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WO2023145789A1 - 全菌体を用いた、ヘリコバクター・スイス抗体の検出法 - Google Patents

全菌体を用いた、ヘリコバクター・スイス抗体の検出法 Download PDF

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WO2023145789A1
WO2023145789A1 PCT/JP2023/002330 JP2023002330W WO2023145789A1 WO 2023145789 A1 WO2023145789 A1 WO 2023145789A1 JP 2023002330 W JP2023002330 W JP 2023002330W WO 2023145789 A1 WO2023145789 A1 WO 2023145789A1
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WO
WIPO (PCT)
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pylori
swiss
whole
antibody
cells
Prior art date
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PCT/JP2023/002330
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English (en)
French (fr)
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英則 松井
絵美子 林原
仁人 鈴木
崇道 高橋
明 石井
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Denka Co Ltd
Kitasato Institute
National Institute of Infectious Diseases
Original Assignee
Denka Co Ltd
Kitasato Institute
National Institute of Infectious Diseases
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Publication date
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Priority to US18/833,175 priority Critical patent/US20250110123A1/en
Priority to JP2023576957A priority patent/JPWO2023145789A1/ja
Priority to EP23746999.4A priority patent/EP4465044A4/en
Priority to CN202380018734.XA priority patent/CN118613722A/zh
Publication of WO2023145789A1 publication Critical patent/WO2023145789A1/ja
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/56922—Campylobacter
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms

Definitions

  • the present invention is based on H.I. It relates to a method for measuring antibodies against Helicobacter suis using whole Swiss cells.
  • H. pylori a microscopic pathogen that parasitizes the human stomach. It is known that infection with temperamental Gram-negative Helix, hereinafter referred to as "H. pylori" is involved.
  • H. pylori infection test methods include the isolation culture method, urea breath test (UBT), and H. pylori in serum and urine.
  • pylori antibody titer ELISA and latex agglutination
  • H. pylori in stool pylori antigen measurement (immunochromatographic method) and gastric biopsy rapid urease test (RUT) are mainly employed.
  • H.I. H. pylori due to the spread of diagnosis and eradication of H. pylori.
  • H. NHPH Non-Helicobacter pylori hericobacters; Helicobacter other than H. pylori
  • H. NHPH includes Helicobacter suisse (hereinafter H. Switzerland), H. bizzozeronnii, H. felis, H. salmonis, H. ailurogastricus, H. cynogasticus, H. baculiformis, H. mustelae, H.; acinonychls, H. cetorum and H. Heilmannii, of which most found in the human stomach are H. Switzerland.
  • H. pylori infects only primates, and infection from close relatives is assumed only in infancy, but H. pylori infects only primates. In Switzerland, people of all ages are infected by animals such as pigs and monkeys.
  • Non-Patent Document 1 About 100,000 years ago, H. Switzerland was parasitic on the stomachs of monkeys. Then, 15,000 years ago, pigs were also infected. With the domestication of pigs, the infection spread explosively, and humans also became infected (Non-Patent Document 1). 181 strains of H . When MLST (Multi Locus Sequencing Typing) analysis of Swiss genes was performed, independent clusters were formed by infected host animals, but strains isolated from humans did not form independent clusters and were included in swine clusters. Therefore, the source of infection to humans was determined to be pigs (Non-Patent Document 2). Therefore, there is a need for infection diagnosis and disinfectants in pigs and humans.
  • MLST Multi Locus Sequencing Typing
  • JP 2016-10331 A International publication WO2019/225639
  • the present invention is based on H.I.
  • the object of the present invention is to provide a method and reagents for measuring antibodies against Helicobacter suis using all Swiss cells.
  • Patent Document 1 describes H. It discloses immobilizing the Swiss F2R2 protein on a plate and measuring antibodies in the serum.
  • Patent Document 2 discloses that HsvA protein, which is said to have a higher antibody titer than F2R2 protein, is immobilized on a plate to measure antibodies in serum.
  • the present invention relates to the following inventions: [1] At least H. H . A reagent that detects antibodies that bind to Swiss whole cells. [2] The reagent of [1], wherein the subject is a mammal. [3] The reagent of [1] or [2], wherein the specimen is derived from blood. [4] Furthermore, H. pylori cell component or H. pylori. H. pylori in a subject-derived specimen containing antibodies against H. pylori body components antibodies that bind to H. pylori or H. pylori. The reagent according to any one of [1] to [3], which also detects antigens of H. pylori body components.
  • [6] anti-H. A method characterized by detecting antibodies that bind to whole Swiss cells: (a) A specimen derived from a subject is treated with H.I. (b) contacting with whole Swiss cells, and (b) H. Detecting antibodies in said specimen bound to whole Swiss cells. [7] The method of [6], wherein the subject is a mammal. [8] The method of [6] or [7], wherein the sample is derived from blood. [9] Furthermore, the H.I. The method according to any one of [6] to [8], which also detects an antibody that binds to H.
  • pylori (a) A specimen derived from a subject is treated with H.I. and (b) H. pylori body components. A step of detecting antibodies in the specimen bound to H. pylori body components. [10] Furthermore, the H.I. The method according to any one of [6] to [8], characterized in that antigens of H. pylori body components are also detected: (a) A specimen derived from a subject is treated with H.I. (b) contacting with antibodies against H. pylori body components; H. pylori in the sample bound to antibodies against H. pylori body components. A step of detecting an antigen of a H. pylori body component.
  • H. Whole swiss cells are H. anti-H. It can be used to measure the presence or absence of Swiss antibodies, or to measure antibody titers.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of ELISA using Swiss whole cells and HsvA antigenic peptides in terms of measured values. Human serum was used as the sample, and H. niger was used as the antigen.
  • FIG. 2 graphically illustrates the results of ELISA using Swiss whole cells and HsvA antigenic peptides.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of ELISA using human serum (3600-fold dilution) as a specimen and using whole H. pylori cells or whole H. suis cells as antigens in terms of measured values.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of ELISA using Swiss whole cells and HsvA antigenic peptides in terms of measured values.
  • FIG. 4 graphically shows the results of ELISA using human serum (3600-fold dilution) as the specimen and whole H. pylori cells (FIG. 4A) or whole H. suis cells (FIG. 4B) as the antigen.
  • Fig. 2 is a diagram showing the results of ELISA using human serum (3600-fold dilution) as a sample and H. suis whole cells or H. suis HsVA partial peptides (SEQ ID NOs: 1 to 5) as antigens, in terms of measured values.
  • Fig. 3 is a diagram showing the results of ELISA using human serum (3600-fold dilution) as a sample and H. suis whole cells or partial peptides of H. suis HsVA (SEQ ID NOs: 6 to 11) as antigens, in terms of measured values. .
  • the present invention provides a method for detecting H. Methods and reagents for detecting antibodies to Swiss whole organisms.
  • the present invention provides a method for detecting H. pneumoniae in a subject. A method for determining the presence of H.S.H. It is also the method of detecting infection in Switzerland. Alternatively, the subject's H. A method of obtaining ancillary data for diagnosing Swiss infections.
  • H. swiss means NHPH (Non-Helicobacter pylori hericobacters; Helicobacter other than H. pylori) or Helicobacter heilmannii sensu lato (broad definition of Helicobacter hirmanii). It means the Swiss strain (Non-Patent Document 3). H. Switzerland is known to infect the stomachs of pigs, monkeys, wild boars, cats and dogs in addition to humans. H.I. The infected mammal from which Switzerland was isolated is not particularly limited and may be, for example, humans, monkeys, wild boars, or pigs.
  • H. Swiss whole cell As used herein, "H. swiss whole cell” means H. suis whole cell. It is a component of the Swiss whole cell, eg H. Obtained by sonicating Swiss. H. It is also called Swiss Whole Cell Fraction. Sonication is performed according to H.I. It can be carried out by suspending the Swiss cells in a buffer solution and using an ultrasonicator. Examples of ultrasonic crushers include a sample-enclosed ultrasonic crusher Bioruptor (BM equipment). By sonication, H.I. The Swiss cells are disrupted to obtain a lysate containing all cell components.
  • ultrasonic crushers include a sample-enclosed ultrasonic crusher Bioruptor (BM equipment).
  • H. Antibodies to Swiss whole cells were obtained from H. Components such as antigens such as proteins and sugars contained in all Swiss cells, that is, H. Refers to antibodies against whole Swiss cell components, which may include multiple antibodies against various substances.
  • H. An antibody against at least one of antigens such as proteins and sugars contained in all Swiss bacterial cells is obtained from H. cerevisiae. It is called an antibody against Swiss whole cells.
  • H . Antibodies are produced against whole Swiss organisms.
  • the antibody is H.I.
  • An antibody that binds to an antigen contained in all Swiss bacteria is said to bind to all Swiss bacteria.
  • Reagents for detecting antibodies to Swiss whole cells can be prepared as reagents applicable to known methods.
  • Known methods include, for example, an enzyme immunoassay method (EIA method), a simple EIA method, an enzyme-linked immunosorbent assay method (ELISA method), a radioimmunoassay method (RIA method), a fluorescence immunoassay method (FIA method), and the like.
  • turbidimetric method TIA method
  • NIA method nephelometric method
  • LIA method latex agglutination method
  • LIA method particle counting method
  • chemiluminescence measurement method CLIA method, CLEIA method
  • sedimentation reaction method surface plasmon resonance method (SPR method); resonant mirror detector method (RMD method); Whether or not the reagent of the present invention can be applied to the desired measurement method is described in H. et al. A sample containing antibody against whole Swiss cells or H. cerevisiae at the same concentration as the sample It can be confirmed by measuring whether or not detection is possible by performing each measurement method using a sample containing an antibody against whole Swiss cells.
  • H. Antibodies to whole Swiss organisms can be used as a marker for H. suis infection.
  • H.I. A subject's own immune system-generated H. It can be determined by confirming the presence of antibodies to Swiss whole cells. The presence of these antibodies has been documented by H. It can be detected and confirmed by antigen-antibody reaction using whole Swiss cells.
  • H. H . Detection in Switzerland is based on labeled immunoassay methods such as enzyme immunoassay (EIA method), simplified EIA method, enzyme-linked immunosorbent assay method (ELISA method), radioimmunoassay method (RIA method), fluorescence immunoassay method (FIA method), etc.
  • EIA method enzyme immunoassay
  • ELISA method enzyme-linked immunosorbent assay method
  • RIA method radioimmunoassay method
  • FFA method fluorescence immunoassay method
  • Measurement method can be performed by an immunoassay method such as a comparative interference method.
