[go: up one dir, main page]

WO2023182322A1 - ３－ヒドロキシアジピン酸および／または３－オキソアジピン酸を生産するための遺伝子改変微生物および当該化学品の製造方法 - Google Patents

３－ヒドロキシアジピン酸および／または３－オキソアジピン酸を生産するための遺伝子改変微生物および当該化学品の製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2023182322A1
WO2023182322A1 PCT/JP2023/011072 JP2023011072W WO2023182322A1 WO 2023182322 A1 WO2023182322 A1 WO 2023182322A1 JP 2023011072 W JP2023011072 W JP 2023011072W WO 2023182322 A1 WO2023182322 A1 WO 2023182322A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
acid
coa
producing
yhhs
reaction
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2023/011072
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
匡平 磯部
健司 河村
勝成 山田
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Toray Industries Inc
Original Assignee
Toray Industries Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Toray Industries Inc filed Critical Toray Industries Inc
Priority to US18/848,396 priority Critical patent/US20250215461A1/en
Priority to EP23774917.1A priority patent/EP4497819A1/en
Priority to CN202380027530.2A priority patent/CN118922530A/zh
Priority to JP2023553007A priority patent/JPWO2023182322A1/ja
Publication of WO2023182322A1 publication Critical patent/WO2023182322A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/44—Polycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C51/00—Preparation of carboxylic acids or their salts, halides or anhydrides
    • C07C51/347—Preparation of carboxylic acids or their salts, halides or anhydrides by reactions not involving formation of carboxyl groups
    • C07C51/377—Preparation of carboxylic acids or their salts, halides or anhydrides by reactions not involving formation of carboxyl groups by splitting-off hydrogen or functional groups; by hydrogenolysis of functional groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/38—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from Aspergillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/44—Polycarboxylic acids
    • C12P7/50—Polycarboxylic acids having keto groups, e.g. 2-ketoglutaric acid

