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WO2023038088A1 - トリスルフィド化合物を用いる、肝細胞増殖因子中のチロシン残基のニトロ化を防止する方法 - Google Patents

トリスルフィド化合物を用いる、肝細胞増殖因子中のチロシン残基のニトロ化を防止する方法 Download PDF

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Publication number
WO2023038088A1
WO2023038088A1 PCT/JP2022/033764 JP2022033764W WO2023038088A1 WO 2023038088 A1 WO2023038088 A1 WO 2023038088A1 JP 2022033764 W JP2022033764 W JP 2022033764W WO 2023038088 A1 WO2023038088 A1 WO 2023038088A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
trisulfide
compound
nitration
pharmaceutically acceptable
acceptable salt
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2022/033764
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
隆一 辰巳
真子 中村
悦男 大島
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kyushu University NUC
Kyowa Hakko Bio Co Ltd
Original Assignee
Kyushu University NUC
Kyowa Hakko Bio Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyushu University NUC, Kyowa Hakko Bio Co Ltd filed Critical Kyushu University NUC
Priority to EP22867409.9A priority Critical patent/EP4400103A4/en
Priority to CN202280060120.3A priority patent/CN117915911A/zh
Priority to US18/689,734 priority patent/US20240374561A1/en
Priority to JP2023546987A priority patent/JP7659282B2/ja
Publication of WO2023038088A1 publication Critical patent/WO2023038088A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
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    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6949—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit inclusion complexes, e.g. clathrates, cavitates or fullerenes
    • A61K47/6951—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit inclusion complexes, e.g. clathrates, cavitates or fullerenes using cyclodextrin
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07D341/00—Heterocyclic compounds containing rings having three or more sulfur atoms as the only ring hetero atoms
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a method for preventing nitration of tyrosine residues in hepatocyte growth factor using trisulfide compounds.
  • Hepatocyte growth factor (hereinafter also referred to as "HGF") was discovered as an in vivo protein that promotes the proliferation of mature hepatocytes. It has various physiological activities such as motility promotion, cell death suppression, morphogenesis induction, anti-fibrosis, and angiogenesis, and various tissues and organs such as liver, gastrointestinal mucosa, nerves, lungs, kidneys, heart, and skin. It has been clarified that it is responsible for the regeneration and protection of
  • HGF is an activator of muscle stem cells (satellite cells), and satellite cells are known to contribute to regeneration of muscle fibers (Non-Patent Document 1).
  • Non-Patent Documents 2 and 8 (Ryuichi Tatsumi, “Basic Science of Muscle Stem Cells and Its Health/Medical Applications", “Kyushu University” Industry-Academia-Government Exchange Promotion Seeds Presentation in Tokyo 2019, March 14, 2019) (A. Elgaabari et al., "Insight Linking Between Nitration and Myogenic Dysfunction of HGF/NK1 Domain "The 128th Annual Meeting of the Japan Society of Animal Science).
  • dysfunction of HGF causes inhibition of satellite cell activation and decreased proliferation. Therefore, nitration of tyrosine residues in the HGF protein is thought to inhibit muscle growth, hypertrophy, regeneration or maintenance, resulting in muscle atrophy, muscle regeneration failure, muscle growth inhibition and the like.
  • Trisulfide compounds such as glutathione trisulfide are converted in vivo to active sulfur molecular species such as glutathione persulfide. It has been reported that active sulfur molecular species have a strong antioxidant effect and may have physiological functions such as anti-aging (for example, Non-Patent Documents 3 and 4). Also, as a method for producing a trisulfide compound, the method described in Patent Document 1 and the like are known.
  • the purpose of the present invention is to provide a nitration inhibitor for tyrosine residues in HGF.
  • the present inventors found that only HGF among cell growth factors undergoes nitration of tyrosine residues, and considered that this nitration of tyrosine residues in HGF has important physiological significance. . Then, the present inventors found that glutathione trisulfide and lipoic acid trisulfide (compounds represented by the formula (4) described below) inhibit nitration of tyrosine residues in HGF, which is considered to be important, in a concentration-dependent manner. The present invention has been completed by discovering that it is suppressed to .
  • X represents -OR 1 or -NR 2 R 3
  • R 1 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms
  • R 2 and R 3 each independently , a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms
  • the alkyl group may have one or more substituents selected from the group consisting of an amino group and a carboxy group.
  • compound (1) a pharmaceutically acceptable salt thereof or a cyclodextrin clathrate thereof, a nitration inhibitor.
  • compound (1) a pharmaceutically acceptable salt thereof or a cyclodextrin clathrate thereof, a nitration inhibitor.
  • the glutathione trisulfide or a pharmaceutically acceptable salt thereof contains at least one selected from the group consisting of glutathione trisulfide, an amino acid salt of glutathione trisulfide, and an alkali metal salt of glutathione trisulfide, The nitration inhibitor according to [2].
  • the glutathione trisulfide or a pharmaceutically acceptable salt thereof comprises at least one selected from the group consisting of glutathione trisulfide, arginine salt of glutathione trisulfide and sodium salt of glutathione trisulfide, [ 2].
  • a method for preventing or treating muscle atrophy and/or muscle regeneration failure comprising administering the nitration inhibitor according to any one of [1] to [5] to a subject in need thereof.
  • a method for preventing or treating muscle atrophy and/or muscle regeneration failure in a pet comprising administering the nitration inhibitor according to any one of [1] to [5] to the pet.
  • the nitration inhibitor according to any one of [1] to [5] for use in preventing or treating muscle atrophy and/or muscle regeneration failure.
  • nitration inhibitor according to any one of [1] to [5] for use in suppressing or improving muscle growth inhibition (reduced meat productivity) due to heat stress in livestock or poultry.
  • a method for inhibiting nitration of tyrosine residues in hepatocyte growth factor comprising administering a trisulfide compound to a subject in need thereof, wherein the trisulfide compound is glutathione trisulfide or its pharmaceutical a salt or compound (1), a pharmaceutically acceptable salt thereof or a cyclodextrin clathrate thereof, a pharmaceutically acceptable salt thereof or a cyclodextrin clathrate thereof; .
  • the method of [16] wherein the trisulfide compound is glutathione trisulfide or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the glutathione trisulfide or a pharmaceutically acceptable salt thereof comprises at least one selected from the group consisting of glutathione trisulfide, an amino acid salt of glutathione trisulfide, and an alkali metal salt of glutathione trisulfide, The method according to [17].
  • the glutathione trisulfide or a pharmaceutically acceptable salt thereof comprises at least one selected from the group consisting of glutathione trisulfide, arginine salt of glutathione trisulfide and sodium salt of glutathione trisulfide, [ 17].
  • a trisulfide compound for use in inhibiting nitration of a tyrosine residue in hepatocyte growth factor, wherein the trisulfide compound is glutathione trisulfide or a pharmaceutically acceptable salt or compound thereof (1) A trisulfide compound which is a pharmaceutically acceptable salt thereof or a cyclodextrin clathrate thereof, a pharmaceutically acceptable salt thereof or a cyclodextrin clathrate thereof.
  • the glutathione trisulfide or a pharmaceutically acceptable salt thereof comprises at least one selected from the group consisting of glutathione trisulfide, an amino acid salt of glutathione trisulfide, and an alkali metal salt of glutathione trisulfide, A trisulfide compound for use according to [22].
  • the glutathione trisulfide or a pharmaceutically acceptable salt thereof comprises at least one selected from the group consisting of glutathione trisulfide, arginine salt of glutathione trisulfide, and sodium salt of glutathione trisulfide, [ 22].
  • [26] Use of a trisulfide compound for the production of a nitration inhibitor for tyrosine residues in hepatocyte growth factor, wherein the trisulfide compound is glutathione trisulfide or a pharmaceutically acceptable Use of a salt or compound (1), a pharmaceutically acceptable salt thereof or a cyclodextrin clathrate thereof, a pharmaceutically acceptable salt thereof or a cyclodextrin clathrate thereof. [27] The use of [26], wherein the trisulfide compound is glutathione trisulfide or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the glutathione trisulfide or a pharmaceutically acceptable salt thereof comprises at least one selected from the group consisting of glutathione trisulfide, an amino acid salt of glutathione trisulfide, and an alkali metal salt of glutathione trisulfide, Use according to [27].
  • the glutathione trisulfide or a pharmaceutically acceptable salt thereof comprises at least one selected from the group consisting of glutathione trisulfide, arginine salt of glutathione trisulfide, and sodium salt of glutathione trisulfide, [ 27].
  • the use of [26], wherein the trisulfide compound is lipoic acid trisulfide or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • a nitration inhibitor for tyrosine residues in HGF can be provided.
  • FIG. 1 shows the inhibitory effect of glutathione trisulfide on the nitration of recombinant HGF, analyzed by Western blotting.
  • FIG. 2 shows the inhibitory effect of lipoic acid trisulfide on the nitration of recombinant HGF analyzed by Western blotting.
  • the nitration inhibitor, the preventive or therapeutic agent for muscle atrophy and/or muscle regeneration failure, and the preventive or therapeutic method thereof of the present invention can be administered or applied to humans or pets.
  • the nitration inhibitor of the present invention, the agent for suppressing or improving muscle growth inhibition (decrease in meat productivity) due to heat stress, and the method for suppressing or improving the same may be administered or applied to livestock or poultry. can be done.
  • tyrosine residues 198 and 250 can be nitrated.
  • tyrosine residues corresponding to tyrosine residues 198 and 250 of human HGF can be nitrated.
  • the tyrosine residue corresponding to the 250th tyrosine residue in human HGF can be nitrated. Nitration of the 198th and/or 250th tyrosine residues in human HGF and the corresponding positions of tyrosine residues in non-human-derived HGF abolishes the activity of HGF.
  • the nitration inhibitor of the present invention is capable of inhibiting nitration of the tyrosine residue at the specific position described above.
  • the trisulfide compound used in the nitration inhibitor of the present invention is glutathione trisulfide or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or compound (1), a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a cyclodextrin inclusion thereof. is the body.
  • Glutathione trisulfide is represented by formula (2).
  • pharmaceutically acceptable salts include, for example, salts with inorganic acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid; acetic acid, succinic acid, fumaric acid, maleic acid, tartaric acid , citric acid, lactic acid, stearic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, salts with organic acids such as p-toluenesulfonic acid; salts with alkali metals such as sodium and potassium; alkalis such as calcium and magnesium salts with earth metals; ammonium salts; and salts with amino acids such as arginine.
