるもの（省令外脱脂濃縮乳）、又は乳タンパク質濃縮物（ＭＰＣ）が挙げられる。
＜実施形態２：ガラクトシルコージビオース等を含む組成物＞
　本実施態様は、ｐＨが特定の値以下である、ガラクトシルコージビオースを含む溶液、及びガラクトシルコージビオース、及びグルコシルエピラクトースを含む、組成物に関する。
［組成物］
（ガラクトシルコージビオース、溶液のｐＨ、含有量）
　本実施形態の組成物は、ガラクトシルコージビオース（本明細書において既に定義されている。）を含む。
　組成物は、好ましい態様において、ガラクトシルコージビオースの一つである、α-D-glucopyranosyl-(1→2)-[β-D-galactopyranosyl-(1→4)-]D-glucopyranoside）を含む。
　このα-D-glucopyranosyl-(1→2)-[β-D-galactopyranosyl-(1→4)-]D-glucopyranosideは、4－ガラクトシルコージビオース、4'－ガラクトシルコージビオースと表記されることもある。また、グルコシルラクトース（本明細書において既に定義されている。）の１種として表記されることもある。
　組成物は、一態様では、このα-D-glucopyranosyl-(1→2)-[β-D-galactopyranosyl-(1→4)-]D-glucopyranosideを含むか否かに関わらず、この糖以外のグルコシルラクトースを含みうる。詳細には、組成物は、この糖以外のグルコシルラクトースの１７種類（1α-α体、1α-β体、1β-α体、1β-β体、2α体、2β体、3α体、3β体、4α体、4β体、5α体、5β体、6α体、6β体、7α体、7β体、8β体）のうち、いずれか１つが製造される場合があり、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７個を含みうる。
　組成物のガラクトシルコージビオースの含有量は特に限定されない。例えば、固形分あたり１０％以上とすることができ、１５％以上とすることができ、２０％以上であることが好ましく、２５％以上であることがより好ましく、３０％以上であることがさらに好ましい。上限値は特に限定されないが、例えば１００％であってもよく、９９％以下であってもよく、８０％以下であってもよく、７０％以下であってもよく、５０％以下であってもよく、４０％以下であってもよい。好ましい態様の一つにおいて、組成物中でのガラクトシルコージビオースの含有量は固形分あたり１０～５０％とすることができ、１５～４０％がより好ましく、３０～４０％がさらに好ましい。なお、本発明に関し、成分の含有量又は濃度を数値で示すときは、特に記載した場合を除き、その値は質量に基づく。
　組成物は、好ましい態様の一つでは、ｐＨが７未満の溶液（糖液）である。あるいは、固形分濃度１０～８０％の溶液としたときのｐＨが７未満であるものである。ｐＨが７未満であれば、ガラクトシルコージビオースの熱安定性が高いからである。ｐＨは、例えば２以上とすることができ、２．５以上とすることができ、３以上とすることができ、好ましくは３以上６以下であり、より好ましくは４以上６以下である。この範囲であれは、ガラクトシルコージビオースの熱安定性がより高いからである。溶液のｐＨは、適切であれば、溶液の固形分濃度を１２％として測定することができる。なお、本発明に関し、ｐＨはこの分野の通常の測定方法により測定することができる。
　組成物は、好ましい態様の一つでは、固形分濃度１０～８０％の溶液（水溶液）としたときのｐＨが７未満である、ガラクトシルコージビオースを含む濃縮物、凍結物、乾燥物である。乾燥物とは、溶液を水分量が７％以下、好ましくは５％以下となるまで乾燥させたものをいう。水分量は、食品分野又は日本農林水産規格（ＪＡＳ）で糖類の水分量を測定する場合の公定法により測定することができる。乾燥物の例として、粉末、顆粒が挙げられる。濃縮物、凍結物、乾燥物を、固形分濃度１０～８０％の溶液としたときのｐＨは、例えば２以上とすることができ、２．５以上とすることができ、３以上とすることができ、好ましくは３以上６以下であり、より好ましくは４以上６以下である。この範囲であれは、ガラクトシルコージビオースの熱安定性がより高いからである。溶液のｐＨは、適切であれば、溶液の固形分濃度を１２％として測定することができる。
