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WO2022230919A1 - 細胞の製造方法 - Google Patents

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WO2022230919A1
WO2022230919A1 PCT/JP2022/019017 JP2022019017W WO2022230919A1 WO 2022230919 A1 WO2022230919 A1 WO 2022230919A1 JP 2022019017 W JP2022019017 W JP 2022019017W WO 2022230919 A1 WO2022230919 A1 WO 2022230919A1
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WO
WIPO (PCT)
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cells
vascular endothelial
sinusoidal
cell
interleukin
Prior art date
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PCT/JP2022/019017
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English (en)
French (fr)
Inventor
貴則 武部
憲和 佐伯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Tokyo Medical and Dental University NUC
Original Assignee
Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Tokyo Medical and Dental University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to US18/557,836 priority patent/US20240228972A1/en
Priority to EP22795832.9A priority patent/EP4332215A4/en
Priority to CN202280031352.6A priority patent/CN117242171A/zh
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    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
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    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing sinusoidal endothelial cells from sinusoidal endothelial progenitor cells and a cell population containing sinusoidal endothelial cells.
  • Sinusoidal vascular endothelial cells which constitute sinusoids, are important for maintaining the functions of parenchymal cells in the liver and bone marrow.
  • cultured cells are self-organized, and three-dimensional structures of organs and complex structures of blood vessels and other vessels are created. Research and development is underway to create reproducible cell structures, i.e., organ organoids. ), it is expected that the utility value of organoids will further increase.
  • Sinusoidal vascular endothelial cells from the liver, etc. are in poor condition when collected and separated from the body, and it is difficult to maintain the state and characteristics of sinusoidal vascular endothelial cells. Therefore, sinusoidal vascular endothelial cells are generally produced in a culture environment by differentiation induction from sinusoidal vascular endothelial progenitor cells, which are the progenitor cells. As methods for producing sinusoidal vascular endothelial cells, for example, the following methods are known.
  • Non-Patent Document 1 after inducing differentiation from human iPS cells to hepatic sinusoidal endothelial cell precursors (LSEC progenitors), liver sinusoidal endothelial cell precursors at low oxygen concentration, TGFb1 type receptor inhibitor It is described that differentiation into CD32+ hepatic sinusoidal vascular endothelial cells (LSECs) was induced by long-term (14 days) treatment with (A83-01). The purity of hepatic sinusoidal vascular endothelial cells in the cell population obtained by the method described in Non-Patent Document 1 is about less than 40%.
  • Non-Patent Document 2 after inducing differentiation from human ES cells to hemangioblasts, at hypoxic or normoxic concentrations, by treatment with AMP, TGFb inhibitor, bFGF, etc., CD32 + liver sinusoids It is described that they were induced to differentiate into vascular endothelial cells.
  • the purity of hepatic sinusoidal vascular endothelial cells in the cell population obtained by the method described in Non-Patent Document 2 is 38.7% at normal oxygen concentration and 90.1% at low oxygen concentration.
  • the method for producing sinusoidal vascular endothelial cells from sinusoidal vascular endothelial progenitor cells has room for improvement, such as improving the purity of sinusoidal vascular endothelial cells in the resulting cell population.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing sinusoidal vascular endothelial cells that is improved over conventional methods.
  • the present inventors have found that at least one substance selected from the interleukin 6 (IL-6) family, such as interleukin 6 (IL-6), oncostatin M (OSM), interleukin 11 (IL-11) Culturing sinusoidal endothelial progenitor cells in a medium containing (cytokines, etc.) improves the purity of sinusoidal endothelial cells in the resulting cell population, especially when cultured at normal oxygen concentration It has also been found that high purities (eg, 95% or higher) can be achieved.
  • IL-6 interleukin 6
  • OSM oncostatin M
  • IL-11 interleukin 11
  • a method for producing sinusoidal endothelial cells from sinusoidal endothelial progenitor cells comprising: A method comprising culturing sinusoidal endothelial progenitor cells in a medium containing one or more substances selected from the interleukin-6 (IL-6) family.
  • IL-6 interleukin-6
  • one or more substances selected from the IL-6 family are at least interleukin 6 (IL-6), oncostatin M (OSM), interleukin 11 (IL-11), ciliary neurotrophic factor (CNTF) ), leukemia inhibitory factor (LIF), cardiotrophin 1 (CT-1), cardiotrophin-like cytokine 1 (CLC), interleukin 27 (IL-27), interleukin 35 (IL-35), interleukin 35 (IL-35), The method of [1], comprising Leukin-39 (IL-39), or a combination thereof.
  • the method of [1], wherein the one or more substances selected from the IL-6 family comprises at least IL-6, OSM, IL-11, or a combination thereof.
  • the hepatic sinusoidal vascular endothelial progenitor cells are yolk sac vein hematopoietic vascular endothelial cells or endocardial endothelial cells, and the sinusoidal vascular endothelial cells are hepatic sinusoidal vascular endothelial cells of [1] to [4].
  • the medium further contains vascular endothelial growth factor (VEGF).
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • sinusoidal vascular endothelial cells can be produced more efficiently than before, especially with high purity even at normal oxygen concentration.
  • sufficiently mature sinusoidal vascular endothelial cells expressing predetermined cell markers can be produced.
  • FIG. 1 shows the results of [4] “Analysis of differentiation markers of vascular endothelial cells using flow cytometry” in Example 1.
  • FIG. "+OSM” indicates the case where oncostatin M was added to the medium as an IL-6 family substance, and "-OSM” indicates the case where oncostatin M was not added as a control (also in FIG. 2).
  • [A] The left column shows the results of expression of CD34 (vertical axis) and CD43 (horizontal axis) of yolk sac vein hematopoietic endothelial cells (hereinafter referred to as "iVVHEC”) differentiated from iPS cells. show.
  • iVVHEC yolk sac vein hematopoietic endothelial cells
  • the right column shows the results of the expression of ICAM1 (vertical axis) and CD32 (horizontal axis) in (hepatic) sinusoidal vascular endothelial cells (hereinafter referred to as "iSEC") induced to differentiate from iPS cells.
  • iSEC sinusoidal vascular endothelial cells
  • [B] Left column shows results for iVVHEC CD34 (vertical axis) and CD43 (horizontal axis) expression.
  • the right column shows the results for iSEC CD73 (vertical axis) and CD184 (horizontal axis) expression.
  • FIG. 2 shows the results of [5] “Analysis of differentiation markers of cell populations by immune cell staining” in Example 1.
  • the cells in "Day 10 iVVHEC” also show a certain amount of green, which indicates the expression of CD31, and white, which indicates the expression of CD32b, but the cells in "Day 20 iSEC” are strongly stained with these two colors.
  • Lower row fluorescence images of CD32b, Factor VIII and DAPI.
  • the cells in "Day 10 iVVHEC” also show a certain amount of red, which indicates the expression of Factor VIII, and white, which indicates the expression of CD32b, but the cells in "Day 20 iSEC” are strongly stained with those two colors.
  • Fluorescence images of CD31, STAB1, LYVE1 and DAPI are [B] Fluorescence images of CD31, STAB1, LYVE1 and DAPI.
  • FIG. 3 shows the results of “Analysis of differentiation markers of vascular endothelial cells using flow cytometry” in Example 2.
  • (-) indicates when no IL-6 family substance was added as a control
  • +IL-6, IL-11 indicates when IL-6 and IL-11 were added to the medium as IL-6 family substances
  • +OSM is when oncostatin M is added to the medium as an IL-6 family substance
  • +IL-6, IL-11, OSM is IL-6, IL-11 and oncostatin M as IL-6 family substances. The case where it added to the culture medium is shown, respectively.
  • Liver Sinusoidal Endothelial Cell LSEC Liver Sinusoidal Endothelial Progenitor Cell: LSEPC Vitelline Venous Hemogenic Endothelial Cell VVHEC Yolk Sac Mesoderm Cell: YSMC Sinusoidal Endothelial Cell: SEC Sinusoidal Endothelial Progenitor Cell: SEPC
  • pluripotent stem cell refers to a cell that can differentiate into various tissues and cells with different morphologies and functions in the body, ectoderm) refers to stem cells that have the ability to differentiate into cells of any lineage. Pluripotent stem cells that can be used in the present invention are not particularly limited. Embryonic stem cells derived from cloned embryos obtained, spermatogonial stem cells, embryonic germ cells and the like can be mentioned.
  • iPS cells Induced pluripotent stem cells
  • iPS cells refer to cells obtained by reprogramming mammalian somatic cells or undifferentiated stem cells by introducing specific factors (nuclear reprogramming factors).
  • iPSCs induced pluripotent stem cells, and iPSCs established by Yamanaka et al. (Takahashi K, Yamanaka S., Cell, (2006) 126: 663-676), and human cell-derived iPSCs established by introducing the same four factors into human fibroblasts (Takahashi K, Yamanaka S. , et al.
  • Nanog-iPS cells were established by selecting Nanog expression as an indicator (Okita, K., Ichisaka, T., and Yamanaka, S. (2007). Nature 448, 313-317.), iPS cells generated by c-Myc-free method (Nakagawa M, Yamanaka S., et al. Nature Biotechnology, (2008) 26, 101 - 106), iPS cells established by introducing 6 factors by virus-free method (Okita K et al. Nat. Methods 2011 May;8(5):409-12, Okita K et al. Stem Cells. 31( 3):458-66.) can also be used.
  • induced pluripotent stem cells established by introducing the four factors of OCT3/4, SOX2, NANOG, and LIN28 produced by Thomson et al. (Yu J., Thomson JA. et al., Science (2007) 318: 1917-1920.), induced pluripotent stem cells produced by Daley et al. (Park IH, Daley GQ. et al., Nature (2007) 451: 141-146), induced pluripotent stem cells produced by Sakurada et al. (Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2008-307007) and the like can also be used.