Definitions

  • the present invention relates to a genetically modified microorganism that produces a high amount of 3-hydroxyadipic acid and/or 3-oxoadipic acid, and a method for producing 3-hydroxyadipic acid and/or 3-oxoadipic acid using the genetically modified microorganism. .
  • 3-Hydroxyadipic acid (IUPAC name: 3-hydroxyhexanedioic acid) is a dicarboxylic acid having 6 carbon atoms. These can be used as polyesters by polymerizing with polyhydric alcohols, and as raw materials for polyamides by polymerizing with polyvalent amines. Furthermore, compounds obtained by adding ammonia to these terminals to form lactams can also be used as raw materials for polyamide.
  • 3-oxoadipic acid (also known as ⁇ -ketoadipic acid, IUPAC name: 3-oxohexanedioic acid) is a dicarboxylic acid with 6 carbon atoms and a molecular weight of 160.12.
  • 3-oxoadipic acid can be used as a polyester by polymerizing with a polyhydric alcohol, and as a raw material for polyamide by polymerizing with a polyvalent amine.
  • ammonia to the terminal of 3-oxoadipic acid to form a lactam, it can be used alone as a raw material for polyamide.
  • Patent Document 1 describes a method for catalyzing the reaction of succinyl-CoA and acetyl-CoA to 3-oxoadipyl-CoA and CoA.
  • a method for producing 3-hydroxyadipic acid using a microorganism of the genus Serratia with enhanced enzyme activity is disclosed, and Patent Document 2 also discloses a method for producing 3-hydroxyadipic acid using succinyl-CoA and acetyl-CoA as starting materials, which do not exist in nature. It has been reported that 3-oxoadipic acid (3-oxoadipate) can be produced as an intermediate in the adipic acid biosynthetic pathway during the process of producing adipic acid using microorganisms.
  • Patent Document 4 describes a method for producing 3-hydroxyadipic acid and/or ⁇ -hydromuconic acid using a genetically modified microorganism in which the function of a dicarboxylic acid excretion carrier is deleted or reduced, and the method for producing 3-hydroxyadipic acid and/or ⁇ -hydromuconic acid is described.
  • the route is via an enzymatic reaction that converts succinyl-CoA and acetyl-CoA to 3-oxoadipyl-CoA and CoA, and the productivity of these substances is improved by deleting or reducing the function of the dicarboxylic acid excretion carrier.
  • the present invention provides a genetically modified microorganism capable of producing 3-hydroxyadipic acid and/or 3-oxoadipic acid with high productivity, and a genetically modified microorganism capable of producing 3-hydroxyadipic acid and/or 3-oxoadipic acid using the modified microorganism.
  • the purpose is to create a method for producing acid.
  • the present invention provides the following (1) to (13).
  • microorganisms that have the ability to produce 3-hydroxyadipic acid and/or 3-oxoadipate, the activity of the enzyme that catalyzes the reaction from succinyl-CoA and acetyl-CoA to 3-oxoadipyl-CoA and CoA
  • the organic phosphate compound excretion carrier is a phosphoserine excretion carrier and/or a glyphosate excretion carrier.
  • A Polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 28-30, 46, 48 or 50
  • B 60% for the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 28-30, 46, 48 or 50
  • Polypeptide (C) SEQ ID NOs: 1, 3, 28 to 30, 46, 48 having a sequence identity of % or more and having a function of improving productivity of 3-hydroxyadipic acid and/or 3-oxoadipic acid or consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted and/or added in the 50 amino acid sequence, and the productivity of 3-hydroxyadipic acid and/or 3-oxoadipic acid is improved.
  • Functional polypeptide (5) Furthermore, a reaction of reducing 3-oxoadipyl-CoA to produce 3-hydroxyadipyl-CoA and/or a reaction of producing 3-hydroxyadipyl-CoA from 3-hydroxyadipyl-CoA.
  • the genetically modified microorganism according to any one of (1) to (5) which further has enhanced activity of an enzyme that catalyzes the reaction of producing 3-oxoadipic acid from 3-oxoadipyl-CoA.
  • a method for producing 3-hydroxyadipic acid and/or 3-oxoadipic acid which comprises culturing the genetically modified microorganism according to any one of (1) to (7).
  • a method for producing a genetically modified microorganism comprising a step of enhancing the activity of the microorganism, and a step of increasing the expression level of YhhS or a homolog thereof in the microorganism.
  • a method for producing adipic acid which includes step B (hydrogenation step) of reacting 3-oxoadipic acid with hydrogen.
  • a method for producing a polyamide comprising a step of producing adipic acid by the method described in (11), and a step C of polycondensing adipic acid and a diamine.
  • the diamine is a diamine containing 1,4-butanediamine, 1,5-pentanediamine, or hexamethylenediamine.
  • the genetically modified microorganism of the present invention produces 3-hydroxyadipic acid and/or 3-oxoadipic acid with higher productivity compared to the parent strain microorganism that does not increase the expression level of the organophosphate compound excretion carrier. be able to.
  • 3-hydroxyadipic acid may be abbreviated as 3HA
  • 3-oxoadipic acid may be abbreviated as 3OA
  • the gene encoding YhhS may be referred to as yhhS.
  • the gene encoding MdtD may be referred to as mdtD.
  • the gene encoding RhtB may be referred to as rhtB.
  • the gene encoding EmrD may be referred to as emrD.
  • 3-oxoadipyl-CoA is sometimes abbreviated as 3OA-CoA
  • 3-hydroxyadipyl-CoA is sometimes abbreviated as 3HA-CoA
  • coenzyme A is sometimes abbreviated as CoA.
  • a nucleic acid encoding a functional polypeptide is sometimes referred to as a gene.
  • Reaction Scheme 1 shows an example of a reaction route for microorganisms to produce 3HA and/or 3OA.
  • reaction A indicates a reaction for producing 3-oxoadipyl-CoA and CoA from acetyl-CoA and succinyl-CoA.
  • Reaction B shows the reduction of 3-oxoadipyl-CoA to produce 3-hydroxyadipyl-CoA.
  • Reaction C shows a reaction to produce 3-hydroxyadipic acid from 3-hydroxyadipyl-CoA.
  • Reaction D shows the reaction to produce 3-oxoadipyl-CoA from 3-oxoadipyl-CoA.
  • microorganisms that have the ability to produce 3HA and/or 3OA are known to have an enzyme that catalyzes at least reaction A (see WO2019/107516).
  • the genetically modified microorganism of the present invention is a microorganism having the ability to produce 3HA and/or 3OA, and the enzyme for the reaction (reaction A) that produces 3-oxoadipyl-CoA and CoA from acetyl-CoA and succinyl-CoA.
  • reaction A the enzyme for the reaction
  • a technical feature that improves the productivity of 3HA and/or 3OA of microorganisms that have the ability to produce 3HA and/or 3OA by enhancing the activity and increasing the expression level of an organophosphate compound excretion carrier. shall be.
  • “genetic modification” means artificially modifying a gene.
  • An organic phosphoric acid compound refers to a compound that has a structure in which phosphoric acid is bonded to an organic compound such as an alcohol, carboxylic acid, or amino acid. Specific examples include glyphosate in which a phosphonomethyl group is substituted on the nitrogen atom.
  • An organic phosphate compound excretion carrier is a membrane protein that has the activity of excreting intracellular organic phosphate compounds to the outside of cells.
  • increasing the expression level of an organophosphate compound excretion carrier means increasing the expression level of a protein that has an organophosphate compound excretion function that microorganisms originally possess, and/or This means that the microorganism is made to express a protein that has a phosphate compound excretion function.
  • Preferred specific examples of organic phosphate compound excretion carriers whose expression level is to be increased in the present invention include phosphoserine excretion carriers and/or glyphosate excretion carriers.
  • phosphoserine excretion carriers include YhhS, MdtD, and RhtB proteins, which are described as O-phosphoserine excretion carriers in Japanese Patent Publication No. 2017-528126, and homologs of these proteins.
  • glyphosate discharge carriers include J. Ind. Microbiol Biotechnol. 2012 April; 39(4):641-7, and the MFS40 protein and homologs thereof, described in Pesticide Biochemistry and Physiology 140 (2017) 65-68.
  • organophosphate compound discharge carrier has a function as a discharge carrier of 3HA and/or 3OA, and it will be understood by those skilled in the art that the organophosphate compound discharge carrier also functions as a discharge carrier of 3HA and/or 3OA. This is an unexpected finding.
  • YhhS, MdtD, RhtB, and MFS40 which are suitable as organophosphate compound excretion carriers whose expression levels are increased in the present invention, and their homologues will be explained in detail.
  • YhhS is a protein estimated to be a major facilitator superfamily (MFS)-type transporter, and a specific example is Escherichia coli str. K-12 substr.
  • YhhS NCBI Protein ID: NP_417930, SEQ ID NO: 1 derived from MG1655 is mentioned, and the yhhS gene encoding the YhhS protein includes Escherichia coli str. K-12substr. Examples include yhhS (NCBI Gene ID: 947982, SEQ ID NO: 2) derived from the MG1655 strain.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, and/or added, and by increasing the expression level, 3HA and/or 3OA Any protein that has the function of improving productivity can be used as YhhS.
  • the range of "one or several" is preferably 10 or less, more preferably 5 or less, even more preferably 4 or less, particularly preferably 1 or 2 or less.
  • sequence identity (defined below) to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, even more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more, and A protein that preferably consists of an amino acid sequence of 97% or more, more preferably 98% or more, even more preferably 99% or more, and has the function of improving the productivity of 3HA and/or 3OA by increasing its expression level.
  • the protein can also be used as YhhS.
  • a homolog of YhhS is a protein that has high amino acid sequence identity with YhhS and is presumed to have a similar function or structure to YhhS.
  • Homologues of YhhS can be obtained, for example, from NCBI (National Center for Biotechnology Information) or KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes) using the amino acid sequence of YhhS as a query sequence.
  • a homolog of YhhS is a protein that has high amino acid sequence identity with YhhS and is presumed to have a similar function or structure to YhhS, and is a protein that is estimated to have a similar function or structure to YhhS. K-12 substr.
  • the sequence identity is specifically 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, and Preferably it is 90% or more, particularly preferably 95% or more, and one that has the function of improving the productivity of 3HA and/or 3OA by increasing its expression level can be used.
  • YhhS homologs include YhhS homolog (SEQ ID NO: 3) derived from Serratia grimesii NBRC13537 strain, YhhS homolog derived from Salmonella enterica ATCC9150 strain (NCBI Protein ID: AA V79243, SEQ ID NO: 28), derived from Klebsiella pneumoniae MGH78578 strain YhhS homolog (NCBI Protein ID: ABR79226, SEQ ID NO: 29) and YhhS homolog derived from Pectobacterium carotovorum PC1 strain (NCBI Protein ID: ACT11150, SEQ ID NO: 30).
  • the encoding gene is yhhS derived from Serratia grimesii NBRC13537 strain. Homolog (SEQ ID NO: 4), yhhS homologue derived from Salmonella enterica ATCC9150 strain (NCBI GeneID: CP000026, REGION: 3539049..3540266, SEQ ID NO: 31), Klebsiella pneum yhhS homolog derived from MGH78578 strain (NCBI Gene ID: CP000647, REGION: 4195189 ..4196409, SEQ ID NO: 32), and the yhhS homolog derived from Pectobacterium carotovorum PC1 strain (NCBI Gene ID: CP001657, REGION: 113478..114677, SEQ ID NO: 33).
  • sequence identity refers to the optimal alignment when two amino acid sequences or base sequences are aligned with or without introducing a gap, It refers to the ratio (percentage) of identical amino acids or bases to all overlapping amino acid sequences (including amino acids that serve as translation start points) or base sequences (including start codons), and is calculated by formula (1).
  • the shorter sequence length to be compared is 100 amino acids or 300 bases or more, and sequence identity is not defined if it is less than 100 amino acids or 300 bases. Sequence identity can be easily determined, for example, in BLAST using default parameters. Sequence identity can also be examined using similar functions installed in software such as Genetyx.
  • sequence identity between the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1, 28, 29, 30, and 3 is calculated using the Genetyx function (%Identity Matrix), and the results are 90.9, 84.4, and 3, respectively. 70.2% and 61.4%.
  • Sequence identity Number of matches (gaps are not counted) / shorter sequence length (length not including gaps at both ends) x 100...Formula (1).
  • MdtD (also known as YegB) is a protein that belongs to the major facilitator superfamily (MFS) called putative multidrug resistance proteins. ia coli str. K-12 substr. MdtD derived from MG1655 strain (NCBI Protein ID: NP_416581, SEQ ID NO: 46) is mentioned, and examples of the gene encoding MdtD include Escherichia coli str. K-12substr. Examples include mdtD (NCBI Gene ID: 946601, SEQ ID NO: 47) derived from the MG1655 strain.
  • MFS major facilitator superfamily
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 46 one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, and/or added, and by increasing the expression level, 3HA and/or 3OA
  • Any protein that has the function of improving productivity can be used as MdtD.
  • the range of "one or several" is preferably 10 or less, more preferably 5 or less, even more preferably 4 or less, particularly preferably 1 or 2 or less.
  • sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46 is 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, even more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, and still more preferably 97% or more. , more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more of the amino acid sequence, and also has the function of improving the productivity of 3HA and/or 3OA by increasing its expression level. It can be used as MdtD.
  • RhtB (also known as YigK) is a protein called homoserine/homoserine lactone efflux protein, and a specific example is Escherichia coli str. K-12 substr. RhtB (NCBI Protein ID: YP_026265, SEQ ID NO: 48) derived from MG1655 strain is mentioned, and examples of the RhtB-encoding gene include Escherichia coli str. K-12substr. RhtB derived from MG1655 strain (NCBI Gene ID: 948316, SEQ ID NO: 49) is mentioned.
  • RhtB any protein that has the function of improving productivity can be used as RhtB.
  • the range of "one or several" is preferably 10 or less, more preferably 5 or less, even more preferably 4 or less, particularly preferably 1 or 2 or less.
  • sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48 is 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, even more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more, and still more preferably 97% or more. , more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more of the amino acid sequence, and also has the function of improving the productivity of 3HA and/or 3OA by increasing its expression level. It can be used as RhtB.
  • MFS40 is a protein belonging to the major facilitator superfamily (MFS), and a specific example is MFS40 derived from Aspergillus oryzae RIB40 strain (NCBI Protein ID: XP_001826 887, SEQ ID NO: 50), and as a gene encoding MFS40, Aspergillus oryzae RIB40 strain
  • the derived MFS40 gene NCBI Reference Sequence: XM_001826835.2, SEQ ID NO: 51
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 50 one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, and/or added, and by increasing the expression level, 3HA and/or 3OA Any protein that has the function of improving productivity can be used as MFS40.
  • the range of "one or several” is preferably 10 or less, more preferably 5 or less, even more preferably 4 or less, particularly preferably 1 or 2 or less.
  • sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 50 is 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, even more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more, even more preferably 97% or more. , more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more of the amino acid sequence, and also has the function of improving the productivity of 3HA and/or 3OA by increasing its expression level. It can be used as MFS40.
  • Homologs of MdtD, RhtB, and MFS40 are proteins that have high amino acid sequence identity with the respective proteins and are presumed to have similar functions or structures to the respective proteins.
  • K-12 substr. MdtD NCBI Protein ID: NP_416581, SEQ ID NO: 46
  • K-12 substr. RhtB derived from MG1655 strain NCBI Protein ID: YP_026265, SEQ ID NO: 48
  • MFS40 derived from Aspergillus oryzae RIB40 strain
  • the sequence identity is 60% or more.
  • 3HA and/or 3OA productivity by increasing the expression level, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more, and increasing the expression level of 3HA and/or 3OA.
  • these homologs can be obtained from, for example, NCBI (National Center for Biotechnology Information) or KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes) using the amino acid sequence of MdtD as a query sequence.
  • BLAST Basic Local Alignment Search Tool
  • search on public databases such as It can be easily obtained by performing the following steps and referring to the gene encoding the applicable sequence. It can also be obtained by PCR using genomic DNA of another organism as a template and oligonucleotides prepared based on the base sequence of the gene encoding MdtD or its homologue as primers.
  • the above-mentioned protein suitable as an organophosphate compound excretion carrier is preferably expressed by introducing the gene encoding it into a microbial host as a foreign gene (see Examples below).
  • reaction A for producing 3-oxoadipyl-CoA and CoA from acetyl-CoA and succinyl-CoA in microorganisms capable of producing 3HA and/or 3OA
  • reaction A for producing 3-oxoadipyl-CoA and CoA from acetyl-CoA and succinyl-CoA in microorganisms capable of producing 3HA and/or 3OA
  • Enzymes that have the activity of catalyzing the reaction that produces 3-oxoadipyl-CoA and CoA from succinyl-CoA and acetyl-CoA include acetyl-CoA acetyltransferase, ⁇ -ketoacylCoA acyltransferase, and 3-oxoadipyl-CoA.
  • acyltransferase ⁇ -ketoadipyl-CoA acyltransferase, acetyl-CoA C-acetyltransferase, acetoacetyl-CoA thiolase, beta-acetoacetyl coenzyme A thiolase, 2-methylacetoace tyl-CoA thiolase, 3-oxothiolase, acetyl coenzyme A thiolase, acetyl-CoA acetyltransferase, acetyl-CoA:N-acetyltrans ferase, acetyl- CoA C-acyltransferase, beta-ketothiolase, 3-ketoacyl-CoA thiolase, beta-ketoacyl coenzyme A thiolase, beta-ketoac yl-CoA thiolase, beta-ketoadipyl coenzyme
  • Enzymes include: Furthermore, although there are no particular classification limitations based on EC numbers, EC 2.3.1. Acyltransferases classified as - are preferred; specific examples include EC 2.3.1.174, EC 2.3.1.9, EC 2.3.1.16, EC 2.3.1.223. Enzymes classified as:
  • Preferred specific examples of these enzymes include microorganisms of the genus Acinetobacter such as Acinetobacter baylyi and Acinetobacter radioresistens, microorganisms of the genus Aerobacter such as Aerobacter cloacae, and Alcalig.
  • microorganisms of the genus Alcaligenes such as Bacillus faecalis, microorganisms of the genus Bacillus such as Bacillus badius, Bacillus megaterium, and Bacillus roseus; Brevibacterium genus microorganisms such as Brevibacterium iodinum, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium Microorganisms of the genus Corynebacterium such as Corynebacterium ammoniagenes and Corynebacterium glutamicum, Cupriavidus metallidurans, Cupriavidus necator, Cup Cupriavidus continuation microorganisms such as Cupriavidus numazuensis and Cupriavidus oxalaticus, Delftia microorganisms such as Delftia acidovorans, Microorganisms of the genus Escherichia such as Escherich
  • genus Sterptomyces such as us
  • genus Yarrowia such as Yarrowia lipolytica
  • examples include enzymes derived from microorganisms of the genus Yersinia such as Yersinia ruckeri, and preferably enzymes derived from Escherichia coli str. K-12 substr.
  • PaaJ derived from MG1655 strain (NCBI Protein ID: NP_415915), PcaF derived from Pseudomonas putida KT2440 strain (NCBI Protein ID: NP_743536), Corynebacterium Examples include PcaF (NCBI Protein ID: CAF21057) derived from M. glutamicum ATCC13032 strain.
  • reaction B in which 3-oxoadipyl-CoA is reduced to produce 3-hydroxyadipyl-CoA according to the descriptions in WO2019/107516 and WO2021/187533;
  • reaction C Enhance the activity of the enzyme that catalyzes the reaction of producing 3-hydroxyadipate from hydroxyadipyl-CoA
  • reaction D the reaction of producing 3-oxoadipate from 3-oxoadipyl-CoA
  • the enzyme that catalyzes the reaction (reaction B) that reduces 3-oxoadipyl-CoA to produce 3-hydroxyadipyl-CoA is classified as 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase under EC 1.1.1.35.
  • Examples include enzymes classified as EC 1.1.1.157 as 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase.
  • PaaH derived from Pseudomonas putida KT2440 strain NCBI Protein ID: NP_745425.1
  • Escherichia coli str. K-12 substr is classified as 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase under EC 1.1.1.35.
  • Examples include enzymes classified as EC 1.1.1.157 as 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase.
  • PaaH derived from Pseudomonas putida KT2440 strain NCBI Protein ID: NP_745425.1
  • PaaH derived from MG1655 strain (NCBI Protein ID: NP_415913.1), DcaH derived from Acinetobacter baylyi ADP1 strain (NCBI Protein ID: CAG68533.1), Serratia PaaH (NCBI Protein ID: WP_063197120) derived from Plymuthica NBRC102599 strain, and PaaH derived from Serratia nematodiphila DSM21420 strain.
  • Polypeptide NCBI Protein ID: WP_033633399.1 is also mentioned as an enzyme that catalyzes the reaction of reducing 3-oxoadipyl-CoA to produce 3-hydroxyadipyl-CoA.
  • Enzymes that catalyze the reaction of producing 3-hydroxyadipate from 3-hydroxyadipyl-CoA (reaction C) and/or the reaction of producing 3-oxoadipate from 3-oxoadipyl-CoA (reaction D) include: Although CoA transferase or acyl-CoA hydrolase can be used, CoA transferase is preferred.
  • CoA transferase means an enzyme that has catalytic activity (CoA transferase activity) for a reaction that produces carboxylic acid and succinyl-CoA using acyl-CoA and succinic acid as substrates.
  • CoA transferases are not particularly limited in classification by EC number, but include EC 2.8.3. Examples include CoA transferase classified as -, CoA transferase or acyl-CoA transferase classified as EC 2.8.3.6, and specific examples include PcaI (NCBI Protein ID: NP_746081) derived from Pseudomonas putida KT2440 strain and PcaJ (NCBI Protein ID: NP_746082) and the like can be preferably used.
  • the method for increasing the expression level of the organophosphate compound excretion carrier or for enhancing various enzyme activities related to 3HA and/or 3OA metabolism there are no particular limitations on the method for increasing the expression level of the organophosphate compound excretion carrier or for enhancing various enzyme activities related to 3HA and/or 3OA metabolism.
  • Various enzymatic activities or functions can be achieved by introducing a gene from outside the host microorganism into the host microorganism, increasing the copy number of the gene, or modifying the promoter region or ribosome binding sequence upstream of the gene.
  • a method of increasing the expression level of a polypeptide having the following is preferred. These methods may be performed alone or in combination.
  • the gene to be introduced may be artificially synthesized based on the amino acid sequence of the enzyme in a database, or may be isolated from nature.
  • the frequency of use of codons corresponding to each amino acid may be changed depending on the host microorganism to be introduced.
  • the method of introducing the nucleic acid is not particularly limited, and methods such as incorporating the nucleic acid into an expression vector capable of autonomous replication within a microorganism and introducing it into a host microorganism, or integrating the nucleic acid into the genome of the microorganism can be used.
  • the number of genes to be introduced may be one or more. Furthermore, gene introduction and enhancement of gene expression may be combined.
  • the expression vector or nucleic acid for genome integration includes a promoter, a ribosome binding sequence, a nucleic acid encoding a polypeptide to be expressed, and a transcription termination sequence. It is preferable that it be configured. Furthermore, a gene that controls promoter activity may be included.
  • the promoter used in the present invention is not particularly limited as long as it can express the enzyme in the host microorganism, and examples thereof include gap promoter, trp promoter, lac promoter, tac promoter, and T7 promoter.
  • a nucleic acid or enhancing the expression of a polypeptide using an expression vector there is no particular limitation as long as it can autonomously replicate in the microorganism, but examples include pBBR1MCS vector, pBR322 vector, pMW vector, pET. vectors, pRSF vectors, pCDF vectors, pACYC vectors, and derivatives of the above-mentioned vectors.
  • the introduction when introducing a nucleic acid or enhancing the expression of a polypeptide using a nucleic acid for genome integration, the introduction can be performed using site-specific homologous recombination.
  • the site homologous recombination method is not particularly limited, but for example, a method using ⁇ Red recombinase and FLP recombinase (Proc Natl Acad Sci USA. 2000 Jun 6; 97(12): 6640-6645), ⁇ Red recombinase ze and sacB genes (Biosci Biotechnol Biochem. 2007 Dec; 71(12): 2905-11.).
  • the method for introducing the expression vector or the nucleic acid for genome integration is not particularly limited as long as it is a method for introducing nucleic acids into microorganisms, but examples include the calcium ion method (Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)), the electroporation method ( NM Calvin, PC Hanawalt. J. Bacteriol, 170 (1988), pp. 2796-2801).
  • Microorganisms that inherently have the ability to produce 3HA and/or 3OA include the following microorganisms. Escherichia genus such as Escherichia fergusonii and Escherichia coli. Serratia grimesii, Serratia ficaria, Serratia fonticola, Serratia odorifera, Serratia plymuthica, Serratia entomophila or Serrati Serratia spp., such as A nematodiphila. Pseudomonas chlororaphis, Pseudomonas putida, Pseudomonas azotoformans, Pseudomonas chlororaphis subsp.
  • Pseudomonas genus such as Pseudomonas aureofaciens, Pseudomonas fragi, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas reptilivora, Pseudomonas azotoformans.
  • Hafnia spp. such as Hafnia alvei. Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium glutamicum, etc. The genus Corynebacterium.
  • Bacillus genus such as Bacillus badius, Bacillus megaterium, and Bacillus roseus.
  • Streptomyces genus such as Streptomyces vinaceus, Streptomyces karnatakensis, Streptomyces olivaceus.
  • Cupriavidus genus such as Cupriavidus metallidurans, Cupriavidus necator, Cupriavidus oxalaticus.
  • Acinetobacter genus such as Acinetobacter baylyi and Acinetobacter radioresistens.
  • Genus Nocardioides such as Nocardioides albus.
  • Brevibacterium genus such as Brevibacterium iodinum. Delftia spp., such as Delftia acidovorans. Shimwellia genus such as Shimwellia blattae. Aerobacter genus such as Aerobacter cloacae. Rhizobium genus such as Rhizobium radiobacter. Planomicrobium genus such as Planomicrobium okeanokoites. Yarrowia spp. such as Yarrowia lipolytica. Rhodosporidium genus such as Rhodosporidium toruloides. Microbacterium genus such as Microbacterium ammoniaphilum. Saccharomyces genus such as Saccharomyces cerevisiae. Yersinia spp. such as Yersinia ruckeri.
  • microorganisms belonging to the genus Escherichia or Serratia are preferably used in the present invention.
  • reactions A, B, and C may be carried out according to the descriptions in WO2017/209102 and WO2019/107516.
  • Microorganisms that can be used as hosts for obtaining genetically modified microorganisms in the present invention are not particularly limited as long as they can be genetically modified, but include Escherichia, Serratia, Hafnia, Psuedomonas, Corynebacterium, and Bacillus.
  • microorganisms belonging to the genera Ermobifida, Clostridium, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Pichia and Candida are Preferably, microorganisms belonging to the genus Escherichia, Serratia, Hafnia, or Pseudomonas are more preferred, and microorganisms belonging to the genus Escherichia or Serratia are particularly preferred.
  • a fermentation raw material is a raw material that can be metabolized by the genetically modified microorganism.
  • “Metabolism” refers to the conversion of a chemical compound taken in by a microorganism from outside the cell or produced from another chemical compound within the cell into another chemical compound through an enzymatic reaction.
  • Saccharides can be preferably used as the carbon source.
  • Specific examples of sugars include monosaccharides such as glucose, sucrose, fructose, galactose, mannose, xylose, and arabinose, disaccharides and polysaccharides in which these monosaccharides are bonded, and starch saccharification solutions containing these, molasses, and cellulose. Examples include containing biomass saccharification liquid.
  • the carbon sources listed above may be used alone or in combination, but it is particularly preferable to culture in a medium containing glucose.
  • the concentration of the carbon source in the medium is not particularly limited, and can be appropriately set depending on the type of carbon source.
  • the preferred concentration of glucose is 5-300 g/L.
  • Examples of the nitrogen source used for culturing the genetically modified microorganism include ammonia gas, aqueous ammonia, ammonium salts, urea, nitrates, and other auxiliary organic nitrogen sources such as oil cake, soybean hydrolyzate, Casein decomposition products, other amino acids, vitamins, corn steep liquor, yeast or yeast extract, meat extract, peptides such as peptone, various fermentation microbial cells and their hydrolysates, etc. can be used.
