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WO2022202761A1 - ｃ－Ｍｅｔタンパク質結合ペプチド複合体 - Google Patents

ｃ－Ｍｅｔタンパク質結合ペプチド複合体 Download PDF

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WO2022202761A1
WO2022202761A1 PCT/JP2022/013001 JP2022013001W WO2022202761A1 WO 2022202761 A1 WO2022202761 A1 WO 2022202761A1 JP 2022013001 W JP2022013001 W JP 2022013001W WO 2022202761 A1 WO2022202761 A1 WO 2022202761A1
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WO
WIPO (PCT)
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peptide
amino acid
met
complex
amino acids
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2022/013001
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English (en)
French (fr)
Inventor
芳典 鈴木
武 江原
正訓 多久和
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Peptidream Inc
Original Assignee
Peptidream Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority to KR1020237036141A priority patent/KR20230159872A/ko
Priority to US18/283,209 priority patent/US20250326865A1/en
Priority to IL305967A priority patent/IL305967A/en
Priority to AU2022243260A priority patent/AU2022243260A1/en
Priority to JP2023509171A priority patent/JPWO2022202761A1/ja
Priority to CA3213849A priority patent/CA3213849A1/en
Priority to CN202280023381.8A priority patent/CN117083304A/zh
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/069—Vascular Endothelial cells

Definitions

  • This invention relates to a complex containing a peptide that binds to the c-Met protein.
  • regenerative medicine which aims to regenerate body tissue that has been damaged by disease or trauma. Because regenerative medicine regenerates tissues using one's own cells, it has the advantage of being less prone to immune problems than conventional methods such as organ transplantation from other people. In these regenerative medicines, it is necessary to culture human-derived cells such as stem cells and differentiate them into target tissues. In addition, basic research using cultured mammalian cells, especially human-derived cells, is continuing in order to create further improved technologies for regenerative medicine. In regenerative medicine and research, the process of efficiently culturing and proliferating target cells is important. Medium components play an important role in the culture of human cells including stem cells, and growth factors (also called GFs) are one of the most important factors.
  • c-Met hepatocyte growth factor receptor
  • HGF hepatocyte growth factor receptor
  • Met its receptor c-Met
  • I'm in. c-Met is a single transmembrane receptor-type tyrosine kinase, and when the ligand HGF binds to c-MET, c-MET dimerizes and is activated. Activation of c-Met is known to be essential for embryonic development, organogenesis, and wound healing.
  • Patent Document 1 reports an antibody having c-Met agonist activity.
  • Non-Patent Document 1 reports a substitute for HGF, which has been developed up to now.
  • Patent Document 2 and Non-Patent Document 2 describe peptide conjugates that can be used as c-Met protein agonists.
  • Peptide complexes that can be used as c-Met protein agonists are known to promote cell proliferation and migration, and using this cell proliferation effect, various pharmaceuticals and medium compositions for cell culture Application to the use is expected.
  • a growth factor substitute added when culturing cells and tissues used in regenerative medicine as an organ protector during organ transplantation, as a regeneration accelerator, and as a therapeutic agent for diseases that cause decreased expression of hepatocyte growth factor
  • an organ protector during organ transplantation as a regeneration accelerator
  • a therapeutic agent for diseases that cause decreased expression of hepatocyte growth factor The usefulness of
  • This invention is basically based on the findings from working examples that the peptide represented by SEQ ID NO: 1 binds to the c-Met protein.
  • this invention is basically based on the findings from Examples that a peptide complex designed to form a dimeric structure by binding the above peptides with a linker functions as a c-Met protein agonist.
  • the first invention relates to a peptide complex containing peptide A that binds to c-Met protein.
  • Peptide A has the amino acid sequence X 1 -X 2 -X 3 -VSX 4 -DX 5 -DX 6 -PRWX 7 -MeC (SEQ ID NO: 1) or a peptide that binds to the c-Met protein consisting of an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acids are substituted, deleted, added or inserted in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:1.
  • X 1 is an amino acid that may be N-alkylated.
  • X2 is any amino acid .
  • X3 is any amino acid.
  • X4 is a hydrophobic amino acid that may be N-alkylated.
  • X5 is any amino acid.
  • X6 is an amino acid or S having an optionally substituted alkyl chain in its side chain.
  • X7 is any amino acid.
  • a complex containing a novel peptide that binds to the c-Met protein can be provided.
  • a novel peptide conjugate having c-Met agonist activity can be provided.
  • a medium for cell or tissue culture as a substitute for growth factors added when culturing cells or tissues used in regenerative medicine, containing a novel peptide complex having c-Met agonist activity A composition can be provided. It can also be used, for example, as an organ-protecting agent during organ transplantation and as a regeneration-promoting agent.
  • novel c-Met protein agonists and pharmaceutical compositions containing such c-Met protein agonists can be provided. This is useful, for example, as a therapeutic agent for diseases resulting in decreased expression of hepatocyte growth factor (HGF).
  • HGF hepatocyte growth factor
  • a pharmaceutical composition containing a novel c-Met protein agonist that promotes cell proliferation can be provided.
  • FIG. 1 shows the results of c-Met agonist activity measurement by phospho-c-Met Alpha LISA assay using the peptide conjugate of the present invention and human HGF.
  • the black square is a c-Met agonist active peptide conjugate (conjugate of peptide (SEQ ID NO: 34) and linker (SEQ ID NO: 37) (GFs_c-Met-00014336-PEG13 dimer; conjugate No. 49 in Table 4) and X indicates human HGF.
  • the horizontal axis is the concentration (nM) of the peptide complex or human HGF, and the vertical axis is the activation signal when the maximum value of the activation signal induced by human HGF is set to 100. indicates the relative value of FIG.
  • FIG. 2 shows the results of c-Met agonist activity measurement by HUVEC cell proliferation evaluation using the peptide complex of the present invention and human HGF.
  • the black square is a c-Met agonist active peptide conjugate (conjugate of peptide (SEQ ID NO: 34) and linker (SEQ ID NO: 37) (GFs_c-Met-00014336-PEG13 dimer; conjugate No. 49 in Table 4) and X indicates human HGF.
  • the horizontal axis is the concentration (nM) of the peptide complex or human HGF, and the vertical axis is the activation signal when the maximum value of the activation signal induced by human HGF is set to 100. indicates the relative value of FIG.
  • FIG. 3 shows the results after 3 days in a tube formation evaluation test of human proximal renal tubular epithelial cells using the peptide complex of the present invention, human HGF and human epidermal growth factor (EGF).
  • FIG. 4 shows the results of tube formation evaluation test of human proximal renal tubular epithelial cells after 8 days using the peptide complex of the present invention, human HGF and human epidermal growth factor (EGF).
  • black arrows indicate tube formation with branching.
  • FIG. 5 shows the results of human Phospho-RTK array assay evaluation using the peptide complex of the present invention and human HGF.
  • FIG. 5(1) shows the array map
  • FIG. 5(2) shows the evaluation results.
  • black squares indicate wells on which antibody against HGFR was immobilized.
  • the first invention relates to a peptide complex containing peptide A that binds to c-Met protein.
  • the c-Met protein is a hepatocyte growth factor (HGF) receptor and has tyrosine kinase activity.
  • the c-Met protein is a transmembrane receptor composed of ⁇ and ⁇ subunits linked by disulfide bonds.
  • the c-Met protein is dimerized in vivo by binding to HGF, followed by autophosphorylation and activation of various signal transductions. As a result, activation of signal transduction of the MAPK pathway and Akt pathway promotes cell proliferation, while inhibiting the induction of apoptosis in cells.
  • the c-Met protein is also called c-Met, MET or HGFR.
  • GenBank accession number for human c-Met protein is NP_000236 and the GenBank accession number for mouse c-Met protein is NP_032617.
  • Hepatocyte growth factor is a multifunctional cytokine that functions as a growth factor for a wide range of tissues and cell types. A heavy chain with a molecular weight of about 60,000 and a light chain with a molecular weight of about 35,000 are disulfide-bonded. It has a heterodimeric structure. HGF is known to promote the proliferation of epithelial cells, endothelial cells and mesenchymal cells, and also has actions such as morphogenesis induction, cell motility enhancement, anti-apoptosis and angiogenesis.
  • GenBank accession number for human HGF is NP_000592 and the GenBank accession number for mouse HGF is NP_001276387. Human HGF is preferred, and HGF refers to human HGF unless otherwise specified in this specification.
  • Binding to c-Met protein means that a peptide or peptide conjugate binds to c-Met protein. Whether it binds to c-Met protein can be measured by known methods for measuring intermolecular binding, such as surface plasmon resonance (SPR) assay, Scatchard analysis and/or radioimmunoassay (RIA). , enzyme immunoassays (EIA) and competitive binding assays such as sandwich competition assays, and different variants thereof known per se in the art. be. For example, evaluation by surface plasmon resonance (SPR) spectroscopy described in Japanese Patent No. 6426103 (Patent Document 2) is preferable.
  • SPR surface plasmon resonance
  • RIA radioimmunoassay
  • a compound having c-Met agonist activity exhibits c-Met agonist activity by binding to c-Met protein. It is possible to indirectly assess whether the peptide or complex binds to the c-Met protein.
  • a complex is said to bind to c-Met protein if part or all of the complex can bind to c-Met protein.
  • the portion of peptide A in the complex may be the site that binds to the c-Met protein, and other portions contained in the complex may also c- It may bind to the Met protein.
  • c-Met Agonist Activity refers to an activity that binds to c-Met protein and exhibits effects similar to those of HGF. Whether a peptide or peptide complex has c-Met agonist activity can be measured by a known method, for example, as shown in the Examples, phospho-c-Met AlphaLISA assay, HUVEC cell proliferation Tests and the like can be used to assess c-Met agonist activity. Also, the ELISA method described in Japanese Patent No. 6426103 (Patent Document 2) can be used to evaluate the phosphorylation ability of c-Met.
  • peptide conjugates having c-Met agonist activity Fatty liver, acute renal failure, chronic renal failure, diabetic nephropathy, acute pneumonia, pulmonary fibrosis, vascular disorder, myocardial infarction, dilated cardiomyopathy, skin ulcer, cerebral infarction, arteriosclerosis obliterans, gastric ulcer and muscle atrophy Lateral sclerosis, etc., can be used to treat these diseases.
  • Peptide conjugates are peptide conjugates containing peptide A that bind c-Met protein.
  • This peptide complex contains one or more peptides A.
  • the peptide conjugate contains two peptides A.
  • Examples of peptide complexes containing one peptide A include, but are not limited to, peptide A and a substance (payload) to be delivered to the c-Met protein, such as a known pharmaceutical composition. and a peptide complex containing peptide A and a marker composition such as a fluorescent protein.
  • the ability of peptide A to bind to c-Met protein is used to deliver the pharmaceutical composition to c-Met to the c-Met protein. becomes possible.
  • the substance to be delivered to the c-Met protein is not particularly limited, and may be any substance desired by those skilled in the art. Examples of such substances include, but are not limited to: Compounds: Not only low-molecular-weight compounds and middle-molecular-weight compounds, but also any compound that can be introduced by the cell cytosis mechanism can be used. Examples include known low-molecular-weight drugs.
  • Peptide may be a peptide that binds to a target in the body and exhibits some effect, eg, a cyclic peptide.
  • RI Any compound that can be labeled with a radioisotope, such as a low-molecular-weight compound, a middle-molecular-weight compound, or an antibody labeled with a radioisotope. Examples include compounds for PET examinations.
  • Protein Any protein, such as an antibody or an enzyme, that exhibits a useful function in the body can be used. Examples include enzymes used in enzyme replacement therapy.
  • Nucleic acid DNA, RNA, etc., as long as they contain a base sequence. Examples include nucleic acid medicines.
  • DDS can be DDS molecules such as liposomes and micelles. The DDS molecule may further contain a compound such as a drug inside. and composites thereof listed above.
  • a peptide conjugate is a peptide conjugate comprising (1) a first peptide, (2) a second peptide, and (3) a linker connecting the first and second peptides.
  • This peptide complex may be a peptide complex consisting only of (1) a first peptide, (2) a second peptide, and (3) a linker connecting the first peptide and the second peptide. .
  • at least one of the first peptide and the second peptide is peptide A.
  • the first peptide and the second peptide may be the same or different, but peptide A is preferred. That is, peptide complexes may be heterodimers or homodimers.
  • a heterodimer is a peptide in which the first peptide and the second peptide are different (eg, peptide A with a different amino acid sequence).
  • a homodimer is peptide A in which the first and second peptides are the same.
  • Preferred peptide conjugates are homodimers.
  • first peptide and the second peptide are the same peptide A, and that the C-terminals of the first peptide and the second peptide are linked to a linker to form a peptide complex.
  • first peptide and the second peptide are cyclic peptides.
  • Peptide A This specification describes Peptide A as well as complexes containing Peptide A.
  • Peptide A is (1) From the amino acid sequence described in X 1 -X 2 -X 3 -VSX 4 -DX 5 -DX 6 -PRWX 7 -MeC (SEQ ID NO: 1) or (2) 1 to 3 (1, 2 or 3) amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 are substituted, deleted, added Or a peptide that binds to the c-Met protein consisting of the inserted amino acid sequence. Also in this peptide (2), the 4th V, 5th S, 7th D, 9th D, 11th P, 12th R, 13th W, and 15 in SEQ ID NO: 1 Those in which the th MeC is maintained are preferred.
  • X 1 is an amino acid which may be N-alkylated, preferably A which may be N-methylated or F which may be N-methylated. A more preferred X 1 is MeF (N-methylated F).
  • X2 is any amino acid , preferably a hydrophilic amino acid, an aliphatic/branched chain amino acid or an aromatic amino acid, more preferably V, T, E, Q or W. The most preferred X2 is T.
  • X3 is any amino acid , a hydrophilic amino acid, an aliphatic amino acid or an aromatic amino acid, more preferably A, R, Y or D. The most preferred X3 is A.
  • X 4 is a hydrophobic amino acid which may be N-alkylated, preferably a hydrophobic amino acid which may be N-methylated, more preferably F or N- which may be N-methylated It is L which may be methylated. Most preferred X4 is MeF (N-methylated F).
  • X5 is any amino acid, preferably a hydrophilic amino acid, an aliphatic/branched chain amino acid or P, more preferably D, E, S, P or V. The most preferred X5 is E.
  • X 6 is an amino acid or S having an optionally substituted alkyl chain in its side chain, preferably (S)-2-aminoheptanoic acid (Ahp), R,L-norleucine (Nle), (S )-2,7-diaminoheptanoic acid (Hty), or S.
  • a more preferred X6 is Ahp .
  • X7 is any amino acid, preferably a hydrophilic or aliphatic amino acid, more preferably S, A, L- ⁇ -aminobutanoic acid (Abu), D, Q, or V; The most preferred X7 is S.
  • amino acid that may be N-alkylated refers to an amino acid having an alkyl group on the nitrogen that forms a peptide bond, or an amino acid having no alkyl group.
  • N-alkylamino acids include, for example, N-butylamino acids, N-ethylamino acids, N-methylamino acids and the like.
  • optionally N-methylated indicates inclusion of N-methylated amino acids. For example, optionally N-methylated A indicates alanine (A) or N-methylalanine (MeA).
  • amino acids having an optionally substituted alkyl chain on the side chain refer to amino acids having an alkyl chain on the side chain, such as amino acids belonging to the aliphatic amino acid group, and functional It is an amino acid with a substituted group, preferably an amino acid having 5 or more C atoms in the alkyl group.
  • amino acids having an alkyl chain on the side chain such as amino acids belonging to the aliphatic amino acid group, and functional It is an amino acid with a substituted group, preferably an amino acid having 5 or more C atoms in the alkyl group.
  • Ahp, Nle, Hty, etc. are included.
  • Preferred examples of peptide A are (1) A peptide consisting of the amino acid sequence set forth in MeF-TAVS-MeF-DED-Ahp-PRWS-MeC (SEQ ID NO: 34), or (2) A peptide having an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acids are substituted, deleted, added or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 34, and which binds to the c-Met protein.
