WO2023221977A1

WO2023221977A1 - 一种硫酸软骨素生物多胺复合物、其制备方法及用途

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Publication number: WO2023221977A1
Application number: PCT/CN2023/094524
Authority: WO
Inventors: 朱小丰; 赵宇翔; 高凡博; 宋凤杰; 马晨阳; 朱星宇
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2022-05-18
Filing date: 2023-05-16
Publication date: 2023-11-23
Anticipated expiration: 2024-11-18
Also published as: JP2025516813A; US20250345439A1; EP4527392A1; KR20250011937A; AU2023273845B2; AU2023273845A1; CN116687959B; EP4527392A4; CN116687959A

Abstract

本发明公开了一种硫酸软骨素生物多胺复合物、其制备方法及用途。本发明提供了一种硫酸软骨素生物多胺复合物，其为硫酸软骨素和生物多胺的复合物，所述硫酸软骨素与生物多胺非共价连接，所述生物多胺包括精胺、亚精胺、腐胺和尸胺的一种、两种、三种或以上的组合。本发明的提供的硫酸软骨素生物多胺复合物具有显著优于普通硫酸软骨素钠的抗炎活性，可以用于炎性疾病，特别是关节炎和关节损伤的预防、治疗以及骨组织的修复中，并且具有降血脂、抗氧化、延缓衰老、延长寿命等功效。

Description

一种硫酸软骨素生物多胺复合物、其制备方法及用途

优先权和相关申请

本申请要求2022年5月18日提交的名称为“一种硫酸软骨素生物多胺、其制备方法及用途”的中国专利申请202210551251.3的优先权，该申请包括附录在内的全部内容作为参考并入本申请。

技术领域

本发明属于天然药物领域，具体涉及硫酸软骨素的提取，以及涉及一种硫酸软骨素生物多胺复合物、其制备方法及用途。

背景技术

硫酸软骨素(chondroitin sulfate,CS)是蛋白多糖(Proteoglycan)家族中的一大类组分，是动物性粘多糖中的代表物质，广泛存在于各种动物组织中，尤其在软骨和结缔组织中含量丰富。硫酸软骨素既为药品原料也为保健食品原料和化妆品原料，提取于动物的软骨组织，来源丰富，结构多样。硫酸软骨素可用于治疗关节炎、神经痛、神经性偏头痛等，对慢性肾炎、慢性肝炎、角膜炎以及角膜溃疡等有辅助治疗作用；对防治冠心病、心绞痛、心肌梗死等疾病也有一些研究报道。其中，硫酸软骨素对减轻关节炎引起的疼痛和症状、抑制病变进程有一定疗效。

然而，世界范围内，尽管关于硫酸软骨素的临床研究较多，但极少作为处方药用于骨组织相关疾病的治疗，这是因为其临床效果并不十分显著，且给药量较高，甚至有一些临床研究认为其几乎无效(引用文献3)。造成这一争议的重要原因在于，软骨素纯度、种类以及被实验人群存在差异，并且硫酸软骨素自身的生物活性十分有限，因此并不足以显现出稳定可靠的显著性差异。与此同时，硫酸软骨素作为一种生物来源多糖，具有极高的安全性，目前尚未发现明显的毒副作用。而其他大部分抗炎类药物普遍副作用较大，不宜长期使用。因此，如何大幅提高硫酸软骨素的生物活性，开发有效性强、安全性高的新型硫酸软骨素类物质具有十分重要的意义。

研究者们为了提高软骨素活性做了诸多努力。早些报道中发现低分子量硫酸软骨素能够降低粘度、提高组织渗透性、提升生物活性。最近也有报道对于例如低分子量硫酸软骨素的低分子量多糖进行了研究。其中，引用文献1公开了一种制备低分子量多糖的方法及其所用的催化剂，其采用金属固相催化剂的多糖降解方法，获得了低分子量的软骨素产品。引用文献2公开了低分子量硫酸软骨素在制备用于祛痘的外用制剂中的用途。然而，低分子量的硫酸软骨素总体而言对抗炎活性的提升有限，并且目前为止几乎未见到商品化的低分子量软骨素。

对于硫酸软骨素的制备方法，引用文献3提及目前的关于硫酸软骨素或包含其的混合物的制备方法所获得产物存在质量与功效不稳定的问题，甚至有副作用，主要原因是原料生物来源众多、生产工艺多样及分子结构差异大、分子量大小不同等。

因此，目前尽管研究者们为了提高硫酸软骨素活性做出了诸多尝试，然而稳定、高活性的硫酸软骨素或包括其的复合物，以及制备方法仍有待进一步研究。

在例如引用文献4和引用文献5的一些报道中，也采用了硫酸软骨素与多胺的组合，但是引用文献4中，硫酸软骨素与多胺的组合仅作为基质使用，并未研究复合物本身(药物)的生物活性。并且其组合物多胺占比较高，从而形成微米粒子，稳定性较差。而本申请形成的是一种水溶性复合物，具有很好稳定性。另外引用文献5虽然公开了多阴离子聚合物和亚精胺的超分子复合物，但没有研究过软骨素的分子量分布以及多胺的种类、蛋白质含量等对复合物活性的影响。

引用文献

引用文献1：CN111495428A

引用文献2：CN111110695A

引用文献3：Discrepancies in Composition and Biological Effects of Different Formulations of Chondroitin Sulfate.Molecules 2015,20,4277-4289

引用文献4：Poly-ion Complex of Chondroitin Sulfate and Spermine and Its Effect on Oral Chondroitin Sulfate Bioavailability.Chem.Pharm.Bull.2016,64,390–398

引用文献5：CN105797159A

发明内容

发明要解决的问题

如前所述，为了提高硫酸软骨素的药理活性，研究者们做了多方面尝试。早些报道中，低分子量硫酸软骨素能够降低粘度、提高组织渗透性、提升生物活性，但总体而言对抗炎活性的提升有限，并且目前为止几乎未见到商品化的低分子量软骨素，同时，也无稳定、高活性的硫酸软骨素或包括其的复合物的提取、制备方法。

发明人的研究发现，由于提取的条件、工艺等的不同，提取出的软骨素活性差异较大，部分软骨素表现出了显著优于其他软骨素的抗炎活性。进一步针对其结构进行研究后，本发明确认了这类软骨素的结构组成，证明是本发明提供的硫酸软骨素生物多胺复合物，抗炎活性远超普通软骨素。

因此，为解决上述问题，本发明提供了一种具有超高活性的硫酸软骨素生物多胺复合物及其制备方法，该硫酸软骨素生物多胺复合物能够大幅提高硫酸软骨素的抗炎(尤其是关节炎)活性，有望弥补骨关节炎临床治疗的空缺。同时也发现其具有降血脂、抗氧化、延缓衰老、延长寿命等功效。目前也尚无硫酸软骨素生物多胺复合物的超强抗炎活性，以及修复关节损伤、降血脂、抗氧化、延缓衰老、延长寿命等功效的报道。

用于解决问题的方案

在本发明的第一方面中，提供了一种硫酸软骨素生物多胺复合物，其为硫酸软骨素和生物多胺的复合物，所述硫酸软骨素与生物多胺非共价连接，所述生物多胺包括精胺、亚精胺、腐胺和尸胺的一种、两种、三种或以上的组合。

在一些实施方案中，所述的硫酸软骨素为酸形式的硫酸软骨素或者盐形式的硫酸软骨素。

在一些实施方案中，所述的硫酸软骨素，按照GPC积分比例，重均分子量在50000以上的硫酸软骨素的比例为0％。

在一些实施方案中，所述的硫酸软骨素，按照GPC积分比例，重均分子量在25000-50000的硫酸软骨素的比例在40％以下。

在一些优选的实施方案中，所述的硫酸软骨素，按照GPC积分比例，重均分子量在25000-50000的硫酸软骨素的比例在35％以下。

在一些更优选的实施方案中，所述的硫酸软骨素，按照GPC积分比例，重均分子量在25000-50000的硫酸软骨素的比例在30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％以下或0％。

在一些实施方案中，所述的硫酸软骨素，按照GPC积分比例，重均分子量在400-25000的硫酸软骨素的比例上限在80％以上、优选在81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上或100％；且，重均分子量在400-25000的硫酸软骨素的比例的下限在40％以上、优选在41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％或60％以上。

在一些实施方案中，所述的硫酸软骨素，按照GPC积分比例，重均分子量在400以下的硫酸软骨素的比例在15％以下，优选在3％以下，更优选在1％以下，最优选为0％。

在一些实施方案中，重均分子量上限在25000以下、优选在24000、23000、22000、21000、20000、19000、18000、17000、16000、15000、14000、13000、12000、11000、10000、9000或8000以下；且重均分子量下限在400、500、600、700或800以上的硫酸软骨素的比例上限在80％以上、优选在81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上或100％，下限在40％以上、优选在41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％或60％以上。

在一些实施方案中，所述的硫酸软骨素，按照GPC积分比例，重均分子量在400-10000的硫酸软骨素的比例为40％-100％，优选50％-100％、60％-100％、70％-100％、80％-100％。

在一些进一步优选的实施方案中，按照GPC积分比例，所述硫酸软骨素的分子量分布如下：重均分子量大于50000的硫酸软骨素的比例是0％，重均分子量在25000-50000的硫酸软骨素的比例为0-40％，重均分子量在400-10000的硫酸软骨素的比例、优选重均分子量在400-8000的硫酸软骨素的比例在40％-100％、重均分子量在400以下的硫酸软骨素的比例为15％以下。

在一些实施方案中，所述的硫酸软骨素生物多胺复合物的重均分子量在400～50000。

在一些优选的实施方案中，所述的硫酸软骨素生物多胺复合物的重均分子量在400～25000。

在所有实施方案中，重均分子量在25000-50000的硫酸软骨素的比例、重均分子量在400-25000的硫酸软骨素的比例、重均分子量在400以下的硫酸软骨素的比例之和为100％。

在一些实施方案中，按硫酸软骨素生物多胺复合物总重量计(g)，在所述硫酸软骨素生物多胺复合物中，含有的所述生物多胺在200μmol/g以下，优选在199μmol/g、198μmol/g、197μmol/g、196μmol/g、195μmol/g、194μmol/g、193μmol/g、192μmol/g、191μmol/g、190μmol/g、189μmol/g、188μmol/g、187μmol/g、186μmol/g、185μmol/g、184μmol/g、183μmol/g、182μmol/g、181μmol/g或180μmol/g以下；且，含有的所述生物多胺在0.5μmol/g以上，优选在0.6μmol/g、0.7μmol/g、0.8μmol/g、0.9μmol/g、1μmol/g以上。

在一些实施方案中，硫酸软骨素生物多胺复合物中蛋白的质量百分比小于8％，优选小于5％，更优选小于3％，最优选小于1％，进一步优选为0％。

本发明的第二方面中，提供了本发明第一方面中所述的硫酸软骨素生物多胺复合物的制备方法，所述的制备方法包括将硫酸软骨素和生物多胺混合的步骤，其中，按硫酸软骨素生物多胺复合物总重量计(g)，在所述硫酸软骨素生物多胺复合物中，含有所述生物多胺0.5-200μmol/g。

本发明的第三方面中，提供了本发明第一方面中所述的硫酸软骨素生物多胺复合物的制备方法，所述的制备方法包括将从原料中分离提取的含硫酸软骨素和多胺的提取液与乙醇混合的步骤，其中，所述提取液的pH值在4～6，所述提取液与乙醇的体积比为1：1～3。

在一些实施方案中，从原料中分离提取硫酸软骨素和多胺包括：

酶解或酸解的步骤，通过酶解或酸解将原料裂解，获得酶解液或酸解液；

分离提取硫酸软骨素和多胺的步骤，从所述酶解液或酸解液中同时或分步提取硫酸软骨素和多胺。

在一些实施方案中，对于分步提取硫酸软骨素和多胺，采用色谱法或萃取法将所述酶解液或酸解液中的多胺分离，并将分离多胺后剩余物经酶解法、蛋白沉淀法、色谱法、醇沉法中的一种或多种进行处理，以将剩余物中的硫酸软骨素分离；可选地，在将硫酸软骨素分离后，还包括将硫酸软骨素低分子化的步骤。

在一些实施方案中，对于同时提取硫酸软骨素和多胺，采用蛋白沉淀法，将所述酶解液或酸解液中蛋白沉淀，以分离硫酸软骨素和多胺。

在一些实施方案中，所述的原料包括动物组织、植物组织以及微生物培养发酵液。

本发明的第四方面中，提供了一种硫酸软骨素生物多胺复合物，其由本发明第二方面或第三方面中所述的制备方法制备获得。

本发明的第五方面中，提供了硫酸软骨素生物多胺复合物的下述(a)～(g)中任一用途：

(a)制备用于抗炎的药物中的用途；

(b)制备用于治疗和/或预防炎性疾病的药物中的用途；

(c)制备用于降血脂的药物中的用途；

(d)制备用于治疗和/或预防高脂血症的药物中的用途；

(e)制备治疗和/或修复关节损伤的药物中的用途；

(f)制备抗氧化的药物中的用途；

(g)制备延缓衰老和/或延长寿命的药物中的用途；

其中，所述的硫酸软骨素生物多胺复合物为本发明第一方面或第四方面中所述的硫酸软骨素生物多胺复合物和/或本发明第二方面或第三方面中所述的制备方法所制备获得的硫酸软骨素生物多胺复合物。

在一些实施方案中，所述炎性疾病包括炎症诱发因素导致的、和/或由炎症细胞、白介素和/或肿瘤坏死因子诱导的炎症，优选地，所述炎性疾病选自过敏症、湿疹、心肌梗死、脑硬死、阿尔兹海默症、皮肤炎或关节炎中的一种或多种。

在一些实施方案中，所述高脂血症包括原发性高脂血症和/或继发性高脂血症。

在一些实施方案中，所述高脂血症包括高甘油三酯血症和/或高胆固醇血症。

在一些实施方案中，所述高脂血症包括高脂血症相关病症，可选地，高脂血症相关病症包括心血管病，任选地，所述心血管病包括动脉硬化症、冠状动脉疾病、心绞痛、颈动脉疾病、中风、脑动脉硬化、心肌梗塞、脑梗塞、充气囊血管成形术后的再狭窄、高血压、间歇性跛行、异常脂血症、餐后脂血症和黄瘤中的一种或多种。

