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WO2023224096A1 - 共通がん抗原カクテルを利用した、がんワクチン、ｔｃｒ／ｃａｒ－ｔ細胞治療薬、コンパニオン診断方法、および血中循環がん細胞検出によるがんの発症リスク診断方法 - Google Patents

共通がん抗原カクテルを利用した、がんワクチン、ｔｃｒ／ｃａｒ－ｔ細胞治療薬、コンパニオン診断方法、および血中循環がん細胞検出によるがんの発症リスク診断方法 Download PDF

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WO2023224096A1
WO2023224096A1 PCT/JP2023/018618 JP2023018618W WO2023224096A1 WO 2023224096 A1 WO2023224096 A1 WO 2023224096A1 JP 2023018618 W JP2023018618 W JP 2023018618W WO 2023224096 A1 WO2023224096 A1 WO 2023224096A1
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WO
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seq
protein
combination
cancer
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English (en)
French (fr)
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哲也 中面
一政 竹之内
信夫 塚本
真菜美 下村
利宙 鈴木
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National Cancer Center Japan
National Cancer Center Korea
Original Assignee
National Cancer Center Japan
National Cancer Center Korea
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Priority to CN202380041568.5A priority patent/CN119384291A/zh
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • the present invention relates to a cancer vaccine that utilizes a common cancer antigen cocktail.
  • the present invention further relates to a TCR/CAR-T cell therapeutic agent, a companion diagnostic method, and a method for diagnosing the risk of developing cancer by detecting circulating cancer cells.
  • TCR/CAR-T cell therapy has not yet appeared as a promising treatment for solid cancers. Furthermore, there is no technology that can be said to have been perfected for capturing CTCs, and there is no technology that can reliably prove that cells that appear to be CTCs are cancer cells and can help diagnose the risk of cancer recurrence or onset. Vaccines using neoantigens and TCR-T cell therapy, which have attracted attention, are also individualized treatments, and the development costs and regulatory hurdles are high.
  • the antigens expressed in the target cancer cells are important.
  • antigens it is difficult to use neoantigens that can be treated individually, and so-called common cancer antigens, which are frequently expressed in cancer but not expressed in most normal organs, are important.
  • common cancer antigens expressed on cell membranes are particularly required for CAR-T cell therapy, antibody therapy, or for capturing circulating cancer cells.
  • cancer antigens such as the cancer testis antigens that have been reported, are not expressed on cell membranes, have a low frequency of expression, or are expressed in normal tissues as well.
  • the present invention provides a cancer vaccine, a TCR/CAR-T cell therapeutic agent, a companion diagnostic method, and a method for diagnosing the risk of developing cancer by detecting circulating cancer cells using a common cancer antigen cocktail. was set as a problem to be solved.
  • the present inventors have identified 10 types of common cancer antigens that are frequently expressed in various solid tumors but rarely expressed in normal tissues through immunohistochemical analysis. Identified. Five of these are membrane protein antigens, which are responsible for most of the solid cancers examined so far, including head and neck cancer, lung cancer, liver cancer, biliary tract cancer, pancreatic cancer, and colorectal cancer. At least one of these five types of antigens is expressed, proving that these common cancer antigen cocktails can cover all solid cancers. The present invention was completed based on the above findings.
  • ⁇ 1> A common cancer antigen containing three or more selected from GPC3, ROBO1, EPHB4, CLDN1, and LAT1 (SLC7A5); (2) a partial peptide of the three or more common cancer antigens that has CTL inducing ability; (3) Dendritic cells stimulated with the partial peptide; or (4) mRNA encoding the common cancer antigen or the partial peptide. including cancer vaccines.
  • the common cancer antigen further includes one or more of AFP, TGFBI, SPARC, HSP105 ⁇ (HSPH1), and FOXM1.
  • ⁇ 3> The cancer vaccine according to ⁇ 1>, wherein the common cancer antigen includes all of GPC3, ROBO1, EPHB4, CLDN1, and LAT1.
  • ⁇ 4> The cancer vaccine according to ⁇ 1>, wherein the common cancer antigen includes all of GPC3, ROBO1, EPHB4, CLDN1, LAT1, AFP, TGFBI, SPARC, HSP105 ⁇ , and FOXM1.
  • ⁇ 5> The cancer vaccine according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4>, wherein the partial peptide is a peptide having an amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOS: 1 to 80.
  • ⁇ 6> (1) A common cancer antigen containing three or more selected from GPC3, ROBO1, EPHB4, CLDN1, LAT1, AFP, TGFBI, SPARC, HSP105 ⁇ , and FOXM1; (2) a partial peptide of the three or more common cancer antigens that has CTL inducing ability; (3) Dendritic cells stimulated with the partial peptide; or (4) mRNA encoding the common cancer antigen or the partial peptide. including cancer vaccines.
  • ⁇ 7> A peptide having the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 5, 7-10, 14-22, 24-38, 40, 42, 48, 49, 52-80.
  • a CAR-T cell therapeutic agent comprising a mixture of T cells having a chimeric antigen receptor (CAR) for a common cancer antigen containing three or more selected from GPC3, ROBO1, EPHB4, CLDN1, and LAT1.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • the common cancer antigen further includes one or more of AFP, TGFBI, SPARC, HSP105 ⁇ , and FOXM1.
  • the common cancer antigen includes all of GPC3, ROBO1, EPHB4, CLDN1, and LAT1.
  • a CAR-T cell therapy agent comprising: ⁇ 13> A mixture of T cells having T cell receptors (TCR) capable of recognizing MHC class I-binding antigen peptides derived from common cancer antigens, including three or more of GPC3, ROBO1, EPHB4, CLDN1, and LAT1.
  • TCR T cell receptors
  • a TCR-T cell therapy drug comprising: ⁇ 14> The TCR-T cell therapeutic agent according to ⁇ 13>, wherein the common cancer antigen further includes one or more of AFP, TGFBI, SPARC, HSP105 ⁇ , and FOXM1.
  • the common cancer antigen includes all of GPC3, ROBO1, EPHB4, CLDN1, and LAT1.
  • the common cancer antigen includes all of GPC3, ROBO1, EPHB4, CLDN1, LAT1, AFP, TGFBI, SPARC, HSP105 ⁇ , and FOXM1.
  • T cell receptor capable of recognizing MHC class I-binding antigen peptides derived from common cancer antigens including three or more of GPC3, ROBO1, EPHB4, CLDN1, LAT1, AFP, TGFBI, SPARC, HSP105 ⁇ , and FOXM1
  • a TCR-T cell therapy comprising a mixture of T cells having a TCR body (TCR).
  • T cell receptor A heterodimer consisting of a combination of the protein of SEQ ID NO: 103 and the protein of SEQ ID NO: 104; A heterodimer consisting of a combination of the protein of SEQ ID NO: 105 and the protein of SEQ ID NO: 106; A heterodimer consisting of a combination of the protein of SEQ ID NO: 107 and the protein of SEQ ID NO: 108; A heterodimer consisting of a combination of the protein of SEQ ID NO: 109 and the protein of SEQ ID NO: 110; A heterodimer consisting of a combination of the protein of SEQ ID NO: 111 and the protein of SEQ ID NO: 112; A heterodimer consisting of a combination of the protein of SEQ ID NO: 123 and the protein of SEQ ID NO: 124; A heterodimer consisting of a combination of the protein of SEQ ID NO: 125 and the protein of SEQ ID NO: 126; A heterodimer consisting of TCR
  • ⁇ 21> A gene having the base sequence of any of SEQ ID NOs: 113-122, 149-176, 185-192, 204-214, and 220-224.
  • step 1 The companion diagnostic method according to ⁇ 22>, wherein in step 1, the presence or absence of expression of one or more of AFP, TGFBI, SPARC, HSP105 ⁇ , and FOXM1 is further measured.
  • ⁇ 24> The companion diagnostic method according to ⁇ 22>, wherein in step 1, the presence or absence of expression of all GPC3, ROBO1, EPHB4, CLDN1, and LAT1 is measured.
  • step 1 the presence or absence of expression of all of GPC3, ROBO1, EPHB4, CLDN1, LAT1, AFP, TGFBI, SPARC, HSP105 ⁇ , and FOXM1 is measured.
  • step 1 the presence or absence of expression of all of GPC3, ROBO1, EPHB4, CLDN1, LAT1, AFP, TGFBI, SPARC, HSP105 ⁇ , and FOXM1 is measured.
  • a method for diagnosing the risk of developing cancer comprising analyzing the expression of three or more of GPC3, ROBO1, EPHB4, CLDN1, and LAT1 in cells in a blood sample derived from a subject.
  • ⁇ 27> The method for diagnosing the risk of developing cancer according to ⁇ 26>, further comprising analyzing the expression of one or more of AFP, TGFBI, SPARC, HSP105 ⁇ , and FOXM1.
  • ⁇ 28> The method for diagnosing the risk of developing cancer according to ⁇ 26>, wherein all expressions of GPC3, ROBO1, EPHB4, CLDN1, and LAT1 are analyzed.
  • ⁇ 29> The method for diagnosing the risk of developing cancer according to ⁇ 26>, which analyzes the expression of all of GPC3, ROBO1, EPHB4, CLDN1, LAT1, AFP, TGFBI, SPARC, HSP105 ⁇ , and FOXM1.
  • a cancer vaccine a TCR/CAR-T cell therapeutic agent, a companion diagnostic method, and a method for detecting circulating cancer cells using a common cancer antigen cocktail.
  • a method for diagnosing the risk of developing cancer is provided.
  • Figure 1 shows the results of immunohistochemical staining using paraffin-embedded tissue sections to confirm the expression of 10 common cancer antigens in hepatocellular carcinoma.
  • Figure 2 shows the expression of cell membrane-expressed common cancer antigens GPC3, EPHB4, CLDN1, LAT1, and ROBO1 in each cancer type.
  • Figure 3 shows the expression of common cancer antigens and the expression of HLA-Class I in childhood cancers of neuroblastoma, nephroblastoma, and choriocarcinoma.
  • FIG. 4 shows the results of confirming the expression of each common cancer antigen in the non-cancerous area of a human clinical specimen of hepatocellular carcinoma.
  • Figure 5 shows the expression of cell membrane-expressed common cancer antigens in 31 normal tissues using a human normal tissue microarray, including GPC3, EPHB4, CLDN1, LAT1, and ROBO1.
  • Figure 6 shows the development of an applied diagnostic system using multiplex fluorescent immunostaining to determine which common cancer antigens are effective targets for immunotherapies such as TCR-T, CAR-T, and cancer vaccines. Demonstrate a concept.
  • Figure 7 shows that PDX was obtained using specimens from hepatocellular carcinoma and lung cancer patients, and human clinical specimens were specimens from patients with hepatocellular carcinoma, intrahepatic cholangiocarcinoma, and oropharyngeal cancer (HPV-).
  • FIG. 8 shows the gene expression of each cancer antigen in hepatocellular carcinoma and primary colorectal cancer.
  • FIG. 9 shows the gene expression of each cancer antigen in hepatocellular carcinoma and colorectal cancer liver metastasis for which antigen prediction was performed.
  • FIG. 10 shows a prediction pipeline for cancer antigen-derived epitope peptides.
  • FIG. 11 shows the distribution of SCOREadj of each cancer antigen-derived peptide in hepatocellular carcinoma.
  • Figure 12 shows the total number of cancer antigen peptides predicted in 7 hepatocellular carcinoma cases.
  • Figure 13 shows a method for identifying common cancer antigen-derived epitope peptides that can induce antigen-specific T cells. From the amino acid sequences of 10 common cancer antigens, 72 HLA-A*24:02-restricted epitope peptides and HLA-A*02:01 were created using an algorithm established through joint research with BrightPath Bio. The results of predicting 73 types of restricted epitope peptides, vaccinating transgenic mice with the synthesized peptides, and evaluating the production of antigen-specific IFN- ⁇ using the ELISpot method are shown.
  • Figure 14 shows that a peptide predicted to be presented at HLA-A*02:01 was synthesized from the full-length amino acid sequences of 10 types of common cancer antigen proteins, and human HLA-A*02:01 was expressed in cells throughout the body. The results are shown in which a large number of peptides were screened to induce peptide-reactive CD8-positive killer T cells (CTL) in splenocytes by administering a peptide vaccine once a week for a total of three times to mice.
  • CTL CD8-positive killer T cells
  • Figure 15 shows that a peptide predicted to be presented at HLA-A*24:02 was synthesized from the full-length amino acid sequences of 10 types of common cancer antigen proteins, and human HLA-A*24:02 was expressed in cells throughout the body. The results are shown in which a large number of peptides were screened to induce peptide-reactive CD8-positive killer T cells (CTL) in splenocytes by administering a peptide vaccine once a week for a total of three times to mice.
  • CTL CD8-positive killer T cells
  • Figure 16 shows whether antigen-specific T cells are induced by vaccinating transgenic mice with common cancer antigen-derived short peptide-sensitized dendritic cells (DC), which have been confirmed to induce CTLs.
  • DC common cancer antigen-derived short peptide-sensitized dendritic cells
  • FIG. 17 shows that HLA-A*24:02 transgenic mice were vaccinated with short peptide-sensitized dendritic cells (DC) derived from common cancer antigens, which have been confirmed to induce CTLs, and antigen-specific T cells were induced.
  • DC short peptide-sensitized dendritic cells
  • FIG. 18 shows that HLA-A*02:01 transgenic mice were vaccinated with short peptide-sensitized dendritic cells (DCs) derived from common cancer antigens, which have been confirmed to induce CTLs, and antigen-specific T cells were induced.
  • DCs short peptide-sensitized dendritic cells
  • FIG. 19 shows that using a long peptide containing the sequence of a short peptide derived from a common cancer antigen that has been confirmed to induce CTL, HLA The results of verification using -A*02:01 Tgm or HLA-A*24:02 Tgm are shown.
  • Figure 20 shows the administration method for three doses of LNP-Covid-19 Spike mRNA.
  • Figure 21 shows the results of Spike antigen-specific IFN- ⁇ production in spleen cells of HLA-A*02:01 Tg mice administered with LNP-Covid-19 Spike mRNA three times.
  • Figure 22 shows the results of Spike antigen-specific IFN- ⁇ production in spleen cells of HLA-A*02:01 Tg mice administered with LNP-eGFP mRNA three times.
  • Figure 23 shows the results of Spike antigen-specific IFN- ⁇ production in inguinal lymph node cells of HLA-A*02:01 Tg mice administered three times with LNP-Covid-19 Spike mRNA or LNP-eGFP mRNA.
  • Figure 24 shows the results of Spike antigen-specific IFN- ⁇ production in spleen cells of HLA-A*24:02 Tg mice administered with LNP-Covid-19 Spike mRNA three times.
  • Figure 25 shows the results of Spike antigen-specific IFN- ⁇ production in spleen cells of HLA-A*24:02 Tg mice administered with LNP-eGFP mRNA three times.
  • Figure 26 shows the results of Spike antigen-specific IFN- ⁇ production in inguinal lymph node cells of HLA-A*24:02 Tg mice administered three times with LNP-Covid-19 Spike mRNA or LNP-eGFP mRNA.
  • Figure 27 shows the administration method for two doses of LNP-Covid-19 Spike mRNA.
  • Figure 28 shows the results of Spike antigen-specific IFN- ⁇ production in spleen cells of HLA-A*02:01 Tg mice administered twice with LNP-Covid-19 Spike mRNA.
  • Figure 29 shows the results of Spike antigen-specific IFN- ⁇ production in spleen cells of HLA-A*02:01 Tg mice administered twice with LNP-eGFP mRNA.
  • Figure 30 shows the results of Spike antigen-specific IFN- ⁇ production in inguinal lymph node cells of HLA-A*02:01 Tg mice administered twice with LNP-Covid-19 Spike mRNA or LNP-eGFP mRNA.
  • Figure 31 shows the results of Spike antigen-specific IFN- ⁇ production in spleen cells of HLA-A*24:02 Tg mice administered twice with LNP-Covid-19 Spike mRNA.
  • Figure 32 shows the results of Spike antigen-specific IFN- ⁇ production in spleen cells of HLA-A*24:02 Tg mice administered twice with LNP-eGFP mRNA.
  • Figure 33 shows the results of Spike antigen-specific IFN- ⁇ production in inguinal lymph node cells of HLA-A*24:02 Tg mice administered twice with LNP-Covid-19 Spike mRNA or LNP-eGFP mRNA.
  • Figure 34 shows the results of antibody measurements against Spike protein.
  • Figure 35 shows the administration method for three doses of LNP-hGPC3 mRNA.
  • Figure 36 shows the results of administering LNP-hGPC3 mRNA to HLA-A*02:01 Tg mice and evaluating the production of antigen-specific IFN- ⁇ in spleen cells by ELISPOT.
  • Figure 37 shows the results of administering LNP-Luciferase mRNA to HLA-A*02:01 Tg mice and evaluating the production of antigen-specific IFN- ⁇ in spleen cells by ELISPOT.
  • Figure 38 shows the results of administering LNP-hGPC3 mRNA to HLA-A*24:02 Tg mice and evaluating the production of antigen-specific IFN- ⁇ in spleen cells by ELISPOT.
  • Figure 39 shows the results of administering LNP-Luciferase mRNA to HLA-A*24:02 Tg mice and evaluating the production of antigen-specific IFN- ⁇ in spleen cells by ELISPOT.
  • Figure 40 shows the administration method for three doses of LNP-hROBO1 mRNA.
  • Figure 41 shows the results of administering LNP-hROBO1 mRNA or LNP-eGFP mRNA to HLA-A*02:01 Tg mice and evaluating the production of antigen-specific IFN- ⁇ in spleen cells by ELISPOT.
  • Figure 42 shows the results of administering LNP-hROBO1 mRNA or LNP-eGFP mRNA to HLA-A*24:02 Tg mice and evaluating the production of antigen-specific IFN- ⁇ in spleen cells by ELISPOT.
  • Figure 43 shows an administration method for administering LNP-hCLDN1 mRNA or LNP-hEPHB4 mRNA three times.
  • Figure 44 shows that LNP-hCLDN1 mRNA, LNP-hEPHB4 mRNA, or LNP-eGFP mRNA was administered to HLA-A*02:01 Tg mice, and the production of antigen-specific IFN- ⁇ in spleen cells was detected by ELISPOT. The results of the evaluation are shown.
  • FIG. 46 shows an administration method for administering LNP-hTGFBI mRNA or LNP-hSPARC mRNA three times.
  • Figure 47 shows that LNP-hTGFBI mRNA, LNP-hSPARC mRNA, or LNP-eGFP mRNA was administered to HLA-A*02:01 Tg mice, and the production of antigen-specific IFN- ⁇ in spleen cells was detected using the ELISPOT method. The results of the evaluation are shown.
  • Figure 48 shows that LNP-hTGFBI mRNA, LNP-hSPARC mRNA, or LNP-eGFP mRNA was administered to HLA-A*24:02 Tg mice, and the production of antigen-specific IFN- ⁇ in spleen cells was detected using the ELISPOT method. The results of the evaluation are shown.
  • Figure 49 shows the administration method for three doses of LNP-hAFP mRNA or LNP-hHSP105 ⁇ mRNA.
  • Figure 50 shows that LNP-hAFP mRNA, LNP-hHSP105 ⁇ mRNA, or LNP-eGFP mRNA was administered to HLA-A*02:01 Tg mice, and the production of antigen-specific IFN- ⁇ in spleen cells was detected using the ELISPOT method. The results of the evaluation are shown.
  • Figure 51 shows that LNP-hAFP mRNA, LNP-hHSP105 ⁇ mRNA, or LNP-eGFP mRNA was administered to HLA-A*24:02 Tg mice, and the production of antigen-specific IFN- ⁇ in spleen cells was detected using the ELISPOT method. The results of the evaluation are shown.
  • Figure 52 shows the administration method for three doses of LNP-(hCLDN1+hEPHB4) mRNA.
  • Figure 53 shows that LNP-(hCLDN1+hEPHB4) mRNA or LNP-Luciferase mRNA was administered to HLA-A*02:01 Tg mice, and the production of antigen-specific IFN- ⁇ in spleen cells was evaluated using the ELISPOT method.
  • Figure 54 shows that LNP-(hCLDN1+hEPHB4) mRNA or LNP-Luciferase mRNA was administered to HLA-A*02:01 Tg mice, and the production of antigen-specific IFN- ⁇ in the inguinal lymph nodes was measured using the ELISPOT method. The results of the evaluation are shown.
  • Figure 55 shows that LNP-(hCLDN1+hEPHB4) mRNA or LNP-Luciferase mRNA was administered to HLA-A*24:02 Tg mice, and the production of antigen-specific IFN- ⁇ in spleen cells was evaluated using the ELISPOT method. The results are shown below.
  • Figure 56 shows that LNP-(hCLDN1+hEPHB4) mRNA or LNP-Luciferase mRNA was administered to HLA-A*24:02 Tg mice, and the production of antigen-specific IFN- ⁇ in the inguinal lymph nodes was measured using the ELISPOT method. The results of the evaluation are shown.
  • Figure 57 shows a method for selecting high affinity T cell clones by inhibiting binding of CD8 molecules to MHC.
  • Figure 58 shows the establishment of peptide-specific CTL clones from peripheral blood of patients who received the GPC3 peptide vaccine.
  • Figure 59 shows the establishment of peptide-specific CTL clones from peripheral blood of patients who received the FOXM1 peptide vaccine.
  • Figure 60 shows the establishment of peptide-specific CTL clones from peripheral blood of patients who received the HSP105 peptide vaccine.
  • Figure 61 shows identification of peptide-reactive TCR genes using human HLA transgenic mice.
  • Figure 62 shows the production of TCR-T cells that recognize a common cancer antigen (FOXM1) by electroporation.
  • Figure 63 shows a development scheme for cocktail TCR-T cells to overcome cancer diversity.
  • Figure 64 shows in vitro cytotoxicity evaluation using CAR-T cells.
  • Figure 65 shows in vivo cytotoxicity evaluation using CAR-T cells.
  • Figure 66 shows the development of cocktail CAR-T therapy.
  • Figure 67 shows the results of expression analysis of membrane protein common cancer antigen in various cancer cell lines.
  • Figure 68 shows the results of expression analysis of membrane protein common cancer antigen in various cancer cell lines.
  • Figure 69 shows the results of detecting CTC-like cells expressing any of the membrane protein common cancer antigens GPC3, ROBO1, CLDN1, and EPHB4 on their cell membranes in blood samples from cases of hepatocellular carcinoma.
  • the present inventors identified 10 types of common cancer antigens that are frequently expressed in various solid cancers but rarely expressed in normal tissues. Five of these are membrane protein antigens, which are responsible for most of the solid cancers examined so far, including head and neck cancer, lung cancer, liver cancer, biliary tract cancer, pancreatic cancer, and colorectal cancer. At least one of these five types of antigens is expressed, proving that these common cancer antigen cocktails can cover all solid cancers.
  • cancer vaccines TCR-T cell therapy, CAR-T cell therapy, their companion diagnostics, and detection of circulating cancer cells in the blood can be used to develop cancer vaccines, TCR-T cell therapy, CAR-T cell therapy, and the development of cancer by detecting circulating cancer cells. It was shown that risk diagnosis is possible.
  • peptides predicted to be presented on HLA-A24 and peptides predicted to be presented on HLA-A2 are synthesized from the full-length amino acid sequences of 10 types of common cancer antigen proteins. - Proving that CD8-positive killer T cells (CTL) that react to the peptide were induced in splenocytes by administering a peptide vaccine three times, once a week, to mice that express A2 in cells throughout the body. did.
  • CTL CD8-positive killer T cells
  • peptides have excellent CTL inducing ability, and can be applied to cancer treatment, recurrence prevention, or prevention by peptide vaccines or dendritic cell vaccines to which peptides have been added.
  • the 10 common cancer antigens contain numerous peptide sequences that can induce CTL, and can also be applied as mRNA vaccines.
  • T cells that are on the cell surface of CTL that specifically react to peptides and that recognize complexes of HLA and peptides on the surface of cancer cells were induced by administration of peptide vaccines derived from 10 types of common cancer antigens.
  • TCR T cell therapy
  • TCR-T therapy T cell therapy
  • cocktail TCR-T therapy that is optimal for each patient or applicable to various cancers is possible.
  • One of the 10 membrane protein common cancer antigens is expressed in most cancer tissues. This means that cocktail antibody therapy or cocktail CAR-T therapy against these can be used as a treatment for most solid tumors.
  • isoforms include splicing variants and SNP variants based on individual differences. Specifically, a protein consisting of an amino acid sequence having preferably 95% or more, more preferably 98% or more sequence identity with the amino acid sequence described in the above Examples, (2) a protein as described in the above Examples In the amino acid sequence, one or more, preferably 1 to several, more preferably 1 to 10, 1 to 5, 1 to 3, 1 or 2 amino acids are substituted, deleted, added or inserted. Examples include proteins consisting of a sequence of amino acids.
  • the peptides and proteins in the present invention include operations such as cloning of DNA based on the base sequence information of the gene encoding the peptides, plasmid construction, transfection into a host, culturing of transformants, and recovery of proteins from the culture. It can be produced by general genetic engineering techniques using expression vectors, cloning vectors, and the like.
  • a recombinant vector can be produced by integrating a polynucleotide into an appropriate vector.
  • the vector may be appropriately selected depending on the type of host and the purpose of use.
  • examples of vectors include vectors derived from chromosomes, episomes, viruses, and the like. Specifically, vectors derived from, for example, bacterial plasmids, bacteriophages, transposons, yeast episomes, insertion elements, yeast chromosomal elements, viruses (such as baculovirus, papovavirus, SV40, vaccinia virus, adenovirus, and retrovirus), etc. and combinations thereof, plasmids, and vectors derived from bacteriophage genetic elements (eg, cosmids, phagemids, etc.).
  • a recombinant vector containing the polynucleotide By inserting a polynucleotide into a vector by a known method, a recombinant vector containing the polynucleotide can be obtained.
  • the recombinant vector into which the polynucleotide has been integrated can be injected into known hosts such as Escherichia coli, bacteria such as Bacillus, yeast, insect cells, or animal cells (e.g., COS-7 cells, Vero cells, CHO cells, etc.).
  • known hosts such as Escherichia coli, bacteria such as Bacillus, yeast, insect cells, or animal cells (e.g., COS-7 cells, Vero cells, CHO cells, etc.).
  • COS-7 cells e.g., COS-7 cells, Vero cells, CHO cells, etc.
  • ⁇ Gene introduction can be performed by methods known to those skilled in the art. Specific examples include calcium phosphate transfection, DEAE-dextran-mediated transfection, microinjection, cationic lipid-mediated transfection, electroporation, transduction, infection, and the like.
  • the cancer vaccine of the present invention is (1) A common cancer antigen containing three or more selected from GPC3, ROBO1, EPHB4, CLDN1, and LAT1; (2) a partial peptide of the three or more common cancer antigens that has CTL inducing ability; (3) Dendritic cells stimulated with the partial peptide; or (4) mRNA encoding the common cancer antigen or the partial peptide. including.
  • the common cancer antigen may include three or more types selected from GPC3, ROBO1, EPHB4, CLDN1, and LAT1, and three or four types selected from GPC3, ROBO1, EPHB4, CLDN1, and LAT1. , or may contain five types.
  • the common cancer antigen may include all of GPC3, ROBO1, EPHB4, CLDN1, and LAT1.
  • the common cancer antigen may further include one or more of AFP, TGFBI, SPARC, HSP105 ⁇ , and FOXM1. That is, the common cancer antigen may further include one, two, three, four, or five of AFP, TGFBI, SPARC, HSP105 ⁇ , and FOXM1.
  • the common cancer antigen may include all of GPC3, ROBO1, EPHB4, CLDN1, LAT1, AFP, TGFBI, SPARC, HSP105 ⁇ , and FOXM1.
  • partial peptides of the three or more types of common cancer antigens described above that have CTL inducing ability can be used as a cancer vaccine. That is, at least three types of partial peptides are used as the partial peptides.
  • the partial peptide may contain at least three types selected from the partial peptide of GPC3, the partial peptide of ROBO1, the partial peptide of EPHB4, the partial peptide of CLDN1, and the partial peptide of LAT1, It may contain three, four, or five types selected from a partial peptide of GPC3, a partial peptide of ROBO1, a partial peptide of EPHB4, a partial peptide of CLDN1, and a partial peptide of LAT1.
  • the partial peptide may include all of the partial peptides of GPC3, ROBO1, EPHB4, CLDN1, and LAT1.
  • partial peptides include AFP partial peptide, TGFBI partial peptide, and SPARC partial peptide. It may further contain one or more of a peptide, a partial peptide of HSP105 ⁇ , and a partial peptide of FOXM1. That is, the common cancer antigen is one, two, three, four, or five of AFP partial peptide, TGFBI partial peptide, SPARC partial peptide, HSP105 ⁇ partial peptide, and FOXM1 partial peptide. may further include.
  • the partial peptide is a partial peptide of GPC3, a partial peptide of ROBO1, a partial peptide of EPHB4, a partial peptide of CLDN1, a partial peptide of LAT1, a partial peptide of AFP, a partial peptide of TGFBI, a partial peptide of SPARC, a partial peptide of HSP105 ⁇ . It may contain all of the peptide and partial peptide of FOXM1.
  • the above partial peptide is an epitope peptide, which binds to MHC (HLA in humans), is antigen-presented on the cell surface, and has antigenicity (can be recognized by T cells).
  • Epitope peptides include CTL epitope peptides, which are epitope peptides that bind to MHC class I, are presented as antigens, and are recognized by CD8-positive T cells, and CTL epitope peptides that are presented as antigens, that bind to MHC class II, and are recognized by CD4-positive T cells.
  • helper epitope peptides that are epitope peptides that can be used.
  • the partial peptide in the present invention is preferably a CTL epitope peptide, which is an epitope peptide that binds to MHC class I, is presented as an antigen, and is recognized by CD8-positive T cells.
  • the partial peptide in the present invention is a peptide derived from a protein specifically expressed in tumor cells, and is a tumor antigen peptide.
  • Antigen presentation is a phenomenon in which a peptide present within a cell binds to MHC, and this MHC/antigen peptide complex is localized on the cell surface. After antigens presented on the cell surface are recognized by T cells and the like, they activate cell-mediated immunity and humoral immunity. Antigens presented to MHC class I activate cell-mediated immunity and are recognized by the T cell receptors of naive T cells, inducing them to become CTLs with cytotoxic activity, which can be used for immunotherapy.
  • the tumor antigen peptide used for this purpose is preferably a peptide that binds to MHC class I and presents the antigen.
  • the partial peptide in the present invention is a partial peptide of GPC3, ROBO1, EPHB4, CLDN1, LAT1, AFP, TGFBI, SPARC, HSP105 ⁇ , or FOXM1, and is preferably a peptide that binds to MHC, especially HLA.
  • the partial peptide is preferably capable of binding to HLA class I, more preferably capable of binding to HLA-A02 and/or HLA-A24.
  • the amino acid length of the partial peptide is not particularly limited as long as it includes the amino acid sequence of the epitope, but generally the amino acid length is preferably about 8 to 14 amino acids, more preferably about 8 to 11 amino acids, and approximately Particularly preferred is about 9 to about 11 amino acids.
  • the epitope peptide that binds to HLA class I which is human MHC class I, has a length of about 8 to 14 amino acids, preferably about 9 to 11 amino acids, and may have a binding motif specific to HLA in its sequence.
  • HLA class I which is human MHC class I
  • a peptide that binds to HLA-A02 has a bond in which the second amino acid from the N-terminus may be leucine, isoleucine, or methionine, and/or the C-terminal amino acid may be valine, leucine, or isoleucine.
  • the peptide that binds to HLA-A24 may have a motif in which the second amino acid from the N-terminus is tyrosine, phenylalanine, methionine, or tryptophan, and/or the C-terminal amino acid is leucine, isoleucine, or It may have a binding motif which may be phenylalanine, but is not limited to the above.
  • the partial peptide is preferably a partial peptide of GPC3, ROBO1, EPHB4, CLDN1, LAT1, AFP, TGFBI, SPARC, HSP105 ⁇ , or FOXM1, and is a partial peptide of 8 to 14 consecutive amino acids in the amino acid sequence of the protein.
  • the second amino acid from the N-terminus may be leucine, isoleucine, or methionine, and/or the C-terminal amino acid may be valine, leucine, or isoleucine.
  • the partial peptide is preferably a partial peptide of GPC3, ROBO1, EPHB4, CLDN1, LAT1, AFP, TGFBI, SPARC, HSP105 ⁇ , or FOXM1, and is comprised of 8 to 14 consecutive amino acids in the amino acid sequence of the above protein.
  • the second amino acid from the N-terminus may be tyrosine, phenylalanine, methionine, or tryptophan, and/or the C-terminal amino acid may be leucine, isoleucine, or phenylalanine, but the above It is not limited.
  • the partial peptide may be modified at the N-terminus and/or C-terminus.
  • modifications include N-alkanoylation (e.g., acetylation), N-alkylation (e.g., methylation), C-terminal alkyl ester (e.g., ethyl ester), and C-terminal amide (e.g., carboxamide).
  • N-alkanoylation e.g., acetylation
  • N-alkylation e.g., methylation
  • C-terminal alkyl ester e.g., ethyl ester
  • C-terminal amide e.g., carboxamide
  • a peptide having an amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to 80 can be used.
  • peptides having the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 5, 7-10, 14-22, 24-38, 40, 42, 48, 49, 52-80 are novel peptides.
  • the partial peptides described above have CTL-inducing activity and can be used as tumor antigen peptides and CTL-inducing agents. That is, by isolating peripheral blood lymphocytes from a human positive for HLA-A02 antigen or HLA-A24 antigen and stimulating them in vitro with the addition of the above-mentioned partial peptide, HLA-A02 antigen presenting the above-mentioned partial peptide is obtained. CTLs that specifically recognize positive cells or HLA-A24 antigen-positive cells can be induced.
  • CTLs The presence or absence of induction of CTLs can be confirmed by, for example, measuring the amount of various cytokines (eg, IFN- ⁇ ) produced by CTLs in response to antigen peptide-presenting cells by, for example, ELISA. It can also be confirmed by a method of measuring the toxicity of CTL against 51Cr-labeled antigen peptide-presenting cells.
  • cytokines eg, IFN- ⁇
  • dendritic cells stimulated with a partial peptide can be used as a cancer vaccine. That is, by bringing the partial peptide into contact with dendritic cells in vitro, antigen-presenting cells are produced that present a complex of the HLA-A02 antigen or HLA-A24 antigen and the partial peptide of the present invention on the cell surface. be able to.
  • isolated cells derived from cancer patients can be used as the dendritic cells.
  • Dendritic cells can be obtained, for example, by separating lymphocytes from the peripheral blood of cancer patients using the Ficoll method, then removing non-adherent cells, and culturing the adherent cells in the presence of GM-CSF and IL-4 to obtain dendritic cells. can be induced.
  • dendritic cells isolated from cancer patients as described above with the partial peptide of the present invention in vitro, a complex between the HLA-A02 antigen or HLA-A24 antigen and the partial peptide is formed on the cell surface.
  • Antigen presenting cells can be produced.
  • mRNA encoding the above-described common cancer antigen or the above-described partial peptide can be used as a cancer vaccine.
  • mRNA encoding the common cancer antigen or partial peptide mRNA encoding multiple partial peptides in tandem may be used. In this case, multiple partial peptides will be encoded on one mRNA.
  • the cancer vaccine of the present invention is effective against cancer patients, particularly against HLA-A02 or HLA-A24 positive cancer patients.
  • cancer patients particularly against HLA-A02 or HLA-A24 positive cancer patients.
  • the cancer vaccine of the present invention can be used for the prevention or treatment of cancer.
  • Cancer prevention involves not only preventing patients from contracting cancer, but also preventing recurrence in patients whose primary tumor has been surgically removed, and eliminating it completely through cancer treatment such as surgery, radiation therapy, or drug therapy. This includes preventing the metastasis of tumors that have failed.
  • Cancer treatment includes not only curing cancer and improving symptoms by shrinking the cancer, but also preventing progression by suppressing cancer cell proliferation, tumor expansion, or metastasis of cancer cells from the primary tumor. It will be done.
  • the cancer vaccine of the present invention can be provided in the form of a pharmaceutical composition.
  • the cancer vaccine of the present invention may be administered either orally or parenterally, but parenterally is generally preferred.
  • parenteral preparations include subcutaneous injections, intramuscular injections, intravenous injections, and suppositories.
  • the above-mentioned active ingredients can be formulated into the cancer vaccine together with a pharmaceutically acceptable excipient.
  • excipients include starch, mannitol, lactose, magnesium stearate, cellulose, polymerized amino acids, and albumin.
  • the above-mentioned active ingredients can be formulated into the cancer vaccine together with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the carrier include water, salt, dextrose, ethanol, glycerol, and DMSO.
  • the cancer vaccine of the present invention may further contain albumin, a wetting agent, an emulsifier, and the like, if desired.
  • the above-mentioned active ingredients can be used together with a suitable adjuvant for activation of cell-mediated immunity.
  • the cancer vaccine of the present invention may contain the adjuvant.
  • adjuvants known in the art can be used, and specific examples include the following.
  • gel types include aluminum hydroxide, aluminum phosphate, and calcium phosphate.
  • bacterial cell types include CpG, monophosphoryl lipid A, cholera toxin, Escherichia coli heat-labile toxin, pertussis toxin, and muramyl dipeptide.
  • oil emulsion type emulsion formulation
  • Polymeric nanoparticle types include liposomes, biodegradable microspheres, and saponin-derived QS-21. Synthetic types include nonionic block copolymers, muramyl peptide analogs, polyphosphazenes, and synthetic polynucleotides.
  • Cytokine types include IFN- ⁇ , IL-2, and IL-12.
  • the dosage form of the cancer vaccine (pharmaceutical composition) of the present invention is not particularly limited; Examples include formulations, lipid-bound formulations, microsphere formulations, and microcapsule formulations.
  • Methods for administering the cancer vaccine (pharmaceutical composition) of the present invention include intradermal administration, subcutaneous administration, intramuscular administration, intravenous administration, and the like.
  • the dose of the active ingredient in a cancer vaccine can be adjusted as appropriate depending on the disease to be treated, the patient's age, body weight, etc., but it is usually 0.0001 mg to 1000 mg, preferably 0.0001 mg to 1000 mg per adult (body weight 50 kg).
  • the dose is 0.001 mg to 1000 mg, more preferably 0.1 mg to 10 mg, and preferably administered once every few days to every few months.
  • dendritic cells stimulated with a partial peptide when using dendritic cells stimulated with a partial peptide as a cancer vaccine, physiological saline, phosphate buffered saline (PBS), culture medium, etc. are required to stably maintain the dendritic cells. It is preferable to include.
  • Administration methods include intravenous administration, subcutaneous administration, and intradermal administration.
  • the CAR-T cell therapy agent of the present invention comprises a mixture of T cells having chimeric antigen receptors (CARs) for common cancer antigens including three or more selected from GPC3, ROBO1, EPHB4, CLDN1, and LAT1.
  • the common cancer antigen may include three or more types selected from GPC3, ROBO1, EPHB4, CLDN1, and LAT1, and three or four types selected from GPC3, ROBO1, EPHB4, CLDN1, and LAT1. , or may contain five types.
  • the common cancer antigen may include all of GPC3, ROBO1, EPHB4, CLDN1, and LAT1.
  • the common cancer antigen may further include one or more of AFP, TGFBI, SPARC, HSP105 ⁇ , and FOXM1. That is, the common cancer antigen may further include one, two, three, four, or five of AFP, TGFBI, SPARC, HSP105 ⁇ , and FOXM1.
  • the common cancer antigen may include all of GPC3, ROBO1, EPHB4, CLDN1, LAT1, AFP, TGFBI, SPARC, HSP105 ⁇ , and FOXM1.
  • CAR-T cell therapy involves genetically introducing a chimeric antigen receptor (CAR), which is a modified part of a monoclonal antibody specific for a tumor antigen, into patient-derived T cells.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • This is an immune cell therapy method in which the cells are amplified and cultured outside the body and then infused into the patient.
  • T cells are activated by culturing peripheral blood mononuclear cells collected from patients in the presence of anti-CD3 antibodies and IL-2, etc., and then transfected with retroviral vectors or lentiviral vectors.
  • Genetically modified T cells are produced by introducing a gene encoding CAR into T cells using a transformation vector.
  • a chimeric antigen receptor is a single-chain antibody (scFv) in which the light chain and heavy chain of the antibody variable region of an antibody that recognizes molecules present on the cell surface of cancer cells are linked in series on the N-terminal side, and is attached to T cells. It is a chimeric protein molecule designed to have the CD3 ⁇ chain of the molecules constituting the receptor (TCR)/CD3 complex on the C-terminal side.
  • TCR receptor
  • One or more costimulatory molecules may be incorporated between the scFv and the zeta chain to enhance T cell activation.
  • TCR-like antibodies including antibody molecules or fragments thereof that can be designed from TCR-like antibodies
  • CAR which recognizes complexes between tumor antigen-derived peptides and MHC, engulfs cancer cells that present tumor antigen peptides that can be targeted by CTLs, and transfers tumor antigen peptides onto MHC class I. Because they can recognize the presenting dendritic cells, the genetically modified T cells into which the CAR has been introduced can be used as cancer preventive and/or therapeutic agents specific to the tumor antigen, similar to artificial CTLs. Useful.
  • T cells having a chimeric antigen receptor (CAR) can be formulated into a CAR-T cell therapeutic agent as is or together with various carriers.
  • the dosage form of the CAR-T cell therapeutic agent may be either an oral or parenteral dosage form. Parenteral administration is generally preferred. Examples of parenteral preparations include subcutaneous injections, intramuscular injections, intravenous injections, and suppositories.
  • the obtained CAR-T cells can be formulated into a CAR-T cell therapy agent together with a pharmaceutically acceptable excipient.
  • excipients include starch, mannitol, lactose, magnesium stearate, cellulose, polymerized amino acids, and albumin.
  • the obtained CAR-T cells can be formulated into a CAR-T cell therapeutic agent together with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a pharmaceutically acceptable carrier examples include water, salt, dextrose, ethanol, glycerol, and DMSO.
  • TCR-T cell therapy drug is a T cell receptor ( TCR).
  • the common cancer antigen may include three or more types selected from GPC3, ROBO1, EPHB4, CLDN1, and LAT1, and three or four types selected from GPC3, ROBO1, EPHB4, CLDN1, and LAT1. , or may contain five types.
  • the common cancer antigen may include all of GPC3, ROBO1, EPHB4, CLDN1, and LAT1.
  • the common cancer antigen may further include one or more of AFP, TGFBI, SPARC, HSP105 ⁇ , and FOXM1. That is, the common cancer antigen may further include one, two, three, four, or five of AFP, TGFBI, SPARC, HSP105 ⁇ , and FOXM1.
