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WO2023038020A1 - 核酸配列改変用組成物および核酸配列の標的部位を改変する方法 - Google Patents

核酸配列改変用組成物および核酸配列の標的部位を改変する方法 Download PDF

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WO2023038020A1
WO2023038020A1 PCT/JP2022/033375 JP2022033375W WO2023038020A1 WO 2023038020 A1 WO2023038020 A1 WO 2023038020A1 JP 2022033375 W JP2022033375 W JP 2022033375W WO 2023038020 A1 WO2023038020 A1 WO 2023038020A1
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WO
WIPO (PCT)
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nucleic acid
acid sequence
modifying
region
composition
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2022/033375
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English (en)
French (fr)
Inventor
郁郎 中村
壮 眞壁
雄一 小橋
康裕 森泉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bex Co ltd
Chiba University NUC
Original Assignee
Bex Co ltd
Chiba University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bex Co ltd, Chiba University NUC filed Critical Bex Co ltd
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Priority to CN202280059262.8A priority patent/CN117916370A/zh
Priority to EP22867342.2A priority patent/EP4400586A4/en
Publication of WO2023038020A1 publication Critical patent/WO2023038020A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
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    • C07K2319/85—Fusion polypeptide containing an RNA binding domain
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    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPR]

Definitions

  • compositions for modifying nucleic acid sequences relate to compositions for modifying nucleic acid sequences and methods for modifying target sites of nucleic acid sequences.
  • a zinc finger nuclease which is a combination of a zinc finger DNA binding domain (zinc finger array) and a non-specific DNA cleavage domain (nuclease domain)
  • ZFN zinc finger nuclease
  • the host plant A method of recombination at a target gene locus in DNA in cells or insect cells (see Patent Document 1, FIG.
  • Transcription activator-like (TAL) effector which is a DNA-binding module possessed by plant pathogens Xanthomonas genus and a DNA endonuclease (nuclease domain) are used to cleave and modify a target gene at a site within or adjacent to a specific nucleotide sequence
  • TAL Transcription activator-like effector
  • Patent Document 1 requires two domains (zinc finger arrays) that recognize genomic DNA, each of which is formed of protein.
  • Each of the two domains that recognize genomic DNA is designed to recognize the 3' side from the target site of double-stranded DNA. Therefore, when modifying the target site of genomic DNA, there is a problem that it is necessary to design a pair of zinc finger arrays with different sequences.
  • the method described in Patent Document 2 has the advantage that the direction of the domain (TAL effector) that recognizes genomic DNA is 5' from the target site of the double-stranded DNA. It is different from the method described in 1.
  • the method described in Patent Document 1 there is the problem that it is necessary to design a pair of TAL effectors with different sequences when modifying the target site of genomic DNA.
  • CRISPR/Cas9 has attracted attention as a technique for modifying the target site of genomic DNA (see Patent Documents 3 to 6).
  • CRISPR/Cas9 as shown in Figure 2, is composed of a guide RNA having a sequence complementary to the DNA to be modified and a Cas9 protein that forms a complex with the guide RNA.
  • CRISPR/Cas9 guide RNA should form a complementary pair by recognizing only one strand of the double-stranded DNA. Therefore, unlike Patent Documents 1 and 2, there is an advantage that only one guide RNA is required to guide the nuclease domain that modifies the target site of the genomic DNA.
  • the method using CRISPR / Cas9 described in Patent Documents 3 to 6 is, as shown in FIG. is cleaved by the Cas9 endonuclease.
  • the method using CRISPR/Cas9 has the problem that the target site of genomic DNA is restricted to the vicinity of the PAM sequence. It is also known to modify RNA by using Cas13, but even in that case, there is a problem that the target site is restricted to the vicinity of the PFS (Protospacer Flanking Site) sequence.
  • PFS Protospacer Flanking Site
  • the disclosure in the present application was made to solve the above problems, and as a result of intensive research, (1) an RNA containing a hybridizing region and a recognition region, and (2) a complex formed with the recognition region It was newly found that the nucleic acid sequence can be modified without depending on the PAM sequence and the PFS sequence by using a fusion protein that Thus, it is an object of the disclosure in this application to provide compositions for modifying nucleic acid sequences and methods for modifying target sites in nucleic acid sequences that are independent of PAM and PFS sequences.
  • a composition for modifying a nucleic acid sequence comprising RNA and a fusion protein
  • RNA is a hybridizing region capable of hybridizing to a sequence 5′ or 3′ to the target site of the nucleic acid sequence
  • a guide region that guides the fusion protein including the guide region comprises a recognition region that forms a complex with the fusion protein
  • the fusion protein is a binding domain that recognizes the RNA recognition region and forms a complex with the recognition region (except that the binding domain contains the RNA recognition region of the Cas protein group); a modification domain that modifies a target site of a nucleic acid sequence
  • a composition for modifying a nucleic acid sequence comprising: (2) The composition for modifying a nucleic acid sequence according to (1) above, wherein the fusion protein comprises a linker sequence connecting the binding domain and the modification domain.
  • the binding domain comprises the RNA binding region of Nova;
  • a composition for modifying a nucleic acid sequence comprising: (9) RNA for forming the composition for modifying a nucleic acid sequence according to any one of (1) to (7) above. (10) A nucleic acid that serves as a template for transcription of RNA for forming the composition for modifying a nucleic acid sequence according to (8) above. (11) A fusion protein for forming the composition for modifying a nucleic acid sequence according to any one of (1) to (7) above.
  • a method of modifying a target site in a nucleic acid sequence comprising: an introduction step of introducing the composition for modifying a nucleic acid sequence according to any one of (1) to (8) above into a cell; a modification step in which the modification domain modifies a target site of the nucleic acid sequence; A method of modifying a target site in a nucleic acid sequence.
  • the nucleic acid according to (13) above which includes, prior to the introducing step, a step of identifying a hybridizing region capable of hybridizing to a sequence on the 5' side or 3' side of the target site of the nucleic acid sequence.
  • a method for modifying the target site of a sequence (15) one hybridizing region is required to modify one target site; A method for modifying the target site of the nucleic acid sequence according to (13) or (14) above.
  • a guide region designing step of designing at least the number of recognition regions and RNA sequences so that a complex can be formed with the number of fusion proteins required for modification of the nucleic acid sequence Before the introduction step, a guide region designing step of designing at least the number of recognition regions and RNA sequences so that a complex can be formed with the number of fusion proteins required for modification of the nucleic acid sequence.
  • composition for modifying a nucleic acid sequence and the method for modifying a target site of a nucleic acid sequence disclosed in the present application can modify a nucleic acid sequence independently of the PAM and PFS sequences.
  • FIG. 1A is a schematic diagram showing an outline of a genome editing method using zinc finger nuclease.
  • FIG. 1B is a schematic diagram showing an outline of a genome editing method using TALENs.
  • Figure 2 is a schematic diagram showing an overview of the genome editing method using CRISPR / Cas9.
  • 3A and 3B are schematic diagrams showing an outline of Modification Composition 1.
  • FIG. 4A and 4B are schematic diagrams outlining variations of the modifying composition 1.
  • FIG. FIG. 5 is a diagram showing an outline of the second embodiment.
  • FIG. 6 is a drawing substitute photograph, which is an electrophoresis photograph of Example 2.
  • FIG. FIG. 7 is a photograph substituting for a drawing, which is an electrophoresis photograph for confirming the band indicated by the arrow in lane 3 of Example 2.
  • composition for modification a composition for modifying a nucleic acid sequence
  • method for modification a method for modifying a target site of a nucleic acid sequence
  • FIGS. 3 and 4 are schematic diagrams showing an outline of Modification Composition 1.
  • FIG. 4A and 4B are schematic diagrams outlining variations of the modifying composition 1.
  • FIG. 3 the description common to FIGS. 3A and 3B may be simply referred to as "FIG. 3".
  • the modification composition 1 contains RNA2 and fusion protein 3.
  • the RNA 2 guides the hybridizing region 21 that can hybridize to the genomic DNA 4 on the 5′ side of the target site (modification site) 41 of the genomic DNA 4 having a double helix structure, and the fusion protein 3.
  • a guide region 22 is included.
  • the hybridizing region 21 hybridizes to the genomic DNA 4 on the 5′ side of the target site 41 .
  • the hybridizing region 21 may be formed so as to hybridize to the genomic DNA 4 on the 3′ side of the target site 41 .
  • the guide region 22 is arranged adjacent to the hybridization region 21 .
  • Guide region 22 also includes recognition region 23 that forms a complex with fusion protein 3 by recognizing binding domain 31 of fusion protein 3 .
  • 3 and 4 show an example in which the target to be modified by the modification composition 1 is the genomic DNA 4.
  • the modifying composition 1 may modify the nucleic acid sequence RNA.
  • RNA4 an example in which the target to be modified by the modifying composition 1 is the genomic DNA 4 will be described. The same is true for RNA4.
  • "genomic DNA 4" should be replaced with "RNA 4".
  • the fusion protein 3 contains a binding domain 31 that forms a complex with the recognition region 23 of RNA2, and a modification domain 32 that modifies the target site 41 of genomic DNA4.
  • the length of the hybridizing region 21 is not particularly limited as long as it is a length that allows positioning of RNA2 on the 5' side or 3' side of the target site 41 of the genomic DNA 4. If the hybridizing region 21 is short, there is a risk of off-targeting. Therefore, the length should be appropriately set while considering the risk of off-target. Although not limited, for example, it may be 15 bp or more, 20 bp or more, 25 bp or more, 30 bp or more, 35 bp or more, 40 bp or more, or 45 bp or more. On the other hand, from the viewpoint of the positioning of RNA2, the length of the hybridizing region 21 is not particularly limited, but the longer the hybridizing region 21, the higher the production cost of RNA2.
  • the length of the guide region 22 may be appropriately adjusted in consideration of the size of the fusion protein 3, the distance from the end of the hybridization region 21 to the target site 41, and the like.
  • Guide region 22 may also include a stem loop.
  • guide region 22 includes two recognition regions 23 to modify target site 41 with a pair of fusion proteins 3 (more specifically, a pair of modification domains 32). If the guide region 22 includes stem loops, the two recognition regions 23 can be placed close to each other sterically.
  • two stem loops may be formed such that the recognition region 23 is located in the loop portion. The number of stem loops and the portion where the recognition region 23 is arranged are merely examples.
  • the number of stem loops may be one, three, or four as long as the pair of modification domains 32 are arranged in a positional relationship that allows modification of the target site 41 .
  • the recognition region 23 may be arranged on the stem, or may be arranged so as to straddle the stem and the loop.
  • the length between the recognition regions 23 (the length of a portion of the guide region 22) may also be appropriately adjusted while considering the size of the fusion protein 3 and the like.
  • the RNA sequence of the recognition region 23 should be determined based on the type of the fusion protein 3 so that it can form a complex with the binding domain 31 of the fusion protein 3. A combination of the RNA sequence of the recognition region 23 and the binding domain 31 will be described later.
  • FIG. 3A shows an example in which the target site 41 is modified by arranging the modification domain 32 of the pair of fusion proteins 3 at the target site 41 of the genomic DNA 4 . Therefore, the guide area 22 includes two recognition areas 23 .
  • a pair of modifying compositions 1 are used to hybridize a pair of hybridizing regions 21 to genomic DNA 4 such that the modifying domain 32 faces the target site 41. good too. Since it is necessary to design two hybridization regions 21, the cost is increased, but it is technically possible.
  • one recognition region 23 may be included in the guide region 22 as shown in FIG. 3B.
  • the guide region 22 may include a stem loop. Further, the recognition region 23 may be arranged in the loop portion, may be arranged in the stem portion, or may be arranged so as to straddle the stem and the loop. Note that FIGS. 3A and 3B show examples in which the recognition area 23 is part of the guide area 22 . Alternatively, the length of recognition area 23 may match the length of guide area 22 . In this specification, the guide region 22 includes the recognition region 23 when the recognition region 23 is part of the guide region 22, and when the length of the recognition region 23 matches the length of the guide region 22, is meant to include any of
  • Fusion protein 3 includes (1) a binding domain 31 that recognizes a specific sequence (recognition region 23) contained in guide region 22 of RNA 2 and forms a complex with recognition region 23, and (2) a target site of genomic DNA 4.
  • the modified domain 32 that modifies 41 is included.
  • the term "fusion protein” refers to a protein that is artificially synthesized to contain the binding domain 31 and the modified domain 32 as described above, and does not exist in nature.
  • a protein that can form a complex with the recognition region 23 and a protein that modifies the genomic DNA 4 may be fused.
  • fusion protein 3 is produced using a known protein, it is not necessary to include the entire amino acid sequence of the known protein.
  • RNA2 For example, in the case of a protein that binds to the recognition region 23 of RNA2, only the region that binds to the recognition region 23 may be used. Moreover, in the case of a protein that modifies the genomic DNA 4, only the region having the function of modifying the genomic DNA 4 may be used.
  • Fusion protein 3 may be produced by a known method.
  • a nucleic acid sequence may be designed based on the amino acid sequence of the designed fusion protein 3 and synthesized using a cell-free protein synthesis system.
  • a nucleic acid sequence including a promoter and the like may be designed, the designed nucleic acid sequence may be introduced into a plasmid, and the fusion protein 3 may be synthesized using cells.
  • the fusion protein 3 is not particularly limited as long as it includes the binding domain 31 and the modification domain 32, and any sequence may be added as necessary.
  • a linker sequence for connecting the binding domain 31 and the modification domain 32, and a nuclear localization sequence (nuclear localization signal/sequence: NLS) as a marker for transporting the fusion protein 3 to the nucleus of the cell are added.
  • NLS nuclear localization sequence
  • a known sequence may be used for the NLS.
  • modified domain 32 may be arranged on the downstream side. Further, when the fusion protein 3 is formed in the order of the modified domain 32 ⁇ binding domain 31 from the upstream side, the NLS is located upstream of the modified domain 32, between the modified domain 32 and the binding domain 31, and downstream of the binding domain 31. should be placed.
  • altering the target site 41 of the nucleic acid sequence means that the target site 41 of the double-stranded DNA 4 or single-stranded (double-stranded) RNA 4 to a state that is physically and/or functionally different from its original state. In other words, it means that the modification domain 32 has the function of making the nucleic acid sequence into the "different state”.
  • the modification domain 32 that makes the target site 41 of the genomic DNA 4 functionally different is not limited, but includes, for example, those having the following functions. (6) transcription activator (7) transcription repressor
  • modified domains 32 More specific examples of the modified domains 32 described in (1) to (7) above are shown below. Enzymes described in patent documents and non-patent documents may be used as the modification domain 32 as they are. Alternatively, a partial region may be deleted or added as long as the described enzyme functions to modify the genomic DNA 4 .
  • the RuvC-like domain has lost nuclease activity, so the D10A mutant acts as a nickase, producing single-stranded DNA breaks (nicks) rather than double-stranded DNA breaks.
  • double-nicking method two sgRNAs and a Cas9 nickase act against a target sequence in double-stranded DNA to guide each strand.
  • HNH nuclease domain H840A point mutation see the literature described in (2-1) above. It is also available from Waken Pharmaceutical Co., Ltd.
  • the enzyme described in (2-1) above cleaves only target strands of DNA, whereas the enzyme described in (2-2) cleaves non-target strands.
  • transposase domain integrase domain, recombinase domain, resolvase domain, invertase domain, protease domain, DNA methyl transferase domain, DNA hydroxymethylase domain, DNA demethylase domain, histone acetylase domain, histone deacetylase domain, nuclease domain, repressor domain, activator domain, nuclear localization signal domain, transcription-regulatory protein (or transcription complex body recruitment) domains, cell uptake activity-related domains, nucleic acid binding domains, antibody presenting domains, histone modifying enzymes, recruiters of histone modifying enzymes; inhibitors of histone modifying enzymes, histone methyltransferases, histone demethylases, histone kinases, histone phosphatases, histone ribosylase, histone deribosylase, histone ubiquitinase, histone de
  • enzymes capable of forming modification domains 32 include, for example, the following types.
  • modified domain 32 that makes the target site 41 of RNA 4 functionally different is not limited, but for example, Adenosine Deaminase Acting on RNA (ADAR), which is a double-stranded RNA-specific adenosine deaminase ( Marina et al., "Evaluation of Engineered CRISPR-Cas-Mediated Systems for Site-Specific RNA Editing", Cell Reports 33, 108350, November 3, 2020).
  • ADAR Adenosine Deaminase Acting on RNA
  • the sequences of the binding domain 31 and the recognition region 23 are not particularly limited as long as they are combinations of protein and RNA sequences that can recognize the recognition region 23 of RNA2 and form a complex with the recognition region 23 . Therefore, when the guide region 22 includes two or more recognition regions 23, it may include the recognition regions 23 having the same RNA sequence for the same binding domain 31, or may include the recognition regions 23 having different RNA sequences. . For the same reason, when the guide region 22 contains two or more recognition regions 23, the same binding domain 31 may form a complex with the same RNA sequence (recognition region 23), or different binding domains 31 may form a complex.