在一些实施方案中，所述关节损伤包括炎症、老化、运动、受伤造成的关节损伤。

本发明的第六方面中，提供了本发明第一方面或第四方面中所述的硫酸软骨素生物多胺复合物和/或本发明第二方面或第三方面中所述的制备方法所制备获得的硫酸软骨素生物多胺复合物在制备保健食品或化妆品中的用途。

本发明的第七方面中，提供了一种药物组合物、保健品或化妆品，其包含本发明第一方面或第四方面中所述的硫酸软骨素生物多胺复合物和/或本发明第二方面或第三方面中所述的制备方法所制备获得的硫酸软骨素生物多胺复合物。

发明的效果

本发明提供的硫酸软骨素生物多胺复合物具有显著优于普通硫酸软骨素钠的抗炎活性，可以用于炎性疾病，特别是关节炎和关节损伤的预防、治疗以及骨组织的修复中，并且具有降血脂、抗氧化、延缓衰老、延长寿命等功效。

附图说明

图1A为测试例1中不同组别小鼠血清中IL-6检测结果示意图。

图1B为测试例1中不同组别小鼠血清中IL-1β检测结果示意图。

图2A为测试例1中不同组别小鼠足趾肿胀度变化曲线示意图。

图2B为测试例1中不同组别小鼠足趾照片及解剖照片。箭头所示为表观炎症所出现的部位。

图3A为测试例2中不同组别大鼠足趾厚度数据示意图。

图3B为测试例2中不同组别大鼠足趾照片。箭头所示为表观炎症所出现的部位。

图4A至图4E为测试例2中不同组别大鼠血常规分析结果示意图；其中，图4A为淋巴细胞绝对值；图4B为淋巴细胞百分比；图4C为中性粒细胞绝对值；图4D为中性粒细胞百分比；图4E为白细胞绝对值。

图5A至图5C为测试例2中不同组别大鼠脏器指数测定结果示意图；其中，图5A为肝脏指数；图5B为脾脏指数；图5C为胸腺指数。

图6为测试例2中不同组别大鼠踝关节CT照片。

图7为测试例2中不同组别大鼠的踝关节CT局部放大图片。箭头所示为模型组的部分关节连接。

图8A至图8F为测试例2中不同组别大鼠CT结果示意图；其中，图8A为骨密度；图8B为骨表面积；图8C为骨体积；图8D为骨表面积与骨体积比值；图8E为骨小梁分离度；图8F为骨小梁的平局厚度。

图9A至图9D为测试例3中不同组别大鼠血脂检测结果示意图；其中，图9A为小鼠血清总胆固醇的水平；图9B为小鼠血清总甘油三酯的水平；图9C为小鼠血清低密度脂蛋白水平；图9D为小鼠血清高密度脂蛋白水平。

图10为测试例5中活性氧阳性细胞数示意图，左侧为对照组，右侧为CSX给药组。

图11为测试例6中CSX抗阿尔兹海默症相关炎症的活性检测结果示意图。

图12A至图12C为测试例7中CSX细胞水平抑制炎症反应的效果示意图，其中，图12A为IL-6；图12B为IL-1β；图12C为TNF-α。

图13为测试例8中CSX延缓衰老/延长寿命活性的结果示意图。

图14为实施例1中各提取物及现有软骨素对IL-6的抑制情况示意图。

图15为实施例1中提取物核磁氢谱图。

图16为实施例1中不同提取物中软骨素氢谱的局部放大图(化学位移3.0ppm)。

图17为实施例1中提取物中含有多胺成分的清液分离色谱图。

图18为实施例1中各类物质对IL-6的抑制情况示意图。

图19为实施例1中软骨素分子与多胺分子的结合作用力示意图。

图20为本发明硫酸软骨素生物多胺复合物的制备方法的流程示意图。

图21A和图21B为测试例8中CSX延缓黑腹果蝇衰老/延长寿命活性的结果示意图。

图22为测试例9中各类物质对IL-6的抑制情况示意图。

图23为测试例10中各类物质对IL-6的抑制情况示意图。

图24为测试例12中各类物质对IL-6的抑制情况示意图。

图25为测试例13中各类物质对IL-6的抑制情况示意图。

具体实施方式

以下，针对本发明的内容进行详细说明。以下所记载的技术特征的说明基于本发明的代表性的实施方案、具体例子而进行，但本发明不限定于这些实施方案、具体例子。需要说明的是：

本说明书中，使用“数值A～数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。

本说明书中，使用“基本上”或“实质上”表示与理论模型或理论数据的标准偏差在5％、优选为3％、更优选为1％范围以内。

本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。

本说明书中，“任选的”或“任选地”是指接下来描述的事件或情况可发生或可不发生，并且该描述包括该事件发生的情况和该事件不发生的情况。

本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。

本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。

在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

在本发明中，术语“重均分子量(Mw)”，其是一种相对分子量，按质量的统计平均分子量，在单位重量上平均得到的分子量，例如可以通过光散射法、凝胶色谱法等方法测定。在一些实施方案中，采用高效凝胶渗透色谱法测定重均分子量，标准物质为右旋糖酐分子量标准套(中国食品药品检定研究院)，测定硫酸软骨素/硫酸软骨素多胺的重均分子量。

在本发明中，术语“硫酸软骨素”(chondroitin sulfate,CS)是指具有不同分子量的不同硫酸酯化的糖胺聚糖类，其存在于各种动物组织中。CS的糖骨架是由重复地通过β-糖苷键(1→4)连接的二糖单元[4)-β-D-GlcA-(1→3)-β-D-GalNAc-(1→]构成。在本发明中，硫酸软骨素包括多糖的酸形式和成盐形式。

CS通常是一种混合物，陆地动物来源提取的CS主要由硫酸软骨素A(chondroitin sulfate A,CSA)和硫酸软骨素C(chondroitin sulfate C,CSC)构成。此外，海洋动物来源提取的CS还包括硫酸软骨素D(chondroitin sulfate D,CSD)、硫酸软骨素E(chondroitin sulfate E,CSE)等类型。在本发明中，CSA是指特征为普遍是CSA类型二糖单元[4)-β-D-GlcA-(1→3)-β-D-GalNAc4SO₃--(1→]的CS(硫酸基团在半乳糖的O-4上)。在本发明中，CSC是指特征为普遍是CSC类型的二糖单元[4)-β-D-GlcA-(1→3)-β-D-GalNAc6SO₃--(1→]的CS(硫酸基团在半乳糖的O-6位上)。CSD是指特征为普遍是CSD类型二糖单元[4)-β-D-GlcA2SO₃-(1→3)-β-D-GalNAc6SO₃--(1→]的CS(硫酸基团在葡萄糖醛酸的O-2和半乳糖的O-6位上)。CSE是指特征为普遍是CSE类型二糖单元[4)-β-D-GlcA-(1→3)-β-D-GalNAc4,6SO₃--(1→]的CS(硫酸基团在半乳糖的O-4，6位上)。

在本发明中，“GPC积分比例”是指使用GPC软件的切片功能，查看所测试的样品色谱图中的各分子量及对应的积分比例，从而得到各分子量范围对应的GPC积分比例。

在本发明中，术语“生物胺(biogenic amines,BA)”是一类具有生物活性、含氨基的低分子质量有机化合物的总称。可看作是氨分子中1-3个氢原子被烷基或芳基取代后而生成的物质，是脂肪族，脂族或杂环族的低分子量有机碱，常存在于动植物体内及食品中。根据生物胺的结构可将其分为三部分：腐胺(putrescine)、尸胺(cadaverin)、精胺(spermine)、亚精胺(spermidine)等脂肪族胺；酪胺(tyramine)、苯乙胺(phenylethylamine)等芳香族胺；组胺(histamine)、色胺(tryptamine)等杂环胺。按组成成分又可以将生物胺分为单胺和多胺(或称为生物多胺)，单胺包括组胺、酪胺、色胺、苯乙胺等，多胺包括尸胺、腐胺、精胺和亚精胺。

在本发明中，术语“预防”或“治疗”是指疾病或病症的获得或发展的风险的降低，即，使疾病的临床症状的至少一种在疾病发作之前易受疾病感染、或未暴露于致病原的受试者中不发展。例如，治疗可以包括：(i)在可能易患疾病、障碍和/或病症但尚未诊断患有所述疾病、障碍和/或病症的患者中预防所述疾病、障碍和/或病症；(ii)抑制所述疾病、障碍和/或病症，即阻止其发展；或(iii)减轻所述疾病、障碍和/或病症，即引起所述疾病、障碍和/或病症的消退。

在本发明中，术语“有效量”意指当施用到受试者用于治疗或预防疾病时足以实现这样的治疗或预防的化合物的量。“有效量”可取决于化合物、疾病及其严重度、以及待治疗的受试者的年龄、体重等改变。“治疗有效量”是指用于治疗性治疗的有效量。“预防有效量”是指用于预防性治疗的有效量。

在本发明中，术语“施用”是指使用本领域技术人员已知的任何各种方法和递送系统将药剂物理导入受试者。示例性施用途径包括静脉内、肌肉内、皮下、腹膜内、脊柱或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输液。

在本发明中，术语“受试者”、“个体”、和“患者”是本领域中公知的，并且在本文中可互换使用，指需要治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。实例包括但不限于人和其它灵长类，包括非人灵长类，诸如黑猩猩及其它猿和猴物种。术语个体、受试者和患者本身不表示特定年龄、性别、人种等。

如本文所用，术语“炎性疾病”是炎症作为它们主要破坏因子的疾病的统称。炎性疾病的实例包括但不限于水肿、皮炎(皮肤炎)、痤疮、口腔溃疡(例如炎症性口腔溃疡)、过敏症、特应性、哮喘、结膜炎、牙周炎、鼻炎、中耳炎、咽喉炎、扁桃体炎、肺炎、胃溃疡、胃炎、克罗恩病、结肠炎、痔疮、痛风、强直性脊柱炎、风湿热、全身性红斑狼疮、纤维肌痛、银屑病关节炎、骨关节炎、类风湿性关节炎、肩周炎、肌腱炎、腱鞘炎、肌炎、肝炎、膀胱炎、肾炎、斯耶格伦氏综合征以及多发性硬化。在本发明中，“炎性疾病”也可以包括有炎症参与的疾病(例如，属于炎症性并发症的疾病)。

在本发明中，术语“慢性炎性疾病”是以存在慢性炎症为特征的各种病况和病症。慢性炎性疾病的实例包括皮肌炎、格雷夫氏病(Grave's disease)、多发性硬化症、重症肌无力、系统性红斑狼疮(SLE)、结节病、干燥综合征(syndrome)、淀粉样变性病、桥本甲状腺炎(Hashimoto thyroiditis)、血管炎、类风湿性关节炎、反应性关节炎、多发性肌炎、硬皮病、艾迪生氏病(Addison's disease)、白斑病、恶性贫血、肾小球肾炎、重症腹腔疾病、1型糖尿病、牛皮癣、肺纤维化和湿疹，在本发明中，“慢性炎性疾病”也可以包括有慢性炎症参与的疾病(例如，属于慢性炎症性并发症的疾病)，这样的“慢性炎性疾病”的实例包括心肌梗死、脑硬死、阿尔兹海默症等。

在本发明中，术语“关节炎”是由于细菌感染或外伤而发生在关节区域内的、与炎性变化有关的疾病的统称。关节炎大体分为急性关节炎和慢性关节炎。急性关节炎还如下进一步划分。(1)浆液性关节炎：通常由外伤诱发，但也可能因为未知原因而发生。其通常发生在一个关节处。(2)浆液纤维蛋白性关节炎：其与急性类风湿性关节炎一起发生，并且在关节腔内聚集浑浊渗出液。甚至在炎症减轻后，由于假膜的生成，其可能导致运动障碍。(3)化脓性关节炎：发生于关节的开放性伤口或接触性传染病如淋病、伤寒、猩红热和败血病的多发的关节炎。1-2月龄的婴幼儿可能由于骨的不可愈合性严重损害而发展为关节脱位。成年人经常发生骨膜骨髓炎，其导致破裂以及使脓液流入关节，因此被称为继发性化脓性关节炎。慢性关节炎可以如下被进一步划分。(1)特殊类型的炎症：一般是指由结核性关节炎或梅毒性关节炎或中年人常见的尿酸代谢失调而引起的痛风性关节炎。(2)多发性关节炎：慢性类风湿性关节炎是最常见的。急性浆液性关节炎可能转变为多发性关节炎，或其可能在肺炎、梅毒和淋病期间作为多关节炎而发生，或者其可能为一类败血病。此外，斯蒂尔病也属于此类。(3)畸形性关节炎：通常由退变性衰老过程或外伤而诱发。(4)血友病关节炎：由血友病患者的关节出血而诱发。退行性关节炎也称为骨关节炎，其是由关节软骨的退行性变化而造成的局部关节炎并主要发生于中年或老年人。

在本发明中，术语“类风湿性关节炎”是慢性、全身性炎性疾病，其可能感染许多器官，并且其的诱因仍未知。该过程初始产生关节周围滑液膜的炎性反应，然后逐渐蔓延至邻近软骨和骨骼，导致关节的破坏和变形。关节外临床表现包括贫血、干燥综合征、皮下结节、肺纤维化、血管炎、真皮溃疡等。

在本发明中，术语“高脂血症”指表征为血清脂质异常升高的病症。循环血液中的脂质部分包括如总胆固醇，某些脂蛋白和甘油三酯。血清脂蛋白在循环中用作脂质的载体，根据其密度分包括：乳糜微粒，极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein,VLDL)，中密度脂蛋白(intermediate density lipoprotein,IDL)，低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)，高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)。术语“高脂血症”包括原发性和继发性高脂血症。原发性高脂血症通常由基因缺陷导致，而继发性高脂血症通常由其它因素导致，如各种疾病状态，药物和饮食因素。例如，继发性高脂血症可由糖尿病引起。或者，高脂血症可由原发性因素和继发性因素共同导致。高脂血症可包括高甘油三酯血症、高胆固醇血症或其组合。“高甘油三酯血症”指血清总甘油三酯水平高于期望水平的病症。“高胆固醇血症”指血清胆固醇水平高于期望水平的病症。在某些实施方案中，高胆固醇血症中血清总胆固醇，HDL胆固醇(HDL-C)或LDL胆固醇(LDL-C)高于期望的水平。高脂血症还会导致患心血管疾病和动脉粥样硬化疾病的风险，并可促使心血管疾病和动脉粥样硬化疾病的发生。术语“心血管疾病”包括血管中异常高浓度的脂质导致的循环系统的血管疾病。术语“动脉粥样硬化”指动脉的一种疾病，其中在内壁上形成脂肪斑，最终阻挡血流。