　本発明に関し、固形分濃度とは、溶液中に溶解している固形分の濃度をいう。固形分濃度は当技術分野の通常の方法により測定されうる。固形分濃度は、適切な場合はＢｒｉｘ値、又は糖度として表すことができる。Ｂｒｉｘ値や糖度は、公知の測定法を適宜用いて測定することができ、一般的には市販の機器（例えば、デジタル屈折計　商品名「ＲＸ－５０００α」（アタゴ社製））を用いて測定することができる。
　熱安定性が高いとは、固形分濃度１２％の溶液として１２０℃、２０分加熱したときのガラクトシルコージビオースの残存率が、８０％以上であること、好ましくは９０％以上であること、より好ましくは９５％以上であることをいう。
　ガラクトシルコージビオースを含む組成物が溶液である場合、溶液の固形分濃度は特に限定されないが、例えば１０％以上であり、３０％以上であることが好ましく、５０％以上であることがより好ましく、６０以上であることがさらに好ましい。上限値は特に限定されないが、例えば８０％以下とすることができ、７８％以下であってもよく、７６％以下であってもよい。固形分は、主として糖類から構成されるが、糖類以外の成分を含んでいることがある。糖類以外の成分の例として、後述する製造方法に用いる酵素、ｐＨ調整のための剤が挙げられる。糖類以外の成分は寄与が小さく、無視できる場合がある。
（他の成分、組成）
　組成物は、ガラクトシルコージビオースのほか、グルコシルエピラクトース、より特定するとグルコシルエピラクトース（α-D-Glcp-(1→2)-[β-D-Galp-(1→4)-]D-Manp）を含んでいてもよい。この糖は、2-グルコシルエピラクトースと表記されることもある。本発明及び実施態様において、グルコシルエピラクトースというときは、特に記載した場合を除き、下記の構造を有する3糖を指す。
　組成物は、さらに、前述のα-D-glucopyranosyl-(1→2)-[β-D-galactopyranosyl-(1→4)-]D-glucopyranosideを含んでいてもよく、またこの糖を含むか否かに関わらず、この糖以外のグルコシルラクトースを含んでいてもよい。
　グルコシルエピラクトースは、本発明者らが、加熱処理したガラクトシルコージビオースの溶液において生成されていることを見出した新規化合物である。
　グルコシルエピラクトースは、ガラクトシルコージビオースを含む組成物を、pH7以上に調整したのち、100℃以上、好ましくは110℃以上で加熱することにより、製造することができる。
　組成物がグルコシルエピラクトースを含む場合、グルコシルエピラクトースの含有量は特に限定されないが、固形分あたり、例えば５％以下、好ましくは３％以下、より好ましくは１％以下、さらに好ましくは０．１％以下で含みうる。下限値は特に限定されないが、例えば固形分あたり０．００１％以上、０．０１％以上、０．０５％以上である。
　組成物がグルコシルエピラクトースを含む場合、ガラクトシルコージビオースとグルコシルエピラクトースとの質量比（ガラクトシルコージビオース：グルコシルエピラクトース）は、特に限定されないが、例えば９９．９９：０．０１～８０：２０であり、９９．９：０．１～８５：１５であってもよく、９９：１～９０：１０であってもよい。
　組成物はまた、乳糖、フルクトース、及びショ糖からなる群より選択されるいずれかの糖をさらに含んでいてもよい。なお、本発明に関し、「いずれか」というときは、特に記載した場合を除き、「少なくとも一つ」の意味で用いている。
　組成物がフルクトースを含む場合、フルクトースの含有量は、特に限定されないが、固形分あたり、例えば５％以上、好ましくは１５％以上、より好ましくは２０％以上、さらに好ましくは３０％以上で含みうる。上限値は特に限定されないが、例えば固形分あたり４５％以下、４０％以下、３５％以下である。ガラクトシルコージビオースの純度が高いことが好ましい場合は、フルクトースの含有量は少ないほうがよく、含まれないことが好ましい。
　組成物がフルクトースを含む場合、ガラクトシルコージビオースとフルクトースとの質量比（ガラクトシルコージビオース：フルクトース）は、特に限定されないが、例えば１５～４０：１５～４５であり、１７～３７：１７～３７であってもよく、２０～３５：２５～４０であってもよい。
　組成物が乳糖を含む場合、乳糖の含有量は、特に限定されないが、固形分あたり、例えば３０％以下、好ましくは２５％以下、より好ましくは２０％以下、さらに好ましくは１５％以下で含みうる。下限値は特に限定されないが、例えば固形分あたり１％以上、５％以上、１０％以上である。ガラクトシルコージビオースの純度が高いことが好ましい場合は、乳糖の含有量は少ないほうがよく、含まれないことが好ましい。