  • the sequences of the binding domain 31 and the recognition region 23 are not limited, but include, for example, the following combinations.
  • Nova: 5'-UCAY-3' K. Jensen et al., "The tetranucleotide UCAY directs the specific recognition of RNA by the Nova K-homology 3 domain", PNAS, 2000, 97 (11), 57 -5745.
  • this paper may be referred to as “Non-Patent Document 1”.
  • the 5'-UCAY-3' is formed in the loop portion of the stem loop.
  • FIG. 6 see Table 1 below).
  • TLS 5'-GGUG-3' (Wang et al., "Induced ncRNAs allosterically modify RNA-binding proteins in cis to inhibit transcription", Nature, Vol 454, 3, July 2008)
  • the proteins that bind to RNA include the following proteins. Since it is known to bind to RNA, the RNA sequence may be appropriately designed. (4)RNG105(N. Shiinaet et al.,“A Novel RNA-Binding Protein in Neuronal RNA Granules:Regulatory Machinery for Local Translation”,The Journal of Neuroscience,April 27,2005 ⁇ 25(17):4420-4434)
  • the Cas protein group Cas9 and the like recognize the PAM sequence of genomic DNA4. It is also known that PAM sequences differ according to the bacterial species from which the nuclease is derived and the type/subtype of the nuclease (see Table 2 below). Furthermore, the Cas protein family, Cas13, is known to recognize PFS sequences in RNA. Therefore, the binding domain 31 disclosed in the present application is excluded from including a protein that recognizes and binds to the PAM sequence and the PFS sequence, and a region of the protein that recognizes the PAM sequence or the PFS sequence. Alternatively, it may be said that the binding domain 31 excludes the RNA recognition region of the Cas protein group.
  • the Cas protein group includes, for example, Cas9, Cpf1, Cas3, Cas8a-c, Cas10, Cse1, Csy1, Csn2, Cas4, Csm2, or Cm5.
  • the region that modifies the nucleic acid sequence may be included as the modification domain 32 .
  • RNA2 includes a hybridization region 21 that hybridizes with genomic DNA4 or RNA4 and a guide region 22 .
  • Guide region 22 includes one or more recognition regions 23 that form a complex with fusion protein 3 . Therefore, as shown in FIGS. 3A and 3B, there may be only one hybridizing region 21 regardless of whether the modification domain 32 has the modification function of a monomer or a dimer (or more). Therefore, the design of the hybridization region 21 is facilitated.
  • CRISPR / Cas9 described in Patent Documents 3 to 6 the target site 41 of genomic DNA 4 is restricted near the PAM sequence. Also in the case of Cas13, target site 41 of RNA4 is restricted to the vicinity of the PFS sequence.
  • the modification composition 1 according to the first embodiment can determine the target site 41 without being restricted by the sequence of the genomic DNA 4 or RNA 4 .
  • the number of recognition areas 23 included in the guide area 22 can be arbitrarily designed. Therefore, since the guide region 22 can be designed according to the type of the fusion protein 3, the degree of freedom in designing the guide region 22 is improved.
  • the fusion protein 3 can be formed by selecting and fusing the region that functions as the binding domain 31 and the region that functions as the modification domain 32, unlike the natural protein (and partially modified protein). Therefore, the size of fusion protein 3 can be reduced compared to conventional natural proteins (and partially modified proteins). Furthermore, the degree of freedom in designing the fusion protein 3 is improved.
  • Modification 1 of composition for modifying nucleic acid sequence Modified Example 1 of the modifying composition 1 according to the embodiment will be described with reference to FIGS. 4A and 4B.
  • the hybridizing region 21 and the guide region 22 of RNA2 are directly connected.
  • RNA2 contains a first complementary region 24 connected to one end of the hybridizing region 21 .
  • the hybridization region 21 and the guide region 22 are indirectly connected.
  • the modification composition 1 since the hybridization region 21 and the guide region 22 are directly connected, it is necessary to integrally form the RNA2.
  • Modification 1 only the hybridizing region 21 and the first complementary region 24 need to be designed according to the target site 41 . Therefore, cost reduction can be achieved by mass-producing the guide region 22 and the fusion protein 3 .
  • the operator who provides the modification composition 1 can provide only the guide region 22 and the fusion protein 3, and the user can design and synthesize the hybridization region 21 and the first complementary region 24. Experiments can also be undertaken.
  • the composition for modification 1 is formed by the RNA 2 and the fusion protein 3 .
  • a nucleic acid that serves as a template for transcription of RNA2 hereinafter sometimes referred to as "RNA2 template”
  • template for fusion protein 3 a nucleic acid that serves as a template for translating fusion protein 3
  • the template for RNA2 and the template for fusion protein 3 can be DNA or RNA.
  • the template for RNA2 should at least contain a sequence for transcription of RNA2.
  • the template for fusion protein 3 may contain at least a sequence for translating fusion protein 3 .
  • the template for RNA2 and the template for fusion protein 3 may contain a promoter and an untranslated region for promoting translation, if necessary.
  • RNA2 and the template for fusion protein 3 are DNA
  • a promoter for RNA transcription is ligated upstream of the template for RNA2
  • a promoter for protein translation is ligated upstream of the template for fusion protein 3. do.
  • RNA2 template and the fusion protein 3 template are introducing the RNA2 template and the fusion protein 3 template into cells, (1) RNA2 is transcribed from the RNA2 template, (2) mRNA is transcribed from the fusion protein 3 template, and transcription is performed. Fusion protein 3 is translated from the resulting mRNA, and (3) modification composition 1 is formed in the cell.
  • the template for RNA2 and the template for fusion protein 3 are DNA, they may be inserted into the same plasmid vector together with the promoter, or may be inserted into different plasmid vectors.
  • the template for RNA2 and the template for fusion protein 3 may be inserted into a DNA-type virus such as adeno-associated virus (AAV) together with a promoter.
  • AAV adeno-associated virus
  • RNA virus such as a lentivirus
  • DNA is first reverse transcribed from the RNA2 template and the fusion protein 3 template inserted into the RNA virus introduced into the cell. Then, RNA2 is transcribed from the reverse-transcribed DNA, mRNA is transcribed from the reverse-transcribed DNA, and fusion protein 3 is translated from the mRNA.
  • the template for fusion protein 3 may be mRNA. If the template for fusion protein 3 is mRNA, it is not necessary to ligate a promoter to the mRNA. By introducing the mRNA into the cell, the fusion protein 3 can be directly translated from the mRNA within the cell.
  • RNA2 and fusion protein 3 differs depending on the type of template nucleic acid.
  • the nucleic acid serving as a template for transcription of RNA includes not only a template that directly transcribes RNA2 (template DNA), but also a template that indirectly transcribes RNA2 (template RNA) is also a concept.
  • the template nucleic acid is a template (mRNA) that directly translates the fusion protein 3, and also indirectly translates the fusion protein 3.
  • the concept also includes a template (template DNA, template RNA).
  • the template for RNA 2 and the template for fusion protein 3 are used for the type (template DNA, template RNA, mNRA) and form (insertion into vector or virus) when the composition for modification 1 is finally formed in the cell. presence or absence) may be the same or different.
  • Promoters for RNA transcription, promoters for protein translation, plasmids, DNA-type viruses, and RNA-type viruses are not particularly limited as long as they have the above functions, and known ones may be used.
  • promoters for RNA transcription include, but are not limited to, U6 promoter.
  • Promoters for protein translation include CMV Promoter and the like. Plasmids include pcDNA3.1 for mammals; pBluescript II KS and pET series for bacteria; pPIC series for yeast;
  • DNA-type viruses include the adeno-associated virus (AAV) described above.
  • RNA-type viruses include the above lentiviruses and the like.
  • the modifying composition 1 according to Modified Example 2 may be rephrased as a composition for forming a modifying composition.
  • Modification 3 of composition for modifying nucleic acid sequence Next, Modified Example 3 of the modifying composition 1 according to the embodiment will be described.
  • the composition for modification 1 is formed by combining the RNA 2 and the fusion protein 3 .
  • the composition for modification 1 is formed by combining the RNA2 template and the fusion protein 3 template.
  • Variation 3 only one of the combination elements forming Modification Composition 1 is provided, and the separately provided elements are combined in use to form Modification Composition 1. You may
  • RNA2 and fusion protein 3 have already been described in modification composition 1 and modification 1 according to the embodiment, and the template for RNA2 and the template for fusion protein 3 have already been described in modification 2. Therefore, specific descriptions will be omitted to avoid duplicate descriptions.
  • the modification method comprises an introduction step of introducing the modification composition 1 described in the modification composition embodiment and modifications into cells, a modification step of modifying the target site 41 of the nucleic acid sequence 4 with the modification domain 32, and a modification step. including.
  • the cell is not particularly limited as long as it contains the nucleic acid sequence 4.
  • examples include human or non-human animal cells; plant cells; insect cells; microbial cells such as E. coli, yeast, and fungi;
  • the cells may be single cells, or aggregates of cells (spheroids).
  • the term "cell” includes both concepts of a single cell and aggregates of multiple cells.
  • the introduction step is not particularly limited as long as the composition for modification 1 can be introduced into cells, and a known method such as electroporation may be used. Moreover, when a DNA virus or an RNA virus is used as the modification composition according to Modification 2, cells may be infected by a known method. In addition, when the composition for modification 1 according to modification 2 is used, a step of forming RNA 2 and fusion protein 3 in the cell is included after the introduction step.
  • the hybridizing region 21 of the modification composition 1 introduced into the cell hybridizes to the nucleic acid sequence 4, and the modification domain 32 modifies the target site 41 of the nucleic acid sequence 4.
  • one or two hybridization regions 21 may be required to modify one target site 41 .
  • the modifying composition 1 disclosed in the present application can contain two or more recognition regions 23 in one guide region 22 . Therefore, the recognition region 23 can be designed so that even one hybridizing region 21 necessary for modifying one target site 41 can form a complex with the number of fusion proteins 3 necessary for modifying the nucleic acid sequence 4. . If only one hybridization region 21 is required to modify one target site 41, manufacturing costs can be reduced and the convenience of experiments can be improved.
  • the modification method may include, prior to the introduction step, a step of identifying a hybridizing region 21 that can hybridize to the sequence on the 5' side or 3' side of the target site 41 of the nucleic acid sequence 4.
  • the entire RNA2 may be produced including the hybridizing region 21 specified in the step of specifying the hybridizing region.
  • the user may prepare the hybridizing region 21 and the first complementary region 24 and combine them with the separately provided guide region 22 and fusion protein 3 to prepare the modification composition 1 and carry out the modification method. good.
  • the modification method includes a guide region designing step of designing at least the number of recognition regions 23 and RNA sequences so that complexes can be formed with the number of fusion proteins 3 required for modification of the nucleic acid sequence 4 before the introduction step. It's okay.
  • the guide region designing step may include designing a linker sequence that connects two or more recognition regions 23, if necessary. It is not known that one guide region 22 forms a complex with two or more fusion proteins 3 and that modification domains 32 contained in the fusion proteins 3 modify the nucleic acid sequence 4 . Therefore, the guide area design process is a new process.
  • DNA has a self-repair function. Therefore, when the nucleic acid sequence 4 is genomic DNA, a step of introducing DNA into the target site 41 may be carried out after carrying out the modification step, if necessary.
  • the modification domain 32 is an enzyme that cleaves the genomic DNA 4, such as FokI
  • the modification step cleaves the target site 41 of the genomic DNA 4 and modifies it into a physically different state.
  • genomic DNA4 may lose its function (knockout).
  • the genomic DNA 4 after cutting may repair the cut site due to its self-repair function.
  • ssODN ssDNA
  • dsDNA dsDNA
  • a desired DNA fragment can be inserted into the cleavage site when repairing target site 41 of genomic DNA 4 cleaved in the modification step.
  • a desired function can be added to genomic DNA4 by inserting a desired DNA fragment (knock-in).
  • a modification composition 1 was prepared by the following procedure. (1) Production of fusion protein (FokI-Nova) As fusion protein 3, FokI-Nova was produced. The amino acid sequence of FokI-Nova is shown in SEQ. ID. 1 (SEQ ID NO: 1). SEQ. ID.
  • the underlined part (“Q” in the 7th column from the right of the 1st row to “F” in the 11th column from the left of the 5th row) indicates the cleavage region of FokI (modified domain 32)
  • the double underlined part (“K” in the 28th column from the left of the 5th row to "G” in the 8th column from the right of the 6th row) indicates the RNA binding region (binding domain 31) of NOVA
  • the bold underlined part (the right of the 6th row) "P" on the 3rd column to "V” on the 4th column from the left of the 7th row) indicates the NLS.
  • Others are linker sequences and the like.
  • the supernatant was recovered as a soluble fraction by centrifugation. 1 ml of resin was placed in the column and allowed to settle. After draining the stock solution, 10 bed volumes of equilibration buffer was added to equilibrate the resin. The soluble fraction was applied to the column and allowed to bind the His-Tag fusion protein. The column was washed with 8 bed volumes of equilibration buffer. The column was washed with 7 bed volumes of equilibration buffer (containing 10 mM Imidazole). The His-Tag fusion protein was eluted with an elution buffer of 3bed volumes. An equal amount of the purified protein was mixed with EzApply (ATTO) and subjected to heat treatment at 95° C.
  • EzApply ATTO
  • ⁇ Reagent> ⁇ Protein extraction reagent: BugBuster Protein Extraction Reagent (Novagen) ⁇ Purified resin: TALON Metal Affinity Resin (Takara Bio) - Equilibration buffer: 50 mM sodium phosphate, 300 mM sodium chloride; pH 7.4 - Elution buffer: 50 mM sodium phosphate, 300 mM sodium chloride, 150 mM imidazole; pH 7.4 - Electrophoresis buffer: 25 mM Tris pH 8.3, 192 mM Glycine, 0.1% SDS
  • RNA2 was produced by the following procedures.
  • the pCR2.1 vector was ligated with XbaI and SpeI by a conventional method.
  • SEQ. ID. The underlined portions of 4 and 5 are the sequences (both ends of the hybridizing region 21) forming a complementary pair with the DNA sequence 4 encoding GFP shown in FIG. Note that in FIG. 5, due to space limitations, the "ID.” of the sequence number is omitted.
  • (b) guide area 22 UCAY5P (5′-TCGGATCCGCAGTCTCATCATCATTTCATTTGTGTTCGTTAGCACATTGGGCAGTCTCAT-3′: SEQ.ID.6) and UCAY3P (5′-GAAGATCTCAAATGAAAATGATGATGAGACTGCCCAATGTGCTAACGAACAAAATGAAA-3′:SEQ.ID.7) were annealed and annealed.
  • the template annealed at the BamHI site was treated with restriction enzymes with BamHI and BglII, and ligation was performed on the downstream side of (a) above by a conventional method.
  • RNA2 (c) Synthesis of RNA2
  • the pCR2.1 vector was subjected to restriction enzyme treatment with HindIII, and RNA was synthesized using the in vitro Transcription T7 Kit.
  • RNA2 is shown in FIG. 6 ⁇ 2-glyR (GCAGUCUCAUCAUCAUUUUCAUUUUG: SEQ.ID.8) via a linker.
  • FIG. 5 is a diagram showing an outline of the second embodiment.
  • the GFP PCR product shown in 9 was obtained.
  • - Fw primer (5'-GTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3': SEQ.ID.10)
  • Rv primer 5'-CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3': SEQ.ID.11
  • hybridizing region 21 was designed to be cleaved near the center of the GFP-encoding sequence (714 bp), as shown in FIG. Therefore, an experiment was performed to confirm that the DNA fragment indicated by the arrow in lane 3 of FIG. 6 contains both the upstream and downstream sides of the sequence encoding GFP.
  • band extract The band indicated by the arrow in lane 3 of FIG. 6 was gel-extracted using Qiagen's QIAquick Gel Extraction Kit (hereinafter referred to as "band extract").
  • An outline of the confirmation experiment will be described with reference to FIG. (1) Amplification of band extract 1: SEQ. ID. 10, SEQ. ID. 12 was used to amplify band extracts. The length of the amplified product is 221 bp. 2: SEQ. ID. 13, SEQ. ID. 11 was used to amplify band extracts. The length of the amplified product is 251 bp. (2) SEQ. ID. Amplification of GFP fragment using 3 as template 3: SEQ. ID. 10, SEQ. ID.
  • SEQ. ID. 12 was used to amplify the sequence encoding the GFP fragment.
  • the length of the amplified product is 221 bp. 4: SEQ. ID. 13
  • SEQ. ID. 11 was used to amplify the sequence encoding the GFP fragment.
  • the length of the amplified product is 251 bp.
  • SEQ. ID. The sequences of 12 and 13 are as follows. ⁇ SEQ. ID. 12:5'-TAGCGGCTGAAGCACTGCAC-3' ⁇ SEQ. ID. 13:5′-ACAAGCAGAAGAACGGCATCAAG-3′
  • Electrophoresis was performed on the above amplification products.
  • the results are shown in FIG. M in FIG. 7 corresponds to the 100 bp Marker, and lanes 1 to 4 in FIG. 7 correspond to the amplification products described in 1 to 4 above. From the results shown in lanes 1 and 2 of FIG. 7, it was confirmed that the band extract cleaved with fusion protein 3 contained the upstream and downstream sides of the sequence encoding the GFP fragment. From the above results, it was confirmed that the modification composition disclosed in the present application can be used to modify a nucleic acid sequence without depending on the PAM sequence and the PFS sequence.
  • the nucleic acid sequence can be modified without depending on the PAM sequence and the PFS sequence. Therefore, it is useful for industries requiring genome editing, such as the pharmaceutical industry and research institutes.
  • SYMBOLS 1 Composition for modifying genomic DNA, 2... RNA, 21... Hybridization region, 22... Guide region, 23... Recognition region, 24... First complementary region, 3... Fusion protein, 31... Binding domain, 32... Modification domain , 4... nucleic acid sequence, genomic DNA, RNA, 41... target site