  • Conservative amino acid substitutions are preferably made when one, two or three amino acid residues are substituted, deleted, added or inserted from a particular sequence.
  • a "conservative amino acid substitution” means a substitution with a functionally equivalent or similar amino acid.
  • Conservative amino acid substitutions in a peptide result in static changes in the amino acid sequence of the peptide. For example, one or more amino acids with similar polarity act functionally equivalently, resulting in a static change in the amino acid sequence of such peptides.
  • substitutions within a group can be considered conservative in structure and function.
  • cysteine residues can have a less polar, oxidized (disulfide) form compared to the reduced (thiol) form.
  • the long aliphatic portion of the arginine side chain may constitute structurally and functionally important features.
  • side chains containing aromatic rings can contribute to ion-aromatic or cation-pi interactions. In such cases, substitution of amino acids having these side chains with those belonging to the acidic or non-polar groups may be structurally and functionally conservative.
  • Residues such as proline, glycine and cysteine can have a direct effect on backbone conformation and often cannot be substituted without structural distortion.
  • Conservative amino acid substitutions are specific substitutions based on side chain similarity, as shown below (Lenininger, Biochemistry, 2nd Revised Edition, 1975, pp. 73-75: L. Lehninger, Biochemistry, 2nd edition , pp 73-75, Worth Publisher, New York (1975)) and typical permutations.
  • conservative amino acid substitution is preferably substitution with an amino acid belonging to the same group to which a certain amino acid belongs, for example, in a group in which natural amino acids are divided based on the properties of their common side chains as follows.
  • Hydrophobic (also referred to as non-polar) amino acids amino acids that exhibit hydrophobicity (non-polarity), such as alanine (also referred to as “Ala” or simply “A”), glycine (also referred to as “Gly” or simply “G”) , valine (also referred to as “Val” or simply “V”), leucine (also referred to as “Leu” or simply “L”), isoleucine (also referred to as “Ile” or simply “I”), proline (also referred to as “Pro” or simply “P”), phenylalanine (also referred to as “Phe” or simply “F”), tryptophan (also referred to as “Trp” or simply “W”), tyrosine (also referred
  • Hydrophobic amino acids can be further classified into the following groups.
  • Aliphatic Amino Acid An amino acid having a fatty acid or hydrogen in its side chain, including Ala, Gly, Val, Ile and Leu.
  • Aliphatic/branched chain amino acids Amino acids having branched fatty acids in their side chains, including Val, Ile, and Leu.
  • Aromatic amino acid An amino acid having an aromatic ring in its side chain, including Trp, Tyr, and Phe.
  • Hydrophilic (also referred to as polar) amino acids amino acids that exhibit hydrophilicity (polarity), such as serine (also referred to as “Ser” or simply “S”), threonine (also referred to as “Thr” or simply “T”), cysteine (also referred to as “Cys” or simply “C”), asparagine (also referred to as “Asn” or simply “N”), glutamine (also referred to as “Gln” or simply “Q”), aspartic acid (“Asp” or simply “ D”), glutamic acid (also referred to as “Glu” or simply “E”), lysine (also referred to as “Lys” or simply “K”), arginine (also referred to as “Arg” or simply “R” ), histidine (also abbreviated as “His” or simply “H”).
  • polarity such as serine (also referred to as “Ser” or simply “S”), threonine (also referred
  • Hydrophilic amino acids can be further classified into the following groups. Acidic amino acid: an amino acid with an acidic side chain, including Asp, Glu, Basic amino acid: an amino acid having a basic side chain, including Lys, Arg, and His. Neutral amino acid: Amino acids whose side chains are neutral, including Ser, Thr, Asn, Gln and Cys. In addition, Gly and Pro can be classified as "amino acids that affect the direction of the main chain", and amino acids containing sulfur molecules in side chains, Cys and Met, can be classified as "sulfur-containing amino acids”.
  • amino acid includes not only natural amino acids but also non-natural amino acids.
  • Non-natural amino acids include, for example, N-alkylamino acids obtained by N-alkylating the above-described natural amino acids, lower branched or unbranched nitrogens forming peptide bonds (e.g., C1-C5, preferably , C1-C3, more preferably those modified with an alkyl group of C1).
  • the N-alkylamino acid is preferably N-ethylamino acid, N-butylamino acid or N-methylamino acid, more preferably N-methylamino acid.
  • non-natural amino acids include D-type amino acids (also referred to as D-amino acids), ⁇ -amino acids, ⁇ -amino acids, amino acid mutants, chemically modified amino acids such as amino acid derivatives, and in vivo amino acids such as norleucine and ornithine. Amino acids that are not protein building blocks are included.
  • amino acids in which a functional group is further added to the side chain of a natural amino acid or substituted with another functional group e.g., amino acids with substitutions or additions in the side chain arylene group, alkylene group, etc., side chain arylene group, amino acids with an increased number of carbon atoms in an alkylene group or an alkyl group, amino acids with substituted aromatic rings in side chains, heterocyclic or condensed amino acids, etc.
  • A4p is alanine with a piperidyl group added to its side chain, and due to the addition of the piperidyl group, it exhibits basic polarity, unlike alanine belonging to the non-polar amino acid group. That is, the aforementioned grouping of naturally occurring amino acids based on their common side chain properties can include unnatural amino acids with similar side chain properties.
  • N-methylarginine (MeR) which is an N-methylated amino acid of arginine belonging to basic amino acids, is a non-natural amino acid, but it exhibits basicity, so it can be classified as a basic amino acid.
  • MeR N-methylarginine
  • non-natural amino acids that exhibit similar side chain properties to certain amino acids can also be included as targets for conservative amino acid substitutions.
  • Non-naturally occurring amino acids include, without limitation, N-methyl amino acids, Ahp, Nle, Hty, Abu, and the like.
  • Ahp, Nle, Abu and Hty can be divided into hydrophobic amino acids
  • Ahp, Nle and Abu into aliphatic amino acids
  • Hty into aromatic amino acids.
  • N-methyl amino acids can be classified as N-alkyl amino acids or according to the nature of the side chain of the original non-N-methylated amino acids.
  • peptide A is preferably a peptide consisting of the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 2 to 34.
  • a peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:34 is preferred.
  • Peptide A is preferably a cyclic peptide.
  • a peptide refers to a structure in which a plurality of amino acids are continuous, and includes polypeptides and proteins in its meaning.
  • amino acids include not only naturally occurring amino acids (natural amino acids) but also non-naturally occurring amino acids (non-natural amino acids).
  • the peptide of the present invention includes a peptide in which a cyclic portion is formed by cyclization after synthesis, a peptide obtained by further chemically modifying the peptide, and a complex of a peptide and a substance bound to the peptide. .
  • amino acids may be modified for cyclization of the peptide.
  • Peptides also include peptides containing such partially modified amino acids.
  • An example of modification for cyclization is the addition of a chloroacetyl group to an amino acid located at the N-terminus, which binds to a cysteine residue in the peptide and cyclizes it.
  • Peptides containing various (natural/unnatural) amino acids to which chloroacetyl groups have been added are also included in the peptides of the present application.
  • a cyclic peptide is a peptide in which two amino acids are bonded and all or part of it is cyclic.
  • peptides in which amino acids in a peptide form a crosslinked structure those in which a cyclic structure is formed by lactam ring formation or macrocyclization reaction, and those having a lasso peptide-like structure are also included. That is, in the present application, the cyclic peptide may have a linear portion as long as a portion thereof forms a cyclic structure.
  • Peptides generally have poor metabolic stability in vivo, and their large size makes it difficult to permeate cell membranes.
  • a method of cyclizing a peptide has been taken to address such a problem. Cyclization of peptides improves protease resistance, improves metabolic stability, and restricts conformational changes, suggesting that rigidity increases and membrane permeability and affinity with target proteins increase. It has been.
  • Cyclization of peptides can be performed according to known methods.
  • a peptide may be designed to contain two or more cysteine residues so that it can form a cyclic structure through disulfide bonds after translation.
  • a peptide having a chloroacetyl group at the N-terminus was synthesized by genetic code reprogramming technology, Cyclization can also be achieved by placing a cysteine residue in the peptide.
  • cyclization of the peptide through a thioether bond results in spontaneous post-translational nucleophilic attack of the mercapto group on the chloroacetyl group, resulting in cyclization of the peptide through a thioether bond.
  • Other combinations of amino acids that combine to form a ring may be placed within the peptide and circularized by genetic code reprogramming techniques.
  • the peptide may be cyclized by synthesizing a cycloamide at the N-terminus, placing L-2-aminoadipic acid residues in the peptide and linking between them.
  • any known cyclization method can be used without particular limitation.
  • Peptide length of peptide A is not particularly limited, but total amino acid residues (if the substance bound to the peptide or the linker that binds the substance and the peptide contains amino acids, amino acids are not included), but preferably within 20 residues.
  • the number of amino acids is 6 or more, 7 or more, 8 or more, 9 or more, 10 or more, 11 or more, preferably 19 or less, 18 or less, 17 or less, 16 or less, 15 or less.
  • nucleic Acid Encoding Peptide A This specification also describes nucleic acid encoding peptide A (c-Met protein binding peptide).
  • nucleic acid may be naturally occurring or non-naturally occurring and includes, but is not limited to, DNA, RNA, and chimeras thereof.
  • Linker The type and length of the linker used in the peptide conjugate are not particularly limited as long as the peptide conjugate can bind to the c-Met protein.
  • linkers include amino acid linkers (peptide linkers), chemical linkers, fatty acid linkers, nucleic acid linkers, sugar chain linkers, etc.
  • they may be complexes such as chemical linkers and peptide linkers.
  • Chemical linkers include, for example, PEG (Polyethyleneglycol) linkers.
  • the linker may also be a fatty acid linker containing divalent chemical moieties derived from fatty acids.
  • Amino acid (peptide) linkers are linkers comprising at least one arbitrary amino acid, such as the sequence [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n, as described in US Pat. No. 7,271,149. (where n is 1, 2, 3, 4, 5 or 6) or using a serine-rich peptide linker as described in US Pat. No. 5,525,491. be able to.
  • These linkers can be bound to the c-Met protein-binding peptide by a known method or a method analogous thereto.
  • a linker can be attached to the c-Met protein-binding peptide by attaching the linker to the terminal Cys residue of the c-Met protein-binding peptide.
  • a linker can also be attached to amino acids other than the C-terminus of the c-Met protein-binding peptide.
  • a preferred example of a linker is a PEG linker.
  • a PEG linker is a linker comprising polyethylene glycol (PEG) or polyethylene glycol (PEG) derivatives.
  • PEG linkers may include amino acids.
  • the PEG linker preferably contains 8 or more PEG molecular units.
  • Specific examples of linkers are (1) a linker having a sequence set forth in any of SEQ ID NOS: 35-41, or (2) 1-3 amino acids in a sequence set forth in any of SEQ ID NOS: 35-41. (Amino acids are not particularly limited as long as they can be used as linkers, but for example, S, G and K and any one or more of those amino acids) are replaced, deleted, added or inserted from the sequence It is a linker.
  • Peptide A, linkers and peptide complexes can be prepared by known methods (eg, Japanese Patent No. 6426103 (Patent Document 2)) or by appropriately modifying known methods.
  • c-Met Protein Agonists The peptide conjugates described above have HGF-like functions through promoting autophosphorylation through multimerization of the c-Met protein. Therefore, the peptide conjugate described above is useful as a c-Met agonist (agonist) or a pharmaceutical composition containing a c-Met protein agonist.
  • compositions comprising a peptide conjugate as described above and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutical compositions containing c-Met protein agonists are used for ischemic heart disease, acute hepatitis, fulminant hepatitis, liver cirrhosis, biliary atresia, fatty liver, acute renal failure, chronic renal failure, diabetes mellitus.
  • nephropathy selected from the group consisting of nephropathy, acute pneumonia, pulmonary fibrosis, vascular disorder, myocardial infarction, dilated cardiomyopathy, skin ulcer, cerebral infarction, arteriosclerosis obliterans, gastric ulcer and amyotrophic lateral sclerosis Used for treatment or prevention of disease.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention contains the peptide complex according to the present invention as an active ingredient. Since it has HGF-like functions, it is useful for cell growth promotion, cell migration promotion, apoptosis suppression, morphogenesis induction, angiogenesis, regeneration and protection of tissues and organs, and as a therapeutic or preventive agent for diseases related to these. Used.
  • Such diseases include, for example, acute hepatitis, fulminant hepatitis, liver cirrhosis, biliary atresia, fatty liver, acute renal failure, chronic renal failure, diabetic nephropathy, acute pneumonia, pulmonary fibrosis, vascular disorders, myocardial infarction, dilatation
  • diseases include, but are not limited to, type cardiomyopathy, skin ulcers, cerebral infarction, arteriosclerosis obliterans, gastric ulcers, and amyotrophic lateral sclerosis.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition is not particularly limited, and may be oral administration or parenteral administration.
  • Parenteral administration includes, for example, injection administration such as intramuscular injection, intravenous injection, and subcutaneous injection, transdermal administration, and transmucosal administration (nasal, oral, ocular, pulmonary, vaginal, and rectal). administration and the like.
  • Peptides in pharmaceutical compositions can be modified in various ways in view of their susceptibility to metabolism and excretion. For example, polyethylene glycol (PEG) or sugar chains can be added to polypeptides to prolong blood residence time and reduce antigenicity.
  • PEG polyethylene glycol
  • sugar chains can be added to polypeptides to prolong blood residence time and reduce antigenicity.
  • biodegradable polymer compounds such as polylactic acid glycol (PLGA), porous hydroxyapatite, liposomes, surface-modified liposomes, emulsions prepared with unsaturated fatty acids, nanoparticles, nanospheres, etc. are used as sustained-release bases. , and may be used to encapsulate the polypeptide.
  • PLGA polylactic acid glycol
  • porous hydroxyapatite porous hydroxyapatite
  • liposomes liposomes
  • surface-modified liposomes emulsions prepared with unsaturated fatty acids, nanoparticles, nanospheres, etc.
  • emulsions prepared with unsaturated fatty acids nanoparticles, nanospheres, etc.
  • emulsions prepared with unsaturated fatty acids nanoparticles, nanospheres, etc.
  • emulsions prepared with unsaturated fatty acids nanoparticles, nanospheres, etc.
  • the pharmaceutical composition may use the active ingredient as it is, or may be formulated by adding pharmaceutically acceptable carriers, excipients, additives and the like.
  • Dosage forms include liquids (e.g., injections), dispersions, suspensions, tablets, pills, powders, suppositories, powders, fine granules, granules, capsules, syrups, troches, Examples include inhalants, ointments, eye drops, nose drops, ear drops, poultices, and the like.
  • excipients for example, excipients, binders, disintegrants, lubricants, solubilizers, solubilizers, coloring agents, flavoring agents, stabilizers, emulsifiers, absorption enhancers, surfactants, pH adjustment Agents, preservatives, antioxidants, etc. can be used as appropriate and can be carried out in a conventional manner.
  • ingredients used for formulation include purified water, saline, phosphate buffer, dextrose, glycerol, pharmaceutically acceptable organic solvents such as ethanol, animal and vegetable oils, lactose, mannitol, glucose, sorbitol, and crystalline cellulose.
  • Surfactants such as polyoxyethylene lauryl ethers, sodium lauryl sulfate and saponin; bile salts such as glycocholic acid, deoxycholic acid and taurocholic acid; Chelating agents such as salicylic acids; fatty acids such as caproic acid, capric acid, lauric acid, oleic acid, linoleic acid, mixed micelles; enamine derivatives, N-acyl collagen peptides, N-acyl amino acids, cyclodextrins, chitosans, A nitric oxide donor or the like may also be used.
  • Pills or tablets can also be coated with sugar-coated, gastric-soluble, or enteric-coated substances.
  • Injections can contain distilled water for injection, physiological saline, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils, alcohols and the like.
  • wetting agents, emulsifiers, dispersants, stabilizers, solubilizers, solubilizers, preservatives and the like can be added.
