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WO2023013640A1 - 多孔質体及びその製造方法 - Google Patents

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WO2023013640A1
WO2023013640A1 PCT/JP2022/029659 JP2022029659W WO2023013640A1 WO 2023013640 A1 WO2023013640 A1 WO 2023013640A1 JP 2022029659 W JP2022029659 W JP 2022029659W WO 2023013640 A1 WO2023013640 A1 WO 2023013640A1
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WO
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amino acid
seq
polypeptide
segment
group
Prior art date
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Application number
PCT/JP2022/029659
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English (en)
French (fr)
Inventor
秀樹 加賀田
一樹 坂田
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Spiber Inc
Original Assignee
Spiber Inc
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Publication date
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Priority to JP2023540365A priority patent/JPWO2023013640A1/ja
Priority to US18/294,011 priority patent/US20250163112A1/en
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    • C08J2201/00—Foams characterised by the foaming process
    • C08J2201/04—Foams characterised by the foaming process characterised by the elimination of a liquid or solid component, e.g. precipitation, leaching out, evaporation
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    • C08J2201/0484—Elimination of a frozen liquid phase the liquid phase being aqueous
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    • C08J2201/0542—Precipitating the polymer by adding a non-solvent or a different solvent from an organic solvent-based polymer composition
    • C08J2201/0544—Precipitating the polymer by adding a non-solvent or a different solvent from an organic solvent-based polymer composition the non-solvent being aqueous
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    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J2389/00—Characterised by the use of proteins; Derivatives thereof

Definitions

  • the present disclosure relates to a porous body and its manufacturing method.
  • Patent Document 1 describes a porous polypeptide material derived from a spider silk protein, wherein the polypeptide contains a water-insoluble polypeptide and has an apparent density of 0.1 g/cm 3 or less.
  • Polypeptide porous bodies characterized are disclosed.
  • the polypeptide porous material as described in Patent Document 1 has room for further improvement in terms of quality, especially flexibility.
  • the present disclosure has been made in view of such circumstances, and an object of the present disclosure is to provide a highly flexible porous material and a method for producing the same.
  • polypeptide derivative wherein the polypeptide derivative has a block copolymer having a first segment comprising a polypeptide backbone and one or more second segments attached to the first segment.
  • a porous body is provided comprising a polymer, wherein the polypeptide backbone is a recombinant polypeptide backbone or a hydrophobic polypeptide backbone, and the second segment comprises a molecular group having a plasticizing function on the polypeptide backbone.
  • the porous body of the present disclosure contains a polypeptide derivative that includes a block copolymer having the first and second segments, so that it has excellent flexibility while using a material having a polypeptide backbone like a protein. ing. Since the above polypeptide derivative contains a block copolymer in which the first segment and the second segment are directly bonded, the occurrence of macroscopic phase separation as in the case of simply mixing a plasticizer with a protein is reduced. ing.
  • the first segment may contain a hydrophobic polypeptide backbone with an average hydropathic index (hydrophobicity: hydrophobicity index) of 0.22 or higher.
  • hydrophobic polypeptide backbone is a hydrophobic polypeptide backbone as described above, the affinity between the molecular group having a plasticizing function and the first segment is improved, and the flexibility of the porous material is further improved. becomes.
  • the molecular weight of the molecular group having a plasticizing function with respect to the polypeptide backbone may be 10 or more and 100 or less when the molecular weight of the polypeptide backbone is 100.
  • the total molecular weight of the second segment may be 10 or more and 2000 or less based on the molecular weight of 100 of the first segment.
  • the molecular group having a plasticizing function for the polypeptide backbone may be polyether, polyester, or polycarbonate.
  • the polyether may be polyethylene glycol (PEG) or polytetramethylene glycol (PTMG).
  • the polypeptide backbone may be a hydrophobic recombinant polypeptide backbone.
  • the above-mentioned polypeptide backbone may contain a backbone derived from a recombinant protein.
  • the recombinant protein may contain a recombinant structural protein.
  • the recombinant structural protein may contain modified fibroin.
  • the modified fibroin may include modified spider silk fibroin.
  • the molecular weight of the second segment may be a value within the range of 1 to 400 when the molecular weight of the first segment is 100.
  • the flexibility of the porous material can be advantageously increased while maintaining the properties of the first segment (for example, high mechanical strength).
  • the second segment includes polyethers, polyesters, polycarbonates, polyamides, polyols, polyolefins, polyacetals, polyketals, poly(meth)acrylates, silicones, polyurethanes, polyalkyleneimines, phenolic resins, urea resins, melamine resins, and polyethers. It may contain a skeleton derived from at least one selected from the group consisting of saccharides.
  • the second segment may contain at least one selected from the group consisting of polyether groups, polyester groups, polycarbonate groups, polyamide groups, polyol groups, and modified polysaccharide groups.
  • a plurality of the first segments may be provided, and a part of the second segment may combine with two or more of the first segments to form a network structure. Having a network structure can further improve the toughness.
  • a plurality of the first segments may be provided, and the first segments and the second segments may be alternately coupled. Alternating bonding of the first segment and the second segment may further improve toughness, for example.
  • the second segment may include a plurality of molecular groups, and the plurality of molecular groups may be linked to each other.
  • the width of the design of the second segment can be expanded more, and the flexibility of the porous body can be adjusted more easily.
  • the second segment may further include a linker, and the molecular group and the polypeptide backbone may be linked via the linker.
  • the linker is a structural unit represented by the following formula (1), a structural unit represented by the following general formulas (2a) to (6), a structural unit represented by the following formula (7), and a structural unit represented by the following general formula (8a) ) to (9), structural units represented by the following general formulas (10) to (11b), and structural units represented by the following general formulas (13) to (16): At least one selected may be included.
  • Y is independently , an oxygen atom, a sulfur atom, or NR 1 ; , (4a), (4b), (8a), (8b), (9), (10), (11a) and (11b), wherein R is, independently of each other, hydrogen, a hydrocarbon group, or an aromatic indicates a group.
  • the first segment may be bound to the second segment via at least one functional group selected from the group consisting of thiol groups, amino groups and hydroxy groups in the polypeptide backbone.
  • Another aspect of the present disclosure is a step A of gelling a mixture containing a polypeptide derivative and a solvent, and a step B of obtaining a porous body containing the polypeptide derivative by removing the solvent from the gelled mixture.
  • the polypeptide derivative has a first segment comprising a polypeptide backbone and one or more second segments attached to the first segment, wherein the polypeptide backbone comprises a recombinant polypeptide
  • a method for producing a porous body is provided, wherein the scaffold or hydrophobic polypeptide scaffold, the second segment comprises a molecular group that has a plasticizing function on the polypeptide scaffold.
  • step B the solvent may be removed from the gelled mixture by freeze-drying the gelled mixture.
  • the solvent may be an organic solvent
  • step B may include replacing the solvent in the gelled mixture with water before freeze-drying.
  • the method for producing the porous material may comprise a step of obtaining a polypeptide derivative by reacting a compound containing a polypeptide skeleton with a compound represented by the following general formulas (1A) to (16A).
  • the polypeptide backbone is selected from the group consisting of thiol groups, amino groups, hydroxy groups, guanidino groups, carboxy groups, phenoxy groups, indole groups, amide groups, azido groups, and alkynyl groups. It may have at least one type.
  • a compound containing a polypeptide backbone having a specific functional group and a molecular group having a plasticizing function on the polypeptide backbone represented by the following general formulas (1A) to (16A)
  • Polypeptide derivatives are prepared by reacting specific compounds with .
  • the resulting polypeptide derivative has a molecular group that has a plasticizing function on the polypeptide backbone, and while having a polypeptide backbone like a protein, the polypeptide derivative as a whole is a material with excellent flexibility. It's becoming Therefore, it is possible to manufacture a porous body having excellent flexibility.
  • the first segment and the second segment are bound, so macroscopic phase separation that occurs when a plasticizer is simply mixed with a protein is reduced.
  • the method for producing the above porous material comprises a compound containing a polypeptide skeleton, a compound containing a molecular group having a plasticizing function for the polypeptide skeleton, and general formulas (2-1A) to (2-16A) below. and a compound having two or more of at least one structural unit selected from the group consisting of structural units selected from
  • the polypeptide backbone is selected from the group consisting of thiol groups, amino groups, hydroxy groups, guanidino groups, carboxy groups, phenoxy groups, indole groups, amide groups, azido groups, and alkynyl groups.
  • the compound containing at least one molecular group is selected from the group consisting of a thiol group, an amino group, a hydroxy group, a guanidino group, a carboxyl group, a phenoxy group, an indole group, an amide group, an azide group, and an alkynyl group. may have at least one
  • a polypeptide derivative is prepared by reacting a compound having two or more structural units of at least one type selected from the group consisting of structural units represented by 1A) to (2-16A).
  • the resulting polypeptide derivative has a molecular group that has a plasticizing function on the polypeptide backbone, and while having a polypeptide backbone like a protein, the polypeptide derivative as a whole is a material with excellent flexibility. It's becoming Therefore, it is possible to manufacture a porous body having excellent flexibility.
  • the first segment and the second segment are bound, so macroscopic phase separation that occurs when a plasticizer is simply mixed with a protein is reduced.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing an example of a domain sequence of modified fibroin.
  • FIG. 2 is a diagram showing the distribution of z/w (%) values of naturally occurring fibroin.
  • FIG. 3 is a diagram showing the distribution of x/y (%) values of naturally occurring fibroin.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing an example of the domain sequence of modified fibroin.
  • FIG. 5 is a schematic diagram showing an example of a fibroin domain sequence.
  • FIG. 6 is a photograph showing the test results of the bending amount of the porous body of Example A.
  • FIG. FIG. 7 is a photograph showing the test results of the bending amount of the porous body of Comparative Example A.
  • FIG. 8 shows the results of SDS-PAGE measurement of the polypeptide derivatives prepared in Examples.
  • FIG. 9 shows the results of SDS-PAGE measurement of the polypeptide derivatives prepared in Examples.
  • FIG. 10 is a schematic cross-sectional view of a pressure molding machine used in Examples.
  • FIG. 11 is a schematic diagram showing how to use the pressure molding machine shown in FIG. 1 is a schematic cross-sectional view of a pressure molding machine in a pressurized state;
  • FIG. 12 is a photograph showing the appearance of a molded article for testing containing the polypeptide derivative of the example.
  • FIG. 13 is a photograph showing the appearance of a test molding molded using the mixture of the comparative example.
  • FIG. 14 is a photograph showing the appearance of a test molding molded using the mixture of the comparative example.
  • 15 is a photograph showing the appearance of the fiber prepared in Example 12.
  • FIG. 16 is a graph showing the results of GPC measurement in Reference Example 2.
  • FIG. 17 is a photograph showing the results of contact angle measurement in Reference Example 3.
  • FIG. 18 is an optical microscope photograph of the cast film produced in Example, and FIGS. 18(a) and 18(b) show the polypeptide derivative film and the modified fibroin+PEG mixture film, respectively, magnified 100 times. It is an optical micrograph.
  • FIG. 19 is a scanning electron micrograph of the cast film produced in Example, and FIGS.
  • FIG. 19(a) and 19(b) are 1000-fold magnifications of the polypeptide derivative film and the modified fibroin+PEG mixture film, respectively. It is a scanning electron micrograph shown.
  • FIG. 20 is a graph showing the results of GPC measurement of the polypeptide derivatives produced in Examples and the modified fibroin as a raw material thereof.
  • each component in the composition means the total amount of the multiple substances present in the composition unless otherwise specified when there are multiple substances corresponding to each component in the composition. .
  • polypeptide derivative refers to a composition containing a block copolymer in which a first segment and a second segment are bound.
  • the polypeptide derivative contains an unreacted first segment (substance to form the first segment) and/or an unreacted second segment (substance to form the second segment). You can stay.
  • the polypeptide derivative herein is in a homogeneous state without phase separation when macroscopically observed. Macroscopic observation is performed at a magnification of about 100 to 3000 times with an optical microscope, scanning electron microscope, or the like.
  • a cast film of the substance to be observed is formed, and the cast film is subjected to an optical microscope or scanning at a magnification of about 100 to 3000 times.
  • a method of confirming by observing with an electron microscope can be mentioned.
  • a homogeneous state without phase separation can be specifically confirmed by the method described in the examples below.
  • the polypeptide derivative may exhibit phase separation when observed microscopically (for example, on a submicron scale using an atomic force microscope).
  • a porous material containing such a polypeptide derivative is a porous material containing a mixture of a first segment and a second segment and a composition in which one of the first segment and the second segment is dispersed in the other.
  • the whole of the polypeptide derivative-containing part is advantageously made uniform in physical properties and mechanical properties, and for example, the occurrence of cracks is advantageously suppressed. obtain. Not only can the transparency be ensured, but the moldability of the polypeptide derivative-containing portion can be effectively enhanced during the production of the porous body.
  • the content of the block copolymer in which the first segment and the second segment are bonded, contained in the polypeptide derivative, relative to the entire polypeptide derivative is not particularly limited, and is, for example, 30% or more on a weight basis. may be 40% or more, may be 50% or more, may be 60% or more, may be 70% or more, or may be 80% or more . It is desirable that the polypeptide derivative contains, as a main component, a block copolymer in which the first segment and the second segment are covalently bonded. Therefore, the content of the block copolymer contained in the polypeptide derivative relative to the entire polypeptide derivative is preferably more than 50%, more preferably 60% or more, and even more preferably 70% or more, on a weight basis.
  • a porous body containing a polypeptide derivative containing the block copolymer at a rate of more than 50% the effect of improving flexibility and/or toughness obtained by containing the polypeptide derivative is achieved at a higher level. obtain.
  • porous body contains a polypeptide derivative. Since the porous material contains a polypeptide derivative, it has excellent flexibility.
  • Polypeptide derivatives include block copolymers having a first segment comprising a polypeptide backbone and one or more second segments attached to the first segment.
  • the second segment contains a molecular group that has a plasticizing function on the polypeptide backbone.
  • the number of second segments is one or more, preferably 2 or more, more preferably 2 to 10, still more preferably 2 to 8, with respect to one first segment, and further Preferably 2-6, most preferably 2-4.
  • the block copolymer contained in the polypeptide derivative may have a first segment and a second segment.
  • one first segment is bound to one or more second segments. or a plurality of connected blocks each including a first segment and a second segment coupled to the first segment.
  • a block copolymer may be a polymer (for example, a graft polymer, etc.) having a first segment containing a polypeptide backbone as a main chain and a second segment as a side chain.
  • the block copolymer may have a plurality of the first segments, and the first segments and the second segments may be alternately bonded.
  • the block copolymer contained in the polypeptide derivative has a plurality of the first segments, and a part of the second segment binds to two or more of the first segments to form a network structure. good too.
  • the bond between the first segment and the second segment may be a direct bond, or a structure that allows the bond between the first segment and the second segment.
  • the bond between the first segment and the second segment may be a coordinate bond, a bond due to ionic interaction, or a covalent bond. .
  • covalent bonds are desirable.
  • the first segment includes a polypeptide backbone, and may, for example, consist of only the polypeptide backbone.
  • the first segment may be linked to the second segment via a functional group (for example, a thiol group of cysteine, etc.) in the amino acid sequence that constitutes the polypeptide backbone.
  • a functional group for example, a thiol group of cysteine, etc.
  • any recombinant polypeptide or hydrophobic polypeptide having a functional group capable of binding to the second segment can be employed as the above polypeptide backbone.
  • the number of functional groups in the polypeptide may be, for example, 1 or more, 2 or more, or 4 or more.
  • the number of functional groups in the polypeptide may be, for example, 30 or less, 25 or less, 20 or less, 15 or less, 10 or less, or 8 or less.
  • the number of functional groups possessed by the polypeptide can be adjusted within the range described above, for example, 1 to 30, 1 to 25, 1 to 20, 1 to 15, 1 to 10, 1 to 8, or 2 to can be eight.
  • the first segment may be linked to the second segment via a functional group introduced to the functional group in the amino acid sequence that constitutes the polypeptide backbone.
  • the functional group as described above is, for example, at least one selected from the group consisting of a thiol group, an amino group, a hydroxy group, a guanidino group, a carboxyl group, a phenoxy group, an indole group, an amide group, an azide group, and an alkynyl group.
  • a thiol group preferably at least one selected from the group consisting of a thiol group, an amino group, a hydroxy group, a guanidino group, a carboxy group, a phenoxy group, an indole group, and an amide group, more preferably a thiol group, an amino group, a hydroxy group, a guanidino group, a carboxy group, a phenoxy group, and an indole group, more preferably a thiol group, an amino group, a hydroxy group, a guanidino group, It may be at least one selected from the group consisting of a carboxy group and a phenoxy group, and more preferably at least one selected from the group consisting of a thiol group, an amino group, a hydroxy group, a guanidino group, and a carboxy group.
  • a thiol group more preferably at least one selected from the group consisting of a thiol group, an amino group, a hydroxy group and a guanidino group, particularly preferably a thiol group, an amino group and a hydroxy group It may be at least one selected from the group consisting of, more preferably at least one selected from the group consisting of a thiol group and an amino group, most preferably a thiol group.
  • the amino group may be, for example, an amino group possessed by lysine.
  • the hydroxy group may be, for example, a hydroxy group possessed by serine, a hydroxy group possessed by threonine, or the like.
  • the guanidino group may be, for example, the guanidino group possessed by arginine.
  • the carboxy group may be, for example, the carboxy group of glutamic acid, the carboxy group of aspartic acid, or the like.
  • the phenoxy group may be, for example, the phenoxy group of tyrosine.
  • the indole group may be, for example, the indole group of triprophane.
  • the amide group may be, for example, an amide group possessed by glutamine, an amide group possessed by asparagine, or the like.
  • the alkynyl group may be an alkynyl group introduced by reacting a thiol group of cysteine with an acetylene halide.
  • the molecular weight of the first segment is, for example, preferably 200 to 1,000,000, more preferably 300 to 900,000, even more preferably 400 to 800,000, still more preferably 500 to 700,000, and still more preferably is 600 to 600,000, more preferably 1,000 to 600,000, more preferably 3,000 to 600,000, even more preferably 5,000 to 600,000, even more preferably 10,000 to 600,000, more preferably is between 5,000 and 100,000.
  • the first segment functioning as a hard segment has a sufficient size with respect to the second segment (soft segment) containing a molecular group with a plasticizing function.
  • the rigidity of the porous body molded using the polypeptide derivative is sufficiently high, and it becomes easier to use as a porous body.
  • the molecular weight of the first segment is 1,000,000 or less, the decrease in reactivity of the ligation reaction is suppressed, and the reaction can be easily completed in a time that allows commercial production as a raw material from a chemical engineering point of view. localization of the unreacted second segment remaining in the
  • the molecular weight of the first segment and the molecular weight of the polypeptide backbone contained in the first segment are, for example, 1000 or more, 2000 or more, 3000 or more, 4000 or more, 5000 or more, 6000 or more, 7000 or more, 8000 or more, 9000 or more. , 10000 or more, 20000 or more, 30000 or more, 40000 or more, 50000 or more, 60000 or more, 70000 or more, 80000 or more, 90000 or more, or 100000 or more. Further, the molecular weight of the first segment and the molecular weight of the polypeptide backbone included in the first segment may be 400,000 or less, less than 360,000, 300,000 or less, or 200,000 or less.
  • the molecular weight of the first segment and the polypeptide backbone the higher the solubility in solvents. Therefore, when the molecular weight of the polypeptide backbone and/or the first segment is, for example, 200,000 or less, or 100,000 or less, the compound containing the polypeptide backbone is dissolved in a solvent to give a plasticizing function to the polypeptide backbone.
  • the compound containing the polypeptide backbone is dissolved in a solvent to give a plasticizing function to the polypeptide backbone.
  • the amount of the second segment is used as much as possible to increase the flexibility of the polypeptide derivative. It is expected that it can be effectively suppressed.
  • the molecular weight of the first segment and the molecular weight of the polypeptide backbone are weight average molecular weights.
  • the molecular weight herein is a value measured by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).
  • SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis
  • the sample is diluted 50-fold with a 10 M urea solution, further diluted 2-fold with a sample buffer (manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and heated at 95° C. for 5 minutes to denature the protein.
  • a sample buffer manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • an SDS-PAGE gel manufactured by Bio-lad
  • an electrophoresis device manufactured by Bio-lad
  • the device is filled with SDS buffer, while the electrophoresis device is connected to a power supply device (manufactured by Biocraft).
  • 10 ⁇ L of the denatured sample is added to each well of the SDS-PAGE gel, and a current of 30 mA/sheet for 30 minutes is applied.
  • the SDS-PAGE gel is removed from the apparatus, immersed in Oriole fluorescent gel stain (manufactured by Bio-lad), and shaken for 1 hour. After that, the gel is placed on a UV sample tray (manufactured by Bio-lad), and a stained image is obtained with a Gel Doc EZ gel imager (manufactured by Bio-lad).
  • the number of amino acid residues constituting the polypeptide backbone may be 50 or more.
  • the number of amino acid residues may be, for example, 100 or more, 150 or more, 200 or more, 250 or more, 300 or more, 350 or more, 400 or more, 450 or more, or 500 or more.
  • the number of amino acid residues may be, for example, 5000 or less, 4500 or less, 4000 or less, 3500 or less, 3000 or less, 2500 or less, 2000 or less, 1500 or less, or 1000 or less. Solubility in solvents tends to increase as the number of amino acid residues decreases.
  • the compound containing the polypeptide backbone is dissolved in a solvent to give a plasticizing function to the polypeptide backbone.
  • the polypeptide backbone is a recombinant polypeptide backbone or a hydrophobic polypeptide backbone, and may be a hydrophobic recombinant polypeptide backbone.
  • Recombinant polypeptide means a polypeptide produced using genetic recombination technology.
  • the polypeptide backbone is a recombinant polypeptide backbone, it is easy to change the design of the amino acid sequence, thus facilitating control of the characteristics, physical properties, etc. of the polypeptide derivative.
  • the polypeptide scaffold is a recombinant polypeptide scaffold, uniform molecular design is always possible, and a desired polypeptide scaffold can be stably obtained. This advantageously stabilizes the quality of the target polypeptide derivative and porous material.
  • the polypeptide backbone is a hydrophobic polypeptide backbone
  • the affinity with the first segment of the molecular group having a plasticizing function is improved, and a more flexible porous body can be produced.
  • the water resistance of such a porous body is improved, and, for example, when the porous body is used as a general-purpose material for industrial use, the service life can be advantageously extended.
  • the hydrophobicity or hydrophilicity of the entire polypeptide derivative can be arbitrarily controlled, for example, by controlling the hydrophobicity or hydrophilicity of the molecular group having a plasticizing function for the polypeptide backbone contained in the second segment.
  • the entire polypeptide derivative can be shifted to the hydrophobic side, thereby It becomes possible to control the hydrophobicity or hydrophilicity of the entire peptide derivative over a wider range.
  • the hydrophobicity of the hydrophobic polypeptide backbone can be estimated using the value of the average hydropathic index (hydrophobicity: hydrophobicity index) described below as an index.
  • the average hydropathic index value of the hydrophobic polypeptide backbone is, for example, 0.00 or more, 0.10 or more, 0.20 or more, 0.22 or more, 0.25 or more, 0.30 or more, 0.35. 0.40 or more, 0.45 or more, 0.50 or more, 0.55 or more, 0.60 or more, 0.65 or more, or 0.70 or more.
  • the upper limit is not particularly limited, it may be, for example, 1.00 or less, or 0.7 or less.
  • the hydrophobic polypeptide skeleton preferably has low solubility in an aqueous solution of lithium bromide (concentration: 9M) at 60°C.
  • This solubility can be evaluated using a polypeptide obtained by decomposing a compound (polypeptide) or polypeptide derivative corresponding to the hydrophobic polypeptide backbone and isolating only the hydrophobic polypeptide backbone.
  • the maximum concentration when the polypeptide is dissolved in an aqueous lithium bromide solution (concentration: 9 M) at 60° C. is, for example, less than 30% by mass, less than 25% by mass, less than 20% by mass, less than 15% by mass, It may be less than 10 wt%, less than 5 wt%, or less than 1 wt%.
  • the hydrophobic polypeptide skeleton may be one that does not dissolve at all in an aqueous solution of lithium bromide (concentration: 9 M) at 60°C.
  • the hydrophobic polypeptide skeleton preferably has a large contact angle with water.
  • the contact angle of water is measured by decomposing a compound (polypeptide) or polypeptide derivative corresponding to the hydrophobic polypeptide skeleton on a substrate and isolating only the hydrophobic polypeptide skeleton. can be formed and evaluated using the film.
  • a polypeptide that forms a film with a contact angle of 55° or more after 5 seconds of water being dropped onto the film is preferred as the hydrophobic polypeptide backbone.
  • the contact angle may be, for example, 60° or greater, 65° or greater, or 70° or greater.
  • the hydrophobic polypeptide backbone is preferably one with excellent hot water resistance. Hydrothermal resistance can be evaluated using a polypeptide obtained by decomposing a compound (polypeptide) or a polypeptide derivative corresponding to the hydrophobic polypeptide backbone and isolating only the hydrophobic polypeptide backbone.
  • the polypeptide backbone may contain a protein-derived backbone, or may consist only of a protein-derived backbone.
  • the protein may be a recombinant protein and may be modified fibroin.
  • Recombinant proteins include any proteins that can be produced on an industrial scale, for example, proteins that can be used for industrial purposes.
  • the term "applicable for industrial use” means, for example, that it can be used for various general-purpose materials used indoors or outdoors.
  • a recombinant protein may be a protein whose domain sequence differs from the amino acid sequence of a naturally occurring protein, or may be a protein whose amino acid sequence is identical to that of a naturally occurring protein.
  • the recombinant protein may be one that uses the amino acid sequence of the naturally occurring protein as it is, or one in which the amino acid sequence is modified based on the amino acid sequence of the naturally occurring protein (for example, a cloned naturally occurring protein
  • the amino acid sequence may be modified by modifying the gene sequence of), or those artificially designed and synthesized without relying on naturally occurring proteins (for example, chemically synthesized nucleic acids encoding the designed amino acid sequences may have a desired amino acid sequence).
  • Recombinant proteins differ from natural proteins in that the amino acid sequence can be freely designed.
  • the amino acid sequence By appropriately designing the amino acid sequence, it is possible to arbitrarily control the functions, characteristics, physical properties, etc. of the porous material. Since uniform molecular design is always possible, it is possible to stably obtain a protein that is highly homologous to the target protein and that meets the purpose. Therefore, it is possible to advantageously stabilize the quality of the desired polypeptide derivative and, in turn, the porous material obtained by using it.
  • a polypeptide backbone may include a backbone derived from a recombinant structural protein.
  • a structural protein means a protein involved in the structure of a living body, a protein constituting a structure produced by a living body, or a protein derived from them.
  • Structural proteins refer to proteins that self-aggregate under certain conditions to form structures such as fibers, films, resins, gels, micelles, and nanoparticles. Specific examples of structural proteins include spider silk (spider silk), silkworm silk, keratin, collagen, elastin, resilin, and proteins derived from these.
  • a recombinant structural protein is a structural protein that is microbially produced by genetic recombination.
  • a recombinant structural protein may have an improved amino acid sequence from the standpoint of moldability and/or productivity.
  • amino acids with smaller side chains are more likely to form hydrogen bonds, making it easier to obtain a porous body with high strength.
  • Alanine residues and glycine residues are amino acids with non-polar side chains, so they are arranged so as to face inward during the folding process during polypeptide production, and tend to adopt an ⁇ -helical structure or a ⁇ -sheet structure. Therefore, it is desirable that the ratio of amino acids such as glycine residues, alanine residues and serine residues is high.
  • the alanine residue content may be, for example, 10-40%, 12-40%, 15-40%, 18-40%, 20-40%, or 22-40%.
  • the glycine residue content is, for example, 10 to 55%, 11 to 55%, 13 to 55%, 15 to 55%, 18 to 55%, 20 to 55%, 22 to 55%, or 25-55%.
  • alanine residue content is a value represented by the following formula.
  • Alanine residue content (number of alanine residues contained in polypeptide/number of total amino acid residues in polypeptide) x 100 (%)
  • Glycine residue content, serine residue content, threonine residue content, proline residue content, and tyrosine residue content are obtained by replacing alanine residues with glycine residues, serine residues, and threonine residues in the above formulas. It is synonymous with a group, a proline residue and a tyrosine residue.
  • amino acids with large side chains or amino acids with flexibility are uniformly distributed throughout the sequence to a certain extent. It is desirable to contain, and specifically, a motif containing a tyrosine residue, a threonine residue, and a proline residue may be repeated in a cycle.
  • the total content of proline residues, threonine residues and tyrosine residues in any 20 consecutive amino acid residues is 5% or more, 5.5% or more, 6.0% or more, 6.5% greater than or equal to 7.0%, greater than or equal to 7.5%, greater than or equal to 8.0%, greater than or equal to 8.5%, greater than or equal to 9.0%, greater than or equal to 10.0%, or greater than or equal to 15.0%.
  • the total content of proline residues, threonine residues and tyrosine residues in any 20 consecutive amino acid residues may be 50% or less, 40% or less, 30% or less, or 20% or less. .
  • the protein has a total serine residue content, threonine residue content and tyrosine residue content of 4% or more, 4.5% or more, 5% or more, 5.5% or more, 6% or more; It may be 5% or more, or 7% or more.
  • the sum of serine residue content, threonine residue content and tyrosine residue content may be, for example, 35% or less, 33% or less, 30% or less, 25% or less, or 20% or less.
  • the protein may have a repetitive sequence. That is, the protein may have multiple amino acid sequences (repetitive sequence units) with high sequence identity.
  • the number of amino acid residues in the repeat sequence unit is preferably 6-200.
  • the sequence identity between repeat sequence units may be, for example, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more.
  • the hydrophobicity (hydropathic index) of the repeating sequence unit is, for example, -0.80 or more, -0.70 or more, -0.60 or more, -0.50 or more, -0.40 or more, -0.
  • the hydrophobicity of the repeating sequence unit is not particularly limited, it may be, for example, 1.0 or less, or 0.7 or less.
  • the protein may contain the (A) n motif.
  • the (A) n motif means an amino acid sequence mainly composed of alanine residues.
  • the number of amino acid residues in the n motif may be 2-27 and may be an integer from 2-20, 2-16, or 2-12.
  • the ratio of the number of alanine residues to the total number of amino acid residues in the n motif may be 40% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 83% or more, 85% or more, 86% 90% or more, 95% or more, or 100% (meaning that it is composed only of alanine residues).
  • the protein preferably has an amino acid sequence corresponding to the insertion of a cysteine residue at a position adjacent to a glycine residue, a serine residue, or an alanine residue. More preferably, it has an amino acid sequence corresponding to the insertion of a cysteine residue at the position.
  • the cysteine residue has a mercapto group (also called a thiol group or a sulfhydryl group), and the selectivity of the mercapto group can facilitate conjugation with the second segment. Therefore, depending on the insertion position of the cysteine residue in the protein, the binding position of the second segment to the polypeptide backbone of the first segment can be any position.
  • a cysteine residue may be located between a glycine residue, a serine residue, or an alanine residue and a glycine residue, a serine residue, or an alanine residue, and a serine residue and a glycine residue. may be located between
  • the protein preferably has an amino acid sequence corresponding to a cysteine residue inserted at a position adjacent to a hydrophobic amino acid residue.
  • hydrophobic amino acid residues are fixed between molecules by hydrophobic interaction.
  • the cysteine residue may be positioned next to the hydrophobic amino acid residue, may be positioned between the hydrophobic amino acid residue and an amino acid residue other than the hydrophobic amino acid residue, It may be positioned between an amino acid residue and a glycine residue, a serine residue, or an alanine residue, and may be positioned between a hydrophobic amino acid residue and a glycine residue.
  • Hydrophobic amino acid residues may be one selected from the group consisting of isoleucine residues, valine residues, leucine residues, phenylalanine residues, methionine residues, and alanine residues.
  • Fibroin is preferable as a protein. Fibroin includes, for example, naturally occurring fibroin. Naturally occurring fibroin includes, for example, fibroin produced by insects or arachnids.
  • fibroin produced by insects include, for example, Bombyx mori, Bombyx mandarina, Antheraea yamamai, Anteraea pernyi, Eriogyna pyretorum, and Pilos cylinthia silkworm. ), silk proteins produced by silkworms such as Samia cynthia, Caligura japonica, Antheraea mylitta, and Antheraea assama, and exhaled by Vespa simillima xantoptera larvae Hornet silk protein.
  • fibroin produced by insects include silkworm fibroin L chain (GenBank Accession No. M76430 (nucleotide sequence), AAA27840.1 (amino acid sequence)).
  • fibroin produced by spiders include, for example, spiders belonging to the genus Araneus such as Araneus spiders, Araneus spiders, Red spiders, Green spiders, and Beetle spiders; Spiders belonging to the genus Pronus, spiders belonging to the genus Pronus such as spiders belonging to the Spiders belonging to the genus Gasteracantha, spiders belonging to the genus Ordgarius such as the genus Ordgarius and the spiders belonging to the genus Ordgarius, spiders belonging to the genus Argiope such as the argiope spider, the argiope spider, and the argiope spider, and the like Spiders belonging to the genus Arachnura, spiders belonging to the genus Acusilas, such as spiders, spiders belonging to the genus Cytophora, such as spiders, spiders, and spiders Spider silk proteins produced by spiders belonging to the genus Cyclosa, such as spiders belonging to the
  • fibroin produced by spiders include fibroin-3 (adf-3) [derived from Araneus diadematus] (GenBank accession number AAC47010 (amino acid sequence), U47855 (nucleotide sequence)), fibroin- 4(adf-4) [derived from Araneus diadematus] (GenBank Accession No. AAC47011 (amino acid sequence), U47856 (nucleotide sequence)), dragline silk protein spidroin 1 [derived from Nephila clavipes] (GenBank Accession No.
  • AAC04504 (amino acid sequence), U37520 (nucleotide sequence)), major angu11ate spidroin 1 [derived from Latrodectus hesperus] (GenBank accession number ABR68856 (amino acid sequence), EF595246 (nucleotide sequence)), dragline silk protein spidroin 2 [derived from Nephila accession number 2Lan4Aclavata] (amino acid sequence), AF441245 (nucleotide sequence)), major ampullate spidroin 1 [from Euprosthenops australis] (GenBank accession number CAJ00428 (amino acid sequence), AJ973155 (nucleotide sequence)), and major ampullate spidroin 2 [Eanprosthenops] Accession number CAM32249.1 (amino acid sequence), AM490169 (nucleotide sequence)), minor amplified silk protein 1 [Nephil
  • fibroin whose sequence information is registered in NCBI GenBank.
  • sequence information registered in NCBI GenBank among the sequences that include INV as a division, spidroin, ampullate, fibroin, "silk and polypeptide", or "silk and protein" are described as keywords in DEFINITION It can be confirmed by extracting the specific product character string from the sequence, CDS, and the specific character string from SOURCE to TISSUE TYPE.
  • modified fibroin means artificially produced fibroin (artificial fibroin).
  • modified fibroin may be fibroin with an amino acid sequence different from that of naturally occurring fibroin, or fibroin with an amino acid sequence identical to that of naturally occurring fibroin.
  • the modified fibroin may be a fibrous protein having a structure similar to that of naturally occurring fibroin, or may be fibroin having a sequence similar to the repeating sequence of naturally occurring fibroin.
  • the “sequence similar to the repeat sequence possessed by fibroin” may be a sequence actually possessed by naturally occurring fibroin, or may be a sequence similar thereto.
  • Modified fibroin refers to a product obtained by modifying the amino acid sequence of a naturally occurring fibroin (e.g., modifying the gene sequence of a cloned naturally occurring fibroin), as long as it has the amino acid sequence specified in the present disclosure.
  • the amino acid sequence may be modified by the method), or the amino acid sequence may be artificially designed without relying on naturally occurring fibroin (for example, by chemically synthesizing the desired amino acid sequence encoding the designed amino acid sequence). (having the amino acid sequence of).
  • a modified fibroin with a modified amino acid sequence is also included in the modified fibroin as long as the amino acid sequence differs from the amino acid sequence of the naturally occurring fibroin.
  • modified fibroin examples include artificial silk fibroin (modified amino acid sequence of silk protein produced by silkworms), and modified spider silk fibroin (modified spider silk protein amino acid sequence produced by spiders). ) and the like.
  • the modified fibroin preferably comprises modified spider silk fibroin, more preferably consists of modified spider silk fibroin.
  • modified fibroin (first modified fibroin) derived from the dragline silk protein produced in the major pituitary gland of spiders, a glycine residue content of modified fibroin with reduced domain sequence (second modified fibroin), (A) modified fibroin with reduced content of n motifs (third modified fibroin), content of glycine residues, and (A) a modified fibroin with reduced n- motif content (fourth modified fibroin), a modified fibroin with a domain sequence containing a region with a large local hydrophobicity index (fifth modified fibroin), and glutamine Modified fibroins having domain sequences with reduced content of residues (sixth modified fibroin) are included.
  • a first modified fibroin includes a protein comprising a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m .
  • the number of amino acid residues in the (A) n motif is preferably an integer of 3 to 20, more preferably an integer of 4 to 20, still more preferably an integer of 8 to 20, an integer of 10 to 20 is even more preferred, integers from 4 to 16 are even more preferred, integers from 8 to 16 are particularly preferred, and integers from 10 to 16 are most preferred.
  • the number of amino acid residues constituting REP in formula 1 is preferably 10 to 200 residues, more preferably 10 to 150 residues, 20 to 100 residues and even more preferably 20 to 75 residues.
  • the total number of glycine residues, serine residues and alanine residues contained in the amino acid sequence represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m is amino acid residue It is preferably 40% or more, more preferably 60% or more, and even more preferably 70% or more of the total number.
  • the first modified fibroin comprises an amino acid sequence unit represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m and has an amino acid sequence whose C-terminal sequence is shown in any one of SEQ ID NOs: 1 to 3, or
  • the polypeptide may be an amino acid sequence having 90% or more homology with the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 1-3.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is identical to the amino acid sequence consisting of the C-terminal 50 amino acids of the amino acid sequence of ADF3 (GI: 1263287, NCBI), and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 has the sequence It is identical to the amino acid sequence shown in No. 1 with 20 residues removed from the C-terminus, and the amino acid sequence shown in SEQ ID No. 3 has 29 residues removed from the C-terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID No. 1. Identical to the amino acid sequence.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 (recombinant spider silk protein ADF3 KaiLargeNRSH1), or (1-ii) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 and 90
  • Modified fibroins comprising amino acid sequences with greater than % sequence identity
  • the sequence identity is 95% or greater.
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 4 is the amino acid sequence (SEQ ID NO: 5) consisting of an initiation codon, a His10 tag, and an HRV3C protease (Human rhinovirus 3C protease) recognition site added to the N-terminus of ADF3.
  • the 13th repeat region was increased to approximately double and mutated so that translation stops at the 1154th amino acid residue.
  • the C-terminal amino acid sequence of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO:4 is identical to the amino acid sequence shown by SEQ ID NO:3.
  • the modified fibroin (1-i) may consist of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:4.
  • the second modified fibroin has an amino acid sequence in which the domain sequence has a reduced content of glycine residues compared to the naturally-derived fibroin.
  • the second modified fibroin can be said to have an amino acid sequence corresponding to at least one or more glycine residues in REP being replaced with another amino acid residue, as compared with naturally occurring fibroin. .
  • the second modified fibroin has a domain sequence of GGX and GPGXX (where G is a glycine residue, P is a proline residue, and X is an amino acid residue other than glycine) in REP compared to naturally occurring fibroin.
  • G is a glycine residue
  • P is a proline residue
  • X is an amino acid residue other than glycine
  • it has an amino acid sequence corresponding to at least one or more glycine residues in the motif sequence being replaced with another amino acid residue
  • the percentage of the motif sequence in which the above-mentioned glycine residue is replaced with another amino acid residue may be 10% or more of the entire motif sequence.
  • the second modified fibroin comprises a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m , and from the domain sequence, the (A) n motif located most C-terminal to the domain sequence
  • w is the total number of amino acid residues in the sequence excluding the sequence from the (A) n motif located on the most C-terminal side to the C-terminus of the domain sequence
  • z/w is 30% or more, It may have an amino acid sequence that is 40% or more, 50% or more, or 50.9% or more.
  • the number of alanine residues relative to the total number of amino acid residues in the n motif may be 83% or more, preferably 86% or more, more preferably 90% or more, and 95% or more. 100% (meaning composed only of alanine residues) is even more preferred.
  • the second modified fibroin preferably has an increased content of the amino acid sequence consisting of XGX by substituting one glycine residue in the GGX motif with another amino acid residue. 6.
  • the content of the amino acid sequence consisting of GGX in the domain sequence is preferably 30% or less, more preferably 20% or less, even more preferably 10% or less. % or less, even more preferably 4% or less, and particularly preferably 2% or less.
  • the content ratio of the amino acid sequence consisting of GGX in the domain sequence can be calculated by the same method as the method for calculating the content ratio (z/w) of the amino acid sequence consisting of XGX below.
  • a method for calculating z/w will be described in more detail.