  • inorganic acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid
  • acetic acid succinic acid, fumaric acid, maleic acid, tartaric acid , citric acid, lactic acid, stearic acid, benzoic acid
  • the pharmaceutically acceptable salt of glutathione trisulfide is preferably an amino acid salt or an alkali metal salt, more preferably an arginine salt or a sodium salt.
  • a pharmaceutically acceptable salt of compound (1) is preferably a salt with an alkali metal, more preferably a sodium salt.
  • Glutathione trisulfide or a pharmaceutically acceptable salt thereof or compound (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof may exist in crystalline polymorphism, but is limited to any crystal form. It may be a single substance or a mixture of any crystal forms.
  • glutathione trisulfide or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or compound (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof includes an amorphous form.
  • Glutathioni trisulfide or a pharmaceutically acceptable salt thereof or Compound (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof includes anhydrides and solvates (especially hydrates).
  • Compound (1) in one embodiment, has the formula (3) [In the formula, R 1 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. ] and R 1 can be, for example, a hydrogen atom, a methyl group, an ethyl group, a propyl group, a butyl group, a pentyl group, a hexyl group. Preferably, R 1 is a hydrogen atom, in which case the compound of formula (3) is lipoic acid trisulfide of formula (4).
  • Compound (1) in another embodiment, has the formula (5) [wherein R 2 and R 3 each independently represent a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and the alkyl group is selected from the group consisting of an amino group and a carboxy group. It may have one or more substituents. ].
  • R2 and R3 may be a hydrogen atom, an alkyl group such as a methyl group, an ethyl group, a propyl group, a butyl group, a pentyl group, a hexyl group, and the like. These alkyl groups may have one or both of an amino group and a carboxy group.
  • R 2 and R 3 may be, for example, groups represented by formula (6) (wherein * represents a bond).
  • Specific examples of the compound represented by formula (5) include, for example, a compound in which both R 2 and R 3 are hydrogen atoms, and a group represented by formula (6) in which R 2 is a hydrogen atom and R 3 is represented by formula (6). compound.
  • the compound represented by the formula (5) is obtained by a step of oxidizing the compound represented by the formula (5a) with an oxidizing agent to obtain a sulfoxide compound (step 1), and reacting the obtained sulfoxide compound with a sulfur source. It can be manufactured by the process (process 2).
  • R 2 and R 3 are each independently a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and the alkyl group is one or more substituents selected from the group consisting of an amino group and a carboxy group. may have ]
  • Steps 1 and 2 may be reacted in one pot without isolating the sulfoxide compound.
  • the solvent used in step 1 is not particularly limited as long as it dissolves the compound represented by formula (5a) and the oxidizing agent and does not inhibit the oxidation reaction.
  • a solvent include water, aqueous sulfuric acid solution, aqueous ethanol solution and aqueous acetonitrile solution, preferably water.
  • the amount of solvent used in step 1 can be 1 mL to 500 mL, preferably 10 mL to 20 mL, per 1 g of the compound represented by formula (5a).
  • Oxidizing agents used in step 1 include potassium peroxymonosulfate (sold under trade names such as Oxone (registered trademark)), peracetic acid, hydrogen peroxide and sodium periodate. Hydrogen peroxide may be used with catalytic amounts of methyltrioxorhenium. Potassium peroxymonosulfate is the preferred oxidizing agent from the standpoint of safety and cost.
  • the amount of the oxidizing agent used can be 0.8 equivalents to 2.0 equivalents, preferably 1.0 equivalents to 1.3 equivalents, relative to 1 equivalent of the compound represented by formula (5a). Equivalent.
  • the reaction temperature in step 1 can be -20°C to 30°C, preferably -5°C to 5°C.
  • the reaction time in step 1 can be 5 minutes to 24 hours, preferably 0.5 hours to 2 hours.
  • the solvent used in step 2 is not particularly limited as long as it dissolves the sulfoxide compound and the sulfur source and does not inhibit the subsequent reaction.
  • examples of such a solvent include water, aqueous sulfuric acid solution, aqueous ethanol solution and aqueous acetonitrile solution, preferably water.
  • the amount of solvent used in step 2 can be 1 mL to 500 mL, preferably 10 mL to 20 mL, per 1 g of the sulfoxide compound.
  • the sulfur source used in step 2 includes sodium sulfide, potassium sulfide, sodium hydrogen sulfide, potassium hydrogen sulfide and hydrogen sulfide.
  • the amount of sulfur source used can be from 0.5 equivalents to 4.0 equivalents, preferably from 0.9 equivalents to 1.2 equivalents, relative to one equivalent of the sulfoxide compound.
  • the reaction temperature in step 2 can be -20°C to 30°C, preferably -5°C to 25°C.
  • the reaction time in step 2 can be 10 minutes to 2 days, preferably 0.5 hours to 2 hours.
  • the reaction solvent includes, for example, water, an aqueous sulfuric acid solution, an aqueous ethanol solution, and an aqueous acetonitrile solution, preferably water, and the amount of the solvent is represented by formula (5a). It can be from 1 mL to 500 mL, preferably from 10 mL to 20 mL, for 1 g of the compound used.
  • Oxidizing agents used include potassium peroxymonosulfate, peracetic acid, hydrogen peroxide (which may be used with a catalytic amount of methyltrioxorhenium) and sodium periodate, preferably potassium peroxymonosulfate.
  • the amount of the oxidizing agent used can be 0.8 equivalents to 2.0 equivalents, preferably 1.0 equivalents to 1.3 equivalents.
  • the sulfur source used includes sodium sulfide, potassium sulfide, sodium hydrogen sulfide, potassium hydrogen sulfide and hydrogen sulfide, and the amount of sulfur source used is can be 0.5 equivalents to 4.0 equivalents, preferably 0.9 equivalents to 1.2 equivalents.
  • the reaction temperature can be -20°C to 30°C, preferably -5°C to 25°C.
  • the reaction time can be from 15 minutes to 2 days, preferably from 1 hour to 4 hours.
  • a step of protecting a functional group such as a hydroxy group, a carbonyl group, an amino group and a carboxy group and a step of deprotecting the protected functional group may be included as necessary.
  • Protecting groups and protection/deprotection reactions for these functional groups are well known to those skilled in the art, and refer to "Greene's Protective Groups in Organic Synthesis" etc. to select appropriate protecting groups and protection/deprotection reactions. be able to.
  • a compound represented by formula (5a) can be produced by condensing lipoic acid and NHR 2 R 3 .
  • Solvents for the condensation reaction include, for example, dichloromethane, chloroform and tetrahydrofuran, preferably tetrahydrofuran.
  • the amount of solvent can be from 1 mL to 200 mL, preferably from 3 mL to 35 mL, per 1 g of the compound of formula (5a).
  • Condensing agents used include, for example, 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide (EDC) and salts thereof, N,N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC), diisopropylcarbodiimide (DIC) (N-hydroxysuccinimide (NHS), 1-hydroxybenzotriazole (HOBt) may be used as an additive.).
  • the amount of condensing agent used can be 0.8 equivalents to 2.0 equivalents, preferably 1.0 equivalents to 1.5 equivalents, relative to 1 equivalent of the compound represented by formula (5a). Equivalent.
  • the temperature of the reaction can be -10°C to 40°C, preferably 15°C to 25°C.
  • the reaction time can be from 1 hour to 3 days, preferably from 1 hour to 24 hours.
  • the compound represented by the formula (3), wherein R 1 is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms is prepared by oxidizing the compound represented by the formula (3a) with an oxidizing agent to obtain a sulfoxide compound (step 1); And it can be produced by a step (step 2) of reacting the obtained sulfoxide compound with a sulfur source.
  • the reaction conditions are the same as above.
  • R 1 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • a compound represented by formula (3a) can be produced by condensing lipoic acid and R 1 OH. Same as above.
  • the compound represented by formula (3), wherein R 1 is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, can also be produced by condensing lipoic acid trisulfide and R 1 OH.
  • the condensation conditions are the same as above.
  • the cyclodextrin may be ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin or derivatives thereof.
  • “derivative” means that at least one hydrogen atom of a hydroxyl group of each cyclodextrin is substituted with an optionally substituted alkyl group or sugar.
  • Cyclodextrin derivatives are, for example, methyl- ⁇ -cyclodextrin, methyl- ⁇ -cyclodextrin, methyl- ⁇ -cyclodextrin, dimethyl- ⁇ -cyclodextrin, dimethyl- ⁇ -cyclodextrin, dimethyl- ⁇ -cyclodextrin, hydroxy ethyl- ⁇ -cyclodextrin, hydroxyethyl- ⁇ -cyclodextrin, hydroxyethyl- ⁇ -cyclodextrin, 2-hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin, 2-hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin, 2-hydroxypropyl- ⁇ - Cyclodextrin, glucosyl- ⁇ -cyclodextrin, glucosyl- ⁇ -cyclodextrin, glucosyl- ⁇ -cyclodextrin, glucosyl- ⁇ -cyclodextrin, glucosyl- ⁇ -cyclodextrin, maltosyl
  • the cyclodextrin clathrate is prepared by dissolving cyclodextrin in a solvent (step a) and adding compound (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof to the resulting solution and stirring (step b) and a step of filtering the stirred liquid, washing with the same solvent as the solvent used in step a, freezing the filtrate, and freeze-drying (step c). Note that the filtration and washing operations in step c may be omitted.
  • the solvent used in step a is preferably water.
  • the amount of solvent used in step a can be 1-350 ml, preferably 1-80 ml, per 1 g of cyclodextrin.
  • the mass ratio of cyclodextrin to compound (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof can be 2-20, preferably 5-16.5.
  • the stirring temperature in step b can be 20 to 50°C, and may be room temperature.
  • the stirring time in step b can be 0.25 to 40 hours, preferably 2 to 35 hours.
  • step b after adding compound (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, the same solvent as used in step a may be added before stirring.
  • the amount of the solvent can be 0-30 ml, preferably 0-20 ml, per 1 g of cyclodextrin.
  • the amount of solvent used in step c can be 0-150 ml, preferably 0-20 ml, per 1 g of cyclodextrin.
  • the freezing temperature in step c can be -30 to -20°C, preferably -20°C.
  • the freezing time in step c can be 10 to 50 hours.