  • the common cancer antigen may include all of GPC3, ROBO1, EPHB4, CLDN1, LAT1, AFP, TGFBI, SPARC, HSP105 ⁇ , and FOXM1.
  • TCR T cell receptor
  • T cell receptor is usually a heterodimer of TRA and TRB.
  • T cell receptors those listed in Tables 2 to 11 in Examples below can be used. That is, specific T cell receptors (TCR) include: A heterodimer consisting of a combination of the protein of SEQ ID NO: 103 and the protein of SEQ ID NO: 104; A heterodimer consisting of a combination of the protein of SEQ ID NO: 105 and the protein of SEQ ID NO: 106; A heterodimer consisting of a combination of the protein of SEQ ID NO: 107 and the protein of SEQ ID NO: 108; A heterodimer consisting of a combination of the protein of SEQ ID NO: 109 and the protein of SEQ ID NO: 110; A heterodimer consisting of a combination of the protein of SEQ ID NO: 111 and the protein of SEQ ID NO: 112; A heterodimer consisting of a combination of the protein of SEQ ID NO: 123
  • T cell receptor TCR
  • a protein having an amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 103-112, 123-148, 177-184, 193-203, and 215-219 is provided.
  • a gene having a base sequence of any one of SEQ ID NOs: 113-122, 149-176, 185-192, 204-214, and 220-224 is provided.
  • T cells having a T cell receptor TCR
  • TCRs T cell receptors
  • the partial peptide of the common cancer antigen of the present invention is used to stimulate patient peripheral blood lymphocytes in vitro to increase T cells having T cell receptors (TCRs) (i.e., tumor-specific CTLs). After this T cell receptor (TCR)-bearing T cell can be returned to the patient.
  • TCRs T cell receptors
  • T cells having a T cell receptor can be used as an active ingredient of a cancer therapeutic or preventive agent, and can be used as a TCR-T cell therapeutic agent.
  • the TCR-T cell therapy agent preferably contains physiological saline, phosphate buffered saline (PBS), a medium, etc. in order to stably maintain TCR-T cells.
  • Administration methods include intravenous administration, subcutaneous administration, and intradermal administration.
  • the TCR-T cells of the present invention can exert cytotoxic activity by targeting a complex between a partial peptide and HLA that is presented as an antigen on tumor cells. That is, the T cell receptor (TCR) of the TCR-T cell of the present invention recognizes the complex of the partial peptide of the present invention and HLA.
  • TCR T cell receptor
  • T cells having a T cell receptor (TCR) can be formulated into a TCR-T cell drug as is or together with various carriers.
  • the dosage form of the TCR-T cell therapy drug may be either an oral dosage form or a parenteral dosage form.
  • Parenteral formulations are generally preferred. Examples of parenteral preparations include subcutaneous injections, intramuscular injections, intravenous injections, and suppositories.
  • the obtained TCR-T cell therapy can be formulated into a TCR-T cell therapy with a pharmaceutically acceptable excipient.
  • excipients include starch, mannitol, lactose, magnesium stearate, cellulose, polymerized amino acids, and albumin.
  • the resulting TCR-T cell therapy can be formulated into a TCR-T cell therapy with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a pharmaceutically acceptable carrier examples include water, salt, dextrose, ethanol, glycerol, and DMSO.
  • the companion diagnostic method of the present invention detects the presence or absence of expression of three or more types (i.e., three types, four types, or five types) of GPC3, ROBO1, EPHB4, CLDN1, and LAT1 in a sample derived from a subject, and HLA class
  • the method includes a step 1 of simultaneously measuring the cell membrane expression of I by multiple fluorescent immunostaining, and a step 2 of determining the suitability of cancer immunotherapy based on the presence or absence of the above expression.
  • step 1 the presence or absence of expression of one or more types (i.e., 1 type, 2 types, 3 types, 4 types, or 5 types) of AFP, TGFBI, SPARC, HSP105 ⁇ , and FOXM1 is further measured. Good too.
  • step 1 the presence or absence of expression of all of GPC3, ROBO1, EPHB4, CLDN1, and LAT1 may be measured.
  • step 1 the presence or absence of expression of all of GPC3, ROBO1, EPHB4, CLDN1, LAT1, AFP, TGFBI, SPARC, HSP105 ⁇ , and FOXM1 may be measured.
  • samples derived from a subject include, but are not limited to, liver, large intestine, oropharynx, esophagus, uterus, kidney, lung, breast, tongue, intrahepatic bile duct, nerve, blood, and the like.
  • Multiplex fluorescent immunostaining may be performed by either a direct method or an indirect method.
  • direct method multiple primary antibodies directly labeled with fluorescence are used, and no labeled secondary antibodies are used.
  • direct method cross-reactivity due to secondary antibodies can be avoided, and the system is simple and operation time is short.
  • Indirect methods use multiple primary antibodies and labeled secondary antibodies against those primary antibodies. It has the advantage of being able to detect with higher sensitivity than the direct method when used in combination with an amplification method.
  • the fluorescent dye used in multiplex fluorescent immunostaining can be selected by considering the fluorescence spectrum of the excitation wavelength and fluorescence wavelength.
  • the companion diagnostic method of the present invention it is possible to test or diagnose the presence or absence of improvement or the degree of improvement when a therapeutic agent is administered to treat cancer in a patient with cancer. Furthermore, the companion diagnostic method of the present invention can be used to select patients to be treated to whom the cancer vaccine, TCR-T cell therapeutic agent, or CAR-T cell therapeutic agent of the present invention can be effectively applied, and the cancer vaccine, TCR-T cell therapeutic agent, or CAR-T cell therapeutic agent of the present invention. It can also be used to predict and judge the therapeutic effects of T cell therapeutics or CAR-T cell therapeutics.
  • the method for diagnosing the risk of developing cancer according to the present invention is based on three or more types (i.e., three, four, or five types) of GPC3, ROBO1, EPHB4, CLDN1, and LAT1 for cells in a blood sample derived from a subject. ).
  • the expression of one or more (ie, one, two, three, four, or five) of AFP, TGFBI, SPARC, HSP105 ⁇ , and FOXM1 may be analyzed.
  • the expression of all GPC3, ROBO1, EPHB4, CLDN1, and LAT1 may be analyzed.
  • the expression of all of GPC3, ROBO1, EPHB4, CLDN1, LAT1, AFP, TGFBI, SPARC, HSP105 ⁇ , and FOXM1 may be analyzed.
  • blood is collected from a subject, and three or more types of cells from GPC3, ROBO1, EPHB4, CLDN1, and LAT1 are collected. (i.e., 3, 4, or 5).
  • three or more types of cells from GPC3, ROBO1, EPHB4, CLDN1, and LAT1 are collected. (i.e., 3, 4, or 5).
  • Example 1 Expression analysis of common cancer antigens by immunohistochemical analysis, development of companion diagnostic method using multiple fluorescent immunostaining system ⁇ Method> 4um paraffin sections were prepared from formalin-fixed paraffin blocks of various human cancer tissues. A commercially available normal tissue microarray slide (BioChain) was used. Deparaffinization was performed with xylene and ethanol, and endogenous peroxidase was inactivated using 0.3% H 2 O 2 /methanol. Antigen retrieval was performed by heat treatment using Target Retrieval Solution, pH 9 (Agilent) or AR6 (AKOYA BIOSCIENCES) inactivation buffer using microwaves or a pressure cooker. After blocking with pig serum, a primary antibody against each antigen was reacted.
  • Target Retrieval Solution pH 9 (Agilent) or AR6 (AKOYA BIOSCIENCES)
  • GPC3 (BIOMOSICS, 300 times diluted), AFP (Agikent, Ready to Use), ROBO1 (PROTEINTECH, 300 times diluted), EPHB4 (Cell Signaling Technology, 300 times diluted), CLDN1 (Cell Signaling Technology, 300 times diluted) FOXM1 (abcam, 150-fold dilution), HSP105 ⁇ (abcam, 200-fold dilution), SPARC (Santa Cruz Biotechnology, 250-fold dilution), TGFBI (abcam, 100-fold dilution), HLA-ABC ( Hokudo, 200-fold dilution), LAT1 (abcam, 200-fold dilution).
  • a polymer reagent (EnVision+ System- HRP Labeled Polymer Anti-Rabbit or EnVision+ System- HRP Labeled Polymer Anti-Mouse) was used as the secondary antibody.
  • Liquid DAB+ Substrate Chromogen System was used for color development. After counterstaining with hematoxylin, dehydration and clearing treatment with ethanol and xylene were performed. The slides were made into virtual slides using NanoZoomer (Hamamatsu Photonics KK).
  • GPC3 (BIOMOSICS, diluted 600 times), ROBO1 (PROTEINTECH, diluted 600 times), EPHB4 (Cell Signaling Technology, diluted 1200 times), CLDN1 (Cell Signaling Technology, diluted 1200 times), HLA-ABC (Hokudo) , 600-fold dilution), LAT1 (abcam, 800-fold dilution).
  • a polymer reagent EnVision+ System- HRP Labeled Polymer Anti-Rabbit or EnVision+ System- HRP Labeled Polymer Anti-Mouse
  • Opal 520, 540, 570, 620, 650, and 690 were used as fluorescent dyes at 100-fold dilutions. After nuclear staining with DAPI, mounting was performed using a water-soluble mounting medium, and the preparations were observed using Vectra3 (PerkinElmer).
  • Figure 1 shows the results of immunohistochemical staining using paraffin-embedded tissue sections to confirm the expression of 10 common cancer antigens in hepatocellular carcinoma.
  • Moderate to high expression of GPC3, AFP, ROBO1, TGFBI, EPHB4, and CLDN1 was observed in the cancerous area of hepatocellular carcinoma, while expression in the non-cancerous area was negative to weak.
  • HLA-Class I was expressed on the cell membrane in most cases, suggesting that the common cancer antigen expressed in hepatocellular carcinoma is an excellent target for TCR-T, CAR-T, and cancer vaccine therapy. It showed that there is.
  • SPARC, HSP105 ⁇ , FOXM1, TGFBI, EPHB4, CLDN1, and LAT1 are moderately to highly expressed in colorectal cancer liver metastasis, oropharyngeal cancer (HPV-), colorectal cancer, esophageal cancer, and uterine cancer. It was confirmed that
  • Figure 2 shows the expression of cell membrane-expressed common cancer antigens GPC3, EPHB4, CLDN1, LAT1, and ROBO1 in each cancer type.
  • GPC3 was co-expressed in hepatocellular carcinoma and childhood cancer nephroblastoma, and weak to moderate expression was observed in squamous cell carcinomas such as lung cancer and esophageal cancer.
  • EPHB4, CLDN1, and ROBO1 are moderately to highly expressed in lung cancer, colorectal cancer, breast cancer, tongue cancer, intrahepatic bile duct cancer, kidney cancer, and esophageal cancer, and LAT1 is strongly expressed in squamous cell carcinoma. There was a tendency to
  • Figure 3 shows the expression of common cancer antigens and HLA-Class I in childhood cancers of neuroblastoma, nephroblastoma, and choriocarcinoma. Although moderate to high expression of each common cancer antigen was observed, including nuclear-expressed FOXM1, expression of HLA-Class I in the cell membrane could not be confirmed.
  • GPC3, EPHB4, CLDN1, LAT1, and ROBO1, which are common cancer antigens expressed on the cell membrane are moderately to highly expressed on the cell membrane of neuroblastoma, nephroblastoma, and choriocarcinoma cancer cells. It was found that there is a possibility that it could be applied to CAR-T therapy by taking advantage of its non-HLA-Class I-restricted properties.
  • Figure 4 shows the results of confirming the expression of each common cancer antigen in the non-cancerous areas of human hepatocellular carcinoma clinical specimens.
  • GPC3, AFP, ROBO1, FOXM1, and CLDN1 were negative, and EPHB4 and TGFBI were weakly expressed in the sinusoids of the liver parenchyma.
  • HLA-Class I is weakly expressed in the cell membrane of hepatic parenchymal cells.
  • Figure 5 shows the expression of cell membrane-expressed common cancer antigens in 31 normal tissues, GPC3, EPHB4, CLDN1, LAT1, and ROBO1, using a human normal tissue microarray. Although signals of EPHB4 and ROBO1 were weakly detected in various tissues, clear cell membrane expression could not be confirmed. GPC3, CLDN1, and LAT1 are clearly expressed only in some tissues.
  • Figure 6 shows the development of an applied diagnostic system using multiplex fluorescent immunostaining to determine which common cancer antigens are effective targets for immunotherapies such as TCR-T, CAR-T, and cancer vaccines. Demonstrate a concept.
  • PDX is a specimen derived from hepatocellular carcinoma and lung cancer patients, and human clinical specimens are specimens from patients with hepatocellular carcinoma, intrahepatic cholangiocarcinoma, and oropharyngeal cancer (HPV-). Multiple fluorescent immunostaining was performed for common cancer antigens expressed on the cell membrane of EPHB4, CLDN1, LAT1, and ROBO1 and HLA-Class I. GPC3 was strongly expressed in hepatocellular carcinoma PDX, followed by the expression of CLDN1 and EPHB4. In lung cancer PDX, GPC3, EPHB4, CLDN1, and LAT1 were moderately to highly expressed in any combination.
  • FIG. 8 shows the gene expression of each cancer antigen in hepatocellular carcinoma and primary colorectal cancer.
  • Gene expression of cancer antigens is shown in a heat map. The expression level of each gene was normalized by log2 (FPKM+1) and evaluated.
  • FPKM+1 log2
  • Figure 9 shows the gene expression of each cancer antigen in hepatocellular carcinoma and primary colorectal cancer for which antigen prediction was performed.
  • Figure 10 shows the prediction pipeline for cancer antigen-derived epitope peptides.
  • Tumor and normal liver tissues were collected from surgically resected specimens of registered cases, DNA and RNA were extracted, and neoantigens and common cancer antigens that are highly expressed in cancer were selected by whole exon sequencing and RNA sequencing.
  • the HLA haplotype of each case was determined from the analysis of all exon sequences, and peptides with high binding strength for MHC Class I (HLA-A, B, C) were predicted.
  • HLA-A, B, C MHC Class I
  • Figure 11 shows the distribution of SCOREadj of each cancer antigen-derived peptide in hepatocellular carcinoma.
  • Peptides derived from each cancer antigen predicted in one case of hepatocellular carcinoma were classified by SCOREadj (1 ⁇ 2: light blue, 2 ⁇ 3: orange, 3 ⁇ 4: gray, 4 ⁇ 5: yellow, 5 ⁇ 6: (blue, and 6 or more: green) and the number is shown (upper row, bar graph).
  • the lower bar graph shows only those peptides with SCOREadj of 6 or more extracted from each cancer antigen-derived peptide.
  • Figure 12 shows the total number of cancer antigen peptides predicted in 7 hepatocellular carcinoma cases.
  • the antigenicity of each cancer antigen-derived peptide was predicted for 7 cases of hepatocellular carcinoma using a similar predictor.
  • the total number of predicted peptides (the total number of peptides derived from cancer antigens predicted to bind to HLA-A, B, and C) was classified using SCOREadj and shown in a bar graph for each case.
  • cocktail vaccines targeting multiple cancer antigens require the optimal combination of peptides predicted for each patient. It is desirable to develop it as a personalized cancer vaccine.
  • personalized medicine often has problems with its cost and the time required for preparation and testing, but in addition to predicting peptides that are expected to have effects derived from multiple common cancer antigens, we have By implementing a peptide library with confirmed immunogenicity derived from common cancer antigens and making it possible to provide it off-the-shelf, it is possible to provide a cocktail peptide vaccine that is more effective at low cost and in a short period of time. be.
  • Example 3 Identification of CTL-inducing peptides derived from common cancer antigens, development of peptide vaccines and paptidopulse dendritic cell vaccines ⁇ Method>
  • 72 HLA-A*24:02-restricted epitope peptides were identified using an algorithm established through joint research with BrightPath Bio.
  • the ability of the predicted antigenic peptide to induce CTL was evaluated using transgenic mice into which the HLA gene had been introduced. Each peptide was dissolved at 10 mg/ml in dimethyl sulfoxide (DMSO, Wako) and immunized with an adjuvant into HLA transgenic mice three times a week. One week later, the spleen was removed and IFN- ⁇ production was evaluated using IFN- ⁇ ELISpot assay.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • Figure 16 shows whether antigen-specific T cells are induced by vaccinating transgenic mice with common cancer antigen-derived short peptide-sensitized dendritic cells (DC), which have been confirmed to induce CTLs. Evaluation was performed using transgenic mice into which the HLA gene was introduced. Each peptide was dissolved at 10 mg/ml in dimethyl sulfoxide (DMSO, Wako), 1 x 10 ⁇ 5 DCs sensitized with each peptide were prepared for each peptide, and the volume was adjusted with PBS to 100 ⁇ l.
  • DC dendritic cells
  • Immunization was performed intradermally at the base of HLA-A*02:01 Tgm or HLA-A*24:02 Tgm using a 27G needle/1 ml syringe (Terumo) with a volume of 27G injection needle/1 ml syringe (Terumo). Immunization was carried out a total of three times at weekly intervals, and one week after the third vaccination, the spleen was removed and the production of IFN- ⁇ was evaluated using the IFN- ⁇ ELISpot assay.
  • the DC used was collected from the femur of HLA-A*02:01 Tgm or HLA-A*24:02 Tgm.
  • splenocytes from immunized mice were isolated into CD8-positive T cells by MACS, and the cells suspended at 1 x 10 ⁇ 5 cells/well were used as effector cells.
  • Splenocytes from unimmunized mice were radiated (100kV, 10mA, 100Gy) and suspended at a concentration of 2 ⁇ 10 ⁇ 6 cells/well in final medium supplemented with each peptide at a concentration of 20ug/ml, and used as target cells. did.
  • peptides predicted to be presented at HLA-A*24:02 or HLA-A*02:01 were synthesized from the full-length amino acid sequences of 10 types of common cancer antigen proteins.
  • a peptide vaccine is administered to mice that express human HLA-A*24:02 or HLA-A*02:01 in cells throughout the body once a week for a total of three times, and splenocytes respond to the peptide.
  • a large number of peptides capable of inducing CD8-positive killer T cells (CTL) were identified through screening.
  • the CTL induction rate in response to the peptides was 30 out of 72 for HLA-A*24:02-restricted common cancer antigen short peptide and 73 for HLA-A*02:01-restricted common cancer antigen short peptide. 38 were in the middle, and 68 out of 145 in total. These peptides have better CTL inducing ability than the GPC3 peptide vaccine peptide used in clinical trials, and can be applied in the future to prevent and prevent recurrence of various cancers.
  • dendritic cells (DC) sensitized with a common cancer antigen-derived short peptide which has been confirmed to induce CTLs, were transferred to HLA-A*24:02 or HLA-A*02:01 transgenic mice.
  • the induction of antigen-specific T cells was evaluated using transgenic mice introduced with each HLA gene.
  • the peptides used were selected from among antigens that are highly expressed mainly in hepatocellular carcinoma, and three peptides were selected for each antigen that had a high CTL induction by the peptide vaccine.
  • DCs were sensitized with the selected peptides, transgenic mice were vaccinated, and the ability to induce antigen-specific CTL was evaluated using IFN- ⁇ ELISpot assay.
  • a long peptide containing the sequence of a short peptide derived from a common cancer antigen that has been confirmed to induce CTL in order to confirm whether the peptide is actually processed within cells and presented on HLA, Verified using HLA-A*02:01 Tgm or HLA-A*24:02 Tgm.
  • a long peptide is a long peptide (15-21mer) designed to contain the amino acid sequence of a short 9-10mer peptide that was able to induce CTLs that respond to the peptide.
  • IFN- ⁇ ELISpot assay it was evaluated whether the peptide was actually processed in cells, bound to MHC molecules, and presented on HLA to induce peptide-specific CTL.
  • Example 4 Development of common cancer antigen mRNA vaccine LNP-Covid-19 Spike mRNA was administered and antigen-specific IFN- ⁇ production was evaluated.
  • An mRNA vaccine (ARCTURUS therapeutics, non-patent literature (de Alwis R. et al. A single dose of self-transcribing and replicating RNA-based SARS-CoV-2 vaccine produces protective adaptive immunity in mice. Mol Ther. 2021;29:1970-1983. 10 ⁇ g was administered intramuscularly (im) to the rectus femoris muscle of HLA-A*02:01 Tg mice and HLA-A*24:02 Tg mice, or intradermally (id) to the base of the ridge.
  • HLA-A*24:02 Tg mice were dissected on Day 20 and HLA-A*02:01 Tg mice were dissected on Day 21.
  • administration was performed on day 0 and day 28, and HLA-A*24:02 Tg mice were dissected on Day 35, and HLA-A*02:01 Tg mice were dissected on Day 36.
  • Cells were prepared from the spleen and inguinal lymph nodes (LN), and serum was collected from heart blood.
  • Antigen-specific IFN- ⁇ production from T cells was evaluated by the ELISPOT method according to the recommended protocol using the BD ELISPOT Mouse IFN- ⁇ Set and the BD ELISPOT AEC Substrate Set (both from BD).
  • Spleen cells were seeded at 2 x 10 ⁇ 6 cells/well and LN cells at 2 x 10 ⁇ 5 cells/well in a 96-well plate coated with anti-mIFN- ⁇ antibody, and PMA (25 ng/mL) + Ionomycin (1 ⁇ g) /mL), a peptide mix covering the Covid-19 Spike protein (PepMix S (jpt PM-WCPV-S-1) for the 3-dose experiment, PepTivator SARC-CoV-2 Prot_S (Miltenyi Biotech , 130-127-953), each peptide 1 ⁇ g/mL), HLA-A*02:01 Tg mice or HLA-A*24: after prediction with the predictor described in paragraph [0094
  • Figure 20 shows the administration method for three doses of LNP-Covid-19 Spike mRNA.
  • 2 ⁇ g or 10 ⁇ g of an mRNA vaccine (ARCTURUS therapeutics) containing mRNA encoding the full-length Spike protein of Covid-19 encapsulated in LNP was administered to the thighs of HLA-A*02:01 Tg mice and HLA-A*24:02 Tg mice. It was administered intramuscularly to the rectus muscle (im) or intradermally to the ridge (id) three times on day 0, day 7, and day 14.
  • HLA-A*24:02 Tg mice received HLA -A*02:01 Tg mice were dissected on Day 21, and the production of antigen-specific IFN- ⁇ was evaluated by the ELISPOT method.
  • Figures 21 and 22 show the results of Spike antigen-specific IFN- ⁇ production in spleen cells of HLA-A*02:01 Tg mice administered three times with LNP-Covid-19 Spike mRNA.
  • Spleen cells of HLA-A*02:01 Tg mice treated with LNP-Covid-19 Spike mRNA three times were treated with PepMix S, POOL1, and im and id against BMDCs treated with LNP-Covid-19 Spike mRNA.
  • T cells producing IFN- ⁇ were induced in both cases.
  • Figure 23 shows the results of Spike antigen-specific IFN- ⁇ production in inguinal lymph node cells of HLA-A*02:01 Tg mice administered three times with LNP-Covid-19 Spike mRNA.
  • Inguinal lymph node cells of HLA-A*02:01 Tg mice treated with LNP-Covid-19 Spike mRNA three times were treated with PepMix S, im and id against BMDCs treated with LNP-Covid-19 Spike mRNA.
  • T cells producing IFN- ⁇ were induced in both cases.
  • mice that were similarly administered three times with the negative control LNP-eGFP mRNA, almost no IFN- ⁇ production was observed against BMDCs to which PepMix S and LNP-Covid-19 Spike mRNA were added. This shows that the production of IFN- ⁇ was specifically induced by administration of LNP-Covid-19 Spike mRNA.
  • FIGS. 24 and 25 show the results of Spike antigen-specific IFN- ⁇ production in spleen cells of HLA-A*24:02 Tg mice administered three times with LNP-Covid-19 Spike mRNA.
  • Splenocytes of HLA-A*24:02 Tg mice administered with LNP-Covid-19 Spike mRNA three times were treated with 1 ⁇ g or 10 ⁇ g of PepMix S, POOL1, and LNP-Covid-19 Spike mRNA per 1 ⁇ 10 ⁇ 6 cells.
  • T cells producing IFN- ⁇ were strongly induced in both im and id.
  • HLA-A*24:02 Tg mice that were similarly administered three times with the negative control LNP-eGFP mRNA, only a small amount of IFN- ⁇ was produced against BMDCs treated with PepMix S, POOL1, and LNP-Covid-19 Spike mRNA. This shows that the production of IFN- ⁇ was specifically induced by administration of LNP-Covid-19 Spike mRNA.
  • Figure 26 shows the results of Spike antigen-specific IFN- ⁇ production in inguinal lymph node cells of HLA-A*24:02 Tg mice administered three times with LNP-Covid-19 Spike mRNA.
  • Inguinal lymph node cells of HLA-A*24:02 Tg mice administered three times with LNP-Covid-19 Spike mRNA were found to have IFN- ⁇ -producing T cells in both im and id against PepMix S and POOL1. cells were induced.
  • HLA-A*24:02 Tg mice that were similarly administered three times with the negative control LNP-eGFP mRNA almost no IFN- ⁇ production was observed in response to PepMix S and POOL1. It can be seen that the production was specifically induced by administration of LNP-Covid-19 Spike mRNA.
  • Figure 27 shows the administration method for two doses of LNP-Covid-19 Spike mRNA.
  • 2 ⁇ g or 10 ⁇ g of an mRNA vaccine containing the full-length mRNA encoding the Covid-19 Spike protein encapsulated in LNPs was administered to the rectus femoris muscle of HLA-A*02:01 Tg mice and HLA-A*24:02 Tg mice.
  • the mice were dissected and the production of antigen-specific IFN- ⁇ was evaluated by ELISPOT.
  • Figures 28 and 29 show the results of Spike antigen-specific IFN- ⁇ production in spleen cells of HLA-A*02:01 Tg mice administered twice with LNP-Covid-19 Spike mRNA.
  • Spleen cells of HLA-A*02:01 Tg mice administered twice with LNP-Covid-19 Spike mRNA were treated with PepTi S, POOL1, and im and id against BMDCs with LNP-Covid-19 Spike mRNA.
  • T cells producing IFN- ⁇ were induced in both cases.
  • mice that were similarly administered twice with the negative control LNP-eGFP mRNA, only a small amount of IFN- ⁇ was produced against BMDCs treated with PepTi S, POOL1, and LNP-Covid-19 Spike mRNA. This fact indicates that the production of IFN- ⁇ was specifically induced by administration of LNP-Covid-19 Spike mRNA.
  • Figure 30 shows the results of Spike antigen-specific IFN- ⁇ production in inguinal lymph node cells of HLA-A*02:01 Tg mice administered twice with LNP-Covid-19 Spike mRNA.
  • Inguinal lymph node cells of HLA-A*02:01 Tg mice administered twice with LNP-Covid-19 Spike mRNA were treated with PepTi S, im and id against BMDCs treated with LNP-Covid-19 Spike mRNA.
  • T cells producing IFN- ⁇ were induced in both cases. In particular, high induction was observed in id.
  • mice that were similarly administered three times with the negative control LNP-eGFP mRNA, almost no IFN- ⁇ production was observed against BMDCs to which PepTi S and LNP-Covid-19 Spike mRNA were added. This shows that the production of IFN- ⁇ was specifically induced by administration of LNP-Covid-19 Spike mRNA.
  • Figures 31 and 32 show the results of Spike antigen-specific IFN- ⁇ production in spleen cells of HLA-A*24:02 Tg mice administered twice with LNP-Covid-19 Spike mRNA.
  • Splenocytes of HLA-A*24:02 Tg mice administered twice with LNP-Covid-19 Spike mRNA were treated with PepTi S, POOL1, and im and id against BMDCs with LNP-Covid-19 Spike mRNA.
  • IFN- ⁇ producing T cells were strongly induced in both cases.
  • mice that were similarly administered twice with the negative control LNP-eGFP mRNA, only a small amount of IFN- ⁇ was produced against BMDCs treated with PepTi S, POOL1, and LNP-Covid-19 Spike mRNA. This fact indicates that the production of IFN- ⁇ was specifically induced by administration of LNP-Covid-19 Spike mRNA.
  • Figure 33 shows the results of Spike antigen-specific IFN- ⁇ production in inguinal lymph node cells of HLA-A*24:02 Tg mice administered twice with LNP-Covid-19 Spike mRNA.
  • Inguinal lymph node cells of HLA-A*24:02 Tg mice administered twice with LNP-Covid-19 Spike mRNA were treated with PepTi S, im and id against BMDCs treated with LNP-Covid-19 Spike mRNA.
  • T cells producing IFN- ⁇ were induced in both cases. In particular, high induction was observed in id.
  • mice that were similarly administered three times with the negative control LNP-eGFP mRNA, almost no IFN- ⁇ production was observed against BMDCs to which PepTi S and LNP-Covid-19 Spike mRNA were added. This shows that the production of IFN- ⁇ was specifically induced by administration of LNP-Covid-19 Spike mRNA.
  • Figure 34 shows the results of antibody measurements against Spike protein.
  • MaxiSorp plate ThrmoFisher was coated with Covid-19 Spike recombinant protein (Sino Biological, 40589-V08B1) with 100ng/50 ⁇ L PBS. After washing once with PBS containing 0.05% Tween20 (PBS-T), blocking was performed for 1 hour at room temperature with 3% non-fat milk. Serum diluted in PBS containing 1% non-fat milk was added and incubated at 37°C for 1 hour.
  • the cells were washed three times with PBS-T and incubated with horseradish peroxidase (HRP)-labeled goat anti-mouse IgG (SouthernNiotech, 6000-fold diluted) in PBS-T containing 1% non-fat milk for 1 hour at room temperature. After washing three times with PBS-T, 3,3',5,5'-tetramethylbenzine substrate solution (Pierce) was added to develop color, and the reaction was stopped with 1.3N H 2 SO 4 and the absorbance at 450 nm was measured.
  • HRP horseradish peroxidase
  • Example 5 Development of common cancer antigen mRNA vaccine LNP-hGPC3 mRNA, LNP-hROBO1 mRNA, LNP-hCLDN1 mRNA, LNP-hEphB4 mRNA, LNP-hTGFBI mRNA, LNP-hSPARC mRNA, LNP-hAFP mRNA, LNP-hHSP105 ⁇ mRNA, LNP-(hCLDN1+hEPHB4) mRNA was administered, and antigen-specific IFN- ⁇ production was evaluated.
  • hGPC3 isoform 2 (RefSeq: NP_004475), hROBO1 isoform X5 (RefSeq: form 1 (NP_003109), hAFP isoform 1 ( NP_001125), hHSPH1 isoform 1 (NP_006635) mRNA encoding the full-length protein, an equal mass mixture of mRNA encoding the full-length protein hCLDN1 (RefSeq: NP_066924) and hEphB4 (RefSeq: NP_004435), the mRNA encoding the full-length protein, Luciferase protein An mRNA vaccine (ARCTURUS therapeutics) containing full-length mRNA encoding full-length eGFP protein and mRNA encoding full-length eGFP protein encapsulated in LNP (Lipid nano particle, ARCTURUS therapeutics) was administered to HLA-A*02:01 Tg mice and HLA-A
  • Spleen cells were seeded at 2 x 10 ⁇ 6 cells/well and LN cells at 2 x 10 ⁇ 5 cells/well in a 96-well plate coated with anti-mIFN- ⁇ antibody, and PMA (25 ng/mL) + Ionomycin (1 ⁇ g) /mL), a mix of short chain peptides (each peptide 10 ⁇ g/mL) that showed peptide-specific IFN- ⁇ production when immunized with the corresponding HLA Tg mice, peptide-specific when immunized with the corresponding HLA Tg mice.
  • HLA HLA-HHD H ⁇ 2M-linker-[HLA ⁇ 1+ ⁇ 2 domain]-[H-2D b ⁇ 3 ⁇ C-terminal domain] mouse cancer cells (MC38 or MCA205, 2 ⁇ 10 ⁇ 5 cells/well) expressing HLA-HHD of the corresponding HLA and the corresponding cancer antigen Cells (MC38 or MCA205, 2 x 10 ⁇ 5 cells/well) were induced to differentiate from the bone marrow of the corresponding HLA Tg na ⁇ ve mouse with mouse GM-CSF (20ng/mL), and the day before use, mouse TNF- ⁇ (20ng/mL) was induced to differentiate.
  • BMDC bone marrow-derived dendritic cells
  • mouse IL-4 (20ng/mL
  • PGE2 (1 ⁇ g/mL)
  • BMDCs (2 x 10 ⁇ 5 cells/mL) transfected with 11 ⁇ g of the corresponding cancer antigen mRNA per 5 x 10 ⁇ 6 cells were added and co-cultured for 20 hours, and the production of IFN- ⁇ was evaluated. The spot was photographed with an Elliphoto counter AT-X (Minerva Tech). The following peptides were added as a mix of short chain peptides.
  • hGPC3 HLA-A*02:01 CA02 11_L, CA02 15_L, A02-GPC3-14_L hGPC3 HLA-A*24:02: A24-GPC3-06_L, A24-GPC3-11_L, A24-GPC3-17_L hROBO1 HLA-A*02:01: CA02 95_L, CA02 97_L hROBO1 HLA-A*24:02: CA24 97_L, CA24 98_L hCLDN1 HLA-A*02:01: CLDN1-A02-2_L, CLDN1-A02-5_L hCLDN1 HLA-A*24:02: CLDN1-A24-2_L, CLDN1-A24-4_L, CLDN1-A24-5_L, CLDN1-A24-7_L hEPHB4 HLA-A*02:01: CA02 121
  • Figure 35 shows an administration method for three doses of LNP-hGPC3 mRNA.
  • 2 ⁇ g or 10 ⁇ g of LNP-hGPC3 mRNA or 10 ⁇ g of LNP-Luciferase mRNA was administered im into the rectus femoris muscle of HLA-A*02:01 Tg mice and HLA-A*24:02 Tg mice, or into the ridge.
  • Administered 3 times on day 0, day 7, and day 14 depending on id HLA-A*24:02 Tg mice were dissected on Day 20, HLA-A*02:01 Tg mice were dissected on Day 22, and antigen-specific IFN was determined by ELISPOT method.
  • - ⁇ production was evaluated.
  • Figures 36-39 show the above results.
  • spleen cells of HLA-A*02:01 Tg mice administered with LNP-hGPC3 mRNA three times had peptide-specific immunization with HLA-A*02:01 Tg mice.
  • a mix of hGPC3 short chain peptides that showed IFN- ⁇ production HLA-A*02:01
  • HLA-A*02:01 A mix of hGPC3 long chain peptides that showed peptide-specific IFN- ⁇ production when peptide immunized Tg mice
  • HLA-A *02:01T cells producing IFN- ⁇ were induced in cancer cells MC38 expressing HHD and hGPC3, and BMDC transfected with hGPC3 mRNA.
  • IFN- ⁇ production against cancer cells MC38 A02HHD hGPC3 expressing HLA-A*02:01HHD and hGPC3 was significantly higher than that against cancer cells MC38 A02HHD mock transfected with HLA-A*02:01HHD and empty vector. This indicates that T cells that specifically recognize and attack hGPC3-expressing cancer cells were induced.
  • HLA-A*02:01 Tg mice that were similarly administered three times with LNP-Luciferase mRNA which is a negative control, only a small amount of IFN- ⁇ production was observed in any of the mice. It can be seen that the production of was specifically induced by administration of LNP-hGPC3 mRNA.
  • a mix of hGPC3 long-chain peptides that caused peptide-specific IFN- ⁇ production in peptide immunization of Tg mice, HLA-A *24:02 IFN- ⁇ -producing T cells were induced in cancer cells MC38 expressing HHD and hGPC3, and BMDC transfected with hGPC3 mRNA.
  • IFN- ⁇ production against cancer cells MC38 A24HHD hGPC3 expressing HLA-A*24:02HHD and hGPC3 was significantly higher than that against MC38 A24HHD mock cancer cells transfected with HLA-A*24:02HHD and an empty vector. This indicates that T cells that specifically recognize and attack hGPC3-expressing cancer cells were induced.
  • mice that were similarly administered three times with LNP-Luciferase mRNA, a negative control, only a small amount of IFN- ⁇ was observed in any of the mice. It can be seen that the production of LNP-hGPC3 mRNA was specifically induced by administration of LNP-hGPC3 mRNA.
  • Example 6 Development of common cancer antigen mRNA vaccine
  • Figure 40 shows an administration method for administering LNP-hROBO1 mRNA three times. 10 ⁇ g of LNP-hROBO1 mRNA or LNP-eGFP mRNA was administered intramuscularly (im) into the rectus femoris muscle of HLA-A*02:01 Tg mice and HLA-A*24:02 Tg mice, or into the ridge. The mice were administered intradermally (id) three times on day 0, day 7, and day 14, and dissected on day 21, and the production of antigen-specific IFN- ⁇ was evaluated by the ELISPOT method.
  • Figures 41 and 42 show the above results. As shown in Figure 41, spleen cells of HLA-A*02:01 Tg mice administered with LNP-hROBO1 mRNA three times were stimulated with peptide-specific IFN- ⁇ by peptide immunization of HLA-A*02:01 Tg mice.
  • HLA-A*02 T cells producing IFN- ⁇ were induced in cancer cells MC38 expressing 01HHD and hROBO1, and BMDC transfected with hROBO1 mRNA. Both im and id express HLA-A*02:01HHD and hROBO1.
  • IFN- ⁇ production against MC38 A02HHD hROBO1 is based on cancer cell MC38 A02HHD mock into which HLA-A*02:01HHD and empty vector have been introduced.
  • HLA-A*24:02 Tg mice administered with LNP-hROBO1 mRNA three times were stimulated with peptide-specific IFN- ⁇ by peptide immunization of HLA-A*24:02 Tg mice.
  • a mix of hROBO1 short chain peptides that produced HLA-A*24:02 A mix of hROBO1 long chain peptides that produced peptide-specific IFN- ⁇ upon peptide immunization of Tg mice, HLA-A*24: IFN- ⁇ -producing T cells were induced in cancer cells MC38 expressing 02HHD and hROBO1, and BMDC transfected with hROBO1 mRNA.
  • IFN- ⁇ production against cancer cells MC38 A24HHD hROBO1 which both i.m. and i.d. express HLA-A*24:02HHD and hROBO1 was significantly higher than that against cancer cells MC38 A24HHD mock transfected with HLA-A2402HHD and an empty vector. This indicates that T cells that specifically recognize and attack hROBO1-expressing cancer cells were induced.
  • HLA-A2402 Tg mice that were similarly administered three times with LNP-eGFP mRNA a negative control, only a small amount of IFN- ⁇ was observed in any of the mice. It can be seen that this was specifically induced by administration of -hROBO1 mRNA.
  • Example 7 Development of common cancer antigen mRNA vaccine
  • Figure 43 shows an administration method for three doses of LNP-hCLDN1 mRNA and LNP-hEPHB4 mRNA.
  • 10 ⁇ g of LNP-hCLDN1 mRNA, LNP-hEPHB4 mRNA, or LNP-eGFP mRNA was administered intradermally (id) to the base of the tail of HLA-A*02:01 Tg mice and HLA-A*24:02 Tg mice.
  • the mice were administered three times in total on day 0, day 7, and day 14, and dissected on day 21, and the production of antigen-specific IFN- ⁇ was evaluated by ELISPOT.
  • Figures 44 and 45 show the above results.
  • spleen cells of HLA-A*02:01 Tg mice administered three times with LNP-hCLDN1 mRNA or LNP-hEPHB4 mRNA were immunized with peptides by peptide immunization of HLA-A*02:01 Tg mice.
  • mice that were similarly administered three times with LNP-eGFP mRNA, which is a negative control, only a small amount of IFN- ⁇ was observed in any of the mice. It can be seen that the production of was specifically induced by administration of LNP-hCLDN1 mRNA or LNP-hEPHB4 mRNA.
  • spleen cells of HLA-A*24:02 Tg mice administered three times with LNP-hCLDN1 mRNA or LNP-hEPHB4 mRNA were immunized with peptides by peptide immunization of HLA-A*24:02 Tg mice.
  • IFN- ⁇ production against the MC38 A24HHD mock or the MCA205 A24HHD mock is thought to be due to the presentation of mouse CLDN1 or EPHB4-derived peptides to HLA-A*24:02HHD.
  • HLA-A*24:02 Tg mice that were similarly administered three times with LNP-eGFP mRNA a negative control, only a small amount of IFN- ⁇ was observed in any of the mice. It can be seen that the production of was specifically induced by administration of LNP-hCLDN1 mRNA or LNP-hEPHB4 mRNA.
  • Example 8 Development of common cancer antigen mRNA vaccine
  • Figure 46 shows the administration method for three doses of LNP-hTGFBI mRNA and LNP-hSPARC mRNA. 10 ⁇ g of LNP-hTGFBI mRNA, LNP-hSPARC mRNA, or LNP-eGFP mRNA was administered intradermally (id) to the ridge of HLA-A*02:01 Tg mice and HLA-A*24:02 Tg mice. The mice were administered three times in total on day 0, day 7, and day 14, and dissected on day 21, and the production of antigen-specific IFN- ⁇ was evaluated by ELISPOT.
  • Figures 47 and 48 show the above results.
  • spleen cells of HLA-A*02:01 Tg mice administered three times with LNP-hTGFBI mRNA or LNP-hSPARC mRNA were immunized with peptides by peptide immunization of HLA-A*02:01 Tg mice.
  • a mix of short peptides of hTGFBI or hSPARC, which showed specific IFN- ⁇ production and a mix of hTGFBI or hSPARC short chain peptides, which showed peptide-specific IFN- ⁇ production after peptide immunization of HLA-A*02:01 Tg mice.
  • T cells producing IFN- ⁇ were induced.
  • spleen cells of HLA-A*24:02 Tg mice administered three times with LNP-hTGFBI mRNA or LNP-hSPARC mRNA were immunized with peptides by peptide immunization of HLA-A*24:02 Tg mice.
  • BMDC transfected with a mix of chain peptides cancer cells MCA205 expressing HLA-A*24:02HHD and hTGFBI, or cancer cells MCA205 expressing HLA-A*24:02HHD and hSPARC, hTGFBI mRNA or hSPARC mRNA.
  • T cells producing IFN- ⁇ were induced.
  • the cancer cell MCA205 A02HHD hTGFBI expressing HLA-A*02:01HHD and hTGFBI was significantly higher than that of the cancer cell MCA205 A02HHD mock into which HLA-A*02:01HHD and empty vector had been introduced. , it can be seen that T cells that specifically recognize and attack cancer cells expressing hTGFBI were induced.