  • a fibroin modified fibroin or naturally occurring fibroin
  • a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m the (A) n located on the most C-terminal side from the domain sequence
  • An amino acid sequence consisting of XGX is extracted from all REPs contained in the sequence excluding the sequence from the motif to the C-terminus of the domain sequence.
  • fibroin whose amino acid sequence information is registered in NCBI GenBank was confirmed by the method exemplified, and 663 types of fibroin (among them, 415 types of arachnid-derived fibroin) were extracted.
  • Naturally derived fibroin containing a domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m and having an amino acid sequence consisting of GGX in fibroin content of 6% or less among all the extracted fibroin z/w was calculated from the amino acid sequence of fibroin in the above-described calculation method.
  • the horizontal axis of FIG. 2 indicates z/w (%), and the vertical axis indicates frequency.
  • the z/w for naturally occurring fibroin is all less than 50.9% (the highest is 50.86%).
  • z/w is preferably 50.9% or more, more preferably 56.1% or more, even more preferably 58.7% or more, and 70% or more. and even more preferably 80% or more.
  • the upper limit of z/w is not particularly limited, it may be, for example, 95% or less.
  • the second modified fibroin is obtained, for example, by substituting at least part of the nucleotide sequence encoding the glycine residue from the cloned naturally-derived fibroin gene sequence so as to encode another amino acid residue. Obtainable. At this time, one glycine residue in the GGX motif and the GPGXX motif may be selected as the glycine residue to be modified, or may be substituted so that z/w is 50.9% or more. For example, it can be obtained by designing an amino acid sequence that satisfies the above aspect from the amino acid sequence of naturally occurring fibroin, and chemically synthesizing a nucleic acid encoding the designed amino acid sequence.
  • one or more amino acid residues are further substituted or deleted. , insertions and/or additions may be made to the amino acid sequence.
  • the other amino acid residue mentioned above is not particularly limited as long as it is an amino acid residue other than glycine residue, but valine (V) residue, leucine (L) residue, isoleucine (I) residue, methionine ( Hydrophobic amino acid residues such as M) residues, proline (P) residues, phenylalanine (F) residues and tryptophan (W) residues, glutamine (Q) residues, asparagine (N) residues, serine (S ) residues, lysine (K) residues and glutamic acid (E) residues are preferred, and hydrophilic amino acid residues such as valine (V) residues, leucine (L) residues, isoleucine (I) residues, phenylalanine ( F) residues and glutamine (Q) residues are more preferred, and glutamine (Q) residues are even more preferred.
  • second modified fibroin examples include (2-i) SEQ ID NO: 6 (Met-PRT380), SEQ ID NO: 7 (Met-PRT410), SEQ ID NO: 8 (Met-PRT525) or SEQ ID NO: 9 (Met -PRT799), or (2-ii) SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, or SEQ ID NO: 9. Mention may be made of modified fibroin.
  • the modified fibroin of (2-i) will be explained.
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 6 is obtained by replacing all GGX in REP of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 10 (Met-PRT313) corresponding to naturally occurring fibroin with GQX.
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 7 is obtained by deleting every two (A) n motifs from the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 6 from the N-terminal side to the C-terminal side, and furthermore, in front of the C-terminal sequence. [(A) n motif-REP] is inserted into the .
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 has two alanine residues inserted on the C-terminal side of each (A) n motif of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, and a partial glutamine (Q) residue. It is obtained by substituting serine (S) residues and deleting some amino acids on the C-terminal side so that the molecular weight is almost the same as that of SEQ ID NO:7.
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 9 is a region of 20 domain sequences present in the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 7 (however, several amino acid residues on the C-terminal side of the region are substituted). A predetermined hinge sequence and a His tag sequence are added to the C-terminus of a sequence in which is repeated four times.
  • the z/w value in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 (corresponding to naturally occurring fibroin) is 46.8%.
  • the z/w values in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 are each 58.7%, 70.1%, 66.1% and 70.0%.
  • the values of x/y at the jagged ratio (described later) of 1:1.8 to 11.3 of the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9 are 15, respectively. .0%, 15.0%, 93.4%, 92.7% and 89.8%.
  • the modified fibroin of (2-i) may consist of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9.
  • the modified fibroin (2-ii) contains an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9.
  • the modified fibroin of (2-ii) is also a protein containing a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m .
  • the sequence identity is preferably 95% or more.
  • the modified fibroin of (2-ii) has a sequence identity of 90% or more with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9, and XGX contained in REP ( where X represents an amino acid residue other than glycine). is preferably 50.9% or more.
  • the second modified fibroin may contain a tag sequence at either or both of the N-terminus and C-terminus. This enables isolation, immobilization, detection, visualization, and the like of modified fibroin.
  • tag sequences include affinity tags that utilize specific affinity (binding, affinity) with other molecules.
  • affinity tag is a histidine tag (His tag).
  • His tag is a short peptide in which about 4 to 10 histidine residues are lined up, and has the property of specifically binding to metal ions such as nickel, so isolation of modified fibroin by metal chelating metal chromatography can be used for
  • a specific example of the tag sequence is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 (an amino acid sequence containing a His tag sequence and a hinge sequence).
  • a tag sequence such as glutathione-S-transferase (GST) that specifically binds to glutathione or maltose binding protein (MBP) that specifically binds to maltose can be used.
  • GST glutathione-S-transferase
  • MBP maltose binding protein
  • epitope tag that utilizes antigen-antibody reaction can also be used as the tag sequence.
  • an antigenic peptide epitope
  • an antibody against the epitope can be bound.
  • epitope tags include HA (peptide sequence of influenza virus hemagglutinin) tag, myc tag, FLAG tag, and the like. Modified fibroin can be easily purified with high specificity by using an epitope tag.
  • a tag sequence that can be cleaved by a specific protease can also be used as a tag sequence.
  • the modified fibroin from which the tag sequence has been cut off can also be recovered by treating the protein adsorbed via the tag sequence with protease.
  • modified fibroin containing a tag sequence examples include: (2-iii) amino acids represented by SEQ ID NO: 12 (PRT380), SEQ ID NO: 13 (PRT410), SEQ ID NO: 14 (PRT525) or SEQ ID NO: 15 (PRT799) sequence, or (2-iv) a modified fibroin comprising an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15. .
  • amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 16 are SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9, respectively.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 was added to the N-terminus of the amino acid sequence shown.
  • the modified fibroin of (2-iii) may consist of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15.
  • the modified fibroin of (2-iv) contains an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15.
  • the modified fibroin of (2-iv) is also a protein containing a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m .
  • the sequence identity is preferably 95% or more.
  • (2-iv) modified fibroin has 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15, and is contained in REP ( where X represents an amino acid residue other than glycine). is preferably 50.9% or more.
  • the second modified fibroin may contain a secretory signal for releasing the protein produced in the artificial protein production system to the outside of the host.
  • the sequence of the secretory signal can be appropriately set according to the type of host.
  • a third modified fibroin has an amino acid sequence in which the domain sequence has a reduced content of (A) n motifs compared to the naturally occurring fibroin.
  • the domain sequence of the third modified fibroin can be said to have an amino acid sequence corresponding to deletion of at least one or more (A) n motifs compared to the naturally occurring fibroin.
  • a third modified fibroin may have an amino acid sequence corresponding to 10-40% deletion of the (A) n motif from the naturally-occurring fibroin.
  • a third modified fibroin has a domain sequence at least one (A) n motif for every 1-3 (A) n motifs from the N-terminal side to the C-terminal side as compared to the naturally-occurring fibroin. may have an amino acid sequence corresponding to the deletion of
  • the third modified fibroin has at least two consecutive (A) n motif deletions from the N-terminal side to the C-terminal side and one (A ) may have an amino acid sequence corresponding to deletion of n motifs repeated in this order.
  • the third modified fibroin may have an amino acid sequence corresponding to deletion of at least every two (A) n motifs from the N-terminal side to the C-terminal side of the domain sequence. .
  • a third modified fibroin comprises a domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m , with two adjacent [(A) n motifs from the N-terminal side to the C-terminal side.
  • -REP] unit sequentially compares the number of amino acid residues of REP, and when the number of amino acid residues of REP with a small number of amino acid residues is set to 1, the ratio of the number of amino acid residues of the other REP is 1.8 to 11.
  • the total number of amino acid residues of the domain sequence is y Furthermore, it may have an amino acid sequence in which x/y is 20% or more, 30% or more, 40% or more, or 50% or more.
  • the number of alanine residues relative to the total number of amino acid residues in the n motif may be 83% or more, preferably 86% or more, more preferably 90% or more, and 95% or more. 100% (meaning composed only of alanine residues) is even more preferred.
  • FIG. 1 shows the domain sequence of the modified fibroin with the N-terminal and C-terminal sequences removed.
  • the domain sequence is, from the N-terminal side (left side), (A) n motif-first REP (50 amino acid residues)-(A) n motif-second REP (100 amino acid residues)-(A) n Motif-third REP (10 amino acid residues)-(A) n motif-fourth REP (20 amino acid residues)-(A) n motif-fifth REP (30 amino acid residues)-(A) It has a sequence called n motif.
  • a set of [(A) n motif-REP] units having a ratio of 1.8 to 11.3 for the number of amino acid residues of the other is set to 1 for the one with the smaller number of amino acid residues. It is indicated by a solid line. This ratio is referred to herein as the serration ratio.
  • a set of [(A) n motif-REP] units in which the other amino acid residue number ratio is less than 1.8 or greater than 11.3 when the number of amino acid residues is less than 1 is indicated by a dashed line. Indicated.
  • each pattern the numbers of all amino acid residues of two adjacent [(A) n motif-REP] units indicated by solid lines are summed up (not only REP but also the number of amino acid residues of (A) n motifs). be.). Then, the added total values are compared, and the total value (maximum total value) of the pattern with the maximum total value is defined as x. In the example shown in FIG. 1, the total value of pattern 1 is the largest.
  • x/y (%) can be calculated by dividing x by the total number of amino acid residues y in the domain sequence.
  • x/y is preferably 50% or more, more preferably 60% or more, even more preferably 65% or more, and even more preferably 70% or more. Preferably, 75% or more is even more preferable, and 80% or more is particularly preferable.
  • the upper limit of x/y is not particularly limited, and may be, for example, 100% or less.
  • x/y is preferably 89.6% or more, and when the serration ratio is 1:1.8 to 3.4, x /y is preferably 77.1% or more, and when the serration ratio is 1:1.9 to 8.4, x/y is preferably 75.9% or more, and the serration ratio is 1 : 1.9 to 4.1, x/y is preferably 64.2% or more.
  • x/y is 46.4% or more. is preferably 50% or more, more preferably 55% or more, even more preferably 60% or more, even more preferably 70% or more, and 80% or more It is particularly preferred to have The upper limit of x/y is not particularly limited as long as it is 100% or less.
  • fibroin whose amino acid sequence information is registered in NCBI GenBank was confirmed by the method exemplified, and 663 types of fibroin (among them, 415 types of arachnid-derived fibroin) were extracted. Of all the extracted fibroin, from the amino acid sequence of naturally occurring fibroin composed of the domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m , x/y was calculated.
  • FIG. 3 shows the results when the serration ratio is 1:1.9 to 4.1.
  • the horizontal axis in FIG. 3 indicates x/y (%), and the vertical axis indicates frequency.
  • the x/y ratios for naturally occurring fibroin are all less than 64.2% (64.14% being the highest).
  • the third modified fibroin deletes one or more of the (A) n motif-encoding sequences from the cloned naturally occurring fibroin gene sequence such that x/y is 64.2% or more.
  • one or more amino acid residues are substituted, deleted, inserted and/or added. Alterations in the amino acid sequence corresponding to what has been done may be made.
  • third modified fibroin examples include (3-i) SEQ ID NO: 17 (Met-PRT399), SEQ ID NO: 7 (Met-PRT410), SEQ ID NO: 8 (Met-PRT525) or SEQ ID NO: 9 (Met -PRT799), or (3-ii) SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, or SEQ ID NO: 9. Mention may be made of modified fibroin.
  • the modified fibroin of (3-i) will be explained.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 is every two (A) n
  • the motif was deleted and one [(A) n motif-REP] was inserted in front of the C-terminal sequence.
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9 is as described in the second modified fibroin.
  • the value of x/y at the jagged ratio of 1:1.8 to 11.3 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 is 15.0%.
  • the x/y values of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 17 and the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 7 are both 93.4%.
  • the value of x/y in the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 8 is 92.7%.
  • the value of x/y in the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 9 is 89.8%.
  • the z/w values in the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9 are 46.8%, 56.2%, 70.1%, 66.0%, respectively. 1% and 70.0%.
  • the modified fibroin of (3-i) may consist of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9.
  • the modified fibroin of (3-ii) contains an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9.
  • the modified fibroin of (3-ii) is also a protein containing a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m .
  • the sequence identity is preferably 95% or more.
  • the modified fibroin of (3-ii) has 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9, and from the N-terminal side to the C-terminal side , the numbers of amino acid residues of REP of two adjacent [(A) n motif-REP] units are sequentially compared, and when the number of amino acid residues of REP with a small number of amino acid residues is set to 1, the number of amino acid residues of the other Amino acid residues of two adjacent [(A) n motif-REP] units with a ratio of the number of amino acid residues of REP of 1.8 to 11.3 (Giza ratio is 1:1.8 to 11.3) It is preferable that x/y is 64.2% or more, where x is the maximum sum of the cardinal numbers and y is the total number of amino acid residues in the domain sequence.
  • the third modified fibroin may contain the tag sequence described above at either or both of the N-terminus and C-terminus.
  • modified fibroin containing a tag sequence (3-iii) the amino acid shown in SEQ ID NO: 18 (PRT399), SEQ ID NO: 13 (PRT410), SEQ ID NO: 14 (PRT525) or SEQ ID NO: 15 (PRT799) sequence, or (3-iv) a modified fibroin comprising an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15. .
  • amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15 have SEQ ID NO: 11 at the N-terminus of the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9, respectively.
  • the amino acid sequence shown in (including His tag sequence and hinge sequence) is added.
  • the modified fibroin of (3-iii) may consist of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15.
  • (3-iv) modified fibroin contains an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15.
  • the modified fibroin of (3-iv) is also a protein containing a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m .
  • the sequence identity is preferably 95% or more.
  • (3-iv) modified fibroin has 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15, and , the numbers of amino acid residues of REP of two adjacent [(A) n motif-REP] units are sequentially compared, and when the number of amino acid residues of REP with a small number of amino acid residues is set to 1, the number of amino acid residues of the other Let x be the maximum value of the total sum of the amino acid residue numbers of two adjacent [(A) n motif-REP] units with a ratio of the number of amino acid residues of REP of 1.8 to 11.3. , x/y is preferably 64.2% or more, where y is the total number of amino acid residues in the domain sequence.
  • the third modified fibroin may contain a secretion signal for releasing the protein produced in the artificial protein production system to the outside of the host.
  • the sequence of the secretory signal can be appropriately set according to the type of host.
  • the fourth modified fibroin has an amino acid sequence whose domain sequence has a reduced content of (A) n motifs and a reduced content of glycine residues compared to naturally occurring fibroin. have.
  • the domain sequence of the fourth modified fibroin is that at least one or more (A) n motifs are deleted, and at least one or more glycine residues in REP are deleted compared to the naturally occurring fibroin. It can be said to have an amino acid sequence corresponding to substitution with another amino acid residue. That is, the fourth modified fibroin is a modified fibroin having both the features of the above-described second modified fibroin and the third modified fibroin. Specific aspects and the like are as described in the second modified fibroin and the third modified fibroin.
  • the fourth modified fibroin include (4-i) SEQ ID NO: 7 (Met-PRT410), SEQ ID NO: 8 (Met-PRT525), SEQ ID NO: 9 (Met-PRT799), SEQ ID NO: 13 (PRT410 ), the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 (PRT525) or SEQ ID NO: 15 (PRT799), or (4-ii) SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15
  • Modified fibroin comprising an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in .
  • Specific embodiments of the modified fibroin comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15 are as described above.
  • a fifth modified fibroin has a domain sequence in which one or more amino acid residues in REP are replaced with amino acid residues having a larger hydrophobicity index than in naturally occurring fibroin, and/or REP It may have an amino acid sequence that includes regions of high local hydrophobicity index corresponding to the insertion of one or more amino acid residues with high hydrophobicity index therein.
  • a region with a locally high hydrophobicity index is preferably composed of 2 to 4 consecutive amino acid residues.
  • the amino acid residue having a large hydrophobicity index is an amino acid selected from isoleucine (I), valine (V), leucine (L), phenylalanine (F), cysteine (C), methionine (M) and alanine (A).
  • a residue is more preferred.
  • a fifth modified fibroin is obtained by replacing one or more amino acid residues in REP with amino acid residues having a higher hydrophobicity index than in naturally occurring fibroin, and/or one or more
  • one or more amino acid residues are substituted, deleted, inserted and / or added as compared to naturally occurring fibroin
  • one or more hydrophilic amino acid residues eg, amino acid residues with a negative hydrophobicity index
  • hydrophobic amino acid residues by substituting a group (for example, an amino acid residue with a positive hydrophobicity index) and/or by inserting one or more hydrophobic amino acid residues into REP.
  • replacing one or more hydrophilic amino acid residues in REP with hydrophobic amino acid residues from the amino acid sequence of naturally occurring fibroin, and/or inserting one or more hydrophobic amino acid residues in REP It can also be obtained by designing an amino acid sequence corresponding to what is described above and chemically synthesizing a nucleic acid encoding the designed amino acid sequence.
  • substitution of one or more hydrophilic amino acid residues in REP with hydrophobic amino acid residues from the amino acid sequence of naturally occurring fibroin, and/or one or more hydrophobic amino acids in REP may also be made.
  • the fifth modified fibroin comprises a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m , and from the (A) n motif located on the most C-terminal side to the C-terminus of the domain sequence
  • p be the total number of amino acid residues contained in a region where the average value of the hydrophobic index of four consecutive amino acid residues is 2.6 or more in all REPs contained in the sequences excluding the sequences from the domain sequence
  • p/q is 6, where q is the total number of amino acid residues contained in the sequence obtained by excluding the sequence from the (A) n motif located on the most C-terminal side to the C-terminus of the domain sequence from the domain sequence. It may have an amino acid sequence that is greater than or equal to .2%.
  • hydrophobicity index of amino acid residues a known index (Hydropathy index: Kyte J, & Doolittle R (1982) "A simple method for displaying the hydropathic character of a protein", J. Mol. Biol., 157, pp. 105-132).
  • HI hydropathic index
  • sequence A [(A) n motif-REP] m excluding the sequence from the (A) n motif located on the most C-terminal side to the C-terminus of the domain sequence (hereinafter referred to as “sequence A”) is used.
  • sequence A the sequence from the domain sequence represented by the formula 1: [(A) n motif-REP] m excluding the sequence from the (A) n motif located on the most C-terminal side to the C-terminus of the domain sequence.
  • the average value of the hydrophobicity index is obtained for all four consecutive amino acid residues (each amino acid residue is used to calculate the average value 1 to 4 times). Next, a region in which the average value of the hydrophobic index of 4 consecutive amino acid residues is 2.6 or more is specified. Even if a certain amino acid residue corresponds to multiple "4 consecutive amino acid residues with an average hydrophobicity index of 2.6 or more", it is included as one amino acid residue in the region. become.
  • the total number of amino acid residues contained in the region is p.
  • the total number of amino acid residues contained in sequence A is q.
  • p/q is preferably 6.2% or more, more preferably 7% or more, even more preferably 10% or more, and 20% or more. Even more preferably, it is still more preferably 30% or more.
  • the upper limit of p/q is not particularly limited, it may be, for example, 45% or less.
  • the amino acid sequence of the cloned naturally occurring fibroin is modified so as to satisfy the p/q conditions described above, so that one or more hydrophilic amino acid residues in REP (eg, hydrophobicity index). negative amino acid residue) with a hydrophobic amino acid residue (e.g., an amino acid residue with a positive hydrophobicity index), and/or inserting one or more hydrophobic amino acid residues in REP can be obtained by locally modifying an amino acid sequence containing a region with a large hydrophobicity index.
  • hydrophilic amino acid residues in REP eg, hydrophobicity index
  • negative amino acid residue with a hydrophobic amino acid residue
  • a hydrophobic amino acid residue e.g., an amino acid residue with a positive hydrophobicity index
  • inserting one or more hydrophobic amino acid residues in REP can be obtained by locally modifying an amino acid sequence containing a region with a large hydrophobicity index.
  • an amino acid sequence that satisfies the above p/q conditions from the amino acid sequence of naturally occurring fibroin and chemically synthesizing a nucleic acid encoding the designed amino acid sequence.
  • one or more amino acid residues in REP have been replaced with amino acid residues having a higher hydrophobicity index compared to naturally-occurring fibroin, and/or one or more
  • further modification corresponding to the substitution, deletion, insertion and/or addition of one or more amino acid residues may be performed. .
  • Amino acid residues with a large hydrophobicity index are not particularly limited, but areoleucine (I), valine (V), leucine (L), phenylalanine (F), cysteine (C), methionine (M) and alanine (A). ) are preferred, and valine (V), leucine (L) and isoleucine (I) are more preferred.
  • the fifth modified fibroin (5-i) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 (Met-PRT720), SEQ ID NO: 20 (Met-PRT665), or SEQ ID NO: 21 (Met-PRT666); or (5-ii) modified fibroin comprising an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 21.
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 19 consists of 3 amino acid residues every other REP except for the terminal domain sequence on the C-terminal side with respect to the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 7 (Met-PRT410).
  • the amino acid sequence (VLI) was inserted at two sites, some glutamine (Q) residues were substituted with serine (S) residues, and some amino acids on the C-terminal side were deleted.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 (Met-PRT525) in which an amino acid sequence (VLI) consisting of three amino acid residues is inserted at every other REP. be.
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 21 is obtained by inserting two amino acid sequences (VLI) each consisting of 3 amino acid residues every other REP into the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 8.
  • the modified fibroin of (5-i) may consist of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 21.
  • the modified fibroin (5-ii) contains an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 21.
  • the modified fibroin of (5-ii) is also a protein containing a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m .
  • the sequence identity is preferably 95% or more.
  • the modified fibroin of (5-ii) has 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 or SEQ ID NO: 21, and is located on the most C-terminal side (A) n Amino acids contained in a region where the average hydrophobicity index of 4 consecutive amino acid residues is 2.6 or more in all REPs contained in the domain sequence excluding the sequence from the motif to the C-terminus of the domain sequence Let p be the total number of residues, and q be the total number of amino acid residues contained in the sequence obtained by excluding the sequence from the (A) n motif located on the most C-terminal side to the C-terminus of the domain sequence from the domain sequence. , p/q is preferably 6.2% or more.
  • the fifth modified fibroin may contain a tag sequence at either or both of the N-terminus and C-terminus.
  • modified fibroin containing a tag sequence examples include (5-iii) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 (PRT720), SEQ ID NO: 23 (PRT665), or SEQ ID NO: 24 (PRT666), or (5-iv ) modified fibroin comprising an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 or SEQ ID NO:24.
  • amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 are added to the N-terminals of the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 21, respectively, where the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 (His tag sequence and hinge sequence) are added.
  • the modified fibroin of (5-iii) may consist of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 or SEQ ID NO:24.
  • the modified fibroin (5-iv) contains an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 or SEQ ID NO:24.
  • the modified fibroin of (5-iv) is also a protein containing a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m .
  • the sequence identity is preferably 95% or more.
  • the modified fibroin of (5-iv) has 90% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 or SEQ ID NO: 24, and is located on the most C-terminal side (A) n Amino acids contained in a region where the average hydrophobicity index of 4 consecutive amino acid residues is 2.6 or more in all REPs contained in the domain sequence excluding the sequence from the motif to the C-terminus of the domain sequence Let p be the total number of residues, and q be the total number of amino acid residues contained in the sequence obtained by excluding the sequence from the (A) n motif located on the most C-terminal side to the C-terminus of the domain sequence from the domain sequence. , p/q is preferably 6.2% or more.
  • the fifth modified fibroin may contain a secretory signal for releasing the protein produced in the artificial protein production system to the outside of the host.
  • the sequence of the secretory signal can be appropriately set according to the type of host.
  • a sixth modified fibroin has an amino acid sequence with a reduced content of glutamine residues compared to naturally occurring fibroin.
  • the sixth modified fibroin preferably contains at least one motif selected from the GGX motif and the GPGXX motif in the REP amino acid sequence.
  • the GPGXX motif content is usually 1% or more, may be 5% or more, and preferably 10% or more.
  • the upper limit of the GPGXX motif content is not particularly limited, and may be 50% or less, or 30% or less.
  • GPGXX motif content is a value calculated by the following method.
  • Formula 1 [(A) n motif-REP] m or Formula 2: [(A) n motif-REP] m -(A) n motif fibroin (modified fibroin or naturally occurring fibroin), the number of GPGXX motifs contained in the region in all REPs contained in the sequence excluding the sequence from the (A) n motif located on the most C-terminal side to the C-terminus of the domain sequence from the domain sequence The number obtained by multiplying the total by three (that is, the total number of G and P in the GPGXX motif) is defined as s, and the sequence from the (A) n motif located on the most C-terminal side to the C-terminus of the domain sequence is taken from the domain sequence.
  • the GPGXX motif content rate is calculated as s/t, where t is the total number of amino acid residues in all REPs excluding (A) n motifs.
  • the "sequence obtained by removing the sequence from the (A) n motif located on the most C-terminal side to the C-terminus of the domain sequence from the domain sequence” is "the most C-terminal side (A)
  • the sequence from the n motif to the C-terminus of the domain sequence” may include sequences that are poorly correlated with sequences characteristic of fibroin, and m is small If the domain sequence is short (that is, if the domain sequence is short), it affects the calculation result of the GPGXX motif content rate, so this effect is to be eliminated.
  • a "GPGXX motif” is located at the C-terminus of REP, it is treated as a "GPGXX motif” even if "XX" is, for example, "AA”.
  • FIG. 5 is a schematic diagram showing the domain sequence of modified fibroin.
  • the sixth modified fibroin preferably has a glutamine residue content of 9% or less, more preferably 7% or less, even more preferably 4% or less, and particularly preferably 0%. .
  • glucose residue content is a value calculated by the following method.
  • Formula 1 [(A) n motif-REP] m or Formula 2: [(A) n motif-REP] m -(A) n motif fibroin (modified fibroin or naturally occurring fibroin), the sequence from the (A) n motif located on the most C-terminal side to the C-terminus of the domain sequence is removed from the domain sequence (the sequence corresponding to "region A" in FIG. 5).
  • a sixth modified fibroin corresponds to a domain sequence that lacks one or more glutamine residues in REP or replaces them with other amino acid residues as compared to the naturally-occurring fibroin. It may have an amino acid sequence.
  • “Another amino acid residue” may be an amino acid residue other than a glutamine residue, but preferably an amino acid residue with a higher hydrophobicity index than a glutamine residue. Hydrophobicity indexes of amino acid residues are shown in Table 1.
  • amino acid residues having a higher hydrophobicity index than glutamine residues include isoleucine (I), valine (V), leucine (L), phenylalanine (F), cysteine (C), methionine (M ) amino acid residues selected from alanine (A), glycine (G), threonine (T), serine (S), tryptophan (W), tyrosine (Y), proline (P) and histidine (H); can.
  • amino acid residues selected from isoleucine (I), valine (V), leucine (L), phenylalanine (F), cysteine (C), methionine (M) and alanine (A) are more preferred.
  • the sixth modified fibroin has a REP hydrophobicity (hydropathy index) of, for example, -0.80 or more, -0.70, -0.60 or more, -0.50 or more, or -0.40 or more. , -0.30 or more, -0.20 or more, -0.10 or more, 0.00 or more, 0.10 or more, 0.20 or more, 0.22 or more, 0.25 or more, 0.30 or more, 0 .35 or greater, 0.40 or greater, 0.45 or greater, 0.50 or greater, 0.55 or greater, 0.60 or greater, 0.65 or greater, or 0.70 or greater.
  • hydrophobicity of REP There is no particular upper limit to the hydrophobicity of REP, and it may be 1.0 or less, or 0.7 or less.
  • REP hydrophobicity as used herein is a value calculated by the following method.
  • Formula 1 [(A) n motif-REP] m or Formula 2: [(A) n motif-REP] m -(A) n motif fibroin (modified fibroin or naturally occurring fibroin), the sequence from the (A) n motif located on the most C-terminal side to the C-terminus of the domain sequence is removed from the domain sequence (the sequence corresponding to "region A" in FIG. 5).
  • the sum of the hydrophobicity indices of each amino acid residue in the region is v, and the sequence from the (A) n motif located on the most C-terminal side to the C-terminus of the domain sequence is removed from the domain sequence, and further ( A) The hydrophobicity of REP is calculated as v/t, where t is the total number of amino acid residues in all REPs excluding n motifs.
  • the reason for targeting is the reason described above. It is the same.
  • a sixth modified fibroin has a domain sequence lacking one or more glutamine residues in REP and/or one or more glutamine residues in REP compared to naturally-occurring fibroin
  • modification corresponding to the substitution of another amino acid residue there may be modifications of the amino acid sequence corresponding to the substitution, deletion, insertion and / or addition of one or more amino acid residues.
  • a sixth modified fibroin is obtained, for example, by deleting one or more glutamine residues in REP from the cloned naturally occurring fibroin gene sequence and/or by deleting one or more glutamine residues in REP.
  • sixth modified fibroin examples include (6-i) SEQ ID NO: 25 (Met-PRT888), SEQ ID NO: 26 (Met-PRT965), SEQ ID NO: 27 (Met-PRT889), SEQ ID NO: 28 (Met -PRT916), SEQ ID NO: 29 (Met-PRT918), SEQ ID NO: 30 (Met-PRT699), SEQ ID NO: 31 (Met-PRT698), SEQ ID NO: 32 (Met-PRT966), SEQ ID NO: 41 (Met-PRT917) or sequence Modified fibroin comprising the amino acid sequence represented by number 42 (Met-PRT1028), or (6-ii) SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 41 or SEQ ID NO: 42, and a modified fibroin comprising an amino acid sequence having 90% or more sequence identity
  • the modified fibroin of (6-i) will be explained.
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO:25 is obtained by replacing all QQs in the amino acid sequence shown by SEQ ID NO:7 (Met-PRT410) with VL.
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 26 is obtained by replacing all QQs in the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 7 with TS, and replacing the remaining Q with A.
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 27 is obtained by replacing all QQs in the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 7 with VL, and replacing the remaining Q with I.
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO:28 is obtained by substituting VI for all QQs in the amino acid sequence shown by SEQ ID NO:7 and L for the remaining Qs.
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 29 is obtained by replacing all QQs in the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 7 with VF, and replacing the remaining Q with I.
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 30 is obtained by replacing all QQs in the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 8 (Met-PRT525) with VL.
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 31 is obtained by replacing all QQs in the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 8 with VL, and replacing the remaining Q with I.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 32 consists of 20 domain sequence regions present in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 (Met-PRT410) that are repeated twice, and all QQ in the sequence are replaced with VF, And the remaining Q is replaced with I.
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 41 (Met-PRT917) is obtained by replacing all QQs in the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 7 with LI and the remaining Qs with V.
  • the amino acid sequence shown by SEQ ID NO:42 (Met-PRT1028) is obtained by replacing all QQs in the amino acid sequence shown by SEQ ID NO:7 with IF, and replacing the remaining Q with T.
  • SEQ ID NO: 25 SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 41 and SEQ ID NO: 42 are all glutamine residues
  • the group content is below 9% (Table 2).
  • the modified fibroin of (6-i) is represented by SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 41 or SEQ ID NO: 42 It may consist of the amino acid sequence shown.
  • the modified fibroin of (6-ii) is represented by SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 41 or SEQ ID NO: 42 Amino acid sequences having 90% or greater sequence identity with the indicated amino acid sequences are included.
  • the modified fibroin of (6-ii) also has a domain represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m or Formula 2: [(A) n motif-REP] m -(A) n motif A protein containing a sequence.
  • the sequence identity is preferably 95% or more.
  • the modified fibroin of (6-ii) preferably has a glutamine residue content of 9% or less.
  • the modified fibroin of (6-ii) preferably has a GPGXX motif content of 10% or more.
  • the sixth modified fibroin may contain a tag sequence at either or both of the N-terminus and C-terminus. This enables isolation, immobilization, detection, visualization, and the like of modified fibroin.
  • modified fibroin containing a tag sequence examples include (6-iii) SEQ ID NO: 33 (PRT888), SEQ ID NO: 34 (PRT965), SEQ ID NO: 35 (PRT889), SEQ ID NO: 36 (PRT916), SEQ ID NO: 37 (PRT918), SEQ ID NO: 38 (PRT699), SEQ ID NO: 39 (PRT698), SEQ ID NO: 40 (PRT966), SEQ ID NO: 43 (PRT917) or SEQ ID NO: 44 (PRT1028) modified fibroin comprising the amino acid sequence, or ( 6-iv) SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 43 or SEQ ID NO: 44 and 90 Modified fibroins comprising amino acid sequences with greater than % sequence identity can be mentioned.
  • amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 43 and SEQ ID NO: 44 are SEQ ID NO: 25 , SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 41 and SEQ ID NO: 42 at the N-terminus of SEQ ID NO: 11
  • the amino acid sequence (including the His-tag sequence and hinge sequence) is added.
  • SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39 , SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 43 and SEQ ID NO: 44 all have a glutamine residue content of 9% or less (Table 3).
  • the modified fibroin of (6-iii) is SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 43 or SEQ ID NO: 44 It may consist of the amino acid sequence shown.
  • the modified fibroin of (6-iv) is SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 43 or SEQ ID NO: 44 Amino acid sequences having 90% or greater sequence identity with the indicated amino acid sequences are included.
  • the modified fibroin of (6-iv) also has a domain represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m or Formula 2: [(A) n motif-REP] m -(A) n motif A protein containing a sequence.
  • the sequence identity is preferably 95% or more.
  • the modified fibroin of (6-iv) preferably has a glutamine residue content of 9% or less.
  • the modified fibroin of (6-iv) preferably has a GPGXX motif content of 10% or more.
  • the sixth modified fibroin may contain a secretion signal for releasing the protein produced in the artificial protein production system to the outside of the host.
  • the sequence of the secretory signal can be appropriately set according to the type of host.
  • the modified fibroin has at least two or more of the characteristics of the first modified fibroin, the second modified fibroin, the third modified fibroin, the fourth modified fibroin, the fifth modified fibroin, and the sixth modified fibroin. It may be a modified fibroin having the characteristics of
  • the modified fibroin according to this embodiment has a domain sequence represented by Formula 1: [(A)n motif-REP]m or Formula 2: [(A)n motif-REP]m-(A)n motif It may be a protein containing
  • the modified fibroin may have additional amino acid sequences (N-terminal sequence and C-terminal sequence) added to either or both of the N-terminal side and the C-terminal side of the domain sequence.
  • the N-terminal sequence and C-terminal sequence are typically, but not limited to, regions that do not have repeated amino acid motifs characteristic of fibroin and consist of about 100 amino acids.
  • domain sequence refers to a fibroin-specific crystalline region (typically corresponding to the (A) n motif of the amino acid sequence) and an amorphous region (typically corresponding to the REP of the amino acid sequence). ) and is represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m or Formula 2: [(A) n motif-REP] m -(A) n motif means an array.
  • the (A) n motif represents an amino acid sequence composed of 4 to 27 amino acid residues, and the number of alanine residues is 80% or more of the total number of amino acid residues in the (A) n motif.
  • REP indicates an amino acid sequence composed of 10-200 amino acid residues.
  • n represents an integer of 10-300. m is preferably an integer of 20-300, more preferably an integer of 30-300.
  • a plurality of (A) n motifs may have the same amino acid sequence or different amino acid sequences.
  • a plurality of REPs may have the same amino acid sequence or different amino acid sequences.
  • At least seven of the (A) n motifs present in the domain sequence are preferably composed only of alanine residues. Consisting only of alanine residues means that the (A) n motif has an amino acid sequence represented by (Ala) k (Ala represents an alanine residue). k is preferably an integer of 4-27, more preferably an integer of 4-20, and still more preferably an integer of 4-16.
  • REP is composed of 10 to 200 amino acid residues.
  • One or more of the amino acid residues constituting REP may be amino acid residues selected from the group consisting of glycine residues, serine residues, and alanine residues. That is, REP may contain amino acid residues selected from the group consisting of glycine residues, serine residues, and alanine residues.
  • One or more of the amino acid residues constituting REP may be hydrophobic amino acid residues. That is, REP preferably contains hydrophobic amino acid residues.
  • a hydrophobic amino acid residue means an amino acid residue with a positive hydrophobicity index.
  • hydrophobicity index of amino acid residues hydrophobicity index, hereinafter also referred to as "HI"
  • HI hydrophobicity index
  • Hydrophobic amino acid residues include, for example, isoleucine (HI: 4.5), valine (HI: 4.2), leucine (HI: 3.8), phenylalanine (HI: 2.8), methionine (HI: 1.9) and alanine (HI: 1.8).
  • the domain sequence preferably has an amino acid sequence corresponding to the insertion of a cysteine residue into REP, as compared with the naturally-derived fibroin.
  • the domain sequence preferably has an amino acid sequence corresponding to the insertion of a cysteine residue at a position adjacent to a glycine residue, a serine residue, or an alanine residue in REP. More preferably, it has an amino acid sequence corresponding to a cysteine residue inserted at a position adjacent to the glycine residue.
  • a cysteine residue in REP may be located between a glycine residue, a serine residue, or an alanine residue and a glycine residue, a serine residue, or an alanine residue; residues.
  • the domain sequence preferably has an amino acid sequence corresponding to the insertion of a cysteine residue at the position adjacent to the hydrophobic amino acid residue in REP.
  • hydrophobic amino acid residues are fixed between molecules by hydrophobic interaction.
  • a cysteine residue in REP may be positioned next to a hydrophobic amino acid residue, or may be positioned between a hydrophobic amino acid residue and an amino acid residue other than a hydrophobic amino acid residue.
  • a hydrophobic amino acid residue and a glycine residue, a serine residue, or an alanine residue and may be positioned between a hydrophobic amino acid residue and a glycine residue.
  • Hydrophobic amino acid residues may be one selected from the group consisting of isoleucine residues, valine residues, leucine residues, phenylalanine residues, methionine residues, and alanine residues.
  • the domain sequence has an amino acid sequence corresponding to the insertion of a cysteine residue into the REP located near the N-terminus and/or C-terminus of the domain sequence compared to naturally-occurring fibroin. good.
  • the molecular chain can be lengthened.
  • a REP located near the N-terminus of a domain sequence means a REP located 1st to 3rd from the N-terminus of the domain sequence.
  • a cysteine residue may be located in the REP positioned 1-2 from the N-terminus of the domain sequence.
  • a REP located near the C-terminus of a domain sequence means a REP located 1st to 3rd from the C-terminus of the domain sequence.
  • a cysteine residue may be located in the REP positioned 1-2 from the C-terminus of the domain sequence.
  • Cysteine residues are preferably located in the most N-terminal and/or most C-terminal REP of the domain sequence.
  • the domain sequence may have an amino acid sequence corresponding to the insertion of a cysteine residue at or near the center in REP compared to naturally occurring fibroin.
  • the vicinity of the center of the amino acid sequence in REP refers to the amino acid residue located in the center of REP (when there are two amino acid residues located in the center, the amino acid residue on the N-terminal side) to N 1st to 5th positions toward the terminal side, or 1st to 5th amino acid residues located in the center of REP (when there are two amino acid residues located in the center, amino acid residues on the C-terminal side) indicates the position of
  • the cysteine residue may be located in the center of REP, and is located at the 1st to 3rd or 1st to 2nd positions toward the N-terminal side or the C-terminal side from the amino acid residue located in the center of REP.
  • a first segment comprising a polypeptide backbone in which a cysteine residue is inserted, for example, so that the cysteine residue is located more centrally than the N-terminal side and/or C-terminal side of the domain sequence
  • a first A polypeptide derivative in which a second segment is linked to a segment of is expected to have improved solubility in a solvent.
  • the modified fibroin preferably contains a GPGXX motif (G represents a glycine residue, P represents a proline residue, and X represents an amino acid residue other than a glycine residue) in the amino acid sequence of REP. Inclusion of this motif in REP can improve the elongation of the modified fibroin.
  • the GPGXX motif content rate is usually 1% or more, may be 5% or more, and preferably 10% or more. In this case, the stress of the modified fibroin fiber becomes even higher.
  • the upper limit of the GPGXX motif content is not particularly limited, and may be 50% or less, or 30% or less.
  • the "GPGXX motif content” is a value calculated by the following method.
  • Formula 1 [(A) n motif-REP] m or Formula 2: [(A) n motif-REP] m -(A) n motif, the most C-terminal In all REPs contained in the sequence excluding the sequence from the located (A) n motif to the C-terminus of the domain sequence from the domain sequence, triple the total number of GPGXX motifs contained in that region (i.e., (corresponding to the total number of G and P in the GPGXX motif) is c, the sequence from the (A) n motif located on the most C-terminal side to the C-terminus of the domain sequence is removed from the domain sequence, and the (A) n motif is further removed.
  • the GPGXX motif content is calculated as c/d, where d is the total number of amino acid residues in all REPs removed.
