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WO2022224372A1 - オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症の治療用アデノ随伴ウイルスビリオン - Google Patents

オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症の治療用アデノ随伴ウイルスビリオン Download PDF

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WO2022224372A1
WO2022224372A1 PCT/JP2021/016141 JP2021016141W WO2022224372A1 WO 2022224372 A1 WO2022224372 A1 WO 2022224372A1 JP 2021016141 W JP2021016141 W JP 2021016141W WO 2022224372 A1 WO2022224372 A1 WO 2022224372A1
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WO
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amino acid
acid sequence
adeno
aav
associated virus
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PCT/JP2021/016141
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English (en)
French (fr)
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慎一 村松
直美 滝野
美加 伊藤
崇倫 山形
一洋 村松
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Gene Therapy Research Institution Co Ltd
Jichi Medical University
Original Assignee
Gene Therapy Research Institution Co Ltd
Jichi Medical University
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Publication date
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Priority to JP2023515946A priority patent/JPWO2022224372A1/ja
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    • C12N2830/50—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating RNA stability, not being an intron, e.g. poly A signal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Y201/03—Carboxy- and carbamoyltransferases (2.1.3)
    • C12Y201/03003—Ornithine carbamoyltransferase (2.1.3.3)

Definitions

  • the present invention relates to a recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector that is less susceptible to neutralizing antibodies in serum for the treatment of urea cycle disorders. More specifically, the present invention is capable of expressing recombinant ornithine transcarbamylase (OTC), has reduced cross-reactivity with neutralizing antibodies in the serum of a living organism, The present invention relates to a modified rAAV that enables highly efficient gene transfer into the liver, and a pharmaceutical composition containing this rAAV.
  • rAAV recombinant adeno-associated virus
  • Ornithine transcarbamylase is an enzyme in the urea cycle involved in ammonia metabolism, and its deficiency is caused by a loss-of-function mutation in the OTC gene on the X chromosome.
  • OTC deficiency is the most common of the urea cycle disorders. Although it is an X-linked genetic disease, women also present with various symptoms. Hyperammonemia is caused by increased catabolism (pyrexia, fasting, etc.) and excessive intake of protein. Clinical symptoms include vomiting, decreased ability to suck, tachypnea, convulsions, disturbed consciousness, behavioral abnormalities, and developmental disorders. In boys, the disease is more common in neonates and can be fatal. In girls, it may be discovered as a result of liver dysfunction.
  • Non-Patent Document 1 A lifelong low-protein diet, residual nitrogen excretion stimulants, and arginine hydrochloride are required. Blood purification therapy is necessary in the acute phase, and living-donor liver transplantation is indicated when hyperammonia episodes are repeated. Even if treatment is started, it is essential that the central nervous system is affected, and the accompanying intellectual disability often forces people to live socially incapable of independence. In view of the above background, the development of an effective therapeutic method is an urgent issue (Non-Patent Document 1).
  • Adeno-associated virus (AAV)-based gene transfer vectors introduce genes into cells in the body, such as nerve cells, hepatocytes (liver parenchymal cells), retinal cells, muscle cells, cardiomyocytes, vascular endothelial cells, and adipocytes. and can be expressed for a long period of time (Patent Documents 1 to 3). Therefore, clinical application as a gene therapy vector for hemophilia, retinitis pigmentosa, Parkinson's disease, etc. is progressing (Non-Patent Documents 2 and 3). Furthermore, recently, it is frequently used as a vector for introducing genes of sgRNA and CAS9 protein in gene editing (Patent Document 3, Non-Patent Document 4). For hemophilia, promising results have been reported in gene therapy in which an AAV vector expressing factor VIII or factor IX is introduced into hepatocytes (Patent Document 4, Non-Patent Documents 5 and 6).
  • AAV Adeno-associated virus
  • an adeno-associated virus type 8 (AAV8) vector is applied with the human liver as the target organ (Non-Patent Document 7).
  • AAV8 vector has a high gene transfer efficiency into the mouse liver, it has a low gene transfer efficiency into the human liver.
  • AAV3B which is said to be superior to AAV8 in gene transfer efficiency into human hepatocytes, cross-reacts with neutralizing antibodies against AAV2 that more than 80% of adults have (Non-Patent Documents 8-10). No effect expected in patients.
  • it is being promoted to perform gene therapy on patients who were not eligible for gene therapy because they have neutralizing antibodies, and to perform gene therapy again on patients who did not obtain sufficient effects from the first gene therapy. ing.
  • a therapeutic means for diseases caused by this disease for example, ornithine transcarbamylase deficiency.
  • the present inventors created a modified AAV vector that expresses ornithine transcarbamylase and has reduced cross-reactivity to neutralizing antibodies in serum (such as AAV2 neutralizing antibodies). As a result, the present invention was completed.
  • the present invention provides an AAV vector that expresses ornithine transcarbamylase, has reduced cross-reactivity to neutralizing antibodies in serum, and has high gene transfer efficiency into hepatocytes, such as gene therapy targeting hepatocytes.
  • a capsid protein comprising an amino acid sequence having residues 472, 587 and 706 plus 1-6 residues deleted, substituted, inserted and/or added to the sequence, and SEQ ID NO: 11 or an amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, the adeno-associated virus vector comprising a polynucleotide encoding a protein having ornithine transcarbamylase activity, An adeno-associated virus vector that does not cross-react with neutralizing antibodies against at least type 2 AAV.
  • the neutralizing antibody is an antibody against an adeno-associated virus of a type different from AAV3 (eg, AAV3B) or AAV8.
  • the liver cell-specific promoter sequence is ApoE promoter, antitrypsin promoter, cKit promoter, liver-specific transcription factors (HNF-1, HNF-2, HNF-3, HNF-6, C/ERP, DBP) promoter, albumin promoter, thyroxine-binding globulin (TBG) promoter, and HCRhAAT promoter, or a polynucleotide sequence having 90% or more homology with these promoters, and functions liver-specifically
  • a pharmaceutical composition for gene transfer into the liver of a living organism comprising the adeno-associated virus vector of any one of [1] to [9] above.
  • the present invention expresses recombinant ornithine transcarbamylase (OTC), has reduced cross-reactivity to neutralizing antibodies against AAV2 and the like, and is derived from AAV vectors with high gene transfer efficiency into hepatocytes, such as AAV3B and AAV8.
  • OTC recombinant ornithine transcarbamylase
  • FIG. 1A shows an alignment of the VP1 protein amino acids of AAV3A, AAV3B and AAV.GT5.
  • FIG. 1B shows a continuation of FIG. 1A.
  • Figure 1C shows an alignment of the Rep protein amino acid sequences of AAV3A, AAV3B and AAV.GT5 (denoted as ARep, BRep and baRep respectively).
  • FIG. 1D shows a continuation of FIG. 1C.
  • FIG. 2A shows the GFP expression level in AAV.GT5 human liver-derived HepG2 cells.
  • FIG. 2B shows the state of the transfected GFP-expressing cells in FIG. 2A.
  • FIG. 2C shows luciferase expression levels in human liver-derived HepG2 cells by AAV.GT5.
  • FIG. 3A shows the GFP expression level in AAV.GT5 human liver-derived PXB cells.
  • FIG. 3B shows the state of the transfected GFP-expressing cells in FIG. 3A.
  • FIG. 4A shows the results of comparing luciferase expression levels in HEK293 cells by each AAV vector after reaction with serum containing neutralizing antibody against AAV (serum #01).
  • FIG. 4B shows the results of comparing luciferase expression levels in HEK293 cells by each AAV vector after reaction with serum containing neutralizing antibody against AAV (serum #02).
  • FIG. 4C shows the results of comparing luciferase expression levels in HEK293 cells by each AAV vector after reaction with serum containing neutralizing antibody against AAV (serum #03).
  • FIG. 4D shows the results of comparing luciferase expression levels in HEK293 cells by each AAV vector after reaction with serum containing neutralizing antibody against AAV (serum #04).
  • FIG. 4E shows the results of comparing luciferase expression levels in HEK293 cells by each AAV vector after reaction with serum containing neutralizing antibody against AAV (serum #05).
  • FIG. 4F shows the results of comparing luciferase expression levels in HEK293 cells by each AAV vector after reaction with serum containing neutralizing antibody against AAV (serum #06).
  • FIG. 4G shows the results of comparing luciferase expression levels in HEK293 cells by each AAV vector after reaction with serum containing neutralizing antibody against AAV (serum #07).
  • FIG. 4H shows the results of comparing luciferase expression levels in HEK293 cells by each AAV vector after reaction with serum containing neutralizing antibody against AAV (serum #08).
  • FIG. 4I shows the results of comparing luciferase expression levels in HEK293 cells by each AAV vector after reaction with serum containing neutralizing antibody against AAV (serum #09).
  • FIG. 4J shows the results of comparing luciferase expression levels in HEK293 cells by each AAV vector after reaction with serum containing neutralizing antibody against AAV (serum #10).
  • FIG. 4K shows the results of comparing the GFP expression level by each AAV vector after reaction with sera containing neutralizing antibodies against AAV (sera #A to #D).
  • FIG. 5A shows the structure of the recombinant viral genome AAV.GT5-HCRhAAT promoter-human OTC-WPRE. (Continued from Figure 5A) FIG.
  • FIG. 6 shows the mRNA expression levels of recombinant OTC in mouse PBX cells.
  • FIG. 7 shows protein expression levels of recombinant OTC in mouse PBX cells.
  • Figure 8 shows protein activity of recombinant OTC in mouse PBX cells.
  • the present invention provides a recombinant adeno-associated virus vector that expresses recombinant ornithine transcarbamylase (OTC) and improves the efficiency of gene transfer into liver cells, pharmaceutical compositions containing the vector, and the like.
  • OTC recombinant ornithine transcarbamylase
  • Adeno-associated virus vector according to the present invention 1.1.
  • About Adeno-Associated Viruses Adeno-associated viruses include viruses of many known blood groups.
  • Adeno-associated viruses with tropism for hepatocytes (liver parenchymal cells) include, for example, type 2, type 3 (3A and 3B), and type 8 blood group viruses.
  • various adeno-associated virus vectors described in Patent Document 1 WO 2008/124724), for example, can be used as vectors for delivery to living hepatocytes.
  • the natural adeno-associated virus is a non-pathogenic virus. Utilizing this characteristic, various recombinant virus vectors carrying desired genes have been produced and used for gene therapy (for example, WO2003/018821, WO2003/053476, WO2007/001010, Pharmaceutical Journal 126(11) 1021-1028).
  • the wild-type AAV genome is a single-stranded DNA molecule with a total nucleotide length of approximately 5 kb, either the sense strand or the antisense strand.
  • AAV genomes generally have inverted terminal repeat (ITR) sequences approximately 145 nucleotides long at both the 5' and 3' ends of the genome.
  • This ITR is known to have a variety of functions, such as a function as a replication origin of the AAV genome and a function as a packaging signal of this genome into virions (e.g., Pharmaceutical Journal 126 (11) 1021-1028, etc.).
  • the internal region of the wild-type AAV genome flanked by ITRs contains the AAV replication (rep) gene and the capsid (cap) gene.
  • rep and cap genes are respectively a protein involved in viral replication (Rep) and a capsid protein (for example, at least one of VP1, VP2 and VP3) that forms a virus particle that is an icosahedral shell. ).
  • the rAAV vectors of the present invention include native adeno-associated viruses type 1 (AAV1), type 2 (AAV2), type 3 (AAV3A/AAV3B), type 4 (AAV4), type 5 (AAV5), type 6 (AAV6), Type 7 (AAV7), Type 8 (AAV8), Type 9 (AAV9), Type 10 (AAV10), Type RH10 (AVVrh10; Hu, C. et al., Molecular Therapy vol. 22 no. 10 oct. 2014, 1792-1802 ), but not limited to.
  • nucleotide sequences of these adeno-associated virus genomes are known and are GenBank accession numbers: AF063497.1 (AAV1), AF043303 (AAV2), NC_001729 (AAV3), NC_001829.1 (AAV4), NC_006152.1 (AAV5), respectively. , AF028704.1 (AAV6), NC_006260.1 (AAV7), NC_006261.1 (AAV8), AY530579 (AAV9), AY631965.1 (AAV10).
  • capsid proteins VP1, VP2, VP3, etc.
  • AAV2, AAV3B AF028705.1
  • AAV8 or AAV9
  • the amino acid sequences of each of these capsid proteins are known, and reference can be made, for example, to the sequences registered under the above GenBank accession numbers corresponding to each AAV.
  • the rAAV vector used in the present invention contains a mutated (modified) capsid protein.
  • mutant capsid proteins include at least one of serine 472, serine 587, and asparagine 706 in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or 3, such as one, preferably A capsid protein having a mutated amino acid sequence in which two, more preferably all three, are substituted with other amino acids, and a plurality at other residue positions other than 472nd, 587th and 706th with respect to the mutated amino acid sequence
  • the amino acid residues of are deleted, substituted, inserted and/or added, and include mutant proteins that can function as capsid proteins.
  • serine at position 472 is at least one of serine at position 587 and asparagine at position 706, for example, one, preferably An amino acid sequence in which two, more preferably all three, are substituted with amino acids selected from the group consisting of glycine, alanine, valine, leucine, threonine and isoleucine, preferably with alanine (e.g.
  • SEQ ID NO: 4 amino acid sequence in which multiple amino acid residues have been deleted, substituted, inserted and/or added at residue positions other than positions 472, 587 and 706 with respect to the mutant amino acid sequence.
  • a capsid protein containing a sequence of amino acids. Combinations of two or more of these deletions, substitutions, insertions and additions may be included at the same time.
  • the number of deletions, substitutions, insertions and/or additions of the above amino acid residues is, for example, 1 to 74, 1 to 70, 1 to 60, 1 to 50, 1 to 40, 1 to 35, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-14, 1-13, 1-12, 1-11, 1-10, 1- 9 (1 to several), 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2 or 1 be done.
  • the smaller the number of deletions, substitutions, insertions and/or additions of amino acid residues the better.
  • the mutant capsid protein of the rAAV vector used in the present invention is preferably about 90% or more, 91% or more, 92% or more of the amino acid sequence (residues 735 to 738) of any of the above SEQ ID NOs: 2 to 4. , 93% or higher, 94% or higher, 95% or higher, 96% or higher, 97% or higher, 98% or higher, 99% or higher, 99.1% or higher, 99.2% or higher, 99.3% or higher, 99.4% or higher, 99.5% or higher, 99.6 % or more, 99.7% or more, 99.8% or more, 99.9% or more of amino acid sequence identity, and can function as a capsid protein.
  • functioning as a capsid protein refers to a protein capable of forming a viral vector capable of infecting target cells.
  • Capsid proteins used in the present invention can form viral vectors alone or together with other capsid protein members (eg, VP2, VP3, etc.).
  • Packaged within the viral vector is a polynucleotide containing a therapeutic gene of interest for delivery to target cells, such as liver cells.
  • the viral vector containing the mutant capsid protein has an infectivity equal to or higher than that of the viral vector containing the wild-type capsid protein.
  • Infectivity can be measured by methods known in the art, such as reporter assays using reporters such as ⁇ -galactosidase, GFP protein, and luciferase.
  • Examples of mutually substitutable amino acid residues in the protein (polypeptide) of the present invention are shown below.
  • Amino acid residues included in the same group can be substituted for each other.
  • Group A leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, o-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine;
  • Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid;
  • Group C Asparagine, Glutamine;
  • Group D lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid;
  • Group E proline, 3-hydroxyproline, 4-hydroxyproline;
  • Proteins containing desired amino acid residue substitutions can be produced according to techniques known to those skilled in the art, such as general genetic engineering techniques and chemical synthesis. Such genetic manipulation procedures are described, for example, in Molecular Cloning 4th Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press. 2012, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-2018 (ISSN:1934- 3647, etc.).
  • the rAAV viral vector used in the present invention may contain a gene encoding a Rep protein for replication in the host genome or in the genome of the helper virus.
  • a Rep protein has the function of recognizing the ITR sequence and carrying out genome replication depending on the sequence, packaging the wild-type AAV genome (or rAAV genome) into a viral vector, As long as it has the function to sing and the function to form the rAAV vector of the present invention to the same extent as the wild type, it is preferably about 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more , 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.1% or more, 99.2% or more, 99.3% or more, 99.4% or more, 99.5% or more, 99.6% or more, 99.7% or more, 99.8% or more, 99.9 They may have amino acid sequences with greater than % identity.