  • the freeze-drying in step c can be performed at an absolute pressure of 20 to 100 Pa and an external temperature of 10 to 40°C, preferably 20°C.
  • the freeze-drying period in step c can be 1 to 5 days.
  • the preventive or therapeutic agent for muscle atrophy and/or muscle regeneration failure of the present invention contains the nitration inhibitor.
  • the muscle atrophy in the present invention includes those caused by a state in which the muscle is not used for a long time or a state in which the frequency or strength of muscle use is reduced due to aging, bedriddenness, trauma, postoperative immobilization, weightlessness, disease, or the like.
  • Muscle atrophy or muscle regeneration failure in the present invention is related to disorders of muscle growth, hypertrophy, regeneration or maintenance triggered by inhibition of activation or decreased proliferation of muscle stem cells (satellite cells), such as age-related sarcopenia.
  • muscle stem cells satellite cells
  • amyotrophic lateral sclerosis, spinal muscular atrophy, spinobulbar muscular atrophy, and muscular dystrophy can be exemplified as typical examples.
  • pets examples include dogs, cats, hamsters, rabbits, ferrets, parakeets, bunchos, and parrots.
  • the dosage of the nitration inhibitor, preventive or therapeutic agent for muscle atrophy and muscle regeneration failure of the present invention is a therapeutically effective amount, and varies depending on symptoms, age, administration method, dosage form, and the like.
  • glutathione trisulfide or its pharmaceutically acceptable salt or compound (1) its pharmaceutically acceptable salt or their cyclodextrin clathrate 0.5 to 2000 mg can be administered, and 1 to 800 mg is preferably administered once or several times a day for consecutive days. It is believed that doses of the above compounds within this range will exhibit preventive or therapeutic effects on muscle atrophy and muscle regeneration failure.
  • the dosage of the nitration inhibitor, preventive or therapeutic agent for muscle atrophy and muscle regeneration failure of the present invention is a therapeutically effective amount, and varies depending on symptoms, age, administration method, dosage form, and the like.
  • a pharmaceutically acceptable salt thereof or a cyclodextrin clathrate thereof 0.1 to 400 mg/kg can be administered per day, preferably 0.1 to 400 mg/kg once or several times per day for continuous administration. It is believed that doses of the above compounds within this range will exhibit preventive or therapeutic effects on muscle atrophy and muscle regeneration failure.
  • An agent for suppressing or improving muscle growth inhibition (decrease in meat productivity) due to heat stress in livestock or poultry contains the nitration inhibitor.
  • causes of muscle growth inhibition (decrease in meat productivity) due to heat stress in livestock or poultry in the present invention include an increase in the outside temperature of the livestock or poultry breeding environment due to summer heat, and the temperature in the livestock or poultry breeding management area. Abnormalities/deviations in management, etc. can be mentioned. These causes are thought to cause respiratory alkalosis, decreased thyroid hormone, increased corticosterone, altered immune response, and overproduction of mitochondrial reactive oxygen species (ROS) in livestock or poultry. be done. As a result, muscle stem cell (satellite cell) activation inhibition and proliferation decrease lead to muscle growth, hypertrophy, regeneration, or maintenance disorders, resulting in a decrease in meat productivity.
  • ROS mitochondrial reactive oxygen species
  • Livestock or poultry include, for example, cattle, horses, pigs, donkeys, sheep, goats, chickens, ducks, geese, ostriches, turkeys, ducks, and quails.
  • the dosage of the nitration inhibitor of the present invention and the inhibitor or ameliorator of muscle growth inhibition (decrease in meat productivity) for livestock or poultry is a therapeutically effective amount, and varies depending on symptoms, administration method, and the like.
  • glutathione trisulfide or a pharmaceutically acceptable salt thereof or compound (1) a pharmaceutically acceptable salt thereof or a cyclodextrin clathrate thereof, 0.1 to 400 mg/kg can be administered per day, preferably 0.1 to 400 mg/kg once or several times per day for continuous administration. It is believed that when the dose of the above compound is within this range, the effect of suppressing or improving muscle growth inhibition (decrease in meat productivity) in livestock or poultry is exhibited.
  • the nitration inhibitor, muscle atrophy and/or muscle regeneration failure preventive or therapeutic agent, and muscle growth inhibition (decrease in meat productivity) inhibitor or ameliorator of the present invention are, for example, tablets, capsules, powders, granules, It can be administered orally as a liquid or syrup, or parenterally as an injection, infusion, or suppository. These dosage forms can be formulated by known formulation techniques.
  • pharmaceutically acceptable excipients such as starch, lactose, refined sucrose, glucose, crystalline cellulose, carboxycellulose, carboxymethylcellulose, carboxyethylcellulose, calcium phosphate, magnesium stearate, Gum arabic and the like can be blended, and if necessary, lubricants, binders, disintegrants, coating agents, coloring agents and the like can be blended.
  • lubricants such as starch, lactose, refined sucrose, glucose, crystalline cellulose, carboxycellulose, carboxymethylcellulose, carboxyethylcellulose, calcium phosphate, magnesium stearate, Gum arabic and the like
  • lubricants such as starch, lactose, refined sucrose, glucose, crystalline cellulose, carboxycellulose, carboxymethylcellulose, carboxyethylcellulose, calcium phosphate, magnesium stearate, Gum arabic and the like
  • lubricants such as starch, lactose, refined sucrose, glucose, crystalline cellulose, carboxycellulose, carboxy
  • GSSSG means glutathione trisulfide.
  • Experimental example 1 ⁇ Inhibitory effect of GSSSG on nitration of recombinant HGF protein by peroxynitrite (ONOO ⁇ )>
  • a recombinant mouse HGF purified preparation (2207-HG-025/CF, manufactured by R&D Systems, containing no carrier protein) dissolved in PBS was added with a HGF:GSSSG molar ratio of 1:10, 1:50 or 1:400.
  • a sample was prepared by adding and mixing the GSSSG dihydrate produced by the method described in Patent Document 1 so that it became.
  • a sample was also prepared in which no GSSSG dihydrate was added and the HGF:GSSSG molar ratio was 1:0.
  • Peroxynitrite (ONOO ⁇ ) was immediately added to each sample such that the HGF:ONOO ⁇ molar ratio was 1:500.
  • a nitration sample was obtained by holding at pH 7.2-7.4 and 25-37° C. for 30 minutes (nitration treatment).
  • Nitrated bovine serum albumin (BSA nitro ) was used as a positive control sample.
  • PL Protein Ladder
  • MW-STD Molecular Weight-Standard
  • material A in FIG. 1 means GSSSG.
  • Experimental example 2 ⁇ Inhibitory effect of lipoic acid trisulfide on nitration of recombinant HGF protein by peroxynitrite (ONOO ⁇ )> Nitration treatment and Western blotting were performed in the same manner as in Experimental Example 1, except that lipoic acid trisulfide was used instead of GSSSG and the molar ratio of HGF: ONOO- was changed to 1:4000.
  • material B in FIG. 1 means lipoic acid trisulfide.
  • GSSSG or a pharmaceutically acceptable salt thereof or compound (1), a pharmaceutically acceptable salt thereof or a cyclodextrin clathrate thereof is a peroxynitrite (ONOO ⁇ )-derived tyrosine residue of HGF. Since it is thought that nitration can be suppressed, it is expected to also suppress dysfunction of HGF caused by various oxidative stresses that occur in vivo.
  • GSSSG or a pharmaceutically acceptable salt thereof or Compound (1), a pharmaceutically acceptable salt thereof or a cyclodextrin clathrate thereof is caused by nitration of tyrosine residues in HGF, It is thought to have a preventive or therapeutic effect on muscle atrophy and muscle regeneration failure.
  • GSSSG or a pharmaceutically acceptable salt thereof or Compound (1), a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a cyclodextrin clathrate thereof inhibits nitration of tyrosine residues of HGF due to heat stress. It is thought that inhibition of muscle growth (decrease in meat productivity), which is the cause, can be suppressed or improved.
  • a reaction vessel was charged with 2.0 g (9.02 mmol) of lipoic acid and 40 mL of a 75% aqueous ethanol solution, and cooled to an internal temperature of 0°C. 3.4 g (10.20 mmol) of Oxone (registered trademark) was added thereto and reacted for about 2 hours. After filtering the inorganic salt in the reaction solution, it was washed with 7 mL of ethanol. 5.8 g (24.1 mmol) of sodium sulfide nonahydrate was added to the filtrate and reacted for about 1 hour.
  • Reference Example 8 Mal- ⁇ -CD clathrate of lipoic acid trisulfide (racemic) A 50 mL eggplant flask was charged with 24.2 mg (0.839 mmol) of Mal- ⁇ -CD12 and 14 mL of water. After confirming that the contents of the flask had dissolved, 100.4 mg (0.421 mmol) of lipoic acid trisulfide was added, and the inside of the flask was washed with 2 mL of water. After stirring at room temperature for 31 hours, the mixture was filtered, and the inside of the flask and the crystals were washed with 10 mL of water. The resulting filtrate was frozen in a -20°C freezer for 22 hours. It was freeze-dried at an external temperature of 20° C. for about 46 hours to obtain 1180.0 mg of clathrate (white solid).
  • Table 2 shows the yield and solubility of the clathrates obtained in Reference Examples 3-9.