术语“药学上可接受的”(或“药理学上可接受的”)是指适当时在施用于动物或人时不产生不利反应，过敏反应或其他不良反应的分子实体及组合物。如本文所用的术语“药学上可接受的载体”包含可以使用作为药学可接受物质之介质的任何及所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂等渗剂及吸收延迟剂、缓冲剂、赋形剂、粘合剂、润滑剂、凝胶、表面活性剂等。

本发明提供一种硫酸软骨素生物多胺复合物，以及从生物组织制备硫酸软骨素生物多胺复合物的方法。本发明提供的硫酸软骨素生物多胺复合物以及通过本发明方法所获得的硫酸软骨素生物多胺复合物(在本发明中可以简称为CSX)的重均分子量为400-50000。硫酸软骨素生物多胺复合物具有显著优于普通硫酸软骨素钠的抗炎活性。本发明还涉及通过本发明方法所获得的硫酸软骨素生物多胺复合物的用途，其可以用于慢性炎症、降血脂、特别是关节炎和关节损伤的预防、治疗以及骨组织的修复等。

以下对于本发明提供的硫酸软骨素生物多胺复合物及其制备方法和用途进行具体详述。

<硫酸软骨素生物多胺复合物>

在本发明的一些方面中，提供了一种硫酸软骨素生物多胺复合物，其为硫酸软骨素和生物多胺的复合物，所述硫酸软骨素与生物多胺连接。在一些具体的实施方案中，硫酸软骨素和生物多胺间通过非共价键连接(非共价连接)。该复合物作为药物本身起作用，而不是作为其他药物或活性成分的基质起作用。本发明提供的硫酸软骨素生物多胺复合物是一种天然药物。但也可以通过化学方法合成。

在一些实施方案中，所述硫酸软骨素生物多胺复合物中的硫酸软骨素包括硫酸软骨素A、硫酸软骨素C、硫酸软骨素D和硫酸软骨素E中的一种或者两种以上的组合。n表示1至100或90或80或70或60或50或40或30或20或16自然数。

在一些具体的实施方案中，根据硫酸软骨素的不同(例如，CSA、CSC、CSD和CSE)，硫酸软骨素生物多胺复合物可以包括具有下式I(CSA)、式II(CSC)、式III(CSD)和式IV(CSE)所示结构中任一项或其以任意比例、任意组合的硫酸软骨素生物多胺复合物。

式I～式IV中，“polyamine”表示多胺/生物多胺。n表示1-100或90或80或70或60或50或40或30或20或16的自然数。

由于硫酸软骨素通常以混合物形式存在，因此可以理解，本发明提供的硫酸软骨素生物多胺复合物，尤其是由例如骨组织等天然原料提取、制备获得的硫酸软骨素生物多胺复合物，通常为连接不同生物多胺的不同硫酸软骨素的混合物。

在本发明的一些实施方案中，生物多胺包括精胺、亚精胺、腐胺和尸胺中的一种、两种、三种或以上的组合。

在本发明的一些具体的实施方案中，生物多胺包括精胺、亚精胺、腐胺和尸胺中的一种。

示例性的，包含一种生物多胺的硫酸软骨素生物多胺复合物可以为：

硫酸软骨素与精胺的复合物；

硫酸软骨素与亚精胺的复合物；

硫酸软骨素与腐胺的复合物；以及，

硫酸软骨素与尸胺的复合物。

在本发明的另一些具体的实施方案中，生物多胺包括精胺、亚精胺、腐胺、尸胺中的至少两种。

在本发明的一些更具体的实施方案中，生物多胺包括选自以下的组合：

精胺和亚精胺；

精胺和腐胺；

精胺和尸胺；

亚精胺和腐胺；

亚精胺和尸胺；

腐胺和尸胺；

精胺、亚精胺和腐胺；

精胺、亚精胺和尸胺；

精胺、腐胺和尸胺；

亚精胺、腐胺和尸胺；或者

精胺、亚精胺、腐胺和尸胺。

如本发明后续实施例及测试例中所证明的，包含两种及两种以上生物多胺的硫酸软骨素生物多胺复合物，其各方面活性通常优于仅含单一种类生物多胺的硫酸软骨素生物多胺复合物。同时，包含一种生物多胺的硫酸软骨素生物多胺复合物也具有显著优于现有硫酸软骨素的活性，这样的活性包括，但不限于抗炎(尤其是关节炎)活性，降血脂、抗氧化、延缓衰老、延长寿命等。

在本发明的一些实施方案中，所述硫酸软骨素生物多胺复合物的重均分子量为400-50000。优选地，所述的硫酸软骨素生物多胺复合物的重均分子量在400～25000。

在本发明的一些实施方案中，所述的硫酸软骨素，按照GPC积分比例，重均分子量在50000以上的硫酸软骨素的比例为0％。

在本发明的一些实施方案中，所述的硫酸软骨素，按照GPC积分比例，重均分子量在25000-50000的硫酸软骨素的比例在40％以下。

在本发明的一些优选实施方案中，所述的硫酸软骨素，按照GPC积分比例，重均分子量在25000-50000的硫酸软骨素的比例在35％以下。

在本发明的一些进一步优选实施方案中，所述的硫酸软骨素，按照GPC积分比例，重均分子量在25000-50000的硫酸软骨素的比例在30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％以下或0％。

在本发明的一些实施方案中，所述的硫酸软骨素，按照GPC积分比例，重均分子量在400-25000的硫酸软骨素的比例的上限在80％以上。优选地，所述的硫酸软骨素，按照GPC积分比例，重均分子量在400-25000的硫酸软骨素的比例的上限在81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上或100％。

在本发明的一些实施方案中，所述的硫酸软骨素，按照GPC积分比例，重均分子量在400-25000的硫酸软骨素的比例的下限在40％以上。优选地，所述的硫酸软骨素，按照GPC积分比例，重均分子量在400-25000的硫酸软骨素的比例的下限在41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％或60％以上。

在本发明的一些实施方案中，所述的硫酸软骨素，按照GPC积分比例，重均分子量在400以下的硫酸软骨素的比例在15％以下，优选在3％以下，更优选在1％以下，最优选为0％。

重均分子量上限在25000以下、优选在24000、23000、22000、21000、20000、19000、18000、17000、16000、15000、14000、13000、12000、11000、10000、9000或8000以下；且重均分子量下限在400、500、600、700或800以上的硫酸软骨素的比例上限在80％以上、优选在81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上或100％，下限在40％以上、优选在41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％或60％以上。

重均分子量在25000-50000的硫酸软骨素的比例、重均分子量在400-25000的硫酸软骨素的比例、重均分子量在400以下的硫酸软骨素的比例之和为100％。

在本发明的一些优选实施方案中，所述的硫酸软骨素，按照GPC积分比例，重均分子量在400-10000的硫酸软骨素的比例为40％-100％，优选50％-100％、60％-100％、70％-100％、80％-100％。

在本发明的一些进一步优选的实施方案中，按照GPC积分比例，所述硫酸软骨素的分子量分布如下：重均分子量大于50000的硫酸软骨素的比例是0％，重均分子量在25000-50000的硫酸软骨素的比例为0-40％，重均分子量在400-10000的硫酸软骨素的比例、优选重均分子量在400-8000的硫酸软骨素的比例在40％-100％、重均分子量在400以下的硫酸软骨素的比例为15％以下。

如后文即将提及的，以及实施例中所述的，本发明提供的硫酸软骨素生物多胺复合物可以通过天然原料中制备，通过天然原料中存在的硫酸软骨素和生物多胺共沉淀形成二者非共价连接的复合物。因此，可以理解，复合物中存在的硫酸软骨素与生物多胺之间的配比，与所使用的天然原料中二者的配比相同或接近，并且在硫酸软骨素所结合的生物多胺达到饱和状态以下的任意配比下，均具有活性。

在一些实施方案中，按硫酸软骨素生物多胺复合物总重量计(g)，在所述硫酸软骨素生物多胺复合物中，含有的所述生物多胺在200μmol/g以下；优选地，在199μmol/g、198μmol/g、197μmol/g、196μmol/g、195μmol/g、194μmol/g、193μmol/g、192μmol/g、191μmol/g、190μmol/g、189μmol/g、188μmol/g、187μmol/g、186μmol/g、185μmol/g、184μmol/g、183μmol/g、182μmol/g、181μmol/g或180μmol/g以下。

在一些优选的实施方案中，按硫酸软骨素生物多胺复合物总重量计(g)，在所述硫酸软骨素生物多胺复合物中，含有的所述生物多胺在0.5μmol/g以上；优选地，在0.6μmol/g、0.7μmol/g、0.8μmol/g、0.9μmol/g、1μmol/g以上。

在一些更优选的实施方案中，按硫酸软骨素生物多胺复合物总重量计(g)，在所述硫酸软骨素生物多胺复合物中，含有所述生物多胺0.5-200μmol/g，优选0.6-200μmol/g、0.7-200μmol/g、0.8-200μmol/g、0.9-200μmol/g，更优选1-200μmol/g、1-195μmol/g、1-190μmol/g、1-185μmol/g、1-180μmol/g。在一些优选的实施方案中，所述生物多胺为精胺、亚精胺、腐胺和尸胺中的一种、两种、三种或以上以任意比例的组合。

在一些实施方案中，所述硫酸软骨素为酸形式的硫酸软骨素(硫酸软骨素酸)或盐形式的硫酸软骨素。在一些优选的实施方案中，所述硫酸软骨素为酸形式的硫酸软骨素，酸形式的硫酸软骨素与生物多胺的结合更加紧密，并且可以结合更多的多胺分子，使得硫酸软骨素生物多胺复合物具有更佳的生物活性。

在本说明书中的“低分子CS”、“低分子软骨素”或“低分子量软骨素”是指重均分子量400-8000的硫酸软骨素，可通过酶解、酸解、氧化自由基降解、辐射降解等方式降解硫酸软骨素制备得到。包含低分子CS的硫酸软骨素生物多胺复合物称为低分子CSX或低分子硫酸软骨素生物多胺复合物。在本说明书中“普通软骨素”或“普通CS”是指商购得到的常规软骨素。

<制备硫酸软骨素生物多胺复合物的方法及由制备方法所获得的酸软骨素生物多胺>

本发明发现了硫酸软骨素多胺相对于硫酸软骨素在多方面均具有显著提升的活性，同时发现，硫酸软骨素多胺可以从天然原料中提取制备获得。然而，现有提取硫酸软骨素的方法，为了保证软骨素的纯度、色泽等性质，通常采用离子树脂交换提纯、过氧化氢脱色、两次以上的醇沉-溶解等步骤。这些步骤提高软骨素纯度的同时，几乎完全将多胺剔除。均未关注到硫酸软骨素与生物多胺的复合，及其功效。并且现有方法通常涉及较高的离子强度，其会对非共价键有较大影响，即使存在少量多胺，也无法形成本发明的生物多胺复合物。

基于上述问题，在本发明的一些方面，提供了一种上述的硫酸软骨素生物多胺复合物的制备方法，其包括将从原料中分离提取的含硫酸软骨素和多胺的提取液与乙醇混合的步骤，其中，所述提取液的pH值在4～6，所述提取液与乙醇的体积比为1：1～3。

在本发明提供的硫酸软骨素生物多胺复合物的制备方法中，在一定条件下，将从原料中分离提取的含硫酸软骨素和多胺的提取液与乙醇混合，使得硫酸软骨素和多胺形成复合物，即硫酸软骨素生物多胺复合物，其具有显著优于普通硫酸软骨素的抗炎活性，并且具有修复关节损伤、降血脂、抗氧化、延缓衰老、延长寿命等作用。

在一些具体实施方案中，所述提取液的pH值可以4、4.5、5、5.5或6。在一些优选的实施方案中，所述提取液的pH值为5。不同于常规的硫酸软骨素的提取、沉淀中所使用的中性的pH值，提取液在上述的pH值条件下，有利于硫酸软骨素生物多胺复合物的形成，例如可以提高可与硫酸软骨素发生共沉淀并复合的生物多胺的含量，从而促进硫酸软骨素生物多胺复合物的形成。

在一些具体实施方案中，所述提取液与乙醇的体积比为1：1～2.5，例如1：1或1：2.5。在一些优选的实施方案中，乙醇的体积占提取液和乙醇混合液体积的60～70％，在该体积比下，更适于形成硫酸软骨素生物多胺复合物。在该体积比下，与追求高纯度的硫酸软骨素的方法不同，其虽然损失了部分硫酸软骨素，但可以提高多胺含量，并且能够减少蛋白杂质，进而促进形成硫酸软骨素生物多胺复合物，而现有技术条件下，通常无法获得硫酸软骨素生物多胺复合物。

在一些具体的实施方案中，所述乙醇为无水乙醇。

(原料的来源)

在本发明中，对于原料的来源没有特殊的限制，可以是任何含有硫酸软骨素和/或多胺的原料，例如动物组织、植物组织以及微生物培养发酵液等。

在一些实施方案中，原料可以为动物的结缔组织，包括软骨、骨、肌腱、肌膜和血管壁等。所述动物可以为陆地动物，例如牛、猪、鸡等，也可以是海洋动物，例如各种鱼类。本领域技术人员可以理解，上述原料包含硫酸软骨素以及多胺成分。在一些实施方案中，原料还可以包括大豆、小麦胚芽等含有多胺成分的原料。

根据原料来源不同，所获得的硫酸软骨素生物多胺复合物中包含的硫酸软骨素的种类亦不相同。通常，陆地(动物)来源提取的CS主要是CSA和CSC的混合物，海洋(动物)来源提取的CS主要为CSA、CSC和CSD的混合物，少数还包含CSE。并且，不同动物种类的原料，其中含有的不同种类的CS的比例有所不同。因此，本发明提供的硫酸软骨素生物多胺复合物的制备方法所获得的硫酸软骨素生物多胺复合物中，硫酸软骨素可以是CSA、CSC、CSD和CSE中的任一种或其以任意比例的任意组合。