  • iPS cell lines established by NIH, RIKEN (RIKEN), Kyoto University, etc. can be used as induced pluripotent stem cells (iPS cells).
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • human iPS cell lines RIKEN's HiPS-RIKEN-1A, HiPS-RIKEN-2A, HiPS-RIKEN-12A, and Nips-B2 strains, Kyoto University's 201B7, 253G1, and 253G4 strains, 409B2 strain, 454E2 strain, 606A1 strain, 610B1 strain, 625A4 strain, 648A1 strain, 1201C1 strain, 1205D1 strain, 1210B2 strain, 1231A3 strain, 1383D2 strain, 1383D6 strain, and the like.
  • clinical grade cell lines provided by Kyoto University, Cellular Dynamics International, etc., and research and clinical cell lines produced using these cell lines may be used.
  • mouse ESCs can use various mouse ES cell lines established by inGenious targeting laboratory, RIKEN (RIKEN), etc., and human ES cells , NIH, RIKEN, Kyoto University, and various human ES cell lines established by Cellartis are available.
  • human ES cell lines include NIH CHB-1 to CHB-12, RUES1, RUES2, HUES1 to HUES28 strains, WisCell Research H1 and H9 strains, RIKEN KhES-1 and KhES- 2 strains, KhES-3 strain, KhES-4 strain, KhES-5 strain, SSES1 strain, SSES2 strain, SSES3 strain, etc. can be used.
  • clinical grade cell lines and research and clinical cell lines generated using those cell lines may be used.
  • the term “cell marker” refers to a gene that is specifically expressed (positive marker) or not expressed (negative marker) in a given cell type, specifically as mRNA by transcription of the gene in the genome , or a substance that is produced (positive marker) or not produced (negative marker) as a protein by translation of its mRNA.
  • the cell marker is preferably a protein expressed on the cell surface (cell surface marker) that can be labeled (stained) with a fluorescent substance, and can easily detect, concentrate, isolate, etc. cells expressing the cell marker. is.
  • a marker gene is "positive” means that the expression level of the mRNA or protein of the gene is detectable by a technique commonly used or known to those skilled in the art, or is lower than a predetermined threshold (background level, etc.) means high.
  • Marker gene is "strongly positive” means that the expression level of mRNA or protein of the gene is “strongly positive”, which is set higher than the usual threshold value for determining whether it is “positive” is higher than a predetermined threshold for determining
  • the marker gene is "negative” the expression level of mRNA or protein of the gene is undetectable or lower than a predetermined threshold (background level, etc.) by a method commonly used or known to those skilled in the art. means that
  • Whether a cell marker is positive or negative can be determined with qualitative or quantitative results by methods commonly known to those skilled in the art.
  • a cell marker as a protein can be detected or its expression level can be measured using an immunological assay using an antibody specific to the protein, such as ELISA, immunostaining, flow cytometry, and the like.
  • Cell markers as mRNA are detected or the expression level is measured using assays using nucleic acids specific to the mRNA, such as RT-PCR (including quantitative PCR), microarrays, biochips, etc. be able to.
  • the cells used in the present invention may be derived from humans or non-human animals such as mammals such as mice, rats, dogs, pigs, and monkeys.
  • non-human animals such as mammals such as mice, rats, dogs, pigs, and monkeys.
  • the cells are preferably derived from humans.
  • “Comprise, include, contain, etc.” means the inclusion of elements following the phrase, but is not limited to this. Thus, the inclusion of the elements following the phrase, but not the exclusion of any other element, is suggested.
  • “consisting of,” means including and limited to any and all elements following the phrase. Thus, the phrase “consisting of” indicates that the listed element is required or required and that other elements are substantially absent.
  • “consisting essentially of, etc.” includes any element following the phrase and is limited to other elements that do not affect the activity or action specified in this disclosure for that element. means to be Thus, the phrase “consisting essentially of” indicates that the listed elements are required or required but other elements are optional and that they affect the activity or action of the listed elements. indicates that it may or may not be present, depending on whether it exerts
  • the method for producing cells of the present invention is a method for producing sinusoidal vascular endothelial cells (SEC) from sinusoidal vascular endothelial progenitor cells (SEPC), wherein one selected from interleukin 6 (IL-6) family or A method comprising the step of culturing SEPCs in a medium containing more substances (hereinafter sometimes referred to as "IL-6 family substances").
  • SEC sinusoidal vascular endothelial cells
  • SEPC sinusoidal vascular endothelial progenitor cells
  • IL-6 family substances A method comprising the step of culturing SEPCs in a medium containing more substances (hereinafter sometimes referred to as "IL-6 family substances").
  • SEC Seusoidal vascular endothelial cells
  • LSEC liver sinusoidal vascular endothelial cells
  • LSEC vascular endothelial cells
  • SEPCs Sepatic sinusoidal vascular endothelial progenitor cells
  • SEPC is not limited to hepatic sinusoidal vascular endothelial progenitor cells (hepatic sinusoidal vascular endothelial progenitor cells), but also various other cells other than the liver such as bone marrow, pituitary gland, spleen, renal glomerulus, and adrenal glands.
  • the progenitor cells of sinusoidal endothelial cells in the organs and tissues of can be used in the production method of the present invention.
  • the production method of the present invention extracts corresponding liver and other organs from SEPCs derived from the liver and other organs and tissues. It can be used to induce differentiation of SECs derived from cells and tissues.
  • the sinusoidal vascular endothelial progenitor cells are hepatic sinusoidal vascular endothelial progenitor cells (LSEPC) and the sinusoidal vascular endothelial cells (SEC) are hepatic sinusoidal vascular endothelial cells (LSEC). .
  • Liver sinusoidal vascular endothelial cells are cells known to have CD32 (more specifically CD32b) and ICAM1 (CD54) as major cell markers. These cells are known to have factors, STAB1, and LYVE1 as cell markers. Specifically, when CD32 is positive and ICAM1 is strongly positive, preferably at least one (more preferably two, particularly preferably three) of factor VIII, STAB1 or LYVE1 is positive In that case, the cell can be determined to be LSEC (if the condition is not met, the cell is a cell other than LSEC).
  • the vascular endothelial cell positive marker CD31 is also a positive marker for LSEC and other SECs.
  • sinusoids are mainly capillary structures of the venous system, and CD73, a positive marker for venous endothelial cells, and CXCR4, a negative marker, are also positive and negative markers for LSEC and other SECs, respectively. .
  • Hepatic sinusoidal vascular endothelial progenitor cells refer to cells that have the ability to differentiate into hepatic sinusoidal vascular endothelial cells (LSEC) and correspond to LSEC progenitor cells.
  • LSEPCs include, for example, yolk sac venous hematopoietic vascular endothelial cells (VVHEC) and endocardial endothelial cells (EEC).
  • Yolk sac vein hematopoietic vascular endothelial cells are hematopoietic vascular endothelial cells (HEC) derived from the yolk sac mesoderm, and are known to be cells responsible for hematopoiesis in the yolk sac in the early fetal period.
  • VVHEC is a cell known to have CD34 as a major cell marker, as well as FN1, ACTA2 and LYVE1, and vein markers such as NR2F2, APLNR and PROX1 as cell markers.
  • the cell when at least CD34 is positive and preferably at least one cell marker selected from the group consisting of FN1, ACTA2, LYVE1, NR2F2, APLNR and PROX1 is positive, the cell is VVHEC. (If the condition is not satisfied, the cell is a cell other than VVHEC).
  • the vascular endothelial cell positive marker CD31 is also a positive marker for VVHEC.
  • CD43 is also a negative marker for VVHEC.
  • Endocardial endothelial cells are another type of endothelial cells that exist in vivo along with vascular endothelial cells.
  • EEC is a cell known to have major cell markers such as CD34, CD31 and VE-cadherin, and other cell markers such as NFATC1, NRG1 and NKX2-5.
  • major cell markers such as CD34, CD31 and VE-cadherin
  • other cell markers such as NFATC1, NRG1 and NKX2-5.
  • at least one selected from the group consisting of CD34, CD31 and VE-cadherin is positive, and preferably at least one cell marker selected from the group consisting of NFATC1, NRG1 and NKX2-5 is positive.
  • the cell can be determined to be an EEC (if the condition is not met, the cell is a non-EEC cell).
  • the sinusoidal endothelial progenitor cells (SEPC) used in the cell production method of the present invention can be prepared by a known method.
  • pluripotent stem cells such as iPS cells and ES cells can be induced to differentiate into LSEPCs and other SEPCs (via lateral plate mesoderm cells and the like).
  • Examples of such a method include a method of inducing the differentiation of pluripotent stem cells such as iPS cells into lateral plate mesoderm cells, and then further inducing the differentiation into yolk vein hematopoietic vascular endothelial cells (VVHEC) (WO2020). /203713, [2] Production of human hematopoietic vascular endothelial cells).
  • SECs can be obtained by culturing SEPCs in a medium containing an IL-6 family substance.
  • SEPCs are usually cultured in two-dimensional culture (flat culture).
  • the culture vessel for two-dimensional culture is not particularly limited, and dishes, flasks, microplates, cell culture sheets such as the trade name "OptiCell” (Nunc) and the like can be used.
  • Culture vessels are surface-treated to improve cell adhesion (hydrophilicity), collagen, gelatin, poly-L-lysine, poly-D-lysine, laminin, fibronectin, matrigel (e.g., BD Matrigel (Japan) It is preferably coated with a substrate for cell adhesion such as Becton Deckinson)), vitronectin or the like.