  • the "sequence obtained by removing the sequence from the (A) n motif located on the most C-terminal side to the C-terminus of the domain sequence from the domain sequence” is "the most C-terminal side (A)
  • the sequence from the n motif to the C-terminus of the domain sequence” may include sequences that are poorly correlated with sequences characteristic of fibroin, and m is small If the domain sequence is short (that is, if the domain sequence is short), it affects the calculation result of the GPGXX motif content rate, so this effect is to be eliminated.
  • a "GPGXX motif” is located at the C-terminus of REP, it is treated as a "GPGXX motif” even if "XX" is, for example, "AA”.
  • FIG. 5 is a schematic diagram showing the domain sequence of fibroin.
  • the modified fibroin has a REP hydrophobicity (hydropathy index: hydrophobic index) of, for example, ⁇ 0.80, ⁇ 0.70, ⁇ 0.06 or more, ⁇ 0.50 or more, ⁇ 0.40 or more. , -0.30 or more, -0.20 or more, -0.10 or more, 0.00 or more, 0.10 or more, 0.20 or more, 0.22 or more, 0.25 or more, 0.30 or more, 0 0.35 or greater, 0.40 or greater, 0.45 or greater, 0.50 or greater, 0.55 or greater, 0.60 or greater, 0.65 or greater, or 0.70 or greater.
  • hydrophobicity of REP There is no particular upper limit to the hydrophobicity of REP, and it may be 1.0 or less, or 0.7 or less.
  • the "hydrophobicity of REP” is a value calculated by the following method.
  • Formula 1 [(A) n motif-REP] m or
  • Formula 2 [(A) n motif-REP] m -(A) n motif, the most C-terminal In all REPs contained in the sequence obtained by removing the sequence from the located (A) n motif to the C-terminus of the domain sequence from the domain sequence (sequence corresponding to “region A” in FIG.
  • each amino acid in the region The sum of the hydrophobicity indices of the residues is e, the sequence from the (A) n motif located on the most C-terminal side to the C-terminus of the domain sequence is removed from the domain sequence, and all REPs excluding the (A) n motif
  • the hydrophobicity of REP is calculated as e/f, where f is the total number of amino acid residues in .
  • the reason for targeting is the reason described above. It is the same.
  • the domain sequence may have an amino acid sequence corresponding to the insertion of 1 or more and less than 16 cysteine residues into REP compared to naturally occurring fibroin. That is, the total number of cysteine residues corresponding to insertion into REP may be 1 or more and less than 16.
  • the total number of cysteine residues corresponding to insertions in REP may be 1 to 12, 1 to 10, 1 to 8, 1 to 6, or 2 to 4.
  • the number of cysteine residues per REP in the domain sequence may be, for example, 1-3, 1-2, or 1.
  • the total number of cysteine residues in the modified fibroin according to this embodiment may be 1 or more and less than 16, 1 or more and 12 or less, 1 or more and 10 or less, 1 or more and 8 or less, 1 or more and 6 or less, or 2 or more and 4 or less. .
  • the modified fibroin according to the present embodiment has one or more amino acid residues substituted, deleted, inserted and/or added as compared with the naturally-derived fibroin, in addition to the modification of the cysteine residue in REP described above. There may also be corresponding amino acid sequence modifications.
  • the molecular weight of the modified fibroin according to this embodiment is not particularly limited, it may be, for example, 10 kDa or more and 700 kDa or less.
  • the molecular weight of the modified fibroin according to the present embodiment is, for example, 2 kDa or more, 3 kDa or more, 4 kDa or more, 5 kDa or more, 6 kDa or more, 7 kDa or more, 8 kDa or more, 9 kDa or more, 10 kDa or more, 20 kDa or more, 30 kDa or more, 40 kDa or more, 50 kDa.
  • the modified fibroin according to this embodiment preferably has an amino acid sequence corresponding to the insertion of a cysteine residue. More specific examples of the modified fibroin include (i) SEQ ID NO: 46 and SEQ ID NO: 47 , SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, or SEQ ID NO: 51, or (ii) SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, or SEQ ID NO: 55 Modified fibroins comprising the amino acid sequences represented can be mentioned.
  • the amino acid sequence (PRT1) represented by SEQ ID NO: 46 is the amino acid sequence (PRT11) represented by SEQ ID NO: 56 by inserting one cysteine residue into the REP located on the most N-terminal side of the domain sequence. be. That is, the total number of cysteine residues in the amino acid sequence (PRT1) represented by SEQ ID NO:46 is one.
  • the amino acid sequence (PRT2) represented by SEQ ID NO: 47 is obtained by inserting one cysteine residue into the REP located on the most N-terminal side of the domain sequence in the amino acid sequence (PRT12) represented by SEQ ID NO: 57. be. That is, the total number of cysteine residues in the amino acid sequence (PRT2) represented by SEQ ID NO: 47 is one.
  • cysteine is added to the REP located most N-terminally and the REP located most C-terminally in the domain sequence, relative to the amino acid sequence (PRT12) represented by SEQ ID NO: 57. Each residue is inserted at one site. That is, the total number of cysteine residues in the amino acid sequence (PRT3) represented by SEQ ID NO:48 is two.
  • the amino acid sequence (PRT4) shown in SEQ ID NO: 49 is located in the REP located first and second from the N-terminal side and C-terminal side of the domain sequence, respectively, with respect to the amino acid sequence (PRT12) shown in SEQ ID NO: 57. , each of which has one cysteine residue inserted. That is, the total number of cysteine residues in the amino acid sequence (PRT4) represented by SEQ ID NO: 49 is 4.
  • the amino acid sequence (PRT5) represented by SEQ ID NO: 50 relative to the amino acid sequence (PRT12) represented by SEQ ID NO: 57, is located in the REP located at the 1st to 4th positions from the N-terminal side and the C-terminal side of the domain sequence, One cysteine residue was inserted in each. That is, the total number of cysteine residues in the amino acid sequence (PRT5) represented by SEQ ID NO:50 is eight.
  • the amino acid sequence (PRT6) represented by SEQ ID NO: 51 relative to the amino acid sequence (PRT12) represented by SEQ ID NO: 57, is located in the REP located at the 1st to 8th positions from the N-terminal side and the C-terminal side of the domain sequence, One cysteine residue was inserted in each. That is, the total number of cysteine residues in the amino acid sequence (PRT6) represented by SEQ ID NO:51 is 16.
  • the amino acid sequence (PRT7) represented by SEQ ID NO: 52 has the amino acid sequence (PRT13) represented by SEQ ID NO: 58 by adding a cysteine residue to REP located at the most N-terminal side and the most C-terminal side of the domain sequence. It is inserted one by one. That is, the total number of cysteine residues in the amino acid sequence (PRT7) represented by SEQ ID NO:52 is two.
  • the amino acid sequence (PRT8) represented by SEQ ID NO: 53 has a cysteine residue in the REP located on the most N-terminal side and the most C-terminal side of the domain sequence, relative to the amino acid sequence (PRT14) shown by SEQ ID NO: 59. It is inserted one by one. That is, the total number of cysteine residues in the amino acid sequence (PRT8) represented by SEQ ID NO:53 is two.
  • the amino acid sequence (PRT9) represented by SEQ ID NO: 54 has the amino acid sequence (PRT14) represented by SEQ ID NO: 59, in the REP located at positions 1 to 4 from each of the N-terminal and C-terminal sides of the domain sequence, One cysteine residue was inserted in each. That is, the total number of cysteine residues in the amino acid sequence (PRT9) represented by SEQ ID NO:54 is eight.
  • the amino acid sequence (PRT10) represented by SEQ ID NO: 55 relative to the amino acid sequence (PRT14) represented by SEQ ID NO: 59, is located in the REP located at the 1st to 8th positions from the N-terminal side and the C-terminal side of the domain sequence, One cysteine residue was inserted in each. That is, the total number of cysteine residues in the amino acid sequence (PRT10) represented by SEQ ID NO:55 is 16.
  • the modified fibroin (i) may have only the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, or SEQ ID NO: 51.
  • the modified fibroin of (ii) may have only the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, or SEQ ID NO:55.
  • the modified fibroin described above may contain a tag sequence at either or both of the N-terminus and C-terminus. This enables isolation, immobilization, detection, visualization, etc. of the modified fibroin.
  • tag sequences include affinity tags that utilize specific affinity (binding, affinity) with other molecules.
  • affinity tag is a histidine tag (His tag).
  • His tag is a short peptide in which about 4 to 10 histidine residues are lined up, and has the property of specifically binding to metal ions such as nickel, so isolation of modified fibroin by metal chelating metal chromatography can be used for
  • a specific example of the tag sequence is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 70 or SEQ ID NO: 71 (amino acid sequence containing a His tag).
  • a tag sequence such as glutathione-S-transferase (GST) that specifically binds to glutathione or maltose binding protein (MBP) that specifically binds to maltose can be used.
  • GST glutathione-S-transferase
  • MBP maltose binding protein
  • epitope tag that utilizes antigen-antibody reaction can also be used as the tag sequence.
  • an antigenic peptide epitope
  • an antibody against the epitope can be bound.
  • epitope tags include HA (peptide sequence of influenza virus hemagglutinin) tag, myc tag, FLAG tag, and the like. Modified fibroin can be easily purified with high specificity by using an epitope tag.
  • a tag sequence that can be cleaved by a specific protease can also be used as a tag sequence.
  • the modified fibroin from which the tag sequence has been cut off can also be recovered by treating the protein adsorbed via the tag sequence with protease.
  • modified fibroin containing a tag sequence examples include (iii) SEQ ID NO: 60 (PRT15), SEQ ID NO: 61 (PRT16), SEQ ID NO: 62 (PRT17), SEQ ID NO: 63 (PRT18), SEQ ID NO: 64 (PRT19) ), or a modified fibroin comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 65 (PRT20), or (iv) SEQ ID NO: 66 (PRT21), SEQ ID NO: 67 (PRT22), SEQ ID NO: 68 (PRT23), or SEQ ID NO: 69 ( Modified fibroin containing the amino acid sequence shown in PRT24) can be mentioned.
  • amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 60 (PRT15), SEQ ID NO: 61 (PRT16), SEQ ID NO: 62 (PRT17), SEQ ID NO: 63 (PRT18), SEQ ID NO: 64 (PRT19), and SEQ ID NO: 65 (PRT20) are , SEQ ID NO: 46 (PRT1), SEQ ID NO: 47 (PRT2), SEQ ID NO: 48 (PRT3), SEQ ID NO: 49 (PRT4), SEQ ID NO: 50 (PRT5), and SEQ ID NO: 51 (PRT6)
  • a tag sequence containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 70 was introduced at the end.
  • amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 66 are SEQ ID NO: 52 (PRT7) and SEQ ID NO: 53 (PRT8), respectively.
  • SEQ ID NO: 54 PRT9
  • SEQ ID NO: 55 PRT10
  • the modified fibroin of (iii) may have only the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, or SEQ ID NO: 65.
  • SEQ ID NO: 60 (PRT15), SEQ ID NO: 61 (PRT16), SEQ ID NO: 62 (PRT17), SEQ ID NO: 63 (PRT18), SEQ ID NO: 64 (PRT19), or SEQ ID NO: 65 (PRT20)
  • the GPGXX motif content of the modified fibroin is 40.2%, 39.9%, 39.9%, 39.7%, 39.3%, and 38.6%, respectively, all of which are 10% or more. .
  • the GPGXX motif content of the modified fibroin containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 66 (PRT21), SEQ ID NO: 67 (PRT22), SEQ ID NO: 68 (PRT23), or SEQ ID NO: 69 (PRT24) is 39.9%, respectively. , 39.9%, 39.3%, and 38.6%, all of which are 10% or more.
  • the modified fibroin described above may contain a secretion signal for releasing the protein produced in the recombinant protein production system to the outside of the host.
  • the sequence of the secretory signal can be appropriately set according to the type of host.
  • a protein can be produced by a conventional method using a nucleic acid that encodes the protein.
  • a nucleic acid encoding the protein may be chemically synthesized based on base sequence information, or may be synthesized using a PCR method or the like.
  • the second segment contains a molecular group that has a plasticizing function on the polypeptide backbone.
  • a molecular group having a plasticizing function for a polypeptide backbone is one in which the intermolecular force between the molecular groups is smaller than the intermolecular force between the polypeptide backbones.
  • a molecular group that can improve the flexibility of A molecular group having a plasticizing function with respect to a polypeptide backbone can also be said to be a molecular group having a melting point or glass transition temperature lower than that of the polypeptide backbone.
  • a molecular group with a plasticizing function on the polypeptide backbone can be, for example, a polyether, polyester, or polycarbonate.
  • Polyether as the molecular group may be, for example, polyethylene glycol (PEG) or polytetramethylene glycol (PTMG).
  • the plasticizing function can also be said to be a function of improving flexibility or a function of increasing breaking elongation in bending and/or tension.
  • a biodegradable group or a biomass-derived group is preferably used as the molecular group having a plasticizing function for the polypeptide backbone.
  • the second segment may contain a plurality of the molecular groups.
  • the second segment may include a plurality of molecular groups, and the plurality of molecular groups may be linked to each other.
  • the connection between the molecular groups may partially have a branch.
  • the second segment can have a branched structure with a plurality of molecular groups, and each branch can form a plurality of bonds with the first segment. That is, a network structure of the first segment and the second segment can also be formed by introducing a branch into a part of the above-mentioned connections.
  • the second segment contains a plurality of the above-described molecular groups, and the molecular groups are linked to each other, so that the range of design of the second segment can be further expanded. flexibility can be adjusted more easily.
  • the plurality of second segments are linked to each other, and at least one of the plurality of second segments is connected to the first segment. may be combined with Alternatively, multiple second segments may be joined to one first segment.
  • a network of second segments may be formed by introducing branches into some of the connections between the plurality of second segments.
  • the second segment may not contain a skeleton derived from poly(meth)acrylate from the viewpoint of further improving biodegradability.
  • the second segment includes, for example, polyethers, polyesters, polycarbonates, polyamides, polyols (polyvinyl alcohol, etc.), polyolefins, polyacetals, polyketals, poly(meth)acrylates, silicones, polyurethanes, polyalkyleneimines, phenolic resins, urea resins, It may contain a skeleton derived from at least one selected from the group consisting of melamine resins and polysaccharides.
  • the second segment preferably contains at least one functional group selected from the group consisting of polyether groups, polyester groups, polycarbonate groups, polyamide groups, polyol groups (such as polyvinyl alcohol groups), and modified polysaccharide groups.
  • the second segment is, for example, an ether bond, an ester bond, a carbonate bond, an amide group, a siloxane bond, a urethane bond, a urethane bond, or at least one selected from the group consisting of structural units having a urea bond. and at least one structural unit selected from the group consisting of structural units having an alkylene group, a substituted alkylene group, an oxymethylene group, an alkyleneimine group, or a modified polysaccharide group.
  • polyether groups include functional groups derived from polyalkylene glycols such as polyethylene glycol, polypropylene glycol, ethylene oxide/propylene oxide copolymer, and polybutylene glycol (polytetramethylene glycol (PTMG)).
  • polyalkylene glycols such as polyethylene glycol, polypropylene glycol, ethylene oxide/propylene oxide copolymer, and polybutylene glycol (polytetramethylene glycol (PTMG)).
  • PTMG polytetramethylene glycol
  • Polyester groups include, for example, polylactic acid, poly(3-hydroxybutanoic acid), polyhydroxybutanoic acid/hydroxyvaleryl acid copolymer, polyhydroxybutanoic acid/4-hydroxybutanoic acid copolymer, polyhydroxybutanoic acid / hydroxyhexanoic acid copolymer, polytrimethylene terephthalate, butanediol / long-chain dicarboxylic acid copolymer, polyethylene terephthalate, polybutylene succinate, polybutylene succinate-adipate copolymer, polybutylene adipate-terephthalate copolymer
  • Examples include functional groups derived from polyesters such as polymers, polycaprolactone, and poly(trimethylene furandicarboxylate) (PTF).
  • the polyester group is preferably a functional group derived from a biomass plastic such as polycaprolactone or a biodegradable plastic.
  • polycarbonate groups include functional groups derived from polycarbonates having an aliphatic hydrocarbon chain as a main skeleton, such as 1,6-hexanediol polycarbonate, 1,5-pentanediol polycarbonate, and 1,10-decanediol carbonate. is mentioned.
  • polyamide groups include functional groups derived from polyamides such as nylon 3, nylon 4, nylon 5, nylon 6, nylon 11, and nylon 610.
  • the polyamide group is preferably a functional group derived from those classified as biomass plastics or biodegradable plastics.
  • polystyrene groups examples include functional groups derived from polyols (polyvinyl alcohols, etc.) such as polyvinyl alcohol and ethylene/vinyl alcohol copolymers.
  • the polyol group is preferably a functional group derived from those classified as biomass plastics or biodegradable plastics.
  • modified polysaccharide groups include functional groups derived from chemically modified compounds such as cellulose, starch, chitin, and chitosan.
  • chemically modified compounds include cellulose acetate, ethylcellulose, starch acetate, hydroxypropylated starch, carboxymethylchitin, carboxymethylchitosan, and the like.
  • the second segment may further contain a linker in addition to the molecular group having a plasticizing function for the polypeptide backbone.
  • the molecular group and the polypeptide backbone may be linked via the linker.
  • the linker is, for example, a structural unit represented by the following formula (1), a structural unit represented by the following general formulas (2a) to (6), a structural unit represented by the following formula (7), or a structural unit represented by the following general formula ( 8a) to (9), structural units represented by the following general formulas (10) to (11b), and a group consisting of structural units represented by the following general formulas (13) to (16)
  • It may contain at least one selected from the structural units represented by the following formula (1), the structural units represented by the following general formulas (2a) to (6), and the structure represented by the following formula (7) unit, and at least one selected from the group consisting of structural units represented by the following general formulas (8a) to (9), and from the viewpoint of improving biodegradability, preferably the following formula (1) and structural
  • a linker may include a plurality of structural units described above. That is, the linker may consist only of the above structural unit, or may have a plurality of the above structural units (a plurality of the above structural units may be covalently bonded to the body of the linker). Preferably, the body of the linker has a relatively low molecular weight.
  • the linker has three or more of the above-described structural units, for example, three first segments can be linked to one second segment, and such selection also results in the polypeptide derivative can introduce a network structure into
  • a plurality of second It can also be a polypeptide derivative comprising a block copolymer in which some of the segments of are linked to each other.
  • the linker has a plurality of structural units described above, at least one of the plurality of structural units may be bound to the polypeptide backbone and at least one may be bound to the molecular group.
  • the linker consists only of the structural unit described above, one of the two bonds described in the formula representing the structural unit representing the linker is bonded to the peptide backbone, and the other is bonded to the molecular group.
  • the linker is represented by the following formula (1), preferably the molecular group is bound to nitrogen (N) and the other is bound to the polypeptide backbone.
  • N is preferably bound to the body of the linker, and the other is the poly It binds to the peptide backbone and the molecular groups described above.
  • Y is independently , an oxygen atom, a sulfur atom, or NR 1 .
  • R 1 represents hydrogen, a hydrocarbon group, an aromatic group, a carbonyl group, or a sulfonyl group.
  • R is , independently of each other, denote hydrogen, a hydrocarbon group, or an aromatic group.
  • the molecular weight of the second segment is, for example, 200 to 500,000, 300 to 400,000, 350 to 350,000, 400 to 300,000, 500 to 200,000, 600 to 1,000,000, 700 to 50,000. , 800-10,000, 900-7,500, or 100-5,000.
  • the molecular weight of the second segment is 200 or more, it becomes easy to suppress the localization of the molecular group having a plasticizing function in the three-dimensional structure of the molecule, and is introduced to exhibit a certain level of function. It is possible to sufficiently reduce the weight ratio of the molecular group having a plasticizing function. As a result, it may be possible to shorten the reaction time and lower the reaction temperature in the production of polypeptide derivatives.
  • the molecular weight of the second segment is 500,000 or less, the molecular weight falls within an appropriate range, and the decrease in binding reactivity of the second segment to the first segment is more likely to be suppressed.
  • the molecular weight of the second segment described above is the weight average molecular weight, and is generally determined by a known method using GPC.
  • the molecular weight of the second segment (molecular group having a plasticizing function for the polypeptide backbone) relative to the molecular weight of the first segment (polypeptide backbone) can be appropriately adjusted depending on the use of the polypeptide derivative.
  • the molecular weight of the second segment (when two or more second segments are bonded to one first segment, the total molecular weight) is based on the molecular weight of the first segment, 100, For example, preferably 1 to 10000, more preferably 1.5 to 9000, still more preferably 2 to 8000, more preferably 3 to 7000, still more preferably 5 to 5000, still more Preferably 7-3000, even more preferably 10-2000.
  • the flexibility of the porous body obtained using the polypeptide derivative can be further enhanced.
  • the molecular weight of the second segment is 10,000 or less relative to the molecular weight of the first segment, sufficient plasticity (flexibility) can be obtained and the rigidity of the porous body can be further improved.
  • the molecular weight of the second segment relative to the molecular weight of the first segment is within the above range, it is possible to produce a porous body with superior flexibility.
  • the molecular weight of the second segment and the molecular weight of the molecular group having a plasticizing function with respect to the polypeptide backbone are based on the molecular weight of the first segment or the molecular weight of the polypeptide backbone contained in the first segment being 100 (preferably when the molecular weight of the polypeptide backbone contained in the first segment is 100), for example, 1.4 or more, 1.5 or more, 1.6 or more, 1.7 or more, 1.8 or more, 1. It may be 9 or more, 2.0 or more, 5.0 or more, 10 or more, 20 or more, 30 or more, or 40 or more.
  • the upper limit is not particularly limited, it may be, for example, 1000 or less, 800 or less, 600 or less, 400 or less, 200 or less, 100 or less, 80 or less, 70 or less, 60 or less, or 50 or less.
  • the molecular weight of the second segment is preferably in the range of 1 to 1000, more preferably in the range of 1 to 800, more preferably 1 when the molecular weight of the first segment is 100. to 600, more preferably 1 to 400, more preferably 1 to 200, more preferably 1 to 100, preferably 1 to 70 , more preferably 1.5 to 60, still more preferably 1.5 to 50, and particularly preferably 2.0 to 50.
  • the ratio of the molecular weight of the first segment (polypeptide backbone) to the molecular weight of the second segment (molecular group having a plasticizing function on the polypeptide backbone) is within the above range, for example, In the porous body obtained using the peptide derivative, flexibility or extensibility, etc., are sufficiently maintained while sufficiently retaining the properties (for example, high mechanical strength) of the first segment due to having a polypeptide skeleton. can be expected to increase
  • the above ratio of the molecular weight of the second segment to the molecular weight of the first segment being 100 is obtained by weight average molecular weight.
  • the content ratio of the first segment (polypeptide skeleton) and the second segment (molecular group having a plasticizing function) in the polypeptide derivative can be appropriately adjusted according to the use of the porous body. .
  • a content ratio is such that the mass ratio of the first segment to the second segment being 100 is, for example, 50 or more, 60 or more, 70 or more, 80 or more, 90 or more, 100 or more, 110 or more, 150 200 or more, 250 or more, 300 or more, 300 or more, 400 or more, 450 or more, 500 or more, 550 or more, or 600 or more.
  • the upper limit of such a value is not particularly limited, it may be 1000 or less, 900 or less, 800 or less, or 700 or less.
  • the linker was described as a component of the second segment, but it may be handled separately from the second segment.
  • a linker can also be treated as a component of the first segment.
  • the molecular weight of the linker portion is smaller than that of the polypeptide backbone and the molecular group, when the linker is treated separately from the second segment, the molecular weight of the second segment is within the range obtained by subtracting the molecular weight of the linker portion. Treat as being the preferred range of molecular weights for the second segment.
  • the linker portion is treated as a component of the first segment
  • the above-mentioned range of the molecular weight of the first segment including the molecular weight of the linker portion is treated as the preferred range of the molecular weight of the first segment.
  • the above-mentioned polypeptide derivative is, for example, a 1,4-addition reaction between a cysteine thiol group (also referred to as a mercapto group or a sulfhydryl group) constituting a polypeptide backbone and a carbon-carbon double bond of maleimide or a maleic acid derivative. is used to generate a thioether bond, the functional group of the molecular group (e.g., polyether group, polyester group, polycarbonate group, polyamide group, polyol group, and modified polysaccharide group selected from the group consisting of (at least one functional group) into the first segment.
  • a cysteine thiol group also referred to as a mercapto group or a sulfhydryl group
  • the functional group of the molecular group e.g., polyether group, polyester group, polycarbonate group, polyamide group, polyol group, and modified polysaccharide group selected from the group consisting of (
  • the above-mentioned polypeptide derivative applies one example of the above-mentioned production method, for example, a compound containing a polypeptide backbone having cysteine, a molecular group having a plasticizing function for the polypeptide backbone, and a thiol group
  • a compound and a compound having two or more maleimide groups can also be produced by forming a thioether bond using the aforementioned 1,4-addition reaction of maleimide groups.
  • polypeptide derivative may be produced using, for example, an addition reaction to an epoxy group or an isocyanate group, a substitution reaction to an ⁇ -halocarbonyl group, or a Huisgen cyclization reaction between an alkynyl group and an azide group.
  • one embodiment of the method for producing a polypeptide derivative comprises reacting a compound containing a polypeptide backbone with at least one compound represented by general formulas (1A) to (16A) below.
  • obtaining the polypeptide derivative by The above step may be a step of obtaining a polypeptide derivative by reacting a compound containing a polypeptide skeleton with a compound represented by the following general formulas (1A) to (12A).
  • the polypeptide backbone preferably has at least one selected from the group consisting of a thiol group, an amino group, a hydroxy group, a guanidino group, a carboxy group, a phenoxy group, an indole group, an amide group, an azide group, and an alkynyl group. has at least one selected from the group consisting of a thiol group, an amino group, a hydroxy group, a guanidino group, a carboxy group, a phenoxy group, an indole group, and an amide group.
  • a reaction between a compound containing a polypeptide backbone and a compound represented by the following general formulas (1A) to (12A) or (14A) may be a Michael addition reaction.
  • R 2 represents a molecular group having a plasticizing function to the polypeptide backbone.
  • the molecular group having a plasticizing function with respect to the polypeptide backbone those exemplified in the description of the above-mentioned polypeptide derivative can be applied.
  • Z represents a halogen atom, a sulfonate group, or a fluorine-containing carboxylic acid ester group.
  • X represents a halogen atom.
  • the number of molecular groups (second segments) having a plasticizing function for the polypeptide backbone introduced into one compound (one first segment) having a polypeptide backbone is the number of amino acids constituting the polypeptide backbone.
  • Sequence-derived thiol, amino, hydroxy, guanidino, carboxy, phenoxy, indole, amide, azide and alkynyl groups preferably thiol, amino, hydroxy, guanidino, carboxy group, phenoxy group, indole group, and amide group
  • Sequence-derived thiol, amino, hydroxy, guanidino, carboxy group, phenoxy group, indole group, and amide group but may be, for example, 1 or more, 2 or more, or 4 or more, 30 or less, 25 or less, 20 It may be 1 or less, 15 or less, 10 or less, or 8 or less.
  • the number of molecular groups (second segments) having a plasticizing function for the polypeptide backbone to be introduced into one compound (one first segment) having a polypeptide backbone should be adjusted within the above range. can be, for example, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10, 1-8, or 2-8.
  • a compound having a polypeptide backbone and at least one compound represented by general formulas (1A) to (16A) may be mixed. If the reaction does not proceed easily, an acid or a base may be added, and heating may be performed.
  • the reaction temperature is usually 0 to 150°C, for example, 50 to 150°C, 70 to 120°C, or 90 to 100°C, and 10 to 110°C, 20 to 100°C, or 25 to 90°C.
  • solvents include hexafluoroisopropyl alcohol (HFIP), dimethylsulfoxide (DMSO), dimethylformamide (DMF), dimethylacetamide (DMA), acetic acid, formic acid, and the like.
  • the product (crude product containing polypeptide derivative) obtained by the above reaction may be purified by, for example, reprecipitation, normal phase column chromatography, reverse phase column chromatography, size exclusion chromatography, washing with a solvent, and the like. good.
  • One embodiment of the above-described method for producing a polypeptide derivative comprises a compound containing a polypeptide backbone, a compound containing a molecular group having a plasticizing function on the polypeptide backbone, and general formulas (2-1A) to (2- 16A) with a compound having two or more at least one structural unit selected from the group consisting of structural units represented by 16A) to obtain a polypeptide derivative.
  • the above step comprises a compound comprising a polypeptide backbone, a compound comprising a molecular group having a plasticizing function with respect to the polypeptide backbone, and structural units represented by general formulas (2-1A) to (2-12A) below. and a compound having two or more at least one functional group selected from the group consisting of reacting with a compound to obtain a polypeptide derivative.
  • the polypeptide backbone preferably has at least one selected from the group consisting of a thiol group, an amino group, a hydroxy group, a guanidino group, a carboxy group, a phenoxy group, an indole group, an amide group, an azide group, and an alkynyl group. has at least one selected from the group consisting of a thiol group, an amino group, a hydroxy group, a guanidino group, a carboxy group, a phenoxy group, an indole group, and an amide group.
  • the compound containing the above molecular group may be a compound having, in addition to the above molecular group, a reactive functional group capable of reacting with structural units represented by the following general formulas (2-1A) to (2-12A).
  • the reactive functional group may be at least one selected from the group consisting of a thiol group, an amino group, a hydroxy group, a guanidino group, a carboxy group, a phenoxy group, an indole group, an amide group, an azide group, and an alkynyl group, Preferably, it is at least one selected from the group consisting of thiol groups, amino groups, hydroxy groups, guanidino groups, carboxy groups, phenoxy groups, indole groups, and amide groups.
  • the compound containing the molecular group may be a compound having two or more reactive functional groups, or may be a compound having two reactive functional groups.
  • the functional group possessed by the polypeptide backbone and the functional group possessed by the compound containing the molecular group are at least one selected from the group consisting of structural units represented by general formulas (2-1A) to (2-16A). can be selected according to the type of the functional group of the compound having two or more functional groups of , and may be the same or different.
  • the functional group possessed by the polypeptide backbone is different from the functional group possessed by the compound containing the molecular group, the molecular structure of the polypeptide derivative can be more easily controlled.
  • each Y independently represents an oxygen atom, a sulfur atom, or NR1 .
  • R 1 represents hydrogen, a hydrocarbon group, an aromatic group, a carbonyl group, or a sulfonyl group.
  • General formulas (2-2A), (2-2B), (2-3A), (2-3B), (2-4A), (2-8A), (2-8B), (2-9A) , (2-10A), (2-11A), (2-11B), and (2-12A) each independently represents hydrogen, a hydrocarbon group, or an aromatic group.
  • Z represents a halogen atom, a sulfonate group, or a fluorine-containing carboxylate group.
  • X represents a halogen atom.
  • reaction between a compound containing a polypeptide backbone and a compound containing a molecular group having a plasticizing function with respect to the polypeptide backbone, and the above-described compound having two or more specific functional groups may be, for example, a Michael addition reaction or the like.
  • the second segment is preferably at least one functional group selected from the group consisting of a compound containing the molecular group and structural units represented by the general formulas (2-1A) to (2-12A).
  • Flexibility can be improved by increasing the weight ratio of the second segment to the first segment. To do so, polymerizing the second segment is effective. For this purpose, it is preferable to combine a plurality of types of plasticizers to polymerize the second segment.
  • a compound containing a polypeptide backbone having a specific functional group and a functional group having a plasticizing function on the polypeptide backbone and a compound containing a molecular group having a specific functional group are used.
  • a group is carved out as a compound having two or more specific structural units.
  • a uniform reaction solution is prepared, by blending a compound having two or more specific structural units to initiate the reaction, the reaction system can be more easily controlled and a more uniform polymer can be obtained.
  • Peptide derivatives can be prepared. Such a method is particularly useful when the solubility in a solvent or the like is low depending on the type of polypeptide backbone and molecular group.
  • the porous material may or may not contain components (other components) other than the polypeptide derivative.
  • Other components include, for example, colorants, smoothing agents, antioxidants, ultraviolet absorbers, dyes, fillers, cross-linking agents, matting agents, leveling agents and the like.
  • the content ratio of the polypeptide derivative relative to the total amount of the porous body may be, for example, 50% by mass or more and 99% by mass or less.
  • the porous body according to the present embodiment can be used for applications used for conventional porous bodies.
  • the porous body according to the present embodiment can be used, for example, in cosmetics, medical applications, waterproof/moisture permeable layers, shock absorbing materials, and clothing applications such as pads included in underwear.
  • a target porous body can be produced by a method including step B of obtaining a porous body containing a polypeptide derivative.
  • the polypeptide derivative is as described above.
  • step A the mixture containing the polypeptide derivative and solvent is gelled.
  • Gelation can be performed, for example, by cooling a mixture (solution) containing a polypeptide derivative and a solvent.
  • the temperature for gelation can be appropriately set according to the type of solvent and the like.
  • the temperature for gelling may be, for example, -196 to 20°C.
  • the solvent may be water or an organic solvent.
  • organic solvents include dimethylsulfoxide, ethanol, N,N-dimethylformamide, hexafluoro-2-propanol, formic acid, and mixed solvents thereof.
  • the concentration of the polypeptide derivative in the mixture may be, for example, 1% by mass or more and 30% by mass or less relative to the total amount of the mixture.
  • the mixture may or may not contain other than the polypeptide derivative and the solvent.
  • Methods for gelling a mixture containing a polypeptide derivative and a solvent include, in addition to the methods described above, gelation methods utilizing known phase separation, such as thermally induced phase separation, polymerization induced phase separation, and non-solvent induced phase separation. A separation method or the like can be adopted.
  • step B the solvent is removed from the gelled mixture.
  • a porous body containing the polypeptide derivative is obtained.
  • the method for removing the solvent from the gelled mixture include known drying methods such as freeze-drying the mixture, heat-drying, vacuum-drying, and air-drying. During drying, the gelled mixture may be pressed under pressure to squeeze out the solvent.
  • step B the solvent (first solvent) in the mixture may be replaced with another solvent (second solvent) before removing the solvent.
  • the second solvent in the mixture may be further replaced with the third solvent (water).
  • the second and third solvents may be the solvents exemplified above.
  • Step B preferably includes replacing the solvent in the gelled mixture with water before freeze-drying.
  • the solvent immediately before removing the solvent is preferably water. This makes it easier to manufacture the porous body.
  • the porous body according to the present embodiment can also be produced by a method including a step of heating a mixture supplied with bubbles to volatilize at least part of the solvent to obtain a porous body.
  • a method including a step of heating a mixture supplied with bubbles to volatilize at least part of the solvent to obtain a porous body.
  • the heating temperature of the mixture can be appropriately set according to the type of solvent.
  • the heating temperature of the mixture may be 100°C or higher, for example, 100-150°C.
  • the porous body according to the present embodiment can be made by, for example, solidifying a mixture in which a component that is easily soluble in a solvent such as hot water is supplied, and then removing the component in the solvent. It can also be produced by a method including a step of obtaining a body, a method including a step of obtaining a porous body by heating a mixture supplied with a foaming agent to remove the solvent at the same time as foaming, and the like. For mixtures and solvents, the aspects described above can be applied.
  • Modified fibroin having the amino acid sequence (PRT27) represented by SEQ ID NO: 72, modified fibroin having the amino acid sequence (PRT17) represented by SEQ ID NO: 62, and amino acid sequence (PRT18) represented by SEQ ID NO: 63 ) was designed.
  • the average hydropathic index value of the modified fibroin having the amino acid sequence (PRT27) shown in SEQ ID NO: 72 was 0.44
  • the average hydropathic index of the modified fibroin having the amino acid sequence (PRT17) shown in SEQ ID NO: 62 was 0.44.
  • the index value is 0.45
  • the average hydropathic index value of the modified fibroin having the amino acid sequence (PRT18) shown in SEQ ID NO: 63 is 0.46.
  • the amino acid sequence (PRT17) represented by SEQ ID NO: 62 has the amino acid sequence (PRT27) represented by SEQ ID NO: 72 in the REP located first from each of the N-terminal side and the C-terminal side of the domain sequence. Cysteine residues are inserted one by one. The total number of cysteine residues of the modified fibroin having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:62 is two.
  • the amino acid sequence (PRT18) represented by SEQ ID NO: 63 is located in the REP located 1st to 2nd from each of the N-terminal side and the C-terminal side of the domain sequence with respect to the amino acid sequence (PRT27) represented by SEQ ID NO: 72, One cysteine residue was inserted in each. The total number of cysteine residues in the modified fibroin having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:63 is four.
  • Nucleic acids encoding modified fibroin having the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63 and SEQ ID NO: 72 were synthesized. An NdeI site was added to the 5' end of the nucleic acid, and an EcoRI site was added downstream of the termination codon. This nucleic acid was cloned into a cloning vector (pUC118). Thereafter, the same nucleic acid was digested with restriction enzymes NdeI and EcoRI, excised, and then recombined with the protein expression vector pET-22b(+) to obtain an expression vector.
  • the seed culture was added to a jar fermenter containing 500 mL of production medium (Table 5) to an OD 600 of 0.05.
  • the temperature of the culture solution was kept at 37° C. and the pH was constantly controlled to 6.9 for culturing.
  • the dissolved oxygen concentration in the culture medium was maintained at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration.
  • the feed solution (glucose 455 g/1 L, Yeast Extract 120 g/1 L) was added at a rate of 1 mL/min.
  • the temperature of the culture solution was kept at 37° C. and the pH was constantly controlled to 6.9 for culturing.
  • the dissolved oxygen concentration in the culture medium was maintained at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration, and culture was carried out for 20 hours.
  • 1 M isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside (IPTG) was added to the culture solution to a final concentration of 1 mM to induce expression of the modified fibroin.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside
  • the culture solution was centrifuged to collect the cells. SDS-PAGE was performed using the cells prepared from the culture solution before and after the addition of IPTG, and the expression of the desired modified fibroin was confirmed by the appearance of the desired modified fibroin size band depending on the addition of IPTG. bottom.
  • the precipitate after washing was suspended in 8 M guanidine buffer (8 M guanidine hydrochloride, 10 mM sodium dihydrogen phosphate, 20 mM NaCl, 1 mM Tris-HCl, pH 7.0) to a concentration of 100 mg/mL, and heated at 60°C. for 30 minutes with a stirrer to dissolve.
  • dialysis was performed with water using a dialysis tube (cellulose tube 36/32 manufactured by Sanko Junyaku Co., Ltd.).
  • the white aggregated protein obtained after dialysis was recovered by centrifugation, water was removed with a freeze dryer, and the freeze-dried powder was recovered to obtain powdery modified fibroin (PRT17, PRT18, PRT27).
  • a frame-shaped silicone rubber sheet with a thickness of 2 mm was attached to the outer periphery of the Teflon sheet laid on the stainless steel plate.
  • the DMSO solution of the polypeptide derivative was dripped on the inner side of the frame-shaped silicon rubber sheet and spread over the entire surface.
  • the polypeptide derivative DMSO solution was then chilled in a 4° C. refrigerator to gel (overnight).
  • the gel was placed in a container containing ethanol together with the sheet (ethanol replacement), and allowed to stand for 3 hours to remove the Teflon sheet and replace DMSO with ethanol.
  • the ethanol in the container was discarded, RO water was added, and the container was allowed to stand for 2 hours, thereby replacing the ethanol with water.
  • the gel that had been completely replaced with RO water was frozen in a -20°C freezer and then dried overnight in a freeze dryer.
  • a porous body Example A
  • the polypeptide derivative DMSO solution was whipped for 1 minute.
  • a frame-shaped silicone rubber sheet of 60 ⁇ 30 ⁇ 2 mm was attached to the outer periphery of the Teflon sheet laid on the stainless steel plate.
  • the foamed DMSO solution of the polypeptide derivative was dripped on the inside of the frame-shaped silicon rubber sheet and spread over the entire surface.
  • the polypeptide derivative DMSO solution was dried at 120° C. for 1 hour. A porous body (Example B) was thus obtained.
  • Example A bends due to its own weight
  • Comparative Example A does not bend due to its own weight. This indicates that the porous material containing the polypeptide derivative has superior flexibility compared to the porous material not containing the polypeptide derivative.
  • Example B Using the porous bodies of Example B and Comparative Example B, both ends in the longitudinal direction of each porous body were gripped and bent.
  • the porous body of Example B could be bent without causing cracks or the like.
  • the porous body of Comparative Example B had cracks near the central portion in the longitudinal direction. This also shows that the porous material containing the polypeptide derivative has superior flexibility to the porous material not containing the polypeptide derivative.
  • Example 1 A polypeptide derivative was prepared using methoxypolyethylene glycol maleimide (manufactured by Sigma-Aldrich: second segment) with a number average molecular weight of 5000.
  • modified fibroin first segment
  • modified fibroin first segment
  • amino acid sequence PRT18
  • SEQ ID NO: 63 amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 63
  • FIG. 8 shows the results of SDS-PAGE.
  • lanes 1 and 7 are standard samples for molecular weight determination
  • lanes 2 and 3 are modified fibroin having the amino acid sequence (PRT18) shown in SEQ ID NO: 63
  • lane 4 is the above prepared in Example 1. It is a polypeptide derivative.