　組成物が乳糖を含む場合、ガラクトシルコージビオースと乳糖との質量比（ガラクトシルコージビオース：乳糖）は、特に限定されないが、例えば１５～４０：１５～３０であり、１７～３７：１７～３７であってもよく、２０～３５：２０～２５であってもよい。
　組成物がショ糖を含む場合、ショ糖の含有量は、特に限定されないが、固形分あたり、例えば３０％以下、好ましくは２５％以下、より好ましくは２０％以下、さらに好ましくは１５％以下、１０％以下、５％以下、１％以下、０．５％以下、０．２％以下、０．１％以下で含みうる。下限値は特に限定されないが、例えば固形分あたり０．０１％以上、０．５％以上、１％以上、５％以上、１０％以上であってもよい。ショ糖は条件によってはすべて反応に利用され、検出限界以下となることがある。
　組成物がショ糖を含む場合、ガラクトシルコージビオースとショ糖との質量比（ガラクトシルコージビオース：ショ糖）は、特に限定されないが、例えば１５～４０：１５～３０であり、１７～３７：１７～３７であってもよく、２０～３５：２０～２５であってもよい。
　組成物はまた、3糖であるガラクトシルコージビオースにグルコースなどの単糖が１分子結合した4糖を含みうる。
　好ましい態様の一つとして、以下の特徴を有する、ガラクトシルコージビオースを含む組成物を挙げることができる。
（１）ガラクトシルコージビオースを、固形分あたり１５～４０％含む
（２）フルクトースを固形分あたり１５～４５％含む
（３）固形分濃度１２％の溶液として１２０℃、２０分加熱したときのガラクトシルコージビオースの残存率が、８０％以上である
　上記の組成物はさらに、下記の特徴を有していてもよい。
（４）乳糖を固形分あたり５～３０％含む
　上記の組成物はさらに、（３）に代えて、又はさらに、下記の特徴を有していてもよい。
（６）固形分濃度１０～８０％の溶液としたときのｐＨが７未満である
　このような組成物は、安定性が高く、加工に適している。また長期保存や流通にも適していると期待できる。さらに、味質に優れる、同量のショ糖よりカロリーが低い、等の点で有用たりうる。
（形態）
　組成物は、種々の形態とすることができる。好ましい態様の一つは、溶液である。一態様において、組成物の形態は、後述する製造方法、すなわち乳糖、及びショ糖を含む組成物に、グルカンスクラーゼ、又はグルカンスクラーゼを発現する乳酸菌又はその処理物を作用させ、ガラクトシルコージビオースを含む組成物を得る工程を含む製造方法により得られる溶液（反応物ということもある。）であってもよい。
　溶液は、濃縮物、凍結物、乾燥物とすることができる。乾燥物とは、溶液を水分量が７％以下、好ましくは５％以下となるまで乾燥させたものをいう。水分量は、食品分野又は日本農林水産規格（ＪＡＳ）で糖類の水分量を測定する場合の公定法により測定することができる。乾燥物の例として、粉末、顆粒が挙げられる。
（用途）
　ガラクトシルコージビオースを含む組成物は、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、又は後述の機能性の成分として、食品、化粧品、及び医薬品等の分野で利用することができる。上記＜ガラクトシルコージビオース等を含む組成物の製造方法＞の（用途）の項の記載は、本実施態様の組成物に関してもそのまま当てはまる。
　一態様の組成物に含まれ得るグルコシルエピラクトースは、有望なプレバイオティクスであるとの報告があるエピラクトースの前駆体として有用であることが期待される（後掲非特許文献５）。したがって、組成物は、グルコシルエピラクトースを得るためのほか、エピラクトースの前駆体を得る目的でも用いられる。
［組成物の製造方法］
　本実施形態のガラクトシルコージビオースを含む組成物は、種々の方法で製造できる。製造方法の特に好ましい例の一つとして、乳糖、及びショ糖を含む組成物に、グルカンスクラーゼ、又はグルカンスクラーゼを発現する乳酸菌又はその処理物を作用させ、ガラクトシルコージビオースを含む組成物を得る工程を含む製造方法が挙げられる。上記＜実施形態１：ガラクトシルコージビオース等を含む組成物の製造方法＞の記載は、本実施形態の組成物の製造に関してもそのまま当てはまる。
（ｐＨ調整工程）