  • the present invention provides a method for producing H. Concerning the method of determining Swiss infection: (a) A specimen derived from a subject is treated with H.I. the step of contacting with Swiss whole cells, (b) H.I. (c) detecting antibodies in said specimen bound to whole Swiss cells; Subjects in whom antibodies that bound to Swiss whole cells were detected were H. determined to be infected with Switzerland, while H. Subjects with no detectable antibodies that bound to whole Swiss cells were tested with H. The process of determining that Switzerland is not infected.
  • the present invention provides a method for producing an H. Concerning the method of determining Swiss infection: (a) A specimen derived from a subject is treated with the H. elegans of the present invention. the step of contacting with Swiss whole cells, (b) H.I. measuring the level of antibody in said specimen that is bound to whole Swiss cells, and (c) if the level of antibody measured is higher than the level of antibody measured for a negative control by a similar method, The subject was treated with H.I. If determined to be infected with H. switzerland and the level of antibody measured is equal to or lower than the level of antibody measured for the negative control by a similar method, the subject is tested for H. pneumoniae. The process of determining that Switzerland is not infected.
  • a negative subject refers to a specimen from a subject not infected with H. suis.
  • the level of antibody refers to the quantitative value of antibody, ie, antibody titer, and is expressed, for example, as the concentration in the sample. Also included in the detection of antibodies is the measurement of levels of antibodies.
  • H. Whether or not the Swiss whole cells and the antibody in the specimen derived from the subject are bound can be confirmed by the method exemplified below.
  • a specimen derived from a subject may be treated with the H. After contact with whole Swiss cells, the reaction is washed to remove unbound antibody.
  • H.I. There is a complex that binds the whole Swiss cells and the antibody in the subject-derived specimen.
  • H. cerevisiae are then contacted with labeled anti-Ig antibodies. After binding the subject-derived antibody bound to the whole Swiss cells with the labeled anti-Ig antibody, the reaction system is washed to remove the unbound labeled anti-Ig antibody, and the remaining labeled anti-Ig antibody.
  • the anti-Ig antibody may be an anti-IgG antibody, an anti-IgM antibody, or the like, but is preferably an anti-IgG antibody. Also, anti-IgG antibodies are preferably monoclonal antibodies.
  • Fab, Fab', F (ab') 2 single chain antibody (scFv), VHH single domain antibody (nanobody), dsFv, dibody, fragment having specific antigen binding such as minibody (antigen-binding fragment) can also be used.
  • Representative examples of such methods include ELISA and immunochromatography.
  • Enzymes such as alkaline phosphatase and horseradish peroxidase, metal colloids such as gold colloids, silica particles, cellulose particles, magnetic particles, fluorescent particles, colored polystyrene particles, colored latex particles, and the like are used for labeling anti-Ig antibodies. There are many things.
  • the binding level is used as an indicator, the amount of antibody can be calculated from the measured values by creating a standard curve using a standard solution whose abundance is known in advance.
  • a surface plasmon resonance sensor, H it is also possible to detect or measure the binding of antibodies in specimens derived from Swiss whole cells and subjects.
  • the sandwich method is preferred.
  • the sandwich method itself is well known in the field of immunoassay, and can be performed, for example, by an immunochromatography method or an ELISA method in which lateral flow immunoassay is performed.
  • sandwich methods per se are all well-known, and the method of the present invention can be carried out by the well-known sandwich method.
  • the ELISA method will be described below.
  • H.I. Whole Swiss bacterial cell component (antigen) is immobilized, and H. elegans is added to the immobilized carrier.
  • a sample that may contain an antibody against the whole Swiss cells is added and contacted to form a complex between the antigen and the antibody on the immobilized carrier.
  • an enzyme-labeled antibody that is specific to a human antibody (anti-Ig antibody) is added and brought into contact, and the anti-Ig antibody is bound to the antigen-antibody complex on the immobilized carrier.
  • a substrate for the enzyme is added, an enzymatic reaction is allowed to occur, color development is measured by absorbance measurement, and a sandwich complex of the antigen and antibody on the plate can be detected.
  • the antigen-antibody reaction can be carried out at 4° C. to 45° C., preferably 20° C. to 40° C., more preferably 25° C. to 38° C., and the reaction time for each binding reaction is 10 minutes to 18 hours. It is preferably 10 minutes to 3 hours, more preferably 30 minutes to 2 hours.
  • H. Binding of the Swiss whole cell component (antigen) to the carrier can be carried out by known methods such as physical adsorption and covalent binding using functional groups.
  • the immobilized amount is not particularly limited, but when the carrier is a 96-well microtiter plate, it is preferably several ng to several tens of ⁇ g per well.
  • the solid-phased H.I. It can be carried out by bringing a solution of whole Swiss cell components (antigens) into contact with a carrier.
  • a solution of whole Swiss cell components (antigens) can be dispensed into wells of a microtiter plate and allowed to stand for a certain period of time to solidify.
  • the subject in the method of determining Swiss infection can be mammals such as humans, monkeys, pigs, cats, wild boars, dogs, rabbits, mice and sheep, and is preferably a human. Also preferably, gastritis, chronic gastritis, goose skin gastritis, type A gastritis, gastric MALT lymphoma, diffuse large B-cell lymphoma, gastric cancer, gastric/duodenal ulcer, idiopathic thrombocytopenic purpura, functional dyspepsia, or A human patient suffering from Parkinson's disease. Moreover, the method of the present invention can be performed qualitatively, quantitatively or semi-quantitatively (Non-Patent Document 4).
  • a tissue sample taken from a subject as a biopsy or a liquid sample taken from a subject can be used as a specimen used as a target for the method of the present invention.
  • the specimen is not particularly limited as long as it can be used as a target for the method of the present invention.
  • Fluid, saliva, or fractions or processed products thereof can be mentioned.
  • the H.I. Preferred specimens are blood, plasma, serum, lymph, and urine when antibodies are to be detected in the method for determining the presence of Swiss.
  • the present invention provides a method for detecting H. H. spp. It relates to a method for determining the presence of Switzerland.
  • the present invention relates to H.I. H . It relates to a method for determining Swiss infection.
  • H. Subjects from whom antibodies against Swiss whole cells were detected were infected with H. Switzerland exists, or H. Determined to be infected with Switzerland.
  • the method of the present invention is performed by measuring the binding between the antibody in the specimen and the test reagent, whether or not it is "detected” in the determination does not necessarily mean the presence or absence of absolute detection. Instead, it may be determined in comparison with other specimens. That is, the presence/absence of detection may be determined based on the measured value instead of based on the ⁇ detection result. That is, in the method of the present invention, the step of "detecting" can be replaced with "measuring” as necessary, and whether or not it is “detected” is determined based on the measured value of the target substance and the negative target. It may be determined in comparison. For example, negative subjects, ie, H. Specimens not containing Switzerland or H.
  • the target substance When the target substance is detected in a specimen derived from a subject who is clearly not infected with Switzerland, if the measured value of the subject is equivalent to that of the negative subject, it is detected in a small amount.
  • H.I. Switzerland does not exist or H. Determined not to have infected Switzerland.
  • the subject's measurement is high compared to the negative subject's measurement, it will be labeled as "detected.” Switzerland exists, or H. Determined to be infected with Switzerland. Therefore, it is within the pre-accepted range of the present invention that the method of the present invention accepts a small measured value for subjects that are negative.
  • H. Swiss infected and H. It is possible to measure antibody titers in specimens from uninfected Swiss subjects and set a cut-off value. If it is equal to or greater than the cutoff value, the H.I. Switzerland exists, or H. It is possible to determine that Switzerland is infected.
  • the cutoff value can be determined, for example, by ROC (receiver operating characteristic curve) analysis.
  • the diagnostic accuracy (sensitivity and specificity) of the method of the present invention can be determined by ROC analysis.
  • ROC analysis was carried out according to H. Specimens collected from Swiss infected persons and H. Anti-H. The Swiss antibody is measured, the sensitivity and false positive rate (1-specificity) at each cutoff value are calculated, and plotted on a coordinate system with (1-specificity) on the horizontal axis and sensitivity on the vertical axis.
  • the diagnostic accuracy is analyzed by ROC analysis, the sensitivity is 80% or higher, preferably 85% or higher, more preferably 90% or higher, and the specificity is 75% or higher, preferably 80% or higher.
  • H An antibody that binds to whole Swiss cells or a protein contained in whole cells and H. Also included are methods of detecting antibodies to H. pylori and reagents for use in such methods.
  • H.I. Antibodies to H. pylori are available from H. pylori.
  • Helicobacter pylori refers to an antibody against any of the constituents of the whole cell of H. pylori, ie, the cell component. For example, H.I. If the test for H. pylori is negative but shows symptoms of gastric disease, H. It is possible that the infection in Switzerland is the cause. From the same subject H.
  • Antibodies that bind to Swiss whole cells and H By detecting antibodies to H. pylori, H. In addition to the presence or absence of H. pylori infection, it is possible to confirm H. suisse infection in subjects who have been overlooked as negative for H. pylori. By confirming the infection at an early stage, an appropriate course of treatment can be established. Specimens from the same subject are H. pylori and H. It may or may not be the same in Switzerland. That is, H. Detection of antibodies that bind to Swiss whole cells and H. The detection of antibodies against H. pylori may be performed simultaneously using the same specimen, or may be performed separately using different specimens collected at different times. H. Detection of antibodies to H. pylori is described in H. pylori. It may be carried out in the same manner as the detection of antibodies against Swiss whole cells.
  • H. Whether or not H. pylori is "detected” does not have to be the absolute presence or absence of detection, and may be determined in comparison with other specimens. That is, the presence/absence of detection may be determined based on the measured value instead of based on the ⁇ detection result. That is, in the method of the present invention, the step of "detecting" can be replaced with “measuring” as necessary, and whether or not it is “detected” is determined based on the measured value of the target substance and the negative target. It may be determined in comparison. For example, negative subjects, ie, H. pylori-free specimen or H.
  • the target substance is detected in a specimen derived from a subject who is clearly not infected with Helicobacter pylori, if the measured value of the subject is equivalent to that of the negative subject, it is detected in a small amount. Also, in the method of the present invention, the H. pylori is absent or H. pylori infection is determined. On the other hand, if the subject's measurement is high compared to the negative subject's measurement, it will be labeled as "detected.” pylori is present, or H. pylori infection is determined. Therefore, it is within the pre-accepted range of the present invention that the method of the present invention accepts a small measured value for subjects that are negative.
  • Example 1 Measurement of human specimen Measurement of anti-H. swiss antibody titer of infected person (human) using ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay; enzyme immunoassay).