  • Example 2 Using methoxypolyethylene glycol maleimide (manufactured by Sigma-Aldrich) having a number average molecular weight of 10000, using 20 mg of methoxy polyethylene glycol maleimide, using 50 mg of modified fibroin, and using hexafluoroisopropyl alcohol (A polypeptide derivative was prepared in the same manner as in Example 1, except that 1 mL of HFIP (manufactured by Central Glass Co., Ltd.) was added and 1 mL of methanol was used for one wash of the crude product. SDS-PAGE of the product confirmed the increase in molecular weight, confirming the introduction of polyethylene glycol chains into the modified fibroin. It was confirmed that the resulting polypeptide derivative had 1 to 4 second segments bound to one first segment. In FIG. 8, lane 5 is the polypeptide derivative prepared in Example 2.
  • Example 3 A polypeptide was produced in the same manner as in Example 2, except that methoxypolyethyleneglycol maleimide (manufactured by Sigma-Aldrich) having a number average molecular weight of 750 was used, and the amount of methoxypolyethyleneglycolmaleimide was 1.5 mg. Derivatives were prepared. SDS-PAGE of the product confirmed the increase in molecular weight, confirming the introduction of polyethylene glycol chains into the modified fibroin. It was confirmed that the resulting polypeptide derivative had 1 to 4 second segments bound to one first segment. In FIG. 8, Lane 6 is the polypeptide derivative prepared in Example 3.
  • FIG. 9 shows the results of SDS-PAGE.
  • lane 1 is the standard sample for molecular weight determination
  • lane 6 is the product
  • lane 7 is the modified fibroin having the amino acid sequence (PRT27) shown in SEQ ID NO:72.
  • Comparative Example 3 A mixture was prepared in the same manner as in Comparative Example 2 except that polyethylene oxide having a number average molecular weight of 20,000 was used as the polyethylene oxide.
  • FIG. 10 is a schematic cross-sectional view of a pressure molding machine.
  • a pressure molding machine 10 shown in FIG. 10 is provided with a heatable mold 2 formed with a through hole, and an upper pin 4 and a lower pin 6 capable of moving up and down within the through hole of the mold 2.
  • a sample is introduced into the gap created by inserting the upper pin 4 or the lower pin 6 into the mold 2, and the composition is formed by the upper pin 4 and the lower pin 6 while the mold 2 is heated. By compressing, a compact can be obtained.
  • FIG. 11(a) is a schematic cross-sectional view of the pressure molding machine before the composition is introduced, (b) is immediately after the sample is introduced, and (c) is the sample being heated and pressurized.
  • the composition is introduced into the through-hole of the mold 2 with only the lower pin 6 inserted therein, and as shown in (b) of FIG.
  • the upper pin 4 is inserted into the through hole of the mold 2 and lowered to start heating the mold 2 to heat and press the sample 8a before being heated and pressurized inside the through hole.
  • the upper pin 4 is lowered until a predetermined pressure is reached, and heating and pressure are continued until the sample reaches a predetermined temperature in the state shown in FIG. 8b is obtained.
  • the temperature of the mold 2 is lowered using a cooler (for example, a spot cooler), and when the molded body 8b reaches a predetermined temperature, the upper pin 4 or the lower pin 6 is removed from the mold 2 and molded.
  • a cooler for example, a spot cooler
  • Example 4 A film containing the synthetic polymer prepared in Example 1 and the artificial fibroin (number average molecular weight: 100,000) having the amino acid sequence (PRT27) shown in SEQ ID NO: 72 prepared as described above was formed. Specifically, 4.4 g of dimethyl sulfoxide was weighed into a container, 0.15 g of the artificial fibroin was weighed out, and the artificial fibroin was dissolved by stirring under nitrogen at 120° C. for 15 minutes. 0.15 g of the above artificial fibroin was further added and stirred under nitrogen at 120° C. for 30 minutes to prepare a solution in which a total of 0.30 g of the above artificial fibroin was dissolved.
  • the dope solution was allowed to stand at 80°C for 30 minutes to remove bubbles.
  • a film was formed from the defoamed dope liquid using a coater (manufactured by Imoto Seisakusho Co., Ltd.).
  • a PET film 150 mm ⁇ 200 mm
  • the dope film was applied at a temperature of 40°C under the conditions of an applicator thickness of 0.5 mm and a coating speed of 20 m/min. It was provided in the form of the PET film.
  • the liquid film of the dope solution was placed together with the PET film in an air blowing oven, dried at 100°C for 15 minutes, transferred to a vacuum oven, and vacuum-dried at 80°C for 15 hours. , and absolute drying to prepare a film-like formed body (film) composed of the synthetic polymer and the artificial fibroin.
  • Example 5 2300 mg of artificial fibroin (number average molecular weight: 50,000: first segment) having the amino acid sequence (PRT17) represented by SEQ ID NO: 62 prepared as described above, polyethylene glycol bismaleimide having a number average molecular weight of 20,000, ( Biochempeg Scientific Inc., HO022022-20K: second segment) was dissolved in 115 mL of solvent (DMSO, manufactured by Kishida Chemical Co., Ltd.) in an eggplant flask, and then 12 ⁇ L of triethylamine (manufactured by Nacalai Tesque Co., Ltd.) was added. The reaction was carried out with stirring at 80° C. for 17 hours.
  • solvent DMSO, manufactured by Kishida Chemical Co., Ltd.
  • the prepared synthetic polymer has a structure in which multiple blocks in which N-substituted maleimide having a polyethylene glycol chain (corresponding to the second segment) is bound to the molecular chain end of artificial fibroin (corresponding to the first segment) are repeated.
  • the synthetic polymer is a molecule in which three segments are bonded in order of the second segment, the first segment, and the second segment.
  • a film containing the synthetic polymer prepared as described above was molded. Specifically, 4.55 g of dimethyl sulfoxide was weighed into a container, 0.45 g of the synthetic polymer was added thereto, and the synthetic polymer was dissolved by stirring for 30 minutes at 90°C under nitrogen. A dope solution was prepared. The stirring speed was set at 100 rpm. In the dope solution, the mixing ratio was adjusted so that the ratio of synthetic polymer:dimethylsulfoxide was 9% by mass:91% by mass.
  • a film-like molded body (film) was prepared in the same manner as in Example 4 using the above dope solution.
  • the prepared film was colorless and transparent, and was confirmed to be more flexible than the film of Example 4. It was confirmed that the film did not crack even when bending stress was applied.
  • Example 6 1424 mg of artificial fibroin (number average molecular weight: 50,000: first segment) having the amino acid sequence (PRT17) represented by SEQ ID NO: 62 prepared as described above, methoxypolyethylene glycol maleimide having a number average molecular weight of 20,000, ( Biochempeg Scientific Inc., MF001022-20K: second segment) 1076 mg was dissolved in 71 mL of solvent (DMSO, manufactured by Kishida Chemical Co., Ltd.) in an eggplant flask, and then triethylamine (manufactured by Nacalai Tesque Co., Ltd.) 7.5 ⁇ L. was added, and the reaction was carried out with stirring at 80° C. for 17 hours.
  • solvent DMSO, manufactured by Kishida Chemical Co., Ltd.
  • the prepared synthetic polymer has a structure in which N-substituted maleimide (corresponding to the second segment) having a polyethylene glycol chain is bound to both ends of the molecular chain of artificial fibroin (corresponding to the first segment). That is, the synthetic polymer is a molecule in which three segments are bonded in order of the second segment, the first segment, and the second segment.
  • a film containing the synthetic polymer prepared as described above was molded. Specifically, 4.30 g of dimethyl sulfoxide was weighed into a container, 0.70 g of the synthetic polymer was added thereto, and the synthetic polymer was dissolved by stirring for 30 minutes at 90°C under nitrogen. A dope solution was prepared. The stirring speed was set at 100 rpm. In the dope solution, the mixing ratio was adjusted so that the ratio of synthetic polymer:dimethylsulfoxide was 14% by mass:86% by mass.
  • a film-like molded body (film) was prepared in the same manner as in Example 4 using the above dope solution.
  • the prepared film was colorless and transparent, and was confirmed to be more flexible than the film of Example 4. It was confirmed that the film did not crack even when bending stress was applied.
  • Example 7 A synthetic polymer was prepared by reacting polyethylene glycol having maleimide groups at both ends (manufactured by BiochemPEG, number average molecular weight: 20000) and artificial fibroin having two cysteine residues. Specifically, 4.022 g of artificial fibroin (number average molecular weight: 50000) having the amino acid sequence (PRT17) shown in SEQ ID NO: 62 prepared as described above and 1.564 g of polyethylene glycol having maleimide groups at both ends and 201 mL of dimethyl sulfoxide as a solvent were weighed into an eggplant flask and stirred at 80° C. for 48 hours to dissolve and react to obtain a synthetic polymer solution.
  • Example 8 A synthetic polymer was prepared by reacting polyethylene glycol having maleimide groups at both ends (manufactured by BiochemPEG, number average molecular weight: 20000) and artificial fibroin having two cysteine residues. Specifically, 348 mg of artificial fibroin (number average molecular weight: 50000) having the amino acid sequence (PRT17) represented by SEQ ID NO: 62 prepared as described above was weighed into a stainless steel container, and 2.11 mL of dimethyl sulfoxide was added as a solvent. , and stirred to dissolve to obtain a fibroin solution.
  • Example 8 while the synthetic polymer was dissolved in dimethylsulfoxide, it was subjected to film forming, which will be described later, without drying.
  • Example 9 Polyethylene glycol having maleimide groups at both ends (manufactured by BiochemPEG, number average molecular weight: 20000), artificial fibroin having two cysteine residues, and artificial fibroin having four cysteine residues are reacted to form a synthetic polymer. was prepared.
  • Example 9 while the synthetic polymer was dissolved in dimethylsulfoxide, it was subjected to film forming, which will be described later, without drying.
  • Example 10 Polyethylene glycol having maleimide groups at both ends (manufactured by BioChemPEG, number average molecular weight: 20000), 2,2′-(ethylenedioxy)diethanethiol having two thiol groups, artificial having two cysteine residues A synthetic polymer was prepared by reacting it with fibroin. Specifically, 300 mg of artificial fibroin (number average molecular weight: 50000) having the amino acid sequence (PRT17) shown in SEQ ID NO: 62 prepared as described above and 284 mg of polyethylene glycol having maleimide groups at both ends were added to a glass container. 3.42 mL of dimethyl sulfoxide was added as a solvent and stirred to dissolve each component to obtain a reaction solution.
  • Example 10 the synthetic polymer dissolved in dimethyl sulfoxide was subjected to film forming, which will be described later, without drying.
  • Example 11 Polyethylene glycol having maleimide groups at both ends (manufactured by BioChemPEG, number average molecular weight: 1000) and polyethylene glycol having cysteine residues at both ends (that is, having thiol groups at both ends) (manufactured by BioChemPEG, number average molecular weight: 2000) and artificial fibroin having two cysteine residues were reacted to prepare a synthetic polymer. Specifically, 378 mg of artificial fibroin (number average molecular weight: 50,000) having the amino acid sequence (PRT17) represented by SEQ ID NO: 62 prepared as described above and 79 mg of polyethylene glycol having maleimide groups at both ends were mixed together.
  • Example 11 143 mg of polyethylene glycol having a cysteine residue at the end was weighed into a vial bottle, 4.40 mL of dimethylsulfoxide was added as a solvent, and dissolved by stirring to obtain a reaction solution. The reaction solution was allowed to react while being stirred at 100° C. for 10 minutes, and then allowed to stand at 100° C. for 10 minutes for reaction to prepare a synthetic polymer. In Example 11, the synthetic polymer dissolved in dimethyl sulfoxide was subjected to film formation, which will be described later, without drying.
  • a PET film 150 mm x 200 mm was prepared as a release member, and a liquid film of the dope solution was provided on the PET film with an applicator so as to have a thickness of 0.4 mm. After that, the liquid film was placed together with the PET film in a blower oven, dried for 30 minutes under conditions of 60°C, transferred to a vacuum oven, and dried under vacuum for 15 hours under conditions of 80°C.
  • a film-like molding (film) composed of synthetic polymer or artificial fibroin was prepared by drying.
  • the films obtained in Examples 7 to 11 have an extremely large breaking elongation and a low elastic modulus compared to the film obtained in Comparative Example 5. . Also from this, it can be confirmed that the films obtained in Examples 7 to 11 are sufficiently excellent in flexibility. In addition, the films obtained in Examples 7 to 11 are sufficiently excellent in toughness.
  • Example 12 2177 mg of artificial fibroin (number average molecular weight: 50000: first segment) having the amino acid sequence (PRT17) represented by SEQ ID NO: 62 prepared as described above and polyethylene glycol bismaleimide having a number average molecular weight of 20000 (Biochempeg Scientific Inc., HO022022-20K: second segment) 823 mg of lithium chloride concentration is 2 M dimethyl sulfoxide solution (DMSO, manufactured by Kishida Chemical Co., Ltd.) 12000 mg after dissolving, under nitrogen, at 100 ° C. for 4 hours.
  • a dope solution in which the synthetic polymer was dissolved was prepared by reacting with stirring. The stirring speed was set at 100 rpm.
  • the mixing ratio was adjusted so that the ratio of synthetic polymer:dimethylsulfoxide was 20% by mass:80% by mass.
  • the obtained dope had a viscosity of 10900 mPa ⁇ s at 100°C.
  • the synthetic polymer in the prepared dope solution has a plurality of blocks in which N-substituted maleimide (corresponding to the second segment) having a polyethylene glycol chain is bound to the molecular chain end of artificial fibroin (corresponding to the first segment). It has a repeated structure.
  • fibers were prepared by dry-wet spinning under the conditions shown below.
  • a dope solution at 100° C. was extruded from a nozzle (nozzle diameter: 0.1 mm) together with nitrogen gas by a gear pump, and passed through a first coagulation bath (first bath), a second coagulation bath (second bath), and a stretching bath (third bath). bath) and then wound up with a heated roller set at 60°C.
  • the draw ratio in the drawing bath was set to 8.5 times.
  • the first bath was a methanol bath at 0°C
  • the second bath was a methanol bath at 25°C
  • the third bath was a water bath at 54°C. It was confirmed that the obtained fibers had sufficient extensibility.
  • the appearance of the obtained fiber is shown in FIG.
  • Table 7 shows the results.
  • “A” indicates that the added fibroin was completely dissolved and a solution with the set concentration was prepared, and "B” indicates that undissolved fibroin was observed. That is, it was confirmed that the modified fibroin is a highly hydrophobic fibroin that cannot be dissolved in a 9 M lithium bromide aqueous solution at 60° C. even in an amount equivalent to 5% by mass.
  • ⁇ Reference Example 2 Evaluation of hydrophobicity of structural protein (hot water resistance)> Modified fibroin (artificial fibroin) and silk fibroin were subjected to a hot water resistance test to evaluate hot water resistance.
  • silk fibroin "Silk Powder IM" manufactured by KB Seiren Co., Ltd. was used. 50000) was used.
  • a dispersion liquid was prepared by adding 50 mg of fibroin and 950 mg of RO water as a solvent to a glass container so that the content of fibroin was 5% by mass. The dispersion was stirred at 100° C. for 5 hours. After 5 hours the solvent was removed by centrifugation.
  • the dispersion was stirred at 100° C. for 15 minutes to prepare a dimethylsulfoxide solution.
  • a masking tape having a thickness of 100 ⁇ m was attached as a shim onto a slide glass, and the dimethyl sulfoxide solution prepared as described above was cast to form a liquid film.
  • the slide glass was transferred to a vacuum oven (product name: VOS-210C manufactured by Tokyo Rika Kyoukai Co., Ltd.), left to stand, and dried under reduced pressure at 80° C. to form a fibroin film.
  • FIG. 18 and FIG. 19 show the results of 100-fold optical microscope observation and 1000-fold scanning electron microscope observation of the two types of cast films, respectively.
  • Figures 18(a) and 18(b) are optical microscope photographs showing the polypeptide derivative film and the modified fibroin + PEG mixture film, respectively, magnified 100 times.
  • Figures 19(a) and 19(b) are scanning electron micrographs showing the polypeptide derivative film and the modified fibroin + PEG mixture film, respectively, magnified 1000 times.
  • FIG. 20 shows a GPC chart of the polypeptide derivative and its raw material, modified fibroin (PRT17, number average molecular weight of 50,000).
  • modified fibroin + PEG mixture film was prepared in the same manner as the above polypeptide derivative film, except that the following a) and b) were added to 0.92 g (0.84 mL) of dimethyl sulfoxide (DMSO) to prepare a mixed solution. bottom.
  • modified fibroin PRT27, number average molecular weight 100000: 58 mg
  • PEG number average molecular weight 20000: 22 mg (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
  • a porous body with excellent flexibility can be provided. According to the present disclosure, it is possible to adjust the physical properties and functions of the polypeptide derivative by selecting the second segment to be introduced relative to the first segment. As a result, the physical properties and functions of the porous material prepared using the polypeptide derivative can be adjusted.

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Abstract

ポリペプチド誘導体を含み、前記ポリペプチド誘導体が、ポリペプチド骨格を含む第一のセグメントと、前記第一のセグメントに結合する一又は複数の第二のセグメントと、を有するブロック共重合体を含み、前記ポリペプチド骨格が、組換えポリペプチド骨格又は疎水性ポリペプチド骨格であり、前記第二のセグメントが前記ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団を含む、多孔質体に関する。

Description

多孔質体及びその製造方法
　本開示は、多孔質体及びその製造方法に関する。
　近年、環境保全意識の高まりに応じて、生分解性を有し且つ生産及び加工に際して必要なエネルギーが小さいタンパク質材料が注目を浴びている。そして、そのようなタンパク質材料は、例えば、繊維、フィルム、樹脂、ゲル、多孔質体等の様々な形態において、様々な分野での需要の増大が見込まれている。しかしながら、天然のタンパク質材料は、均質なものを大量に得ることが難しい。そのため、天然タンパク質材料の欠点を補い得る、人工タンパク質を含む材料が検討されてきている。
　例えば、特許文献１には、クモ糸タンパク質に由来するポリペプチド多孔質体であって、前記ポリペプチドは非水溶性ポリペプチドを含み、見掛けの密度が０．１ｇ／ｃｍ３以下であることを特徴とするポリペプチド多孔質体が開示されている。
国際公開第２０１４／１７５１７８号
　特許文献１に記載されるようなポリペプチド多孔質体には、品質、特に柔軟性において更なる改善の余地があった。本開示は、このような事情に鑑みてなされたものであり、柔軟性に優れる多孔質及びその製造方法を提供することを目的とする。
　本開示の一側面は、ポリペプチド誘導体を含み、ポリペプチド誘導体が、ポリペプチド骨格を含む第一のセグメントと、第一のセグメントに結合する一又は複数の第二のセグメントと、を有するブロック共重合体を含み、ポリペプチド骨格が、組換えポリペプチド骨格又は疎水性ポリペプチド骨格であり、第二のセグメントがポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団を含む、多孔質体を提供する。
　本開示の多孔質体は、上記第一及び第二のセグメントを有するブロック共重合体を含むポリペプチド誘導体を含むことによって、タンパク質同様にポリペプチド骨格を有する材料が用いられながら、柔軟性に優れている。上記ポリペプチド誘導体は、第一のセグメントと第二のセグメントとが直接結合したブロック共重合体を含むため、タンパク質に可塑剤を単純に混合する場合のようなマクロな相分離の発生が低減されている。
　上記第一のセグメントは、平均ハイドロパシー・インデックス（疎水性度：疎水性指標）が０．２２以上である疎水性ポリペプチド骨格を含んでいてよい。ポリペプチド骨格が上述のような疎水性ポリペプチド骨格であることによって、可塑化機能を有する分子団との第一のセグメントとの親和性が向上し、多孔質体の柔軟性が更に優れたものとなる。
　上記ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団の分子量は、上記ポリペプチド骨格の分子量を１００としたときに、１０以上であってよく、１００以下であってよい。
　上記第二のセグメントの合計の分子量は、上記第一のセグメントの分子量１００を基準として、１０以上であってよく、２０００以下であってよい。
　上記ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団は、ポリエーテル、ポリエステル、又はポリカーボネートであってよい。
　上記ポリエーテルは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はポリテトラメチレングリコール（ＰＴＭＧ）であってよい。
　上記ポリペプチド骨格が疎水性組換えポリペプチド骨格であってよい。
　上記ポリペプチド骨格が組換えタンパク質に由来する骨格を含んでもよい。
　上記組換えタンパク質が組換え構造タンパク質を含んでもよい。
　上記組換え構造タンパク質が改変フィブロインを含んでもよい。
　上記改変フィブロインが改変クモ糸フィブロインを含んでもよい。
　上記第二のセグメントの分子量が、上記第一のセグメントの分子量を１００としたときに１～４００の範囲内の値であってよい。これによって、ポリペプチド誘導体を含む多孔質体において、第一のセグメントの特性（例えば、高い機械的強度）を保持しつつ、多孔質体としての柔軟性を有利に高めることができる。
　上記第二のセグメントが、ポリエーテル、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリオール、ポリオフィン、ポリアセタール、ポリケタール、ポリ（メタ）アクリレート、シリコーン、ポリウレタン、ポリアルキレンイミン、フェノール樹脂、尿素樹脂、メラミン樹脂、及び多糖類からなる群より選択される少なくとも一種に由来する骨格を含んでもよい。
　上記第二のセグメントが、ポリエーテル基、ポリエステル基、ポリカーボネート基、ポリアミド基、ポリオール基、及び、修飾多糖基からなる群より選択される少なくとも一種を含んでもよい。
　上記第一のセグメントを複数有し、上記第二のセグメントの一部が２以上の上記第一のセグメントと結合してネットワーク構造を形成していてもよい。ネットワーク構造を有することで、靭性が更に向上し得る。
　上記第一のセグメントを複数有し、上記第一のセグメントと第二のセグメントとが交互に結合していてもよい。第一のセグメントと第二のセグメントとが交互に結合することによって、例えば、靭性が更に向上し得る。
　上記第二のセグメントが複数の上記分子団を含み、複数の上記分子団が互いに連結していてもよい。第二セグメントの設計の幅をより広げることができ、多孔質体の柔軟性をより容易に調整できる。
　第二のセグメントがリンカーを更に含み、上記リンカーを介して上記分子団と上記ポリペプチド骨格とが結合していてもよい。
　上記リンカーが、下記式（１）で表される構造単位、下記一般式（２ａ）～（６）で表される構造単位、下記式（７）で表される構造単位、下記一般式（８ａ）～（９）で表される構造単位、下記一般式（１０）～（１１ｂ）で表される構造単位、及び下記一般式（１３）～（１６）で表される構造単位からなる群より選択される少なくとも一種を含んでもよい。
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　上記一般式（２ａ）、（２ｂ）、（３ａ）、（４ａ）、（４ｂ）、（５）、（６）、（１０）、（１１ａ）及び（１１ｂ）において、Ｙは、互いに独立に、酸素原子、硫黄原子、又はＮＲ１を示し、Ｒ１は、水素、炭化水素基、芳香族基、カルボニル基、又はスルホニル基を示し、上記一般式（２ａ）、（２ｂ）、（３ａ）、（４ａ）、（４ｂ）、（８ａ）、（８ｂ）、（９）、（１０）、（１１ａ）及び（１１ｂ）において、Ｒは、互いに独立に、水素、炭化水素基、又は芳香族基を示す。
　上記リンカーが、上記式（１）で表される構造単位、並びに、上記一般式（２ａ）、（３ａ）、（４ａ）、（４ｂ）及び（１０）で表される構造単位からなる群より選択される少なくとも一種であってよい。
　第一のセグメントが、ポリペプチド骨格中のチオール基、アミノ基及びヒドロキシ基からなる群より選択される少なくとも１種の官能基によって第二のセグメントと結合していてよい。
　本開示の他の一側面は、ポリペプチド誘導体及び溶媒を含む混合物をゲル化させる工程Ａと、ゲル化した混合物から溶媒を離脱させることにより、ポリペプチド誘導体を含む多孔質体を得る工程Ｂと、を含み、ポリペプチド誘導体が、ポリペプチド骨格を含む第一のセグメントと、第一のセグメントに結合する一又は複数の第二のセグメントと、を有し、ポリペプチド骨格が、組換えポリペプチド骨格又は疎水性ポリペプチド骨格であり、第二のセグメントがポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団を含む、多孔質体を製造する方法を提供する。
　工程Ｂにおいて、ゲル化した混合物を凍結乾燥させることにより、ゲル化した混合物から溶媒を離脱させてよい。
　上記多孔質体を製造する方法において、溶媒が有機溶媒であり、工程Ｂにおいて、凍結乾燥させる前にゲル化した混合物中の溶媒を水に置換することを含んでいてよい。
　上記多孔質体を製造する方法は、ポリペプチド骨格を含む化合物と、下記一般式（１Ａ）～（１６Ａ）で表される化合物とを反応させることによってポリペプチド誘導体を得る工程を備えていてよい。ポリペプチド誘導体を得る工程において、ポリペプチド骨格は、チオール基、アミノ基、ヒドロキシ基、グアニジノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、インドール基、アミド基、アジド基、及びアルキニル基からなる群より選択される少なくとも一種を有していてよい。
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　上記一般式（１Ａ）、（２Ａ）、（２Ｂ）、（３Ａ）、（３Ｂ）、（４Ａ）、（５Ａ）、（６Ａ）、（７Ａ）、（８Ａ）、（８Ｂ）、（９Ａ）、（１０Ａ）、（１１Ａ）、（１１Ｂ）及び（１２Ａ）においてＲ２は、上記ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団を示し、上記一般式（２Ａ）、（２Ｂ）、（３Ａ）、（３Ｂ）、（４Ａ）、（５Ａ）、（６Ａ）、（８Ｂ）、（９Ａ）、（１０Ａ）、（１１Ａ）及び（１１Ｂ）において、Ｙは、互いに独立に、酸素原子、硫黄原子、又はＮＲ１を示し、Ｒ１は、水素、炭化水素基、芳香族基、カルボニル基、又はスルホニル基を示し、上記一般式（２Ａ）、（２Ｂ）、（３Ａ）、（３Ｂ）、（４Ａ）、（５Ａ）、（８Ａ）、（８Ｂ）、（９Ａ）、（１０Ａ）、（１１Ａ）及び（１１Ｂ）においてＲは、互いに独立に、水素、炭化水素基、又は芳香族基を示し、上記一般式（６Ａ）及び（１２Ａ）において、Ｚはハロゲン原子、スルホン酸エステル基、又は含フッ素カルボン酸エステル基を示し、上記一般式（１５Ａ）において、Ｘはハロゲン原子を示す。
　ポリペプチド誘導体を得る工程では、特定の官能基を有するポリペプチド骨格を含む化合物と、ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団を有する、下記一般式（１Ａ）～（１６Ａ）で表される特定の化合物と、を反応させることによってポリペプチド誘導体を調製している。こうすることによって、得られるポリペプチド誘導体は、ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団を有し、タンパク質同様にポリペプチド骨格を有しながら、ポリペプチド誘導体全体として、柔軟性に優れる材料となっている。このため、柔軟性に優れる多孔質体を製造可能である。上記ポリペプチド誘導体は、第一のセグメントと第二のセグメントとが結合しているため、タンパク質に可塑剤を単純に混合する場合のようなマクロな相分離の発生が低減されている。
　上記多孔質体を製造する方法は、ポリペプチド骨格を含む化合物と、ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団を含む化合物と、下記一般式（２－１Ａ）～（２－１６Ａ）で表される構造単位からなる群より選択される少なくとも一種の構造単位を２つ以上有する化合物と、を反応させることによってポリペプチド誘導体を得る工程を備えていてよい。ポリペプチド誘導体を得る工程において、ポリペプチド骨格は、チオール基、アミノ基、ヒドロキシ基、グアニジノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、インドール基、アミド基、アジド基、及びアルキニル基からなる群より選択される少なくとも一種を有し、上記分子団を含む化合物は、チオール基、アミノ基、ヒドロキシ基、グアニジノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、インドール基、アミド基、アジド基、及びアルキニル基からなる群より選択される少なくとも一種を有していてよい。
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　上記一般式（２－２Ａ）、（２－２Ｂ）、（２－３Ａ）、（２－３Ｂ）、（２－４Ａ）、（２－５Ａ）、（２－６Ａ）、（２－１０Ａ）、（２－１１Ａ）、及び（２－１１Ｂ）において、Ｙは、互いに独立に、酸素原子、硫黄原子、又はＮＲ１を示し、Ｒ１は、水素、炭化水素基、芳香族基、カルボニル基、又はスルホニル基を示し、上記一般式（２－２Ａ）、（２－２Ｂ）、（２－３Ａ）、（２－３Ｂ）、（２－４Ａ）、（２－８Ａ）、（２－８Ｂ）、（２－９Ａ）、（２－１０Ａ）、（２－１１Ａ）、（２－１１Ｂ）、及び（２－１２Ａ）においてＲは、互いに独立に、水素、炭化水素基、又は芳香族基を示し、上記一般式（２－６Ａ）及び（２－１２Ａ）において、Ｚはハロゲン原子、スルホン酸エステル基、又は含フッ素カルボン酸エステル基を示し、上記一般式（２－１５Ａ）において、Ｘはハロゲン原子を示す。
　ポリペプチド誘導体を得る工程では、特定の官能基を有するポリペプチド骨格を含む化合物と、ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有し、特定の官能基を有する分子団を含む化合物と、一般式（２－１Ａ）～（２－１６Ａ）で表される構造単位からなる群より選択される少なくとも一種の構造単位を２つ以上有する化合物と、を反応させることによってポリペプチド誘導体を調製する。こうすることによって、得られるポリペプチド誘導体は、ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団を有し、タンパク質同様にポリペプチド骨格を有しながら、ポリペプチド誘導体全体として、柔軟性に優れる材料となっている。このため、柔軟性に優れる多孔質体を製造可能である。上記ポリペプチド誘導体は、第一のセグメントと第二のセグメントとが結合しているため、タンパク質に可塑剤を単純に混合する場合のようなマクロな相分離の発生が低減されている。
　本開示によれば、柔軟性に優れる多孔質体及びその製造方法を提供できる。