  • IFN- ⁇ production against the MCA205 A24HHD mock in LNP-hSPARC mRNA-administered mice is thought to be due to the presentation of mouse SPARC-derived peptides to HLA-A*24:02HHD.
  • HLA-A*02:01 Tg mice that were similarly administered three times with LNP-eGFP mRNA a negative control, IFN- ⁇ production was low in all cases. It can be seen that this was specifically induced by administration of -hTGFBI mRNA or LNP-hSPARC mRNA.
  • Example 9 Development of common cancer antigen mRNA vaccine
  • Figure 49 shows an administration method for three doses of LNP-hAFP mRNA and LNP-hHSP105 ⁇ mRNA.
  • 10 ⁇ g of LNP-hAFP mRNA, LNP-hHSP105 ⁇ mRNA, or LNP-eGFP mRNA was administered intradermally (id) to the base of the tail of HLA-A*02:01 Tg mice and HLA-A*24:02 Tg mice.
  • the mice were administered three times in total on day 0, day 7, and day 14, and dissected on day 21, and the production of antigen-specific IFN- ⁇ was evaluated by ELISPOT.
  • Figures 50 and 51 show the above results.
  • cancer cells expressing HLA-A*02:01HHD and hAFP were found in the spleen cells of HLA-A*02:01 Tg mice administered three times with LNP-hAFP mRNA or LNP-hHSP105 ⁇ mRNA.
  • T cells that produce IFN- ⁇ were induced in MC38, a cancer cell expressing HLA-A*02:01HHD and hHSP105 ⁇ , and in BMDC transfected with hAFP mRNA or hHSP105 ⁇ mRNA.
  • mice that were similarly administered three times with the negative control LNP-eGFP mRNA, one individual showed high production of IFN- ⁇ against MC38, but the production of IFN- ⁇ against BMDCs transfected with antigen mRNA was high.
  • the production of IFN- ⁇ in BMDCs transfected with antigen mRNA was thought to be specifically induced by administration of LNP-hAFP mRNA or LNP-hHSP105 ⁇ mRNA.
  • cancer cells expressing HLA-A*24:02HHD and hAFP were found in the spleen cells of HLA-A*24:02 Tg mice administered three times with LNP-hAFP mRNA or LNP-hHSP105 ⁇ mRNA.
  • T cells that produce IFN- ⁇ were induced in MC38, a cancer cell expressing HLA-A*24:02HHD and hHSP105 ⁇ , and in BMDCs transfected with hAFP mRNA or hHSP105 ⁇ mRNA.
  • IFN- ⁇ production against cancer cells MC38 A24HHD hAFP expressing HLA-A*24:02HHD and hAFP was significantly higher than that against MC38 A24HHD mock cancer cells transfected with HLA-A*24:02HHD and empty vector. This indicates that T cells that specifically recognize and attack hAFP-expressing cancer cells were induced. Cancer cells expressing HLA-A*24:02HHD and hHSP105 ⁇ IFN- ⁇ production was observed in MC38 A24HHD mock to the same extent as in MC38 A24HHD hHSP105 ⁇ . -A*24:02 This is probably because it was presented to HHD.
  • Example 10 Development of common cancer antigen mRNA vaccine
  • Figure 52 shows an administration method for three doses of LNP-(hCLDN1+hEPHB4) mRNA.
  • 10 ⁇ g or 20 ⁇ g of LNP-(hCLDN1+hEPHB4) mRNA or 20 ⁇ g of LNP-Luciferase mRNA was administered intradermally to the ridge of HLA-A*02:01 Tg mice and HLA-A*24:02 Tg mice ( id), the mice were administered three times in total on day 0, day 7, and day 14, and dissected on day 21, and the production of antigen-specific IFN- ⁇ was evaluated by ELISPOT.
  • Figures 53 to 56 show the above results.
  • HLA-A*02:01HHD and hCLDN1 T cells that produce IFN- ⁇ were induced in cancer cells MCA205 expressing HLA-A*02:01HHD and hEPHB4, and BMDCs transfected with hCLDN1 mRNA or hEPHB4 mRNA.
  • IFN- ⁇ production against cancer cells MCA205 A02HHD hEPHB4 expressing HLA-A*02:01HHD and hEPHB4 was significantly higher than that against cancer cells MCA205 A02HHD mock transfected with HLA-A*02:01HHD and empty vector.
  • HLA-A*02:01HHD and hCLDN1-expressing cancer cells MCA205 A02HHD
  • the IFN- ⁇ production against MCA205 A02HHD mock was observed to be similar to that against hCLDN1 due to peptides derived from mouse CLDN1 or EPHB4. This is thought to be because it was presented to HLA-A*02:01HHD.
  • HLA-A*02:01 Tg mice that were similarly administered three times with LNP-Luciferase mRNA, which is a negative control, the production of IFN- ⁇ was relatively low in all cases. was specifically induced by administration of LNP-(hCLDN1+hEPHB4) mRNA.
  • HLA-A*24:02HHD and hCLDN1 were found in the spleen cells and inguinal lymph nodes of HLA-A*24:02 Tg mice administered with LNP-(hCLDN1+hEPHB4) mRNA three times.
  • T cells that produce IFN- ⁇ were induced in BMDCs transfected with cancer cells MCA205 expressing HLA-A*24:02HHD and hEPHB4, hCLDN1 mRNA, or hEPHB4 mRNA. was.
  • IFN- ⁇ production against cancer cells MCA205 A24HHD hEPHB4 expressing HLA-A*24:02HHD and hEPHB4 was significantly higher than that against cancer cells MCA205 A24HHD mock transfected with HLA-A*24:02HHD and empty vector. This indicates that T cells that specifically recognize and attack hEPHB4-expressing cancer cells were induced. Cancer cells expressing HLA-A*24:02HHD and hCLDN1 IFN- ⁇ production against MCA205 A24HHD hCLDN1 was observed to be the same as that against MCA205 A02HHD mock, which is based on peptides derived from mouse CLDN1 or EPHB4. This is thought to be because it was presented to HLA-A*24:02HHD.
  • mice that were similarly administered three times with the negative control LNP-Luciferase mRNA, the production of IFN- ⁇ was relatively low in all cases. was specifically induced by administration of LNP-(hCLDN1+hEPHB4) mRNA.
  • FIG. 57 shows a method for selecting high affinity T cell clones by inhibiting binding of CD8 molecules to MHC.
  • FIG. 57A shows the interaction between dextramer and TCR molecules in the presence of anti-CD8 antibody.
  • adding anti-CD8 antibody in advance prevents non-peptide-specific binding between CD8 molecules and MHC molecules. Only T cell clones with stronger binding TCR molecules are stained.
  • FIG. 57B shows a comparison of dextramer staining with and without CD8 binding inhibition.
  • T cell clones A and B show approximately equal staining with dextramer when CD8 binding is not inhibited, but when CD8 binding is inhibited, clone A exhibits stronger staining than clone B. Indicated.
  • FIG. 57C Selection of high affinity clones by CD8 binding inhibition.
  • Figure 58 shows the establishment of peptide-specific CTL clones from peripheral blood of patients who received the GPC3 peptide vaccine.
  • Dextramer-positive T cells were single-sorted from the peripheral blood of a patient who received a cancer peptide vaccine using a GPC3-derived peptide under conditions that inhibited CD8 binding, and were cultured on allofeeder cells to establish T cell clones.
  • Figures 60A and B show evaluation of TCR avidity by dextramer staining of HLA-A2-restricted GPC3-specific T cell clones.
  • Figures 60C and D show evaluation of TCR binding strength by dextramer staining of HLA-A24-restricted GPC3-specific T cell clones.
  • C No inhibition of CD8 binding.
  • D Comparison and study with CD8 binding inhibition.
  • FIG. 60E shows evaluation of antigen-specific IFN- ⁇ production ability of HLA-A24-restricted GPC3-specific T cell clones.
  • the established T cell clones were co-cultured with GPC3-positive HepG2 liver cancer cell line, GPC3-negative SK-Hep cell line (SK-vec), and GPC3 forced expression cell line (SK-GPC3) for 20 hours to detect IFN- ⁇ production. was evaluated by ELISPOT method.
  • the GPC3-derived peptide (GPC3 A24 prp.) used in the peptide vaccine was exogenously bound to T2-A24 cells, a TAP-deficient cell line, as a positive control, and the cells bound to an HIV-derived peptide as a negative control. Antigen specificity was assessed.
  • peripheral blood lymphocytes provided by patients with the HLA-A2 haplotype and patients with the HLA-A24 haplotype who received the GPC3 peptide vaccine were cultured and stimulated with the peptide, followed by CD8 inhibition.
  • Anti-affinity T cells were selected by staining with dextramer, and T cell clones were established. Established. When we compared the dextramer binding properties of each established clone with and without CD8 inhibition, we found that although the staining intensity decreased overall for A2-restricted clones, the stainability was maintained in all clones.
  • TCR-T cells For use in therapy and re-evaluate their function.
  • the table shows the amino acid sequence and gene sequence of the TCR gene isolated from each clone.
  • Figure 59 shows the establishment of peptide-specific CTL clones from peripheral blood of patients who received the FOXM1 peptide vaccine.
  • Dextramer-positive T cells were single-sorted from the peripheral blood of patients who received a cancer peptide vaccine using a FOXM1-derived peptide under conditions that inhibited CD8 binding, and were cultured on allofeeder cells to establish T cell clones.
  • Figures 59A and B show evaluation of TCR binding strength by dextramer staining of HLA-A24-restricted FOXM1-specific T cell clones.
  • Figure 60 shows the establishment of peptide-specific CTL clones from peripheral blood of patients who received the HSP105 peptide vaccine.
  • HSP105-HLA-A2 dextramer was insufficiently stained and could not be used to detect bound T cells.
  • peripheral blood of patients who had received a cancer peptide vaccine using HSP105-derived peptides was stimulated in the presence of antigen, and CD8T cells that exhibited a degranulation response were detected using a CD107a assay.
  • CD107a-positive CD8 T cells were single sorted and cultured on allofeeder cells to establish T cell clones.
  • FIG. 60A shows the evaluation of the reactivity of HLA-A2-restricted HSP105-specific T cell clones for IFN- ⁇ production by the ELISPOT method.
  • Each established T cell clone was co-cultured for 20 hours with target cells (T2 cells) to which HSP105-derived peptide was exogenously bound, and antigen stimulation-dependent IFN- ⁇ production was evaluated.
  • Antigen specificity was evaluated using cells bound with HIV-derived peptides as a negative control.
  • Figures 60B and C show the cytotoxic activity of HLA-A2-restricted HSP105-specific T cell clones.
  • Target cells were labeled with a fluorescent dye (calcein), co-cultured with T cell clones for 4 hours, and cytotoxic activity against the target cells was evaluated using the decay of fluorescence as an indicator.
  • B Targeted T2 cells with exogenously bound peptide.
  • Cells in which the HSP105-derived peptide (HSPA-7) used in the peptide vaccine was exogenously bound to T2 cells, a TAP-deficient cell line, were used as a positive control, and cells to which an HIV-derived peptide (HIVA2) was bound were used as a negative control. Antigen specificity was assessed.
  • HSPA-7 HSP105-derived peptide
  • HIVA2 HIV-derived peptide
  • HSP105 cancer cell lines endogenously expressing HSP105 were targeted and cytotoxic activity was evaluated.
  • Caski cells and SiHa-A2 cells were used as HSP105 positive cell lines, and SW620 cell line and HepG2 cell line were used as HSP105 negative cell lines. Cytotoxic activity of 11B9 clone has not been evaluated.
  • T-cell clones with HSP105 peptide reactivity were established from patients with HLA-A2 haplotypes who received an HSP105 peptide vaccine.
  • HLA-A2-HSP105 dextramer has insufficient staining properties, making it difficult to detect reactive clones by dextramer staining.
  • co-culture with the A2-expressing K562 cell line in the presence of the peptide which recognizes the antigen and shows degranulation (when degranulation is shown, CD107a molecules that normally exist inside the cells are exposed on the cell surface.
  • T cells (based on the degranulation evaluation method) were sorted and reactive T cell clones were established.
  • Figure 61 shows identification of peptide-reactive TCR genes using human HLA transgenic mice.
  • Figures 61A and 61B show peptide vaccines administered to human HLA gene-transfected mice and evaluation of peptide reactivity in the spleen. 50ug of a candidate cancer antigen-derived peptide was mixed with polyI:CLC as an adjuvant, and the mixture was administered intradermally to the ridge of mice three times every other week. Thereafter, the spleen was removed, the peptide used in the vaccine was added in vitro, cultured for 20 hours, and antigen-specific IFN- ⁇ production was detected by ELISPOT.
  • FIG 61C shows isolation of peptide-reactive TCR genes and evaluation of antigen reactivity by reporter assay.
  • Spleens of vaccinated mice were cultured for 4 hours in the presence of antigenic peptides and anti-CD107a antibodies, and degranulated cells (CD107a-positive cells) were single-cell sorted and collected in 96-well plates.
  • TCR genes were amplified from the collected cells using reverse transcription and TCR-specific primers, and TAP flag fragments incorporating each TCR gene were constructed. The constructed TAP fragments of each TCR gene and the NFAT transcription factor-responsive luciferase expression vector were introduced into Jurkat cells.
  • FIG. 61D shows reactivity evaluation of EPHB4 peptide-reactive TCR isolated from human HLA gene-transfected mice. Using the generated TCR-expressing Jurnakt cells, reactivity to EPHB4-derived peptides was expressed as luciferase activity (RLU). As a positive control, a known NY-ESO-1 peptide-specific TCR (1G4 TCR) was used. The case of co-culture with Cos-7 cells bound to EPHB4 peptide is shown in white ( ⁇ ), and the case of co-culture with Cos-7 cells bound to NY-ESO-1 peptide is shown in black ( ⁇ ).
  • RLU luciferase activity
  • T cell clones have been established by culturing them again in the presence of feeder cells, but it takes time for proliferation to stabilize, and it is not always possible to establish T cell clones from all sorted cells. . Therefore, we introduced a high-throughput TCR gene detection and functional evaluation method from single cells developed by Hamana et al. of the University of Toyama. In the method of Hamana et al., instead of re-cultivating the sorted cells, the TCR gene is directly amplified and isolated by PCR method, and the isolated TCR gene is ligated to a linear DNA containing a gene expression promoter using Gibson assembly.
  • a gene expression vector will be constructed, the constructed TCR gene expression vector will be introduced into a Jurkat cell line derived from T cell lymphoma, the TCR molecule will be reconstituted, and its reactivity will be evaluated. By not culturing, evaluation can be performed without losing cells that have been sorted in a short period of time. By sorting, we were able to identify the TCR genes of 21 of 39 CD107a-positive T cells isolated from the splenocytes of vaccinated mice, and we identified the TCR genes of 8 T cells excluding the same TCR gene. The cells were reconstituted and their antigen reactivity was evaluated.
  • the Jurkat cell line in which the TCR has been reconstituted contains a reporter gene that induces luciferase gene expression by the transcription factor NFAT, which is activated downstream of the TCR signal, and when the reconstituted TCR molecule recognizes an antigen, Reactivity can be quantitatively evaluated by measuring the luminescence caused by the luciferin luciferase reaction, which is dependent on the strength of the activation signal.
  • NFAT transcription factor NFAT
  • Figure 62 shows the production of TCR-T cells that recognize a common cancer antigen (FOXM1) by electroporation.
  • Figure 62A shows TCR-T cell production by electroporation.
  • sgRNA specific for the constant region of TCR was introduced together with Cas9 protein by electroporation, and endogenous TCR-deficient T cells (TCR DKO donor cells) were prepared.
  • TCR-T cells were produced by introducing mRNA of a single-chain TCR gene in which the TCR ⁇ chain gene and the TCR ⁇ chain gene were linked by a P2A sequence by electroporation.
  • FIG. 62B shows the expression of TCR molecules on the cell surface of the produced TCR-T cells.
  • the produced TCR-T cells were stained with anti-CD3 antibody and anti-TCR ⁇ antibody, and the expression of TCR molecules on the cell surface was evaluated.
  • the histogram shows the expression of CD3 and TCR ⁇ molecules on the cell surface, respectively (red: TCR-T cells, blue: donor cells).
  • FIG. 62C shows IFN- ⁇ production by antigen stimulation of the prepared TCR-T cells.
  • the prepared TCR-T cells were co-cultured for 20 hours with T2-A24 cells to which a cancer antigen peptide (FOXM1 pep.) had been bound exogenously, and IFN- ⁇ production was detected by ELISPOT.
  • a cancer antigen peptide FOXM1 pep.
  • TCR-T cells by reconstructing the identified cancer antigen-reactive TCR gene.
  • Figure 63 shows a development scheme for cocktail TCR-T cells that overcome cancer diversity.
  • TCR-T cells are generated by selecting TCR genes specific to each of the multiple cancer antigen peptides.
  • Example 12 Development of CAR-T cell therapy and cocktail CAR-T cell therapy targeting membrane protein common cancer antigen ⁇ Method>
  • Figure 64(a) For in vitro cytotoxicity evaluation of CAR-T cells, rhabdomyosarcoma cell line Rh30 and intrahepatic cholangiocarcinoma cell line SSP25 were used as target cells. Calcein-AM (Dojindo) at a concentration of 10 ⁇ g/ml was added to the cell line, and the cells were left to stand at 37°C for 30 minutes for staining.
  • Calcein-AM Dojindo
  • inactivated PBMCs heated for 15 minutes or more in a heat block set at 80°C were co-cultured instead of effector cells.
  • IGEPAL CA-630 MP Biomedicals
  • Nonidet P-40 equivalent was added to inactivated PBMC at a concentration of 6%.
  • the cytotoxicity rate was calculated using the following calculation method.
  • Injury rate (%) free amount of experimental group - natural free amount of experimental group) / (maximum free amount of experimental group - spontaneous free amount of experimental group) x 100
  • (b) For GPC3 CAR-T cells, prepared GC33 CAR ⁇ T cells were used as effector cells. These cells were developed using a retroviral vector that expresses a CAR derived from the GPC3-specific antibody GC33 developed by the Chugai-Roche Group. The CAR was introduced into 6-day-old healthy human PBMCs stimulated with zoledronic acid. Clones of CAR-expressing Vg9-positive ⁇ T cells were generated by single cell sorting.
  • the target cells are the SK-Hep-1 cell line, a liver cancer cell line that does not express GPC3, the cell line SK/hGPC3, which forcibly expresses the human GPC3 full-length sequence gene (hGPC3), and the cell line transformed with an empty vector as a negative control.
  • SK/vec was used. Calcein staining of target cells and calculation of injury rate were performed in the same manner as described above.
  • Cells were stained and measured using the same method as (a) and (b). PDX maintained and swollen in immunodeficient mice as target cells was extracted, the tissue was cut as much as possible with scissors, dispersed using Tumor Dissociation Kit, human (Miltenyi Biotec), and red blood cells were removed before use. did.
  • Figure 65(a) PDX models were created by transplanting each PDX adjusted to 5 mm square into SCID/Beige mice (colon cancer liver metastasis PDX) and NSG mice (head and neck cancer PDX model). The size of the tumor was calculated as area (b) or volume (d) by measuring the major axis and minor axis using calipers.
  • the blocks were sliced into 4 ⁇ m slices and pasted on glass slides, dried, and then stained.
  • DAB staining used a polymer reagent suitable for the primary antibody (Polymer reagent: EnVision+ System- HRP Labeled Polymer Anti-Rabbit or EnVision+ System- HRP Labeled Polymer Anti-Mouse) and a coloring reagent (Liquid DAB+ Substrate Chromogen System). After counterstaining with hematoxylin, the specimens were made into virtual slides using NanoZoomer (Hamamatsu Photonics K.K.).
  • Multiplex fluorescent immunohistochemical staining was performed according to the above method, using antibodies against each antigen such as EPHB4 (Cell Signaling Technology), human CD8 (Leica Biosystems), CD3 (abcam), Cleaved Caspase-3 (Cell Signaling Technology), A polymer reagent (EnVision+ System- HRP Labeled Polymer Anti-Rabbit or EnVision+ System- HRP Labeled Polymer Anti-Mouse) was used as the next antibody, and Opal 520, 540, 570, 620, 650, 690 (AKOYA BIOSCIENCES) was used as the fluorescent dye. Observation was made using Vectra3 (PerkinElmer).
  • Figure 64 shows in vitro cytotoxicity evaluation using CAR-T cells.
  • EPHB4 CAR-T cells and blast cells activated by PHA stimulation were each co-cultured with EPHB4-positive PDX cells, and the exposure of CD107a molecules, which recognize antigens and exhibit degranulation, to the cell surface was measured. Exposure of CD107a was observed only in EPHB4 CAR-T cells, indicating that cytotoxic activity was induced in an antigen-specific manner.
  • Figure 65 shows in vivo cytotoxicity evaluation using CAR-T cells.
  • EPHB4 CAR-T cells were transferred to each model 7 days after PDX transplantation, and further transferred the next day (colorectal cancer liver metastasis model)/the day after the next (head and neck cancer model).
  • the control group received physiological saline.
  • Figure 66 shows the development of cocktail CAR-T therapy.
  • cocktail CAR-T therapy We took advantage of the fact that one of five membrane protein common cancer antigens is expressed in most cancer tissues, created a cocktail CAR-T cell that expresses multiple CAR molecules, and determined the combination and ratio. Aiming to develop an optimized cocktail CAR-T treatment. This makes it possible to address issues such as cancer heterogeneity and differences between patients from multiple angles, and to effectively and efficiently suppress cancer growth and induce T cell infiltration.
  • Example 13 Expression analysis of membrane protein common cancer antigen in various cancer cell lines/Development of cancer risk diagnosis method by detecting circulating cancer cells in the blood using antibodies against membrane protein common cancer antigen
  • Hepatocellular carcinoma cell lines HepG2, Hep3B, HuH-7, PLC/PRF/5, JHH-2, JHH-4, JHH-5, JHH-6, JHH-7
  • intrahepatic cholangiocarcinoma cell lines RBE, SSP-25
  • colorectal cancer cell line HCT116, Lovo, colo201, HT29, WiDr, SW480, CaCO2
  • pancreatic cancer cell line Pancreatic cancer cell line
  • lung cancer cell line (RERF-LC) -AI, LK-2, II-18, A549, LU99, H1975, Lu-135, NCI-H446)
  • breast cancer cell line MDA-MB-231, MCF7
  • cervical cancer cell line HeLa
  • ovary Cancer cell lines KOC-7C, NOY
  • Antibody (Abnova, clone:84-1, 100-fold dilution), APC-labeled anti-human GPC3 antibody (Sino Biological, clone:024, 10-fold dilution), AF647-labeled anti-human ROBO1 antibody (R&D, clone:770502, 50-fold dilution) ), AF647-labeled anti-human Claudin-1 antibody (R&D, clone:421203, 25-fold dilution), and AF647-labeled anti-human EphB4 antibody (Miltenyi, clone:REA923, 50-fold dilution) for 20 minutes, and then FACS Canto ( BD Biosciences).
  • the above results are shown in FIGS. 67 and 68.
  • the hepatocellular carcinoma cell line HepG2 expressed all four membrane protein common cancer antigens GPC3, ROBO1, CLDN1, and EPHB4 in addition to EpCAM and CSV.