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Abstract

ＰＡＭ配列、ＰＦＳ配列に依存しない核酸配列改変用組成物および核酸配列の標的部位を改変する方法を提供することを課題とする。 【解決手段】ＲＮＡおよび融合タンパク質を含む核酸配列改変用組成物であって、　ＲＮＡは、　核酸配列の標的部位の５'側または３'側の配列にハイブリダイズし得るハイブリダイズ領域と、　融合タンパク質をガイドするガイド領域と、 を含み、　ガイド領域は、融合タンパク質と複合体を形成する認識領域を含み、　融合タンパク質は、　ＲＮＡの認識領域を認識し、認識領域と複合体を形成する結合ドメインと（但し、結合ドメインがＣａｓタンパク質群のＲＮＡ認識領域を含むことを除く。）、　核酸配列の標的部位を改変する改変ドメインと、 を含む　核酸配列改変用組成物、により課題を解決できる。

Description

核酸配列改変用組成物および核酸配列の標的部位を改変する方法
　本出願における開示は、核酸配列改変用組成物および核酸配列の標的部位を改変する方法に関する。
　近年、様々な生物種において、ゲノムＤＮＡの標的部位を改変する技術であるゲノム編集が注目されている。ゲノム編集方法としては、例えば、（１）ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン（Ｚｉｎｃ　ｆｉｎｇｅｒ　ａｒｒａｙ）と非特異的なＤＮＡ切断ドメイン（Ｎｕｃｌｅａｓｅ　ｄｏｍａｉｎ）とを連結した、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を用い、宿主の植物細胞または昆虫細胞にＤＮＡ中の標的遺伝子座において組換えを行う方法（特許文献１、図１Ａ参照）、（２）植物病原菌キサントモナス属が有するＤＮＡ結合モジュールである転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターと、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（Ｎｕｃｌｅａｓｅ　ｄｏｍａｉｎ）と、を連結したＴＡＬＥＮを用いて、特定のヌクレオチド配列内又はそれに隣接する部位で、標的遺伝子を切断・修飾する方法（特許文献２、図１Ｂ参照）、が知られている。
　しかしながら、図１Ａに示すように、上記特許文献１に記載の方法はゲノムＤＮＡを認識するドメイン（Ｚｉｎｃ　ｆｉｎｇｅｒ　ａｒｒａｙ）が２つ必要であり、それぞれ、タンパク質で形成されている。そして、ゲノムＤＮＡを認識する２つのドメインは、それぞれ、二本鎖ＤＮＡの標的部位から３’側を認識するように設計されている。したがって、ゲノムＤＮＡの標的部位を改変する際には、配列が異なる一対のＺｉｎｃ　ｆｉｎｇｅｒ　ａｒｒａｙの設計が必要であるという問題がある。
　また、図１Ｂに示すように、上記特許文献２に記載の方法は、ゲノムＤＮＡを認識するドメイン（ＴＡＬ　ｅｆｆｅｃｔｏｒ）の方向が、二本鎖ＤＮＡの標的部位から５’側である点で特許文献１に記載の方法と異なる。しかしながら、特許文献１に記載の方法と同様に、ゲノムＤＮＡの標的部位を改変する際には、配列が異なる一対のＴＡＬ　ｅｆｆｅｃｔｏｒの設計が必要であるという問題がある。
　一方、ゲノムＤＮＡの標的部位を改変する技術として、近年、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が注目されている（特許文献３～６参照）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、図２に示すように、改変したいＤＮＡと相補的な配列を有するガイドＲＮＡと、ガイドＲＮＡと複合体を形成するキャス９タンパク質で構成されている。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のガイドＲＮＡは、２本鎖ＤＮＡの一方の鎖のみを認識して相補対を形成すればよい。したがって、上記特許文献１および２と異なり、ゲノムＤＮＡの標的部位を改変するＮｕｃｌｅａｓｅ　ｄｏｍａｉｎをガイドするガイドＲＮＡは一つでよいというメリットがある。
特許第４９６８４９８号公報 特表２０１３－５１３３８９号公報 特表２０１５－５２７８８９号公報 特表２０１６－５００２６２号公報 特表２０１６－５０１５３１号公報 特表２０１６－５０１５３２号公報
　しかしながら、特許文献３～６に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いた方法は、図２に示すように、ゲノムＤＮＡのＰＡＭ配列（５’－ＮＧＧ－３’等）の３～４塩基上流側の塩基がＣａｓ９エンドヌクレアーゼにより切断される。つまり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いた方法は、ゲノムＤＮＡの標的部位がＰＡＭ配列の近傍に制限されるという問題がある。また、Ｃａｓ１３を用いることでＲＮＡを改変することも知られているが、その場合も、標的部位がＰＦＳ（Ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ　Ｆｌａｎｋｉｎｇ　Ｓｉｔｅ）配列の近傍に制限されるという問題がある。
　本出願における開示は、上記問題点を解決するためになされたもので、鋭意研究を行ったところ、（１）ハイブリダイズ領域および認識領域を含むＲＮＡと、（２）認識領域と複合体を形成する融合タンパク質と、を用いることで、ＰＡＭ配列、ＰＦＳ配列に依存することなく、核酸配列を改変できることを新たに見出した。すなわち、本出願における開示の目的は、ＰＡＭ配列、ＰＦＳ配列に依存しない核酸配列改変用組成物および核酸配列の標的部位を改変する方法を提供することである。
（１）ＲＮＡおよび融合タンパク質を含む核酸配列改変用組成物であって、
　ＲＮＡは、
　　核酸配列の標的部位の５’側または３’側の配列にハイブリダイズし得るハイブリダイズ領域と、
　　融合タンパク質をガイドするガイド領域と、
を含み、
　　ガイド領域は、融合タンパク質と複合体を形成する認識領域を含み、
　融合タンパク質は、
　　前記ＲＮＡの認識領域を認識し、認識領域と複合体を形成する結合ドメインと（但し、結合ドメインがＣａｓタンパク質群のＲＮＡ認識領域を含むことを除く。）、
　　核酸配列の標的部位を改変する改変ドメインと、
を含む
　核酸配列改変用組成物。
（２）融合タンパク質は、結合ドメインおよび改変ドメインを連結するリンカー配列を含む
　上記（１）に記載の核酸配列改変用組成物。
（３）ガイド領域が、認識領域を２つ含む
　上記（１）または（２）に記載の核酸配列改変用組成物。
（４）ハイブリダイズ領域の一端部に接続した第１相補領域を含み、
　第１相補領域がガイド領域の一端部側と相補対を形成することで、ハイブリダイズ領域およびガイド領域が間接的に接続する
　上記（１）～（３）の何れか一つに記載の核酸配列改変用組成物。
（５）ガイド領域が、ステムループを含む
　上記（１）～（４）の何れか一つに記載の核酸配列改変用組成物。
（６）結合ドメインが、ＮｏｖａのＲＮＡ結合領域を含み、
　改変ドメインが、ゲノムＤＮＡを切断するＦｏｋＩの開裂領域を含む
　上記（１）～（５）の何れか一つに記載の核酸配列改変用組成物。
（７）核酸配列が、ゲノムＤＮＡである
　上記（１）～（６）の何れか一つに記載の核酸配列改変用組成物。
（８）上記（１）～（７）の何れか一つに記載のＲＮＡを転写するための鋳型となる核酸、および、
　上記（１）～（７）の何れか一つに記載の融合タンパク質を翻訳するための鋳型となる核酸、
を含む
　核酸配列改変用組成物。
（９）上記（１）～（７）の何れか一つに記載の核酸配列改変用組成物を形成するための、ＲＮＡ。
（１０）上記（８）に記載の核酸配列改変用組成物を形成するための、ＲＮＡを転写するための鋳型となる核酸。
（１１）上記（１）～（７）の何れか一つに記載の核酸配列改変用組成物を形成するための、融合タンパク質。
（１２）上記（８）に記載の核酸配列改変用組成物を形成するための、融合タンパク質を翻訳するための鋳型となる核酸。
（１３）核酸配列の標的部位を改変する方法であって、該方法は、
　　上記（１）～（８）の何れか一項に記載の核酸配列改変用組成物を細胞に導入する導入工程と、
　　改変ドメインが核酸配列の標的部位を改変する改変工程と、
を含む
　核酸配列の標的部位を改変する方法。
（１４）導入工程の前に、核酸配列の標的部位の５’側または３’側の配列にハイブリダイズし得るハイブリダイズ領域を特定するハイブリダイズ領域特定工程を含む
　上記（１３）に記載の核酸配列の標的部位を改変する方法。
（１５）一つの標的部位を改変するために必要なハイブリダイズ領域が一つである、
　上記（１３）または（１４）に記載の核酸配列の標的部位を改変する方法。
（１６）ガイド領域が、認識領域を２つ含む
　上記（１５）に記載の核酸配列の標的部位を改変する方法。
（１７）導入工程の前に、核酸配列の改変に必要な数の融合タンパク質と複合体を形成できるように、認識領域の数およびＲＮＡ配列を少なくとも設計するガイド領域設計工程を含む、
　上記（１６）に記載の核酸配列の標的部位を改変する方法。
　本出願で開示する核酸配列改変用組成物および核酸配列の標的部位を改変する方法により、ＰＡＭ配列、ＰＦＳ配列に依存することなく核酸配列を改変できる。
図１Ａはジンクフィンガーヌクレアーゼを用いたゲノム編集方法の概略を示す概略図である。図１ＢはＴＡＬＥＮを用いたゲノム編集方法の概略を示す概略図である。 図２はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いたゲノム編集方法の概略を示す概略図である。 図３Ａおよび図３Ｂは、改変用組成物１の概略を示す概略図である。 図４Ａおよび図４Ｂは、改変用組成物１の変形例の概略を示す概略図である。 図５は実施例２の概略を示す図である。 図６は図面代用写真で、実施例２の電気泳動写真である。 図７は図面代用写真で、実施例２のレーン３の矢印に示すバンドを確認するための電気泳動写真である。
　以下、図面を参照しつつ、核酸配列改変用組成物（以下、「改変用組成物」と記載することがある。）および核酸配列の標的部位を改変する方法（以下、「改変方法」と記載することがある。）の実施形態について、詳しく説明する。なお、本明細書において、同種の機能を有する部材には、同一又は類似の符号が付されている。そして、同一又は類似の符号の付された部材について、繰り返しとなる説明が省略される場合がある。
　また、図面において示す各構成の位置、大きさ、範囲などは、理解を容易とするため、実際の位置、大きさ、範囲などを表していない場合がある。このため、本出願における開示は、必ずしも、図面に開示された位置、大きさ、範囲などに限定されない。
（核酸配列改変用組成物の実施形態）
　図３および図４を参照して、実施形態に係る改変用組成物１について説明する。図３Ａおよび図３Ｂは、改変用組成物１の概略を示す概略図である。図４Ａおよび図４Ｂは、改変用組成物１の変形例の概略を示す概略図である。なお、以下の説明において、図３Ａおよび図３Ｂに共通する説明は、単に「図３」と記載することがある。
　改変用組成物１は、ＲＮＡ２および融合タンパク質３を含む。図３に示す例では、ＲＮＡ２は、２重らせん構造を有するゲノムＤＮＡ４の標的部位（改変部位）４１の５’側のゲノムＤＮＡ４にハイブリダイズし得るハイブリダイズ領域２１と、融合タンパク質３をガイドするガイド領域２２を含んでいる。なお、図３に示す例では、ハイブリダイズ領域２１は標的部位４１の５’側でゲノムＤＮＡ４にハイブリダイズする。代替的に、図示は省略するが、標的部位４１の３’側でゲノムＤＮＡ４にハイブリダイズするようにハイブリダイズ領域２１を形成してもよい。ガイド領域２２は、ハイブリダイズ領域２１に隣接して配置される。また、ガイド領域２２は、融合タンパク質３の結合ドメイン３１を認識することで融合タンパク質３と複合体を形成する認識領域２３を含む。なお、図３および図４には、改変用組成物１が改変する対象がゲノムＤＮＡ４である例が示されている。代替的に、改変用組成物１は、核酸配列であるＲＮＡを改変してもよい。以下の説明では、改変用組成物１が改変する対象がゲノムＤＮＡ４である例について説明するが、改変ドメイン３２に関する説明以外の部分は、改変用組成物１が改変する対象がゲノムＤＮＡ４の場合でもＲＮＡ４の場合でも同じである。改変ドメイン３２に関する説明以外の部分は、「ゲノムＤＮＡ４」を「ＲＮＡ４」と読み替えればよい。
　融合タンパク質３は、ＲＮＡ２の認識領域２３と複合体を形成する結合ドメイン３１と、ゲノムＤＮＡ４の標的部位４１を改変する改変ドメイン３２と、を含む。
　ハイブリダイズ領域２１の長さは、ゲノムＤＮＡ４の標的部位４１の５’側または３’側でＲＮＡ２の位置決めができる長さであれば特に制限はない。ハイブリダイズ領域２１が短いと、オフターゲットのリスクがある。したがって、オフターゲットのリスクを考慮しながら、長さを適宜設定すればよい。限定されるものではないが、例えば、１５ｂｐ以上、２０ｂｐ以上、２５ｂｐ以上、３０ｂｐ以上、３５ｂｐ以上、４０ｂｐ以上、４５ｂｐ以上とすればよい。一方、ＲＮＡ２の位置決めとの観点では、ハイブリダイズ領域２１の長さに特に制限はないが、ハイブリダイズ領域２１が長いほどＲＮＡ２の製造コストが高くなる。したがって、限定されるものではないが、例えば、６ｋｂｐ以下、５ｋｂｐ以下、４ｋｂｐ以下、３ｋｂｐ以下、２ｋｂｐ以下、１ｋｂｐ以下、７５０ｂｐ以下、５００ｂｐ以下、３００ｂｐ以下、２００ｂｐ以下、１００ｂｐ以下、９０ｂｐ以下、８０ｂｐ以下、７０ｂｐ以下、６０ｂｐ以下、５０ｂｐ以下とすればよい。
　ガイド領域２２の長さは、融合タンパク質３のサイズ、ハイブリダイズ領域２１の端部から標的部位４１までの距離等を考慮しながら適宜調整すればよい。また、ガイド領域２２は、ステムループを含んでいてもよい。図３Ａに示す例では、一対の融合タンパク質３（より具体的には、一対の改変ドメイン３２）で標的部位４１を改変するため、ガイド領域２２は２つの認識領域２３を含んでいる。ガイド領域２２がステムループを含む場合、２つの認識領域２３を立体構造的に近接して配置できる。図３Ａに示す例では、例えば、認識領域２３がループ部分に配置されるように、２つのステムループを形成すればよい。なお、前記ステムループの数と認識領域２３が配置される部分は単なる例示である。一対の改変ドメイン３２が標的部位４１を改変できる位置関係に配置されれば、ステムループの数は、１つ、３つ、４つであってもよい。また、認識領域２３はステムに配置されていてもよいし、ステムとループに跨る様に配置されてもよい。認識領域２３の間の長さ（ガイド領域２２の一部の長さ）についても、融合タンパク質３のサイズ等を考慮しながら、適宜調整すればよい。
　認識領域２３は、融合タンパク質３の結合ドメイン３１と複合体を形成できるように、融合タンパク質３の種類に基づきＲＮＡ配列を決めればよい。認識領域２３のＲＮＡ配列と結合ドメイン３１の組合せについては後述する。
　なお、図３Ａは、ゲノムＤＮＡ４の標的部位４１に一対の融合タンパク質３の改変ドメイン３２を配置し、標的部位４１を改変する例を示している。したがって、ガイド領域２２には、２つの認識領域２３が含まれる。代替的に、図１Ａおよび図１Ｂに示すように、一対の改変用組成物１を用い、標的部位４１に改変ドメイン３２が対向するように一対のハイブリダイズ領域２１をゲノムＤＮＡ４にハイブリダイズしてもよい。ハイブリダイズ領域２１を２つ設計する必要があることからコストアップ等にはなるが、技術的には可能である。更に代替的に、融合タンパク質３の改変ドメイン３２が一つで標的部位４１を改変できる場合は、図３Ｂに示すように、ガイド領域２２に含まれる認識領域２３は一つでもよい。ガイド領域２２に含まれる認識領域２３が一つの場合でも、ガイド領域２２はステムループを含んでいてもよい。また、認識領域２３は、ループ部分に配置されてもよいし、ステム部分に配置されてもよいし、ステムとループに跨る様に配置されてもよい。なお、図３Ａおよび図３Ｂには、認識領域２３がガイド領域２２の一部である例が示されている。代替的に、認識領域２３の長さがガイド領域２２の長さと一致してもよい。本明細書において、ガイド領域２２が認識領域２３を含むとは、認識領域２３がガイド領域２２の一部である場合、および、認識領域２３の長さがガイド領域２２の長さと一致する場合、の何れも包含することを意味する。