  • Swiss medium composition Brucella Broth (BD BBL) 2.8 g Agar powder (BD BBL) 1.5 g Pyruvic acid (Sigma) 0.1 g added when preparing agar medium Skirrow Supplement (2 mL/vial, Oxoid) 0.4 mL Vitox Supplement (10 mL/vial, Oxoid) 2 mL Amphotericin B (0.25 mg/mL) 2 mL Adjust pH to 5 with 0.135 mL of concentrated hydrochloric acid 20 mL of inactivated fetal bovine serum (FBS) Distilled water was added to bring the total volume to 100 mL.
  • BD BBL Swiss medium composition Brucella Broth
  • BD BBL 2.8 g
  • Non-Patent Document 2 9 mL of agar medium was added to a 75 cm 2 flask to prepare a slant medium, and H. spp. Swiss SNTW101c strain (Non-Patent Document 2) was inoculated, 12 mL of liquid medium was added, temperature was 37°C, humidity was 100%, and microaerobic conditions (5% O 2 , 12% CO 2 , 83% N 2 ) were used. Shaking culture was performed for 1 week. After that, the culture medium was centrifuged (13,420 G x 10 minutes) to collect the cells.
  • the cells were washed twice with PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4), suspended in distilled water, and subjected to sonication for 5 minutes under ice-cold conditions (Bioruptor II ultrasonic cell disruption). 30 seconds of sonication and 5 repetitions of 30 seconds rest on the device (setting High)).
  • the disruption solution was "H. Swiss Whole Cell Suspension”.
  • a Bio-Rad Protein Assay kit was used with BSA as a standard protein.
  • HsvA antigen peptide No. 16 is a 14 amino acid residue (SEQ ID NO: 6), and this No. An antibody test that crosses 16 peptides has been proposed by H.I. In the Swiss infection test, it has excellent sensitivity and specificity, so it is No. The 16 peptides are H.16 peptides. It is thought to be involved in Switzerland-specific antibody production.
  • H. pylori-infected persons determined by existing test methods (urea breath test, antibody test, antigen test, etc.), and H. pylori Sera were collected from Swiss-infected subjects (H. suis infection was determined by the real-time PCR method described in Patent Document 2 or culture from the stomach biopsy by preparing DNA from the subject's stomach biopsy).
  • H. suis infection was determined by the real-time PCR method described in Patent Document 2 or culture from the stomach biopsy by preparing DNA from the subject's stomach biopsy).
  • serum was collected from a healthy subject who had not been infected with any bacteria (non-infected).
  • 50 ⁇ L/well of human serum diluted with a blocking solution was added dropwise and left at 37° C. for 1 hour.
  • the serum solution was discarded and washed with 200 ⁇ L/well of PBS-T three times.
  • Horseradish peroxidase-labeled secondary antibody (Goat anti-Human IgA + IgG + IgM (H + L), Jackson ImmunoResearch, Inc.) diluted 100,000 times with blocking solution was dropped at 50 ⁇ L/well and left at 37 ° C. for 1 hour. The secondary antibody solution was discarded, and washed with 200 ⁇ L/well of PBS-T three times. 50 ⁇ L/well of SuperBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate (1-Component), Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.
  • Figures 1 and 2 show the results of ELISA using human serum.
  • human sera 3 H. swiss positives (patients A, B, C); 3 H. pylori positives (patients D, E, F); 3 uninfected Specimens (Patients G, H, I)) could be discriminated as positive when the absorbance was 1.0 or more and as negative when the absorbance was less than 1.0.
  • HsvA antigen peptide No. 16, 200-fold, 800-fold and 3200-fold diluted human sera (3 H. swiss positive (patients A, B, C); 3 H.
  • H. suis whole cell has HsvA antigenic peptide No. 16, H. It was shown to be extremely sensitive and specific for antibodies to Switzerland. Therefore, whole H. suis cells are useful for specific infection diagnosis using antibodies in serum.
  • Example 2 Measurement of human specimen Measurement of anti-H. pylori antibody titer and anti-H. swiss antibody titer of infected person (human) using ELISA (EnzymeLinked ImmunoSorbent Assay; enzyme immunoassay) (1) ELISA for H.I. Preparation of H. pylori antigens (whole H. pylori cells)H.
  • ELISA EnzymeLinked ImmunoSorbent Assay; enzyme immunoassay
  • Non-Patent Document 2 pylori TN2GF4 strain was prepared in brucella broth containing 10% (V/V) fetal calf serum (FCS) at a temperature of 37°C, humidity of 100%, microaerobic conditions (5% O 2 , 10% CO 2 , 85% N 2 ) for 48 hours, and then the culture medium was centrifuged (13,420 G x 10 minutes) to collect the cells. The cells were washed twice with PBS phosphate-buffered saline (pH 7.4), suspended in distilled water, and subjected to sonication for 5 minutes under ice-cold conditions (Bioruptor II ultrasonic cell disruptor).
  • FCS fetal calf serum
  • Non-Patent Document 2 9 mL of agar medium was added to a 75 cm 2 flask to prepare a slant medium, and H. spp. Swiss SNTW101c strain (Non-Patent Document 2) was inoculated, 12 mL of liquid medium was added, temperature was 37°C, humidity was 100%, and microaerobic conditions (5% O 2 , 12% CO 2 , 83% N 2 ) were used. Shaking culture shaking was performed for one week. After that, the culture medium was centrifuged (13,420 G x 10 minutes) to collect the cells.
  • the cells were washed twice with PBS phosphate-buffered saline (pH 7.4), suspended in distilled water, and subjected to sonication for 5 minutes under ice-cold conditions (Bioruptor II ultrasonic cell disruptor). (setting High), sonication for 30 seconds, rest for 30 seconds, repeated 5 times).
  • the disruption solution was "H. Swiss Whole Cell Suspension”.
  • a Bio-Rad Protein Assay kit was used with BSA as a standard protein.
  • PBS-T PBS containing 0.05% (V/V) Tween 20
  • 200 ⁇ L/well of a blocking solution 1% (V/V) BSA, PBS pH 7.0
  • H. pylori-infected persons with symptoms of gastric disease determined by existing test methods (urea breath test, antibody test, antigen test, etc.) and H. pylori patients with symptoms of gastric disease.
  • Sera were collected from Swiss-infected subjects (H. suis infection was determined by the real-time PCR method described in Patent Document 2 or culture from the stomach biopsy by preparing DNA from the subject's stomach biopsy).
  • serum was collected from a healthy subject who had not been infected with any bacteria (non-infected).
  • 50 ⁇ L/well of human serum diluted with a specimen diluent (0.5% (V/V) BSA, PBS system pH 7.0) was added dropwise and left at 37° C. for 1 hour.
  • the serum solution was discarded and washed with 250 ⁇ L/well of PBS-T three times.
  • Horseradish peroxidase-labeled secondary antibody (Goat anti-Human IgG (H+L), Jackson ImmunoResearch, Inc.) was added dropwise at 50 ⁇ L/well and left at 37° C. for 1 hour. The secondary antibody solution was discarded, and washed with 250 ⁇ L/well of PBS-T three times.
  • 50 ⁇ L/well of TMB One Component HRP Microwell Substrate, (Surmodics, Inc.) was dropped to develop a blue color, and then 50 ⁇ L/well of 0.17 M sulfuric acid was dropped to change the color to yellow.
  • Absorbance at 450 nm reference wavelength: 620 nm to 630 nm
  • FIGS 3 and 4 show the results of ELISA using human serum (3,600-fold dilution).
  • H. pylori whole cells H. pylori-infected groups (stomach disease-A, B, C, D) showed an absorbance of H. pylori.
  • H.I. In Swiss whole organisms H.
  • Example 3 Measurement of human specimen Measurement of anti-H. swiss antibody titer of infected person (human) using ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay; enzyme immunoassay).
  • Swiss medium composition Brucella Broth (BD BBL) 2.8 g Agar powder (BD BBL) 1.5 g Pyruvic acid (Sigma) 0.1 g added when preparing agar medium Skirrow Supplement (2 mL/vial, Oxoid) 0.4 mL Vitox Supplement (10 mL/vial, Oxoid) 2 mL Amphotericin B (0.25 mg/mL) 2 mL Adjust pH to 5 with 0.135 mL of concentrated hydrochloric acid 20 mL of inactivated fetal bovine serum (FBS) Distilled water was added to bring the total volume to 100 mL.
  • FBS inactivated fetal bovine serum
  • the cells were washed twice with PBS phosphate-buffered saline (pH 7.4), suspended in distilled water, and subjected to sonication for 5 minutes under ice-cold conditions (Bioruptor II ultrasonic cell disruptor). (setting High), sonication for 30 seconds, rest for 30 seconds, repeated 5 times).
  • the disruption solution was "H. Swiss Whole Cell Suspension”.
  • a Bio-Rad Protein Assay kit was used with BSA as a standard protein.
  • HsvA antigenic peptides are a part of HsvA (an outer membrane protein specifically present only in H. Switzerland, composed of about 3000 amino acid residues) disclosed in International Publication WO2019/225639. 14 amino acid residues are shown.
  • EKKAVQQMENSNPD Peptide No. 11: SEQ ID NO: 1
  • EKKAVEQMENSNPD Peptide No. 11 (TKY): SEQ ID NO: 2)
  • EKDAVTSLKNSNSG Peptide No. 11 (SH8): SEQ ID NO: 3
  • EKDAVTSLENSNSG Peptide No. 11 (SH10): SEQ ID NO: 4
  • NQGTLEFLSNDVST Peptide No.
  • TNGQEVSASIDYNK Peptide No. 16: SEQ ID NO: 6
  • AKLSNFASNDALPD Peptide No. 23: SEQ ID NO: 7
  • PTTSSGASPDSSNP Peptide No. 10: SEQ ID NO: 8
  • NVDNILNMPSTTSG Peptide No. 20: SEQ ID NO: 9
  • TLTLEGTETFAQNS Peptide No. 81: SEQ ID NO: 10
  • ADIQSSQTTFANSV Peptide No. 61: SEQ ID NO: 11).
  • PBS-T PBS containing 0.05% (V/V) Tween 20
  • 200 ⁇ L/well of a blocking solution 1% (V/V) BSA, PBS pH 7.0
  • H. pylori-infected persons determined by existing test methods (urea breath test, antibody test, antigen test, etc.), and H. pylori Sera were collected from Swiss-infected subjects (H. suis infection was determined by the real-time PCR method described in Patent Document 2 or culture from the stomach biopsy by preparing DNA from the subject's stomach biopsy).