  • a substrate for cell adhesion such as Becton Deckinson
  • Substances belonging to the "IL-6 family” refer to cytokines and the like that share gp130 as a signal transducing substance (receptor). , interleukin 11 (IL-11), interleukin 27 (IL-27), interleukin 35 (IL-35), interleukin 39 (IL-39), leukemia inhibitory factor (LIF), oncostatin M (oncostatin M: OSM), cardiotrophin 1 (CT-1), ciliary neurotrophic factor (CNTF), cardiotrophin-like cytokine 1 (CLC ) are known.
  • LIF leukemia inhibitory factor
  • oncostatin M oncostatin M: OSM
  • CT-1 cardiotrophin 1
  • CNTF ciliary neurotrophic factor
  • CLC cardiotrophin-like cytokine 1
  • any one selected from these IL-6 families can be used singly or in combination.
  • the IL-6 family substance preferably includes at least IL-6, OSM, IL-11, or any combination thereof, more preferably at least OSM. Any combination includes, for example, a combination of IL-6 and IL-11 or a combination of IL-6, IL-11 and OSM.
  • the concentration of the IL-6 family substance in the medium is not particularly limited. and the composition of the medium (basal medium and other components used in combination with the IL-6 family substance).
  • the concentration of the IL-6 family substance in the medium can be, for example, in the range of 5-100 ⁇ M, preferably 5-20 ⁇ M.
  • basal medium for preparing the medium used in the present invention examples include DMEM/F-12 (Gibco), Stempro-34 SFM (Gibco), Essential 6 medium (Gibco), Essential 8 medium (Gibco), EGM ( Lonza), EGM-2 (Lonza), EGM-2 MV (Lonza), HCM (Gibco), BulletKit (Lonza), VascuLife EnGS Comp Kit (LCT), Human Endothelial-SFM Basal Growth Medium (Invitrogen), Human Microvascular endothelial cell growth medium (TOYOBO);
  • Additives (other than IL-6 family substances) for preparing the medium used in the present invention include, for example, B27 Supplements (GIBCO), BMP4 (bone morphogenetic factor 4), GSK ⁇ inhibitor (e.g., CHIR99021), VEGF (vascular endothelial cell growth factor), FGF2 (fibroblast growth factor (bFGF (basic fibroblast growth factor))), Folskolin, SCF (stem cell factor), TGF ⁇ receptor inhibitor (e.g., SB431542), ROCK inhibitor ( Y-27632), Flt-3L (Fms-related tyrosine kinase 3 ligand), IL-3 (interleukin 3), TPO (thrombopoietin), hEGF (recombinant human epidermal growth factor), hydrocortisone, ascorbic acid , IGF1, FBS (fetal bovine serum), antibiotics (eg, gentamicin, amphotericin B), heparin, L-glut
  • the medium used in the method for producing cells of the present invention preferably contains vascular endothelial growth factor (VEGF).
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • concentration of VEGF in the medium can be, for example, in the range of 5-80 ⁇ M, preferably 5-10 ⁇ M.
  • Cultivation of SEPCs in the present invention can be performed at normal oxygen concentration (particularly unregulated concentration, for example, about 21%), and even in that case, a cell population with higher purity of SECs than conventional can be obtained. , at low oxygen concentrations (eg less than 10%, for example about 5%).
  • the SEPC culture period in the present invention is not particularly limited, and can be, for example, a period until the number of SEPCs in the cell population is sufficiently increased to achieve the desired purity, which is usually 6 to 20 days. , preferably 6 to 14 days.
  • the cell population of the present invention is a cell population containing SECs obtained by the above-described cell production method of the present invention. According to the cell production method of the present specification, a cell population with relatively high SEC purity can be obtained (without requiring separate steps such as purification, purification, and concentration).
  • the purity of SEC in the cell population is not particularly limited as long as the desired degree of purity is achieved depending on the application of the cell population.
  • the purity can be 80% or higher, 85% or higher, 90% or higher, or 95% or higher.
  • the "purity" of a specific cell is a numerical value represented by the ratio of the number of cells to the total number of cells in the cell population. It can be measured by a simple method. Also in the present invention, for example, samples are collected from the cell population obtained by the method for producing cells of the present invention, and fluorescent immunostaining is performed for SEC cell markers (e.g., markers described separately herein). After that, the purity of SECs in that cell population can be determined by measurement using flow cytometry.
  • the use of the cell population of the present invention is not particularly limited, and can be used for various purposes using SEC.
  • the SECs contained in) the cell populations of the present invention can be utilized to generate organoids or three-dimensional organs of sinusoidal organs or tissues such as liver, bone marrow, and the like.
  • Day represents the number of days from the initiation of differentiation induction of human iPS cell colonies.
  • Day 0 is the start of the culture in step [1] below.
  • Example 1 Preparation of hepatic sinusoidal vascular endothelial cells by addition of oncostatin M [experimental method] [1] Preparation of human yolk sac mesoderm cells Human iPS cells (625A4; iPS Research Institute, Kyoto University) were placed in AK02N (Ajinomoto) (10 cm dish; 8 ml, 24-well plate; 0.5 ml) in 5% CO 2 , Culture was continued at 37° C. until iPS cell colonies with a diameter of 500-700 ⁇ m were formed (about 6-7 days).
  • the resulting colonies were added to Essential 8 medium (Gibco) (10 cm dish; 8 ml, 24-well plate; 0.5 ml) with BMP4 (80 ng/ml), VEGF (80 ng/ml) and CHIR99021 (2 ⁇ M).
  • Essential 8 medium Gibco
  • BMP4 80 ng/ml
  • VEGF 80 ng/ml
  • CHIR99021 2 ⁇ M
  • Human yolk sac mesoderm cells were produced by culturing in a medium at 5% CO 2 at 37° C. for 2 days (Day 0-2).
  • Stempro-34 SFM (Gibco) (10 cm dish; 8 ml) was added with VEGF (80 ng/ml), SCF (50 ng/ml), Flt-3L (50 ng/ml), IL-3 (50 ng/ml), IL- 6 (50 ng/ml) and TPO (5 ng/ml) were added to the medium, cultured at 5% CO 2 at 37° C. for 2 days (Day 5-6), and VEGF was removed from the medium having the above composition.
  • CD34-positive and CD32-positive yolk sac vein hematopoietic endothelial cells (iVVHEC) were induced by replacing the medium and culturing at 37° C. in 5% CO 2 for 2 days (Day 7-8).
  • the cells were suspended in a PBS(-) buffer containing 1 mM EDTA and 4% FBS and counted. Dispense 1 ⁇ 10 8 or less cells, centrifuge under the same conditions, suspend in PBS(-) buffer containing 300 ⁇ l of 1 mM EDTA and 4% FBS, and add 1 ⁇ l per 1 ⁇ 10 6 cells.
  • a CD34 MicroBead Kit (Miltenyi) was added, mixed, and left on ice for 30 minutes.
  • EGM (Lonza) medium at a volume ratio of 1:1, VEGF (5 ng/mL), Y-27632 (10 ⁇ M) (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) were added to the hepatic sinusoidal endothelial cell induction medium.
  • 1 ⁇ 10 5 cells and 2 ⁇ 10 5 cells were coated on a 24-well plate or a 12-well plate, respectively, coated with Matrigel (BD Pharmingen) diluted 50-fold with PBS(-) at 37° C. for 30 minutes.
  • the cells were seeded and cultured at 37° C. in 5% CO 2 for 6 days or longer (Days 9-14 and thereafter) to obtain cell populations containing hepatic sinusoidal vascular endothelial cells.
  • the medium was exchanged with a hepatic sinusoidal vascular endothelial cell-inducing medium excluding Y-27632 (10 ⁇ M) the next day after seeding, and then every two days.
  • yolk sac vein hematopoietic vascular endothelial cells were cultured in the same manner as above except that OSM (final concentration 10 ng/ml) was not added to obtain a cell population containing hepatic sinusoidal vascular endothelial cells.
  • Fig. 1 [A] The results are shown in Fig. 1 [A]. It can be seen that the production method of the present invention using oncostatin M yielded a cell population containing CD32 + ICAM1 (CD54) ++ LSEC (iSEC) with extremely high purity (95% or more) from CD34 + VVHEC (iVVHEC).
  • the primary antibody solution was 1/50 PE-CD184 (BioLegend, Cat: 306506), BV421-CD34 (BD Biosciences, Cat: 562577), APC-CD73 (Miltenyi Biotec, Cat: 130-095-183), BV786-CD43 (BD Biosciences, Cat: 744662) in BD Horizon Brilliant TM Stain Buffer was used in the same manner as described above to obtain an antibody-stained cell suspension and analyze differentiation markers by flow cytometry. did. The results are shown in FIG. 1[B].
  • the cell population obtained by the production method of the present invention using oncostatin M contains cells having CD73+CXCR4-, indicating that oncostatin induces this surface marker profile of venous vascular endothelial cells.
  • LSEC contained in the cell population obtained by the production method of the present invention not only expresses (positive) CD31 and CD32 on the cell surface, but also secretes a large amount of factor VIII protein. I know there is.
  • the primary antibody solution was 1/100 Anti- Stabilin-1 (NOVUS Bio, H00023166-M05), 1/100 Anti-CD31 (Abcam, ab28364), 1/100 Anti-LYVE1 (R&D, AF2089) antibodies Set the secondary antibody solution to the secondary antibody corresponding to each primary antibody (1/1000, Alexa Flor 555, 1/1000, Alexa Flor 594, 1/1000, Alexa Flor 647) and 1/1000 DAPI-HCB (Hycult Biotech, HM2167) was added to the solution, but immunocytostaining was performed in the same manner as above. As a control, immune cell staining was also performed on the cells in which oncostatin M was not added in steps [1] to [3].
  • LSECs contained in the cell population obtained by the production method of the present invention express STAB1 and LYVE1 proteins as sinusoidal endothelial markers in addition to the CD32 and factor VIII proteins described above. .