  • composition of the present invention may be administered in combination with other drugs or therapeutic methods useful for the above diseases.
  • the dosage may vary depending on symptoms, patient age, Depending on gender, body weight, sensitivity difference, dosing method, dosing interval, type of active ingredient, type of formulation, but not particularly limited, for example, 30 ⁇ g to 1000 mg, 100 ⁇ g to 500 mg, 100 ⁇ g to 100 mg once or divided into several times can be administered as In the case of administration by injection, 1 ⁇ g/kg to 3000 ⁇ g/kg or 3 ⁇ g/kg to 1000 ⁇ g/kg may be administered once or in several divided doses, depending on the body weight of the patient.
  • mammals e.g., humans, mice, rats, guinea pigs, rabbits, dogs, horses, monkeys, pigs, sheep, etc.
  • the dosage may vary depending on symptoms, patient age, Depending on gender, body weight, sensitivity difference, dosing method, dosing interval, type of active ingredient, type of formulation, but not particularly limited, for example, 30 ⁇ g to 1000 mg, 100 ⁇ g to 500 mg, 100 ⁇ g to 100
  • This specification also provides methods of treatment of the various diseases described above comprising administering to a subject (eg, mammal or patient) an effective amount of the peptide conjugate, or an effective amount of the pharmaceutical composition.
  • a subject eg, mammal or patient
  • an effective amount of the peptide conjugate or an effective amount of the pharmaceutical composition.
  • This specification also describes the use of peptide A or the above-described peptide conjugate in the manufacture of the above-described pharmaceutical composition, and the method of manufacturing the above-described pharmaceutical composition using peptide A or the above-described peptide conjugate. Describe.
  • This specification also provides culture medium additives containing the above-described peptide conjugates and culture medium containing the peptide conjugates.
  • This culture medium additive is used for culturing mammalian-derived cells or tissues.
  • cells to be cultured include, but are not limited to, somatic cells, germ cells, and pluripotent stem cells, which are cells that have the ability to differentiate into all tissues and cells that make up the living body. be done.
  • Pluripotent stem cells include, for example, ES cells, spermatogonial stem cells, pluripotent germ stem cells, embryonic germ cells, iPS cells, cultured fibroblasts, and cells derived from bone marrow stem cells.
  • tissue to be cultured include tissues differentiated from cells and tissues removed from the body.
  • this culture medium additive can be used to protect regenerated tissues and organs for organ transplantation.
  • Cells or tissues are preferably derived from primates such as humans, monkeys and chimpanzees, more preferably from humans.
  • the medium is not particularly limited as long as it is a medium for culturing cells or tissues, but a medium to which human HGF is added is preferred. It may be a serum medium, preferably a serum-free medium or a low-serum medium.
  • the culture medium additive may be in the form of a solution or in the form of a dry solid (eg solid, powder, etc.). When it is in the form of a solution, it may be used as a culture medium as it is, or it may be diluted with a solvent and, if necessary, added with the additives described above, and used as a culture medium.
  • Solvents used for dilution include, for example, water, buffer solutions, physiological saline, media used for various cell and tissue cultures, etc., and these can be used alone or in combination of two or more. good too.
  • the culture medium additive is in the form of a dry solid, for example, it is dissolved in a solvent such as water, buffer solution, physiological saline, and medium used for various cell and tissue cultures, and if necessary, the above-mentioned You may use what added the additive as a culture medium.
  • the content of the peptide complex of the present invention in the medium for culturing cells or tissues or in the medium for cells obtained therefrom can be arbitrarily set by those skilled in the art depending on the cells or tissues to be cultured.
  • the final concentration is about 0.01 to about 10000 nmol / L, preferably about 0.1 to about 1000 nmol / L, more preferably about 0.5 to about 1000 nmol / L, more preferably from about 1 to about 100 nmol/L.
  • DDS Carrier Peptide A described above has the property of binding to c-Met protein. For this reason, peptide A or a peptide conjugate containing peptide A can be used as a DDS carrier (drug delivery carrier) or a drug delivery conjugate by binding to a known substance to be delivered to c-Met protein, such as a drug. Function. This specification also discloses such DDS carriers and drug delivery complexes. Peptide A or a peptide complex can be bound to a drug using a known method.
  • ⁇ as Angstroms (unit); BSA as bovine serum albumin; DMSO as dimethylsulfoxide; DMF as dimethylformamide; DIPEA or DIEA as N,N-diisopropylethylamine; DODT as 3,6-dioxa-1,8-octane-dithiol; DMEM as Dulbecco's Modified Eagle Medium EC50 as 50% effective concentration; EGF as Epidermal Growth Factor; Fmoc as 9-fluorenylmethyloxycarbonyl; FBS as fetal bovine serum; Fmoc-Lys(Fmoc)-OH as N 2 ,N 6 -bis(((9H-fluoren-9-yl)methoxy)carbonyl)-L-lysine; g as gram (unit); HATU as O-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethylur
  • Fmoc-Trp(Boc)-OH Fmoc-Thr(tBu)-OH; Fmoc-N-Me-Gly-OH; Fmoc-Asp(OtBu)-OH; Fmoc-N-Me-Phe-OH; -OH; Fmoc-N-Me-Ala-OH; Fmoc-His(Trt)-OH; Fmoc-Tyr(tBu)-OH; Fmoc-Val-OH; Fmoc-HydPro(tBu)-OH; Trt)-OH; Fmoc-Lys(Mtt)-OH; Fmoc-Ser(tBu)-OH; Fmoc-N-Me-Ser(tBu)-OH.
  • ESI-MS (+) in mass spectrometry, with the molecular weight calculated considering the amino acids used according to the target sequence and the building blocks used as necessary.
  • ESI-MS(+) indicates electrospray ionization mass spectrometry performed in positive ion mode. Detected masses were reported in "m/z” unit notation. Compounds with a molecular weight of approximately greater than 1000 were frequently detected as divalent ions or trivalent ions.
  • reaction was carried out using Fmoc-AA/HATU/DIPEA (8.4 equivalents/7.8 equivalents/16.8 equivalents) per equivalent of resin.
  • Fmoc was removed by reacting with a 20% piperidine in DMF solution at 25° C. for 5 minutes, after removing the solution, adding a 20% piperidine in DMF solution again and reacting for 15 minutes.
  • Introduction of the chloroacetyl group was carried out by removing the Fmoc group of the ⁇ -amino group of the solid-phase resin holding the Fmoc-protected peptide obtained in the previous step by the method described above, followed by addition of 0.3M chloroacetic acid in DMF.
  • reaction solution was recovered by filtration through a frit.
  • the solid-phase resin remaining in the reaction vessel was shaken again with the cutting cocktail, and the solution component was recovered from the frit and mixed with the above filtrate.
  • this filtrate was added to a mixed solvent of excess diethyl ether/hexane (1/1) cooled to 0° C., a cloudy precipitate was formed.
  • the mixture was centrifuged (8500 rpm, 0° C., 30 seconds) and the solution decanted.
  • the resulting solid was washed again with a small amount of diethyl ether/hexane cooled to 0° C. and dried under reduced pressure.
  • the resulting solid was used for the next cyclization reaction.
  • the cyclization reaction of the peptide was carried out by dissolving the peptide in DMSO so that the final concentration of the peptide was 2.5 mM based on the number of moles of the solid phase resin, adding 10 equivalents of triethylamine, and shaking at 25° C. for 16 hours.
  • the resulting reaction solution was concentrated under reduced pressure using EZ-2 Elite.
  • the resulting mixture was subjected to solid phase extraction using Gilson ASPEC® C18 cartridges.
  • the resulting extract was concentrated under reduced pressure using EZ-2 Elite. Analyzed by LC-MS, the mass spectrum of the desired product was observed as one of the main peaks.
  • a DMF solution (10 equivalents), a DMF solution of 0.49 M HATU (9.8 equivalents), and a DMF solution of 0.5 M DIPEA (10 equivalents) were added to the solid-phase resin and shaken at room temperature for 30 minutes.
  • Deprotection of the side chain and cleavage from the solid-phase resin were carried out by the following method. First, the resin obtained after the chloroacetyl group-introducing step was washed with DMF five times and methylene chloride three times, and then dried under reduced pressure. Subsequently, reactant cocktail-A (a mixture of TFA/H 2 O/TIS/DODT at a volume ratio of 92.5:2.5:2.5:2.5) was added to the reaction vessel containing the solid phase resin.
  • reactant cocktail-A a mixture of TFA/H 2 O/TIS/DODT at a volume ratio of 92.5:2.5:2.5:2.5
  • the cyclization reaction of the peptide was carried out by dissolving the peptide in DMSO/acetonitrile/water (18/1/1) so that the final concentration of the peptide was 1 mM based on the number of moles of the solid-phase resin. °C for 15 hours.
  • the resulting reaction solution was concentrated under reduced pressure using EZ-2 Elite.
  • the purity of the target product was calculated from the area ratio of the LC/MS (UV wavelength 225 nm) chromatogram under the following analysis conditions and was 59.97%.
  • c-Met activation ability c-Met agonist activity of the peptide conjugate of the present invention
  • Phosphorylation of Met was verified.
  • Human A431 cells were cultured in DMEM containing 10% FBS (Gibco), high glucose, GlutaMAX (registered trademark) Supplement, pyruvate (Thermo Fisher Scientific). The cells were detached using Accutase (Innovative cell technologies), seeded in a 96-well plate at 10,000 cells per well, and cultured overnight.
  • the assay was performed according to the protocol of the kit, and SpectraMax (registered trademark) Paradigm (registered trademark) multimode microplate reader (Molecular Devices Japan) was used for signal detection.
  • the obtained signals were analyzed with GraphPad Prism (MDF). Taking the maximum value of the signal induced by HGF as 100%, 2 indicates activation of 50% or more, and 2 indicates activation of 50% or less. was described as 1.
  • Table 3 shows the results.
  • Activity measurement was performed using a monomeric peptide in the same manner, but c-Met agonist activity was not shown.
  • the C50 value was calculated with GraphPad Prism as the concentration of peptide exhibiting 50% activity of the signal induced by HGF. Table 4 shows the results.
  • the EC50 value of HGF as a control was 0.66 nM. Furthermore, a graph of the c-Met agonist activity of the peptide (SEQ ID NO: 34) and linker (SEQ ID NO: 37) conjugate (GFs_c-Met-00014336-PEG13 dimer; conjugate No. 49 in Table 4) is shown in FIG. Indicated. The EC50 of the peptide conjugate was 0.72 nM, showing almost the same c-Met agonistic activity as HGF. These results indicated that the peptide complex of the present invention certainly has c-Met agonist activity.
  • HUVEC human umbilical vein endothelial cells
  • HuMedia-EG2 HuMedia-EG2
  • Cells were detached using Accutase (Innovative Cell Technologies), resuspended in Medium without serum or growth factors (Cell Systems) containing 5% FBS (MBL), and plated in 96 wells with 10,000 cells per well. Plates were inoculated and cultured overnight.
  • the obtained signal values were analyzed with GraphPad Prism to calculate EC50.
  • a graph of the activity obtained is shown in FIG.
  • the EC50 of HGF was 0.37 nM
  • the EC50 of the peptide complex was 0.55 nM, indicating that the peptide complex of the present invention exhibited almost the same c-Met agonist activity as HGF.
  • the resin obtained after the chloroacetyl group-introducing step was washed with DMF five times and methylene chloride three times, and then dried under reduced pressure.
  • reactant cocktail-A a mixture of TFA/H 2 O/TIS/DODT at a volume ratio of 92.5:2.5:2.5:2.5
  • the reaction solution was recovered by filtration through a frit.
  • the solid-phase resin remaining in the reaction vessel was shaken again with the cutting cocktail, and the solution component was recovered from the frit and mixed with the above filtrate.
  • the filtrate was added to excess diethyl ether/hexane (1/1) mixed solvent cooled to 0° C. to form a cloudy precipitate, the mixture was centrifuged (9000 rpm, 2 minutes), and the solution was decanted. The obtained solid was washed again with a small amount of diethyl ether/hexane cooled to 0° C. and then dried under reduced pressure. The resulting solid was used for the next cyclization reaction.
  • the peptide cyclization reaction was carried out by dissolving the peptide in DMSO/acetonitrile/water (18/1/1) so that the final concentration of the peptide was 2.5 mM based on the number of moles of the solid-phase resin, and then adding 10 equivalents of triethylamine. and shaken at 25° C. for 4 hours. The resulting reaction solution was concentrated under reduced pressure using EZ-2 Elite.
  • the purity of the target product was calculated from the area ratio of the LC/MS (UV wavelength 225 nm) chromatogram under the following analysis conditions and was 96.90%.
  • GFs_c-Met-00014234 (8.0 mg, 3.51 ⁇ mol) was dissolved in DMF (0.2 mL), DIPEA (2.3 ⁇ L, 13 ⁇ mol) in DMF solution (23 ⁇ L) and bis(2,5-dioxopyrrolidine-1 -yl) (3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-undecaoxapentatriacontane-1,35-diyl) biscarbonate (1.38 mg, 1.67 ⁇ mol) of DMF solution (14 ⁇ L) was added, and the mixture was stirred at 25° C. for 16 hours.
  • the purity of the target product was calculated from the area ratio of the LC/MS (UV wavelength 225 nm) chromatogram under the following analysis conditions and was 96.42%.
  • the cyclic peptide (GFs_c-Met-00014234) (8.0 mg, 3.51 ⁇ mol) synthesized in Example 6-1 was dissolved in DMF (0.25 mL), and a DMF solution (20 ⁇ L) of triethylamine (2.0 ⁇ L, 14 mmol) ) and bis(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52-
  • a DMF solution (18 ⁇ L) of heptadecaoxapentententacontanedioate (1.75 mg, 1.65 ⁇ mol) was added and stirred at 25° C. for 16 hours.
  • the purity of the target product was calculated from the area ratio of the LC/MS (UV wavelength 225 nm) chromatogram under the following analysis conditions and was 94.19%.
  • GFs_c-Met-00014234 (8.0 mg, 3.51 ⁇ mol) was dissolved in DMF (0.25 mL), triethylamine (2.0 ⁇ L, 14 ⁇ mol) in DMF (20 ⁇ L) and bis(2,5-dioxopyrrolidine-1). -yl) 4,7,10,13,16,19,22,25,28-nonoxahentriacontanedioate (1.17 mg, 1.65 ⁇ mol) in DMF (12 ⁇ L) was added and the mixture was heated at 25° C. for 16 hours. Stirred.
  • the purity of the target product was calculated from the area ratio of the LC/MS (UV wavelength 225 nm) chromatogram under the following analysis conditions and was 94.56%.
  • RPTEC Human proximal renal tubular epithelial cells
  • REBM Renal Epithelial Cell Basal Medium
  • FBS 2.4 mM L-Alanyl-L-Glutamine + 10 nM Triiodothyronine + 10 ng /mL rh EGF + 100 ng/mL Hydrocortisone Hemisuccinate + 5 ⁇ g/mL rh Insulin + 1 ⁇ M Epinephrine + 5 ug/mL Transferrin) (ATCC).
  • FIG. 3 shows the results after 3 days, where a is MOCK (no addition), b is 1.6 nM EGF, c is 2 nM HGF, and d is 2 nM peptide complex (peptide complex No. 49 in Table 4).
  • FIG. 4 shows the results after 8 days. 34) and linker (SEQ ID NO: 37) conjugate (GFs_c-Met-00014336-PEG13 dimer; peptide conjugate No. 49 in Table 4) added in wells.
  • linker SEQ ID NO: 37
  • GFs_c-Met-00014336-PEG13 dimer peptide conjugate No. 49 in Table 4
  • FIG. 4f showed that not only tube formation but also branch formation was promoted. Since tube formation requires multifunctional actions such as cell proliferation, migration, and collagen degradation, the peptide complex of the present invention was shown to have physiological activity similar to that of HGF.