  • AAV3-derived Rep protein such as AAV3A or AAV3B Rep protein, or a fusion protein thereof (amino acid sequence of SEQ ID NO: 8) is preferably used, but not limited thereto.
  • the capsid proteins VP1 and the like (VP1, VP2 and/or VP3) encoded by the internal regions of the wild-type AAV genome described above, and the Rep proteins are isolated from the AAV helper by polynucleotides encoding these proteins. It is incorporated into a plasmid and used to obtain the rAAV of the present invention.
  • Capsid proteins (VP1, VP2 and/or VP3) and Rep proteins used in the present invention may be incorporated into one, two, three or more plasmids as required.
  • one or more of these capsid proteins and Rep proteins may be included in the AAV genome.
  • capsid proteins (VP1, VP2 and/or VP3) and Rep proteins are preferably all encoded in one polynucleotide and provided as an AAV helper plasmid.
  • the polynucleotide (that is, the polynucleotide) packaged in the rAAV vector of the present invention is located between the ITRs located on the 5' and 3' sides of the wild-type genome.
  • the polynucleotide of the internal region i.e., one or both of the rep gene and the cap gene
  • the polynucleotide encoding the protein of interest gene editing means and / or repair gene
  • transcribing this polynucleotide It can be produced by replacing it with a gene cassette containing a promoter sequence and the like.
  • the 5' and 3' located ITRs are located at the 5' and 3' ends of the AAV genome, respectively.
  • the ITRs located at the 5' and 3' ends are the 5' and 3' ITRs contained in the genome of AAV1, AAV2, AAV3, AAV6, AAV8, or AAV9. Including but not limited to these specific AAVs.
  • the ITR portion easily adopts a sequence in which complementary sequences are exchanged (flip and flop structure), the ITR contained in the rAAV genome of the present invention may have the 5' and 3' directions reversed. .
  • the length of the polynucleotide to be replaced with the internal region is practically preferably the same as the length of the original polynucleotide. That is, the total length of the rAAV genome of the present invention is preferably about the same as the wild-type total length of 5 kb, for example, about 2-6 kb, preferably about 4-6 kb.
  • the length of the therapeutic gene to be incorporated into the rAAV genome of the present invention is preferably It is about 0.01-3.7 kb in length, more preferably about 0.01-2.5 kb in length, more preferably about 0.01-2 kb in length, but is not limited thereto.
  • two or more therapeutic genes can be simultaneously administered as long as the total length of the rAAV genome is within the above range. can be incorporated.
  • the genes encoding each protein may be arranged in the same orientation or in different orientations.
  • the gene of interest (such as a therapeutic gene) may take time (several days) to be expressed.
  • the target gene to be introduced can be designed to be self-complementary (sc), thereby shortening the time until expression.
  • sc self-complementary
  • Polynucleotides packaged in rAAV vectors of the invention may be of the non-sc or sc type.
  • the polynucleotides packaged in the rAAV vectors of the invention are non-sc.
  • the capsid protein used in the present invention can be encoded, for example, by a polynucleotide appropriately modified based on codon preferences in host cells.
  • Polynucleotides encoding preferred capsid proteins used in the present invention include, for example, one or more (eg, 1 to 50, 1 to 40, 1 ⁇ 30, 1 ⁇ 25, 1 ⁇ 20, 1 ⁇ 15, 1 ⁇ 10, 1 ⁇ 9 (1 ⁇ several), 1 ⁇ 8, 1 ⁇ 7, 1 ⁇ 6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 1, etc.) nucleotide deletions, substitutions, insertions and/or additions, wherein SEQ ID NOs:2-4 or a capsid protein containing an amino acid sequence in which one or more of the above amino acids are deleted, substituted, inserted and/or added in the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 2 to 4 (capsomeres can be formed) is) comprising a polynucleotide encoding a protein.
  • polynucleotides in the present invention are, for example, polynucleotides encoding the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 to 4, or polynucleotides that are capable of hybridizing under stringent hybridization conditions to their complementary sequences.
  • Hybridization can be performed according to a known method or a method analogous thereto, such as the method described in Molecular Cloning (4th Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press. 2012). Alternatively, when using a commercially available library, it can be performed according to the method described in the instructions provided by the manufacturer.
  • stringent conditions may be any of low stringent conditions, medium stringent conditions and high stringent conditions. “Low stringent conditions” are, for example, 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, and 32°C.
  • “moderately stringent conditions” are, for example, 5 x SSC, 5 x Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, and 42°C.
  • “Highly stringent conditions” are, for example, 5 x SSC, 5 x Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, and 50°C. Under these conditions, it can be expected that the higher the temperature, the more efficiently DNAs with higher homology can be obtained. However, multiple factors such as temperature, probe concentration, probe length, ionic strength, time, and salt concentration can be considered as factors that affect the stringency of hybridization, and those skilled in the art can select these factors as appropriate. It is possible to achieve similar stringency in .
  • hybridizable polynucleotide when compared with the control polynucleotide sequence, when calculated by homology search software such as FASTA and BLAST using default parameters, for example, 70% or more, 80% or more , 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.1% or more, 99.2% or more, 99.3 % or greater, 99.4% or greater, 99.5% or greater, 99.6% or greater, 99.7% or greater, 99.8% or greater, 99.9% or greater identity. Generally, the higher the numerical value of homology, the better.
  • a neutralizing antibody refers to an antibody that reduces or eliminates the activity of a certain antigen by binding to the antigen, when the antigen has activity such as toxicity or infectivity.
  • neutralizing in the context of antibody activity means, for example, that an anti-adeno-associated virus neutralizing antibody (e.g., IgG, IgM, IgA) in serum binds to an antigen, an AAV vector, resulting in Refers to reducing or eliminating the ability of AAV vectors to introduce genes.
  • This neutralization reaction includes a series of complement reactions such as binding of an antigen (for example, an AAV vector) to an antibody, binding of the Fc portion of an antibody to the first component of complement (C1), and the like, resulting in the AAV The vector reduces or loses its ability to infect (gene transfer) target cells.
  • a neutralizing antibody may also include serum components, that is, components that bind to antibodies such as complement and are directly involved in neutralizing reactions such as antigen inactivation and removal. intended.
  • cross-reactivity of neutralizing antibodies refers to reactions in which neutralizing antibodies bind to target substances (eg, AAV3) different from their original target antigens (eg, AAV2).
  • target substances eg, AAV3
  • does not cross-react with neutralizing antibody means that the neutralizing antibody does not sufficiently function in the binding reaction with a target substance that is not the original target antigen, preferably does not detectably bind. or, even if detectable, the amount of target substance bound (molar or mass ratio) is significantly reduced when compared to the original target antigen.
  • the amount of the target substance to be reduced in this way is several percent (about 5%), about 10%, about 15%, about 20%, about 25%, about Binding amounts of 30%, about 35%, about 40%, about 45%, about 50%, about 60% are included.
  • This ratio can be obtained using a known method such as a method for measuring the amount of protein bound to the antibody.
  • cross-reactivity of neutralizing antibodies can be indirectly measured and compared using proteins encoded within the recombinant virus (such as reporter genes).
  • Neutralizing antibodies according to the present invention are preferably of mammalian origin, more preferably of primate origin, and most preferably of human origin.
  • Neutralizing antibodies used in the present invention are neutralizing antibodies against AAV2 unless otherwise specified. Normally, humans are highly likely to have antibodies against AAV2, but most of them are not neutralizing antibodies, and it is reported that 18-32% have neutralizing ability (Chirmule N et al., Gene Ther 6: 1574-1583, 1999; Moskalenko M, et al., J Virol 74: 1761-1766, 2000).
  • neutralizing antibodies against AAV2 are known to contain neutralizing antibodies against AAV3A and AAV3B (Fu H et al., Hum Gene Ther Clin Dev 2017; 28:187-196, Ling CJ et al. Integr Med 2015;13:341-346). This is also suggested by the relatively high amino acid identity (specifically about 87-88%) between the AAV2 VP1 protein (SEQ ID NO: 1) and the AAV3A or AAV3B VP1 protein (SEQ ID NO: 2 or 3). be done.
  • neutralizing antibodies for use in the present invention may comprise multiple isotypes (eg, IgG, IgM, IgA, etc.).
  • the neutralizing antibody against AAV2 according to the present invention needs to be verified in advance for performance such as antibody concentration or antibody titer.
  • Such verification means are known, and for example, the means described in Ito et al. (Ito et al., Ann Clin Biochem 46: 508-510, 2009) can be used.
  • the titer of neutralizing antibody can be analyzed by evaluating the inhibitory ability when an AAV2 vector containing a reporter gene such as ⁇ -galactosidase or luciferase is introduced into HEK293 cells (see above). Ito et al.).
  • the neutralizing antibody used in the present invention has an antibody titer of 1:4 to 1:640, preferably 1:16 to 1:254, more preferably 1:32 to 1:128.
  • Specific methods for measuring the antibody titer in the present invention are described in "(e) Verification of cross-reactivity with neutralizing antibody in serum” and "(3) Measurement of antibody titer of neutralizing antibody” in Examples. You can refer to the description of In addition, Li C, et al., Gene Ther 19: 288-294, 2012; Methods described in literature such as Methos 26:45-53, 2015 can be used.
  • the adeno-associated virus vectors of the present invention are less susceptible to neutralizing antibodies in serum than wild-type vectors.
  • the viral vectors of the present invention (for example, those containing a capsid protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4) have at least the ability to transduce genes into target cells after being treated with neutralizing antibodies in serum. 60%, preferably 70% or more, more preferably 75% or more, still more preferably 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more.
  • known assays such as reporter assay, in situ hybridization, and radioisotope labeling can be used for comparison of gene introduction ability.
  • wild-type viral vectors lack the ability to transduce genes into target cells after similarly being treated with neutralizing antibodies in serum. It can be retained less than about 60%, less than about 50%, less than about 40%, less than about 35%, less than about 30%.
  • the viral vector of the present invention is 1.2-fold or more, preferably 1.5-fold or more, more preferably 1.75-fold more effective against target cells after being treated with neutralizing antibodies in serum compared to the wild-type viral vector. More than twice, preferably more than twice the amount of gene can be introduced.
  • a neutralizing antibody against AAV2 can also have neutralizing activity against AAV3 and the like due to cross-reactivity (Fu H et al., Hum Gene Ther Clin Dev 2017; 28:187-196 Integr Med 2015;13:341-346, Mimuro J, et al., J Med Virol 86: 1990-1997, 2014.).
  • the amino acid sequence identity between the AAV2 capsid protein VP1 and AAV3A VP1 is calculated to be 87%, and the identity between AAV2 VP1 and AAV3B VP1 is 88% (these identities can be found on the Blastp website ( https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)).
  • Further studies on epitope mapping of anti-AAV2 neutralizing antibodies are described by Moskalenko, M. et al. (J Virol 74: 1761-1766, 2000).
  • the following extracellular receptors related to AAV cell infection are known (Summerfold et al., Mol Ther 24: 2016; Pillay et al., Nature 530:108-112, 2016).
  • AAV2, 3, 6 Heparan sulfate proteoglycan
  • AAV9 N-terminal galactose AAV1, 4, 5, 6: specific N-linked or O-linked sialic acid moieties
  • AAV5 Platelet-derived growth factor (which can be modified by sialic acid)
  • the rAAV vector of the present invention preferably contains a polynucleotide containing a liver-specific promoter and a gene of interest operably linked to the promoter (i.e., packaging of such polynucleotides).
  • a promoter specific to cells in the liver for example, a promoter specific to hepatic parenchymal cells, hepatic non-parenchymal cells (astrocytes, etc.) and the like can be used.
  • promoter sequences include ApoE promoter, antitrypsin promoter, cKit promoter, liver-specific transcription factors (HNF-1, HNF-2, HNF-3, HNF-6, C/ERP, DBP ) promoters, thyroxine-binding globulin (TBG) promoters (Ran FA, et al., Nature 520(7546):186-91, 2015), promoters of other liver-specific proteins (such as albumin), and combinations of these promoters synthetic promoters, etc., but are not limited to these.
  • these promoters can be further combined with known enhancers, preferably liver-specific enhancers.
  • enhancers include the ApoE enhancer and the like.
  • the rAAV vector of the present invention is preferably a liver-specific, more preferably hepatocyte (hepatocyte)-specific ApoE promoter, antitrypsin promoter, TBG promoter, or the known synthetic promoter HCRhAAT promoter (e.g., SEQ ID NO: 12 nucleotides 397-1046).
  • the liver-specific promoter (or enhancer) used in the present invention has 1 or more (eg, 1 to 100, 1 to 50, 1 to 40, 1 to 30) in the polynucleotide sequence of the above promoter. 1-25, 1-20, 1-15, 1-10, 1-9 (1-several), 1-8, 1-7, 1-6, 1- 5, 1-4, 1-3, 1-2, 1, etc.) nucleotide deletions, substitutions, insertions and/or additions, wherein the liver-specific Anything that can function as a promoter can also be used.
  • the ability to function as a liver-specific promoter means that, for example, when liver-derived cells and non-liver-derived cells are compared in a reporter assay, non-liver-derived cells have a detection threshold level of about It refers to expressing a reporter or expressing about 25% or less, about 20% or less, about 15% or less, about 10% or less, or less of a reporter compared to liver-derived cells.
  • the polynucleotide having the above deletion, substitution, insertion and/or addition means that the specific activity relative to the original promoter sequence is 50%, 60%, 70%, 80%, 90% or more. do. The fewer the number of mutations mentioned above, the better.
  • AAV vector of the present invention Diseases to be treated using the AAV vector of the present invention include ornithine transcarbamylase deficiency associated with hepatocyte genomic disorder, hemophilia, acute intermittent porphyria, Wilson's disease, phenylketonuria, familial hypertension, Cholesterolemia etc. are mentioned.
  • the recombinant viral vectors used in the present invention may contain various therapeutic genes (polynucleotides) to perform the above treatments.
  • proteins encoded by such therapeutic genes include ornithine transcarbamylase (OTC), carbamoyl phosphate synthase I (CPS1), blood coagulation factor VIII (FVIII), blood coagulation factor IX (FIX), hepatocyte Proteins such as, but not limited to, growth factor (HGF), hepatocyte growth factor receptor (c-Kit).
  • OTC ornithine transcarbamylase
  • CPS1 carbamoyl phosphate synthase I
  • FVIII blood coagulation factor VIII
  • FIX blood coagulation factor IX
  • HGF growth factor
  • c-Kit hepatocyte growth factor receptor
  • Ornithine transcarbamylase deficiency is a disorder involving the ornithine transcarbamylase gene and is caused by dysfunction of the urea cycle in the liver.
  • the liver of a living body produces harmless urea from ammonia, which is toxic to the living body, and this pathway is called the urea cycle.
  • enzymes involved in this urea cycle include ornithine transcarbamylase (OTC), carbamoyl phosphate synthase I (CPS1), argininosuccinate synthase (ASS), argininosuccinate lyase (ASL), arginase I (ARG1), N- Acetylglutamate synthase (NAGS), ornithine/citrulline antiporter (ORNT1). Genetic abnormalities in these enzymes result in urea cycle disorders. Of these urea cycle disorders, OTC deficiency is the most common.
  • OTC The mature form of OTC is composed of a trimer of a protein of approximately 36 kda (in humans) encoded on the X chromosome (amino acid sequence of SEQ ID NO: 11). OTC specifically converts ornithine to citrulline in the urea cycle ((3) in the figure below).
  • the OTC used in the present invention is not particularly limited as long as it is an enzyme that converts ornithine to citrulline, preferably mammal-derived, more preferably human-derived.
  • a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 can be used as OTC for use in the present invention.
  • the ornithine transcarbamylase activity is preferably 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, 95% or more, or 99% or more compared to the wild type Mutants that retain activity can also be used.
  • Such variants include, for example, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 , or those having amino acid sequences with greater than 99% identity.
  • OTC measurement methods include, for example, enzyme activity measurement (Pierson et al. (1977) J. Biol. Chem. 252, 6464-6469) and immunological measurement (WO 2006/073073).
  • any measuring method known in the art can be used as a method for measuring OTC.
  • ammonia concentration in blood or medium by means known in the art, it can be confirmed that administration of the vector of the present invention reduces ammonia concentration.
  • the therapeutic gene used in the present invention may be, for example, a gene for inhibiting target function (antisense nucleotide, CAS9, etc.), but is not limited to these.
  • an antisense nucleotide is a polynucleotide for altering (e.g., disrupting, reducing) the function of a targeted endogenous gene, or altering (e.g., reducing) the expression level of an endogenous protein. ).