  • serum was collected from a healthy subject who had not been infected with any bacteria (non-infected).
  • the serum solution was discarded and washed with 250 ⁇ L/well of PBS-T three times.
  • Horseradish peroxidase-labeled secondary antibody (Goat anti-Human IgG (H+L), Jackson ImmunoResearch, Inc.) was added dropwise at 50 ⁇ L/well and left at 37° C. for 1 hour. The secondary antibody solution was discarded, and washed with 250 ⁇ L/well of PBS-T three times.
  • 50 ⁇ L/well of TMB One Component HRP Microwell Substrate, (Surmodics, Inc.) was dropped to develop a blue color, and then 50 ⁇ L/well of 0.17 M sulfuric acid was dropped to change the color to yellow.
  • Absorbance at 450 nm reference wavelength: 620 nm to 630 nm
  • H. H. pylori infection as distinct from H. pylori infection. Sensitive diagnosis of Swiss infection becomes possible. All publications, patents and patent applications cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety.

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Abstract

Ｈ．スイスの全菌体を用いたヘリコバクター・スイスの抗体の測定方法および測定試薬の提供。　少なくともＨ．スイス全菌体および抗Ｉｇ抗体を含む、被験体由来の検体のＨ．スイス全菌体と結合する抗体を検出する試薬。

Description

全菌体を用いた、ヘリコバクター・スイス抗体の検出法
　本発明は、Ｈ．スイスの全菌体を用いたヘリコバクター・スイスの抗体の測定方法に関する。
　現在、慢性胃炎、胃潰瘍や十二指腸潰瘍、胃癌、胃Ｍｕｃｏｓａ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（ＭＡＬＴ）リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫などに、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、ヒトの胃に寄生する微好気性のグラム陰性螺旋菌、以下、「Ｈ．ピロリ」という）による感染が関与することが知られている。Ｈ．ピロリの感染検査方法として、分離培養法や尿素呼気試験（ＵＢＴ）、血清や尿中のＨ．ピロリ抗体価の測定（ＥＬＩＳＡとラッテクス凝集法）、便中のＨ．ピロリ抗原測定（イムノクロマト法）、胃生検体の迅速ウレアーゼ試験（ＲＵＴ）が主に採用されている。
　しかし、近年、Ｈ．ピロリの診断や除菌の普及によるＨ．ピロリの感染率の低下に伴い、Ｈ．ピロリ以外のヒトに重篤な胃疾患を誘発するヘリコバクターとして、ＮＨＰＨ（Ｎｏｎ－Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ｈｅｒｉｃｏｂａｃｔｅｒｓ; Ｈ．ピロリ以外のヘリコバクター)が問題となってきた。ＮＨＰＨには、ヘリコバクター・スイス（以下、 Ｈ．スイス）、Ｈ．ｂｉｚｚｏｚｅｒｏｎｎｉｉ、Ｈ．ｆｅｌｉｓ、Ｈ．ｓａｌｍｏｎｉｓ、Ｈ．ａｉｌｕｒｏｇａｓｔｒｉｃｕｓ、Ｈ．ｃｙｎｏｇａｓｔｉｃｕｓ、 Ｈ． ｂａｃｕｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｈ． ｍｕｓｔｅｌａｅ、Ｈ． ａｃｉｎｏｎｙｃｈｌｓ、 Ｈ．ｃｅｔｏｒｕｍおよびＨ． ｈｅｉｌｍａｎｎｉｉが含まれ、このうちヒトの胃から見つかる大部分は、Ｈ．スイスである。
　Ｈ．ピロリは霊長類にしか感染せず、乳幼児期においてのみ近親者からの感染が想定されるが、Ｈ．スイスは年齢に関係なく、豚、猿などの動物から感染する。
　Ｈ.スイスは約１０万年前には、サルの胃に寄生していた。その後１．５万年前にブタにも感染するようになった。ブタの家畜化に伴い感染が爆発的に広まり、ヒトにも感染するようになった（非特許文献１）。世界各地から分離された１８１株のＨ．スイス遺伝子のＭＬＳＴ（Ｍｕｌｔｉ Ｌｏｃｕｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｔｙｐｉｎｇ）解析を行ったところ、感染宿主動物により独立のクラスターを形成したが、ヒトから分離した株は、独立のクラスターを形成せず、ブタのクラスターに含まれることから、ヒトへの感染源はブタと判定された(非特許文献２)。そこで、ブタとヒトにおいて感染診断と除菌剤が必要となる。
　Ｈ．スイスの感染検査方法として、血清中のＨ．スイス抗体価の測定（ＥＬＩＳＡとラッテクス凝集法）が報告されている（特許文献１、２）。
特開２０１６－１０３３１号公報 国際公開ＷＯ２０１９／２２５６３９号
Ｆｌａｈｏｕ　ｅｔ　ａｌ．，ＩＳＭ　Ｊ．，Ｊａｎ；１２（１）：７７－８６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｉｓｍｅｊ．２０１７．１４５ Ｅ．Ｒｉｍｂａｒａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　２０２１　Ｖｏｌ．１１８　Ｉｓｓｕｅ　１３　ｅ２０２６３３７１１８．ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．２０２６３３７１１８． Ｈａｅｓｅｂｒｏｕｃｋ　Ｆ．ｅｔ　ａｌ．，Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ，１６（４），３３９－３４０，２０１１　ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１５２３－５３７８．２０１１．００８４９．ｘ Ａ．Ｄ．Ａｕｇｕｓｔｉｎ，ｅｔ　ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｍｅｄ．，２０１９，６，１８８，ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｍｅｄ．２０１９．００１８８（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ／３１５５５６４８）
　本発明は、Ｈ．スイスの全菌体を用いたヘリコバクター・スイスの抗体の測定方法および測定試薬の提供を目的とする。
　特許文献１にはＨ．スイスのＦ２Ｒ２蛋白をプレートに固相して血清中の抗体を測定することが開示されている。そして、特許文献２にはＦ２Ｒ２蛋白質より抗体価が高いとさされるＨｓｖＡ蛋白をプレートに固相して血清中の抗体を測定することが開示されている。
　しかしながら、従来の方法より感度と特異性の高い方法が求められていた。
　今回、本発明者らは、Ｈ．スイスの全菌体を用いることで、感染者の体内の抗Ｈ．スイス抗体の測定感度と特異性を高めることを新規に発見し、新しい測定法を見出した。
　より具体的には、本発明は、以下の発明に関する：
[１]　少なくともＨ．スイス全菌体および抗Ｉｇ抗体を含む、被験体由来の検体のＨ．スイス全菌体と結合する抗体を検出する試薬。
[２]　被験体が哺乳動物であることを特徴とする、[１]の試薬。
[３]　検体が血液由来であることを特徴とする、[１]または[２]の試薬。
[４]　さらに、Ｈ．ピロリの菌体成分またはＨ．ピロリ菌体成分に対する抗体を含む、被験体由来の検体のＨ．ピロリと結合する抗体またはＨ．ピロリ菌体成分の抗原も検出することを特徴とする、[１]～[３]のいずれかの試薬。
[５]　ＥＬＩＳＡまたはイムノクロマト用試薬である、[１]～[４]のいずれかの試薬。
[６]　以下の工程を含む、被験体由来の検体の抗Ｈ．スイス全菌体と結合する抗体を検出することを特徴とする方法：
（ａ）被験体由来の検体をＨ．スイス全菌体と接触させる工程、および
（ｂ）Ｈ．スイス全菌体と結合した、前記検体中の抗体を検出する工程。
[７]　被験体が哺乳動物であることを特徴とする、[６]の方法。
[８]　検体が血液由来であることを特徴とする、[６]または[７]の方法。
[９]　さらに、以下の工程を含む、被験体由来の検体のＨ．ピロリと結合する抗体も検出することを特徴とする[６]～[８]のいずれかの方法：
（ａ）被験体由来の検体をＨ．ピロリ菌体成分と接触させる工程、および
（ｂ）Ｈ．ピロリ菌体成分と結合した、前記検体中の抗体を検出する工程。
[１０]　さらに、以下の工程を含む、被験体由来の検体のＨ．ピロリ菌体成分の抗原も検出することを特徴とする、[６]～[８]のいずれかの方法：
（ａ）被験体由来の検体をＨ．ピロリ菌体成分に対する抗体と接触させる工程、および
（ｂ）Ｈ．ピロリ菌体成分に対する抗体と結合した、前記検体中のＨ．ピロリ菌体成分の抗原を検出する工程。
[１１]　[１]～[５]のいずれかの試薬を用いた測定および／または[６]～[１０]のいずれかの方法により抗体が検出された被験体をＨ．スイスに感染していると判定する、Ｈ．スイスの感染の検出方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2022-009397号の開示内容を包含する。
　Ｈ．スイス全菌体を用いることで、感染者の体内の抗Ｈ．スイス抗体を高感度に測定することができる。Ｈ．スイス全菌体は、Ｈ．スイス感染診断対象体由来血液中の抗Ｈ．スイス抗体の有無、または抗体価を測定するために使用することができる。