  • Example 2 Preparation of hepatic sinusoidal vascular endothelial cells by adding IL-6 and IL-11 After performing the steps [1] and [2] in the same manner as in Example 1, in step [3], A cell population containing hepatic sinusoidal endothelial cells was obtained by using any one of the following 1) to 3) as the hepatic sinusoidal endothelial cell induction medium. 2) is obtained by repeating substantially the same steps as in the first embodiment. 1) Mix EGM (Lonza) medium with 5% FBS Gold (Biosera), IL-6 (10 ng/ml) and IL-11 (5 ng/ml) in HCM (Lonza) at a volume ratio of 1:1.
  • VEGF 5 ng/mL
  • Y-27632 10 ⁇ M
  • HCM hepatic sinusoidal endothelial cell induction medium 2
  • VEGF (5 ng/mL) and Y-27632 (10 ⁇ M) were added to a 1:1 volume ratio of EGM (Lonza) medium and EGM (Lonza) medium to induce liver sinusoidal endothelial cells 3) HCM (Lonza) 5% FBS Gold (Biosera), IL-6 (10ng/ml), IL-11 (5ng/ml) and OSM (20ng/ml) mixed with EGM (Lonza) medium at a volume ratio of 1:1 Liver sinusoidal endothelial cell induction medium with VEGF (5 ng/mL) and Y-27632 (10 ⁇ M) added to

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Abstract

【課題】従来よりも改善された類洞血管内皮細胞の製造方法を提供する。　【解決手段】類洞血管内皮前駆細胞から類洞血管内皮細胞を製造する方法であって、インターロイキン６（ＩＬ－６）ファミリーから選択される一種またはそれ以上の物質、例えば、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、インターロイキン６（ＩＬ－６）、インターロイキン１１（ＩＬ－１１）など、を含む培地で類洞血管内皮前駆細胞を培養する工程を含む方法。

Description

細胞の製造方法
　本発明は、類洞血管内皮前駆細胞から類洞血管内皮細胞を製造する方法および類洞血管内皮細胞を含む細胞集団に関する。
発明の背景
　肝臓や骨髄には「類洞」と呼ばれる、細胞内および細胞間に大小の孔を有し、また基底膜も不連続な層でしかない毛細血管が張り巡らされている。類洞を構成している類洞血管内皮細胞は、肝臓や骨髄の実質細胞の機能を維持する上で重要である。例えば、肝臓などの各種の臓器の疾患に対する医薬品開発や再生医療の実現を目指すために、培養細胞を自己組織化させ、臓器の三次元的な構造や、血管その他の脈管の複雑な構造を再現した細胞構造体、すなわち臓器オルガノイドを作製するための研究開発が進められているが、肝臓のオルガノイドに肝類洞血管に相当する構造を再現できれば、移植手術や、血漿タンパク質（例えば第VIII因子）の産生にも利用することができるといった、オルガノイドの利用価値がさらに高まることが期待される。
　肝臓等の類洞血管内皮細胞は、生体から採取して分離した場合は細胞の状態が悪く、類洞血管内皮細胞としての状態や特性を維持することが困難である。そのため、類洞血管内皮細胞は、培養環境下で、その前駆細胞である類洞血管内皮前駆細胞からの分化誘導により製造することが一般的である。類洞血管内皮細胞の製造方法としては、例えば次のようなものが知られている。非特許文献１には、ヒトｉＰＳ細胞から肝類洞血管内皮細胞前駆体（LSEC progenitors）へと分化誘導した後、肝類洞血管内皮細胞前駆体を低酸素濃度で、ＴＧＦｂ１型受容体阻害剤（A83-01）を用いて長期間（１４日間）処理することにより、ＣＤ３２＋肝類洞血管内皮細胞（LSECs）へと分化誘導したことが記載されている。この非特許文献１に記載の方法により得られた細胞集団における肝類洞血管内皮細胞の純度は４０％未満程度である。非特許文献２には、ヒトＥＳ細胞から血管芽細胞へと分化誘導した後、低酸素濃度または通常酸素濃度で、ＡＭＰ、ＴＧＦｂ阻害剤、ｂＦＧＦ等を用いて処理することにより、ＣＤ３２＋肝類洞血管内皮細胞へと分化誘導したことが記載されている。この非特許文献２に記載の方法により得られた細胞集団における肝類洞血管内皮細胞の純度は、通常酸素濃度では３８．７％、低酸素濃度では９０．１％である。
Koui et al, Stem Cell Reports, 9, 490-498, 2017 Gage et al, Cell Stem Cell, 27, 254-269, 2020
　類洞血管内皮前駆細胞から類洞血管内皮細胞を製造する方法には、例えば得られる細胞集団中の類洞血管内皮細胞の純度をより向上させるなど、改善の余地があった。
　本発明は、従来よりも改善された類洞血管内皮細胞の製造方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、インターロイキン６（ＩＬ－６）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、インターロイキン１１（ＩＬ－１１）など、インターロイキン６（ＩＬ－６）ファミリーから選択される少なくとも１種の物質（サイトカイン等）を含む培地で、類洞血管内皮前駆細胞を培養することにより、得られる細胞集団中の類洞血管内皮細胞の純度が向上すること、特に通常酸素濃度で培養した場合であっても高い純度（例えば９５％以上）を達成できることを見出した。
　すなわち、本発明は少なくとも下記の事項を含む。
［１］
　類洞血管内皮前駆細胞から類洞血管内皮細胞を製造する方法であって、
　インターロイキン６（ＩＬ－６）ファミリーから選択される一種またはそれ以上の物質を含む培地で類洞血管内皮前駆細胞を培養する工程を含む方法。
［２］
　ＩＬ－６ファミリーから選択される一種またはそれ以上の物質が、少なくともインターロイキン６（ＩＬ－６）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、インターロイキン１１（ＩＬ－１１）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、カルジオトロフィン１（ＣＴ－１）、カルジオトロフィン様サイトカイン１（ＣＬＣ）、インターロイキン２７（ＩＬ－２７）、インターロイキン３５（ＩＬ－３５）、インターロイキン３９（ＩＬ－３９）、または、それらの組み合わせを含む、［１］に記載の方法。
［３］
　ＩＬ－６ファミリーから選択される一種またはそれ以上の物質が、少なくともＩＬ－６、ＯＳＭ、ＩＬ－１１、またはそれらの組み合わせを含む、［１］に記載の方法。
［３a］
　ＩＬ－６ファミリーから選択される一種またはそれ以上の物質が、ＩＬ－６、ＯＳＭ、ＩＬ－１１、またはそれらの組み合わせである、［１］に記載の方法。
［４］
　ＩＬ－６ファミリーから選択される一種またはそれ以上の物質が、少なくともＯＳＭを含む、［１］に記載の方法。
［４ａ］
　ＩＬ－６ファミリーから選択される一種またはそれ以上の物質が、ＯＳＭである、［１］に記載の方法。
［５］
　類洞血管内皮前駆細胞が、肝類洞血管内皮前駆細胞であり、類洞血管内皮細胞が、肝類洞血管内皮細胞である、［１］～［４］のいずれか一項に記載の方法。
［５ａ］
　肝類洞血管内皮前駆細胞が、卵黄嚢静脈造血性血管内皮細胞または心内膜内皮細胞であり、類洞血管内皮細胞が、肝類洞血管内皮細胞である、［１］～［４］のいずれか一項に記載の方法。
［６］
　肝類洞血管内皮前駆細胞が、卵黄嚢静脈造血性血管内皮細胞である、［５］に記載の方法。
［７］
　前記培地が、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）をさらに含む、［１］～［６］のいずれか一項に記載の方法。
［８］
　前記類洞血管内皮前駆細胞が多能性幹細胞から誘導されたものである［１］～［７］のいずれか一項に記載の方法。
［９］
　［１］～［８］のいずれか一項に記載の方法により得られた類洞血管内皮細胞を含む細胞集団。
　本発明の製造方法により、従来よりも効率的に、特に通常酸素濃度であっても高い純度で、類洞血管内皮細胞を製造することができる。また、本発明の製造方法により、所定の細胞マーカーを発現した、十分に成熟した類洞血管内皮細胞を製造することができる。