  • GPC3, ROBO1, CLDN1, and EPHB4 were expressed on the cell membrane. This indicates the possibility of detecting CTCs, which were missed by conventional CTC markers, by combining these four membrane protein common cancer antigens.
  • ⁇ Method> Approximately 5 mL of peripheral blood was collected from a hepatocellular carcinoma patient 3 days after tumor removal surgery using an EDTA-2K blood collection tube. 1/2 volume of Calcein-AM (DOJINDO) adjusted to 0.1 ug/mL in PBS was added to hepatocellular carcinoma cell line HepG2 and colorectal cancer cell line HCT116 suspended in PBS, and the cells were labeled at 37°C for 15 minutes. Ta. 1x10 ⁇ 3 Calcein-labeled HepG2 and HCT116 were added to half of the patient's peripheral blood.
  • DOE Calcein-AM
  • RBC lysis buffer Three times the volume of RBC lysis buffer (G BIOSCIENCES) was added to the peripheral blood spiked with the cancer cell line and peripheral blood not spiked with the cancer cell line, and hemolyzed for 10 minutes at room temperature. Suspend the remaining cells in 1mL of MACS Buffer (PBS+0.5%BSA+2mM EDTA), add 250uL of CD45 Dynabeads and 250uL of CD15 Dynabeads, stir at 4°C for 1 hour, and then remove CD45-positive cells and CD15-positive cells using a magnet. Cells were removed.
  • MACS Buffer PBS+0.5%BSA+2mM EDTA
  • the remaining cells were stained with zombie-NIR diluted 1200 times with PBS for 15 minutes at room temperature, then treated with Fc block (BD Biosciences, 10 times diluted) in FACS buffer for 20 minutes, and further treated with PerCP-labeled anti-CD45 antibody (Miltenyi , 50-fold dilution), PE-labeled anti-EpCAM antibody (Miltenyi, 100-fold dilution), PE-labeled anti-Cell-Surface Vimentin (CSV) antibody (Abnova, 100-fold dilution), APC-labeled anti-human GPC3 antibody (Sino Biological, 10-fold dilution) AF647-labeled anti-human ROBO1 antibody (R&D, 50-fold dilution), AF647-labeled anti-human Claudin-1 antibody (R&D, 50-fold dilution), AF647-labeled anti-human EphB4 antibody (Miltenyi, 50-fold dilution

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Abstract

本発明の課題は、共通がん抗原カクテルを利用した、がんワクチン、ＴＣＲ／ＣＡＲ－Ｔ細胞治療薬、コンパニオン診断方法、および血中循環がん細胞検出によるがんの発症リスク診断方法を提供することである。本発明によれば、（１）ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、およびＬＡＴ１から選択される３種以上を含む共通がん抗原；（２）前記３種以上の共通がん抗原の部分ペプチドであってＣＴＬ誘導能を有する部分ペプチド；（３）前記部分ペプチドで刺激した樹状細胞；または（４）前記共通がん抗原または前記部分ペプチドをコードするｍＲＮＡを含む、がんワクチンが提供される。

Description

共通がん抗原カクテルを利用した、がんワクチン、ＴＣＲ／ＣＡＲ－Ｔ細胞治療薬、コンパニオン診断方法、および血中循環がん細胞検出によるがんの発症リスク診断方法
　本発明は、共通がん抗原カクテルを利用した、がんワクチンに関する。本発明はさらに、ＴＣＲ／ＣＡＲ－Ｔ細胞治療薬、コンパニオン診断方法、および血中循環がん細胞検出によるがんの発症リスク診断方法に関する。
　がんと診断され、根治的な切除手術を受けたとしても、１０年以上生存できない患者は多い。日本では毎年１００万人ががんに罹患して、４０万人が死亡している。がんを対象とした、がんワクチン、ＴＣＲ／ＣＡＲ－Ｔ細胞治療薬、コンパニオン診断方法、および血中循環がん細胞検出によるがんの発症リスク診断方法が開発されれば、毎年の罹患者１００万人の多くが対象となるものと考えられる。また、将来的に採血でのがん発症リスク診断や発症リスク者へのがん予防ワクチンとしても使えるようになれば、全国民が対象となりうる。
　しかし、これまでのがんに対するワクチン療法の開発はいずれも失敗に終わっている。ＴＣＲ／ＣＡＲ－Ｔ細胞治療も固形がんの治療法として有望なものは未だ登場していない。また、ＣＴＣを捕捉する技術も完成したと言えるものはなく、ＣＴＣと思われる細胞を確実にがん細胞と証明してがんの再発・発症リスク診断につながる技術はない。注目されたネオアンチゲンを利用したワクチンやＴＣＲ－Ｔ細胞治療も個別化治療であり、開発コストや規制のハードルは高い。
　多くの人が適応となるがんワクチンやＴＣＲ遺伝子導入Ｔ細胞療法を開発するためには、標的とするがん細胞に発現している抗原が重要である。抗原としては、個別対応になるネオアンチゲンでは難しく、高頻度のがんで発現し、ほとんどの正常臓器に発現しない、いわゆる共通がん抗原が重要である。また、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法や抗体治療、あるいは血中循環がん細胞を捕捉するためには、特に、細胞膜に発現する共通がん抗原が必要になる。従来報告されているようながん精巣抗原など有名ながん抗原の多くは細胞膜には発現せず、発現頻度が少ない、あるいは正常組織にも発現しているといった問題があった。
　本発明は、共通がん抗原カクテルを利用した、がんワクチン、ＴＣＲ／ＣＡＲ－Ｔ細胞治療薬、コンパニオン診断方法、および血中循環がん細胞検出によるがんの発症リスク診断方法を提供することを解決すべき課題とした。
　本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、免疫組織化学的解析により、様々な固形がんに高頻度に発現し、正常組織にはほとんど発現しない１０種類の共通がん抗原を同定した。そのうち５種類は膜蛋白抗原であり、これまで調べた頭頚部がん、肺がん、肝がん、胆道がん、膵がん、大腸がんといった固形がんにおいて、ほとんどの症例のがんに、これら５種類の抗原の少なくとも一以上が発現しており、これらの共通がん抗原カクテルはあらゆる固形がんをカバーできることを証明した。本発明は上記の知見に基づいて完成したものである。
　即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
＜１＞　（１）ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、およびＬＡＴ１（ＳＬＣ７Ａ５）から選択される３種以上を含む共通がん抗原；
（２）前記３種以上の共通がん抗原の部分ペプチドであってＣＴＬ誘導能を有する部分ペプチド；
（３）前記部分ペプチドで刺激した樹状細胞；または
（４）前記共通がん抗原または前記部分ペプチドをコードするｍＲＮＡ
を含む、がんワクチン。
＜２＞　前記共通がん抗原が、ＡＦＰ、ＴＧＦＢＩ、ＳＰＡＲＣ、ＨＳＰ１０５α（ＨＳＰＨ１）、およびＦＯＸＭ１のうちの１種以上をさらに含む、＜１＞に記載のがんワクチン。
＜３＞　前記共通がん抗原が、ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、およびＬＡＴ１の全てを含む、＜１＞に記載のがんワクチン。
＜４＞　前記共通がん抗原が、ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、ＬＡＴ１、ＡＦＰ、ＴＧＦＢＩ、ＳＰＡＲＣ、ＨＳＰ１０５α、およびＦＯＸＭ１の全てを含む、＜１＞に記載のがんワクチン。
＜５＞　前記部分ペプチドが、配列番号１から８０の何れかに記載のアミノ酸配列を有するペプチドである、＜１＞から＜４＞の何れか一項に記載のがんワクチン。
＜６＞　（１）ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、ＬＡＴ１、ＡＦＰ、ＴＧＦＢＩ、ＳＰＡＲＣ、ＨＳＰ１０５α、およびＦＯＸＭ１から選択される３種以上を含む共通がん抗原；
（２）前記３種以上の共通がん抗原の部分ペプチドであってＣＴＬ誘導能を有する部分ペプチド；
（３）前記部分ペプチドで刺激した樹状細胞；または
（４）前記共通がん抗原または前記部分ペプチドをコードするｍＲＮＡ
を含む、がんワクチン。
＜７＞　配列番号５、７～１０、１４～２２、２４～３８、４０、４２、４８、４９、５２～８０の何れかに記載のアミノ酸配列を有するペプチド。
＜８＞　ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、およびＬＡＴ１から選択される３種以上を含む共通がん抗原に対するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有するＴ細胞の混合物を含む、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法剤。
＜９＞　前記共通がん抗原が、ＡＦＰ、ＴＧＦＢＩ、ＳＰＡＲＣ、ＨＳＰ１０５α、およびＦＯＸＭ１のうちの１種以上をさらに含む、＜８＞に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞療法剤。
＜１０＞　前記共通がん抗原が、ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、およびＬＡＴ１の全てを含む、＜８＞に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞療法剤。
＜１１＞　前記共通がん抗原が、ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、ＬＡＴ１、ＡＦＰ、ＴＧＦＢＩ、ＳＰＡＲＣ、ＨＳＰ１０５α、およびＦＯＸＭ１の全てを含む、＜８＞に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞療法剤。
＜１２＞　ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、ＬＡＴ１、ＡＦＰ、ＴＧＦＢＩ、ＳＰＡＲＣ、ＨＳＰ１０５α、およびＦＯＸＭ１から選択される３種以上を含む共通がん抗原に対するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有するＴ細胞の混合物を含む、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法剤。
＜１３＞　ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、およびＬＡＴ１のうちの３種以上を含む共通がん抗原由来のＭＨＣクラスＩ結合性抗原ペプチドを認識できるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＴ細胞の混合物を含む、ＴＣＲ－Ｔ細胞療法薬。
＜１４＞　前記共通がん抗原が、ＡＦＰ、ＴＧＦＢＩ、ＳＰＡＲＣ、ＨＳＰ１０５α、およびＦＯＸＭ１のうちの１種以上をさらに含む、＜１３＞に記載のＴＣＲ－Ｔ細胞療法剤。
＜１５＞　前記共通がん抗原が、ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、およびＬＡＴ１の全てを含む、＜１３＞に記載のＴＣＲ－Ｔ細胞療法剤。
＜１６＞　前記共通がん抗原が、ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、ＬＡＴ１、ＡＦＰ、ＴＧＦＢＩ、ＳＰＡＲＣ、ＨＳＰ１０５α、およびＦＯＸＭ１の全てを含む、＜１３＞に記載のＴＣＲ－Ｔ細胞療法剤。
＜１７＞　ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、ＬＡＴ１、ＡＦＰ、ＴＧＦＢＩ、ＳＰＡＲＣ、ＨＳＰ１０５α、およびＦＯＸＭ１のうちの３種以上を含む共通がん抗原由来のＭＨＣクラスＩ結合性抗原ペプチドを認識できるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＴ細胞の混合物を含む、ＴＣＲ－Ｔ細胞療法薬。
＜１８＞　Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が、
配列番号１０３のタンパク質と配列番号１０４のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１０５のタンパク質と配列番号１０６のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１０７のタンパク質と配列番号１０８のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１０９のタンパク質と配列番号１１０のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１１１のタンパク質と配列番号１１２のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１２３のタンパク質と配列番号１２４のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１２５のタンパク質と配列番号１２６のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１２７のタンパク質と配列番号１２８のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１２９又は１３０のタンパク質と配列番号１３１のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１３２のタンパク質と配列番号１３３のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１３４のタンパク質と配列番号１３５のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１３６のタンパク質と配列番号１３７のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１３８又は１３９のタンパク質と配列番号１４０のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１４１のタンパク質と配列番号１４２のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１４３のタンパク質と配列番号１４４のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１４５のタンパク質と配列番号１４６のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１４７のタンパク質と配列番号１４８のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１７７のタンパク質と配列番号１７８のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１７９のタンパク質と配列番号１８０のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１８１のタンパク質と配列番号１８２のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１８３のタンパク質と配列番号１８４のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１９３のタンパク質と配列番号１９４のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１９５のタンパク質と配列番号１９６のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１９７のタンパク質と配列番号１９８のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１９９又は２００のタンパク質と配列番号２０１のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号２０２のタンパク質と配列番号２０３のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号２１６のタンパク質と配列番号２１７のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；または
配列番号２１８のタンパク質と配列番号２１９のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
の何れかである、＜１３＞から＜１７＞の何れか一に記載のＴＣＲ－Ｔ細胞療法剤。
＜１９＞　配列番号１０３～１１２、１２３～１４８、１７７～１８４、１９３～２０３、２１５～２１９の何れかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
＜２０＞　配列番号１０３のタンパク質と配列番号１０４のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１０５のタンパク質と配列番号１０６のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１０７のタンパク質と配列番号１０８のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１０９のタンパク質と配列番号１１０のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１１１のタンパク質と配列番号１１２のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１２３のタンパク質と配列番号１２４のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１２５のタンパク質と配列番号１２６のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１２７のタンパク質と配列番号１２８のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１２９又は１３０のタンパク質と配列番号１３１のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１３２のタンパク質と配列番号１３３のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１３４のタンパク質と配列番号１３５のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１３６のタンパク質と配列番号１３７のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１３８又は１３９のタンパク質と配列番号１４０のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１４１のタンパク質と配列番号１４２のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１４３のタンパク質と配列番号１４４のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１４５のタンパク質と配列番号１４６のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１４７のタンパク質と配列番号１４８のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１７７のタンパク質と配列番号１７８のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１７９のタンパク質と配列番号１８０のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１８１のタンパク質と配列番号１８２のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１８３のタンパク質と配列番号１８４のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１９３のタンパク質と配列番号１９４のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１９５のタンパク質と配列番号１９６のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１９７のタンパク質と配列番号１９８のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１９９又は２００のタンパク質と配列番号２０１のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号２０２のタンパク質と配列番号２０３のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号２１６のタンパク質と配列番号２１７のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；または
配列番号２１８のタンパク質と配列番号２１９のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
の何れかである、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）。
＜２１＞　配列番号１１３～１２２、１４９～１７６、１８５～１９２、２０４～２１４、２２０～２２４の何れかの塩基配列を有する遺伝子。
＜２２＞　対象者由来の試料におけるＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、およびＬＡＴ１のうちの３種以上の発現の有無、およびＨＬＡ　class Iの細胞膜発現を多重蛍光免疫染色により同時に測定する工程１、および上記発現の有無に基づいて、がんの免疫療法の適応を判定する工程２を含む、コンパニオン診断方法。
＜２３＞　工程１において、さらにＡＦＰ、ＴＧＦＢＩ、ＳＰＡＲＣ、ＨＳＰ１０５α、およびＦＯＸＭ１のうちの１種以上の発現の有無を測定する、＜２２＞に記載のコンパニオン診断方法。
＜２４＞　工程１において、ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、およびＬＡＴ１の全ての発現の有無を測定する、＜２２＞に記載のコンパニオン診断方法。
＜２５＞　工程１において、ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、ＬＡＴ１、ＡＦＰ、ＴＧＦＢＩ、ＳＰＡＲＣ、ＨＳＰ１０５α、およびＦＯＸＭ１の全ての発現の有無を測定する、＜２２＞に記載のコンパニオン診断方法。
＜２６＞　対象者由来の血液試料における細胞について、ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、およびＬＡＴ１のうちの３種以上の発現を分析することを含む、がんの発症リスクの診断方法。
＜２７＞　さらにＡＦＰ、ＴＧＦＢＩ、ＳＰＡＲＣ、ＨＳＰ１０５α、およびＦＯＸＭ１のうちの１種以上の発現を分析することを含む、＜２６＞に記載のがんの発症リスクの診断方法。
＜２８＞　ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、およびＬＡＴ１の全ての発現を分析する、＜２６＞に記載のがんの発症リスクの診断方法。
＜２９＞　ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、ＬＡＴ１、ＡＦＰ、ＴＧＦＢＩ、ＳＰＡＲＣ、ＨＳＰ１０５α、およびＦＯＸＭ１の全ての発現を分析する、＜２６＞に記載のがんの発症リスクの診断方法。
　本発明によれば、共通がん抗原カクテルを利用した、共通がん抗原カクテルを利用した、がんワクチン、ＴＣＲ／ＣＡＲ－Ｔ細胞治療薬、コンパニオン診断方法、および血中循環がん細胞検出によるがんの発症リスク診断方法が提供される。
図１は、肝細胞がんなどにおける10種の共通がん抗原の発現を確認するために、パラフィン包埋組織切片を用いた免疫組織化学染色を実施した結果を示す。 図２は、GPC3, EPHB4, CLDN1, LAT1, ROBO1の細胞膜発現型共通がん抗原の各がん種での発現を示す。 図３は、神経芽腫、腎芽腫、絨毛がんの小児がんにおける共通がん抗原の発現とHLA-ClassＩの発現を示す。 図４は、肝細胞がんヒト臨床検体の非がん部における各共通がん抗原の発現を確認した結果を示す。 図５は、ヒト正常組織マイクロアレイを用いてGPC3, EPHB4, CLDN1, LAT1, ROBO1の31の正常組織における細胞膜発現型共通がん抗原の発現を表に示す。 図６は、TCR-T, CAR-T, がんワクチン等の免疫療法に、どの共通がん抗原を標的にすると効果的かを判定するために多重蛍光免疫染色を利用した適用診断システム開発の概念を示す。 図７は、PDXは肝細胞がんと肺がん患者由来の標本、ヒト臨床検体には肝細胞がん、肝内胆管がん、中咽頭がん(HPV-)患者の標本を用いてGPC3, EPHB4, CLDN1, LAT1, ROBO1の細胞膜発現型の共通がん抗原とHLA-ClassＩを対象に多重蛍光免疫染色を行った結果を示す。 図８は、肝細胞がんならびに原発性大腸がんにおける各がん抗原の遺伝子発現を示す。 図９は、抗原予測を行った肝細胞がんならびに大腸がん肝転移における各がん抗原の遺伝子発現を示す。 図１０は、がん抗原由来エピトープペプチドの予測パイプラインを示す。 図１１は、肝細胞がんにおける各がん抗原由来ペプチドのSCOREadjの分布を示す。 図１２は、肝細胞がん7症例において予測されたがん抗原ペプチドの総数を示す。 図１３は、抗原特異的T細胞を誘導できる共通がん抗原由来エピトープペプチドの同定法を示す。10種類の共通がん抗原アミノ酸配列より、ブライトパス・バイオ社との共同研究で確立したアルゴリズムを用いて、HLA-A*24:02拘束性エピトープペプチドを72種類、HLA-A*02:01拘束性エピトープペプチドを73種類予測し、合成されたペプチドをトランスジェニックマウスにワクチンし、ELISpot法により抗原特異的IFN-γの産生を評価した結果を示す。 図１４は、10種類の共通がん抗原蛋白質全長のアミノ酸配列から HLA-A*02:01に提示が予測されるペプチドを合成し、ヒトのHLA-A*02:01を全身の細胞に発現するマウスに、週に1回、計3回ペプチドワクチンを投与して、脾細胞中にペプチドに反応するCD8陽性キラーT細胞(CTL)を誘導できるペプチドをスクリーニングによって多数同定した結果を示す。 図１５は、10種類の共通がん抗原蛋白質全長のアミノ酸配列から HLA-A*24:02に提示が予測されるペプチドを合成し、ヒトの HLA-A*24:02を全身の細胞に発現するマウスに、週に1回、計3回ペプチドワクチンを投与して、脾細胞中にペプチドに反応するCD8陽性キラーT細胞(CTL)を誘導できるペプチドをスクリーニングによって多数同定した結果を示す。 図１６は、CTLの誘導が確認された共通がん抗原由来ショートペプチド感作樹状細胞(DC)を、トランスジェニックマウスにワクチンすることによって、抗原特異的T細胞が誘導されるか、各HLA遺伝子を導入したトランスジェニックマウスを用いて評価する方法を示す。 図１７は、CTLの誘導が確認された共通がん抗原由来ショートペプチド感作樹状細胞(DC)を、HLA-A*24:02トランスジェニックマウスにワクチンし、抗原特異的T細胞が誘導されるか、各HLA遺伝子を導入したトランスジェニックマウスを用いて評価した結果を示す。 図１８は、CTLの誘導が確認された共通がん抗原由来ショートペプチド感作樹状細胞(DC)を、HLA-A*02:01トランスジェニックマウスにワクチンし、抗原特異的T細胞が誘導されるか、各HLA遺伝子を導入したトランスジェニックマウスを用いて評価した結果を示す。 図１９は、CTLの誘導が確認された共通がん抗原由来ショートペプチドの配列を含むロングペプチドを用いて、ペプチドが実際に細胞内でプロセスされHLA上に提示されるかを確かめるために、HLA-A*02:01 TgmまたはHLA-A*24:02 Tgmを用いて検証した結果を示す。 図２０は、LNP-Covid-19 Spike mRNA 3回投与の投与方法を示す。 図２１は、LNP-Covid-19 Spike mRNA を3回投与したHLA-A*02:01 Tgマウスの脾臓細胞でのSpike抗原特異的ＩＦＮ－γ産生の結果を示す。 図２２は、LNP-eGFP mRNA を3回投与したHLA-A*02:01 Tgマウスの脾臓細胞でのSpike抗原特異的ＩＦＮ－γ産生の結果を示す。 図２３は、LNP-Covid-19 Spike mRNA あるいはLNP-eGFP mRNAを3回投与したHLA-A*02:01 Tgマウスの鼠径リンパ節細胞でのSpike抗原特異的ＩＦＮ－γ産生の結果を示す。 図２４は、LNP-Covid-19 Spike mRNA を3回投与したHLA-A*24:02 Tgマウスの脾臓細胞でのSpike抗原特異的ＩＦＮ－γ産生の結果を示す。 図２５は、LNP-eGFP mRNA を3回投与したHLA-A*24:02 Tgマウスの脾臓細胞でのSpike抗原特異的ＩＦＮ－γ産生の結果を示す。 図２６は、LNP-Covid-19 Spike mRNA あるいはLNP-eGFP mRNAを3回投与したHLA-A*24:02 Tgマウスの鼠径リンパ節細胞でのSpike抗原特異的ＩＦＮ－γ産生の結果を示す。 図２７は、LNP-Covid-19 Spike mRNA 2回投与の投与方法を示す。 図２８は、LNP-Covid-19 Spike mRNA を2回投与したHLA-A*02:01 Tgマウスの脾臓細胞でのSpike抗原特異的ＩＦＮ－γ産生の結果を示す。 図２９は、LNP-eGFP mRNA を2回投与したHLA-A*02:01 Tgマウスの脾臓細胞でのSpike抗原特異的ＩＦＮ－γ産生の結果を示す。 図３０は、LNP-Covid-19 Spike mRNA あるいはLNP-eGFP mRNAを2回投与したHLA-A*02:01 Tgマウスの鼠径リンパ節細胞でのSpike抗原特異的ＩＦＮ－γ産生の結果を示す。 図３１は、LNP-Covid-19 Spike mRNA を2回投与したHLA-A*24:02 Tgマウスの脾臓細胞でのSpike抗原特異的ＩＦＮ－γ産生の結果を示す。 図３２は、LNP-eGFP mRNA を2回投与したHLA-A*24:02 Tgマウスの脾臓細胞でのSpike抗原特異的ＩＦＮ－γ産生の結果を示す。 図３３は、LNP-Covid-19 Spike mRNA あるいはLNP-eGFP mRNAを2回投与したHLA-A*24:02 Tgマウスの鼠径リンパ節細胞でのSpike抗原特異的ＩＦＮ－γ産生の結果を示す。 図３４は、Spikeタンパク質に対する抗体測定の結果を示す。 図３５は、LNP-hGPC3 mRNA 3回投与の投与方法を示す。 図３６は、LNP-hGPC3 mRNAを、HLA-A*02:01 Tgマウスに投与し、ELISPOT法により脾臓細胞での抗原特異的ＩＦＮ－γの産生を評価した結果を示す。 図３７は、LNP-Luciferase mRNAを、HLA-A*02:01 Tgマウスに投与し、ELISPOT法により脾臓細胞での抗原特異的ＩＦＮ－γの産生を評価した結果を示す。 図３８は、LNP-hGPC3 mRNAを、HLA-A*24:02 Tgマウスに投与し、ELISPOT法により脾臓細胞での抗原特異的ＩＦＮ－γの産生を評価した結果を示す。 図３９は、LNP-Luciferase mRNAを、HLA-A*24:02 Tgマウスに投与し、ELISPOT法により脾臓細胞での抗原特異的ＩＦＮ－γの産生を評価した結果を示す。 図４０は、LNP-hROBO1 mRNA 3回投与の投与方法を示す。 図４１は、LNP-hROBO1 mRNA あるいはLNP-eGFP mRNAをHLA-A*02:01 Tgマウスに投与し、ELISPOT法により脾臓細胞での抗原特異的ＩＦＮ－γの産生を評価した結果を示す。 図４２は、LNP-hROBO1 mRNA あるいはLNP-eGFP mRNAをHLA-A*24:02 Tgマウスに投与し、ELISPOT法により脾臓細胞での抗原特異的ＩＦＮ－γの産生を評価した結果を示す。 図４３は、LNP-hCLDN1 mRNA あるいはLNP-hEPHB4 mRNA 3回投与の投与方法を示す。 図４４は、LNP-hCLDN1 mRNA、LNP-hEPHB4 mRNA、あるいはLNP-eGFP mRNAを、HLA-A*02:01 Tgマウスに投与し、ELISPOT法により脾臓細胞での抗原特異的ＩＦＮ－γの産生を評価した結果を示す。 図４５は、LNP-hCLDN1 mRNA、LNP-hEPHB4 mRNA、あるいはLNP-eGFP mRNAを、HLA-A*24:02 Tgマウスに投与し、ELISPOT法により脾臓細胞での抗原特異的ＩＦＮ－γの産生を評価した結果を示す。 図４６は、LNP-hTGFBI mRNA あるいはLNP-hSPARC mRNA 3回投与の投与方法を示す。 図４７は、LNP-hTGFBI mRNA、LNP-hSPARC mRNA、あるいはLNP-eGFP mRNAを、HLA-A*02:01 Tgマウスに投与し、ELISPOT法により脾臓細胞での抗原特異的ＩＦＮ－γの産生を評価した結果を示す。 図４８は、LNP-hTGFBI mRNA、LNP-hSPARC mRNA、あるいはLNP-eGFP mRNAを、HLA-A*24:02 Tgマウスに投与し、ELISPOT法により脾臓細胞での抗原特異的ＩＦＮ－γの産生を評価した結果を示す。 図４９は、LNP-hAFP mRNA あるいはLNP-hHSP105α mRNA 3回投与の投与方法を示す。 図５０は、LNP-hAFP mRNA、LNP-hHSP105α mRNA、あるいはLNP-eGFP mRNAを、HLA-A*02:01 Tgマウスに投与し、ELISPOT法により脾臓細胞での抗原特異的ＩＦＮ－γの産生を評価した結果を示す。 図５１は、LNP-hAFP mRNA、LNP-hHSP105α mRNA、あるいはLNP-eGFP mRNAを、HLA-A*24:02 Tgマウスに投与し、ELISPOT法により脾臓細胞での抗原特異的ＩＦＮ－γの産生を評価した結果を示す。 図５２は、LNP-(hCLDN1+hEPHB4) mRNA 3回投与の投与方法を示す。 図５３は、LNP-(hCLDN1+hEPHB4) mRNA、あるいはLNP-Luciferase mRNAを、HLA-A*02:01 Tgマウスに投与し、ELISPOT法により脾臓細胞での抗原特異的ＩＦＮ－γの産生を評価した結果を示す。 図５４は、LNP-(hCLDN1+hEPHB4) mRNA、あるいはLNP-Luciferase mRNAを、HLA-A*02:01 Tgマウスに投与し、ELISPOT法により鼠径リンパ節での抗原特異的ＩＦＮ－γの産生を評価した結果を示す。 図５５は、LNP-(hCLDN1+hEPHB4) mRNA、あるいはLNP-Luciferase mRNAを、HLA-A*24:02 Tgマウスに投与し、ELISPOT法により脾臓細胞での抗原特異的ＩＦＮ－γの産生を評価した結果を示す。 図５６は、LNP-(hCLDN1+hEPHB4) mRNA、あるいはLNP-Luciferase mRNAを、HLA-A*24:02 Tgマウスに投与し、ELISPOT法により鼠径リンパ節での抗原特異的ＩＦＮ－γの産生を評価した結果を示す。 図５７は、CD8分子のMHCへの結合阻害による高親和性T細胞クローンの選択法を示す。 図５８は、GPC3ペプチドワクチンを受けた患者末梢血からのペプチド特異的CTLクローンの樹立を示す。 図５９は、FOXM1ペプチドワクチンを受けた患者末梢血からのペプチド特異的CTLクローンの樹立を示す。 図６０は、HSP105ペプチドワクチンを受けた患者末梢血からのペプチド特異的CTLクローンの樹立を示す。 図６１は、ヒトHLA遺伝子導入マウスを用いたペプチド反応性TCR遺伝子の同定を示す。 図６２は、エレクトロポレーション法による共通がん抗原（FOXM1)を認識するTCR-T細胞の作製を示す。 図６３は、がんの多様性を克服するカクテルTCR-T細胞の開発スキームを示す。 図６４は、 CAR-T細胞によるin vitro 細胞傷害性評価を示す。 図６５は、CAR-T細胞によるin vivo 細胞傷害性評価を示す。 図６６は、カクテルCAR-T治療の開発を示す。 図６７は、様々ながん細胞株における膜タンパク共通がん抗原の発現解析の結果を示す。 図６８は、様々ながん細胞株における膜タンパク共通がん抗原の発現解析の結果を示す。 図６９は、　肝細胞がんの症例の採血検体中において、膜蛋白質共通がん抗原GPC3、ROBO1、CLDN1、EPHB4のいずれかを細胞膜に発現しているCTC様細胞を検出した結果を示す。
　以下、本発明について更に詳細に説明する。
　本発明者らは、免疫組織化学的解析により、様々な固形がんに高頻度に発現し、正常組織にはほとんど発現しない１０種類の共通がん抗原を同定した。そのうち５種類は膜蛋白抗原であり、これまで調べた頭頚部がん、肺がん、肝がん、胆道がん、膵がん、大腸がんといった固形がんにおいて、ほとんどの症例のがんに、これら５種類の抗原の少なくとも一以上が発現しており、これらの共通がん抗原カクテルはあらゆる固形がんをカバーできることを証明した。これらの結果により、これらの共通がん抗原カクテルを利用した、がんワクチン、ＴＣＲ－Ｔ細胞治療、ＣＡＲ－Ｔ細胞治療、それらのコンパニオン診断、および血中循環がん細胞検出によるがんの発症リスク診断が可能であることが示された。
　日本人の８５％、世界の人口の５０％はＨＬＡ－Ａ２４あるいは－Ａ２を持っている。本発明においては、１０種類の共通がん抗原蛋白質全長のアミノ酸配列から、ＨＬＡ－Ａ２４に提示が予測されるペプチドおよびＨＬＡ－Ａ２に提示が予測されるペプチドを合成し、ヒトのＨＬＡ－Ａ２４あるいは－Ａ２を全身の細胞に発現するマウスに、週に１回、計３回ペプチドワクチンを投与して、脾細胞中にペプチドに反応するＣＤ８陽性キラーＴ細胞（ＣＴＬ）が誘導されることを証明した。これらのペプチドは、ＣＴＬ誘導能に優れており、ペプチドワクチン、またはペプチドを付加した樹状細胞ワクチンにより、がんの治療、再発予防または予防に応用が可能である。また、１０種類の共通がん抗原は、ＣＴＬを誘導できる多数のペプチド配列を含むものであり、ｍＲＮＡワクチンとしても応用可能である。
　さらに、１０種類の共通がん抗原由来のペプチドワクチンの投与により誘導された、ペプチドに特異的に反応するＣＴＬの細胞表面にあり、がん細胞表面のＨＬＡとペプチドの複合体を認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をクローニングすることにより、このＴＣＲを遺伝子導入したＴ細胞療法（ＴＣＲ－Ｔ治療）を開発することができる。各共通がん抗原ペプチドに反応できるＴＣＲのレパートリーを増やすことにより、患者個々に最適な、あるいは、様々ながんに適応可能なカクテルＴＣＲ－Ｔ治療が可能である。１０種類の膜蛋白共通がん抗原のいずれかはほとんどのがん組織に発現している。このことは、これらに対するカクテル抗体療法、あるいはカクテルＣＡＲ－Ｔ治療は、ほとんどの固形がんの治療法として使えることを意味している。
＜共通がん抗原＞
　ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、ＬＡＴ１、ＡＦＰ、ＴＧＦＢＩ、ＳＰＡＲＣ、ＨＳＰ１０５α、およびＦＯＸＭ１は、それぞれ公知のタンパク質である。後記の実施例において、
hGPC3_isoform_2_NP_004475
hROBO1_isoform_X5_XP_006713340(hROBO1の細胞質内型)
hROBO1_isoform_a_NP_002932(hROBO1の膜局在型)
hEPHB4_NP_004435
hCLDN1_NP_066924
hSLC7A5_NP_003477
hAFP_isoform_1_NP_001125
hTGFBI_NP_000349
hSPARC_isoform_1_NP_003109
hFOXM1_isoform_2_NP_068772
hHSPH1_isoform_1_NP_006635
として記載したアミノ酸配列で表されるタンパク質、そのアイソフォーム、またはそのホモログを使用することができる。アイソフォームとしては、例えばスプライシングバリアント、個体差に基づくＳＮＰ等のバリアント等が挙げられる。具体的には、上記の実施例に記載したアミノ酸配列において、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、（２）上記の実施例に記載したアミノ酸配列において、１または複数、好ましくは１～数個、さらに好ましくは、１～１０個、１～５個、１～３個、１もしくは２個のアミノ酸が置換、欠失、付加または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。
＜ペプチドおよびタンパク質＞
  本発明におけるペプチドおよびタンパク質は、これをコードする遺伝子の塩基配列情報に基づくＤＮＡのクローニング、プラスミド構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養及び培養物からのタンパク質の回収などの操作を含む一般的な遺伝子工学的手法によって、発現ベクター又はクローニングベクター等を用いて製造することができる。
  組み換えベクターは、ポリヌクレオチドを適当なベクターに組み込むことにより製造することができる。ベクターは、宿主の種類及び使用目的により適宜選択すればよい。ベクターとしては、例えば、染色体、エピソーム又はウイルス等に由来するベクターが挙げられる。具体的には、例えば細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入エレメント、酵母染色体エレメント、ウイルス（例えばバキュロウイルス、パポバウイルス、ＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、及びレトロウイルス等）等に由来するベクター及びそれらを組み合わせたベクター、プラスミド及びバクテリオファージの遺伝学的エレメント由来のベクター（例えばコスミド及びファージミド等）が挙げられる。
  ポリヌクレオチドを、公知の方法によりベクターに挿入することにより、ポリヌクレオチドを含む組換えベクターが得られる。
  ポリヌクレオチドが組み込まれた組換えベクターは、公知の宿主、例えば大腸菌、バチルス属細菌のような細菌、酵母、昆虫細胞又は動物細胞（例えば、COS-7細胞、Vero細胞、CHO細胞等）等に公知の方法で導入することにより、組換えベクターが導入された形質転換体が得られる。
  遺伝子導入は、当業者に公知の方法により行うことができる。具体的には、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染等が挙げられる。
＜がんワクチン＞
　本発明のがんワクチンは、
（１）ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、およびＬＡＴ１から選択される３種以上を含む共通がん抗原；
（２）前記３種以上の共通がん抗原の部分ペプチドであってＣＴＬ誘導能を有する部分ペプチド；
（３）前記部分ペプチドで刺激した樹状細胞；または
（４）前記共通がん抗原または前記部分ペプチドをコードするｍＲＮＡ
を含む。
　共通がん抗原は、ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、およびＬＡＴ１から選択される３種以上を含むものであればよく、ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、およびＬＡＴ１から選択される３種、４種、または５種を含むものでもよい。好ましくは、共通がん抗原は、ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、およびＬＡＴ１の全てを含んでいてもよい。
　ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、およびＬＡＴ１から選択されるもの以外に、共通がん抗原は、ＡＦＰ、ＴＧＦＢＩ、ＳＰＡＲＣ、ＨＳＰ１０５α、およびＦＯＸＭ１のうちの１種以上をさらに含んでいてもよい。即ち、共通がん抗原は、ＡＦＰ、ＴＧＦＢＩ、ＳＰＡＲＣ、ＨＳＰ１０５α、およびＦＯＸＭ１のうちの１種、２種、３種、４種または５種をさらに含んでいてもよい。
　好ましくは、共通がん抗原が、ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、ＬＡＴ１、ＡＦＰ、ＴＧＦＢＩ、ＳＰＡＲＣ、ＨＳＰ１０５α、およびＦＯＸＭ１の全てを含むものでもよい。
　本発明においては、上記した３種以上の共通がん抗原の部分ペプチドであってＣＴＬ誘導能を有する部分ペプチドをがんワクチンとして使用することができる。即ち、部分ペプチドとしては、少なくとも３種類以上の部分ペプチドを使用することになる。
　具体的には、部分ペプチドとしては、ＧＰＣ３の部分ペプチド、ＲＯＢＯ１の部分ペプチド、ＥＰＨＢ４の部分ペプチド、ＣＬＤＮ１の部分ペプチド、およびＬＡＴ１の部分ペプチドから選択される３種以上を含むものであればよく、ＧＰＣ３の部分ペプチド、ＲＯＢＯ１の部分ペプチド、ＥＰＨＢ４の部分ペプチド、ＣＬＤＮ１の部分ペプチド、およびＬＡＴ１の部分ペプチドから選択される３種、４種、または５種を含むものでもよい。好ましくは、部分ペプチドとしては、ＧＰＣ３の部分ペプチド、ＲＯＢＯ１の部分ペプチド、ＥＰＨＢ４の部分ペプチド、ＣＬＤＮ１の部分ペプチド、およびＬＡＴ１の部分ペプチドの全てを含んでいてもよい。
　ＧＰＣ３の部分ペプチド、ＲＯＢＯ１の部分ペプチド、ＥＰＨＢ４の部分ペプチド、ＣＬＤＮ１の部分ペプチド、およびＬＡＴ１の部分ペプチドから選択されるもの以外に、部分ペプチドは、ＡＦＰの部分ペプチド、ＴＧＦＢＩの部分ペプチド、ＳＰＡＲＣの部分ペプチド、ＨＳＰ１０５αの部分ペプチド、およびＦＯＸＭ１の部分ペプチドのうちの１種以上をさらに含んでいてもよい。即ち、共通がん抗原は、ＡＦＰの部分ペプチド、ＴＧＦＢＩの部分ペプチド、ＳＰＡＲＣの部分ペプチド、ＨＳＰ１０５αの部分ペプチド、およびＦＯＸＭ１の部分ペプチドのうちの１種、２種、３種、４種または５種をさらに含んでいてもよい。
　好ましくは、部分ペプチドは、ＧＰＣ３の部分ペプチド、ＲＯＢＯ１の部分ペプチド、ＥＰＨＢ４の部分ペプチド、ＣＬＤＮ１の部分ペプチド、ＬＡＴ１の部分ペプチド、ＡＦＰの部分ペプチド、ＴＧＦＢＩの部分ペプチド、ＳＰＡＲＣの部分ペプチド、ＨＳＰ１０５αの部分ペプチド、およびＦＯＸＭ１の部分ペプチドの全てを含むものでもよい。
　上記の部分ペプチドは、エピトープペプチドであり、ＭＨＣ（ヒトにおいてはＨＬＡ）と結合して、細胞表面に抗原提示され、かつ抗原性を有する（Ｔ細胞によって認識され得る）ペプチドである。エピトープペプチドとしては、ＭＨＣクラスＩと結合して抗原提示され、ＣＤ８陽性Ｔ細胞に認識されるエピトープペプチドであるＣＴＬエピトープペプチド、並びにＭＨＣクラスＩＩと結合して抗原提示され、ＣＤ４陽性Ｔ細胞に認識されるエピトープペプチドであるヘルパーエピトープペプチドがある。本発明における部分ペプチドは、好ましくは、ＭＨＣクラスＩと結合して抗原提示され、ＣＤ８陽性Ｔ細胞に認識されるエピトープペプチドであるＣＴＬエピトープペプチドである。
  本発明における部分ペプチドは、腫瘍細胞において特異的に発現しているタンパク質由来のペプチドであり、腫瘍抗原ペプチドである。抗原提示とは、細胞内に存在するペプチドがＭＨＣと結合し、このＭＨＣ／抗原ペプチド複合体が細胞表面に局在化する現象である。細胞表面に提示された抗原はＴ細胞などにより認識された後、細胞性免疫や液性免疫を活性化する。ＭＨＣクラスＩに提示された抗原は、細胞性免疫を活性化するとともに、ナイーブＴ細胞のＴ細胞受容体に認識され、ナイーブＴ細胞を、細胞傷害活性を有するＣＴＬへと誘導するため、免疫療法に用いられる腫瘍抗原ペプチドとしては、ＭＨＣクラスＩと結合し、抗原提示されるペプチドが好ましい。
  本発明における部分ペプチドは、上記の通り、ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、ＬＡＴ１、ＡＦＰ、ＴＧＦＢＩ、ＳＰＡＲＣ、ＨＳＰ１０５α、またはＦＯＸＭ１の部分ペプチドであって、ＭＨＣ、特にＨＬＡと結合するペプチドであり、好ましくはＭＨＣ、特にＨＬＡにより抗原提示されるペプチドであり、さらに好ましくはＭＨＣ、特にＨＬＡにより抗原提示されてＣＴＬを誘導可能なペプチドである。部分ペプチドは、好ましくはＨＬＡクラスＩに結合可能であり、より好ましくはＨＬＡ－Ａ０２および/またはＨＬＡ－Ａ２４に結合可能である。
　部分ペプチドは、エピトープのアミノ酸配列を含む配列であれば、アミノ酸長は特に限定されないが、一般的にはアミノ酸長は約８～１４アミノ酸程度が好ましく、約８～１１アミノ酸程度がより好ましく、約９～約１１アミノ酸程度が特に好ましい。
  ヒトのＭＨＣクラスＩであるＨＬＡクラスＩと結合するエピトープペプチドは、約８～１４アミノ酸長、好ましくは約９～１１アミノ酸長であり、その配列中に結合するＨＬＡ特有の結合モチーフを有することが知られている。例えば、ＨＬＡ－Ａ０２と結合するペプチドは、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシン、イソロイシンもしくはメチオニンであってもよく、および／またはＣ末端のアミノ酸がバリン、ロイシンもしくはイソロイシンであってもよいという結合モチーフを有してもよく、ＨＬＡ－Ａ２４と結合するペプチドは、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニンもしくはトリプトファンであってもよく、および／またはＣ末端のアミノ酸がロイシン、イソロイシンもしくはフェニルアラニンであってもよい結合モチーフを有していてもよいが、上記に限定されるわけではない。