図１は、改変フィブロインのドメイン配列の一例を示す模式図である。 図２は、天然由来のフィブロインのｚ／ｗ（％）の値の分布を示す図である。 図３は、天然由来のフィブロインのｘ／ｙ（％）の値の分布を示す図である。 図４は、改変フィブロインのドメイン配列の一例を示す模式図である。 図５は、フィブロインのドメイン配列の一例を示す模式図である。 図６は、実施例Ａの多孔質体の曲がり量の試験結果を示す写真である。 図７は、比較例Ａの多孔質体の曲がり量の試験結果を示す写真である。 図８は、実施例で調製したポリペプチド誘導体についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥの測定結果を示す図である。 図９は、実施例で調製したポリペプチド誘導体についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥの測定結果を示す図である。 図１０は、実施例で用いた加圧成形機の模式断面図である。 図１１は、図１０に示した加圧成形機の使用方法を示す模式図であり、（ａ）は組成物導入前、（ｂ）は組成物導入直後、（ｃ）は組成物を加熱及び加圧している状態、の加圧成形機の模式断面図である。 図１２は、実施例のポリペプチド誘導体を含む試験用成形体の外観を示す写真である。 図１３は、比較例の混合物を用いて成形した試験用成形体の外観を示す写真である。 図１４は、比較例の混合物を用いて成形した試験用成形体の外観を示す写真である。 図１５は、実施例１２で調製した繊維の外観を示す写真である。 図１６は、参考例２におけるＧＰＣ測定の結果を示すグラフである。 図１７は、参考例３における接触角測定の結果を示す写真である。 図１８は、実施例で作製したキャストフィルムの光学顕微鏡写真であり、図１８（ａ）及び図１８（ｂ）はそれぞれポリペプチド誘導体フィルム及び改変フィブロイン＋ＰＥＧ混合体フィルムを１００倍に拡大して示す光学顕微鏡写真である。 図１９は、実施例で作製したキャストフィルムの走査型電子顕微鏡写真であり、図１９（ａ）及び図１９（ｂ）はそれぞれポリペプチド誘導体フィルム及び改変フィブロイン＋ＰＥＧ混合体フィルムを１０００倍に拡大して示す走査型電子顕微鏡写真である。 図２０は、実施例で作製したポリペプチド誘導体及びその原料である改変フィブロインのＧＰＣ測定の結果を示すグラフである。
　以下、本開示を実施するための形態について、場合によって図面を参照し、詳細に説明する。ただし、以下の実施形態は本開示を説明するための例示であり、本開示を以下の内容に限定する趣旨ではない。
　本明細書において例示する材料は特に断らない限り、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。組成物中の各成分の含有量は、組成物中の各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
　本明細書においてポリペプチド誘導体とは、第一のセグメントと第二セグメントとが結合したブロック共重合体を含む組成物を言う。ポリペプチド誘導体は、未反応の第一のセグメント（第一のセグメントを形成するための物質）、及び／又は、未反応の第二のセグメント（第二のセグメントを形成するための物質）を含んでいてもよい。本明細書におけるポリペプチド誘導体は、マクロ的な観察では、相分離なく、均一な状態である。マクロ的な観察は、例えば、光学顕微鏡又は走査電子顕微鏡等によって１００～３０００倍程度の倍率で実施される。マクロ的な観察によって、相分離なく均一な状態であることを確認する方法としては、観察対象となる物質のキャストフィルムを形成し、当該キャストフィルムを１００～３０００倍程度の倍率で光学顕微鏡又は走査電子顕微鏡によって観察することよって確認する方法が挙げられる。相分離なく均一な状態であることは、具体的には、後述する実施例に記載の方法によって確認することができる。本明細書におけるポリペプチド誘導体は、ミクロ的に（例えば原子間力顕微鏡を用いたサブミクロンスケールで）観察したときには相分離が認められ得るものである。
　このようなポリペプチド誘導体を含む多孔質体は、第一のセグメントと第二セグメントとの混合物及び第一のセグメントと第二セグメントのうちの一方が他方に分散されてなる組成物を含む多孔質体とは異なって、ポリペプチド誘導体含有部（多孔質体の一部若しくは全部）の全体において、物理特性乃至機械特性の均一化が有利に図られて、例えば、クラックの発生が有利に抑制され得る。透明性が確保され得るだけでなく、多孔質体の作製時に、ポリペプチド誘導体含有部の成形性が効果的に高められ得る。ポリペプチド誘導体に含まれる、第一のセグメントと第二セグメントとが結合したブロック共重合体のポリペプチド誘導体全体に対する含有量は、特に限定されるものではなく、例えば、重量基準で、３０％以上であってもよく、４０％以上であってもよく、５０％以上であってもよく、６０％以上であってもよく、７０％以上であってもよく、８０％以上であってもよい。ポリペプチド誘導体は、第一のセグメントと第二セグメントとが共有結合したブロック共重合体を主成分として含んでいることが望ましい。従って、ポリペプチド誘導体に含まれる上記ブロック共重合体のポリペプチド誘導体全体に対する含有量は、重量基準で、好ましくは５０％超であり、より好ましくは６０％以上であり、更に好ましくは７０％以上であり、更により好ましくは８０％以上であり、最も好ましくは８５％以上である。上記ブロック共重合体を５０％超の割合で含有するポリペプチド誘導体を含む多孔質体においては、ポリペプチド誘導体を含むことによって得られる柔軟性及び／又は靭性の向上効果がより高いレベルで達成され得る。
［多孔質体］
　本実施形態に係る多孔質体は、ポリペプチド誘導体を含む。当該多孔質体は、ポリペプチド誘導体を含んでいるため、柔軟性に優れている。
＜ポリペプチド誘導体＞
　ポリペプチド誘導体は、ポリペプチド骨格を含む第一のセグメントと、上記第一のセグメントに結合する一又は複数の第二のセグメントを有するブロック共重合体を含む。上記第二のセグメントが上記ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団を含む。第二のセグメントの数は、第一のセグメント１つに対して、一又は複数であり、好ましくは２以上であり、より好ましくは２～１０であり、さらに好ましくは２～８であり、さらに好ましくは２～６であり、最も好ましくは２～４である。
　ポリペプチド誘導体に含まれるブロック共重合体としては、第一のセグメント及び第二のセグメントを有するものであればよく、例えば、１つの第一のセグメントに一又は複数の第二のセグメントが結合したものであってよく、第一のセグメントと、第一のセグメントに結合した第二のセグメントとを含むブロックが複数連結したものであってもよい。ブロック共重合体は、ポリペプチド骨格を含む第一のセグメントを主鎖とし、第二のセグメントを側鎖に有する高分子（例えば、グラフトポリマー等）であってよい。ブロック共重合体は、上記第一のセグメントを複数有し、上記第一のセグメントと第二のセグメントとが交互に結合していてもよい。第一のセグメントと第二のセグメントとが交互に結合することによって、例えば、上記ポリペプチド誘導体を含むことによって、多孔質体の靭性が更に向上し得る。
　ポリペプチド誘導体に含まれるブロック共重合体は、上記第一のセグメントを複数有し、上記第二のセグメントの一部が２以上の上記第一のセグメントと結合してネットワーク構造を形成していてもよい。ネットワーク構造を有することで、上記ポリペプチド誘導体を含むことによって、多孔質体の靭性が更に向上し得る。
　第一のセグメントと第二のセグメントとの結合は、直接結合していてもよく、第一のセグメント及び第二のセグメントと結合できるような構造によって結合していてもよい。それらのいずれの結合形態においても、第一のセグメントと第二のセグメントとの結合は配位結合であってもよく、イオン的相互作用による結合であってもよく、共有結合であってもよい。それらの中でも共有結合が望ましい。
＜第一のセグメント＞
　第一のセグメントはポリペプチド骨格を含み、例えば、ポリペプチド骨格のみからなってもよい。第一のセグメントは、ポリペプチド骨格を構成するアミノ酸配列中の官能基（例えば、システインの有するチオール基等）によって第二のセグメントと結合していてよい。換言すれば、第二のセグメントと結合可能な官能基を有する組換えポリペプチド又は疎水性ポリペプチドであれば、上記のポリペプチド骨格として採用できる。この際、ポリペプチドが有する上記官能基の数は、例えば、１個以上、２個以上、又は４個以上であってよい。ポリペプチドが有する上記官能基の数は、例えば、３０個以下、２５個以下、２０個以下、１５個以下、１０個以下、又は８個以下であってよい。ポリペプチドが有する上記官能基の数は上述の範囲内で調整することができ、例えば、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～８、又は２～８であってよい。第一のセグメントは、ポリペプチド骨格を構成するアミノ酸配列中の官能基に対して導入した官能基によって第二のセグメントと結合していてよい。
　上述のような官能基は、例えば、チオール基、アミノ基、ヒドロキシ基、グアニジノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、インドール基、アミド基、アジド基、及びアルキニル基からなる群より選択される少なくとも一種であってよく、好ましくは、チオール基、アミノ基、ヒドロキシ基、グアニジノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、インドール基、及びアミド基からなる群より選択される少なくとも一種であってよく、より好ましくは、チオール基、アミノ基、ヒドロキシ基、グアニジノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、及びインドール基からなる群より選択される少なくとも一種であってよく、更に好ましくは、チオール基、アミノ基、ヒドロキシ基、グアニジノ基、カルボキシ基、及びフェノキシ基からなる群より選択される少なくとも一種であってよく、更により好ましくは、チオール基、アミノ基、ヒドロキシ基、グアニジノ基、及びカルボキシ基からなる群より選択される少なくとも一種であってよく、更によりまた好ましくは、チオール基、アミノ基、ヒドロキシ基、及びグアニジノ基からなる群より選択される少なくとも一種であってよく、特に好ましくは、チオール基、アミノ基、及びヒドロキシ基からなる群より選択される少なくとも一種であってよく、特により好ましくは、チオール基、及びアミノ基からなる群より選択される少なくとも一種であってよく、最も好ましくはチオール基である。アミノ基は、例えば、リジンが有するアミノ基であってよい。ヒドロキシ基は、例えば、セリンが有するヒドロキシ基、及びスレオニンが有するヒドロキシ基等であってよい。グアニジノ基は、例えば、アルギニンが有するグアニジノ基であってよい。カルボキシ基は、例えば、グルタミン酸が有するカルボキシ基、及びアスパラギン酸が有するカルボキシ基等であってよい。フェノキシ基は、例えば、チロシンが有するフェノキシ基であってよい。インドール基は、例えば、トリプロファンが有するインドール基であってよい。アミド基は、例えば、グルタミンが有するアミド基、及びアスパラギンが有するアミド基等であってよい。アルキニル基は、システインが有するチオール基に対してハロゲン化アセチレンを反応させて導入したアルキニル基であってよい。
　第一のセグメントの分子量は、例えば、好ましくは２００～１００００００であり、より好ましくは３００～９０００００であり、更に好ましくは４００～８０００００であり、更により好ましくは５００～７０００００であり、更によりまた好ましくは６００～６０００００であり、更に好適には１０００～６０００００であり、更に好適には３０００～６０００００であり、更に好適には５０００～６０００００であり、更に好適には１００００～６０００００であり、更に好適には５０００～１０００００である。
　第一のセグメントの分子量が２００以上であると、可塑化機能を有する分子団を含む第二のセグメント（ソフトセグメント）に対してハードセグメントとして機能する第一のセグメントが充分な大きさになる。そうなった場合には、ポリペプチド誘導体を用いて成形される多孔質体の剛性が充分に大きくなり、多孔質体としてより使用しやすくなる。第一のセグメントの分子量が１００００００以下であると、連結反応の反応性の低下が抑えられ、化学工学的に素材として商業生産が可能な時間で反応を完遂させやすくなり、その結果、多孔質体内に残存した未反応の第二セグメントの局在化を抑制しやすくなる。
　第一のセグメントの分子量、及び第一のセグメントに含まれるポリペプチド骨格の分子量は、例えば、１０００以上、２０００以上、３０００以上、４０００以上、５０００以上、６０００以上、７０００以上、８０００以上、９０００以上、１００００以上、２００００以上、３００００以上、４００００以上、５００００以上、６００００以上、７００００以上、８００００以上、９００００以上、又は１０００００以上であってよい。さらに、第一のセグメントの分子量、及び第一のセグメントに含まれるポリペプチド骨格の分子量は、４０００００以下、３６００００未満、３０００００以下、又は２０００００以下であってよい。
　第一のセグメント及びポリペプチド骨格は、分子量が小さい程、溶媒への溶解度が高まる傾向にある。それ故、ポリペプチド骨格及び／又は第一のセグメントの分子量が、例えば２０００００以下、或いは１０００００以下である場合には、ポリペプチド骨格を含む化合物を溶媒に溶解させて、ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団を含む化合物と反応させることでポリペプチド誘導体を得る際に、目的とするポリペプチド誘導体の生成効率の向上が望まれ得る。そのようにして得られるポリペプチド誘導体を用いて形成された多孔質体においては、ある程度の強度を確保しつつ、柔軟性の向上が期待され得る。加えて、ポリペプチド骨格及び／又は第一のセグメントの分子量が、例えば２０００００以下、或いは１０００００以下である場合には、ポリペプチド誘導体の柔軟性を高めるために第二のセグメントの使用量を可及的に抑制し得ることが期待される。上記した第一のセグメントの分子量及びポリペプチド骨格の分子量は重量平均分子量である。
　本明細書における分子量は、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって測定される値である。かかる電気泳動は以下の手順にて実施される。すなわち、先ず、２ｍｇの粉末サンプルに２００μＬ、２Ｍ塩化リチウムＤＭＳＯ（富士フィルム和光純薬製）を加え、８０℃、６０分間、さらに９５℃、１０分間加熱しながら攪拌することで、サンプルを溶解させる。その後、１０Ｍウレア溶液でサンプルを５０倍希釈、試料用緩衝液（富士フィルム和光純薬製）でさらに２倍希釈し、９５℃、５分間加熱することで、タンパク質を変性させる。次いで、電気泳動装置（Bio－lad製）にＳＤＳ－ＰＡＧＥ用ゲル（Bio－lad製）を取り付け、装置にＳＤＳバッファーを満たす一方、電気泳動装置を電源装置（Bio craft製）に繋ぐ。変性させたサンプルを１０μＬずつＳＤＳ－ＰＡＧＥ用ゲルの各ウェルに加え、３０ｍＡ／１枚、３０分間の条件で電流を流す。電気泳動終了後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用ゲルを装置から取り出し、Ｏｒｉｏｌｅ蛍光ゲルステイン（Bio-lad製）に浸し、１時間振盪する。その後、ＵＶサンプルトレイ（Bio－lad製）にゲルをのせ、Gel Doc EZゲル撮影装置（Bio－lad製）で染色像を取得する。
　ポリペプチド骨格を構成するアミノ酸残基数は５０以上であってよい。当該アミノ酸残基数は、例えば、１００以上、１５０以上、２００以上、２５０以上、３００以上、３５０以上、４００以上、４５０以上、又は５００以上であってよい。当該アミノ酸残基数は、例えば、５０００以下、４５００以下、４０００以下、３５００以下、３０００以下、２５００以下、２０００以下、１５００以下、又は１０００以下であってよい。アミノ酸残基数が少ない程、溶媒への溶解度が高まる傾向にある。それ故、本実施形態に係るポリペプチドのアミノ酸残基数が、例えば５０００以下、或いは２５００以下である場合には、ポリペプチド骨格を含む化合物を溶媒に溶解させて、ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団を含む化合物と反応させることでポリペプチド誘導体を得る際に、目的とするポリペプチド誘導体の生成効率の向上が望まれ得る。そのようにして得られるポリペプチド誘導体を用いて形成される多孔質体においては、ある程度の強度を確保しつつ、柔軟性の向上が期待され得る。
　ポリペプチド骨格は、組換えポリペプチド骨格又は疎水性ポリペプチド骨格であり、疎水性組換えポリペプチド骨格であってよい。
　組換えポリペプチドは、遺伝子組換え技術を使用して製造されたポリペプチドを意味する。ポリペプチド骨格が組換えポリペプチド骨格である場合、アミノ酸配列の設計変更が容易であることから、ポリペプチド誘導体の特性、物性等のコントロールが容易になる。ポリペプチド骨格が組換えポリペプチド骨格である場合、常に均一な分子デザインが可能であるため、目的に応じたポリペプチド骨格を安定的に得ることができる。これによって、目的とするポリペプチド誘導体及び多孔質体の品質の安定化が有利に図られる。
　ポリペプチド骨格が疎水性ポリペプチド骨格である場合には、可塑化機能を有する分子団の第一のセグメントとの親和性が向上し、より柔軟性に優れる多孔質体を製造できる。加えて、かかる多孔質体の耐水性が向上し、例えば、多孔質体が工業用の汎用材料として使用される場合に、使用寿命の延命化が有利に図られ得る。ポリペプチド誘導体は、例えば、第二のセグメントに含まれる、ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団の疎水性乃至親水性をコントロールすることで、ポリペプチド誘導体全体の疎水性乃至親水性を任意に調整可能である。ポリペプチド骨格が疎水性ポリペプチド骨格である場合には、ポリペプチド骨格が親水性ポリペプチド骨格である場合に比して、ポリペプチド誘導体全体を疎水性側にシフトすることができ、以てポリペプチド誘導体全体の疎水性乃至親水性をより幅広い範囲にわたってコントロール可能となる。
　疎水性ポリペプチド骨格における疎水性は、後述する平均ハイドロパシー・インデックス（疎水性度：疎水性指標）の値を指標として推定することができる。疎水性ポリペプチド骨格の平均ハイドロパシー・インデックスの値は、例えば、０．００以上、０．１０以上、０．２０以上、０．２２以上、０．２５以上、０．３０以上、０．３５以上、０．４０以上、０．４５以上、０．５０以上、０．５５以上、０．６０以上、０．６５以上、又は０．７０以上であってよい。その上限値は特に制限されるものではないものの、例えば、１．００以下であってもよく、０．７以下であってもよい。
　疎水性ポリペプチド骨格は、６０℃における臭化リチウム水溶液（濃度：９Ｍ）に対する溶解性の低いものが好ましい。この溶解性は、上記疎水性ポリペプチド骨格に相当する化合物（ポリぺプチド）又はポリペプチド誘導体を分解し疎水性ポリペプチド骨格のみ単離して得られたポリペプチドを用いて評価できる。６０℃における臭化リチウム水溶液（濃度：９Ｍ）に対して上記ポリペプチドを溶解させた場合の最大濃度が、例えば、３０質量％未満、２５質量％未満、２０質量％未満、１５質量％未満、１０質量％未満、５質量％未満、又は１質量％未満であってよい。疎水性ポリペプチド骨格としては、６０℃における臭化リチウム水溶液（濃度：９Ｍ）に対して全く溶解しないものであってもよい。
　疎水性ポリペプチド骨格は、水の接触角が大きなものであることが好ましい。水の接触角は、基材上に上記疎水性ポリペプチド骨格に相当する化合物（ポリぺプチド）又はポリペプチド誘導体を分解し疎水性ポリペプチド骨格のみ単離して得られたポリペプチドからなる膜を形成し、当該膜を用いて評価できる。当該膜に水を滴下して、５秒間経過後の接触角が５５°以上となるような膜を構成するポリペプチドが、上記疎水性ポリペプチド骨格として好ましい。上記接触角は、例えば、６０°以上、６５°以上、又は７０°以上であってよい。
　疎水性ポリペプチド骨格は、耐熱水性に優れたものであることが好ましい。対熱水性は、上記疎水性ポリペプチド骨格に相当する化合物（ポリぺプチド）又はポリペプチド誘導体を分解し疎水性ポリペプチド骨格のみ単離して得られたポリペプチドを用いて評価できる。上記ポリペプチドと水とからなる分散液であって、上記ポリペプチドの含有量が５質量％である分散液を調製し、当該分散液を１００℃で５時間加熱処理しても分解しないようなポリペプチドが、上記疎水性ポリペプチド骨格として好ましい。
　ポリペプチド骨格は、タンパク質に由来する骨格を含んでいてよく、タンパク質に由来する骨格のみからなっていてもよい。タンパク質は、組換えタンパク質であってよく、改変フィブロインであってよい。ポリペプチド骨格が組換えタンパク質に由来する骨格を含むことによって、ポリペプチド骨格を構成するアミノ酸配列中の官能基の数及び位置を任意に調節することできる。これによって、ポリペプチド誘導体の構造並びに特性をデザインすることが可能となる。
　組換えタンパク質としては、工業規模での製造が可能な任意のタンパク質を挙げることができ、例えば、工業用に利用できるタンパク質等を挙げることができる。工業用に利用可能とは、例えば、屋内又は屋外で使用される様々な汎用材料等に利用し得ることをいう。
　組換えタンパク質は、そのドメイン配列が、天然由来のタンパク質のアミノ酸配列とは異なるタンパク質であってもよく、天然由来のタンパク質のアミノ酸配列と同一であるタンパク質であってもよい。組換えタンパク質は、天然由来のタンパク質のアミノ酸配列をそのまま利用したものであってもよく、天然由来のタンパク質のアミノ酸配列に依拠してそのアミノ酸配列を改変したもの（例えば、クローニングした天然由来のタンパク質の遺伝子配列を改変することによりアミノ酸配列を改変したもの）であってもよく、天然由来のタンパク質に依らず人工的に設計及び合成したもの（例えば、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより所望のアミノ酸配列を有するもの）であってもよい。
　組換えタンパク質は、天然タンパク質とは異なり、アミノ酸配列を自由に設計し得るものであることから、かかる組換えタンパク質に由来する骨格が、ポリペプチド誘導体に含有される場合には、組換えタンパク質のアミノ酸配列を適宜にデザインすることによって多孔質体の機能、特性、物性等を任意にコントロールすることができる。常に均一な分子デザインが可能であるため、目的タンパク質との相同性の高い、目的に応じたタンパク質を安定的に得ることができる。以て、目的とするポリペプチド誘導体、ひいてはそれを用いて得られる多孔質体の品質の安定化が有利に図られる。
　ポリペプチド骨格は、組換え構造タンパク質に由来する骨格を含んでいてよい。構造タンパク質とは、生体の構造に関わるタンパク質、若しくは生体が作り出す構造体を構成するタンパク質、又はそれらに由来するタンパク質を意味する。構造タンパク質は、一定の条件下において自己凝集し、繊維、フィルム、樹脂、ゲル、ミセル、ナノパーティクル等の構造体を形成するタンパク質のことをいう。構造タンパク質の具体例としては、スパイダーシルク（クモ糸）、カイコシルク、ケラチン、コラ－ゲン、エラスチン及びレシリン、並びにこれら由来のタンパク質等を挙げることができる。組換え構造タンパク質は、遺伝子組換えにより微生物生産した構造タンパク質である。組換え構造タンパク質は、成形性及び／又は生産性の観点からアミノ酸の配列を改良したものであってよい。
　タンパク質を人工的に成形する際、側鎖の小さいアミノ酸ほど水素結合しやすく、強度の高い多孔質体を得やすい。アラニン残基及びグリシン残基は、側鎖が非極性のアミノ酸であるため、ポリペプチド生成における折りたたみの過程で内側に向くように配置され、αヘリックス構造又はβシート構造を取りやすい。よって、グリシン残基、アラニン残基、セリン残基等のアミノ酸の割合が高いことが望ましい。強度向上の観点から、アラニン残基含有量は、例えば、１０～４０％、１２～４０％、１５～４０％、１８～４０％、２０～４０％、又は、２２～４０％であってよい。強度向上の観点から、グリシン残基含有量は、例えば、１０～５５％、１１～５５％、１３～５５％、１５～５５％、１８～５５％、２０～５５％、２２～５５％、又は２５～５５％であってよい。
　本明細書において、「アラニン残基含有量」とは、下記式で表される値である。
　アラニン残基含有量＝（ポリペプチドに含まれるアラニン残基の数／ポリペプチドの全アミノ酸残基の数）×１００（％）
　グリシン残基含有量、セリン残基含有量、スレオニン残基含有量、プロリン残基含有量及びチロシン残基含有量は、上記式において、アラニン残基をそれぞれグリシン残基、セリン残基、スレオニン残基、プロリン残基及びチロシン残基と読み替えたものと同義である。
　加工性を向上させる観点では、加工時点において分子間の強固な水素結合を阻害することが重要であり、この観点から側鎖の大きいアミノ酸又は屈曲性を有するアミノ酸が一定程度、配列全体に均質に含まれていることが望ましく、具体的には、チロシン残基、スレオニン残基、プロリン残基が含まれるモチーフを繰り返して周期で入っていてもよい。例えば、任意の連続した２０アミノ酸残基の中、プロリン残基、スレオニン残基及びチロシン残基の合計含有量が、５％以上、５．５％超、６．０％以上、６．５％超、７．０％以上、７．５％超、８．０％以上、８．５％超、９．０％以上、１０．０％以上、又は１５．０％以上であってよい。例えば、任意の連続した２０アミノ酸残基の中、プロリン残基、スレオニン残基及びチロシン残基の合計含有量が、５０％以下、４０％以下、３０％以下、又は２０％以下であってよい。
　タンパク質は、セリン残基含有量、スレオニン残基含有量及びチロシン残基含有量の合計が、４％以上、４．５％以上、５％以上、５．５％以上、６％以上、６．５％以上、又は７％以上であってよい。セリン残基含有量、スレオニン残基含有量及びチロシン残基含有量の合計は、例えば、３５％以下、３３％以下、３０％以下、２５％以下、又は２０％以下であってよい。
　タンパク質は、反復配列を有するものであってよい。すなわち、タンパク質は、配列同一性が高いアミノ酸配列（反復配列単位）が複数存在するものであってよい。反復配列単位のアミノ酸残基数は６～２００であることが好ましい。反復配列単位間の配列同一性は、例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上であってよい。反復配列単位の疎水性度（ハイドロパシー・インデックス）は、例えば、－０．８０以上、－０．７０以上、－０．６０以上、－０．５０以上、－０．４０以上、－０．３０以上、－０．２０以上、－０．１０以上、０．００以上、０．２２以上、０．２５以上、０．３０以上、０．３５以上、０．４０以上、０．４５以上、０．５０以上、０．５５以上、０．６０以上、０．６５以上、又は０．７０以上であってよい。反復配列単位の疎水性度の上限値は特に制限されるものではないものの、例えば、１．０以下であってもよく、０．７以下であってもよい。
　タンパク質は、（Ａ）ｎモチーフを含むものであってよい。本明細書において、（Ａ）ｎモチーフとは、アラニン残基を主とするアミノ酸配列を意味する。（Ａ）ｎモチーフのアミノ酸残基数は２～２７であってよく、２～２０、２～１６、又は２～１２の整数であってよい。（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数の割合は４０％以上であってよく、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８３％以上、８５％以上、８６％以上、９０％以上、９５％以上、又は１００％（アラニン残基のみで構成されることを意味する。）であってもよい。
　タンパク質には、グリシン残基、セリン残基、又はアラニン残基と隣り合う位置に、システイン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有していることが好ましく、グリシン残基と隣り合う位置に、システイン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有していることがより好ましい。システイン残基はメルカプト基を（チオール基又はスルフヒドリル基ともいう）有し、メルカプト基の選択性によって、第二のセグメントとの結合を容易なものとすることができる。したがって、タンパク質におけるシステイン残基の挿入位置に応じて、第一のセグメントのポリペプチド骨格に対する第二のセグメントの結合位置を任意の位置とすることができる。システイン残基は、グリシン残基、セリン残基、又はアラニン残基と、グリシン残基、セリン残基、又はアラニン残基との間に位置していてよく、セリン残基と、グリシン残基との間に位置していてよい。
　タンパク質は、疎水性アミノ酸残基と隣り合う位置に、システイン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有していることが好ましい。この場合、分子間で疎水性アミノ酸残基同士が疎水的相互作用により固定される。システイン残基は、疎水性アミノ酸残基の隣に位置していてよく、疎水性アミノ酸残基と、疎水性アミノ酸残基以外のアミノ酸残基との間に、位置していてもよく、疎水性アミノ酸残基と、グリシン残基、セリン残基、又はアラニン残基との間に位置していてよく、疎水性アミノ酸残基と、グリシン残基との間に位置していてよい。疎水性アミノ酸残基は、イソロイシン残基、バリン残基、ロイシン残基、フェニルアラニン残基、メチオニン残基、及びアラニン残基からなる群より選択される１種であってよい。
　タンパク質としては、フィブロインが好ましい。フィブロインとしては、例えば、天然由来のフィブロインが挙げられる。天然由来のフィブロインとしては、例えば、昆虫又はクモ類が産生するフィブロインが挙げられる。
　昆虫が産生するフィブロインとしては、例えば、ボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ）、クワコ（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍａｎｄａｒｉｎａ）、天蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ　ｙａｍａｍａｉ）、柞蚕（Ａｎｔｅｒａｅａ　ｐｅｒｎｙｉ）、楓蚕（Ｅｒｉｏｇｙｎａ　ｐｙｒｅｔｏｒｕｍ）、蓖蚕（Ｐｉｌｏｓａｍｉａ　Ｃｙｎｔｈｉａ　ｒｉｃｉｎｉ）、樗蚕（Ｓａｍｉａ　ｃｙｎｔｈｉａ）、栗虫（Ｃａｌｉｇｕｒａ　ｊａｐｏｎｉｃａ）、チュッサー蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ　ｍｙｌｉｔｔａ）、ムガ蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ　ａｓｓａｍａ）等のカイコが産生する絹タンパク質、及びスズメバチ（Ｖｅｓｐａ　ｓｉｍｉｌｌｉｍａ　ｘａｎｔｈｏｐｔｅｒａ）の幼虫が吐出するホーネットシルクタンパク質が挙げられる。
　昆虫が産生するフィブロインのより具体的な例としては、例えば、カイコ・フィブロインＬ鎖（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ７６４３０（塩基配列）、ＡＡＡ２７８４０．１（アミノ酸配列））が挙げられる。
　クモ類が産生するフィブロインとしては、例えば、オニグモ、ニワオニグモ、アカオニグモ、アオオニグモ及びマメオニグモ等のオニグモ属（Ａｒａｎｅｕｓ属）に属するクモ、ヤマシロオニグモ、イエオニグモ、ドヨウオニグモ及びサツマノミダマシ等のヒメオニグモ属（Ｎｅｏｓｃｏｎａ属）に属するクモ、コオニグモモドキ等のコオニグモモドキ属（Ｐｒｏｎｕｓ属）に属するクモ、トリノフンダマシ及びオオトリノフンダマシ等のトリノフンダマシ属（Ｃｙｒｔａｒａｃｈｎｅ属）に属するクモ、トゲグモ及びチブサトゲグモ等のトゲグモ属（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ属）に属するクモ、マメイタイセキグモ及びムツトゲイセキグモ等のイセキグモ属（Ｏｒｄｇａｒｉｕｓ属）に属するクモ、コガネグモ、コガタコガネグモ及びナガコガネグモ等のコガネグモ属（Ａｒｇｉｏｐｅ属）に属するクモ、キジロオヒキグモ等のオヒキグモ属（Ａｒａｃｈｎｕｒａ属）に属するクモ、ハツリグモ等のハツリグモ属（Ａｃｕｓｉｌａｓ属）に属するクモ、スズミグモ、キヌアミグモ及びハラビロスズミグモ等のスズミグモ属（Ｃｙｔｏｐｈｏｒａ属）に属するクモ、ゲホウグモ等のゲホウグモ属（Ｐｏｌｔｙｓ属）に属するクモ、ゴミグモ、ヨツデゴミグモ、マルゴミグモ及びカラスゴミグモ等のゴミグモ属（Ｃｙｃｌｏｓａ属）に属するクモ、及びヤマトカナエグモ等のカナエグモ属（Ｃｈｏｒｉｚｏｐｅｓ属）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質、並びにアシナガグモ、ヤサガタアシナガグモ、ハラビロアシダカグモ及びウロコアシナガグモ等のアシナガグモ属（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、オオシロカネグモ、チュウガタシロカネグモ及びコシロカネグモ等のシロカネグモ属（Ｌｅｕｃａｕｇｅ属）に属するクモ、ジョロウグモ及びオオジョロウグモ等のジョロウグモ属（Ｎｅｐｈｉｌａ属）に属するクモ、キンヨウグモ等のアズミグモ属（Ｍｅｎｏｓｉｒａ属）に属するクモ、ヒメアシナガグモ等のヒメアシナガグモ属（Ｄｙｓｃｈｉｒｉｏｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、クロゴケグモ、セアカゴケグモ、ハイイロゴケグモ及びジュウサンボシゴケグモ等のゴケグモ属（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ属）に属するクモ、及びユープロステノプス属（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ属）に属するクモ等のアシナガグモ科（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈｉｄａｅ科）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質が挙げられる。スパイダーシルクタンパク質としては、例えば、ＭａＳｐ（ＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２）、ＡＤＦ（ＡＤＦ３及びＡＤＦ４）等の牽引糸タンパク質、並びにＭｉＳｐ（ＭｉＳｐ１及びＭｉＳｐ２）等が挙げられる。
　クモ類が産生するフィブロインのより具体的な例としては、例えば、ｆｉｂｒｏｉｎ－３（ａｄｆ－３）［Ａｒａｎｅｕｓ　ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１０（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５５（塩基配列））、ｆｉｂｒｏｉｎ－４（ａｄｆ－４）［Ａｒａｎｅｕｓ　ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１１（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　１［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ０４５０４（アミノ酸配列）、Ｕ３７５２０（塩基配列））、ｍａｊｏｒ　ａｎｇｕ１１ａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　１［Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ　ｈｅｓｐｅｒｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ６８８５６（アミノ酸配列）、ＥＦ５９５２４６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　２［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖａｔａ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＬ３２４７２（アミノ酸配列）、ＡＦ４４１２４５（塩基配列））、ｍａｊｏｒ　ａｎｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　１［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ　ａｕｓｔｒａｌｉｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＪ００４２８（アミノ酸配列）、ＡＪ９７３１５５（塩基配列））、及びｍａｊｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ　２［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ　ａｕｓｔｒａｌｉｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＭ３２２４９．１（アミノ酸配列）、ＡＭ４９０１６９（塩基配列））、ｍｉｎｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５８９．１（アミノ酸配列））、ｍｉｎｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　２［Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５９１．１（アミノ酸配列））、並びにｍｉｎｏｒ　ａｍｐｕｌｌａｔｅ　ｓｐｉｄｒｏｉｎ－ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｎｅｐｈｉｌｅｎｇｙｓ　ｃｒｕｅｎｔａｔａ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ３７２７８．１（アミノ酸配列））等が挙げられる。
　天然由来のフィブロインのより具体的な例としては、更に、ＮＣＢＩ　ＧｅｎＢａｎｋに配列情報が登録されているフィブロインを挙げることができる。例えば、ＮＣＢＩ　ＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列情報のうちＤＩＶＩＳＩＯＮとしてＩＮＶを含む配列の中から、ＤＥＦＩＮＩＴＩＯＮにｓｐｉｄｒｏｉｎ、ａｍｐｕｌｌａｔｅ、ｆｉｂｒｏｉｎ、「ｓｉｌｋ及びｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ」、又は「ｓｉｌｋ及びｐｒｏｔｅｉｎ」がキーワードとして記載されている配列、ＣＤＳから特定のｐｒｏｄｕｃｔの文字列、ＳＯＵＲＣＥからＴＩＳＳＵＥ　ＴＹＰＥに特定の文字列の記載された配列を抽出することにより確認することができる。
　タンパク質は、改変フィブロインであってよい。本明細書において「改変フィブロイン」とは、人為的に製造されたフィブロイン（人造フィブロイン）を意味する。改変フィブロインは、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列とは異なるフィブロインであってもよく、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列と同一であるフィブロインであってもよい。
　改変フィブロインは、天然由来フィブロインに準ずる構造を有する繊維状タンパク質であってよく、天然由来フィブロインが有する反復配列と同様の配列を有するフィブロインであってもよい。「フィブロインが有する反復配列と同様の配列」とは、実際に天然由来フィブロインが有する配列であってもよく、それと類似する配列であってもよい。
　「改変フィブロイン」は、本開示で特定されるアミノ酸配列を有するものであれば、天然由来のフィブロインに依拠してそのアミノ酸配列を改変したもの（例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列を改変することによりアミノ酸配列を改変したもの）であってもよく、天然由来のフィブロインに依らず人工的にアミノ酸配列を設計したもの（例えば、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより所望のアミノ酸配列を有するもの）であってもよい。改変フィブロインのアミノ酸配列を改変したものも、そのアミノ酸配列が天然由来のフィブロインのアミノ酸配列とは異なるものであれば、改変フィブロインに含まれる。改変フィブロインとしては、例えば、人工絹（シルク）フィブロイン（カイコが産生する絹タンパク質のアミノ酸配列を改変したもの）、及び改変クモ糸フィブロイン（クモ類が産生するスパイダーシルクタンパク質のアミノ酸配列を改変したもの）などが挙げられる。改変フィブロインは、好ましくは改変クモ糸フィブロインを含み、より好ましくは改変クモ糸フィブロインからなる。
　本実施形態に係る改変フィブロインの具体的な例として、クモの大瓶状腺で産生される大吐糸管しおり糸タンパク質に由来する改変フィブロイン（第１の改変フィブロイン）、グリシン残基の含有量が低減されたドメイン配列を有する改変フィブロイン（第２の改変フィブロイン）、（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減されたドメイン配列を有する改変フィブロイン（第３の改変フィブロイン）、グリシン残基の含有量、及び（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロイン（第４の改変フィブロイン）、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むドメイン配列を有する改変フィブロイン（第５の改変フィブロイン）、並びにグルタミン残基の含有量が低減されたドメイン配列を有する改変フィブロイン（第６の改変フィブロイン）が挙げられる。
　第１の改変フィブロインとしては、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質が挙げられる。第１の改変フィブロインにおいて、（Ａ）ｎモチーフのアミノ酸残基数は、３～２０の整数が好ましく、４～２０の整数がより好ましく、８～２０の整数が更に好ましく、１０～２０の整数が更により好ましく、４～１６の整数が更によりまた好ましく、８～１６の整数が特に好ましく、１０～１６の整数が最も好ましい。第１の改変フィブロインは、式１中、ＲＥＰを構成するアミノ酸残基の数は、１０～２００残基であることが好ましく、１０～１５０残基であることがより好ましく、２０～１００残基であることが更に好ましく、２０～７５残基であることが更により好ましい。第１の改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるアミノ酸配列中に含まれるグリシン残基、セリン残基及びアラニン残基の合計残基数がアミノ酸残基数全体に対して、４０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、７０％以上であることが更に好ましい。
　第１の改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるアミノ酸配列の単位を含み、かつＣ末端配列が配列番号１～３のいずれかに示されるアミノ酸配列又は配列番号１～３のいずれかに示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であるポリペプチドであってもよい。
　配列番号１に示されるアミノ酸配列は、ＡＤＦ３（ＧＩ：１２６３２８７、ＮＣＢＩ）のアミノ酸配列のＣ末端の５０残基のアミノ酸からなるアミノ酸配列と同一であり、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＣ末端から２０残基取り除いたアミノ酸配列と同一であり、配列番号３に示されるアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＣ末端から２９残基取り除いたアミノ酸配列と同一である。
　第１の改変フィブロインのより具体的な例として、（１－ｉ）配列番号４（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｓｐｉｄｅｒ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＡＤＦ３ＫａｉＬａｒｇｅＮＲＳＨ１）で示されるアミノ酸配列、又は（１－ｉｉ）配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　配列番号４で示されるアミノ酸配列は、Ｎ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎ　ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ　３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号５）を付加したＡＤＦ３のアミノ酸配列において、第１～１３番目の反復領域をおよそ２倍になるように増やすとともに、翻訳が第１１５４番目アミノ酸残基で終止するように変異させたものである。配列番号４で示されるアミノ酸配列のＣ末端のアミノ酸配列は、配列番号３で示されるアミノ酸配列と同一である。
　（１－ｉ）の改変フィブロインは、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　第２の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、グリシン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有する。第２の改変フィブロインは、天然由来のフィブロインと比較して、少なくともＲＥＰ中の１又は複数のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有するものということができる。
　第２の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中のＧＧＸ及びＧＰＧＸＸ（但し、Ｇはグリシン残基、Ｐはプロリン残基、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）から選ばれる少なくとも一つのモチーフ配列において、少なくとも１又は複数の当該モチーフ配列中の１つのグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
　第２の改変フィブロインは、上述のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたモチーフ配列の割合が、全モチーフ配列に対して、１０％以上であってもよい。
　第２の改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含み、上記ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列中の全ＲＥＰに含まれるＸＧＸ（但し、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をｚとし、上記ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列中の総アミノ酸残基数をｗとしたときに、ｚ／ｗが３０％以上、４０％以上、５０％以上又は５０．９％以上であるアミノ酸配列を有するものであってもよい。（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数は８３％以上であってよいが、８６％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることが更に好ましく、１００％であること（アラニン残基のみで構成されることを意味する）が更により好ましい。
　第２の改変フィブロインは、ＧＧＸモチーフの１つのグリシン残基を別のアミノ酸残基に置換することにより、ＸＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合を高めたものであることが好ましい。第２の改変フィブロインは、ドメイン配列中のＧＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合が３０％以下であることが好ましく、２０％以下であることがより好ましく、１０％以下であることが更に好ましく、６％以下であることが更により好ましく、４％以下であることが更によりまた好ましく、２％以下であることが特に好ましい。ドメイン配列中のＧＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合は、下記ＸＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合（ｚ／ｗ）の算出方法と同様の方法で算出することができる。
　ｚ／ｗの算出方法を更に詳細に説明する。まず、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むフィブロイン（改変フィブロイン又は天然由来のフィブロイン）において、ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列に含まれる全てのＲＥＰから、ＸＧＸからなるアミノ酸配列を抽出する。ＸＧＸを構成するアミノ酸残基の総数がｚである。例えば、ＸＧＸからなるアミノ酸配列が５０個抽出された場合（重複はなし）、ｚは５０×３＝１５０である。例えば、ＸＧＸＧＸからなるアミノ酸配列の場合のように２つのＸＧＸに含まれるＸ（中央のＸ）が存在する場合は、重複分を控除して計算する（ＸＧＸＧＸの場合は５アミノ酸残基である）。ｗは、ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列に含まれる総アミノ酸残基数である。例えば、図１に示したドメイン配列の場合、ｗは４＋５０＋４＋１００＋４＋１０＋４＋２０＋４＋３０＝２３０である（最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフは除いている。）。次に、ｚをｗで除すことによって、ｚ／ｗ（％）を算出することができる。
　ここで、天然由来のフィブロインにおけるｚ／ｗについて説明する。まず、上述のように、ＮＣＢＩ　ＧｅｎＢａｎｋにアミノ酸配列情報が登録されているフィブロインを例示した方法により確認したところ、６６３種類のフィブロイン（このうち、クモ類由来のフィブロインは４１５種類）が抽出された。抽出された全てのフィブロインのうち、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含み、フィブロイン中のＧＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合が６％以下である天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から、上述の算出方法により、ｚ／ｗを算出した。その結果を図２に示す。図２の横軸はｚ／ｗ（％）を示し、縦軸は頻度を示す。図２から明らかなとおり、天然由来のフィブロインにおけるｚ／ｗは、いずれも５０．９％未満である（最も高いもので、５０．８６％）。
　第２の改変フィブロインにおいて、ｚ／ｗは、５０．９％以上であることが好ましく、５６．１％以上であることがより好ましく、５８．７％以上であることが更に好ましく、７０％以上であることが更により好ましく、８０％以上であることが更によりまた好ましい。ｚ／ｗの上限に特に制限はないが、例えば、９５％以下であってもよい。
　第２の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列から、グリシン残基をコードする塩基配列の少なくとも一部を置換して別のアミノ酸残基をコードするように改変することにより得ることができる。このとき、改変するグリシン残基として、ＧＧＸモチーフ及びＧＰＧＸＸモチーフにおける１つのグリシン残基を選択してもよいし、ｚ／ｗが５０．９％以上になるように置換してもよい。例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から上記態様を満たすアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中のグリシン残基を別のアミノ酸残基に置換したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。
　上記の別のアミノ酸残基としては、グリシン残基以外のアミノ酸残基であれば特に制限はないが、バリン（Ｖ）残基、ロイシン（Ｌ）残基、イソロイシン（Ｉ）残基、メチオニン（Ｍ）残基、プロリン（Ｐ）残基、フェニルアラニン（Ｆ）残基及びトリプトファン（Ｗ）残基等の疎水性アミノ酸残基、グルタミン（Ｑ）残基、アスパラギン（Ｎ）残基、セリン（Ｓ）残基、リシン（Ｋ）残基及びグルタミン酸（Ｅ）残基等の親水性アミノ酸残基が好ましく、バリン（Ｖ）残基、ロイシン（Ｌ）残基、イソロイシン（Ｉ）残基、フェニルアラニン（Ｆ）残基及びグルタミン（Ｑ）残基がより好ましく、グルタミン（Ｑ）残基が更に好ましい。
　第２の改変フィブロインのより具体的な例として、（２－ｉ）配列番号６（Ｍｅｔ－ＰＲＴ３８０）、配列番号７（Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０）、配列番号８（Ｍｅｔ－ＰＲＴ５２５）若しくは配列番号９（Ｍｅｔ－ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又は（２－ｉｉ）配列番号６、配列番号７、配列番号８若しくは配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
　（２－ｉ）の改変フィブロインについて説明する。配列番号６で示されるアミノ酸配列は、天然由来のフィブロインに相当する配列番号１０（Ｍｅｔ－ＰＲＴ３１３）で示されるアミノ酸配列のＲＥＰ中の全てのＧＧＸをＧＱＸに置換したものである。配列番号７で示されるアミノ酸配列は、配列番号６で示されるアミノ酸配列から、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）ｎモチーフを欠失させ、更にＣ末端配列の手前に［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］を１つ挿入したものである。配列番号８で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列の各（Ａ）ｎモチーフのＣ末端側に２つのアラニン残基を挿入し、更に一部のグルタミン（Ｑ）残基をセリン（Ｓ）残基に置換し、配列番号７の分子量とほぼ同じとなるようにＣ末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。配列番号９で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中に存在する２０個のドメイン配列の領域（但し、当該領域のＣ末端側の数アミノ酸残基が置換されている。）を４回繰り返した配列のＣ末端に所定のヒンジ配列とＨｉｓタグ配列が付加されたものである。
　配列番号１０で示されるアミノ酸配列（天然由来のフィブロインに相当）におけるｚ／ｗの値は、４６．８％である。配列番号６で示されるアミノ酸配列、配列番号７で示されるアミノ酸配列、配列番号８で示されるアミノ酸配列、及び配列番号９で示されるアミノ酸配列におけるｚ／ｗの値は、それぞれ５８．７％、７０．１％、６６．１％及び７０．０％である。配列番号１０、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９で示されるアミノ酸配列のギザ比率（後述する）１：１．８～１１．３におけるｘ／ｙの値は、それぞれ１５．０％、１５．０％、９３．４％、９２．７％及び８９．８％である。
　（２－ｉ）の改変フィブロインは、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　（２－ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（２－ｉｉ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　（２－ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＲＥＰ中に含まれるＸＧＸ（但し、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をｚとし、上記ドメイン配列中のＲＥＰの総アミノ酸残基数をｗとしたときに、ｚ／ｗが５０．９％以上であることが好ましい。
　第２の改変フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。これにより、改変フィブロインの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。