図１は、実施例１の［４］「フローサイトメトリーを用いた血管内皮細胞の分化マーカー解析」の結果を示す。「＋ＯＳＭ」はＩＬ－６ファミリー物質としてオンコスタチンＭを培地に添加した場合、「－ＯＳＭ」は対照としてオンコスタチンＭを添加しなかった場合を示す（図２においても同様）。［Ａ］左列は、ｉＰＳ細胞から分化誘導された卵黄嚢静脈造血性血管内皮細胞（以下、「ｉＶＶＨＥＣ」と呼ぶ。）のＣＤ３４（縦軸）およびＣＤ４３（横軸）の発現についての結果を示す。右列は、ｉＰＳ細胞から分化誘導された（肝）類洞血管内皮細胞（以下、「ｉＳＥＣ」と呼ぶ。）のＩＣＡＭ１（縦軸）およびＣＤ３２（横軸）の発現についての結果を示す。［Ｂ］左列は、ｉＶＶＨＥＣのＣＤ３４（縦軸）およびＣＤ４３（横軸）の発現についての結果を示す。右列は、ｉＳＥＣのＣＤ７３（縦軸）およびＣＤ１８４（横軸）の発現について結果を示す。 図２は、実施例１の［５］「免疫細胞染色による細胞集団の分化マーカー解析」の結果を示す。［Ａ］上段：ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３１およびＤＡＰＩの蛍光画像。カラー画像では、「Ｄａｙ１０　ｉＶＶＨＥＣ」における細胞も、ＣＤ３１の発現を示す緑色およびＣＤ３２ｂの発現を示す白色が一定程度認められるが、「Ｄａｙ２０　ｉＳＥＣ」における細胞は、それらの２色で強く染色されている。下段：ＣＤ３２ｂ、Ｆａｃｔｏｒ　ＶＩＩＩおよびＤＡＰＩの蛍光画像。カラー画像では、「Ｄａｙ１０　ｉＶＶＨＥＣ」における細胞も、Ｆａｃｔｏｒ　ＶＩＩＩの発現を示す赤色およびＣＤ３２ｂの発現を示す白色が一定程度認められるが、「Ｄａｙ２０　ｉＳＥＣ」における細胞は、それらの２色で強く染色されている。［Ｂ］ＣＤ３１、ＳＴＡＢ１、ＬＹＶＥ１およびＤＡＰＩの蛍光画像。カラー画像では、「＋ＯＳＭ」における細胞は、ｉＯＭＤａｙ１０　ｉＶＶＨＥＣ」における細胞も、ＣＤ３１の発現を示す赤色、ＳＴＡＢ１の発現を示す緑色、ＬＹＶＥ１の発現を示す白色、いずれも強く染色されているが、「－ＯＳＭ」における細胞は、ＣＤ３１の発現を示す赤色は一定程度認められるものの、ＳＴＡＢ１の発現を示す緑色およびＬＹＶＥ１の発現を示す白色はほとんど認められない。 図３は、実施例２の「フローサイトメトリーを用いた血管内皮細胞の分化マーカー解析」の結果を示す。「（－）」は対照としてＩＬ－６ファミリー物質を添加しなかった場合、「＋ＩＬ－６、ＩＬ－１１」はＩＬ－６ファミリー物質としてＩＬ－６およびＩＬ－１１を培地に添加した場合、「＋ＯＳＭ」はＩＬ－６ファミリー物質としてオンコスタチンＭを培地に添加した場合、「＋ＩＬ－６、ＩＬ－１１、ＯＳＭ」はＩＬ－６ファミリー物質としてＩＬ－６、ＩＬ－１１およびオンコスタチンＭを培地に添加した場合をそれぞれ示す。
－定義－
　・略語
　本明細書では、以下の略語を用いることがある。
　肝類洞血管内皮細胞（Liver Sinusoidal Endothelial Cell）：ＬＳＥＣ
　肝類洞血管内皮前駆細胞（Liver Sinusoidal Endothelial Progenitor Cell）：ＬＳＥＰＣ
　卵黄嚢静脈造血性血管内皮細胞（Vitelline Venous Hemogenic Endothelial Cell）ＶＶＨＥＣ
　卵黄嚢中胚葉（Yolk Sac Mesoderm Cell）：ＹＳＭＣ
　類洞血管内皮細胞（Sinusoidal Endothelial Cell）：ＳＥＣ
　類洞血管内皮前駆細胞（Sinusoidal Endothelial Progenitor Cell）：ＳＥＰＣ
　・多能性幹細胞
　本明細書において「多能性幹細胞（pluripotent stem cell）」とは、生体の種々の異なった形態や機能を持つ組織や細胞に分化でき、三胚葉（内胚葉、中胚葉、外胚葉）のどの系統の細胞にも分化し得る能力を有する幹細胞を指す。本発明において使用可能な多能性幹細胞は、特に限定されないが、例えば、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞と称することもある）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞と称することもある）、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹細胞、精子幹細胞、胚性生殖細胞などが挙げられる。
　「人工多能性幹細胞」（ｉＰＳ細胞）とは、哺乳動物体細胞または未分化幹細胞に、特定の因子（核初期化因子）を導入して再プログラミングすることにより得られる細胞を指す。現在、「人工多能性幹細胞」にはさまざまなものがあり、山中らにより、マウス線維芽細胞にOct3/4・Sox2・Klf4・c-Mycの４因子を導入することにより、樹立されたiPSC（Takahashi K, Yamanaka S., Cell, (2006) 126: 663-676）のほか、同様の４因子をヒト線維芽細胞に導入して樹立されたヒト細胞由来のiPSC（Takahashi K, Yamanaka S., et al. Cell, (2007) 131: 861-872.）、上記４因子導入後、Nanogの発現を指標として選別し、樹立したNanog-iPS細胞（Okita, K., Ichisaka, T., and Yamanaka, S. (2007). Nature 448, 313-317.）、c-Mycを含まない方法で作製されたiPS細胞（Nakagawa M, Yamanaka S., et al. Nature Biotechnology, (2008) 26, 101 - 106）、ウイルスフリー法で6因子を導入して樹立されたiPS細胞（Okita K et al. Nat. Methods 2011 May;8(5):409-12, Okita K et al. Stem Cells. 31(3):458-66.）も用いることができる。また、Thomsonらにより作製されたOCT3/4・SOX2・NANOG・LIN28の４因子を導入して樹立された人工多能性幹細胞（Yu J., Thomson JA. et al., Science (2007) 318: 1917-1920.）、Daleyらにより作製された人工多能性幹細胞（Park IH, Daley GQ. et al., Nature (2007) 451: 141-146）、桜田らにより作製された人工多能性幹細胞（特開2008-307007号）等も用いることができる。このほか、公開されている全ての非特許文献（例えば、Shi Y., Ding S., et al., Cell Stem Cell, (2008) Vol3, Issue 5,568-574；、Kim JB., Scholer HR., et al., Nature, (2008) 454, 646-650；Huangfu D., Melton, DA., et al., Nature Biotechnology, (2008) 26, No 7, 795-797）または特許文献（例えば、特開2008-307007号、特開2008-283972号、US2008/2336610、US2009/047263、WO2007/069666、WO2008/118220、WO2008/124133、WO2008/151058、WO2009/006930、WO2009/006997、WO2009/007852）に記載されている、当該分野で公知の人工多能性幹細胞のいずれも用いることができる。
　人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）としては、NIH、理研（理化学研究所）、京都大学等が樹立した各種iPS細胞株が利用可能である。例えば、ヒトiPS細胞株であれば、理研のHiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株、京都大学の201B7株、253G1株、253G4株、409B2株、454E2株、606A1株、610B1株、625A4株、648A1株、1201C1株、1205D1株、1210B2株、1231A3株、1383D2株、1383D6株等が挙げられる。あるいは、京都大学やCellular Dynamics International等から提供される臨床グレードの細胞株並びにそれらの細胞株を用いて作製された研究用および臨床用の細胞株等を用いてもよい。
　「胚性幹細胞」（ＥＳ細胞）としては、マウスESCであれば、inGenious targeting laboratory社、理研（理化学研究所）等が樹立した各種マウスES細胞株が利用可能であり、ヒトES細胞であれば、NIH、理研、京都大学、Cellartis社が樹立した各種ヒトES細胞株が利用可能である。たとえば、ヒトES細胞株としては、NIHのCHB-1～CHB-12株、RUES1株、RUES2株、HUES1～HUES28株等、WisCell ResearchのH1株、H9株、理研のKhES-1株、KhES-2株、KhES-3株、KhES-4株、KhES-5株、SSES1株、SSES2株、SSES3株等を利用することができる。あるいは、臨床グレードの細胞株並びにそれらの細胞株を用いて作製された研究用および臨床用の細胞株等を用いてもよい。
　・細胞マーカー
　本明細書において「細胞マーカー」は、所定の細胞型において特異的に発現する（陽性マーカー）または発現しない（陰性マーカー）遺伝子、具体的にはゲノム中の当該遺伝子の転写によるｍＲＮＡとして、またはそのｍＲＮＡの翻訳によるタンパク質として、生成する（陽性マーカー）または生成しない（陰性マーカー）物質を指す。細胞マーカーは、好ましくは蛍光物質により標識（染色）可能であり、当該細胞マーカーを発現している細胞の検出、濃縮、単離等を容易に行える、細胞表面に発現するタンパク質（細胞表面マーカー）である。
　マーカー遺伝子が「陽性」であるとは、その遺伝子のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現量が、当業者にとって一般的または公知の手法により、検出可能である、または所定の閾値（バックグラウンドレベル等）よりも高いことを意味する。マーカー遺伝子が「強陽性」であるとは、その遺伝子のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現量が、「陽性」であるかを判定するための通常の閾値より高く設定された、「強陽性」であるかを判定するための所定の閾値よりも高いことを意味する。マーカー遺伝子が「陰性」とは、その遺伝子のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現量が、当業者にとって一般的または公知の手法により、検出不可能である、または所定の閾値（バックグラウンドレベル等）よりも低いことを意味する。