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Abstract

トリスルフィド化合物を含有する肝細胞増殖因子中のチロシン残基のニトロ化抑制剤であって、上記トリスルフィド化合物は、グルタチオントリスルフィド若しくはその製剤学的に許容される塩又は式（１） で表される化合物［式中、Ｘは、－ＯＲ１又は－ＮＲ２Ｒ３を示し、Ｒ１は水素原子又は炭素数１～６のアルキル基を示し、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立に、水素原子又は炭素数１～６のアルキル基を示し、上記アルキル基は、アミノ基及びカルボキシ基からなる群より選択される１以上の置換基を有していてよい。］、その製剤学的に許容される塩若しくはそれらのシクロデキストリン包接体である、ニトロ化抑制剤。

Description

トリスルフィド化合物を用いる、肝細胞増殖因子中のチロシン残基のニトロ化を防止する方法
　本発明は、トリスルフィド化合物を用いる、肝細胞増殖因子中のチロシン残基のニトロ化を防止する方法に関する。
　肝細胞増殖因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ；以下、「ＨＧＦ」ともいう。）は、成熟肝細胞の増殖を促進する生体内タンパク質として発見されたが、その後の研究から、ＨＧＦは細胞増殖に加えて細胞運動促進、細胞死抑制、形態形成誘導、抗線維化、血管新生など多彩な生理活性を有し、肝臓のみならず、消化管粘膜、神経、肺、腎臓、心臓、皮膚など様々な組織及び臓器の再生と保護を担うことが明らかになっている（非特許文献５～７）。
　ＨＧＦは、筋幹細胞（衛星細胞）の活性化因子であることが更に報告されており、衛星細胞は、筋線維の再生等に寄与することが知られている（非特許文献１）。
　近年、ＨＧＦのタンパク質中にあるチロシン残基がニトロ化されると、ＨＧＦの生理活性が消失することが報告された（非特許文献２、８）（辰巳隆一、「筋幹細胞の基礎科学とその健康・医療応用」、『九州大学』産・学・官交流促進シーズ発表会　ｉｎ　東京２０１９、２０１９年３月１４日）（A. Elgaabariら、「Insight linking between nitration and myogenic dysfunction of HGF/NK1 domain」日本畜産学会第１２８回大会）。同報告において、ＨＧＦの機能不全が、衛星細胞の活性化阻害や増殖低下の原因となることが示唆されている。従って、ＨＧＦのタンパク質中にあるチロシン残基のニトロ化により、筋の成長、肥大、再生又は維持が阻害され、結果として、筋委縮、筋再生不全、筋成長阻害等を招くと考えられる。
　グルタチオントリスルフィドのようなトリスルフィド化合物は、生体内でグルタチオンパースルフィドのような活性イオウ分子種に転換される。活性イオウ分子種は、強力な抗酸化作用を有し、老化防止等の生理機能を有する可能性が報告されている（例えば非特許文献３，４）。また、トリスルフィド化合物の製造方法として、特許文献１に記載された方法等が知られている。
国際公開第２０１８／１１７１８６号
R.Tatsumi, "Mechano-biology of skeletal muscle hypertrophy and regeneration: possible mechanism of stretch-induced activation of resident myogenic stem cells", Animal Science Journal 81(1),11-20(2010). 今冨菜々ら、「筋幹細胞活性化因子ＨＧＦのニトロ化による不活化の生理学的意義：加齢性筋萎縮・再生不全の主要因のブレークスルー」、日本畜産学会第１２８回大会要旨 T.Ida,et al., "Reactive cysteine persulfides and S-polythiolation regulate oxidative stress and redox signaling",PNAS,May27,2014,111(21)7606-7611 T.Akaike,et al., "Cysteinyl-tRNA synthetase governs cysteine polysulfidation and mitochondrial bioenergetics", Nature Communications,2017,Oct27;8(1):1177 坪内博仁、「ＨＧＦの発見と臨床応用への展開」、日本消化器病学会雑誌、第１１０巻第１２号２０３３－２０４１頁（２０１３年） 水野信哉及び中村敏一、「再生因子ＨＧＦの臨床応用」、Drug Delivery System、 １６－６（２００１年） C. Desole, et al., "HGF and MET: From Brain Development to Neurological Disorders", Frontiers in Cell and Developmental Biology, Vol. 9（published 09 June 2021, Article 683609）. A. Elgaabari, et. al., "A pilot study on nitration/dysfunction of NK1 segment of myogenic stem cell activator HGF", Biochemistry and Biophysics Reports Vol. 31, 101295 (2022) (published June 11, 2022)
　本発明は、ＨＧＦ中のチロシン残基のニトロ化抑制剤を提供することを目的とする。
　本発明者らは、細胞増殖因子の中でＨＧＦだけがチロシン残基のニトロ化を受けることを見出し、このＨＧＦにおけるチロシン残基のニトロ化が、生理学的に重要な意義を有するものと考えた。そして、本発明者らは、グルタチオントリスルフィド及びリポ酸トリスルフィド（後述する式（４）で表される化合物）が、このように重要と考えられるＨＧＦのチロシン残基のニトロ化を濃度依存的に抑制することを見出して、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、以下の［１］～［３０］を提供する。
［１］トリスルフィド化合物を含有する肝細胞増殖因子中のチロシン残基のニトロ化抑制剤であって、上記トリスルフィド化合物は、グルタチオントリスルフィド若しくはその製剤学的に許容される塩又は式（１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 で表される化合物［式中、Ｘは、－ＯＲ１又は－ＮＲ２Ｒ３を示し、Ｒ１は水素原子又は炭素数１～６のアルキル基を示し、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立に、水素原子又は炭素数１～６のアルキル基を示し、上記アルキル基は、アミノ基及びカルボキシ基からなる群より選択される１以上の置換基を有していてよい。］（以下、「化合物（１）」ともいう。）、その製剤学的に許容される塩若しくはそれらのシクロデキストリン包接体である、ニトロ化抑制剤。
［２］上記トリスルフィド化合物が、グルタチオントリスルフィド又はその製剤学的に許容される塩である、［１］に記載のニトロ化抑制剤。
［３］上記グルタチオントリスルフィド又はその製剤学的に許容される塩が、グルタチオントリスルフィド、グルタチオントリスルフィドのアミノ酸塩及びグルタチオントリスルフィドのアルカリ金属塩からなる群から選択される少なくとも１種を含む、［２］に記載のニトロ化抑制剤。
［４］上記グルタチオントリスルフィド又はその製剤学的に許容される塩が、グルタチオントリスルフィド、グルタチオントリスルフィドのアルギニン塩及びグルタチオントリスルフィドのナトリウム塩からなる群から選択される少なくとも１種を含む、［２］に記載のニトロ化抑制剤。
［５］上記トリスルフィド化合物が、リポ酸トリスルフィド又はその製剤学的に許容される塩である、［１］に記載のニトロ化抑制剤。
［６］［１］～［５］のいずれかに記載のニトロ化抑制剤を含有する、筋萎縮及び／又は筋再生不全の予防又は治療剤。
［７］［１］～［５］のいずれかに記載のニトロ化抑制剤を、それを必要とする対象に投与する、筋萎縮及び／又は筋再生不全の予防又は治療方法。
［８］［１］～［５］のいずれかに記載のニトロ化抑制剤を愛玩動物に投与することを含む、愛玩動物の筋萎縮及び／又は筋再生不全を予防又は治療する方法。
［９］筋萎縮及び／又は筋再生不全の予防又は治療における使用のための、［１］～［５］のいずれかに記載のニトロ化抑制剤。
［１０］筋萎縮及び／又は筋再生不全の予防又は治療剤の製造のための、［１］～［５］のいずれかに記載のニトロ化抑制剤の使用。
［１１］［１］～［５］のいずれかに記載のニトロ化抑制剤を含有する、家畜又は家禽の暑熱ストレスによる筋成長阻害（食肉生産性の低下）の抑制又は改善剤。
［１２］［１］～［５］のいずれかに記載のニトロ化抑制剤を、それを必要とする家畜又は家禽に投与する、暑熱ストレスによる筋成長阻害（食肉生産性の低下）の抑制又は改善方法。
［１３］［１］～［５］のいずれかに記載のニトロ化抑制剤を家畜又は家禽に投与することを含む、家畜又は家禽の暑熱ストレスによる筋成長阻害（食肉生産性の低下）を抑制又は改善する方法。
［１４］家畜又は家禽の暑熱ストレスによる筋成長阻害（食肉生産性の低下）の抑制又は改善における使用のための、［１］～［５］のいずれかに記載のニトロ化抑制剤。
［１５］家畜又は家禽の暑熱ストレスによる筋成長阻害（食肉生産性の低下）の抑制又は改善剤の製造のための、［１］～［５］のいずれかに記載のニトロ化抑制剤の使用。
［１６］トリスルフィド化合物を、それを必要とする対象に投与する、肝細胞増殖因子中のチロシン残基のニトロ化抑制方法であって、上記トリスルフィド化合物は、グルタチオントリスルフィド若しくはその製剤学的に許容される塩又は化合物（１）、その製剤学的に許容される塩若しくはそれらのシクロデキストリン包接体、その製剤学的に許容される塩若しくはそれらのシクロデキストリン包接体である、方法。
［１７］上記トリスルフィド化合物が、グルタチオントリスルフィド又はその製剤学的に許容される塩である、［１６］に記載の方法。
［１８］上記グルタチオントリスルフィド又はその製剤学的に許容される塩が、グルタチオントリスルフィド、グルタチオントリスルフィドのアミノ酸塩及びグルタチオントリスルフィドのアルカリ金属塩からなる群から選択される少なくとも１種を含む、［１７］に記載の方法。