　タグ配列として、例えば、他の分子との特異的親和性（結合性、アフィニティ）を利用したアフィニティタグを挙げることができる。アフィニティタグの具体例として、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を挙げることができる。Ｈｉｓタグは、ヒスチジン残基が４から１０個程度並んだ短いペプチドで、ニッケル等の金属イオンと特異的に結合する性質があるため、金属キレートクロマトグラフィー（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ　ｍｅｔａｌ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）による改変フィブロインの単離に利用することができる。タグ配列の具体例として、例えば、配列番号１１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含むアミノ酸配列）が挙げられる。
　タグ配列として、グルタチオンに特異的に結合するグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースに特異的に結合するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）等のタグ配列を利用することもできる。
　タグ配列として、抗原抗体反応を利用した「エピトープタグ」を利用することもできる。抗原性を示すペプチド（エピトープ）をタグ配列として付加することにより、当該エピトープに対する抗体を結合させることができる。エピトープタグとして、ＨＡ（インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのペプチド配列）タグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ等を挙げることができる。エピトープタグを利用することにより、高い特異性で容易に改変フィブロインを精製することができる。
　タグ配列を特定のプロテアーゼで切り離せるようにしたものもタグ配列として使用することができる。当該タグ配列を介して吸着したタンパク質をプロテアーゼ処理することにより、タグ配列を切り離した改変フィブロインを回収することもできる。
　タグ配列を含む改変フィブロインのより具体的な例として、（２－ｉｉｉ）配列番号１２（ＰＲＴ３８０）、配列番号１３（ＰＲＴ４１０）、配列番号１４（ＰＲＴ５２５）若しくは配列番号１５（ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又は（２－ｉｖ）配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４若しくは配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
　配列番号１６（ＰＲＴ３１３）、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１０、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。
　（２－ｉｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　（２－ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（２－ｉｖ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　（２－ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＲＥＰ中に含まれるＸＧＸ（但し、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をｚとし、上記ドメイン配列中のＲＥＰの総アミノ酸残基数をｗとしたときに、ｚ／ｗが５０．９％以上であることが好ましい。
　第２の改変フィブロインは、人工タンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
　第３の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減されたアミノ酸配列を有する。第３の改変フィブロインのドメイン配列は、天然由来のフィブロインと比較して、少なくとも１又は複数の（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有するものということができる。
　第３の改変フィブロインは、天然由来のフィブロインから（Ａ）ｎモチーフを１０～４０％欠失させたことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
　第３の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、少なくともＮ末端側からＣ末端側に向かって１～３つの（Ａ）ｎモチーフ毎に１つの（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
　第３の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、少なくともＮ末端側からＣ末端側に向かって２つ連続した（Ａ）ｎモチーフの欠失、及び１つの（Ａ）ｎモチーフの欠失がこの順に繰り返されたことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
　第３の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、少なくともＮ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
　第３の改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含み、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットのＲＥＰのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないＲＥＰのアミノ酸残基数を１としたとき、他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比が１．８～１１．３となる隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値をｘとし、ドメイン配列の総アミノ酸残基数をｙとしたときに、ｘ／ｙが２０％以上、３０％以上、４０％以上又は５０％以上であるアミノ酸配列を有するものであってもよい。（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数は８３％以上であってよいが、８６％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることが更に好ましく、１００％であること（アラニン残基のみで構成されることを意味する）が更により好ましい。
　ｘ／ｙの算出方法を図１を参照しながら更に詳細に説明する。図１には、改変フィブロインからＮ末端配列及びＣ末端配列を除いたドメイン配列を示す。当該ドメイン配列は、Ｎ末端側（左側）から（Ａ）ｎモチーフ－第１のＲＥＰ（５０アミノ酸残基）－（Ａ）ｎモチーフ－第２のＲＥＰ（１００アミノ酸残基）－（Ａ）ｎモチーフ－第３のＲＥＰ（１０アミノ酸残基）－（Ａ）ｎモチーフ－第４のＲＥＰ（２０アミノ酸残基）－（Ａ）ｎモチーフ－第５のＲＥＰ（３０アミノ酸残基）－（Ａ）ｎモチーフという配列を有する。
　隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットは、重複がないように、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、順次選択する。このとき、選択されない［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットが存在してもよい。図１には、パターン１（第１のＲＥＰと第２のＲＥＰの比較、及び第３のＲＥＰと第４のＲＥＰの比較）、パターン２（第１のＲＥＰと第２のＲＥＰの比較、及び第４のＲＥＰと第５のＲＥＰの比較）、パターン３（第２のＲＥＰと第３のＲＥＰの比較、及び第４のＲＥＰと第５のＲＥＰの比較）、パターン４（第１のＲＥＰと第２のＲＥＰの比較）を示した。なお、これ以外にも選択方法は存在する。
　次に各パターンについて、選択した隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニット中の各ＲＥＰのアミノ酸残基数を比較する。比較は、よりアミノ酸残基数の少ない方を１としたときの、他方のアミノ酸残基数の比を求めることによって行う。例えば、第１のＲＥＰ（５０アミノ酸残基）と第２のＲＥＰ（１００アミノ酸残基）の比較の場合、よりアミノ酸残基数の少ない第１のＲＥＰを１としたとき、第２のＲＥＰのアミノ酸残基数の比は、１００／５０＝２である。同様に、第４のＲＥＰ（２０アミノ酸残基）と第５のＲＥＰ（３０アミノ酸残基）の比較の場合、よりアミノ酸残基数の少ない第４のＲＥＰを１としたとき、第５のＲＥＰのアミノ酸残基数の比は、３０／２０＝１．５である。
　図１中、よりアミノ酸残基数の少ない方を１としたときに、他方のアミノ酸残基数の比が１．８～１１．３となる［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットの組を実線で示した。本明細書中、この比をギザ比率と呼ぶ。よりアミノ酸残基数の少ない方を１としたときに、他方のアミノ酸残基数の比が１．８未満又は１１．３超となる［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットの組は破線で示した。
　各パターンにおいて、実線で示した隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットの全てのアミノ酸残基数を足し合わせる（ＲＥＰのみではなく、（Ａ）ｎモチーフのアミノ酸残基数もである。）。そして、足し合わせた合計値を比較して、当該合計値が最大となるパターンの合計値（合計値の最大値）をｘとする。図１に示した例では、パターン１の合計値が最大である。
　次に、ｘをドメイン配列の総アミノ酸残基数ｙで除すことによって、ｘ／ｙ（％）を算出することができる。
　第３の改変フィブロインにおいて、ｘ／ｙは、５０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、６５％以上であることが更に好ましく、７０％以上であることが更により好ましく、７５％以上であることが更によりまた好ましく、８０％以上であることが特に好ましい。ｘ／ｙの上限に特に制限はなく、例えば、１００％以下であってよい。ギザ比率が１：１．９～１１．３の場合には、ｘ／ｙは８９．６％以上であることが好ましく、ギザ比率が１：１．８～３．４の場合には、ｘ／ｙは７７．１％以上であることが好ましく、ギザ比率が１：１．９～８．４の場合には、ｘ／ｙは７５．９％以上であることが好ましく、ギザ比率が１：１．９～４．１の場合には、ｘ／ｙは６４．２％以上であることが好ましい。
　第３の改変フィブロインが、ドメイン配列中に複数存在する（Ａ）ｎモチーフの少なくとも７つがアラニン残基のみで構成される改変フィブロインである場合、ｘ／ｙは、４６．４％以上であることが好ましく、５０％以上であることがより好ましく、５５％以上であることが更に好ましく、６０％以上であることが更により好ましく、７０％以上であることが更によりまた好ましく、８０％以上であることが特に好ましい。ｘ／ｙの上限に特に制限はなく、１００％以下であればよい。
　ここで、天然由来のフィブロインにおけるｘ／ｙについて説明する。まず、上述のように、ＮＣＢＩ　ＧｅｎＢａｎｋにアミノ酸配列情報が登録されているフィブロインを例示した方法により確認したところ、６６３種類のフィブロイン（このうち、クモ類由来のフィブロインは４１５種類）が抽出された。抽出された全てのフィブロインのうち、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列で構成される天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から、上述の算出方法により、ｘ／ｙを算出した。ギザ比率が１：１．９～４．１の場合の結果を図３に示す。
　図３の横軸はｘ／ｙ（％）を示し、縦軸は頻度を示す。図３から明らかなとおり、天然由来のフィブロインにおけるｘ／ｙは、いずれも６４．２％未満である（最も高いもので、６４．１４％）。
　第３の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列から、ｘ／ｙが６４．２％以上になるように（Ａ）ｎモチーフをコードする配列の１又は複数を欠失させることにより得ることができる。例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から、ｘ／ｙが６４．２％以上になるように１又は複数の（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。
　第３の改変フィブロインのより具体的な例として、（３－ｉ）配列番号１７（Ｍｅｔ－ＰＲＴ３９９）、配列番号７（Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０）、配列番号８（Ｍｅｔ－ＰＲＴ５２５）若しくは配列番号９（Ｍｅｔ－ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又は（３－ｉｉ）配列番号１７、配列番号７、配列番号８若しくは配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
　（３－ｉ）の改変フィブロインについて説明する。配列番号１７で示されるアミノ酸配列は、天然由来のフィブロインに相当する配列番号１０（Ｍｅｔ－ＰＲＴ３１３）で示されるアミノ酸配列から、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）ｎモチーフを欠失させ、更にＣ末端配列の手前に［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］を１つ挿入したものである。配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列は、第２の改変フィブロインで説明したとおりである。
　配列番号１０で示されるアミノ酸配列（天然由来のフィブロインに相当）のギザ比率１：１．８～１１．３におけるｘ／ｙの値は１５．０％である。配列番号１７で示されるアミノ酸配列、及び配列番号７で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙの値は、いずれも９３．４％である。配列番号８で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙの値は、９２．７％である。配列番号９で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙの値は、８９．８％である。配列番号１０、配列番号１７、配列番号７、配列番号８及び配列番号９で示されるアミノ酸配列におけるｚ／ｗの値は、それぞれ４６．８％、５６．２％、７０．１％、６６．１％及び７０．０％である。
　（３－ｉ）の改変フィブロインは、配列番号１７、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　（３－ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１７、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（３－ｉｉ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　（３－ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１７、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＮ末端側からＣ末端側に向かって、隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットのＲＥＰのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないＲＥＰのアミノ酸残基数を１としたとき、他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比が１．８～１１．３（ギザ比率が１：１．８～１１．３）となる隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値をｘとし、ドメイン配列の総アミノ酸残基数をｙとしたときに、ｘ／ｙが６４．２％以上であることが好ましい。
　第３の改変フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方に上述したタグ配列を含んでいてもよい。
　タグ配列を含む改変フィブロインのより具体的な例として、（３－ｉｉｉ）配列番号１８（ＰＲＴ３９９）、配列番号１３（ＰＲＴ４１０）、配列番号１４（ＰＲＴ５２５）若しくは配列番号１５（ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又は（３－ｉｖ）配列番号１８、配列番号１３、配列番号１４若しくは配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
　配列番号１８、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１７、配列番号７、配列番号８及び配列番号９で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。
　（３－ｉｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１８、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　（３－ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号１８、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（３－ｉｖ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　（３－ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号１８、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＮ末端側からＣ末端側に向かって、隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットのＲＥＰのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないＲＥＰのアミノ酸残基数を１としたとき、他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比が１．８～１１．３となる隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値をｘとし、ドメイン配列の総アミノ酸残基数をｙとしたときに、ｘ／ｙが６４．２％以上であることが好ましい。
　第３の改変フィブロインは、人工タンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
　第４の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減されたことに加え、グリシン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有するものである。第４の改変フィブロインのドメイン配列は、天然由来のフィブロインと比較して、少なくとも１又は複数の（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに加え、更に少なくともＲＥＰ中の１又は複数のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有するものということができる。すなわち、第４の改変フィブロインは、上述した第２の改変フィブロインと、第３の改変フィブロインの特徴を併せ持つ改変フィブロインである。具体的な態様等は、第２の改変フィブロイン、及び第３の改変フィブロインで説明したとおりである。
　第４の改変フィブロインのより具体的な例として、（４－ｉ）配列番号７（Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０）、配列番号８（Ｍｅｔ－ＰＲＴ５２５）、配列番号９（Ｍｅｔ－ＰＲＴ７９９）、配列番号１３（ＰＲＴ４１０）、配列番号１４（ＰＲＴ５２５）若しくは配列番号１５（ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又は（４－ｉｉ）配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１３、配列番号１４若しくは配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含む改変フィブロインの具体的な態様は上述のとおりである。
　第５の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むアミノ酸配列を有するものであってよい。
　局所的に疎水性指標の大きい領域は、連続する２～４アミノ酸残基で構成されていることが好ましい。
　上述の疎水性指標の大きいアミノ酸残基は、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）及びアラニン（Ａ）から選ばれるアミノ酸残基であることがより好ましい。
　第５の改変フィブロインは、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する改変に加え、更に、天然由来のフィブロインと比較して、１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変があってもよい。
　第５の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列からＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がマイナスであるアミノ酸残基）を疎水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がプラスであるアミノ酸残基）に置換すること、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入することにより得ることができる。例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基を疎水性アミノ酸残基に置換したこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基を疎水性アミノ酸残基に置換したこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。
　第５の改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含み、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を上記ドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域に含まれるアミノ酸残基の総数をｐとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を上記ドメイン配列から除いた配列に含まれるアミノ酸残基の総数をｑとしたときに、ｐ／ｑが６．２％以上であるアミノ酸配列を有してもよい。
　アミノ酸残基の疎水性指標については、公知の指標（Ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ　ｉｎｄｅｘ：Ｋｙｔｅ　Ｊ，＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ　Ｒ（１９８２）“Ａ　ｓｉｍｐｌｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ　ｔｈｅ　ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ　ｃｈａｒａｃｔｅｒ　ｏｆ　ａ　ｐｒｏｔｅｉｎ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７，ｐｐ．１０５－１３２）を使用する。具体的には、各アミノ酸の疎水性指標（ハイドロパシー・インデックス、以下「ＨＩ」とも記す。）は、下記表１に示すとおりである。
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　ｐ／ｑの算出方法を更に詳細に説明する。算出には、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列（以下、「配列Ａ」とする）を用いる。まず、配列Ａに含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値を算出する。疎水性指標の平均値は、連続する４アミノ酸残基に含まれる各アミノ酸残基のＨＩの総和を４（アミノ酸残基数）で除して求める。疎水性指標の平均値は、全ての連続する４アミノ酸残基について求める（各アミノ酸残基は、１～４回平均値の算出に用いられる。）。次いで、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域を特定する。あるアミノ酸残基が、複数の「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」に該当する場合であっても、領域中には１アミノ酸残基として含まれることになる。当該領域に含まれるアミノ酸残基の総数がｐである。配列Ａに含まれるアミノ酸残基の総数がｑである。
　例えば、「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」が２０カ所抽出された場合（重複はなし）、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域には、連続する４アミノ酸残基（重複はなし）が２０含まれることになり、ｐは２０×４＝８０である。例えば、２つの「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」が１アミノ酸残基だけ重複して存在する場合、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域には、７アミノ酸残基含まれることになる（ｐ＝２×４－１＝７。「－１」は重複分の控除である。）。例えば、図４に示したドメイン配列の場合、「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」が重複せずに７つ存在するため、ｐは７×４＝２８となる。例えば、図４に示したドメイン配列の場合、ｑは４＋５０＋４＋４０＋４＋１０＋４＋２０＋４＋３０＝１７０である（Ｃ末端側の最後に存在する（Ａ）ｎモチーフは含めない）。次に、ｐをｑで除すことによって、ｐ／ｑ（％）を算出することができる。図４の場合２８／１７０＝１６．４７％となる。
　第５の改変フィブロインにおいて、ｐ／ｑは、６．２％以上であることが好ましく、７％以上であることがより好ましく、１０％以上であることが更に好ましく、２０％以上であることが更により好ましく、３０％以上であることが更によりまた好ましい。ｐ／ｑの上限は、特に制限されないが、例えば、４５％以下であってもよい。
　第５の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインのアミノ酸配列を、上記のｐ／ｑの条件を満たすように、ＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がマイナスであるアミノ酸残基）を疎水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がプラスであるアミノ酸残基）に置換すること、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入することにより、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むアミノ酸配列に改変することにより得ることができる。例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から上記のｐ／ｑの条件を満たすアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当する改変を行ってもよい。
　疎水性指標の大きいアミノ酸残基としては、特に制限はないが、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）及びアラニン（Ａ）が好ましく、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）及びイソロイシン（Ｉ）がより好ましい。
　第５の改変フィブロインのより具体的な例として、（５－ｉ）配列番号１９（Ｍｅｔ－ＰＲＴ７２０）、配列番号２０（Ｍｅｔ－ＰＲＴ６６５）若しくは配列番号２１（Ｍｅｔ－ＰＲＴ６６６）で示されるアミノ酸配列、又は（５－ｉｉ）配列番号１９、配列番号２０若しくは配列番号２１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
　（５－ｉ）の改変フィブロインについて説明する。配列番号１９で示されるアミノ酸配列は、配列番号７（Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０）で示されるアミノ酸配列に対し、Ｃ末端側の端末のドメイン配列を除いて、ＲＥＰ一つ置きにそれぞれ３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（ＶＬＩ）を２カ所挿入し、更に一部のグルタミン（Ｑ）残基をセリン（Ｓ）残基に置換し、かつＣ末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。配列番号２０で示されるアミノ酸配列は、配列番号８（Ｍｅｔ－ＰＲＴ５２５）で示されるアミノ酸配列に対し、ＲＥＰ一つ置きにそれぞれ３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（ＶＬＩ）を１カ所挿入したものである。配列番号２１で示されるアミノ酸配列は、配列番号８で示されるアミノ酸配列に対し、ＲＥＰ一つ置きにそれぞれ３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（ＶＬＩ）を２カ所挿入したものである。
　（５－ｉ）の改変フィブロインは、配列番号１９、配列番号２０又は配列番号２１で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　（５－ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１９、配列番号２０又は配列番号２１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（５－ｉｉ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　（５－ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１９、配列番号２０又は配列番号２１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域に含まれるアミノ酸残基の総数をｐとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれるアミノ酸残基の総数をｑとしたときに、ｐ／ｑが６．２％以上であることが好ましい。
　第５の改変フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。
　タグ配列を含む改変フィブロインのより具体的な例として、（５－ｉｉｉ）配列番号２２（ＰＲＴ７２０）、配列番号２３（ＰＲＴ６６５）若しくは配列番号２４（ＰＲＴ６６６）で示されるアミノ酸配列、又は（５－ｉｖ）配列番号２２、配列番号２３若しくは配列番号２４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
　配列番号２２、配列番号２３及び配列番号２４で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。
　（５－ｉｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号２２、配列番号２３又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　（５－ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号２２、配列番号２３又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（５－ｉｖ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　（５－ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号２２、配列番号２３又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域に含まれるアミノ酸残基の総数をｐとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれるアミノ酸残基の総数をｑとしたときに、ｐ／ｑが６．２％以上であることが好ましい。
　第５の改変フィブロインは、人工タンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
　第６の改変フィブロインは、天然由来のフィブロインと比較して、グルタミン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有する。
　第６の改変フィブロインは、ＲＥＰのアミノ酸配列中に、ＧＧＸモチーフ及びＧＰＧＸＸモチーフから選ばれる少なくとも一つのモチーフが含まれていることが好ましい。
　第６の改変フィブロインが、ＲＥＰ中にＧＰＧＸＸモチーフを含む場合、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率は、通常１％以上であり、５％以上であってもよく、１０％以上であるのが好ましい。ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の上限に特に制限はなく、５０％以下であってよく、３０％以下であってもよい。
　本明細書において、「ＧＰＧＸＸモチーフ含有率」は、以下の方法により算出される値である。
　式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロイン（改変フィブロイン又は天然由来のフィブロイン）において、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、その領域に含まれるＧＰＧＸＸモチーフの個数の総数を３倍した数（即ち、ＧＰＧＸＸモチーフ中のＧ及びＰの総数に相当）をｓとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除き、更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｔとしたときに、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率はｓ／ｔとして算出される。
　ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出において、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としているのは、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列」（ＲＥＰに相当する配列）には、フィブロインに特徴的な配列と相関性の低い配列が含まれることがあり、ｍが小さい場合（つまり、ドメイン配列が短い場合）、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出結果に影響するので、この影響を排除するためである。ＲＥＰのＣ末端に「ＧＰＧＸＸモチーフ」が位置する場合、「ＸＸ」が例えば「ＡＡ」の場合であっても、「ＧＰＧＸＸモチーフ」として扱う。
　図５は、改変フィブロインのドメイン配列を示す模式図である。図５を参照しながらＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出方法を具体的に説明する。まず、図５に示した改変フィブロインのドメイン配列（「［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフ」タイプである。）では、全てのＲＥＰが「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」（図５中、「領域Ａ」で示した配列。）に含まれているため、ｓを算出するためのＧＰＧＸＸモチーフの個数は７であり、ｓは７×３＝２１となる。同様に、全てのＲＥＰが「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」（図５中、「領域Ａ」で示した配列。）に含まれているため、当該配列から更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数ｔは５０＋４０＋１０＋２０＋３０＝１５０である。次に、ｓをｔで除すことによって、ｓ／ｔ（％）を算出することができ、図５の改変フィブロインの場合２１／１５０＝１４．０％となる。
　第６の改変フィブロインは、グルタミン残基含有率が９％以下であることが好ましく、７％以下であることがより好ましく、４％以下であることが更に好ましく、０％であることが特に好ましい。
　本明細書において、「グルタミン残基含有率」は、以下の方法により算出される値である。
　式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロイン（改変フィブロイン又は天然由来のフィブロイン）において、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列（図５の「領域Ａ」に相当する配列。）に含まれる全てのＲＥＰにおいて、その領域に含まれるグルタミン残基の総数をｕとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除き、更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｔとしたときに、グルタミン残基含有率はｕ／ｔとして算出される。グルタミン残基含有率の算出において、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としている理由は、上述した理由と同様である。
　第６の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、又は他のアミノ酸残基に置換したことに相当するアミノ酸配列を有するものであってよい。
　「他のアミノ酸残基」は、グルタミン残基以外のアミノ酸残基であればよいが、グルタミン残基よりも疎水性指標の大きいアミノ酸残基であることが好ましい。アミノ酸残基の疎水性指標は表１に示すとおりである。
　表１に示すとおり、グルタミン残基よりも疎水性指標の大きいアミノ酸残基としては、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、プロリン（Ｐ）及びヒスチジン（Ｈ）から選ばれるアミノ酸残基を挙げることができる。これらの中でも、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）及びアラニン（Ａ）から選ばれるアミノ酸残基であることがより好ましく、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）及びフェニルアラニン（Ｆ）から選ばれるアミノ酸残基であることが更に好ましい。
　第６の改変フィブロインは、ＲＥＰの疎水性度（ハイドロパシー・インデックス）が、例えば、－０．８０以上、－０．７０、－０．６０以上、－０．５０以上、－０．４０以上、－０．３０以上、－０．２０以上、－０．１０以上、０．００以上、０．１０以上、０．２０以上、０．２２以上、０．２５以上、０．３０以上、０．３５以上、０．４０以上、０．４５以上、０．５０以上、０．５５以上、０．６０以上、０．６５以上、又は０．７０以上であってよい。ＲＥＰの疎水性度の上限に特に制限はなく、１．０以下であってよく、０．７以下であってもよい。
　本明細書において、「ＲＥＰの疎水性度」は、以下の方法により算出される値である。
　式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロイン（改変フィブロイン又は天然由来のフィブロイン）において、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列（図５の「領域Ａ」に相当する配列。）に含まれる全てのＲＥＰにおいて、その領域の各アミノ酸残基の疎水性指標の総和をｖとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除き、更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｔとしたときに、ＲＥＰの疎水性度はｖ／ｔとして算出される。ＲＥＰの疎水性度の算出において、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としている理由は、上述した理由と同様である。
　第６の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、及び／又はＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変があってもよい。
　第６の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列からＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失させること、及び／又はＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換することにより得ることができる。例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、及び／又はＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。
　第６の改変フィブロインのより具体的な例として、（６－ｉ）配列番号２５（Ｍｅｔ－ＰＲＴ８８８）、配列番号２６（Ｍｅｔ－ＰＲＴ９６５）、配列番号２７（Ｍｅｔ－ＰＲＴ８８９）、配列番号２８（Ｍｅｔ－ＰＲＴ９１６）、配列番号２９（Ｍｅｔ－ＰＲＴ９１８）、配列番号３０（Ｍｅｔ－ＰＲＴ６９９）、配列番号３１（Ｍｅｔ－ＰＲＴ６９８）、配列番号３２（Ｍｅｔ－ＰＲＴ９６６）、配列番号４１（Ｍｅｔ－ＰＲＴ９１７）若しくは配列番号４２（Ｍｅｔ－ＰＲＴ１０２８）で示されるアミノ酸配列を含む改変フィブロイン、又は（６－ｉｉ）配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号４１若しくは配列番号４２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変フィブロインを挙げることができる。
　（６－ｉ）の改変フィブロインについて説明する。配列番号２５で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０）中のＱＱを全てＶＬに置換したものである。配列番号２６で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＴＳに置換し、かつ残りのＱをＡに置換したものである。配列番号２７で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＶＬに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。配列番号２８で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＶＩに置換し、かつ残りのＱをＬに置換したものである。配列番号２９で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＶＦに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。
　配列番号３０で示されるアミノ酸配列は、配列番号８で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ－ＰＲＴ５２５）中のＱＱを全てＶＬに置換したものである。配列番号３１で示されるアミノ酸配列は、配列番号８で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＶＬに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。
　配列番号３２で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０）中に存在する２０個のドメイン配列の領域を２回繰り返した配列中のＱＱを全てＶＦに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。
　配列番号４１で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ－ＰＲＴ９１７）は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＬＩに置換し、かつ残りのＱをＶに置換したものである。配列番号４２で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ－ＰＲＴ１０２８）は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＩＦに置換し、かつ残りのＱをＴに置換したものである。
　配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号４１及び配列番号４２で示されるアミノ酸配列は、いずれもグルタミン残基含有率は９％以下である（表２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000061
　（６－ｉ）の改変フィブロインは、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号４１又は配列番号４２で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　（６－ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号４１又は配列番号４２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（６－ｉｉ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　（６－ｉｉ）の改変フィブロインは、グルタミン残基含有率が９％以下であることが好ましい。（６－ｉｉ）の改変フィブロインは、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率が１０％以上であることが好ましい。
　第６の改変フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。これにより、改変フィブロインの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。
　タグ配列を含む改変フィブロインのより具体的な例として、（６－ｉｉｉ）配列番号３３（ＰＲＴ８８８）、配列番号３４（ＰＲＴ９６５）、配列番号３５（ＰＲＴ８８９）、配列番号３６（ＰＲＴ９１６）、配列番号３７（ＰＲＴ９１８）、配列番号３８（ＰＲＴ６９９）、配列番号３９（ＰＲＴ６９８）、配列番号４０（ＰＲＴ９６６）、配列番号４３（ＰＲＴ９１７）若しくは配列番号４４（ＰＲＴ１０２８）で示されるアミノ酸配列を含む改変フィブロイン、又は（６－ｉｖ）配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４３若しくは配列番号４４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変フィブロインを挙げることができる。
　配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４３及び配列番号４４で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号４１及び配列番号４２で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。Ｎ末端にタグ配列を付加しただけであるため、グルタミン残基含有率に変化はなく、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４３及び配列番号４４で示されるアミノ酸配列は、いずれもグルタミン残基含有率が９％以下である（表３）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000062
　（６－ｉｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４３又は配列番号４４で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
　（６－ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４３又は配列番号４４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（６－ｉｖ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
　（６－ｉｖ）の改変フィブロインは、グルタミン残基含有率が９％以下であることが好ましい。（６－ｉｖ）の改変フィブロインは、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率が１０％以上であることが好ましい。
　第６の改変フィブロインは、人工タンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
　改変フィブロインは、第１の改変フィブロイン、第２の改変フィブロイン、第３の改変フィブロイン、第４の改変フィブロイン、第５の改変フィブロイン、及び第６の改変フィブロインが有する特徴のうち、少なくとも２つ以上の特徴を併せ持つ改変フィブロインであってもよい。
　本実施形態に係る改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質であってよい。改変フィブロインは、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側のいずれか一方又は両方に更にアミノ酸配列（Ｎ末端配列及びＣ末端配列）が付加されていてもよい。Ｎ末端配列及びＣ末端配列は、これに限定されるものではないが、典型的には、フィブロインに特徴的なアミノ酸モチーフの反復を有さない領域であり、１００残基程度のアミノ酸からなる。
　本明細書において「ドメイン配列」とは、フィブロイン特有の結晶領域（典型的には、アミノ酸配列の（Ａ）ｎモチーフに相当する。）と非晶領域（典型的には、アミノ酸配列のＲＥＰに相当する。）を生じるアミノ酸配列であり、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるアミノ酸配列を意味する。ここで、（Ａ）ｎモチーフは４～２７アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示し、かつ（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数が８０％以上である。ＲＥＰは１０～２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ｍは１０～３００の整数を示す。ｍは、２０～３００の整数であることが好ましく、３０～３００の整数であることがより好ましい。複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。
　ドメイン配列中に複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、少なくとも７つがアラニン残基のみで構成されることが好ましい。アラニン残基のみで構成されるとは、（Ａ）ｎモチーフが、（Ａｌａ）ｋ（Ａｌａはアラニン残基を示す。）で表されるアミノ酸配列を有することを意味する。ｋは、好ましくは４～２７の整数、より好ましくは４～２０の整数、更に好ましくは４～１６の整数を示す。
　ＲＥＰは、１０～２００アミノ酸残基から構成される。ＲＥＰを構成するアミノ酸残基の１以上が、グリシン残基、セリン残基、及びアラニン残基からなる群より選択されるアミノ酸残基であってよい。すなわち、ＲＥＰは、グリシン残基、セリン残基、及びアラニン残基からなる群より選択されるアミノ酸残基を含んでいてよい。
　ＲＥＰを構成するアミノ酸残基の１以上が、疎水性アミノ酸残基であってよい。すなわち、ＲＥＰは、疎水性アミノ酸残基を含んでいることが好ましい。疎水性アミノ酸残基とは、疎水性指標がプラスであるアミノ酸残基を意味する。アミノ酸残基の疎水性指標（ハイドロパシー・インデックス、以下「ＨＩ」とも記す。）については、公知の指標公知の指標（Ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ　ｉｎｄｅｘ：Ｋｙｔｅ　Ｊ，＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ　Ｒ（１９８２）“Ａ　ｓｉｍｐｌｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ　ｔｈｅ　ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ　ｃｈａｒａｃｔｅｒ　ｏｆ　ａ　ｐｒｏｔｅｉｎ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７，ｐｐ．１０５－１３２）を使用する。疎水性アミノ酸残基としては、例えば、イソロイシン（ＨＩ：４．５）、バリン（ＨＩ：４．２）、ロイシン（ＨＩ：３．８）、フェニルアラニン（ＨＩ：２．８）、メチオニン（ＨＩ：１．９）、アラニン（ＨＩ：１．８）が挙げられる。
　本実施形態に係る改変フィブロインにおいて、ドメイン配列は、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中にシステイン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有することが好ましい。
　ドメイン配列は、ＲＥＰ中のグリシン残基、セリン残基、又はアラニン残基と隣り合う位置に、システイン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有していることが好ましく、ＲＥＰ中のグリシン残基と隣り合う位置に、システイン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有していることがより好ましい。ＲＥＰ中のシステイン残基は、グリシン残基、セリン残基、又はアラニン残基と、グリシン残基、セリン残基、又はアラニン残基との間に位置していてよく、セリン残基と、グリシン残基との間に位置していてよい。