　細胞マーカーが陽性であるか陰性であるかは、当業者にとって一般的または公知の手法により、定性的または定量的な結果をもって判定することができる。タンパク質としての細胞マーカーは、当該タンパク質に特異的な抗体を用いた免疫学的アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫染色、フローサイトメトリーなどを利用して、検出するまたは発現量を測定することができる。ｍＲＮＡとしての細胞マーカーは、当該ｍＲＮＡに特異的な核酸を用いたアッセイ、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ（定量的ＰＣＲを含む）、マイクロアレイ、バイオチップなどを利用して、検出するまたは発現量を測定することができる。
　本発明において用いる細胞は、ヒトに由来するものであってもよいし、ヒト以外の動物、例えばマウス、ラット、イヌ、ブタ、サルなどの哺乳動物に由来するものであってもよい。例えば、本発明の細胞集団を用いて作製される臓器オルガノイドまたは立体臓器の用途が、ヒトへの移植や、ヒトの医薬の開発などである場合は、細胞はヒトに由来するものが好ましい。
　本明細書において、細胞、化合物、その他の物質について、それらが単数形で記載されている事項と複数形で記載されている事項は、特段の断り書きがない限り、相互に変換して解釈可能であるものとする。
　「～を含む（comprise、include、contain等）」とは、その語句に続く要素の包含を示すがこれに限定されないことを意味する。したがって、その語句に続く要素の包含は示唆するが、他の任意の要素の除外は示唆しない。一方、「～からなる（consisting of等）」とは、その語句に続くあらゆる要素を包含し、かつ、これに限定されることを意味する。したがって、「～からなる」という語句は、列挙された要素が要求されるか又は必須であり、他の要素は実質的に存在しないことを示す。「～から本質的になる（consisting essentially of等）」とは、その語句に続く任意の要素を包含し、かつ、その要素について本開示で特定された活性又は作用に影響しない他の要素に限定されることを意味する。したがって、「～から本質的になる」という語句は、列挙された要素が要求されるか又は必須であるが、他の要素は任意選択であり、それらが列挙された要素の活性又は作用に影響を及ぼすかどうかに応じて、存在させる場合もあり、存在させない場合もあることを示す。
－細胞の製造方法－
　本発明の細胞の製造方法は、類洞血管内皮前駆細胞（ＳＥＰＣ）から類洞血管内皮細胞（ＳＥＣ）を製造する方法であって、インターロイキン６（ＩＬ－６）ファミリーから選択される一種またはそれ以上の物質（以下「ＩＬ－６ファミリー物質」と表記することがある。）を含む培地でＳＥＰＣを培養する工程を含む方法である。
　「類洞血管内皮細胞」（ＳＥＣ）は、肝臓、骨髄、下垂体などの各種の「類洞」を構成している血管内皮細胞を指す。ＳＥＣは、物質交換を行う小孔構造（有窓構造、平均径107±1.5nm、1cm３あたり528±142個、https://www.nature.com/articles/gt200860参照）を有する。本発明では、肝臓の類洞血管内皮細胞（肝類洞血管内皮細胞：ＬＳＥＣ）に限らず、骨髄、下垂体、脾臓、腎糸球体、副腎など、肝臓以外の種々の臓器や組織における類洞血管内皮細胞（ＳＥＣ）を本発明の製造方法の対象とすることができる。
　「類洞血管内皮前駆細胞」（ＳＥＰＣ）は、上述した類洞血管内皮細胞（ＳＥＣ）への分化能を有する前駆細胞を指す。ＳＥＣについてと同様、ＳＥＰＣについても、肝臓の類洞血管内皮細胞の前駆細胞（肝類洞血管内皮前駆細胞）に限らず、骨髄、下垂体、脾臓、腎糸球体、副腎など、肝臓以外の種々の臓器や組織における類洞血管内皮細胞の前駆細胞を、本発明の製造方法で用いることができる。言い換えれば、各種のＳＥＰＣ同士の共通性および各種のＳＥＣ同士の共通性に基づき、本発明の製造方法は、肝臓およびそれ以外の臓器や組織に由来するＳＥＰＣから、対応する肝臓およびそれ以外の臓器や組織に由来するＳＥＣを分化誘導するために利用することができる。
　本発明の一側面において、類洞血管内皮前駆細胞（ＳＥＰＣ）は肝類洞血管内皮前駆細胞（ＬＳＥＰＣ）であり、類洞血管内皮細胞（ＳＥＣ）は肝類洞血管内皮細胞（ＬＳＥＣ）である。
　肝類洞血管内皮細胞（ＬＳＥＣ）は、ＣＤ３２（より具体的にはＣＤ３２ｂ）およびＩＣＡＭ１（ＣＤ５４）が主要な細胞マーカーとなることが知られている細胞であり、それ以外にも、例えば第VIII因子、ＳＴＡＢ１、ＬＹＶＥ１が細胞マーカーとなることが知られている細胞である。具体的には、ＣＤ３２が陽性かつＩＣＡＭ１が強陽性である場合、好ましくはさらに第VIII因子、ＳＴＡＢ１またはＬＹＶＥ１のうちの少なくとも１つ（より好ましくは２つ、特に好ましくは３つ）が陽性である場合、その細胞はＬＳＥＣである（その条件を満たさない場合は、その細胞はＬＳＥＣ以外の細胞である）であると判別することができる。なお、血管内皮細胞の陽性マーカーＣＤ３１は、ＬＳＥＣおよびその他のＳＥＣにとっても陽性マーカーである。また、類洞は主に静脈系の毛細血管構造であり、静脈系血管内皮細胞の陽性マーカーであるＣＤ７３および陰性マーカーであるＣＸＣＲ４は、ＬＳＥＣおよびその他のＳＥＣにとってもそれぞれ陽性マーカーおよび陰性マーカーである。
　「肝類洞血管内皮前駆細胞」（ＬＳＥＰＣ）は、肝類洞血管内皮細胞（ＬＳＥＣ）への分化能を有する、ＬＳＥＣの前駆細胞に該当する細胞を指す。ＬＳＥＰＣとしては、例えば、卵黄嚢静脈造血性血管内皮細胞（ＶＶＨＥＣ）および心内膜内皮細胞（endocardial endothelial cell：ＥＥＣ）が挙げられる。
　卵黄嚢静脈造血性血管内皮細胞（ＶＶＨＥＣ）は、卵黄嚢中胚葉に由来する造血性血管内皮細胞（ＨＥＣ）であり、胎児期初期における卵黄嚢内での造血を担う細胞として知られている。ＶＶＨＥＣは、ＣＤ３４が主要な細胞マーカーとなり、それら以外にも、ＦＮ１、ＡＣＴＡ２およびＬＹＶＥ１、ならびに静脈マーカーであるＮＲ２Ｆ２、ＡＰＬＮＲおよびＰＲＯＸ１などが細胞マーカーとなることが知られている細胞である。具体的には、少なくともＣＤ３４が陽性であり、好ましくはさらにＦＮ１、ＡＣＴＡ２、ＬＹＶＥ１、ＮＲ２Ｆ２、ＡＰＬＮＲおよびＰＲＯＸ１からなる群より選ばれる少なくとも１種の細胞マーカーが陽性である場合、その細胞はＶＶＨＥＣである（その条件を満たさない場合は、その細胞はＶＶＨＥＣ以外の細胞である）と判別することができる。なお、血管内皮細胞の陽性マーカーＣＤ３１は、ＶＶＨＥＣにとっても陽性マーカーである。また、ＣＤ４３は、ＶＶＨＥＣにとって陰性マーカーである。
　心内膜内皮細胞（ＥＥＣ）は、血管内皮細胞と共に生体内に存在するもう一つの内皮細胞である。ＥＥＣは、ＣＤ３４、ＣＤ３１、ＶＥ－カドヘリンなどが主要な細胞マーカーとなり、それ以外にも、ＮＦＡＴＣ１、ＮＲＧ１、ＮＫＸ２－５などが細胞マーカーとなることが知られている細胞である。具体的には、ＣＤ３４、ＣＤ３１およびＶＥ－カドヘリンからなる群より選ばれる少なくとも１種が陽性であり、好ましくはさらにＮＦＡＴＣ１、ＮＲＧ１およびＮＫＸ２－５からなる群より選ばれる少なくとも１種の細胞マーカーが陽性である場合、その細胞はＥＥＣである（その条件を満たさない場合は、その細胞はＥＥＣ以外の細胞である）と判別することができる。
　本発明の細胞の製造方法に用いる類洞内皮前駆細胞（ＳＥＰＣ）は、公知の手法により準備することができる。例えば、公知の手法に従って、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞などの多能性幹細胞から（側板中胚葉系細胞等を経て）、ＬＳＥＰＣやその他のＳＥＰＣへと分化誘導することが可能である。そのような方法としては、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞から側板中胚葉系細胞へと分化誘導した後、さらに卵黄静脈造血性血管内皮細胞（ＶＶＨＥＣ）へと分化誘導する方法が挙げられる（WO2020/203713の実施例、［２］ヒト造血性血管内皮細胞の作製の項参照）。また、Ohta, R. et al, J. Vis. Exp. (148), e59823, doi:10.3791/59823 (2019)を参照して卵黄嚢中胚葉細胞（ＹＳＭＣ）から血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）に分化誘導した後、Matsubara et al, Biochemical and Biophysical Research Communications, 515(1), 2019を参照してＥＰＣからＶＶＨＥＣに分化誘導する方法が挙げられる。
　本発明の細胞の製造方法では、ＩＬ－６ファミリー物質を含む培地でＳＥＰＣを培養することにより、ＳＥＣを得ることができる。ＳＥＰＣの培養は、通常は二次元培養（平面培養）で行われる。二次元培養用の培養容器は特に限定されるものではなく、ディッシュ、フラスコ、マイクロプレート、商品名「OptiCell」（Nunc社）等の細胞培養シートなどを用いることができる。培養容器は、細胞との接着性（親水性）を向上させるための表面処理や、コラーゲン、ゼラチン、ポリ-L-リジン、ポリ-D-リジン、ラミニン、フィブロネクチン、マトリゲル（例、BDマトリゲル（日本ベクトン・デッキンソン社））、ビトロネクチンなどの細胞接着用基質でコーティングされていることが好ましい。
　「ＩＬ－６ファミリー」に属する物質は、シグナル伝達物質（受容体）としてｇｐ１３０を共有するサイトカイン等を指し、これまでに、ＩＬ－６ファミリーのサイトカイン等としては、インターロイキン６（ＩＬ－６）、インターロイキン１１（ＩＬ－１１）、インターロイキン２７（ＩＬ－２７）、インターロイキン３５（ＩＬ－３５）、インターロイキン３９（ＩＬ－３９）、白血病阻止因子（leukemia inhibitory factor：ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（oncostatin M：ＯＳＭ）、カルジオトロフィン１（cardiotorophin 1：ＣＴ－１）、毛様体神経栄養因子（ciliary neurotrophic factor：ＣＮＴＦ）、カルジオトロフィン様サイトカイン１（cardiotorophin-like cytokine：ＣＬＣ）などが知られている。本発明では、ＩＬ－６ファミリー物質として、これらのＩＬ－６ファミリーから選択されるいずれか一種を単独で、または複数を組みあわせて用いることができる。