　融合タンパク質３は、（１）ＲＮＡ２のガイド領域２２に含まれる特異的配列（認識領域２３）を認識し、認識領域２３と複合体を形成する結合ドメイン３１と、（２）ゲノムＤＮＡ４の標的部位４１を改変する改変ドメイン３２と、を含めば特に制限はない。なお、本明細書において「融合タンパク質」とは、上記のとおり結合ドメイン３１と改変ドメイン３２を含むように人為的に合成したタンパク質であって、天然には存在しないタンパク質である。融合タンパク質３は、例えば、認識領域２３と複合体を形成できるタンパク質と、ゲノムＤＮＡ４を改変するタンパク質を融合すればよい。なお、公知のタンパク質を用いて融合タンパク質３を作製する場合、公知のタンパク質の全アミノ酸配列を含む必要はない。例えば、ＲＮＡ２の認識領域２３に結合するタンパク質の場合、認識領域２３に結合する領域のみを用いてもよい。また、ゲノムＤＮＡ４を改変するタンパク質の場合、ゲノムＤＮＡ４を改変する機能を有する領域のみを用いてもよい。
　融合タンパク質３は、公知の方法で作製すればよい。例えば、設計した融合タンパク質３のアミノ酸配列に基づき核酸配列を設計し、無細胞タンパク質合成系を用いて合成すればよい。或いは、プロモーター等を含めて核酸配列を設計し、当該設計した核酸配列をプラスミドに導入し、細胞を用いて融合タンパク質３を合成してもよい。上記のとおり、本明細書において「融合タンパク質」と記載した場合、天然タンパク質自体は除かれる。
　上記のとおり、融合タンパク質３は、結合ドメイン３１および改変ドメイン３２を含めば特に制限はなく、必要に応じて、任意の配列を追加してもよい。例えば、結合ドメイン３１および改変ドメイン３２を連結するためのリンカー配列や、融合タンパク質３を細胞の核へ輸送するための目印となる核局在化配列（ｎｕｃｌｅａｒ　ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｓｉｇｎａｌ／ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＬＳ）を追加してもよい。ＮＬＳは公知の配列を用いればよい。ＮＬＳを追加する場合は、ＮＬＳが奏する機能が得られれば配置する位置に特に制限はない。例えば、アミノ酸配列でみて、上流側から結合ドメイン３１→改変ドメイン３２の順に融合タンパク質３が形成される場合、ＮＬＳは結合ドメイン３１の上流側、結合ドメイン３１と改変ドメイン３２との間、改変ドメイン３２の下流側に配置すればよい。また、上流側から改変ドメイン３２→結合ドメイン３１の順に融合タンパク質３が形成される場合、ＮＬＳは改変ドメイン３２の上流側、改変ドメイン３２と結合ドメイン３１との間、結合ドメイン３１の下流側に配置すればよい。
　また、本明細書において、核酸配列（より具体的には、ゲノムＤＮＡ４またはＲＮＡ４）の標的部位４１を「改変」するとは、二本鎖ＤＮＡ４または一本鎖（二本鎖）ＲＮＡ４の標的部位４１をオリジナルの状態とは物理的に及び／又は機能的に異なる状態にすることを意味する。換言すると、改変ドメイン３２が、核酸配列を当該「異なる状態」にする機能を有することを意味する。
　ゲノムＤＮＡ４の標的部位４１を物理的に異なる状態（物理的に異なれば、結果として機能も異なる場合が多い）にする改変ドメイン３２としては、限定されるものではないが、例えば、以下の機能を有するものが挙げられる。
（１）二本鎖ＤＮＡの糖とリン酸の間のホスホジエステル結合を加水分解してヌクレオチドとするヌクレアーゼ（ｎｕｃｌｅａｓｅ）
（２）二本鎖ＤＮＡの片鎖にニックを導入するニッカーゼ（ｎｉｃｋａｓｅ）
（３）ＤＮＡのメチル基（例えば、５－メチルシトシン）を脱メチル化するＤＮＡ脱メチル化酵素
（４）ＤＮＡの塩基に含まれるＮＨ2をｃ＝Ｏに変化する脱アミノ化酵素
（５）上記（３）および（４）以外のＤＮＡが有する基を置換する酵素
　ゲノムＤＮＡ４の標的部位４１を機能的に異なる状態にする改変ドメイン３２としては、限定されるものではないが、例えば、以下の機能を有するものが挙げられる。
（６）転写活性化因子
（７）転写抑制因子
　上記（１）～（７）に記載の改変ドメイン３２のより具体的な例を以下に示す。なお、特許文献および非特許文献に記載の酵素は、改変ドメイン３２としてそのまま用いてもよい。或いは、記載した酵素がゲノムＤＮＡ４を改変する機能を奏する範囲内であれば、一部領域が欠損していてもよいし、追加されていてもよい。
（１）ヌクレアーゼ
（１－１）ＦｏｋＩ（特許第５２６６２１０号公報；Ｔ．　Ｓａｋｕｍａ　ｅｔ　ａｌ．，“Ｒｅｐｅａｔｉｎｇ　ｐａｔｔｅｒｎ　ｏｆ　ｎｏｎ－ＲＶＤ　ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｍｏｄｕｌｅｓ　ｅｎｈａｎｃｅｓ　ＴＡＬＥＮ　ａｃｔｉｖｉｔｙ”，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　３，Ａｒｔｉｃｌｅ　ｎｕｍｂｅｒ：３３７９　（２０１３））
（１－２）ＦｉｒｍＣｕｔヌクレアーゼ（国際公開第２０２０／０４５２８１号公報）
（２）ニッカーゼ
（２－１）ＲｕｖＣ　ヌクレアーゼ・ドメイン　Ｄ１０Ａ点変異（Ｍ．　Ｊｉｎｅｋ　ｅｔ　ａｌ．，“Ａ　Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ　Ｄｕａｌ－ＲＮＡ－Ｇｕｉｄｅｄ　ＤＮＡ　Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　ｉｎ　Ａｄａｐｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ”，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　（２０１２），Ｖｏｌ．３３７，Ｉｓｓｕｅ　６０９６，ｐｐ．８１６－８２１；和研薬株式会社から入手も可能である。）
　本酵素は、Ｃａｓ９の１０番目のアミノ酸をアスパラギン酸（Ｄ）からアラニン（Ａ）に変えたものである。Ｃａｓ９に２つあるヌクレアーゼドメインのうちＲｕｖＣ様ドメインのヌクレアーゼ活性が消失するため、Ｄ１０Ａ変異体はニッカ―ゼとして作用し、二本鎖ＤＮＡ切断ではなく、一本鎖ＤＮＡ切断（ニック）を生じる。ダブルニッキング法では、二本鎖ＤＮＡの標的配列に対して各々の鎖まで案内する２つのｓｇＲＮＡとＣａｓ９ニッカ―ゼを作用させる。
（２－２）ＨＮＨ　ヌクレアーゼ・ドメイン　Ｈ８４０Ａ点変異（上記（２－１）に記載の文献参照。和研薬株式会社から入手も可能である。）
　上記（２－１）に記載の酵素は、ＤＮＡのｔａｒｇｅｔ　Ｓｔｒａｎｄのみを切断するが、（２－２）に記載の酵素はｎｏｎ－ｔａｒｇｅｔ　ｓｔｒａｎｄを切断する。
（３）ＤＮＡ脱メチル化酵素
（３－１）メチル化シトシンヒドロキシラーゼＴｅｔ１（Ｓ．　Ｍｏｒｉｔａ　ｅｔ　ａｌ．，“Ｔａｒｇｅｔｅｄ　ＤＮＡ　ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｕｓｉｎｇ　ｄＣａｓ９－ｐｅｐｔｉｄｅ　ｒｅｐｅａｔ　ａｎｄ　ｓｃＦｖ－ＴＥＴ１　ｃａｔａｌｙｔｉｃ　ｄｏｍａｉｎ　ｆｕｓｉｏｎｓ”，　Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　３４，ｐ：１０６０－１０６５　（２０１６））
（４）脱アミノ化酵素
（４－１）アデノシンデアミナーゼ（Ｃ．　Ｌｉ　ｅｔ　ａｌ．，“Ｅｘｐａｎｄｅｄ　ｂａｓｅ　ｅｄｉｔｉｎｇ　ｉｎ　ｒｉｃｅ　ａｎｄ　ｗｈｅａｔ　ｕｓｉｎｇ　ａ　Ｃａｓ９－ａｄｅｎｏｓｉｎｅ　ｄｅａｍｉｎａｓｅ　ｆｕｓｉｏｎ”，Ｇｅｎｏｍｅ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　１９，Ａｒｔｉｃｌｅ　ｎｕｍｂｅｒ：５９（２０１８））
（４－２）シチジンデアミナーゼ（Ａ．　Ｋｏｍｏｒ　ｅｔ　ａｌ．，“Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ　ｅｄｉｔｉｎｇ　ｏｆ　ａ　ｔａｒｇｅｔ　ｂａｓｅ　ｉｎ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ　ＤＮＡ　ｃｌｅａｖａｇｅ”，ｎａｔｕｒｅ　５３３，ｐ：４２０－４２４（２０１６））
（５）その他の酵素
　ヒストンアセチル基転移酵素、ヒストン脱アセチル化酵素、ヒストンリジンメチル基転移酵素、ヒストンリジン脱メチル化酵素等。
（６）転写活性化因子
（６－１）Ｖｐ６４（Ｌ．　Ｌｏｗｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，“Ｒｏｂｕｓｔ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｐｌａｎｔｓ　Ｕｓｉｎｇ　Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ　ＣＲＩＳＰＲ－Ａｃｔ２．０　ａｎｄ　ｍＴＡＬＥ－Ａｃｔ　Ｓｙｓｔｅｍｓ”，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｌａｎｔ，Ｖｏｌｕｍｅ　１１，Ｉｓｓｕｅ　２，２０１８，ｐ：２４５－２５６）
（６－２）Ｖｐ１６（上記（６－１）に記載の文献参照。）
（７）転写抑制因子
（７―１）ＫＲＡＢ（Ｍ．　Ｂｏｅｔｔｃｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，“Ｃｈｏｏｓｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｒｉｇｈｔ　Ｔｏｏｌ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｊｏｂ：　ＲＮＡｉ，　ＴＡＬＥＮ，　ｏｒ　ＣＲＩＳＰＲ”，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｅｌｌ，２０１５　２１；５８（４）：５７５－８５）
（７－２）ＳＲＤＸ（Ｌ．　Ｌｏｗｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，“Ａ　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９　Ｔｏｏｌｂｏｘ　ｆｏｒ　Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ　Ｐｌａｎｔ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｅｄｉｔｉｎｇ　ａｎｄ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ”，Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０１５，１６９（２）：９７１－８５）
　また、上記（１）～（７）と一部重複するが、特表２０１５－５２７８８９号公報に記載の「トランスポザーゼドメイン、インテグラーゼドメイン、リコンビナーゼドメイン、リゾルバーゼドメイン、インベルターゼドメイン、プロテアーゼドメイン、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメイン、ＤＮＡヒドロキシメチラーゼドメイン、ＤＮＡデメチラーゼドメイン、ヒストンアセチラーゼドメイン、ヒストンデアセチラーゼドメイン、ヌクレアーゼドメイン、リプレッサードメイン、アクチベータードメイン、核局在化シグナルドメイン、転写－調節タンパク質（または転写複合体リクルート）ドメイン、細胞取り込み活性関連ドメイン、核酸結合ドメイン、抗体提示ドメイン、ヒストン修飾酵素、ヒストン修飾酵素のリクルーター；ヒストン修飾酵素のインヒビター、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデメチラーゼ、ヒストンキナーゼ、ヒストンホスファターゼ、ヒストンリボシラーゼ（ｒｉｂｏｓｙｌａｓｅ）、ヒストンデリボシラーゼ（ｄｅｒｉｂｏｓｙｌａｓｅ）、ヒストンユビキチナーゼ（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｓｅ）、ヒストンデユビキチナーゼ、ヒストンビオチナーゼ（ｂｉｏｔｉｎａｓｅ）およびヒストンテイルプロテアーゼ」等を用いてもよい。特表２０１５－５２７８８９号公報の記載事項は、参照により本明細書に含まれる。
　上記例示した改変ドメイン３２を形成できる酵素の内、図３Ａに示すように２つの改変ドメイン３２でゲノムＤＮＡ４を改変する酵素、図３Ｂに示すように１つの改変ドメイン３２でゲノムＤＮＡ４を改変する酵素、或いは、４つの改変ドメインでゲノムＤＮＡ４を改変する酵素は、例えば、以下の種類が挙げられる。
＜１つの改変ドメイン３２＞
　ＲｕｖＣ　ヌクレアーゼ・ドメイン　Ｄ１０Ａ点変異、ＨＮＨ　ヌクレアーゼ・ドメイン　Ｈ８４０Ａ点変異
＜２つの改変ドメイン３２＞
　ＦｏｋＩ、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、Ｖｐ１６
＜４つの改変ドメイン３２＞
　ＶＰ６４
　また、ＲＮＡ４の標的部位４１を機能的に異なる状態にする改変ドメイン３２としては、限定されるものではないが、例えば、二本鎖ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼであるＡｄｅｎｏｓｉｎｅ　Ｄｅａｍｉｎａｓｅ　Ａｃｔｉｎｇ　ｏｎ　ＲＮＡ（ＡＤＡＲ）（Ｍａｒｉｎａ　ｅｔ　ａｌ．，“Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ　ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　ｆｏｒ　Ｓｉｔｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＲＮＡ　Ｅｄｉｔｉｎｇ”，　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　３３，１０８３５０，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ　３，２０２０）等が挙げられる。
　結合ドメイン３１および認識領域２３の配列は、ＲＮＡ２の認識領域２３を認識して認識領域２３と複合体を形成できるタンパク質およびＲＮＡ配列の組合せであれば特に制限はない。したがって、ガイド領域２２が２つ以上の認識領域２３を含む場合、同一の結合ドメイン３１に対して同一のＲＮＡ配列を有する認識領域２３を含んでもよし、ＲＮＡ配列が異なる認識領域２３を含んでもよい。同じ理由により、ガイド領域２２が２つ以上の認識領域２３を含む場合、同一のＲＮＡ配列（認識領域２３）に対して同一の結合ドメイン３１が複合体を形成してもよいし、異なる結合ドメイン３１が複合体を形成してもよい。
　結合ドメイン３１および認識領域２３の配列は、限定されるものではないが、例えば、以下の組合せが挙げられる。
（１）Ｎｏｖａ：５’－ＵＣＡＹ－３’（Ｋ．　Ｊｅｎｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，“Ｔｈｅ　ｔｅｔｒａｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ＵＣＡＹ　ｄｉｒｅｃｔｓ　ｔｈｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ＲＮＡ　ｂｙ　ｔｈｅ　Ｎｏｖａ　Ｋ－ｈｏｍｏｌｏｇｙ　３　ｄｏｍａｉｎ”，ＰＮＡＳ，２０００，９７（１１），５７４０－５７４５。以下、本論文を「非特許文献１」と記載することがある。）
　なお、上記５’－ＵＣＡＹ－３’は、ステムループのループ部分に形成されている。