　ドメイン配列は、ＲＥＰ中の疎水性アミノ酸残基と隣り合う位置に、システイン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有していることが好ましい。この場合、分子間で疎水性アミノ酸残基同士が疎水的相互作用により固定される。ＲＥＰ中のシステイン残基は、疎水性アミノ酸残基の隣に位置していてよく、疎水性アミノ酸残基と、疎水性アミノ酸残基以外のアミノ酸残基との間に、位置していてもよく、疎水性アミノ酸残基と、グリシン残基、セリン残基、又はアラニン残基との間に位置していてよく、疎水性アミノ酸残基と、グリシン残基との間に位置していてよい。疎水性アミノ酸残基は、イソロイシン残基、バリン残基、ロイシン残基、フェニルアラニン残基、メチオニン残基、及びアラニン残基からなる群より選択される１種であってよい。
　ドメイン配列は、天然由来のフィブロインと比較して、ドメイン配列のＮ末端及び／又はＣ末端の近傍に位置するＲＥＰ中に、システイン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有していてよい。この場合、分子鎖を長くすることができる。本明細書において、ドメイン配列のＮ末端の近傍に位置するＲＥＰとは、ドメイン配列のＮ末端から１～３番目に位置するＲＥＰを意味する。例えば、システイン残基は、ドメイン配列のＮ末端から１～２番目に位置するＲＥＰ中に位置していてよい。本明細書において、ドメイン配列のＣ末端の近傍に位置するＲＥＰとは、ドメイン配列のＣ末端から１～３番目に位置するＲＥＰを意味する。例えば、システイン残基は、ドメイン配列のＣ末端から１～２番目に位置するＲＥＰ中に位置していてよい。システイン残基は、ドメイン配列の最もＮ末端側及び／又は最もＣ末端側に位置するＲＥＰ中に位置していることが好ましい。
　ドメイン配列は、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の中央又は中央近傍にシステイン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有していてよい。本明細書において、ＲＥＰ中のアミノ酸配列の中央近傍とは、ＲＥＰの中央に位置するアミノ酸残基（中央に位置するアミノ酸残基が２つ存在する場合はＮ末端側のアミノ酸残基）からＮ末端側に向かって１～５番目の位置、又はＲＥＰの中央に位置するアミノ酸残基（中央に位置するアミノ酸残基が２つ存在する場合はＣ末端側のアミノ酸残基）から１～５番目の位置を示す。例えば、システイン残基は、ＲＥＰの中央に位置していてもよく、ＲＥＰの中央に位置するアミノ酸残基からＮ末端側、又はＣ末端側に向かって１～３番目又は１～２番目に位置していてもよい。ここにおいて、システイン残基が、例えば、ドメイン配列のＮ末端側とＣ末端側にそれぞれ一つずつ位置するように挿入されたポリペプチド骨格を含む第一のセグメントを用いる場合、そのような第一のセグメントと第二のセグメントとが交互に一つずつ位置するように連結させてなるポリペプチド誘導体を得ることができる。このポリペプチド誘導体を用いて得られる多孔質体では、靭性の更なる向上が期待され得る。システイン残基が、例えば、ドメイン配列のＮ末端側及び／又はＣ末端側よりも中央部側に位置するように挿入されたポリペプチド骨格を含む第一のセグメントを用いる場合、そのような第一のセグメントに対して第二のセグメントが連結されてなるポリペプチド誘導体では、溶媒に対する溶解度の向上が期待され得る。
　改変フィブロインは、ＲＥＰのアミノ酸配列中に、ＧＰＧＸＸモチーフ（Ｇはグリシン残基、Ｐはプロリン残基、Ｘはグリシン残基以外のアミノ酸残基を示す。）を含むことが好ましい。ＲＥＰ中にこのモチーフが含まれることにより、改変フィブロインの伸度を向上させることができる。
　改変フィブロインが、ＲＥＰ中にＧＰＧＸＸモチーフを含む場合、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率は、通常１％以上であり、５％以上であってもよく、好ましくは１０％以上である。この場合、改変フィブロイン繊維の応力がより一層高くなる。ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の上限に特に制限はなく、５０％以下であってよく、３０％以下であってもよい。
　本明細書において、「ＧＰＧＸＸモチーフ含有率」は、以下の方法によって算出される値である。式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロインにおいて、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、その領域に含まれるＧＰＧＸＸモチーフの個数の総数を３倍した数（即ち、ＧＰＧＸＸモチーフ中のＧ及びＰの総数に相当）をｃとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除き、更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｄとしたときに、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率はｃ／ｄとして算出される。
　ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出において、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としているのは、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列」（ＲＥＰに相当する配列）には、フィブロインに特徴的な配列と相関性の低い配列が含まれることがあり、ｍが小さい場合（つまり、ドメイン配列が短い場合）、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出結果に影響するので、この影響を排除するためである。ＲＥＰのＣ末端に「ＧＰＧＸＸモチーフ」が位置する場合、「ＸＸ」が例えば「ＡＡ」の場合であっても、「ＧＰＧＸＸモチーフ」として扱う。
　図５は、フィブロインのドメイン配列を示す模式図である。図５を参照しながらＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出方法を具体的に説明する。まず、図５に示したフィブロインのドメイン配列（「［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフ」タイプである。）では、全てのＲＥＰが「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」（図５中、「領域Ａ」で示した配列。）に含まれているため、ｃを算出するためのＧＰＧＸＸモチーフの個数は７であり、ｃは７×３＝２１となる。同様に、全てのＲＥＰが「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」（図５中、「領域Ａ」で示した配列。）に含まれているため、当該配列から更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数ｄは５０＋４０＋１０＋２０＋３０＝１５０である。次に、ｃをｄで除すことによって、ｃ／ｄ（％）を算出することができ、図５のフィブロインの場合２１／１５０＝１４．０％となる。
　改変フィブロインは、ＲＥＰの疎水性度（ハイドロパシー・インデックス：疎水性指標）が、例えば、－０．８０、－０．７０、－０．０６以上、－０．５０以上、－０．４０以上、－０．３０以上、－０．２０以上、－０．１０以上、０．００以上、０．１０以上、０．２０以上、０．２２以上、０．２５以上、０．３０以上、０．３５以上、０．４０以上、０．４５以上、０．５０以上、０．５５以上、０．６０以上、０．６５以上、０．７０以上であってよい。ＲＥＰの疎水性度の上限に特に制限はなく、１．０以下であってよく、０．７以下であってもよい。
　本明細書において、「ＲＥＰの疎水性度」は、以下の方法により算出される値である。式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍ－（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロインにおいて、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列（図５の「領域Ａ」に相当する配列。）に含まれる全てのＲＥＰにおいて、その領域の各アミノ酸残基の疎水性指標の総和をｅとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除き、更に（Ａ）ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｆとしたときに、ＲＥＰの疎水性度はｅ／ｆとして算出される。ＲＥＰの疎水性度の算出において、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としている理由は、上述した理由と同様である。
　ドメイン配列は、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中に１以上１６未満のシステイン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有していてよい。つまり、ＲＥＰに挿入したことに相当するシステイン残基の総数は、１以上１６未満であってよい。ＲＥＰ中に挿入したことに相当するシステイン残基の総数は、１以上１２以下、１以上１０以下、１以上８以下、１以上６以下、又は２以上４以下であってもよい。ドメイン配列中のＲＥＰ一つあたりのシステイン残基数は、例えば、１～３であってよく、１～２であってよく、１であってよい。
　本実施形態に係る改変フィブロインのシステイン残基の総数は、１以上１６未満、１以上１２以下、１以上１０以下、１以上８以下、１以上６以下、又は２以上４以下であってもよい。
　本実施形態に係る改変フィブロインは、上述したＲＥＰ中のシステイン残基に関する改変に加え、天然由来のフィブロインと比較して、１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変が更にあってもよい。
　本実施形態に係る改変フィブロインの分子量は、特に限定されないが、例えば、１０ｋＤａ以上７００ｋＤａ以下であってよい。本実施形態に係る改変フィブロインの分子量は、例えば、２ｋＤａ以上、３ｋＤａ以上、４ｋＤａ以上、５ｋＤａ以上、６ｋＤａ以上、７ｋＤａ以上、８ｋＤａ以上、９ｋＤａ以上、１０ｋＤａ以上、２０ｋＤａ以上、３０ｋＤａ以上、４０ｋＤａ以上、５０ｋＤａ以上、６０ｋＤａ以上、７０ｋＤａ以上、８０ｋＤａ以上、９０ｋＤａ以上、又は１００ｋＤａ以上であってよく、６００ｋＤａ以下、５００ｋＤａ以下、４００ｋＤａ以下、３６０ｋＤａ未満、３００ｋＤａ以下、又は２００ｋＤａ以下であってよい。
　本実施形態に係る改変フィブロインとしては、システイン残基が挿入されたことに相当するアミノ酸配列を有することが好ましく、当該改変フィブロインのより具体的な例として、（ｉ）配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、又は配列番号５１で表されるアミノ酸配列を含む、改変フィブロイン、又は（ｉｉ）配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、又は配列番号５５で表されるアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げるこができる。
　配列番号４６で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１）は、配列番号５６で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１１）に対し、ドメイン配列の最もＮ末端側に位置するＲＥＰに、システイン残基を１カ所挿入したものである。すなわち、配列番号４６で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１）におけるシステイン残基の総数は１である。
　配列番号４７で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ２）は、配列番号５７で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１２）に対し、ドメイン配列の最もＮ末端側に位置するＲＥＰに、システイン残基を１カ所挿入したものである。すなわち、配列番号４７で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ２）におけるシステイン残基の総数は１である。
　配列番号４８で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ３）は、配列番号５７で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１２）に対し、ドメイン配列の最もＮ末端側に位置するＲＥＰ及び最もＣ末端側に位置するＲＥＰに、システイン残基をそれぞれ１カ所挿入したものである。すなわち、配列番号４８で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ３）におけるシステイン残基の総数は２である。
　配列番号４９で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ４）は、配列番号５７で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１２）に対し、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側それぞれから１番目及び２番目に位置するＲＥＰ中に、それぞれ１カ所ずつシステイン残基が挿入されたものである。すなわち、配列番号４９で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ４）におけるシステイン残基の総数は４である。
　配列番号５０で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ５）は、配列番号５７で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１２）に対し、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側それぞれから１～４番目に位置するＲＥＰ中に、それぞれ１カ所ずつシステイン残基が挿入されたものである。すなわち、配列番号５０で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ５）におけるシステイン残基の総数は８である。
　配列番号５１で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ６）は、配列番号５７で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１２）に対し、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側それぞれから１～８番目に位置するＲＥＰ中に、それぞれ１カ所ずつシステイン残基が挿入されたものである。すなわち、配列番号５１で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ６）におけるシステイン残基の総数は１６である。
　配列番号５２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ７）は、配列番号５８で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１３）に対し、ドメイン配列の最もＮ末端側及び最もＣ末端側それぞれに位置するＲＥＰに、システイン残基を１カ所ずつ挿入したものである。すなわち、配列番号５２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ７）におけるシステイン残基の総数は２である。
　配列番号５３で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ８）は、配列番号５９で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１４）に対し、ドメイン配列の最もＮ末端側及び最もＣ末端側それぞれに位置するＲＥＰに、システイン残基を１カ所ずつ挿入したものである。すなわち、配列番号５３で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ８）におけるシステイン残基の総数は２である。
　配列番号５４で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ９）は、配列番号５９で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１４）に対し、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側それぞれから１～４番目に位置するＲＥＰ中に、それぞれ１カ所ずつシステイン残基が挿入されたものである。すなわち、配列番号５４で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ９）におけるシステイン残基の総数は８である。
　配列番号５５で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１０）は、配列番号５９で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１４）に対し、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側それぞれから１～８番目に位置するＲＥＰ中に、それぞれ１カ所ずつシステイン残基が挿入されたものである。すなわち、配列番号５５で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１０）におけるシステイン残基の総数は１６である。
　（ｉ）の改変フィブロインは、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、又は配列番号５１で示されるアミノ酸配列のみを有するものであってもよい。（ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、又は配列番号５５で示されるアミノ酸配列のみを有するものであってもよい。
　上述の改変フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。これによって、改変フィブロインの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。
　タグ配列として、例えば、他の分子との特異的親和性（結合性、アフィニティ）を利用したアフィニティタグを挙げることができる。アフィニティタグの具体例として、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を挙げることができる。Ｈｉｓタグは、ヒスチジン残基が４から１０個程度並んだ短いペプチドで、ニッケル等の金属イオンと特異的に結合する性質があるため、金属キレートクロマトグラフィー（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ　ｍｅｔａｌ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）による改変フィブロインの単離に利用することができる。タグ配列の具体例として、例えば、配列番号７０又は配列番号７１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグを含むアミノ酸配列）が挙げられる。
　タグ配列として、グルタチオンに特異的に結合するグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースに特異的に結合するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）等のタグ配列を利用することもできる。
　タグ配列として、抗原抗体反応を利用した「エピトープタグ」を利用することもできる。抗原性を示すペプチド（エピトープ）をタグ配列として付加することにより、当該エピトープに対する抗体を結合させることができる。エピトープタグとして、ＨＡ（インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのペプチド配列）タグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ等を挙げることができる。エピトープタグを利用することにより、高い特異性で容易に改変フィブロインを精製することができる。
　タグ配列を特定のプロテアーゼで切り離せるようにしたものもタグ配列として使用することができる。当該タグ配列を介して吸着したタンパク質をプロテアーゼ処理することにより、タグ配列を切り離した改変フィブロインを回収することもできる。
　タグ配列を含む改変フィブロインのより具体的な例として、（ｉｉｉ）配列番号６０（ＰＲＴ１５）、配列番号６１（ＰＲＴ１６）、配列番号６２（ＰＲＴ１７）、配列番号６３（ＰＲＴ１８）、配列番号６４（ＰＲＴ１９）、若しくは配列番号６５（ＰＲＴ２０）で示されるアミノ酸配列を含む、改変フィブロイン、又は（ｉｖ）配列番号６６（ＰＲＴ２１）、配列番号６７（ＰＲＴ２２）、配列番号６８（ＰＲＴ２３）、若しくは配列番号６９（ＰＲＴ２４）で示されるアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
　配列番号６０（ＰＲＴ１５）、配列番号６１（ＰＲＴ１６）、配列番号６２（ＰＲＴ１７）、配列番号６３（ＰＲＴ１８）、配列番号６４（ＰＲＴ１９）、及び配列番号６５（ＰＲＴ２０）で示されるアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号４６（ＰＲＴ１）、配列番号４７（ＰＲＴ２）、配列番号４８（ＰＲＴ３）、配列番号４９（ＰＲＴ４）、配列番号５０（ＰＲＴ５）、及び配列番号５１（ＰＲＴ６）で示されるアミノ酸配列のＮ末端に、配列番号７０で示されるアミノ酸配列を含むタグ配列を導入したものである。配列番号６６（ＰＲＴ２１）、配列番号６７（ＰＲＴ２２）、配列番号６８（ＰＲＴ２３）、及び配列番号６９（ＰＲＴ２４）で示されるアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号５２（ＰＲＴ７）、配列番号５３（ＰＲＴ８）、配列番号５４（ＰＲＴ９）、及び配列番号５５（ＰＲＴ１０）で示されるアミノ酸配列のＮ末端に、配列番号７０で示されるアミノ酸配列を含むタグ配列を導入したものである。
　（ｉｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、又は配列番号６５で示されるアミノ酸配列のみを有するものであってもよい。
　配列番号６０（ＰＲＴ１５）、配列番号６１（ＰＲＴ１６）、配列番号６２（ＰＲＴ１７）、配列番号６３（ＰＲＴ１８）、配列番号６４（ＰＲＴ１９）、又は配列番号６５（ＰＲＴ２０）で示されるアミノ酸配列を含む、改変フィブロインのＧＰＧＸＸモチーフ含有率は、それぞれ４０．２％、３９．９％、３９．９％、３９．７％、３９．３％、及び３８．６％であり、いずれも１０％以上である。
　（ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、若しくは配列番号６９で示されるアミノ酸配列のみを有するものであってもよい。
　配列番号６６（ＰＲＴ２１）、配列番号６７（ＰＲＴ２２）、配列番号６８（ＰＲＴ２３）、又は配列番号６９（ＰＲＴ２４）で示されるアミノ酸配列を含む、改変フィブロインのＧＰＧＸＸモチーフ含有率は、それぞれ３９．９％、３９．９％、３９．３％、及び３８．６％であり、いずれも１０％以上である。
　上述の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
　タンパク質は、当該タンパク質をコードする核酸を使用して、常法により製造することができる。当該タンパク質をコードする核酸は、塩基配列情報に基づいて、化学合成してもよく、ＰＣＲ法等を利用して合成してもよい。
（第二のセグメント）
上記第二のセグメントは、上記ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団を含む。ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団とは、当該分子団同士の分子間力が、ポリペプチド骨格同士の分子間力よりも小さく、両者を混合した場合に、ポリペプチド骨格単体よりも素材の柔軟性を向上させることが可能な分子団をいう。ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団とは、ポリペプチド骨格よりも融点又はガラス転移温度が低い分子団ともいえる。ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団は、例えば、ポリエーテル、ポリエステル、又はポリカーボネートであってよい。当該分子団としてのポリエーテルは、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はポリテトラメチレングリコール（ＰＴＭＧ）であってよい。可塑化機能とは、柔軟性の向上機能、或いは曲げ及び／又は引っ張りにおける破断伸度を高める機能ともいえる。ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団は、生分解性を有するもの、或いはバイオマス由来のものが好適に用いられる。それによって、多孔質体全体として生分解性、及び、バイオ価をより高めることが十分に期待され、更には多孔質体の製造エネルギーの更なる低減が図られ得る。
　上記第二のセグメントは、上記分子団を複数含んでもよい。そして、上記第二のセグメントが複数の上記分子団を含み、複数の上記分子団が互いに連結していてもよい。上記分子団同士の連結は、一部に分岐を有していてもよい。上記連結が一部に分岐を有することで、第二のセグメントは、複数の上記分子団による分岐構造を有することができ、分岐ごとに第一のセグメントとの結合を複数形成することもできる。すなわち、上記連結の一部に分岐を導入することによっても、第一のセグメントと第二のセグメントとのネットワーク構造を形成することができる。このように、第二のセグメントが複数の上記分子団を含み、それらの分子団が互いに連結するものであることによって、第二セグメントの設計の幅をより広げることができ、例えば、多孔質体の柔軟性をより容易に調整できる。第二のセグメントが上記分子団を一つだけ含んでいる場合には、複数の第二のセグメント同士を互いに連結させて、それら複数の第二のセグメントのうちの少なくとも一つを第一のセグメントに結合させてもよい。あるいは、複数の第二のセグメントを一つの第一のセグメントに結合させてもよい。複数の第二のセグメント同士を連結する場合には、複数の第二のセグメント同士の連結の一部に分岐を導入して、第二のセグメントのネットワークを形成してもよい。第二のセグメントは、生分解性の更なる向上等の観点から、ポリ（メタ）アクリレートに由来する骨格を含んでいなくてよい。
　第二のセグメントは、例えば、ポリエーテル、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリオール（ポリビニルアルコール等）、ポリオレフィン、ポリアセタール、ポリケタール、ポリ（メタ）アクリレート、シリコーン、ポリウレタン、ポリアルキレンイミン、フェノール樹脂、尿素樹脂、メラミン樹脂、及び多糖類からなる群より選択される少なくとも一種に由来する骨格を含んでよい。
　第二のセグメントは、好ましくは、ポリエーテル基、ポリエステル基、ポリカーボネート基、ポリアミド基、ポリオール基（ポリビニルアルコール基等）、及び、修飾多糖基からなる群より選択される少なくとも一種の官能基を含んでもよく、エーテル基、エステル基、カーボネート基、アミド基、及び、修飾多糖基からなる群より選択される少なくとも一種の官能基を含んでもよい。第二のセグメントは、例えば、エーテル結合、エステル結合、炭酸エステル結合（カーボネート結合）、アミド基、シロキサン結合、ウレタン結合、ウレタン結合、又はウレア結合を有する構造単位からなる群より選択される少なくとも一種の構造単位を含んでよく、アルキレン基、置換アルキレン基、オキシメチレン基、アルキレンイミン基、又は修飾多糖基を有する構造単位からなる群より選択される少なくとも一種の構造単位を含むともいえる。
　ポリエーテル基としては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレンオキサイド／プロピレンオキサイド共重合体、及びポリブチレングリコール（ポリテトラメチレングリコール（ＰＴＭＧ））等のポリアルキレングリコール類に由来する官能基が挙げられる。これらのポリエーテル基が第二のセグメントに含まれる場合、ポリエーテル基は、必要に応じて第二セグメントに含まれる、後述するリンカーが有するエステル基、チオエステル基、又はアミド基中のヘテロ元素（Ｏ，Ｎ，Ｓ）に直結していてもよい。あるいはポリエーテル基は、第一セグメントに含まれるポリペプチド骨格が有するエステル基、チオエステル基、又はアミド基中のヘテロ元素（Ｏ，Ｎ，Ｓ）に直結していてもよい。この場合、ポリエーテル基全体がリンカー及び／又は第一セグメントから分離しやすくなり、その結果、ポリエーテル基の生分解速度が高められ得る。
　ポリエステル基としては、例えば、ポリ乳酸、ポリ（３－ヒドロキシブタン酸）、ポリヒドロキシブタン酸／ヒドロキシバレリル酸共重合体、ポリヒドロキシブタン酸／４－ヒドロキシブタン酸共重合体、ポリヒドロキシブタン酸／ヒドロキシヘキサン酸共重合体、ポリトリメチレンテレフタラート、ブタンジオール／長鎖ジカルボン酸共重合体、ポリエチレンテレフタラート、ポリブチレンサクシネート、ポリブチレンサクシネート・アジペート共重合体、ポリブチレンアジペート・テレフタラート共重合体、ポリカプロラクトン、及びポリトリメチレンフランジカルボキシレート（Poly(trimethylene furandicarboxylate):PTF）等のポリエステル類に由来する官能基が挙げられる。ポリエステル基は、上述のポリエステル類の中でも、好ましくは、ポリカプロラクトン等のバイオマスプラスチック又は生分解性プラスチックに分類されるに由来する官能基である。
　ポリカーボネート基としては、例えば、１，６－ヘキサンジオールポリカーボネート、１，５－ペンタンジオールポリカーボネート、及び１，１０－デカンジオールカーボネート等の脂肪族炭化水素鎖を主骨格として有するポリカーボネート類に由来する官能基が挙げられる。
　ポリアミド基としては、例えば、ナイロン３、ナイロン４、ナイロン５、ナイロン６、ナイロン１１、及びナイロン６１０等のポリアミド類に由来する官能基が挙げられる。ポリアミド基は、上述のポリアミド類の中でも、好ましくは、バイオマスプラスチック又は生分解性プラスチックに分類されるに由来する官能基である。
　ポリオール基（ポリビニルアルコール基等）としては、例えば、ポリビニルアルコール、エチレン・ビニルアルコール共重合体等のポリオール類（ポリビニルアルコール類等）に由来する官能基が挙げられる。ポリオール基は、上述のポリオール類の中でも、好ましくは、バイオマスプラスチック又は生分解性プラスチックに分類されるに由来する官能基である。
　修飾多糖類基としては、例えば、セルロース、デンプン、キチン、及びキトサン等を化学修飾した化合物に由来する官能基が挙げられる。上記化学修飾した化合物は、例えば、酢酸セルロース、エチルセルロース、酢酸デンプン、ヒドロキシプロピル化デンプン、カルボキシメチルキチン、及びカルボキシメチルキトサン等が挙げられる。
　第二のセグメントは、上記ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団に加えて、リンカーを更に含んでもよい。この場合、上記リンカーを介して、上記分子団と上記ポリペプチド骨格とが結合していてよい。リンカーは、例えば、下記式（１）で表される構造単位、下記一般式（２ａ）～（６）で表される構造単位、下記式（７）で表される構造単位、下記一般式（８ａ）～（９）で表される構造単位、下記一般式（１０）～（１１ｂ）で表される構造単位、及び下記一般式（１３）～（１６）で表される構造単位からなる群より選択される少なくとも一種を含んでよく、下記式（１）で表される構造単位、下記一般式（２ａ）～（６）で表される構造単位、下記式（７）で表される構造単位、及び下記一般式（８ａ）～（９）で表される構造単位からなる群より選択される少なくとも一種を含んでよく、生分解性を向上させる観点から、好ましくは、下記式（１）で表される構造単位、並びに、下記一般式（２ａ）、（３ａ）、（４ａ）、（４ｂ）及び（１０）で表される構造単位からなる群より選択される少なくとも一種を含む。リンカーは、上述の構造単位を複数含んでもよい。すなわち、リンカーは、上述の構造単位のみからなってもよく、上述の構造単位を複数有してもよい（リンカーの本体部に対して上述の構造単位が複数共有結合していてもよい）。リンカーの本体部は比較的分子量が小さいことが好ましい。リンカーが上述の構造単位を３つ以上有する場合、例えば、１つの第二のセグメントに対して、３つの第一のセグメントが結合することが可能であり、このような選択によっても上記ポリペプチド誘導体にネットワーク構造を導入することができる。上記ポリペプチド誘導体の製造に用いる原料の選択（ポリペプチド骨格を有する化合物、及び、当該ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団を含む化合物の官能基を調整すること）によって、複数ある第二のセグメントの一部が互いに結合したブロック共重合体を含むポリペプチド誘導体とすることもできる。リンカーが上述の構造単位を複数有する場合、複数ある構造単位の少なくとも一つが上記ポリペプチド骨格と結合し、少なくとも一つが上記分子団と結合する構造であってよい。リンカーが、上述の構造単位のみからなる場合、リンカーを示す構造単位を表す式中に記載された二本の結合の一方にペプチド骨格、他方に上記分子団が結合する。例えば、上記リンカーが下記式（１）で表される場合、好ましくは、上記分子団が窒素（Ｎ）と結合し、他方がポリペプチド骨格と結合する。リンカーが上述の構造単位を複数有する場合、例えば、下記式（１）で表される構造単位の場合、好ましくは、リンカーの本体部に対して窒素（Ｎ）が結合し、他方が、上記ポリペプチド骨格及び上記分子団と結合する。
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　上記一般式（２ａ）、（２ｂ）、（３ａ）、（４ａ）、（４ｂ）、（５）、（６）、（１０）、（１１ａ）及び（１１ｂ）において、Ｙは、互いに独立に、酸素原子、硫黄原子、又はＮＲ１を示す。上記ＮＲ１において、Ｒ１は、水素、炭化水素基、芳香族基、カルボニル基、又はスルホニル基を示す。上記一般式（２ａ）、（２ｂ）、（３ａ）、（４ａ）、（４ｂ）、（８ａ）、（８ｂ）、（９）、（１０）、（１１ａ）及び（１１ｂ）において、Ｒは、互いに独立に、水素、炭化水素基、又は芳香族基を示す。
　第二のセグメントの分子量（ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団）は、例えば、２００～５０００００、３００～４０００００、３５０～３５００００、４００～３０００００、５００～２０００００、６００～１００００００、７００～５００００、８００～１００００、９００～７５００、又は１００～５０００であってよい。
　第二のセグメントの分子量の分子量が２００以上である場合、分子の三次元構造内において可塑化機能を有する上記分子団の局在化を抑制しやすくなり、一定レベルの機能を発揮する為に導入しなければいけない可塑化機能を有する分子団の重量比率を充分に低くすることができる。その結果、ポリペプチド誘導体の製造における反応時間の短時間化、反応温度の低温化が実現できる可能性がある。
　第二のセグメントの分子量の分子量が５０００００以下である場合、分子量が適度な範囲になり、第一のセグメントに対する第二のセグメントの結合反応性の低下がより抑制されやすくなる。
　上記した第二のセグメントの分子量は、重量平均分子量であり、一般にはＧＰＣを用いた公知の方法で求められるものである。
　第一のセグメントの分子量（ポリペプチド骨格）に対する第二のセグメント（ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団）の分子量は、ポリペプチド誘導体の用途等に応じて、適宜調整することができる。第二のセグメントの分子量（第一のセグメント１つに対して２つ以上の第二のセグメントが結合している場合には、合計の分子量）は、第一のセグメントの分子量１００を基準として、例えば、好ましくは１～１００００であり、より好ましくは１．５～９０００であり、更に好ましくは２～８０００であり、より好ましくは３～７０００であり、更に好ましくは５～５０００であり、更により好ましくは７～３０００であり、更によりまた好ましくは１０～２０００である。
　第一のセグメントの分子量に対する第二のセグメントの分子量が１以上であると、ポリペプチド誘導体を用いて得られる多孔質体の柔軟性を更に高めることができる。第一のセグメントの分子量に対する第二のセグメントの分子量が１００００以下であると、充分な可塑性（柔軟性）を有するとともに、多孔質体の剛性を更に向上させることができる。第一のセグメントの分子量に対する第二のセグメントの分子量が上述の範囲内であることで、柔軟性により優れる多孔質体を製造することが可能である。
　第二のセグメントの分子量、及びポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団の分子量は、第一のセグメントの分子量、又は第一のセグメントに含まれるポリペプチド骨格の分子量を１００としたとき（好ましくは第一のセグメントに含まれるポリペプチド骨格の分子量を１００としたとき）に、例えば、１．４以上、１．５以上、１．６以上、１．７以上、１．８以上、１．９以上、２．０以上、５．０以上、１０以上、２０以上、３０以上、又は４０以上であってもよい。その上限値は特に限定されるものではないものの、例えば、１０００以下、８００以下、６００以下、４００以下、２００以下、１００以下、８０以下、７０以下、６０以下、５０以下であってよい。さらに、第二のセグメントの分子量は、第一のセグメントの分子量を１００としたときに、望ましくは１～１０００の範囲内であり、より望ましくは１～８００の範囲内であり、更に望ましくは１～６００の範囲内であり、更により望ましくは１～４００の範囲内であり、更に望ましくは１～２００の範囲内であり、より望ましくは１～１００の範囲内であり、好ましくは１～７０の範囲内であり、より好ましくは１．５～６０であり、更に好ましくは１．５～５０であり、特に好ましくは２．０～５０である。第一のセグメント（ポリペプチド骨格）の分子量と第二のセグメント（ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団）の分子量との比が上記の範囲内の値である場合には、例えば、ポリペプチド誘導体を用いて得られる多孔質体において、ポリペプチド骨格を有していることによる第一のセグメントの特性（例えば、高い機械的強度）を十分に保持しつつ、柔軟性、或いは延伸性等を高めることが期待され得る。上記した、第一のセグメントの分子量を１００としたときの第二のセグメントの分子量の比率は重量平均分子量で求めたものである。
　第一のセグメント（ポリペプチド骨格）と第二のセグメント（可塑化機能を有する分子団）とのポリペプチド誘導体中の含有比率は、多孔質体の用途等に応じて、適宜調整することができる。かかる含有比率は、質量比で、第二のセグメントを１００としたときに、第一のセグメントが、例えば、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、１００以上、１１０以上、１５０以上、２００以上、２５０以上、３００以上、３００以上、４００以上、４５０以上、５００以上、５５０以上、又は６００以上であってよい。かかる値の上限値は特に限定されるものではないものの、１０００以下、９００以下、８００以下、又は７００以下であってよい。第一のセグメントと第二のセグメントとのポリペプチド誘導体中の含有比率が上記の範囲内の値とされていることによって、第二のセグメントの無駄な使用が抑えられて、ポリペプチド誘導体の製造コストの抑制が図られ得る。ポリペプチド誘導体中における、第一のセグメントに対する第二のセグメントの含有比率の低減は、例えば、第一のセグメントの分子量の低減等によって有利に実現され得る。
　上述の実施形態の説明においては、リンカーを第二のセグメントの構成要素として説明したが、第二のセグメントとは区別して取り扱ってもよい。リンカーを第一のセグメントの構成要素として扱うこともできる。リンカー部の分子量は上記ポリペプチド骨格及び上記分子団に比べて小さいが、リンカーを第二のセグメントとは区別して取り扱う場合、上述の第二のセグメントの分子量はリンカー部の分子量を差し引いた範囲を第二のセグメントの分子量の好適範囲であるものとして扱う。同様に、リンカー部を第一のセグメントの構成要素として扱う場合、上述の第一のセグメントの分子量はリンカー部の分子量を加えた範囲を第一のセグメントの分子量の好適範囲であるものとして扱う。
＜ポリペプチド誘導体の製造方法＞
　上述のポリペプチド誘導体は、例えば、ポリペプチド骨格を構成するシステインのチオール基（メルカプト基又はスルフヒドリル基ともいう）と、マレイミド又はマレイン酸誘導体の炭素－炭素二重結合との１，４－付加反応を利用して、チオエーテル結合を生成させることによって、上記分子団の有する官能基（例えば、ポリエーテル基、ポリエステル基、ポリカーボネート基、ポリアミド基、ポリオール基、及び、修飾多糖基からなる群より選択される少なくとも一種の官能基）を第一のセグメントに導入することで製造することができる。上述のポリペプチド誘導体は、上述の製造方法の一例を応用し、例えば、システインを有するポリペプチド骨格を含む化合物と、当該ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団を含み、且つチオール基を有する化合物と、マレイミド基を２つ以上有する化合物とを、上述のマレイミド基の１，４－付加反応を利用してチオエーテル結合を形成することによっても製造することができる。上述のポリペプチド誘導体は、その他、例えば、エポキシ基、又はイソシアネート基に対する付加反応、α－ハロカルボニル基に対する置換反応、アルキニル基とアジド基との間のＨｕｉｓｇｅｎ環化反応を利用して製造することもできる。
　より一般的には、ポリペプチド誘導体の製造方法の一実施形態は、ポリペプチド骨格を含む化合物と、下記一般式（１Ａ）～（１６Ａ）で表される化合物の少なくとも１種とを反応させることによってポリペプチド誘導体を得る工程を備える。上記工程は、ポリペプチド骨格を含む化合物と、下記一般式（１Ａ）～（１２Ａ）で表される化合物とを反応させることによってポリペプチド誘導体を得る工程であってよい。上記ポリペプチド骨格は、チオール基、アミノ基、ヒドロキシ基、グアニジノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、インドール基、アミド基、アジド基、及びアルキニル基からなる群より選択される少なくとも一種を有し、好ましくは、チオール基、アミノ基、ヒドロキシ基、グアニジノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、インドール基、及びアミド基からなる群より選択される少なくとも一種を有する。ポリペプチド骨格を含む化合物と、下記一般式（１Ａ）～（１２Ａ）又は（１４Ａ）で表される化合物との反応がマイケル付加反応であってよい。
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Figure JPOXMLDOC01-appb-C000083
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Figure JPOXMLDOC01-appb-C000101
　上記一般式（１Ａ）、（２Ａ）、（２Ｂ）、（３Ａ）、（３Ｂ）、（４Ａ）、（５Ａ）、（６Ａ）、（７Ａ）、（８Ａ）、（８Ｂ）、（９Ａ）、（１０Ａ）、（１１Ａ）、（１１Ｂ）及び（１２Ａ）においてＲ２は、上記ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団を示す。上記ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団としては、上述のポリペプチド誘導体についての説明において例示したものを適用できる。
　上記一般式（２Ａ）、（２Ｂ）、（３Ａ）、（３Ｂ）、（４Ａ）、（５Ａ）、（６Ａ）、（８Ｂ）、（９Ａ）、（１０Ａ）、（１１Ａ）及び（１１Ｂ）において、Ｙは、互いに独立に、酸素原子、硫黄原子、又はＮＲ１を示す。上記ＮＲ１において、Ｒ１は、水素、炭化水素基、芳香族基、カルボニル基、又はスルホニル基を示す。上記一般式（２Ａ）、（２Ｂ）、（３Ａ）、（３Ｂ）、（４Ａ）、（５Ａ）、（８Ａ）、（８Ｂ）、（９Ａ）、（１０Ａ）、（１１Ａ）及び（１１Ｂ）においてＲは、互いに独立に、水素、炭化水素基、又は芳香族基を示す。上記一般式（６Ａ）及び（１２Ａ）において、Ｚはハロゲン原子、スルホン酸エステル基、及び含フッ素カルボン酸エステル基を示す。上記一般式（１５Ａ）において、Ｘはハロゲン原子を示す。
　ポリペプチド骨格を有する化合物一つ（第一のセグメント一つ）に対して導入されるポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団（第二のセグメント）の数は、ポリペプチド骨格を構成するアミノ酸配列に由来するチオール基、アミノ基、ヒドロキシ基、グアニジノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、インドール基、アミド基、アジド基、及びアルキニル基（好ましくは、チオール基、アミノ基、ヒドロキシ基、グアニジノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、インドール基、及びアミド基）の合計官能基数以下となるが、例えば、１個以上、２個以上、又は４個以上であってよく、３０個以下、２５個以下、２０個以下、１５個以下、１０個以下、又は８個以下であってよい。ポリペプチド骨格を有する化合物一つ（第一のセグメント一つ）に対して導入されるポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団（第二のセグメント）の数は上述の範囲内で調整することができ、例えば、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～８、又は２～８であってよい。
　ポリペプチド誘導体の製造方法においては、例えば、溶媒中で、ポリペプチド骨格を有する化合物と一般式（１Ａ）～（１６Ａ）で表される化合物の少なくとも１種（好ましくは一般式（１Ａ）～（１２Ａ）で表される化合物）とを混合してもよい。反応が進行しにくい場合には、酸、塩基の添加、及び加温等を行ってもよい。反応温度は、通常、０～１５０℃であり、例えば、５０～１５０℃、７０～１２０℃、又は９０～１００℃であってよく、１０～１１０℃、２０～１００℃、又は２５～９０℃であってよい。使用される溶媒は、ポリペプチド骨格を有する化合物及び一般式（１Ａ）～（１６Ａ）で表される化合物を溶解することができ、所望の反応の進行を阻害しないものであればよい。このような溶媒としては、ヘキサフルオロイソプロピルアルコール（ＨＦＩＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、酢酸、ギ酸等が挙げられる。
　上述の反応によって得られる生成物（ポリペプチド誘導体を含む粗製物）は、例えば、再沈殿、順相カラムクロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、溶媒による洗浄等によって精製してもよい。
　上述のポリペプチド誘導体の製造方法の一実施形態は、ポリペプチド骨格を含む化合物と、ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団を含む化合物と、下記一般式（２－１Ａ）～（２－１６Ａ）で表される構造単位からなる群より選択される少なくとも一種の構造単位を２つ以上有する化合物と、を反応させることによってポリペプチド誘導体を得る工程を備える。上記工程は、ポリペプチド骨格を含む化合物と、上記ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団を含む化合物と、下記一般式（２－１Ａ）～（２－１２Ａ）で表される構造単位からなる群より選択される少なくとも一種の官能基を２つ以上有する化合物と、を反応させることによってポリペプチド誘導体を得る工程であってよい。
　上記ポリペプチド骨格は、チオール基、アミノ基、ヒドロキシ基、グアニジノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、インドール基、アミド基、アジド基、及びアルキニル基からなる群より選択される少なくとも一種を有し、好ましくは、チオール基、アミノ基、ヒドロキシ基、グアニジノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、インドール基、及びアミド基からなる群より選択される少なくとも一種を有する。
　上記分子団を含む化合物は、上記分子団以外に、下記一般式（２－１Ａ）～（２－１２Ａ）で表される構造単位と反応し得る反応性官能基を有する化合物であってよい。反応性官能基は、チオール基、アミノ基、ヒドロキシ基、グアニジノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、インドール基、アミド基、アジド基、及びアルキニル基からなる群より選択される少なくとも一種であってよく、好ましくは、チオール基、アミノ基、ヒドロキシ基、グアニジノ基、カルボキシ基、フェノキシ基、インドール基、及びアミド基からなる群より選択される少なくとも一種である。上記分子団を含む化合物は、反応性官能基を２個以上有する化合物であってよく、反応性官能基を２個有する化合物であってよい。
　ポリペプチド骨格が有する官能基と、上記分子団を含む化合物の有する官能基とは、一般式（２－１Ａ）～（２－１６Ａ）で表される構造単位からなる群より選択される少なくとも一種の官能基を２つ以上有する化合物の官能基の種類に応じて、選択することができ、同一であっても異なってもよい。ポリペプチド骨格が有する官能基と、上記分子団を含む化合物の有する官能基とが異なる場合、ポリペプチド誘導体の分子構造の制御をより容易に行うことができる。
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Figure JPOXMLDOC01-appb-C000103
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Figure JPOXMLDOC01-appb-C000119
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Figure JPOXMLDOC01-appb-C000121
　上記一般式（２－２Ａ）、（２－２Ｂ）、（２－３Ａ）、（２－３Ｂ）、（２－４Ａ）、（２－５Ａ）、（２－６Ａ）、（２－１０Ａ）、（２－１１Ａ）、及び（２－１１Ｂ）において、Ｙは、互いに独立に、酸素原子、硫黄原子、又はＮＲ１を示す。Ｒ１は、水素、炭化水素基、芳香族基、カルボニル基、又はスルホニル基を示す。上記一般式（２－２Ａ）、（２－２Ｂ）、（２－３Ａ）、（２－３Ｂ）、（２－４Ａ）、（２－８Ａ）、（２－８Ｂ）、（２－９Ａ）、（２－１０Ａ）、（２－１１Ａ）、（２－１１Ｂ）、及び（２－１２Ａ）においてＲは、互いに独立に、水素、炭化水素基、又は芳香族基を示す。上記一般式（２－６Ａ）及び（２－１２Ａ）において、Ｚはハロゲン原子、スルホン酸エステル基、又は含フッ素カルボン酸エステル基を示す。上記一般式（２－１５Ａ）において、Ｘはハロゲン原子を示す。
　ポリペプチド骨格を含む化合物及び上記ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団を含む化合物と、上述の特定官能基を２つ以上有する化合物との反応は、例えば、マイケル付加反応等であってよい。
　上記第二のセグメントは、好ましくは、上記分子団を含む化合物と、上記一般式（２－１Ａ）～（２－１２Ａ）で表される構造単位からなる群より選択される少なくとも一種の官能基を２つ以上有する化合物との付加反応物（又は付加重合物）に由来する骨格を含んでいてよく、反応性官能基及びポリエーテル基を含む化合物と、上記一般式（２－１Ａ）～（２－１２Ａ）で表される構造単位からなる群より選択される少なくとも一種の官能基２つ以上、及び、ポリエーテル基を含む化合物との付加反応物（又は付加重合物）に由来する骨格を含んでいてもよい。
　第一セグメントに対する第二セグメントの重量比率を高くすれば柔軟性が向上可能である。そうするには、第二セグメントの高分子化が有効である。そして、そのためには、複数種類の可塑剤を結合させて、第二セグメントの高分子化を図ることが好ましい。
　ポリペプチド誘導体を得る工程では、特定の官能基を有するポリペプチド骨格を含む化合物、及びポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有し、特定の官能基を有する分子団を含む化合物に対して反応する官能基を、特定の構造単位を２つ以上有する化合物として切り分けている。このような方法を取ることで、特定の官能基を有するポリペプチド骨格を含む化合物と、ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有し、特定の官能基を有する分子団を含む化合物との間で反応を進行させずに、反応溶液を調製することができる。混合しても反応が進行しないため、十分に均一な状態となるまで、例えば時間をかけることもできる。均一な反応溶液が調製された後、特定の構造単位を２つ以上有する化合物を配合することによって、反応を開始させることによって、反応系の制御をより容易に行うことができ、より均一なポリペプチド誘導体を調製することができる。このような方法は、ポリペプチド骨格及び分子団の種類に応じて溶媒等へ溶解性が低いときに特に有用である。
＜その他の成分＞
　多孔質体は、ポリペプチド誘導体以外の成分（その他の成分）を含んでいてもよく、含んでいなくてもよい。その他の成分としては、例えば、着色剤、平滑剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、染料、充填剤、架橋剤、艶消し剤、レベリング剤等が挙げられる。その他の成分を含有する場合、多孔質体全量に対するポリペプチド誘導体の含有割合は、例えば、５０質量％以上であってよく、９９質量％以下であってよい。
＜多孔質体の用途＞
　本実施形態に係る多孔質体は、従来の多孔質体に用いられた用途に使用することができる。本実施形態に係る多孔質体は、例えば、化粧品用途、医療用途、防水透湿層、衝撃吸収材、下着等に含まれるパッドとしての衣料用途等の用途に使用することができる。
［多孔質体の製造方法］
　本実施形態に係る多孔質体の製造方法特に限定されるものではないが、例えば、ポリペプチド誘導体及び溶媒を含む混合物をゲル化させる工程Ａと、ゲル化した混合物から溶媒を離脱させることにより、ポリペプチド誘導体を含む多孔質体を得る工程Ｂと、を含む方法によって、目的とする多孔質体を製造することができる。ポリペプチド誘導体については、上述したとおりである。
　工程Ａでは、ポリペプチド誘導体及び溶媒を含む混合物をゲル化させる。ゲル化は、例えば、ポリペプチド誘導体及び溶媒を含む混合物（溶液）を冷却することによって行うことができる。ゲル化のための温度は、溶媒の種類等に応じて、適宜設定することができる。ゲル化のための温度は、例えば、－１９６～２０℃であってよい。
　溶媒は、水、又は有機溶媒であってよい。有機溶媒としては、例えば、ジメチルスルホキシド、エタノール、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、ヘキサフルオロ－２－プロパノール、ギ酸、又はそれらの混合溶媒等が挙げられる。