  したがって、部分ペプチドは、好ましくは、ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、ＬＡＴ１、ＡＦＰ、ＴＧＦＢＩ、ＳＰＡＲＣ、ＨＳＰ１０５α、またはＦＯＸＭ１の部分ペプチドであって、上記ンパク質のアミノ酸配列中の連続する８～１４アミノ酸からなり、Ｎ末端から第２番目のアミノ酸がロイシン、イソロイシンもしくはメチオニンであってもよく、および／または、Ｃ末端のアミノ酸がバリン、ロイシンもしくはイソロイシンであるペプチドであってもよいエピトープペプチドを含む。あるいは、部分ペプチドは、好ましくは、ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、ＬＡＴ１、ＡＦＰ、ＴＧＦＢＩ、ＳＰＡＲＣ、ＨＳＰ１０５α、またはＦＯＸＭ１の部分ペプチドであって、上記タンパク質のアミノ酸配列中の連続する８～１４アミノ酸からなり、　Ｎ末端から第２番目のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニンもしくはトリプトファンであってもよく、および／または、Ｃ末端のアミノ酸がロイシン、イソロイシンもしくはフェニルアラニンであってもよいペプチドであるが、上記に限定されるわけではない。
　部分ペプチドは、Ｎ末端および／またはＣ末端が修飾されていてもよい。修飾として具体的には、Ｎ－アルカノイル化（例えば、アセチル化）、Ｎ－アルキル化（例えば、メチル化）、Ｃ末端アルキルエステル（例えば、エチルエステル）、およびＣ末端アミド（例えばカルボキサミド）等が挙げられる。
　部分ペプチドの合成については、通常のペプチド化学において用いられる既知の方法に準じて行うことができる。
　上記した部分ペプチドとしては、配列番号１から８０の何れかに記載のアミノ酸配列を有するペプチドを使用することができる。
　上記のペプチドのうち、配列番号５、７～１０、１４～２２、２４～３８、４０、４２、４８、４９、５２～８０の何れかに記載のアミノ酸配列を有するペプチドは新規ペプチドである。
　上記した部分ペプチドはＣＴＬ誘導活性を有し、腫瘍抗原ペプチドとして、ＣＴＬ誘導剤として使用することができる。すなわち、ＨＬＡ－Ａ０２抗原またはＨＬＡ－Ａ２４抗原が陽性のヒトから末梢血リンパ球を単離し、インビトロで上記した部分ペプチドを添加して刺激することにより、上記の部分ペプチドを提示したＨＬＡ－Ａ０２抗原陽性細胞、またはＨＬＡ－Ａ２４抗原陽性細胞を特異的に認識するＣＴＬを誘導することができる。ＣＴＬの誘導の有無は、例えば、抗原ペプチド提示細胞に反応してＣＴＬが産生する種々のサイトカイン（例えばＩＦＮ－γ）の量を、例えばＥＬＩＳＡ法などによって測定することにより、確認することができる。また５１Ｃｒで標識した抗原ペプチド提示細胞に対するＣＴＬの傷害性を測定する方法によっても確認することもできる。
　本発明においては、部分ペプチドで刺激した樹状細胞をがんワクチンとして使用することができる。即ち、部分ペプチドと樹状細胞とをin vitroで接触させることにより、細胞表面にＨＬＡ－Ａ０２抗原またはＨＬＡ－Ａ２４抗原と本発明の部分ペプチドとの複合体を提示させた抗原提示細胞を製造することができる。好ましくは、樹状細胞としては、がん患者由来の単離された細胞を使用することができる。樹状細胞は、例えば、がん患者の末梢血からフィコール法によりリンパ球を分離し、その後非付着細胞を除き、付着細胞をＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－４存在下で培養して樹状細胞を誘導することができる。上記のようにしてがん患者から単離された樹状細胞と、本発明の部分ペプチドをin vitroで接触させることにより、細胞表面にＨＬＡ－Ａ０２抗原またはＨＬＡ－Ａ２４抗原と部分ペプチドとの複合体を提示させた抗原提示細胞を製造することができる。
　本発明においては、上記した共通がん抗原、または上記した部分ペプチドをコードするｍＲＮＡをがんワクチンとして使用することができる。共通がん抗原または部分ペプチドをコードするｍＲＮＡとしては、複数の部分ペプチドをタンデムにコードするｍＲＮＡを使用してもよい。この場合、１本のｍＲＮＡ上に複数の部分ペプチドがコードされることになる。
　本発明のがんワクチンは、がん患者に対して有効であり、特にＨＬＡ－Ａ０２またはＨＬＡ－Ａ２４陽性のがん患者に対して有効である。具体的には、例えば、肝細胞がん、大腸がん、中咽頭がん、食道がん、子宮がん、腎芽腫、肺がん、乳がん、舌がん、肝内胆管がん、腎がん、神経芽腫、絨毛がんなどの患者に対して有効である。
　本発明のがんワクチンは、がんの予防または治療のために使用することができる。がんの予防としては、患者のがんへの罹患の予防だけでなく、手術により原発巣の腫瘍を切除した患者における再発予防、手術、放射線療法もしくは薬物療法等のがん治療により完全に除去できなかった腫瘍の転移防止等が含まれる。がんの治療には、がんを縮小させるがんの治癒・症状改善のみでなく、がん細胞の増殖、腫瘍の拡大もしくは原発巣からのがん細胞の転移を抑制する進行防止等が含まれる。
　本発明のがんワクチンは、医薬組成物の形態で提供することができる。
  本発明のがんワクチンの剤形は、経口投与剤又は非経口投与剤のいずれでもよいが、一般的には非経口投与剤が好ましい。非経口投与剤としては、皮下注射剤、筋肉内注射剤、静脈内注射剤、座剤などが挙げられる。
  本発明のがんワクチンが経口投与剤である場合は、上記した有効成分を、薬学的に許容される賦形剤とともに、がんワクチンに製剤化することができる。賦形剤としては、例えば、スターチ、マンニトール、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、重合アミノ酸、及びアルブミン等が挙げられる。
  本発明のがんワクチンが非経口投与剤である場合は、上記した有効成分を、薬学的に許容される担体とともに、がんワクチンに製剤化することができる。担体としては、例えば、水、食塩、デキストロース、エタノール、グリセロール、及びＤＭＳＯ等が挙げられる。
  本発明のがんワクチンは、更に、所望により、アルブミン、湿潤剤、及び／又は乳化剤などを含んでいてもよい。
  また、細胞性免疫の賦活化のために、上記した有効成分は、適当なアジュバントとともに使用することができる。本発明のがんワクチンは、当該アジュバントを含有してもよい。
  アジュバントとしては、当分野において既知のアジュバントが適用可能であり、具体的には、以下のものが挙げられる。ゲルタイプとしては、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムおよびリン酸カルシウムなどが挙げられる。菌体タイプとしては、ＣｐＧ、モノホスホリルリピドＡ、コレラ毒素、大腸菌易熱性毒素、百日咳毒素およびムラミルジペプチドなどが挙げられる。油乳濁液タイプ（エマルション製剤）としては、フロイント不完全アジュバントなどが挙げられる。高分子ナノ粒子タイプとしては、リポソーム、生分解性マイクロスフェアおよびサポニン由来のＱＳ－２１などが挙げられる。合成タイプとしては、非イオン性ブロックコポリマー、ムラミルペプチドアナログ、ポリホスファゼンおよび合成ポリヌクレオチドなどが挙げられる。サイトカインタイプとしてＩＦＮ－γ、ＩＬ－２およびＩＬ－１２などが挙げられる。
  本発明のがんワクチン（医薬組成物）の剤形は、特に限定されないが、油乳濁液（エマルション製剤）、高分子ナノ粒子、リポソーム製剤、直径数μｍのビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結合させた製剤、マイクロスフェア製剤、マイクロカプセル製剤などが挙げられる。      
　本発明のがんワクチン（医薬組成物）の投与方法としては、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与などが挙げられる。がんワクチンにおける有効成分の投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、成人（体重５０ｋｇ）一人当たりで通常０．０００１ｍｇ～１０００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ～１０００ｍｇ、より好ましくは０．１ｍｇ～１０ｍｇであり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。
 また、部分ペプチドで刺激した樹状細胞をがんワクチンとして使用する場合には、上記の樹状細胞を安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、培地等を含むことが好ましい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与などが挙げられる。このような部分ペプチドで刺激した樹状細胞を有効成分として含有するがんワクチンを患者の体内に戻すことにより、がんに罹患している患者の体内で、本発明の共通がん抗原を発現するがん細胞に特異的なＣＴＬが効率良く誘導され、その結果、がんを予防または治療することができる。
＜ＣＡＲ－Ｔ細胞療法剤＞
　本発明のＣＡＲ－Ｔ細胞療法剤は、ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、およびＬＡＴ１から選択される３種以上を含む共通がん抗原に対するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有するＴ細胞の混合物を含む。
　共通がん抗原は、ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、およびＬＡＴ１から選択される３種以上を含むものであればよく、ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、およびＬＡＴ１から選択される３種、４種、または５種を含むものでもよい。好ましくは、共通がん抗原は、ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、およびＬＡＴ１の全てを含んでいてもよい。
　ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、およびＬＡＴ１から選択されるもの以外に、共通がん抗原は、ＡＦＰ、ＴＧＦＢＩ、ＳＰＡＲＣ、ＨＳＰ１０５α、およびＦＯＸＭ１のうちの１種以上をさらに含んでいてもよい。即ち、共通がん抗原は、ＡＦＰ、ＴＧＦＢＩ、ＳＰＡＲＣ、ＨＳＰ１０５α、およびＦＯＸＭ１のうちの１種、２種、３種、４種または５種をさらに含んでいてもよい。
　好ましくは、共通がん抗原が、ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、ＬＡＴ１、ＡＦＰ、ＴＧＦＢＩ、ＳＰＡＲＣ、ＨＳＰ１０５α、およびＦＯＸＭ１の全てを含むものでもよい。
　ＣＡＲ－Ｔ細胞療法とは、腫瘍抗原に特異的なモノクローナル抗体の一部に遺伝子操作を加えて改変したキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を患者由来のＴ細胞に遺伝子導入し、この遺伝子改変Ｔ細胞を体外で増幅培養した後に患者に輸注するという免疫細胞治療法である。具体的には、患者から採取された末梢血単核球を抗ＣＤ３抗体とＩＬ－２等の存在下で培養することによりＴ細胞を活性化したのち、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターなどの形質転換用ベクターを用いてＣＡＲをコードする遺伝子をＴ細胞に導入することにより、遺伝子改変Ｔ細胞を作製する。
　キメラ抗原受容体は、がん細胞の細胞表面に存在する分子を認識する抗体の抗体可変領域の軽鎖と重鎖を直列に結合させた単鎖抗体（ｓｃＦｖ）をＮ末端側に、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）／ＣＤ３複合体を構成する分子のうちＣＤ３ζ鎖をＣ末端側に持つように設計されたキメラタンパク分子である。このキメラ抗原受容体は、ｓｃＦｖ領域で特定の抗原を認識すると、ＣＤ３ζ鎖を介してＴ細胞の活性化が生じる。Ｔ細胞の活性化を増強するために、ｓｃＦｖとζ鎖の間に１または２以上の共刺激分子（例えばＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳなど）を組み込んでもよい。ｓｃＦｖとして、ＴＣＲ様抗体（ＴＣＲ様抗体から設計され得る抗体分子またはその断片を含む）を用いてＣＡＲを作製することができる。腫瘍抗原由来のペプチドとＭＨＣとの複合体を認識するＣＡＲは、ＣＴＬが標的とし得る腫瘍抗原ペプチドを提示しているがん細胞、がん細胞を貪食してＭＨＣクラスＩ上に腫瘍抗原ペプチドを提示している樹状細胞などを認識することができるため、前記ＣＡＲを導入した遺伝子改変Ｔ細胞は、人工ＣＴＬと同様に、前記腫瘍抗原に特異的ながんの予防および／または治療剤として有用である。
　キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有するＴ細胞（ＣＡＲ―Ｔ細胞）は、そのまま、又は各種担体とともにＣＡＲ－Ｔ細胞療法剤に製剤することができる。
  ＣＡＲ－Ｔ細胞療法剤の剤形は、経口投与剤又は非経口投与剤のいずれであってもよい。一般的には非経口投与剤が好ましい。非経口投与剤としては、皮下注射剤、筋肉内注射剤、静脈内注射剤、座剤などが挙げられる。
  ＣＡＲ－Ｔ細胞療法剤が経口投与剤である場合は、得られたＣＡＲ－Ｔ細胞を、薬学的に許容される賦形剤とともに、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法剤に製剤することができる。当該賦形剤としては、例えば、スターチ、マンニトール、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、重合アミノ酸、及びアルブミン等が挙げられる。
  ＣＡＲ－Ｔ細胞療法剤が非経口投与剤である場合は、得られたＣＡＲ－Ｔ細胞を、薬学的に許容される担体とともに、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法剤に製剤することができる。当該賦形剤としては、例えば、水、食塩、デキストロース、エタノール、グリセロール、及びＤＭＳＯ等が挙げられる。
＜ＴＣＲ－Ｔ細胞療法薬＞
　本発明のＴＣＲ－Ｔ細胞療法薬は、ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、およびＬＡＴ１のうちの３種以上を含む共通がん抗原由来のＭＨＣクラスＩ結合性抗原ペプチドを認識できるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＴ細胞の混合物を含む。
　共通がん抗原は、ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、およびＬＡＴ１から選択される３種以上を含むものであればよく、ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、およびＬＡＴ１から選択される３種、４種、または５種を含むものでもよい。好ましくは、共通がん抗原は、ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、およびＬＡＴ１の全てを含んでいてもよい。
　ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、およびＬＡＴ１から選択されるもの以外に、共通がん抗原は、ＡＦＰ、ＴＧＦＢＩ、ＳＰＡＲＣ、ＨＳＰ１０５α、およびＦＯＸＭ１のうちの１種以上をさらに含んでいてもよい。即ち、共通がん抗原は、ＡＦＰ、ＴＧＦＢＩ、ＳＰＡＲＣ、ＨＳＰ１０５α、およびＦＯＸＭ１のうちの１種、２種、３種、４種または５種をさらに含んでいてもよい。
　好ましくは、共通がん抗原が、ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、ＬＡＴ１、ＡＦＰ、ＴＧＦＢＩ、ＳＰＡＲＣ、ＨＳＰ１０５α、およびＦＯＸＭ１の全てを含むものでもよい。
　共通がん抗原由来のＭＨＣクラスＩ結合性抗原ペプチドを認識できるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、本発明の部分ペプチド（抗原ペプチド）とＨＬＡとの複合体を認識することができる。
　Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、通常、ＴＲＡとＴＲＢのヘテロダイマーである。
　Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の具体例としては、後記の実施例における表２～表１１に記載のものを使用することができる。即ち、具体的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）としては、
配列番号１０３のタンパク質と配列番号１０４のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１０５のタンパク質と配列番号１０６のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１０７のタンパク質と配列番号１０８のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１０９のタンパク質と配列番号１１０のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１１１のタンパク質と配列番号１１２のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１２３のタンパク質と配列番号１２４のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１２５のタンパク質と配列番号１２６のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１２７のタンパク質と配列番号１２８のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１２９又は１３０のタンパク質と配列番号１３１のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１３２のタンパク質と配列番号１３３のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１３４のタンパク質と配列番号１３５のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１３６のタンパク質と配列番号１３７のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１３８又は１３９のタンパク質と配列番号１４０のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１４１のタンパク質と配列番号１４２のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１４３のタンパク質と配列番号１４４のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１４５のタンパク質と配列番号１４６のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１４７のタンパク質と配列番号１４８のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１７７のタンパク質と配列番号１７８のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１７９のタンパク質と配列番号１８０のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１８１のタンパク質と配列番号１８２のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１８３のタンパク質と配列番号１８４のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１９３のタンパク質と配列番号１９４のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１９５のタンパク質と配列番号１９６のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１９７のタンパク質と配列番号１９８のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号１９９又は２００のタンパク質と配列番号２０１のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号２０２のタンパク質と配列番号２０３のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
配列番号２１６のタンパク質と配列番号２１７のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；または
配列番号２１８のタンパク質と配列番号２１９のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
を挙げることができる。
　上記したＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のアミノ酸配列及び塩基配列はいずれも新規な配列である。
　本発明によれば、配列番号１０３～１１２、１２３～１４８、１７７～１８４、１９３～２０３、２１５～２１９の何れかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質が提供される。
　本発明によれば、配列番号１１３～１２２、１４９～１７６、１８５～１９２、２０４～２１４、２２０～２２４何れかの塩基配列を有する遺伝子が提供される。
  本発明の共通がん抗原の部分ペプチドと末梢血リンパ球とをin vitroで接触させることにより、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＴ細胞を誘導することができる。得られるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＴ細胞は、本発明の共通がん抗原を提示する細胞を特異的に傷害することができる。好ましくは、本発明の共通がん抗原の部分ペプチドを用いて、in vitroで患者末梢血リンパ球を刺激してＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＴ細胞（即ち、腫瘍特異的ＣＴＬ）を増やした後に、このＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＴ細胞を患者に戻すことができる。
 上記の通り、 Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＴ細胞は、がんの治療剤または予防剤の有効成分とすることができ、ＴＣＲ－Ｔ細胞療法薬として使用することができる。ＴＣＲ－Ｔ細胞療法薬は、ＴＣＲ－Ｔ細胞を安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、培地等を含むことが好ましい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与などが挙げられる。このようなＴＣＲ－Ｔ細胞を有効成分として含有してなるがんの治療または予防剤を患者の体内に戻すことにより、本発明の共通がん抗原が陽性のがんに罹患した患者の体内でＴＣＲ－Ｔ細胞によるがん細胞の傷害作用が促進され、がん細胞を破壊することにより、がんを治療することができる。
  本発明のＴＣＲ－Ｔ細胞は、腫瘍細胞に抗原提示されている部分ペプチドとＨＬＡとの複合体を標的として細胞傷害活性を発揮することができる。すなわち本発明のＴＣＲ－Ｔ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、本発明の部分ペプチドとＨＬＡとの複合体を認識するものである。
　Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＴ細胞（ＴＣＲ－Ｔ細胞）は、そのまま、又は各種担体とともにＴＣＲ－Ｔ細胞薬に製剤することができる。
  ＴＣＲ－Ｔ細胞療法薬の剤形は、経口投与剤又は非経口投与剤のいずれであってもよい。一般的には非経口投与剤が好ましい。非経口投与剤としては、皮下注射剤、筋肉内注射剤、静脈内注射剤、座剤などが挙げられる。
　ＴＣＲ－Ｔ細胞療法薬が経口投与剤である場合は、得られたＴＣＲ－Ｔ細胞療法を、薬学的に許容される賦形剤とともに、ＴＣＲ－Ｔ細胞療法薬に製剤することができる。当該賦形剤としては、例えば、スターチ、マンニトール、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、重合アミノ酸、及びアルブミン等が挙げられる。
  ＴＣＲ－Ｔ細胞療法薬が非経口投与剤である場合は、得られたＴＣＲ－Ｔ細胞療法を、薬学的に許容される担体とともに、ＴＣＲ－Ｔ細胞療法薬に製剤することができる。当該賦形剤としては、例えば、水、食塩、デキストロース、エタノール、グリセロール、及びＤＭＳＯ等が挙げられる。
＜コンパニオン診断方法＞
　本発明のコンパニオン診断方法は、対象者由来の試料におけるＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、およびＬＡＴ１のうちの３種以上（即ち、３種、４種または５種）の発現の有無、およびＨＬＡ　class Iの細胞膜発現を多重蛍光免疫染色により同時に測定する工程１、および上記発現の有無に基づいて、がんの免疫療法の適応を判定する工程２を含む。
　好ましくは、工程１において、さらにＡＦＰ、ＴＧＦＢＩ、ＳＰＡＲＣ、ＨＳＰ１０５α、およびＦＯＸＭ１のうちの１種以上（即ち、１種、２種、３種、４種または５種）の発現の有無を測定してもよい。
　好ましくは、工程１において、ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、およびＬＡＴ１の全ての発現の有無を測定してもよい。
　好ましくは、工程１において、ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、ＬＡＴ１、ＡＦＰ、ＴＧＦＢＩ、ＳＰＡＲＣ、ＨＳＰ１０５α、およびＦＯＸＭ１の全ての発現の有無を測定してもよい。
　対象者由来の試料としては、特に限定されないが、肝臓、大腸、中咽頭、食道、子宮、腎臓、肺、乳房、舌、肝内胆管、神経、血液などを挙げることができる。
　本発明の共通がん抗原の発現の有無、およびＨＬＡ　class Iの細胞膜発現は、多重蛍光免疫染色により同時に測定する。多重蛍光免疫染色は直接法または間接法のいずれでもよい。直接法においては、蛍光を直接標識した一次抗体を複数使用し、標識二次抗体は使用しない。直接法においては、二次抗体による交差反応を避けることができ、また系が簡単で操作時間が短い。間接法においては、一次抗体を複数使用し、それらの一次抗体に対する標識二次抗体を使用します。増幅法の併用などにより、直接法よりも高い感度で検出できるという利点がある。
　多重蛍光免疫染色において使用する蛍光色素は、励起波長および蛍光波長の蛍光スペクトルを考慮して、選択することができる。
  本発明のコンパニオン診断方法においては、がんを有する患者において、がんの治療のために治療薬を投与した場合における、改善の有無またはその程度を検査または診断することができる。さらに本発明のコンパニオン診断方法は、本発明のがんワクチン、ＴＣＲ－Ｔ細胞治療薬またはＣＡＲ－Ｔ細胞治療薬を有効に適用できる治療対象患者の選択や、本発明のがんワクチン、ＴＣＲ－Ｔ細胞治療薬またはＣＡＲ－Ｔ細胞治療薬による治療効果の予測や判定にも利用することができる。
＜がんの発症リスクの診断方法＞
　本発明のがんの発症リスクの診断方法は、対象者由来の血液試料における細胞について、ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、およびＬＡＴ１のうちの３種以上（即ち、３種、４種または５種）の発現を分析することを含む。
　好ましくは、ＡＦＰ、ＴＧＦＢＩ、ＳＰＡＲＣ、ＨＳＰ１０５α、およびＦＯＸＭ１のうちの１種以上（即ち、１種、２種、３種、４種または５種）の発現を分析してもよい。
　好ましくは、ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、およびＬＡＴ１の全ての発現を分析してもよい。
　好ましくは、ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、ＬＡＴ１、ＡＦＰ、ＴＧＦＢＩ、ＳＰＡＲＣ、ＨＳＰ１０５α、およびＦＯＸＭ１の全ての発現を分析してもよい。
　本発明のがんの発症リスクの診断方法においては、典型的には、対象者から血液を採取し、そこに含まれる細胞について、ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、およびＬＡＴ１のうちの３種以上（即ち、３種、４種または５種）の発現を分析する。上記した共通がん抗原の発現量を検出または測定することにより、がんの罹患の有無またはその程度を検出、検査または診断することができる。
実施例１：免疫組織化学的解析による共通がん抗原の発現解析、多重蛍光免疫染色システムでのコンパニオン診断法の開発
＜方法＞
　様々なヒトがん組織のホルマリン固定パラフィンブロックより、4umのパラフィン切片を作製した。正常組織のマイクロアレイスライドは市販のもの(BioChain社)を使用した。キシレンとエタノールによる脱パラフィンを行い、0.3%H2O2/メタノールを用いて内因性ペルオキシダーゼを不活化した。抗原賦活化はTarget Retrieval Solution, pH9(Agilent社)もしくはAR6(AKOYA BIOSCIENCES社)不活化バッファーでのマイクロウェーブもしくは圧力釜による熱処理を行った。ブタ血清によるブロッキングを行った後、各抗原に対する一次抗体を反応させた。GPC3 (BIOMOSICS社,300倍希釈)、AFP (Agikent社, Ready to Use)、ROBO1 (PROTEINTECH社, 300倍希釈)、EPHB4 (Cell Signaling Technology社,300倍希釈)、CLDN1 (Cell Signaling Technology社,300倍希釈)、FOXM1 (abcam社,150倍希釈)、HSP105α(abcam社,200倍希釈)、SPARC (Santa Cruz Biotechnology社,250倍希釈)、TGFBI (abcam社,100倍希釈)、HLA-ABC (Hokudo社,200倍希釈)、LAT1 (abcam社,200倍希釈)。二次抗体にはポリマー試薬(EnVision+ System- HRP Labelled Polymer Anti-RabbitもしくはEnVision+ System- HRP Labelled Polymer Anti-Mouse)を用いた。発色にはLiquid DAB+ Substrate Chromogen Systemを使用した。ヘマトキシリンでの対比染色を行った後、エタノールとキシレンによる脱水、透徹処理を行った。プレパラートはNanoZoomer (Hamamatsu Photonics K.K.)によりバーチャルスライド化した。
　多重蛍光免疫組織化学染色の実施においてはキシレンとエタノールによる脱パラフィンを行い、0.3%H2O2/メタノールを用いて内因性ペルオキシダーゼを不活化した。抗原賦活化はTarget Retrieval Solution, pH9(Agilent社)もしくはAR6(AKOYA BIOSCIENCES社)不活化バッファーでのマイクロウェーブによる熱処理を行った。ブタ血清によるブロッキングを行った後、各抗原に対する一次抗体を反応させた。GPC3 (BIOMOSICS社, 600倍希釈)、ROBO1 (PROTEINTECH社, 600倍希釈)、EPHB4 (Cell Signaling Technology社,300倍希釈)、CLDN1 (Cell Signaling Technology社,1200倍希釈)、HLA-ABC (Hokudo社,600倍希釈)、LAT1 (abcam社,800倍希釈)。二次抗体にはポリマー試薬(EnVision+ System- HRP Labelled Polymer Anti-RabbitもしくはEnVision+ System- HRP Labelled Polymer Anti-Mouse)を用いた。蛍光色素にOpal 520, 540, 570, 620, 650, 690(AKOYA BIOSCIENCES社)を各100倍希釈で使用した。DAPIでの核染色を行った後、水溶性封入剤による封入を行い、プレパラートをVectra3(PerkinElmer)で観察した。
＜結果＞
　図１は、肝細胞がんなどにおける10種の共通がん抗原の発現を確認するために、パラフィン包埋組織切片を用いた免疫組織化学染色を実施した結果を示す。肝細胞がんのがん部においてGPC3, AFP, ROBO1, TGFBI, EPHB4, CLDN1は中程度から高度の発現を認め、非がん部における発現は陰性ないし弱程度のものであった。また、大部分の症例においてHLA-ClassＩの細胞膜での発現を認めたことから肝細胞がんで発現している共通がん抗原はTCR-T, CAR-Tおよびがんワクチン療法の標的として優れていることを示した。大腸がん肝転移、中咽頭がん(HPV-)、大腸がん、食道がん、子宮がんにおいてSPARC, HSP105α, FOXM1, TGFBI, EPHB4, CLDN1, LAT1は同様に中程度から高度の発現をしていることが確認された。
　図２は、GPC3, EPHB4, CLDN1, LAT1, ROBO1の細胞膜発現型共通がん抗原の各がん種での発現を示す。GPC3は肝細胞がんと小児がんの腎芽腫で共発現を認め、肺がん、食道がんといった扁平上皮がんで弱から中程度の発現を認めた。EPHB4, CLDN1, ROBO1は肺がん、大腸がん、乳がん、舌がん、肝内胆管がん、腎がん、食道がんで中程度から高度の発現を認め、LAT1は扁平上皮がんで強発現している傾向にあった。
　図３は、神経芽腫、腎芽腫、絨毛がんの小児がんにおける共通がん抗原の発現とHLA-ClassＩの発現を示す。細胞核発現型のFOXM1をはじめ、各共通がん抗原の中程度から高度の発現を認めるものの、HLA-ClassＩの細胞膜での発現は確認できなかった。一方でGPC3, EPHB4, CLDN1, LAT1, ROBO1の細胞膜発現型の共通がん抗原は、神経芽腫、腎芽腫、絨毛がんのがん細胞の細胞膜にいずれかが中程度から高度の発現をしており、HLA-ClassＩ非拘束性の性質を利用してCAR-T療法に応用できる可能性があることが分かった。
　図４は、肝細胞がんヒト臨床検体の非がん部における各共通がん抗原の発現を確認した結果を示す。GPC3, AFP, ROBO1, FOXM1, CLDN1は陰性であり、EPHB4とTGFBIは肝実質部の類洞に弱程度の発現を認めた。HLA-ClassＩは肝実質細胞の細胞膜に弱程度の発現をみる。
　図５は、ヒト正常組織マイクロアレイを用いてGPC3, EPHB4, CLDN1, LAT1, ROBO1の31の正常組織における細胞膜発現型共通がん抗原の発現を表に示す。EPHB4とROBO1は弱程度に各種組織におけるシグナルを検出するもののはっきりとした細胞膜発現を確認できなかった。GPC3, CLDN1, LAT1は一部の組織にのみ明らかな発現を認める。
　図６は、TCR-T, CAR-T, がんワクチン等の免疫療法に、どの共通がん抗原を標的にすると効果的かを判定するために多重蛍光免疫染色を利用した適用診断システム開発の概念を示す。
　図７においては、PDXは肝細胞がんと肺がん患者由来の標本、ヒト臨床検体には肝細胞がん、肝内胆管がん、中咽頭がん(HPV-)患者の標本を用いてGPC3, EPHB4, CLDN1, LAT1, ROBO1の細胞膜発現型の共通がん抗原とHLA-ClassＩを対象に多重蛍光免疫染色を行った。肝細胞がんPDXではGPC3が強発現しており、次いでCLDN1, EPHB4の発現が確認された。肺がんPDXではGPC3, EPHB4, CLDN1, LAT1がいずれかの組み合わせで中程度から高度に発現していた。ヒト臨床検体においては肝細胞がん患者と中咽頭がん(HPV-)患者でGPC3, CLDN1, LAT1だけでなく、HLA-ClassＩの発現も認め、CAR-TだけでなくTCR-T, がんワクチンにも適用可能である可能性を示した。肝内胆管がん患者ではLAT1, 次いでEPHB4, CLDN1が適用可能抗原であることが確認された。
実施例２：共通がん抗原の遺伝子発現とHLA結合ペプチドの予測
＜方法＞
　図８は、肝細胞がんならびに原発性大腸がんにおける各がん抗原の遺伝子発現を示す。TCGA（https://www.cancer.gov/ccg/research/genome-sequencing/tcga）に登録された肝細胞がん371例（左図）ならびに原発性大腸がん478例（右図）における各がん抗原の遺伝子発現を、ヒートマップで示した。各遺伝子の発現量は、log2 (FPKM+1)で正規化し、評価した。各がん抗原の名称にについて、高頻度または高発現を呈する抗原を赤、中頻度または中程度の発現を呈する抗原を緑、低頻度または低発現を呈する抗原を青、ほとんどの症例で発現が認められない抗原を黒で示した。
　図９は、抗原予測を行った肝細胞がんならびに原発性大腸がんにおける各がん抗原の遺伝子発現を示す。2016年から2023年までに国立がん研究センター東病院で外科的切除を受けた、肝細胞がん43例ならびに大腸がん由来転移性肝がん24例における各がん抗原の遺伝子発現を、ヒートマップで示した。各遺伝子の発現量は、log2 (TPM+1)で正規化し、評価した。肝細胞がんについては、HBV陽性（５例）、HCV陽性（10例）、非ウイルス性（28例）に分類し、示した。
　図１０は、がん抗原由来エピトープペプチドの予測パイプラインを示す。登録した症例の外科的切除検体より腫瘍ならびに正常肝組織を収集し、DNAならびにRNAを抽出し、全エクソンシークエンスならびにRNAシークエンスにより、がんで高発現するネオアンチゲンならびに共通がん抗原を選択した。全エクソンシークエンスの解析から各症例のHLAハプロタイプを決定し、MHC Class I (HLA-A, B, C)に対し高い結合力を持つペプチドを予測した。MHCへの結合力とそれぞれの抗原の発現量を因子として加えた予測器を構築し、がん抗原由来ペプチドの抗原性をSCOREadjとして算出した。
　図１１は、肝細胞がんにおける各がん抗原由来ペプチドのSCOREadjの分布を示す。肝細胞がん１例において予測された各がん抗原由来ペプチドを、SCOREadjで分類（1~2：水色, 2~3：オレンジ, 3~4：灰色, 4~5:黄色、5~6：青色, および６以上：緑色）し、その数を示した（上段、棒グラフ）。各がん抗原遺伝子の発現を、赤(Log2_TPM=10)~青(Log2_TPM=1)で示した。下段の棒グラフには、それぞれのがん抗原由来ペプチドで、SCOREadjが６以上のペプチドのみを抽出し、示した。
　図１２は、肝細胞がん7症例において予測されたがん抗原ペプチドの総数を示す。肝細胞がん7症例について、同様の予測器を用いて各がん抗原由来ペプチドの抗原性を予測した。予測されたペプチドの総数（がん抗原由来でHLA-A、BならびにCに結合が予測されたペプチドの合計数）をSCOREadjで分類し、症例ごとに棒グラフで示した。
＜結果＞
　肝細胞がんならびに大腸がんにおける12種の共通がん抗原の遺伝子発現を、TCGAに登録されたメタデータ、（肝細胞がん：TCGA-LIHC、大腸がん:TCGA-COAD）を用いて確認した。結果、CLDN1、SPARCならびにTGFβIについては、ほとんどの症例において発現が確認された。LAT1、FOXM1、EPHB4ならびにHSP105は、大腸がんでは大部分の症例で発現が認められるが、肝細胞がんでは高頻度で発現は見られるものの、大腸がんに比較し低発現であった。一方、肝細胞がんでは、GPC3またはAFPが高発現を呈する症例が認められるのに対し、大腸がんではこれらのがん抗原の発現は低値もしくは確認できなかった。ROBO1は、肝細胞がんで低い発現を認める症例が散見されるが、大腸がんでは大部分が低発現であった。NY-ESO-1およびWT1は、肝細胞がんならびに大腸がんにおいては、ほとんど発現が認められなかった。次に、我々が収集した肝細胞がんならびに転移性大腸がんの各症例について、腫瘍および正常組織より抽出したDNAまたはRNAを用いて全エクソン解析ならびにRNAシークエンス解析により、遺伝子変異に由来するネオアンチゲンとこれらの共通がん抗原の発現を評価し、がんワクチンの候補となりえるか、検討を行った。その結果、TCGAのメタデータを用いた解析と同様に、肝細胞がんにおいてはCLDN1、GPC3、SPARCならびにTGFβIが高頻度で発現することが示された。AFPについても、まれに高発現する症例が認められた。転移性大腸がんにおいては、CLDN1、LAT1、HSP105、SPARCならびにTGFβIが高頻度で発現するのに対し、ROBO1、GPC3、AFPといった肝細胞がん特異的ながん抗原発現はほとんど認められず、原発性大腸がんと同様の傾向であった。一方、EPHB4ならびにFOXM1は、転移性大腸がんでは、一部の症例で発現が認められるにとどまっており、原発性大腸がんとのがん抗原発現の差異がある可能性が示された。以上の結果から、NY-ESO-1ならびにWT1を除いたこれらの10種類のがん抗原は、肝細胞がんまたは転移巣を含む大腸がん症例において、固形がんにおける多様性（heterogeneity）を克服する革新的な免疫療法の有望な標的となり得ると考えられる。
　続いて、実際にこれらのがん抗原を標的とした場合、がんを傷害、排除するCD8+T細胞の標的となるがん抗原由来エピトープがどの程度、各症例で存在しうるか、検証した。我々はこれまでに、ブライトパス・バイオ株式会社との共同研究によりnetMHCPan(https://　services.healthtech.dtu.dk/services/NetMHCpan-4.1/)ならびにMHCFlurry（https://github. com/openvax/ mhcflurry）といった既存のHLA結合予測とタンパク質のプロテアソーム切断予測アルゴリズムであるNetChop（https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetChop-3.1/）を組み合わせ、さらにがん抗原の発現情報を加味した予測器を開発した。この予測器では、これらの複数の因子を、線形予測関数を用いて、最適化しSCOREadjとして評価を行う。我々は、これまでに、46症例の肝細胞がんまたは転移性大腸がんより予測したネオアンチゲン由来、278ペプチドを用いて、我々の予測器の有用性を検証し、国際誌（Cancer Sci. 2022 Apr;113(4):1113-1124.）に報告している。これらの一連の予測では各症例における遺伝子発現情報を得ることが可能であるため、ネオアンチゲンのみならず、共通がん抗原の発現も同時に評価が可能である。そこで、実際に発現が高いがん抗原について、抗原性が高いと予測されるペプチドが各症例でどの程度認められるか検証した。肝細胞がん１症例について予測を行ってみたところ、どの抗原に対してもHLAの結合が予測されるペプチド群が抽出できた。SCOREadjが高いペプチドについて抽出した場合にも、期待通り、GPC3やROBO1、FOXM1、EPHB4などのがん抗原について、エピトープと期待されうるペプチドが30~40程度予測可能であった。ネオアンチゲンを標的とした検証では、強い免疫原性を呈したペプチドが予測したうちの50%程度であったことを考慮すると、がんワクチンの候補とするに十分な数の共通がん抗原由来のペプチドを選択可能であることがわかった。また、SPARCのように発現は高いが予測されたペプチド数が少ない場合や、逆に発現は同程度であるが、ROBO1ではペプチド数が多く、逆にCLDN1では少ないといったように、予測されたSCOREadjの高いペプチドの数は抗原の発現量のみには依存せず、HLAへの結合親和性による影響が大きいことが示唆された。同様に、肝細胞がん６症例について検証した結果、どの症例においても100個程度の共通がん抗原由来ペプチドががんペプチドワクチンの候補として有用であるといった予測がなされた。
　がん抗原の発現量や発現パターンの多様性のみならず、各症例でHLAハプロタイプが異なることから、複数のがん抗原を標的としたカクテルワクチンは、患者ごとに予測された最適なペプチドの組み合わせを処方する個別化がんワクチンとしての開発が望ましい。一方、個別化医療はそのコストや準備や検査のために必要な時間が問題となることが多いが、複数の共通がん抗原由来の効果が期待できるペプチドの予測に加え、これらの10種類の共通がん抗原由来の免疫原性が確認されたペプチドライブラリを実装しオフザシェルフでの提供を可能にすることで、低コストでかつ短期間でより効果が高い、カクテルペプチドワクチンの提供が可能である。
実施例３：共通がん抗原由来CTL誘導ペプチドの同定、ペプチドワクチン・パプチドパルス樹状細胞ワクチンの開発
＜方法＞
　図１３においては、10種類の共通がん抗原アミノ酸配列より、ブライトパス・バイオ社との共同研究で確立したアルゴリズムを用いて、HLA-A*24:02拘束性エピトープペプチドを72種類、HLA-A*02:01拘束性エピトープペプチドを73種類予測し、合成した。次世代シークエンサーによる全エクソン解析およびRNAシークエンス解析を行い、得られた遺伝子変異とその発現データから、これらのHLAに結合しうるペプチドをin silicoで予測する。予測した抗原ペプチドがCTLを誘導することができるか、HLA遺伝子を導入したトランスジェニックマウスを用いて評価した。各ペプチドはDimethyl sulfoxide (DMSO, Wako)で10 mg/mlに溶解し、アジュバントとともにHLAトランスジェニックマウスに1週間毎3回免疫した。さらに1週間後に脾臓を摘出してＩＦＮ－γの産生をＩＦＮ－γ ELISpot assayで評価した。
　図１６においては、CTLの誘導が確認された共通がん抗原由来ショートペプチド感作樹状細胞(DC)を、トランスジェニックマウスにワクチンすることによって、抗原特異的T細胞が誘導されるか、各HLA遺伝子を導入したトランスジェニックマウスを用いて評価した。各ペプチドはDimethyl sulfoxide (DMSO, Wako)で10 mg/mlに溶解し、各ペプチドを感作したDCを、1ペプチドあたり1×10^5個ずつ作製し、PBSで液量を調製して100μlの液量でHLA-A*02:01 TgmもしくはHLA-A*24:02 Tgm の尾根部皮内に27G注射針/1 mlシリンジ (Terumo)を用いて免疫した。免疫は1週ごとに計3回行い、3回目のワクチンから1週間後脾臓を摘出し、ＩＦＮ－γの産生をＩＦＮ－γ ELISpot assayで評価した。
　DCは、HLA-A*02:01 TgmもしくはHLA-A*24:02 Tgmの大腿骨から採取したものを使用した。2×10^6個のDCを10 mlのFinal medium(10% FBS/1% L-glutamin/streptomycin-penicillin/NEAA/10 mM HEPES/Sodium pyruvate/2-ME (Gibco)) + 2-ME(1000倍希釈)　  + 20 ng/ml rmGM-CSF(PeproTech)に懸濁し、低接着の10 cmペトリディッシュ(AS ONE)に播種して培養を開始した。培養開始から3日目に、10 ml Final medium + 20 ng/ml rmGM-CSFを添加した。6日目に培地を半量コニカルチューブに取り、1,500 rpm, 5 min遠心して上清を除き、ペレットを新しい10 mlのFinal mediumで懸濁して同じディッシュに戻した。8日目に、6日目と同様に半量培地交換を行った。9日目にコニカルチューブにculture medium 10 mLを採取した。穏やかにピペッティングして、非接着細胞および緩く接着している細胞を回収し、同じ コニカルチューブに採取した。1500 rpm, 5 min遠心後、上清を捨てた。10 mL のserum free RPMIで懸濁し、1500 rpm, 5 minで遠心分離した。これを2回繰り返し（FBSを除くため）、上清を捨て、10 mL のserum free RPMIで懸濁し、maturation cytokine (20 ng/mL TNFα, 1μg/mL PGE2 , 20 ng/mL IL-4, 0.1μM Zometa, 10 μg/mL antigen peptide or no peptide for negative control)を加え、over nightで培養した。10日目に、各ペプチドで感作したDCをPBSで2回洗浄し、1×10^5/100μlに懸濁したものをマウスに投与した。
　ELISpot assayは、免疫したマウスのsplenocyteをMACSによってCD8陽性T細胞に単離し、1×10^5cells/wellに懸濁したものをエフェクター細胞として使用した。未免疫マウスのsplenocyteをラジエーション(100kV, 10mA, 100Gy)し、各ペプチドを20ug/ml濃度で添加したFinal mediumで、2×10^6 cells/wellの濃度に懸濁したものをターゲット細胞として使用した。
＜結果＞
　図１４、図１５、表１においては、10種類の共通がん抗原蛋白質全長のアミノ酸配列から HLA-A*24:02またはHLA-A*02:01に提示が予測されるペプチドを合成し、ヒトの HLA-A*24:02あるいはHLA-A*02:01を全身の細胞に発現するマウスに、週に1回、計3回ペプチドワクチンを投与して、脾細胞中にペプチドに反応するCD8陽性キラーT細胞(CTL)を誘導できるペプチドをスクリーニングによって多数同定した。そのペプチドに反応するCTL誘導率は、HLA-A*24:02拘束性共通がん抗原ショートペプチドで72個中30個、HLA-A*02:01拘束性共通がん抗原ショートペプチドで73個中38個、あわせて145個中68個であった。これらのペプチドは、臨床試験で使用したGPC3ペプチドワクチンのペプチドよりもCTL誘導能に優れており、今後、様々ながんの再発予防、予防に応用可能である。
　図１７及び図１８においては、CTLの誘導が確認された共通がん抗原由来ショートペプチド感作樹状細胞(DC)を、HLA-A*24:02またはHLA-A*02:01トランスジェニックマウスにワクチンし、抗原特異的T細胞が誘導されるか、各HLA遺伝子を導入したトランスジェニックマウスを用いて評価した。その結果、多数のペプチドについて、共通がん抗原ペプチド感作樹状細胞ワクチンによる抗原特異的なCTLの誘導をＩＦＮ－γ ELISpot assayによって確認することができた。使用したペプチドは、主に肝細胞がんに高発現がみられる抗原の中で、ペプチドワクチンによってCTLの誘導が高かったペプチドを、各抗原につき3つずつ選択した。選択したペプチドをDCに感作させ、トランスジェニックマウスにワクチンを行い、ＩＦＮ－γ ELISpot assayを用いて抗原特異的なCTLの誘導能の評価を行った。