［１９］上記グルタチオントリスルフィド又はその製剤学的に許容される塩が、グルタチオントリスルフィド、グルタチオントリスルフィドのアルギニン塩及びグルタチオントリスルフィドのナトリウム塩からなる群から選択される少なくとも１種を含む、［１７］に記載の方法。
［２０］上記トリスルフィド化合物が、リポ酸トリスルフィド又はその製剤学的に許容される塩である、［１６］に記載の方法。
［２１］肝細胞増殖因子中のチロシン残基のニトロ化抑制における使用のための、トリスルフィド化合物であって、上記トリスルフィド化合物は、グルタチオントリスルフィド若しくはその製剤学的に許容される塩又は化合物（１）、その製剤学的に許容される塩若しくはそれらのシクロデキストリン包接体、その製剤学的に許容される塩若しくはそれらのシクロデキストリン包接体である、トリスルフィド化合物。
［２２］上記トリスルフィド化合物が、グルタチオントリスルフィド又はその製剤学的に許容される塩である、［２１］に記載の使用のためのトリスルフィド化合物。
［２３］上記グルタチオントリスルフィド又はその製剤学的に許容される塩が、グルタチオントリスルフィド、グルタチオントリスルフィドのアミノ酸塩及びグルタチオントリスルフィドのアルカリ金属塩からなる群から選択される少なくとも１種を含む、［２２］に記載の使用のためのトリスルフィド化合物。
［２４］上記グルタチオントリスルフィド又はその製剤学的に許容される塩が、グルタチオントリスルフィド、グルタチオントリスルフィドのアルギニン塩及びグルタチオントリスルフィドのナトリウム塩からなる群から選択される少なくとも１種を含む、［２２］に記載の使用のためのトリスルフィド化合物。
［２５］上記トリスルフィド化合物が、リポ酸トリスルフィド又はその製剤学的に許容される塩である、［２１］に記載の使用のためのトリスルフィド化合物。
［２６］肝細胞増殖因子中のチロシン残基のニトロ化抑制剤の製造のための、トリスルフィド化合物の使用であって、上記トリスルフィド化合物は、グルタチオントリスルフィド若しくはその製剤学的に許容される塩又は化合物（１）、その製剤学的に許容される塩若しくはそれらのシクロデキストリン包接体、その製剤学的に許容される塩若しくはそれらのシクロデキストリン包接体である、使用。
［２７］上記トリスルフィド化合物が、グルタチオントリスルフィド又はその製剤学的に許容される塩である、［２６］に記載の使用。
［２８］上記グルタチオントリスルフィド又はその製剤学的に許容される塩が、グルタチオントリスルフィド、グルタチオントリスルフィドのアミノ酸塩及びグルタチオントリスルフィドのアルカリ金属塩からなる群から選択される少なくとも１種を含む、［２７］に記載の使用。
［２９］上記グルタチオントリスルフィド又はその製剤学的に許容される塩が、グルタチオントリスルフィド、グルタチオントリスルフィドのアルギニン塩及びグルタチオントリスルフィドのナトリウム塩からなる群から選択される少なくとも１種を含む、［２７］に記載の使用。
［３０］上記トリスルフィド化合物が、リポ酸トリスルフィド又はその製剤学的に許容される塩である、［２６］に記載の使用。
　本発明によれば、ＨＧＦ中のチロシン残基のニトロ化抑制剤を提供することができる。
図１は、グルタチオントリスルフィドによる、リコンビナントＨＧＦのニトロ化の抑制効果をウエスタンブロットで解析したものである。 図２は、リポ酸トリスルフィドによる、リコンビナントＨＧＦのニトロ化の抑制効果をウエスタンブロットで解析したものである。
　以下、本発明の内容について詳細に説明するが、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。なお、本明細書では、「筋成長阻害及び／又は食肉生産性の低下」を「筋成長阻害（食肉生産性の低下）」と表すことがある。
　本発明のニトロ化抑制剤、筋萎縮及び／又は筋再生不全の予防又は治療剤、及び、同予防又は治療方法は、ヒト又は愛玩動物に対して投与又は適用されることができる。また、本発明のニトロ化抑制剤、暑熱ストレスによる筋成長阻害（食肉生産性の低下）の抑制又は改善剤、及び、同抑制又は改善方法は、家畜又は家禽に対して投与又は適用されることができる。
　ヒトＨＧＦにおいては、１９８番目及び２５０番目のチロシン残基がニトロ化され得る。後述する愛玩動物及び家畜のうち、哺乳類のＨＧＦにおいては、ヒトＨＧＦの１９８番目及び２５０番目のチロシン残基に対応するチロシン残基がニトロ化され得る。後述する愛玩動物及び家畜又は家禽のうち、鳥類のＨＧＦにおいては、ヒトＨＧＦの２５０番目のチロシン残基に対応するチロシン残基がニトロ化され得る。ヒトＨＧＦにおける１９８番目及び／又は２５０番目のチロシン残基、並びに、それに対応する位置の非ヒト由来ＨＧＦ中のチロシン残基のニトロ化が、ＨＧＦの活性を消失させる。ＨＧＦの機能不全は、筋の成長、肥大、再生又は維持の阻害を招き、筋委縮や筋再生不全などの原因となると考えられる。本発明のニトロ化抑制剤は、上述した特定の位置のチロシン残基のニトロ化を抑制することが可能である。
　本発明のニトロ化抑制剤に用いられるトリスルフィド化合物は、グルタチオントリスルフィド若しくはその製剤学的に許容される塩又は化合物（１）、その製剤学的に許容される塩若しくはそれらのシクロデキストリン包接体である。グルタチオントリスルフィドは式（２）で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　本発明において、製剤学的に許容される塩としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸との塩；酢酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、乳酸、ステアリン酸、安息香酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸などの有機酸との塩；ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属との塩；カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属との塩；アンモニウム塩；アルギニンなどのアミノ酸との塩などを挙げることができる。
　グルタチオントリスルフィドの製剤学的に許容される塩としては、アミノ酸塩又はアルカリ金属塩であることが好ましく、アルギニン塩又はナトリウム塩であることがより好ましい。化合物（１）の製剤学的に許容される塩としては、アルカリ金属との塩であることが好ましく、ナトリウム塩であることがより好ましい。
　グルタチオントリスルフィド若しくはその製剤学的に許容される塩又は化合物（１）若しくはその製剤学的に許容される塩には、結晶多形が存在することもあるが、いずれの結晶形にも限定されず、いずれかの結晶形の単一物であっても混合物であってもよい。また、グルタチオントリスルフィド若しくはその製剤学的に許容される塩又は化合物（１）若しくはその製剤学的に許容される塩には、非晶質体も含まれる。グルタチオントリスルフィド若しくはその製剤学的に許容される塩又は化合物（１）若しくはその製剤学的に許容される塩には、無水物と溶媒和物（特に水和物）とが含まれる。
　化合物（１）は、一実施形態において、式（３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 で表される化合物［式中、Ｒ１は水素原子又は炭素数１～６のアルキル基を示す。］であり、Ｒ１は、例えば水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、へキシル基であってよい。好ましくは、Ｒ１は水素原子であり、この場合、式（３）で表される化合物は式（４）で表されるリポ酸トリスルフィドである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　化合物（１）は、別の実施形態において、式（５）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 で表される化合物［式中、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立に、水素原子又は炭素数１～６のアルキル基を示し、前記アルキル基は、アミノ基及びカルボキシ基からなる群より選択される１以上の置換基を有していてよい。］である。Ｒ２及びＲ３は、水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、へキシル基等のアルキル基であってよい。これらのアルキル基は、アミノ基及びカルボキシ基の一方又は両方の置換基を有していてよい。Ｒ２及びＲ３は、例えば、式（６）で表される基であってよい（式中、＊は結合手を示す。）。式（５）で表される化合物の具体例として、例えば、Ｒ２及びＲ３はともに水素原子である化合物、Ｒ２が水素原子でありＲ３が式（６）で表される基である化合物が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　式（５）で表される化合物は、式（５ａ）で表される化合物を酸化剤により酸化させてスルホキシド化合物を得る工程（工程１）、及び、得られたスルホキシド化合物を硫黄源と反応させる工程（工程２）によって製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 ［式中、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立に、水素原子又は炭素数１～６のアルキル基であり、前記アルキル基は、アミノ基及びカルボキシ基からなる群より選択される１以上の置換基を有していてよい。］
　上記製造方法は、スルホキシド化合物を単離することなく、工程１及び工程２をワンポットで反応を行ってもよい。
　工程１に用いられる溶媒は、式（５ａ）で表される化合物及び酸化剤を溶解し、酸化反応を阻害しないものであれば、特に限定されない。このような溶媒としては、例えば、水、硫酸水溶液、エタノール水溶液及びアセトニトリル水溶液が挙げられ、好ましくは、水である。工程１に用いられる溶媒の量は、式（５ａ）で表される化合物１ｇに対して１ｍＬ～５００ｍＬとすることができ、好ましくは、１０ｍＬ～２０ｍＬである。