  • the concentration of the nitrogen source in the medium is not particularly limited, but is preferably 0.1 to 50 g/L.
  • inorganic salts used for culturing the genetically modified microorganism for example, phosphates, magnesium salts, calcium salts, iron salts, manganese salts, etc. can be added as appropriate.
  • the culture conditions of the genetically modified microorganism for producing 3HA and/or 3OA include the medium with the above component composition, culture temperature, stirring speed, pH, aeration amount, inoculation amount, etc., the type of the genetically modified microorganism, and external conditions. Adjust or select as appropriate and set.
  • the pH range for culturing is not particularly limited as long as the genetically modified microorganism can grow, but is preferably pH 5 to 8, more preferably pH 5.5 to 6.8.
  • the range of aeration conditions during culture is not particularly limited as long as 3HA and/or 3OA can be produced, but in order to grow the microbial mutant well, at least at the beginning of culture, the range of aeration conditions in the culture container should be maintained in the liquid phase or gas phase. It is preferable that oxygen remains in the.
  • antifoaming agents such as mineral oil, silicone oil, and surfactants can be appropriately added to the medium.
  • the produced product can be recovered.
  • Recovery, e.g. isolation, of the produced product can be carried out according to the general method of stopping the culture when the accumulated amount has increased to an appropriate level and collecting the fermentation product from the culture. .
  • the product is isolated from the culture by column chromatography, ion exchange chromatography, activated carbon treatment, crystallization, membrane separation, distillation, etc. be able to.
  • methods include adding an acid component to the salt of the product and collecting the precipitate, and removing water from the culture using a reverse osmosis membrane or evaporator to increase the concentration of the product. After increasing the temperature, the product and/or salt crystals of the product are precipitated by cooling crystallization or adiabatic crystallization, and the product and/or salt crystals of the product are separated by centrifugation or filtration. Examples of methods include adding alcohol to the culture to convert the product into an ester, recovering the ester of the product by distillation, and then obtaining the product by hydrolysis. It is not limited. Further, these recovery methods can be appropriately selected and optimized depending on the physical properties of the product.
  • Adipic acid can be produced by reacting (hydrogenating) 3HA and/or 3OA obtained in the present invention with hydrogen in the presence of a hydrogenation catalyst.
  • the hydrogenation catalyst preferably contains a transition metal element, specifically selected from the group consisting of palladium, platinum, ruthenium, rhodium, rhenium, nickel, cobalt, iron, iridium, osmium, copper and chromium. It is preferable to contain one or more kinds, and more preferably one or more kinds selected from the group consisting of palladium, platinum, nickel, cobalt, iron, copper, and chromium.
  • a transition metal element specifically selected from the group consisting of palladium, platinum, ruthenium, rhodium, rhenium, nickel, cobalt, iron, iridium, osmium, copper and chromium.
  • the hydrogenation catalyst can be supported on the carrier by a known method such as an impregnation method, a precipitation precipitation method, or a gas phase support method.
  • the carrier include carbon, polymer, metal oxide, metal sulfide, zeolite, clay, heteropolyacid, solid phosphoric acid, hydroxyapatite, and the like.
  • Hydrogen to be reacted with 3HA and/or 3OA may be added to the reactor all at once or sequentially.
  • the partial pressure of hydrogen is not particularly limited, but if it is too low, the reaction time will be long, while if the partial pressure of hydrogen is too high, it is undesirable for equipment safety, so it is preferably 0.1 MPa or more and 10 MPa or less (gauge pressure) at room temperature. More preferably, it is 0.3 MPa or more and 5 MPa or less (gauge pressure), and still more preferably 0.5 MPa or more and 3 MPa or less (gauge pressure).
  • the reaction format may be a reaction format using any reactor such as a batch tank reactor, a semi-batch tank reactor, a continuous tank reactor, a continuous tubular reactor, or a trickle bed tubular reactor.
  • a solid hydrogenation catalyst When a solid hydrogenation catalyst is used, the reaction can be carried out in any of a suspended bed type, fixed bed type, moving bed type, and fluidized bed type.
  • the hydrogenation reaction temperature is not particularly limited, but if it is too low, the reaction rate will be slow, and if the reaction temperature is too high, energy consumption will increase, which is not preferred. From this point of view, the reaction temperature is preferably 100 to 350°C, more preferably 120 to 300°C, even more preferably 130 to 280°C, and even more preferably 140 to 250°C. The temperature is preferably 150 to 230°C, more preferably 160 to 220°C.
  • the oxygen concentration should be 5.5% to avoid deterioration of the hydrogenation catalyst and generation of explosion gas. It is preferable that it is less than % by volume.
  • the amount of ammonia relative to 3HA and/or 3OA is preferably 5% by weight or less, more preferably 3% by weight or less, and 0% by weight. (That is, reaction in the absence of ammonia) is more preferable.
  • the hydrogenation of 3HA and/or 3OA is preferably performed in the presence of a solvent.
  • Solvents for hydrogenation include methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol, tert-butanol, pentane, hexane, cyclohexane, heptane, octane, decane, dimethyl ether, diethyl ether, 1,2-dimethoxy Ethane, diglyme, tetrahydrofuran, dioxane, methyl acetate, ethyl acetate, n-propyl acetate, n-butyl acetate, ⁇ -butyrolactone, N-methylpyrrolidone, dimethyl sulfoxide, aqueous solvents, etc. can be used, and two or more of these Although a mixed solvent may be used, it is preferable to use an aqueous solvent from the viewpoint of economy and environment.
  • the aqueous solvent refers to water or a mixed solvent consisting mainly of water and a water-miscible organic solvent. "Mainly composed of water” means that the proportion of water in the mixed solvent is more than 50% by volume, preferably 70% by volume or more, and more preferably 90% by volume or more.
  • Water-miscible organic solvents include methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol, tert-butanol, 1,2-dimethoxyethane, diglyme, tetrahydrofuran, dioxane, ⁇ -butyrolactone, N-methylpyrrolidone. , dimethyl sulfoxide, dimethylformamide, dimethylacetamide, acetone, and the like.
  • the pH of the aqueous solvent is not particularly limited, but in consideration of suppressing catalyst deterioration, suppressing the formation of by-products, corrosiveness to the reaction equipment, etc., it is preferably pH 2 to 13, more preferably pH 3 to 11.
  • the pH is preferably from 4 to 10, more preferably from 4 to 10.
  • adipic acid When a solvent other than a primary alcohol and a secondary alcohol is used as a hydrogenation solvent, the corresponding adipic acid, Adipate salt and adipate ester are produced.
  • a solvent containing primary alcohol or secondary alcohol such as methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol is used as a hydrogenation solvent, after the reaction, adipic acid, adipic acid salt, adipic acid A mixture of monoester and adipic acid diester is obtained.
  • adipic acid carboxylic acid, carboxylic acid salt, carboxylic acid ester, and mixtures thereof are collectively referred to as "adipic acid.”
  • the carboxylic acid of adipic acid obtained in the present invention can be converted into an adipic acid ester by further subjecting it to an esterification reaction.
  • the esterification method is not particularly limited, but examples include dehydration condensation of carboxylic acid and alcohol using an acid catalyst and a condensing agent, and a method using an alkylating reagent such as diazomethane or alkyl halide.
  • Adipic acid obtained in the present invention can be separated and purified by conventional unit operations such as centrifugation, filtration, membrane filtration, distillation, extraction, crystallization, and drying.
  • Adiponitrile can be produced from the adipic acid obtained in the present invention by a known method (for example, Japanese Patent Publication No. 61-24555).
  • Hexamethylene diamine can be produced by hydrogenating the obtained adiponitrile by a known method (for example, Japanese Patent Publication No. 2000-508305).
  • a polyamide can be produced by polycondensing the adipic acid obtained in the present invention with a diamine by a known method (for example, see Osamu Fukumoto, "Polyamide Resin Handbook", Nikkan Kogyo Publishing, January 1998). I can do it. Specifically, by using 1,4-diaminobutane, 1,5-pentanediamine, and hexamethylene diamine as diamines, polyamide 46, polyamide 56, and polyamide 66 can be produced, respectively.
  • Polyamide fibers can be produced by processing polyamide by a known method (for example, International Publication No. 2019/208427).
  • the polyamide fiber thus obtained can be used for clothing such as innerwear, sportswear, and casual wear, and for industrial materials such as airbags and tire cords.
  • a polyamide molded product can be produced by molding polyamide by a known method (for example, International Publication No. 2021/006257).
  • the polyamide molded products thus obtained can be used for automobile parts, electrical parts, electronic parts, building materials, various containers, daily necessities, household goods, sanitary goods, and the like.
  • Reference example 1 Enzyme that catalyzes the reaction (reaction A) that produces 3OA-CoA and CoA from acetyl-CoA and succinyl-CoA, reaction that produces 3HA-CoA from 3OA-CoA (reaction B), and produces 3HA from 3HA-CoA.
  • reaction A that produces 3OA-CoA and CoA from acetyl-CoA and succinyl-CoA
  • reaction B reaction that produces 3HA-CoA from 3OA-CoA
  • 3HA-CoA reaction that produces 3HA from 3OA-CoA
  • Vector pBBR1MCS-2 ( ME Kovach, (1995), Gene 166:175-176) was digested with XhoI to obtain pBBR1MCS-2/XhoI.
  • Escherichia coli str. K-12 substr In order to incorporate a constitutive expression promoter into the vector, Escherichia coli str. K-12 substr. Using MG1655 genomic DNA as a template, primers were designed to amplify the upstream region 200b (SEQ ID NO: 5) of gapA (NCBI GeneID: NC_000913.3) (SEQ ID NO: 6, 7), and a PCR reaction was performed according to a conventional method. . The obtained fragment and pBBR1MCS-2/XhoI were ligated using "In-Fusion HD Cloning Kit" (manufactured by Takara Bio Inc.) and introduced into E. coli strain DH5 ⁇ . The plasmid was extracted from the obtained recombinant E.
  • pBBR1MCS-2::Pgap the plasmid was designated as pBBR1MCS-2::Pgap. Subsequently, pBBR1MCS-2::Pgap was cut with ScaI to obtain pBBR1MCS-2::Pgap/ScaI.
  • primers were designed to amplify the full length of the acyltransferase gene pcaF (NCBI Gene ID: 1041755, SEQ ID NO: 8) using the genomic DNA of Pseudomonas putida strain KT2440 as a template.
  • PCR reaction was performed according to a conventional method.
  • the obtained fragment and pBBR1MCS-2::Pgap/ScaI were ligated using "In-Fusion HD Cloning Kit” (manufactured by Takara Bio Inc.) and introduced into E. coli strain DH5 ⁇ .
  • the plasmid was extracted from the obtained recombinant strain, and the nucleotide sequence was confirmed by a conventional method, and the plasmid was designated as pBBR1MCS-2::AT. Subsequently, pBBR1MCS-2::AT was cut with HpaI to obtain pBBR1MCS-2::AT/HpaI.
  • CoA transferase genes pcaI and pcaJ were amplified using genomic DNA of Pseudomonas putida strain KT2440 as a template.
  • Primers were designed to amplify a continuous sequence containing the full length of (SEQ ID NO: 13, 14), and a PCR reaction was performed according to a conventional method.
  • the obtained fragment and pBBR1MCS-2::AT/HpaI were ligated using In-Fusion HD Cloning Kit and introduced into E. coli strain DH5 ⁇ .
  • the plasmid was extracted from the obtained recombinant strain, and the plasmid whose base sequence was confirmed by a conventional method was designated as pBBR1MCS-2::ATCT.
  • pBBR1MCS-2::ATCT was cut with ScaI to obtain pBBR1MCS-2::ATCT/ScaI.
  • SEQ ID NO: 15 that catalyzes reaction B
  • Primers were designed (SEQ ID NOs: 17 and 18), and a PCR reaction was performed according to a conventional method.
  • the obtained fragment and pBBR1MCS-2::ATCT/ScaI were ligated using "In-Fusion HD Cloning Kit” (manufactured by Takara Bio Inc.) and introduced into E. coli strain DH5 ⁇ .
  • the plasmid was extracted from the obtained recombinant strain, and the nucleotide sequence was confirmed by a conventional method, and the plasmid was designated as pBBR1MCS-2::ATCTOR.
  • telomere sequence was replaced with the chloramphenicol resistance gene.
  • PCR was performed using pHSG396 (manufactured by Takara Bio Inc.) as a template and the nucleic acids of SEQ ID NOs: 19 and 20 as primers to amplify the chloramphenicol resistance gene.
  • This PCR fragment and the fragment obtained by cleaving pBBR1MCS-2::ATCTOR with SapI were ligated using In-Fusion HD Cloning Kit and introduced into E. coli DH5 ⁇ strain.
  • the plasmid was extracted from the obtained recombinant strain, and the plasmid whose base sequence was confirmed by a conventional method was designated as pBBRc::ATCTOR.
  • Reference example 2 Preparation of a plasmid expressing YhhS
  • Escherichia coli str. K-12 substr. PCR was performed using the genomic DNA of the MG1655 strain as a template and the nucleic acids of SEQ ID NOs: 21 and 22 as primers to amplify a nucleic acid containing the full length of the yhhS gene (SEQ ID NO: 2) and 0.5 kb of its upstream and downstream regions.
  • This PCR fragment and the fragment obtained by cleaving an expression vector pMW119 manufactured by Nippon Gene Co., Ltd. capable of autonomous replication in E.
  • coli with KpnI were ligated using the In-Fusion HD Cloning Kit, and introduced into E. coli DH5 ⁇ strain. did.
  • the plasmid was extracted from the obtained recombinant strain, and the plasmid whose base sequence was confirmed by a conventional method was designated as pMW::EcYHHS.
  • Reference example 3 Creation of a mutant Escherichia microorganism deficient in YhhS function In order to delete the YhhS function in an Escherichia microorganism, an Escherichia microorganism mutant was created in which the gene encoding YhhS was deleted.
  • PCR was performed using pKD4 as a template and oligo DNAs of SEQ ID NOs: 23 and 24 as primers to obtain a PCR fragment with a sequence length of 1.6 kb for yhhS deletion.
  • the FRT recombinase expression plasmid pKD46 was introduced into Escherichia coli str. K-12 substr. It was introduced into BW25113 strain to obtain an ampicillin-resistant strain. The obtained strain was inoculated into 5 mL of LB medium containing 100 ⁇ g/mL of ampicillin, and cultured with shaking at 37° C. for 1 day.
  • 0.5 mL of the culture solution was inoculated into 50 mL of LB medium containing 100 ⁇ g/mL of ampicillin and 50 mM of arabinose, and cultured with rotation at 37° C. for 2 hours. After cooling the culture solution on ice for 20 minutes, the bacterial cells were washed three times with 10% (w/w) glycerol. The washed pellet was suspended in 100 ⁇ L of 10% (w/w) glycerol, mixed with 5 ⁇ L of PCR fragment, and then cooled on ice for 10 minutes in an electroporation cuvette.
  • Reference example 4 Preparation of 3HA and/or 3OA producing strain and control strain deficient in YhhS function Plasmids pBBRc::ATCTOR and pMW119 prepared in Reference Example 1 were introduced into Ec ⁇ yhhS prepared in Reference Example 3, and the YhhS function was deficient. Deficient 3HA and/or 3OA producing strains were created.
  • Ec ⁇ yhhS and E. coli str. K-12 substr. BW25113 was inoculated into 5 mL of LB medium and cultured with shaking at 37°C for 1 day. 0.5 mL of the culture solution was inoculated into 5 mL of LB medium, and cultured with shaking at 37° C. for 2 hours. After cooling the culture solution on ice for 20 minutes, the bacterial cells were washed three times with 10% (w/w) glycerol. The washed pellet was suspended in 100 ⁇ L of 10% (w/w) glycerol, mixed with 1 ⁇ L of pBBRc::ATCTOR and pMW119, and then cooled on ice for 10 minutes in an electroporation cuvette.
  • Escherichia coli str. K-12 substr. pBBRc::ATCTOR and pMW119 were introduced into the BW25113 strain by the above method to obtain a 3HA and/or 3OA producing strain (EcWT/3HA_pMW) that does not lack YhhS function.
  • Comparative example 1 3HA production test of control strain Control strain (EcWT/3HA_pMW) was adjusted to pH 7 in medium I (Bacto tryptone (manufactured by Difco Laboratories) 10 g/L, Bacto yeast extract (manufactured by Difco Laboratories) 5 g/L, sodium chloride 5 g A platinum loop was inoculated into 5 mL ( ⁇ 18 mm glass test tube, aluminum stopper) of 15 ⁇ g/mL of chloramphenicol, 100 ⁇ g/mL of ampicillin, and cultured with shaking at 30° C. and 120 min ⁇ 1 for 24 hours.
  • medium I Bacto yeast extract (manufactured by Difco Laboratories) 5 g/L
  • a platinum loop was inoculated into 5 mL ( ⁇ 18 mm glass test tube, aluminum stopper) of 15 ⁇ g/mL of chloramphenicol, 100 ⁇ g/mL of ampicillin, and cultured with shaking
  • 0.25 mL of the culture solution was adjusted to pH 6.5 in medium II (glucose 50 g/L, ammonium sulfate 1 g/L, potassium phosphate 50 mM, magnesium sulfate 0.025 g/L, iron sulfate 0.0625 mg/L, manganese sulfate 2 .7mg/L, Calcium chloride 0.33mg/L, Sodium chloride 1.25g/L, Bacto tryptone 2.5g/L, Bacto yeast extract 1.25g/L, Chloramphenicol 15 ⁇ g/mL, Ampicillin 100 ⁇ g/mL ) and cultured at 30°C.
  • medium II glucose 50 g/L, ammonium sulfate 1 g/L, potassium phosphate 50 mM, magnesium sulfate 0.025 g/L, iron sulfate 0.0625 mg/L, manganese sulfate 2 .7mg/L, Calcium chloride 0.33mg/
  • the supernatant obtained by centrifuging the bacterial cells from the obtained culture solution was subjected to membrane treatment using "Millex-GV” (0.22 ⁇ m, PVDF, manufactured by Merck), and the permeate was subjected to LC-MS/MS under the following conditions.
  • the analysis quantified the concentration of 3HA and other products accumulated in the culture supernatant, as well as sugars remaining unutilized in the medium. Furthermore, Table 1 shows the yield of 3HA calculated using the following formula (2) based on the results.
  • Quantitative analysis of 3HA by LC-MS/MS/HPLC 1290Infinity (manufactured by Agilent Technologies)
  • Mobile phase: 0.1% formic acid aqueous solution/methanol 70/30 Flow rate: 0.3 mL/min
  • ⁇ MS/MS Triple-Quad LC/MS (manufactured by Agilent Technologies)
  • Reference example 5 3HA production test of a 3HA and/or 3OA producing strain deficient in YhhS function Using the 3HA and/or 3OA producing strain deficient in YhhS function (Ec ⁇ yhhS/3HA_pMW) prepared in Reference Example 4, the same procedure as in Comparative Example 1 was carried out. A production test of 3HA was conducted using the method described above. The results are shown in Table 1.
  • Reference example 6 Production of 3HA and/or 3OA producing strain with restored YhhS function Plasmid pBBRc::ATCTOR produced in Reference Examples 1 and 2 in the same manner as Reference Example 4 for Ec ⁇ yhhS in which YhhS function was deleted. and pMW::EcYHHS was introduced to create a 3HA and/or 3OA producing strain (Ec ⁇ yhhS/3HA_EcYHHS) in which the function of YhhS was restored.
  • Reference example 7 3HA production test of 3HA and/or 3OA producing strain with restored YhhS function
  • 3HA and/or 3OA producing strain with restored YhhS function prepared in Reference Example 6 was used.
  • a 3HA production test was conducted in the same manner as in Comparative Example 1 using a 3OA producing strain (Ec ⁇ yhhS/3HA_EcYHHS). The results are shown in Table 1.
  • Example 1 Creation of 3HA and/or 3OA producing strains with increased expression of YhhS E. coli str. K-12 substr.
  • Example 2 3HA production test using 3HA and/or 3OA producing strains with increased expression of YhhS
  • the 3HA and/or 3OA producing strains with increased expression of YhhS prepared in Example 1 were tested.
  • a 3HA production test was conducted in the same manner as in Comparative Example 1 using a 3OA producing strain (EcWT/3HA_EcYHHS). The results are shown in Table 1.
  • Comparative example 2 3OA production test of control strain
  • a loop of control strain (EcWT/3HA_pMW) was inoculated into 5 mL of medium I ( ⁇ 18 mm glass test tube, aluminum stopper) adjusted to pH 7, and shaken at 30°C and 120 min -1 for 24 hours. It was cultivated for a long time. 0.25 mL of the culture solution was adjusted to pH 6.5 using medium III (glucose 10 g/L, sodium succinate 10 g/L, ammonium sulfate 1 g/L, potassium phosphate 50 mM, magnesium sulfate 0.025 g/L, iron sulfate 0.
  • medium III glucose 10 g/L, sodium succinate 10 g/L, ammonium sulfate 1 g/L, potassium phosphate 50 mM, magnesium sulfate 0.025 g/L, iron sulfate 0.
  • Example 3 3OA production test using 3HA and/or 3OA producing strains with increased expression of YhhS
  • 3HA and/or 3OA producing strains with increased expression of YhhS prepared in Example 1 were tested.
  • a 3OA production test was conducted in the same manner as in Comparative Example 2 using a 3OA production strain (EcWT/3HA_EcYHHS). The results are shown in Table 2.
  • Reference example 8 Preparation of Plasmids for Expressing Various Transporters
  • a genomic DNA of the MG1655 strain as a template, 0.5 kb of the upstream region and 0.5 kb of the downstream region of the yhhS gene were amplified.
  • Nucleic acids of SEQ ID NOs: 34 and 35, and 36 and 37 were used as primers, respectively.
  • This PCR fragment and the fragment obtained by cleaving the expression vector pMW119 manufactured by Nippon Gene Co., Ltd. capable of autonomous replication in E.
  • coli with SacI and KpnI were ligated using the In-Fusion HD Cloning Kit, and the E. coli DH5 ⁇ strain was ligated using the In-Fusion HD Cloning Kit. It was introduced in The plasmid was extracted from the obtained recombinant strain, and the plasmid whose base sequence was confirmed by a conventional method was designated as pMW::Pro-Ter.
  • Reference example 9 Preparation of a plasmid expressing the YhhS homolog
  • the yhhS homolog sequence of Salmonella enterica ATCC9150 strain was synthesized, and the full length of the gene was synthesized using the sequence as a template and the nucleic acids of SEQ ID NOs: 38 and 39 as primers. Amplified.
  • This PCR fragment and the fragment obtained by cleaving pMW::Pro-Ter with SacI and KpnI were ligated using In-Fusion HD Cloning Kit and introduced into E. coli DH5 ⁇ strain.
  • the plasmid was extracted from the obtained recombinant strain, and the plasmid whose base sequence was confirmed by a conventional method was designated as pMW::SeYHHS.
  • the yhhS homolog sequence of Klebsiella pneumoniae strain MGH78578 was synthesized, and the full length of the gene was amplified using the sequence as a template and the nucleic acids of SEQ ID NOs: 40 and 41 as primers.
  • This PCR fragment was inserted into pMW::Pro-Ter in the same manner as in the production of pMW::SeYHHS, and the resulting plasmid was designated as pMW::KpYHHS.
  • the yhhS homolog sequence of Pectobacterium carotovorum PC1 strain was synthesized, and the full length of the gene was amplified using the sequence as a template and the nucleic acids of SEQ ID NOs: 42 and 43 as primers.
  • This PCR fragment was inserted into pMW::Pro-Ter in the same manner as in the production of pMW::SeYHHS, and the resulting plasmid was designated as pMW::PcYHHS.
  • the full length of the gene was amplified using the genomic DNA of Serratia grimesii NBRC13537 strain as a template and the nucleic acids of SEQ ID NOs: 44 and 45 as primers.
  • This PCR fragment was inserted into pMW::Pro-Ter in the same manner as in the production of pMW::SeYHHS, and the resulting plasmid was designated as pMW::SgYHHS.
  • Example 4 Construction of 3HA and/or 3OA producing strains with increased expression of YhhS homolog E. coli str. K-12 substr. Plasmid pBBRc::ATCTOR produced in Reference Example 1 was introduced into BW25113 in the same manner as in Reference Example 4. Plasmids pMW::SeYHHS, pMW::KpYHHS, pMW::PcYHHS, or pMW::SgYHHS prepared in Reference Example 9 were introduced into the obtained strain to increase the expression of YhhS homologs. Alternatively, 3OA producing strains (EcWT/3HA_SeYHHS, EcWT/3HA_KpYHHS, EcWT/3HA_PcYHHS, EcWT/3HA_SgYHHS) were produced.
  • Example 5 3HA production test of 3HA and/or 3OA producing strains with increased expression of YhhS homolog
  • the expression of the YhhS homolog produced in Example 4 was increased.
  • a 3HA production test was conducted in the same manner as in Comparative Example 1 using 3HA and/or 3OA producing strains (EcWT/3HA_SeYHHS, EcWT/3HA_KpYHHS, EcWT/3HA_PcYHHS, EcWT/3HA_SgYHHS). The results are shown in Table 3.
  • Example 6 3OA production test of 3HA and/or 3OA producing strains with increased expression of YhhS homolog
  • the expression of the YhhS homolog produced in Example 4 was increased.
  • a 3OA production test was conducted in the same manner as in Comparative Example 2 using 3HA and/or 3OA producing strains (EcWT/3HA_SeYHHS, EcWT/3HA_KpYHHS, EcWT/3HA_PcYHHS, EcWT/3HA_SgYHHS). The results are shown in Table 4.
  • Reference example 10 Preparation of a plasmid expressing an organophosphate compound excretion carrier
  • MdtD Escherichia coli str. K-12 substr.
  • the full length of the gene was amplified using the genomic DNA of the MG1655 strain as a template and the nucleic acids of SEQ ID NOs: 52 and 53 as primers.
  • This PCR fragment was inserted into pMW::Pro-Ter in the same manner as in the production of pMW::SeYHHS, and the resulting plasmid was designated as pMW::EcMDTD.
  • RhtB Escherichia coli str. K-12 substr.
  • the full length of the gene was amplified using the genomic DNA of strain MG1655 as a template and the nucleic acids of SEQ ID NOs: 54 and 55 as primers.
  • This PCR fragment was inserted into pMW::Pro-Ter in the same manner as in the production of pMW::SeYHHS, and the resulting plasmid was designated as pMW::EcRHTB.
  • the full length of the gene was amplified using the gene-synthesized MFS40 gene of Aspergillus oryzae RIB40 strain as a template and the nucleic acids of SEQ ID NOs: 56 and 57 as primers.
  • This PCR fragment was inserted into pMW::Pro-Ter in the same manner as in the production of pMW::SeYHHS, and the resulting plasmid was designated as pMW::AoMFS40.
  • Example 7 Creation of 3HA and/or 3OA producing strains with increased expression of organophosphate compound excretion carrier E. coli str. K-12 substr.
  • Plasmid pBBRc::ATCTOR produced in Reference Example 1 was introduced into BW25113 in the same manner as in Reference Example 4.
  • Plasmids pMW::EcMDTD, pMW::EcRHTB, or pMW::AoMFS40 prepared in Reference Example 10 were introduced into the obtained strain to increase the expression of the organophosphate compound excretion carrier 3HA and/or 3OA producing strains (EcWT/3HA_EcMDTD, EcWT/3HA_EcRHTB, EcWT/3HA_AoMFS40) were produced.
  • Example 8 3HA production test of 3HA and/or 3OA producing strain with increased expression of organophosphate compound excretion carrier
  • the strain was prepared in Example 7.
  • a 3HA production test was conducted in the same manner as in Comparative Example 1 using 3HA and/or 3OA producing strains (EcWT/3HA_EcMDTD, EcWT/3HA_EcRHTB, EcWT/3HA_AoMFS40) with increased expression of organophosphate compound excretion carriers. .
  • the results are shown in Table 5.
  • Reference example 11 Production of 3HA and/or 3OA producing strains with increased expression of proteins that belong to MFS and do not have organophosphate compound excretion function YhhS, MdtD, and MFS40 are all proteins that belong to MFS.
  • YhhS, MdtD, and MFS40 are all proteins that belong to MFS.
  • EmrD is a protein belonging to MFS called Multidrug resistance protein D, and a specific example is Escherichia coli str. K-12 substr.
  • EmrD NCBI Protein ID: NP_418129, SEQ ID NO: 58
  • examples of the gene encoding EmrD include Escherichia coli str. K-12substr.
  • Examples include emrD (NCBI Gene ID: 948180, SEQ ID NO: 59) derived from the MG1655 strain. It is described in Japanese Patent Publication No. 2017-528126 that EmrD does not have the function of excreting O-phosphoserine, which is an organic phosphoric acid compound.
  • Escherichia coli str. K-12 substr The full length of the gene was amplified using the genomic DNA of the MG1655 strain as a template and the nucleic acids of SEQ ID NOs: 60 and 61 as primers. This PCR fragment was inserted into pMW::Pro-Ter in the same manner as in the production of pMW::SeYHHS, and the resulting plasmid was designated as pMW::EcEMRD.
  • Reference example 12 Creation of a 3HA and/or 3OA producing strain that has increased expression of a protein that belongs to MFS and does not have an organophosphate compound excretion function E. coli str. K-12 substr.
  • Plasmid pBBRc::ATCTOR produced in Reference Example 1 was introduced into BW25113 in the same manner as in Reference Example 4.
  • the plasmid pMW::EcEMRD prepared in Reference Example 11 was introduced into the obtained strain to increase the expression of a protein that belongs to MFS and does not have an organophosphate compound excretion function to produce 3HA and/or 3OA.
  • a strain (EcWT/3HA_pMW::EcEMRD) was created.
  • Reference example 13 3HA production test of a 3HA and/or 3OA producing strain that has increased expression of a protein that belongs to MFS and does not have an organophosphate compound excretion function.
  • a 3HA production test was conducted in the same manner as in Comparative Example 1 using a 3HA and/or 3OA producing strain (EcWT/3HA_pMW::EcEMRD) in which the expression of a protein that does not have increased was increased. The results are shown in Table 6.
  • Comparing the results of Comparative Example 1 and Reference Example 13 it is found that the 3HA and/or 3OA producing strain (Reference Example 13) with increased expression of the organophosphate compound excretion carrier has less 3HA than the control strain (Comparative Example 1). Yield decreased. Therefore, it was suggested that increasing the expression level of a protein that does not have an organophosphate compound excretion function does not enhance the 3HA excretion function and does not improve 3HA productivity.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