在一些优选的实施方案中，可以选择鸡骨作为原料，鸡骨一般含有较高含量的生物多胺，并且更加廉价，货源品质稳定，容易大量获取。

(前处理)

在进行本发明的方法前，通常需要进行前处理的步骤，以使原料适于进行本发明的方法(例如酶解、酸解、分离提取等)。对于前处理的方法没有特别的限制，本领域技术人员可以根据不同的原料选择合适的前处理方法，例如对于骨、软骨等原料，前处理方法可以包括煮沸、去除杂质、清洗、干燥、研磨粉碎等。又如对于大豆，前处理方法可以包括研磨粉碎。

(原料中硫酸软骨素和多胺的分离提取)

在与乙醇混合复合沉淀为硫酸软骨素生物多胺复合物前，可以将原料中的硫酸软骨素和多胺分离提取，以提高原料中的硫酸软骨素和多胺的比例，获得更高纯度的硫酸软骨素生物多胺复合物，降低无机盐、蛋白质等杂质的存在，以及杂质对后续复合沉淀的过程的影响。

在本发明的一些实施方案中，在原料中硫酸软骨素和多胺的分离提取中，首先将原料进行酶解或酸解，通过酶解或酸解将原料裂解，获得酶解液或酸解液，以使原料中的硫酸软骨素和/或多胺等成分充分释放。

酶解或酸解不充分会影响多胺的释放，因此，在一些实施方案中，将原料进行充分地酶解或酸解。本领域技术人员可以选择合适量的酶解或酸解试剂达到充分酶解或酸解原料。

在一些实施方案中，对于酶解，可以选择的酶包括木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶中的一种或多种。在一些优选的实施方案中，对于每克经前处理后的样本，添加酶不少于4000U，优选10000U以上、16000U以上、20000U以上、30000U以上、40000U以上、50000U以上。酶活力越低，越无法将蛋白水解彻底，从而无法从原料中释放多胺分子。并且，在三氯乙酸沉淀蛋白的过程中，多胺容易与较大蛋白结合为沉淀，从而进一步减少多胺的提取量，从而影响产物活性。在一些实施方案中，酶解的温度在50℃～70℃，优选55℃～65℃，例如55℃、60℃、65℃。在一些实施方案中，酶解的时间在1～24小时，优选3～24小时、3～16小时，例如3小时、6小时、16小时。在一些实施方案中，酶解可以进行1次。在另一些实施方案中，酶解可以进行2次、3次或更多次。

在一些实施方案中，对于酸解，可以使用有机酸和/或无机酸。在一些实施方案中，所述的有机酸可以包括三氟乙酸、三氯乙酸、甲酸和乙酸中的一种或多种。在一些实施方案中，所述的无机酸可以包括盐酸、硫酸和硝酸中的一种或多种。在一些实施方案中，所述的酸解可以配合超声波萃取、加入、研磨等方法辅助进行，以提高酸解效率，充分裂解原料，将硫酸软骨素和/或多胺等成分释放。

本发明的一些实施方案中，从酶解或酸解后获得的酶解液或酸解液中分离提取硫酸软骨素和多胺。在一些实施方案中，硫酸软骨素和多胺可以分步分离提取。分步提取可以将多胺最大程度的提取，提高硫酸软骨素生物多胺复合物中多胺的重量比，并进一步减少杂质(蛋白和无机盐等)。并且可以实现对于硫酸软骨素的单独的进一步操作，例如进一步纯化、去除盐形式的硫酸软骨素或将硫酸软骨素低分子化等。在另一些实施方案中，硫酸软骨素和多胺可以同时分离提取。

在一些具体的实施方案中，对于硫酸软骨素和多胺同时分离提取的情况，通常采用酶解处理原料。在一些实施方案中，可以在酶解液中加入酸以使酶解液中的蛋白沉淀，以去除酶解液中的蛋白。在一些具体的实施方案中，经过去除酶解液中的蛋白后，所得的初步提取液中，硫酸软骨素的浓度可以在约为6-7％(w/v)的范围。在该浓度范围时，后续步骤中更有利于获得硫酸软骨素生物多胺复合物。在该浓度范围下的硫酸软骨素的初步提取液中，所含的生物多胺的含量更高，从而更有利于和硫酸软骨素的复合。

并将去除蛋白后的所得液体浓缩和/或调节pH值后，加入乙醇进行复合沉淀，以获得硫酸软骨素生物多胺复合物。在一些具体的实施方案中，用于沉淀蛋白的酸可以选择三氯乙酸、过氯酸、硝酸等。

对于硫酸软骨素和多胺分步分离提取的情况，在一些实施方案中，可以采用色谱法或萃取法将样品中的多胺分离，再将剩余物经酶解、蛋白沉淀、色谱、醇沉中的一种或多种，以将剩余物中的硫酸软骨素纯化。将纯化后的硫酸软骨素与分离的多胺混合，加入乙醇进行复合沉淀，获得硫酸软骨素生物多胺复合物。

在一些具体的实施方案中，所述的色谱法为离子交换色谱法。在一些具体的实施方案中，所述的萃取法为有机溶剂萃取法或超临界萃取法。在一些更具体的实施方案中，所述的有机溶剂萃取法中使用的有机溶剂包括正丁醇、二氯甲烷、三氯甲烷和乙醚中的一种或多种。在另一些更具体的实施方案中，所述的超临界萃取法为二氧化碳超临界萃取法。

在一些具体的实施方案中，对于硫酸软骨素和多胺分步分离提取的情况，还包括硫酸软骨素低分子化的步骤。在一些实施方案中，例如对于经酶解、蛋白沉淀、色谱、醇沉中的一种或多种纯化后的硫酸软骨素，采用CN111495428A中所公开的(例如其中的实施例2)方法进行低分子化，以获得低分子量硫酸软骨素。在一些实施方案中，将低分子量硫酸软骨素与分离的多胺混合，加入乙醇进行复合沉淀，获得硫酸软骨素生物多胺复合物。

在一些具体的实施方案中，通过上述制备硫酸软骨素生物多胺复合物的方法所获得的含硫酸软骨素生物多胺复合物的提取物中，经硫酸软骨素和分离后检测，多胺总含量(质量比)为0.01％～5％。

(其他步骤)

对于制备硫酸软骨素生物多胺复合物的方法的其他步骤，没有特别限制，可以根据实际的设备或需要进行调整或选用。在一些实施方案中，包括对于产物的纯化的步骤，以获得更高纯度的硫酸软骨素生物多胺复合物。然而，可以理解，经过上述方法制备获得的硫酸软骨素生物多胺复合物已可以发挥其作用。

在本发明的另一些实施方案中，本发明提供的硫酸软骨素生物多胺复合物可以通过将硫酸软骨素和生物多胺混合而制备，其中，按硫酸软骨素生物多胺复合物总重量计，在所述硫酸软骨素生物多胺复合物中，含有所述生物多胺0.5-200μmol/g。

在一些具体的实施方案中，所述硫酸软骨素和所述生物多胺可是市售的。在另一些具体的实施方案中，所述硫酸软骨素和所述生物多胺可以是分别从如前文所述的原料中提取的。

在一些更具体的实施方案中，将硫酸软骨素和生物多胺在溶剂中混合，并经过干燥而制备。

在一些示例性的实施方案中，所述的溶剂为水。在一些示例性的实施方案中，所述的干燥为冷冻干燥。

在本发明的一些方面中，还提供了由上述的制备方法制备获得的硫酸软骨素生物多胺复合物。

<药物组合物、保健品和化妆品>

在本发明中的一些方面，还提供了一种药物组合物，其包括上述的硫酸软骨素生物多胺复合物或通过上述的硫酸软骨素生物多胺复合物的制备方法所获得的硫酸软骨素生物多胺复合物，以及药学上可接受的载体。

在本发明中的另一些方面，还提供了一种保健品，其包括上述的硫酸软骨素生物多胺复合物或通过上述的硫酸软骨素生物多胺复合物的制备方法所获得的硫酸软骨素生物多胺复合物。

在本发明的另一些方面，还提供了一种化妆品，其包括上述的硫酸软骨素生物多胺复合物或通过上述的硫酸软骨素生物多胺复合物的制备方法所获得的硫酸软骨素生物多胺复合物。

<硫酸软骨素生物多胺复合物的抗炎用途及方法>

在本发明中的一些方面，提供了硫酸软骨素生物多胺复合物在制备用于抑制/抗炎症的药物中的用途，其中，所述硫酸软骨素生物多胺复合物为上述的硫酸软骨素生物多胺复合物或通过上述的硫酸软骨素生物多胺复合物的制备方法所获得的硫酸软骨素生物多胺复合物。

在一些实施方案中，提供了硫酸软骨素生物多胺复合物在制备用于治疗和/或预防炎性疾病的药物中的用途，其中，所述硫酸软骨素生物多胺复合物为上述的硫酸软骨素生物多胺复合物或通过上述的硫酸软骨素生物多胺复合物的制备方法所获得的硫酸软骨素生物多胺复合物。

在本发明的一些实施方案中，所述炎性疾病为各种炎症诱发因素导致的、和/或由炎症细胞、白介素(Interleukin,IL)和/或肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF)等炎症因子介导的炎性疾病。在一些具体的实施方案中，炎症因子包括白介素6(IL-6)和白介素1β(IL-1β)中的一种或两种。

在本发明的一些实施方案中，所述炎性疾病为慢性炎性疾病。

在本发明的一些实施方案中，所述炎性疾病选自过敏症、湿疹、心肌梗死、脑硬死、阿尔兹海默症、皮肤炎或关节炎中的一种或多种。

在本发明的一些实施方案中，所述炎性疾病为关节炎。在本发明的一些更具体的实施方案中，关节炎为慢性关节炎，例如多发性关节炎。更具体地，关节炎为慢性类风湿性关节炎。

在本发明中的一些方面，提供了一种治疗和/或预防炎性疾病的方法，其包括向受试者施用治疗有效量或预防有效量的硫酸软骨素生物多胺复合物的步骤，其中，硫酸软骨素生物多胺复合物为上述的硫酸软骨素生物多胺复合物或通过上述的硫酸软骨素生物多胺复合物的制备方法所获得的硫酸软骨素生物多胺复合物。

<硫酸软骨素生物多胺复合物的降血脂用途及方法>

在本发明中的另一些方面，还发现了上述的硫酸软骨素生物多胺复合物或通过上述的硫酸软骨素生物多胺复合物的制备方法所获得的硫酸软骨素生物多胺复合物具有降血脂的作用。

因此，在一些实施方案中，提供了硫酸软骨素生物多胺复合物在制备用于降血脂的药物中的用途；在另一些实施方案中，提供了硫酸软骨素生物多胺复合物在制备用于治疗和/或预防高脂血症的药物中的用途；其中，所述硫酸软骨素生物多胺复合物为上述的硫酸软骨素生物多胺复合物或通过上述的硫酸软骨素生物多胺复合物的制备方法所获得的硫酸软骨素生物多胺复合物。

在一些具体实施方案中，高脂血症可以为原发性高脂血症和/或继发性高脂血症。在一些具体实施方案中，高脂血症可以为高甘油三酯血症和/或高胆固醇血症。

在一些具体实施方案中，用于治疗和/或预防高脂血症的药物也适用于与高脂血症相关(例如触发或加重)的病症，其包括心血管病，诸如，但不限于，动脉硬化症、冠状动脉疾病、心绞痛、颈动脉疾病、中风、脑动脉硬化、心肌梗塞、脑梗塞、充气囊血管成形术后的再狭窄、高血压、间歇性跛行、异常脂血症、餐后脂血症和黄瘤。

在本发明中的一些方面，提供了一种治疗和/或预防高脂血症的方法，其包括向受试者施用治疗有效量或预防有效量的硫酸软骨素生物多胺复合物的步骤，其中，硫酸软骨素生物多胺复合物为上述的硫酸软骨素生物多胺复合物或通过上述的硫酸软骨素生物多胺复合物的制备方法所获得的硫酸软骨素生物多胺复合物。

在本发明中的其他方面，提供了硫酸软骨素生物多胺复合物在制备用于调节血脂(降低总胆固醇、降低甘油三酯)、辅助降血脂的保健食品中的用途，该保健食品有助于维持血脂(胆固醇/甘油三酯)健康水平；其中，硫酸软骨素生物多胺复合物为上述的硫酸软骨素生物多胺复合物或通过上述的硫酸软骨素生物多胺复合物的制备方法所获得的硫酸软骨素生物多胺复合物。

<硫酸软骨素生物多胺复合物的其他用途>

在本发明还发现了上述的硫酸软骨素生物多胺复合物或通过上述的硫酸软骨素生物多胺复合物的制备方法所获得的硫酸软骨素生物多胺复合物具有治疗/修复关节损伤、抗氧化、延缓衰老、延长寿命等作用。

因此，在一些实施方案中，提供了硫酸软骨素生物多胺复合物在制备用于治疗和/或修复关节损伤的药物中的用途，其中，硫酸软骨素生物多胺复合物为上述的硫酸软骨素生物多胺复合物或通过上述的硫酸软骨素生物多胺复合物的制备方法所获得的硫酸软骨素生物多胺复合物。

在一些具体的实施方案中，关节损伤可以为炎症、老化、运动、受伤等原因造成的关节损伤。

在本发明中的其他方面，提供了硫酸软骨素生物多胺复合物在制备保健食品中的用途；其中，硫酸软骨素生物多胺复合物为上述的硫酸软骨素生物多胺复合物或通过上述的硫酸软骨素生物多胺复合物的制备方法所获得的硫酸软骨素生物多胺复合物。在一些具体实施方案中，提供了硫酸软骨素生物多胺复合物在制备有助于改善骨密度的保健食品中的用途。

在一些实施方案中，提供了硫酸软骨素生物多胺复合物在制备用于抗氧化、延缓衰老和/或延长寿命的药物中的用途，其中，硫酸软骨素生物多胺复合物为上述的硫酸软骨素生物多胺复合物或通过上述的硫酸软骨素生物多胺复合物的制备方法所获得的硫酸软骨素生物多胺复合物。