　本実施形態の組成物の製造方法は、ｐＨ調整工程をさらに含んでよい。ｐＨが７未満である場合、調整することは要さないが、このようなｐＨを確認する工程も、ｐＨ調整工程といいうる。ｐＨ調整工程で用いられるｐＨ調整のための剤は、食品、医薬品、化粧品製造に適したものであれば特に限定されない。例として、クエン酸、リンゴ酸、グルコン酸、コハク酸、アスコルビン酸、酒石酸、乳酸、フマル酸等の有機酸、リン酸等の無機酸及びそれらの塩類が挙げられる。得られる組成物を適切なｐＨに調整することは、含まれる目的の成分の安定化のために重要である場合がある。
　ｐＨは、例えば７未満に調整することができる。ｐＨが７未満であれば、ガラクトシルコージビオースの熱安定性が高いからである。ｐＨは、例えば２以上とすることができ、２．５以上とすることができ、３以上とすることができ、好ましくは３以上６以下であり、より好ましくは４以上６以下である。この範囲であれは、ガラクトシルコージビオースの熱安定性がより高いからである。溶液のｐＨは、適切であれば、溶液の固形分濃度を１２％として測定することができる。
［実施例１：乳糖を用いたガラクトシルコージビオースの製造］
（酵素液の調製）
　市販MRS液体培地を用いてLactobacillus satsumensis JCM12392を30℃で一晩培養後、10℃以下に冷却して培養を終了した。
　得られた培養液を遠心分離して上澄みを捨てることによって集菌した後、等量のクエン酸リン酸緩衝液(pH 5.0)を加えて再度集菌することで菌体を洗浄した。得られた菌体へ元の培養液の半量の上記緩衝液を添加し、懸濁したものを酵素液（酵素タンパク質のアミノ酸配列：SEQ ID NO:1）とした。
（酵素反応）
　ショ糖32 w/w%、乳糖16 w/w%、酵素液10 w/w%を混合し、48℃で18時間、静置条件で反応させた。反応後の糖組成についてHPLC（SUPELCO apHeraTM NH2 HPLC Column、移動相68%アセトニトリル、カラム温度35℃、流速1.0 mL/min、RI検出）を用いて分析した結果を図１に示す。組成物は、固形分あたり、ガラクトシルコージビオース　25-30%、乳糖　15-20%、フルクトース　30-35%）を含んでいた。
［実施例２：ホエイ粉を用いたガラクトシルコージビオースの製造］
　実施例１に示す酵素反応条件のうち、乳糖の代わりにホエイパウダー（株式会社明治）（乳糖を75%含む。）を20 w/w%配合して同条件で酵素反応を行った。
　ホエイパウダーを使用した場合においても、実施例1と同様のクロマトグラムが得られた。
［実施例３：3糖及び4糖画分の精製］
　酵素反応液をカーボンセライトカラムへ通液後に、蒸留水を通液することにより非吸着物質を除去した。濃度を変えたエタノール水溶液を用いて段階的に溶出を行うことで、4'-ガラクトシルコージビオースを主成分として含む3糖からなる画分、及び4'-ガラクトシルコージビオースにグルコースが更に1分子結合した4糖画分を得た（図２）。
［実施例４：分画精製物のラクターゼ処理及び構造解析］
　精製した3糖画分を凍結乾燥し、pH6.5のリン酸クエン酸バッファへ10%の濃度で溶解した。そこへラクターゼ（製品名：GODO-YNL、合同酒精株式会社）を0.1%添加し、40℃で酵素反応を行った。アミドカラム(BEH Amide,ウォーターズ)を用いたLCMS分析の結果、反応後にコージビオース（グルコース同士がα-1,2結合で繋がった2糖、溶出時間7.75分にあたる）の生成を認めた（図３）。
　以上の結果などから、3糖画分の主成分はガラクトシルコージビオ―スであることを確認した。酵素の活性からは、乳糖のガラクトース残基への転移も考えられるが、意外なことにガラクトース残基への転移はほとんど起こらず、ガラクトシルコージビオースが生成した（下記））。
［実施例５：ガラクトシルコージビオース含有発酵乳］
（酵素液の調製）
　市販MRS液体培地で賦活培養したLactobacillus satsumensis JCM12392を以下に示す培地へ1%植え継ぎ、ジャーファーメンターにてpHを6.4へと水酸化ナトリウムによって一定に保ちながら30℃で27時間培養後、10℃以下に冷却して培養を終了した。
　得られた培養液を遠心分離して上澄みを捨てることによって、菌体濃度を15倍に濃縮したLiquorilactobacillus satsumensis濃縮液（酵素タンパク質のアミノ酸配列：SEQ ID NO:1を産生する菌体濃縮物）を酵素液とした。