　図１９においては、CTLの誘導が確認された共通がん抗原由来ショートペプチドの配列を含むロングペプチドを用いて、ペプチドが実際に細胞内でプロセスされHLA上に提示されるかを確かめるために、HLA-A*02:01 TgmまたはHLA-A*24:02 Tgmを用いて検証した。ロングペプチドとは、ペプチドに反応するCTLを誘導できた9～10merから成るショートペプチドのアミノ酸配列を含むようにデザインされた長鎖のペプチド (15～21mer)であり、このロングペプチドをワクチンすることにより、実際に細胞内でプロセシングされMHC分子と結合し、HLA上に提示されてペプチド特異的CTLが誘導されるか、ＩＦＮ－γ ELISpot assayを用いて評価を行った。HLA-A*24:02拘束性共通がん抗原ロングペプチドワクチンでは、合成されたロングペプチド21個中3個において、その配列に含まれたショートペプチドに反応するCTLの誘導が確認できた。HLA-A*02:01拘束性共通がん抗原ロングペプチドワクチンでは、合成されたロングペプチド21個中9個において、その配列に含まれたショートペプチドに反応するCTLの誘導が確認された。
実施例４：共通がん抗原mRNAワクチンの開発
　LNP-Covid-19 Spike mRNAを投与し、抗原特異的ＩＦＮ－γ産生を評価した。
　Covid-19(SARS-CoV-2)のSpikeタンパク質全長をコードしたmRNAをLNP(Lipid nano particle)に封入したmRNAワクチン(ARCTURUS therapeutics社, 非特許文献(de Alwis R. et al. A single dose of self-transcribing and replicating RNA-based SARS-CoV-2 vaccine produces protective adaptive immunity in mice. Mol Ther. 2021;29:1970-1983.)のConventional mRNA、以下のmRNAワクチンについても同様に作成)の2μgあるいは10μgを、HLA-A*02:01 TgマウスおよびHLA-A*24:02 Tgマウスの大腿直筋へ筋肉内投与(i.m.)、あるいは尾根部へ皮内投与(i.d.)した。3回投与プロトコールでは、day0、day7、day14に計3回投与し、HLA-A*24:02 TgマウスはDay20に、HLA-A*02:01 TgマウスはDay21に解剖した。2回投与プロトコールでは、day0、day28に投与し、HLA-A*24:02 TgマウスはDay35に、HLA-A*02:01 TgマウスはDay36に解剖した。脾臓と鼠径リンパ節(LN)から細胞を調製し、心臓採血した血液から血清を採取した。BD ELISPOT Mouse ＩＦＮ－γ SetおよびBD ELISPOT AEC Substrate Set(ともにBD)を用い、推奨プロトコールに従ったELISPOT法によりT細胞からの抗原特異的ＩＦＮ－γ産生を評価した。抗mＩＦＮ－γ抗体をコートした96 well plateに、脾臓細胞は2×10^6 cells/well, LN細胞は2×10^5 cells/wellで播種し、PMA(25ng/mL)+Ionomycin(1μg/mL)、Covid-19 Spikeタンパク質を網羅するペプチドのmix(3回投与実験ではPepMix S(jpt社 PM-WCPV-S-1)、2回投与実験ではPepTivator SARC-CoV-2 Prot_S (Miltenyi Biotech, 130-127-953)、各ペプチド1μg/mL)、Covid-19 Spikeタンパク質配列から段落［００９４］に記載の予測器で予測後にHLA-A*02:01 TgマウスあるいはHLA-A*24:02 Tgマウスへのペプチド免疫でペプチド特異的ＩＦＮ－γ産生を確認したペプチドのmixであるPOOL1 (各ペプチド5μg/mL)、対応するHLA Tgマウスのナイーブマウスの骨髄からマウスGM-CSF(20ng/mL)で分化誘導し、使用前日にマウスTNF-α(20ng/mL), マウスIL-4(20ng/mL), PGE2(1μg/mL)を加えて成熟化させた骨髄由来樹上細胞(BMDC)(2×10^5 cells/well)、同様の成熟化と同時に1×10^6 cellsあたり10μgのLNP-Spike mRNAを加えたBMDC(2×10^5 cells/well)をそれぞれ加えて20時間共培養し、ＩＦＮ－γの産生を評価した。スポットはエリフォトカウンターAT-X(ミネルヴァテック)で撮影し、スポット数をカウントした。各wellの左下にスポット数を記した。
　図２０は、LNP-Covid-19 Spike mRNA 3回投与の投与方法を示す。
　Covid-19のSpikeタンパク質全長をコードしたmRNAをLNPに封入したmRNAワクチン(ARCTURUS therapeutics社)の2μgあるいは10μgを、HLA-A*02:01 TgマウスおよびHLA-A*24:02 Tgマウスの大腿直筋への筋肉内投与(i.m.)、あるいは尾根部への皮内投与(i.d.)により、day0、day7、day14に計3回投与し、HLA-A*24:02 TgマウスはDay20に、HLA-A*02:01 TgマウスはDay21に解剖し、ELISPOT法により抗原特異的ＩＦＮ－γの産生を評価した。
　図２１及び図２２は、LNP-Covid-19 Spike mRNA を3回投与したHLA-A*02:01 Tgマウスの脾臓細胞でのSpike抗原特異的ＩＦＮ－γ産生の結果を示す。
　LNP-Covid-19 Spike mRNAを3回投与したHLA-A*02:01 Tgマウスの脾臓細胞には、PepMix S、POOL1、LNP-Covid-19 Spike mRNAを加えたBMDCに対して、i.m.とi.d.の両方でＩＦＮ－γを産生するT細胞が誘導されていた。陰性対照であるLNP-eGFP mRNAを同様に3回投与したHLA-A*02:01 Tgマウスでは、PepMix S、POOL1、LNP-Covid-19 Spike mRNAを加えたBMDCに対するＩＦＮ－γの産生はほとんど認められなかったことから、上記ＩＦＮ－γの産生はLNP-Covid-19 Spike mRNAの投与によって特異的に誘導されたことがわかる。
　図２３は、LNP-Covid-19 Spike mRNA を3回投与したHLA-A*02:01 Tgマウスの鼠径リンパ節細胞でのSpike抗原特異的ＩＦＮ－γ産生の結果を示す。
　LNP-Covid-19 Spike mRNAを3回投与したHLA-A*02:01 Tgマウスの鼠径リンパ節細胞には、PepMix S、LNP-Covid-19 Spike mRNAを加えたBMDCに対して、i.m.とi.d.の両方でＩＦＮ－γを産生するT細胞が誘導されていた。陰性対照であるLNP-eGFP mRNAを同様に3回投与したHLA-A*02:01 Tgマウスでは、PepMix S、LNP-Covid-19 Spike mRNAを加えたBMDCに対するＩＦＮ－γの産生はほとんど認められなかったことから、上記ＩＦＮ－γの産生はLNP-Covid-19 Spike mRNAの投与によって特異的に誘導されたことがわかる。
　図２４及び図２５は、LNP-Covid-19 Spike mRNA を3回投与したHLA-A*24:02 Tgマウスの脾臓細胞でのSpike抗原特異的ＩＦＮ－γ産生の結果を示す。
　LNP-Covid-19 Spike mRNAを3回投与したHLA-A*24:02 Tgマウスの脾臓細胞には、PepMix S、POOL1、LNP-Covid-19 Spike mRNAを1×10^6 cellsあたり1μgあるいは10μg加えたBMDCに対して、i.m.とi.d.の両方でＩＦＮ－γを産生するT細胞が強く誘導されていた。陰性対照であるLNP-eGFP mRNAを同様に3回投与したHLA-A*24:02 Tgマウスでは、PepMix S、POOL1、LNP-Covid-19 Spike mRNAを加えたBMDCに対するＩＦＮ－γの産生はわずかであったことから、上記ＩＦＮ－γの産生はLNP-Covid-19 Spike mRNAの投与によって特異的に誘導されたことがわかる。
　図２６は、LNP-Covid-19 Spike mRNA を3回投与したHLA-A*24:02 Tgマウスの鼠径リンパ節細胞でのSpike抗原特異的ＩＦＮ－γ産生の結果を示す。
　LNP-Covid-19 Spike mRNAを3回投与したHLA-A*24:02 Tgマウスの鼠径リンパ節細胞には、PepMix S、POOL1に対して、i.m.とi.d.の両方でＩＦＮ－γを産生するT細胞が誘導されていた。陰性対照であるLNP-eGFP mRNAを同様に3回投与したHLA-A*24:02 Tgマウスでは、PepMix S、POOL1に対するＩＦＮ－γの産生はほとんど認められなかったことから、上記ＩＦＮ－γの産生はLNP-Covid-19 Spike mRNAの投与によって特異的に誘導されたことがわかる。
　図２７は、LNP-Covid-19 Spike mRNA 2回投与の投与方法を示す。
　Covid-19のSpikeタンパク質全長をコードしたmRNAをLNPに封入したmRNAワクチンの2μgあるいは10μgを、HLA-A*02:01 TgマウスおよびHLA-A*24:02 Tgマウスの大腿直筋への筋肉内投与(i.m.)、あるいは尾根部への皮内投与(i.d.)により、day0、day28に投与し、HLA-A*24:02 TgマウスはDay35に、HLA-A*02:01 TgマウスはDay36に解剖し、ELISPOT法により抗原特異的ＩＦＮ－γの産生を評価した。
　図２８及び図２９は、LNP-Covid-19 Spike mRNA を2回投与したHLA-A*02:01 Tgマウスの脾臓細胞でのSpike抗原特異的ＩＦＮ－γ産生の結果を示す。
　LNP-Covid-19 Spike mRNAを2回投与したHLA-A*02:01 Tgマウスの脾臓細胞には、PepTi S、POOL1、LNP-Covid-19 Spike mRNAを加えたBMDCに対して、i.m.とi.d.の両方でＩＦＮ－γを産生するT細胞が誘導されていた。陰性対照であるLNP-eGFP mRNAを同様に2回投与したHLA-A*02:01 Tgマウスでは、PepTi S、POOL1、LNP-Covid-19 Spike mRNAを加えたBMDCに対するＩＦＮ－γの産生はわずかにしか認められなかったことから、上記ＩＦＮ－γの産生はLNP-Covid-19 Spike mRNAの投与によって特異的に誘導されたことがわかる。
　図３０は、LNP-Covid-19 Spike mRNA を2回投与したHLA-A*02:01 Tgマウスの鼠径リンパ節細胞でのSpike抗原特異的ＩＦＮ－γ産生の結果を示す。
　LNP-Covid-19 Spike mRNAを2回投与したHLA-A*02:01 Tgマウスの鼠径リンパ節細胞には、PepTi S、LNP-Covid-19 Spike mRNAを加えたBMDCに対して、i.m.とi.d.の両方でＩＦＮ－γを産生するT細胞が誘導されていた。特に、i.d.において高い誘導が認められた。陰性対照であるLNP-eGFP mRNAを同様に3回投与したHLA-A*02:01 Tgマウスでは、PepTi S、LNP-Covid-19 Spike mRNAを加えたBMDCに対するＩＦＮ－γの産生はほとんど認められなかったことから、上記ＩＦＮ－γの産生はLNP-Covid-19 Spike mRNAの投与によって特異的に誘導されたことがわかる。
　図３１及び図３２は、LNP-Covid-19 Spike mRNA を2回投与したHLA-A*24:02 Tgマウスの脾臓細胞でのSpike抗原特異的ＩＦＮ－γ産生の結果を示す。
　LNP-Covid-19 Spike mRNAを2回投与したHLA-A*24:02 Tgマウスの脾臓細胞には、PepTi S、POOL1、LNP-Covid-19 Spike mRNAを加えたBMDCに対して、i.m.とi.d.の両方でＩＦＮ－γを産生するT細胞が強く誘導されていた。陰性対照であるLNP-eGFP mRNAを同様に2回投与したHLA-A*02:01 Tgマウスでは、PepTi S、POOL1、LNP-Covid-19 Spike mRNAを加えたBMDCに対するＩＦＮ－γの産生はわずかにしか認められなかったことから、上記ＩＦＮ－γの産生はLNP-Covid-19 Spike mRNAの投与によって特異的に誘導されたことがわかる。
　図３３は、LNP-Covid-19 Spike mRNA を2回投与したHLA-A*24:02 Tgマウスの鼠径リンパ節細胞でのSpike抗原特異的ＩＦＮ－γ産生の結果を示す。
　LNP-Covid-19 Spike mRNAを2回投与したHLA-A*24:02 Tgマウスの鼠径リンパ節細胞には、PepTi S、LNP-Covid-19 Spike mRNAを加えたBMDCに対して、i.m.とi.d.の両方でＩＦＮ－γを産生するT細胞が誘導されていた。特に、i.d.において高い誘導が認められた。陰性対照であるLNP-eGFP mRNAを同様に3回投与したHLA-A*24:02 Tgマウスでは、PepTi S、LNP-Covid-19 Spike mRNAを加えたBMDCに対するＩＦＮ－γの産生はほとんど認められなかったことから、上記ＩＦＮ－γの産生はLNP-Covid-19 Spike mRNAの投与によって特異的に誘導されたことがわかる。
　図３４は、Spikeタンパク質に対する抗体測定の結果を示す。
＜方法＞
　MaxiSorp plate (ThrmoFisher)にCovid-19 Spikeリコンビナントタンパク質(Sino Biological, 40589-V08B1)を100ng/50μL PBSでコートした。0.05%Tween20を含むPBS(PBS-T)で1回の洗浄後、3% non-fat milkでの室温で1時間ブロッキングした。1% non-fat milkを含むPBSで希釈した血清を加え、37℃で1時間インキュベートした。PBS-Tで3回洗浄し、1% non-fat milkを含むPBS-T中でhorseradish peroxidase(HRP)標識goat anti-mouse IgG (SouthernNiotech, 6000倍希釈)と室温で1時間インキュベートした。PBS-Tで3回洗浄後、3,3’,5,5’-tetramethylbenzine substrate solution(Pierce)を加えて発色させ、1.3N H2SO4で反応を止め450nmの吸光度を測定した。
＜結果＞
　陰性対照であるLNP-eGFP mRNAの投与では抗体は誘導されないが、LNP-Covid-19 Spike mRNAの2μgあるいは10μgのいずれにおいても、またi.m.とi.d.のいずれにおいても、3回投与、2回投与のいずれにおいてもCovid-19 Spikeタンパク質に対するIgG抗体が誘導されていた。概して、2μgよりも10μgの方が、またi.m.よりもi.d.の方が誘導されるIgG抗体は高い傾向にあった。特に、10μg i.d.の2回投与において高い抗体誘導が認められた。
実施例５：共通がん抗原mRNAワクチンの開発
　LNP-hGPC3 mRNA、LNP-hROBO1 mRNA、LNP-hCLDN1 mRNA、LNP-hEphB4 mRNA、LNP-hTGFBI mRNA、LNP-hSPARC mRNA、LNP-hAFP mRNA、LNP-hHSP105α mRNA、LNP-(hCLDN1+hEPHB4) mRNAを投与し、抗原特異的ＩＦＮ－γ産生を評価した。
　hGPC3 isoform 2 (RefSeq: NP_004475)、hROBO1 isoform X5 (RefSeq: XP_006713340)、hCLDN1 (RefSeq: NP_066924)、hEphB4 (RefSeq: NP_004435)、TGFBI (RefSeq: NP_000349)、hSPARC isoform 1 (NP_003109)、hAFP isoform 1 (NP_001125)、hHSPH1 isoform 1 (NP_006635)それぞれのタンパク質全長をコードしたmRNA、hCLDN1 (RefSeq: NP_066924) タンパク質全長をコードしたmRNAとhEphB4 (RefSeq: NP_004435) タンパク質全長をコードしたmRNAの等質量混合物、 Luciferaseタンパク質全長をコードしたmRNA、eGFPタンパク質全長をコードしたmRNAをLNP(Lipid nano particle、ARCTURUS therapeutics社)に封入したmRNAワクチン(ARCTURUS therapeutics社)を、HLA-A*02:01 TgマウスおよびHLA-A*24:02 Tgマウスの大腿直筋へ筋肉内投与(i.m.)、あるいは尾根部へ皮内投与(i.d.)した。脾臓と鼠径リンパ節(LN)から細胞を調製した。BD ELISPOT Mouse ＩＦＮ－γ SetおよびBD ELISPOT AEC Substrate Set(ともにBD)を用い、推奨プロトコールに従ったELISPOT法によりT細胞からの抗原特異的ＩＦＮ－γ産生を評価した。抗mＩＦＮ－γ抗体をコートした96 well plateに、脾臓細胞は2×10^6 cells/well, LN細胞は2×10^5 cells/wellで播種し、PMA(25ng/mL)+Ionomycin(1μg/mL)、対応するHLA Tgマウスへのペプチド免疫でペプチド特異的ＩＦＮ－γ産生が見られた短鎖ペプチドのmix(各ペプチド10μg/mL)、対応するHLA Tgマウスへのペプチド免疫でペプチド特異的ＩＦＮ－γ産生が見られた長鎖ペプチドのmix (各ペプチド10μg/mL)、対応するHLA のHLA-HHD(hβ2M-linker-[HLAのα1+α2ドメイン]-[H-2Dbのα3～C末端ドメイン]のキメラタンパク質)を発現するマウスがん細胞(MC38あるいはMCA205、2×10^5 cells/well)、対応するHLA のHLA-HHDと対応するがん抗原を発現するマウスがん細胞(MC38あるいはMCA205、2×10^5 cells/well)、対応するHLA Tgマウスのナイーブマウスの骨髄からマウスGM-CSF(20ng/mL)で分化誘導し、使用前日にマウスTNF-α(20ng/mL), マウスIL-4(20ng/mL), PGE2(1μg/mL)を加えて成熟化させた骨髄由来樹上細胞(BMDC)(2x10^5 cells/well)、同様の成熟化と同時に5×10^6 cellsあたり11μgの対応するがん抗原mRNAをトランスフェクトしたBMDC(2×10^5 cells/mL)をそれぞれ加えて20時間共培養し、ＩＦＮ－γの産生を評価した。スポットはエリフォトカウンターAT-X(ミネルヴァテック)で撮影した。短鎖ペプチドのmixとして以下のペプチドを加えた。
hGPC3 HLA-A*02:01: CA02 11, CA02 13, CA02 15, A02-GPC3-10, A02-GPC3-12, A02-GPC3-14, A02-GPC3-18
hGPC3 HLA-A*24:02: A24-GPC3-06, A24-GPC3-10, A24-GPC3-11, A24-GPC3-17
hROBO1 HLA-A*02:01: CA02 91, CA02 92, CA02 95, CA02 97
hROBO1 HLA-A*24:02: CA24 95, CA24 97, CA24 98
hCLDN1 HLA-A*02:01: CLDN1-A02-2, CLDN1-A02-5, CLDN1-A02-6
hCLDN1 HLA-A*24:02: CLDN1-A24-2, CLDN1-A24-4, CLDN1-A24-5, CLDN1-A24-7
hEPHB4 HLA-A*02:01: CA02 121, CA02 122, CA02 123, CA02 126, CA02 127
hEPHB4 HLA-A*24:02: CA24 123, CA24 124, CA24 127
hTGFBI HLA-A*02:01: CA02 81, CA02 82, CA02 83, CA02 86
hTGFBI HLA-A*24:02: CA24 85
hSPARC HLA-A*02:01: CA02 52, CA02 56
hSPARC HLA-A*24:02: CA24 51, CA24 52, CA24 53
hAFP HLA-A*02:01: CA02 101, CA02 103, CA02 104
hAFP HLA-A*24:02: CA24 102, CA24 105
hHSP105α HLA-A*02:01: CA02 21, CA02 24
hHSP105α HLA-A*24:02: CA24 22, CA24 23, CA24 24, CA24 25
hHSP105α HLA-A*24:02 short peptide
CA24 22: PFSKVLTFL
CA24 23: KLCGPYEKF
CA24 24: PYPEAKIGRF
CA24 25: NYGIYKQDL
長鎖ペプチドのmixとして以下のペプチドを加えた。
hGPC3 HLA-A*02:01: CA02 11_L、CA02 15_L, A02-GPC3-14_L
hGPC3 HLA-A*24:02: A24-GPC3-06_L, A24-GPC3-11_L, A24-GPC3-17_L
hROBO1 HLA-A*02:01: CA02 95_L, CA02 97_L
hROBO1 HLA-A*24:02: CA24 97_L, CA24 98_L
hCLDN1 HLA-A*02:01: CLDN1-A02-2_L, CLDN1-A02-5_L
hCLDN1 HLA-A*24:02: CLDN1-A24-2_L, CLDN1-A24-4_L, CLDN1-A24-5_L, CLDN1-A24-7_L
hEPHB4 HLA-A*02:01: CA02 121_L, CA02 123_L
hEPHB4 HLA-A*24:02: CA24 124_L
hTGFBI HLA-A*02:01: CA02 83_L, CA02 86_L
hSPARC HLA-A*02:01: CA02 56_L
hSPARC HLA-A*24:02: CA24 51_L, CA24 53_L
hAFP HLA-A*02:01: 02 103_L
hAFP HLA-A*24:02: 24 105_L
hHSP105α HLA-A*02:01: A2-7_L
hHSP105α HLA-A*24:02: A24-1_L, A24-7_L
hHSP105α HLA-A*02:01 long peptide 
A2-7_L: VGLNCL[RLMNDMTAV]ALNYG
hHSP105α HLA-A*24:02 long peptide
A24-1_L: KNAVE[EYVYEFRDKL]CGPYE
A24-7_L: AVAL[NYGIYKQDL]PSLDEK
　図３５は、LNP-hGPC3 mRNA 3回投与の投与方法を示す。
　LNP-hGPC3 mRNAの2μgあるいは10μg、あるいはLNP-Luciferase mRNAの10μgを、HLA-A*02:01 TgマウスおよびHLA-A*24:02 Tgマウスの大腿直筋へのi.m.、あるいは尾根部へのi.d.により、day0、day7、day14に計3回投与し、HLA-A*24:02 TgマウスはDay20に、HLA-A*02:01 TgマウスはDay22に解剖し、ELISPOT法により抗原特異的ＩＦＮ－γの産生を評価した。
　図３６～図３９は、上記の結果を示す。
　図３６及び図３７に示す通り、LNP-hGPC3 mRNAを3回投与したHLA-A*02:01 Tgマウスの脾臓細胞には、HLA-A*02:01 Tgマウスへのペプチド免疫でペプチド特異的ＩＦＮ－γ産生が見られたhGPC3短鎖ペプチドのmix、HLA-A*02:01 Tgマウスへのペプチド免疫でペプチド特異的ＩＦＮ－γ産生が見られたhGPC3長鎖ペプチドのmix、HLA-A*02:01HHDとhGPC3を発現するがん細胞MC38、hGPC3 mRNAをトランスフェクトしたBMDCに対して、ＩＦＮ－γを産生するT細胞が誘導されていた。i.m.に比べてi.d.の方が産生されるＩＦＮ－γは多く、特に2μgで3回のi.d.によって強いＩＦＮ－γ誘導が認められた。HLA-A*02:01HHDとhGPC3を発現するがん細胞MC38 A02HHD hGPC3に対するＩＦＮ－γ産生は、HLA-A*02:01HHDと空ベクターを導入したがん細胞MC38 A02HHD mockに対するものと比べて有意に高かったことから、hGPC3を発現するがん細胞を特異的に認識して攻撃するT細胞が誘導されたことがわかる。陰性対照であるLNP-Luciferase mRNAを同様に3回投与したHLA-A*02:01 Tgマウスでは、いずれに対してもＩＦＮ－γの産生はわずかしか認められなかったことから、上記ＩＦＮ－γの産生はLNP-hGPC3 mRNAの投与によって特異的に誘導されたことがわかる。
　図３８及び図３９に示す通り、LNP-hGPC3 mRNAを3回投与したHLA-A*24:02 Tgマウスの脾臓細胞には、HLA-A*24:02 Tgマウスへのペプチド免疫でペプチド特異的ＩＦＮ－γ産生が見られたhGPC3短鎖ペプチドのmix、HLA-A*24:02 Tgマウスへのペプチド免疫でペプチド特異的ＩＦＮ－γ産生が見られたhGPC3長鎖ペプチドのmix、HLA-A*24:02HHDとhGPC3を発現するがん細胞MC38、hGPC3 mRNAをトランスフェクトしたBMDCに対して、ＩＦＮ－γを産生するT細胞が誘導されていた。i.m.に比べてi.d.の方が産生されるＩＦＮ－γは多い傾向があり、特に10μgで3回のi.d.によって強いＩＦＮ－γ誘導が認められた。HLA-A*24:02HHDとhGPC3を発現するがん細胞MC38 A24HHD hGPC3に対するＩＦＮ－γ産生は、HLA-A*24:02HHDと空ベクターを導入したがん細胞MC38 A24HHD mockに対するものと比べて有意に高かったことから、hGPC3を発現するがん細胞を特異的に認識して攻撃するT細胞が誘導されたことがわかる。陰性対照であるLNP-Luciferase mRNAを同様に3回投与したHLA-A*24:02 Tgマウスでは、いずれに対してもＩＦＮ－γの産生はわずかしか認められなかったことから、上記ＩＦＮ－γの産生はLNP-hGPC3 mRNAの投与によって特異的に誘導されたことがわかる。
実施例６：共通がん抗原mRNAワクチンの開発
　図４０は、LNP-hROBO1 mRNA 3回投与の投与方法を示す。
　LNP-hROBO1 mRNA、あるいはLNP-eGFP mRNAの10μgを、HLA-A*02:01 TgマウスおよびHLA-A*24:02 Tgマウスの大腿直筋への筋肉内投与(i.m.)、あるいは尾根部への皮内投与(i.d.)により、day0、day7、day14に計3回投与し、Day21に解剖し、ELISPOT法により抗原特異的ＩＦＮ－γの産生を評価した。
　図４１及び図４２は、上記の結果を示す。
　図４１に示す通り、LNP-hROBO1 mRNAを3回投与したHLA-A*02:01 Tgマウスの脾臓細胞には、HLA-A*02:01 Tgマウスへのペプチド免疫でペプチド特異的ＩＦＮ－γ産生が見られたhROBO1短鎖ペプチドのmix、HLA-A*02:01 Tgマウスへのペプチド免疫でペプチド特異的ＩＦＮ－γ産生が見られたhROBO1長鎖ペプチドのmix、HLA-A*02:01HHDとhROBO1を発現するがん細胞MC38、hROBO1 mRNAをトランスフェクトしたBMDCに対して、ＩＦＮ－γを産生するT細胞が誘導されていた。i.m.、i.d.ともにHLA-A*02:01HHDとhROBO1を発現するがん細胞MC38 A02HHD hROBO1に対するＩＦＮ－γ産生は、HLA-A*02:01HHDと空ベクターを導入したがん細胞MC38 A02HHD mockに対するものと比べて有意に高かったことから、hROBO1を発現するがん細胞を特異的に認識して攻撃するT細胞が誘導されたことがわかる。陰性対照であるLNP-eGFP mRNAを同様に3回投与したHLA-A*02:01 Tgマウスでは、いずれに対してもＩＦＮ－γの産生はわずかしか認められなかったことから、上記ＩＦＮ－γの産生はLNP-hROBO1 mRNAの投与によって特異的に誘導されたことがわかる。
　図４２に示す通り、LNP-hROBO1 mRNAを3回投与したHLA-A*24:02 Tgマウスの脾臓細胞には、HLA-A*24:02 Tgマウスへのペプチド免疫でペプチド特異的ＩＦＮ－γ産生が見られたhROBO1短鎖ペプチドのmix、HLA-A*24:02 Tgマウスへのペプチド免疫でペプチド特異的ＩＦＮ－γ産生が見られたhROBO1長鎖ペプチドのmix、HLA-A*24:02HHDとhROBO1を発現するがん細胞MC38、hROBO1 mRNAをトランスフェクトしたBMDCに対して、ＩＦＮ－γを産生するT細胞が誘導されていた。i.m.、i.d.ともにHLA-A*24:02HHDとhROBO1を発現するがん細胞MC38 A24HHD hROBO1に対するＩＦＮ－γ産生は、HLA-A2402HHDと空ベクターを導入したがん細胞MC38 A24HHD mockに対するものと比べて有意に高かったことから、hROBO1を発現するがん細胞を特異的に認識して攻撃するT細胞が誘導されたことがわかる。陰性対照であるLNP-eGFP mRNAを同様に3回投与したHLA-A2402 Tgマウスでは、いずれに対してもＩＦＮ－γの産生はわずかしか認められなかったことから、上記ＩＦＮ－γの産生はLNP-hROBO1 mRNAの投与によって特異的に誘導されたことがわかる。
実施例７：共通がん抗原mRNAワクチンの開発
　図４３は、LNP-hCLDN1 mRNA およびLNP-hEPHB4 mRNA 3回投与の投与方法を示す。
　LNP-hCLDN1 mRNA、LNP-hEPHB4 mRNA、あるいはLNP-eGFP mRNAの10μgを、HLA-A*02:01 TgマウスおよびHLA-A*24:02 Tgマウスの尾根部への皮内投与(i.d.)により、day0、day7、day14に計3回投与し、Day21に解剖し、ELISPOT法により抗原特異的ＩＦＮ－γの産生を評価した。
　図４４および図４５は、上記の結果を示す。
　図４４に示す通り、LNP-hCLDN1 mRNAあるいはLNP-hEPHB4 mRNAを3回投与したHLA-A*02:01 Tgマウスの脾臓細胞には、HLA-A*02:01 Tgマウスへのペプチド免疫でペプチド特異的ＩＦＮ－γ産生が見られたhCLDN1あるいはhEPHB4の短鎖ペプチドのmix、HLA-A*02:01 Tgマウスへのペプチド免疫でペプチド特異的ＩＦＮ－γ産生が見られたhCLDN1あるいはhEPHB4の長鎖ペプチドのmix、HLA-A*02:01HHDとhCLDN1を発現するがん細胞MC38あるいはHLA-A*02:01HHDとhEPHB4を発現するがん細胞MCA205、hCLDN1 mRNAあるいはhEPHB4 mRNAをトランスフェクトしたBMDCに対して、ＩＦＮ－γを産生するT細胞が誘導されていた。HLA-A*02:01HHDとhCLDN1を発現するがん細胞MC38 A02HHD hCLDN1あるいはHLA-A*02:01HHDとhEPHB4を発現するがん細胞MCA205 A02HHD hEPHB4に対するＩＦＮ－γ産生は、HLA-A*02:01HHDと空ベクターを導入したがん細胞MC38 A02HHD mockあるいはMCA205 A02HHD mockに対するものと比べて有意に高かったことから、hCLDN1あるいはhEPHB4を発現するがん細胞を特異的に認識して攻撃するT細胞が誘導されたことがわかる。陰性対照であるLNP-eGFP mRNAを同様に3回投与したHLA-A*02:01 Tgマウスでは、いずれに対してもＩＦＮ－γの産生はわずかしか認められなかったことから、上記ＩＦＮ－γの産生はLNP-hCLDN1 mRNAあるいはLNP-hEPHB4 mRNAの投与によって特異的に誘導されたことがわかる。
　図４５に示す通り、LNP-hCLDN1 mRNAあるいはLNP-hEPHB4 mRNAを3回投与したHLA-A*24:02 Tgマウスの脾臓細胞には、HLA-A*24:02 Tgマウスへのペプチド免疫でペプチド特異的ＩＦＮ－γ産生が見られたhCLDN1あるいはhEPHB4の短鎖ペプチドのmix、HLA-A*24:02 Tgマウスへのペプチド免疫でペプチド特異的ＩＦＮ－γ産生が見られたhCLDN1あるいはhEPHB4の長鎖ペプチドのmix、HLA-A*24:02HHDとhCLDN1を発現するがん細胞MC38あるいはHLA-A*24:02HHDとhEPHB4を発現するがん細胞MCA205、hCLDN1 mRNAあるいはhEPHB4 mRNAをトランスフェクトしたBMDCに対して、ＩＦＮ－γを産生するT細胞が誘導されていた。HLA-A*24:02HHDとhCLDN1を発現するがん細胞MC38 A24HHD hCLDN1あるいはHLA-A*24:02HHDとhEPHB4を発現するがん細胞MCA205 A24HHD hEPHB4に対するＩＦＮ－γ産生は、HLA-A*24:02HHDと空ベクターを導入したがん細胞MC38 A24HHD mockあるいはMCA205 A24HHD mockに対するものと比べて高かったことから、hCLDN1あるいはhEPHB4を発現するがん細胞を特異的に認識して攻撃するT細胞が誘導されたことがわかる。MC38 A24HHD mockあるいはMCA205 A24HHD mockに対するＩＦＮ－γ産生は、マウスのCLDN1あるいはEPHB4由来のペプチドがHLA-A*24:02HHDに提示されたためと考えられる。陰性対照であるLNP-eGFP mRNAを同様に3回投与したHLA-A*24:02 Tgマウスでは、いずれに対してもＩＦＮ－γの産生はわずかしか認められなかったことから、上記ＩＦＮ－γの産生はLNP-hCLDN1 mRNAあるいはLNP-hEPHB4 mRNAの投与によって特異的に誘導されたことがわかる。
実施例８：共通がん抗原mRNAワクチンの開発
　図４６は、LNP-hTGFBI mRNA およびLNP-hSPARC mRNA 3回投与の投与方法を示す。
　LNP-hTGFBI mRNA、LNP-hSPARC mRNA、あるいはLNP-eGFP mRNAの10μgを、HLA-A*02:01 TgマウスおよびHLA-A*24:02 Tgマウスの尾根部への皮内投与(i.d.)により、day0、day7、day14に計3回投与し、Day21に解剖し、ELISPOT法により抗原特異的ＩＦＮ－γの産生を評価した。
　図４７および図４８は、上記の結果を示す。
　図４７に示す通り、LNP-hTGFBI mRNAあるいはLNP-hSPARC mRNAを3回投与したHLA-A*02:01 Tgマウスの脾臓細胞には、HLA-A*02:01 Tgマウスへのペプチド免疫でペプチド特異的ＩＦＮ－γ産生が見られたhTGFBIあるいはhSPARCの短鎖ペプチドのmix、HLA-A*02:01 Tgマウスへのペプチド免疫でペプチド特異的ＩＦＮ－γ産生が見られたhTGFBIあるいはhSPARCの長鎖ペプチドのmix、HLA-A*02:01HHDとhTGFBIを発現するがん細胞MCA205あるいはHLA-A*02:01HHDとhSPARCを発現するがん細胞MCA205、hTGFBI mRNAあるいはhSPARC mRNAをトランスフェクトしたBMDCに対して、ＩＦＮ－γを産生するT細胞が誘導されていた。HLA-A*02:01HHDとhTGFBIを発現するがん細胞MCA205 A02HHD hTGFBIあるいはHLA-A*02:01HHDとhSPARCを発現するがん細胞MCA205 A02HHD hSPARCに対するＩＦＮ－γ産生は、HLA-A*02:01HHDと空ベクターを導入したがん細胞MCA205 A02HHD mockに対するものと比べて有意に高かったことから、hTGFBIあるいはhSPARCを発現するがん細胞を特異的に認識して攻撃するT細胞が誘導されたことがわかる。陰性対照であるLNP-eGFP mRNAを同様に3回投与したHLA-A*02:01 Tgマウスでは、いずれに対してもＩＦＮ－γの産生は少なかったことから、上記ＩＦＮ－γの産生はLNP-hTGFBI mRNAあるいはLNP-hSPARC mRNAの投与によって特異的に誘導されたことがわかる。
　図４８に示す通り、LNP-hTGFBI mRNAあるいはLNP-hSPARC mRNAを3回投与したHLA-A*24:02 Tgマウスの脾臓細胞には、HLA-A*24:02 Tgマウスへのペプチド免疫でペプチド特異的ＩＦＮ－γ産生が見られたhTGFBIあるいはhSPARCの短鎖ペプチドのmix、HLA-A*24:02 Tgマウスへのペプチド免疫でペプチド特異的ＩＦＮ－γ産生が見られたhTGFBIあるいはhSPARCの長鎖ペプチドのmix、HLA-A*24:02HHDとhTGFBIを発現するがん細胞MCA205あるいはHLA-A*24:02HHDとhSPARCを発現するがん細胞MCA205、hTGFBI mRNAあるいはhSPARC mRNAをトランスフェクトしたBMDCに対して、ＩＦＮ－γを産生するT細胞が誘導されていた。HLA-A*02:01HHDとhTGFBIを発現するがん細胞MCA205 A02HHD hTGFBIは、HLA-A*02:01HHDと空ベクターを導入したがん細胞MCA205 A02HHD mockに対するものと比べて有意に高かったことから、hTGFBIを発現するがん細胞を特異的に認識して攻撃するT細胞が誘導されたことがわかる。LNP-hSPARC mRNA投与マウスでのMCA205 A24HHD mockに対するＩＦＮ－γ産生は、マウスのSPARC由来のペプチドがHLA-A*24:02HHDに提示されたためと考えられる。陰性対照であるLNP-eGFP mRNAを同様に3回投与したHLA-A*02:01 Tgマウスでは、いずれに対してもＩＦＮ－γの産生は少なかったことから、上記ＩＦＮ－γの産生はLNP-hTGFBI mRNAあるいはLNP-hSPARC mRNAの投与によって特異的に誘導されたことがわかる。
実施例９：共通がん抗原mRNAワクチンの開発
　図４９は、LNP-hAFP mRNA およびLNP-hHSP105α mRNA 3回投与の投与方法を示す。
　LNP-hAFP mRNA、LNP-hHSP105α mRNA、あるいはLNP-eGFP mRNAの10μgを、HLA-A*02:01 TgマウスおよびHLA-A*24:02 Tgマウスの尾根部への皮内投与(i.d.)により、day0、day7、day14に計3回投与し、Day21に解剖し、ELISPOT法により抗原特異的ＩＦＮ－γの産生を評価した。
　図５０および図５１は、上記の結果を示す。
　図５０に示す通り、LNP-hAFP mRNAあるいはLNP-hHSP105α mRNAを3回投与したHLA-A*02:01 Tgマウスの脾臓細胞には、HLA-A*02:01HHDとhAFPを発現するがん細胞MC38あるいはHLA-A*02:01HHDとhHSP105αを発現するがん細胞MC38、hAFP mRNAあるいはhHSP105α mRNAをトランスフェクトしたBMDCに対して、ＩＦＮ－γを産生するT細胞が誘導されていた。HLA-A*02:01HHDとhAFPを発現するがん細胞MC38 A02HHD hAFPあるいはHLA-A*02:01HHDとhHSP105αを発現するがん細胞MC38 A02HHD hHSP105αに対するＩＦＮ－γ産生は、HLA-A*02:01HHDと空ベクターを導入したがん細胞MC38 A02HHD mockに対するものと比べて有意に高かったことから、hAFPあるいはhHSP105αを発現するがん細胞を特異的に認識して攻撃するT細胞が誘導されたことがわかる。陰性対照であるLNP-eGFP mRNAを同様に3回投与したHLA-A*02:01 Tgマウスでは、１個体でMC38に対するＩＦＮ－γの産生が高かったが、抗原mRNAをトランスフェクトしたBMDC対してのＩＦＮ－γの産生は少なく、抗原mRNAをトランスフェクトしたBMDC対してのＩＦＮ－γの産生はLNP-hAFP mRNAあるいはLNP-hHSP105α mRNAの投与によって特異的に誘導されたと考えられる。
　図５１に示す通り、LNP-hAFP mRNAあるいはLNP-hHSP105α mRNAを3回投与したHLA-A*24:02 Tgマウスの脾臓細胞には、HLA-A*24:02HHDとhAFPを発現するがん細胞MC38あるいはHLA-A*24:02HHDとhHSP105αを発現するがん細胞MC38、hAFP mRNAあるいはhHSP105α mRNAをトランスフェクトしたBMDCに対して、ＩＦＮ－γを産生するT細胞が誘導されていた。HLA-A*24:02HHDとhAFPを発現するがん細胞MC38 A24HHD hAFPに対するＩＦＮ－γ産生は、HLA-A*24:02HHDと空ベクターを導入したがん細胞MC38 A24HHD mockに対するものと比べて有意に高かったことから、hAFPを発現するがん細胞を特異的に認識して攻撃するT細胞が誘導されたことがわかる。HLA-A*24:02HHDとhHSP105αを発現するがん細胞MC38 A24HHD hHSP105αに対するＩＦＮ－γ産生と同程度にMC38 A24HHD mockに対するＩＦＮ－γ産生が認められたのは、マウスのHSP105α由来のペプチドがHLA-A*24:02HHDに提示されたためと考えられる。陰性対照であるLNP-eGFP mRNAを同様に3回投与したHLA-A*24:02 Tgマウスでは、いずれに対してもＩＦＮ－γの産生は少なかったことから、上記ＩＦＮ－γの産生はLNP-hAFP mRNAあるいはLNP-hHSP105α mRNAの投与によって特異的に誘導されたことがわかる。
実施例１０：共通がん抗原mRNAワクチンの開発
　図５２は、LNP-(hCLDN1+hEPHB4) mRNA 3回投与の投与方法を示す。
　LNP-(hCLDN1+hEPHB4) mRNAの10μgあるいは20μg、あるいはLNP-Luciferase mRNAの20μgを、HLA-A*02:01 TgマウスおよびHLA-A*24:02 Tgマウスの尾根部への皮内投与(i.d.)により、day0、day7、day14に計3回投与し、Day21に解剖し、ELISPOT法により抗原特異的ＩＦＮ－γの産生を評価した。
　図５３から図５６は、上記の結果を示す。
　図５３および図５４に示す通り、LNP-(hCLDN1+hEPHB4) mRNAを3回投与したHLA-A*02:01 Tgマウスの脾臓細胞および鼠径リンパ節には、HLA-A*02:01HHDとhCLDN1を発現するがん細胞MCA205あるいはHLA-A*02:01HHDとhEPHB4を発現するがん細胞MCA205、hCLDN1 mRNAあるいはhEPHB4 mRNAをトランスフェクトしたBMDCに対して、ＩＦＮ－γを産生するT細胞が誘導されていた。HLA-A*02:01HHDとhEPHB4を発現するがん細胞MCA205 A02HHD hEPHB4に対するＩＦＮ－γ産生は、HLA-A*02:01HHDと空ベクターを導入したがん細胞MCA205 A02HHD mockに対するものと比べて有意に高かったことから、hEPHB4を発現するがん細胞を特異的に認識して攻撃するT細胞が誘導されたことがわかる。HLA-A*02:01HHDとhCLDN1を発現するがん細胞MCA205 A02HHD hCLDN1に対するＩＦＮ－γ産生と同程度にMCA205 A02HHD mockに対するＩＦＮ－γ産生が認められたのは、マウスのCLDN1あるいはEPHB4由来のペプチドがHLA-A*02:01HHDに提示されたためと考えられる。陰性対照であるLNP-Luciferase mRNAを同様に3回投与したHLA-A*02:01 Tgマウスでは、いずれに対してもＩＦＮ－γの産生は比較的低かったことから、上記ＩＦＮ－γの産生はLNP-(hCLDN1+hEPHB4) mRNAの投与によって特異的に誘導されたことがわかる。
　図５５および図５６に示す通り、LNP-(hCLDN1+hEPHB4) mRNAを3回投与したHLA-A*24:02 Tgマウスの脾臓細胞および鼠径リンパ節には、HLA-A*24:02HHDとhCLDN1を発現するがん細胞MCA205あるいはHLA-A*24:02HHDとhEPHB4を発現するがん細胞MCA205、hCLDN1 mRNAあるいはhEPHB4 mRNAをトランスフェクトしたBMDCに対して、ＩＦＮ－γを産生するT細胞が誘導されていた。HLA-A*24:02HHDとhEPHB4を発現するがん細胞MCA205 A24HHD hEPHB4に対するＩＦＮ－γ産生は、HLA-A*24:02HHDと空ベクターを導入したがん細胞MCA205 A24HHD mockに対するものと比べて有意に高かったことから、hEPHB4を発現するがん細胞を特異的に認識して攻撃するT細胞が誘導されたことがわかる。HLA-A*24:02HHDとhCLDN1を発現するがん細胞MCA205 A24HHD hCLDN1に対するＩＦＮ－γ産生と同程度にMCA205 A02HHD mockに対するＩＦＮ－γ産生が認められたのは、マウスのCLDN1あるいはEPHB4由来のペプチドがHLA-A*24:02HHDに提示されたためと考えられる。陰性対照であるLNP-Luciferase mRNAを同様に3回投与したHLA-A*02:01 Tgマウスでは、いずれに対してもＩＦＮ－γの産生は比較的低かったことから、上記ＩＦＮ－γの産生はLNP-(hCLDN1+hEPHB4) mRNAの投与によって特異的に誘導されたことがわかる。
＜mRNA用アミノ酸配列＞
>hGPC3_isoform_2_ NP_004475（配列番号８１）
MAGTVRTACLVVAMLLSLDFPGQAQPPPPPPDATCHQVRSFFQRLQPGLKWVPETPVPGSDLQVCLPKGP
TCCSRKMEEKYQLTARLNMEQLLQSASMELKFLIIQNAAVFQEAFEIVVRHAKNYTNAMFKNNYPSLTPQ
AFEFVGEFFTDVSLYILGSDINVDDMVNELFDSLFPVIYTQLMNPGLPDSALDINECLRGARRDLKVFGN
FPKLIMTQVSKSLQVTRIFLQALNLGIEVINTTDHLKFSKDCGRMLTRMWYCSYCQGLMMVKPCGGYCNV
VMQGCMAGVVEIDKYWREYILSLEELVNGMYRIYDMENVLLGLFSTIHDSIQYVQKNAGKLTTTIGKLCA
HSQQRQYRSAYYPEDLFIDKKVLKVAHVEHEETLSSRRRELIQKLKSFISFYSALPGYICSHSPVAENDT
LCWNGQELVERYSQKAARNGMKNQFNLHELKMKGPEPVVSQIIDKLKHINQLLRTMSMPKGRVLDKNLDE
EGFESGDCGDDEDECIGGSGDGMIKVKNQLRFLAELAYDLDVDDAPGNSQQATPKDNEISTFHNLGNVHS
PLKLLTSMAISVVCFFFLVH
>hROBO1_isoform_X5_ XP_006713340(hROBO1の細胞質内型) （配列番号８２）
MIAEPAHFYLFGLICLCSGSRLRQEDFPPRIVEHPSDLIVSKGEPATLNCKAEGRPTPTIEWYKGGERVE
TDKDDPRSHRMLLPSGSLFFLRIVHGRKSRPDEGVYVCVARNYLGEAVSHNASLEVAILRDDFRQNPSDV
MVAVGEPAVMECQPPRGHPEPTISWKKDGSPLDDKDERITIRGGKLMITYTRKSDAGKYVCVGTNMVGER
ESEVAELTVLERPSFVKRPSNLAVTVDDSAEFKCEARGDPVPTVRWRKDDGELPKSRYEIRDDHTLKIRK
VTAGDMGSYTCVAENMVGKAEASATLTVQVGSEPPHFVVKPRDQVVALGRTVTFQCEATGNPQPAIFWRR
EGSQNLLFSYQPPQSSSRFSVSQTGDLTITNVQRSDVGYYICQTLNVAGSIITKAYLEVTDVIADRPPPV
IRQGPVNQTVAVDGTFVLSCVATGSPVPTILWRKDGVLVSTQDSRIKQLENGVLQIRYAKLGDTGRYTCI
ASTPSGEATWSAYIEVQEFGVPVQPPRPTDPNLIPSAPSKPEVTDVSRNTVTLSWQPNLNSGATPTSYII
EAFSHASGSSWQTVAENVKTETSAIKGLKPNAIYLFLVRAANAYGISDPSQISDPVKTQDVLPTSQGVDH
KQVQRELGNAVLHLHNPTVLSSSSIEVHWTVDQQSQYIQGYKILYRPSGANHGESDWLVFEVRTPAKNSV
VIPDLRKGVNYEIKARPFFNEFQGADSEIKFAKTLEEAPSAPPQGVTVSKNDGNGTAILVSWQPPPEDTQ
NGMVQEYKVWCLGNETRYHINKTVDGSTFSVVIPFLVPGIRYSVEVAASTGAGSGVKSEPQFIQLDAHGN
PVSPEDQVSLAQQISDVVKQPAFIAGIGAACWIILMVFSIWLYRHRKKRNGLTSTYAGIRKVPSFTFTPT
VTYQRGGEAVSSGGRPGLLNISEPAAQPWLADTWPNTGNNHNDCSISCCTAGNGNSDSNLTTYSRPADCI
ANYNNQLDNKQTNLMLPESTVYGDVDLSNKINEMKTFNSPNLKDGRFVNPSGQPTPYATTQLIQSNLSNN
MNNGSGDSGEKHWKPLGQQKQEVAPVQYNIVEQNKLNKDYRANDTVPPTIPYNQSYDQNTGGSYNSSDRG
SSTSGSQGHKKGARTPKVPKQGGMNWADLLPPPPAHPPPHSNSEEYNISVDESYDQEMPCPVPPARMYLQ
QDELEEEEDERGPTPPVRGAASSPAAVSYSHQSTATLTPSPQEELQPMLQDCPEETGHMQHQPDRRRQPV
SPPPPPRPISPPHTYGYISGPLVSDMDTDAPEEEEDEADMEVAKMQTRRLLLRGLEQTPASSVGDLESSV
TGSMINGWGSASEEDNISSGRSSVSSSDGSFFTDADFAQAVAAAAEYAGLKVARRQMQDAAGRRHFHASQ
CPRPTSPVSTDSNMSAAVMQKTRPAKKLKHQPGHLRRETYTDDLPPPPVPPPAIKSPTAQSKTQLEVRPV
VVPKLPSMDARTDRSSDRKGSSYKGREVLDGRQVVDMRTNPGDPREAQEQQNDGKGRGNKAAKRDLPPAK
THLIQEDILPYCRPTFPTSNNPRDPSSSSSMSSRGSGSRQREQANVGRRNIAEMQVLGGYERGEDNNEEL
EETES
>hROBO1_isoform_a_ NP_002932(hROBO1の膜局在型) （配列番号８３）
MKWKHVPFLVMISLLSLSPNHLFLAQLIPDPEDVERGNDHGTPIPTSDNDDNSLGYTGSRLRQEDFPPRI
VEHPSDLIVSKGEPATLNCKAEGRPTPTIEWYKGGERVETDKDDPRSHRMLLPSGSLFFLRIVHGRKSRP
DEGVYVCVARNYLGEAVSHNASLEVAILRDDFRQNPSDVMVAVGEPAVMECQPPRGHPEPTISWKKDGSP
LDDKDERITIRGGKLMITYTRKSDAGKYVCVGTNMVGERESEVAELTVLERPSFVKRPSNLAVTVDDSAE
FKCEARGDPVPTVRWRKDDGELPKSRYEIRDDHTLKIRKVTAGDMGSYTCVAENMVGKAEASATLTVQEP
PHFVVKPRDQVVALGRTVTFQCEATGNPQPAIFWRREGSQNLLFSYQPPQSSSRFSVSQTGDLTITNVQR
SDVGYYICQTLNVAGSIITKAYLEVTDVIADRPPPVIRQGPVNQTVAVDGTFVLSCVATGSPVPTILWRK
DGVLVSTQDSRIKQLENGVLQIRYAKLGDTGRYTCIASTPSGEATWSAYIEVQEFGVPVQPPRPTDPNLI