在一些具体的实施方案中，所述药物通过清除氧自由基实现抗氧化作用。

在本发明中的其他方面，提供了硫酸软骨素生物多胺复合物在制备有助于抗氧化的保健食品中的用途，该保健食品有助于人体维持氧化与抗氧化过程的平衡；其中，硫酸软骨素生物多胺复合物为上述的硫酸软骨素生物多胺复合物或通过上述的硫酸软骨素生物多胺复合物的制备方法所获得的硫酸软骨素生物多胺复合物。

在本发明中的其他方面，提供了硫酸软骨素生物多胺复合物在制备化妆品中的用途，其中，硫酸软骨素生物多胺复合物为上述的硫酸软骨素生物多胺复合物或通过上述的硫酸软骨素生物多胺复合物的制备方法所获得的硫酸软骨素生物多胺复合物。在一些具体实施方案中，提供了硫酸软骨素生物多胺复合物在制备用于有助于抗氧化的化妆品中的用途。

实施例与测试例

以下通过实施例与测试例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。以下提供了本发明实施方案中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。下述实施例与测试例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例与测试例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

在以下实施例中，硫酸软骨素/硫酸软骨素生物多胺复合物的分子量测定方法如下：

使用高效凝胶渗透色谱法(Gel Permeation Chromatography,GPC)对硫酸软骨素/硫酸软骨素生物多胺复合物的分子量及其分布的测定。标样采用的是右旋糖酐分子量标样。流动相为0.2M硫酸钠水溶液。

色谱条件如下：

色谱柱：TSKgel G3000PWXL 7.8*300mm

流速：0.5m L/min

检测器：示差折光检测器

柱温：35℃

进样体积：30μL。

在以下实施例中，多胺测定按照GB5009.208-2016进行。

以下实施例的基本原理：生物多胺与硫酸软骨素之间存在较强的非共价键作用力，因此调节生物多胺与硫酸软骨素在溶液中的pH和浓度等条件，通过乙醇醇沉的方法沉淀，达到提取纯化目的。但是由于生物组织中还存在大量的其他分子(氨基酸、肽、蛋白、脂肪、无机盐等)，为了排除其他物质的干扰，并且进一步提高纯度以及多胺的含量，按照不同原材料和需求，采用不同的提取工艺。

实施例：硫酸软骨素生物多胺复合物的提取

实施例1.硫酸软骨素生物多胺复合物的发现与验证

在本实施例中，硫酸软骨素生物多胺复合物作为一个整体从动物骨组织中分离并沉淀出来。在确认活性来源为硫酸软骨素多胺物质之前，本实施例对此进行了多方面的分析与表征。

一、提取

本实施例中采用鸡骨作为原料。

(1)原料的前处理

将新鲜生骨煮沸，去除血水、油脂、残留的肉渣等杂质，之后将骨用清水洗净后，干燥，研磨粉碎。

(2)原料中硫酸软骨素和多胺的分离提取

2.1酶解

称取经前处理的鸡骨，每份5g，分别加入100mL pH 5.7-6.0的水和按原料鸡骨的质量计2％的酶，分别为：

0.1g木瓜蛋白酶(200U/mg，必胜生物科技)(A-2号)；

0.1g木瓜蛋白酶(2000U/mg，adamas试剂)(A-3号)；

0.1g木瓜蛋白酶(800U/mg，必胜生物科技)(A-4号)；或者，

0.1g胰蛋白酶(250U/mg，阿拉丁试剂)和0.1g胃蛋白酶(3000U/mg，阿拉丁试剂)(A-6号)；

搅拌均匀，将体系升温至65℃，保温反应3小时，酶解经预处理的鸡骨，形成酶解液。

2.2硫酸软骨素和多胺的分离提取

酶解反应结束后，用滤纸分别过滤步骤2.1所获得的酶解液。向经过滤后所得滤液中分别加入5.0g三氯乙酸(阿拉丁试剂，中国)，冰浴1小时，混匀，8000rpm/min离心5分钟，取上清液，以除去多余的蛋白。

(3)硫酸软骨素生物多胺复合物的复合沉淀

将步骤2.2中所得上清液分别用氢氧化钠固体调pH至大约5，分别减压浓缩至大约10mL黄色液体(无固体析出)。

将黄色液体中分别加入25mL无水乙醇醇沉，振荡，离心，分别得到提取物(硫酸软骨素生物多胺复合物)，离心所得醇沉固体用无水乙醇再次洗涤一次，离心，离心后所得固体40℃真空干燥过夜，得600mg白色固体，即为提取物(经后续验证为硫酸软骨素生物多胺复合物)。

二、提取物的分析

对通过上述不同酶处理后提取获得提取物进行分析及验证。

首先，检测其对IL-6的抑制水平，即抗炎活性。具体地，采用的细胞为小鼠单核细胞RAW264.7。消化细胞并接种96孔板，每孔1万个细胞。细胞贴壁后，以含有0.1μg/ml LPS的DMEM 10％FBS培养基稀释地塞米松(DXM)及CSX。地塞米松终浓度为0.1mg/ml，CSX终浓度为0.1mg/ml。培养18-24小时，吸取上清，酶联免疫吸附实验(Elisa)检测上清中IL-6的水平。

图14为不同提取物及现有软骨素作用后对IL-6的抑制水平图，其中A-2、A-3、A-4、A-6号为上述不同酶处理后提取所得提取物，A-1为企业提供的软骨素(伍星生物，湖南)，A-5号为采购自试剂公司的软骨素(阿拉丁，上海)。由图14可知A-3号提取物对于IL-6的抑制效果显著优于其他提取物或软骨素，A-6号次之，而A-1、A-4、A-5号软骨素并未有显著性差异。

选取抗炎活性较好的软骨素提取物(A-3号)进行了核磁氢谱测试(溶剂：氘代水，600MHZ，安捷伦，美国)，发现除了软骨素分子的氢原子信号外，在化学位移1.7、1.9和3.0ppm处出现了明显的新信号(图15)。

图16为不同提取物的核磁氢谱中该特征峰至(1.7ppm)的局部特写，图16中A、B、C、D为使用上述不同提取方法获得的提取物，分别对应A-6号、A-4号、A-3号、A-2号提取物。相对积分面积C>A>B>D，而所对应的提取物抑制炎症因子的活性顺序为A-3>A-6>A-4>A-2，而特征峰的积分面积与活性大小对应。

为了进一步探求活性来源，尝试将提取物中成分分离，将软骨素与化学位移1.7、1.9和3.0ppm处物质分离，分离方法如下：

向2L纯水中加入100克A-3提取物和200克氯化十六烷基吡啶(Hexadecylpyridinium Chloride，CPC)(伊诺凯公司LOT:KYGA540)，软骨素与CPC发生静电作用产生白色沉淀。室温下搅拌1小后然后离心(7000rpm,10℃,15分钟)，沉淀为CPC与软骨素的复合物，而清液含有化学位移1.7、1.9和3.0ppm处物质成分。上述软骨素与CPC沉淀，加入10％NaCl水溶液中，60℃加热搅拌，使沉淀解离。之后加入三倍溶液体积的无水乙醇，沉淀为硫酸软骨素。乙醇沉淀的操作重复两次后，过滤后的沉淀干燥后得白色固体81g，纯度为95.5％。核磁测试发现上述化学位移的特征峰消失。

对于上述含有化学位移1.7、1.9和3.0ppm处物质成分的清液，用二氯甲烷(200mL/次)洗涤清液三次，除去多余CPC，收集水相，加入大约280mL无水乙醇，出现沉淀(盐、蛋白、多余软骨素等物质)，离心去除，清液冷冻干燥48小时得到白色固体。将白色固体溶解后进一步使用凝胶色谱柱进行分离，分离条件如下。分离设备为AKTA pure蛋白纯化系统(美国)，色谱柱为GE Superdex G30increase 10/300GL(美国)。流动相为水，流速0.5ml/min。检测波长为210nm和260nm。对馏分进行分别收集(色谱图如图17所示，图内数字为收集的馏分编号)，并且分别再次进行IL-6抗炎因子的活性测试，方法如前所述，发现3号馏分远高于其他组分，对A-3馏分进一步的浓缩，并进行核磁和质谱测定后，确认为精胺、亚精胺和腐胺3种生物多胺，这三种胺的摩尔比例接近1：1：1。

为进一步证明提取物中，CS与多胺的存在形式，通过以下实验证实CS与多胺相互结合：

1、对3号提取物进行透析，透析袋截留分子量为10kD，透析5天，每8h换一次水。透析结束后，截留液冷冻干燥。对多胺含量测试后发现，多胺含量未发现减少。

2、异硫氰酸荧光素(FITC)和软骨素多胺的反应。

实验方法：A-3号提取物(50mg)溶解在10mL纯水中，用6mol/L的氢氧化钠溶液调pH 9-10，然后加入含10mg的FITC水溶液(1mL)，锡纸包裹避光室温反应过夜。使用1000D透析膜，透析5天后，加入三倍体积无水乙醇，得黄色沉淀。过滤后用无水乙醇洗涤一次，得黄色固体，真空干燥过夜。采用普通软骨素作为对照进行相同操作。普通软骨素为白色，活性软骨素为黄色，可以看到颜色有明显差异。这说明FITC分子与多胺分子的氨基发生了缩合反应，尽管部分氨基由于形成酰胺导致与CS的结合减弱，但是仍有未反应氨基与CS存在较强结合作用。由于多胺分子仍结合于CS的高分子链上，所以经过透析后，仍有明显颜色。而普通软骨素，无法与FITC分子反应，因此游离的FITC分子被除去。普通软骨素是湖南伍星生物科技公司提供的牛来源软骨素，重均分子量为21k，其中分子量大于50000的比例为0％，25000至50000的比例为31％，分子量400-25000的比例为69％。，分子量在400以下的硫酸软骨素的比例为0％。

3、ITC反应

为了检测软骨素分子与多胺分子之间是否存在亲和力以及亲和力大小，采用了等温滴定量热法(Isothermal Titration Calorimetry,ITC)(MicroCal^TM iTC200)测定软骨素分子与多胺分子的结合常数。

多胺分子作为配体滴定软骨素分子，按照结合摩尔比为1:1设定参数。软骨素分子溶于水中，浓度为20μM，多胺分子同样溶于水，浓度为200μM，每滴2μL，共滴定17次。

实验结果如图19，软骨素分子与多胺分子的结合常数KD＝1/KA＝5μM，反应化学量N＝1.74，焓△H＝2.29Kcal/mol。可知，软骨素与多胺分子有着较强的结合作用力。

经过上述测试，A-2、A-3、A-4、A-6号提取物中主要活性成分为含有精胺、亚精胺和腐胺的硫酸软骨素生物多胺复合物，经分离后检测，以提取物的总重量计，多胺含量(摩尔质量比)、硫酸软骨素质量比、蛋白质量比，以及重均分子量结果如下表1所示。硫酸软骨素质量比的测试方法参照中国药典2020硫酸软骨素钠，标样为硫酸软骨素(中国食品药品检定研究院)。蛋白含量测定的方法采用Lowry分子量使用GPC测得，其中A-2和A-4的分子量较大的原因可能是蛋白与多个多糖分子连接的共价键未完全破坏。蛋白的存在可能导致复合物的抗炎活性降低，甚至出现促炎作用。例如A-2号有一定促炎作用，这可能是由于蛋白等杂质含量过高造成的。而A-6号没有较好的抗炎效果，也可能是蛋白含量较高导致的。

表1：

为了进一步验证活性来源，按照A-3号提取物中多胺的比例进行了复配。还按照相同的摩尔量分别将三种多胺与软骨素复配，并一起测定了IL-6的抑制能力，具体方法如前所述。复配方法为硫酸软骨素(Sigma，美国)溶于水后，分别或者同时加入精胺四盐酸盐(Acros，美国)、亚精胺三盐酸盐(Acros，美国)和腐胺二盐酸盐(Acros，美国)，搅拌均匀后冷冻干燥，得白色固体。此处硫酸软骨素的重均分子量为20100，分子量在400-25000的比例为71％。25000-50000的比例为29％，400以下的比例为0％。

图18为各类物质对IL-6抗炎活性测试，B-1号为生物多胺组合(精胺+亚精胺+腐胺；三种多胺的配比与B-4号的提取物中的配比相同；三种多胺的总摩尔量与B-4号的提取物使用量中所含的多胺总摩尔量相同)，B-2号为CS与多胺组合的复配(CS+精胺+亚精胺+腐胺；三种多胺的配比与B-4号的提取物中的配比相同；三种多胺的总摩尔量与B-4号的提取物中所含的多胺总摩尔量相同；CS使用量与B-4号的提取物减去多胺外的质量相同)，B-3号为CS+精胺(精胺的摩尔量与B-4号的提取物中所含的多胺总摩尔量相同；CS使用量与B-4号的提取物减去多胺外的质量相同)，B-4号为上述的A-3号提取物，B-5号为CS+亚精胺(亚精胺的摩尔量与B-4号的提取物所含的多胺总摩尔量相同；CS使用量与B-4号的提取物减去多胺外的质量相同)，B-6号为CS+腐胺(腐胺的摩尔量与B-4号的提取物使用量中所含的多胺总摩尔量相同；CS使用量与B-4号的提取物减去多胺外的质量相同)，B-7号为CS(其使用量与B-4号的提取物的质量相同)。由上述结果可知，在相同多胺含量情况下，复配物与提取物的活性相当，并高于同等量的上述生物多胺的组合物(未与CS复配)，远高于单独CS。复配组合中多胺的总摩尔量占比与A-3相同。

由上述结果可知，在相同多胺含量情况下，复配物与提取物的活性相当，对炎症因子的抑制率是同等量的上述生物多胺组合物(未与CS复配)的约3.5倍，并远高于单独CS。

现有的硫酸软骨素的提取方法中，通常为获得更高纯度的硫酸软骨素，而将原料中其他成分去除。而与现有技术不同的是，本发明将原料在酶的充分作用后，采用无水乙醇，在一定条件下沉淀硫酸软骨素，意外地获得了硫酸软骨素与多胺的复合物，并发现该复合物具有相比硫酸软骨素出乎意料显著提升的活性。因此，在后续实施例中，采用分步提取方法，提升从原料中获得多胺的量，并与原料中获得的硫酸软骨素复合，从天然原料获得硫酸软骨素多胺。