　工程１に用いられる酸化剤として、ペルオキシ一硫酸カリウム（Ｏｘｏｎｅ（登録商標）などの商品名で販売される）、過酢酸、過酸化水素及び過ヨウ素酸ナトリウムが挙げられる。過酸化水素は触媒量のメチルトリオキソレニウムとともに使用してもよい。安全性及びコストの観点から、ペルオキシ一硫酸カリウムが好ましい酸化剤である。使用される酸化剤の量は、式（５ａ）で表される化合物１当量に対して、０．８当量～２．０当量とすることができ、好ましくは、１．０当量～１．３当量である。
　工程１の反応温度は、－２０℃～３０℃とすることができ、好ましくは、－５℃～５℃である。
　工程１の反応時間は、５分間～２４時間とすることができ、好ましくは、０．５時間～２時間である。
　工程２に用いられる溶媒は、スルホキシド化合物及び硫黄源を溶解し、その後の反応を阻害しないものであれば、特に限定されない。このような溶媒としては、例えば、水、硫酸水溶液、エタノール水溶液及びアセトニトリル水溶液が挙げられ、好ましくは、水である。工程２に用いられる溶媒の量は、スルホキシド化合物１ｇに対して１ｍＬ～５００ｍＬとすることができ、好ましくは、１０ｍＬ～２０ｍＬである。
　工程２に用いられる硫黄源として、硫化ナトリウム、硫化カリウム、硫化水素ナトリウム、硫化水素カリウム及び硫化水素が挙げられる。使用される硫黄源の量は、スルホキシド化合物１当量に対して、０．５当量～４．０当量とすることができ、好ましくは、０．９当量～１．２当量である。
　工程２の反応温度は、－２０℃～３０℃とすることができ、好ましくは、－５℃～２５℃である。
　工程２の反応時間は、１０分間～２日間とすることができ、好ましくは、０．５時間～２時間である。
　工程１及び工程２をワンポットで行う場合、反応溶媒としては、例えば、水、硫酸水溶液、エタノール水溶液及びアセトニトリル水溶液が挙げられ、好ましくは、水であり、溶媒の量は、式（５ａ）で表される化合物１ｇに対して１ｍＬ～５００ｍＬとすることができ、好ましくは、１０ｍＬ～２０ｍＬである。使用される酸化剤としては、ペルオキシ一硫酸カリウム、過酢酸、過酸化水素（触媒量のメチルトリオキソレニウムとともに使用してもよい）及び過ヨウ素酸ナトリウムが挙げられ、好ましくは、ペルオキシ一硫酸カリウムであり、使用される酸化剤の量は、式（５ａ）で表される化合物１当量に対して、０．８当量～２．０当量とすることができ、好ましくは、１．０当量～１．３当量である。使用される硫黄源としては、硫化ナトリウム、硫化カリウム、硫化水素ナトリウム、硫化水素カリウム及び硫化水素が挙げられ、使用される硫黄源の量は、式（５ａ）で表される化合物１当量に対して、０．５当量～４．０当量とすることができ、好ましくは、０．９当量～１．２当量である。反応温度は、－２０℃～３０℃とすることができ、好ましくは、－５℃～２５℃である。反応時間は、１５分間～２日間とすることができ、好ましくは、１時間～４時間である。
　工程１及び工程２の他に、必要に応じて、ヒドロキシ基、カルボニル基、アミノ基、カルボキシ基などの官能基を保護する工程及び保護された官能基を脱保護する工程を含んでいてもよい。これらの官能基の保護基、保護／脱保護反応は当業者にとって周知であり、”Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”などを参照して、適切な保護基、保護／脱保護反応を選択することができる。
　式（５ａ）で表される化合物は、リポ酸とＮＨＲ２Ｒ３を縮合することで製造することができる。縮合反応の溶媒としては、例えばジクロロメタン、クロロホルム、テトラヒドロフランが挙げられ、好ましくは、テトラヒドロフランである。溶媒の量は、式（５ａ）で表される化合物１ｇに対して１ｍＬ～２００ｍＬとすることができ、好ましくは、３ｍＬ～３５ｍＬである。使用する縮合剤としては、例えば１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）及びその塩、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を添加剤として用いてもよい。）が挙げられる。使用される縮合剤の量は、式（５ａ）で表される化合物１当量に対して、０．８当量～２．０当量とすることができ、好ましくは、１．０当量～１．５当量である。反応の温度は、－１０℃～４０℃とすることができ、好ましくは、１５℃～２５℃である。反応の時間は、１時間～３日間とすることができ、好ましくは、１時間～２４時間である。
　式（５）で表される化合物は、リポ酸トリスルフィドとＮＨＲ２Ｒ３を縮合することによっても製造することができる。縮合の条件は上記と同様である。
　Ｒ１が炭素数１～６のアルキル基である式（３）で表される化合物は、式（３ａ）で表される化合物を酸化剤により酸化させてスルホキシド化合物を得る工程（工程１）、及び、得られたスルホキシド化合物を硫黄源と反応させる工程（工程２）によって製造することができる。反応条件は上記と同様である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 ［式中、Ｒ１は、水素原子又は炭素数１～６のアルキル基を示す。］
　式（３ａ）で表される化合物は、リポ酸とＲ１ＯＨを縮合することで製造することができる。上記と同様である。
　Ｒ１が炭素数１～６のアルキル基である式（３）で表される化合物は、リポ酸トリスルフィドとＲ１ＯＨを縮合することによっても製造することができる。縮合の条件は上記と同様である。
　シクロデキストリンは、α－シクロデキストリン、β－シクロデキストリン、γ－シクロデキストリン又はそれらの誘導体であってよい。ここで、「誘導体」とは、各シクロデキストリンが有する少なくとも１つの水酸基の水素原子が、置換基を有していてよいアルキル基又は糖によって置換されていることを意味する。シクロデキストリン誘導体は、例えば、メチル－α－シクロデキストリン、メチル－β－シクロデキストリン、メチル－γ－シクロデキストリン、ジメチル－α－シクロデキストリン、ジメチル－β－シクロデキストリン、ジメチル－γ－シクロデキストリン、ヒドロキシエチル－α－シクロデキストリン、ヒドロキシエチル－β－シクロデキストリン、ヒドロキシエチル－γ－シクロデキストリン、２－ヒドロキシプロピル－α－シクロデキストリン、２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン、２－ヒドロキシプロピル－γ－シクロデキストリン、グルコシル－α－シクロデキストリン、グルコシル－β－シクロデキストリン、グルコシル－γ－シクロデキストリン、マルトシル－α－シクロデキストリン、マルトシル－β－シクロデキストリン、マルトシル－γ－シクロデキストリン、スルホブチルエーテル－β－シクロデキストリン等を用いることができる。
　シクロデキストリン包接体は、シクロデキストリンを溶媒に溶解させる工程（工程ａ）と、得られた溶解液に化合物（１）又はその製剤学的に許容される塩を添加して攪拌する工程（工程ｂ）と、攪拌後の液を濾過し、工程ａで用いた溶媒と同一の溶媒で洗浄し、濾液を凍結させ、凍結乾燥させる工程（工程ｃ）によって製造することができる。なお、工程ｃの濾過及び洗浄操作は省略してもよい。
　工程ａに用いられる溶媒としては、好ましくは水である。
　工程ａに用いられる溶媒の量は、シクロデキストリン１ｇに対して１～３５０ｍｌとすることができ、好ましくは１～８０ｍｌである。
　工程ｂにおいて、化合物（１）又はその製剤学的に許容される塩に対するシクロデキストリンの質量比は２～２０とすることができ、好ましくは５～１６．５である。
　工程ｂの攪拌温度は２０～５０℃とすることができ、室温であってよい。
　工程ｂの攪拌時間は０．２５～４０時間とすることができ、好ましくは２～３５時間である。
　工程ｂでは、化合物（１）又はその製剤学的に許容される塩を添加した後、攪拌する前に、工程ａで用いた溶媒と同一の溶媒を加えもよい。このとき、溶媒の量は、シクロデキストリン１ｇに対して０～３０ｍｌとすることができ、好ましくは、０～２０ｍｌである。
　工程ｃに用いられる溶媒の量は、シクロデキストリン１ｇに対して０～１５０ｍｌとすることができ、好ましくは０～２０ｍｌである。
　工程ｃの凍結温度は、－３０～－２０℃とすることができ、好ましくは－２０℃である。
　工程ｃの凍結時間は、１０～５０時間とすることができる。
　工程ｃの凍結乾燥は、絶対圧力で２０～１００Ｐａ、外温を１０～４０℃、好ましくは外温２０℃として行うことができる。
　工程ｃの凍結乾燥期間は、１～５日とすることができる。
　本発明の筋萎縮及び／又は筋再生不全の予防又は治療剤は、上記ニトロ化抑制剤を含有する。
　本発明における筋萎縮としては、加齢、寝たきり、外傷、術後固定、無重力、何らかの疾患への罹患等により、永らく筋肉を使用しない状態あるいは使用頻度や強度が低下した状態から生じるものが挙げられる。本発明における筋委縮又は筋再生不全は、筋幹細胞（衛星細胞）の活性化阻害や増殖低下を端緒とする、筋の成長、肥大、再生又は維持の不調に関連するもので、加齢性サルコペニア、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、球脊髄性筋萎縮症、筋ジストロフィー症をその代表として例示できる。
　愛玩動物としては、例えば、イヌ、ネコ、ハムスター、ウサギ、フェレット、インコ、ブンチョウ、オウム等が挙げられる。
　本発明のニトロ化抑制剤、筋萎縮及び筋再生不全の予防又は治療剤の投与量は、治療的に有効な量であって、症状、年齢、投与法、剤型等により異なる。通常の場合には、成人に対し、グルタチオントリスルフィド若しくはその製剤学的に許容される塩又は化合物（１）、その製剤学的に許容される塩若しくはそれらのシクロデキストリン包接体として、１日当たり０．５～２０００ｍｇ投与することができ、１～８００ｍｇを１日当たり１回又は数回に分けて、連日投与するのが好ましい。上記の化合物の投与量がこの範囲にあると、筋萎縮及び筋再生不全に対する予防効果又は治療効果が示されると考えられる。
　本発明のニトロ化抑制剤、筋萎縮及び筋再生不全の予防又は治療剤の投与量は、治療的に有効な量であって、症状、年齢、投与法、剤型等により異なる。通常の場合には、愛玩動物に対し、グルタチオントリスルフィド若しくはその製剤学的に許容される塩又は化合物（１）、その製剤学的に許容される塩若しくはそれらのシクロデキストリン包接体として、１日当たり０．１～４００ｍｇ／ｋｇ投与することができ、０．１～４００ｍｇ／ｋｇを１日当たり１回又は数回に分けて、連日投与するのが好ましい。上記の化合物の投与量がこの範囲にあると、筋萎縮及び筋再生不全に対する予防効果又は治療効果が示されると考えられる。