  • Examples of such polynucleotides include, but are not limited to, antisense molecules, ribozymes, interfering RNAs (iRNAs), microRNAs (miRNAs), sgRNAs.
  • dsRNA, siRNA, shRNA or miRNA double-stranded RNA
  • dsRNA, siRNA, shRNA or miRNA double-stranded RNA
  • the recombinant viral vectors used in the present invention may contain one or more therapeutic genes.
  • a pharmaceutical composition comprising the rAAV vector (rAAV virion) of the invention.
  • a pharmaceutical composition containing the rAAV vector of the present invention hereinafter referred to as the pharmaceutical composition of the present invention
  • a therapeutic gene can be introduced into the liver cells of a subject with high efficiency, and the introduced treatment
  • a pharmaceutical composition capable of treating a disease of interest by expressing a gene for use.
  • rAAV vectors containing such therapeutic genes are included in the pharmaceutical compositions of the invention. Examples of such therapeutic genes include, but are not limited to, genome editing means and genome repair means as described above.
  • the rAAV vector of the present invention preferably comprises a liver cell-specific promoter and a gene operably linked to the promoter.
  • the rAAV vectors of the present invention can contain genes that are useful in the treatment of hemophilia and the like, and can incorporate those genes into liver cells, preferably liver parenchymal cells.
  • the pharmaceutical composition of the present invention When the pharmaceutical composition of the present invention is used, it can be administered, for example, orally, parenterally (intravenously), intramuscularly, buccal mucosa, rectally, vaginally, transdermally, nasally, or by inhalation. It is preferred to administer Intravenous administration is even more preferred.
  • the active ingredients of the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated singly or in combination, and may also be provided in the form of preparations by blending them with pharmaceutically acceptable carriers or pharmaceutical additives. can. In this case, the active ingredient of the present invention can be contained, for example, in an amount of 0.1-99.9% by weight in the formulation.
  • the active ingredients of the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated singly or in combination, and may also be provided in the form of preparations by blending them with pharmaceutically acceptable carriers or pharmaceutical additives. can.
  • the active ingredient of the present invention has, for example, a potency of 10 5 to 10 16 vg/mL (900 fg/mL to 90 mg/mL) and a potency of 10 6 to 10 15 vg/mL ( 9.0 pg/mL to 9.0 mg/mL), 10 7 to 10 14 vg/mL (90 pg/mL to 900 ⁇ g/mL), 10 8 to 10 13 vg/mL (900 pg/mL to 90 pg/mL) ⁇ g/mL), titers 10 9 - 10 12 vg/mL (9 ng/mL - 9 ⁇ g/mL), titers 10 10 - 10 11 vg/mL (90 ng/mL - 900 ng/
  • formulations suitable for parenteral administration include injections and suppositories.
  • parenteral administration a solution of the active ingredient of the present invention in either sesame oil or peanut oil, or in aqueous propylene glycol or sorbitol solutions can be used.
  • the aqueous solutions should be suitably buffered (preferably pH 8 or greater) if necessary and the liquid diluent first rendered isotonic.
  • Physiological saline for example, can be used as such a liquid diluent.
  • the aqueous solutions prepared are suitable for intravenous injection, while the oily solutions are suitable for intra-articular, intramuscular and subcutaneous injection.
  • the aseptic production of all these solutions is readily accomplished by standard pharmaceutical techniques well known to those skilled in the art.
  • the active ingredient of the present invention can also be administered topically such as to the skin. Topical administration in the form of creams, jellies, pastes or ointments is desirable in this case according to standard pharmaceutical practice.
  • formulations suitable for oral administration include powders, tablets, capsules, fine granules, granules, liquids, syrups, and the like.
  • various excipients such as microcrystalline cellulose, sodium citrate, calcium carbonate, dipotassium phosphate, glycine are added to starch, preferably corn, potato or tapioca starch, and alginic acid or seed.
  • granule-forming binders such as polyvinylpyrrolidone, sucrose, gelatin, gum arabic.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, and an appropriate dosage is selected according to various conditions such as the type of disease, age and symptoms of the patient, administration route, purpose of treatment, and presence or absence of concomitant drugs. It is possible to The dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is, for example, 1 to 5000 mg, preferably 10 to 1000 mg per day for an adult (eg, body weight 60 kg), but is not limited thereto. These daily doses may be administered in 2 to 4 divided doses.
  • vg vector genome
  • Viral vectors of the invention are preferably more safely and easily administered to a subject by peripheral administration.
  • peripheral administration refers to administration routes generally understood by those skilled in the art as peripheral administration, such as intravenous administration, intraarterial administration, intraperitoneal administration, intracardiac administration, and intramuscular administration.
  • the viral vector of the present invention can be administered to a subject to infect liver cells and provide the above-described genome editing means delivered by the virus in the infected cells, resulting in genome editing.
  • the viral vectors of the invention are preferably capable of infecting liver parenchymal cells and effecting genome editing.
  • the viral vector of the present invention preferably has a ratio of cells undergoing genome editing among hepatocytes of the liver of the administered subject to preferably 70% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 91% or higher, 92% or higher, 93% or higher, 94% or higher, 95% or higher, 96% or higher, 97% or higher, 98% or higher, 99% or higher, 99.1% or higher, 99.2% or higher, 99.3% or higher, 99.4% ⁇ 99.5%, ⁇ 99.6%, ⁇ 99.7%, ⁇ 99.8%, ⁇ 99.9%, or 100%.
  • kits for producing the rAAV of the present invention can include, for example, (a) a first polynucleotide for expressing capsid protein VP1 or the like, and (b) a second polynucleotide packaged within a rAAV vector.
  • the first polynucleotide comprises a polynucleotide encoding the amino acids of SEQ ID NO:4 and the second polynucleotide may or may not comprise a therapeutic gene of interest.
  • various restriction enzyme cleavage sites can be included for incorporating therapeutic genes of such interest.
  • kits for producing the rAAV virions of the present invention can further include any of the components described herein (eg, AdV helper, etc.). Kits of the invention can also further include instructions describing a protocol for generating rAAV virions using the kits of the invention.
  • viral vector As used herein, the terms “viral vector”, “viral virion”, and “viral particle” are used interchangeably unless otherwise specified. "Adeno-associated virus vector” also includes adeno-associated virus containing genetic recombination.
  • polynucleotide is used interchangeably with “nucleic acid”, “gene” or “nucleic acid molecule” and is intended to be a polymer of nucleotides.
  • nucleotide sequence is used interchangeably with “nucleic acid sequence” or “base sequence” and is a sequence of deoxyribonucleotides (abbreviated as A, G, C and T) is shown as
  • A, G, C and T deoxyribonucleotides
  • a “polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a fragment thereof” is intended to be a polynucleotide comprising the sequence represented by each deoxynucleotide A, G, C and/or T of SEQ ID NO: 1, or a fragment portion thereof. be done.
  • Each of the "viral genome” and “polynucleotide” according to the present invention may exist in the form of DNA (eg, cDNA or genomic DNA), but may optionally be in the form of RNA (eg, mRNA).
  • RNA eg, mRNA
  • Each of the viral genome and polynucleotides used herein can be double-stranded or single-stranded DNA.
  • single-stranded DNA or RNA it may be the coding strand (also known as the sense strand) or the non-coding strand (also known as the antisense strand).
  • polypeptide As used herein, the terms “protein” and “polypeptide” are used interchangeably, and are intended to be polymers of amino acids.
  • the left end is the N-terminus (amino terminus) and the right end is the C-terminus (carboxyl terminus) according to the convention of peptide designation.
  • the partial peptide of the polypeptide of the present invention (which may be abbreviated as the partial peptide of the present invention in this specification) is a partial peptide of the above-described polypeptide of the present invention, preferably the above-described polypeptide of the present invention. It has properties similar to those of peptides.
  • Plasmids means various known genetic elements, such as plasmids, phages, transposons, cosmids, chromosomes, and the like. Plasmids are capable of replication in a particular host and transport gene sequences between cells. As used herein, plasmids contain various known nucleotides (DNA, RNA, PNA and mixtures thereof) and may be single-stranded or double-stranded, preferably double-stranded. . For example, as used herein, unless otherwise specified, the term "rAAV vector plasmid” is intended to include the duplex formed by the rAAV vector genome and its complement. Plasmids used in the present invention may be linear or circular.
  • packaging refers to events including preparation of the single-stranded viral genome, assembly of the coat protein (capsid), and encapsidation of the viral genome.
  • a suitable plasmid vector usually multiple plasmids
  • recombinant viral particles i.e., viral virions, viral vectors
  • AAV vectors Five types of AAV vectors (AAV2, AAV3B, AAV.GT5, AAV8, and AAV-LK03) were used.
  • AAV.GT5 has three amino acid substitutions in the coat protein VP1 of AAV3A and 3B: Serine (S) at position 472 to alanine (A), Serine (S) at position 587 to alanine (A), It contains an amino acid sequence in which asparagine (N) at position 706 is replaced with alanine (A).
  • AAV.M1 contains a single amino acid substitution in the coat protein VP1 of AAV3A and 3B, that is, an amino acid sequence in which serine (S) at position 587 is substituted with alanine (A).
  • AAV.M2 has two amino acid substitutions in the coat protein VP1 of AAV3A and 3B: alanine (A) for serine (S) at position 472 and alanine (A) for serine (S) at position 587. containing the amino acid sequence.
  • Three types of genes encoding proteins to be expressed in each AAV vector were used.
  • AcGFP green fluorescent protein
  • CMV cytomegalovirus promoter
  • AcGFP green fluorescent protein
  • ITR inverted terminal repeats
  • Luciferase we inserted a sequence encoding Luciferase instead of AcGFP to create four types of Luciferase: AAV2-CMV-Luciferase, AAV3B-CMV-Luciferase, AAV.GT5-CMV-Luciferase, and AAV-LK03-CMV-Luciferase.
  • AAV2-CMV-Luciferase AAV2-CMV-Luciferase
  • AAV3B-CMV-Luciferase AAV.GT5-CMV-Luciferase
  • AAV-LK03-CMV-Luciferase AAV2-CMV-Luciferase
  • OTC an expression cassette consisting of the liver regulatory region enhancer of the ApoE/C1 gene, human antitrypsin promoter (HCRhAAT), OTC cDNA, and SV40 poly(A) is inserted between the inverted terminal repeats (ITR) of AAV3A.
  • AAV.GT5-HCRhAAT-OTC and AAV8-HCRhAAT-OTC were constructed.
  • AAV2 GenBank Accession # NC_001401.2 (whole genome sequence) (The amino acid sequence of AAV2 capsid protein VP1 is shown in SEQ ID NO: 1.)
  • AAV3A GenBank Accession # U48704 (genome sequence) (The amino acid sequence of AAV3A capsid protein VP1 is shown in SEQ ID NO:2.
  • AAV3B GenBank Accession # AF028705.1 (genome sequence) (The amino acid sequence of AAV3B capsid protein VP1 is shown in SEQ ID NO:3.
  • AAV.GT5 (prepared in this application) (The amino acid sequence of capsid protein VP1 is shown in SEQ ID NO:4.)
  • AAV8 GenBank Accession # NC_006261 (genome sequence) (The amino acid sequence of AAV8 capsid protein VP1 is shown in SEQ ID NO:5.
  • AAV.M1 (prepared in this application) (The amino acid sequence of capsid protein VP1 is shown in SEQ ID NO: 17.)
  • AAV.M2 (prepared in this application) (The amino acid sequence of capsid protein VP1 is shown in SEQ ID NO: 18.)
  • Neutralizing antibody activity against AAV2 is measured by the method described in Melian A et al., HUMAN GENE THERAPY METHODS, 26:45-52, 2015, and the neutralizing antibody titer is 1:32 to 1:128 or 1:128 or more 10 serum samples were used.
  • FIG. 1 Vector infection Various AAV vectors expressing GFP (AAV2-CMV-AcGFP, AAV8-CMV-AcGFP, AAV3B-CMV-AcGFP, or AAV.GT5-CMV-AcGFP) described in (a) ⁇ 10 3 to 1 ⁇ 10 4 vg/cell, AAV vectors expressing Lucferase (AAV2-CMV-Luciferase, AAV3B-CMV-Luciferase, AAV.GT5-CMV-Luciferase, AAV-LK03-CMV-Luciferase) Alternatively, 800 vg/cell and 4 ⁇ 10 4 vg/cell for vectors expressing OTC (AAV.GT5-HCRhAAT-OTC, AAV8-HCRhAAT-OTC) were added to each cultured cell and cultured for 1 to 10 days. .
  • OTC AAV.GT5-HCRhAAT-OTC, AAV8-HCRhAAT-
  • AAV.GT5-CMV-Luciferase AAV-LK03-CMV-Luciferase
  • AAV3B-CMV-Luciferase AAV2-CMV-Luciferase
  • AAV2-CMV-Luciferase AAV.GT5-CMV-Luciferase
  • AAV-LK03-CMV-Luciferase AAV-LK03-CMV-Luciferase
  • AAV3B-CMV-Luciferase AAV2-CMV-Luciferase
  • RNA was purified from AAV.GT5-HCRhAAT-OTC and AAV8-HCRhAAT-OTC-administered PXB cells (n 4) using RNeasy Mini Kit (QIAGEN). cDNA was synthesized from 100 ng of total RNA, and a High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor (Applied Biosystems) was used for the reverse transcription reaction.
  • the cDNA sample was diluted 6-fold using nuclease-free water, and the Ct value was measured by the SYBR Green method of real time PCR (Applied Biosystems). Primers were made with optimized OTC sequences.
  • OTC Forward ACCGGCGAAGAGATCAAGTA (SEQ ID NO: 13)
  • OTC Reverse ATCATGCCCAGAGACTTTCC (SEQ ID NO: 14)
  • GAPDH Forward AATTCCATGGCACCGTCAAG (SEQ ID NO: 15)
  • GAPDH Reverse ATCGCCCCACTTGATTTTGG (SEQ ID NO: 16)
  • the comparative Ct method was used for the analysis of each mRNA expression level.
  • the relative amount of OTC in the AAV.GT5-HCRhAAT-OTC administration group was calculated when the expression level in the AAV8-HCRhAAT-OTC administration group was set to 1. (Measurement of OTC protein)
  • the cultured PXB cells were rinsed with PBS, and 100 ⁇ l/well of RIPA Buffer+protease inhibitor was added to lyse the cells. After collecting the supernatant by centrifugation, Laemmli Buffer+ ⁇ ME was added and heated to reduce the protein.
  • Electrophoresis was performed on a 4-15% polyacrylamide gel with Tris/glycine/SDS buffer, transferred to a PVDF membrane, blocked, and then reacted with an OTC antibody (1:2000, Santa Cruz) at 4°C overnight. After washing with 0.1% PBST six times, it was reacted with HRP-anti-mouse-IgG (1:5000, GE Healthcare) at room temperature for 60 minutes. After washing 6 times with 0.1% PBST, chemiluminescence was performed with ECL Prime Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare), detection was performed with Amersham Imager 600, and the volume value of the band was measured with built-in analysis software.
  • the amount of housekeeping protein was measured with a GAPDH antibody (1:10000, Abcam) and compared with the correction value of OTC Volume value/GAPDH Volume value.
  • OTC activity measurement PXB cells were detached from the dish and centrifuged (1000 rpm, 3 minutes, room temperature) to remove the medium. Furthermore, it was washed twice with PBS. Mitochondrial lysis buffer (0.5% Triton X-100 [v/v] in dH2O, 10 mM HEPES, 2 mM DTT [pH 7.4]) was added and homogenized on ice. After centrifugation (20630 G, 20 minutes, 4°C), the supernatant was collected and the amount of protein was measured.
  • AAV.GT5 Confirmation of ability of AAV.GT5 to infect human liver-derived cells HepG2 and PXB
  • AAV8-CMV-AcGFP, AAV2-CMV-AcGFP, AAV3B-CMV-AcGFP and AAV.GT5-CMV-AcGFP 5 ⁇ 10 8 vg the day after seeding HepG2 cells 5 ⁇ 10 4 cells/well in a 96-well optical bottom plate /well. After culturing in a 37°C, 5% CO 2 incubator for 7 days, the fluorescence intensity of GFP was measured with a plate reader and quantitatively compared (Table 1 and Fig. 2A).
  • AAV.GT5 showed approximately 1.1-fold (107.9%) higher expression than AAV3B. Therefore, AAV.GT5 is considered to be capable of gene transfer equivalent to or greater than that of AAV3B into these human liver-derived cells.