３－ヒドロキシアジピン酸および／または３－オキソアジピン酸を高い生産性で生産することが可能な遺伝子改変微生物及び当該遺伝子改変微生物を用いた３－ヒドロキシアジピン酸および／または３－オキソアジピン酸の製造方法が開示されている。遺伝子改変微生物は、３－ヒドロキシアジピン酸および／または３－オキソアジピン酸を製造する能力を有する微生物において、スクシニル－ＣｏＡおよびアセチル－ＣｏＡから３－オキソアジピル－ＣｏＡおよびＣｏＡへの反応を触媒する酵素の活性を強化させ、かつ、有機リン酸化合物排出担体またはそれらのホモログの発現量を増大させたものである。

Description

３－ヒドロキシアジピン酸および／または３－オキソアジピン酸を生産するための遺伝子改変微生物および当該化学品の製造方法
　本発明は、３－ヒドロキシアジピン酸および／または３－オキソアジピン酸を高生産する遺伝子改変微生物、および当該遺伝子改変微生物を用いた３－ヒドロキシアジピン酸および／または３－オキソアジピン酸の製造方法に関する。
　３－ヒドロキシアジピン酸（ＩＵＰＡＣ名：３－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｅｄｉｏｉｃ　ａｃｉｄ）は炭素数６のジカルボン酸である。これらは多価アルコールと重合することでポリエステルとして、また多価アミンと重合することでポリアミドの原料として用いることができる。また、これらの末端にアンモニアを付加してラクタム化した化合物もポリアミドの原料として用いることができる。
　３－オキソアジピン酸（別名：β－ケトアジピン酸、ＩＵＰＡＣ名：３－ｏｘｏｈｅｘａｎｅｄｉｏｉｃ　ａｃｉｄ）は、炭素数６、分子量１６０．１２のジカルボン酸である。３－オキソアジピン酸は多価アルコールと重合することでポリエステルとして、また多価アミンと重合することでポリアミドの原料として用いることができる。また、３－オキソアジピン酸の末端にアンモニアを付加してラクタム化することで、単独でもポリアミドの原料になり得る。
　微生物を利用した３－ヒドロキシアジピン酸または３－オキソアジピン酸の製造に関連する文献として、特許文献１には、スクシニル－ＣｏＡおよびアセチル－ＣｏＡから３－オキソアジピル－ＣｏＡおよびＣｏＡへの反応を触媒する酵素活性を強化したＳｅｒｒａｔｉａ属微生物を用いた３－ヒドロキシアジピン酸の製造方法が開示されており、また、特許文献２には、スクシニル－ＣｏＡとアセチル－ＣｏＡを出発原料とした天然には存在しない微生物によるアジピン酸を製造する方法の過程で、アジピン酸生合成経路の中間体として３－オキソアジピン酸（３－オキソアジペート）が生成しうるとの報告がある。
　また、微生物を利用した化学品の製造方法においては、製造対象の化学品を細胞から排出する排出担体（トランスポーター）が活用されており（例えば、特許文献３ならびに非特許文献１および２）、特許文献４には、ジカルボン酸排出担体の機能を欠損または低下させた遺伝子改変微生物を用いた３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸の製造方法が記載されており、これら物質の生合成経路として、スクシニル－ＣｏＡおよびアセチル－ＣｏＡを３－オキソアジピル－ＣｏＡおよびＣｏＡへと変換する酵素反応を経由すること、ジカルボン酸排出担体の機能を欠損または低下させることでこれら物質の生産性が向上するとの記載がある。
ＷＯ２０１７／２０９１０２号 ＷＯ２００９／１５１７２８号 特表２０１７－５２８１２６号公報 ＷＯ２０２１／１８７５３３号
Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２　Ａｐｒ；３９（４）：６４１－７ Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　１４０（２０１７）６５－６８
　本発明では、３－ヒドロキシアジピン酸および／または３－オキソアジピン酸を高い生産性で製造することができる遺伝子改変微生物、および当該改変微生物を用いた３－ヒドロキシアジピン酸および／または３－オキソアジピン酸の製造方法を創出することを目的とする。
　本発明者は上記目的を達成するため鋭意検討した結果、３－ヒドロキシアジピン酸および／または３－オキソアジピン酸を製造する能力を有する微生物において、３－ヒドロキシアジピン酸および／または３－オキソアジピン酸とは全く関連しない物質である有機リン酸化合物の排出担体の発現量を増大させることで、３－ヒドロキシアジピン酸および／または３－オキソアジピン酸の生産性を向上させることができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は以下の（１）～（１３）を提供する。
（１）３－ヒドロキシアジピン酸および／または３－オキソアジピン酸を製造する能力を有する微生物において、スクシニル－ＣｏＡおよびアセチル－ＣｏＡから３－オキソアジピル－ＣｏＡおよびＣｏＡへの反応を触媒する酵素の活性を強化させ、かつ、有機リン酸化合物排出担体の発現量を増大させた、遺伝子改変微生物。
（２）前記有機リン酸化合物排出担体が、ホスホセリン排出担体および／またはグリホサート排出担体である、（１）に記載の遺伝子改変微生物。
（３）前記有機リン酸化合物排出担体が、ＹｈｈＳ、ＭｄｔＤ、ＲｈｔＢ、ＭＦＳ４０またはそれらのホモログである、（１）または（２）に記載の遺伝子改変微生物。
（４）以下の（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのポリペプチドをコードする遺伝子を導入して前記有機リン酸化合物排出担体の発現量を増大させた、（１）から（３）のいずれかに記載の遺伝子改変微生物。
（Ａ）配列番号１、３、２８～３０、４６、４８または５０のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｂ）配列番号１、３、２８～３０、４６、４８または５０のアミノ酸配列に対して６０％以上の配列同一性を有し、かつ、３－ヒドロキシアジピン酸および／または３－オキソアジピン酸の生産性向上機能を有するポリペプチド
（Ｃ）配列番号１、３、２８～３０、４６、４８または５０のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、３－ヒドロキシアジピン酸および／または３－オキソアジピン酸の生産性向上機能を有するポリペプチド
（５）さらに、３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応および／または３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡから３－ヒドロキシアジピン酸を生成する反応を触媒する酵素の活性を強化させた、（１）から（４）のいずれかに記載の遺伝子改変微生物。
（６）さらに、３－オキソアジピル－ＣｏＡから３－オキソアジピン酸を生成する反応を触媒する酵素の活性を強化させた、（１）から（５）のいずれかに記載の遺伝子改変微生物。
（７）前記微生物がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属またはＳｅｒｒａｔｉａ属に属する微生物である、（１）から（６）のいずれかに記載の遺伝子改変微生物。
（８）（１）から（７）のいずれかに記載の遺伝子改変微生物を培養する工程を含む、３－ヒドロキシアジピン酸および／または３－オキソアジピン酸の製造方法。
（９）遺伝子改変により、３－ヒドロキシアジピン酸および／または３－オキソアジピン酸を製造する能力を有する微生物のスクシニル－ＣｏＡおよびアセチル－ＣｏＡから３－オキソアジピル－ＣｏＡおよびＣｏＡへの反応を触媒する酵素の活性を強化する工程、ならびに、該微生物のＹｈｈＳもしくはそのホモログの発現量を増大させる工程を含む、遺伝子改変微生物の製造方法。
（１０）有機リン酸化合物排出担体の発現量を増大させた３－ヒドロキシアジピン酸および／または３－オキソアジピン酸を製造する能力を有する微生物を培養する工程を含む、３－ヒドロキシアジピン酸および／または３－オキソアジピン酸の製造方法。
（１１）（８）または（１０）に記載の方法により３－ヒドロキシアジピン酸および／または３－オキソアジピン酸を製造する工程Ａ、ならびに、水素化触媒の存在下、３－ヒドロキシアジピン酸および／または３－オキソアジピン酸と水素とを反応させる工程Ｂ（水素化工程）を含む、アジピン酸の製造方法。
（１２）（１１）に記載の方法によりアジピン酸を製造する工程、ならびに、アジピン酸およびジアミンを重縮合する工程Ｃを含む、ポリアミドの製造方法。
（１３）前記ジアミンが、１，４－ブタンジアミン、１，５－ペンタンジアミンまたはヘキサメチレンジアミンを含有するジアミンである、請求項１１に記載のポリアミドの製造方法。
　本発明の遺伝子改変微生物は、有機リン酸化合物排出担体の発現量を増大させていない親株の微生物と比較して、３－ヒドロキシアジピン酸および／または３－オキソアジピン酸を高い生産性で生産することができる。
　以下、本明細書では３－ヒドロキシアジピン酸を３ＨＡ、３－オキソアジピン酸を３ＯＡと略すことがある。また、ＹｈｈＳをコードする遺伝子をｙｈｈＳと記載する場合がある。また、ＭｄｔＤをコードする遺伝子をｍｄｔＤと記載する場合がある。また、ＲｈｔＢをコードする遺伝子をｒｈｔＢと記載する場合がある。また、ＥｍｒＤをコードする遺伝子をｅｍｒＤと記載する場合がある。また、３－オキソアジピル－ＣｏＡを３ＯＡ－ＣｏＡ、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを３ＨＡ－ＣｏＡ、補酵素ＡをＣｏＡと略すことがある。また、機能を持つポリペプチドをコードする核酸のことを遺伝子と記載することがある。
　下記反応スキーム１は、微生物が３ＨＡおよび／または３ＯＡを製造するうえでの反応経路の例を示している。ここで、反応Ａは、アセチル－ＣｏＡおよびスクシニル－ＣｏＡから３－オキソアジピル－ＣｏＡおよびＣｏＡを生成する反応を示す。反応Ｂは、３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を示す。反応Ｃは、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡから３－ヒドロキシアジピン酸を生成する反応を示す。反応Ｄは、３－オキソアジピル－ＣｏＡから３－オキソアジピン酸を生成する反応を示す。これらの反応経路のうち、３ＨＡおよび／または３ＯＡを製造する能力を有する微生物は、少なくとも反応Ａを触媒する酵素を有していることが知られている（ＷＯ２０１９／１０７５１６号参照。）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　そして、本発明の遺伝子改変微生物は、３ＨＡおよび／または３ＯＡを製造する能力を有する微生物において、アセチル－ＣｏＡおよびスクシニル－ＣｏＡから３－オキソアジピル－ＣｏＡおよびＣｏＡを生成する反応（反応Ａ）の酵素の活性を強化するととともに、有機リン酸化合物排出担体の発現量を増大させることで、３ＨＡおよび／または３ＯＡを製造する能力を有する微生物の３ＨＡおよび／または３ＯＡの生産性を向上させることを技術的特徴とする。なお、「遺伝子改変」は、人工的に遺伝子を改変することを意味する。
　有機リン酸化合物とは、アルコール、カルボン酸、アミノ酸などの有機化合物とリン酸が結合した構造を有する化合物のことを指し、水酸基を有するアミノ酸であるセリンとリン酸がエステル結合したホスホセリンや、グリシンの窒素原子上にホスホノメチル基が置換したグリホサートなどが具体例として挙げられる。
　有機リン酸化合物排出担体とは、細胞内の有機リン酸化合物を細胞外に排出する活性を有する膜タンパク質である。また、有機リン酸化合物排出担体の発現量を増大するとは、微生物がもともと保有する有機リン酸化合物排出機能を有するタンパク質の発現量を増大すること、および／または、微生物がもともと保有していない有機リン酸化合物排出機能を有するタンパク質を当該微生物にて発現するようにすることを意味する。本発明において発現量の増大の対象となる有機リン酸化合物排出担体の好ましい具体例としては、ホスホセリン排出担体および／またはグリホサート排出担体が挙げられる。
　ホスホセリン排出担体の具体例としては、特表２０１７－５２８１２６号公報にてＯ－ホスホセリンの排出担体として記載されているＹｈｈＳ、ＭｄｔＤおよびＲｈｔＢタンパク質ならびにこれらタンパク質のホモログが挙げられる。
　グリホサート排出担体の具体例としては、Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２　Ａｐｒ；３９（４）：６４１－７に記載のＹｈｈＳタンパク質およびそのホモログや、Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　１４０（２０１７）６５－６８に記載のＭＦＳ４０タンパク質およびそのホモログが挙げられる。
　なお、ホスホセリン排出担体およびグリホサート排出担体の具体例の説明で引用した上記文献には、ＹｈｈＳ等で例示される有機リン酸化合物排出担体がジカルボン酸排出担体としての活性を有することについては記載がなく、従って、有機リン酸化合物排出担体の発現量を増大することで、本明細書の実施例で示されるように炭素数６のジカルボン酸である３ＨＡおよび／または３ＯＡの生産能が向上することは、有機リン酸化合物排出担体が３ＨＡおよび／または３ＯＡの排出担体としての機能を有することを意味し、有機リン酸化合物排出担体が３ＨＡおよび／または３ＯＡの排出担体としても機能することは当業者にとって予想外の知見である。
　以下、本発明において発現量を増大させる有機リン酸化合物排出担体として好適である、ＹｈｈＳ、ＭｄｔＤ、ＲｈｔＢおよびＭＦＳ４０ならびにこれらのホモログについて詳細に説明する。
　ＹｈｈＳは、ｍａｊｏｒ　ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ　ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ（ＭＦＳ）－ｔｙｐｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒと推定されるタンパク質であり、具体例として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｓｔｒ．Ｋ－１２　ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５由来のＹｈｈＳ（ＮＣＢＩ　ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＮＰ＿４１７９３０、配列番号１）が挙げられ、ＹｈｈＳタンパク質をコードするｙｈｈＳ遺伝子として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｓｔｒ．Ｋ－１２ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５株由来のｙｈｈＳ（ＮＣＢＩ　ＧｅｎｅＩＤ：９４７９８２、配列番号２）が挙げられる。また、配列番号１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、その発現量を増大させることで３ＨＡおよび／または３ＯＡの生産性を向上させる機能を有するタンパク質であれば、当該タンパク質をＹｈｈＳとして用いることができる。ここで、「１もしくは数個」の範囲は、好ましくは１０個以内、より好ましくは５個以内、さらに好ましくは４個以内、特に好ましくは１個または２個以内である。また、配列番号１のアミノ酸配列に対する配列同一性（定義は後述）が６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、その発現量を増大させることで３ＨＡおよび／または３ＯＡの生産性を向上させる機能を有するタンパク質も、当該タンパク質をＹｈｈＳとして用いることができる。
　ＹｈｈＳのホモログとは、ＹｈｈＳとアミノ酸配列の配列同一性が高く、ＹｈｈＳと類似の機能または構造を有すると推定されるタンパク質である。
　ＹｈｈＳのホモログは、例えば、ＹｈｈＳのアミノ酸配列を問い合わせ配列として、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）やＫＥＧＧ（Ｋｙｏｔｏ　Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｏｍｅｓ）などにおける公開データベース上でＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ）検索を行い、当てはまる配列をコードする遺伝子を参照することで容易に取得できる。また、ＹｈｈＳもしくはそのホモログをコードする遺伝子の塩基配列に基づいて作成したオリゴヌクレオチドをプライマーとして、他の生物のゲノムＤＮＡを鋳型に用いたＰＣＲによっても取得できる。
　ＹｈｈＳのホモログとは、ＹｈｈＳとアミノ酸配列の配列同一性が高く、ＹｈｈＳと類似の機能または構造を有すると推定されるタンパク質であり、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｓｔｒ．Ｋ－１２　ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５由来のＹｈｈＳのアミノ酸配列（ＮＣＢＩ　ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＮＰ＿４１７９３０、配列番号１）に対して、配列同一性が、具体的には６０％以上であり、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上であって、かつ、その発現量を増大させることで３ＨＡおよび／または３ＯＡの生産性を向上させる機能を有するものが利用できる。このようなＹｈｈＳホモログの具体例としては、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｇｒｉｍｅｓｉｉ　ＮＢＲＣ１３５３７株由来のＹｈｈＳホモログ（配列番号３）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｅｎｔｅｒｉｃａ　ＡＴＣＣ９１５０株由来のＹｈｈＳホモログ（ＮＣＢＩ　ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＡＡＶ７９２４３、配列番号２８）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　ＭＧＨ７８５７８株由来のＹｈｈＳホモログ（ＮＣＢＩ　ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＡＢＲ７９２２６、配列番号２９）、Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ　ＰＣ１株由来のＹｈｈＳホモログ（ＮＣＢＩ　ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＡＣＴ１１１５０、配列番号３０）が挙げられ、これらタンパク質をコードする遺伝子として、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｇｒｉｍｅｓｉｉ　ＮＢＲＣ１３５３７株由来のｙｈｈＳホモログ（配列番号４）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｅｎｔｅｒｉｃａ　ＡＴＣＣ９１５０株由来のｙｈｈＳホモログ（ＮＣＢＩ　ＧｅｎｅＩＤ：ＣＰ００００２６、ＲＥＧＩＯＮ：３５３９０４９．．３５４０２６６、配列番号３１）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　ＭＧＨ７８５７８株由来のｙｈｈＳホモログ（ＮＣＢＩ　ＧｅｎｅＩＤ：ＣＰ０００６４７、ＲＥＧＩＯＮ：４１９５１８９．．４１９６４０９、配列番号３２）、Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ　ＰＣ１株由来のｙｈｈＳホモログ（ＮＣＢＩ　ＧｅｎｅＩＤ：ＣＰ００１６５７、ＲＥＧＩＯＮ：１１３４７８．．１１４６７７、配列番号３３）が挙げられる。なお、本明細書及び請求の範囲において、「配列同一性」とは、２つのアミノ酸配列または塩基配列にギャップを導入して、またはギャップを導入しないで整列させた場合の、最適なアライメントにおいて、オーバーラップする全アミノ酸配列（翻訳開始点となるアミノ酸を含む）または塩基配列（開始コドンを含む）に対する同一アミノ酸または塩基の割合（パーセンテージ）を意味し、式（１）によって算出する。式（１）において、比較する短い方の配列長は１００アミノ酸または３００塩基以上であり、１００アミノ酸または３００塩基未満の場合には配列同一性は定義されない。配列同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴにおいてデフォルトのパラメーターを用いて容易に調べることができる。また、配列同一性はＧｅｎｅｔｙｘなどのソフトウェアに搭載されている同様の機能を用いても調べることができる。式（１）に従い、Ｇｅｎｅｔｙｘの機能（％Ｉｄｅｎｔｉｔｙ　Ｍａｔｒｉｘ）を用いて配列番号１、２８、２９、３０、および３のアミノ酸配列間の配列同一性を算出すると、それぞれ９０．９、８４．４、７０．２、および６１．４％となる。
　配列同一性（％）＝一致数（ギャップ同士はカウントしない）／短い方の配列長（両端のギャップを含まない長さ）×１００・・・式（１）。
　ＭｄｔＤ（別名：ＹｅｇＢ）は、Ｐｕｔａｔｉｖｅ　ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｐｒｏｔｅｉｎと呼ばれるｍａｊｏｒ　ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ　ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ（ＭＦＳ）に属するタンパク質であり、具体例としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｓｔｒ．Ｋ－１２　ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５株由来のＭｄｔＤ（ＮＣＢＩ　ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＮＰ＿４１６５８１、配列番号４６）が挙げられ、ＭｄｔＤをコードする遺伝子として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｓｔｒ．Ｋ－１２ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５株由来のｍｄｔＤ（ＮＣＢＩ　ＧｅｎｅＩＤ：９４６６０１、配列番号４７）が挙げられる。また、配列番号４６のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、その発現量を増大させることで３ＨＡおよび／または３ＯＡの生産性を向上させる機能を有するタンパク質であれば、当該タンパク質をＭｄｔＤとして用いることができる。ここで、「１もしくは数個」の範囲は、好ましくは１０個以内、より好ましくは５個以内、さらに好ましくは４個以内、特に好ましくは１個または２個以内である。また、配列番号４６のアミノ酸配列に対する配列同一性が６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、その発現量を増大させることで３ＨＡおよび／または３ＯＡの生産性を向上させる機能を有するタンパク質も、当該タンパク質をＭｄｔＤとして用いることができる。
　ＲｈｔＢ（別名：ＹｉｇＫ）は、Ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ／ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ　ｌａｃｔｏｎｅ　ｅｆｆｌｕｘ　ｐｒｏｔｅｉｎと呼ばれるタンパク質であり、具体例としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｓｔｒ．Ｋ－１２　ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５株由来のＲｈｔＢ（ＮＣＢＩ　ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＹＰ＿０２６２６５、配列番号４８）が挙げられ、ＲｈｔＢをコードする遺伝子として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｓｔｒ．Ｋ－１２ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５株由来のｒｈｔＢ（ＮＣＢＩ　ＧｅｎｅＩＤ：９４８３１６、配列番号４９）が挙げられる。また、配列番号４８のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、その発現量を増大させることで３ＨＡおよび／または３ＯＡの生産性を向上させる機能を有するタンパク質であれば、当該タンパク質をＲｈｔＢとして用いることができる。ここで、「１もしくは数個」の範囲は、好ましくは１０個以内、より好ましくは５個以内、さらに好ましくは４個以内、特に好ましくは１個または２個以内である。また、配列番号４８のアミノ酸配列に対する配列同一性が６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、その発現量を増大させることで３ＨＡおよび／または３ＯＡの生産性を向上させる機能を有するタンパク質も、当該タンパク質をＲｈｔＢとして用いることができる。