（２）上記非特許文献１のＦＩＧ．６に記載の組合せ（以下の表１参照）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（３）ＴＬＳ：５’－ＧＧＵＧ－３’（Ｗａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，“Ｉｎｄｕｃｅｄ　ｎｃＲＮＡｓ　ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃａｌｌｙ　ｍｏｄｉｆｙ　ＲＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｃｉｓ　ｔｏ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ”，ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ　４５４，３，Ｊｕｌｙ　２００８）
　また、ＲＮＡ配列は明記されていないが、ＲＮＡに結合するタンパク質として以下のタンパク質が挙げられる。ＲＮＡと結合することは公知であることから、ＲＮＡ配列は適宜設計すればよい。
（４）ＲＮＧ１０５（Ｎ．　Ｓｈｉｉｎａｅｔ　ｅｔ　ａｌ．，“Ａ　Ｎｏｖｅｌ　ＲＮＡ－Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　Ｎｅｕｒｏｎａｌ　ＲＮＡ　Ｇｒａｎｕｌｅｓ：Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｍａｃｈｉｎｅｒｙ　ｆｏｒ　Ｌｏｃａｌ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”，Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｐｒｉｌ　２７，２００５・２５（１７）：４４２０－４４３４）
（５）ＮＡＰＯＲ（Ｗ．　ＺＨＡＮＧｅｔ　ｅｔ　ａｌ．，“Ｒｅｇｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ　ｓｐｌｉｃｉｎｇ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｎｅｒｖｏｕｓ　ｓｙｓｔｅｍ：　Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｔｈｅ　ＲＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＮＡＰＯＲ”，ＲＮＡ（２００２），８：６７１－６８５）．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ）
（６）ＤＡＺＬおよびＲＢＦＯＸ（Ｄ．　Ｓｈａｒｍａ１　ｅｔ　ａｌ．，“Ｔｈｅ　ｋｉｎｅｔｉｃ　ｌａｎｄｓｃａｐｅ　ｏｆ　ａｎ　ＲＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ｃｅｌｌｓ”，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ　５９１，４　Ｍａｒｃｈ　２０２１）
（７）Ｓａｍ６８（Ｐ．　Ｂｉｅｌｌｉ　ｅｔ　ａｌ．，“Ｔｈｅ　ＲＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓａｍ６８　ｉｓ　ａ　ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｐｌａｙｅｒ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｃａｎｃｅｒ”，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ－Ｒｅｌａｔｅｄ　Ｃａｎｃｅｒ　（２０１１）　１８　Ｒ９１－Ｒ１０２）
（８）Ｓｐｉ－１／ＰＵ．１（Ｍ．　Ｈａｌｌｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，“Ｔｈｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｓｐｉ－１／ＰＵ．１　Ｂｉｎｄｓ　ＲＮＡ　ａｎｄ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｓ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ＲＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｐ５４ｎｒｂ”），ＴＨＥ　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ　ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，Ｖｏｌ．２７１，Ｎｏ．１９，ｐｐ．１１１７７－１１１８１，１９９６）
（９）ＰＵＭ２　Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＱＫＩ　Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＩＧＦ２ＢＰ　Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｍ．　Ｈａｆｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ－ｗｉｄｅ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＲＮＡ－Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｄ　ＭｉｃｒｏＲＮＡ　Ｔａｒｇｅｔ　Ｓｉｔｅｓ　ｂｙ　ＰＡＲ－ＣＬＩＰ”，Ｃｅｌｌ，１４１，１２９－１４１，２０１０）
　上記した結合ドメイン３１および改変ドメイン３２の具体例を示すために引用した各論文の記載事項、並びに、各論文が引用する論文の記載事項は、参照により本明細書に含まれる。
　なお、Ｃａｓタンパク質群であるＣａｓ９等は、ゲノムＤＮＡ４のＰＡＭ配列を認識することは公知である。また、ＰＡＭ配列はヌクレアーゼが由来する細菌種やヌクレアーゼの型／亜型によって異なることも公知である（以下の表２参照）。更に、Ｃａｓタンパク質群であるＣａｓ１３はＲＮＡのＰＦＳ配列を認識することは公知である。したがって、本出願で開示する結合ドメイン３１は、ＰＡＭ配列、ＰＦＳ配列を認識して結合するタンパク質、および、当該タンパク質のＰＡＭ配列またはＰＦＳ配列を認識する領域を含むことは除かれる。代替的に、結合ドメイン３１が、Ｃａｓタンパク質群のＲＮＡ認識領域を含むことを除くと換言してもよい。Ｃａｓタンパク質群としては、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ－ｃ、Ｃａｓ１０、Ｃｓｅ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｓｍ２、またはＣｍ５等が挙げられる。一方、Ｃａｓタンパク質群の内、核酸配列を改変する領域は、改変ドメイン３２として含まれてもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　第１の実施形態に係る改変用組成物を用いることで、以下の効果を奏する。
（１）ＲＮＡ２は、ゲノムＤＮＡ４またはＲＮＡ４とハイブリダイズするハイブリダイズ領域２１と、ガイド領域２２とを含む。そして、ガイド領域２２は、融合タンパク質３と複合体を形成する認識領域２３を１つ以上含む。したがって、図３Ａおよび図３Ｂに示すように、改変ドメイン３２が改変機能を有するのが１量体または２量体（若しくはそれ以上）を問わず、ハイブリダイズ領域２１は一つでよい。そのため、ハイブリダイズ領域２１の設計が容易になる。
（２）特許文献３～６に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、ゲノムＤＮＡ４の標的部位４１がＰＡＭ配列近傍に制限される。また、Ｃａｓ１３の場合も、ＲＮＡ４の標的部位４１がＰＦＳ配列の近傍に制限される。一方、第１の実施形態に係る改変用組成物１は、ゲノムＤＮＡ４またはＲＮＡ４の配列の制限を受けずに標的部位４１を決めることができる。
（３）ガイド領域２２に含まれる認識領域２３の数を任意に設計できる。したがって、融合タンパク質３の種類に応じてガイド領域２２を設計できることから、ガイド領域２２の設計の自由度が向上する。
（４）融合タンパク質３は、天然タンパク質（および一部を改変したタンパク質）と異なり、結合ドメイン３１として機能する領域および改変ドメイン３２として機能する領域を選択して融合することで形成できる。したがって、従来の天然タンパク質（および一部を改変したタンパク質）と比較して、融合タンパク質３のサイズを小さくできる。更に、融合タンパク質３の設計の自由度が向上する。
（核酸配列改変用組成物の変形例１）
　次に、図４Ａおよび図４Ｂを参照して、実施形態に係る改変用組成物１の変形例１を説明する。図３に示す例では、ＲＮＡ２のハイブリダイズ領域２１およびガイド領域２２は、直接接続している。一方、図４Ａおよび図４Ｂに示す変形例では、ＲＮＡ２は、ハイブリダイズ領域２１の一端部に接続した第１相補領域２４を含んでいる。そして、第１相補領域２４がガイド領域２２の一端部側と相補対を形成することで、ハイブリダイズ領域２１およびガイド領域２２が間接的に接続する。
　実施形態に係る改変用組成物１の場合、ハイブリダイズ領域２１およびガイド領域２２が直接接続しているため、ＲＮＡ２を一体的に形成する必要がある。一方、変形例１では、標的部位４１に応じてハイブリダイズ領域２１および第１相補領域２４のみ設計すればよい。したがって、ガイド領域２２および融合タンパク質３を大量生産することでコストダウンを図ることができる。また、改変用組成物１を提供する事業者はガイド領域２２および融合タンパク質３のみを提供し、ユーザー側でハイブリダイズ領域２１および第１相補領域２４を設計・合成することもできるので、速やかに実験に着手することもできる。
（核酸配列改変用組成物の変形例２）
　次に、実施形態に係る改変用組成物１の変形例２を説明する。上記実施形態に係る改変用組成物１および変形例１では、ＲＮＡ２および融合タンパク質３で改変用組成物１を形成している。代替的に、変形例２として、ＲＮＡ２を転写するための鋳型となる核酸（以下、「ＲＮＡ２用鋳型」と記載することがある。）、および、融合タンパク質３を翻訳するための鋳型となる核酸（以下、「融合タンパク質３用鋳型」と記載することがある。）、を用いて改変用組成物１を形成してもよい。ＲＮＡ２用鋳型および融合タンパク質３用鋳型は、ＤＮＡまたはＲＮＡを用いることができる。ＲＮＡ２用鋳型は、ＲＮＡ２を転写するための配列を少なくとも含んでいればよい。また、融合タンパク質３用鋳型は、融合タンパク質３を翻訳するための配列を少なくとも含んでいればよい。ＲＮＡ２用鋳型および融合タンパク質３用鋳型は、必要に応じて、プロモーターや翻訳促進用の非翻訳領域を含んでいてもよい。
　より具体的には、ＲＮＡ２用鋳型および融合タンパク質３用鋳型がＤＮＡの場合、ＲＮＡ２用鋳型の上流にＲＮＡ転写用のプロモーターを連結し、融合タンパク質３用鋳型の上流にタンパク質翻訳用のプロモーターを連結する。そして、ＲＮＡ２用鋳型および融合タンパク質３用鋳型を細胞に導入することで、細胞内で、（１）ＲＮＡ２用鋳型からＲＮＡ２が転写され、（２）融合タンパク質３用鋳型からｍＲＮＡが転写され、転写されたｍＲＮＡから融合タンパク質３が翻訳され、（３）細胞内で改変用組成物１が形成される。
　また、ＲＮＡ２用鋳型および融合タンパク質３用鋳型がＤＮＡの場合は、プロモーターと共に同一のプラスミドベクターに挿入されてもよいし、異なるプラスミドベクターに挿入されてもよい。或いは、プラスミドベクターに換え、ＲＮＡ２用鋳型および融合タンパク質３用鋳型は、プロモーターと共にアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）等のＤＮＡ型ウイルスに挿入されてもよい。プラスミドベクターまたはＤＮＡ型ウイルスを細胞に導入することで、細胞内で改変用組成物１が形成される。なお、プラスミドベクターまたはＤＮＡ型ウイルスが既にプロモーターを含んでいる場合は、プロモーターを含まないＲＮＡ２用鋳型および融合タンパク質３用鋳型をプラスミドベクターまたはＤＮＡ型ウイルスに挿入すればよい。
　ＲＮＡ２用鋳型および融合タンパク質３用鋳型がＲＮＡの場合は、ＤＮＡ型ウイルスに換え、レンチウイルス等のＲＮＡ型ウイルスを用いればよい。ＲＮＡ型ウイルスを用いた場合、細胞に導入されたＲＮＡ型ウイルスに挿入されているＲＮＡ２用鋳型および融合タンパク質３用鋳型から、先ずＤＮＡが逆転写される。そして、逆転写されたＤＮＡからＲＮＡ２が転写され、また、逆転写されたＤＮＡからｍＲＮＡが転写され当該ｍＲＮＡから融合タンパク質３が翻訳される。なお、融合タンパク質３用鋳型は、ｍＲＮＡであってもよい。融合タンパク質３用鋳型がｍＲＮＡの場合、ｍＲＮＡにプロモーターを連結する必要はない。ｍＲＮＡを細胞内に導入することで、細胞内でｍＲＮＡから融合タンパク質３を直接翻訳できる。
　上記のとおり、鋳型となる核酸の種類に応じて、最終的にＲＮＡ２および融合タンパク質３が得られる経路が異なる。本明細書において「ＲＮＡを転写するための鋳型となる核酸」と記載した場合、鋳型となる核酸は、直接ＲＮＡ２を転写する鋳型（鋳型ＤＮＡ）に加え、間接的にＲＮＡ２を転写する鋳型（鋳型ＲＮＡ）も含む概念である。同様に、「融合タンパク質を翻訳するための鋳型となる核酸」と記載した場合、鋳型となる核酸は、直接融合タンパク質３を翻訳する鋳型（ｍＲＮＡ）に加え、間接的に融合タンパク質３を翻訳する鋳型（鋳型ＤＮＡ、鋳型ＲＮＡ）も含む概念である。
　なお、ＲＮＡ２用鋳型および融合タンパク質３用鋳型は、細胞内で最終的に改変用組成物１が形成されれば、種類（鋳型ＤＮＡ、鋳型ＲＮＡ、ｍＮＲＡ）および形態（ベクターやウイルスへの挿入の有無）が同じであってもよいし、異なっていてもよい。
　ＲＮＡ転写用のプロモーター、タンパク質翻訳用のプロモーター、プラスミド、ＤＮＡ型ウイルス、ＲＮＡ型ウイルスは、上記機能を奏するものであれば特に制限はなく、公知のものを用いればよい。限定されるものではないが、例えば、ＲＮＡ転写用のプロモーターとしては、Ｕ６　Ｐｒｏｍｏｔｅｒ等が挙げられる。タンパク質翻訳用のプロモーターとしては、ＣＭＶ　Ｐｒｏｍｏｔｅｒ等が挙げられる。プラスミドとしては、哺乳類用としてｐｃＤＮＡ３．１；バクテリア用としてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＫＳ、ｐＥＴ系；酵母用としてｐＰＩＣ系；等が挙げられる。ＤＮＡ型ウイルスとしては、上記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）が挙げられる。ＲＮＡ型ウイルスとしては、上記レンチウイルス等が挙げられる。なお、変形例２に係る改変用組成物１は、改変用組成物形成用の組成物と換言してもよい。
（核酸配列改変用組成物の変形例３）
　次に、実施形態に係る改変用組成物１の変形例３を説明する。上記実施形態に係る改変用組成物１および変形例１では、ＲＮＡ２および融合タンパク質３を組み合わせて改変用組成物１を形成している。また、変形例２では、ＲＮＡ２用鋳型および融合タンパク質３用鋳型を組み合わせて改変用組成物１を形成している。代替的に、変形例３では、改変用組成物１を形成する組み合わせ要素の一方のみを提供し、別々に提供された要素を使用の際に組み合すことで、改変用組成物１を形成してもよい。
　より具体的には、（１）実施形態に係る改変用組成物１および変形例１に記載のＲＮＡ２のみを、改変用組成物１を形成するためのＲＮＡ２として提供、（２）実施形態に係る改変用組成物１および変形例１に記載の融合タンパク質３のみを、改変用組成物１を形成するための融合タンパク質３として提供、（３）変形例２に記載のＲＮＡ２用鋳型のみを、改変用組成物１を形成するためのＲＮＡ２用鋳型として提供、（４）変形例２に記載の融合タンパク質３用鋳型のみを、改変用組成物１を形成するための融合タンパク質３用鋳型として提供、すればよい。ＲＮＡ２および融合タンパク質３は、実施形態に係る改変用組成物１および変形例１で既に説明済みで、ＲＮＡ２用鋳型および融合タンパク質３用鋳型は、変形例２で既に説明済みである。したがって、重複記載となることから具体的な記載は省略する。
（核酸配列の標的部位を改変する方法の実施形態）
　改変方法は、上記改変用組成物の実施形態および変形例で説明した改変用組成物１を細胞に導入する導入工程と、改変ドメイン３２が核酸配列４の標的部位４１を改変する改変工程と、を含む。