  • AAV8 and AAV2 had lower gene transfer efficiencies into human liver-derived cells than AAV3B and AAV.GT5 (Fig. 2A).
  • both AAV.GT5 and AAV3B are close to the upper limit of the measurement range, so there is a possibility that a smaller difference than the actual amount ratio was shown. Therefore, the ability of each rAAV vector to infect human liver-derived HepG2 cells was confirmed using luciferase.
  • AAV3B and AAV-LK03 were used as controls.
  • a graph and relative values of the results of the luminescence intensity (RLU) measurements are shown in FIG. 2C. From the measured values of RLU, it was confirmed that AAV.GT5 was 2.0 times more expressed than AAV3B and 1.3 times more expressed than AAV-LK03 (Table 2 and FIG. 2C).
  • 3A and 3B show the results of gene transfer into PXB cells, which were collected from the PXB mouse liver and contained more than 90% of human hepatocytes.
  • AAV.GT5-CMV-AcGFP Similar to HepG2 cells, the GFP expression level of AAV.GT5-CMV-AcGFP was about 1.1 times higher than that of AAV3B in PXB cells. Therefore, AAV.GT5 is considered to be capable of gene transfer equivalent to or greater than that of AAV3B into these human liver-derived cells. On the other hand, AAV8 and AAV2 had lower gene transfer efficiencies into human hepatocytes than AAV3B and AAV.GT5 (Figs. 2 and 3).
  • AAV.GT5 when comparing the luciferase activity of AAV.GT5 in the presence of serum at the same serum dilution rate (e.g., 32-fold dilution), AAV.GT5 produced a very large difference, such as 4-fold or more, compared to wild-type AAV3B and AAV2 (Fig. 4A ⁇ 4J table and middle graph). Also, AAV.GT5 requires 1.5 times the amount of antiserum required for the same luciferase activity (e.g., half maximal activity) of AAV-LK03, wild-type AAV3B, AAV2, even for serum #02. It was also shown to be more than double (from the lower graphs of FIGS. 4A to 4J). These results indicated that AAV.GT5 was least inhibited by neutralizing antibodies than the AAV-LK03, AAV3B, and AAV2 controls.
  • AAV.GT5 was least inhibited by neutralizing antibodies than the AAV-LK03, AAV3B, and AAV2 controls
  • AAV.GT5 was least inhibited by neutralizing antibodies than any of the AAV.M1, AAV.M2, AAV3B and AAV2 controls.
  • AAV.GT5-OTC DNA having the following structure (referred to as AAV.GT5-OTC) was prepared. A more detailed array configuration is shown in FIGS. 5A, 5B and SEQ ID NO:12.
  • Table 6 and FIG. 7 show the results of comparing the protein expression levels of OTC with AAV.GT5.
  • AAV.GT5 confirmed an approximately 86-fold improvement in protein expression level compared to the control, similar to the result of mRNA expression level.
  • Table 7 and FIG. 8 show the results of comparison of OTC enzymatic activity with AAV.GT5. Based on the above results, the use of AAV.GT5-OTC as a therapeutic tool is expected to offer advantages such as very strong OTC expression and/or a large reduction in viral vector dosage.
  • the recombinant adeno-associated virus vector of the present invention was able to reduce attack from neutralizing antibodies in vivo and, for example, could transduce genes into target cells at a rate of about four times or more in the presence of neutralizing antibodies. Furthermore, under the control of a liver-specific promoter, the human ornithine transcarbamylase protein could be expressed with approximately 90-fold higher efficiency than controls. Therefore, it is believed that ornithine transcarbamylase deficiency can be treated more efficiently by using the recombinant adeno-associated virus vector expressing the human ornithine transcarbamylase protein of the present invention.
  • SEQ ID NO: 1 amino acid sequence of AAV2 capsid protein
  • SEQ ID NO: 2 amino acid sequence of AAV3A capsid protein
  • SEQ ID NO: 3 amino acid sequence of AAV3B capsid protein
  • SEQ ID NO: 4 amino acid sequence of AAV.GT5 modified capsid protein (S472A, S587A, N706A)
  • SEQ ID NO: 5 amino acid sequence of AAV8 capsid protein
  • SEQ ID NO: 6 amino acid sequence of AAV3A Rep protein (ARep)
  • SEQ ID NO: 7 amino acid sequence of AAV3B Rep protein (BRep)
  • SEQ ID NO: 8 AAV.GT5 Rep protein (baRep )
  • SEQ ID NO: 9 amino acid sequence of AAV-LK03 capsid protein
  • SEQ ID NO: 10 cDNA sequence of ornithine transcarbamylase (OTC)
  • OTC amino acid sequence of ornithine transcarbamylase

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Abstract

本出願は、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症に対する新規治療手段を提供する。より詳細には、本出願は、オルニチントランスカルバミラーゼを発現し、血中の中和抗体からの攻撃を低減させて、生体（例えば、ヒト）の肝臓に効率よく遺伝子導入する改変型アデノ随伴ウイルスベクターを提供する。本出願は、オルニチントランスカルバミラーゼを発現する、VP1タンパク質のアミノ酸配列において472番目、587番目及び706番目のうちの少なくとも１つが他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列などを含む改変型VP1タンパク質を含み、AAV2に対する中和抗体と交差反応しない、改変型アデノ随伴ウイルスベクターなどを提供する。

Description

オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症の治療用アデノ随伴ウイルスビリオン
　本発明は、尿素サイクル異常症の治療のための、血清中の中和抗体の影響を受けにくい組換えアデノ随伴ウイルス（recombinant adeno-associated virus: rAAV）ベクターに関する。より詳細には、本発明は、組換えオルニチントランスカルバミラーゼ（OTC）を発現可能であり、生体の血清中の中和抗体との交差反応性が低減しており、生体（例えば、ヒト）の肝臓により高効率の遺伝子導入を可能とする改変型rAAV、およびこのrAAVを含む医薬組成物に関する。
　オルニチントランスカルバミラーゼ（OTC）は、アンモニアの代謝に関わる尿素サイクルの酵素で、その欠損症は、Ｘ染色体にあるOTC遺伝子の機能喪失型変異に起因する。OTC欠損症は尿素サイクル異常症の中では最も頻度が高い。Ｘ連鎖性遺伝性疾患であるが、女性でも様々な症候を呈する。異化の亢進（発熱、絶食など）、蛋白質の過剰摂取などによって高アンモニア血症を生じる。臨床症状は嘔吐、哺乳力低下、多呼吸、けいれん、意識障害、行動異常、発達障害などがみられる。男児では新生児発症が多く、致死的になることもある。女児では肝機能障害を契機に発見されることがある。生涯にわたり、低蛋白食事療法、残余窒素排泄促進剤や塩酸アルギニンの投与が必要となる。また、急性期には血液浄化療法が必要で、高アンモニア発作を繰り返すときには生体肝移植の適応となる。治療を開始しても中枢神経系への影響は必須であり、それに伴う知的障害によって社会的に自立できない生活を余儀なくされることが多い。以上の背景からも有効な治療法開発が喫緊の課題である（非特許文献１）。
　アデノ随伴ウイルス(AAV)を応用した遺伝子導入用ベクターは、神経細胞、肝細胞（肝実質細胞）、網膜細胞、筋肉細胞、心筋細胞、血管内皮細胞、脂肪細胞などの体内の細胞に遺伝子を導入し、長期間発現させることができる（特許文献１～３）。そのため、血友病、網膜色素変性症、パーキンソン病などの遺伝子治療用ベクターとして臨床応用が進んでいる(非特許文献２、３)。さらに、最近では遺伝子編集におけるsgRNAとCAS9蛋白質の遺伝子を導入するためのベクターとして頻用されている(特許文献３、非特許文献４)。血友病に対しては、第VIII因子またはIX因子を発現するAAVベクターを肝細胞に導入する遺伝子治療で有望な結果が報告されている(特許文献４、非特許文献５、６)。
　上記のOTC欠損症の遺伝子治療ではヒト肝臓を標的臓器として、8型アデノ随伴ウイルス（AAV8）ベクターが応用されている（非特許文献７）。しかし、AAV8ベクターは、マウスの肝臓へ遺伝子導入効率は高いが、ヒト肝臓への遺伝子導入効率は低い。また、ヒト肝細胞への遺伝子導入効率がAAV8より優れているとされるAAV3Bでは、成人の80％以上が持つAAV2に対する中和抗体と交差反応するため(非特許文献８～１０)、多くの患者で効果が期待できない。また、中和抗体を持つため遺伝子治療の対象外であった患者に遺伝子治療を行うこと、1回目の遺伝子治療で十分な効果が得られなかった患者に再度遺伝子治療を行うこと等が進められている。
国際公開第2008/124724号 国際公開第2012/057363号 国際公開第2018/131551号 特表2016-525356
Nakamura K, et al., Pediatr Int. ;56(4):506-9, 2014 Dunber CE, et al., Science 359: eaan4672, 2018. Hastie E, Samulski RJ, Hum Gene Ther 26: 257-265, 2015. Ohmori T, et al., Sci Rep 7: 4159, 2017. George LA, et al., N Engl J Med 377: 2215-2227,2017. Rangarajan S, et al., N Engl J Med 377: 2519-2530, 2017. Wang L., et al., Gene Therapy (2012) 19, 404-410 Mimuro J, et al., J Med Virol 86: 1990-1997, 2014. Ling C, et al., J Integr Med 13: 341-346, 2015. Meliani A, et al., Hum Gene Ther Methods  26: 45-53, 2015.
　そこで、AAV2等に対する血清中の中和抗体に対する交差反応性が低減しており、肝細胞に対する遺伝子導入効率が高いAAVベクター、例えばAAV3BやAAV8に由来する新規のAAVベクターによって肝臓細胞のゲノム障害に起因する疾患（例えばオルニチントランスカルバミラーゼ欠損症）に対する治療手段の確立が求められている。
　上記の課題を解決するために、本発明者らは、オルニチントランスカルバミラーゼを発現する、血清中の中和抗体（AAV2中和抗体など）に対する交差反応性が低減した改変型AAVベクターを創出して、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、オルニチントランスカルバミラーゼを発現する、血清中の中和抗体に対する交差反応性が低減しており、肝細胞に対する遺伝子導入効率が高いAAVベクター、例えば肝細胞を標的とする遺伝子治療のための組換えアデノ随伴ウイルスベクター、それを含む医薬組成物など、以下に例示する発明を提供する。
［１］　配列番号２または３のアミノ酸配列において、472番目のセリン、587番目のセリン、及び706番目のアスパラギンのうちの少なくとも１つが他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または前記置換されたアミノ酸配列に対して、472番目、587番目及び706番目の残基の他に1～6個の残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質、ならびに
　配列番号１１のアミノ酸配列、または配列番号１１のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、オルニチントランスカルバミラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含むアデノ随伴ウイルスベクターであって、少なくとも２型AAVに対する中和抗体と交差反応しない、アデノ随伴ウイルスベクター。
［２］　前記472番目のセリン、587番目のセリンおよび706番目のアスパラギンが、それぞれ、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、トレオニンおよびイソロイシンからなる群から選択されるアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質を含む、上記［１］に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
［３］　前記472番目のセリン、587番目のセリンおよび706番目のアスパラギンのうちの少なくとも１つがアラニンに置換されたアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質を含む、上記［１］に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
［４］　前記キャプシドタンパク質が、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質を含む、上記［１］に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
［５］　前記中和抗体が、AAV3(例えばAAV3B)またはAAV8とは異なる型のアデノ随伴ウイルスに対する抗体である、上記［１］に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
［６］　前記中和抗体が、AAV2に対する抗体である、上記［１］に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
［７］　肝臓細胞特異的プロモーター配列を含むウイルスゲノムを有する、上記［１］に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
［８］　前記肝臓細胞特異的プロモーター配列が、ApoEプロモーター、アンチトリプシンプロモーター、cKitプロモーター、肝臓特異的転写因子（HNF-1、HNF-2、HNF-3、HNF-6、C/ERP、DBP）のプロモーター、アルブミンプロモーター、サイロキシン結合グロブリン(TBG)のプロモーター、およびHCRhAATプロモーターからなる群から選択されるプロモーター、またはこれらプロモーターと90％以上の相同性を有するポリヌクレオチド配列を含み、肝臓特異的に機能するプロモーターを含む、上記［１］に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
［９］　配列番号２または３に記載のアミノ酸配列において、472番目のセリン、587番目のセリン、及び706番目のアスパラギンのうちの少なくとも１つが他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または前記置換されたアミン酸配列に対して、472番目、587番目及び706番目の残基の他に1～6個の残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質、ならびに
　配列番号１１のアミノ酸配列、または配列番号１１のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、オルニチントランスカルバミラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含む、アデノ随伴ウイルスベクター。