PSAPSKPEVTDVSRNTVTLSWQPNLNSGATPTSYIIEAFSHASGSSWQTVAENVKTETSAIKGLKPNAIY
LFLVRAANAYGISDPSQISDPVKTQDVLPTSQGVDHKQVQRELGNAVLHLHNPTVLSSSSIEVHWTVDQQ
SQYIQGYKILYRPSGANHGESDWLVFEVRTPAKNSVVIPDLRKGVNYEIKARPFFNEFQGADSEIKFAKT
LEEAPSAPPQGVTVSKNDGNGTAILVSWQPPPEDTQNGMVQEYKVWCLGNETRYHINKTVDGSTFSVVIP
FLVPGIRYSVEVAASTGAGSGVKSEPQFIQLDAHGNPVSPEDQVSLAQQISDVVKQPAFIAGIGAACWII
LMVFSIWLYRHRKKRNGLTSTYAGIRKVPSFTFTPTVTYQRGGEAVSSGGRPGLLNISEPAAQPWLADTW
PNTGNNHNDCSISCCTAGNGNSDSNLTTYSRPADCIANYNNQLDNKQTNLMLPESTVYGDVDLSNKINEM
KTFNSPNLKDGRFVNPSGQPTPYATTQLIQSNLSNNMNNGSGDSGEKHWKPLGQQKQEVAPVQYNIVEQN
KLNKDYRANDTVPPTIPYNQSYDQNTGGSYNSSDRGSSTSGSQGHKKGARTPKVPKQGGMNWADLLPPPP
AHPPPHSNSEEYNISVDESYDQEMPCPVPPARMYLQQDELEEEEDERGPTPPVRGAASSPAAVSYSHQST
ATLTPSPQEELQPMLQDCPEETGHMQHQPDRRRQPVSPPPPPRPISPPHTYGYISGPLVSDMDTDAPEEE
EDEADMEVAKMQTRRLLLRGLEQTPASSVGDLESSVTGSMINGWGSASEEDNISSGRSSVSSSDGSFFTD
ADFAQAVAAAAEYAGLKVARRQMQDAAGRRHFHASQCPRPTSPVSTDSNMSAAVMQKTRPAKKLKHQPGH
LRRETYTDDLPPPPVPPPAIKSPTAQSKTQLEVRPVVVPKLPSMDARTDRSSDRKGSSYKGREVLDGRQV
VDMRTNPGDPREAQEQQNDGKGRGNKAAKRDLPPAKTHLIQEDILPYCRPTFPTSNNPRDPSSSSSMSSR
GSGSRQREQANVGRRNIAEMQVLGGYERGEDNNEELEETES
>hEPHB4_ NP_004435（配列番号８４）
MELRVLLCWASLAAALEETLLNTKLETADLKWVTFPQVDGQWEELSGLDEEQHSVRTYEVCDVQRAPGQA
HWLRTGWVPRRGAVHVYATLRFTMLECLSLPRAGRSCKETFTVFYYESDADTATALTPAWMENPYIKVDT
VAAEHLTRKRPGAEATGKVNVKTLRLGPLSKAGFYLAFQDQGACMALLSLHLFYKKCAQLTVNLTRFPET
VPRELVVPVAGSCVVDAVPAPGPSPSLYCREDGQWAEQPVTGCSCAPGFEAAEGNTKCRACAQGTFKPLS
GEGSCQPCPANSHSNTIGSAVCQCRVGYFRARTDPRGAPCTTPPSAPRSVVSRLNGSSLHLEWSAPLESG
GREDLTYALRCRECRPGGSCAPCGGDLTFDPGPRDLVEPWVVVRGLRPDFTYTFEVTALNGVSSLATGPV
PFEPVNVTTDREVPPAVSDIRVTRSSPSSLSLAWAVPRAPSGAVLDYEVKYHEKGAEGPSSVRFLKTSEN
RAELRGLKRGASYLVQVRARSEAGYGPFGQEHHSQTQLDESEGWREQLALIAGTAVVGVVLVLVVIVVAV
LCLRKQSNGREAEYSDKHGQYLIGHGTKVYIDPFTYEDPNEAVREFAKEIDVSYVKIEEVIGAGEFGEVC
RGRLKAPGKKESCVAIKTLKGGYTERQRREFLSEASIMGQFEHPNIIRLEGVVTNSMPVMILTEFMENGA
LDSFLRLNDGQFTVIQLVGMLRGIASGMRYLAEMSYVHRDLAARNILVNSNLVCKVSDFGLSRFLEENSS
DPTYTSSLGGKIPIRWTAPEAIAFRKFTSASDAWSYGIVMWEVMSFGERPYWDMSNQDVINAIEQDYRLP
PPPDCPTSLHQLMLDCWQKDRNARPRFPQVVSALDKMIRNPASLKIVARENGGASHPLLDQRQPHYSAFG
SVGEWLRAIKMGRYEESFAAAGFGSFELVSQISAEDLLRIGVTLAGHQKKILASVQHMKSQAKPGTPGGT
GGPAPQY
>hCLDN1_NP_066924（配列番号８５）
MANAGLQLLGFILAFLGWIGAIVSTALPQWRIYSYAGDNIVTAQAMYEGLWMSCVSQSTGQIQCKVFDSL
LNLSSTLQATRALMVVGILLGVIAIFVATVGMKCMKCLEDDEVQKMRMAVIGGAIFLLAGLAILVATAWY
GNRIVQEFYDPMTPVNARYEFGQALFTGWAAASLCLLGGALLCCSCPRKTTSYPTPRPYPKPAPSSGKDY
V
>hSLC7A5_NP_003477（配列番号８６）
MAGAGPKRRALAAPAAEEKEEAREKMLAAKSADGSAPAGEGEGVTLQRNITLLNGVAIIVGTIIGSGIFV
TPTGVLKEAGSPGLALVVWAACGVFSIVGALCYAELGTTISKSGGDYAYMLEVYGSLPAFLKLWIELLII
RPSSQYIVALVFATYLLKPLFPTCPVPEEAAKLVACLCVLLLTAVNCYSVKAATRVQDAFAAAKLLALAL
IILLGFVQIGKGDVSNLDPNFSFEGTKLDVGNIVLALYSGLFAYGGWNYLNFVTEEMINPYRNLPLAIII
SLPIVTLVYVLTNLAYFTTLSTEQMLSSEAVAVDFGNYHLGVMSWIIPVFVGLSCFGSVNGSLFTSSRLF
FVGSREGHLPSILSMIHPQLLTPVPSLVFTCVMTLLYAFSKDIFSVINFFSFFNWLCVALAIIGMIWLRH
RKPELERPIKVNLALPVFFILACLFLIAVSFWKTPVECGIGFTIILSGLPVYFFGVWWKNKPKWLLQGIF
STTVLCQKLMQVVPQET
>hAFP_isoform_1_NP_001125（配列番号８７）
MKWVESIFLIFLLNFTESRTLHRNEYGIASILDSYQCTAEISLADLATIFFAQFVQEATYKEVSKMVKDA
LTAIEKPTGDEQSSGCLENQLPAFLEELCHEKEILEKYGHSDCCSQSEEGRHNCFLAHKKPTPASIPLFQ
VPEPVTSCEAYEEDRETFMNKFIYEIARRHPFLYAPTILLWAARYDKIIPSCCKAENAVECFQTKAATVT
KELRESSLLNQHACAVMKNFGTRTFQAITVTKLSQKFTKVNFTEIQKLVLDVAHVHEHCCRGDVLDCLQD
GEKIMSYICSQQDTLSNKITECCKLTTLERGQCIIHAENDEKPEGLSPNLNRFLGDRDFNQFSSGEKNIF
LASFVHEYSRRHPQLAVSVILRVAKGYQELLEKCFQTENPLECQDKGEEELQKYIQESQALAKRSCGLFQ
KLGEYYLQNAFLVAYTKKAPQLTSSELMAITRKMAATAATCCQLSEDKLLACGEGAADIIIGHLCIRHEM
TPVNPGVGQCCTSSYANRRPCFSSLVVDETYVPPAFSDDKFIFHKDLCQAQGVALQTMKQEFLINLVKQK
PQITEEQLEAVIADFSGLLEKCCQGQEQEVCFAEEGQKLISKTRAALGV
>hTGFBI_NP_000349（配列番号８８）
MALFVRLLALALALALGPAATLAGPAKSPYQLVLQHSRLRGRQHGPNVCAVQKVIGTNRKYFTNCKQWYQ
RKICGKSTVISYECCPGYEKVPGEKGCPAALPLSNLYETLGVVGSTTTQLYTDRTEKLRPEMEGPGSFTI
FAPSNEAWASLPAEVLDSLVSNVNIELLNALRYHMVGRRVLTDELKHGMTLTSMYQNSNIQIHHYPNGIV
TVNCARLLKADHHATNGVVHLIDKVISTITNNIQQIIEIEDTFETLRAAVAASGLNTMLEGNGQYTLLAP
TNEAFEKIPSETLNRILGDPEALRDLLNNHILKSAMCAEAIVAGLSVETLEGTTLEVGCSGDMLTINGKA
IISNKDILATNGVIHYIDELLIPDSAKTLFELAAESDVSTAIDLFRQAGLGNHLSGSERLTLLAPLNSVF
KDGTPPIDAHTRNLLRNHIIKDQLASKYLYHGQTLETLGGKKLRVFVYRNSLCIENSCIAAHDKRGRYGT
LFTMDRVLTPPMGTVMDVLKGDNRFSMLVAAIQSAGLTETLNREGVYTVFAPTNEAFRALPPRERSRLLG
DAKELANILKYHIGDEILVSGGIGALVRLKSLQGDKLEVSLKNNVVSVNKEPVAEPDIMATNGVVHVITN
VLQPPANRPQERGDELADSALEIFKQASAFSRASQRSVRLAPVYQKLLERMKH
>hSPARC_isoform_1_NP_003109（配列番号８９）
MRAWIFFLLCLAGRALAAPQQEALPDETEVVEETVAEVTEVSVGANPVQVEVGEFDDGAEETEEEVVAEN
PCQNHHCKHGKVCELDENNTPMCVCQDPTSCPAPIGEFEKVCSNDNKTFDSSCHFFATKCTLEGTKKGHK
LHLDYIGPCKYIPPCLDSELTEFPLRMRDWLKNVLVTLYERDEDNNLLTEKQKLRVKKIHENEKRLEAGD
HPVELLARDFEKNYNMYIFPVHWQFGQLDQHPIDGYLSHTELAPLRAPLIPMEHCTTRFFETCDLDNDKY
IALDEWAGCFGIKQKDIDKDLVI
>hFOXM1_isoform_2_NP_068772（配列番号９０）
MKTSPRRPLILKRRRLPLPVQNAPSETSEEEPKRSPAQQESNQAEASKEVAESNSCKFPAGIKIINHPTM
PNTQVVAIPNNANIHSIITALTAKGKESGSSGPNKFILISCGGAPTQPPGLRPQTQTSYDAKRTEVTLET
LGPKPAARDVNLPRPPGALCEQKRETCADGEAAGCTINNSLSNIQWLRKMSSDGLGSRSIKQEMEEKENC
HLEQRQVKVEEPSRPSASWQNSVSERPPYSYMAMIQFAINSTERKRMTLKDIYTWIEDHFPYFKHIAKPG
WKNSIRHNLSLHDMFVRETSANGKVSFWTIHPSANRYLTLDQVFKPLDPGSPQLPEHLESQQKRPNPELR
RNMTIKTELPLGARRKMKPLLPRVSSYLVPIQFPVNQSLVLQPSVKVPLPLAASLMSSELARHSKRVRIA
PKVLLAEEGIAPLSSAGPGKEEKLLFGEGFSPLLPVQTIKEEEIQPGEEMPHLARPIKVESPPLEEWPSP
APSFKEESSHSWEDSSQSPTPRPKKSYSGLRSPTRCVSEMLVIQHRERRERSRSRRKQHLLPPCVDEPEL
LFSEGPSTSRWAAELPFPADSSDPASQLSYSQEVGGPFKTPIKETLPISSTPSKSVLPRTPESWRLTPPA
KVGGLDFSPVQTSQGASDPLPDPLGLMDLSTTPLQSAPPLESPQRLLSSEPLDLISVPFGNSSPSDIDVP
KPGSPEPQVSGLAANRSLTEGLVLDTMNDSLSKILLDISFPGLDEDPLGPDNINWSQFIPELQ
>hHSPH1_isoform_1_NP_006635（配列番号９１）
MSVVGLDVGSQSCYIAVARAGGIETIANEFSDRCTPSVISFGSKNRTIGVAAKNQQITHANNTVSNFKRF
HGRAFNDPFIQKEKENLSYDLVPLKNGGVGIKVMYMGEEHLFSVEQITAMLLTKLKETAENSLKKPVTDC
VISVPSFFTDAERRSVLDAAQIVGLNCLRLMNDMTAVALNYGIYKQDLPSLDEKPRIVVFVDMGHSAFQV
SACAFNKGKLKVLGTAFDPFLGGKNFDEKLVEHFCAEFKTKYKLDAKSKIRALLRLYQECEKLKKLMSSN
STDLPLNIECFMNDKDVSGKMNRSQFEELCAELLQKIEVPLYSLLEQTHLKVEDVSAVEIVGGATRIPAV
KERIAKFFGKDISTTLNADEAVARGCALQCAILSPAFKVREFSVTDAVPFPISLIWNHDSEDTEGVHEVF
SRNHAAPFSKVLTFLRRGPFELEAFYSDPQGVPYPEAKIGRFVVQNVSAQKDGEKSRVKVKVRVNTHGIF
TISTASMVEKVPTEENEMSSEADMECLNQRPPENPDTDKNVQQDNSEAGTQPQVQTDAQQTSQSPPSPEL
TSEENKIPDADKANEKKVDQPPEAKKPKIKVVNVELPIEANLVWQLGKDLLNMYIETEGKMIMQDKLEKE
RNDAKNAVEEYVYEFRDKLCGPYEKFICEQDHQNFLRLLTETEDWLYEEGEDQAKQAYVDKLEELMKIGT
PVKVRFQEAEERPKMFEELGQRLQHYAKIAADFRNKDEKYNHIDESEMKKVEKSVNEVMEWMNNVMNAQA
KKSLDQDPVVRAQEIKTKIKELNNTCEPVVTQPKPKIESPKLERTPNGPNIDKKEEDLEDKNNFGAEPPH
QNGECYPNEKNSVNMDLD
＜mRNAワクチン コドン最適化前元配列＞
>hGPC3_var2_NM_004484（配列番号９２）
ATGGCCGGGACCGTGCGCACCGCGTGCTTGGTGGTGGCGATGCTGCTCAGCTTGGACTTCCCGGGACAGG
CGCAGCCCCCGCCGCCGCCGCCGGACGCCACCTGTCACCAAGTCCGCTCCTTCTTCCAGAGACTGCAGCC
CGGACTCAAGTGGGTGCCAGAAACTCCCGTGCCAGGATCAGATTTGCAAGTATGTCTCCCTAAGGGCCCA
ACATGCTGCTCAAGAAAGATGGAAGAAAAATACCAACTAACAGCACGATTGAACATGGAACAGCTGCTTC
AGTCTGCAAGTATGGAGCTCAAGTTCTTAATTATTCAGAATGCTGCGGTTTTCCAAGAGGCCTTTGAAAT
TGTTGTTCGCCATGCCAAGAACTACACCAATGCCATGTTCAAGAACAACTACCCAAGCCTGACTCCACAA
GCTTTTGAGTTTGTGGGTGAATTTTTCACAGATGTGTCTCTCTACATCTTGGGTTCTGACATCAATGTAG
ATGACATGGTCAATGAATTGTTTGACAGCCTGTTTCCAGTCATCTATACCCAGCTAATGAACCCAGGCCT
GCCTGATTCAGCCTTGGACATCAATGAGTGCCTCCGAGGAGCAAGACGTGACCTGAAAGTATTTGGGAAT
TTCCCCAAGCTTATTATGACCCAGGTTTCCAAGTCACTGCAAGTCACTAGGATCTTCCTTCAGGCTCTGA
ATCTTGGAATTGAAGTGATCAACACAACTGATCACCTGAAGTTCAGTAAGGACTGTGGCCGAATGCTCAC
CAGAATGTGGTACTGCTCTTACTGCCAGGGACTGATGATGGTTAAACCCTGTGGCGGTTACTGCAATGTG
GTCATGCAAGGCTGTATGGCAGGTGTGGTGGAGATTGACAAGTACTGGAGAGAATACATTCTGTCCCTTG
AAGAACTTGTGAATGGCATGTACAGAATCTATGACATGGAGAACGTACTGCTTGGTCTCTTTTCAACAAT
CCATGATTCTATCCAGTATGTCCAGAAGAATGCAGGAAAGCTGACCACCACTATTGGCAAGTTATGTGCC
CATTCTCAACAACGCCAATATAGATCTGCTTATTATCCTGAAGATCTCTTTATTGACAAGAAAGTATTAA
AAGTTGCTCATGTAGAACATGAAGAAACCTTATCCAGCCGAAGAAGGGAACTAATTCAGAAGTTGAAGTC
TTTCATCAGCTTCTATAGTGCTTTGCCTGGCTACATCTGCAGCCATAGCCCTGTGGCGGAAAACGACACC
CTTTGCTGGAATGGACAAGAACTCGTGGAGAGATACAGCCAAAAGGCAGCAAGGAATGGAATGAAAAACC
AGTTCAATCTCCATGAGCTGAAAATGAAGGGCCCTGAGCCAGTGGTCAGTCAAATTATTGACAAACTGAA
GCACATTAACCAGCTCCTGAGAACCATGTCTATGCCCAAAGGTAGAGTTCTGGATAAAAACCTGGATGAG
GAAGGGTTTGAAAGTGGAGACTGCGGTGATGATGAAGATGAGTGCATTGGAGGCTCTGGTGATGGAATGA
TAAAAGTGAAGAATCAGCTCCGCTTCCTTGCAGAACTGGCCTATGATCTGGATGTGGATGATGCGCCTGG
AAACAGTCAGCAGGCAACTCCGAAGGACAACGAGATAAGCACCTTTCACAACCTCGGGAACGTTCATTCC
CCGCTGAAGCTTCTCACCAGCATGGCCATCTCGGTGGTGTGCTTCTTCTTCCTGGTGCACTGA
>hROBO1_varX6_cloned_from_SW480(細胞質内型) （配列番号９３）
ATGATTGCGGAGCCCGCTCACTTTTACCTGTTTGGATTAATATGTCTCTGTTCAGGCTCCCGTCTTCGTCAGGAAGATTTTCCACCTCGCATTGTTGAACACCCTTCAGACCTGATTGTCTCAAAAGGAGAACCTGCAACTTTGAACTGCAAAGCTGAAGGCCGCCCCACACCCACTATTGAATGGTACAAAGGGGGAGAGAGAGTGGAGACAGACAAAGATGACCCTCGCTCACACCGAATGTTGCTGCCGAGTGGATCTTTATTTTTCTTACGTATAGTACATGGACGGAAAAGTAGACCTGATGAAGGAGTCTATGTCTGTGTAGCAAGGAATTACCTTGGAGAGGCTGTGAGCCACAATGCATCGCTGGAAGTAGCCATACTTCGGGATGACTTCAGACAAAACCCTTCGGATGTCATGGTTGCAGTAGGAGAGCCTGCAGTAATGGAATGCCAACCTCCACGAGGCCATCCTGAGCCCACCATTTCATGGAAGAAAGATGGCTCTCCACTGGATGATAAAGATGAAAGAATAACTATACGAGGAGGAAAGCTCATGATCACTTACACCCGTAAAAGTGACGCTGGCAAATATGTTTGTGTTGGTACCAATATGGTTGGGGAACGTGAGAGTGAAGTAGCCGAGCTGACTGTCTTAGAGAGACCATCATTTGTGAAGAGACCCAGTAACTTGGCAGTAACTGTGGATGACAGTGCAGAATTTAAATGTGAGGCCCGAGGTGACCCTGTACCTACAGTACGATGGAGGAAAGATGATGGAGAGCTGCCCAAATCCAGATATGAAATCCGAGATGATCATACCTTGAAAATTAGGAAGGTGACAGCTGGTGACATGGGTTCATACACTTGTGTTGCAGAAAATATGGTGGGCAAAGCTGAAGCATCTGCTACTCTGACTGTTCAAGTTGGGTCTGAACCTCCACATTTTGTTGTGAAACCCCGTGACCAGGTTGTTGCTTTGGGACGGACTGTAACTTTTCAGTGTGAAGCAACCGGAAATCCTCAACCAGCTATTTTCTGGAGGAGAGAAGGGAGTCAGAATCTACTTTTCTCATATCAACCACCACAGTCATCCAGCCGATTTTCAGTCTCCCAGACTGGCGACCTCACAATTACTAATGTCCAGCGATCTGATGTTGGTTATTACATCTGCCAGACTTTAAATGTTGCTGGAAGCATCATCACAAAGGCATATTTGGAAGTTACAGATGTGATTGCAGATCGGCCTCCCCCAGTTATTCGACAAGGTCCTGTGAATCAGACTGTAGCCGTGGATGGCACTTTCGTCCTCAGCTGTGTGGCCACAGGCAGTCCAGTGCCCACCATTCTGTGGAGAAAGGATGGAGTCCTCGTTTCAACCCAAGACTCTCGAATCAAACAGTTGGAGAATGGAGTACTGCAGATCCGATATGCTAAGCTGGGTGATACTGGTCGGTACACCTGCATTGCATCAACCCCCAGTGGTGAAGCAACATGGAGTGCTTACATTGAAGTTCAAGAATTTGGAGTTCCAGTTCAGCCTCCAAGACCTACTGACCCAAATTTAATCCCTAGTGCCCCATCAAAACCTGAAGTGACAGATGTCAGCAGAAATACAGTCACATTATCGTGGCAACCAAATTTGAATTCAGGAGCAACTCCAACATCTTATATTATAGAAGCCTTCAGCCATGCATCTGGTAGCAGCTGGCAGACCGTAGCAGAGAATGTGAAAACAGAAACATCTGCCATTAAAGGACTCAAACCTAATGCAATTTACCTTTTCCTTGTGAGGGCAGCTAATGCATATGGAATTAGTGATCCAAGCCAAATATCAGATCCAGTGAAAACACAAGATGTCCTACCAACAAGTCAGGGGGTGGACCACAAGCAGGTCCAGAGAGAGCTGGGAAATGCTGTTCTGCACCTCCACAACCCCACCGTCCTTTCTTCCTCTTCCATCGAAGTGCACTGGACAGTAGATCAACAGTCTCAGTATATACAAGGATATAAAATTCTCTATCGGCCATCTGGAGCCAACCACGGAGAATCAGACTGGTTAGTTTTTGAAGTGAGGACGCCAGCCAAAAACAGTGTGGTAATCCCTGATCTCAGAAAGGGAGTCAACTATGAAATTAAGGCTCGCCCTTTTTTTAATGAATTTCAAGGAGCAGATAGTGAAATCAAGTTTGCCAAAACCCTGGAAGAAGCACCCAGTGCCCCACCCCAAGGTGTAACTGTATCCAAGAATGATGGAAACGGAACTGCAATTCTAGTTAGTTGGCAGCCACCTCCAGAAGACACTCAAAATGGAATGGTCCAAGAGTATAAGGTTTGGTGTCTGGGCAATGAAACTCGATACCACATCAACAAAACAGTGGATGGTTCCACCTTTTCCGTGGTCATTCCCTTTCTTGTTCCTGGAATCCGATACAGTGTGGAAGTGGCAGCCAGCACTGGGGCTGGGTCTGGGGTAAAGAGTGAGCCTCAGTTCATCCAGCTGGATGCCCATGGAAACCCTGTGTCACCTGAGGACCAAGTCAGCCTCGCTCAGCAGATTTCAGATGTGGTGAAGCAGCCGGCCTTCATAGCAGGTATTGGAGCAGCCTGTTGGATCATCCTCATGGTCTTCAGCATCTGGCTTTATCGACACCGCAAGAAGAGAAACGGACTTACTAGTACCTACGCGGGTATCAGAAAAGTCCCGTCTTTTACCTTCACACCAACAGTAACTTACCAGAGAGGAGGCGAAGCTGTCAGCAGTGGAGGGAGGCCTGGACTTCTCAACATCAGTGAACCTGCCGCGCAGCCATGGCTGGCAGACACGTGGCCTAATACTGGCAACAACCACAATGACTGCTCTATCAGCTGCTGCACGGCAGGCAATGGAAACAGCGACAGCAACCTCACTACCTACAGTCGCCCAGCTGATTGTATAGCAAATTATAACAACCAACTGGATAACAAACAAACAAATCTGATGCTCCCTGAGTCAACTGTTTATGGTGATGTGGACCTTAGTAACAAAATCAATGAGATGAAAACCTTCAATAGCCCAAATCTGAAGGATGGGCGTTTTGTCAATCCATCAGGGCAGCCTACTCCTTACGCCACCACTCAGCTCATCCAGTCAAACCTCAGCAACAACATGAACAATGGCAGCGGGGACTCTGGCGAGAAGCACTGGAAACCACTGGGACAGCAGAAACAAGAAGTGGCACCAGTTCAGTACAACATCGTGGAGCAAAACAAGCTGAACAAAGATTATCGAGCAAATGACACAGTTCCTCCAACTATCCCATACAACCAATCATACGACCAGAACACAGGAGGATCCTACAACAGCTCAGACCGGGGCAGTAGTACATCTGGGAGTCAGGGGCACAAGAAAGGGGCAAGAACACCCAAGGTACCAAAACAGGGTGGCATGAACTGGGCAGACCTGCTTCCTCCTCCCCCAGCACATCCTCCTCCACACAGCAATAGCGAAGAGTACAACATTTCTGTAGATGAAAGCTATGACCAAGAAATGCCATGTCCCGTGCCACCAGCAAGGATGTATTTGCAACAAGATGAATTAGAAGAGGAGGAAGATGAACGAGGCCCCACTCCCCCTGTTCGGGGAGCAGCTTCTTCTCCAGCTGCCGTGTCCTATAGCCATCAGTCCACTGCCACTCTGACTCCCTCCCCACAGGAAGAACTCCAGCCCATGTTACAGGATTGTCCAGAGGAGACTGGCCACATGCAGCACCAGCCCGACAGGAGACGGCAGCCTGTGAGTCCTCCTCCACCACCACGGCCGATCTCCCCTCCACATACCTATGGCTACATTTCAGGACCCCTGGTCTCAGATATGGATACGGATGCGCCAGAAGAGGAAGAAGACGAAGCCGACATGGAGGTAGCCAAGATGCAAACCAGAAGGCTTTTGTTACGTGGGCTTGAGCAGACACCTGCCTCCAGTGTTGGGGACCTGGAGAGCTCTGTCACGGGGTCCATGATCAACGGCTGGGGCTCAGCCTCAGAGGAGGACAACATTTCCAGCGGACGCTCCAGTGTTAGTTCTTCGGACGGCTCCTTTTTCACTGATGCTGACTTTGCCCAGGCAGTCGCAGCAGCGGCAGAGTATGCTGGTCTGAAAGTAGCACGACGGCAAATGCAGGATGCTGCTGGTCGTCGACATTTTCATGCGTCTCAGTGCCCTAGGCCCACAAGTCCCGTGTCTACAGACAGCAACATGAGTGCCGCCGTAATGCAGAAAACCAGACCAGCCAAGAAACTGAAACACCAGCCAGGACATCTGCGCAGAGAAACCTACACAGATGATCTTCCACCACCTCCTGTGCCGCCACCTGCTATAAAGTCACCTACTGCCCAATCCAAGACACAGCTGGAAGTACGACCTGTAGTGGTGCCAAAACTCCCTTCTATGGATGCAAGAACAGACAGATCATCAGACAGAAAAGGAAGCAGTTACAAGGGGAGAGAAGTGTTGGATGGAAGACAGGTTGTTGACATGCGAACAAATCCAGGTGATCCCAGAGAAGCACAGGAACAGCAAAATGACGGGAAAGGACGTGGAAACAAGGCAGCAAAACGAGACCTTCCACCAGCAAAGACTCATCTCATCCAAGAGGATATTCTACCTTATTGTAGACCTACTTTTCCAACATCAAATAATCCCAGAGATCCCAGTTCCTCAAGCTCAATGTCATCAAGAGGATCAGGAAGCAGACAAAGAGAACAAGCAAATGTAGGTCGAAGAAATATTGCAGAAATGCAGGTACTTGGAGGATATGAAAGAGGAGAAGATAATAATGAAGAATTAGAGGAAACTGAAAGCTGA
>hROBO1_var1_NM_002941(膜局在型) （配列番号９４）
ATGAAATGGAAACATGTTCCTTTTTTGGTCATGATATCACTCCTCAGCTTATCCCCAAATCACCTGTTTC
TGGCCCAGCTTATTCCAGACCCTGAAGATGTAGAGAGGGGGAACGACCACGGGACGCCAATCCCCACCTC
TGATAACGATGACAATTCGCTGGGCTATACAGGCTCCCGTCTTCGTCAGGAAGATTTTCCACCTCGCATT
GTTGAACACCCTTCAGACCTGATTGTCTCAAAAGGAGAACCTGCAACTTTGAACTGCAAAGCTGAAGGCC
GCCCCACACCCACTATTGAATGGTACAAAGGGGGAGAGAGAGTGGAGACAGACAAAGATGACCCTCGCTC
ACACCGAATGTTGCTGCCGAGTGGATCTTTATTTTTCTTACGTATAGTACATGGACGGAAAAGTAGACCT
GATGAAGGAGTCTATGTCTGTGTAGCAAGGAATTACCTTGGAGAGGCTGTGAGCCACAATGCATCGCTGG
AAGTAGCCATACTTCGGGATGACTTCAGACAAAACCCTTCGGATGTCATGGTTGCAGTAGGAGAGCCTGC
AGTAATGGAATGCCAACCTCCACGAGGCCATCCTGAGCCCACCATTTCATGGAAGAAAGATGGCTCTCCA
CTGGATGATAAAGATGAAAGAATAACTATACGAGGAGGAAAGCTCATGATCACTTACACCCGTAAAAGTG
ACGCTGGCAAATATGTTTGTGTTGGTACCAATATGGTTGGGGAACGTGAGAGTGAAGTAGCCGAGCTGAC
TGTCTTAGAGAGACCATCATTTGTGAAGAGACCCAGTAACTTGGCAGTAACTGTGGATGACAGTGCAGAA
TTTAAATGTGAGGCCCGAGGTGACCCTGTACCTACAGTACGATGGAGGAAAGATGATGGAGAGCTGCCCA
AATCCAGATATGAAATCCGAGATGATCATACCTTGAAAATTAGGAAGGTGACAGCTGGTGACATGGGTTC
ATACACTTGTGTTGCAGAAAATATGGTGGGCAAAGCTGAAGCATCTGCTACTCTGACTGTTCAAGAACCT
CCACATTTTGTTGTGAAACCCCGTGACCAGGTTGTTGCTTTGGGACGGACTGTAACTTTTCAGTGTGAAG
CAACCGGAAATCCTCAACCAGCTATTTTCTGGAGGAGAGAAGGGAGTCAGAATCTACTTTTCTCATATCA
ACCACCACAGTCATCCAGCCGATTTTCAGTCTCCCAGACTGGCGACCTCACAATTACTAATGTCCAGCGA
TCTGATGTTGGTTATTACATCTGCCAGACTTTAAATGTTGCTGGAAGCATCATCACAAAGGCATATTTGG
AAGTTACAGATGTGATTGCAGATCGGCCTCCCCCAGTTATTCGACAAGGTCCTGTGAATCAGACTGTAGC
CGTGGATGGCACTTTCGTCCTCAGCTGTGTGGCCACAGGCAGTCCAGTGCCCACCATTCTGTGGAGAAAG
GATGGAGTCCTCGTTTCAACCCAAGACTCTCGAATCAAACAGTTGGAGAATGGAGTACTGCAGATCCGAT
ATGCTAAGCTGGGTGATACTGGTCGGTACACCTGCATTGCATCAACCCCCAGTGGTGAAGCAACATGGAG
TGCTTACATTGAAGTTCAAGAATTTGGAGTTCCAGTTCAGCCTCCAAGACCTACTGACCCAAATTTAATC
CCTAGTGCCCCATCAAAACCTGAAGTGACAGATGTCAGCAGAAATACAGTCACATTATCGTGGCAACCAA
ATTTGAATTCAGGAGCAACTCCAACATCTTATATTATAGAAGCCTTCAGCCATGCATCTGGTAGCAGCTG
GCAGACCGTAGCAGAGAATGTGAAAACAGAAACATCTGCCATTAAAGGACTCAAACCTAATGCAATTTAC
CTTTTCCTTGTGAGGGCAGCTAATGCATATGGAATTAGTGATCCAAGCCAAATATCAGATCCAGTGAAAA
CACAAGATGTCCTACCAACAAGTCAGGGGGTGGACCACAAGCAGGTCCAGAGAGAGCTGGGAAATGCTGT
TCTGCACCTCCACAACCCCACCGTCCTTTCTTCCTCTTCCATCGAAGTGCACTGGACAGTAGATCAACAG
TCTCAGTATATACAAGGATATAAAATTCTCTATCGGCCATCTGGAGCCAACCACGGAGAATCAGACTGGT
TAGTTTTTGAAGTGAGGACGCCAGCCAAAAACAGTGTGGTAATCCCTGATCTCAGAAAGGGAGTCAACTA
TGAAATTAAGGCTCGCCCTTTTTTTAATGAATTTCAAGGAGCAGATAGTGAAATCAAGTTTGCCAAAACC
CTGGAAGAAGCACCCAGTGCCCCACCCCAAGGTGTAACTGTATCCAAGAATGATGGAAACGGAACTGCAA
TTCTAGTTAGTTGGCAGCCACCTCCAGAAGACACTCAAAATGGAATGGTCCAAGAGTATAAGGTTTGGTG
TCTGGGCAATGAAACTCGATACCACATCAACAAAACAGTGGATGGTTCCACCTTTTCCGTGGTCATTCCC
TTTCTTGTTCCTGGAATCCGATACAGTGTGGAAGTGGCAGCCAGCACTGGGGCTGGGTCTGGGGTAAAGA
GTGAGCCTCAGTTCATCCAGCTGGATGCCCATGGAAACCCTGTGTCACCTGAGGACCAAGTCAGCCTCGC
TCAGCAGATTTCAGATGTGGTGAAGCAGCCGGCCTTCATAGCAGGTATTGGAGCAGCCTGTTGGATCATC
CTCATGGTCTTCAGCATCTGGCTTTATCGACACCGCAAGAAGAGAAACGGACTTACTAGTACCTACGCGG
GTATCAGAAAAGTCCCGTCTTTTACCTTCACACCAACAGTAACTTACCAGAGAGGAGGCGAAGCTGTCAG
CAGTGGAGGGAGGCCTGGACTTCTCAACATCAGTGAACCTGCCGCGCAGCCATGGCTGGCAGACACGTGG
CCTAATACTGGCAACAACCACAATGACTGCTCCATCAGCTGCTGCACGGCAGGCAATGGAAACAGCGACA
GCAACCTCACTACCTACAGTCGCCCAGCTGATTGTATAGCAAATTATAACAACCAACTGGATAACAAACA
AACAAATCTGATGCTCCCTGAGTCAACTGTTTATGGTGATGTGGACCTTAGTAACAAAATCAATGAGATG
AAAACCTTCAATAGCCCAAATCTGAAGGATGGGCGTTTTGTCAATCCATCAGGGCAGCCTACTCCTTACG
CCACCACTCAGCTCATCCAGTCAAACCTCAGCAACAACATGAACAATGGCAGCGGGGACTCTGGCGAGAA
GCACTGGAAACCACTGGGACAGCAGAAACAAGAAGTGGCACCAGTTCAGTACAACATCGTGGAGCAAAAC
AAGCTGAACAAAGATTATCGAGCAAATGACACAGTTCCTCCAACTATCCCATACAACCAATCATACGACC
AGAACACAGGAGGATCCTACAACAGCTCAGACCGGGGCAGTAGTACATCTGGGAGTCAGGGGCACAAGAA
AGGGGCAAGAACACCCAAGGTACCAAAACAGGGTGGCATGAACTGGGCAGACCTGCTTCCTCCTCCCCCA
GCACATCCTCCTCCACACAGCAATAGCGAAGAGTACAACATTTCTGTAGATGAAAGCTATGACCAAGAAA
TGCCATGTCCCGTGCCACCAGCAAGGATGTATTTGCAACAAGATGAATTAGAAGAGGAGGAAGATGAACG
AGGCCCCACTCCCCCTGTTCGGGGAGCAGCTTCTTCTCCAGCTGCCGTGTCCTATAGCCATCAGTCCACT
GCCACTCTGACTCCCTCCCCACAGGAAGAACTCCAGCCCATGTTACAGGATTGTCCAGAGGAGACTGGCC
ACATGCAGCACCAGCCCGACAGGAGACGGCAGCCTGTGAGTCCTCCTCCACCACCACGGCCGATCTCCCC
TCCACATACCTATGGCTACATTTCAGGACCCCTGGTCTCAGATATGGATACGGATGCGCCAGAAGAGGAA
GAAGACGAAGCCGACATGGAGGTAGCCAAGATGCAAACCAGAAGGCTTTTGTTACGTGGGCTTGAGCAGA
CACCTGCCTCCAGTGTTGGGGACCTGGAGAGCTCTGTCACGGGGTCCATGATCAACGGCTGGGGCTCAGC
CTCAGAGGAGGACAACATTTCCAGCGGACGCTCCAGTGTTAGTTCTTCGGACGGCTCCTTTTTCACTGAT
GCTGACTTTGCCCAGGCAGTCGCAGCAGCGGCAGAGTATGCTGGTCTGAAAGTAGCACGACGGCAAATGC
AGGATGCTGCTGGCCGTCGACATTTTCATGCGTCTCAGTGCCCTAGGCCCACAAGTCCCGTGTCTACAGA
CAGCAACATGAGTGCCGCCGTAATGCAGAAAACCAGACCAGCCAAGAAACTGAAACACCAGCCAGGACAT
CTGCGCAGAGAAACCTACACAGATGATCTTCCACCACCTCCTGTGCCGCCACCTGCTATAAAGTCACCTA
CTGCCCAATCCAAGACACAGCTGGAAGTACGACCTGTAGTGGTGCCAAAACTCCCTTCTATGGATGCAAG
AACAGACAGATCATCAGACAGAAAAGGAAGCAGTTACAAGGGGAGAGAAGTGTTGGATGGAAGACAGGTT
GTTGACATGCGAACAAATCCAGGTGATCCCAGAGAAGCACAGGAACAGCAAAATGACGGGAAAGGACGTG
GAAACAAGGCAGCAAAACGAGACCTTCCACCAGCAAAGACTCATCTCATCCAAGAGGATATTCTACCTTA
TTGTAGACCTACTTTTCCAACATCAAATAATCCCAGAGATCCCAGTTCCTCAAGCTCAATGTCATCAAGA
GGATCAGGAAGCAGACAAAGAGAACAAGCAAATGTAGGTCGAAGAAATATTGCAGAAATGCAGGTACTTG
GAGGATATGAAAGAGGAGAAGATAATAATGAAGAATTAGAGGAAACTGAAAGCTGA
>hEPHB4_cloned_from_SKmel23（配列番号９５）
ATGGAGCTCCGGGTGCTGCTCTGCTGGGCTTCGTTGGCCGCAGCTTTGGAAGAGACCCTGCTGAACACAAAATTGGAAACTGCTGATCTGAAGTGGGTGACATTCCCTCAGGTGGACGGGCAGTGGGAGGAACTGAGCGGCCTGGATGAGGAACAGCACAGCGTGCGCACCTACGAAGTGTGTGACGTGCAGCGTGCCCCGGGCCAGGCCCACTGGCTTCGCACAGGTTGGGTCCCACGGCGGGGCGCCGTCCACGTGTACGCCACGCTGCGCTTCACCATGCTCGAGTGCCTGTCCCTGCCTCGGGCTGGGCGCTCCTGCAAGGAGACCTTCACCGTCTTCTACTATGAGAGCGATGCGGACACGGCCACGGCCCTCACGCCAGCCTGGATGGAGAACCCCTACATCAAGGTGGACACGGTGGCCGCGGAGCATCTCACCCGGAAGCGCCCTGGGGCCGAGGCCACCGGGAAGGTGAATGTCAAGACGCTGCGTCTGGGACCGCTCAGCAAGGCTGGCTTCTACCTGGCCTTCCAGGACCAGGGTGCCTGCATGGCCCTGCTATCCCTGCACCTCTTCTACAAAAAGTGCGCCCAGCTGACTGTGAACCTGACTCGATTCCCGGAGACTGTGCCTCGGGAGCTGGTTGTGCCCGTGGCCGGTAGCTGCGTGGTGGATGCCGTCCCCGCCCCTGGCCCCAGCCCCAGCCTCTACTGCCGTGAGGATGGCCAGTGGGCCGAACAGCCGGTCACGGGCTGCAGCTGTGCTCCGGGGTTCGAGGCAGCTGAGGGGAACACCAAGTGCCGAGCCTGTGCCCAGGGCACCTTCAAGCCCCTGTCAGGAGAAGGGTCCTGCCAGCCATGCCCAGCCAATAGCCACTCTAACACCATTGGATCAGCCGTCTGCCAGTGCCGCGTCGGGTACTTCCGGGCACGCACAGACCCCCGGGGTGCACCCTGCACCACCCCTCCTTCGGCTCCGCGGAGCGTGGTTTCCCGCCTGAACGGCTCCTCCCTGCACCTGGAATGGAGTGCCCCCCTGGAGTCTGGTGGCCGAGAGGACCTCACCTACGCCCTCCGCTGCCGGGAGTGCCGACCCGGAGGCTCCTGTGCGCCCTGCGGGGGAGACCTGACTTTTGACCCCGGCCCCCGGGACCTGGTGGAGCCCTGGGTGGTGGTTCGAGGGCTACGTCCTGACTTCACCTATACCTTTGAGGTCACTGCATTGAACGGGGTATCCTCCTTAGCCACGGGGCCCGTCCCATTTGAGCCTGTCAATGTCACCACTGACCGAGAGGTACCTCCTGCAGTGTCCGACATCCGGGTGACGCGGTCCTCACCCAGCAGCTTGAGCCTGGCCTGGGCTGTTCCCCGGGCACCCAGTGGGGCTGTGCTGGACTACGAGGTCAAATACCATGAGAAGGGCGCCGAGGGTCCCAGCAGCGTGCGGTTCCTGAAGACGTCAGAAAACCGGGCAGAGCTGCGGGGGCTGAAGCGGGGAGCCAGCTACCTGGTGCAGGTACGGGCGCGCTCTGAGGCCGGCTACGGGCCCTTCGGCCAGGAACATCACAGCCAGACCCAACTGGATGAGAGCGAGGGCTGGCGGGAGCAGCTGGCCCTGATTGCGGGCACGGCAGTCGTGGGTGTGGTCCTGGTCCTGGTGGTCATTGTGGTCGCAGTTCTCTGCCTCAGGAAGCAGAGCAATGGGAGAGAAGCAGAATATTCGGACAAACACGGACAGTATCTCATCGGGCATGGTACTAAGGTCTACATCGACCCCTTCACTTATGAAGACCCTAATGAGGCTGTGAGGGAATTTGCAAAAGAGATCGATGTCTCCTACGTCAAGATTGAAGAGGTGATTGGTGCAGGTGAGTTTGGCGAGGTGTGCCGGGGGCGGCTCAAGGCCCCAGGGAAGAAGGAGAGCTGTGTGGCAATCAAGACCCTGAAGGGTGGCTACACGGAGCGGCAGCGGCGTGAGTTTCTGAGCGAGGCCTCCATCATGGGCCAGTTCGAGCACCCCAATATCATCCGCCTGGAGGGCGTGGTCACCAACAGCATGCCCGTCATGATTCTCACAGAGTTCATGGAGAACGGCGCCCTGGACTCCTTCCTGCGGCTAAACGACGGACAGTTCACAGTCATCCAGCTCGTGGGCATGCTGCGGGGCATCGCCTCGGGCATGCGGTACCTTGCCGAGATGAGCTACGTCCACCGAGACCTGGCTGCTCGCAACATCCTAGTCAACAGCAACCTCGTCTGCAAAGTGTCTGACTTTGGCCTTTCCCGATTCCTGGAGGAGAACTCTTCCGATCCCACCTACACGAGCTCCCTGGGAGGAAAGATTCCCATCCGATGGACTGCCCCGGAGGCCATTGCCTTCCGGAAGTTCACTTCCGCCAGTGATGCCTGGAGTTACGGGATTGTGATGTGGGAGGTGATGTCATTTGGGGAGAGGCCGTACTGGGACATGAGCAATCAGGACGTGATCAATGCCATTGAACAGGACTACCGGCTGCCCCCGCCCCCAGACTGTCCCACCTCCCTCCACCAGCTCATGCTGGACTGTTGGCAGAAAGACCGGAATGCCCGGCCCCGCTTCCCCCAGGTGGTCAGCGCCCTGGACAAGATGATCCGGAACCCCGCCAGCCTCAAAATCGTGGCCCGGGAGAATGGCGGGGCCTCACACCCTCTCCTGGACCAGCGGCAGCCTCACTACTCAGCTTTTGGCTCTGTGGGCGAGTGGCTTCGGGCCATCAAAATGGGAAGATACGAAGAAAGTTTCGCAGCCGCTGGCTTTGGCTCCTTCGAGCTGGTCAGCCAGATCTCTGCTGAGGACCTGCTCCGAATCGGAGTCACTCTGGCGGGACACCAGAAGAAAATCTTGGCCAGTGTCCAGCACATGAAGTCCCAGGCCAAGCCGGGAACCCCGGGTGGGACAGGAGGACCGGCCCCGCAGTACTGA
>hCLDN1_NM_021101（配列番号９６）
ATGGCCAACGCGGGGCTGCAGCTGTTGGGCTTCATTCTCGCCTTCCTGGGATGGATCGGCGCCATCGTCA
GCACTGCCCTGCCCCAGTGGAGGATTTACTCCTATGCCGGCGACAACATCGTGACCGCCCAGGCCATGTA
CGAGGGGCTGTGGATGTCCTGCGTGTCGCAGAGCACCGGGCAGATCCAGTGCAAAGTCTTTGACTCCTTG
CTGAATCTGAGCAGCACATTGCAAGCAACCCGTGCCTTGATGGTGGTTGGCATCCTCCTGGGAGTGATAG
CAATCTTTGTGGCCACCGTTGGCATGAAGTGTATGAAGTGCTTGGAAGACGATGAGGTGCAGAAGATGAG
GATGGCTGTCATTGGGGGTGCGATATTTCTTCTTGCAGGTCTGGCTATTTTAGTTGCCACAGCATGGTAT
GGCAATAGAATCGTTCAAGAATTCTATGACCCTATGACCCCAGTCAATGCCAGGTACGAATTTGGTCAGG
CTCTCTTCACTGGCTGGGCTGCTGCTTCTCTCTGCCTTCTGGGAGGTGCCCTACTTTGCTGTTCCTGTCC
CCGAAAAACAACCTCTTACCCAACACCAAGGCCCTATCCAAAACCTGCACCTTCCAGCGGGAAAGACTAC
GTGTGA
>hSLC7A5_NM_003486（配列番号９７）
ATGGCGGGTGCGGGCCCGAAGCGGCGCGCGCTAGCGGCGCCGGCGGCCGAGGAGAAGGAAGAGGCGCGGG
AGAAGATGCTGGCCGCCAAGAGCGCGGACGGCTCGGCGCCGGCAGGCGAGGGCGAGGGCGTGACCCTGCA
GCGGAACATCACGCTGCTCAACGGCGTGGCCATCATCGTGGGGACCATTATCGGCTCGGGCATCTTCGTG
ACGCCCACGGGCGTGCTCAAGGAGGCAGGCTCGCCGGGGCTGGCGCTGGTGGTGTGGGCCGCGTGCGGCG
TCTTCTCCATCGTGGGCGCGCTCTGCTACGCGGAGCTCGGCACCACCATCTCCAAATCGGGCGGCGACTA
CGCCTACATGCTGGAGGTCTACGGCTCGCTGCCCGCCTTCCTCAAGCTCTGGATCGAGCTGCTCATCATC
CGGCCTTCATCGCAGTACATCGTGGCCCTGGTCTTCGCCACCTACCTGCTCAAGCCGCTCTTCCCCACCT
GCCCGGTGCCCGAGGAGGCAGCCAAGCTCGTGGCCTGCCTCTGCGTGCTGCTGCTCACGGCCGTGAACTG
CTACAGCGTGAAGGCCGCCACCCGGGTCCAGGATGCCTTTGCCGCCGCCAAGCTCCTGGCCCTGGCCCTG
ATCATCCTGCTGGGCTTCGTCCAGATCGGGAAGGGTGATGTGTCCAATCTAGATCCCAACTTCTCATTTG
AAGGCACCAAACTGGATGTGGGGAACATTGTGCTGGCATTATACAGCGGCCTCTTTGCCTATGGAGGATG
GAATTACTTGAATTTCGTCACAGAGGAAATGATCAACCCCTACAGAAACCTGCCCCTGGCCATCATCATC
TCCCTGCCCATCGTGACGCTGGTGTACGTGCTGACCAACCTGGCCTACTTCACCACCCTGTCCACCGAGC
AGATGCTGTCGTCCGAGGCCGTGGCCGTGGACTTCGGGAACTATCACCTGGGCGTCATGTCCTGGATCAT
CCCCGTCTTCGTGGGCCTGTCCTGCTTCGGCTCCGTCAATGGGTCCCTGTTCACATCCTCCAGGCTCTTC
TTCGTGGGGTCCCGGGAAGGCCACCTGCCCTCCATCCTCTCCATGATCCACCCACAGCTCCTCACCCCCG
TGCCGTCCCTCGTGTTCACGTGTGTGATGACGCTGCTCTACGCCTTCTCCAAGGACATCTTCTCCGTCAT
CAACTTCTTCAGCTTCTTCAACTGGCTCTGCGTGGCCCTGGCCATCATCGGCATGATCTGGCTGCGCCAC