  • Human Phospho-RTK Array Assay A431 cells were cultured in DMEM containing 10% FBS (Gibco), high glucose, GlutaMAX (registered trademark) Supplement, pyruvate (Thermo Fisher Scientific). The cells were detached using Accutase (registered trademark) (Innovative cell technologies), seeded in a 6-well plate at 1,000,000 cells per well, and cultured overnight. For starvation the following day, the assay medium was replaced with an assay medium (DMEM containing 0.1% BSA (Sigma), high glucose, GlutaMAX (registered trademark) Supplement, pyruvate (Thermo Fisher Scientific)) and cultured overnight. .
  • FBS Gibco
  • GlutaMAX registered trademark
  • pyruvate Thermo Fisher Scientific
  • This invention can be used in the pharmaceutical industry and the biotechnology industry.

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Abstract

【解決課題】ｃ－Ｍｅｔタンパク質と結合するペプチド複合体を提供する。 【解決手段】　ペプチドＡを含むペプチド複合体であって，ペプチドＡは，Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｖ－Ｓ－Ｘ４－Ｄ－Ｘ５－Ｄ－Ｘ６－Ｐ－Ｒ－Ｗ－Ｘ７－ＭｅＣ（配列番号１）に記載のアミノ酸配列からなるペプチドであるか，又は配列番号１に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が，置換，欠失，付加又は挿入されたアミノ酸配列からなる。Ｘ１は，Ａ，ＭｅＡ，Ｆ又はＭｅＦである。Ｘ２は，Ｖ，Ｔ，Ｅ，Ｑ，又はＷである。Ｘ３は，Ａ，Ｒ，Ｙ，又はＤである。Ｘ４は，Ｆ，ＭｅＦ，Ｌ又はＭｅＦである。Ｘ５は，Ｄ，Ｅ，Ｓ，Ｐ又はＶである。Ｘ６は，（Ｓ）－２－アミノヘプタン酸（Ａｈｐ），Ｒ，Ｌ－ノルロイシン（Ｎｌｅ），（Ｓ）－２，７－ジアミノヘプタン酸（Ｈｔｙ），又はＳである。Ｘ７は，Ｓ，Ａ，Ｌ－α－アミノブタン酸（Ａｂｕ），Ｄ，Ｑ，又はＶである。

Description

ｃ－Ｍｅｔタンパク質結合ペプチド複合体
　この発明は，ｃ－Ｍｅｔタンパク質に結合するペプチドを含む複合体などに関する。
　近年，病気や外傷などによる損傷を受けたからだの組織を再生することを目指す，再生医療が注目されている。再生医療は自己の細胞を用いて組織を再生するため，他者からの臓器移植などの従来法に比べ免疫の問題が起こりにくいという利点をもつ。それら再生医療では，幹細胞などのヒト由来の細胞を培養し，目的の組織に分化させることが必要である。また，再生医療のさらなる改良技術を生み出すために，培養した哺乳類細胞，特にヒト由来の細胞を用いた基礎研究が続けられている。
　これら再生医療や研究においては，目的となる細胞を効率的に培養し増殖させる工程が重要となる。
　幹細胞をはじめヒト細胞の培養において培地成分は重要な役割を果たしているが，特にその中でも成長因子（ＧＦと称することもある）は最も重要な要素のひとつである。しかし，成長因子は一般的に非常に高価であり，かつ，例えば幹細胞を用いた研究においては未分化状態の細胞を維持するなどのために多量が必要となる。
　また，成長因子の一つ肝細胞増殖因子（ＨＧＦ：ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）とその受容体であるｃ－Ｍｅｔ（ｃ－Ｍｅｔ又はＭｅｔと称することもある）は，医薬品のターゲットとしても研究が進んでいる。
　ｃ－Ｍｅｔは１回膜貫通型の受容体型チロシンキナーゼで，リガンドであるＨＧＦがｃ－ＭＥＴに結合すると，ｃ－ＭＥＴは二量体化し活性化される。ｃ－Ｍｅｔの活性化は胚発生，器官形成，創傷治癒に必須であることが知られており，例えばＨＧＦと受容体ｃ－Ｍｅｔの結合は，関連するシグナル伝達経路を活性化し，特異的に内皮細胞の増殖及び機能を促進・維持し，血管新生を促進し，さらに血管新生から側副循環を形成することが知られている。そのため，ｃ－Ｍｅｔの活性化作用を有する化合物が求められており，研究が進んでいる。
　そのような中，特許文献１では，ｃ－Ｍｅｔアゴニスト活性を有する抗体が報告されている。また，非特許文献１では，現在までに開発が進んでいるＨＧＦの代替物が報告されている。
　また近年，低分子や抗体等の高分子に変わる中分子化合物として，ペプチド，特に環状ペプチドの医薬組成物等としての利用が注目されている。例えば，特許文献２及び非特許文献２には，ｃ－Ｍｅｔタンパク質アゴニストとして利用可能なペプチド複合体が記載されている。当該ｃ－Ｍｅｔタンパク質アゴニストとして利用可能なペプチド複合体は，細胞の増殖や遊走を促進させることが知られており，この細胞増殖作用を用いて医薬品や細胞培養時の培地組成物など，様々な用途への応用が期待されている。例えば，再生医療に用いられる細胞や組織の培養時に添加する成長因子代替物，臓器移植時の臓器保護剤，再生促進剤，及び肝細胞増殖因子の発現低下を来す疾患のための治療薬としての有用性が挙げられる。
特表２０２１－５０７９３ 特許第６４２６１０３号公報 ＴＨＥ　ＣＨＥＭＩＣＡＬ　ＴＩＭＥＳ（関東化学株式会社）２０２０　Ｎｏ．２　ｐ．６－１１　特集　再生医療関連技術　化学合成可能な増殖因子代替化合物の開発　植木　亮介及び山東　信介 Ｉｔｏ，Ｋ．　ｅｔ．　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ　ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，　６，　Ａｒｔｉｃｌｅ　ｎｕｍｂｅｒ：　６３７３　（２０１５）
　前述のとおり，幹細胞をはじめとする細胞の培養において，高価な成長因子を加える必要があり，それが幹細胞などの医療応用を困難にしていた。また，成長因子は医薬品としての可能性も大きいため，安価で安定的に提供可能な成長因子の代替物の開発が望まれている。そのような状況の中，上記の公報に記載があるとおり，ｃ－Ｍｅｔタンパク質に結合するペプチドを含むｃ－Ｍｅｔタンパク質アゴニストとして利用可能なペプチド複合体が見出された。しかしながら，上記公報に記載されているペプチド複合体のなかにはヒトＨＧＦと比べ低い活性を示すものがあるため，当該ペプチド複合体以外のｃ－Ｍｅｔタンパク質に結合する複合体の開発が望まれた。
　この明細書に記載された発明は，上記のいずれか１つ又は２つ以上を解決することを目的とする。
　この発明は，基本的には，配列番号１で示されるペプチドがｃ－Ｍｅｔタンパク質と結合するという実施例による知見に基づく。
　また，この発明は，基本的には，上記のペプチドをリンカーで結合させ，ダイマー構造をとるように設計したペプチド複合体が，ｃ－Ｍｅｔタンパク質アゴニストとして機能するという実施例による知見に基づく。
　第１の発明は，ｃ－Ｍｅｔタンパク質と結合するペプチドＡを含むペプチド複合体に関する。
　ペプチドＡは，Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｖ－Ｓ－Ｘ４－Ｄ－Ｘ５－Ｄ－Ｘ６－Ｐ－Ｒ－Ｗ－Ｘ７－ＭｅＣ（配列番号１）に記載のアミノ酸配列からなるペプチドであるか，又は配列番号１に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が，置換，欠失，付加又は挿入されたアミノ酸配列からなるｃ－Ｍｅｔタンパク質と結合するペプチドである。
　　Ｘ１は，Ｎ－アルキル化されてもよいアミノ酸である。
　　Ｘ２は，任意のアミノ酸である。
　　Ｘ３は，任意のアミノ酸である。
　　Ｘ４は，Ｎ－アルキル化されてもよい疎水性アミノ酸である。
　　Ｘ５は，任意のアミノ酸である。
　　Ｘ６は，置換を有してもよいアルキル鎖を側鎖に有するアミノ酸又はＳである。
　　Ｘ７は，任意のアミノ酸である。
　この発明によれば，ｃ－Ｍｅｔタンパク質に結合する新規なペプチドを含む複合体を提供できる。
　また，この発明によれば，ｃ－Ｍｅｔアゴニスト活性を有する新規なペプチド複合体を提供できる。
　さらに，この発明によれば，ｃ－Ｍｅｔアゴニスト活性を有する新規なペプチド複合体を含む，再生医療に用いられる細胞や組織の培養時に添加する成長因子の代替物としての細胞又は組織培養用の培地組成物を提供できる。これは，例えば，臓器移植時の臓器保護剤，再生促進剤としても利用可能である。
　また，この発明によれば新規なｃ－Ｍｅｔタンパク質アゴニストやそのようなｃ－Ｍｅｔタンパク質アゴニストを含む医薬組成物を提供できる。これは，例えば，肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の発現低下を来す疾患のための治療薬として有用である。
　さらに，この発明によれば，細胞の増殖を促進させる新規なｃ－Ｍｅｔタンパク質アゴニストを含む医薬組成物を提供できる。
図１は，本発明のペプチド複合体及びヒトＨＧＦを用いた，ホスホ－ｃ－Ｍｅｔ　ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイによるｃ－Ｍｅｔアゴニスト活性測定の結果を示す。図中，黒四角はｃ－Ｍｅｔアゴニスト活性ペプチド複合体（ペプチド（配列番号３４）とリンカー（配列番号３７）の複合体（ＧＦｓ＿ｃ－Ｍｅｔ－０００１４３３６－ＰＥＧ１３ダイマー；表４における複合体Ｎｏ．４９）を示し，ＸはヒトＨＧＦを示す。横軸はペプチド複合体又はヒトＨＧＦの濃度（ｎＭ）を，縦軸はヒトＨＧＦで誘導される活性化シグナルの最大値を１００としたときの活性化シグナルの相対値を示す。 図２は，本発明のペプチド複合体及びヒトＨＧＦを用いた，ＨＵＶＥＣ細胞増殖評価によるｃ－Ｍｅｔアゴニスト活性測定の結果を示す。図中，黒四角はｃ－Ｍｅｔアゴニスト活性ペプチド複合体（ペプチド（配列番号３４）とリンカー（配列番号３７）の複合体（ＧＦｓ＿ｃ－Ｍｅｔ－０００１４３３６－ＰＥＧ１３ダイマー；表４における複合体Ｎｏ．４９）を示し，ＸはヒトＨＧＦを示す。横軸はペプチド複合体又はヒトＨＧＦの濃度（ｎＭ）を，縦軸はヒトＨＧＦで誘導される活性化シグナルの最大値を１００としたときの活性化シグナルの相対値を示す。 図３は，本発明のペプチド複合体，ヒトＨＧＦ及びヒト上皮成長因子（ＥＧＦ）を用いた，ヒト近位尿細管上皮細胞の管腔形成評価試験における３日後の結果を示す。 図４は，本発明のペプチド複合体，ヒトＨＧＦ及びヒト上皮成長因子（ＥＧＦ）を用いた，ヒト近位尿細管上皮細胞の管腔形成評価試験における８日後の結果を示す。図中，黒矢印は分岐を有する管腔形成を示す。 図５は，本発明のペプチド複合体及びヒトＨＧＦを用いた，ヒト　Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＲＴＫ　アレイアッセイ評価の結果を示す。図５（１）はアレイマップを示し，図５（２）は評価結果を示す。図中，黒四角はＨＧＦＲに対する抗体が固定されたウェルを示す。
　以下，本発明を実施するための形態について説明する。本発明は，以下に説明する形態に限定されるものではなく，以下の形態から当業者が自明な範囲で適宜修正したものも含む。
　第１の発明は，ｃ－Ｍｅｔタンパク質と結合するペプチドＡを含むペプチド複合体に関する。
　ｃ－Ｍｅｔタンパク質
　ｃ－Ｍｅｔタンパク質は，肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）受容体であり，チロシンキナーゼ活性を有する。ｃ－Ｍｅｔタンパク質は，ジスルフィド結合で結合したαサブユニット及びβサブユニットで構成される膜貫通型受容体である。ｃ－Ｍｅｔタンパク質は，生体内で，ＨＧＦが結合することにより二量体化され，続いて自己リン酸化が起こり，各種のシグナル伝達が活性化される。その結果，ＭＡＰＫ経路やＡｋｔ経路のシグナル伝達が活性化されることにより，細胞増殖が促進される一方で，細胞のアポトーシス誘導が阻害される。この機能を亢進させて細胞の増殖や遊走を促進させることができれば，再生医療に用いられる細胞製剤などの製造や，肝硬変などの難治性臓器疾患の治癒を促進できる可能性がある。
　ｃ－Ｍｅｔタンパク質は，ｃ－Ｍｅｔ，ＭＥＴ又はＨＧＦＲともよばれる。ヒトのｃ－Ｍｅｔタンパク質のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号はＮＰ＿０００２３６であり，マウスのｃ－Ｍｅｔタンパク質のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号はＮＰ＿０３２６１７である。
　肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）
　肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）は，多機能サイトカインとして，広範な組織および細胞種に対する増殖因子として機能する因子であり，分子量約６万の重鎖と約３．５万の軽鎖がジスルフィド結合したヘテロダイマー構造を有する。ＨＧＦは上皮系細胞，内皮細胞や間葉系細胞の増殖を促進することが知られており，他にも形態形成誘導，細胞運動性亢進，抗アポトーシスや血管新生作用などの働きを有する。ヒトのＨＧＦのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号はＮＰ＿０００５９２であり，マウスのＨＧＦのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号はＮＰ＿００１２７６３８７である。ヒトＨＧＦであることが好ましく，本明細書において特記しない限りＨＧＦはヒトＨＧＦを示す。
　ｃ－Ｍｅｔタンパク質と結合
　ｃ－Ｍｅｔタンパク質と結合するとは，ペプチド又はペプチド複合体が，ｃ－Ｍｅｔタンパク質と結合することを意味する。ｃ－Ｍｅｔタンパク質と結合するか否かは，公知の分子間結合を測定する方法によって測定することができ，例えば，表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイ，スキャチャード解析ならびに／または放射免疫アッセイ（ＲＩＡ），酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）およびサンドイッチ競合アッセイなどの競合結合アッセイ，ならびに当技術分野でそれ自体公知であるその異なるバリアントを含む，それ自体公知である任意の適切な様式で決定することが可能である。好ましくは，例えば，特許第６４２６１０３号公報（特許文献２）に記載された表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分光による評価である。また，ｃ－Ｍｅｔアゴニスト活性を有する化合物は，ｃ－Ｍｅｔタンパク質と結合することでｃ－Ｍｅｔアゴニスト活性を示すため，ｃ－Ｍｅｔアゴニスト活性を評価すること，すなわちc-Metアゴニスト活性の有無により，当該ペプチド又は複合体が，ｃ－Ｍｅｔタンパク質と結合したか否かを間接的に評価することが可能である。なお，複合体においては，当該複合体の一部又は全部がｃ－Ｍｅｔタンパク質に結合可能であれば当該複合体はｃ－Ｍｅｔタンパク質と結合するという。例えば，当該複合体がペプチドＡを含む場合においては，当該複合体におけるペプチドＡの部分が，ｃ－Ｍｅｔタンパク質と結合する部位であってもよく，当該複合体に含まれる他の部分もｃ－Ｍｅｔタンパク質に結合してもよい。