实施例2.木瓜蛋白酶酶解-树脂纯化提取+无水乙醇复合沉淀

本实施例采用猪软骨作为原料制备硫酸软骨素生物多胺复合物。

(1)原料的前处理

原料预处理方法同实施例1。

(2)原料中硫酸软骨素和多胺的分离提取

2.1酶解

称取100g经前处理的猪软骨加入500mL水和按原料猪软骨的质量计2％的木瓜蛋白酶(2000U/mg)，pH调至6-7，升温至55℃，搅拌16小时，将酶解体系降至室温，获得酶解产物。

2.2生物多胺的色谱

将2.1中酶解产物垫硅藻土真空抽滤，滤去骨渣等不溶杂质，得淡黄色透明溶液。

量取100mL弱酸性阳离子交换树脂树脂(本实施例中，采用型号D152)，加入空柱管中，用纯水冲洗，填实。将500mL上述获得的淡黄色透明溶液(滤液)过柱，收集透过液。之后用200mL 4％(m/v)稀盐酸冲洗树脂柱，收集洗脱液为洗脱液A。经过上述的阳离子交换柱吸附洗脱后，可以将多胺物质浓缩提纯，富集于洗脱液A中。

2.3硫酸软骨素分离提取

将步骤2.2中所得透过液减压蒸馏，浓缩至100mL，加入5g三氯乙酸沉淀蛋白，离心除去沉淀，保留清液。

将经三氯乙酸沉淀蛋白处理后的透过液，加三倍体积无水乙醇醇沉出硫酸软骨素，振荡，离心。离心所得下层固体用无水乙醇洗涤一次，离心，离心后所得固体45℃真空干燥过夜，得硫酸软骨素钠粗产品。

为了进一步提纯硫酸软骨素，将所得硫酸软骨素钠粗产品配制为质量体积比20％的水溶液，加入50mL强碱性阴离子交换树脂(本实施例中采用D280)，搅拌吸附，吸附时间为20-30min。之后加入1-1.5倍树脂体积9％(m/v)氯化钠溶液进行洗脱，得洗脱液B。将洗脱液B再次用三倍体积无水乙醇醇沉出硫酸软骨素，振荡，离心。离心所得下层固体用无水乙醇洗涤一次，离心，离心后所得固体45℃真空干燥过夜，得到硫酸软骨素钠。测定纯度为90.1％，测定方法同实施例1。

(3)硫酸软骨素的低分子化(固相催化降解)

将步骤2.3获得的干燥的固体(硫酸软骨素钠)用100mL水溶解，获得溶液，按照CN111495428A (专利名称：一种制备低分子量多糖的方法及其所用的催化剂)进行处理：简要地，溶液中加入0.1g树脂催化剂和2.1mL 30％过氧化氢，50℃反应6h后，得到低分子量硫酸软骨素溶液。

(4)硫酸软骨素生物多胺复合物的复合沉淀

向步骤(3)中获得的低分子量硫酸软骨素溶液中加入步骤2.2中获得的洗脱液A，调节pH至约5，加2.5倍体积无水乙醇醇沉，振荡，离心，离心所得下层固体用无水乙醇洗涤一次，离心，离心所得固体45℃真空干燥过夜，得到乳白色固体6.0g，即为硫酸软骨素生物多胺复合物。

经过测试，该物质为含有精胺和亚精胺的硫酸软骨素生物多胺复合物，经分离后检测，提取物中多胺总含量(摩尔质量比)为23.26μmol/g。其中，精胺4.31μmol/g，亚精胺7.07μmol/g，腐胺5.59μmol/g，尸胺6.29μmol/g。低分子软骨素的重均分子量为4.3k，其中大于50000的比例是0％，25000-50000是的比例是0％，400-25000是100％，具体地，分子量在8000-25000的含量为14％，5000-8000的含量30％，400-5000的含量为56％，400以下的含量为0％。

实施例3.酸提-有机溶剂萃取法+无水乙醇复合沉淀

本实施例采用鸡组织(含鸡骨、鸡头和鸡内脏)作为原料制备硫酸软骨素生物多胺复合物。

(1)原料的前处理

将新鲜鸡组织(含鸡骨、鸡头和鸡内脏)除肉。

(2)原料中硫酸软骨素和多胺的分离提取

2.1酸解

称取100g经前处理的鸡组织(含鸡骨、鸡头和鸡内脏)，用1M稀盐酸超声萃取两次共2小时(300mL 1h，200mL 1h)，萃取后使用滤纸过滤。组织滤渣用纯水50mL洗涤两次，组织残渣备用。

2.2生物多胺的萃取

将步骤2.1中的全部液体合并，共获得600mL淡黄色略浑浊液，旋转蒸发浓缩至50mL，离心，取上清液，用氢氧化钠调pH约12，离心，上清液用10mL正丁醇萃取两次，以提取生物多胺混合物。合并有机相，稀盐酸调至酸性，浓缩至干得灰棕色固体，为生物多胺的粗提物。

2.3硫酸软骨素分离提取

2.3.1酶解

向步骤2.1中的组织滤渣加入100mL pH 5.7-6.0的水和按组织滤渣的质量计2％的木瓜蛋白酶(2000U/mg)，搅拌均匀，将体系升温至65℃，保温反应3小时，然后补加1g的木瓜蛋白酶继续反应3小时，获得酶解液。

2.3.2分离提取

将步骤2.3.1中酶解液过滤后，向过滤后所得滤液中加入20.0g三氯乙酸，冰浴暂存1小时，混匀，8000rpm/min离心5分钟，取上清液，以去除蛋白质。用氢氧化钠固体调pH至大约5，加入三倍无水乙醇醇沉，振荡，离心，滤液暂存，离心所得醇沉固体用无水乙醇再次洗涤一次，离心，离心所得固体40℃真空干燥过夜，得白色固体，即为硫酸软骨素。

(3)硫酸软骨素的低分子化(固相催化降解)

步骤2.3.2中获得的经干燥的白色固体(硫酸软骨素)用100mL水溶解，获得溶液，按照CN111495428A(一种制备低分子量多糖的方法及其所用的催化剂)进行低分子化处理，得到低分子量硫酸软骨素溶液，简要地，溶液中加入0.05g树脂催化剂和1.1mL 30％过氧化氢，50℃反应3h后，得到低分子量硫酸软骨素溶液。

(4)硫酸软骨素生物多胺复合物的复合沉淀

使用步骤(3)中获得的低分子量硫酸软骨素溶液溶解步骤2.2中生物多胺的粗提物(灰棕色固体)，调节pH至约5，加入2.5倍体积无水乙醇醇沉，振荡，离心，离心所得下层固体用无水乙醇洗涤一次，离心，离心所得固体45℃真空干燥过夜，得到乳白色固体6.0g，即为硫酸软骨素生物多胺复合物。

经过测试，该物质为含有精胺、亚精胺、腐胺和尸胺的硫酸软骨素生物多胺复合物，经分离后检测，提取物中多胺总含量(摩尔质量比)为56.91μmol/g。其中，精胺28.16μmol/g，亚精胺9.82μmol/g，腐胺8.07μmol/g，尸胺10.86μmol/g。低分子软骨素重均分子量为6.2k，其中大于50000的比例是0％，25000-50000是的比例是0％，400-25000是100％，具体地，8000-25000的比例为24％，5000-8000的比例为26％，400-5000的比例为43％，400以下的比例为0％。

实施例4.酸提-有机溶剂萃取法+无水乙醇复合沉淀

本实施例采用鱼骨及大豆作为原料制备硫酸软骨素生物多胺复合物。大豆中富含精胺和亚精胺，添加大豆作为原料目的在于提高产物中多胺的含量。

(1)原料的前处理

采用搅拌机将原料鱼骨及大豆粉碎。

(2)原料中硫酸软骨素和多胺的分离提取

2.1酸解

称取100g经前处理的鱼骨及10g经前处理的大豆用1M稀盐酸超声萃取两次共2小时(300mL 1h，200mL 1h)，萃取后使用滤纸过滤。组织滤渣用纯水50mL洗涤两次，组织残渣备用。

2.2生物多胺的萃取

将步骤2.1中的全部液体合并，共600mL淡黄色略浑浊液，旋转蒸发浓缩至50mL，离心，取上清液，用氢氧化钠调pH约12，离心，上清液用10mL正丁醇萃取两次，以提取生物多胺混合物。合并有机相，浓缩至干得灰棕色固体，为生物多胺的粗提物。

2.3硫酸软骨素分离提取

2.3.1酶解

2.3.2分离提取

将步骤2.3.1中获得的酶解液使用滤纸过滤，向过滤后所得滤液中加入20.0g三氯乙酸，冰浴暂存1小时，混匀，8000rpm/min离心5分钟，取上清液，以去除蛋白质。量取100mL强酸性阳离子交换树脂树脂(在实施例中使用型号001*7)，加入空柱管中，用纯水冲洗，填实。将离心后上清液过柱，收集透过液，透过液为硫酸软骨素酸。

(3)硫酸软骨素生物多胺复合物的复合沉淀

将步骤2.2中灰棕色固体溶于步骤2.3.2中获得的透过液，调节pH至5.0。加入2.5倍无水乙醇醇沉，振荡，离心，离心所得醇沉固体用无水乙醇再次洗涤一次，离心，离心所得固体40℃真空干燥过夜，得白色固体，即为硫酸软骨素生物多胺复合物。

经过测试，该物质为含有精胺、亚精胺、腐胺和尸胺的硫酸软骨素生物多胺复合物，经分离后检测，提取物中多胺总含量(摩尔质量比)为129.7μmol/g，其中，精胺5.2μmol/g，亚精胺70.3μmol/g，腐胺49.7μmol/g，尸胺4.6μmol/g。软骨素的重均分子量为22k，其中大于50000的比例为0％，25000至50000的比例为37％，400-25000的比例为63％，其中8000-25000的比例为53％，5000-8000的比例为8％，400-5000的比例为2％，400以下的比例为0％。

测试例

测试例1：佐剂型关节炎小鼠试验评价不同硫酸软骨素对慢性炎症治疗效果

为分析CSX是否能够抑制小鼠炎症反应，建立小鼠佐剂关节炎模型(每天每只小鼠(维通利华，BALB/c)右后趾部注射0.01mL弗氏完全佐剂(complete Freund’s adjuvant,CFA，Sigma)，一周建立关节炎模型后，给药)，然后灌胃给药(剂量：3mg/只/天；注：1A组为CS、1B组为低分子CS，低分子CS为实施例2中降解方法得到的CS(重均分子量4.3k，分子量分布同实施例2)、1C组为CSX，其为实施例3的产物)。30天后，眼眶采血，制备血清，通过Mouse IL-6 ELISA试剂盒(货号：VAL604)与Mouse IL-1 ELISA试剂盒(R&D Systems，货号：MLB00C)检测IL-6与IL-1β炎症因子。

如图1A和图1B所示，结果显示，1C组显著降低小鼠血清中IL-6及IL-1β的水平。正常组(无模型组)的血清IL-6及IL-1β水平极低，对照组(模型组)IL-6及IL-1β显著升高。1C组的血清IL-6水平已经与正常组(无模型组)相当。显示出强有力的炎症抑制效果。

此外，对小鼠足趾部宽度进行的测量。以分析足趾肿胀水平。参见图2A，结果显示，随着给药时间延长，1B组及1C组的小鼠足趾肿胀显著下降，其中1C组，在给药22天时，其足趾肿胀已经减缓很多，个别小鼠已经接近正常组。可见，1C组具有显著降低佐剂诱导的足趾肿胀的效果。

对小鼠的足趾进行了解剖分析，参见图2B，结果显示，对照组(模型组)腿部出现显著的炎症反应引起的红肿及病灶。1C组则未见显著炎症反应病灶，无红肿现象。

结果表明：用3mg/天/只CSX能显著改善小鼠关节炎，低分子量CS效果次之，传统CS最差，30天后炎症仍很明显。

测试例2：对关节炎(类风湿性关节炎)的治疗效果

大鼠类风湿性关节炎模型中，CSX对类风湿关节炎具有显著治疗效果。主要表现在：CSX能显著改善炎症模型大鼠足趾、肝脏、脾脏等器官的肿胀度，降低血液中淋巴细胞、中性粒细胞炎症表型，疗效接近甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)；能基本治愈慢性炎症导致的关节及足骨损伤，疗效优于MTX；没有MTX毒副作用。

本测试例进行了大鼠(维通利华，SD)类风湿性关节炎中CSX效果的分析。大鼠类风湿性关节炎模型的制备：用牛II型胶原(CII，索莱宝)制备大鼠类风湿性关节炎模型，将CII与等体积的弗氏完全佐剂(CFA，Chondrex)混合制成乳剂，乳剂中CII的终浓度为1.0mg/mL。随机选取6只大鼠作为空白对照组(即正常组/空白组)，其余大鼠用于类风湿性关节炎模型的制备，除空白对照组大鼠外，其余大鼠均在背部、尾根部多点注射乳剂共计0.5mL，10天后，在第一次免疫的相同部位注射相同剂量的胶原蛋白与佐剂的乳剂混合物以加强免疫。分组及给药：正常组(空白组)、模型组、阳性对照组(MTX，甲氨蝶呤溶液0.2mg/kg，隔天灌胃给药)、药物组(实施例2获得的CSX，用量200mg/kg，每天灌胃给药)。

给药后1周、2周、3周、4周观察大鼠足趾肿胀情况，测量记录各组大鼠右后肢足趾厚度。具体方法：限制大鼠活动后，轻柔拉直大鼠右后肢，使用记号笔在大鼠足趾测量处进行标记后，游标卡尺测量足趾的厚度。