　本発明の別の実施形態に係る家畜又は家禽の暑熱ストレスによる筋の成長阻害（食肉生産性の低下）の抑制又は改善剤は、上記ニトロ化抑制剤を含有する。
　本発明における家畜又は家禽の暑熱ストレスによる筋の成長阻害（食肉生産性の低下）の原因としては、夏季の暑熱による家畜又は家禽の飼育環境の外気温上昇、家畜又は家禽の飼育管理区域における温度管理の異常・逸脱等が挙げられる。これらの原因により、家畜又は家禽の体内における、呼吸性アルカローシス、甲状腺ホルモンの低下、コルチコステロンの増加、免疫応答の変化及びミトコンドリア活性酸素（ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｏｘｙｇｅｎ　ｓｐｅｃｉｅｓ、ＲＯＳ）の過剰産生が引き起こされると考えられる。その結果、筋幹細胞（衛星細胞）の活性化阻害や増殖低下を端緒として、筋の成長、肥大、再生又は維持の不調を引き起こし、食肉生産性が低下する。
　家畜又は家禽としては、例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ロバ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ダチョウ、シチメンチョウ、カモ、ウズラ等が挙げられる。
　本発明のニトロ化抑制剤、家畜又は家禽に対する筋の成長阻害（食肉生産性の低下）抑制又は改善剤の投与量は、治療的に有効な量であって、症状、投与法等により異なる。通常の場合には、家畜又は家禽に対し、グルタチオントリスルフィド若しくはその製剤学的に許容される塩又は化合物（１）、その製剤学的に許容される塩若しくはそれらのシクロデキストリン包接体として、１日当たり０．１～４００ｍｇ／ｋｇ投与することができ、０．１～４００ｍｇ／ｋｇを１日当たり１回又は数回に分けて、連日投与するのが好ましい。上記の化合物の投与量がこの範囲にあると、家畜又は家禽に対する筋の成長阻害（食肉生産性の低下）抑制又は改善効果が示されると考えられる。
　本発明のニトロ化抑制剤、筋萎縮及び／又は筋再生不全の予防又は治療剤並びに筋の成長阻害（食肉生産性の低下）抑制又は改善剤は、例えば錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、液剤若しくはシロップ剤として経口的に、又は、注射剤、輸液、若しくは坐剤として非経口的に投与することが出来る。公知の製剤技術によってこれらの剤型に製剤化することができる。固形剤の場合には、製剤化に際して製剤学的に認容し得る賦形剤、例えば澱粉、乳糖、精製白糖、グルコース、結晶セルロース、カルボキシセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、燐酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、アラビアゴム等を配合することができ、必要であれば滑沢剤、結合剤、崩壊剤、被覆剤、着色剤等を配合することができる。また、液剤の場合には、安定剤、溶解助剤、懸濁化剤、乳化剤、緩衝剤、保存剤等を配合することができる。
　以下に、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。なお、ＧＳＳＳＧはグルタチオントリスルフィドを意味する。
実験例１
＜ペルオキシナイトライト（ＯＮＯＯ－）によるリコンビナントＨＧＦタンパク質のニトロ化に対するＧＳＳＳＧの抑制効果＞
　ＰＢＳに溶解したリコンビナントマウスＨＧＦ精製標品（２２０７－ＨＧ－０２５／ＣＦ、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、　キャリアタンパク質不含）に、ＨＧＦ：ＧＳＳＳＧのモル比が１：１０、１：５０又は１：４００となるように、特許文献１に記載された方法で製造したＧＳＳＳＧ二水和物を添加及び混和したサンプルを作製した。ＧＳＳＳＧ二水和物を添加せず、ＨＧＦ：ＧＳＳＳＧのモル比を１：０としたサンプルも作製した。各サンプルに直ちに、ペルオキシナイトライト（ＯＮＯＯ－）を、ＨＧＦ：ＯＮＯＯ－のモル比が１：５００となるように添加した。ｐＨ７．２～７．４、２５～３７℃で３０分保持し（ニトロ化処理）、ニトロ化サンプルを得た。
　得られたニトロ化サンプルを用いて、常法に従いウエスタンブロットを行った。ニトロ化サンプルをＳＤＳとβ－メルカプトエタノールを含む溶液で処理し、還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用試料とした。電気泳動には、１０％ポリアクリルアミドゲルを用いた。使用した転写膜の材質はニトロセルロースであった。ＨＲＰ標識抗ニトロチロシンモノクローナル抗体（カタログ番号：ｓｃ－３２７５７　ＨＲＰ、Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）及びＨＲＰ標識抗ＨＧＦモノクローナル抗体（カタログ番号：ｓｃ－３７４４２２　ＨＲＰ、Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を使用した。ＥＣＬ試薬を用いて免疫反応を画像撮影装置に記録した。陽性コントロール試料としてニトロ化ウシ血清アルブミン（ＢＳＡｎｉｔｒｏ）を使用した。なお、図１中のＰＬ（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌａｄｄｅｒ）およびＭＷ－ＳＴＤ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｗｅｉｇｈｔ－Ｓｔａｎｄａｒｄ）は分子量マーカーである。また、図１中のｍａｔｅｒｉａｌ　ＡはＧＳＳＳＧを意味する。
　抗ＨＧＦ抗体での反応強度が各レーンで概ね同じであることを確認した後（図１の下枠）、抗ニトロチロシン抗体との反応強度が、ＧＳＳＳＧの添加モル比の増加に伴い減少することを確認した（図１の上枠）。すなわち、ＧＳＳＳＧによる、ＨＧＦ中のチロシン残基のニトロ化抑制効果を可視化した。
実験例２
＜ペルオキシナイトライト（ＯＮＯＯ－）によるリコンビナントＨＧＦタンパク質のニトロ化に対するリポ酸トリスルフィドの抑制効果＞
　ＧＳＳＳＧの代わりにリポ酸トリスルフィドを用いたこと、ＨＧＦ：ＯＮＯＯ－のモル比を１：４０００としたこと以外は実験例１と同様にして、ニトロ化処理及びウエスタンブロットを行った。なお、図１中のｍａｔｅｒｉａｌ　Ｂはリポ酸トリスルフィドを意味する。
　実験例１と同様、抗ＨＧＦ抗体での反応強度が各レーンで概ね同じであることを確認した後（図２の下枠）、抗ニトロチロシン抗体との反応強度が、リポ酸トリスルフィドの添加モル比の増加に伴い減少することを確認した（図２の上枠）。すなわち、リポ酸トリスルフィドによる、ＨＧＦ中のチロシン残基のニトロ化抑制効果を可視化した。
　ＧＳＳＳＧ若しくはその製剤学的に許容される塩又は化合物（１）、その製剤学的に許容される塩若しくはそれらのシクロデキストリン包接体は、ペルオキシナイトライト（ＯＮＯＯ－）によるＨＧＦのチロシン残基のニトロ化を抑制することができると考えられることから、生体内で生じる様々な酸化ストレスに起因するＨＧＦの機能不全をも抑制することが期待される。ＧＳＳＳＧ若しくはその製剤学的に許容される塩又は化合物（１）、その製剤学的に許容される塩若しくはそれらのシクロデキストリン包接体は、ＨＧＦ中のチロシン残基のニトロ化が原因となる、筋萎縮及び筋再生不全に対する予防又は治療効果を奏すると考えられる。また、ＧＳＳＳＧ若しくはその製剤学的に許容される塩又は化合物（１）、その製剤学的に許容される塩若しくはそれらのシクロデキストリン包接体は、暑熱ストレスによるＨＧＦのチロシン残基のニトロ化が原因となる、筋の成長阻害（食肉生産性の低下）を抑制又は改善することができると考えられる。
参考例１
＜（Ｒ）－リポ酸トリスルフィドの製造＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 ２００ｍＬ四径フラスコに、（Ｒ）－α－リポ酸２４．３８ｇ（１１８．１７ｍｍｏｌ）、７５％エタノール水溶液４８８ｍＬ（２０．０ｖ／ｗ）を仕込んだ。フラスコの内容物が溶解したのを確認した後、内温０℃まで冷却した。ここに、Ｏｘｏｎｅ（登録商標）（４１．４０ｇ、１２４．２０ｍｍｏｌ、１．０５当量）を２分割して添加した後、約５０分間反応させた。反応液中の不溶物をろ去後、エタノール６５ｍＬ（２．６７ｖ／ｗ）で洗浄した。ろ洗液に内温２～６℃で、Ｎａ２Ｓ水溶液（Ｎａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏ７０．７０ｇを水５６９ｍＬに溶解）４００ｍＬ（２０６．９３ｍｍｏｌ、１．７５当量）を約２．５時間かけて滴下した（滴下及び反応中は、３ｍｏｌ／Ｌ硫酸水溶液を用い、ｐＨ６－７に制御、総使用量１４ｍＬ）。内温３℃、ｐＨ７にて、約５０分間反応させた後、３ｍｏｌ／Ｌ硫酸水溶液４１ｍＬ（１．７ｖ／ｗ）を滴下し、ｐＨ１．３とした。次に、水３２０ｍＬ（１３．１ｖ／ｗ）及び酢酸エチル３２０ｍＬ（１３．１ｖ／ｗ）を添加し、酢酸エチルで抽出した。水層を酢酸エチル１６０ｍＬ（６．６ｖ／ｗ）で４回抽出し、有機層を合わせ、外温３０℃で減圧濃縮した。濃縮物にエタノールを加え溶解させた後、ＯＤＳでカラム精製した。フラクションを外温３０℃で減圧濃縮後、オイルポンプで乾燥し、（Ｒ）－リポ酸トリスルフィド１０．６９ｇ（４４．８４ｍｍｏｌ、収率３８％、ＨＰＬＣ純度９９．７％、白色固体）を得た。
＜（Ｒ）－リポアミドトリスルフィドの製造＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 　２００ｍＬ四径フラスコに、（Ｒ）－リポ酸トリスルフィド２．００ｇ（８．３９ｍｍｏｌ）、塩化メチレン６５ｍＬ（３２．５ｖ／ｗ）を仕込んだ。フラスコの内容物が溶解したのを確認した後、１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）２．０７ｇ（１０．７７ｍｍｏｌ、１．２８当量）及びＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）１．４２ｇ（１２．３３ｍｍｏｌ、１．４７当量）を添加した。フラスコ内の空気を窒素で置換した後、室温で約８時間反応させた。次に、室温で２８％アンモニア水２．２８ｍＬ（３３．７４ｍｍｏｌ、４．０２当量）を５分かけて滴下し、終夜で反応させた。その後、室温で、水６０ｍＬ（３０．０ｖ／ｗ）を添加して分液した後、有機層を２．５％炭酸水素ナトリウム水溶液６０ｍＬ（３０．０ｖ／ｗ）で３回洗浄し、さらに、水６０ｍＬ（３０．０ｖ／ｗ）で４回洗浄した。その後、洗浄後の有機層を外温２５℃で減圧濃縮後、オイルポンプで乾燥させ、（Ｒ）－リポアミドトリスルフィド１．９３ｇ（８．１３ｍｍｏｌ、収率９７％、ＨＰＬＣ純度９９．６％、白色固体）を得た。