検体としてヒト血清を用い、抗原としてＨ．スイス全菌体およびＨｓｖＡ抗原ペプチドを用いたＥＬＩＳＡの結果を測定値で示す図である。 検体としてヒト血清を用い、抗原としてＨ．スイス全菌体およびＨｓｖＡ抗原ペプチドを用いたＥＬＩＳＡの結果をグラフで示す図である。 検体としてヒト血清（３６００倍希釈）を用い、抗原としてＨ.ピロリ全菌体またはＨ.スイス全菌体を用いたＥＬＩＳＡの結果を測定値で示す図である。 検体としてヒト血清（３６００倍希釈）を用い、抗原としてＨ.ピロリ全菌体（図４Ａ）またはＨ.スイス全菌体（図４Ｂ）を用いたＥＬＩＳＡの結果をグラフで示す図である。 検体としてヒト血清（３６００倍希釈）を用い、抗原としてＨ.スイス全菌体またはＨ.スイスのＨｓＶＡの部分ペプチド（配列番号１～５）を用いたＥＬＩＳＡの結果を測定値で示す図である。 検体としてヒト血清（３６００倍希釈）を用い、抗原としてＨ.スイス全菌体またはＨ.スイスのＨｓＶＡの部分ペプチド（配列番号６～１１）を用いたＥＬＩＳＡの結果を測定値で示す図である。
　以下、本発明の方法について説明する。
　本発明は、被験体の生体試料中のＨ．スイスの全菌体に対する抗体を検出する方法、および該抗体を検出する試薬である。本発明は、被験体におけるＨ．スイスの存在を判定する方法、または被験体のＨ．スイスの感染の検出方法でもある。あるいは、被験体のＨ．スイス感染症を診断するための補助的データを取得する方法である。
（Ｈ．スイス：Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｉｓ）
　本明細書において、「Ｈ．スイス」とは、５０種類以上報告されているヘリコバクター属細菌の中で、ＮＨＰＨ（Ｎｏｎ－Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ｈｅｒｉｃｏｂａｃｔｅｒｓ; Ｈ．ピロリ以外のヘリコバクター)あるいは、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｈｅｉｌｍａｎｎｉｉ ｓｅｎｓｕ ｌａｔｏ（広義のヘリコバクター・ハイルマニイ)に含まれるＨ．スイスの菌種を意味する（非特許文献３）。Ｈ．スイスは、ヒト以外にブタ、サル、イノシシ、ネコ、イヌなどの胃に感染することが知られている。本明細書におけるＨ．スイスが単離された感染哺乳動物は特に限定されるものではなく、例えば、ヒト、サル、イノシシ、またはブタであってよい。
（Ｈ．スイス全菌体）
　本明細書において、「Ｈ．スイス全菌体」とは、Ｈ．スイスの全菌体の成分であり、例えばＨ．スイスを超音波破砕することで得られる。Ｈ．スイス全菌体画分とも呼ぶ。超音波破砕は、Ｈ．スイス菌体を緩衝液に懸濁させ超音波破砕機を用いて行うことができる。超音波破砕機としてサンプル密閉型超音波破壊装置Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ（ビーエム機器）が挙げられる。超音波破砕により、Ｈ．スイス菌体は破壊され、全菌体成分を含む破砕物が得られる。
（Ｈ．スイス全菌体に対する抗体を検出する方法および試薬）
　Ｈ．スイス全菌体に対する抗体は、Ｈ．スイス全菌体に含まれる蛋白質、糖等の抗原等の成分、すなわちＨ．スイス全菌体成分に対する抗体をいい、種々の物質に対する複数の抗体が含まれ得る。本発明において、Ｈ．スイス全菌体に含まれる蛋白質、糖等の抗原のうち少なくともいずれかの抗原に対する抗体をＨ．スイス全菌体に対する抗体という。実際には、Ｈ．スイスが感染した被験体において、体内でＨ．スイス菌体が分解された結果、被験体中でＨ．スイス全菌体に対する抗体が産生される。
　なお、抗体がＨ．スイス全菌体に含まれる抗原と結合することを、抗体がスイス全菌体と結合するという。
　Ｈ．スイス全菌体に対する抗体を検出する試薬は、公知の方法に適用し得る試薬として作製することができる。公知の方法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、簡易ＥＩＡ法、酵素結合イムノソルベントアッセイ法（ＥＬＩＳＡ法）、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ法）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）等の標識化免疫測定法；イムノブロッティング法；イムノクロマト法；クロマトグラフィ法；比濁法（ＴＩＡ法）；比ろう法（ＮＩＡ法）；比色法；ラテックス凝集法（ＬＩＡ法）；粒子計数法（ＣＩＡ法）；化学発光測定法（ＣＬＩＡ法、ＣＬＥＩＡ法）；沈降反応法；表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）；レゾナントミラーディテクター法（ＲＭＤ法）；比較干渉法等を挙げることができる。本発明の試薬が、所望の測定法に適用することが可能であるか否かは、Ｈ．スイス全菌体に対する抗体を含む検体または該検体と同じ濃度のＨ．スイス全菌体に対する抗体を含むサンプルを用いて、各測定法を実施することにより、検出可能であるか否かを測定することで確認することができる。
　Ｈ．スイス全菌体に対する抗体をＨ.スイス感染のマーカーとして用いることができる。
　すなわち、被験体がＨ．スイスに感染しているか否かは、被験体自身の免疫系が生み出したＨ．スイス全菌体に対する抗体の存在を確認することにより決定することができる。これらの抗体の存在は、Ｈ．スイス全菌体を利用した抗原抗体反応により検出し確認することができる。Ｈ．スイス全菌体を利用したＨ．スイスの検出は、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、簡易ＥＩＡ法、酵素結合イムノソルベントアッセイ法（ＥＬＩＳＡ法）、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ法）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）等の標識化免疫測定法；ウェスタンブロッティング法等のイムノブロッティング法；金コロイド凝集法等のイムノクロマト法；イオン交換クロマトグラフィ法、アフィニティクロマトグラフィ法等のクロマトグラフィ法；比濁法（ＴＩＡ法）；比ろう法（ＮＩＡ法）；比色法；ラテックス凝集法（ＬＩＡ法）；粒子計数法（ＣＩＡ法）；化学発光測定法（ＣＬＩＡ法、ＣＬＥＩＡ法）；沈降反応法；表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）；レゾナントミラーディテクター法（ＲＭＤ法）；比較干渉法等の免疫測定法により行うことができる。
　一態様において、本発明は、以下の工程を含むＨ．スイス感染の判定方法に関する：
（ａ）被験体由来の検体をＨ．スイス全菌体と接触させる工程、
（ｂ）Ｈ．スイス全菌体と結合した、前記検体中の抗体を検出する工程、及び
（ｃ）Ｈ．スイス全菌体と結合した抗体が検出された被験体をＨ．スイスに感染していると判定し、一方、Ｈ．スイス全菌体と結合した抗体が検出されなかった被験体を、Ｈ．スイスに感染していないと判定する工程。
　他の態様において、本発明は、以下の工程を含むＨ．スイス感染の判定方法に関する：
（ａ）被験体由来の検体を、本発明のＨ．スイス全菌体と接触させる工程、
（ｂ）Ｈ．スイス全菌体と結合した、前記検体中の抗体のレベルを測定する工程、及び
（ｃ）測定された抗体のレベルが、同様の方法により陰性対照について測定された抗体のレベルよりも高い場合、該被験体をＨ．スイスに感染していると判定し、一方、測定された抗体のレベルが、同様の方法により陰性対照について測定された抗体のレベルと同等か低い場合、該被験体を、Ｈ．スイスに感染していないと判定する工程。ここで、陰性対象とは、Ｈ.スイスに感染していない被験体由来の検体をいう。抗体のレベルとは、抗体の定量値、すなわち抗体価をいい、例えば、検体中の濃度で表される。また、抗体のレベルの測定は、抗体の検出に含まれる。
　Ｈ．スイス全菌体と被験体由来の検体中の抗体が結合したか否かは、以下に例示される方法で確認すればよい。例えば、被験体者由来の検体を、本発明のＨ．スイス全菌体と接触させた後に、反応系を洗浄して非結合の抗体を除去する。この結果、反応系には、Ｈ．スイス全菌体と被験体由来の検体中の抗体が結合した複合体が存在する。その後、標識化した抗Ｉｇ抗体と接触させてＨ．スイス全菌体と結合した被験体由来の抗体と該標識抗Ｉｇ抗体とを結合させた後に、反応系を洗浄して非結合の標識抗Ｉｇ抗体を除去して、残った標識抗Ｉｇ抗体の標識を検出し、該標識抗Ｉｇ抗体の標識が検出された場合にＨ．スイス全菌体と被験体由来の検体中の抗体が結合したと判断することができる。該標識抗Ｉｇ抗体の標識レベルを測定することで、Ｈ．スイス全菌体と被験者由来の検体中の抗体とのレベルを測定することもできる。抗Ｉｇ抗体は、抗ＩｇＧ抗体でも、抗ＩｇＭ抗体等でもよいが、好ましくは抗ＩｇＧ抗体である。また、抗ＩｇＧ抗体は好ましくはモノクローナル抗体を用いる。また、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ＶＨＨシングルドメイン抗体（ナノボディ）、ｄｓＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｍｉｎｉｂｏｄｙなどの特異的な抗原結合性を有する断片（抗原結合性断片）を用いることもできる。このような方法の代表例として、ＥＬＩＳＡ等やイムノクロマト法を挙げることができる。抗Ｉｇ抗体の標識には、アルカリフォスファターゼや西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素、金コロイドのような金属コロイド、シリカ粒子、セルロース粒子、磁性粒子、蛍光粒子、着色ポリスチレン粒子および着色ラテックス粒子等が用いられることが多い。金属コロイド粒子、着色ポリスチレン粒子や着色ラテックス粒子等の着色粒子を用いる場合には、これらの標識試薬が凝集することによって着色が生じるので、この着色を測定する。結合レベルを指標として利用する場合、予め存在量が判明している標準溶液を用いて標準曲線を作成することにより、測定値から抗体量を計算することができる。あるいは、表面プラズモン共鳴センサーを用いて、Ｈ．スイス全菌体と被験体由来の検体中の抗体の結合を検出、または測定することもできる。
　上記の免疫測定法の中でも、サンドイッチ法が好ましい。サンドイッチ法自体は免疫測定の分野において周知であり、例えばラテラルフロー式に免疫測定を行うイムノクロマト法やＥＬＩＳＡ法により行うことができる。これらのサンドイッチ法自体はいずれも周知であり、本発明の方法は周知のサンドイッチ法により行うことができる。以下、ＥＬＩＳＡ法について説明する。