　ｃ－Ｍｅｔアゴニスト活性
　ｃ－Ｍｅｔアゴニスト活性とは，ｃ－Ｍｅｔタンパク質と結合し，ＨＧＦが有する活性と類似の影響を示す活性をいう。ペプチド又はペプチド複合体がｃ－Ｍｅｔアゴニスト活性を有するか否かは，公知の方法によって測定することができ，例えば，実施例に示されるように，ホスホ－ｃ－Ｍｅｔ　ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイや，ＨＵＶＥＣ細胞増殖試験などを用いて，ｃ－Ｍｅｔアゴニスト活性を評価できる。また，特許第６４２６１０３号公報（特許文献２）に記載されたＥＬＩＳＡ法を用いて，ｃ－Ｍｅｔのリン酸化能を評価することもできる。
　ｃ－Ｍｅｔアゴニスト活性を有するペプチド複合体が治癒できる疾病
　ｃ－Ｍｅｔアゴニスト活性を有するペプチド複合体が治癒できる疾病の例は，虚血性心疾患，急性肝炎，劇症肝炎，肝硬変，胆道閉鎖症，脂肪肝，急性腎不全，慢性腎不全，糖尿病性腎症，急性肺炎，肺線維症，血管障害，心筋梗塞，拡張型心筋症，皮膚潰瘍，脳梗塞，閉塞性動脈硬化症，胃潰瘍及び筋萎縮性側索硬化症などであり，それら疾病の治療に使用できる。
　ペプチド複合体
　ペプチド複合体は，ｃ－Ｍｅｔタンパク質と結合するペプチドＡを含むペプチド複合体である。このペプチド複合体は，ペプチドＡを１つ又は２つ以上含む。ペプチド複合体は，ペプチドＡを２つ含むものが好ましい。また，ペプチドＡを１つ含むペプチド複合体の例は，限定されるものでは無いが，例えば，ペプチドＡと，ｃ－Ｍｅｔタンパク質に送達したい物質（ペイロード），例えば公知の医薬組成物等とを含むペプチド複合体や，ペプチドＡと蛍光タンパク質などのマーカーとなる組成物を含むペプチド複合体である。公知の医薬組成物とペプチドＡとの複合体の場合は，ペプチドＡのｃ－Ｍｅｔタンパク質への結合能を利用して，ｃ－Ｍｅｔに送達したい医薬組成物をｃ－Ｍｅｔタンパク質に送達することが可能となる。
　ｃ－Ｍｅｔタンパク質に送達したい物質としては特に限定はなく，当業者の希望する何らの物質であってよい。該物質の例としては，限られないが，以下が挙げられる：
　化合物：低分子化合物，中分子化合物だけではなく，細胞のサイトーシス機構で導入可能な化合物であれば何でもよい。例えば公知の低分子薬剤が挙げられる。
　ペプチド：体内の標的に結合して何らかの効果を示すペプチドであってよく，例えば環状ペプチドであってよい。
　ＲＩ：放射性同位元素でラベルした低分子，中分子化合物や抗体等，放射性同位元素でラベルできる化合物であれば何でもよい。例えば，ＰＥＴ検査用の化合物が挙げられる。
　タンパク質：抗体，酵素等の，体内にて有用な機能を示すタンパク質であれば何でもよい。例えば，酵素補充療法に用いられる酵素が挙げられる。
　核酸：ＤＮＡ，ＲＮＡ等，塩基配列を含むものであれば何でもよい。例えば，核酸医薬品が挙げられる。
　ＤＤＳ：リポソームやミセルなどのＤＤＳ分子であってよい。当該ＤＤＳ分子には内部にさらに医薬品などの化合物が含まれていてもよい。
　及び，上記に挙げたそれらの複合体であってよい。
　ペプチド複合体の例は，（１）第１のペプチドと，（２）第２のペプチドと，（３）第１のペプチド及び第２のペプチドをつなぐリンカーを含むペプチド複合体である。
　このペプチド複合体は，（１）第１のペプチドと，（２）第２のペプチドと，（３）第１のペプチド及び第２のペプチドをつなぐリンカーのみからなるペプチド複合体であってもよい。
　このペプチド複合体は，第１のペプチド及び第２のペプチドの少なくとも一方は，ペプチドＡである。
　第１のペプチド及び第２のペプチドは，同一でも異なってもよいが，ペプチドＡであることが好ましい。
　つまり，ペプチド複合体は，ヘテロダイマーであってもホモダイマーであってもよい。ヘテロダイマーは，第１のペプチド及び第２のペプチドが，異なるペプチド（例えばアミノ酸配列の異なるペプチドＡ）である。ホモダイマーは，第１のペプチド及び第２のペプチドが，同じペプチドＡである。好ましいペプチド複合体は，ホモダイマーである。
　第１のペプチド及び第２のペプチドは，同一のペプチドＡであり，第１のペプチド及び第２のペプチドのＣ末端がリンカーと結合した，ペプチド複合体であることが好ましい。特に，第１のペプチド及び第２のペプチドが，環状ペプチドであることが好ましい。
　ペプチドＡ
　この明細書は，ペプチドＡを含む複合体のみならずペプチドＡも記載する。
　ペプチドＡは，
　（１）Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｖ－Ｓ－Ｘ４－Ｄ－Ｘ５－Ｄ－Ｘ６－Ｐ－Ｒ－Ｗ－Ｘ７－ＭｅＣ（配列番号１）に記載のアミノ酸配列からなるｃ－Ｍｅｔタンパク質と結合するペプチドであるか，又は
　（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１～３個（１個，２個又は３個）のアミノ酸が，置換，欠失，付加又は挿入されたアミノ酸配列からなるｃ－Ｍｅｔタンパク質と結合するペプチドである。この（２）のペプチドにおいても，配列番号１における４番目のＶ，５番目のＳ，７番目のＤ，９番目のＤ，１１番目のＰ，１２番目のＲ，１３番目のＷ，及び１５番目のＭｅＣが維持されているものが好ましい。
　　Ｘ１は，Ｎ－アルキル化されてもよいアミノ酸であり，好ましくはＮ－メチル化されてもよいＡ又はＮ－メチル化されてもよいＦである。さらに好ましいＸ１は，ＭｅＦ（Ｎ－メチル化されたＦ）である。
　　Ｘ２は，任意のアミノ酸であり，好ましくは親水性アミノ酸，脂肪族・分岐鎖アミノ酸又は芳香族アミノ酸であり，さらに好ましくはＶ，Ｔ，Ｅ，Ｑ，又はＷである。最も好ましいＸ２は，Ｔである。
　　Ｘ３は，任意のアミノ酸であり，親水性アミノ酸，脂肪族アミノ酸又は芳香族アミノ酸であり，さらに好ましくはＡ，Ｒ，Ｙ，又はＤである。最も好ましいＸ３は，Ａである。
　　Ｘ４は，Ｎ－アルキル化されてもよい疎水性アミノ酸であり，好ましくはＮ－メチル化されてもよい疎水性アミノ酸であり，さらに好ましくはＮ－メチル化されていてもよいＦ又はＮ－メチル化されてもよいＬである。最も好ましいＸ４は，ＭｅＦ（Ｎ－メチル化されたＦ）である。
　　Ｘ５は，任意のアミノ酸であり，好ましくは親水性アミノ酸，脂肪族・分岐鎖アミノ酸又はＰであり，さらに好ましくはＤ，Ｅ，Ｓ，Ｐ又はＶである。最も好ましいＸ５は，Ｅである。
　　Ｘ６は，置換を有してもよいアルキル鎖を側鎖に有するアミノ酸又はＳであり，好ましくは（Ｓ）－２－アミノヘプタン酸（Ａｈｐ），Ｒ，Ｌ－ノルロイシン（Ｎｌｅ），　（Ｓ）－２，７－ジアミノヘプタン酸（Ｈｔｙ），又はＳである。さらに好ましいＸ６は，Ａｈｐである。
　　Ｘ７は，任意のアミノ酸であり，好ましくは親水性アミノ酸又は脂肪族アミノ酸であり，さらに好ましくはＳ，Ａ，Ｌ－α－アミノブタン酸（Ａｂｕ），Ｄ，Ｑ，又はＶである。最も好ましいＸ７は，Ｓである。
「Ｎ－アルキル化されていてもよいアミノ酸」とは，ペプチド結合を形成する窒素上にアルキル基を持つアミノ酸であるＮ－アルキルアミノ酸又はアルキル基を持たないアミノ酸を示す。Ｎ－アルキルアミノ酸としては，例えば，Ｎ－ブチルアミノ酸，Ｎ－エチルアミノ酸，Ｎ－メチルアミノ酸などが挙げられる。また，「Ｎ－メチル化されていてもよい」とは，Ｎ－メチル化アミノ酸を含むことを示す。例えば，Ｎ－メチル化されていてもよいＡとは，アラニン（Ａ）又はＮ－メチルアラニン（ＭｅＡ）を示す。
「置換を有してもよいアルキル鎖を側鎖に有するアミノ酸」とは，側鎖にアルキル鎖を有するアミノ酸，例えば脂肪族アミノ酸グループに属するアミノ酸や，それらアミノ酸の側鎖アルキル基の末端に官能基が置換されたアミノ酸であり，好ましくは，当該アルキル基に含まれるＣが５以上であるアミノ酸である。例えば，Ａｈｐ，Ｎｌｅ，Ｈｔｙなどが含まれる。
　ペプチドＡの好ましい例は，
　（１）ＭｅＦ－Ｔ－Ａ－Ｖ－Ｓ－ＭｅＦ－Ｄ－Ｅ－Ｄ－Ａｈｐ－Ｐ－Ｒ－Ｗ－Ｓ－ＭｅＣ（配列番号３４）に記載のアミノ酸配列からなるペプチドであるか，又は
　（２）配列番号３４に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が，置換，欠失，付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり，ｃ－Ｍｅｔタンパク質と結合するペプチドである。
　保存的アミノ酸置換
　特定の配列から，１個，２個又は３個のアミノ酸残基が置換，欠失，付加又は挿入される場合，保存的アミノ酸置換がなされることが好ましい。「保存的アミノ酸置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」とは，機能的に等価または類似のアミノ酸との置換を意味する。ペプチドにおける保存的アミノ酸置換は，該ペプチドのアミノ酸配列に静的変化をもたらす。例えば，同様の極性を有する一つまたは二つ以上のアミノ酸は機能的に等価に作用し，かかるペプチドのアミノ酸配列に静的変化をもたらす。一般に，あるグループ内の置換は構造および機能について保存的であると考えることができる。しかしながら，当業者には自明であるように，特定のアミノ酸残基が果たす役割は当該アミノ酸を含む分子の三次元構造における意味合いにおいて決定され得る。例えば，システイン残基は，還元型の（チオール）フォームと比較してより極性の低い，酸化型の（ジスルフィド）フォームをとることができる。アルギニン側鎖の長い脂肪族の部分は構造的および機能的に重要な特徴を構成し得る。また，芳香環を含む側鎖（トリプトファン，チロシン，フェニルアラニン）はイオン－芳香族相互作用または陽イオン－ｐｉ相互作用に寄与し得る。かかる場合において，これらの側鎖を有するアミノ酸を，酸性または非極性グループに属するアミノ酸と置換しても，構造的および機能的には保存的であり得る。プロリン，グリシン，システイン（ジスルフィド・フォーム）等の残基は主鎖の立体構造に直接的な効果を与える可能性があり，しばしば構造的ゆがみなしに置換することはできない。
保存的アミノ酸置換は，以下に示すとおり，側鎖の類似性に基づく特異的置換（レーニンジャ，生化学，改訂第２版，１９７５年刊行，７３乃至７５頁：Ｌ．  Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  ｐｐ７３～７５，  Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９７５））および典型的置換を含む。
　また，保存的アミノ酸置換は，例えば，以下のように天然のアミノ酸をその共通する側鎖の性質に基づいて分けたグループにおいて，あるアミノ酸が属するグループと同じグループに属するアミノ酸への置換が好ましい。
　疎水性（非極性とも言う）アミノ酸：疎水性（非極性）を示すアミノ酸であって，アラニン（「Ａｌａ」または単に「Ａ」とも記す），グリシン（「Ｇｌｙ」または単に「Ｇ」とも記す），バリン（「Ｖａｌ」または単に「Ｖ」とも記す），ロイシン（「Ｌｅｕ」または単に「Ｌ」とも記す），イソロイシン（「Ｉｌｅ」または単に「Ｉ」とも記す），プロリン（「Ｐｒｏ」または単に「Ｐ」とも記す），フェニルアラニン（「Ｐｈｅ」または単に「Ｆ」とも記す），トリプトファン（「Ｔｒｐ」または単に「Ｗ」とも記す），チロシン（「Ｔｙｒ」または単に「Ｙ」とも記す），メチオニン（「Ｍｅｔ」または単に「Ｍ」とも記す）を含む。
　なお，疎水性アミノ酸はさらに以下のグループに分けることもできる。
脂肪族アミノ酸：側鎖に脂肪酸又は水素を有するアミノ酸であって，Ａｌａ，Ｇｌｙ，Ｖａｌ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕを含む。
脂肪族・分岐鎖アミノ酸：側鎖に分岐型脂肪酸を有するアミノ酸であって，Ｖａｌ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕを含む。
芳香族アミノ酸：側鎖に芳香環を有するアミノ酸であって，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，Ｐｈｅを含む。親水性（極性とも言う）アミノ酸：親水性（極性）を示すアミノ酸であって，セリン（「Ｓｅｒ」または単に「Ｓ」とも記す），スレオニン（「Ｔｈｒ」または単に「Ｔ」とも記す），システイン（「Ｃｙｓ」または単に「Ｃ」とも記す），アスパラギン（「Ａｓｎ」または単に「Ｎ」とも記す），グルタミン（「Ｇｌｎ」または単に「Ｑ」とも記す），アスパラギン酸（「Ａｓｐ」または単に「Ｄ」とも記す），グルタミン酸（「Ｇｌｕ」または単に「Ｅ」とも記す），リジン（リシンとも記する。「Ｌｙｓ」または単に「Ｋ」とも記す），アルギニン（「Ａｒｇ」または単に「Ｒ」とも記す），ヒスチジン（「Ｈｉｓ」または単に「Ｈ」とも記す）を含む。
　なお，親水性アミノ酸はさらに以下のグループに分けることもできる。
　酸性アミノ酸：側鎖が酸性を示すアミノ酸であって，Ａｓｐ，Ｇｌｕを含む，
　塩基性アミノ酸：側鎖が塩基性を示すアミノ酸であって，Ｌｙｓ，Ａｒｇ，Ｈｉｓを含む。
　中性アミノ酸：側鎖が中性を示すアミノ酸であって，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ａｓｎ，Ｇｌｎ，Ｃｙｓを含む。
　また，Ｇｌｙ及びＰｒｏについては，「主鎖の方角に影響を与えるアミノ酸」に分けることもでき，側鎖に硫黄分子を含むアミノ酸，Ｃｙｓ及びＭｅｔは，「含硫アミノ酸」に分けることもできる。
　本明細書において，「アミノ酸」は，天然のアミノ酸のみならず，非天然のアミノ酸も含む。非天然のアミノ酸には，例えば，上記記載した天然のアミノ酸がＮ－アルキル化されたＮ－アルキルアミノ酸，ペプチド結合を形成する窒素が分岐した若しくは分岐しない低級（例えば，Ｃ１－Ｃ５の，好ましくは，Ｃ１－Ｃ３，より好ましくはＣ１）のアルキル基で修飾されたもの，が含まれる。Ｎ－アルキルアミノ酸においては，好ましくはＮ－エチルアミノ酸，Ｎ－ブチルアミノ酸又はＮ－メチルアミノ酸であり，さらに好ましくはＮ－メチルアミノ酸である。また，非天然のアミノ酸には，Ｄ型アミノ酸（Ｄ-アミノ酸とも記する），β－アミノ酸，γ－アミノ酸，アミノ酸変異体，アミノ酸誘導体等の化学修飾されたアミノ酸，ノルロイシンやオルニチン等の生体内でタンパク質の構成材料とならないアミノ酸などが含まれる。さらに，天然のアミノ酸の側鎖に官能基がさらに付加された又は別の官能基に置換されたアミノ酸（例えば，側鎖のアリーレン基，アルキレン基等の部分に置換や付加を有するアミノ酸，側鎖のアリーレン基，アルキレン基やアルキル基のＣ数が増加したアミノ酸，側鎖の芳香環に置換を有するアミノ酸や，複素環化や縮合環化したアミノ酸など）が含まれる。
　なお，天然のアミノ酸の側鎖に官能基等の構造が付加または置換等されることで，天然のアミノ酸とは異なる性質を付与することができる。例えば，Ａ４ｐは側鎖にピペリジル基が付加されたアラニンであるが，当該ピペリジル基が付加されたことで，非極性アミノ酸グループに属するアラニンとは異なり，塩基性という極性を示す。