　ＭＦＳ４０は、ｍａｊｏｒ　ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ　ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ（ＭＦＳ）に属するタンパク質であり、具体例としてＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ　ＲＩＢ４０株由来のＭＦＳ４０（ＮＣＢＩ　ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＸＰ＿００１８２６８８７、配列番号５０）が挙げられ、ＭＦＳ４０をコードする遺伝子として、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ　ＲＩＢ４０株由来のＭＦＳ４０遺伝子（ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：　ＸＭ＿００１８２６８３５．２、配列番号５１）が挙げられる。また、配列番号５０のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、その発現量を増大させることで３ＨＡおよび／または３ＯＡの生産性を向上させる機能を有するタンパク質であれば、当該タンパク質をＭＦＳ４０として用いることができる。ここで、「１もしくは数個」の範囲は、好ましくは１０個以内、より好ましくは５個以内、さらに好ましくは４個以内、特に好ましくは１個または２個以内である。また、配列番号５０のアミノ酸配列に対する配列同一性が６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、その発現量を増大させることで３ＨＡおよび／または３ＯＡの生産性を向上させる機能を有するタンパク質も、当該タンパク質をＭＦＳ４０として用いることができる。
　ＭｄｔＤ、ＲｈｔＢおよびＭＦＳ４０のホモログとは、それぞれのタンパク質とアミノ酸配列の配列同一性が高く、それぞれのタンパク質と類似の機能または構造を有すると推定されるタンパク質であり、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｓｔｒ．Ｋ－１２　ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５株由来のＭｄｔＤ（ＮＣＢＩ　ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＮＰ＿４１６５８１、配列番号４６）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｓｔｒ．Ｋ－１２　ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５株由来のＲｈｔＢ（ＮＣＢＩ　ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＹＰ＿０２６２６５、配列番号４８）およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ　ＲＩＢ４０株由来のＭＦＳ４０（ＮＣＢＩ　ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＸＰ＿００１８２６８８７、配列番号５０）に対して、配列同一性が、具体的には６０％以上であり、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上であって、かつ、その発現量を増大させることで３ＨＡおよび／または３ＯＡの生産性を向上させる機能を有するものが利用できる。また、これらホモログは、例えば、ＭｄｔＤのアミノ酸配列を問い合わせ配列として、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）やＫＥＧＧ（Ｋｙｏｔｏ　Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｏｍｅｓ）などにおける公開データベース上でＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ）検索を行い、当てはまる配列をコードする遺伝子を参照することで容易に取得できる。また、ＭｄｔＤもしくはそのホモログをコードする遺伝子の塩基配列に基づいて作成したオリゴヌクレオチドをプライマーとして、他の生物のゲノムＤＮＡを鋳型に用いたＰＣＲによっても取得できる。
　有機リン酸化合物排出担体として好適な上記タンパク質は、これをコードする遺伝子を外来遺伝子として微生物宿主に導入して発現させることが好ましい（下記実施例参照）。
　３ＨＡおよび／または３ＯＡを製造する能力を有する微生物におけるアセチル－ＣｏＡおよびスクシニル－ＣｏＡから３－オキソアジピル－ＣｏＡおよびＣｏＡを生成する反応（反応Ａ）の酵素の活性の強化方法自体は公知であり、例えばＷＯ２０１７／２０９１０２号に記載の方法に準じて好ましく行うことができる。
　スクシニル－ＣｏＡおよびアセチル－ＣｏＡから３－オキソアジピルＣｏＡおよびＣｏＡを生じる反応を触媒する活性を有する酵素として、ａｃｅｔｙｌ－ＣｏＡ　ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、β－ｋｅｔｏａｃｙｌＣｏＡ　ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、３－ｏｘｏａｄｉｐｙｌ－ＣｏＡ　ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、β－ｋｅｔｏａｄｉｐｙｌ－ＣｏＡ　ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ａｃｅｔｙｌ－ＣｏＡ　Ｃ－ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ａｃｅｔｏａｃｅｔｙｌ－ＣｏＡ　ｔｈｉｏｌａｓｅ、ｂｅｔａ－ａｃｅｔｏａｃｅｔｙｌ　ｃｏｅｎｚｙｍｅ　Ａ　ｔｈｉｏｌａｓｅ、２－ｍｅｔｈｙｌａｃｅｔｏａｃｅｔｙｌ－ＣｏＡ　ｔｈｉｏｌａｓｅ、３－ｏｘｏｔｈｉｏｌａｓｅ、ａｃｅｔｙｌ　ｃｏｅｎｚｙｍｅ　Ａ　ｔｈｉｏｌａｓｅ、ａｃｅｔｙｌ－ＣｏＡ　ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ａｃｅｔｙｌ－ＣｏＡ：Ｎ－ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ａｃｅｔｙｌ－ＣｏＡ　Ｃ－ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ｂｅｔａ－ｋｅｔｏｔｈｉｏｌａｓｅ、３－ｋｅｔｏａｃｙｌ－ＣｏＡ　ｔｈｉｏｌａｓｅ、ｂｅｔａ－ｋｅｔｏａｃｙｌ　ｃｏｅｎｚｙｍｅ　Ａ　ｔｈｉｏｌａｓｅ、ｂｅｔａ－ｋｅｔｏａｃｙｌ－ＣｏＡ　ｔｈｉｏｌａｓｅ、ｂｅｔａ－ｋｅｔｏａｄｉｐｙｌ　ｃｏｅｎｚｙｍｅ　Ａ　ｔｈｉｏｌａｓｅ、ｂｅｔａ－ｋｅｔｏａｄｉｐｙｌ－ＣｏＡ　ｔｈｉｏｌａｓｅ、３－ｋｅｔｏａｃｙｌ　ｃｏｅｎｚｙｍｅ　Ａ　ｔｈｉｏｌａｓｅ、３－ｋｅｔｏａｃｙｌ　ｔｈｉｏｌａｓｅ、３－ｋｅｔｏｔｈｉｏｌａｓｅ、３－ｏｘｏａｃｙｌ－ＣｏＡ　ｔｈｉｏｌａｓｅ、３－ｏｘｏａｃｙｌ－ｃｏｅｎｚｙｍｅ　Ａ　ｔｈｉｏｌａｓｅ、６－ｏｘｏａｃｙｌ－ＣｏＡ　ｔｈｉｏｌａｓｅ、ａｃｅｔｏａｃｅｔｙｌ－ＣｏＡ　ｂｅｔａ－ｋｅｔｏｔｈｉｏｌａｓｅ、ａｃｅｔｙｌ－ＣｏＡ　ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ｋｅｔｏａｃｙｌ－ＣｏＡ　ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ｋｅｔｏａｃｙｌ－ｃｏｅｎｚｙｍｅ　Ａ　ｔｈｉｏｌａｓｅ、ｌｏｎｇ－ｃｈａｉｎ　３－ｏｘｏａｃｙｌ－ＣｏＡ　ｔｈｉｏｌａｓｅ、ｏｘｏａｃｙｌ－ｃｏｅｎｚｙｍｅ　Ａ　ｔｈｉｏｌａｓｅ、ｐｒｏ－３－ｋｅｔｏａｃｙｌ－ＣｏＡ　ｔｈｉｏｌａｓｅ、３－ｏｘｏａｄｉｐｙｌ－ＣｏＡ　ｔｈｉｏｌａｓｅ、３－ｏｘｏ－５，６－ｄｉｄｅｈｙｄｒｏｓｕｂｅｒｙｌ－ＣｏＡ　ｔｈｉｏｌａｓｅなどの酵素が挙げられる。また、ＥＣ番号による分類上の限定は特にないが、ＥＣ　２．３．１．－に分類されるアシルトランスフェラーゼが好ましく、具体例としては、ＥＣ　２．３．１．１７４、ＥＣ　２．３．１．９、ＥＣ　２．３．１．１６、ＥＣ　２．３．１．２２３に分類される酵素が挙げられる。
　また、機能未知の遺伝子配列によってコードされるタンパク質が、上記の酵素に該当するかどうかについては、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）などのサイトでＢＬＡＳＴ検索を行い、当該酵素に該当するかどうかを推定することができる。
　これら酵素の好ましい具体例としては、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｂａｙｌｙｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓなどのＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属微生物、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅなどのＡｅｒｏｂａｃｔｅｒ属微生物、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓなどのＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属微生物、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂａｄｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｒｏｓｅｕｓなどのＢａｃｉｌｌｕｓ属微生物、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｏｄｉｎｕｍなどのＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属微生物、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなどのＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属微生物、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｎｅｃａｔｏｒ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｎｕｍａｚｕｅｎｓｉｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｏｘａｌａｔｉｃｕｓなどのＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ続微生物、Ｄｅｌｆｔｉａ　ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓなどのＤｅｌｆｔｉａ属微生物、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉなどのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物、Ｈａｆｎｉａ　ａｌｖｅｉなどのＨａｆｎｉａ属微生物、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍなどのＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属微生物、Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ　ａｌｂｕｓなどのＮｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ属微生物、Ｐｌａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ　ｏｋｅａｎｏｋｏｉｔｅｓなどのＰｌａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属微生物、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｒａｇｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｒｅｐｔｉｌｉｖｏｒａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓなどのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属微生物、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒなどのＲｈｉｚｏｂｉｕｍ属微生物、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ　ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓなどのＲｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属微生物、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属微生物、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｇｒｉｍｅｓｉｉ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｎｅｍａｔｏｄｉｐｈｉｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｏｄｏｒｉｆｅｒａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａなどのＳｅｒｒａｔｉａ属微生物、Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ　ｂｌａｔｔａｅなどのＳｈｉｍｗｅｌｌｉａ属微生物、Ｓｔｅｒｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｖｉｎａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｋａｒｎａｔａｋｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｖｉｎａｃｅｕｓなどのＳｔｅｒｐｔｏｍｙｃｅｓ属微生物、Ｙａｒｒｏｗｉａ　ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａなどのＹａｒｒｏｗｉａ属微生物、Ｙｅｒｓｉｎｉａ　ｒｕｃｋｅｒｉなどのＹｅｒｓｉｎｉａ属微生物由来の酵素が挙げられ、好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｓｔｒ．　Ｋ－１２　ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５株由来のＰａａＪ（ＮＣＢＩ　ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＮＰ＿４１５９１５）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＫＴ２４４０株由来のＰｃａＦ（ＮＣＢＩ　ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＮＰ＿７４３５３６）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１３０３２株由来のＰｃａＦ（ＮＣＢＩ　ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＣＡＦ２１０５７）などが挙げられる。
　また、本発明の遺伝子改変微生物では、ＷＯ２０１９／１０７５１６号およびＷＯ２０２１／１８７５３３号の記載に準じて３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応（反応Ｂ）、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡから３－ヒドロキシアジピン酸を生成する反応（反応Ｃ）および／または３－オキソアジピル－ＣｏＡから３－オキソアジピン酸を生成する反応（反応Ｄ）を触媒する酵素の活性を強化することが好ましい。
　３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応（反応Ｂ）を触媒する酵素としては、３－ヒドロキシアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼとしてＥＣ　１．１．１．３５に分類される酵素、３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼとしてＥＣ　１．１．１．１５７に分類される酵素などが挙げられる。具体的には、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＫＴ２４４０株由来のＰａａＨ（ＮＣＢＩ　ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＮＰ＿７４５４２５．１）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｓｔｒ．　Ｋ－１２　ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５株由来のＰａａＨ（ＮＣＢＩ　ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＮＰ＿４１５９１３．１）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｂａｙｌｙｉ　ＡＤＰ１株由来のＤｃａＨ（ＮＣＢＩ　ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＣＡＧ６８５３３．１）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ　ＮＢＲＣ１０２５９９株由来のＰａａＨ（ＮＣＢＩ　ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＷＰ＿０６３１９７１２０）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｎｅｍａｔｏｄｉｐｈｉｌａ　ＤＳＭ２１４２０株由来のポリペプチド（ＮＣＢＩ　ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＷＰ＿０３３６３３３９９．１）も３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素として挙げられる。
　３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡから３－ヒドロキシアジピン酸を生成する反応（反応Ｃ）および／または３－オキソアジピル－ＣｏＡから３－オキソアジピン酸を生成する反応（反応Ｄ）を触媒する酵素としては、ＣｏＡトランスフェラーゼまたはアシル－ＣｏＡヒドロラーゼなどを用いることができるが、好ましくはＣｏＡトランスフェラーゼである。
　ＣｏＡトランスフェラーゼとは、アシル－ＣｏＡおよびコハク酸を基質としてカルボン酸およびスクシニル－ＣｏＡを生成する反応の触媒活性（ＣｏＡトランスフェラーゼ活性）を有する酵素を意味する。ＣｏＡトランスフェラーゼとしては、ＥＣ番号による分類上の限定は特にないが、ＥＣ　２．８．３．－に分類されるＣｏＡトランスフェラーゼ、ＥＣ　２．８．３．６に分類されるＣｏＡトランスフェラーゼまたはアシル－ＣｏＡトランスフェラーゼなどが挙げられ、具体例として、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＫＴ２４４０株由来のＰｃａＩ（ＮＣＢＩ　ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＮＰ＿７４６０８１）およびＰｃａＪ（ＮＣＢＩ　ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＮＰ＿７４６０８２）等を好ましく用いることができる。
　本発明において有機リン酸化合物排出担体の発現量を増大させたり、３ＨＡおよび／または３ＯＡの代謝に関連する各種酵素活性を強化する方法は特に限定されないが、各種酵素または機能を有するポリペプチドをコードする遺伝子を宿主微生物の菌体外から菌体内へと導入したり、当該遺伝子のコピー数を増加させたり、当該遺伝子上流のプロモーター領域やリボソーム結合配列を改変させたりすることで各種酵素活性または機能を有するポリペプチドの発現量を増大する方法が好ましい。これらの方法は単独で行ってもよいし、組み合わせてもよい。導入する遺伝子はデータベース上に存在する当該酵素のアミノ酸配列を基に人工的に合成してもよいし、天然から分離してもよい。人工的に合成する場合、導入する宿主微生物に合わせて各アミノ酸に対応するコドンの使用頻度を変更してもよい。核酸を導入する方法は特に限定されず、微生物内で自律複製可能な発現ベクターに当該核酸を組み込み宿主微生物に導入する方法や、微生物のゲノムに当該核酸を組み込む方法などを用いることができる。
　導入する遺伝子は１種類でも複数種類でもよい。また遺伝子の導入と遺伝子発現の増強を組み合わせてもよい。
　本発明で発現させるポリペプチドをコードする核酸を発現ベクターまたは宿主微生物ゲノムに組み込む場合、当該発現ベクターまたはゲノム組み込み用核酸はプロモーター、リボソーム結合配列、発現させるポリペプチドをコードする核酸、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーター活性を制御する遺伝子が含まれていてもよい。
　本発明で用いるプロモーターは、宿主微生物内で酵素を発現させられるものであれば特に限定されないが、例えばｇａｐプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが挙げられる。
　本発明で発現ベクターを用いて核酸の導入や、ポリペプチドの発現の増強を行う場合は、当該微生物中で自律複製可能であれば特に限定されないが、例えばｐＢＢＲ１ＭＣＳベクター、ｐＢＲ３２２ベクター、ｐＭＷベクター、ｐＥＴベクター、ｐＲＳＦベクター、ｐＣＤＦベクター、ｐＡＣＹＣベクター、および上述のベクターの派生型などが挙げられる。
　本発明でゲノム組み込み用核酸を用いて核酸の導入や、ポリペプチドの発現の増強を行う場合は、部位特異的相同組換えを用いて導入することができる。部位相同組換えの方法は特に限定されないが、例えばλ　Ｒｅｄ　レコンビナーゼおよびＦＬＰレコンビナーゼを用いる方法（Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ．２０００　Ｊｕｎ　６；　９７（１２）：６６４０－６６４５）、λ　ＲｅｄレコンビナーゼおよびｓａｃＢ遺伝子を用いる方法（Ｂｉｏｓｃｉ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００７　Ｄｅｃ；７１（１２）：２９０５－１１．）が挙げられる。
　発現ベクターまたはゲノム組み込み用核酸の導入方法は、微生物に核酸を導入する方法であれば特に限定されないが、例えばカルシウムイオン法（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９（１９７０））、エレクトロポレーション法（ＮＭ　Ｃａｌｖｉｎ，ＰＣ　Ｈａｎａｗａｌｔ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１７０　（１９８８），ｐｐ．２７９６－２８０１）などが挙げられる。
　３ＨＡおよび／または３ＯＡを製造する能力を元来有する微生物としては、以下の微生物が挙げられる。
　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉなどのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属。
　Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｇｒｉｍｅｓｉｉ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｏｄｏｒｉｆｅｒａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａまたはＳｅｒｒａｔｉａ　ｎｅｍａｔｏｄｉｐｈｉｌａなどのＳｅｒｒａｔｉａ属。
　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ　ｓｕｂｓｐ．　ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｒａｇｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｒｅｐｔｉｌｉｖｏｒａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓなどのＰｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ属。
　Ｈａｆｎｉａ　ａｌｖｅｉなどのＨａｆｎｉａ属。
　Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなどのＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属。
　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂａｄｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｒｏｓｅｕｓなどのＢａｃｉｌｌｕｓ属。
　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｖｉｎａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｋａｒｎａｔａｋｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖａｃｅｕｓなどのＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属。
　Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｎｅｃａｔｏｒ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｏｘａｌａｔｉｃｕｓなどのＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属。
　Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｂａｙｌｙｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓなどのＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属。
　Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓなどのＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属。
　Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ　ａｌｂｕｓなどのＮｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ属。
　Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｏｄｉｎｕｍなどのＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属。
　Ｄｅｌｆｔｉａ　ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓなどのＤｅｌｆｔｉａ属。
　Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ　ｂｌａｔｔａｅなどのＳｈｉｍｗｅｌｌｉａ属。
　Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅなどのＡｅｒｏｂａｃｔｅｒ属。
　Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒなどのＲｈｉｚｏｂｉｕｍ属。
　Ｐｌａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ　ｏｋｅａｎｏｋｏｉｔｅｓなどのＰｌａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属。
　Ｙａｒｒｏｗｉａ　ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａなどのＹａｒｒｏｗｉａ属。
　Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ　ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓなどのＲｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属。
　Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍなどのＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属。
　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属。
　Ｙｅｒｓｉｎｉａ　ｒｕｃｋｅｒｉなどのＹｅｒｓｉｎｉａ属。
　前記３ＨＡおよび／または３ＯＡを製造する能力を元来有する微生物の中でも、本発明ではＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属またはＳｅｒｒａｔｉａ属に属する微生物が好ましく利用される。
　本発明の遺伝子改変微生物が、３ＨＡおよび／または３ＯＡを製造する能力を元来有していない場合には、ＷＯ２０１７／２０９１０２号およびＷＯ２０１９／１０７５１６号の記載に準じて、反応Ａ、Ｂ、Ｃを触媒する酵素をコードする核酸を適当に組み合わせて微生物に導入することで、これらの製造能を付与することができる。
　本発明で遺伝子改変微生物を得るための宿主として用いることができる微生物は、遺伝子改変が可能な微生物であれば特に制限はないが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｈａｆｎｉａ属、Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｄｅｌｆｔｉａ属、Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ属、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属およびＣａｎｄｉｄａ属に属する微生物が好ましく、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｈａｆｎｉａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する微生物がより好ましく、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属またはＳｅｒｒａｔｉａ属に属する微生物が特に好ましい。
　発酵原料とは、当該遺伝子改変微生物が代謝し得る原料である。「代謝」とは、微生物が細胞外から取り入れた、あるいは細胞内で別の化学化合物より生じたある化学化合物が、酵素反応により別の化学化合物へと変換されることを指す。炭素源としては、糖類を好ましく用いることができる。糖類の具体例としては、グルコース、シュクロース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、キシロース、アラビノース等の単糖類、これら単糖類が結合した二糖類、多糖類、およびこれらを含有する澱粉糖化液、糖蜜、セルロース含有バイオマス糖化液などが挙げられる。
　上記に挙げた炭素源は、一種類のみ用いてもよいし、組み合わせて用いてもよいが、特にグルコースを含む培地で培養することが好ましい。炭素源の添加において、培地中の炭素源の濃度は、特に限定されず、炭素源の種類などに応じて適宜設定することができる。グルコースの好ましい濃度は、５～３００ｇ／Ｌである。
　当該遺伝子改変微生物の培養に用いる窒素源としては、例えば、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば、油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用できる。培地中の窒素源の濃度は、特に限定されないが、好ましくは、０．１～５０ｇ／Ｌである。
　当該遺伝子改変微生物の培養に用いる無機塩類としては、例えば、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩およびマンガン塩等を適宜添加使用することができる。
　３ＨＡおよび／または３ＯＡを生産するための遺伝子改変微生物の培養条件は、前記成分組成の培地、培養温度、撹拌速度、ｐＨ、通気量、植菌量などを、当該遺伝子改変微生物の種類および外部条件などに応じて、適宜調節あるいは選択して設定する。
　培養におけるｐＨの範囲は当該遺伝子改変微生物が生育することができれば特に制限はないが、好ましくはｐＨ５～８、より好ましくはｐＨ５．５～６．８である。
　培養における通気条件の範囲は３ＨＡおよび／または３ＯＡを生産することができれば特に制限はないが、当該微生物変異体を良好に生育させるために、少なくとも培養開始時において培養容器内の液相あるいは気相に酸素が残存していることが好ましい。
　液体培養において発泡がある場合には、鉱油、シリコーン油および界面活性剤などの消泡剤を適宜培地に配合することができる。
　前記微生物の培養物中に、３ＨＡおよび／または３ＯＡが回収可能な量まで生産された後、生産された当該生産物を回収することができる。生産された当該生産物の回収、例えば単離は、蓄積量が適度に高まった時点で培養を停止し、その培養物から、発酵生産物を採取する一般的な方法に準じて行うことができる。具体的には、遠心分離、ろ過などにより菌体を分離したのち、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、活性炭処理、結晶化、膜分離、蒸留などにより、当該生産物を培養物から単離することができる。より具体的には、当該生産物の塩に酸成分を添加して析出物を回収する方法、培養物を逆浸透膜やエバポレーターなどを用いた濃縮操作により水を除去して当該生産物の濃度を高めた後、冷却結晶化や断熱結晶化により当該生産物および／または当該生産物の塩の結晶を析出させ、遠心分離やろ過などにより当該生産物および／または当該生産物の塩の結晶を得る方法、培養物にアルコールを添加して当該生産物をエステルとした後、蒸留操作により当該生産物のエステルを回収後、加水分解により当該生産物を得る方法等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。また、これらの回収方法は生成物の物性などにより適当に選択して最適化することができる。
　本発明で得られる３ＨＡおよび／または３ＯＡを、水素化触媒の存在下、水素と反応（水素化）させることにより、アジピン酸を製造することができる。
　水素化触媒は、遷移金属元素を含んでいることが好ましく、具体的には、パラジウム、白金、ルテニウム、ロジウム、レニウム、ニッケル、コバルト、鉄、イリジウム、オスミウム、銅およびクロムからなる群から選ばれる１種または２種以上を含んでいることが好ましく、パラジウム、白金、ニッケル、コバルト、鉄、銅およびクロムからなる群から選ばれる１種または２種以上を含んでいることがより好ましい。
　水素化触媒は、使用する金属量が節約できる、触媒の活性表面が増加する等の観点から、担体に担持して使用することが好ましい。水素化触媒の担体への担持は、含浸法、析出沈殿法、気相担持法など公知の方法により行うことができる。担体としては、炭素、高分子、金属酸化物、金属硫化物、ゼオライト、粘土、ヘテロポリ酸、固体リン酸、ハイドロキシアパタイトなどが挙げられる。
　３ＨＡおよび／または３ＯＡと反応させる水素は、反応器に一括添加しても逐次添加してもよい。水素の分圧は特に制限されないが、低すぎると反応時間が長くなる一方、水素の分圧が高すぎると設備安全上望ましくないため、常温で０．１ＭＰａ以上１０ＭＰａ以下（ゲージ圧）が好ましく、より好ましくは０．３ＭＰａ以上５ＭＰａ以下（ゲージ圧）、さらに好ましくは０．５ＭＰａ以上３ＭＰａ以下（ゲージ圧）である。
　反応形式は、バッチ式槽型反応器、半バッチ式槽型反応器、連続式槽型反応器、連続式管型反応器、トリクルベッド式管状反応器のいずれの反応器を用いる反応形式でもよい。固体の水素化触媒を用いる場合、懸濁床式、固定床式、移動床式、流動床式のいずれの方式でも反応を実施することができる。
　水素化の反応温度は、特に制限されないが、低すぎると反応速度が遅くなり、反応温度が高すぎるとエネルギー消費量が多くなるため好ましくない。このような観点から、反応温度は１００～３５０℃であることが好ましく、１２０～３００℃であることがより好ましく、１３０～２８０℃であることがさらに好ましく、１４０～２５０℃であることがさらに好ましく、１５０～２３０℃であることがさらに好ましく、１６０～２２０℃であることがさらに好ましい。
　反応器中の雰囲気は、水素の他に、窒素、ヘリウム、アルゴン等の不活性ガスが共存していてもよいが、水素化触媒の劣化および爆鳴気の生成につながるため、酸素濃度は５体積％以下であることが好ましい。また、３ＨＡおよび／または３ＯＡならびにアジピン酸の安定性の観点から、３ＨＡおよび／または３ＯＡに対するアンモニア量が５重量％以下であることが好ましく、３重量％以下であることがより好ましく、０重量％（すなわち、アンモニア非存在下での反応）であることがさらに好ましい。
　３ＨＡおよび／または３ＯＡの水素化は、溶媒存在下で行うことが好ましい。
　水素化の溶媒としては、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、イソプロパノール、ｎ－ブタノール、イソブタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール、ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、オクタン、デカン、ジメチルエーテル、ジエチルエーテル、１，２－ジメトキシエタン、ジグリム、テトラヒドロフラン、ジオキサン、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ｎ－プロピル、酢酸ｎ－ブチル、γ－ブチロラクトン、Ｎ－メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド、水系溶媒などが使用でき、これらのうち２種類以上の混合溶媒を用いてもよいが、経済性や環境性の観点から水系溶媒を用いることが好ましい。
　本発明において、水系溶媒とは、水または水を主体として水混和性有機溶媒を混合させている混合溶媒を意味する。「水を主体として」とは混合溶媒中の水の割合が５０体積％超、好ましくは７０体積％以上、さらに好ましくは９０体積％以上であることを意味する。
　水混和性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、イソプロパノール、ｎ－ブタノール、イソブタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール、１，２－ジメトキシエタン、ジグリム、テトラヒドロフラン、ジオキサン、γ－ブチロラクトン、Ｎ－メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、アセトンなどが挙げられる。
　水系溶媒のｐＨは特に制限されないが、触媒劣化の抑制、副生成物の生成抑制、反応装置への腐食性等を考慮すると、ｐＨ２～１３であることが好ましく、ｐＨ３～１１であることがより好ましく、ｐＨ４～１０であることがさらに好ましい。
　１級アルコール並びに２級アルコールを除く溶媒を水素化の溶媒とする場合、３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸のカルボン酸、カルボン酸塩、カルボン酸エステルから、それぞれ対応するアジピン酸、アジピン酸塩、アジピン酸エステルが生成する。メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、イソプロパノール、ｎ－ブタノール、イソブタノール等の１級アルコールまたは２級アルコールを含む溶媒を水素化の溶媒とする場合、反応後には、アジピン酸、アジピン酸塩、アジピン酸モノエステル、アジピン酸ジエステルの混合物が得られる。なお、本明細書では、アジピン酸のカルボン酸、カルボン酸塩、カルボン酸エステルおよびこれらの混合物を総称して「アジピン酸」という。
　本発明で得られたアジピン酸のカルボン酸は、さらにエステル化反応に供することによりアジピン酸エステルに変換することができる。エステル化する方法は特に制限されないが、例えば酸触媒、縮合剤を用いたカルボン酸とアルコールの脱水縮合、ジアゾメタンやハロゲン化アルキルなどのアルキル化試薬を用いる方法などが挙げられる。
　本発明で得られたアジピン酸は、遠心分離、濾過、膜濾過、蒸留、抽出、晶析、乾燥など通常の単位操作により分離・精製することができる。
　本発明で得られたアジピン酸から公知の方法（例えば、特公昭６１－２４５５５号公報）により、アジポニトリルを製造することができる。得られたアジポニトリルを公知の方法（例えば、特表２０００－５０８３０５号公報）により水素化することでヘキサメチレンジアミンを製造することができる。
　本発明で得られたアジピン酸を公知の方法（例えば福本修編、「ポリアミド樹脂ハンドブック」日刊工業出版社（１９９８年１月）参照）で、ジアミンと重縮合することにより、ポリアミドを製造することができる。具体的には、ジアミンとして、１，４－ジアミノブタン、１，５－ペンタンジアミン、ヘキサメチレンジアミンを用いることにより、それぞれ、ポリアミド４６、ポリアミド５６、ポリアミド６６を製造することができる。
　ポリアミドを公知の方法（例えば、国際公開２０１９／２０８４２７号）により加工し、ポリアミド繊維を製造することができる。かくして得られるポリアミド繊維は、インナーウエア、スポーツウエア、カジュアルウェア等の衣料用途やエアバッグ、タイヤコード等の産業資材用途に用いることができる。
　また、ポリアミドを公知の方法（例えば、国際公開２０２１／００６２５７号）により成形加工し、ポリアミド成形品を製造することができる。かくして得られるポリアミド成形品は、自動車部品、電気部品、電子部品、建築部材、各種容器、日用品、生活雑貨および衛生用品等に用いることができる。
　以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
参考例１
アセチル－ＣｏＡおよびスクシニル－ＣｏＡから３ＯＡ－ＣｏＡおよびＣｏＡを生成する反応（反応Ａ）を触媒する酵素、３ＯＡ－ＣｏＡから３ＨＡ－ＣｏＡを生成する反応（反応Ｂ）、３ＨＡ－ＣｏＡから３ＨＡを生成する反応（反応Ｃ）および／または３ＯＡ－ＣｏＡから３ＯＡを生成する反応（反応Ｄ）を触媒する酵素を発現するプラスミドの作製
　大腸菌内で自律複製可能であり、カナマイシン耐性遺伝子を有するベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２（ＭＥ　Ｋｏｖａｃｈ，（１９９５），Ｇｅｎｅ　１６６：１７５－１７６）をＸｈｏＩで切断し、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２／ＸｈｏＩを得た。当該ベクターに構成的な発現プロモーターを組み込むために、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｓｔｒ．Ｋ－１２　ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡを鋳型としてｇａｐＡ（ＮＣＢＩ　ＧｅｎｅＩＤ：ＮＣ＿０００９１３．３）の上流域２００ｂ（配列番号５）を増幅するためのプライマーを設計し（配列番号６、７）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２／ＸｈｏＩを、“Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ”（タカラバイオ株式会社製）を用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え大腸菌株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：Ｐｇａｐとした。続いてｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＰｇａｐをＳｃａＩで切断し、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：Ｐｇａｐ／ＳｃａＩを得た。反応Ａを触媒する酵素をコードする遺伝子を増幅するために、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＫＴ２４４０株のゲノムＤＮＡを鋳型としてアシルトランスフェラーゼ遺伝子ｐｃａＦ（ＮＣＢＩ　ＧｅｎｅＩＤ：１０４１７５５、配列番号８）の全長を増幅するためのプライマーを設計し（配列番号９、１０）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：Ｐｇａｐ／ＳｃａＩを、“Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ”（タカラバイオ株式会社製）を用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴとした。続いてｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴをＨｐａＩで切断し、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴ／ＨｐａＩを得た。反応Ｃおよび／または反応Ｄを触媒する酵素をコードする遺伝子を増幅するために、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＫＴ２４４０株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子ｐｃａＩおよびｐｃａＪ（ＮＣＢＩ　ＧｅｎｅＩＤ：１０４６６１３、１０４６６１２；配列番号１１、１２）の全長を含む連続した配列を増幅するためのプライマーを設計し（配列番号１３、１４）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴ／ＨｐａＩを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔを用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴとした。
　ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴをＳｃａＩで切断し、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ／ＳｃａＩを得た。反応Ｂを触媒する配列番号１５のポリペプチドをコードする核酸を増幅するために、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ　ＡＴＣＣ１３８８０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、反応Ｂを触媒する酵素遺伝子（配列番号１６）の全長を増幅するためのプライマーを設計し（配列番号１７、１８）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ／ＳｃａＩを、“Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ”（タカラバイオ株式会社製）を用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲとした。
　次に、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲのカナマイシン耐性遺伝子をクロラムフェニコール耐性遺伝子に置き換えた。ｐＨＳＧ３９６（タカラバイオ株式会社製）を鋳型、配列番号１９、２０の核酸をプライマーとしてＰＣＲを行い、クロラムフェニコール耐性遺伝子を増幅した。本ＰＣＲ断片、およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲをＳａｐＩで切断して得られた断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔを用いて連結し、大腸菌ＤＨ５α株に導入した。得られた組換え株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをｐＢＢＲｃ：：ＡＴＣＴＯＲとした。
参考例２
ＹｈｈＳを発現するプラスミドの作製
　ＹｈｈＳをコードする遺伝子およびその周辺領域を増幅するために、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｓｔｒ．Ｋ－１２　ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを鋳型、配列番号２１、２２の核酸をプライマーとしてＰＣＲを行い、ｙｈｈＳ遺伝子（配列番号２）の全長およびその上下流域０．５ｋｂを含む核酸を増幅した。本ＰＣＲ断片、および大腸菌内で自律複製可能な発現ベクターｐＭＷ１１９（株式会社ニッポンジーン製）をＫｐｎＩで切断して得られた断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔを用いて連結し、大腸菌ＤＨ５α株に導入した。得られた組換え株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをｐＭＷ：：ＥｃＹＨＨＳとした。
参考例３
ＹｈｈＳの機能が欠損したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体の作製
　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物のＹｈｈＳの機能を欠損させるために、ＹｈｈＳをコードする遺伝子を欠損させたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体を作製した。
　目的遺伝子の欠損方法は、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ．２０００　Ｊｕｎ　６；９７（１２）：６６４０－６６４５に記載の方法に従った。