［１０］　配列番号２または３に記載のアミノ酸配列において、472番目のセリン、587番目のセリンおよび706番目のアスパラギンのうちの少なくとも１つが他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列であって、他の残基位置において1～6個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列、
　前記472番目のセリン、587番目のセリンおよび706番目のアスパラギンが、それぞれ、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、トレオニンおよびイソロイシンからなる群から選択されるアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
　前記472番目のセリン、587番目のセリンおよび706番目のアスパラギンのうちの少なくとも１つがアラニンに置換されたアミノ酸配列、または
　配列番号４に記載のアミノ酸配列
のうちのいずれか1つの配列をコードする、ポリヌクレオチド。
［１１］　上記［１］～［９］のいずれか１項に記載のアデノ随伴ウイルスベクターを含む、生体の肝臓への遺伝子導入のための医薬組成物。
［１２］　前記生体がヒトである、上記［１１］に記載の医薬組成物。
［１３］　オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症の治療のための上記［１１］または［１２］に記載の医薬組成物。
［１４］　血中アンモニア濃度の低減のための上記［１１］または［１２］に記載の医薬組成物。
　本発明は、組換えオルニチントランスカルバミラーゼ（OTC）を発現し、AAV2等に対する中和抗体に対する交差反応性が低減しており、肝細胞に対する遺伝子導入効率が高いAAVベクター、例えばAAV3BやAAV8に由来するAAVベクターを提供する。さらに、本発明に係るAAVベクターを用いることにより、元々、中和抗体を持つため遺伝子治療の対象外であった患者への遺伝治療や、1回目の遺伝子治療で十分な効果が得られなかった患者に再度遺伝子治療を行うことが可能となる。本願発明のAAVベクターを用いることにより、特に肝細胞へのオルニチントランスカルバミラーゼ遺伝子導入を向上させることができるので、特にオルニチントランスカルバミラーゼ欠損症の治療に有用である。
図１Ａは、AAV3A、AAV3B及びAAV.GT5のVP1タンパク質アミノ酸のアラインメントを示す。 図１Ｂは図１Ａの続きを示す。 図１Ｃは、AAV3A、AAV3B及びAAV.GT5のRepタンパク質アミノ酸配列（各々ARep、BRep、baRepとして示される）のアラインメントを示す。 図１Ｄは図１Ｃの続きを示す。 図２Ａは、AAV.GT5のヒト肝臓由来HepG2細胞におけるGFP発現量を示す。 図２Ｂは、図２Ａおいて遺伝子導入されたGFP発現細胞の状態を示す。 図２Ｃは、AAV.GT5によるヒト肝臓由来HepG2細胞におけるルシフェラーゼ発現量を示す。 図３Ａは、AAV.GT5のヒト肝臓由来PXB細胞におけるGFP発現量を示す。 図３Ｂは、図３Ａおいて遺伝子導入されたGFP発現細胞の状態を示す。 図４Ａは、AAVに対する中和抗体を含む血清（血清#01）との反応後の各AAVベクターによる、HEK293細胞におけるルシフェラーゼ発現量を比較した結果を示す。 図４Ｂは、AAVに対する中和抗体を含む血清（血清#02）との反応後の各AAVベクターによる、HEK293細胞におけるルシフェラーゼ発現量を比較した結果を示す。 図４Ｃは、AAVに対する中和抗体を含む血清（血清#03）との反応後の各AAVベクターによる、HEK293細胞におけるルシフェラーゼ発現量を比較した結果を示す。 図４Ｄは、AAVに対する中和抗体を含む血清（血清#04）との反応後の各AAVベクターによる、HEK293細胞におけるルシフェラーゼ発現量を比較した結果を示す。 図４Ｅは、AAVに対する中和抗体を含む血清（血清#05）との反応後の各AAVベクターによる、HEK293細胞におけるルシフェラーゼ発現量を比較した結果を示す。 図４Ｆは、AAVに対する中和抗体を含む血清（血清#06）との反応後の各AAVベクターによる、HEK293細胞におけるルシフェラーゼ発現量を比較した結果を示す。 図４Ｇは、AAVに対する中和抗体を含む血清（血清#07）との反応後の各AAVベクターによる、HEK293細胞におけるルシフェラーゼ発現量を比較した結果を示す。 図４Ｈは、AAVに対する中和抗体を含む血清（血清#08）との反応後の各AAVベクターによる、HEK293細胞におけるルシフェラーゼ発現量を比較した結果を示す。 図４Ｉは、AAVに対する中和抗体を含む血清（血清#09）との反応後の各AAVベクターによる、HEK293細胞におけるルシフェラーゼ発現量を比較した結果を示す。 図４Ｊは、AAVに対する中和抗体を含む血清（血清#10）との反応後の各AAVベクターによる、HEK293細胞におけるルシフェラーゼ発現量を比較した結果を示す。 図４Ｋは、AAVに対する中和抗体を含む血清（血清#A～#D）との反応後の各AAVベクターによるGFP発現量を比較した結果を示す。 図５Ａは組換えウイルスゲノムAAV.GT5-HCRhAAT promoter-human OTC-WPREの構造を示す。 （図５Ａの続き） 図６は、マウスPBX細胞における組換えOTCのmRNA発現量を示す。 図７は、マウスPBX細胞における組換えOTCのタンパク質発現量を示す。 図８は、マウスPBX細胞における組換えOTCのタンパク質活性を示す。
　本発明は、組換えオルニチントランスカルバミラーゼ（OTC）を発現し、肝臓の細胞への遺伝子導入の効率を向上させる組換えアデノ随伴ウイルスベクター、そのベクターを含む医薬組成物などを提供する。
１．本発明に係る組換えアデノ随伴ウイルスベクターについて
１．１．アデノ随伴ウイルスについて
　アデノ随伴ウイルスは、公知の多数の血液型のウイルスを含む。肝細胞（肝実質細胞）に対して指向性を示すアデノ随伴ウイルスとしては、例えば、２型、３型（３Ａ及び３Ｂ）、８型の血液型のウイルスが挙げられる。本発明において、生体の肝細胞に送達するためのベクターとしては、例えば、特許文献１（WO 2008/124724）に記載される種々のアデノ随伴ウイルスベクターを用いることができる。
　天然のアデノ随伴ウイルスは非病原性ウイルスである。この特徴を利用して、所望の遺伝子を保持する種々の組換ウイルスベクターが作製されて、遺伝子治療のために利用されている（例えば、WO2003/018821、WO2003/053476、WO2007/001010、薬学雑誌126(11)1021-1028などを参照のこと）。野生型AAVゲノムは、全長が約５kbのヌクレオチド長を有する一本鎖DNA分子であり、センス鎖またはアンチセンス鎖である。AAVゲノムは、一般に、ゲノムの５'側および３'側の両末端に約145ヌクレオチド長のインバーテッドターミナルリピート（ITR）配列を有する。このITRは、AAVゲノムの複製起点としての機能及びこのゲノムのビリオン内へのパッケージングシグナルとしての機能等の多様な機能を有することが知られている（例えば、上記の文献である薬学雑誌 126(11)1021-1028などを参照のこと）。ITRに挟まれた野生型AAVゲノムの内部領域（以下、内部領域）は、AAV複製（rep）遺伝子及びキャプシド（cap）遺伝子を含む。これらrep遺伝子及びcap遺伝子は、それぞれ、ウイルスの複製に関与するタンパク質(Rep)、及び正20面体構造の外殻であるウイルス粒子を形成するキャプシドタンパク質（例えば、VP1、VP2及びVP3の少なくとも１つ）をコードする。さらなる詳細については、例えば、Human Gene Therapy, 13, pp.345-354, 2002、Neuronal Development 45, pp.92-103, 2001、実験医学 20,pp.1296-1300, 2002、薬学雑誌126(11)1021-1028、Hum Gene Ther,16,541-550, 2005などを参照のこと。
　本発明のrAAVベクターは、天然のアデノ随伴ウイルス１型（AAV1）、２型（AAV2）、３型（AAV3A/AAV3B）、４型（AAV4）、５型（AAV5）、６型（AAV6）、７型（AAV7）、８型（AAV8）、９型（AAV9）、１０型（AAV10）、ＲＨ１０型（AVVrh10；Hu,C.ら、Molecular Therapy vol. 22 no. 10 oct. 2014, 1792-1802）に由来するベクターであるが、これに限定されない。これらのアデノ随伴ウイルスゲノムのヌクレオチド配列は公知であり、それぞれ、GenBank登録番号：AF063497.1（AAV1）、AF043303（AAV2）、NC_001729(AAV3)、NC_001829.1（AAV4）、NC_006152.1（AAV5）、AF028704.1（AAV6）、NC_006260.1（AAV7）、NC_006261.1（AAV8）、AY530579（AAV9）、AY631965.1 (AAV10)のヌクレオチド配列を参照できる。
　本発明において、特に肝細胞への指向性のために、AAV2、AAV3B（AF028705.1）、AAV8、またはAAV9に由来するキャプシドタンパク質（VP1、VP2、VP3など）を利用することが好ましい。これら各キャプシドタンパク質のアミノ酸配列は公知であり、例えば、各AAVに対応する上記のGenBank登録番号に登録された配列を参照できる。
１．２．本発明に係るキャプシドタンパク質について
　本発明に用いるrAAVベクターは、変異（改変）されたキャプシドタンパク質を含む。このような変異体キャプシドタンパク質としては、配列番号２または３に記載のアミノ酸配列において、472番目のセリン、587番目のセリン、及び706番目のアスパラギンのうちの少なくとも１つ、例えば１つ、好ましくは２つ、より好ましくは３つ全てが他のアミノ酸で置換された変異アミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質、さらに当該変異アミノ酸配列に対して472番目、587番目及び706番目以外の他の残基位置において複数のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、キャプシドタンパク質として機能できる変異体タンパク質を含む。これら欠失、置換、挿入および／または付加のうち２種以上の組合せを同時に含んでもよい。
　また、本発明に用いるrAAVベクターは、配列番号２または３に記載のアミノ酸配列において、472番目のセリンが、587番目のセリン及び706番目のアスパラギンのうちの少なくとも１つ、例えば１つ、好ましくは２つ、より好ましくは３つ全てが、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、トレオニンおよびイソロイシンからなる群から選択されるアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、好ましくはアラニンで置換された配列（例えば配列番号４のアミノ酸配列）を有するキャプシドタンパク質、さらに当該変異アミノ酸配列に対して472番目、587番目及び706番目以外の他の残基位置において複数のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質を含む。これら欠失、置換、挿入及び付加のうち２種以上の組合せを同時に含んでもよい。
　上記のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の数としては、例えば、1～74個、1～70個、1～60個、1～50個、1～40個、1～35個、1～30個、1～25個、1～20個、1～15個、1～14個、1～13個、1～12個、1～11個、1～10個、1～9個（1～数個）、1～8個、1～7個、1～6個、1～5個、1～4個、1～3個、1～2個または１個の数が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の数は、一般的に小さい程好ましい。
　本発明に用いるrAAVベクターの変異体キャプシドタンパク質は、好ましくは、上記配列番号２～４のいずれかのアミノ酸配列（735～738残基）に対して約90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつキャプシドタンパク質として機能できるタンパク質であり得る。
　本発明においてキャプシドタンパク質として機能するとは、標的細胞に対する感染能を有するウイルスベクターを形成可能であるタンパク質を指す。本発明に用いるキャプシドタンパク質は、単独で又は他のキャプシドタンパク質メンバー（例えば、VP2、VP3など）と一緒になってウイルスベクターを形成できる。当該ウイルスベクター内には、標的細胞、例えば肝臓細胞に送達されるための目的の治療用遺伝子などを含むポリヌクレオチドがパッケージングされる。
　好ましくは、変異体キャプシドタンパク質を含むウイルスベクターは、野生型キャプシドタンパク質を含むウイルスベクターと同等以上の感染能を有するものであり、具体的には、野生型のウイルスゲノム重量当たりの感染能と比較して、好ましくは50%、60%、70%、80％、85％、90%、91％、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上であることを意味する。感染能の測定には、当該分野において公知の方法、例えばβガラクトシダーゼ、ＧＦＰタンパク質、ルシフェラーゼなどのレポーターを利用したレポーターアッセイを用いることができる。
　本発明のタンパク質（ポリペプチド）において相互に置換可能なアミノ酸残基の例を以下に示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
　A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、o-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン；
　B群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸；
　C群：アスパラギン、グルタミン；
　D群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸；
　E群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン；
　F群：セリン、トレオニン、ホモセリン；
　G群：フェニルアラニン、チロシン。
目的のアミノ酸残基置換を含むタンパク質は、通常の遺伝子操作技術、化学合成など、当業者に公知の手法に従って作製することができる。このような遺伝子操作手順については、例えば、Molecular Cloning 4th Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press. 2012、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-2018(ISSN:1934-3647等)などを参照することができる。
　本発明において用いられるrAAVウイルスベクターは、内包するゲノム中またはヘルパーウイルスのゲノム中に、複製のためのRepタンパク質をコードする遺伝子を含み得る。そのようなRepタンパク質は、本発明のrAAVを複製させるために、ITR配列を認識してその配列に依存してゲノム複製を行う機能、ウイルスベクター内に野生型AAVゲノム（又はrAAVゲノム）をパッケージングする機能、本発明のrAAVベクターを形成する機能を、野生型と同程度に有する限り、好ましくは約90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。あるいは、60残基以下、50残基以下、40残基以下、30残基以下、20残基以下、15残基以下、10残基以下、又は5残基以下のアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加を含んでいてもよい。ここで、野生型と同程度に有するとは、野生型に対する比活性として50%、60%、70%、80％、90%またはそれ以上であることを意味する。本発明において、好ましくは、公知のAAV3由来のRepタンパク質、例えばAAV3A、AAV3BのRepタンパク質、あるいはこれらの融合タンパク質（配列番号８のアミノ酸配列）などが使用されるがこれらに限定されない。
　本発明の１実施形態において、上記の野生型AAVゲノムの内部領域にコードされるキャプシドタンパク質VP1など（VP1、VP2および／またはVP3）、およびRepタンパク質は、これらタンパク質をコードするポリヌクレオチドがAAVヘルパープラスミドに組込まれて、本発明のrAAVを得るために用いられる。本発明で用いるキャプシドタンパク質（VP1、VP2および／またはVP3）、ならびにRepタンパク質は、必要に応じて１種、２種、３種またはそれ以上のプラスミドに組込まれていてもよい。場合によって、これらのキャプシドタンパク質およびRepタンパク質のうちの1種以上がAAVゲノムに含まれてもよい。本発明において、好ましくは、キャプシドタンパク質（VP1、VP2および／またはVP3）およびRepタンパク質は全て、１種のポリヌクレオチドにコードされ、AAVヘルパープラスミドとして提供される。
１．３．ウイルスゲノムについて
（１）rAAVウイルスゲノムについて
　本発明のrAAVベクター中にパッケージングされるポリヌクレオチド（すなわち、ポリヌクレオチド）は、野生型ゲノムの5'側および3'側に位置するITRの間に位置する内部領域（すなわち、rep遺伝子及びcap遺伝子の一方または両方）のポリヌクレオチドを、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチド（ゲノム編集手段、及び/又は修復用遺伝子）およびこのポリヌクレオチドを転写するためのプロモーター配列などを含む遺伝子カセットによって置換することにより作製できる。好ましくは、5'側および3'側に位置するITRは、それぞれAAVゲノムの5’末端および3’末端に位置する。好ましくは、本発明のrAAVゲノムにおいて、5’末端および3’末端に位置するITRは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV6、AAV8、またはAAV9のゲノムに含まれる5'側ITRおよび3'側ITRを含むが、これら特定のAAVに限定されない。一般的に、ITR部分は容易に相補配列が入れ替わった配列(flip and flop structure)をとるため、本発明のrAAVゲノムに含まれるITRは、5’と3’の方向が逆転していてもよい。本発明のrAAVゲノムにおいて、内部領域と置き換えられるポリヌクレオチド（すなわち、ゲノム編集手段及び/又は修復用遺伝子）の長さは、元のポリヌクレオチドの長さと同程度が実用上好ましい。すなわち、本発明のrAAVゲノムは、全長が野生型の全長である5kbと同程度、例えば約2～6kb、好ましくは約4～6kbであることが好ましい。本発明のrAAVゲノムに組込まれる治療用遺伝子の長さは、プロモーター、ポリアデニレーションなどを含めた転写調節領域の長さ（例えば、約１～1.5kbと仮定する場合）を差し引くと、好ましくは長さが約0.01～3.7kb、より好ましくは長さが約0.01～2.5kb、さらに好ましく約0.01～2kbであるが、これに限定されない。さらに、公知のinternal ribosome entry site (IRES)配列、T2A配列等を介在させるなどの公知の手法を用いて、rAAVゲノムの全長が上記の範囲内である限り、二種類以上の治療用遺伝子を同時に組み込むことが可能である。本発明のrAAVが二種以上のタンパク質を発現する場合、各々のタンパク質をコードする遺伝子は、同じ方向に配置されても、異なる方向に配置されてもよい。
　一般的に、組換えアデノ随伴ウイルスベクター内にパッケージングされるポリヌクレオチドが一本鎖である場合、目的の遺伝子（治療用遺伝子など）は発現されるまでに時間（数日）を要し得る。この場合、導入される目的の遺伝子を自己相補性（self-complementary：sc)型となるように設計して、発現までの時間をより短くできる。具体的には、例えば、Foust K.D.ら(Nat Biotechnol. 2009 Jan;27(1):59-65)などに記載されている。本発明のrAAVベクター中にパッケージングされるポリヌクレオチドは、非sc型であってもよいしsc型であってもよい。好ましくは、本発明のrAAVベクター中にパッケージングされているポリヌクレオチドは非sc型である。