　細胞は、核酸配列４を含むものであれば特に制限はない。例えば、ヒトまたは非ヒト動物細胞；植物細胞；昆虫細胞；大腸菌、酵母、カビなどの微生物細胞；などが挙げられる。また、細胞は、単一細胞でもよいし、細胞同士が凝集して塊になったもの（スフェロイド）であってもよい。本明細書において「細胞」と記載した場合、単一の細胞および複数の細胞が凝集した塊の何れの概念も包含する。
　導入工程は、改変用組成物１を細胞に導入できれば特に制限はなく、エレクトロポレーション等、公知の方法を用いればよい。また、変形例２に係る改変用組成物としてＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスを用いた場合は、公知の方法により細胞に感染させればよい。なお、変形例２に係る改変用組成物１を用いた場合は、導入工程の後に、細胞内においてＲＮＡ２および融合タンパク質３が形成される工程を含む。
　改変工程では、細胞に導入された改変用組成物１のハイブリダイズ領域２１が核酸配列４にハイブリダイズし、改変ドメイン３２が核酸配列４の標的部位４１を改変する。なお、上記のとおり、一つの標的部位４１を改変するために必要なハイブリダイズ領域２１は一つであってもよいし、２つであってもよい。しかしながら、本出願で開示する改変用組成物１は、一つのガイド領域２２に２つ以上の認識領域２３を含むことができる。したがって、一つの標的部位４１を改変するために必要なハイブリダイズ領域２１が一つでも、核酸配列４の改変に必要な数の融合タンパク質３と複合体を形成できるように認識領域２３を設計できる。一つの標的部位４１を改変するために必要なハイブリダイズ領域２１を一つにした場合には、製造コストの削減や実験の利便性が向上できる。
　改変方法は、導入工程の前に、核酸配列４の標的部位４１の５’側または３’側の配列にハイブリダイズし得るハイブリダイズ領域２１を特定するハイブリダイズ領域特定工程を含んでもよい。ハイブリダイズ領域特定工程で特定したハイブリダイズ領域２１を含めてＲＮＡ２全体を作製してもよい。また、ユーザー側でハイブリダイズ領域２１と第１相補領域２４を作製し、別途提供されたガイド領域２２および融合タンパク質３と組み合わせることで、改変用組成物１を作製し改変方法を実施してもよい。
　改変方法は、導入工程の前に、核酸配列４の改変に必要な数の融合タンパク質３と複合体を形成できるように、認識領域２３の数およびＲＮＡ配列を少なくとも設計するガイド領域設計工程を含んでもよい。ガイド領域設計工程は、必要に応じて、２以上の認識領域２３を連結するリンカー配列の設計を含んでもよい。一つのガイド領域２２が、２つ以上の融合タンパク質３と複合体を形成し、当該融合タンパク質３に含まれる改変ドメイン３２が核酸配列４を改変することは知られていない。したがって、上記ガイド領域設計工程は新規工程である。
　また、ＤＮＡは自己修復機能を有する。したがって、核酸配列４がゲノムＤＮＡの場合、改変工程実施後に、必要に応じて標的部位４１へのＤＮＡ導入工程を実施してもよい。改変ドメイン３２がＦｏｋＩ等のゲノムＤＮＡ４を切断する酵素の場合、改変工程によりゲノムＤＮＡ４の標的部位４１は切断され物理的に異なる状態に改変される。その結果、ゲノムＤＮＡ４は、機能を喪失する場合がある（ノックアウト）。一方、切断後のゲノムＤＮＡ４は自己修復機能により、切断箇所を修復する場合がある。ｓｓＯＤＮ、ｓｓＤＮＡ、または、ｄｓＤＮＡを改変組成物１と同時に細胞に導入することで、改変工程で切断されたゲノムＤＮＡ４の標的部位４１を修復する際に、切断箇所に所望のＤＮＡ断片を挿入できる。所望のＤＮＡ断片を挿入することで、ゲノムＤＮＡ４に意図した機能を追加することもできる（ノックイン）。
　なお、本出願における開示は、上記の実施形態に制限されない。本出願における開示の範囲内において、上記の各実施形態の自由な組み合わせ、あるいは各実施形態の任意の構成要素の変形、または、任意の構成要素の省略が可能である。
　以下に実施例を掲げ、本出願で開示する実施形態を具体的に説明するが、この実施例は単に実施形態の説明のためのものである。本出願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。
＜実施例１＞
　以下の手順により、改変用組成物１を作製した。
（１）融合タンパク質（ＦｏｋＩ－Ｎｏｖａ）の作製
　融合タンパク質３として、ＦｏｋＩ－Ｎｏｖａを作製した。ＦｏｋＩ－Ｎｏｖａのアミノ酸配列をＳＥＱ．ＩＤ．１（配列番号１）に示す。なお、以下の表３に示すＳＥＱ．ＩＤ．１の内、下線部分（１行目右から７列目の“Ｑ”～５行目左から１１列目の“Ｆ”）がＦｏｋＩの開裂領域（改変ドメイン３２）を示し、二重下線部分（５行目左から２８列目の“Ｋ”～６行目右から８列目の“Ｇ”）がＮＯＶＡのＲＮＡ結合領域（結合ドメイン３１）を示し、太文字下線部分（６行目右から３列目の“Ｐ”～７行目左から４列目の“Ｖ”）がＮＬＳを示す。その他は、リンカー配列等である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（１－１）発現ベクターの発現用大腸菌へのクローニング
　配列番号１に示すＦｏｋＩ－Ｎｏｖａを発現するように設計した発現ベクターを発現用大腸菌へクローニングした。１０ｎｇ／μＬの濃度に調整した発現ベクター１μＬと発現用大腸菌５０μＬを混合し、氷上で２０分静置した。その後、４２℃　１分間処理にてヒートショックを与えた後氷上に戻した。形質転換した大腸菌全量とＳＯＣ培地２５０μＬを混合し、３７℃で１時間培養した。このうち、１００μＬをＬＢプレート（抗生物質入り）に撒いて３７℃で一晩培養した。
　プレートから単一のコロニーをピックアップし、３７℃、ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ培養した。培養液と５０％グリセロール溶液を等量混合した後、－８０℃で保存した。
＜試薬＞
・発現用大腸菌：ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ
・抗生物質：カナマイシン
（１－２）１００ｍＬ培養・精製
　大腸菌グリセロールストックから植菌し、１０ｍｌのＬＢ培地（抗生物質入り）にて３７℃、ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ培養した。１００ｍＬのＬＢ培地（抗生物質入り）に、前培養液を１０ｍｌ添加し、３７℃にて培養した。ＯＤ＝０．６付近であることを確認し、ＩＰＴＧを終濃度１ｍＭになるよう添加し、２５℃でＯｖｅｒ　ｎｉｇｈｔ培養した。菌体に５ｍｌのタンパク質抽出試薬を加えて懸濁した。タンパク質抽出試薬、１０μｌのＬｙｓｏｎａｓｅ　Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を添加し、室温で５分攪拌した。遠心分離にて上清を可溶性画分として回収した。カラムにレジン１ｍｌを入れ、沈降させた。保存液を流した後、平衡バッファーを１０ｂｅｄ　ｖｏｌｕｍｅｓ入れ、レジンを平衡化した。
　可溶性画分をカラムに加え、Ｈｉｓ－Ｔａｇ融合タンパク質を結合させた。８ｂｅｄ　ｖｏｌｕｍｅｓの平衡バッファーにてカラムを洗浄した。７ｂｅｄ　ｖｏｌｕｍｅｓの平衡バッファー（１０ｍＭ　Ｉｍｉｄａｚｏｌｅを含む）にてカラムを洗浄した。３ｂｅｄ　ｖｏｌｕｍｅｓの溶出バッファーにてＨｉｓ－Ｔａｇ融合タンパク質を溶出した。
　精製後のタンパク質を、ＥｚＡｐｐｌｙ（ＡＴＴＯ）と等量混合し、９５℃　５ｍｉｎ熱処理を行い電気泳動サンプルを調整した。５－２０％　ポリアクリルアミドゲルにサンプルをアプライし、２０ｍＡ　７０ｍｉｎ泳動した。ＦｏｋＩ抗体を使用し、設計したサイズのＦｏｋＩ－Ｎｏｖａ融合タンパク質を合成できたことを確認した。
＜試薬＞
・タンパク質抽出試薬：ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）
・精製レジン：ＴＡＬＯＮ　Ｍｅｔａｌ　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｒｅｓｉｎ（タカラバイオ）
・平衡バッファー：５０ｍＭ　ｓｏｄｉｕｍ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，３００ｍＭ　ｓｏｄｉｕｍ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ；ｐＨ７．４
・溶出バッファー：５０ｍＭ　ｓｏｄｉｕｍ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，３００ｍＭ　ｓｏｄｉｕｍ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ，１５０ｍＭ　ｉｍｉｄａｚｏｌｅ；ｐＨ７．４
・泳動バッファー：２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８．３，１９２ｍＭ　Ｇｌｙｃｉｎｅ，０．１％　ＳＤＳ
（２）ＲＮＡ２（ハイブリダイズ領域２１＋ガイド領域２２）の作製
　実施例で作製したＲＮＡ２の配列をＳＥＱ．ＩＤ．２に示す。ＲＮＡ２は、以下の手順により作製した。
（ａ）ハイブリダイズ領域２１
　ｐＥＧＦＰ－Ｎ１（ＳＥＱ．ＩＤ．３）を鋳型に、
・Ｆｗプライマー（ｅＧＦＰ　Ｘｂａ５Ｐ：５’－ＧＣＴＣＴＡＧＡＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＧＴＧＴＣ－３’：ＳＥＱ．ＩＤ．４）
・Ｒｖプライマー（ｅＧＦＰ　Ｓｐｅ３Ｐ：５’－ＴＧＡＣＴＡＧＴＧＧＧＴＧＴＣＧＣＣＣＴＣＧＡＡＣＴＴＣＡＣＣＴ－３’：ＳＥＱ．ＩＤ．５）
を用い、２９０ｂｐを増幅し、両端に制限酵素サイトを付加した。ｐＣＲ２．１ベクターに、ＸｂａＩとＳｐｅＩで常法によりｌｉｇａｔｉｏｎした。
　なお、ＳＥＱ．ＩＤ．４および５のアンダーライン部分は、図５に示すＧＦＰをコードするＤＮＡ配列４と相補対を形成する配列（ハイブリダイズ領域２１の両端部）である。なお、図５では、紙面の都合上、配列番号の「ＩＤ．」を省略して記載する。
（ｂ）ガイド領域２２
　ＵＣＡＹ５Ｐ（５’－ＴＣＧＧＡＴＣＣＧＣＡＧＴＣＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＴＴＴＣＡＴＴＴＴＧＴＴＣＧＴＴＡＧＣＡＣＡＴＴＧＧＧＣＡＧＴＣＴＣＡＴ－３’：ＳＥＱ．ＩＤ．６）、および、ＵＣＡＹ３Ｐ（５’－ＧＡＡＧＡＴＣＴＣＡＡＡＡＴＧＡＡＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＧＡＣＴＧＣＣＣＡＡＴＧＴＧＣＴＡＡＣＧＡＡＣＡＡＡＡＴＧＡＡＡ－３’：ＳＥＱ．ＩＤ．７）をアニールし、伸長反応を行った。ＢａｍＨＩサイトにアニールした鋳型をＢａｍＨＩとＢｇｌＩＩで制限酵素処理し、上記（ａ）の下流側に常法によりｌｉｇａｔｉｏｎを行った。
（ｃ）ＲＮＡ２の合成
　ｐＣＲ２．１ベクターをＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素処理をおこない、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｔ７　ＫｉｔでＲＮＡを合成した。
　なお、ＲＮＡ２は、認識領域２３として非特許文献１のＦＩＧ．６のα２－ｇｌｙＲ（ＧＣＡＧＵＣＵＣＡＵＣＡＵＣＡＵＵＵＵＣＡＵＵＵＵＧ：ＳＥＱ．ＩＤ．８）を、リンカーを介して２つ含む。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
＜実施例２＞
　実施例１で作製した改変用組成物１を用い、以下の手順でＧＦＰをコードするゲノムＤＮＡ４（ＳＥＱ．ＩＤ．９）の切断実験を行った。図５は実施例２の概略を示す図である。
（１）ＧＦＰのＰＣＲ増幅
　ＳＥＱ．ＩＤ．３を鋳型にして、以下のプライマーを用い常法によりＳＥＱ．ＩＤ．９に示すＧＦＰのＰＣＲ産物を得た。
・Ｆｗプライマー（５’－ＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧ－３’：ＳＥＱ．ＩＤ．１０）
・Ｒｖプライマー（５’－ＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣＣＧ－３’：ＳＥＱ．ＩＤ．１１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
（２）上記（１）で得たＰＣＲ産物を２００ｎｇ、実施例１で作製したＲＮＡを２００ｎｇ、実施例１で作製した融合タンパク質（Ｎｏｖａ－ＦｏｋＩ）を１２５ｎｇ用いた。ＣｕｔＳｍａｒｔ　Ｂｕｆｆｅｒを用い３７℃で２時間処理した後、ＲＮａｓｅ処理し、電気泳動を行った。図６に結果を示す。図６に示す電気泳動写真の各レーンは以下のとおりである。
Ｍ：１００ｂｐ　Ｍａｒｋｅｒ
１：ＧＦＰのＰＣＲ産物のみ
２：ＧＦＰのＰＣＲ産物＋融合タンパク質
３：ＧＦＰのＰＣＲ産物＋融合タンパク質＋ＲＮＡ
　図６に示すように、レーン２の「ＧＦＰのＰＣＲ産物＋融合タンパク質」では、ＦｏｋＩにより、ＰＣＲ産物がランダムに切断されたことを確認した。一方、レーン３の「ＧＦＰのＰＣＲ産物＋融合タンパク質＋ＲＮＡ」では、改変用組成物１のハイブリダイズ領域２１がＧＦＰのＰＣＲ産物にハイブリダイズすることから、所定の長さでＰＣＲ産物が切断されることを確認した。
　なお、ハイブリダイズ領域２１は、図５に示すように、ＧＦＰをコードする配列（７１４ｂｐ）のほぼ中央付近で切断されるように設計した。そのため、図６のレーン３の矢印に示すＤＮＡ断片が、ＧＦＰをコードする配列の上流側および下流側の両方を含んでいることを確認する実験を行った。
　図６のレーン３の矢印で示すバンドを、キアゲン社の　ＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔによりゲル抽出した（以下、「バンド抽出物」と記載する。）。図５を参照して確認実験の概略を説明する。
（１）バンド抽出物の増幅
１：ＦｗプライマーにＳＥＱ．ＩＤ．１０、ＲｖプライマーにＳＥＱ．ＩＤ．１２を用いて、バンド抽出物を増幅した。増幅産物の長さは２２１ｂｐである。
２：ＦｗプライマーにＳＥＱ．ＩＤ．１３、ＲｖプライマーにＳＥＱ．ＩＤ．１１を用いて、バンド抽出物を増幅した。増幅産物の長さは２５１ｂｐである。
（２）ＳＥＱ．ＩＤ．３を鋳型にしたＧＦＰ断片の増幅
３：ＦｗプライマーにＳＥＱ．ＩＤ．１０、ＲｖプライマーにＳＥＱ．ＩＤ．１２を用いて、ＧＦＰ断片をコードする配列を増幅した。増幅産物の長さは２２１ｂｐである。
４：ＦｗプライマーにＳＥＱ．ＩＤ．１３、ＲｖプライマーにＳＥＱ．ＩＤ．１１を用いて、ＧＦＰ断片をコードする配列を増幅した。増幅産物の長さは２５１ｂｐである。
　なお、ＳＥＱ．ＩＤ．１２および１３の配列は以下の通りである。
・ＳＥＱ．ＩＤ．１２：５’－ＴＡＧＣＧＧＣＴＧＡＡＧＣＡＣＴＧＣＡＣ－３’
・ＳＥＱ．ＩＤ．１３：５’－ＡＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡＡＧ－３’
　上記増幅産物の電気泳動を行った。図７に結果を示す。図７のＭは１００ｂｐ　Ｍａｒｋｅｒ、図７のレーン１～４は上記１～４に記載の増幅産物に相当する。図７のレーン１および２に示す結果から、融合タンパク質３で切断したバンド抽出物には、ＧＦＰ断片をコードする配列の上流側と下流側が含まれていることを確認した。以上の結果より、本出願で開示する改変用組成物を用いることで、ＰＡＭ配列、ＰＦＳ配列に依存することなく核酸配列を改変できることを確認した。
　本出願で開示する核酸配列改変用組成物および核酸配列の標的部位を改変する方法を用いることで、ＰＡＭ配列、ＰＦＳ配列に依存することなく核酸配列を改変できる。したがって、製薬業界、研究機関等、ゲノム編集が必要な産業に有用である。
１…ゲノムＤＮＡ改変用組成物、２…ＲＮＡ、２１…ハイブリダイズ領域、２２…ガイド領域、２３…認識領域、２４…第１相補領域、３…融合タンパク質、３１…結合ドメイン、３２…改変ドメイン、４…核酸配列、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、４１…標的部位