参见图3A和图3B，结果显示，药物组(CSX)大鼠的足趾肿胀度在给药7天后，显著下降，且无任何不良反应；给药14天后，其足趾肿胀进一步下降。模型组大鼠足趾一直处于显著肿胀状态。继续给药至28天，足趾肿胀维持在一个比较稳定的水平。不在体现出进一步的下降，可能与肿胀造模导致的结蹄组织增生有关。阳性对照组(MTX)大鼠也体现出了其预期的可以抑制足趾肿胀的效果，但表现出腹泻、体重减轻等不良反应。以上结果说明，CSX具有显著的抑制大鼠类风湿关节炎引起的足趾肿胀的效果。且在大鼠中无显著毒性。

参见图4A至图4E，给药14天后，采集了大鼠的静脉血，并进行血常规分析，可观察到阳性对照组(MTX)的淋巴细胞绝对值与模型组相比显著下降，药物组(CSX)的淋巴细胞百分比较模型组显著降低。但药物组(CSX)的淋巴细胞绝对值与模型组无统计学差异。此外，阳性对照组(MTX)与模型组比较，中性粒细胞绝对值显著降低，药物组(CSX)也出现显著降低。白细胞绝对值显示模型组与药物组(CSX)、阳性对照组(MTX)无统计学差异。

参见图5A至图5C，在给药28天后，进行了大鼠的解剖，并取肝脏、脾脏和胸腺，精确称量重量后，以各脏器与大鼠体重的比值，进行了脏器指数测定，结果显示CSX可以显著降低大鼠肝脏肿大。脾脏指数反映出CSX可以显著降低大鼠脾脏肿大，提示降低慢性炎症的发生。胸腺指数统计学无显著差异。

以上结果说明：CSX能显著改善炎症模型大鼠足趾、肝脏、脾脏等肿胀度，降低血液中淋巴细胞、中性粒细胞炎症表型，疗效接近MTX。

参见图6和图7大鼠踝关节部位CT显示：空白组(正常组)大鼠关节部位界面清晰，各关节结合部位规则，骨质表面光滑。模型组大鼠关节结合界面不清晰，关节不规则，骨质表面及不光滑、骨质增生、肿大等。药物组(CSX)大鼠关节部位也有一定程度的损伤，但关节界面较模型组清晰，关节较规则，骨质表面较光滑。阳性对照组(MTX)大鼠较对照组关节骨质表面相对光滑，关节结合面较模型组更紧密。但其关节损伤程度较药物组(CSX)大鼠更严重。

参见图8A至图8F，CT结果显示，模型组的骨密度(bone mineral density,BMD)显著低于空白组(正常组)。给药CSX后，能够有效缓解炎症诱发的骨密度降低。模型组的踝关节比表面积较空白组有明显升高，而给药CSX及MTX后，大鼠踝关节的骨表面积(bone surface，BS)显著降低，其中药物组(CSX)大鼠下降更为明显。药物组(CSX)大鼠表现出踝关节的骨体积(bone volume,BV)的显著降低及骨表面积与骨体积比值(BS/BV)的现显著降低。骨小梁分离度(Trabecular Separation/Spacing，Tb.Sp)是指骨小梁之间的髓腔平均宽度。Tb.Sp增加，可能发生骨质疏松。模型组大鼠Tb.Sp出现显著升高，而在CSX给药后，大鼠Tb.Sp出现降低，提示CSX有降低炎症导致的骨质疏松的效果。药物组(CSX)的骨小梁的平局厚度(Trabecular Thickness，Tb.Th)较模型组有所上升，也反映出CSX能够抑制炎症诱到的骨质疏松。综上，CT结果说明，CSX有显著抑制炎症导致的骨质疏松，提高骨密度，改善骨质表面的光滑程度的功能，其效果要优于MTX。

同时，实验显示，阳性对照组(MTX)在本实验给药剂量下，出现腹泻症状，而药物组(CSX)则未出现任何表观异常。小鼠急性毒性试验显示，药物组(CSX)在单次给药高达2000mg/kg时，未出现毒性反应，提示，CSX可能具有更好的安全性。

上述CT结果说明：CSX能基本治愈慢性炎症导致的关节及足骨损伤，药效强于MTX。

测试例3：降血脂活性

为评价CSX的降血脂效果，本测试例通过饲喂C57/b6小鼠高脂肪饲料(60％脂肪热量饲料(Research diets))三周后，灌胃给药43天(注：2A组为普通CS、2B组为低分子CS，低分子CS为实施例2中降解方法得到的CS(重均分子量4.3k，分子量分布同实施例2)、2C组为实施例1的A-3号提取物产物CSX，给药量都为6mg/只，每天灌胃给药)，评价了小鼠总胆固醇(T-CHO)、甘油三酯(TG)、高/低密度脂蛋白胆固醇(H/LDL-C)的水平。无血脂模型组为正常饲料喂养组、血脂模型组为进行高脂肪饲料饲养，但仅灌胃PBS组、普通饲料组为造模三周后，改用普通饲料饲养组。普通软骨素是湖南伍星生物科技公司提供的牛来源软骨素，重均分子量为21k，其中分子量大于50000的比例为0％，25000至50000的比例为31％，分子量400-25000的比例为69％，分子量在400以下的硫酸软骨素的比例为0％。

参见图9A至图9D，与血脂模型组比对，2A、2B、2C组总胆固醇均显著降低，其中2C组的降低效果最为明显。2A及2B组的总甘油三酯较血脂模型组下降不显著，2C组表现出显著性降低。2A、2B、2C组低密度脂蛋白胆固醇较血脂模型组显著降低，2C组降低最为明显。高密度脂蛋白胆固醇较血脂模型组相比，2A、2B组表现出显著降低，2C组不显著。本测试例的动物试验表明：CSX具有显著降低血清总胆固醇，血清总甘油三酯及低密度脂蛋白的效果。

测试例4：抗皮肤炎症活性

为评价CSX对皮肤炎症的消炎作用，本测试例采用小鼠耳肿模型，对小鼠右耳进行3次致敏。致敏剂为佛波酯(普西唐试剂，中国)，浓度为0.125mg/mL，致敏方式为涂抹小鼠右耳，每次20μL(每面10μL)，每次致敏相隔48小时。4A组为CSX(实施例3产物)水溶液、4B组为低分子CS与亚精胺的复配水溶液(亚精胺的摩尔质量比例同4A组的多胺摩尔比例，亚精胺的摩尔量与实施例3的提取物中所含的多胺总摩尔量相同；CS使用量与提取物减去多胺外的质量相同，低分子CS为实施例2中降解方法得到的CS(重均分子量4.3k，分子量分布同实施例2))、4C组为阴性对照组(超纯水)。4D组为普通CS与亚精胺的复配水溶液(亚精胺的摩尔质量比例同4A组的多胺摩尔比例，即亚精胺的摩尔量与实施例3的提取物中所含的多胺总摩尔量相同；CS使用量与提取物减去多胺外的质量相同)。普通CS是湖南伍星生物科技公司提供的软骨素，其重均分子量为48k，其中分子量在大于50000的含量为34％，25000-50000的含量55％，400-25000的含量为11％。4A和4B、4D的溶液浓度都为质量体积比2％，每天给药一次，连续给药共6天，给药方式为表面涂抹，给药量都为20μL/只。评价指标主要为小鼠耳朵肿胀度及体重。小鼠耳肿度的评价方法为脱颈椎处死小鼠，剪下双耳，用直径6mm打孔器取左右对称耳片，电子天平拣重，左右耳重量差计为肿胀度。

结果参见下表2和表3，可见实施例3产物CSX和低分子CS与亚精胺的复配均具有显著消除炎症的作用，实施例3产物效果更佳，但均明显优于阴性对照组。并且，CSX对小鼠体重无影响，未发现明显副作用。低分子CS与亚精胺的复配效果优于普通CS与亚精胺的复配。

表2.小鼠耳朵肿胀度统计

表3.小鼠体重统计

测试例5：抗氧化活性

为评价CSX的抗氧化效果，本测试例采用人肝脏HEPG2细胞为模型，通过荧光探针法检测CSX对细胞活性氧自由基的影响。本测试例中采用的CSX-1为实施例1的A-3号提取物产物，CSX-2为低分子CS与多胺(精胺、亚精胺和腐胺)复配，复配比例与CSX-1相同(三种多胺的配比与实施例1的A-3号提取物中的配比相同，多胺的总摩尔量与实施例1的A-3号提取物中所含的多胺总摩尔量相同；CS使用量与提取物减去多胺外的质量相同)，低分子CS与实施例2中降解方法CS的方法相同(重均分子量4.3k，分子量分布同实施例2)。

本实验的原理是一种利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测。DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。

取对数生长期细胞，显微镜观察细胞状态。以无菌PBS洗两次，弃去上清，加入3mL PBS，加入0.5mL 2.5％胰酶，37℃消化5分钟，加入3mL有血清培养基终止反应，吸至15mL离心管，1000转离心，弃上清，加入适量培养基，细胞计数，分2000至10000个细胞至96孔板的每个孔，37℃培养6小时，使细胞贴壁，加入不同浓度药物刺激，24小时取出板子，1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使探针终浓度为10μM。去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA。37℃细胞培养箱内孵育20分钟。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。使用488nm激发波长，525nm发射波长，流式细胞仪检测刺激前后荧光的强弱。

细胞学实验表明：CSX(尤其是低分子CSX)在0.25mg/mL的终浓度时具有显著的抗氧化能力。与对照组(未处理细胞)相比，CSX-1给药组的活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)阳性细胞数，从36.5％下降到25.7％，CSX-2进一步降低至1.17％，参照图10。

测试例6：抗阿尔兹海默症相关炎症的活性检测

阿尔兹海默症(Alzheimer disease，AD)等神经退行性疾病的研究显示，炎症过程在AD的发病过程起根本性作用，中枢神经组织中的小胶质细胞介导的炎症反应是神经退行性疾病尤其是阿尔兹海默症的主要诱因之一。与AD相关的炎性成分包括脑细胞如小胶质细胞和星形细胞。小胶质细胞释放的IL-6被认为是其介导AD产生的主要因素之一。

为检测CSX抑制小胶质细胞炎症的效果，以CSX(实施例2中制备)处理人小胶质细胞HMC3。结果表明，CSX可显著抑制LPS诱导的小胶质细胞的IL-6的表达水平。参见图11。

测试例7：CSX细胞水平抑制炎症反应的效果

小鼠单核细胞RAW264.7在脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)的诱导下，会导致细胞诸多炎症因子，如IL-6、TNF-α、IL-1β的表达水平上调。本测试例分析了CSX能否抑制细胞炎症因子的产生。本测试例使用的CSX为实施例3产物。

以DMEM 10％FBS(Life technology)培养基加入终浓度0.1μg/mL LPS(索莱宝)。以含LPS的10％FBS DMEM配制CSX，终浓度为0.6mg/mL，每孔加入100μl。每个梯度三个重复。地塞米松(Dexamethasone,DXM)用量母液2mg/mL。以含LPS的10％FBS DMEM 1000倍比稀释，每孔加入100μl。每个梯度三个重复。设置细胞无LPS刺激组，细胞LPS刺激组。各三个重复。培养24小时后，小心吸取上清直接酶联免疫吸附试验(ELISA)分析。

参照图12A～图12C，结果显示，CSX能够显著抑制LPS诱导的小鼠单核巨噬细IL-6、IL-1β及TNF-α的表达。对IL-6的抑制效果优于地塞米松。证明CSX具有非常好的细胞水平炎症因子表达水平的效果。

测试例8：延缓衰老/延长寿命活性

为评价CSX延长寿命活性，以孔雀鱼为研究对象，检测子代存活时间。实验用鱼为购自北京十里河花鸟鱼虫市场人工培育的受孕孔雀鱼一尾(商品名“鸿运当头”)。养殖一周后，此实验用鱼产鱼苗50余尾，稳定饲养3日后，将鱼苗分为2组养殖，每组各25尾。此测试例使用的CSX为实施例3产物。

饲养条件：每缸约放10L已晾晒1周的水，保持恒温26摄氏度，配置水循环过滤系统和加氧装置。每二天补水到10L，每周换约1/3水(约3-4L)。用水为桶装饮用水。每天喂适量幼鱼饲料一次。1号缸加CSX：每周换水后，加入30mg/L CSX；2号缸正常养殖：每周换水不加CSX。每日观察统计鱼苗的死亡数量，以(存活天数*条数)总和/总条数，分别计算每缸鱼苗的平均存活时间。

结果显示，1号缸平均存活时间为31.88天，2号缸平均存活时间为27.48天，说明30mg/L CSX可延长人工培育孔雀鱼鱼苗存活时间16.01％，结果参见图13。

为进一步评价CSX延缓衰老/延长寿命活性，以黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(本实验室饲养)为研究对象，检测其存活时间。实验用黑腹果蝇为实验室饲养的w1118野生型黑腹果蝇，基础饲料配方为2.2％蔗糖、8％麦芽提取物、1.8％酵母、1.2％尼泊金丁酯的液体饲料。以3种不同配方的饲料分别喂养雌、雄果蝇，配方1为基础饲料配方，配方2为向基础饲料配方中加入0.1g/L CSX(实施例2产物)，配方3为向基础饲料配方中加入亚精胺盐酸盐与精胺盐酸盐的组合(其摩尔量是配方2中多胺的摩尔量的10倍)。每种配方设置6组，包括雌虫3组、雄虫3组，每组各20头，均为羽化后4小时内未交配的雌、雄果蝇。每日观察统计果蝇的死亡数量，每日补充添加400μl各组对应的饲料，以(存活天数*头数)总和/总头数，分别计算每组果蝇的平均存活时间。

参见图21A和图21B，结果显示，配方1饲养的果蝇平均存活时间为46.2～49天，配方2饲养的果蝇平均存活时间为54.5～59天，配方3饲养的果蝇平均存活时间为50.6～52.5天。说明，与普通饲料相比，CSX可延长果蝇寿命18.0％～20.4％；值得一提的是，配方2的CSX中多胺摩尔总量仅为配方3中游离多胺的十分之一，但是与之相比，CSX组的延长寿命效果比一般多胺高出7.7％～12.38％。