　混合物におけるポリペプチド誘導体の濃度は、例えば、混合物全量に対して、１質量％以上であってよく、３０質量％以下であってよい。混合物は、ポリペプチド誘導体及び溶媒以外を含んでいてもよく、含んでいなくてもよい。
　ポリペプチド誘導体及び溶媒を含む混合物をゲル化させる方法は、上述の方法の他、公知の相分離を利用したゲル化方法、例えば、熱誘起相分離法、重合誘起相分離法、非溶媒誘起相分離法等が採用可能である。
　工程Ｂでは、ゲル化した混合物から溶媒を離脱させる。これによって、ポリペプチド誘導体を含む多孔質体を得る。ゲル化した混合物から溶媒を離脱させる方法としては、例えば、混合物を凍結乾燥させる方法、加熱乾燥させる方法、真空乾燥させる方法、自然乾燥させる方法等の公知の乾燥方法が挙げられる。乾燥中にゲル化した混合物を加圧圧縮して溶媒を絞りだす操作を加えてもよい。
　工程Ｂにおいて、溶媒を離脱させる前に混合物中の溶媒（第１の溶媒）を他の溶媒（第２の溶媒）に置換してもよい。第１の溶媒（例えば、ジメチルスルホキシド）を第２の溶媒（例えば、エタノール）に置換した後、混合物中の第２の溶媒を更に第３の溶媒（水）に置換してもよい。第２及び第３の溶媒は、上記例示した溶媒であってよい。
　工程Ｂでは、凍結乾燥させる前にゲル化した混合物中の溶媒を水に置換することを含むことが好ましい。凍結乾燥によって溶媒を離脱させる場合、溶媒を離脱させる直前の溶媒は水であることが好ましい。これによって、多孔質体の製造がより容易になる。
　本実施形態に係る多孔質体は、気泡を供給した混合物を加熱して少なくとも一部の溶媒を揮発させて、多孔質体を得る工程を含む方法によって製造することもできる。混合物及び溶媒については上述した態様を適用することができる。
　混合物の加熱温度は、溶媒の種類に応じて適宜設定することができる。例えば、混合物の加熱温度は、１００℃以上であってよく、例えば、１００～１５０℃であってよい。
　本実施形態に係る多孔質体は、上述した方法に以外に、例えば、熱水等の溶媒に溶けやすい成分を供給した混合物を固化させた後、溶媒中でその成分を除去することによって多孔質体を得る工程を含む方法、発泡剤を供給した混合物を加熱して発泡と同時に溶媒を除去することで多孔質体を得る工程を含む方法等によって製造することもできる。混合物及び溶媒については上述した態様を適用することができる。
　以下、実施例等に基づいて本開示をより具体的に説明する。ただし、本開示は以下の実施例に限定されるものではない。
＜改変フィブロインの製造＞
（１）発現ベクターの作製
　配列番号７２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ２７）を有する改変フィブロイン、配列番号６２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１７）を有する改変フィブロイン、及び配列番号６３で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１８）を有する改変フィブロインを設計した。配列番号７２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ２７）を有する改変フィブロインの平均ハイドロパシー・インデックスの値は０．４４であり、配列番号６２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１７）を有する改変フィブロインの平均ハイドロパシー・インデックスの値は０．４５であり、配列番号６３で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１８）を有する改変フィブロインの平均ハイドロパシー・インデックスの値は０．４６である。
　配列番号６２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１７）は、配列番号７２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ２７）に対し、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側のそれぞれから１番目に位置するＲＥＰ中に、それぞれ１カ所ずつシステイン残基が挿入されたものである。配列番号６２で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロインのシステイン残基の総数は２である。配列番号６３で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１８）は、配列番号７２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ２７）に対し、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側それぞれから１～２番目に位置するＲＥＰ中に、それぞれ１カ所ずつシステイン残基が挿入されたものである。配列番号６３で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロインのシステイン残基の総数は４である。
　配列番号６２、配列番号６３及び配列番号７２で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロインをコードする核酸をそれぞれ合成した。当該核酸には、５’末端にＮｄｅＩサイト、終止コドン下流にＥｃｏＲＩサイトを付加した。この核酸をクローニングベクター（ｐＵＣ１１８）にクローニングした。その後、同核酸をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理して切り出した後、タンパク質発現ベクターｐＥＴ－２２ｂ（＋）に組換えて発現ベクターを得た。
（２）タンパク質の製造
　得られた発現ベクターで、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）を形質転換した。当該形質転換大腸菌を、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養した。当該培養液を、アンピシリンを含む１００ｍＬのシード培養用培地（表４）にＯＤ６００が０．００５となるように添加した。培養液温度を３０℃に保ち、ＯＤ６００が５になるまでフラスコ培養を行い（約１５時間）、シード培養液を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000122
　当該シード培養液を５００ｍＬの生産培地（表５）を添加したジャーファーメンターにＯＤ６００が０．０５となるように添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000123
　生産培地中のグルコースが完全に消費された直後に、フィード液（グルコース４５５ｇ／１Ｌ、Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ　１２０ｇ／１Ｌ）を１ｍＬ／分の速度で添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにし、２０時間培養を行った。その後、１Ｍのイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培養液に対して終濃度１ｍＭになるよう添加し、改変フィブロインを発現誘導させた。ＩＰＴＧ添加後２０時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製した菌体を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、ＩＰＴＧ添加に依存した目的とする改変フィブロインサイズのバンドの出現によって、目的とする改変フィブロインの発現を確認した。
（３）タンパク質の精製
　ＩＰＴＧを添加してから２時間後に回収した菌体を２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の菌体を約１ｍＭのＰＭＳＦを含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁させ、高圧ホモジナイザー（ＧＥＡ　Ｎｉｒｏ　Ｓｏａｖｉ社製）で細胞を破砕した。破砕した細胞を遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、高純度になるまで２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の沈殿物を１００ｍｇ／ｍＬの濃度になるように８Ｍ　グアニジン緩衝液（８Ｍ　グアニジン塩酸塩、１０ｍＭ　リン酸二水素ナトリウム、２０ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．０）で懸濁し、６０℃で３０分間、スターラーで撹拌し、溶解させた。溶解後、透析チューブ（三光純薬株式会社製のセルロースチューブ３６／３２）を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質を遠心分離により回収し、凍結乾燥機で水分を除き、凍結乾燥粉末を回収することにより、粉末状の改変フィブロイン（ＰＲＴ１７、ＰＲＴ１８、ＰＲＴ２７）を得た。
＜実施例Ａの多孔質体の製造＞
　下記ａ），ｂ），ｃ）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）１４．２５ｇ（１２．９５ｍＬ）に投入後、窒素置換して１００℃、３００ｒｐｍで攪拌（１５ｍｉｎ）し、その後、室温で１０ｍｉｎ静置した。これにより、ＤＭＳＯ中でポリペプチド誘導体を合成して、ポリペプチド誘導体ＤＭＳＯ溶液（ポリペプチド誘導体濃度：５ｗｔ％）を調製した。
ａ）改変フィブロイン（ＰＲＴ：１７、数平均分子量５００００）：４５７ｍｇ
ｂ）ｍａｌ－ＰＥＧ－ｍａｌ（数平均分子量２００００）：２７６ｍｇ（バイオケムペグ社　ＨＯ０２２０２２－２０Ｋ）
ｃ）ＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨ（数平均分子量２０００）：１７．０ｍｇ（バイオケムペグ社　ＨＯ００３００３－２Ｋ）
　ステンレス板上に敷いたテフロンシートの外周部に厚さ２ｍｍの枠状シリコンゴムシートを貼り付けた。その後、枠状シリコンゴムシートの内側にポリペプチド誘導体ＤＭＳＯ溶液を垂らし、全体にいきわたらせた。次いで、ポリペプチド誘導体ＤＭＳＯ溶液を４℃冷蔵庫で冷却してゲル化させた（一晩）。その後、エタノールを収容した容器内にゲルをシートごと投入し（エタノール置換）、３時間静置することで、テフロンシートを剥がすと共に、ＤＭＳＯをエタノールに置換した。次に、容器内のエタノールを捨ててＲＯ水を入れ２時間静置することでエタノールを水にＲＯ置換した。その後、ＲＯ水への置換が完了したゲルを－２０℃冷凍庫で凍結させた後、凍結乾燥機で一晩乾燥させた。これにより、多孔質体（実施例Ａ）を得た。
＜比較例Ａの多孔質体の製造＞
　改変フィブロイン（ＰＲＴ１７、数平均分子量５００００）３５０ｍｇをＤＭＳＯ４．６５ｇ（４．２３ｍＬ）に投入後、窒素置換して１００℃、３００ｒｐｍで攪拌（１５ｍｉｎ）し、その後、室温で１０ｍｉｎ静置した。これにより、改変フィブロインのＤＭＳＯ溶液（改変フィブロイン濃度：７ｗｔ％）を調製した。その後、ポリペプチド誘導体ＤＭＳＯ溶液を用いる代わりに、上記改変フィブロインのＤＭＳＯ溶液を用いて、実施例Ａと同様にして、多孔質体（比較例Ａ）を得た。
＜実施例Ｂの多孔質体の製造＞
　下記ａ），ｂ），ｃ）をＤＭＳＯ４．２７５ｇ（３．８７ｍＬ）に投入後、窒素置換して１００℃、３００ｒｐｍで攪拌（１５ｍｉｎ）した。これにより、ＤＭＳＯ中でポリペプチド誘導体を合成して、ポリペプチド誘導体ＤＭＳＯ溶液（ポリペプチド誘導体濃度：５ｗｔ％）を調製した。
ａ）改変フィブロイン（ＰＲＴ１７、数平均分子量５００００）：２２５ｍｇ
ｂ）ｍａｌ－ＰＥＧ－ｍａｌ（数平均分子量２００００）：６０ｍｇ（バイオケムペグ社　ＨＯ０２２０２２－２０Ｋ）
ｃ）ＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨ　（数平均分子量２０００）：４ｍｇ（バイオケムペグ社　ＨＯ００３００３－２Ｋ）
　ハンドブレンダーを用いて、ポリペプチド誘導体ＤＭＳＯ溶液を１分間泡立てた。ステンレス板上に敷いたテフロンシートの外周部に６０×３０×２ｍｍの枠状シリコンゴムシートを貼り付けた。その後、枠状シリコンゴムシートの内側に泡立てたポリペプチド誘導体ＤＭＳＯ溶液を垂らし、全体にいきわたらせた。その後、１２０℃でポリペプチド誘導体ＤＭＳＯ溶液を１時間乾燥させた。これにより多孔質体（実施例Ｂ）を得た。
＜比較例Ｂの多孔質体の製造＞
　改変フィブロイン（ＰＲＴ１７、数平均分子量５００００）２２５ｍｇをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）４．２７５ｇ（３．８８６ｍＬ）に投入後、窒素置換して１００℃、３００ｒｐｍで攪拌（１５ｍｉｎ）した。これにより、改変フィブロインのＤＭＳＯ溶液（改変フィブロイン濃度：５ｗｔ％）を調製した。その後、実施例Ｂでポリペプチド誘導体ＤＭＳＯ溶液を用いる代わりに、上記改変フィブロインのＤＭＳＯ溶液を用いて、実施例Ｂと同様にして、多孔質体（比較例Ｂ）を得た。
＜柔軟性の評価＞
　実施例Ａ及び比較例Ａの多孔質体を用い、それらを長さ方向一端部のみにおいて片持ち状態で支持し、このときの自重による曲がり具合を観察した。その結果を図６及び図７に示す。
　図６及び図７から明らかなように、実施例Ａは自重によって曲がりが発生しているものの、比較例Ａは自重による曲がりが生じていないことが確認される。これは、ポリペプチド誘導体を含む多孔質体が、ポリペプチド誘導体を含まない多孔質体に比して優れた柔軟性を有することを示している。
実施例Ｂ及び比較例Ｂの多孔質体を用い、それら各多孔質体の長さ方向両端部を掴んで曲げた。実施例Ｂの多孔質体は亀裂等を生じさせることなく曲げることができた。比較例Ｂの多孔質体は長さ方向中央部付近に亀裂が発生した。このことからも、ポリペプチド誘導体を含む多孔質体が、ポリペプチド誘導体を含まない多孔質体よりも柔軟性に優れていることが分かる。
＜成形時の外観及びブリードアウトの評価＞
（実施例１）
　数平均分子量：５０００のメトキシポリエチレングリコールマレイミド（シグマアルドリッチ社製：第二のセグメント）を用いて、ポリペプチド誘導体を調製した。具体的には、ガラス容器に、上述のようにして調製した配列番号６３で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１８）を有する、数平均分子量：５００００の改変フィブロイン（第一のセグメント）を２５００ｍｇ、上記メトキシポリエチレングリコールマレイミドを５００ｍｇ測り取り、更に溶媒として、ヘキサフルオロイソプロピルアルコール（セントラル硝子株式会社製、ＨＦＩＰ）を５０ｍＬ加え、撹拌することで、改変フィブロイン等を溶解させ反応溶液を得た。その後、室温（２５℃）にて、反応溶液を２０時間撹拌することで反応を行った。
　２０時間が経過したところで、溶媒を留去し、粗生成物をメタノール（ナカライテスク株式会社製）で３回洗浄した。一回の洗浄にメタノール５０ｍＬを用いた。洗浄操作によって、メトキシポリエチレングリコールマレイミド等の未反応物を除去した。洗浄操作後、減圧乾燥を行うことによって、生成物（ポリペプチド誘導体）を得た。生成物に対するＳＤＳ－ＰＡＧＥによって、分子量の増大を確認し、改変フィブロインに、ポリエチレングリコール鎖が導入されていることを確認した。得られたポリペプチド誘導体は、第一のセグメント一つに対して１～４個の第二のセグメントが結合したものとなっていることを確認した。図８にＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す。図８において、１及び７レーンが分子量特定のための標準サンプルであり、２，３が配列番号６３で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１８）を有する改変フィブロインであり、４が実施例１で調製した上記ポリペプチド誘導体である。
（実施例２）
　数平均分子量が１００００であるメトキシポリエチレングリコールマレイミド（シグマアルドリッチ社製）を用いたこと、メトキシポリエチレングリコールマレイミドの配合量を２０ｍｇとしたこと、改変フィブロインを５０ｍｇとしたこと、溶媒としてヘキサフルオロイソプロピルアルコール（セントラル硝子株式会社製、ＨＦＩＰ）を１ｍＬ加えこと、及び粗生成物の一回の洗浄にメタノール１ｍＬを用いた以外は、実施例１と同様にして、ポリペプチド誘導体を調製した。生成物に対するＳＤＳ－ＰＡＧＥによって、分子量の増大を確認し、改変フィブロインに、ポリエチレングリコール鎖が導入されていることを確認した。得られたポリペプチド誘導体は、第一のセグメント一つに対して１～４個の第二のセグメントが結合したものとなっていることを確認した。図８において、５レーンが実施例２で調製したポリペプチド誘導体である。
（実施例３）
　数平均分子量が７５０であるメトキシポリエチレングリコールマレイミド（シグマアルドリッチ社製）を用いたこと、及びメトキシポリエチレングリコールマレイミドの配合量を１．５ｍｇとしたこと以外は、実施例２と同様にして、ポリペプチド誘導体を調製した。生成物に対するＳＤＳ－ＰＡＧＥによって、分子量の増大を確認し、改変フィブロインに、ポリエチレングリコール鎖が導入されていることを確認した。得られたポリペプチド誘導体は、第一のセグメント一つに対して１～４個の第二のセグメントが結合したものとなっていることを確認した。図８において、６レーンが実施例３で調製したポリペプチド誘導体である。
（比較例１）
　比較のため、システインを有しない改変フィブロインを用いて同様の実験を行った。すなわち、ガラス容器に、上述のようにして調製した配列番号７２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ２７）を有する改変フィブロイン（数平均分子量：１０００００）を２０ｍｇ、数平均分子量：５０００のメトキシポリエチレングリコールマレイミド（シグマアルドリッチ社製）を４ｍｇ測り取り、更に溶媒として、ヘキサフルオロイソプロパノール（セントラル硝子株式会社製、ＨＦＩＰ）を１ｍＬ加え、撹拌することで、改変フィブロイン等を溶解させ反応溶液を得た。その後、室温（２５℃）にて、反応溶液を２０時間撹拌することで反応を行った。
　２０時間が経過したところで、溶媒を留去し、粗生成物をメタノール（ナカライテスク株式会社製）で３回洗浄した。一回の洗浄にメタノール１ｍＬを用いた。洗浄操作によって、メトキシポリエチレングリコールマレイミド等の未反応物を除去した。洗浄操作後、減圧乾燥を行うことによって、生成物を得た。生成物に対するＳＤＳ－ＰＡＧＥによって、分子量に変化がないことが確認され、改変フィブロインと、メトキシポリエチレングリコールマレイミドとの反応が進行してないことを確認した。図９にＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す。図９において、１レーンが分子量特定のための標準サンプルであり、６レーンが生成物であり、７レーンが配列番号７２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ２７）を有する改変フィブロインである。
（比較例２）
　上述のようにして調製した配列番号７２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ２７）を有する改変フィブロイン（数平均分子量：１０００００）と、ポリエチレンオキサイドとの混合物を調製した。具体的には、容器に、上記改変フィブロイン１０ｇと、上記改変フィブロイン全量を１００質量％として、５質量％の重量となるように、ポリエチレンオキサイド（数平均分子量：４０００）を配合し、ビーズミル（日本コークス工業株式会社製、アトライター）を用いて回転数：１０００回／分の条件で１０分間、乾式混合させて、混合物を調製した。
（比較例３）
　ポリエチレンオキサイドとして、数平均分子量２００００のポリエチレンオキサイドを用いた他、比較例２と同様にして、混合物を調製した。
（比較例Ｄ）
　上述のようにして調製した配列番号７２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ２７）を有する改変フィブロイン（数平均分子量：１０００００）と、ポリエチレンオキサイドモノステアレート（４０Ｅ．Ｏ．、数平均分子量：２０００）との混合物を調製した。改変フィブロイン全量を１００質量％として、１０質量％の重量となるように、ポリエチレンオキサイドモノステアレートを配合し、エタノール（９９．５％）中で１５時間混合し、オーブンにて６０℃で５時間乾燥させて、混合物を調製した。
（評価）
　実施例１～３で調製したポリペプチド誘導体、比較例２、３及び４で調製した混合物を用いて、それぞれ以下の条件で、加熱加圧成形によって成形体を調製した。成形には、図１０に示す加圧成形機１０を用いた。図１０は、加圧成形機の模式断面図である。図１０に示す加圧成形機１０は、貫通孔が形成され加温可能な金型２と、金型２の貫通孔内で上下動が可能な上側ピン４及び下側ピン６とを備えるものであり、金型２に、上側ピン４又は下側ピン６を挿入して生じる空隙に、サンプルを導入して、金型２を加温しつつ、上側ピン４及び下側ピン６で組成物を圧縮することで、成形体を得ることができる。
　図１１を用いて、成形体を得る工程を説明する。図１１の（ａ）は組成物導入前、（ｂ）はサンプル導入直後、（ｃ）はサンプルを加熱及び加圧している状態の加圧成形機の模式断面図である。図１１の（ａ）に示すように、金型２の貫通孔に下側ピン６のみを挿入した状態で貫通孔内に組成物を導入し、図１１の（ｂ）に示すように、金型２の貫通孔に上側ピン４を挿入して下降させ、金型２の加熱を開始して、加熱加圧前のサンプル８ａを貫通孔内で加熱加圧する。あらかじめ定めた加圧力に至るまで上側ピン４を下降させ、図１１の（ｃ）に示す状態でサンプルが所定の温度に達するまで、加熱及び加圧を継続して、加熱加圧後の成形体８ｂを得る。場合によって、冷却器（例えばスポットクーラー）を用いて金型２の温度を下降させ、成形体８ｂが所定の温度になったところで、上側ピン４又は下側ピン６を金型２から抜き取り、成形体を得てもよい。加圧に関しては、下側ピン６を固定した状態で上側ピン４を下降させて実施してもよいが、上側ピン４の下降と下側ピン６の上昇の両方を実施してもよい。
　具体的にはまず、上記ポリペプチド誘導体又は上記混合物を０.６ｇ測り取り、図１０に示す加圧成形機１０の金型２（実施例１については、直径：１４ｍｍの円形状の貫通孔を有する円柱形状の金型を用い、比較例２，３及び４については、断面が３５ｍｍ×２５ｍｍの長方形状の貫通孔を有する円柱形状の金型を用いた。）の貫通孔内に導入した。この際、厚みが均等になるようにサンプルを加えていった。全てのサンプルを導入した後、金型２の加熱を開始するとともに、ハンドプレス機（ＮＰａシステム株式会社製、商品名：ＮＴ－１００Ｈ－Ｖ０９）を用いて、上側ピン４と下側ピン６を貫通孔内に挿入することでサンプルの加圧を行った。この際、サンプルの加圧条件が５０ＭＰａとなるように制御した。サンプルの温度が１５０℃に到達してから５分間経過したところで、加熱を中止し、スポットクーラー（トラスコ中山株式会社製、商品名：ＴＳ－２５ＥＰ－１）で冷却して、サンプルの温度が５０℃になったところで取り出し、バリ取りを行った後、直径：１４ｍｍ×厚さ：３．０ｍｍの円盤状の成形体（比較例２，３及び４は、縦：３５ｍｍ×横：２５ｍｍ×厚さ：３．０ｍｍの直方体形状の成形体）を得た。成形に使用した、上記成形材料及び上記混合物の水分含有量は、加熱乾燥式水分計で測定したところ、いずれも７～９質量％であった。
　得られた成形体について、外観についての目視観察、及びブリードアウトに関しての指で触り観測を行い、以下の基準で評価した。結果を表６に示す。成形体の外観を図１２、図１３及び図１４に示す。
［外観の評価基準］
Ａ：均一である。
Ｂ：均一であるが濁りがみられる。
Ｃ：不均一である。
［ブリードアウトの評価基準］
Ａ：ベタツキがない。
Ｂ：成形直後にベタツキがあるが、ふき取った後はベタツキがない。
Ｃ：ふき取ってもべたつきが残る、又は再度ベタツキが発生する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000124
　表６中、「－」は、測定を実施していないことを意味する。表６、図１２、図１３、図１４に示される結果から確認されるように、第一のセグメントと、第二のセグメントとが直接結合していることによって、実施例１～３では相分離等が確認されなかった。一方、改変フィブロインと、柔軟性の高分子との混合物である比較例１～４では、相分離及び／又はブリードアウトが発生することが確認された。
（実施例４）
　実施例１で調製した合成高分子、及び上述のようにして調製した配列番号７２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ２７）を有する人工フィブロイン（数平均分子量：１０００００）を含むフィルムを成形した。具体的には、容器にジメチルスルホキシド４．４ｇ測り取り、ここに上記人工フィブロイン０．１５ｇを測り取り、窒素下で１２０℃の条件下で１５分間撹拌し上記人工フィブロインを溶解させた。上記人工フィブロイン０．１５を更に加え、窒素下で１２０℃の条件下で３０分間撹拌し上記人工フィブロインが合計０．３０ｇ溶解した溶液を調製した。上記溶液中に、上記合成高分子０．１５ｇを測り取り、窒素下で９０℃の条件下で１５分間撹拌し上記合成高分子を溶解させた。上記合成高分子０．１５ｇを更に加え、窒素下で９０℃の条件下で３０分間撹拌させることで、上記人工フィブロイン及び上記合成高分子がそれぞれ０．３０ｇずつ溶解したドープ液を調製した。ドープ液中において、合成高分子：人工フィブロイン：ジメチルスルホキシドが、６質量％：６質量％：８８質量％となるように混合比を調整した。
　上記ドープ液を８０℃の下、３０分間静置することで脱泡させた。コーター（株式会社井元製作所製）を用いて、脱泡後のドープ液からフィルムを成形した。まず、離型部材としてＰＥＴフィルム（１５０ｍｍ×２００ｍｍ）をコーター上に設置し、アプリケーター厚さ０．５ｍｍ、塗工スピード２０ｍ／分間の条件で、４０℃の温度条件下でドープ液の液膜を上記ＰＥＴフィルム状に設けた。その後、ドープ液の液膜をＰＥＴフィルムごと、送風オーブン内に静置し、１００℃の条件下で１５分間乾燥させ、更に真空オーブンに移し、８０℃の条件下で１５時間かけて真空乾燥させ、絶乾させることで、合成高分子及び人工フィブロインからなるフィルム状の成形体（フィルム）を調製した。
　調製されたフィルムは無色透明であり、柔軟性があることが確認された。当該フィルムは曲げ応力を加えた場合であっても割れが発生しないことが確認された。
（実施例５）
　上述のようにして調製した配列番号６２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１７）を有する人工フィブロイン（数平均分子量：５００００：第一のセグメント）２３００ｍｇと、数平均分子量２０，０００のポリエチレングリコールビスマレイミド、（Ｂｉｏｃｈｅｍｐｅｇ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ．製、ＨＯ０２２０２２－２０Ｋ：第二のセグメント）９００ｍｇをナスフラスコ内で１１５ｍＬの溶媒（ＤＭＳＯ、キシダ化学株式会社製）に溶解させた後、トリエチルアミン（ナカライテスク株式会社製）１２μＬを加え、８０℃で１７時間撹拌しながら反応を行なった。酢酸エチル（関東化学株式会社製）３００ｍＬ、さらにヘキサン（関東化学株式会社製）３００ｍＬを加え、２時間静置して生成物を沈殿させた。さらに遠心（１，０００ｇ×１０分）を行い、上清を除去した。未反応のポリエチレングリコールビスマレイミドを除去するため、酢酸エチルを再度添加、遠心、上清除去を３回繰り返した。更に、減圧乾燥を行う事により生成物を得た。調製された合成高分子は、人工フィブロイン（第一のセグメントに相当）の分子鎖末端に、ポリエチレングリコール鎖を有するＮ置換マレイミド（第二のセグメントに相当）が結合したブロックが複数繰り返された構造を有する。すなわち、当該合成高分子は、第二のセグメント、第一のセグメント、及び第二のセグメントの順に３つのセグメントが結合した分子となっている。
　上述のとおり調製した合成高分子を含むフィルムを成形した。具体的には、容器にジメチルスルホキシド４．５５ｇ測り取り、ここに上記合成高分子０．４５ｇを加え、窒素下で９０℃の条件下で３０分間撹拌させることで、上記合成高分子が溶解したドープ液を調製した。撹拌速度は１００ｒｐｍに設定した。ドープ液中において、合成高分子：ジメチルスルホキシドが、９質量％：９１質量％となるように混合比を調整した。
　上記ドープ液を用いて、実施例４と同様にしてフィルム状の成形体（フィルム）を調製した。調製されたフィルムは無色透明であり、実施例４のフィルムよりもより柔軟性に優れることが確認された。当該フィルムは曲げ応力を加えた場合であっても割れが発生しないことが確認された。
（実施例６）
　上述のようにして調製した配列番号６２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１７）を有する人工フィブロイン（数平均分子量：５００００：第一のセグメント）１４２４ｍｇと、数平均分子量２０，０００のメトキシポリエチレングリコールマレイミド、（Ｂｉｏｃｈｅｍｐｅｇ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ．製、ＭＦ００１０２２－２０Ｋ：第二のセグメント）１０７６ｍｇをナスフラスコ内で７１ｍＬの溶媒（ＤＭＳＯ、キシダ化学株式会社製）に溶解させた後、トリエチルアミン（ナカライテスク株式会社製）７．５μＬを加え、８０℃で１７時間撹拌しながら反応を行なった。酢酸エチル（関東化学株式会社製）２１０ｍＬ、さらにヘキサン（関東化学株式会社製）２１０ｍＬを加え、１７時間静置して生成物を沈殿させた。さらに遠心（１，０００ｇ×１０分）を行い、上清を除去した。未反応のメトキシポリエチレングリコールマレイミドを除去するため、酢酸エチルを再度添加、遠心、上清除去を３回繰り返した。更に減圧乾燥を行う事によって合成高分子を得た。調製された合成高分子は、人工フィブロイン（第一のセグメントに相当）の分子鎖の両末端に、ポリエチレングリコール鎖を有するＮ置換マレイミド（第二のセグメントに相当）が結合した構造を有する。すなわち、当該合成高分子は、第二のセグメント、第一のセグメント、及び第二のセグメントの順に３つのセグメントが結合した分子となっている。
　上述のとおり調製した合成高分子を含むフィルムを成形した。具体的には、容器にジメチルスルホキシド４．３０ｇ測り取り、ここに上記合成高分子０．７０ｇを加え、窒素下で９０℃の条件下で３０分間撹拌させることで、上記合成高分子が溶解したドープ液を調製した。撹拌速度は１００ｒｐｍに設定した。ドープ液中において、合成高分子：ジメチルスルホキシドが、１４質量％：８６質量％となるように混合比を調整した。
　上記ドープ液を用いて、実施例４と同様にしてフィルム状の成形体（フィルム）を調製した。調製されたフィルムは無色透明であり、実施例４のフィルムよりもより柔軟性に優れることが確認された。当該フィルムは曲げ応力を加えた場合であっても割れが発生しないことが確認された。
（実施例７）
　両末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコール（バイオケムペグ社製、数平均分子量：２００００）と、システイン残基を２つ有する人工フィブロインとを反応させ、合成高分子を調製した。具体的には、上述のように調製した配列番号６２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１７）を有する人工フィブロイン（数平均分子量：５００００）４.０２２ｇと、両末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコール１.５６４ｇと、溶媒としてジメチルスルホキシド２０１ｍＬとをナスフラスコに測り取り、８０℃で４８時間撹拌し溶解及び反応させ、合成高分子の溶液を得た。得られた溶液に、酢酸エチル６０３ｍＬ、及びヘキサン６０３ｍＬを加えて２時間攪拌し、遠心分離を行った後、さらに酢酸エチルで３回洗浄した。その後、エバポレーターで乾燥させて、最後に室温で真空乾燥させて合成高分子の粉末を得た。
（実施例８）
　両末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコール（バイオケムペグ社製、数平均分子量：２００００）と、システイン残基を２つ有する人工フィブロインとを、反応させ、合成高分子を調製した。具体的には、上述のように調製した配列番号６２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１７）を有する人工フィブロイン（数平均分子量：５００００）３４８ｍｇをステンレス容器に測り取り、溶媒としてジメチルスルホキシド２.１１ｍＬを加え、撹拌し溶解させてフィブロイン溶液を得た。両末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコール１３２ｍｇをガラス容器に測り取り、溶媒としてジメチルスルホキシド１.０９ｍＬを加え、撹拌し溶解させてポリエチレングリコール溶液を得た。得られたフィブロイン溶液とポリエチレングリコール溶液とを撹拌しながら混合し、１００℃で５分間撹拌しながら反応させた後、更に１００℃で１０分間静置させ反応させることによって合成高分子を調製した。実施例８では、ジメチルスルホキシドに合成高分子が溶解したままの状態で、乾燥させることなく、後述するフィルム成形に供した。
（実施例９）
　両末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコール（バイオケムペグ社製、数平均分子量：２００００）と、システイン残基を２つ有する人工フィブロインと、システイン残基を４つ有する人工フィブロインとを反応させ、合成高分子を調製した。具体的には、上述のように調製した配列番号６２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１７）を有する人工フィブロイン（数平均分子量：５００００、システイン残基の総数２）３３６ｍｇと、配列番号６３で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１８）を有する人工フィブロイン（数平均分子量：５３１００、システイン残基の総数４）４４ｍｇと、両末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコール１６０ｍｇとをガラス容器に測り取り、溶媒としてジメチルスルホキシド４.４２ｍＬを加え、撹拌しながら上述の成分を溶解させることで反応溶液を得た。得られた反応溶液を１００℃で１０分間撹拌しながら反応させた後、更に１００℃で５分間静置させ反応させることによって、合成高分子を調製した。実施例９では、ジメチルスルホキシドに合成高分子が溶解したままの状態で、乾燥させることなく、後述するフィルム成形に供した。
（実施例１０）
　両末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコール（バイオケムペグ社製、数平均分子量：２００００）と、チオール基を２つ有する２、２’－（エチレンジオキシ）ジエタンチオール、システイン残基を２つ有する人工フィブロインとを反応させ、合成高分子を調製した。具体的には、上述のように調製した配列番号６２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１７）を有する人工フィブロイン（数平均分子量：５００００）３００ｍｇと、両末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコール２８４ｍｇとをガラス容器に測り取り、溶媒としてジメチルスルホキシド３.４２ｍＬを加え、撹拌し各成分を溶解させることで反応溶液を得た。得られた反応溶液を１００℃で１５分間撹拌し反応させた後、２、２’－（エチレンジオキシ）ジエタンチオール１.５５ｍｇを更に加え、１００℃で１０分間撹拌させ反応させることによって、合成高分子を調製した。実施例１０では、ジメチルスルホキシドに合成高分子が溶解したままの状態で、乾燥させることなく、後述するフィルム成形に供した。
（実施例１１）
　両末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコール（バイオケムペグ社製、数平均分子量：１０００）と、両末端にシステイン残基を有する（即ち、両末端にチオール基を有する）ポリエチレングリコール（バイオケムペグ社製、数平均分子量：２０００）と、システイン残基を２つ有する人工フィブロインとを反応させ、合成高分子を調製した。具体的には、上述のように調製した配列番号６２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１７）を有する人工フィブロイン（数平均分子量：５００００）３７８ｍｇと、両末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコールを７９ｍｇと、両末端にシステイン残基を有するポリエチレングリコール１４３ｍｇとをバイアル瓶に測り取り、溶媒としてジメチルスルホキシド４．４０ｍＬを加え、撹拌し溶解させることで反応溶液を得た。反応溶液を１００℃で１０分間撹拌しながら反応させたのち、更に１００℃で１０分間静置させ反応させることによって合成高分子を調製した。実施例１１では、ジメチルスルホキシドに合成高分子が溶解したままの状態で、乾燥させることなく、後述するフィルム成形に供した。
（比較例５）
　実施例７～１１で調製された合成高分子との比較のために、上述のようにして調製した配列番号７２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ２７）を有する人工フィブロイン（分子量：１０００００）を用い、類似の操作を加えた。具体的には、上述のようにして調製した配列番号７２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ２７）を有する人工フィブロイン（分子量：１０００００）の粉末６５０ｍｇをステンレス容器に測り取り、溶媒としてジメチルスルホキシド３.９５５ｍＬを加え、撹拌し分散液を得た。得られた分散液を１２０℃で、３０分間撹拌し溶解した後、更に１００℃で１０分間静置させた。比較例５では、ジメチルスルホキシドに人工フィブロインが溶解したままの状態で、乾燥させることなく、後述するフィルム成形に供した。
＜成形体の評価＞
　実施例７～１１で調製された合成高分子を用いて、以下の条件でフィルム状の成形体を作製した。実施例７で調製された合成高分子については、まず合成高分子の粉末５３０ｍｇをジメチルスルホキシド３.５３ｍＬに加え、９０℃で４０分間攪拌させることによって、上記粉末を溶解させてドープ溶液を調製し、次いで８０℃で３０分間静置し、脱泡させたものをフィルム成形に供した。実施例８～１１で調製された合成高分子は、ジメチルスルホキシドに溶解させたまま、乾燥させることなく、ドープ溶液としてフィルム成形に供した。比較例５の人工フィブロインも同様にジメチルスルホキシドに溶解したまま、乾燥させることなくドープ溶液としてフィルム成形に供した。
　まず、離型部材としてＰＥＴフィルム（１５０ｍｍ×２００ｍｍ）を用意し、アプリケーターで厚さ０．４ｍｍとなるようにドープ溶液の液膜を、上記ＰＥＴフィルム上に設けた。その後、上記液膜をＰＥＴフィルムごと、送風オーブン内に静置し、６０℃の条件下で３０分間乾燥させ、更に真空オーブンに移し、８０℃の条件下で１５時間かけて真空乾燥させ、絶乾させることによって合成高分子又は人工フィブロインからなるフィルム状の成形体（フィルム）を調製した。
　調製された各フィルムに対して引張試験を行うことで、弾性率、引張強度、破断伸度、及びタフネスを評価した。結果を表７に示す。表７には絶乾状態におけるフィルムの膜厚も併記した。表７に示す破断伸度は、比較例５で得られた結果を基準とする相対値で記した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000125
　表７に示されるとおり、実施例７～１１で得られたフィルムは、比較例５で得られたフィルムと比べて、破断伸度が極めて大きく、且つ弾性率が低く抑制されていることがわかる。このことからも、実施例７～１１で得られたフィルムは柔軟性に十分に優れることが確認できる。くわえて、実施例７～１１で得られたフィルムはタフネスも十分に優れたものとなっている。
　実施例７及び実施例８の結果から、一旦粉体として合成高分子を単離し再度溶解させてからフィルムを調製するよりも反応後の溶液から直接フィルムを成形することによって弾性率、破断伸度及びタフネスに優れるフィルムを調製できることが確認できた。実施例８、実施例１０及び実施例１１の結果から、第二のセグメントを構成する柔軟さを調製することによって、得られるフィルムの柔軟性を調製することができ、第二のセグメントを長くすることによって、その傾向が顕著となることが確認された。
（実施例１２）
　上述のようにして調製した配列番号６２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１７）を有する人工フィブロイン（数平均分子量：５００００：第一のセグメント）２１７７ｍｇと、数平均分子量２００００のポリエチレングリコールビスマレイミド、（Ｂｉｏｃｈｅｍｐｅｇ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ．製、ＨＯ０２２０２２－２０Ｋ：第二のセグメント）８２３ｍｇを塩化リチウムの濃度が２Ｍのジメチルスルホキシド溶液（ＤＭＳＯ、キシダ化学株式会社製）１２０００ｍｇに溶解させた後、窒素下で、１００℃で４時間撹拌しながら反応させることで、上記合成高分子が溶解したドープ液を調製した。撹拌速度は１００ｒｐｍに設定した。ドープ液中において、合成高分子：ジメチルスルホキシドが、２０質量％：８０質量％となるように混合比を調整した。得られたドープの１００℃における粘度は、１０９００ｍＰａ・ｓであった。調製されたドープ液中の合成高分子は、人工フィブロイン（第一のセグメントに相当）の分子鎖末端に、ポリエチレングリコール鎖を有するＮ置換マレイミド（第二のセグメントに相当）が結合したブロックが複数繰り返された構造を有する。
　上記ドープ液を用いて、以下に示す条件で乾湿式紡糸することによって、繊維を調製した。１００℃のドープ液をノズル（ノズル直径：０．１ｍｍ）からギアポンプによって窒素ガスと共に押出しし、第一凝固浴（第１浴）、第二凝固浴（第２浴）、及び延伸浴（第３浴）を通過させた後、６０℃に設定した加熱式ローラーによって巻き取った。延伸浴での延伸倍率は８．５倍に設定した。第１浴は０℃のメタノール浴とし、第２浴は２５℃のメタノール浴とし、第３浴は５４℃の水浴とした。得られた繊維は十分な伸張性を有することを確認した。得られた繊維の外観を図１５に示す。
＜参考例１：構造タンパク質の疎水性評価（溶解性）＞
　改変フィブロイン（人工フィブロイン）、シルクフィブロイン（平均ハイドロパシー・インデックスの値：０．２１）について、９Ｍ臭化リチウム水溶液への溶解性を評価した。シルクフィブロインとしては、ＫＢセーレン社製の「シルクパウダーＩＭ」を用い、改変フィブロインとしては、上述のようにして調製した配列番号６２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１７）を有する改変フィブロイン（数平均分子量：５００００）、及び上述のようにして調製した配列番号７２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ２７）を有する改変フィブロイン（数平均分子量：１０００００）を用いた。溶解性の評価は、具体的には、９Ｍ臭化リチウム水溶液にそれぞれシルクフィブロイン、改変フィブロインを所定量添加し、６０℃で３０分間撹拌した後の水溶液の外観を観察することによって、溶解性を評価した。結果を表７に示す。表７中、「Ａ」は添加したフィブロインが完全に溶解し、設定した濃度の溶液を調製できたことを示し、「Ｂ」はフィブロインの解け残りが観察されたことを示す。すなわち、改変フィブロインは６０℃の９Ｍ臭化リチウム水溶液に対しても５質量％相当の量も溶解させることができない、疎水性の高いフィブロインであることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000126
＜参考例２：構造タンパク質の疎水性評価（耐熱水性）＞
　改変フィブロイン（人工フィブロイン）、シルクフィブロインについて、熱水耐性試験を行い、耐熱水性を評価した。シルクフィブロインとしては、ＫＢセーレン社製の「シルクパウダーＩＭ」を用い、改変フィブロインとしては、上述のようにして調製した配列番号６２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１７）を有する改変フィブロイン（数平均分子量：５００００）を用いた。フィブロインの含有量が５質量％となるように、ガラス容器にフィブロイン５０ｍｇ、溶媒としてＲＯ水を９５０ｍｇ加えて分散液を調製した。当該分散液を１００℃で５時間撹拌した。５時間が経過したところで、遠心分離によって溶媒を除去した。溶媒を除去後アセトンで２回洗浄し、遠心分離によってアセトンを除去した。洗浄操作後、減圧乾燥を行うことによって処理粉末を得た。処理粉末に対するＧＰＣ測定によって、分解の程度を確認した。ＧＰＣの結果を図１６に示す。図１６から明らかなように、シルクフィブロインは処理前に比べて分子量の減少が確認され、改変フィブロインにはそのような分子量の減少が確認されなかった。この結果から、上記の改変フィブロインはＲＯ水に対する親水性がシルクフィブロインよりも低かったためと推定される。換言すれば、上記改変フィブロインは疎水性が高いといえる。図１６中、配列番号６２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１７）を有する改変フィブロイン（数平均分子量：５００００）の結果をＰＲＴ１００と記す。
＜参考例３：構造タンパク質の疎水性評価（接触角）＞
　改変フィブロイン（人工フィブロイン）、シルクフィブロインについて、水に対する接触角の測定及び評価を行った。シルクフィブロインとしては、ＫＢセーレン社製の「シルクパウダーＩＭ」を用い、改変フィブロインとしては、上述のようにして調製した配列番号６２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１７）を有する改変フィブロイン（数平均分子量：５００００）、及び上述のようにして調製した配列番号７２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ２７）を有する改変フィブロイン（数平均分子量：１０００００）を用いた。接触角の測定は、具体的にはまず、フィブロインの含有量が３質量％となるように、ガラス容器にフィブロイン３０ｍｇ、溶媒としてジメチルスルホキシド９７０ｍｇを加え、分散液を調製した。当該分散液を１００℃で１５分間撹拌してジメチルスルホキシド溶液を調製した。次に、スライドガラス上に、厚さ１００μｍのマスキングテープを貼り付けシムにして、上述のようにして調製したジメチルスルホキシド溶液をキャストし液膜を形成した。その後、スライドガラスごと、真空オーブン（東京理科危機社製、製品名：ＶＯＳ－２１０Ｃ）内に移動、静置し、８０℃で減圧乾燥を行うことでフィブロインのフィルム（膜）を形成した。当該フィルムに対して、２μＬのＲＯ水を滴下し、５秒間経過後の水の接触角を、接触角計（共和界面科学社製、製品名：ＤＭｓ－０６１）を用いて測定した。測定は各フィブロインに対して、６サンプルで行い、その平均値を評価に用いた。結果を表８及び図１７に示す。表８に示すとおり、シルクフィブロインに比べて改変フィブロインは水の接触角が大きく、疎水性が高いことが確認された。図１７中、シルクフィブロインの結果を左に示し、配列番号６２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ１７）を有する改変フィブロインの結果を右に示し、配列番号７２で示されるアミノ酸配列（ＰＲＴ２７）を有する改変フィブロインの結果を中央に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000127
＜参考例４：ポリペプチド誘導体の構造評価＞
　下記２種類のキャストフィルム（ポリペプチド誘導体フィルム、改変フィブロイン＋ＰＥＧ混合体フィルム）を作製した。２種類のキャストフィルムの光学顕微鏡１００倍観察結果と、走査型電子顕微鏡１０００倍観察結果をそれぞれ図１８及び図１９に示す。
　図１８（ａ）及び図１８（ｂ）はそれぞれポリペプチド誘導体フィルム及び改変フィブロイン＋ＰＥＧ混合体フィルムを１００倍に拡大して示す光学顕微鏡写真である。図１９（ａ）及び図１９（ｂ）はそれぞれポリペプチド誘導体フィルム及び改変フィブロイン＋ＰＥＧ混合体フィルムを１０００倍に拡大して示す走査型電子顕微鏡写真である。
　ポリペプチド誘導体とその原料である改変フィブロイン（ＰＲＴ１７、数平均分子量５００００）のＧＰＣチャートを図２０に示す。
　図１８～２０より、ポリペプチド誘導体フィルムは顕微鏡観察では明確な相分離構造は確認されず、フィブロインとＰＥＧが化学的に結合した結果、分子量の増加が見られたことが確認された。
（ポリペプチド誘導体フィルムの作製）
　下記ａ），ｂ）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０．９２ｇ（０．８４ｍＬ）に投入後、窒素置換して１００℃、３００ｒｐｍで攪拌（１５分）し、その後、室温で１０分静置した。これにより、ＤＭＳＯ中でポリペプチド誘導体を合成して、ポリペプチド誘導体溶液（ポリペプチド誘導体濃度：８ｗｔ％）を調製した。
ａ）改変フィブロイン（ＰＲＴ１７、数平均分子量５００００）：５８ｍｇ
ｂ）ｍａｌ－ＰＥＧ－ｍａｌ（数平均分子量２００００）：２２ｍｇ（バイオケムペグ社　ＨＯ０２２０２２－２０Ｋ）
　ステンレス板に張り付けた離型紙上に、ポリペプチド誘導体溶液を垂らした後、ドクターブレードでならして、幅８０ｍｍ、厚さ４００μｍでキャストした。その後、キャストしたポリペプチド誘導体溶液を６０℃の送風オーブンで３０分乾燥した後、８０℃で１５時間、真空乾燥した。これにより、ポリペプチド誘導体フィルムを作製した。
（改変フィブロイン＋ＰＥＧ混合体フィルムの作製）
　下記ａ），ｂ）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０．９２ｇ（０．８４ｍＬ）に投入して混合溶液を調整する他は、上記のポリペプチド誘導体フィルムと同じ方法で改変フィブロイン＋ＰＥＧ混合体フィルムを作製した。
ａ）改変フィブロイン（ＰＲＴ２７、数平均分子量１０００００）：５８ｍｇ
ｂ）ＰＥＧ（数平均分子量２００００）：２２ｍｇ（和光純薬工業株式会社）
　本開示によれば、柔軟性に優れる多孔質体を提供できる。本開示によれば、第一のセグメントに対して導入する第二のセグメントの選択によって、ポリペプチド誘導体の物性及び機能を調整することが可能である。ひいては、上記ポリペプチド誘導体を用いて調製される多孔質体の物性及び機能を調整し得る。
　２…金型、４…上側ピン、６…下側ピン、８ａ…サンプル、８ｂ…成形体、１０…加圧成形機。

Claims (19)

  1. 　ポリペプチド誘導体を含み、
    　前記ポリペプチド誘導体が、ポリペプチド骨格を含む第一のセグメントと、
    　前記第一のセグメントに結合する一又は複数の第二のセグメントと、を有するブロック共重合体を含み、
    　前記ポリペプチド骨格が、組換えポリペプチド骨格であり、
    　前記第二のセグメントが前記ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団を含む、多孔質体。
  2. 　ポリペプチド誘導体を含み、
    　前記ポリペプチド誘導体が、ポリペプチド骨格を含む第一のセグメントと、
    　前記第一のセグメントに結合する一又は複数の第二のセグメントと、を有するブロック共重合体を含み、
    　前記ポリペプチド骨格が、疎水性ポリペプチド骨格であり、
    　前記第二のセグメントが前記ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団を含む、多孔質体。
  3. 　前記ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団の分子量が、前記ポリペプチド骨格の分子量を１００としたときに、１０以上である、請求項１又は２に記載の多孔質体。
  4. 　前記ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団の分子量が、前記ポリペプチド骨格の分子量を１００としたときに、１００以下である、請求項３に記載の多孔質体。
  5. 　前記第二のセグメントの合計の分子量が、前記第一のセグメントの分子量１００を基準として、１０以上である、請求項１又は２に記載の多孔質体。
  6. 　前記第二のセグメントの合計の分子量が、前記第一のセグメントの分子量１００を基準として、２０００以下である、請求項５に記載の多孔質体。
  7. 　前記ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団が、ポリエーテル、ポリエステル、又はポリカーボネートである、請求項１～６のいずれか一項に記載の多孔質体。
  8. 　前記ポリエーテルが、ポリエチレングリコールである、請求項７に記載の多孔質体。
  9. 　前記ポリペプチド骨格が疎水性組換えポリペプチド骨格である、請求項１～８のいずれか一項に記載の多孔質体。
  10. 　前記ポリペプチド骨格の平均ハイドロパシー・インデックスが０．２２以上である、請求項１～９のいずれか一項に記載の多孔質体。
  11. 　前記ポリペプチド骨格が組換えタンパク質に由来する骨格を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の多孔質体。
  12. 　前記組換えタンパク質が組換え構造タンパク質を含む、請求項１１に記載の多孔質体。
  13. 　前記組換え構造タンパク質が改変フィブロインを含む、請求項１２に記載の多孔質体。
  14. 前記改変フィブロインが改変クモ糸フィブロインを含む、請求項１３に記載の多孔質体。
  15. 　前記第一のセグメントが前記ポリペプチド骨格中のチオール基、アミノ基及びヒドロキシ基からなる群より選択される少なくとも１種の官能基によって前記第二のセグメントと結合している、請求項１～１４のいずれか一項に記載の多孔質体。
  16. 　ポリペプチド誘導体及び溶媒を含む混合物をゲル化させる工程Ａと、
    　ゲル化した前記混合物から前記溶媒を離脱させることにより、前記ポリペプチド誘導体を含む多孔質体を得る工程Ｂと、を含み、
    　前記ポリペプチド誘導体が、ポリペプチド骨格を含む第一のセグメントと、
    　前記第一のセグメントに結合する一又は複数の第二のセグメントと、を有するブロック共重合体を含み、
    　前記ポリペプチド骨格が、組換えポリペプチド骨格であり、
    　前記第二のセグメントが前記ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団を含む、多孔質体を製造する方法。
  17. 　ポリペプチド誘導体及び溶媒を含む混合物をゲル化させる工程Ａと、
    　ゲル化した前記混合物から前記溶媒を離脱させることにより、前記ポリペプチド誘導体を含む多孔質体を得る工程Ｂと、を含み、
    　前記ポリペプチド誘導体が、ポリペプチド骨格を含む第一のセグメントと、
    　前記第一のセグメントに結合する一又は複数の第二のセグメントと、を有するブロック共重合体を含み、
    　前記ポリペプチド骨格が、疎水性ポリペプチド骨格であり、
    　前記第二のセグメントが前記ポリペプチド骨格に対する可塑化機能を有する分子団を含む、多孔質体を製造する方法。
  18. 　前記工程Ｂにおいて、ゲル化した前記混合物を凍結乾燥させることにより、ゲル化した前記混合物から前記溶媒を離脱させる、請求項１６又は１７に記載の多孔質体を製造する方法。
  19. 　前記溶媒が有機溶媒であり、
    　前記工程Ｂにおいて、凍結乾燥させる前にゲル化した前記混合物中の前記溶媒を水に置換することを含む、請求項１８に記載の多孔質体を製造する方法。

     
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