　すなわち，天然のアミノ酸をその共通する側鎖の性質に基づいて分けた，前述のグループに，同様の側鎖の性質を有する非天然アミノ酸を含めることが出来る。例えば，塩基性アミノ酸に属するアルギニンのＮ－メチル化アミノ酸であるＮ－メチルアルギニン（ＭｅＲ）は，非天然アミノ酸であるが，塩基性を示すため，塩基性アミノ酸に分類することができる。このように，あるアミノ酸と同様の側鎖の性質を示す非天然アミノ酸についても，保存的アミノ酸置換の対象として含むことができる。
　非限定的に，非天然のアミノ酸には，Ｎ－メチルアミノ酸，Ａｈｐ，Ｎｌｅ，Ｈｔｙ，Ａｂｕ等を含む。例えば，Ａｈｐ，Ｎｌｅ，Ａｂｕ，Ｈｔｙは疎水性アミノ酸に分けることができ，さらに，Ａｈｐ，Ｎｌｅ，Ａｂｕは脂肪族アミノ酸，Ｈｔｙは芳香族アミノ酸に分けることもできる。なお，Ｎ－メチルアミノ酸については，Ｎ－アルキルアミノ酸として分類することもでき，Ｎ－メチル化されていない元のアミノ酸の側鎖の性質に従い分類することもできる。
　ペプチドＡは，具体的には，配列番号２～配列番号３４のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドであることが好ましい。これらの中では，配列番号３４に記載のアミノ酸配列からなるペプチドであることが好ましい。
　ペプチドＡは，環状ペプチドであることが好ましい。
　ペプチドとは，アミノ酸が複数連続した構造をいい，ポリペプチド，たんぱく質をもその意味に包含する。なお，本願においてアミノ酸とは，天然に存在するアミノ酸（天然アミノ酸）だけではなく，天然に存在しないアミノ酸（非天然アミノ酸）をも包含する。
また，本願においては，合成後環状化により環状部が形成されたペプチド，当該ペプチドをさらに化学修飾して得られるペプチド，ペプチドとペプチドに結合した物質の複合体も，本発明のペプチドに含まれる。
　本明細書において，ペプチドの環状化のためにアミノ酸の一部を改変する場合がある。ペプチドには，そのような一部の改変がなされたアミノ酸を含むペプチドも包含する。環状化のための改変の例として，Ｎ末端に位置するアミノ酸にクロロアセチル基を付加し，ペプチド中のシステイン残基と結合し環状化するような場合がある。クロロアセチル基が付加された各種（天然/非天然）アミノ酸を含むペプチドも本願のペプチドに包含される。
　環状ペプチドとは，ペプチド中の２つのアミノ酸が結合し，その全部または一部が環状になっているものをいう。なお，本願においては，ペプチド中のアミノ酸が架橋構造を形成したもの，ラクタム環形成又はマクロ環化反応により環状構造を形成したものや，ラッソペプチド状構造を有するもの等をも包含される。すなわち，本願において環状ペプチドは，その一部が環状構造を形成するものであればよく，直鎖部を有していてもよい。
　ペプチドは，一般的に生体内において代謝安定性が悪く，またサイズが大きいので細胞膜を透過しづらいという問題がある。そのような課題に対し，ペプチドを環状化させるという方法がとられてきた。ペプチドを環状化すると，プロテアーゼ耐性が向上し代謝安定性が向上し，またコンフォメーション変化にも制限が加わるため，剛直性が増して膜透過性や標的タンパク質との親和性が向上することが示唆されてきた。
　ペプチドの環化については，公知の方法に従って行うことができる。これに限られるものではないが，例えば，ペプチドに2個以上のシステイン残基を含むよう設計することで，翻訳された後，ジスルフィド結合により環状構造を形成できる。また，Ｇｏｔｏらの方法（Ｙ. Ｇｏｔｏ, ｅｔ ａｌ. ＡＣＳ Ｃｈｅｍ. Ｂｉｏｌ. ３ １２０－１２９ （２００８））に従い，遺伝暗号のリプログラミング技術により，Ｎ末端にクロロアセチル基を有するペプチドを合成し，ペプチド中にシステイン残基を配置しておくことによっても環状化できる。これにより，翻訳後に自発的にメルカプト基がクロロアセチル基に求核攻撃し，ペプチドがチオエーテル結合により環状化する。遺伝暗号のリプログラミング技術により，結合して環状を形成するその他のアミノ酸の組合せをペプチド内に配置して環状化してもよい。あるいは，Ｎ末端にシクロアミドを有するペプチドを合成し，ペプチド中にＬ－２－アミノアジピン酸残基を配置し，それらの間で結合することによって，環状化してもよい。このように，公知の環状化方法であれば，特に制限されず用いることができる。
　ペプチドＡのペプチド長
　ペプチドＡのペプチド長（アミド結合の数）は特に限定されないが，総アミノ酸残基（ペプチドに結合した物質又は当該物質とペプチドを結合するリンカーがアミノ酸を含む場合は，それらのアミノ酸は含めない）が，２０残基以内が好ましい。好ましくはアミノ酸が６以上，７以上，８以上，９以上，１０以上，１１以上であり，好ましくはアミノ酸が１９以下，１８以下，１７以下，１６以下，１５以下である。
　ペプチドＡをコードする核酸
　この明細書は，ペプチドＡ（ｃ－Ｍｅｔタンパク質結合ペプチド）をコードする核酸をも記載する。 本明細書において「核酸」は，天然であっても非天然であってもよく，ＤＮＡ，ＲＮＡ，及びこれらのキメラを含むが，これらに限定されない。
　リンカー
　ペプチド複合体に用いられるリンカーは，ペプチド複合体がｃ－Ｍｅｔタンパク質と結合できる限り，その種類や長さは特に限定されない。リンカーの例は，アミノ酸リンカー（ペプチドリンカー），化学リンカー，脂肪酸リンカー，核酸リンカー，糖鎖リンカーなどがあり，例えば化学リンカーとペプチドリンカーなどの複合体であってもよい。化学リンカーとしては，例えば，ＰＥＧ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）リンカーが挙げられる。また，リンカーは，脂肪酸から誘導される二価化学部分を含む脂肪酸リンカーでもよい。アミノ酸（ペプチド）リンカーは，少なくとも１個の任意のアミノ酸を含むリンカーであり，例えば，米国特許第７，２７１，１４９号に記載のような，配列［Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ］ｎ（式中，ｎは１，２，３，４，５または６である）を有するペプチドなどのグリシン－リッチペプチドや，米国特許第５，５２５，４９１号に記載のセリン－リッチペプチドリンカーを用いることができる。それらリンカーは，公知の方法又はそれに準ずる方法でｃ－Ｍｅｔタンパク質結合ペプチドに結合させることができる。例えば，ｃ－Ｍｅｔタンパク質結合ペプチドの末端のＣｙｓ残基にリンカーを結合させることで，リンカーをｃ－Ｍｅｔタンパク質結合ペプチドに結合させることができる。また，ｃ－Ｍｅｔタンパク質結合ペプチドのＣ末端以外に含まれるアミノ酸にリンカーを結合させることもできる。
　リンカーの好ましい例は，ＰＥＧリンカーである。ＰＥＧリンカーは，ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体を含むリンカーである。ＰＥＧリンカーは，アミノ酸を含むものであってもよい。ＰＥＧリンカーは，ＰＥＧ分子単位を８個以上含むものが好ましい。リンカーの具体例は，（１）配列番号３５～４１のいずれかに記載の配列を有するリンカーであるか，（２）配列番号３５～４１のいずれかに記載の配列において１～３個のアミノ酸（アミノ酸はリンカーとして使用可能なアミノ酸であれば特に限定はされないが，例えばＳ,Ｇ及びＫ並びにそれらのアミノ酸のいずれか又は２つ以上）が，置換，欠失，付加又は挿入された配列からなるリンカーである。
　ペプチドＡ，リンカー及びペプチド複合体は，公知の方法（例えば特許第６４２６１０３号公報（特許文献２）），又は公知の方法を適宜修正することで作成できる。
　ｃ－Ｍｅｔタンパク質アゴニスト
　上記したペプチド複合体は，ｃ－Ｍｅｔタンパク質の多量体化により自己リン酸化を促進することを通じて，ＨＧＦ様の機能を有する。よって，上記したペプチド複合体は，ｃ－Ｍｅｔアゴニスト（作動薬）や，ｃ－Ｍｅｔタンパク質アゴニストを含む医薬組成物として有用である。
　医薬組成物
　この明細書は，上記したペプチド複合体と薬学的に許容される担体とを含む，医薬組成物をも提供する。上記したペプチド複合体のうち，ｃ－Ｍｅｔタンパク質アゴニストを含む医薬組成物は，虚血性心疾患，急性肝炎，劇症肝炎，肝硬変，胆道閉鎖症，脂肪肝，急性腎不全，慢性腎不全，糖尿病性腎症，急性肺炎，肺線維症，血管障害，心筋梗塞，拡張型心筋症，皮膚潰瘍，脳梗塞，閉塞性動脈硬化症，胃潰瘍及び筋萎縮性側索硬化症からなる群より選択される疾患の治療又は予防に用いられる。
  本発明に係る医薬組成物は，本発明に係るペプチド複合体を有効成分として含む。ＨＧＦ様の機能を有することから，細胞増殖促進，細胞遊走促進，アポトーシス抑制，形態形成誘導，血管新生，組織や臓器の再生や保護に有用であり，これらが関連する疾患の治療又は予防剤として用いられる。かかる疾患としては，例えば，急性肝炎，劇症肝炎，肝硬変，胆道閉鎖症，脂肪肝，急性腎不全，慢性腎不全，糖尿病性腎症，急性肺炎，肺線維症，血管障害，心筋梗塞，拡張型心筋症，皮膚潰瘍，脳梗塞，閉塞性動脈硬化症，胃潰瘍及び筋萎縮性側索硬化症が挙げられるが，これらに限定されない。
　 上記医薬組成物の投与形態は特に限定されず，経口的投与でも非経口的投与でもよい。非経口的投与としては，例えば，筋肉内注射，静脈内注射，皮下注射等の注射投与，経皮投与，経粘膜投与（経鼻，経口腔，経眼，経肺，経膣，経直腸）投与等が挙げられる。
  医薬組成物中のペプチドは，代謝及び排泄されやすい性質に鑑みて，各種の修飾を行うことができる。例えば，ポリペプチドにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）や糖鎖を付加して血中滞留時間を長くし，抗原性を低下させることができる。また，ポリ乳酸・グリコール（ＰＬＧＡ）などの生体内分解性の高分子化合，多孔性ヒドロキシアパタイト，リポソーム，表面修飾リポソーム，不飽和脂肪酸で調製したエマルジョン，ナノパーティクル，ナノスフェア等を徐放化基剤として用い，これにポリペプチドを内包させてもよい。経皮投与する場合，弱い電流を皮膚表面に流して角質層を透過させることもできる（イオントフォレシス法）。
　 医薬組成物は，有効成分をそのまま用いてもよいし，薬学的に許容できる担体，賦形剤，添加剤等を加えて製剤化してもよい。剤形としては，例えば，液剤（例えば注射剤），分散剤，懸濁剤，錠剤，丸剤，粉末剤，坐剤，散剤，細粒剤，顆粒剤，カプセル剤，シロップ剤，トローチ剤，吸入剤，軟膏剤，点眼剤，点鼻剤，点耳剤，パップ剤等が挙げられる。
  製剤化は，例えば，賦形剤，結合剤，崩壊剤，滑沢剤，溶解剤，溶解補助剤，着色剤，矯味矯臭剤，安定化剤，乳化剤，吸収促進剤，界面活性剤，ｐＨ調整剤，防腐剤，抗酸化剤などを適宜使用し，常法により行うことができる。
　 製剤化に用いられる成分の例としては，精製水，食塩水，リン酸緩衝液，デキストロース，グリセロール，エタノール等薬学的に許容される有機溶剤，動植物油，乳糖，マンニトール，ブドウ糖，ソルビトール，結晶セルロース，ヒドロキシプロピルセルロース，デンプン，コーンスターチ，無水ケイ酸，ケイ酸アルミニウムマグネシウム，コラーゲン，ポリビニルアルコール，ポリビニルピロリドン，カルボキシビニルポリマー，カルボキシメチルセルロースナトリウム，ポリアクリル酸ナトリウム，アルギン酸ナトリウム，水溶性デキストラン，カルボキシメチルスターチナトリウム，ぺクチン，メチルセルロース，エチルセルロース，キサンタンガム，アラビアゴム，トラガント，カゼイン，寒天，ポリエチレングリコール，ジグリセリン，グリセリン，プロピレングリコール，ワセリン，パラフィン，ミリスチン酸オクチルドデシル，ミリスチン酸イソプロピル，高級アルコール，ステアリルアルコール，ステアリン酸，ヒト血清アルブミン，等が挙げられるがこれらに限定されない。
　難吸収性薬物の吸収を改善する吸収促進剤として，ポリオキシエチレンラウリルエーテル類，ラウリル硫酸ナトリウム，サポニン等の界面活性剤；グリココール酸，デオキシコール酸，タウロコール酸等の胆汁酸塩；ＥＤＴＡ，サリチル酸類等のキレート剤；カプロン酸，カプリン酸，ラウリン酸，オレイン酸，リノール酸，混合ミセル等の脂肪酸類；エナミン誘導体，Ｎ－アシルコラーゲンペプチド，Ｎ－アシルアミノ酸，シクロデキストリン類，キトサン類，一酸化窒素供与体等を用いてもよい。
　 丸剤又は錠剤は，糖衣，胃溶性，腸溶性物質で被覆することもできる。注射剤は，注射用蒸留水，生理食塩水，プロピレングリコール，ポリエチレングリコール，植物油，アルコール類等を含むことができる。さらに，湿潤剤，乳化剤，分散剤，安定化剤，溶解剤，溶解補助剤，防腐剤等を加えることができる。
　 本発明の医薬組成物は，上記疾患に有用な他の医薬や治療法と併用投与してもよい。
　 本発明の医薬組成物を哺乳類（例えば，ヒト，マウス，ラット，モルモット，ウサギ，イヌ，ウマ，サル，ブタ，ヒツジ等），特にヒトに投与する場合の投与量は，症状，患者の年齢，性別，体重，感受性差，投与方法，投与間隔，有効成分の種類，製剤の種類によって異なり，特に限定されないが，例えば，３０μｇ～１０００ｍｇ，１００μｇ～５００ｍｇ，１００μｇ～１００ｍｇを1回又は数回に分けて投与することができる。注射投与の場合，患者の体重により，１μｇ／ｋｇ～３０００μｇ／ｋｇ，３μｇ／ｋｇ～１０００μｇ／ｋｇを1回又は数回に分けて投与してもよい。
　治療方法
　この明細書は，対象（例えば哺乳類や患者）に，有効量のペプチド複合体，又は有効量の医薬組成物を投与する工程を含む，上記した各種疾患の治療方法をも提供する。また，この明細書は，上記した医薬組成物の製造における，ペプチドＡ，又は上記したペプチド複合体の使用や，ペプチドＡ，又は上記したペプチド複合体を用いる上記した医薬組成物の製造方法をも記載する。
　培養用培地添加物や培地
　この明細書は，上記したペプチド複合体を含む培養用培地添加物や，ペプチド複合体を含む培養用培地をも提供する。この培養用培地添加物は，哺乳類由来の細胞又は組織を培養するために用いられる。培養する細胞の例としては，これに限定されるものでは無いが，体細胞，生殖細胞や，生体を構成する全ての組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞である多能性幹細胞が挙げられる。多能性幹細胞としては，例えば，ＥＳ細胞，精子幹細胞，多能性生殖幹細胞，胚性生殖細胞，ｉＰＳ細胞，培養線維芽細胞又は骨髄幹細胞由来の細胞が挙げられる。また，それら幹細胞と体細胞との融合細胞であってもよく，ストレスや細胞刺激によって誘導・選抜される多能性幹細胞や，体細胞の核を核移植することによって作成された初期胚を培養することによって樹立した多能性幹細胞であってもよい。また，培養する組織の例としては，細胞から分化された組織や，身体から取り出された組織が挙げられる。例えば，この培養用培地添加物は，再生した組織や臓器移植のための臓器の保護等に使用することが可能である。
　細胞又は組織は，ヒト，サル，チンパンジー等の霊長目由来の細胞又は組織であることが好ましく，より好ましくはヒト由来である。
　培地は，細胞又は組織を培養するための培地であれば特に限定はされないが，ヒトＨＧＦを添加して使用する培地が好ましい。血清培地であってよく，好ましくは無血清培地や低血清培地である。
　培養用培地添加物は，溶液の形態であっても，乾燥した固体（例えば，固形状，粉末状等）の形態であってもよい。溶液の形態である場合には，そのまま培養用の培地として用いてもよいし，溶媒で希釈し，必要に応じて上述した添加剤を加えたものを，培養用の培地として用いてもよい。希釈する際に用いる溶媒としては，例えば，水，緩衝液，生理食塩水，各種細胞や組織培養に用いられる培地等が挙げられ，これらは単独で用いても，２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　培養用培地添加物が乾燥した固体の形態である場合には，例えば，水，緩衝液，生理食塩水，各種細胞や組織培養に用いられる培地等の溶媒に溶解し，必要に応じて上述した添加剤を加えたものを，培養用の培地として用いてもよい。