AGAAAGCCTGAGCTTGAGCGGCCCATCAAGGTGAACCTGGCCCTGCCTGTGTTCTTCATCCTGGCCTGCC
TCTTCCTGATCGCCGTCTCCTTCTGGAAGACACCCGTGGAGTGTGGCATCGGCTTCACCATCATCCTCAG
CGGGCTGCCCGTCTACTTCTTCGGGGTCTGGTGGAAAAACAAGCCCAAGTGGCTCCTCCAGGGCATCTTC
TCCACGACCGTCCTGTGTCAGAAGCTCATGCAGGTGGTCCCCCAGGAGACATAG
>hAFP_var1_ BC027881（配列番号９８）
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実施例１１：共通がん抗原由来ペプチドを標的とするTCR-T細胞療法、カクテルTCR-T細胞療法の開発
＜方法＞
　図５７は、CD8分子のMHCへの結合阻害による高親和性T細胞クローンの選択法を示す。
　図５７のAは、抗CD8抗体存在下でのデキストラマーとTCR分子の相互作用を示す。デキストラマーに結合したMHC分子／がん抗原ペプチド複合体とTCR分子が結合する場合に、抗CD8抗体をあらかじめ加えておくことで、ペプチド非特異的なCD8分子とMHC分子との結合を防ぎ、より結合力の強いTCR分子を持つT細胞クローンのみが染色される。
　図５７のBは、CD8結合阻害の有無によるデキストラマー染色の比較を示す。T細胞クローン AおよびBは、CD8結合阻害を行わない場合には、ほぼ等しいデキストラマーでの染色性をしめすが、CD8分子の結合を阻害すると、クローンAはクローンBに比較し強い染色性を示した。
　図５７のCは、CD8結合阻害による高親和性クローンの選択。上記の原理を利用し、がん抗原ペプチドを認識するＴ細胞をデキストラマー染色により精製することで、がん抗原ペプチドに対しより高親和性のTCR遺伝子を持つT細胞クローンを樹立することができる。
＜結果＞
　MHC・ペプチド複合体とTCRの結合には、Ｔ細胞上のCD8分子が補助的にはたらき、その結合を増強することが知られている。本法ではデキストラマー染色を行う前に抗CD8抗体を用いてCD8分子のMHC分子への結合を阻害することで、CD8分子の結合に依存した非特異的染色を減弱し、かつ単独で強い結合力を持つTCR遺伝子を持つクローンを検出することに成功した。実際に、GPC3ペプチドに反応するT細胞クローン２種類をCD8阻害なしの条件下でデキストラマー染色を行った場合、Clone AとClone Bの染色強度は同程度であるが、CD8阻害条件下では明らかな染色性の違いが認められた。本課題では、同様の原理に基づき、患者末梢血から、抗親和性を持つペプチド反応性TCR遺伝子を発現するT細胞を選択するため、CD8阻害を併用したデキストラマーによる染色法を用いた。
　図５８は、GPC3ペプチドワクチンを受けた患者末梢血からのペプチド特異的CTLクローンの樹立を示す。GPC3由来ペプチドを用いたがんペプチドワクチンを受けた患者末梢血よりCD8結合阻害条件下で、デキストラマー陽性T細胞をシングルソーティングし、アロフィーダー細胞上で培養し、T細胞クローンを樹立した。
　図６０のAおよびBは、 HLA-A2拘束性GPC3特異的T細胞クローンのデキストラマー染色によるTCRの結合力の評価を示す。A. CD8結合阻害なし。B. CD8結合阻害ありで比較、検討した。
　図６０のCおよびDは、HLA-A24拘束性GPC3特異的T細胞クローンのデキストラマー染色によるTCRの結合力の評価を示す。C. CD8結合阻害なし。D. CD8結合阻害ありで比較、検討した。
　図６０のEは、HLA-A24拘束性GPC3特異的T細胞クローンの抗原特異的ＩＦＮ－γ産生能の評価を示す。樹立したT細胞クローンを、GPC3陽性HepG2肝がん細胞株、GPC3陰性SK-Hep細胞株(SK-vec)ならびにGPC3強制発現細胞株(SK-GPC3)と20時間共培養し、ＩＦＮ－γ産生をELISPOT法により評価した。ペプチドワクチンに用いたGPC3由来ペプチド(GPC3 A24 prp.)をTAP欠損細胞株であるT2-A24細胞に外来性に結合させた細胞を陽性コントロール、HIV由来ペプチドを結合させた細胞を陰性コントロールとして、抗原特異性を評価した。
＜結果＞
　GPC3ペプチド特異的TCR遺伝子を単離する目的で、GPC3ペプチドワクチンを受けたHLA-A2ハプロタイプの患者ならびにHLA-A24ハプロタイプの患者から提供された末梢血リンパ球をペプチドで刺激培養後、CD8阻害を併用したデキストラマーによる染色法により、抗親和性T細胞を選択、T細胞クローンを樹立した。樹立した。樹立した各クローンのデキストラマー結合性をCD8阻害の有無で比較したところ、A2拘束性クローンについては、全体的に染色強度が低下するものの、染色性はどのクローンでも維持されていたのに対し、A24拘束性クローンでは、e1D8クローンに見られるように顕著に染色性が低下するクローンが確認された。以上の結果から、CD8阻害の有無により影響されずより高いデキストラマー染色性を示すＴ細胞クローンを選択することで、親和性の高いTCR遺伝子を効率よく同定できると考えられる。続いて、樹立したHLA-A24拘束性T細胞クローンのＩＦＮ－γ産生能を評価した。いずれのＴ細胞クローンも外来性にペプチドを結合させたT2-A24細胞と共培養させた場合には、強いＩＦＮ－γ産生を示した。一方で、内在性にGPC3を発現する強制発現細胞株（SK-GPC3）およびHepG2細胞株と共培養した場合には、各クローンで反応性の差異が顕著に見られた。また、そのＩＦＮ－γ産生能は、必ずしもデキストラマー染色とは一致せず、先に述べたe1D8は、デキストラマー染色性は低いものの、内在性GPC3発現細胞に対し、強いＩＦＮ－γ産生を示す一方で、eC7クローンはデキストラマー染色強度は高いが、内在性GPC3発現細胞株との共培養によるＩＦＮ－γ産生能は低いという結果であった。これは、T細胞のＩＦＮ－γ産生能が、TCRの結合力のみならず、クローンごとの細胞内の様々な機能の違いによって決まるためであると考えられる。内在性抗原を認識し腫瘍を排除可能なTCR遺伝子の選択には、治療に用いるTCR-T細胞を構築し、再度、その機能を評価することが必要である。表に、各クローンから単離したTCR遺伝子のアミノ酸配列ならびに遺伝子配列を示した。
　図５９は、FOXM1ペプチドワクチンを受けた患者末梢血からのペプチド特異的CTLクローンの樹立を示す。FOXM1由来ペプチドを用いたがんペプチドワクチンを受けた患者末梢血よりCD8結合阻害条件下で、デキストラマー陽性T細胞をシングルソーティングし、アロフィーダー細胞上で培養し、T細胞クローンを樹立した。
　図５９のAおよびBは、HLA-A24拘束性FOXM1特異的T細胞クローンのデキストラマー染色によるTCRの結合力の評価を示す。A. CD8結合阻害なし。B. CD8結合阻害ありで比較、検討した。
＜結果＞
　FOXM1ペプチドワクチンを受けた患者末梢血をペプチド存在下で刺激培養し、HLA-A24デキストラマー染色により、反応性クローンを樹立した。デキストラマー染色により樹立したFOXM1特異的反応性T細胞クローンのTCRの結合力を評価した結果、4つのクローンのうち、3つのクローンはCD8阻害条件下においても良好な染色性を確認できたが、21E7クローンについては、CD8阻害により顕著な染色性の低下が認められた。表に、各クローンから単離したTCR遺伝子のアミノ酸配列ならびに遺伝子配列を示した。
　図６０は、HSP105ペプチドワクチンを受けた患者末梢血からのペプチド特異的CTLクローンの樹立を示す。HSP105-HLA-A2デキストラマーは染色性が不十分であり、結合を示すT細胞の検出に使用できなかった。そのため、HSP105由来ペプチドを用いたがんペプチドワクチンを受けた患者末梢血を抗原存在下で刺激し、脱顆粒反応を示すCD8T細胞をCD107aアッセイで検出した。CD107a陽性CD８T細胞をシングルソーティングし、アロフィーダー細胞上で培養し、T細胞クローンを樹立した。
　図６０のAは、HLA-A2拘束性HSP105特異的T細胞クローンのＩＦＮ－γ産生をELISPOT法による反応性の評価を示す。樹立した各T細胞クローンを、HSP105由来ペプチドを外来性に結合させた標的細胞（T2細胞）と20時間、共培養し、抗原刺激依存的なＩＦＮ－γ産生を評価した。HIV由来ペプチドを結合させた細胞を陰性コントロールとして、抗原特異性を評価した。
　図６０のBおよびCは、HLA-A2拘束性HSP105特異的T細胞クローンの細胞傷害活性を示す。標的細胞を蛍光色素(カルセイン)で標識し、T細胞クローンと４時間共培養し、蛍光の減衰を指標に標的細胞に対する細胞傷害活性を評価した。B.外来性にペプチドを結合させたT2細胞を標的とした。ペプチドワクチンに用いたHSP105由来ペプチド(HSPA-7）をTAP欠損細胞株であるT2細胞に外来性に結合させた細胞を陽性コントロール、HIV由来ペプチド（HIVA2）を結合させた細胞を陰性コントロールとして、抗原特異性を評価した。C.内在性にHSP105を発現するがん細胞株を標的とし、細胞傷害活性を評価した。Caski細胞およびSiHa-A２細胞はHSP105陽性、SW620細胞株およびHepG2細胞株はHSP105陰性細胞株として用いた。11B9クローンの細胞傷害活性は未評価。
＜結果＞
　HSP105のペプチドワクチンを受けたHLA-A2ハプロタイプを持つ患者から、HSP105ペプチド反応性を持つT細胞クローンを樹立した。HLA-A2-HSP105デキストラマーは、染色性が不十分であり、デキストラマー染色による反応性クローンの検出が困難であったため、本検討では、あらかじめペプチドで刺激培養した患者末梢血単核球を、再度、ペプチド存在下でA2発現K562細胞株と共培養し、抗原を認識し脱顆粒を示す（脱顆粒を示した場合、通常、細胞内に存在するCD107a分子が細胞表面に露出することを利用した脱顆粒評価法による）T細胞をソーティングにより分取し、反応性T細胞クローンを樹立した。樹立した５つのT細胞クローンの抗原特異的ＩＦＮ－γ産生能を評価したところ、いずれのクローンでもペプチド存在下でHLA-A2 T2細胞との共培養によりＩＦＮ－γ産生を認めたが、特に7B9, 10G7, 10C9は強いＩＦＮ－γ産生能を示した。11B9クローンについては、他のクローンに比較し、顕著に反応性が低かったことから、7B9, 8D4, 10G7ならびに10C9について、続いて細胞傷害性テストを実施した。これら４つのクローンのいずれも、ペプチドを外来性に結合させたT2細胞に対し傷害活性を示し、特に7B9、8D4クローンは強い傷害活性を示した。さらに、内在性にHSP105を発現するこれらクローンのがん細胞株に対する細胞傷害活性を評価した結果、7B9, 10G7ならびに10C9クローンは、CasKi細胞株に対していずれも有意な細胞傷害活性を示した。SiHaA2ならびにSW620細胞株に対する傷害活性は、HSP105陰性HepG2細胞株と比較し、有意な細胞傷害活性は認められなかった。8D4、11B9クローンについては、未実施であり、今後、再評価を行う。表に、各クローンから単離したアミノ酸配列ならびにTCR遺伝子の遺伝子配列を示した。
　図６１は、ヒトHLA遺伝子導入マウスを用いたペプチド反応性TCR遺伝子の同定を示す。
　図６１のA.およびBは、ヒトHLA遺伝子導入マウスへのペプチドワクチンとその脾臓のおけるペプチド反応性の評価を示す。候補となるがん抗原由来ペプチド 50ugをアジュバントとしてpolyI:CLCと混合し、マウスの尾根部皮内に１週おきに３回投与を行った。その後、脾臓を摘出し、in vitroでワクチンに用いたペプチドを添加し、20時間培養し、抗原特異的ＩＦＮ－γ産生をELISPOT法により検出した。
　図６１のCは、ペプチド反応性TCR遺伝子の単離とレポーターアッセイによる抗原反応性の評価を示す。ワクチンを行ったマウスの脾臓を抗原ペプチドならびに抗CD107a抗体存在かで、4時間培養し、脱顆粒を起こした細胞(CD107a陽性細胞）を、単一細胞ソーティングし96 wellプレートに回収した。回収した細胞から、逆転写およびTCR特異的プライマーを用いて、TCR遺伝子を増幅し、それぞれのTCR遺伝子を組み込んだTAPフラグフラグメントを構築した。構築した各TCR遺伝子のTAPフラグメントと、NFAT転写因子反応性ルシフェラーゼ発現ベクターをJurkat細胞に遺伝子導入した。16時間培養後、遺伝子導入したJurkat細胞と抗原ペプチドを外来性に結合させたHLA-A24発現COS-7細胞を共培養し、再構築したTCRからの刺激依存的なルシフェラーゼの発現をルシフェラーゼアッセイにて測定した。図は、富山大学の浜名らの論文より抜粋した（Biochem Biophys Res Commun. 2016, 10;474(4):709-714.)。
　図６１のDは、ヒトHLA遺伝子導入マウスより単離したEPHB4ペプチド反応性TCRの反応性評価を示す。作製したTCR発現Jurnakt細胞を用いてEPHB4由来ペプチドに対する反応性をルシフェラーゼ活性(RLU)として示した。陽性コントロールとして、既知のNY-ESO-1ペプチド特異的TCR(1G4 TCR)を用いた。EPHB4ペプチドを結合させたCos-7細胞と共培養した場合を白(□）で、NY-ESO-1ペプチドを結合させたCos-7細胞と共培養した場合を黒(■）で示した。
＜結果＞
　これまでに、本課題では、ヒトHLA遺伝子導入マウスを用いることで、新規がん抗原関しても、ハイスループットにエピトープペプチドの同定が可能であることを示した。同様に、ヒトHLA遺伝子導入マウスを用いることで、新規がん抗原を認識するTCR遺伝子を同定可能か検討する目的で、EPHB4由来ペプチドをアジュバントと共にHLA-A24Tgマウスに繰り返し免疫し、ペプチド応答性CD8T細胞を誘導した後、脾臓より、シングル細胞ソーティングによりEPHB4反応性TCR遺伝子の単離を行った。ワクチンしたマウスの脾細胞を、in vitroでペプチド存在下で再刺激し、脱顆粒を起こしCD107a陽性となったT細胞をソーティングにより回収した。これまでのT細胞クローンの樹立では、再度、フィーダー細胞存在下で培養しT細胞クローンを樹立してきたが、増殖が安定するには時間がかかり、必ずしもソーティングしたすべての細胞から樹立できるわけではない。そこで、富山大学の浜名らが開発した、ハイスループットのシングル細胞からのTCR遺伝子の検出ならびに機能評価法を導入した。浜名らの方法では、ソーティングした細胞を再培養するのではなく、直接PCR法によりTCR遺伝子を増幅単離し、ギブソンアッセンブリにより単離したTCR遺伝子を遺伝子発現プロモーターを含む直鎖DNAに連結し、TCR遺伝子発現ベクターを構築し、構築したTCR遺伝子発現ベクターをT細胞リンパ腫由来のJurkat細胞株に遺伝子導入しTCR分子を再構築し、その反応性を評価する。培養を行わないことで、短期間にソーティングした細胞をロストすることなく、評価が可能である。ソーティングによりワクチンしたマウスの脾細胞より単離したCD107a陽性Ｔ細胞、39個のうち、21細胞について、そのTCR遺伝子を同定することができ、同じTCR遺伝子を省いた8つのT細胞のTCR遺伝子を再構築し、その抗原反応性を評価した。TCRを再構築したJurkat細胞株には、あらかじめTCRシグナル下流で活性化する転写因子NFATによりルシフェラーゼ遺伝子発現が誘導されるレポーター遺伝子が組み込まれており、再構築したTCR分子が抗原を認識した場合、その活性化シグナルの強さに依存したルシフェリンルシフェラーゼ反応による発光を測定することで、反応性を定量的に評価することができる。EPHB4由来ペプチドまたは、NY-ESO-1由来ペプチド存在下で、TCRを再構築したJurkat細胞の反応性を評価したところ、８つのTCR遺伝子のうち７つで、EPHB4ペプチドに対する反応性が認められ、TCR_07遺伝子では最も強い抗原特異的反応性を確認することができた。表に、各クローンから単離したアミノ酸配列ならびにTCR遺伝子の遺伝子配列を示した。
　図６２は、エレクトロポレーション法による共通がん抗原（FOXM1)を認識するTCR-T細胞の作製を示す。
　図６２のAは、エレクトロポレーション法によるTCR-T細胞作製。末梢血単核球を抗CD3抗体とIL2存在下で培養した後、TCRの定常領域に特異的なsgRNAをCas9タンパク質と共にエレクトロポレーション法により導入し、内在性TCRの欠損したT細胞(TCR DKO donor cells)を作製した。培養した後、続いて、TCRα鎖遺伝子とTCRβ鎖遺伝子をP2A配列で連結した一本鎖TCR遺伝子のmRNAをエレクトロポレーション法により導入し、TCR-T細胞を作製した。
　図６２のBは、作製したTCR-T細胞の細胞表面におけるTCR分子の発現を示す。作製したTCR-T細胞を抗CD３抗体ならびに抗TCRαβ抗体で染色し、細胞表面におけるTCR分子の発現を評価した。ヒストグラムに、それぞれCD3およびTCRαβ分子の細胞表面における発現を示した（赤：TCR-T細胞、青：Donor cells)。
　図６２のCは、作製したTCR-T細胞の抗原刺激によるＩＦＮ－γ産生を示す。作製したTCR-T細胞を外来性にがん抗原ペプチド(FOXM1 pep.)を結合させたT2-A24細胞と20時間共培養し、ＩＦＮ－γ産生をELISPOT法にて検出した。
＜結果＞
　同定したがん抗原反応性TCR遺伝子を再構築したTCR-T細胞の構築を行った。本課題では、TCRのα鎖とβ鎖をP2A配列を介して連結した人工一本鎖TCR遺伝子を合成し合成した人工遺伝子よりin vitro転写により作製したTCR mRNAを、エレクトロポレーション法により、抗CD3抗体で刺激培養した末梢血由来CD8陽性T細胞に導入した。また、内因性TCR分子をあらかじめCRISPR-Cas9システムによりノックアウトすることで、外来性に導入、再構築したTCR分子のみが細胞表面に高効率で発現する。これまでに同定したFOXM1特異的TCR遺伝子について検討を行ったところ、F5, (21)1D5ならびに1F5クローンのいずれのTCRも細胞表面に高発現することを確認した。また、作製したTCR-T細胞の抗原反応性をＩＦＮ－γ産生を指標に評価したところ、期待通り、どのTCR-T細胞もFOXM1由来ペプチドに対して強い反応性を示した。1F5クローンのTCRは、発現は十分であるが、その他の2つに比較し反応性が低く、(21)1D5が最も高い反応性を示したいことから、これらのFOXM1反応性TCRのうち(21)1D5クローンのTCR遺伝子が最も有望であることがわかった。今後、このような方法で、取得したTCR遺伝子の抗原特異性や、TCR-T細胞療法での有用性を評価する。
　図６３は、がんの多様性を克服するカクテルTCR-T細胞の開発スキームを示す。10種類のがん抗原のエピトープペプチドのライブラリを構築し、それらのペプチドを用いたがんワクチンを受けたがん患者の末梢血や、ペプチドを繰り返しワクチンしたヒトHLA遺伝子導入マウスからと、それらのペプチドを特異的に認識するHLA-A2またはA24拘束性TCR遺伝子を単離し、がん抗原特異的TCRライブラリを構築する。各がん抗原の発現をスクリーニングし、ペプチドワクチンに対する反応性をテストした後、複数のがん抗原ペプチドに対し、それぞれ特異的なTCR遺伝子を選択しTCR-T細胞を作製する。作製した複数のがん抗原特異的TCR-T細胞を、混合し”カクテルTCR-T細胞“製剤として投与することで、がんの多様性に対して有効なＴ細胞療法が確立できる。
＜結果＞
　10種類のがん抗原のエピトープペプチドを同定しがん抗原ペプチドライブラリを構築することでオフザシェルフのがんペプチドワクチンが可能となるばかりでなく、同時にそれらのペプチドを認識する強力なTCRを同定しがん抗原特異的TCRライブラリを作製することで、複数のがん抗原を標的としたがんの多様性による免疫回避を打破する”カクテルTCR-T細胞“療法が実現可能となる。
実施例１２：膜タンパク共通がん抗原を標的とするCAR-T細胞療法、カクテルCAR-T細胞療法の開発
＜方法＞
　図６４(a) CAR-T細胞のin vitroにおける細胞傷害性評価には横紋筋肉腫細胞株Rh30と肝内胆管癌細胞株SSP25をターゲット細胞として使用した。細胞株に10 μg/ml 濃度のCalcein-AM (Dojindo)を添加し、37℃で30分間静置して染色した。エフェクター細胞となる EPHB4 CAR-T細胞と染色したターゲット細胞を、 96well Half Area, Flat Bottom プレート(Corning)内で、E/T = 1、E/T = 3 、E/T = 10 、あるいはE/T = 30の割合で 4-6 時間共培養し、培養前と培養後の蛍光値を Terascan VPC2(Minerva Tech) を用いて測定した。Calceinの自然遊離は、不活化 PBMC（80 ℃に設定したヒートブロックで 15 分以上加熱）をエフェクター細胞の代わりに共培養した。同様に最大遊離は、不活化PBMCにIGEPAL CA-630(MP Biomedicals)（NonidetP-40同等物質）を 6%の濃度で加えたものを使用した。細胞傷害率は、以下の計算方法で算出した。
傷害率(%)=実験群の遊離量－実験群の自然遊離量)/(実験群の最大遊離量－実験群の自然遊離)x100
(b) GPC3 CAR-T細胞は作製したGC33 CAR γδT細胞をエフェクター細胞として使用した。この細胞は中外・ロシュグループが開発したGPC3に対する特異的な抗体GC33由来のCARを発現させるレトロウイルスベクターを使用し、ゾレドロン酸刺激培養6日目の健常人PBMCにCARを導入し、陽性細胞のシングルセルソーティングにより、CAR発現Vg9陽性γδT細胞のクローンを作製した。ターゲット細胞にはGPC3を発現しない肝癌細胞株SK-Hep-1細胞株にヒトGPC3全長配列遺伝子(hGPC3)を強制発現した細胞株SK/hGPC3、ネガティブコントロールとしてemptyベクターで形質転換を行った細胞株(SK/vec)を用いた。 ターゲット細胞のCalcein染色、傷害率の算出は上述と同様の方法で行った。
(c) (a), (b)同様の方法で細胞を染色し、計測を行った。ターゲット細胞として免疫不全マウスにて維持・腫大させたPDXを摘出し、組織を剪刀で可能な限り裁断後Tumor Dissociation Kit, human（Miltenyi Biotec）で分散させた後、赤血球の除去処理を行い使用した。
(d)(c)と同様に調整したPDX由来細胞とEPHB4 CAR-T細胞もしくは予めPHA刺激で活性化させたblast細胞を共培養後、CD8陽性細胞中のCD107a陽性細胞をフローサイトメトリー解析した。
　図６５(a) PDXモデルはSCID/Beigeマウス（大腸がん肝転移PDX）、及びNSGマウス（頭頸部がんPDXモデル）に5mm角に調整した各PDXを移植し作製した。腫瘍の大きさはノギスを使用し、長径並びに短径を計測し面積(b)もしくは体積(d)として算出した。(c), (e)免疫組織学的解析は前述に倣ってFFPE薄切標本を作製した。端的に、各臓器採材後、4%PFAに18-24ｈ浸透後、PFAをPBS(-)で洗浄。70％エタノールに一晩以上浸透後、パラフィン包埋し、パラフィンブロックを作製した。ブロックを4μmに薄切後スライドガラスに貼り付け、乾燥後、各染色を行った。DAB染色は一次抗体に適したポリマー試薬（ポリマー試薬：EnVision+ System- HRP Labelled Polymer Anti-RabbitもしくはEnVision+ System- HRP Labelled Polymer Anti-Mouse)並びに、発色試薬（Liquid DAB+ Substrate Chromogen System）を使用した。ヘマトキシリンでの対比染色を行った後、標本はNanoZoomer (Hamamatsu Photonics K.K.)によりバーチャルスライド化した。多重蛍光免疫組織化学染色も上記方法に準じ、各抗原に対する抗体EPHB4 (Cell Signaling Technology社)、ヒトCD8 (Leica Biosystems社)、CD3 (abcam社)、Cleaved Caspase-3 (Cell Signaling Technology社)、二次抗体としてポリマー試薬（EnVision+ System- HRP Labelled Polymer Anti-RabbitもしくはEnVision+ System- HRP Labelled Polymer Anti-Mouse）、蛍光色素にOpal 520, 540, 570, 620, 650, 690(AKOYA BIOSCIENCES社)を使用しVectra3(PerkinElmer)で観察した。
＜結果＞
　図６４は、 CAR-T細胞によるin vitro 細胞傷害性評価を示す。
(a) EPHB4 CAR-T細胞によるEPHB4陽性腫瘍細胞株の細胞傷害。EPHB4を発現する横紋筋肉腫細胞株（Rh30）と肝内胆管癌細胞株（SSP25）のいずれに対してもE:T比依存的に細胞傷害性が上がることが確認された。
(b) GPC3 CAR-Tによる細胞傷害性の評価。GPC3 CAR-T細胞はヒトGPC3全長配列遺伝子(hGPC3)を強制発現した細胞株SK/hGPC3に対し、E:T比依存的に細胞傷害性が上がった。
(c)EPHB4 CAR-T細胞によるEPHB4陽性PDX細胞の細胞傷害。EPHB4 CAR-T細胞をエフェクター細胞、PDX細胞をターゲット細胞とし、各E:T比で8時間反応後の細胞傷害率を比較した。E:T比を上げることで細胞傷害率が上がり、E/T = 10のとき最も強い細胞傷害率を示した。右側のパネルはE/T = 10のときの検鏡写真を表す。
(d)EPHB4 CAR-T細胞のEPHB4陽性PDX細胞による細胞傷害応答の確認。EPHB4 CAR-T細胞及びPHA刺激による活性化blast細胞をそれぞれEPHB4陽性PDX細胞と共培養し、抗原を認識し脱顆粒を示すCD107a分子の細胞表面への露出を測定した。EPHB4 CAR-T細胞においてのみCD107aの露出が認められたため抗原特異的に細胞傷害性活性が誘導されたことがわかった。
　図６５は、CAR-T細胞によるin vivo 細胞傷害性評価を示す。
(a) EPHB4陽性PDX移植によるモデル動物の作製（大腸がん肝転移・頭頸部がん ）。各モデルPDX移植後7日にEPHB4 CAR-T細胞を移入し、更に翌日（大腸がん肝転移モデル）/翌々日（頭頸部がんモデル）に追加移入した。コントロール群は生理食塩水を移入した。
(b)大腸がん肝転移PDXモデルの腫瘍サイズ（面積）の変化。CAR-T細胞移入群で腫瘍の腫大が抑制された。(c)大腸がん肝転移PDXモデルのPDX領域におけるEPHB4の発現確認。CAR-T細胞移入後6日で腫瘍部(PDX)を採取後、FFPE薄切サンプルにてEPHB4の発現をDAB染色で確認。CAR-T細胞移入群でEPHB4の消失が認められた。(d)頭頸部がんPDXモデルの腫瘍サイズ（面積）の変化。CAR-T細胞移入群で腫瘍の腫大が抑制された。(e) 頭頸部がんPDXモデルにおけるPDX領域の免疫組織学的解析。右下のパネル以外はDAB染色とヘマトキシリン染色による評価。CAR-T細胞移入群でhCD3, hCD8がday15でも確認でき、CAR-T細胞の存在が示唆された。また、移入群ではEPHB4の発現が消失しており、アポトーシスのマーカーである活性化型カスパーゼ3（C-Caspase3）の発現もコントロールと比較し、強く確認できた（上パネル）。左下パネルでは、hCD8が確認された領域でEPHB4の発現が低下しており、多重免疫組織染色を行った右下パネルでもC-Caspase3の発現が確認された（＊部）
　図６６は、カクテルCAR-T治療の開発を示す。
　我々は5種類の膜蛋白共通がん抗原のいずれかがほとんどのがん組織に発現していることを利用し、複数のCAR分子を発現するカクテルCAR-T細胞を作製し、組み合わせや割合を至適化したカクテルCAR-T治療の開発を目指す。これにより、がんの不均一性や患者間の相違などの問題に対し多面的に対応することが出来、効果的・効率的ながんの増殖抑制やT細胞の浸潤などを誘導できる。
実施例１３：様々ながん細胞株における膜タンパク共通がん抗原の発現解析・膜タンパク共通がん抗原に対する抗体を利用した血中循環がん細胞検出によるがんの発症リスク診断法の開発
＜方法＞
　肝細胞がん細胞株(HepG2, Hep3B, HuH-7, PLC/PRF/5, JHH-2, JHH-4, JHH-5, JHH-6, JHH-7), 肝内胆管がん細胞株(RBE, SSP-25), 大腸がん細胞株(HCT116, Lovo, colo201, HT29, WiDr, SW480, CaCO2), 膵がん細胞株(Panc1, AsPC1, PK1, PK9), 肺がん細胞株(RERF-LC-AI, LK-2, II-18, A549, LU99, H1975, Lu-135, NCI-H446), 乳がん細胞株(MDA-MB-231, MCF7), 子宮頸がん細胞株(HeLa), 卵巣がん細胞株(KOC-7C, NOY1, NOY2, RMG-II, RMUG-S), 腎細胞がん細胞株(Caki-1, ACHN, RCC7), 悪性黒色腫細胞株(A375ml, SKmel23), 口腔がん細胞株(SAS, Ca9-22, HSC2, HSC3), 胃がん細胞株(MKN74, MKN45, KATO-3), リンパ腫細胞株(Raji, K562)を0.05% Trypsin-EDTAで剥がした後、FACS buffer (PBS+2%FCS)中でFc block (BD Biosciences, 10倍希釈)で20分間処理し、さらに、PE標識抗EpCAM抗体(Miltenyi, 100倍希釈)、PE標識抗Cell-Surface Vimentin (CSV)抗体(Abnova, clone:84-1, 100倍希釈)、APC標識抗ヒトGPC3抗体(Sino Biological,clone:024, 10倍希釈)、AF647標識抗ヒトROBO1抗体(R&D, clone:770502, 50倍希釈)、AF647標識抗ヒトClaudin-1抗体(R&D, clone:421203, 25倍希釈)、AF647標識抗ヒトEphB4抗体(Miltenyi, clone:REA923, 50倍希釈)のそれぞれで20分間染色し、FACS Canto (BD Biosciences)で解析した。
＜結果＞
　上記の結果を図６７及び図６８に示す。
　肝細胞がん細胞株HepG2は、EpCAM、CSVに加えて、4種類の膜蛋白共通がん抗原GPC3、ROBO1、CLDN1、EPHB4の全てを発現していた。
　様々ながん種由来の50種類の細胞株をこれらの抗原に対する抗体で染めたところ、従来のCTCマーカーであるEpCAMやCSVがほとんど発現していない7種類の細胞株は4種類の膜蛋白共通がん抗原GPC3、ROBO1、CLDN1、EPHB4のいずれかを細胞膜に発現していた。このことは、従来のCTCマーカーでは逃していたCTCを、これら4種類の膜蛋白共通がん抗原の併用によって捉えられる可能性を示している。
＜方法＞
　腫瘍摘出手術の3日後の肝細胞がん患者から、EDTA-2K採血管を用いて約5mLの末梢血を採取した。PBSに懸濁した肝細胞がん細胞株HepG2および大腸がん細胞株HCT116に、PBSで0.1ug/mLとしたCalcein-AM (DOJINDO)を1/2体積量加え、37℃で15分間標識させた。Calcein標識されたHepG2およびHCT116を1x10^3個ずつ、患者末梢血の半分に添加した。がん細胞株を添加した末梢血および未添加末梢血に、3倍体積量のRBC lysis buffer (G BIOSCIENCES)を加え、室温で10分間溶血させた。残った細胞を1mLのMACS Buffer (PBS+0.5%BSA+2mM EDTA)に懸濁し、250uLのCD45 Dynabeadsと250uLのCD15 Dynabeadsを加えて4℃で1時間攪拌後、磁石によりCD45陽性細胞およびCD15陽性細胞を除去した。残った細胞を、PBSで1200倍希釈したzombie-NIRで室温15分染色後、FACS buffer中でFc block (BD Biosciences, 10倍希釈)で20分間処理し、さらに、PerCP標識抗CD45抗体(Miltenyi, 50倍希釈)、PE標識抗EpCAM抗体(Miltenyi, 100倍希釈)、PE標識抗Cell-Surface Vimentin (CSV)抗体(Abnova, 100倍希釈)、APC標識抗ヒトGPC3抗体(Sino Biological, 10倍希釈)、AF647標識抗ヒトROBO1抗体(R&D, 50倍希釈)、AF647標識抗ヒトClaudin-1抗体(R&D, 50倍希釈)、AF647標識抗ヒトEphB4抗体(Miltenyi, 50倍希釈)、Hoechst33342(DOJINDO, 30ug/mL)で20分間染色し、FACS Melody (BD Biosciences)で解析した。
＜結果＞
　上記の結果を図６９に示す。
　肝細胞がんや大腸がんの複数の症例で、切除手術の術前あるいは術後(1日目あるいは3日目)の採血検体5-10mL中に、従来のCTCマーカーであるEpCAMもCSVも発現せずに、4種類の膜蛋白質共通がん抗原GPC3、ROBO1、CLDN1、EPHB4のいずれかを細胞膜に発現しているCTC様細胞を検出できたことから、従来のCTCマーカーに加えてGPC3、ROBO1、CLDN1、EPHB4を加えることによってCTC様細胞の検出感度が増加することが示された。

Claims (29)

  1. （１）ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、およびＬＡＴ１から選択される３種以上を含む共通がん抗原；
    （２）前記３種以上の共通がん抗原の部分ペプチドであってＣＴＬ誘導能を有する部分ペプチド；
    （３）前記部分ペプチドで刺激した樹状細胞；または
    （４）前記共通がん抗原または前記部分ペプチドをコードするｍＲＮＡ
    を含む、がんワクチン。
  2. 前記共通がん抗原が、ＡＦＰ、ＴＧＦＢＩ、ＳＰＡＲＣ、ＨＳＰ１０５α、およびＦＯＸＭ１のうちの１種以上をさらに含む、請求項１に記載のがんワクチン。
  3. 前記共通がん抗原が、ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、およびＬＡＴ１の全てを含む、請求項１に記載のがんワクチン。
  4. 前記共通がん抗原が、ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、ＬＡＴ１、ＡＦＰ、ＴＧＦＢＩ、ＳＰＡＲＣ、ＨＳＰ１０５α、およびＦＯＸＭ１の全てを含む、請求項１に記載のがんワクチン。
  5. 前記部分ペプチドが、配列番号１から８０の何れかに記載のアミノ酸配列を有するペプチドである、請求項１から４の何れか一項に記載のがんワクチン。
  6. （１）ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、ＬＡＴ１、ＡＦＰ、ＴＧＦＢＩ、ＳＰＡＲＣ、ＨＳＰ１０５α、およびＦＯＸＭ１から選択される３種以上を含む共通がん抗原；
    （２）前記３種以上の共通がん抗原の部分ペプチドであってＣＴＬ誘導能を有する部分ペプチド；
    （３）前記部分ペプチドで刺激した樹状細胞；または
    （４）前記共通がん抗原または前記部分ペプチドをコードするｍＲＮＡ
    を含む、がんワクチン。
  7. 配列番号５、７～１０、１４～２２、２４～３８、４０、４２、４８、４９、５２～８０の何れかに記載のアミノ酸配列を有するペプチド。
  8. ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、およびＬＡＴ１から選択される３種以上を含む共通がん抗原に対するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有するＴ細胞の混合物を含む、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法剤。
  9. 前記共通がん抗原が、ＡＦＰ、ＴＧＦＢＩ、ＳＰＡＲＣ、ＨＳＰ１０５α、およびＦＯＸＭ１のうちの１種以上をさらに含む、請求項８に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞療法剤。
  10. 前記共通がん抗原が、ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、およびＬＡＴ１の全てを含む、請求項８に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞療法剤。
  11. 前記共通がん抗原が、ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、ＬＡＴ１、ＡＦＰ、ＴＧＦＢＩ、ＳＰＡＲＣ、ＨＳＰ１０５α、およびＦＯＸＭ１の全てを含む、請求項８に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞療法剤。
  12. ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、ＬＡＴ１、ＡＦＰ、ＴＧＦＢＩ、ＳＰＡＲＣ、ＨＳＰ１０５α、およびＦＯＸＭ１から選択される３種以上を含む共通がん抗原に対するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有するＴ細胞の混合物を含む、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法剤。
  13. ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、およびＬＡＴ１のうちの３種以上を含む共通がん抗原由来のＭＨＣクラスＩ結合性抗原ペプチドを認識できるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＴ細胞の混合物を含む、ＴＣＲ－Ｔ細胞療法薬。
  14. 前記共通がん抗原が、ＡＦＰ、ＴＧＦＢＩ、ＳＰＡＲＣ、ＨＳＰ１０５α、およびＦＯＸＭ１のうちの１種以上をさらに含む、請求項１３に記載のＴＣＲ－Ｔ細胞療法剤。
  15. 前記共通がん抗原が、ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、およびＬＡＴ１の全てを含む、請求項１３に記載のＴＣＲ－Ｔ細胞療法剤。
  16. 前記共通がん抗原が、ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、ＬＡＴ１、ＡＦＰ、ＴＧＦＢＩ、ＳＰＡＲＣ、ＨＳＰ１０５α、およびＦＯＸＭ１の全てを含む、請求項１３に記載のＴＣＲ－Ｔ細胞療法剤。
  17. ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、ＬＡＴ１、ＡＦＰ、ＴＧＦＢＩ、ＳＰＡＲＣ、ＨＳＰ１０５α、およびＦＯＸＭ１のうちの３種以上を含む共通がん抗原由来のＭＨＣクラスＩ結合性抗原ペプチドを認識できるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＴ細胞の混合物を含む、ＴＣＲ－Ｔ細胞療法薬。
  18. Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が、
    配列番号１０３のタンパク質と配列番号１０４のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    配列番号１０５のタンパク質と配列番号１０６のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    配列番号１０７のタンパク質と配列番号１０８のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    配列番号１０９のタンパク質と配列番号１１０のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    配列番号１１１のタンパク質と配列番号１１２のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    配列番号１２３のタンパク質と配列番号１２４のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    配列番号１２５のタンパク質と配列番号１２６のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    配列番号１２７のタンパク質と配列番号１２８のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    配列番号１２９又は１３０のタンパク質と配列番号１３１のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    配列番号１３２のタンパク質と配列番号１３３のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    配列番号１３４のタンパク質と配列番号１３５のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    配列番号１３６のタンパク質と配列番号１３７のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    配列番号１３８又は１３９のタンパク質と配列番号１４０のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    配列番号１４１のタンパク質と配列番号１４２のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    配列番号１４３のタンパク質と配列番号１４４のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    配列番号１４５のタンパク質と配列番号１４６のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    配列番号１４７のタンパク質と配列番号１４８のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    配列番号１７７のタンパク質と配列番号１７８のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    配列番号１７９のタンパク質と配列番号１８０のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    配列番号１８１のタンパク質と配列番号１８２のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    配列番号１８３のタンパク質と配列番号１８４のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    配列番号１９３のタンパク質と配列番号１９４のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    配列番号１９５のタンパク質と配列番号１９６のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    配列番号１９７のタンパク質と配列番号１９８のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    配列番号１９９又は２００のタンパク質と配列番号２０１のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    配列番号２０２のタンパク質と配列番号２０３のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    配列番号２１６のタンパク質と配列番号２１７のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；または
    配列番号２１８のタンパク質と配列番号２１９のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    の何れかである、請求項１３から１７の何れか一項に記載のＴＣＲ－Ｔ細胞療法剤。
  19. 配列番号１０３～１１２、１２３～１４８、１７７～１８４、１９３～２０３、２１５～２１９の何れかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
  20. 配列番号１０３のタンパク質と配列番号１０４のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    配列番号１０５のタンパク質と配列番号１０６のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    配列番号１０７のタンパク質と配列番号１０８のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    配列番号１０９のタンパク質と配列番号１１０のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    配列番号１１１のタンパク質と配列番号１１２のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    配列番号１２３のタンパク質と配列番号１２４のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    配列番号１２５のタンパク質と配列番号１２６のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    配列番号１２７のタンパク質と配列番号１２８のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    配列番号１２９又は１３０のタンパク質と配列番号１３１のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    配列番号１３２のタンパク質と配列番号１３３のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    配列番号１３４のタンパク質と配列番号１３５のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    配列番号１３６のタンパク質と配列番号１３７のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    配列番号１３８又は１３９のタンパク質と配列番号１４０のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    配列番号１４１のタンパク質と配列番号１４２のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    配列番号１４３のタンパク質と配列番号１４４のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    配列番号１４５のタンパク質と配列番号１４６のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    配列番号１４７のタンパク質と配列番号１４８のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    配列番号１７７のタンパク質と配列番号１７８のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    配列番号１７９のタンパク質と配列番号１８０のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    配列番号１８１のタンパク質と配列番号１８２のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    配列番号１８３のタンパク質と配列番号１８４のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    配列番号１９３のタンパク質と配列番号１９４のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    配列番号１９５のタンパク質と配列番号１９６のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    配列番号１９７のタンパク質と配列番号１９８のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    配列番号１９９又は２００のタンパク質と配列番号２０１のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    配列番号２０２のタンパク質と配列番号２０３のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    配列番号２１６のタンパク質と配列番号２１７のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；または
    配列番号２１８のタンパク質と配列番号２１９のタンパク質との組み合わせからなるヘテロダイマー；
    の何れかである、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）。
  21. 配列番号１１３～１２２、１４９～１７６、１８５～１９２、２０４～２１４、２２０～２２４の何れかの塩基配列を有する遺伝子。
  22. 対象者由来の試料におけるＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、およびＬＡＴ１のうちの３種以上の発現の有無、およびＨＬＡ　class Iの細胞膜発現を多重蛍光免疫染色により同時に測定する工程１、および上記発現の有無に基づいて、がんの免疫療法の適応を判定する工程２を含む、コンパニオン診断方法。
  23. 工程１において、さらにＡＦＰ、ＴＧＦＢＩ、ＳＰＡＲＣ、ＨＳＰ１０５α、およびＦＯＸＭ１のうちの１種以上の発現の有無を測定する、請求項２２に記載のコンパニオン診断方法。
  24. 工程１において、ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、およびＬＡＴ１の全ての発現の有無を測定する、請求項２２に記載のコンパニオン診断方法。
  25. 工程１において、ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、ＬＡＴ１、ＡＦＰ、ＴＧＦＢＩ、ＳＰＡＲＣ、ＨＳＰ１０５α、およびＦＯＸＭ１の全ての発現の有無を測定する、請求項２２に記載のコンパニオン診断方法。
  26. 対象者由来の血液試料における細胞について、ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、およびＬＡＴ１のうちの３種以上の発現を分析することを含む、がんの発症リスクの診断方法。
  27. さらにＡＦＰ、ＴＧＦＢＩ、ＳＰＡＲＣ、ＨＳＰ１０５α、およびＦＯＸＭ１のうちの１種以上の発現を分析することを含む、請求項２６に記載のがんの発症リスクの診断方法。
  28. ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、およびＬＡＴ１の全ての発現を分析する、請求項２６に記載のがんの発症リスクの診断方法。
  29. ＧＰＣ３、ＲＯＢＯ１、ＥＰＨＢ４、ＣＬＤＮ１、ＬＡＴ１、ＡＦＰ、ＴＧＦＢＩ、ＳＰＡＲＣ、ＨＳＰ１０５α、およびＦＯＸＭ１の全ての発現を分析する、請求項２６に記載のがんの発症リスクの診断方法。
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