　本発明の一側面において、ＩＬ－６ファミリ－物質は、少なくともＩＬ－６、ＯＳＭ、ＩＬ－１１、またはそれらから選ばれる任意の組み合わせを含むことが好ましく、少なくともＯＳＭを含むことがより好ましい。任意の組合せとしては、例えば、ＩＬ－６およびＩＬ－１１の組合せや、ＩＬ－６、ＩＬ－１１およびＯＳＭの組合せが挙げられる。
　ＩＬ－６ファミリー物質の培地中の濃度は特に限定されるものではなく、本発明の作用効果、特にＬＳＥＰＣからＬＳＥＣへの分化誘導効率や、得られる細胞集団中のＬＳＥＣの純度が所望のものとなるよう、また培地の組成（基礎培地およびＩＬ－６ファミリー物質と併用される他の成分）などに応じて、適宜調節することができる。本発明の一側面において、ＩＬ－６ファミリー物質の培地中の濃度は、例えば５～１００μＭ、好ましくは５～２０μＭの範囲内とすることができる。
　本発明で用いる培地を調製するための基礎培地としては、例えば、DMEM/F-12（Gibco）、Stempro-34 SFM (Gibco)、Essential 6培地（Gibco）、Essential 8培地（Gibco）、EGM（Lonza）、EGM-2（Lonza）、EGM-2 MV（Lonza）、HCM（Gibco）、BulletKit（Lonza）、VascuLife EnGS Comp Kit（LCT）、Human Endothelial-SFM Basal Growth Medium（Invitrogen）、ヒト微小血管内皮細胞増殖培地（TOYOBO）などが挙げられる。
　本発明で用いる培地を調製するための（ＩＬ－６ファミリー物質以外の）添加物としては、例えば、B27 Supplements（GIBCO）、BMP4（骨形成因子４）、GSKβ阻害剤（例、CHIR99021）、VEGF（血管内皮細胞成長因子）、FGF2（fibroblast growth factor（bFGF（basic fibroblast growth factor）ともいう））、Folskolin、SCF（stem cell factor）、TGFβ受容体阻害剤（例、SB431542）、ROCK阻害剤（例、Y-27632）、Flt-3L（Fms-related tyrosine kinase 3 ligand）、IL-3（interleukin 3）、TPO（トロンボポイエチン）、hEGF（組換えヒト上皮細胞成長因子）、ヒドロコルチゾン、アスコルビン酸、IGF1、FBS（ウシ胎児血清）、抗生物質（例えば、ゲンタマイシン、アンフォテリシンＢ）、ヘパリン、Ｌ－グルタミン、フェノールレッドおよびBBEからなる群より選ばれる１種以上が挙げられる。
　本発明の一側面において、本発明の細胞の製造方法に用いる培地は、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）を含むことが好ましい。ＶＥＧＦの培地中の濃度は、例えば５～８０μＭ、好ましくは５～１０μＭの範囲内とすることができる。
　本発明におけるＳＥＰＣの培養は、通常酸素濃度（特に調節されていない濃度、例えば約２１％）において行うことができ、その場合であっても従来よりもＳＥＣの純度が高い細胞集団が得られるが、低酸素濃度（例えば１０％未満、一例として約５％）において行うことも可能である。
　本発明におけるＳＥＰＣの培養期間は特に限定されるものではなく、例えば、細胞集団中のＳＥＣが十分に増えて所望の純度を達成するまでの期間とすることができるが、通常は６～２０日、好ましくは６～１４日である。
　ＳＥＰＣの培養に関するその他の技術的事項は、当業者であれば適宜調節することができ、必要に応じてＳＥＰＣからＳＥＣを製造するための公知の方法に準じたもの、またはそれを本発明に適合するよう改変したものとすることができる。
－細胞集団－
　本発明の細胞集団は、上述した本発明の細胞の製造方法により得られたＳＥＣを含む細胞集団である。本明細書の細胞の製造方法により、ＳＥＣの純度が比較的高い細胞集団を（別途の純化、精製、濃縮等の工程を要することなく）得ることができる。
　細胞集団中のＳＥＣの純度は特に限定されるものではなく、細胞集団の用途等に応じて所望の程度の純度が達成されていればよいが、例えば、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上の純度とすることができる。
　なお、特定の細胞（本発明においてはＳＥＣ）の「純度」は、細胞集団中の全細胞数に対する当該細胞数の比率によって表される数値であり、例えばフローサイトメトリーを利用するなど、一般的な手法により測定することができる。本発明においても、例えば、本発明の細胞の製造方法により得られた細胞集団からサンプルを採取し、ＳＥＣの細胞マーカー（例えば、本明細書中に別記のマーカー）を対象とした蛍光免疫染色を行った後、フローサイトメトリーを用いた測定により、その細胞集団におけるＳＥＣの純度を求めることができる。
　本発明の細胞集団の用途は特に限定されるものではなく、ＳＥＣを利用する様々な目的のために用いることができる。例えば、本発明の細胞集団（に含まれるＳＥＣ）は、肝臓、骨髄等の類洞を有する臓器または組織の、オルガノイドまたは立体臓器を作製するために利用することができる。
　以下の実施例において、「Day」は、ヒトiPS細胞コロニーの分化誘導開始からの日数を表す。「Day 0」が、下記工程［１］の培養開始時である。
[実施例１] オンコスタチンM添加による肝類洞血管内皮細胞の作製
[実験方法]
　［１］ヒト卵黄嚢中胚葉細胞の作製
　ヒトiPS細胞（625A4；京都大学iPS研究所）を、AK02N（味の素）（10cm dish; 8ml、24-well plate; 0.5ml）中、５％ＣＯ２、３７℃で直径500-700μmのiPS細胞コロニーが形成されるまで（約6～7日間）培養を行なった。得られたコロニーを、Essential 8培地（Gibco) （10cm dish; 8ml、24-well plate; 0.5ml）にBMP4（80 ng/ml）、VEGF（80 ng/ml）およびCHIR99021（2μM）を添加した培地中、５％ＣＯ２、３７℃で2日間培養し、ヒト卵黄嚢中胚葉細胞を作製した（Day 0-2）。
　［２］ヒト卵黄嚢静脈造血性血管内皮細胞の作製
　［１］ヒト卵黄嚢中胚葉細胞の作製に引き続き、Essential 6培地（Gibco）（10cm dish; 8ml）にVEGF（80ng/ml）、FGF2（25ng/ml）、SCF（50ng/ml）およびSB431542（2μM）を添加した培地に交換し、５％ＣＯ２、３７℃でさらに2日間培養することで血球‐血管内皮共通前駆細胞を誘導した（Day 3-4）。その後、Stempro-34 SFM（Gibco）（10cm dish; 8ml）にVEGF（80ng/ml）、SCF（50ng/ml）、Flt-3L（50ng/ml）、IL-3（50ng/ml）、IL-6（50ng/ml）およびTPO（5ng/ml）を添加した培地に交換し、５％ＣＯ２、３７℃で２日間培養した後（Day 5-6）、上記組成の培地からVEGFを除いた培地に交換して、５％ＣＯ２、３７℃で２日間培養することで（Day 7-8）、CD34陽性、CD32陽性の卵黄嚢静脈造血性血管内皮細胞（iVVHEC）を誘導した。
　［３］ヒト肝類洞血管内皮細胞の作製
　［２］の工程で得られたCD34陽性、CD32陽性のヒト卵黄嚢静脈造血性血管内皮細胞を含む細胞集団に対して、TrypLe Express（Gibco）を３７℃、１５分反応させ、その後P1000 マイクロピペットによるピペッティングにより、細胞を乖離しながら15mLチューブへ回収し、Stempro-34 SFM（Gibco）培地を7mL添加した後、1000 rpm、室温、5分間遠心分離した。上清を除去後、1mM EDTA、4% FBS を含むPBS(-)バッファで懸濁し、セルカウントを実施した。1×108個以下の細胞を分注し、同様の条件で遠心分離した後、300μlの1mM EDTA、4% FBS を含むPBS(-)バッファに懸濁し、1×106個細胞あたり1μlのCD34 MicroBead Kit (Miltenyi)を加え、混和し、氷上で30分間静置した。次いで1mM EDTA、4% FBS を含むPBS(-)バッファで2回洗浄後、同様のバッファ500 μlにて懸濁し、QuadroMACS SeparatorおよびLS Column（Miltenyi）を用いて、CD34陽性の卵黄嚢静脈造血性血管内皮細胞を純化取得した。純化した細胞懸濁液を1000 rpm、室温、5分間遠心分離し、上清を除去後、HCM（Lonza）に5% FBS Gold（Biosera）,OSM（20ng/ml）（R&D）を加えた培地とEGM（Lonza）培地を1:1体積割合で混合したものにVEGF（5ng/mL）、Y-27632（10μM）（富士フィルム和光純薬）を加えた肝類洞血管内皮細胞誘導培地に懸濁後、PBS(-)にて50倍希釈したマトリゲル（BD Pharmingen）で３７℃、３０分コーティングした24 well plateまたは12 well plateにそれぞれ、1×105個、2×105個の細胞を播種し、５％ＣＯ２、３７℃で６日間以上（Day 9-14およびそれ以降）、培養し、肝類洞血管内皮細胞を含む細胞集団を得た。培地交換は播種後翌日にY-27632（10μM）を除いた肝類洞血管内皮細胞誘導培地に交換後、2日おきに実施した。
　対照として、OSM（最終濃度10ng/ml）を加えなかったこと以外は上記と同様にして、卵黄嚢静脈造血性血管内皮細胞を培養し、肝類洞血管内皮細胞を含む細胞集団を得た。
　［４］フローサイトメトリーを用いた血管内皮細胞の分化マーカー解析