　細胞又は組織を培養するための培地中，又はこれから得られた細胞用の培地中の本発明のペプチド複合体の含有量は，培養する細胞または組織によって当業者が任意に設定することができるが，例えば，組成物全量又は培地全量に対して，最終濃度として，約０．０１～約１００００ｎｍｏｌ／Ｌ，好ましくは約０．１～約１０００ｎｍｏｌ／Ｌ，より好ましくは約０．５～約１０００ｎｍｏｌ／Ｌ，更に好ましくは約１～約１００ｎｍｏｌ／Ｌであり得る。
　ＤＤＳキャリア
　上記したペプチドＡは，ｃ－Ｍｅｔタンパク質と結合する性質を有する。このため，ペプチドＡやペプチドＡを含むペプチド複合体は，公知のｃ－Ｍｅｔタンパク質へ送達したい物質，例えば薬剤と結合することで，ＤＤＳキャリア（薬剤送達用担体）や，薬剤送達用複合体として機能する。この明細書は，そのようなＤＤＳキャリアや薬剤送達用複合体をも開示する。ペプチドＡやペプチド複合体と，薬剤とは，公知の方法を用いて，結合させることができる。
略語（一般）
オングストローム（単位）としてÅ；
ウシ血清アルブミンとしてＢＳＡ；
ジメチルスルホキシドとしてＤＭＳＯ；
ジメチルホルムアミドとしてＤＭＦ；
Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンとしてＤＩＰＥＡもしくはＤＩＥＡ；
３，６－ジオキサー１，８－オクタン－ジチオールとしてＤＯＤＴ；
ダルベッコ改変イーグル培地としてＤＭＥＭ
５０％効果濃度としてＥＣ５０；
上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）としてＥＧＦ；
９－フルオレニルメチルオキシカルボニルとしてＦｍｏｃ；
ウシ胎児血清としてＦＢＳ；
Ｎ２，Ｎ６－ビス（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｌ－リジンとしてＦｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）－ＯＨ；
グラム（単位）としてｇ；
Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾールー１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロりん酸塩としてＨＡＴＵ；
ＨＧＦ受容体としてＨＧＦＲ；
液体クロマトグラフィー質量分析計としてＬＣ－ＭＳもしくはＬＣ／ＭＳ；
ミリリットル（単位）としてｍＬ；モーラー（単位）としてＭ；マイクロリットル；
（単位）としてμＬ；
ミリモーラー（単位）としてｍＭ；
ミリグラム（単位）としてｍｇ；
アセトニトリルとしてＭｅＣＮ；
分（単位）としてｍｉｎ；
ミリメートル（単位）としてｍｍ；
ナノメートル（単位）としてｎｍ；
腎上皮細胞用基本培地（Ｒｅｎａｌ　Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂａｓａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ）としてＲＥＢＭ；
回転毎分（単位）としてｒｐｍ；
トリフルオロ酢酸としてＴＦＡ；
トリイソプロピルシランとしてＴＩＳ
略語（非天然アミノ酸）
ＭｅＦ　Ｎ－メチル－Ｌ－フェニルアラニン
ＭｅＡ　Ｎ－メチル－Ｌ－アラニン
Ａｈｐ　（Ｓ）－２－アミノヘプタン酸
Ｎｌｅ　Ｌ－ノルロイシン
Ｈｔｙ　（Ｓ）－２－アミノ―４－（４－ヒドロキシフェニル）ブタン酸
Ａｂｕ　（Ｓ）－２アミノブタン酸
ＭｅＣ　Ｎ－メチル－Ｌ－システイン
ＰＥＧ４ｃ　１－アミノ－３，６，９，１２－テトラオキサ－１５－ペンタデカン酸
ＰＥＧ８ｃ　１－アミノ－３，６，９，１２－テトラオキサペンタデカン－１５－オイック酸
ＰＥＧ１２ｃ　１－アミノ－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３，３６－ドデカオキサノナトリアコンタン－３９－オイック酸
ｃＰＥＧ１ｃ　３，３‘－オキシジプロピオン酸
ｃＰＥＧ９ｃ　４，７，１０，１３，１６，１９，２２，２５，２８－ノナオキサヘントリアコンタンジオイック酸
ｃＰＥＧ１７ｃ　４，７，１０，１３，１６，１９，２２，２５，２８，３１，３４，３７，４０，４３，４６，４９，５２－ヘプタデカオキサペンタペンタコンタンジオイック酸
ＯＣＯＰＥＧ１３ＯＣＯ　３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３－ウンデカオキサペンタトリアコンタン－１，３５－ジイルビス（炭酸水素塩）
　化学合成
　以下の実施例における化学合成において使用された全ての原料、ビルディングブロック、試薬、酸、塩基、固相樹脂、溶媒は、市販品をそのまま用いたか、もしくは当業者にて有機化学的手法を用いて合成できるものである。なお、保護基を含むアミノ酸は特記が無い限り市販品をそのまま用いた。
　固相樹脂におけるペプチド鎖の伸長は、それぞれの実施例に記載された樹脂を出発原料とし、通常用いられるペプチドカップリング反応条件とＦｍｏｃ除去反応条件を用いて行った。反応はペプチド自動合成機であるＢｉｏｔａｇｅ社のＳｉｒｏ　Ｉを使用し、製造元のマニュアルに従い行った。使用される一般的なアミノ酸を下記に列挙し、側鎖保護基はカッコ内に示した。
　Ｆｍｏｃ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－ＯＨ；Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ；Ｆｍｏｃ－Ｎ－Ｍｅ－Ｇｌｙ－ＯＨ；Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ；Ｆｍｏｃ－Ｎ－Ｍｅ－Ｐｈｅ－ＯＨ；Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ；Ｆｍｏｃ－Ｎ－Ｍｅ－Ａｌａ－ＯＨ；Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ；Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ；Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨ；Ｆｍｏｃ－ＨｙｄＰｒｏ（ｔＢｕ）－ＯＨ；Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ；Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）－ＯＨ；Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ；Ｆｍｏｃ－Ｎ－Ｍｅ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ。
　得られた粗精製ペプチドの精製方法として、Ｗａｔｅｒｓ社ＡｕｔｏＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ－ＳＱＤ２　ｓｉｎｇｌｅ　ｑｕａｄｒｕｐｌｅ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒで逆相分取ＨＰＬＣを使用し、目的物由来のｍ／ｚイオンをモニタリングしながら溶出した。ＥＳＩ－ｐｏｓｉｔｉｖｅのスキャンモードで得られるマススペクトルと目的物の分子式より計算される多価イオンを含むマススペクトルが使用した質量分析器の誤差範囲で一致しているのを確認した。なお、使用したカラムを含む精製条件はそれぞれの実施例に示した。
化学合成されたペプチドの構造決定は、目的配列に従って用いたアミノ酸と必要に応じて用いたビルディングブロックを考慮し計算された分子量を、質量スペクトル分析法におけるＥＳＩ－ＭＳ（＋）により確認した。なお、”ＥＳＩ－ＭＳ（＋）”とは、正イオンモードで実施したエレクトロスプレーイオン化質量スペクトル分析法を示す。検出された質量は“ｍ／ｚ”単位表記によって報告された。なお、分子量がおおよそ１０００より大きい化合物は、２価イオンまたは３価イオンとして高頻度で検出された。
　ｃ－Ｍｅｔアゴニスト活性を有するペプチドの同定
　ｃ－Ｍｅｔアゴニストペプチドは、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　ＨＧＦ　Ｒ／ｃ－ＭＥＴ　Ｆｃ　Ｃｈｉｍｅｒａ　Ｈｉｓ－ｔａｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ社）をターゲットとし、国際公開ＷＯ２０１４／１１９６００号、国際公開　ＷＯ２０１２／０３３１５４号、又は国際公開　ＷＯ２００７／０６６６２７号に記載されているスクリーニング方法で、同定した。当該ペプチドが実際にｃ－Ｍｅｔアゴニスト活性を持つかどうかを確認する目的で、それらのペプチドを化学合成した。なお、ペプチド２つがリンカーで結合した、ホモダイマーの形（ペプチド複合体）で合成した。合成したペプチド複合体に含まれるペプチド部分のアミノ酸配列を、表１に示し、リンカー配列を表２に示す。また、合成したペプチド複合体（ペプチドとリンカーの組合せ）については表３及び４に示す。
　表１：ペプチド部分のアミノ酸配列
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２：リンカー配列
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３：ペプチド複合体
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４：ペプチド複合体
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　ｃ－Ｍｅｔアゴニスト活性を有するペプチドの化学合成
　　［実施例３－１］
　表３に記載のペプチド複合体については、他に合成実施例が無い限り、以下に記載のペプチド複合体と同様に合成した。なお、表３におけるＥＳＩ－ＭＳ（ｍ／ｚ）は、ＥＳＩ－ＭＳ（＋）観測値を示し、［Ｍ＋ＸＨ］Ｘ＋は、その場合におけるプロトン付加数を（Ｍ＋ＸＨ）Ｘ＋として示したときのＸの値を示す。
 
　ＧＦｓ＿ｃ－Ｍｅｔ＿００１２＿７複合体（ＧＦｓ＿ｃ－Ｍｅｔ＿００１２＿７－ＰＥＧ１２ｃ－Ｋダイマー：表３におけるペプチド複合体Ｎｏ．８）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　ＮｏｖａＰＥＧ　Ｒｉｎｋ　Ａｍｉｄｅ　ｒｅｓｉｎ　（メルク，　０．５３　ｍｍｏｌ／ｇ，　０．００５ｇ）を用い、前述の一般的方法にてＦｍｏｃ基の除去から開始し、目的のペプチドを合成した。その際、Ｂｉｏｔａｇｅ社のＳｉｒｏ　Ｉを固相合成機として使用し、製造元のマニュアルに従って合成を行った。固相樹脂にＦｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）－ＯＨを導入後、両Ｆｍｏｃ基を除去し、Ｌｙｓ上の２つのアミノ基から同時に伸長させることで合成を行った。各残基の導入には樹脂１当量に対し、Ｆｍｏｃ－ＡＡ／　ＨＡＴＵ／　ＤＩＰＥＡ（８．４当量／７．８当量／１６．８当量）を用い、反応を行った。また、Ｆｍｏｃ除去は２０％　ピペリジンのＤＭＦ溶液と２５℃下、５分間反応させた後、溶液を除去後、再度２０％　ピペリジンのＤＭＦ溶液を加え１５分間反応させた。クロロアセチル基の導入は前工程で得られたＦｍｏｃ保護されたペプチドが保持された固相樹脂に対し、前述した方法でα－アミノ基のＦｍｏｃ基を除去したのち、０．３Ｍ　クロロ酢酸のＤＭＦ溶液（８．４当量）、０．２８Ｍ　ＨＡＴＵのＤＭＦ溶液（７．８当量）、１．０５Ｍ　ＤＩＰＥＡのＤＭＦ溶液（１６．８当量）を固相樹脂に加え２５℃下、３０分間振盪を２回繰り返すことにより行った。側鎖の脱保護および固相樹脂からの切り出しは、以下の方法で実施した。まずクロロアセチル基導入工程後に得られた樹脂をＤＭＦで５回と塩化メチレンで３回洗浄した後、減圧下乾燥した。続いて固相樹脂の入った反応容器に、反応剤カクテル－　Ａ（ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＳ／ＤＯＤＴの体積比９２．５：２．５：２．５：２．５の混合物）を加え、２５℃で６０分間振盪した。反応液をフリットより濾過回収した。反応容器に残った固相樹脂は切り出し用カクテルと再度振盪し、フリットより溶液成分を回収、前述の濾液と混合した。この濾液を０℃に冷やした過剰のジエチルエーテル／ヘキサン（１／１）の混合溶媒に加えると、白濁沈殿が生じた。この混合物を遠心分離し（８５００　ｒｐｍ、０℃、３０秒間）、溶液をデカンテーションした。得られた固体を再度０℃に冷やした少量のジエチルエーテル／ヘキサンにて洗浄後、減圧下乾燥させた。得られた固体を次の環化反応に用いた。ペプチドの環化反応はペプチドの終濃度が固相樹脂のモル数を基に２．５ｍＭとなるようにＤＭＳＯに溶解後、１０当量のトリエチルアミンを加えて、２５℃で１６時間振盪した。得られた反応溶液をＥＺ－２　Ｅｌｉｔｅを用いて減圧濃縮した。
　得られた混合物をギルソン社のＡＳＰＥＣ（登録商標）　Ｃ１８カートリッジを用いて固相抽出した。得られた抽出液をＥＺ－２　Ｅｌｉｔｅを用いて減圧濃縮した。
ＬＣ－ＭＳで分析し、目的物のマススペクトルは主たるピークの一つに観測された。
分析条件：保持時間＝１．７3分；カラム：Ｋｉｎｅｔｅｘ（登録商標） ＥＶＯ Ｃ１８ １．７ μｍ ２．１ ｘ ５０ｍｍ, １００Å；移動相：Ａ ＝ ０．０２５％ ＴＦＡ ｉｎ Ｈ２Ｏ、Ｂ ＝ ０．０２５％ ＴＦＡ ｉｎ ＭｅＣＮ；温度：６０ ℃；グラジエント（％ Ｂ ｃｏｎｃ）：２．１０分間かけて５－９５％、その後０．７５分間かけて ９５－９５％；流量：０．６ｍＬ/ｍｉｎ
ＥＳＩ－ＭＳ（＋）　観測値ｍ／ｚ＝　１７２５．０（Ｍ＋３Ｈ）３＋　理論値ｍ/ｚ＝５１７０．９１
　［実施例３－２］
表４に記載のペプチド複合体については、他に合成実施例が無い限り、以下に記載のペプチド複合体と同様に合成した。なお、表４におけるＥＳＩ－ＭＳ（ｍ／ｚ）は、ＥＳＩ－ＭＳ（＋）観測値を示し、［Ｍ＋ＸＨ］Ｘ＋は、その場合におけるプロトン付加数を（Ｍ＋ＸＨ）Ｘ＋として示したときのＸの値を示す。
 