　ＥＬＩＳＡ用プレートに、Ｈ．スイス全菌体成分(抗原）を固相化し、該固相化担体にＨ．スイス全菌体に対する抗体を含む可能性がある検体を添加して接触させ、固相化担体上で抗原と抗体の複合体を形成させる。さらに、ヒト抗体に対する特異的抗体（抗Ｉｇ抗体）であって酵素で標識した抗体を添加して接触させ、固相化担体上の抗原と抗体の複合体に抗Ｉｇ抗体を結合させる。次いで、酵素に対する基質を添加し、酵素反応を行わせ、発色を吸光度の測定により測定しプレート上の抗原と抗体のサンドイッチ複合体を検出すればよい。
　抗原抗体反応は４℃～４５℃、好ましくは２０℃～４０℃、さらに好ましくは２５℃～３８℃で行うことができ、また、それぞれの結合反応の反応時間は、１０分～１８時間、より好ましくは１０分～３時間、さらに好ましくは３０分～２時間程度である。
　Ｈ．スイス全菌体成分(抗原）の担体への結合は、物理的吸着、官能基を利用した共有結合等、公知の方法で行うことができる。固相化量は、特に限定されないが担体が96ウェルマイクロタイタープレートの場合、1ウエル当たり数ngから数十μgが望ましい。固相化は固相化すべきＨ．スイス全菌体成分(抗原）の溶液を担体と接触させることにより行うことができる。例えば、Ｈ．スイス全菌体成分(抗原）の溶液をマイクロタイタープレートのウエルに分注し一定時間置くことにより固相化することができる。Ｈ．スイス全菌体成分(抗原）を固相化した後は、アッセイ中の非特異的結合を防ぐためにウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、卵白アルブミン等を含んだブロッキング溶液を用いてブロッキングを行うことが好ましい。
　Ｈ．スイスは広く哺乳動物に感染することから、本発明のＨ．スイスの存在を判定する方法及びＨ．スイスへの感染を判定する方法における被験体は、ヒト、サル、ブタ、ネコ、イノシシ、 イヌ、ウサギ、ネズミ及びヒツジ等の哺乳動物とすることができ、好ましくは、ヒトである。また、好ましくは、胃炎、慢性胃炎、鳥肌胃炎、Ａ型胃炎、 胃ＭＡＬＴリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、胃癌、胃・十二指腸潰瘍、特発性血小板減少紫斑病、機能性ディスペプシア、またはパーキンソン病に罹患しているヒト患者である。また、本発明の方法は、定性的、定量的または半定量的に行うことができる（非特許文献４）。
　本発明のＨ．スイス存在を判定する方法において用いる検体としては、例えば、生検として被験体から採取した組織試料または被験体から採取した液体試料を使用することができる。検体は、本発明の方法の対象として用い得るものであれば特に限定はなく、例えば、組織、血液、血漿、血清、リンパ液、尿、便、漿液、髄液、関節液、眼房水、涙液、唾液またはそれらの分画物若しくは処理物を挙げることができる。本発明のＨ．スイスの存在を判定する方法において抗体を検出対象とする場合には、好ましい検体は、血液、血漿、血清、リンパ液、及び尿である。
　本発明のＨ．スイス全菌体は、本明細書の開示を参照して当業者周知の方法により適宜調製することができる。また、本発明の試薬は、当該技術分野周知の方法により、適宜製造することができる。
　一態様において、本発明は、検体中の、Ｈ．スイス全菌体に対する抗体を検出する方法を含む、当該検体を採取した被験体におけるＨ．スイスの存在を判定する方法に関する。特に、本発明は、Ｈ．スイス全菌体に対する抗体を検出することを含む、被験体におけるＨ．スイスの感染を判定する方法に関する。本方法において、Ｈ．スイス全菌体に対する抗体が検出された検体を採取した被験体は、Ｈ．スイスが存在する、またはＨ．スイスに感染していると判定される。
　本発明の方法が、前記検体中の抗体と、被検試薬との結合を測定することにより行われる場合、判定において「検出された」か否かは、絶対的な検出の有無である必要はなく、他の検体との比較において決定してもよい。すなわち、±の検出結果に基づくものではなく、測定値から検出の有無を決定してもよい。すなわち、本発明の方法において、「検出する」工程は、必要に応じて「測定する」と置き換えることができ、「検出された」か否かは、対象物質の測定値に基づき陰性対象との比較において決定してもよい。例えば、陰性対象、即ち、Ｈ．スイスを含まない検体、またはＨ．スイスに感染していないことが明らかな被験体由来の検体等において目的の物質が検出される場合、検被体の測定値が当該陰性対象の測定値と同等であれば、微量ながら検出されていても、本発明の方法においては「検出されなかった」としてＨ．スイスが存在しない、またはＨ．スイスに感染していないと判定される。一方で、陰性対象の測定値と比較して、被験体の測定値が高い場合には、「検出された」としてＨ．スイスが存在する、またはＨ．スイスに感染していると判定される。よって、本発明の方法において、陰性である対象についてわずかな測定値が認められることは、本発明が予め許容する範囲内である。
　本発明の方法においては、Ｈ．スイス感染者とＨ．スイス非感染者の検体中の抗体の抗体価を測定し、カットオフ値を設定することができる。カットオフ値以上であれば、Ｈ．スイスが存在する、またはＨ．スイスに感染していると判定することが可能である。
　カットオフ値は、例えば、ＲＯＣ（ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｃｕｒｖｅ：受信者動作特性曲線）解析により定めることができる。また、ＲＯＣ解析により本発明の方法による診断精度（感度及び特異度）を決定することができる。ＲＯＣ解析は、Ｈ．スイス感染者から採取した検体とＨ．スイス非感染者から採取した検体について抗Ｈ．スイス抗体を測定し、各カットオフ値での感度及び偽陽性率（１－特異度）を算出し、横軸を（１－特異度）とし、縦軸を感度とした座標上にプロットする。ＲＯＣ解析により診断精度を解析した場合の感度は８０％以上、好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上であり、特異度は７５％以上、好ましくは８０％以上であることが良い。
（Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）に対する抗体の検出）
　本発明は同一の被験体においてＨ．スイス全菌体、または全菌体に含まれる蛋白質と結合する抗体とＨ．ピロリに対する抗体を検出する方法および該方法に用いる試薬も包含する。ここで、Ｈ．ピロリに対する抗体は、Ｈ．ピロリの全菌体のいずれかの構成成分、すなわち菌体成分に対する抗体をいう。例えばＨ．ピロリの検査で陰性だが胃疾患の症状が示される場合は、Ｈ．スイスの感染が原因の可能性が考えられる。同一の被検体からＨ．スイス全菌体と結合する抗体とＨ．ピロリに対する抗体を検出することで、Ｈ．ピロリの感染の有無だけではなく、これまでＨ.ピロリ陰性で見逃されていた被験体に対してもＨ.スイス感染の確認をすることができる。早期に感染を確認することで、適切な治療方針を定めることができる。同一の被験体由来の検体はＨ．ピロリとＨ．スイスで同じであっても、異なってもよい。すなわち、Ｈ．スイス全菌体と結合する抗体の検出とＨ．ピロリに対する抗体の検出は、同じ検体を用いて同時に行ってもよいし、別の時に採取された異なる検体を用いて別途行ってもよい。Ｈ．ピロリに対する抗体の検出は、Ｈ．スイス全菌体対する抗体の検出と同様の方法で行えばよい。
　Ｈ．ピロリの判定においても「検出された」か否かは、絶対的な検出の有無である必要はなく、他の検体との比較において決定してもよい。すなわち、±の検出結果に基づくものではなく、測定値から検出の有無を決定してもよい。すなわち、本発明の方法において、「検出する」工程は、必要に応じて「測定する」と置き換えることができ、「検出された」か否かは、対象物質の測定値に基づき陰性対象との比較において決定してもよい。例えば、陰性対象、即ち、Ｈ．ピロリを含まない検体またはＨ．ピロリに感染していないことが明らかな被験体由来の検体等において目的の物質が検出される場合、被験体の測定値が当該陰性対象の測定値と同等であれば、微量ながら検出されていても、本発明の方法においては「検出されなかった」としてＨ．ピロリが存在しない、またはＨ．ピロリに感染していないと判定される。一方で、陰性対象の測定値と比較して、被験体の測定値が高い場合には、「検出された」としてＨ．ピロリが存在する、またはＨ．ピロリに感染していると判定される。よって、本発明の方法において、陰性である対象についてわずかな測定値が認められることは、本発明が予め許容する範囲内である。
　以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。
（実施例１）ヒト検体の測定
　ＥＬＩＳＡ(ＥｎｚｙｍｅＬｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ ;酵素免疫測定法)を用いた感染者（ヒト）の抗Ｈ.スイス抗体価の測定
Ｈ．スイス培地の組成
ブルセラブロス(ＢＤ ＢＢＬ)　　　　　　　　２．８ ｇ
寒天粉末(ＢＤ ＢＢＬ)　　　　　　　　　　　１．５ ｇ　寒天培地作製の場合に加えるピルビン酸(Ｓｉｇｍａ)　　　　　 ０．１ ｇ
Skirrow Supplement(2 mL/vial, Oxoid)　　　　　　　　　　　０．４ ｍL
Vitox Supplement(10 mL/vial, Oxoid)　　　　　　　　　 　　２ ｍL
Amphotericin B(0.25 mg/mL)　　　　　　　　　　　　　　　　２ ｍL
濃塩酸　　　　　　　　　　　　　　　０．１３５ ｍLによりｐＨを５に調整
非働化牛胎児血清（ＦＢＳ）　　　　　　　　　　　　　　　　２０ ｍL
蒸留水を加えて、全量を１００ ｍＬとした。
　７５ｃｍ２のフラスコに、寒天培地を９ｍＬ加え斜面培地を作製し、－８０℃保存の鳥肌胃炎の患者から分離したＨ．スイス ＳＮＴＷ１０１ｃ株（非特許文献２）を植菌し、液体培地を１２ｍＬ加え、温度３７℃，湿度１００％，微好気条件（５％Ｏ２，１２％ＣＯ２，８３％Ｎ２）で、振とう培養を１週間行った。その後、培養液を遠心分離（１３，４２０ Ｇ ｘ １０分間）により菌体を集めた。菌体はＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）で２回洗浄後、蒸留水に懸濁し、氷冷条件下で５分間の超音波破砕処理を行った（Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ ＩＩ超音波細胞破壊装置（設定Ｈｉｇｈ）で、３０秒間の音波処理と３０秒間の休止を５回繰り返す）。破壊液を「Ｈ．スイス全菌体懸濁液」とした。蛋白質の定量には、ＢＳＡを標準蛋白質としてＢｉｏ－Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙキットを用いた。