　［１］―［３］の工程で12 well plateを用いて分化誘導を実施後、培地を除去してPBS(-)（GIBCO）で２回洗浄後、TrypLE Express（Gibco）を1mL/wellの容量で添加して１５分間３７℃で放置した。その後P1000 マイクロピペットによるピペッティングにより、細胞を乖離しながら15mLチューブへ回収し、Stempro-34 SFM(Gibco)培地を5mL添加した後、1000 rpm、室温、5分間遠心分離した。上清を除去後、1mM EDTA、4% FBS を含むPBS(-)バッファを用いて1度洗浄後、１次抗体溶液(1/50 PE-CD32（BioLegend, Cat: 303205）, BV421-CD34（BD Biosciences, Cat: 562577）,APC-CD54（BD Biosciences, Cat: 559771）,BV786-CD43（BD Biosciences, Cat: 744662）in BD Horizon BrilliantTM Stain Buffer)50μlにて細胞を懸濁し、氷上で30分間静置した。次いで1mM EDTA、4% FBS を含むPBS(-)バッファで2回洗浄後、1/1000 DAPI、1mM EDTA、4% FBS を含むPBS(-)バッファにて細胞を懸濁し、40μmセルストレーナーキャップ付きチューブに移した。得られた抗体染色細胞懸濁液を用いて、BD LSRFortessa フローサイトメトリーによって分化マーカーの解析を実施した。フローサイトメトリーから得られたデータの解析は、FlowJo 10.7.1 (BD)を用いて実施した。
　結果を図１［Ａ］に示す。オンコスタチンＭを用いる本発明の製造方法により、ＣＤ３４＋ＶＶＨＥＣ（iVVHEC）から、極めて高い純度（９５％以上）でＣＤ３２＋ＩＣＡＭ１（ＣＤ５４）＋＋ＬＳＥＣ（iSEC）を含む細胞集団が得られたことが分かる。
　また、１次抗体溶液を、1/50 PE-CD184（BioLegend, Cat: 306506）, BV421-CD34（BD Biosciences, Cat: 562577）,APC-CD73（Miltenyi Biotec, Cat: 130-095-183）,BV786-CD43（BD Biosciences, Cat: 744662）in BD Horizon BrilliantTM Stain Bufferに変更したこと以外は上記と同様にして、抗体染色細胞懸濁液を得て、フローサイトメトリーにより分化マーカーの解析を実施した。結果を図１［Ｂ］に示す。オンコスタチンＭを用いる本発明の製造方法により得られた細胞集団にはＣＤ７３＋ＣＸＣＲ４－を有する細胞が含まれており、オンコスタチンがこの静脈系血管内皮細胞の表面マーカープロファイルを誘導することが分かる。
　［５］免疫細胞染色による細胞集団の分化マーカー解析
　［１］―［３］の工程で24 well plateを用いて分化誘導を実施後、培地を除去してPBS(-)（GIBCO）で１回洗浄後、細胞に４％パラホルムアルデヒドを500μl/24 wellの容量で添加して１５分間室温で放置した。その後PBS(-)で３回洗浄し、４℃で一晩保存した。その後細胞にPROTEIN BLOCK SERUM-FREE blocking溶液［DAKO, X909］を500μl/24wellの容量で添加して６０分間室温で放置してブロッキングをおこなった。その後、0.1% Donkey Serumを含むPBS(-)に、ターゲットとなる抗原に対する１次抗体をウェルごとに異なる組み合わせ（1/100 Anti-Factor VIII (Abcam, ab41188), 1/500 Anti-CD32b (Abcam, ab151497）の抗体セットまたは、 1/50 Anti-CD31 (Abcam, ab24590), 1/500 Anti-CD32b (Abcam, ab151497）の抗体セット)にて加えた１次抗体溶液を、各ウェルに対して500μl/24wellの容量で添加し、室温６０分または４℃で一晩静置した。次いでPBS(-)で３回洗浄後、1% blocking溶液 in PBS(-)に各１次抗体に対応する２次抗体（1/1000, Alexa Flour 555, 1/1000, Alexa Flour 647）および1/1000 DAPI-HCB Hycult Biotech, HM2167）加えた、２次抗体溶液を500μl/24wellの容量で添加し、室温で６０分インキュベートした。その後PBS(-)で３回洗浄後、PBS(-)500μl/24wellの容量で添加、保持し、BZ-X700蛍光顕微鏡 (Keyence)を用いて蛍光画像の取得を実施した。
　結果を図２［Ａ］に示す。本発明の製造方法により得られた細胞集団に含まれるＬＳＥＣ（iSEC）は、細胞表面にＣＤ３１およびＣＤ３２を発現している（陽性である）だけでなく、多量の第VIII因子タンパク質を分泌していることが分かる。
　また、１次抗体溶液を、1/100 Anti- Stabilin-1 (NOVUS Bio, H00023166-M05), 1/100 Anti-CD31 (Abcam, ab28364), 1/100 Anti-LYVE1 (R&D, AF2089）の抗体セットに変更し、２次抗体溶液を、各１次抗体に対応する２次抗体（1/1000, Alexa Flour 555, 1/1000, Alexa Flour 594, 1/1000, Alexa Flour 647）および1/1000 DAPI-HCB Hycult Biotech, HM2167）を加えた溶液に変更したこと以外は上記と同様にして、免疫細胞染色を行った。対照として、［１］―［３］の工程において、オンコスタチンＭを添加しなかった場合の細胞についての免疫細胞染色も行った。蛍光画像の取得は、LSM880共焦点顕微鏡（Zeiss）を用いて実施した。結果を図２［Ｂ］に示す。本発明の製造方法により得られた細胞集団に含まれるＬＳＥＣ（iSEC）は、類洞内皮マーカーとして、前述したＣＤ３２および第VIII因子タンパク質に加えて、ＳＴＡＢ１およびＬＹＶＥ１タンパク質も発現していることが分かる。
[実施例２] IL-6およびIL-11添加による肝類洞血管内皮細胞の作製
　実施例１と同様に［１］および［２］の工程を行った後、［３］の工程において、「肝類洞血管内皮細胞誘導培地」として、下記１）～３）のいずれかを用いるようにして、肝類洞血管内皮細胞を含む細胞集団を得た。なお、２）は、実施例１と実質的に同じ工程を繰り返したものである。
　１）HCM（Lonza）に5% FBS Gold（Biosera）,IL-6（10ng/ml）およびIL-11（5ng/ml）を加えた培地とEGM（Lonza）培地を1:1体積割合で混合したものにVEGF（5ng/mL）、Y-27632（10μM）を加えた肝類洞血管内皮細胞誘導培地
　２）HCM（Lonza）に5% FBS Gold（Biosera）,OSM（20ng/ml）を加えた培地とEGM（Lonza）培地を1:1体積割合で混合したものにVEGF（5ng/mL）、Y-27632（10μM）を加えた肝類洞血管内皮細胞誘導培地
　３）HCM（Lonza）に5% FBS Gold（Biosera）,IL-6（10ng/ml）,IL-11（5ng/ml）およびOSM（20ng/ml）を加えた培地とEGM（Lonza）培地を1:1体積割合で混合したものにVEGF（5ng/mL）、Y-27632（10μM）を加えた肝類洞血管内皮細胞誘導培地
　結果を図３に示す。ＩＬ－６ファミリー物質としてＩＬ－６およびＩＬ－１１を用いた場合も、一定程度の純度（５０％以上）でＣＤ３２＋ＩＣＡＭ１（ＣＤ５４）＋＋ＬＳＥＣを含む細胞集団が得られたこと、またＩＬ－６ファミリー物質としてＩＬ－６、ＩＬ－１１およびＯＳＭの３種を併用した場合も、ＯＳＭを単独で用いた場合と同等以上の純度（９７％以上）でＣＤ３２＋ＩＣＡＭ１（ＣＤ５４）＋＋ＬＳＥＣを含む細胞集団が得られたことが分かる。

Claims (9)

  1. 　類洞血管内皮前駆細胞から類洞血管内皮細胞を製造する方法であって、
    　インターロイキン６（ＩＬ－６）ファミリーから選択される一種またはそれ以上の物質を含む培地で類洞血管内皮前駆細胞を培養する工程を含む方法。
  2. 　ＩＬ－６ファミリーから選択される一種またはそれ以上の物質が、少なくともインターロイキン６（ＩＬ－６）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、インターロイキン１１（ＩＬ－１１）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、カルジオトロフィン１（ＣＴ－１）、カルジオトロフィン様サイトカイン１（ＣＬＣ）、インターロイキン２７（ＩＬ－２７）、インターロイキン３５（ＩＬ－３５）、インターロイキン３９（ＩＬ－３９）、または、それらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　ＩＬ－６ファミリーから選択される一種またはそれ以上の物質が、少なくともＩＬ－６、ＯＳＭ、ＩＬ－１１、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
  4. 　ＩＬ－６ファミリーから選択される一種またはそれ以上の物質が、少なくともＯＳＭを含む、請求項１に記載の方法。
  5. 　類洞血管内皮前駆細胞が、肝類洞血管内皮前駆細胞であり、類洞血管内皮細胞が、肝類洞血管内皮細胞である、請求項１に記載の方法。
  6. 　肝類洞血管内皮前駆細胞が、卵黄嚢静脈造血性血管内皮細胞である、請求項５に記載の方法。
  7. 　前記培地が、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  8. 　前記類洞血管内皮前駆細胞が多能性幹細胞から誘導されたものである、請求項１に記載の方法。
  9. 　請求項１に記載の方法により得られた類洞血管内皮細胞を含む細胞集団。

     
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