１Ｈ－ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ（ｐｐｍ）＝５．３６（ｂｓ，２Ｈ），３．３３（ｍ，１Ｈ），３．１３（ｍ，２Ｈ），２．２２（ｍ，３Ｈ），１．８９（ｍ，１Ｈ），１．７４－１．４２（ｍ，６Ｈ）．
ＨＲ－ＥＳＩ－ＴＯＦ－ＭＳ：ｍ／ｚ　２３６．０２３８　（［Ｍ－Ｈ］－），ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ［Ｃ８Ｈ１４ＮＯＳ３］－２３６．０２４３．
参考例２
＜リポアミドトリスルフィド（ラセミ体）の製造＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 　５００ｍＬ四径フラスコに、リポアミド（ラセミ体）１．００ｇ（４．８７ｍｍｏｌ）、８５％ジメチルホルムアミド水溶液１８２ｍＬ（１８２．０ｖ／ｗ）を仕込んだ。フラスコの内容物が溶解したのを確認した後、内温４℃まで冷却した。同フラスコに、Ｏｘｏｎｅ（登録商標）１．６３ｇ（４．８９ｍｍｏｌ、１．００当量）を３分割して１０分毎に添加し、約１時間反応させた。３ｍｏｌ／Ｌ硫酸水溶液を用い、反応液のｐＨを５－１１に制御しながら、内温５℃で硫化ナトリウム９水和物１．２４ｇ（５．１６ｍｍｏｌ、１．０６当量）を分割して仕込み、約１．５時間反応させた。水１８０ｍＬ（１８０．０ｖ／ｗ）及び塩化メチレン５０ｍＬ（５０．０ｖ／ｗ）を添加し、塩化メチレンで抽出した後、水層を塩化メチレン５０ｍＬ（５０．０ｖ／ｗ）で２回抽出し、有機層を合わせ、外温３０℃以下で減圧濃縮した。濃縮残渣に水８０ｍＬ（８０．０ｖ／ｗ）を室温で３０分間かけて滴下し、晶出させ、スラリー液をろ過後、水５０ｍＬ（５０．０ｖ／ｗ）で洗浄した。湿晶を２５℃で減圧乾燥し、リポアミドトリスルフィド（ラセミ体）５１０ｍｇ（２．１５ｍｍｏｌ、収率４４％、ＨＰＬＣ純度９２％、白色固体）を得た。
＜リポアミドトリスルフィドの純度試験（ＨＰＬＣ）＞
検出器：紫外吸光光度計（測定波長：２２０ｎｍ）
カラム：ＬｉＣｈｒｏｓｏｒｂ　ＲＰ－１８（関東化学、４．０ｍｍＩ．Ｄ．×２５０ｍｍ、５μｍ）
カラム温度：４０℃付近の一定温度
移動相Ａ：リン酸水溶液（ｐＨ３）
移動相Ｂ：メタノール
移動相の送液：移動相Ａ及び移動相Ｂの混合比を次のように変えて濃度勾配制御した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
 流量：１ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：１０μＬ
面積測定範囲：試料溶液注入後３５分間
保持時間：リポアミドスルホキシド（１２～１３分）、リポアミド（約１７分）、
リポアミドトリスルフィド（約１９分）
参考例３～９
　以下、「ＨＰ」は「ヒドロキシプロピル」、「Ｍｅ」は「メチル」、「Ｍａｌ」は「マルトシル」の略称である。
＜リポ酸トリスルフィドの製造＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　リポ酸２．０ｇ（９．０２ｍｍｏｌ）、７５％エタノール水溶液４０ｍＬを反応容器に仕込み、内温０℃まで冷却した。ここに、Ｏｘｏｎｅ（登録商標）３．４ｇ（１０．２０ｍｍｏｌ）を添加し、約２時間反応させた。反応液中の無機塩をろ過後、エタノール７ｍＬで洗浄した。ろ液に、硫化ナトリウム九水和物５．８ｇ（２４．１ｍｍｏｌ）を添加し、約１時間反応させた。この反応液に３ｍｏｌ／Ｌ硫酸水溶液を７ｍＬ滴下後、続けて、水２０ｍＬ、酢酸エチル（ＡｃＯＥｔ）４５ｍＬを添加し、ＡｃＯＥｔで抽出した。水層をＡｃＯＥｔ２０ｍＬで２回抽出し、有機層を合わせて減圧濃縮した。濃縮物にエタノール３ｍＬを加えて溶解した後、溶解液をＯＤＳカラム（ＹＭＣ　Ｄｉｓｐｏ　ＰａｃｋＡＴ、移動相：アセトニトリル水溶液）により精製し、リポ酸トリスルフィド０．７ｇ（２．３９ｍｍｏｌ、ＨＰＬＣ純度：１００％）を得た。
＜リポ酸トリスルフィドのＣＤ包接体の製造＞
参考例３：リポ酸トリスルフィド（ラセミ体）のβ－ＣＤ包接体
　１００ｍＬナスフラスコに、β－ＣＤ１０２０．０ｍｇ（０．８９９ｍｍｏｌ）、水８０ｍＬを仕込んだ。フラスコの内容物が溶解したのを確認した後、リポ酸トリスルフィド９９．８ｍｇ（０．４１９ｍｍｏｌ）を添加し、水２０ｍＬでフラスコ内を洗い込んだ。４５℃で１５分間撹拌後、ろ過し、水１０ｍＬでフラスコ内及び結晶を洗浄した。得られたろ液を－２０℃の冷凍庫内で２３時間凍結した。外温２０℃で約４．５日間凍結乾燥し、包接体９８０．０ｍｇ（白色固体）を得た。
参考例４：リポ酸トリスルフィド（ラセミ体）のＨＰ－β－ＣＤ包接体
　５０ｍＬナスフラスコに、ＨＰ－β－ＣＤ１２９１．０ｍｇ、水１６ｍＬを仕込んだ。フラスコの内容物が溶解したのを確認した後、リポ酸トリスルフィド１００．０ｍｇ（０．４１９ｍｍｏｌ）を添加した。室温で約２８時間撹拌後、ろ過し、水１０ｍＬでフラスコ内及び結晶を洗浄した。得られたろ液を－２０℃の冷凍庫内で約２日間凍結した。外温２０℃で約２日間凍結乾燥し、包接体１３３０．０ｍｇ（白色固体）を得た。
参考例５：（Ｒ）－リポ酸トリスルフィドのＨＰ－β－ＣＤ包接体
　５０ｍＬナスフラスコに、ＨＰ－β－ＣＤ９６９．９ｍｇ、水１０ｍＬを仕込んだ。フラスコの内容物が溶解したのを確認した後、（Ｒ）－リポ酸トリスルフィド１００．３ｍｇ（０．４２１ｍｍｏｌ）を添加し、水４ｍＬでフラスコ内を洗い込んだ。室温で約２５時間撹拌後、ろ過し、水１２ｍＬでフラスコ内及び結晶を洗浄した。得られたろ液を－２０℃の冷凍庫内で１５時間凍結した。外温２０℃で約２日間凍結乾燥し、包接体１０４０．０ｍｇ（白色固体）を得た。
参考例６：リポ酸トリスルフィド（ラセミ体）のＭｅ－β－ＣＤ包接体
　５０ｍＬナスフラスコに、Ｍｅ－β－ＣＤ（数メチル化混合物）１６１６．０ｍｇ、水１２ｍＬを仕込んだ。フラスコの内容物が溶解したのを確認した後、リポ酸トリスルフィド１０１．０ｍｇ（０．４２４ｍｍｏｌ）を添加し、水４ｍＬでフラスコ内を洗い込んだ。２１時間撹拌後、ろ過し、水１２ｍＬでフラスコ内及び結晶を洗浄した。得られたろ液を－２０℃の冷凍庫内で２０時間凍結させた。外温２０℃で約４日間凍結乾燥し、包接体１６６５．２ｍｇ（白色固体）を得た。
参考例７：（Ｒ）－リポ酸トリスルフィドのＭｅ－β－ＣＤ包接体
　５０ｍＬナスフラスコに、Ｍｅ－β－ＣＤ（数メチル化混合物）１６１６．０ｍｇ、水１６ｍＬを仕込んだ。フラスコの内容物が溶解したのを確認した後、（Ｒ）－リポ酸トリスルフィド９９．９ｍｇ（０．４２０ｍｍｏｌ）を添加し、水４ｍＬでフラスコ内を洗い込んだ。室温で６時間撹拌後、ろ過し、水１３ｍＬでフラスコ内及び結晶を洗浄した。得られたろ液を－２０℃の冷凍庫内で２８時間凍結した。外温２０℃で約３日間凍結乾燥し、包接体１６１０．９ｍｇ（白色固体）を得た。
参考例８：リポ酸トリスルフィド（ラセミ体）のＭａｌ－β－ＣＤ包接体
　５０ｍＬナスフラスコに、Ｍａｌ－β－ＣＤ１２２４．２ｍｇ（０．８３９ｍｍｏｌ）、水１４ｍＬを仕込んだ。フラスコの内容物が溶解したのを確認した後、リポ酸トリスルフィド１００．４ｍｇ（０．４２１ｍｍｏｌ）を添加し、水２ｍＬでフラスコ内を洗い込んだ。室温で３１時間撹拌後、ろ過し、水１０ｍＬでフラスコ内及び結晶を洗浄した。得られたろ液を－２０℃の冷凍庫内で２２時間凍結した。外温２０℃で約４６時間凍結乾燥し、包接体１１８０．０ｍｇ（白色固体）を得た。
参考例９：（Ｒ）－リポ酸トリスルフィドのＭａｌ－β－ＣＤ包接体
　５０ｍＬナスフラスコに、Ｍａｌ－β－ＣＤ１２２４．２ｍｇ（０．８３９ｍｍｏｌ）、水１０ｍＬを仕込んだ。フラスコの内容物が溶解したのを確認した後、（Ｒ）－リポ酸トリスルフィド１００．１ｍｇ（０．４２０ｍｍｏｌ）を添加し、水５ｍＬでフラスコ内を洗い込んだ。室温で４．５時間撹拌後、ろ過し、水１１ｍＬでフラスコ内及び結晶を洗浄した。得られたろ液を－２０℃の冷凍庫内で２４時間凍結した。外温２０℃で約４１時間凍結乾燥し、包接体１３１９．６ｍｇ（白色固体）を得た。
　参考例３～９で得られた包接体の収率及び溶解度を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
 

Claims (7)

  1. 　トリスルフィド化合物を含有する肝細胞増殖因子中のチロシン残基のニトロ化抑制剤であって、
    　前記トリスルフィド化合物は、グルタチオントリスルフィド若しくはその製剤学的に許容される塩又は式（１）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     で表される化合物［式中、Ｘは、－ＯＲ１又は－ＮＲ２Ｒ３を示し、Ｒ１は水素原子又は炭素数１～６のアルキル基を示し、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立に、水素原子又は炭素数１～６のアルキル基を示し、前記アルキル基は、アミノ基及びカルボキシ基からなる群より選択される１以上の置換基を有していてよい。］、その製剤学的に許容される塩若しくはそれらのシクロデキストリン包接体である、ニトロ化抑制剤。
  2. 　前記トリスルフィド化合物が、グルタチオントリスルフィド又はその製剤学的に許容される塩である、請求項１に記載のニトロ化抑制剤。
  3. 　前記トリスルフィド化合物が、リポ酸トリスルフィド又はその製剤学的に許容される塩である、請求項１に記載のニトロ化抑制剤。
  4. 　請求項１～３のいずれか一項に記載のニトロ化抑制剤を含有する、筋萎縮及び／又は筋再生不全の予防又は治療剤。
  5. 　請求項１～３のいずれか一項に記載のニトロ化抑制剤を愛玩動物に投与することを含む、愛玩動物の筋萎縮及び／又は筋再生不全を予防又は治療する方法。
  6. 　請求項１～３のいずれか一項に記載のニトロ化抑制剤を含有する、家畜又は家禽の暑熱ストレスによる筋の成長阻害（食肉生産性の低下）の抑制又は改善剤。
  7. 　請求項１～３のいずれか一項に記載のニトロ化抑制剤を家畜又は家禽に投与することを含む、家畜又は家禽の暑熱ストレスによる筋の成長阻害（食肉生産性の低下）を抑制又は改善する方法。

     
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