（ガラクトシルコージビオース含有発酵乳の製造）
　生乳５００．０ｇ、脱脂粉乳５３．２ｇ、生クリーム２３．０ｇ、水道水４０３．６ｇ、ショ糖５０gを混合して原料乳を調製する。原料乳を９５℃の温度で加熱殺菌し、加熱殺菌された原料乳を冷却する。その後、原料乳に、Liquorilactobacillus satsumensis濃縮液（酵素液）を０．５%接種し、48℃で18時間、静置条件で発酵させたのち、Lactobacillus bulgaricusとStreptococcus thermophilusを乳酸菌スターターとして添加する。乳酸菌スターターの添加量は、２０ｇである。乳酸菌スターターが添加された原料乳をカップ容器（容量：１００ｍｌ。プラスチック製）へ充填した。カップ容器に充填された原料乳を、温度４３℃の発酵室において、乳酸酸度が０．７％となるまで静置発酵させる。
［実施例６：水溶液の熱安定性評価］
　各pHの緩衝液（pH3～6には100 mMクエン酸リン酸緩衝液、pH6～pH8には100 mMリン酸緩衝液）を用い、実施例３で得た精製分画したガラクトシルコージビオースを12°Bx（12wt%）となるよう溶解した。これを、オートクレーブ装置を用いて60℃、80℃、100℃、120℃の条件で20分間加熱処理した後のガラクトシルコージビオースの残存率を評価した。
　残存率は次の条件でHPLC法により算出した。
　カラム：SUPELCO apHeraTM NH2 HPLC Column
　移動相：68%アセトニトリル
　カラム温度：35℃
　流速：1.0 mL/min
　検出：RI
　120℃で20分間の加熱処理の結果、溶出時間15.8分付近に観察されるガラクトシルコージビオースは、pH6以下では大きな変化を認めなかった。しかし、pH7以上ではクロマトピークの減衰と同時に構造変化を受けた化合物に由来すると思われる新規なクロマトピークが溶出時間12.1分付近に発生した（図４）。
　いずれのpHにおいてもガラクトシルコージビオースに減衰が観察されなかった60℃加熱処理条件を100とした際の各温度処理条件のピーク面積を図５に示す。
［実施例７：新糖の特定］
　加熱処理によって生成した化合物（生成化合物）の分子構造を、アミドカラム(ACQUITY UPLC BEH Amide Column, 130 angstrom, 1.7 μm, 2.1 mm X 100 mm,ウォーターズ)を用いたLC/MS法によって推定した。具体的には、実施例３で得た精製分画したガラクトシルコージビオースの溶液を加熱処理し、生成した化合物（図６下）に対し、β-ガラクトシダーゼ（ラクターゼ）GODO-YNLを0.1%添加し、40℃で酵素反応を行った。結果、ガラクトース基の加水分解によりガラクトシルコージビオースから生じたコージビオースの他に、生成化合物に由来すると思われる新規な2糖のピークが観察された（図６中）。本ピークはコージビオースを異性化して得られる2-グルコシルマンノース（図６上）と溶出時間が一致した。
　したがって、加熱処理により生成した化合物はガラクトシルコージビオースの還元末端グルコースがマンノースへと異性化したグルコシルエピラクトース（α-D-Glcp-(1→2)-[β-D-Galp-(1→4)-]D-Manp）であると推定された。
　この新規化合物は、有望なプレバイオティクスであるとの報告があるエピラクトースの前駆体として有用であることが期待される（非特許文献５：Prebiotic properties of epilactose. J Dairy Sci. 2008 Dec;91(12):4518-26.）。
［実施例８：pHを調製した糖溶液及びその乾燥物の調製］
　実施例１又は実施例２で得られたガラクトシルコージビオースを含む組成物のpHを確認し、pHが7を超える場合は、食品として許容可能なpH調整剤で、pHが7以下となるように調整する。得られたpHが7以下である糖溶液は、常法により乾燥させ、粉末を調製できる。
　本発明により、ガラクトシルコージビオース等のオリゴ糖を含有する食品、及び食品の製造方法が提供される。また本発明により、様々な人々の栄養の改善が実現され、健康的な生活が確保され、福祉が促進されることが期待できる。
［配列表に記載した配列］
SEQ ID NOs:1-8  Amino acid sequence of glycoside hydrolase