测试例9：抗炎活性测试

本测试例对各类物质对IL-6抗炎活性测试，检测方法同实施例1。在本测试例中，使用的低分子CS全部为实施例2中降解方法得到的CS(重均分子量4.3k，分子量分布同实施例2)。其中，C-1号为低分子CS，C-2号为精胺，C-3号为亚精胺，C-4号为亚精胺+精胺，C-5为亚精胺+精胺+腐胺，C-6号为低分子CS+精胺，C-7号为低分子CS+亚精胺，C-8号为低分子CS+亚精胺+精胺，C-9号为低分子CS+亚精胺+精胺+腐胺。其中C3-C12号的多胺总摩尔量相同，且涉及采用两种以上多胺的，各多胺摩尔比相同。由上述结果可知，CS与多胺的复配物的活性显著优于单独的低分子CS或者多胺。多种胺组合的效果优于单独胺。参见图22。

测试例10：低分子CS与生物多胺和非生物多胺活性的比较

本测试例对低分子CS与各类生物多胺的组合对IL-6抗炎活性测试，检测方法同实施例1，低分子CS全部为实施例2中降解方法得到的CS(重均分子量4.3k，分子量分布同实施例2)。在本测试例中，使用的低分子CS全部为实施例2中降解方法得到的CS(重均分子量4.3k，分子量分布同实施例2)。结果参见图23，其中，D-1号为低分子CS+精胺，D-2号为低分子CS+亚精胺，D-3号为低分子CS+腐胺，D-4号为低分子CS+尸胺，D-5为低分子CS+组胺，D-6为低分子CS+色胺，D-7为低分子CS+1,7-二氨基庚烷，D-8为低分子CS+五乙撑六胺。各组中多胺的总摩尔浓度质量比相同均为2μmol/g，且涉及采用两种以上多胺的，各多胺摩尔比相同。由上述结果可知，低分子CS与各类多胺的组合活性不同，其中精胺与亚精胺活性相当，并优于腐胺，更优于尸胺。而组胺和色胺，以及非生物多胺1,7-二氨基庚烷和五乙撑六胺有致炎作用，且组胺作用最强。

测试例11：不同生物多胺含量的硫酸软骨素生物多胺复合物活性比较

本测试例对低分子CS与精胺按照不同比例复配，测定其复配组合的稳定性，低分子CS全部为实施例2中降解方法得到的CS(重均分子量4.3k，分子量分布同实施例2)。实验方法如下：配制低分子CS水溶液40mg/ml，按照下表4浓度配制精胺盐酸水溶液。取相同体积的两种溶液混匀，得E-1至E-8号复配溶液。使用紫外分光光度计测定溶液得透光度(波长600nm)。其中E-7、E-8号透光度明显降低，可能是因为形成了纳米至微米级别的胶体溶液。通过两种方式测定复配溶液的稳定性：1.静置7天观察其稳定性；2.向1ml兔血浆溶液(北京陆桥生物)加入复配溶液20μl，观察溶液变化，以模拟其在血液中的稳定性。结果如下表4。由上述结果可知，精胺含量过高(E-7、E-8号)，容易与软骨素作用产生沉淀，造成体系不稳定。同时过高的精胺含量(E-6、E-7、E-8号)，容易与血清蛋白发生静电结合，从而产生大量沉淀，并且细胞试验发现其细胞毒性明显。这说明过高的精胺含量的组合稳定性不佳且有较高毒性，不具备实际应用价值。E-6、E-7、E-8号是按照引用文献4的方法合成。

表4：

注：“-*”表示由于细胞毒性过大，无法得出有效的IL-6抑制率数据。

测试例12：证明其他多糖及其他重均分子量CS效果不及本组合

本测试例对各分子量分布的CS及其他阴离子多糖与多胺的组合对IL-6抗炎活性测试，检测方法同实施例1。组合中多胺为腐胺、精胺和亚精胺的组合，总摩尔浓度质量比相同均为2μmol/g，且，涉及两种以上多胺的，各多胺摩尔比相同。其中，F-1号为CS+多胺，所使用的为实施例2中降解方法得到的CS，重均分子量为4.3k，分子量分布同实施例2。F-2号为CS+多胺，所使用的CS为湖南伍星生物科技公司提供的产品，其重均分子量为48k，其中分子量在大于50000的含量为34％，25000-50000的含量55％，400-25000的含量为11％。F-3号为CS+多胺，所使用的CS为湖南伍星生物科技公司提供的产品，其重均分子量为35k，其中分子量在大于50000的含量为12％，25000-50000的含量68％，400-25000的含量为20％。F-4号为CS+多胺，所使用的CS为湖南伍星生物科技公司提供的产品，通过酶解法制备得到，其重均分子量为879，400-2000的比例是99％，其中400-1000的比例是54％，1000-2000的比例是45％，小于400的比例为1％，大于2000的比例为0％。F-5为CS+多胺，所使用的CS为湖南伍星生物科技公司提供的产品，其重均分子量为27k，其中分子量在大于50000的含量为0％，25000-50000的含量53％，400-25000的含量为47％。F-6为CS+多胺，所使用的CS为湖南伍星生物科技公司提供的产品，通过酶解法制备得到，其重均分子量为598，小于400的比例为11％，大于2000的比例为0％，400-2000的比例是89％，其中400-1000的比例是85％，1000-2000的比例是4％。F-7号为CS完全水解物+多胺，CS完全水解物的重均分子量为415，小于400的比例为56％，大于400的比例为44％。CS完全水解物是使用6M盐酸在100摄氏度条件下水解硫酸软骨素4h制备而得到的。F-8号为透明质酸+多胺，F-9为海藻糖+多胺。测定结果如图24所示。由上述结果可知，F-1、F-4、F-5、F-6低分子CS与多胺的复配物的活性显著优于其他分子量分布的CS或者其他阴离子多糖与多胺的组合。

测试例13：证明各种多胺的摩尔比例不会对活性造成明显影响

本测试例对CS与不同摩尔比例的多胺的组合对IL-6抗炎活性测试，检测方法同实施例1，CS全部为实施例2中降解方法得到的CS(重均分子量4.3k，分子量分布同实施例2)。组合中多胺为腐胺、精胺和亚精胺的组合，总摩尔浓度质量比相同均为2μmol/g。其中G-1的多胺摩尔比为精胺：亚精胺：腐胺＝1：1：1，G-2的多胺摩尔比为精胺：亚精胺：腐胺＝5：1：1，G-3的多胺摩尔比为精胺：亚精胺：腐胺＝1：5：1，G-4的多胺摩尔比为精胺：亚精胺：腐胺＝1：1：5。测定结果如图25所示。由上述结果可知，在对于同一分子量和分子量分布的CS而言，多胺的摩尔总量相同的情况下，各多胺之间不同摩尔比例不会对活性造成明显影响。

Claims

一种硫酸软骨素生物多胺复合物，其为硫酸软骨素和生物多胺的复合物，所述硫酸软骨素与生物多胺非共价连接，所述生物多胺包括精胺、亚精胺、腐胺和尸胺的一种、两种、三种或以上的组合。
根据权利要求1所述的硫酸软骨素生物多胺复合物，其中，所述的硫酸软骨素为酸形式的硫酸软骨素或者盐形式的硫酸软骨素。
根据权利要求1或2所述的硫酸软骨素生物多胺复合物，其中，

所述的硫酸软骨素，按照GPC积分比例，重均分子量在50000以上的硫酸软骨素的比例为0％；

和，所述的硫酸软骨素，按照GPC积分比例，重均分子量在25000-50000的硫酸软骨素的比例在40％以下；

优选地，重均分子量在25000-50000的硫酸软骨素的比例在35％以下；

进一步优选地，重均分子量在25000-50000的硫酸软骨素的比例在30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％以下或0％；

和，所述的硫酸软骨素，按照GPC积分比例，重均分子量在400-25000的硫酸软骨素的比例上限在80％以上、优选在81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上或100％；

且，重均分子量在400-25000的硫酸软骨素的比例的下限在40％以上、优选在41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％或60％以上；

和，所述的硫酸软骨素，按照GPC积分比例，重均分子量在400以下的硫酸软骨素的比例在15％以下，优选在3％以下，更优选在1％以下，最优选为0％；

和/或，

重均分子量上限在25000以下、优选在24000、23000、22000、21000、20000、19000、18000、17000、16000、15000、14000、13000、12000、11000、10000、9000或8000以下；且重均分子量下限在400、500、600、700或800以上的硫酸软骨素的比例上限在80％以上、优选在81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上或100％，下限在40％以上、优选在41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％或60％以上；

其中，重均分子量在25000-50000的硫酸软骨素的比例、重均分子量在400-25000的硫酸软骨素的比例、重均分子量在400以下的硫酸软骨素的比例之和为100％。
根据权利要求1～3中任一项所述的硫酸软骨素生物多胺复合物，其中，所述的硫酸软骨素，按照GPC积分比例，重均分子量在400-10000的硫酸软骨素的比例为40％-100％，优选50％-100％、60％-100％、70％-100％、80％-100％；

优选地，按照GPC积分比例，所述硫酸软骨素的分子量分布如下：重均分子量大于50000的硫酸软骨素的比例是0％，重均分子量在25000-50000的硫酸软骨素的比例为0-40％，重均分子量在400-10000的硫酸软骨素的比例、优选重均分子量在400-8000的硫酸软骨素的比例在40％-100％、重均分子量在400以下的硫酸软骨素的比例为15％以下。
根据权利要求1～4中任一项所述的硫酸软骨素生物多胺复合物，其特征在于，所述的硫酸软骨素生物多胺复合物的重均分子量在400～50000，

优选地，所述的硫酸软骨素生物多胺复合物的重均分子量在400～25000。
根据权利要求1～5中任一项所述的硫酸软骨素生物多胺复合物，其中，按硫酸软骨素生物多胺复合物总重量计(g)，在所述硫酸软骨素生物多胺复合物中，含有的所述生物多胺在200μmol/g以下，优选在199μmol/g、198μmol/g、197μmol/g、196μmol/g、195μmol/g、194μmol/g、193μmol/g、192μmol/g、191μmol/g、190μmol/g、189μmol/g、188μmol/g、187μmol/g、186μmol/g、185μmol/g、184μmol/g、183μmol/g、182μmol/g、181μmol/g或180μmol/g以下；

且，含有的所述生物多胺在0.5μmol/g以上，优选在0.6μmol/g、0.7μmol/g、0.8μmol/g、0.9μmol/g、1μmol/g以上。
根据权利要求1～6中任一项所述的硫酸软骨素生物多胺复合物，其中，硫酸软骨素生物多胺复合物中蛋白的质量百分比小于8％，优选小于5％，更优选小于3％，最优选小于1％，进一步优选为0％。
如权利要求1～7中任一项所述的硫酸软骨素生物多胺复合物的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括将硫酸软骨素和生物多胺混合的步骤，其中，按硫酸软骨素生物多胺复合物总重量计 (g)，在所述硫酸软骨素生物多胺复合物中，含有所述生物多胺0.5-200μmol/g。
如权利要求1～7中任一项所述的硫酸软骨素生物多胺复合物的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括将从原料中分离提取的含硫酸软骨素和多胺的提取液与乙醇混合的步骤，其中，所述提取液的pH值在4～6，所述提取液与乙醇的体积比为1：1～3。
根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，从原料中分离提取硫酸软骨素和多胺包括：

酶解或酸解的步骤，通过酶解或酸解将原料裂解，获得酶解液或酸解液；

分离提取硫酸软骨素和多胺的步骤，从所述酶解液或酸解液中同时或分步提取硫酸软骨素和多胺。
根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，对于分步提取硫酸软骨素和多胺，采用色谱法或萃取法将所述酶解液或酸解液中的多胺分离，并将分离多胺后剩余物经酶解法、蛋白沉淀法、色谱法、醇沉法中的一种或多种进行处理，以将剩余物中的硫酸软骨素分离；

可选地，在将硫酸软骨素分离后，还包括将硫酸软骨素低分子化的步骤。
根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，对于同时提取硫酸软骨素和多胺，采用蛋白沉淀法，将所述酶解液或酸解液中蛋白沉淀，以分离硫酸软骨素和多胺。
如权利要求9～12中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述的原料包括动物组织、植物组织以及微生物培养发酵液。
一种硫酸软骨素生物多胺复合物，其由权利要求8～12中任一项所述的制备方法制备获得。
硫酸软骨素生物多胺复合物的下述(a)～(g)中任一用途：

(a)制备用于抗炎的药物中的用途；

(b)制备用于治疗和/或预防炎性疾病的药物中的用途；

(c)制备用于降血脂的药物中的用途；

(d)制备用于治疗和/或预防高脂血症的药物中的用途；

(e)制备治疗和/或修复关节损伤的药物中的用途；

(f)制备抗氧化的药物中的用途；

(g)制备延缓衰老和/或延长寿命的药物中的用途；

其中，所述的硫酸软骨素生物多胺复合物为如权利要求1～7、14中任一项所述的硫酸软骨素生物多胺复合物和/或如权利要求8～13中任一项所述的制备方法所制备获得的硫酸软骨素生物多胺复合物。
根据权利要求15所述的用途，其中，所述炎性疾病包括炎症诱发因素导致的、和/或由炎症细胞、白介素和/或肿瘤坏死因子诱导的炎症，优选地，所述炎性疾病选自过敏症、湿疹、心肌梗死、脑硬死、阿尔兹海默症、皮肤炎或关节炎中的一种或多种；或者，

所述高脂血症包括原发性高脂血症和/或继发性高脂血症；或者，

所述高脂血症包括高甘油三酯血症和/或高胆固醇血症；或者，

所述高脂血症包括高脂血症相关病症，可选地，高脂血症相关病症包括心血管病，任选地，所述心血管病包括动脉硬化症、冠状动脉疾病、心绞痛、颈动脉疾病、中风、脑动脉硬化、心肌梗塞、脑梗塞、充气囊血管成形术后的再狭窄、高血压、间歇性跛行、异常脂血症、餐后脂血症和黄瘤中的一种或多种；或者，

所述关节损伤包括炎症、老化、运动、受伤造成的关节损伤。
如权利要求1～7、14中任一项所述的硫酸软骨素生物多胺复合物和/或如权利要求8～13中任一项所述的制备方法所制备获得的硫酸软骨素生物多胺复合物在制备保健食品或化妆品中的用途。
一种药物组合物、保健品或化妆品，其包含如权利要求1～7、14中任一项所述的硫酸软骨素生物多胺复合物和/或如权利要求8～13中任一项所述的制备方法所制备获得的硫酸软骨素生物多胺复合物。