Claims (17)

  1. 　ＲＮＡおよび融合タンパク質を含む核酸配列改変用組成物であって、
    　ＲＮＡは、
    　　核酸配列の標的部位の５’側または３’側の配列にハイブリダイズし得るハイブリダイズ領域と、
    　　融合タンパク質をガイドするガイド領域と、
    を含み、
    　　ガイド領域は、融合タンパク質と複合体を形成する認識領域を含み、
    　融合タンパク質は、
    　　前記ＲＮＡの認識領域を認識し、認識領域と複合体を形成する結合ドメインと（但し、結合ドメインがＣａｓタンパク質群のＲＮＡ認識領域を含むことを除く。）、
    　　核酸配列の標的部位を改変する改変ドメインと、
    を含む
    　核酸配列改変用組成物。
  2. 　融合タンパク質は、結合ドメインおよび改変ドメインを連結するリンカー配列を含む
    　請求項１に記載の核酸配列改変用組成物。
  3. 　ガイド領域が、認識領域を２つ含む
    　請求項１または２に記載の核酸配列改変用組成物。
  4. 　ハイブリダイズ領域の一端部に接続した第１相補領域を含み、
    　第１相補領域がガイド領域の一端部側と相補対を形成することで、ハイブリダイズ領域およびガイド領域が間接的に接続する
    　請求項１～３の何れか一項に記載の核酸配列改変用組成物。
  5. 　ガイド領域が、ステムループを含む
    　請求項１～４の何れか一項に記載の核酸配列改変用組成物。
  6. 　結合ドメインが、ＮｏｖａのＲＮＡ結合領域を含み、
    　改変ドメインが、ゲノムＤＮＡを切断するＦｏｋＩの開裂領域を含む
    　請求項１～５の何れか一項に記載の核酸配列改変用組成物。
  7. 　核酸配列が、ゲノムＤＮＡである
    　請求項１～６の何れか一項に記載の核酸配列改変用組成物。
  8. 　請求項１～７の何れか一項に記載のＲＮＡを転写するための鋳型となる核酸、および、
    　請求項１～７の何れか一項に記載の融合タンパク質を翻訳するための鋳型となる核酸、
    を含む
    　核酸配列改変用組成物。
  9. 　請求項１～７の何れか一項に記載の核酸配列改変用組成物を形成するための、ＲＮＡ。
  10. 　請求項８に記載の核酸配列改変用組成物を形成するための、ＲＮＡを転写するための鋳型となる核酸。
  11. 　請求項１～７の何れか一項に記載の核酸配列改変用組成物を形成するための、融合タンパク質。
  12. 　請求項８に記載の核酸配列改変用組成物を形成するための、融合タンパク質を翻訳するための鋳型となる核酸。
  13. 　核酸配列の標的部位を改変する方法であって、該方法は、
    　　請求項１～８の何れか一項に記載の核酸配列改変用組成物を細胞に導入する導入工程と、
    　　改変ドメインが核酸配列の標的部位を改変する改変工程と、
    を含む
    　核酸配列の標的部位を改変する方法。
  14. 　導入工程の前に、核酸配列の標的部位の５’側または３’側の配列にハイブリダイズし得るハイブリダイズ領域を特定するハイブリダイズ領域特定工程を含む
    　請求項１３に記載の核酸配列の標的部位を改変する方法。
  15. 　一つの標的部位を改変するために必要なハイブリダイズ領域が一つである、
    　請求項１３または１４に記載の核酸配列の標的部位を改変する方法。
  16. 　ガイド領域が、認識領域を２つ含む
    　請求項１５に記載の核酸配列の標的部位を改変する方法。
  17. 　導入工程の前に、核酸配列の改変に必要な数の融合タンパク質と複合体を形成できるように、認識領域の数およびＲＮＡ配列を少なくとも設計するガイド領域設計工程を含む
    　請求項１６に記載の核酸配列の標的部位を改変する方法。
     