SEQ ID NOs:9-21  Amino acid sequence of glycoside hydrolase (partial)

Claims (30)

  1. 　乳糖、及びショ糖を含む組成物に、グルカンスクラーゼを作用させ、ガラクトシルコージビオースを含む組成物を得る工程
    を含む、オリゴ糖含有組成物の製造方法。
  2. 　グルカンスクラーゼが、乳酸菌又はその処理物として用いられる、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　乳酸菌が、グルカンスクラーゼを定常的に発現する乳酸菌である、請求項２に記載の製造方法。
  4. 　グルカンスクラーゼが、菌体結合型である、請求項１に記載の製造方法。
  5. 　グルカンスクラーゼが、デキストランスクラーゼ活性を有するものである、請求項１に記載の製造方法。
  6. 　乳酸菌又はその処理物が、生菌体、死菌体、菌体を含む培養物、菌体破砕物、及びグルカンスクラーゼの精製物からなる群より選択されるいずれかである、請求項２に記載の製造方法。
  7. 　グルカンスクラーゼ、又はグルカンスクラーゼを発現する乳酸菌又はその処理物が、ラクトバチラシエ(Lactobacillaceae)科に属する乳酸菌に由来する、請求項１から６のいずれか１項に記載の製造方法。
  8. 　グルカンスクラーゼ、又はグルカンスクラーゼを発現する乳酸菌又はその処理物が、リクオリラクトバチルス(Liquorilactobacillus)属に属する乳酸菌に由来する、請求項１から６のいずれか１項に記載の製造方法。
  9. 　グルカンスクラーゼ、又はグルカンスクラーゼを発現する乳酸菌又はその処理物が、リクオリラクトバチルス・サツメンシス(Liquorilactobacillus satsumensis)に属する乳酸菌に由来する、請求項１から６のいずれか１項に記載の製造方法。
  10. 　乳糖、及びショ糖を含む組成物に、
    下記(A)、（B）、又は(C)のタンパク質からなるグルカンスクラーゼを作用させ、
    ガラクトシルコージビオースを含む組成物を得る工程
    を含む、オリゴ糖含有組成物の製造方法。
    (A)配列番号1～8のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質;
    (B)配列番号1～8のいずれか１に記載のアミノ酸配列と高い配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつグルカンスクラーゼ活性を有するタンパク質；
    (C)配列番号1～8のいずれか１に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸を置換、欠失、挿入、及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、かつグルカンスクラーゼ活性を有するタンパク質。
  11. 　グルカンスクラーゼが、下記(B')、又は(C')のタンパク質からなる、請求項１０に記載の製造方法。
    (B')配列番号1～8に記載のアミノ酸配列と高い配列同一性を有するアミノ酸配列であって、ただし配列番号1の位置450-467、488-499、及び559-573に相当する部分は同一であるアミノ酸配列からなり、かつグルカンスクラーゼ活性を有するタンパク質；
    (C')配列番号1～8に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸を置換、欠失、挿入、及び/又は付加したアミノ酸配列であって、ただし配列番号1の位置450-467、488-499、及び559-573に相当する部分の配列は同一であるアミノ酸配列からなり、かつグルカンスクラーゼ活性を有するタンパク質。
  12. 　原料乳、及びショ糖を含む組成物に、グルカンスクラーゼを発現する乳酸菌又はその処理物を作用させ、ガラクトシルコージビオースを含有する組成物を得る工程；及び
    　原料乳に、乳酸菌スターターを添加して発酵させ、発酵乳を得る工程
    を含む、ガラクトシルコージビオース含有発酵乳の製造方法。
  13. 　下記(A)、（B）、又は(C)のタンパク質からなるグルカンスクラーゼを含む、酵素剤。