　本発明に用いるキャプシドタンパク質は、例えば、宿主細胞におけるコドン優先度に基づき適宜改変されたポリヌクレオチドによってコードされ得る。本発明に用いられる好ましいキャプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、例えば、配列番号２～４のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列において、１個以上（例えば、1～50個、1～40個、1～30個、1～25個、1～20個、1～15個、1～10個、1～9個（1～数個）、1～8個、1～7個、1～6個、1～5個、1～4個、1～3個、1～2個、1個など）のヌクレオチドの欠失、置換、挿入および／または付加を有するポリヌクレオチドであって、配列番号２～４のアミノ酸配列を含むタンパク質、あるいは配列番号２～４のアミノ酸配列において上記の１個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列を含みキャプシドタンパク質として機能する（キャプソメアを形成可能である）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。これら欠失、置換、挿入および／または付加のうち２種以上の組合せを同時に含んでもよい。上記ヌクレオチドの欠失、置換、挿入および／または付加の数は、一般的に小さい程好ましい。また、本願発明において好ましいポリヌクレオチドは、例えば、配列番号２～４のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドまたはその相補配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであって、配列番号２～４のアミノ酸配列を含むタンパク質、あるいは配列番号２～４のアミノ酸配列において上記の１個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列を含みキャプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。
　ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning 4th Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press. 2012）に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、製造業者により提供される使用説明書などに記載の方法に従って行うことができる。ここで、「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、50℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するDNAが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
　ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、FASTA、BLASTなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、対照のポリヌクレオチド配列と比較して、例えば、70%以上、80%以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。
　なお、アミノ酸配列やポリヌクレオチド配列の同一性または相同性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268,1990； Proc. Natl. Acad. Sci USA 90: 5873, 1993）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403,1990）。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばExpect threshold＝100、Word size＝12とする。また、BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばExpect threshold＝50、Word size＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、好ましくは各プログラムのデフォルトパラメーターを用いるが、これらパラメーターは当業者に公知の範囲内で適宜変更されてもよい。
２．中和抗体の交差反応性について
　本発明に係るアデノ随伴ウイルスベクターは、少なくとも血清中に存在する２型AAV（AAV2）、場合によりさらに１型AAV（AAV1）および／または８型AAV（AAV8）もしくは他の野生型AAVに対する中和抗体と交差反応しないものである。
　本発明において、中和抗体とは、ある抗原が生体に対して毒性や感染力などの活性をもつとき、その抗原に結合して活性を減退または消失させる抗体を指す。本発明において、抗体の活性に関する文脈において「中和」とは、例えば血清中の抗アデノ随伴ウイルス中和抗体（例えば、IgG、IgM、IgA）が、抗原であるAAVベクターと結合した結果、そのAAVベクターの遺伝子導入能力を低下または喪失させることをいう。この中和反応は、抗原（例えばAAVベクター）と抗体との結合、抗体のFc部分と補体第１成分（C1）との結合などの一連の補体反応等を含み、結果的にそのAAVベクターは標的細胞への感染能（遺伝子導入能）を低下または喪失する。また、本発明において、中和抗体は、血清成分を伴うこと、すなわち補体などの抗体と結合して抗原の不活性化や除去などの中和反応に直接的に関係する成分も含むことが意図される。
　本発明において、中和抗体の交差反応とは、中和抗体が、本来の標的抗原（例えば、AAV2）とは異なる標的物質（例えば、AAV3）と結合する反応を指す。また、本発明において「中和抗体と交差反応しない」とは、中和抗体が本来の標的抗原ではない標的物質との結合反応において、十分には機能しないこと、好ましくは検出可能には結合しないことを指すが、または検出可能であっても本来の標的抗原と比較する場合に標的物質の結合量（モル比または質量比）が有意に低減されることを指す。このような低減される標的物質の量としては、本来の標的抗原の結合量と比較して、数％（約5％）、約10％、約15％、約20％、約25％、約30％、約35％、約40％、約45％、約50％、約60％の結合量が挙げられる。この割合は、抗体に結合したタンパク質量を測定する方法などの公知の方法を用いて取得できる。あるいは、中和抗体の交差反応は、組換えウイルス内にコードされるタンパク質（レポーター遺伝子など）を用いて間接的に測定して比較することもできる。
　本発明に係る中和抗体は、好ましくは哺乳動物由来ものであり、より好ましくは霊長類由来のもの、最も好ましくはヒト由来のものである。本発明に用いる中和抗体は、特に記載されない場合、AAV2に対する中和抗体である。通常、ヒトはAAV2に対する抗体を所持している可能性が高いが、その大部分は中和能力を有する抗体ではなく、中和能力を有するものは18～32％との報告もある（Chirmule N. et al., Gene Ther 6: 1574-1583, 1999；Moskalenko M, et al., J Virol 74: 1761-1766, 2000）。さらに、AAV2に対する中和抗体を含むヒト血清の多くは、AAV3AやAAV3Bに対する中和抗体を含むことが公知である（Fu Hら、Hum Gene Ther Clin Dev 2017; 28:187-196, Ling CJら Integr Med 2015;13:341-346）。このことはAAV2のVP1タンパク質（配列番号１）とAAV3AまたはAAV3BのVP1タンパク質（配列番号２または３）とのアミノ酸同一性が比較的高いこと（具体的には約87～88％）によっても示唆される。
　さらに、本発明に用いる中和抗体は、複数のアイソタイプ（例えば、IgG、IgM、IgAなど）を含み得る。したがって、本発明に係るAAV2に対する中和抗体は、事前に抗体濃度もしくは抗体力価などの性能について検証する必要がある。そのような検証手段は公知であり、例えば、Itoらの文献（Ito et al., Ann Clin Biochem 46: 508-510, 2009）に記載される手段を用いることができる。具体的には、中和抗体の力価（抗体価）を、HEK293細胞に対してβガラクトシダーゼやルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子を含むAAV2ベクターを導入する場合の阻害能力を評価することによって分析できる（上記Itoらの文献）。
　本発明に用いる中和抗体は、抗体価が1:4～1:640であり、好ましくは1:16～1:254、より好ましくは1:32～1:128である。本発明における抗体価の具体的な測定方法については、実施例中の「(e) 血清中の中和抗体との交差反応性の検証」、「(3)中和抗体の抗体価の測定」の記載等を参照できる。
　また、中和抗体の交差反応性を確認するためのアッセイ方法の具体的な手順として、Li C, et al., Gene Ther 19: 288-294, 2012、Meliani A, et al., Hum Gene Ther Methos 26:45-53, 2015などの文献に記載の方法を用いることができる。
　本願発明のアデノ随伴ウイルスベクターは、野生型のものと比較して、血清中の中和抗体の影響を受けにくいものである。具体的には、本発明のウイルスベクター（例えば、配列番号４のアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質を含むもの）は、血清中の中和抗体によって処理された後に、標的細胞に遺伝導入する能力を少なくとも60%、好ましくは70%以上、より好ましくは75%以上、さらに好ましくは80％以上、85%以上、90%以上、95%以上維持するものである。ここで、遺伝子導入能力の比較には、例えばレポーターアッセイ、インサイチュハイブリダイゼーション、ラジオアイソトープ標識などの公知のアッセイを利用することができる。一方、野生型のウイルスベクター（例えば、配列番号２または３のアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質を含むもの）は、同様に血清中の中和抗体によって処理された後に、標的細胞に遺伝導入する能力を約60％未満、約50%未満、約40%未満、約35%未満、約30%未満保持し得る。
　あるいは、本発明のウイルスベクターは、野生型のウイルスベクターと比較して、血清中の中和抗体によって処理された後に、標的細胞に対して1.2倍以上、好ましくは1.5倍以上、より好ましくは1.75倍以上、さらに好ましくは2倍以上の量の遺伝子を導入できるものである。
　本発明において、例えばAAV2に対する中和抗体は、交差反応によってAAV3等に対しても中和活性を有し得ることが公知である（Fu Hら、Hum Gene Ther Clin Dev 2017; 28:187-196, Ling CJら Integr Med 2015;13:341-346, Mimuro J, et al., J Med Virol 86: 1990-1997, 2014.）。ここで、AAV2のキャプシドタンパク質VP1とAAV3A VP1との間のアミノ酸配列の同一性は87％、AAV2 VP1とAAV3B VP1との同一性は88％と計算される（これら同一性はBlastpのウェブサイト（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）を利用して得た結果）。さらに、抗AAV2中和抗体のエピトープマッピングに関する研究が、Moskalenko, M.ら（J Virol 74: 1761-1766, 2000）に記載されている。
　また、AAVの細胞への感染に関する細胞外レセプターとして、以下のものが知られている（Summerfold et al., Mol Ther 24: 2016；Pillay et al., Nature 530:108-112, 2016）。
　一次レセプター
　　AAV2、3、6：ヘパラン硫酸プロテオグリカン
　　AAV9：N末端ガラクトース
　　AAV1、4、5、6：特定のN連結型またはO連結型シアル酸部分
　二次レセプター
　　AAV2：線維芽細胞増殖因子レセプター及びインテグリン
　　AAV2、3：肝細胞増殖因子レセプター（c-Met）
　　AAV5：血小板由来増殖因子（これはシアル酸によって修飾され得る）
　本出願の開示内容と上記の受容体に関する知見に基づいて、本発明に係る組換えウイルスベクターに基づいて、AAV2等に対する生体の中和抗体による阻害をより一層受けにくい組換えベクターを設計、スクリーニング、取得することも考えられる。
３．本発明のウイルスベクターが含む遺伝子について
　１実施形態において、本発明のrAAVベクターは、好ましくは、肝臓特異的なプロモーターおよびそのプロモーターと作動可能に連結された目的遺伝子を含むポリヌクレオチドを含む（すなわち、そのようなポリヌクレオチドがパッケージングされている）。本発明に用いるプロモーターとしては、肝臓中の細胞に特異的なプロモーター、例えば、肝実質細胞、肝非実質細胞（星状細胞等）などに特異的なプロモーターを用いることができる。このようなプロモーター配列としては、具体的には、ApoEプロモーター、アンチトリプシンプロモーター、cKitプロモーター、肝臓特異的転写因子（HNF-1、HNF-2、HNF-3、HNF-6、C/ERP、DBPなど）のプロモーター、サイロキシン結合グロブリン(TBG)プロモーター（Ran FA, et al., Nature 520(7546):186-91, 2015）、その他の肝臓特異的タンパク質（アルブミンなど）のプロモーター、これらプロモーターを組み合わせた合成プロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。また、これらのプロモーターはさらに、公知のエンハンサー、好ましくは肝臓特異的なエンハンサーと組み合わせることができる。このようなエンハンサーとしては、ApoEエンハンサーなどが挙げられる。これらプロモーターおよびエンハンサーは、単独または任意の複数を組み合わせて用いることができる。さらにまた、上記の肝臓特異的なプロモーター及びエンハンサーを利用した合成プロモーターを用いることもできる。本発明のrAAVベクターは、好ましくは、肝臓特異的、より好ましくは肝細胞（肝実質細胞）特異的なApoEプロモーター、アンチトリプシンプロモーター、TBGプロモーター、または公知の合成プロモーターであるHCRhAATプロモーター（例えば配列番号１２のヌクレオチド397～1046の配列を有するもの）を含み得る。
　また、本発明において用いる肝臓特異的なプロモーター（またはエンハンサー）は、上記のプロモーターのポリヌクレオチド配列において、１個以上（例えば、1～100個、1～50個、1～40個、1～30個、1～25個、1～20個、1～15個、1～10個、1～9個（1～数個）、1～8個、1～7個、1～6個、1～5個、1～4個、1～3個、1～2個、1個など）のヌクレオチドの欠失、置換、挿入および／または付加を有する配列を含むポリヌクレオチドであって、肝臓特異的なプロモーターとして機能し得るものを用いることもできる。本明細書中、肝臓特異的なプロモーターとして機能し得ることは、例えば、肝臓由来の細胞と肝臓に由来しない細胞とをレポーターアッセイにおいて比較した場合、肝臓に由来しない細胞では、検出の閾値程度のレポーターを発現するか、または肝臓由来の細胞と比較して約25％以下、約20％以下、約15％以下、約10％以下もしくはそれ以下のレポーターを発現することをいう。また、上記の欠失、置換、挿入および／または付加を有するポリヌクレオチドは、元のプロモーター配列に対する比活性として50%、60%、70%、80％、90%またはそれ以上であることを意味する。上記の変異の数は少ないほど好ましい。
　本発明のAAVベクターを用いる治療対象となる疾患として、肝細胞のゲノム障害と関連するオルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、血友病、急性間欠性ポルフィリア症、Wilson病、フェニルケトン尿症、家族性高コレステロール血症などが挙げられる。
　上記の治療を行うために、本発明に用いる組換えウイルスベクターは、様々な治療用遺伝子（ポリヌクレオチド）を含み得る。そのような治療用遺伝子がコードするタンパク質としては、例えば、オルニチントランスカルバミラーゼ（OTC）、カルバモイルリン酸シンターゼI(CPS1)、血液凝固VIII因子（FVIII）、血液凝固IX因子(FIX)、肝細胞増殖因子（HGF）、肝細胞増殖因子受容体（c-Kit）などのタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
　オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症は、オルニチントランスカルバミラーゼ遺伝子に係る障害であり、肝臓における尿素サイクルの機能不全などを原因とする。生体の肝臓では、生体に有毒なアンモニアから無害な尿素を生成しており、この経路は尿素サイクルと称される。この尿素サイクルに関与する酵素の例として、オルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)、カルバモイルリン酸シンターゼI(CPS1)、アルギニノコハク酸シンターゼ(ASS)、アルギニノコハク酸リアーゼ(ASL)、アルギナーゼI(ARG1)、N-アセチルグルタミン酸シンターゼ(NAGS)、オルニチン/シトルリンアンチポーター (ORNT1)が挙げられる。これらの酵素の遺伝子的な異常が生じると尿素サイクル異常症が生じる。この尿素サイクル異常症のうち、OTC欠損症は最も頻度が高い。
　OTCの成熟体は、Ｘ染色体上にコードされる約36kda（ヒトの場合）のタンパク質（配列番号１１のアミノ酸配列）の三量体から構成される。OTCは、詳細には、尿素サイクルにおいてオルニチンをシトルリンに変換する（下記図中の(3)）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 　　　　　　　　　　（岩波書店「岩波 生物学辞典 第４版」より）
　本願発明において用いるOTCとしては、オルニチンをシトルリンに変換する酵素であれば特に限定されず、好ましくは哺乳動物由来のもの、より好ましくはヒト由来ものが挙げられる。例えば、本発明に用いるOTCとして、配列番号１１のアミノ酸配列を有するタンパク質を使用できる。また、オルニチントランスカルバミラーゼ活性として、野生型と比較して好ましくは40％以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上または99%以上の比活性を保持する変異体を用いることもできる。そのような変異体としては、例えば、配列番号１１のアミノ酸配列に対して60%以上、70%以上、80%以上、90％以上、95%以上、96％以上、97%以上、98%以上、または99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するものが挙げられるが、これらに限定されない。
　OTCの測定方法としては、例えば、酵素活性による測定方法（Piersonら(1977) J. Biol. Chem. 252, 6464-6469）、免疫学的測定法（WO 2006/073073）が公知である。本願発明において、OTCの測定方法として当該分野で公知である任意の測定方法を使用できる。さらに、血中または培地中のアンモニア濃度を当該分野で公知の手段によって測定することで、本願発明のベクターの投与によってアンモニア濃度が低減されることを確認できる。
　本発明に用いる治療用遺伝子は、例えば、標的の機能を阻害するための遺伝子（アンチセンスヌクレオチド、CAS9等）であってもよいが、これらに限定されない。本明細書中で用いる場合、アンチセンスヌクレオチドとは、標的とする内在性遺伝子の機能を変化（例えば、破壊、低下）させるためのポリヌクレオチド、または内在性タンパク質の発現レベルを変化（例えば、低下）させるためのポリヌクレオチドを指す。このようなポリヌクレオチドとしては、例えば、アンチセンス分子、リボザイム、干渉性RNA（iRNA）、マイクロRNA(miRNA)、sgRNAが挙げられるが、これらに限定されない。二重鎖RNA(dsRNA、siRNA、shRNA又はmiRNA)の調製方法、使用方法などは、多くの文献から公知である（特表2002-516062号公報; 米国公開許第2002/086356A号; Nature Genetics, 24(2), 180-183, 2000 Feb.等参照）。さらに、本発明に用いる組換えウイルスベクターは、１種以上の治療用遺伝子を含んでもよい。