　ｐＫＤ４を鋳型として、プライマーとして配列番号２３および２４のオリゴＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、ｙｈｈＳ欠損のための配列長１．６ｋｂのＰＣＲ断片を得た。ＦＲＴ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ発現プラスミドであるｐＫＤ４６を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｓｔｒ．Ｋ－１２　ｓｕｂｓｔｒ．ＢＷ２５１１３株に導入し、アンピシリン耐性株を取得した。得られた株をアンピシリン１００μｇ／ｍＬを含む５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１日振とう培養した。培養液０．５ｍＬをアンピシリン１００μｇ／ｍＬおよびアラビノース５０ｍＭを含む５０ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３７℃で２時間、回旋培養した。培養液を２０分間氷冷したのち、菌体を１０％（ｗ／ｗ）グリセロールで３回洗浄した。洗浄後のペレットを１００μＬの１０％（ｗ／ｗ）グリセロールで懸濁し、５μＬのＰＣＲ断片と混合したのちエレクトロポレーションキュベット内で１０分間氷冷した。“Ｇｅｎｅ　ｐｕｌｓｅｒ”（Ｂｉｏ－ｒａｄ社製）を用いてエレクトロポレーションを実施した（３ｋＶ、２００Ω、２５μＦ）後、即座に１ｍＬのＳＯＣ培地を添加し、３７℃で２時間振とう培養した。全量をカナマイシン２５μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で１日インキュベートした。得られたカナマイシン耐性株を用いてコロニーダイレクトＰＣＲを行い、バンド長より目的遺伝子の欠損およびカナマイシン耐性遺伝子の挿入を確認した。プライマーはそれぞれ配列番号２５および２６、２６および２７のオリゴＤＮＡを使用した。得られたＹｈｈＳの機能が欠損したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体をＥｃΔｙｈｈＳとした。
参考例４
ＹｈｈＳの機能が欠損した３ＨＡおよび／または３ＯＡ生産株およびコントロール株の作製
　参考例３で作製したＥｃΔｙｈｈＳに対して、参考例１で作製したプラスミドｐＢＢＲｃ：：ＡＴＣＴＯＲおよびｐＭＷ１１９を導入し、ＹｈｈＳの機能が欠損した３ＨＡおよび／または３ＯＡ生産株を作製した。
　ＥｃΔｙｈｈＳおよびＥ．ｃｏｌｉ　ｓｔｒ．Ｋ－１２　ｓｕｂｓｔｒ．ＢＷ２５１１３を５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１日振とう培養した。培養液０．５ｍＬを５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３７℃で２時間、振とう培養した。培養液を２０分間氷冷したのち、菌体を１０％（ｗ／ｗ）グリセロールで３回洗浄した。洗浄後のペレットを１００μＬの１０％（ｗ／ｗ）グリセロールで懸濁し、１μＬのｐＢＢＲｃ：：ＡＴＣＴＯＲおよびｐＭＷ１１９と混合したのちエレクトロポレーションキュベット内で１０分間氷冷した。“Ｇｅｎｅ　ｐｕｌｓｅｒ”（Ｂｉｏ－ｒａｄ社製）を用いてエレクトロポレーションを実施した（３ｋＶ、２００Ω、２５μＦ）後、即座に１ｍＬのＳＯＣ培地を添加し、３７℃で１時間振とう培養した。５０μＬをクロラムフェニコール１５μｇ／ｍＬおよびアンピシリン１００μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で１日インキュベートした。得られた株をＥｃΔｙｈｈＳ／３ＨＡ＿ｐＭＷとした。
　また、コントロール株として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｓｔｒ．Ｋ－１２　ｓｕｂｓｔｒ．ＢＷ２５１１３株に前記方法によりｐＢＢＲｃ：：ＡＴＣＴＯＲおよびｐＭＷ１１９を導入して、ＹｈｈＳの機能が欠損していない３ＨＡおよび／または３ＯＡ生産株（ＥｃＷＴ／３ＨＡ＿ｐＭＷ）を得た。
比較例１
コントロール株の３ＨＡ生産試験
　コントロール株（ＥｃＷＴ／３ＨＡ＿ｐＭＷ）を、ｐＨ７に調整した培地Ｉ（Ｂａｃｔｏトリプトン（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）１０ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、クロラムフェニコール１５μｇ／ｍＬ、アンピシリン１００μｇ／ｍＬ）５ｍＬ（φ１８ｍｍガラス試験管、アルミ栓）に一白金耳植菌し、３０℃、１２０ｍｉｎ－１で２４時間振とう培養した。当該培養液０．２５ｍＬをｐＨ６．５に調整した培地ＩＩ（グルコース５０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸カリウム５０ｍＭ、硫酸マグネシウム０．０２５ｇ／Ｌ、硫酸鉄０．０６２５ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン２．７ｍｇ／Ｌ、塩化カルシウム０．３３ｍｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１．２５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏトリプトン２．５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ酵母エキス１．２５ｇ／Ｌ、クロラムフェニコール１５μｇ／ｍＬ、アンピシリン１００μｇ／ｍＬ）５ｍＬ（φ１８ｍｍガラス試験管、アルミ栓）に添加し、３０℃で静置培養した。
　取得した培養液より菌体を遠心分離した上清を“Ｍｉｌｌｅｘ－ＧＶ”（０．２２μｍ、ＰＶＤＦ、Ｍｅｒｃｋ社製）を用いて膜処理し、透過液を以下の条件によるＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析することで培養上清中に蓄積した３ＨＡおよび他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。さらに、その結果を元に以下の式（２）を用いて算出した３ＨＡの収率を表１に示す。
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる３ＨＡの定量分析
・ＨＰＬＣ：１２９０Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
カラム：Ｓｙｎｅｒｇｉ　ｈｙｄｒｏ－ＲＰ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）、長さ１００ｍｍ、内径３ｍｍ、粒径２．５μｍ
移動相：０．１％ギ酸水溶液／メタノール＝７０／３０
流速：０．３ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
ＬＣ検出器：１２６０ＤＡＤ　ＶＬ＋（２１０ｎｍ）
・ＭＳ／ＭＳ：Ｔｒｉｐｌｅ－Ｑｕａｄ　ＬＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
イオン化法：ＥＳＩ　ネガティブモード。
ＨＰＬＣによる糖の定量分析
・ＨＰＬＣ：Ｓｈｉｍａｚｕ　Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（株式会社島津製作所製）
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ　Ｓｕｇａｒ　ＳＨ１０１１（昭和電工株式会社製）、長さ３００ｍｍ、内径８ｍｍ、粒径６μｍ
移動相：０．０５Ｍ　硫酸水溶液
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：６５℃
検出器：ＲＩＤ－１０Ａ（株式会社島津製作所製）。
　３ＨＡ収率（％）＝３ＨＡの生成量（ｍｏｌ）／糖の消費量（ｍｏｌ）×１００・・・式（２）。
参考例５
ＹｈｈＳの機能が欠損した３ＨＡおよび／または３ＯＡ生産株の３ＨＡ生産試験
　参考例４で作製したＹｈｈＳの機能が欠損した３ＨＡおよび／または３ＯＡ生産株（ＥｃΔｙｈｈＳ／３ＨＡ＿ｐＭＷ）を用いて、比較例１と同様の方法により３ＨＡの生産試験を行った。その結果を表１に示す。
　比較例１と参考例５の結果を比較すると、ＹｈｈＳの機能が欠損した３ＨＡおよび／または３ＯＡ生産株（参考例５）では、ＹｈｈＳの機能を欠損させないコントロール株（比較例１）に比べて３ＨＡ収率が低下した。これらの結果と、これまでのＹｈｈＳは有機リン酸化合物の排出機能を有するという知見から、ＹｈｈＳは３ＨＡの排出機能を有することで３ＨＡの生産性向上に寄与することが示唆された。
　参考例６
ＹｈｈＳの機能を回復させた３ＨＡおよび／または３ＯＡ生産株の作製
　ＹｈｈＳの機能を欠損させたＥｃΔｙｈｈＳに対して、参考例４と同様の方法にて参考例１および２で作製したプラスミドｐＢＢＲｃ：：ＡＴＣＴＯＲおよびｐＭＷ：：ＥｃＹＨＨＳを導入し、ＹｈｈＳの機能を回復させた３ＨＡおよび／または３ＯＡ生産株（ＥｃΔｙｈｈＳ／３ＨＡ＿ＥｃＹＨＨＳ）を作製した。
参考例７
ＹｈｈＳの機能を回復させた３ＨＡおよび／または３ＯＡ生産株の３ＨＡ生産試験
　ＹｈｈＳが３ＨＡ排出機能を有することをさらに確かめるために、参考例６で作製した、ＹｈｈＳの機能を回復させた３ＨＡおよび／または３ＯＡ生産株（ＥｃΔｙｈｈＳ／３ＨＡ＿ＥｃＹＨＨＳ）を用いて、比較例１と同様の方法により３ＨＡの生産試験を行った。その結果を表１に示す。
　参考例５と参考例７の結果を比較すると、ＹｈｈＳの機能を回復させた３ＨＡおよび／または３ＯＡ生産株（参考例７）では、ＹｈｈＳの機能が欠損した３ＨＡおよび／または３ＯＡ生産株（参考例５）と比べて３ＨＡ収率が増加し、ＹｈｈＳは３ＨＡの排出機能を有することで３ＨＡの生産性向上に寄与することがさらに示唆された。
実施例１
ＹｈｈＳの発現を増大させた３ＨＡおよび／または３ＯＡ生産株の作製
　Ｅ．　ｃｏｌｉ　ｓｔｒ．Ｋ－１２　ｓｕｂｓｔｒ．ＢＷ２５１１３に対して、参考例４と同様の方法にて参考例１および２で作製したプラスミドｐＢＢＲｃ：：ＡＴＣＴＯＲおよびｐＭＷ：：ＥｃＹＨＨＳを導入し、ＹｈｈＳの発現を増大させた３ＨＡおよび／または３ＯＡ生産株（ＥｃＷＴ／３ＨＡ＿ＥｃＹＨＨＳ）を作製した。
実施例２
ＹｈｈＳの発現を増大させた３ＨＡおよび／または３ＯＡ生産株の３ＨＡ生産試験
　ＹｈｈＳの発現量増大による３ＨＡ生産性向上効果を確かめるために、実施例１で作製したＹｈｈＳの発現を増大させた３ＨＡおよび／または３ＯＡ生産株（ＥｃＷＴ／３ＨＡ＿ＥｃＹＨＨＳ）を用いて、比較例１と同様の方法により３ＨＡ生産試験を行った。その結果を表１に示す。
　比較例１と実施例２の結果を比較すると、ＹｈｈＳの発現を増大させた３ＨＡおよび／または３ＯＡ生産株（実施例２）では、コントロール株（比較例１）に比べて３ＨＡ収率が向上した。したがって、ＹｈｈＳの発現量の増大で３ＨＡ排出機能が強化されることによって３ＨＡの生産性が向上することが示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
比較例２
コントロール株の３ＯＡ生産試験
　コントロール株（ＥｃＷＴ／３ＨＡ＿ｐＭＷ）を、ｐＨ７に調整した５ｍＬの培地Ｉ（φ１８ｍｍガラス試験管、アルミ栓）に一白金耳植菌し、３０℃、１２０ｍｉｎ－１で２４時間振とう培養した。当該培養液０．２５ｍＬをｐＨ６．５に調整した培地ＩＩＩ（グルコース１０ｇ／Ｌ、コハク酸ナトリウム１０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸カリウム５０ｍＭ、硫酸マグネシウム０．０２５ｇ／Ｌ、硫酸鉄０．０６２５ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン２．７ｍｇ／Ｌ、塩化カルシウム０．３３ｍｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１．２５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏトリプトン２．５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ酵母エキス１．２５ｇ／Ｌ、クロラムフェニコール１５μｇ／ｍＬ、アンピシリン１００μｇ／ｍＬ）５ｍＬ（φ１８ｍｍガラス試験管、アルミ栓）に添加し、３０℃で振とう培養した。
　取得した培養液より菌体を遠心分離した上清を比較例１と同様の方法にて分析することで、培養上清中に蓄積した３ＯＡおよび他の生成物、培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量した。さらに、その結果を元に以下の式（３）を用いて算出した３ＯＡの収率を表２に示す。
　３ＯＡ収率（％）＝３ＯＡの生成量（ｍｏｌ）／糖の消費量（ｍｏｌ）×１００・・・式（３）。
実施例３
ＹｈｈＳの発現を増大させた３ＨＡおよび／または３ＯＡ生産株の３ＯＡ生産試験
　ＹｈｈＳの発現量増大による３ＯＡ生産性向上効果を確かめるために、実施例１で作製したＹｈｈＳの発現を増大させた３ＨＡおよび／または３ＯＡ生産株（ＥｃＷＴ／３ＨＡ＿ＥｃＹＨＨＳ）を用いて、比較例２と同様の方法により３ＯＡ生産試験を行った。その結果を表２に示す。
　比較例２と実施例３の結果を比較すると、ＹｈｈＳの発現を増大させた３ＨＡおよび／または３ＯＡ生産株（実施例３）では、コントロール株（比較例２）に比べて３ＯＡ収率が向上した。したがって、ＹｈｈＳの発現量の増大で３ＯＡ排出機能が強化されることによって３ＯＡの生産性が向上することが示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
参考例８
様々なトランスポーターを発現させるためのプラスミドの作製
　大腸菌のｙｈｈＳ遺伝子のプロモーターを含む上流領域およびターミネーターを含む下流領域を増幅するために、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｓｔｒ．　Ｋ－１２　ｓｕｂｓｔｒ．　ＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを鋳型として、ｙｈｈＳ遺伝子の上流域０．５ｋｂおよび下流域０．５ｋｂを増幅した。プライマーにはそれぞれ配列番号３４と３５、および３６と３７の核酸を用いた。本ＰＣＲ断片、および大腸菌内で自律複製可能な発現ベクターｐＭＷ１１９（株式会社ニッポンジーン製）をＳａｃＩおよびＫｐｎＩで切断して得られた断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔを用いて連結し、大腸菌ＤＨ５α株に導入した。得られた組換え株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをｐＭＷ：：Ｐｒｏ－Ｔｅｒとした。
参考例９
ＹｈｈＳホモログを発現するプラスミドの作製
　ＹｈｈＳホモログを発現させるために、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｅｎｔｅｒｉｃａ　ＡＴＣＣ９１５０株のｙｈｈＳホモログ配列を遺伝子合成し、当該配列を鋳型として、配列番号３８と３９の核酸をプライマーとして当該遺伝子の全長を増幅した。本ＰＣＲ断片、およびｐＭＷ：：Ｐｒｏ－ＴｅｒをＳａｃＩおよびＫｐｎＩで切断して得られた断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔを用いて連結し、大腸菌ＤＨ５α株に導入した。得られた組換え株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをｐＭＷ：：ＳｅＹＨＨＳとした。
　同様に、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　ＭＧＨ７８５７８株のｙｈｈＳホモログ配列を遺伝子合成し、当該配列を鋳型として、配列番号４０と４１の核酸をプライマーとして当該遺伝子の全長を増幅した。本ＰＣＲ断片をｐＭＷ：：ＳｅＹＨＨＳ作製時と同様の方法にてｐＭＷ：：Ｐｒｏ－Ｔｅｒに挿入し、得られたプラスミドをｐＭＷ：：ＫｐＹＨＨＳとした。
　同様に、Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ　ＰＣ１株のｙｈｈＳホモログ配列を遺伝子合成し、当該配列を鋳型として、配列番号４２と４３の核酸をプライマーとして当該遺伝子の全長を増幅した。本ＰＣＲ断片をｐＭＷ：：ＳｅＹＨＨＳ作製時と同様の方法にてｐＭＷ：：Ｐｒｏ－Ｔｅｒに挿入し、得られたプラスミドをｐＭＷ：：ＰｃＹＨＨＳとした。
　同様に、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｇｒｉｍｅｓｉｉ　ＮＢＲＣ１３５３７株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号４４と４５の核酸をプライマーとして当該遺伝子の全長を増幅した。本ＰＣＲ断片をｐＭＷ：：ＳｅＹＨＨＳ作製時と同様の方法にてｐＭＷ：：Ｐｒｏ－Ｔｅｒに挿入し、得られたプラスミドをｐＭＷ：：ＳｇＹＨＨＳとした。
実施例４
ＹｈｈＳホモログの発現を増大させた３ＨＡおよび／または３ＯＡ生産株の作製
　Ｅ．　ｃｏｌｉ　ｓｔｒ．Ｋ－１２　ｓｕｂｓｔｒ．ＢＷ２５１１３に対して、参考例４と同様の方法にて参考例１で作製したプラスミドｐＢＢＲｃ：：ＡＴＣＴＯＲを導入した。得られた株に対して、参考例９で作製したプラスミドｐＭＷ：：ＳｅＹＨＨＳ、ｐＭＷ：：ＫｐＹＨＨＳ、ｐＭＷ：：ＰｃＹＨＨＳ、またはｐＭＷ：：ＳｇＹＨＨＳを導入し、ＹｈｈＳホモログの発現を増大させた３ＨＡおよび／または３ＯＡ生産株（ＥｃＷＴ／３ＨＡ＿ＳｅＹＨＨＳ、ＥｃＷＴ／３ＨＡ＿ＫｐＹＨＨＳ、ＥｃＷＴ／３ＨＡ＿ＰｃＹＨＨＳ、ＥｃＷＴ／３ＨＡ＿ＳｇＹＨＨＳ）を作製した。
実施例５
ＹｈｈＳホモログの発現を増大させた３ＨＡおよび／または３ＯＡ生産株の３ＨＡ生産試験
　ＹｈｈＳホモログの発現量増大による３ＨＡ生産性向上効果を確かめるために、実施例４で作製したＹｈｈＳホモログの発現を増大させた３ＨＡおよび／または３ＯＡ生産株（ＥｃＷＴ／３ＨＡ＿ＳｅＹＨＨＳ、ＥｃＷＴ／３ＨＡ＿ＫｐＹＨＨＳ、ＥｃＷＴ／３ＨＡ＿ＰｃＹＨＨＳ、ＥｃＷＴ／３ＨＡ＿ＳｇＹＨＨＳ）を用いて、比較例１と同様の方法により３ＨＡ生産試験を行った。その結果を表３に示す。
　比較例１と実施例５の結果を比較すると、ＹｈｈＳホモログの発現を増大させた３ＨＡおよび／または３ＯＡ生産株（実施例５）では、コントロール株（比較例１）に比べて３ＨＡ収率が向上した。したがって、ＹｈｈＳホモログの発現量の増大で３ＨＡ排出機能が強化されることによって３ＨＡの生産性が向上することが示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
実施例６
ＹｈｈＳホモログの発現を増大させた３ＨＡおよび／または３ＯＡ生産株の３ＯＡ生産試験
　ＹｈｈＳホモログの発現量増大による３ＯＡ生産性向上効果を確かめるために、実施例４で作製したＹｈｈＳホモログの発現を増大させた３ＨＡおよび／または３ＯＡ生産株（ＥｃＷＴ／３ＨＡ＿ＳｅＹＨＨＳ、ＥｃＷＴ／３ＨＡ＿ＫｐＹＨＨＳ、ＥｃＷＴ／３ＨＡ＿ＰｃＹＨＨＳ、ＥｃＷＴ／３ＨＡ＿ＳｇＹＨＨＳ）を用いて、比較例２と同様の方法により３ＯＡ生産試験を行った。その結果を表４に示す。
　比較例２と実施例６の結果を比較すると、ＹｈｈＳホモログの発現を増大させた３ＨＡおよび／または３ＯＡ生産株（実施例６）では、コントロール株（比較例２）に比べて３ＯＡ収率が向上した。したがって、ＹｈｈＳホモログの発現量の増大で３ＯＡ排出機能が強化されることによって３ＯＡの生産性が向上することが示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
参考例１０
有機リン酸化合物排出担体を発現するプラスミドの作製
　有機リン酸化合物排出担体ＭｄｔＤを発現させるために、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｓｔｒ．　Ｋ－１２　ｓｕｂｓｔｒ．　ＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号５２と５３の核酸をプライマーとして当該遺伝子の全長を増幅した。本ＰＣＲ断片をｐＭＷ：：ＳｅＹＨＨＳ作製時と同様の方法にてｐＭＷ：：Ｐｒｏ－Ｔｅｒに挿入し、得られたプラスミドをｐＭＷ：：ＥｃＭＤＴＤとした。
　同様に、ＲｈｔＢを発現させるために、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｓｔｒ．　Ｋ－１２　ｓｕｂｓｔｒ．　ＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号５４と５５の核酸をプライマーとして当該遺伝子の全長を増幅した。本ＰＣＲ断片をｐＭＷ：：ＳｅＹＨＨＳ作製時と同様の方法にてｐＭＷ：：Ｐｒｏ－Ｔｅｒに挿入し、得られたプラスミドをｐＭＷ：：ＥｃＲＨＴＢとした。
　同様に、ＭＦＳ４０を発現させるために、遺伝子合成したＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ　ＲＩＢ４０株のＭＦＳ４０遺伝子を鋳型として、配列番号５６と５７の核酸をプライマーとして当該遺伝子の全長を増幅した。本ＰＣＲ断片をｐＭＷ：：ＳｅＹＨＨＳ作製時と同様の方法にてｐＭＷ：：Ｐｒｏ－Ｔｅｒに挿入し、得られたプラスミドをｐＭＷ：：ＡｏＭＦＳ４０とした。
実施例７
有機リン酸化合物排出担体の発現を増大させた３ＨＡおよび／または３ＯＡ生産株の作製
　Ｅ．　ｃｏｌｉ　ｓｔｒ．Ｋ－１２　ｓｕｂｓｔｒ．ＢＷ２５１１３に対して、参考例４と同様の方法にて参考例１で作製したプラスミドｐＢＢＲｃ：：ＡＴＣＴＯＲを導入した。得られた株に対して、参考例１０で作製したプラスミドｐＭＷ：：ＥｃＭＤＴＤ、ｐＭＷ：：ＥｃＲＨＴＢ、またはｐＭＷ：：ＡｏＭＦＳ４０を導入し、有機リン酸化合物排出担体の発現を増大させた３ＨＡおよび／または３ＯＡ生産株（ＥｃＷＴ／３ＨＡ＿ＥｃＭＤＴＤ、ＥｃＷＴ／３ＨＡ＿ＥｃＲＨＴＢ、ＥｃＷＴ／３ＨＡ＿ＡｏＭＦＳ４０）を作製した。
実施例８
有機リン酸化合物排出担体の発現を増大させた３ＨＡおよび／または３ＯＡ生産株の３ＨＡ生産試験
　有機リン酸化合物排出担体の発現量増大による３ＨＡ生産性向上効果を確かめるために、実施例７で作製した有機リン酸化合物排出担体の発現を増大させた３ＨＡおよび／または３ＯＡ生産株（ＥｃＷＴ／３ＨＡ＿ＥｃＭＤＴＤ、ＥｃＷＴ／３ＨＡ＿ＥｃＲＨＴＢ、ＥｃＷＴ／３ＨＡ＿ＡｏＭＦＳ４０）を用いて、比較例１と同様の方法により３ＨＡ生産試験を行った。その結果を表５に示す。
　比較例１と実施例８の結果を比較すると、有機リン酸化合物排出担体の発現を増大させた３ＨＡおよび／または３ＯＡ生産株（実施例８）では、コントロール株（比較例１）に比べて３ＨＡ収率が向上した。したがって、有機リン酸化合物排出担体の発現量の増大で３ＨＡ排出機能が強化されることによって３ＨＡの生産性が向上することが示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
参考例１１
ＭＦＳに属し、かつ有機リン酸化合物排出機能を持たないタンパク質の発現を増大させた３ＨＡおよび／または３ＯＡ生産株の作製
　ＹｈｈＳ、ＭｄｔＤ、およびＭＦＳ４０はいずれもＭＦＳに属するタンパク質である。ここでは、ＭＦＳに属し、かつ有機リン酸化合物排出機能を持たないタンパク質が３ＨＡ排出機能を有するかどうかを検証するために、ＥｍｒＤの発現を増強させた３ＨＡおよび／または３ＯＡ生産株を作製した。
　ＥｍｒＤはＭｕｌｔｉｄｒｕｇ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄと呼ばれるＭＦＳに属するタンパク質であり、具体例としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｓｔｒ．Ｋ－１２　ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５株由来のＥｍｒＤ（ＮＣＢＩ　ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＮＰ＿４１８１２９、配列番号５８）が挙げられ、ＥｍｒＤをコードする遺伝子として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｓｔｒ．Ｋ－１２ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５株由来のｅｍｒＤ（ＮＣＢＩ　ＧｅｎｅＩＤ：９４８１８０、配列番号５９）が挙げられる。ＥｍｒＤが有機リン酸化合物であるＯ－ホスホセリンの排出機能を有しないことは、特表２０１７－５２８１２６号公報に記載されている。
　ＥｍｒＤを発現させるために、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｓｔｒ．　Ｋ－１２　ｓｕｂｓｔｒ．　ＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号６０と６１の核酸をプライマーとして当該遺伝子の全長を増幅した。本ＰＣＲ断片をｐＭＷ：：ＳｅＹＨＨＳ作製時と同様の方法にてｐＭＷ：：Ｐｒｏ－Ｔｅｒに挿入し、得られたプラスミドをｐＭＷ：：ＥｃＥＭＲＤとした。
参考例１２
ＭＦＳに属し、かつ有機リン酸化合物排出機能を持たないタンパク質の発現を増大させた３ＨＡおよび／または３ＯＡ生産株の作製
　Ｅ．　ｃｏｌｉ　ｓｔｒ．Ｋ－１２　ｓｕｂｓｔｒ．ＢＷ２５１１３に対して、参考例４と同様の方法にて参考例１で作製したプラスミドｐＢＢＲｃ：：ＡＴＣＴＯＲを導入した。得られた株に対して、参考例１１で作製したプラスミドｐＭＷ：：ＥｃＥＭＲＤを導入し、ＭＦＳに属し、かつ有機リン酸化合物排出機能を持たないタンパク質の発現を増大させた３ＨＡおよび／または３ＯＡ生産株（ＥｃＷＴ／３ＨＡ＿ｐＭＷ：：ＥｃＥＭＲＤ）を作製した。
参考例１３
ＭＦＳに属し、かつ有機リン酸化合物排出機能を持たないタンパク質の発現を増大させた３ＨＡおよび／または３ＯＡ生産株の３ＨＡ生産試験
　参考例１２で作製したＭＦＳに属し、かつ有機リン酸化合物排出機能を持たないタンパク質の発現を増大させた３ＨＡおよび／または３ＯＡ生産株（ＥｃＷＴ／３ＨＡ＿ｐＭＷ：：ＥｃＥＭＲＤ）を用いて、比較例１と同様の方法により３ＨＡ生産試験を行った。その結果を表６に示す。
　比較例１と参考例１３の結果を比較すると、有機リン酸化合物排出担体の発現を増大させた３ＨＡおよび／または３ＯＡ生産株（参考例１３）では、コントロール株（比較例１）に比べて３ＨＡ収率が低下した。したがって、有機リン酸化合物排出機能を持たないタンパク質の発現量の増大では３ＨＡ排出機能が強化されず、３ＨＡの生産性は向上しないことが示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007