　ＨｓｖＡ抗原ペプチドＮｏ．１６は、特許文献２で開示されているＨｓｖＡ（Ｈ．スイスにのみ特異的に存在する外膜蛋白質で、約３０００アミノ酸残基で構成される）の一部である１４アミノ酸残基（配列番号６）を示し、このＮｏ．１６ペプチドに交差する抗体検査が、Ｈ．スイス感染検査において、感度と特異性に優れていることから、Ｎｏ．１６ペプチドは、Ｈ．スイス特異的な抗体産生に関与していると考えられる。
　０．１Ｍ炭酸-重炭酸緩衝液（ｐＨ９．４）に溶解したＨ.スイス全菌体懸濁液（４μｇ/ｍＬ）１００μＬ/ｗｅｌｌを９６－ｗｅｌｌ ＮＵＮＣ ＩｍｍｕｎｏＰｌａｔｅ ＃４３９４５４へ滴下し、４℃に一晩置いた。翌日菌体溶液を廃棄し、ＰＢＳ－Ｔ（０．０５％（Ｖ/Ｖ） Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）２００μＬ/ｗｅｌｌで３回洗浄した。Ｂｌｏｃｋｅｒ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン） １０Ｘ ｉｎ ＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）より調製したブロッキング溶液（１％（Ｖ/Ｖ）ＢＳＡ、ＰＢＳ系ｐＨ７．４）を２００μＬ/ｗｅｌｌ滴下し、３７℃に１時間置いた。ブロッキング溶液を廃棄し、ＰＢＳ－Ｔ ２００μＬ/ｗｅｌｌで３回洗浄した。Ｈ.ピロリ感染者（既存の検査法（尿素呼気試験や抗体検査、抗原検査など）で判定）、およびＨ．スイス感染者（被検者の胃生検体からＤＮＡを調製し、特許文献２に記載のリアルタイムＰＣＲ法あるいは胃生検体からの培養によりＨ．スイス感染を判定）から血清をそれぞれ採取した。また対照として、いずれの菌にも感染していない健常人からの血清を採取した（非感染）。ブロッキング溶液を用いて希釈したヒト血清を５０μＬ/ｗｅｌｌ滴下し、３７℃に１時間置いた。血清溶液を廃棄し、ＰＢＳ－Ｔ ２００μＬ/ｗｅｌｌで３回洗浄した。ブロッキング溶液を用いて１００,０００倍希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ標識二次抗体（Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＡ＋ＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）,Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ, Ｉｎｃ.）を５０μＬ/ｗｅｌｌ滴下し、３７℃で１時間置いた。二次抗体溶液を廃棄し、ＰＢＳ－Ｔ ２００μＬ/ｗｅｌｌで３回洗浄した。ＳｕｐｅｒＢｌｕｅ ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（１－Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）, Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ, Ｉｎｃ.（ＫＰＬ）を５０μＬ/ｗｅｌｌ滴下し青く発色後に、１Ｎ塩酸を５０μＬ/ｗｅｌｌ滴下し黄色へ変色させた。プレートリーダーを用いて４５０ｎｍ（リファレンス波長：６２０ｎｍ～６３０ｎｍ）の吸光度を測定した。
　ヒト血清を用いたＥＬＩＳＡの結果を図１および図２に示す。Ｈ.スイス全菌体では、１８００倍及び３６００倍希釈ヒト血清（Ｈ．スイス陽性３検体（患者Ａ、Ｂ、Ｃ）；Ｈ．ピロリ陽性３検体（患者Ｄ、Ｅ、Ｆ）；非感染３検体（患者Ｇ、Ｈ、Ｉ））について、吸光度１．０以上を陽性、以下を陰性として区別することができた。一方ＨｓｖＡ抗原ペプチドＮｏ．１６では、２００倍、８００倍及び３２００倍希釈ヒト血清（Ｈ．スイス陽性３検体（患者Ａ、Ｂ、Ｃ）；Ｈ．ピロリ陽性３検体（患者Ｄ、Ｅ、Ｆ）；非感染３検体（患者Ｇ、Ｈ、Ｉ））について、陽性と陰性を区別することができなかった。このことから、Ｈ.スイス全菌体は、ＨｓｖＡ抗原ペプチドＮｏ．１６よりも、Ｈ．スイスに対する抗体に極めて高感度且つ特異的であることが示された。よってＨ.スイス全菌体は、血清中の抗体を利用した特異的な感染診断に有用である。
（実施例２）ヒト検体の測定
　ＥＬＩＳＡ(ＥｎｚｙｍｅＬｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ ;酵素免疫測定法)を用いた感染者（ヒト）の抗Ｈ.ピロリ抗体価の測定および抗Ｈ.スイス抗体価の測定
（１）ＥＬＩＳＡ用Ｈ．ピロリ抗原（Ｈ．ピロリ全菌体）の調製
Ｈ．ピロリ　ＴＮ２ＧＦ４株（非特許文献２）は、１０％（Ｖ/Ｖ）牛胎児血清（ＦＣＳ）を含むブルセラブロスで温度３７℃、湿度１００％、微好気条件（５％Ｏ２、１０％ＣＯ２、８５％Ｎ２）で４８時間振とう培養を行った後で、培養液を遠心分離（１３，４２０ Ｇ ｘ １０分間）により菌体を集めた。菌体はＰＢＳリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）で２回洗浄後、蒸留水に懸濁し、氷冷条件下で５分間の超音波破砕処理を行った（Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ ＩＩ超音波細胞破壊装置（設定Ｈｉｇｈ）で、３０秒間の音波処理と３０秒間の休止を５回繰り返す）。破壊液を「Ｈ．ピロリ全菌体懸濁液」とした。蛋白質の定量には、ＢＳＡを標準蛋白質としてＢｉｏ－Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙキットを用いた。
（２）ＥＬＩＳＡ用Ｈ．スイス抗原（Ｈ．スイス全菌体）の調製
Ｈ．スイス培地の組成
ブルセラブロス(ＢＤ ＢＢＬ)　　　　　　　　２.８ ｇ
寒天粉末(ＢＤ ＢＢＬ)　　　　　　　　　　　１.５ ｇ　寒天培地作製の場合に加えるピルビン酸(Ｓｉｇｍａ)　　　　　　 ０．１ ｇ
Skirrow Supplement(2 mL/vial, Oxoid)　　　　　　　　　　　０．４ ｍL
Vitox Supplement(10 mL/vial, Oxoid)　　　　　　　　　　　 ２ ｍL
Amphotericin B(0.25 mg/mL)　　　　　　　　　　　　　　　　２ ｍL
濃塩酸　　　　　　　　　　　　　　　０．１３５ ｍLによりｐＨを５に調整
非働化牛胎児血清（ＦＢＳ）　　　　　　　　　　　　　　　　２０ ｍL
蒸留水を加えて、全量を１００ ｍＬとした。
　７５ｃｍ２のフラスコに、寒天培地を９ｍＬ加え斜面培地を作製し、－８０℃保存の鳥肌胃炎の患者から分離したＨ．スイス ＳＮＴＷ１０１ｃ株（非特許文献２）を植菌し、液体培地を１２ｍＬ加え、温度３７℃，湿度１００％，微好気条件（５％Ｏ２，１２％ＣＯ２，８３％Ｎ２）で、振とう培養振を１週間行った。その後、培養液を遠心分離（１３，４２０ Ｇ ｘ １０分間）により菌体を集めた。菌体はＰＢＳリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）で２回洗浄後、蒸留水に懸濁し、氷冷条件下で５分間の超音波破砕処理を行った（Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ ＩＩ超音波細胞破壊装置（設定Ｈｉｇｈ）で、３０秒間の音波処理と３０秒間の休止を５回繰り返す）。破壊液を「Ｈ．スイス全菌体懸濁液」とした。蛋白質の定量には、ＢＳＡを標準蛋白質としてＢｉｏ－Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙキットを用いた。
　０．０５Ｍ炭酸-重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）に溶解したＨ．ピロリ全菌体懸濁液およびＨ.スイス全菌体懸濁液（４μｇ/ｍＬ）１００μＬ/ｗｅｌｌを９６－ｗｅｌｌ ＮＵＮＣ ＩｍｍｕｎｏＰｌａｔｅ ＃４６８６６７へ滴下し、４℃に一晩置いた。翌日菌体溶液を廃棄し、ＰＢＳ－Ｔ（０．０５％（Ｖ/Ｖ） Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）２５０μＬ/ｗｅｌｌで３回洗浄した。ブロッキング溶液（１％（Ｖ/Ｖ）ＢＳＡ、ＰＢＳ系ｐＨ７．０）を２００μＬ/ｗｅｌｌ滴下し、３７℃に１時間置いた。ブロッキング溶液を廃棄し、ＰＢＳ－Ｔ ２５０μＬ/ｗｅｌｌで３回洗浄した。胃疾患の症状を有するＨ.ピロリ感染者（既存の検査法（尿素呼気試験や抗体検査、抗原検査など）で判定）、および胃疾患の症状を有するＨ．スイス感染者（被検者の胃生検体からＤＮＡを調製し、特許文献２に記載のリアルタイムＰＣＲ法あるいは胃生検体からの培養によりＨ．スイス感染を判定）から血清をそれぞれ採取した。また対照として、いずれの菌にも感染していない健常人からの血清を採取した（非感染）。検体希釈液（０．５％（Ｖ/Ｖ）ＢＳＡ、ＰＢＳ系ｐＨ７．０）を用いて希釈したヒト血清を５０μＬ/ｗｅｌｌ滴下し、３７℃に１時間置いた。血清溶液を廃棄し、ＰＢＳ－Ｔ ２５０μＬ/ｗｅｌｌで３回洗浄した。二次抗体希釈液（１．０％（Ｖ/Ｖ）ＢＳＡ、ＰＢＳ系ｐＨ７．０）を用いて２０，０００倍希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ標識二次抗体（Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）,Ｊａｃｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ, Ｉｎｃ.）を５０μＬ/ｗｅｌｌ滴下し、３７℃で１時間置いた。二次抗体溶液を廃棄し、ＰＢＳ－Ｔ ２５０μＬ/ｗｅｌｌで３回洗浄した。ＴＭＢ Ｏｎｅ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ＨＲＰ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ,（Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ, Ｉｎｃ.）を５０μＬ/ｗｅｌｌ滴下し青く発色後に、０．１７Ｍ硫酸を５０μＬ/ｗｅｌｌ滴下し黄色へ変色させた。プレートリーダーを用いて４５０ｎｍ（リファレンス波長：６２０ｎｍ～６３０ｎｍ）の吸光度を測定した。