４．医薬組成物について
　本発明のさらなる実施形態において、本発明のrAAVベクター（rAAVビリオン）を含む医薬組成物が提供される。本発明のrAAVベクターを含む医薬組成物（以下、本発明の医薬組成物という）を利用することによって、被検体の肝臓の細胞に高い効率で治療用遺伝子を導入可能であり、導入される治療用遺伝子が発現することによって目的の疾患を治療できる医薬組成物を提供する。このような治療用遺伝子を含むrAAVベクターは、本発明の医薬組成物に含められる。このような治療用遺伝子としては、例えば上記のようなゲノム編集手段、ゲノム修復手段などが挙げられるが、これらに限定されない。
　１実施形態において、本発明のrAAVベクターは、好ましくは肝臓の細胞に特異的なプロモーターおよびそのプロモーターと作動可能に連結された遺伝子を含む。本発明のrAAVベクターは、血友病などに対する治療に有用である遺伝子を含むことができ、それら遺伝子を、肝臓の細胞、好ましくは肝実質細胞に組込むことができる。
　本発明の医薬組成物を使用する場合、例えば、経口、非経口（静脈内）、筋肉、口腔粘膜、直腸、膣、経皮、鼻腔経由または吸入経由などで投与することができるが、非経口的に投与するのが好ましい。静脈内投与がさらに好ましい。本発明の医薬組成物の有効成分は単独で、あるいは組み合わせて配合されても良いが、これに製薬学的に許容しうる担体あるいは製剤用添加物を配合して製剤の形態で提供することもできる。この場合、本発明の有効成分は、例えば、製剤中、0.1～99.9重量％含有することができる。
　本発明の医薬組成物の有効成分は単独で、あるいは組み合わせて配合されても良いが、これに製薬学的に許容しうる担体あるいは製剤用添加物を配合して製剤の形態で提供することもできる。この場合、本発明の有効成分は、例えば、製剤中、力価が105～1016 vg/mL（900 fg/mL～90 mg/mL）、力価が10６～1015 vg/mL（9.0 pg/mL～9.0 mg/mL）、力価107～1014 vg/mL（90 pg/mL～900 μg/mL）、力価108～1013 vg/mL（900 pg/mL～90 μg/mL）、力価109～1012 vg/mL（9 ng/mL～9 μg/mL）、力価1010～1011 vg/mL（90 ng/mL～900 ng/mL）の量を含有することができる。また、製薬学的に許容しうる担体あるいは添加剤としては、例えば賦形剤、崩壊剤、崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、溶解剤、溶解補助剤、等張化剤、pH調整剤、安定化剤等を用いることができる。
　非経口投与に適する製剤としては、例えば注射剤、坐剤等が挙げられる。非経口投与の場合、本発明の有効成分をゴマ油または落花生油のいずれかに溶解するか、あるいはプロピレングリコール水溶液、またはソルビトール水溶液に溶解した溶液を使用することができる。水溶液は必要に応じて適宜に緩衝し（好適にはｐＨ８以上）、液体希釈剤をまず等張にする必要がある。このような液体希釈剤としては、例えば、生理食塩水を使用できる。調製された水溶液は静脈内注射に適し、一方、油性溶液は関節内注射、筋肉注射および皮下注射に適する。これらすべての溶液を無菌状態で製造するには、当業者に周知の標準的な製薬技術で容易に達成することができる。さらに、本発明の有効成分は皮膚など局所的に投与することも可能である。この場合は標準的な医薬慣行によりクリーム、ゼリー、ペースト、軟膏の形で局所投与するのが望ましい。
　経口投与に適する製剤の例としては、例えば散剤、錠剤、カプセル剤、細粒剤、顆粒剤、液剤またはシロップ剤等を挙げることが出来る。経口投与の場合、微晶質セルロース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸ジカリウム、グリシンのような種々の賦形剤を、澱粉、好適にはとうもろこし、じゃがいもまたはタピオカの澱粉、およびアルギン酸やある種のケイ酸複塩のような種々の崩壊剤、およびポリビニルピロリドン、蔗糖、ゼラチン、アラビアゴムのような顆粒形成結合剤と共に使用することができる。
　本発明の医薬組成物の投与量は特に限定されず、疾患の種類、患者の年齢や症状、投与経路、治療の目的、併用薬剤の有無等の種々の条件に応じて適切な投与量を選択することが可能である。本発明の医薬組成物の投与量は、例えば、成人（例えば、体重60kg）１日当たり1～5000 mg、好ましくは10～1000 mgであるが、これらに限定されない。これらの１日投与量は２回から４回に分けて投与されても良い。また、投与単位としてvg（vector genome）を利用する場合、例えば、体重1kgあたり、106～1014 vg、好ましくは108～1013 vg、さらに好ましくは109～1012 vgの範囲の投与量を選択することが可能であるが、これらに限定されない。
５．本発明のウイルスベクターの投与
　本発明のウイルスベクターは、好ましくは、対象に末梢投与によってより安全かつ容易に投与される。本明細書において末梢投与とは、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、心腔内投与、筋肉内投与など、当業者に末梢投与として通常理解される投与経路をいう。
　本発明のウイルスベクターは、対象に投与されて、肝臓の細胞に感染し、感染した細胞においてウイルスによって送達された上記のゲノム編集手段を提供し、ゲノム編集をもたらすことができる。本発明のウイルスベクターは、好ましくは、肝実質細胞に感染してゲノム編集をもたらすことができる。本発明のウイルスベクターは、好ましくは、投与された対象の肝臓の肝実質細胞のうちゲノム編集を受ける細胞の割合が、好ましくは、70%以上、80％以上、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上、または100％である。
６．本発明のrAAVベクターの調製キット
　本発明は別の実施形態において、本発明のrAAVを作製するためのキットを提供する。このようなキットは、例えば、(a)キャプシドタンパク質VP1等を発現するための第１のポリヌクレオチド、および(b)rAAVベクター内にパッケージングされる第２のポリヌクレオチドを含むことができる。例えば、第１のポリヌクレオチドは、配列番号４のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを含み、第２のポリヌクレオチドは、目的の治療用遺伝子を含んでも含まなくてもよい。好ましくは、そのような目的の治療用遺伝子を組込むための種々の制限酵素切断部位を含むことができる。
　本発明のrAAVビリオンを作製するためのキットは、本明細書中に記載されるいずれの構成（例えば、AdVヘルパーなど）もさらに含むことができる。本発明のキットはまた、本発明のキットを使用してrAAVビリオンを作製するためのプロトコルを記載した指示書もさらに含み得る。
７．本明細書中のその他の用語について
　本明細書中に用いられる各用語が示す意味は以下のとおりである。本明細書中、特には説明されない用語については、当業者が通常理解する用語が意味する範囲を指すことが意図される。
　本明細書中で使用される場合、特に述べられない限り、「ウイルスベクター」、「ウイルスビリオン」、「ウイルス粒子」の各用語は、相互に交換可能に用いられる。また、「アデノ随伴ウイルスベクター」は、遺伝子組換えを含むアデノ随伴ウイルスを含む。
　本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「核酸」、「遺伝子」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「ヌクレオチド配列」は、「核酸配列」または「塩基配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。例えば、「配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメント」とは、配列番号１の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃおよび／またはＴによって示される配列を含むポリヌクレオチドまたはその断片部分が意図される。
　本発明に係る「ウイルスゲノム」および「ポリヌクレオチド」は各々、DNAの形態（例えば、cDNAまたはゲノムDNA）で存在し得るが、場合によってはRNA（例えば、mRNA）の形態であってもよい。本明細書において使用されるウイルスゲノムおよびポリヌクレオチドは各々、二本鎖または一本鎖のDNAであり得る。一本鎖DNAまたはRNAの場合、コード鎖（センス鎖としても知られる）であっても、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であってもよい。
　特に述べられない限り、本明細書中、rAAVゲノムがコードするプロモーター、目的遺伝子、ポリアデニレーションシグナルなどの遺伝子上の配置について説明される場合、rAAVゲノムがセンス鎖である場合についてはその鎖自体について、アンチセンス鎖である場合はその相補鎖について記載される。また、本明細書中、文脈より明らかな場合、組換えを表す「r」は省略されることもある。
　本明細書において、「タンパク質」と「ポリペプチド」とは相互に交換可能に用いられ、アミノ酸の重合体が意図される。本明細書において使用されるポリペプチドは、ペプチド標記の慣例に従って左端がN末端（アミノ末端）、右端がC末端（カルボキシル末端）である。本発明のポリペプチドの部分ペプチド（本明細書中、本発明の部分ペプチドと略記する場合がある）としては、前記した本発明のポリペプチドの部分ペプチドで、好ましくは、前記した本発明のポリペプチドと同様の性質を有するものである。
　本明細書において、用語「プラスミド」は、種々の公知の遺伝子要素、例えば、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体等を意味する。プラスミドは特定の宿主において複製することができ、そして細胞間で遺伝子配列を輸送できる。本明細書において、プラスミドは、種々の公知のヌクレオチド（DNA、RNA、PNAおよびその混合物）を含み、一本鎖であっても二本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖である。例えば、本明細書において、用語「rAAVベクタープラスミド」は、特に明記しない限り、rAAVベクターゲノムおよびその相補鎖により形成される二本鎖を含むことが意図される。本発明において使用されるプラスミドは、直鎖状であっても環状であってもよい。
　本明細書中において使用される場合、用語「パッケージング」とは、１本鎖ウイルスゲノムの調製、外被タンパク質（キャプシド）の組み立て、およびウイルスゲノムをキャプシドで包むこと（encapsidation）などを含む事象をいう。適切なプラスミドベクター（通常、複数のプラスミド）が適切な条件下でパッケージング可能な細胞株に導入される場合、組換えウイルス粒子（すなわち、ウイルスビリオン、ウイルスベクター）が組み立てられ、培養物中に分泌される。
　本明細書中、特には説明されない用語については、当業者が通常理解する用語が意味する範囲を指すことが意図される。
　以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されるものではない。
A. 材料及び方法
(a) AAVベクター
　５種類のAAVベクター（AAV2、AAV3B、AAV.GT5、AAV8、およびAAV-LK03）を使用した。
　AAV.GT5は、AAV3Aおよび3Bの外被蛋白VP1の3か所のアミノ酸置換、すなわち472番目のセリン(S)をアラニン(A)に、587番目のセリン(S)をアラニン(A)に、706番目のアスパラギン(N)をアラニン(A)に置換したアミノ酸配列を含む。一方、AAV.M1は、AAV3Aおよび3Bの外被蛋白VP1の1か所のアミノ酸置換、すなわち587番目のセリン(S)をアラニン(A)に置換したアミノ酸配列を含む。AAV.M2は、AAV3Aおよび3Bの外被蛋白VP1の2か所のアミノ酸置換、すなわち472番目のセリン(S)をアラニン(A)に、587番目のセリン(S)をアラニン(A)に置換したアミノ酸配列を含む。　
　各AAVベクターに発現させるタンパクをコードする遺伝子は3種類を使用した。
緑色蛍光蛋白質(AcGFP)については、cytomegalovirus promoter (CMV)プロモーター、緑色蛍光蛋白質(AcGFP)のcDNA、SV40 poly(A)からなる発現カセットを、AAV3Aのinverted terminal repeats (ITR)の間に挿入し、AAV2-CMV-AcGFP、AAV3B-CMV-AcGFP、AAV.GT5-CMV-AcGFP、AAV8-CMV-AcGFPの4種を作製した。LuciferaseについてはAcGFPの代わりにLuciferaseをコードする配列を挿入し、AAV2-CMV-Luciferase、AAV3B-CMV-Luciferase、AAV.GT5-CMV-Luciferase、AAV-LK03-CMV-Luciferaseの4種を作製した。OTCについては、ApoE/C1遺伝子の肝臓制御領域のエンハンサー及びヒト抗トリプシンプロモーター（HCRhAAT）、OTCのcDNA、SV40 poly(A)からなる発現カセットを、AAV3Aのinverted terminal repeats (ITR)の間に挿入し、2種のベクターAAV.GT5-HCRhAAT-OTC、AAV8- HCRhAAT-OTCを作製した。 
　AAV2:  GenBank Accession # NC_001401.2（全ゲノム配列）
　　（AAV2 キャプシドタンパク質VP1のアミノ酸配列を配列番号１に示す。）
　AAV3A:  GenBank Accession # U48704（ゲノム配列）
　　（AAV3A キャプシドタンパク質VP1のアミノ酸配列を配列番号２に示す。）
　AAV3B:  GenBank Accession # AF028705.1（ゲノム配列）
　　（AAV3B キャプシドタンパク質VP1のアミノ酸配列を配列番号３に示す。）
　AAV.GT5:（本出願において調製したもの）
　　（キャプシドタンパク質VP1のアミノ酸配列を配列番号４に示す。）
　AAV8:  GenBank Accession # NC_006261（ゲノム配列）
　　（AAV8 キャプシドタンパク質VP1のアミノ酸配列を配列番号５に示す。）
　AAV-LK03：（キャプシドタンパク質VP1のアミノ酸配列を配列番号９に示す。）（Lisowski L.ら、Nature. 2014 February 20; 506(7488): 382-386）
　AAV.M1:（本出願において調製したもの）
　　（キャプシドタンパク質VP1のアミノ酸配列を配列番号１７に示す。）
　AAV.M2:（本出願において調製したもの）
　　（キャプシドタンパク質VP1のアミノ酸配列を配列番号１８に示す。）
(b) 細胞培養
 １）HEK 293細胞
　 2×104または5×104cells/wellのHEK293細胞を播き、10% ウシ胎仔血清（FCS）- DMEM/F12培地(Thermo Fisher Scientific)を使用して5% CO2、37℃で培養した。 ２）HepG2細胞
   2×104または5×104cells/wellのHepG2細胞を播き、10% FCS- DMEM Low glucose培地 (Thermo Fisher Scientific)を使用して5% CO2、37℃で培養した。 ３）PXB細胞（フェニックスバイオ社）
　PXBマウス肝臓から採取した細胞であり、ヒト肝細胞が90%以上を占める。7×104(96 well　plate)または 7.4×105(12 well plate) cells/wellの細胞を播き、専用のｄHCGM培地（フェニックスバイオ社）を使用して5% CO2、37℃で培養した。
　AAV2に対する中和抗体の活性を、 Melian Aら、HUMAN GENE THERAPY METHODS, 26:45-52, 2015に記載の方法により測定し、中和抗体価が1:32～1:128もしくは1:128以上を示した血清10人分を使用した。
(c) ベクター感染
　(a)に記載した、GFPを発現する各種のAAVベクター（AAV2-CMV-AcGFP、AAV8-CMV-AcGFP、AAV3B-CMV-AcGFP、あるいはAAV.GT5-CMV-AcGFP）は2×103～1×104 vg/cellを、Lucferaseを発現するAAVベクター（AAV2-CMV-Luciferase, AAV3B-CMV-Luciferase, AAV.GT5-CMV-Luciferase, AAV-LK03-CMV-Luciferase）は400または800 vg/cellを、OTCを発現するベクター（AAV.GT5-HCRhAAT-OTC, AAV8-HCRhAAT-OTC）は4×104 vg/cellを各培養細胞に添加し、1～10日間、培養した。
(d) GFPまたはルシフェラーゼの発現の評価
　GFPの発現測定のため、プレートリーダー（バイオテックジャパン）を用いて、各種AAVベクターによって発現されたGFPの蛍光強度測定し比較した。また、GFP発現細胞の代表的な視野の画像を蛍光顕微鏡(オリンパスIX83)で撮影した。
　ルシフェラーゼの活性測定のため、各細胞に細胞溶解バッファー、ルシフェリンなどを含む試薬（Bright-GloTM Luciferase Assay System, Promega）を添加し、プレートリーダー（バイオテックジャパン）を用いて、発光強度を測定し比較した。
(e)  血清中の中和抗体との交差反応性の検証
レポーターとしてルシフェラーゼを用いて中和抗体に対する抵抗性を確認した。比較対照として、AAV2、AAV3B、及びAAV-LK03（公知の中和抗体抵抗性の改変型AAV：Perocheau, D.P.ら(2018)HUMAN GENE THERAPY, 30,1, 79-87）を用いた。
　健常人より採取した10種の血清について、FCSで1:2～1:128まで2倍希釈系列を調製した。4種のAAV（AAV.GT5-CMV-Luciferase、AAV-LK03-CMV-Luciferase、AAV3B-CMV-Luciferase、及びAAV2-CMV-Luciferase）を前述の血清と１：１の比率で混和し、37℃、1時間反応後、HEK293細胞に投与した。24時間後に、Luciferase Assay Kitを用いて、ルシフェラーゼの発光活性を測定した。対照として検体血清の代わりにFCSと混和させたAAVの値を100%とし、各AAVの発光活性の相対値を％で表した。また、ルシフェラーゼ活性を50%以下に抑える最大希釈率を中和抗体価とした。
(f) オルニチンカルバミルトランスフェラーゼ(OTC)発現ベクターの調製
　慣用的な遺伝子組み換え手法等を用いてヒトオルニチンカルバミルトランスフェラーゼcDNA（配列番号１０）を組み込んだ各AAVベクターを調製した。
(g)　OTCの発現確認
　7.4×105/wellのPXB細胞を12 well Plate、3枚に播き、専用のｄHCGM培地（フェニックスバイオ社）を使用して5% CO2、37℃で培養した。培養6日後に、AAV.GT5-HCR-hAAT-OTC及びAAV8-HCRhAAT-OTCを4×104vg/cellで各群４wellずつ投与した。内因性OTCレベルの確認のため、非投与4well を対照とした。投与3日、7日後に培地を交換しつつ、37℃、5% CO2 で培養した。投与10日後に培養を終了し、OTC mRNA測定、OTCタンパク測定、及びOTC酵素活性測定を行った。
（OTC mRNAの測定）
　AAV.GT5-HCRhAAT-OTC, AAV8-HCRhAAT-OTCを投与したPXB cell(n=4)よりRNeasy Mini Kit (QIAGEN)を使用してtotal RNAを精製した。total RNA 100ngよりcDNA合成を行い、逆転写反応にはHigh Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor (Applied Biosystems)を使用した。cDNA サンプルをnuclease-free Waterを用いて6倍に希釈し、real time PCR(Applied Biosystems)のSYBR Green法にてCt値を測定した。プライマーは最適化されたOTC配列にて作製した。