Claims (13)

  1. 　３－ヒドロキシアジピン酸および／または３－オキソアジピン酸を製造する能力を有する微生物において、スクシニル－ＣｏＡおよびアセチル－ＣｏＡから３－オキソアジピル－ＣｏＡおよびＣｏＡへの反応を触媒する酵素の活性を強化させ、かつ、有機リン酸化合物排出担体の発現量を増大させた、遺伝子改変微生物。
  2. 　前記有機リン酸化合物排出担体が、ホスホセリン排出担体および／またはグリホサート排出担体である、請求項１に記載の遺伝子改変微生物。
  3. 　前記有機リン酸化合物排出担体が、ＹｈｈＳ、ＭｄｔＤ、ＲｈｔＢ、ＭＦＳ４０またはそれらのホモログである、請求項１または２に記載の遺伝子改変微生物。
  4. 　以下の（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのポリペプチドをコードする遺伝子を導入して前記有機リン酸化合物排出担体の発現量を増大させた、請求項１から３のいずれかに記載の遺伝子改変微生物。
    （Ａ）配列番号１、３、２８～３０、４６、４８または５０のアミノ酸配列からなるポリペプチド
    （Ｂ）配列番号１、３、２８～３０、４６、４８または５０のアミノ酸配列に対して６０％以上の配列同一性を有し、かつ、３－ヒドロキシアジピン酸および／または３－オキソアジピン酸の生産性向上機能を有するポリペプチド
    （Ｃ）配列番号１、３、２８～３０、４６、４８または５０のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、３－ヒドロキシアジピン酸および／または３－オキソアジピン酸の生産性向上機能を有するポリペプチド
  5. 　さらに、３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応および／または３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡから３－ヒドロキシアジピン酸を生成する反応を触媒する酵素の活性を強化させた、請求項１から４のいずれかに記載の遺伝子改変微生物。
  6. 　さらに、３－オキソアジピル－ＣｏＡから３－オキソアジピン酸を生成する反応を触媒する酵素の活性を強化させた、請求項１から５のいずれかに記載の遺伝子改変微生物。
  7. 　前記微生物がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属またはＳｅｒｒａｔｉａ属に属する微生物である、請求項１から６のいずれかに記載の遺伝子改変微生物。
  8. 　請求項１から７のいずれかに記載の遺伝子改変微生物を培養する工程を含む、３－ヒドロキシアジピン酸および／または３－オキソアジピン酸の製造方法。
  9. 　遺伝子改変により、３－ヒドロキシアジピン酸および／または３－オキソアジピン酸を製造する能力を有する微生物のスクシニル－ＣｏＡおよびアセチル－ＣｏＡから３－オキソアジピル－ＣｏＡおよびＣｏＡへの反応を触媒する酵素の活性を強化する工程、ならびに、該微生物のＹｈｈＳもしくはそのホモログの発現量を増大させる工程を含む、遺伝子改変微生物の製造方法。
  10. 　有機リン酸化合物排出担体の発現量を増大させた３－ヒドロキシアジピン酸および／または３－オキソアジピン酸を製造する能力を有する微生物を培養する工程を含む、３－ヒドロキシアジピン酸および／または３－オキソアジピン酸の製造方法。
  11. 　請求項８または１０に記載の方法により３－ヒドロキシアジピン酸および／または３－オキソアジピン酸を製造する工程Ａ、ならびに、水素化触媒の存在下、３－ヒドロキシアジピン酸および／または３－オキソアジピン酸と水素とを反応させる工程Ｂ（水素化工程）を含む、アジピン酸の製造方法。
  12. 　請求項１１に記載の方法によりアジピン酸を製造する工程、ならびに、アジピン酸およびジアミンを重縮合する工程Ｃを含む、ポリアミドの製造方法。
  13. 　前記ジアミンが、１，４－ブタンジアミン、１，５－ペンタンジアミンまたはヘキサメチレンジアミンを含有するジアミンである、請求項１１に記載のポリアミドの製造方法。
PCT/JP2023/011072 2022-03-23 2023-03-22 ３－ヒドロキシアジピン酸および／または３－オキソアジピン酸を生産するための遺伝子改変微生物および当該化学品の製造方法 Ceased WO2023182322A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US18/848,396 US20250215461A1 (en) 2022-03-23 2023-03-22 Genetically modified microorganism for producing 3-hydroxyadipic acid and/or 3-oxoadipic acid, and production method for said chemical products
EP23774917.1A EP4497819A1 (en) 2022-03-23 2023-03-22 Genetically-modified microorganism for producing 3-hydroxyadipic acid and/or 3-oxoadipic acid and production method for said chemical products
CN202380027530.2A CN118922530A (zh) 2022-03-23 2023-03-22 用于生产3-羟基己二酸和/或3-氧代己二酸的基因修饰微生物以及该化学品的制造方法
JP2023553007A JPWO2023182322A1 (ja) 2022-03-23 2023-03-22

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2022046640 2022-03-23
JP2022-046640 2022-03-23

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023182322A1 true WO2023182322A1 (ja) 2023-09-28

Family

ID=88101121

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2023/011072 Ceased WO2023182322A1 (ja) 2022-03-23 2023-03-22 ３－ヒドロキシアジピン酸および／または３－オキソアジピン酸を生産するための遺伝子改変微生物および当該化学品の製造方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20250215461A1 (ja)
EP (1) EP4497819A1 (ja)
JP (1) JPWO2023182322A1 (ja)
CN (1) CN118922530A (ja)
WO (1) WO2023182322A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111386339A (zh) * 2017-11-30 2020-07-07 东丽株式会社 用于生产3-羟基己二酸、α-氢化己二烯二酸及/或己二酸的基因修饰微生物以及该化学产品的制造方法
WO2025063258A1 (ja) * 2023-09-21 2025-03-27 東レ株式会社 α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸を生産するための遺伝子改変微生物および当該化学品の製造方法

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6124555B2 (ja) 1978-07-01 1986-06-11 Ebara Mfg
JP2000508305A (ja) 1996-04-10 2000-07-04 ビーエーエスエフ アクチェンゲゼルシャフト ６―アミノカプロニトリルとヘキサメチレンジアミンの同時製造方法
WO2009151728A2 (en) 2008-03-27 2009-12-17 Genomatica, Inc. Microorganisms for the production of adipic acid and other compounds
WO2017099209A1 (ja) * 2015-12-11 2017-06-15 東レ株式会社 ３－オキソアジピン酸の製造方法
JP2017528126A (ja) 2014-08-12 2017-09-28 シージェイ チェイルジェダン コーポレーション Ｏ−ホスホセリン生産微生物及びそれを用いたｏ−ホスホセリンまたはｌ−システイン生産方法
WO2017209102A1 (ja) 2016-05-31 2017-12-07 東レ株式会社 ３－ヒドロキシアジピン酸の製造方法
WO2019107516A1 (ja) 2017-11-30 2019-06-06 東レ株式会社 ３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸を生産するための遺伝子改変微生物および当該化学品の製造方法
WO2019208427A1 (ja) 2018-04-25 2019-10-31 東レ株式会社 ポリアミド繊維および織編物、並びに、ポリアミド繊維の製造方法
WO2021006257A1 (ja) 2019-07-11 2021-01-14 東レ株式会社 ポリアミド樹脂組成物およびそれを成形してなる成形品
WO2021187533A1 (ja) 2020-03-18 2021-09-23 東レ株式会社 ３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸を生産するための遺伝子改変微生物および当該化学品の製造方法

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6124555B2 (ja) 1978-07-01 1986-06-11 Ebara Mfg
JP2000508305A (ja) 1996-04-10 2000-07-04 ビーエーエスエフ アクチェンゲゼルシャフト ６―アミノカプロニトリルとヘキサメチレンジアミンの同時製造方法
WO2009151728A2 (en) 2008-03-27 2009-12-17 Genomatica, Inc. Microorganisms for the production of adipic acid and other compounds
JP2017528126A (ja) 2014-08-12 2017-09-28 シージェイ チェイルジェダン コーポレーション Ｏ−ホスホセリン生産微生物及びそれを用いたｏ−ホスホセリンまたはｌ−システイン生産方法
WO2017099209A1 (ja) * 2015-12-11 2017-06-15 東レ株式会社 ３－オキソアジピン酸の製造方法
WO2017209102A1 (ja) 2016-05-31 2017-12-07 東レ株式会社 ３－ヒドロキシアジピン酸の製造方法
WO2019107516A1 (ja) 2017-11-30 2019-06-06 東レ株式会社 ３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸を生産するための遺伝子改変微生物および当該化学品の製造方法
WO2019208427A1 (ja) 2018-04-25 2019-10-31 東レ株式会社 ポリアミド繊維および織編物、並びに、ポリアミド繊維の製造方法
WO2021006257A1 (ja) 2019-07-11 2021-01-14 東レ株式会社 ポリアミド樹脂組成物およびそれを成形してなる成形品
WO2021187533A1 (ja) 2020-03-18 2021-09-23 東レ株式会社 ３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸を生産するための遺伝子改変微生物および当該化学品の製造方法

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOSCI BIOTECHNOL BIOCHEM., vol. 71, no. 12, December 2007 (2007-12-01), pages 2905 - 11
J. IND. MICROBIOL BIOTECHNOL., vol. 39, no. 4, April 2012 (2012-04-01), pages 641 - 7
JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY, vol. 53, 1970, pages 159
KOITA, KHUSHNUMA ET AL.: "Identification and Analysis of the Putative Pentose Sugar Efflux Transporters in Escherichia coli", PLOS ONE, vol. 7, no. 8, 28 August 2012 (2012-08-28), pages 1 - 10, XP002753123, DOI: 10.1371/journal.pone.0043700 *
ME KOVACH, GENE, vol. 166, 1995, pages 175 - 176
NIKKAN KOGYO SHIMBUN: "Polyamide Resin Handbook", 1998
NM CALVINPC HANAWALT, . BACTERIOL, vol. 170, 1988, pages 2796 - 2801
PESTICIDE BIOCHEMISTRY AND PHYSIOLOGY, vol. 140, 2017, pages 65 - 68
PROC NATL ACAD SCI U.S.A., vol. 97, no. 12, 6 June 2000 (2000-06-06), pages 6640 - 6645
PROC NATL ACAD SCI USA, vol. 97, no. 12, 6 June 2000 (2000-06-06), pages 6640 - 6645

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111386339A (zh) * 2017-11-30 2020-07-07 东丽株式会社 用于生产3-羟基己二酸、α-氢化己二烯二酸及/或己二酸的基因修饰微生物以及该化学产品的制造方法
CN111386339B (zh) * 2017-11-30 2024-05-10 东丽株式会社 用于生产3-羟基己二酸、α-氢化己二烯二酸及/或己二酸的基因修饰微生物以及该化学产品的制造方法
WO2025063258A1 (ja) * 2023-09-21 2025-03-27 東レ株式会社 α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸を生産するための遺伝子改変微生物および当該化学品の製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP4497819A1 (en) 2025-01-29
US20250215461A1 (en) 2025-07-03
JPWO2023182322A1 (ja) 2023-09-28
CN118922530A (zh) 2024-11-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7331691B2 (ja) ３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸を生産するための遺伝子改変微生物および当該化学品の製造方法
JP7530554B2 (ja) ３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸を生産するための遺伝子改変微生物および当該化学品の製造方法
JP6999090B2 (ja) ３－ヒドロキシアジピン酸の製造方法
WO2023182322A1 (ja) ３－ヒドロキシアジピン酸および／または３－オキソアジピン酸を生産するための遺伝子改変微生物および当該化学品の製造方法
JP7784060B2 (ja) ３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸を生産するための遺伝子改変微生物および当該化学品の製造方法
JP7646119B2 (ja) ３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸を生産するための遺伝子改変微生物および当該化学品の製造方法
EP4317416A1 (en) Recombinant microorganism and method for producing c6 compound
CN116406420A (zh) 用于生产3-羟基己二酸和/或α-氢化己二烯二酸的基因修饰微生物以及该化学品的制造方法
WO2017104722A1 (ja) スクロース資化性を有するｐｈａ生産微生物、及び該微生物を用いたｐｈａの製造方法
WO2023157816A1 (ja) ３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸を生産するための遺伝子改変微生物および当該化学品の製造方法
JP7769868B2 (ja) 遺伝子改変微生物および有機酸の製造方法
WO2025063258A1 (ja) α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸を生産するための遺伝子改変微生物および当該化学品の製造方法
WO2024242124A1 (ja) ３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸を生産するための遺伝子改変微生物および当該化学品の製造方法
JP2024090463A (ja) ３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸を生産するための遺伝子改変微生物および当該化学品の製造方法
WO2022181654A1 (ja) 変異型アシル－ＣｏＡヒドロラーゼ
JP2023144366A (ja) ３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸を生産するための遺伝子改変微生物および当該化学品の製造方法
JP3396740B2 (ja) ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子
CN116445379A (zh) N-乙酰氨基葡萄糖6-磷酸脱乙酰酶的失活及其在生产谷氨酸中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2023553007

Country of ref document: JP

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 23774917

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 202447068139

Country of ref document: IN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2401005964

Country of ref document: TH

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 202380027530.2

Country of ref document: CN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 18848396

Country of ref document: US

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112024019241

Country of ref document: BR

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2023774917

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2023774917

Country of ref document: EP

Effective date: 20241023

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112024019241

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20240918

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 18848396

Country of ref document: US