　ヒト血清（３，６００倍希釈）を用いたＥＬＩＳＡの結果を図３および図４に示す。Ｈ．ピロリ全菌体では、Ｈ．ピロリ感染群（胃疾患‐Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）の吸光度がＨ．スイス感染群（胃疾患‐Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）または非感染群（健常者‐Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）よりも優位に高い結果が得られた（Ｈ．ピロリ感染群 ｖｓ．Ｈ．スイス感染群 ｏｒ 非感染群：Ｐ＝０．０２０９）。また、Ｈ．スイス全菌体では、Ｈ．スイス感染群（胃疾患‐Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）の吸光度がＨ．ピロリ感染群（胃疾患‐Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）または非感染群（健常者‐Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）よりも優位に高い結果が得られた（Ｈ．スイス感染群 ｖｓ．Ｈ．ピロリ感染群 ｏｒ 非感染群：Ｐ＝０．０２０９）。このことより、同一の被検体に対し抗Ｈ．ピロリ抗体と抗Ｈ．スイス抗体の両方の検査をすることで、Ｈ．ピロリ感染の有無だけではなく、今までＨ．ピロリ陰性で見逃されていた対象についても、Ｈ．スイス感染と診断できることが明らかとなった。
（実施例３）ヒト検体の測定
　ＥＬＩＳＡ(ＥｎｚｙｍｅＬｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ ;酵素免疫測定法)を用いた感染者（ヒト）の抗Ｈ.スイス抗体価の測定
Ｈ．スイス培地の組成
ブルセラブロス(ＢＤ ＢＢＬ)　　　　　　　　２.８ ｇ
寒天粉末(ＢＤ ＢＢＬ)　　　　　　　　　　　１.５ ｇ　寒天培地作製の場合に加えるピルビン酸(Ｓｉｇｍａ)　　　　　　 ０．１ ｇ
Skirrow Supplement(2 mL/vial, Oxoid)　　　　　　　　　　　　０．４ ｍL
Vitox Supplement(10 mL/vial, Oxoid)　　　　　　　　　　　　 ２ ｍL
Amphotericin B(0.25 mg/mL)　　　　　　　　　　　　　　　　　２ ｍL
濃塩酸　　　　　　　　　　　　　　　０．１３５ ｍLによりｐＨを５に調整
非働化牛胎児血清（ＦＢＳ）　　　　　　　　　　　　　　　　　２０ ｍL
蒸留水を加えて、全量を１００ ｍＬとした。
　７５ｃｍ２のフラスコに、寒天培地を９ｍＬ加え斜面培地を作製し、－８０℃保存の鳥肌胃炎の患者から分離したＨ．スイス ＳＮＴＷ１０１ｃ株（国際公開ＷＯ２０１９／２２５６３９号）を植菌し、液体培地を１２ｍＬ加え、温度３７℃，湿度１００％，微好気条件（５％Ｏ２，１２％ＣＯ２，８３％Ｎ２）で、振とう培養振を１週間行った。その後、培養液を遠心分離（１３，４２０ Ｇ ｘ １０分間）により菌体を集めた。菌体はＰＢＳリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）で２回洗浄後、蒸留水に懸濁し、氷冷条件下で５分間の超音波破砕処理を行った（Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ ＩＩ超音波細胞破壊装置（設定Ｈｉｇｈ）で、３０秒間の音波処理と３０秒間の休止を５回繰り返す）。破壊液を「Ｈ．スイス全菌体懸濁液」とした。蛋白質の定量には、ＢＳＡを標準蛋白質としてＢｉｏ－Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙキットを用いた。
　ＨｓｖＡ抗原ペプチド（１１種）は、国際公開ＷＯ２０１９／２２５６３９号で開示されているＨｓｖＡ（Ｈ．スイスにのみ特異的に存在する外膜蛋白質で、約３０００アミノ酸残基で構成される）の一部である１４アミノ酸残基を示す。
ＥＫＫＡＶＱＱＭＥＮＳＮＰＤ（ペプチドＮｏ．１１：配列番号１）、
ＥＫＫＡＶＥＱＭＥＮＳＮＰＤ（ペプチドＮｏ．１１（ＴＫＹ）：配列番号２）、
ＥＫＤＡＶＴＳＬＫＮＳＮＳＧ（ペプチドＮｏ．１１（ＳＨ８）：配列番号３）、
ＥＫＤＡＶＴＳＬＥＮＳＮＳＧ（ペプチドＮｏ．１１（ＳＨ１０）：配列番号４）、
ＮＱＧＴＬＥＦＬＳＮＤＶＳＴ（ペプチドＮｏ．１９（ＴＫＹ）：配列番号５）、
ＴＮＧＱＥＶＳＡＳＩＤＹＮＫ（ペプチドＮｏ．１６：配列番号６）、
ＡＫＬＳＮＦＡＳＮＤＡＬＰＤ（ペプチドＮｏ．２３：配列番号７）、
ＰＴＴＳＳＧＡＳＰＤＳＳＮＰ（ペプチドＮｏ．１０：配列番号８）、
ＮＶＤＮＩＬＮＭＰＳＴＴＳＧ（ペプチドＮｏ．２０：配列番号９）、
ＴＬＴＬＥＧＴＥＴＦＡＱＮＳ（ペプチドＮｏ．８１：配列番号１０）、及び
ＡＤＩＱＳＳＱＴＴＦＡＮＳＶ（ペプチドＮｏ．６１：配列番号１１）。
　０．０５Ｍ炭酸-重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）に溶解したＨ．ピロリ全菌体懸濁液およびＨｓｖＡ抗原ペプチド（各４μｇ/ｍＬ）１００μＬ/ｗｅｌｌを９６－ｗｅｌｌ ＮＵＮＣ ＩｍｍｕｎｏＰｌａｔｅ ＃４６８６６７へ滴下し、４℃に一晩置いた。翌日菌体溶液を廃棄し、ＰＢＳ－Ｔ（０．０５％（Ｖ/Ｖ） Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）２５０μＬ/ｗｅｌｌで３回洗浄した。ブロッキング溶液（１％（Ｖ/Ｖ）ＢＳＡ、ＰＢＳ系ｐＨ７．０）を２００μＬ/ｗｅｌｌ滴下し、３７℃に１時間置いた。ブロッキング溶液を廃棄し、ＰＢＳ－Ｔ ２５０μＬ/ｗｅｌｌで３回洗浄した。Ｈ.ピロリ感染者（既存の検査法（尿素呼気試験や抗体検査、抗原検査など）で判定）、およびＨ．スイス感染者（被検者の胃生検体からＤＮＡを調製し、特許文献２に記載のリアルタイムＰＣＲ法あるいは胃生検体からの培養によりＨ．スイス感染を判定）から血清をそれぞれ採取した。また対照として、いずれの菌にも感染していない健常人からの血清を採取した（非感染）。検体希釈液（０．５％（Ｖ/Ｖ）ＢＳＡ、ＰＢＳ系ｐＨ７．０）を用いて希釈したヒト血清を５０μＬ/ｗｅｌｌ滴下し、３７℃に１時間置いた。血清溶液を廃棄し、ＰＢＳ－Ｔ ２５０μＬ/ｗｅｌｌで３回洗浄した。二次抗体希釈液（１．０％（Ｖ/Ｖ）ＢＳＡ、ＰＢＳ系ｐＨ７．０）を用いて２０，０００倍希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ標識二次抗体（Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）,Ｊａｃｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ, Ｉｎｃ.）を５０μＬ/ｗｅｌｌ滴下し、３７℃で１時間置いた。二次抗体溶液を廃棄し、ＰＢＳ－Ｔ ２５０μＬ/ｗｅｌｌで３回洗浄した。ＴＭＢ Ｏｎｅ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ＨＲＰ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ,（Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ, Ｉｎｃ.）を５０μＬ/ｗｅｌｌ滴下し青く発色後に、０．１７Ｍ硫酸を５０μＬ/ｗｅｌｌ滴下し黄色へ変色させた。プレートリーダーを用いて４５０ｎｍ（リファレンス波長：６２０ｎｍ～６３０ｎｍ）の吸光度を測定した。
　ヒト血清（３，６００倍希釈）を用いたＥＬＩＳＡの結果を図５－１および５－２に示す。Ｈ．スイス全菌体ではＨ．スイス感染者に対して吸光度が最小であった検体でも１．３９１（Ａｂｓ．４５０ｎｍ～６３０ｎｍ）と高い吸光度が得られ、Ｈ．スイスに感染していないＨ．ピロリ感染者および非感染者に対しては吸光度が最大であった検体でも０．５９１（Ａｂｓ．４５０ｎｍ～６３０ｎｍ）に止まり、Ｈ．スイス感染者と非感染者とを明確に区別することができた。一方ＨｓｖＡ抗原ペプチドではいずれの配列ペプチドにおいてもＨ．スイス感染者に対して高い吸光度が得られず、Ｈ．スイスに感染していないＨ．ピロリ感染者や非感染者に対する吸光度と明確に区別することができなかった。このことから、Ｈ．スイス全菌体を用いることにより、ＨｓｖＡ抗原ペプチドを用いた検出系よりも、感度・特異度ともに優れたＨ．スイスの診断ができることが明らかとなった。
　本発明の方法により、Ｈ．ピロリ感染と区別してＨ．スイス感染の高感度な診断が可能となる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
配列番号１～１１：合成

Claims (11)

  1. 　少なくともＨ．スイス全菌体および抗Ｉｇ抗体を含む、被験体由来の検体のＨ．スイス全菌体と結合する抗体を検出する試薬。
  2. 　被験体が哺乳動物であることを特徴とする、請求項１記載の試薬。
  3. 　検体が血液由来であることを特徴とする、請求項１または２に記載の試薬。
  4. 　さらに、Ｈ．ピロリの菌体成分またはＨ．ピロリ菌体成分に対する抗体を含む、被験体由来の検体のＨ．ピロリと結合する抗体またはＨ．ピロリ菌体成分の抗原も検出することを特徴とする、請求項１～３のいずれか１項に記載の試薬。
  5. 　ＥＬＩＳＡまたはイムノクロマト用試薬である、請求項１～４のいずれか１項に記載の試薬。
  6. 　以下の工程を含む、被験体由来の検体の抗Ｈ．スイス全菌体と結合する抗体を検出することを特徴とする方法：
    （ａ）被験体由来の検体をＨ．スイス全菌体と接触させる工程、および
    （ｂ）Ｈ．スイス全菌体と結合した、前記検体中の抗体を検出する工程。
  7. 　被験体が哺乳動物であることを特徴とする、請求項６記載の方法。
  8. 　検体が血液由来であることを特徴とする、請求項６または７に記載の方法。
  9. 　さらに、以下の工程を含む、被験体由来の検体のＨ．ピロリと結合する抗体も検出することを特徴とする、請求項６～８のいずれか１項に記載の方法：
    （ａ）被験体由来の検体をＨ．ピロリ菌体成分と接触させる工程、および
    （ｂ）Ｈ．ピロリ菌体成分と結合した、前記検体中の抗体を検出する工程。
  10. 　さらに、以下の工程を含む、被験体由来の検体のＨ．ピロリ菌体成分の抗原も検出することを特徴とする、請求項６～８のいずれか１項に記載の方法：
    （ａ）被験体由来の検体をＨ．ピロリ菌体成分に対する抗体と接触させる工程、および
    （ｂ）Ｈ．ピロリ菌体成分に対する抗体と結合した、前記検体中のＨ．ピロリ菌体成分の抗原を検出する工程。
  11. 　請求項１～５のいずれか１項に記載の試薬を用いた測定および／または請求項６～１０のいずれか１項に記載の方法により抗体が検出された被験体をＨ．スイスに感染していると判定する、Ｈ．スイスの感染の検出方法。
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