　OTC Forward: ACCGGCGAAGAGATCAAGTA　（配列番号１３）
　OTC Reverse: ATCATGCCCAGAGACTTTCC　（配列番号１４）
　また、標準化用として以下の配列をGAPDHの検出に使用した。
　GAPDH Forward: AATTCCATGGCACCGTCAAG　（配列番号１５）
　GAPDH Reverse: ATCGCCCCACTTGATTTTGG　（配列番号１６）
　各mRNA発現量の解析は比較Ct法(ΔΔCt法)を使用した。GAPDH遺伝子を内部標準として、AAV8-HCRhAAT-OTC投与群の発現量を1とした場合のAAV.GT5-HCRhAAT-OTC投与群のOTC相対量を算出した。
（OTC タンパク質の測定）
　培養を終了したPXB細胞をPBSでリンスし、RIPA Buffer+プロテアーゼ阻害剤を100 μl/well加えて細胞を溶解した。遠心分離により上清を回収後、Laemmli Buffer+βMEを加えて加熱し、タンパクを還元した。
　4-15% ポリアクリルアミドゲル、トリス/グリシン/SDSバッファーで電気泳動し、PVDF膜に転写、ブロッキング後、OTC抗体（1:2000,  SantaCruz）と4℃、一晩反応させた。0.1% PBSTで6回洗浄後、HRP-anti-mouse-IgG (1:5000,  GEヘルスケア)と室温、60分間反応させた。0.1% PBSTで6回洗浄後、ECL Prime Western Blotting Detection Reagent(GEヘルスケア)で化学発光させてAmersham Imager 600で検出し、内蔵の解析ソフトでバンドのVolume値を測定した。同様に、GAPDH抗体（1:10000,  Abcam）でハウスキーピングタンパク量を測定し、OTC Volume値/GAPDH Volume値の補正値で比較した。（OTCの活性測定）
　PXB細胞をディッシュから剥がして遠心（1000 rpm、3分間、室温）して培地を除去した。さらにPBSで２回洗浄した。ミトコンドリア溶解緩衝液（0.5% Triton X-100 [v/v] in dH2O, 10 mM HEPES, 2 mM DTT [pH 7.4])を加えて氷上でホモジェナイズした。遠心（20630 G、20分間、4℃）し、上清を回収して蛋白量を測定した。5-10μgの蛋白量を10μlにして、reaction solution (5 mM ornithine, 15 mM carbamyl phosphate, 270 mM triethanolamine）を加えて計700μl にした。60分間37℃でインキュベートし、Stop solution（0.5% antipyrine/50% sulfuric acid (w/v): 0.8% 2,3-butanedion monoxime :distilled water [1:1:1.5]）を270μL 添加した。遮光して15分間煮沸した。96ウェルプレートに200μl入れて、波長490 nmにおける吸光度を測定した。酵素活性はμmol of citrulline produced/mg of liver protein/hrで示した。
B.　結果
(1)  改変体AAV.GT5の作製
　アデノ随伴ウイルスAAV3AとAAV3Bとの融合Rep配列、およびAAV3BのVP配列を含むDNAを人工合成した。その際にAAV3BのVP1においてS472A、S587A、N706Aの変異を生じるように遺伝子操作し、アデノ随伴ウイルス改変体AAV.GT5を得た。
　AAV3A、AAV3B及びAAV.GT5のそれぞれのVP1タンパク質アミノ酸配列（配列番号２～４）及びRepタンパク質アミノ酸配列（配列番号６～８）のアラインメントを図１Ａ～図１Ｄに示す。
(2)  AAV.GT5のヒト肝臓由来株細胞HepG2及びPXBに対する感染能の確認
　上記で作製したAAV.GT5のヒト肝臓由来細胞HepG2細胞への感染能を確認した。
　HepG2細胞 5×104 cells/wellを96 well Optical bottom Plateに播種した翌日、AAV8-CMV-AcGFP、AAV2-CMV-AcGFP、AAV3B-CMV-AcGFPおよびAAV.GT5-CMV-AcGFP  5×108vg/well を投与した。37℃、5％ CO2インキュベーターで7日間培養後、プレートリーダーでGFPの蛍光強度を測定して定量的に比較した(表１および図２Ａ)、このときの細胞の様子を図２Ｂに示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  
　GFP強度の測定結果に基づくと、AAV.GT5はAAV3Bの約1.1倍（107.9%）の発現を示した。よって、AAV.GT5はこのヒト肝臓由来細胞に対してAAV3Bと同等以上の遺伝子導入が可能と考えられる。一方、AAV8とAAV2は、AAV3BやAAV.GT5に比べてヒト肝臓由来細胞への遺伝子導入効率がより低かった（図２Ａ）。
　上記のGFP発現による測定系において、AAV.GT5およびAAV3Bの両者は、測定範囲の上限に近いため、実際の量比よりも小さな差が示された可能性がある。そこで、ヒト肝臓由来細胞株HepG2細胞に対する各rAAVベクターの感染能を、ルシフェラーゼを用いて確認した。また、対照としてAAV3BおよびAAV-LK03を用いた。
　AAV.GT5-CMV-Luciferase、AAV-LK03-CMV-LuciferaseおよびAAV3B-CMV-Luciferaseの各々を、HepG2細胞 2×104cells/wellを播種して1日後の細胞に対して、MOI=800 vg/cell で投与して培養した。
　AAV投与2日後にBright-Glo Luciferase Assay System(Promega)を用いてLuciferaseの活性を測定した（n=4）。発光強度（RLU)の測定値の結果のグラフ及び相対値を図２Ｃに示す。
　RLUの測定値から、AAV.GT5はAAV3Bと比較して2.0倍の発現であること、AAV-LK03と比較して1.3倍の発現であることを確認した（表２および図２Ｃ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
  
　PXBマウス肝臓から採取した、ヒト肝細胞が90%以上をしめるPXB細胞に対する遺伝子導入の結果を図３Ａ及び３Ｂに示した。PXB細胞（フェニックスバイオ社）7×104 cell/wellを96well Plateに播種した6日後、AAV8-CMV-AcGFP、AAV2-CMV-AcGFP、AAV3B-CMV-AcGFPおよびAAV.GT5-CMV-AcGFP  5×108 vg/well を投与した。37℃、5％ CO2インキュベーターで7日間培養後、プレートリーダーでGFPの蛍光強度を測定して定量的に比較した(表３および図３Ａ)。このときの細胞の様子を図３Ｂに示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 　HepG2細胞の場合と同様に、PXB細胞においてもAAV.GT5-CMV-AcGFPのGFP発現量はAAV3Bの約1.1倍であった。
　よって、AAV.GT5はこれらヒト肝臓由来細胞に対してAAV3Bと同等以上の遺伝子導入が可能と考えられる。一方、AAV8とAAV2は、AAV3B、AAV.GT5に比べてヒト肝細胞への遺伝子導入効率は低かった（図２、図３）。
(3)  中和抗体の抗体価の測定
　上記(e)の手順に従って10種の血清（血清#01～#10）を用いて、AAV.GT5、AAV-LK03、AAV3B、AAV2によるルシフェラーゼ活性を50%以下に抑える最大希釈率（中和抗体価）を得た。これらの結果を表４に示す。
　中和抗体価は試験した10種の血清において、AAV.GT5が最も低かった。すなわち、抗体との反応性が弱かった。AAV.GT5に対する中和抗体価はAAV-LK03、およびAAV3Bの1/8～1/4程度であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
  
　上記の中和抗体価の測定結果に基づくと、例えば、血清#01の場合、対照について1:32または1:64であったものが、AAV.GT5について1:8であり、よって中和抗体価で約4倍以上の向上を示した。
(4)  抗血清による発現阻害に対する効果
　さらに、上記の中和抗体価測定の結果に基づき、中和抗体の影響下でのAAV.GT5、AAV-LK03、AAV3B、AAV2による遺伝子発現を比較した。その結果を図４Ａ～４Jに示す。
　上記の中和抗体価で約4倍以上の向上は、同じ血清希釈率で比較すると発現量でも非常に大きな差を生じた。
　例えば、AAV.GT5は、同じ血清希釈率（例えば32倍希釈）の血清存在下でルシフェラーゼ活性を比較すると、野生型AAV3B、AAV2よりも4倍以上等の非常に大きな差を生じた（図４Ａ～４Ｊの表および中央グラフより）。
　また、AAV.GT5は、同じルシフェラーゼ活性（例えば、最大活性の半分）に要する抗血清量は、例えば血清#02の場合であっても、AAV-LK03、野生型AAV3B、AAV2に要する量の1.5倍以上であることも示された（図４Ａ～４Ｊの下段のグラフより）。
　これらの結果から、AAV.GT5は、AAV-LK03、AAV3B、AAV2のいずれの対照よりも、中和抗体による発現阻害を最も受けないことが示された。
　レポーターとしてGFPを用いたことを除いて上記(e)の手順に従って、4種の血清（血清#A、#B、#Cおよび#D）の32倍希釈物を用いて、AAV.GT5、AAV.M1(S587A)、AAV.M2(S472A＋S587A)、AAV3BおよびAAV2によるGFP発現の抑制阻害を確認した。これらの結果を図４Ｋに示す。
　これらの結果から、AAV.GT5は、AAV.M1、AAV.M2、AAV3BおよびAAV2のいずれの対照よりも、中和抗体による発現阻害を最も受けないことが示された。
(5)　OTC発現ベクターの調製
　AAV.GT5によって組換えOTCを発現させるために下記構成のDNA（AAV.GT5-OTCと称する）を調製した。より詳細な配列の構成を図５Ａ、図５Ｂ及び配列番号１２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
(6)　組換えAAVベクターによるOTC発現比較
　PXBマウス肝臓から採取した細胞でありヒト肝細胞が90%以上を占めるPXB細胞を用いて、AAV.GT5-OTCのヒト肝臓細胞への感染、発現効率をAAV8-OTCと比較した。
　AAV.GT5によるOTCのmRNA発現量の比較結果を表５及び図６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
 　AAV.GT5は、OTC mRNAの発現において対照と比較して約90倍以上の発現量向上を確認した。
　また、AAV.GT5によるOTCのタンパク質発現量の比較結果を表６及び図７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
 　AAV.GT5は、mRNAの発現量の結果と同様に、対照と比較して約86倍のタンパク質発現量の向上を確認した。
　さらに、AAV.GT5によるOTCの酵素活性の比較結果を表７及び図８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
 　以上の結果より、AAV.GT5-OTCを治療手段として使用することによって非常に強力なOTC発現および／またはウイルスベクター投与量の大きな低減などの利点が期待できる。
(7)　AAV.GT5-OTCによるアンモニア濃度低減作用の検証
　OTC欠損症患者より取得した肝臓細胞等を培養し、種々の濃度のAAV.GT5-OTCまたは対照ベクターおよびNH4Clを添加して、経時的に培地中のアンモニア濃度をモニタリングする。
　また、OTC欠損症患者より取得した肝臓細胞を用いて、OTC欠損症のモデル動物を調製する（例えば、Sugahara, G.ら、J Inherit Metab Dis. 2020: 1-11を参照のこと）。調製したモデル動物に対して、種々の濃度のAAV.GT5-OTCおよび対照ベクターを投与して、経時的に血中アンモニア濃度をモニタリングする。
　本発明の組換えアデノ随伴ウイルスベクターは、生体の中和抗体からの攻撃を低減させて、例えば、中和抗体の存在下で標的細胞に対しておよそ４倍以上高い効率で遺伝子導入できた。さらに、肝臓特異的プロモーターの制御下で、ヒトオルニチントランスカルバミラーゼタンパク質を対照に対して約90倍高い効率で発現させることができた。
　よって、本発明のヒトオルニチントランスカルバミラーゼタンパク質を発現する組換えアデノ随伴ウイルスベクターを用いることにより、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症をより効率的に治療可能になると考えられる。
　配列番号１：AAV2キャプシドタンパク質のアミノ酸配列
　配列番号２：AAV3Aキャプシドタンパク質のアミノ酸配列
　配列番号３：AAV3Bキャプシドタンパク質のアミノ酸配列
　配列番号４：AAV.GT5改変キャプシドタンパク質（S472A、S587A、N706A）のアミノ酸配列
　配列番号５：AAV8キャプシドタンパク質のアミノ酸配列
　配列番号６：AAV3AのRepタンパク質（ARep）のアミノ酸配列
　配列番号７：AAV3BのRepタンパク質（BRep）のアミノ酸配列
　配列番号８：AAV.GT5のRepタンパク質（baRep）のアミノ酸配列
　配列番号９：AAV-LK03キャプシドタンパク質のアミノ酸配列
　配列番号１０：オルニチントランスカルバミラーゼ（OTC）のcDNA配列
　配列番号１１：オルニチントランスカルバミラーゼ（OTC）のアミノ酸配列
　配列番号１２：OTC発現ベクター（AAV.GT5-HCRhAAT promoter-human OTC-WPRE）の配列
　配列番号１３：OTC mRNA発現検出用プライマーOTC Forward
　配列番号１４：OTC mRNA発現検出用プライマーOTC Reverse
　配列番号１５：GAPDH mRNA発現検出用プライマーGAPDH Forward
　配列番号１６：GAPDH mRNA発現検出用プライマーGAPDH Reverse
　配列番号１７：AAV.M1改変キャプシドタンパク質（S587A）のアミノ酸配列
　配列番号１８：AAV.M2改変キャプシドタンパク質（S472A, S587A）のアミノ酸配列

Claims (13)

  1. 　配列番号２または３のアミノ酸配列において、472番目のセリン、587番目のセリン、及び706番目のアスパラギンのうちの少なくとも１つが他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または前記置換されたアミノ酸配列に対して、472番目、587番目及び706番目の残基の他に1～6個の残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質、ならびに
    　配列番号１１のアミノ酸配列、または配列番号１１のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、オルニチントランスカルバミラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
    を含むアデノ随伴ウイルスベクターであって、少なくとも２型AAVに対する中和抗体と交差反応しない、アデノ随伴ウイルスベクター。
  2. 　前記472番目のセリン、587番目のセリンおよび706番目のアスパラギンが、それぞれ、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、トレオニンおよびイソロイシンからなる群から選択されるアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質を含む、請求項１に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
  3. 　前記472番目のセリン、587番目のセリンおよび706番目のアスパラギンのうちの少なくとも１つがアラニンに置換されたアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質を含む、請求項１に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
  4. 　前記キャプシドタンパク質が、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質を含む、請求項１に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
  5. 　前記中和抗体が、AAV3またはAAV8とは異なる型のアデノ随伴ウイルスに対する抗体である、請求項１に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
  6. 　前記中和抗体が、AAV2に対する抗体である、請求項１に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
  7. 　肝臓細胞特異的プロモーター配列を含むウイルスゲノムを有する、請求項１に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
  8. 　前記肝臓細胞特異的プロモーター配列が、ApoEプロモーター、アンチトリプシンプロモーター、cKitプロモーター、肝臓特異的転写因子（HNF-1、HNF-2、HNF-3、HNF-6、C/ERP、DBP）のプロモーター、アルブミンプロモーター、サイロキシン結合グロブリン(TBG)のプロモーター、およびHCRhAATプロモーターからなる群から選択されるプロモーター、またはこれらプロモーターと90％以上の相同性を有するポリヌクレオチド配列を含み肝臓特異的に機能するプロモーターを含む、請求項１に記載のアデノ随伴ウイルスベクター。
  9. 　配列番号２または３に記載のアミノ酸配列において、472番目のセリン、587番目のセリン、及び706番目のアスパラギンのうちの少なくとも１つが他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または前記置換されたアミン酸配列に対して、472番目、587番目及び706番目の残基の他に1～6個の残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質、ならびに
    　配列番号１１のアミノ酸配列、または配列番号１１のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、オルニチントランスカルバミラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
    を含む、アデノ随伴ウイルスベクター。
  10. 　配列番号２または３に記載のアミノ酸配列において、472番目のセリン、587番目のセリンおよび706番目のアスパラギンのうちの少なくとも１つが他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列であって、他の残基位置において1～6個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列、
    　前記472番目のセリン、587番目のセリンおよび706番目のアスパラギンが、それぞれ、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、トレオニンおよびイソロイシンからなる群から選択されるアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
    　前記472番目のセリン、587番目のセリンおよび706番目のアスパラギンのうちの少なくとも１つがアラニンに置換されたアミノ酸配列、または
    　配列番号４に記載のアミノ酸配列
    のうちのいずれか1つの配列をコードする、ポリヌクレオチド。
  11. 　請求項１～９のいずれか１項に記載のアデノ随伴ウイルスベクターを含む、生体の肝臓への遺伝子導入のための医薬組成物。
  12. 　前記生体がヒトである、請求項１１に記載の医薬組成物。
  13. 　オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症の治療のための請求項１１または１２に記載の医薬組成物。
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