     
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Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4968498B2 (ja) 2002-01-23 2012-07-04 ユニバーシティ オブ ユタ リサーチ ファウンデーション ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いる、標的化された染色体変異誘発
JP2013513389A (ja) 2009-12-10 2013-04-22 リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ Ｔａｌエフェクターに媒介されるｄｎａ修飾
WO2013058404A1 (ja) * 2011-10-21 2013-04-25 国立大学法人九州大学 Pprモチーフを利用したrna結合性蛋白質の設計方法及びその利用
JP5266210B2 (ja) 2006-05-25 2013-08-21 サンガモ バイオサイエンシズ インコーポレイテッド 改変開裂ハーフドメイン
JP2015527889A (ja) 2012-07-25 2015-09-24 ザ ブロード インスティテュート， インコーポレイテッド 誘導可能なｄｎａ結合タンパク質およびゲノム撹乱ツール、ならびにそれらの適用
JP2016500262A (ja) 2012-12-12 2016-01-12 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッ 遺伝子産物の発現を変更するためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系および方法
JP2016501532A (ja) 2012-12-12 2016-01-21 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッ 配列操作のための改善された系、方法および酵素組成物のエンジニアリングおよび最適化
JP2016501531A (ja) 2012-12-12 2016-01-21 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 配列操作および治療適用のための系、方法および組成物の送達、エンジニアリングおよび最適化
WO2019217942A1 (en) * 2018-05-11 2019-11-14 Beam Therapeutics Inc. Methods of substituting pathogenic amino acids using programmable base editor systems
WO2020045281A1 (ja) 2018-08-27 2020-03-05 国立大学法人広島大学 新規ヌクレアーゼドメインおよびその利用
JP2020510038A (ja) * 2017-03-09 2020-04-02 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ がんワクチン

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20190177378A1 (en) * 2016-08-10 2019-06-13 Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation Dna-binding protein using ppr motif, and use thereof
CN118421665A (zh) * 2017-10-06 2024-08-02 俄勒冈健康与科学大学 用于编辑rna的组合物和方法
JP7506405B2 (ja) * 2018-05-01 2024-06-26 ウェイク・フォレスト・ユニバーシティ・ヘルス・サイエンシーズ 真核生物の遺伝子編集のためのレンチウイルスベースのベクターならびに関連システムおよび方法
KR102898966B1 (ko) * 2019-05-29 2025-12-10 고쿠리쓰다이가쿠호진 규슈다이가쿠 응집이 적은 피피알 단백질 및 그의 이용
JP7606176B2 (ja) * 2019-12-18 2024-12-25 イースト チャイナ ノーマル ユニバーシティ ゲノム編集効率を向上させる融合タンパク質及びその使用
US20230416709A1 (en) * 2020-11-06 2023-12-28 Editforce, Inc. Foki nuclease domain mutant

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4968498B2 (ja) 2002-01-23 2012-07-04 ユニバーシティ オブ ユタ リサーチ ファウンデーション ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いる、標的化された染色体変異誘発
JP5266210B2 (ja) 2006-05-25 2013-08-21 サンガモ バイオサイエンシズ インコーポレイテッド 改変開裂ハーフドメイン
JP2013513389A (ja) 2009-12-10 2013-04-22 リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ Ｔａｌエフェクターに媒介されるｄｎａ修飾
WO2013058404A1 (ja) * 2011-10-21 2013-04-25 国立大学法人九州大学 Pprモチーフを利用したrna結合性蛋白質の設計方法及びその利用
JP2015527889A (ja) 2012-07-25 2015-09-24 ザ ブロード インスティテュート， インコーポレイテッド 誘導可能なｄｎａ結合タンパク質およびゲノム撹乱ツール、ならびにそれらの適用
JP2016500262A (ja) 2012-12-12 2016-01-12 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッ 遺伝子産物の発現を変更するためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系および方法
JP2016501532A (ja) 2012-12-12 2016-01-21 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッ 配列操作のための改善された系、方法および酵素組成物のエンジニアリングおよび最適化
JP2016501531A (ja) 2012-12-12 2016-01-21 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 配列操作および治療適用のための系、方法および組成物の送達、エンジニアリングおよび最適化
JP2020510038A (ja) * 2017-03-09 2020-04-02 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ がんワクチン
WO2019217942A1 (en) * 2018-05-11 2019-11-14 Beam Therapeutics Inc. Methods of substituting pathogenic amino acids using programmable base editor systems
WO2020045281A1 (ja) 2018-08-27 2020-03-05 国立大学法人広島大学 新規ヌクレアーゼドメインおよびその利用

Non-Patent Citations (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A. KOMOR ET AL.: "Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage", NATURE, vol. 533, 2016, pages 420 - 424, XP093078921, DOI: 10.1038/nature17946
C. LI ET AL.: "Expanded base editing in rice and wheat using a Cas9-adenosine deaminase fusion", GENOME BIOLOGY, vol. 19, 2018, XP055655088, DOI: 10.1186/s13059-018-1443-z
D. SHARMAL ET AL.: "The kinetic landscape of an RNA-binding protein in cells", NATURE, vol. 591, 4 March 2021 (2021-03-04)
K. JENSEN ET AL.: "The tetranucleotide UCAY directs the specific recognition of RNA by the Nova K-homology 3 domain", PNAS, vol. 97, no. 11, 2000, pages 5740 - 5745
L. LOWDER ET AL.: "A CRISPR/Cas9 Toolbox for Multiplexed Plant Genome Editing and Transcriptional Regulation", PLANT PHYSIOLOGY, vol. 169, no. 2, 2015, pages 971 - 85, XP055548389, DOI: 10.1104/pp.15.00636
L. LOWDER ET AL.: "Robust Transcriptional Activation in Plants Using Multiplexed CRISPR-Act 2.0 and mTALE-Act Systems", MOLECULAR PLANT, vol. 11, 2018, pages 245 - 256, XP055577314, DOI: 10.1016/j.molp.2017.11.010
LAPINAITE AUDRONE, DOUDNA JENNIFER A., CATE JAMIE H. D.: "Programmable RNA recognition using a CRISPR-associated Argonaute", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, vol. 115, no. 13, 27 March 2018 (2018-03-27), pages 3368 - 3373, XP093046666, ISSN: 0027-8424, DOI: 10.1073/pnas.1717725115 *
M. BOETTCHER ET AL.: "Choosing the Right Tool for the Job: RNAi, TALEN, or CRISPR", MOLECULAR CELL, vol. 58, no. 4, 2015, pages 575 - 85, XP029129109, DOI: 10.1016/j.molcel.2015.04.028
M. HAFNER ET AL.: "Transcriptome-wide Identification of RNA-Binding Protein and MicroRNA Target Sites by PAR-CLIP", CELL, vol. 141, 2010, pages 129 - 141, XP055293783, DOI: 10.1016/j.cell.2010.03.009
M. HALLIER ET AL.: "The Transcription Factor Spi-l/PU.1 Binds RNA and Interferes with the RNA-binding Protein p54nrb", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 271, no. 19, 1996, pages 11177 - 11181
M. JINEK ET AL.: "A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity", SCIENCE, vol. 337, 2012, pages 816 - 821, XP055229606, DOI: 10.1126/science.1225829
MARINA ET AL.: "Evaluation of Engineered CRISPR-Cas-Mediated Systems for Site-Specific RNA Editing", CELL REPORTS, vol. 33, 3 November 2020 (2020-11-03), pages 108350, XP055898294, DOI: 10.1016/j.celrep.2020.108350
N. SHIINAET ET AL.: "A Novel RNA-Binding Protein in Neuronal RNA Granules: Regulatory Machinery for Local Translation", THE JOURNAL OF NEUROSCIENCE, vol. 25, no. 17, 27 April 2005 (2005-04-27), pages 4420 - 4434
P. BIELLI ET AL.: "The RNA-binding protein Sam68 is a multifunctional player in human cancer", ENDOCRINE-RELATED CANCER, vol. 18, 2011, pages R91 - R102
S. MORITA ET AL.: "Targeted DNA demethylation in vivo using dCas9-peptide repeat and scFv-TET1 catalytic domain fusions", NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 34, 2016, pages 1060 - 1065, XP055459997, DOI: 10.1038/nbt.3658
See also references of EP4400586A4
T. SAKUMA ET AL.: "Repeating pattern of non-RVD variations in DNA-binding modules enhances TALEN activity", SCIENTIFIC REPORTS, vol. 3, 2013, XP055594242, DOI: 10.1038/srep03379
W. ZHANGET ET AL.: "RNA", vol. 8, 2002, CAMBRIDGE UNIVERSITY PRESS, article "Region-specific alternative splicing in the nervous system: Implications for regulation by the RNA-binding protein NAPOR", pages: 671 - 685
WANG ET AL.: "Induced ncRNAs allosterically modify RNA-binding proteins in cis to inhibit transcription", NATURE, vol. 454, 3 July 2008 (2008-07-03)

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