    (A)配列番号1～8のいずれか１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質;
    (B)配列番号1～8のいずれか１に記載のアミノ酸配列と高い配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつグルカンスクラーゼ活性を有するタンパク質；
    (C)配列番号1～8のいずれか１に記載のアミノ酸配列において複数個のアミノ酸を置換、欠失、挿入、及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、かつグルカンスクラーゼ活性を有するタンパク質。
  14. 　グルカンスクラーゼが、下記(B')、又は(C')のタンパク質からなる、請求項１３に記載の酵素剤。
    (B')配列番号1～8に記載のアミノ酸配列と高い配列同一性を有するアミノ酸配列であって、ただし、配列番号1の位置450-467、488-499、及び559-573に相当する部分は同一であるアミノ酸配列からなり、かつグルカンスクラーゼ活性を有するタンパク質；
    (C')配列番号1～8に記載のアミノ酸配列において複数個のアミノ酸を置換、欠失、挿入、及び/又は付加したアミノ酸配列であって、ただし、配列番号1の位置450-467、488-499、及び559-573に相当する部分の配列は同一であるアミノ酸配列からなり、かつグルカンスクラーゼ活性を有するタンパク質。
  15. 　グルカンスクラーゼが、グルカンスクラーゼを発現する乳酸菌の、生菌体、死菌体、菌体を含む培養物、菌体破砕物からなる群より選択されるいずれかとして含まれる、請求項１３又は１４に記載の酵素剤。
  16. 　請求項１から６のいずれか１項の製造方法に用いる、請求項１３又は１４に記載の酵素剤。
  17. 　グルコシルエピラクトースを製造するための、請求項１３又は１４に記載の酵素剤。
  18. 　ｐＨが７未満である、ガラクトシルコージビオースを含む溶液。
  19. 　ガラクトシルコージビオースを含む組成物であって、固形分濃度１０～８０％の溶液としたときのｐＨが７未満である、組成物。
  20. 　フルクトースを、固形物あたり１０％以上含む、請求項１９に記載の組成物。
  21. 　請求項１から６、及び１０から１２のいずれか１項に記載の製造方法により得られる、請求項１８に記載の溶液、又は請求項１９若しくは２０に記載の組成物。
  22. 　以下の特徴を有する、ガラクトシルコージビオースを含む組成物。
    （１）ガラクトシルコージビオースを、固形分あたり１５～４０％含む
    （２）フルクトースを固形分あたり１５～４５％含む
    （３）固形分濃度１２％の溶液として１２０℃、２０分加熱したときのガラクトシルコージビオースの残存率が、８０％以上である
  23. 　グルコシルエピラクトース、又はそれを含む組成物。
  24. 　請求項１から６、及び１０から１２のいずれか１項に記載の製造方法であって、得られた組成物のｐＨを７未満に調整する工程、
    をさらに含む、製造方法。
  25. 　請求項１から６、及び１０から１２のいずれか１項に記載の製造方法であって、オリゴ糖含有組成物が、ガラクトシルコージビオースとフルクトースを含む、製造方法。
  26. 　請求項１から６、及び１０から１２のいずれか１項に記載の製造方法であって、オリゴ糖含有組成物が、ガラクトシルコージビオースを、固形分あたり１０％以上１００％以下含む、製造方法。
  27. 　請求項１から６、及び１０から１２のいずれか１項に記載の製造方法であって、オリゴ糖含有組成物が、フルクトースを、固形分あたり１％以上含む、製造方法。
  28. 　請求項１から６、及び１０から１２のいずれか１項に記載の製造方法であって、オリゴ糖含有組成物が、ガラクトシルコージビオースと乳糖との質量比（ガラクトシルコージビオース：乳糖）が、１５～４０：１５～３０である、製造方法。
  29. 　請求項１から６、及び１０から１２のいずれか１項に記載の製造方法であって、オリゴ糖含有組成物が、グルコシルエピラクトースを含む、製造方法。
  30. 　請求項１８から２３のいずれか１項に記載のオリゴ糖含有組成物を製造するための、請求項１から６、及び１０から１２のいずれか１項に記載の製造方法。
     
     
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