　ＧＦｓ＿ｃ－Ｍｅｔ－００１２複合体（ＧＦｓ＿ｃ－Ｍｅｔ－００１２－ＰＥＧ１２ダイマー；表４におけるペプチド複合体Ｎｏ．１７）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　Ｓｉｅｂｅｒ　ａｍｉｄｅ　ｒｅｓｉｎ　（渡辺化学，　０．４７　ｍｍｏｌ／ｇ，　０．１１ｇ）を用い、前述の一般的方法にてＦｍｏｃ基の除去から開始し、目的のペプチドを合成した。その際、Ｂｉｏｔａｇｅ社のＳｉｒｏ　Ｉを固相合成機として使用し、製造元のマニュアルに従って合成を行った。固相樹脂にＦｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）－ＯＨを導入後、両Ｆｍｏｃ基を除去し、Ｌｙｓの２つのアミノ基から同時に伸長させることで合成を行った。各残基の導入には樹脂１当量に対し、Ｆｍｏｃ－ＡＡ／　ＨＡＴＵ／　ＤＩＰＥＡ（８．４当量／８当量／１６当量）を用い反応を行った。また、Ｆｍｏｃ除去は０．１Ｍ　ＨＯＢｔ含有５％　ピペリジンのＤＭＦ溶液と２５℃下、５分間反応させた後、溶液を除去後、再度０．１Ｍ　ＨＯＢｔ含有５％　ピペリジンのＤＭＦ溶液と再度１５分間反応させた。クロロアセチル基の導入は、前工程で得られたＦｍｏｃ保護されたペプチドが保持された固相樹脂に対し、前述した方法でα－アミノ基のＦｍｏｃ基を除去したのち、０．５Ｍ　クロロ酢酸のＤＭＦ溶液（１０当量）、０．４９Ｍ　ＨＡＴＵのＤＭＦ溶液（９．８当量）、０．５Ｍ　ＤＩＰＥＡのＤＭＦ溶液（１０当量）を固相樹脂に加え室温にて３０分間振盪することにより行った。側鎖の脱保護および固相樹脂からの切り出しは、以下の方法で実施した。まずクロロアセチル基導入工程後に得られた樹脂をＤＭＦで５回と塩化メチレンで３回洗浄した後、減圧下乾燥した。続いて固相樹脂の入った反応容器に、反応剤カクテル－　Ａ（ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＳ／ＤＯＤＴの体積比９２．５：２．５：２．５：２．５の混合物）を加え、２５℃で６０分間振盪した。反応液をフリットより濾過回収した。反応容器に残った固相樹脂は切り出し用カクテルと再度振盪し、フリットより溶液成分を回収、前述の濾液と混合した。この濾液を０℃に冷やした過剰のジエチルエーテル／ヘキサン（１／１）の混合溶媒に加えると、白濁沈殿が生じた。この混合物を遠心分離し（９０００　ｒｐｍ、２　分間）、溶液をデカンテーションした。得られた固体を再度０℃に冷やした少量のジエチルエーテル／ヘキサンにて洗浄後、減圧下乾燥した。得られた固体を次の環化反応に用いた。ペプチドの環化反応はペプチドの終濃度が固相樹脂のモル数を基に１ｍＭとなるようにＤＭＳＯ／アセトニトリル／水（１８／１／１）に溶解後、２０当量のトリエチルアミンを加えて、２５℃で１５時間振盪した。得られた反応溶液をＥＺ－２　Ｅｌｉｔｅを用いて減圧濃縮した。
　得られた混合物は以下の条件を用いて精製した（カラム：Ｗａｔｅｒｓ　ＸＳｅｌｅｃｔ（登録商標）　Ｃ１８　１９　ｘ　１５０ｍｍ；移動相：Ａ　＝　０．１％　ＴＦＡ　ｉｎ　Ｈ２Ｏ，Ｂ　＝　０．１％　ＴＦＡ　ｉｎ　ＭｅＣＮ；温度：４０　℃；グラジエント（％Ｂ　ｃｏｎｃ）：３分間かけて１３－３８％，その後８分間かけて３８－４３％，その後１分間かけて４３－６０％；流量：１７ｍＬ／ｍｉｎ。
目的物の純度は以下の分析条件のＬＣ／ＭＳ（ＵＶ波長２２５ｎｍ）クロマトグラムの面積比から算出し５９．９７％であった。　
　分析条件：保持時間＝５．７５分；カラム：Ｋｉｎｅｔｅｘ（登録商標）　ＥＶＯ　Ｃ１８　２．６　μｍ　２．１　ｘ　１５０ｍｍ，　１００Å；移動相：Ａ　＝　０．０２５％　ＴＦＡ　ｉｎ　Ｈ２Ｏ，Ｂ　＝　０．０２５％　ＴＦＡ　ｉｎ　ＭｅＣＮ；温度：６０　℃；グラジエント（％　Ｂ　ｃｏｎｃ）：７．１５分間かけて２０－６０％，その後０．３０分間かけて　６０－９５％，その後１．５５分間かけて９５－９５％；流量：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
ＥＳＩ－ＭＳ（＋）　観測値ｍ／ｚ＝　１３００．６　（Ｍ＋４Ｈ）４＋　　理論値ｍ/ｚ＝５１９６．５６
　ホスホ－ｃ－Ｍｅｔ　ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイによる本発明のペプチド複合体のｃ－Ｍｅｔアゴニスト活性測定
　本発明のペプチド複合体のｃ－Ｍｅｔの活性化能（ｃ－Ｍｅｔアゴニスト活性）を評価する為に、ｃ－Ｍｅｔのリン酸化を検証した。
　ヒト細胞であるＡ４３１細胞を１０％　ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社）を含むＤＭＥＭ，　ｈｉｇｈ　ｇｌｕｃｏｓｅ，　ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，　ｐｙｒｕｖａｔｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）で培養した。Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ　ｃｅｌｌ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて細胞を剥離後、１ウェルあたり１００００細胞となるように９６穴プレートに播種し、一晩培養した。翌日スタベーションの為０．１％　ＢＳＡ　（シグマアルドリッチ社）を含むＤＭＥＭ，　ｈｉｇｈ　ｇｌｕｃｏｓｅ，　ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，　ｐｙｒｕｖａｔｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）に交換し更に一晩培養した。その後、実施例３で合成したペプチド複合体、又はコントロールとしてＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　ＨＧＦ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ社）を加え、１５分刺激後、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）　ＳｕｒｅＦｉｒｅ（登録商標）　ＵｌｔｒａＴＭ　Ｐｈｏｓｐｈｏ－ｃ－Ｍｅｔ　（Ｔｙｒ１２３４／１２３５）　キット（パーキンエルマー社）に付属するＬｙｓｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒで細胞を溶解した。アッセイはキットのプロトコールに沿って実施し、シグナルの検出にはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）　Ｐａｒａｄｉｇｍ（登録商標）　ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ　ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ　ｒｅａｄｅｒ（モレキュラーデバイスジャパン社）を使用した。
　得られたシグナルをＧｒａｐｈＰａｄ　Ｐｒｉｓｍ（エムデーエフ社）で解析し、ＨＧＦで誘導されるシグナルの最大値を１００％として、５０％以上の活性化を示すものを２、５０％以下の活性化を示すものを１として記載した。その結果を表３に示す。なお、同様にモノマーのペプチドを用いて活性測定を行ったが、ｃ－Ｍｅｔアゴニスト活性は示さなかった。
　また、同様にして、Ｃ５０の値をＨＧＦで誘導されるシグナルの５０％の活性を示すペプチドの濃度としてＧｒａｐｈＰａｄ　Ｐｒｉｓｍで算出した。その結果を表４に示す。なお、本アッセイにおいて、コントロールであるＨＧＦの　ＥＣ５０の値は０．６６ｎＭであった。
　さらに、ペプチド（配列番号３４）とリンカー（配列番号３７）の複合体（ＧＦｓ＿ｃ－Ｍｅｔ－０００１４３３６－ＰＥＧ１３ダイマー；表４における複合体Ｎｏ．４９）について、ｃ－Ｍｅｔアゴニスト活性のグラフを図１に示した。当該ペプチド複合体のＥＣ５０は０．７２　ｎＭであり、ＨＧＦとほぼ変わらないｃ－Ｍｅｔアゴニスト活性を示した。
　これらの結果より、本発明のペプチド複合体は、確かにｃ－Ｍｅｔアゴニスト活性を有することが示された。
　ＨＵＶＥＣ細胞増殖評価
　本発明のペプチド複合体の生物活性を評価する為に細胞増殖誘導活性を検証した。
　正常ヒトさい帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）をＨｕＭｅｄｉａ－ＥＧ２（クラボウ社）を使用して培養した。　Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ　ｃｅｌｌ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて細胞を剥離後　５％　ＦＢＳ　（ＭＢＬ社）を含むＭｅｄｉｕｍ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｓｅｒｕｍ　ｏｒ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒｓ（Ｃｅｌｌ　ｓｙｓｔｅｍｓ社）に再懸濁し、１ウェルあたり１００００細胞となるように９６穴プレートに播種し、一晩培養した。翌日、実施例２で合成したペプチド（配列番号３４）とリンカー（配列番号３７）の複合体（ＧＦｓ＿ｃ－Ｍｅｔ－０００１４３３６－ＰＥＧ１３ダイマー；表４におけるペプチド複合体Ｎｏ．４９）、又はコントロールとしてＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　ＨＧＦ　Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ社）を加え更に２日間培養した。その後培地を除き、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）　Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ試薬（プロメガ社）を用い付属のプロトコールに沿って細胞数を定量した。検出にはＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）　Ｐａｒａｄｉｇｍ（登録商標）　ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ　ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ　ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を使用した。
　得られたシグナル値をＧｒａｐｈＰａｄ　Ｐｒｉｓｍで解析しＥＣ５０を算出した。得られた活性のグラフを図２に示した。結果として、ＨＧＦのＥＣ５０は０．３７　ｎＭ、当該ペプチド複合体のＥＣ５０は０．５５　ｎＭと、本発明のペプチド複合体はＨＧＦとほぼ変わらないｃ－Ｍｅｔアゴニスト活性を示した。
　この結果より、本発明のペプチド複合体は、ヒト細胞の増殖を誘導する活性を有することが示された。
　以下のペプチド複合体を合成した。
　［実施例６－１］
　表１におけるＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．３４に記載のアミノ酸配列を有する環状ペプチドの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　Ｓｉｅｂｅｒ　ａｍｉｄｅ　ｒｅｓｉｎ　（渡辺化学，　０．６５　ｍｍｏｌ／ｇ，　０．３１　ｇ）を用い、前述の一般的方法にてＦｍｏｃ基の除去から開始し、目的のペプチドを合成した。その際、Ｂｉｏｔａｇｅ社のＳｉｒｏ　Ｉを固相合成機として使用し、製造元のマニュアルに従って合成を行った。各残基の導入には樹脂１当量に対し、Ｆｍｏｃ－ＡＡ／　ＨＡＴＵ／　ＤＩＰＥＡ　（３．２当量／３当量／６．３当量）を用い反応を行った。また、Ｆｍｏｃ除去は２０％　ピペリジンのＤＭＦ溶液と２５℃下、５分間反応させた後、溶液を除去後、２０％　ピペリジンのＤＭＦ溶液と再度１５分間反応させた。クロロアセチル基の導入は前工程で得られたＦｍｏｃ保護されたペプチドが保持された固相樹脂に対し、前述した方法でα－アミノ基のＦｍｏｃ基を除去したのち、０．５Ｍ　クロロ酢酸のＤＭＦ溶液（５当量）、０．４９Ｍ　ＨＡＴＵのＤＭＦ溶液（４．９当量）、０．５Ｍ　ＤＩＰＥＡのＤＭＦ溶液（５当量）を固相樹脂に加え室温にて３０分間振盪することにより行った。側鎖の脱保護および固相樹脂からの切り出しは、以下の方法で実施した。まずクロロアセチル基導入工程後に得られた樹脂をＤＭＦで５回と塩化メチレンで３回洗浄した後、減圧下乾燥した。続いて固相樹脂の入った反応容器に、反応剤カクテル－　Ａ（ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＳ／ＤＯＤＴの体積比９２．５：２．５：２．５：２．５の混合物）を加え、２５℃で６０分間振盪した。反応液をフリットより濾過回収した。反応容器に残った固相樹脂は切り出し用カクテルと再度振盪し、フリットより溶液成分を回収、前述の濾液と混合した。この濾液を０℃に冷やした過剰のジエチルエーテル／ヘキサン（１／１）の混合溶媒に加えると白濁沈殿が生じ、この混合物を遠心分離し（９０００ｒｐｍ、２　分間）、溶液をデカンテーションした。得られた固体を再度０℃に冷やした少量のジエチルエーテル／ヘキサンにて洗浄後、減圧下乾燥した。得られた固体を次の環化反応に用いた。ペプチドの環化反応は、ペプチドの終濃度が固相樹脂のモル数を基に２．５ｍＭとなるようにＤＭＳＯ／アセトニトリル／水（１８／１／１）に溶解後、１０当量のトリエチルアミンを加えて、２５℃で４時間振盪した。得られた反応溶液をＥＺ－２　Ｅｌｉｔｅを用いて減圧濃縮した。
　得られた粗生成物は以下の条件を用いて精製し
た（カラム：Ｗａｔｅｒｓ　Ｘｂｒｉｄｇｅ（登録商標）　Ｃ１８　５μｍ　５０　ｘ　１５０ｍｍ；移動相：Ａ　＝　０．１％　ＴＦＡ　ｉｎ　Ｈ２Ｏ，Ｂ　＝　０．１％　ＴＦＡ　ｉｎ　ＭｅＣＮ；温度：４０　℃；グラジエント（％Ｂ　ｃｏｎｃ）：３分間かけて５－３０％，その後８分間かけて３０－３５％，その後１分間かけて３５－６０％；流量：１２０ｍＬ／ｍｉｎ。
　目的物の純度は以下の分析条件のＬＣ／ＭＳ（ＵＶ波長２２５ｎｍ）クロマトグラムの面積比から算出し９６．９０％であった。　
　分析条件：保持時間＝３．８４分；カラム：Ｋｉｎｅｔｅｘ（登録商標）　ＥＶＯ　Ｃ１８　２．６μｍ　２．１　ｘ　１５０ｍｍ，　１００Å；移動相：Ａ　＝　０．０２５％　ＴＦＡ　ｉｎ　Ｈ２Ｏ，Ｂ　＝　０．０２５％　ＴＦＡ　ｉｎ　ＭｅＣＮ；温度：６０　℃；グラジエント（％Ｂ　ｃｏｎｃ）：７．１５分間かけて２０－６０％，その後０．３０分間かけて　６０－９５％，その後１．５５分間かけて９５－９５％；流量：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
ＥＳＩ－ＭＳ（＋）　観測値ｍ／ｚ＝　１０２７．７（Ｍ＋２Ｈ）２＋　
得られた環状ペプチドを、ペプチド複合体の合成に用いた。
　　［実施例６－２］
　　ＧＦｓ＿ｃ－Ｍｅｔ－０００１４３３６（ＧＦｓ＿ｃ－Ｍｅｔ－０００１４３３６－ＰＥＧ１３ダイマー；表４におけるペプチド複合体Ｎｏ．４９）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　ＧＦｓ＿ｃ－Ｍｅｔ－０００１４２３４（８．０ｍｇ、３．５１μｍｏｌ）をＤＭＦ（０．２ｍＬ）に溶かし、ＤＩＰＥＡ（２．３μＬ、１３μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（２３μＬ）及びビス（２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）（３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３－ウンデカオキサペンタトリアコンタン－１，３５－ジイル）ビスカーボネート（１．３８ｍｇ、１．６７μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１４μＬ）を加え２５℃で１６時間攪拌した。
　得られた混合物は以下の条件を用いて精製した（カラム：Ｗａｔｅｒｓ　ＸＳｅｌｅｃｔ（登録商標）　Ｃ１８　１９　ｘ　１５０ｍｍ；移動相：Ａ　＝　０．１％　ＴＦＡ　ｉｎ　Ｈ２Ｏ，Ｂ　＝　０．１％　ＴＦＡ　ｉｎ　ＭｅＣＮ；温度：４０　℃；グラジエント（％Ｂ　ｃｏｎｃ）：３分間かけて１３－３８％，その後８分間かけて３８－４３％，その後１分間かけて４３－６０％；流量：１７ｍＬ／ｍｉｎ。
　目的物の純度は以下の分析条件のＬＣ／ＭＳ（ＵＶ波長２２５　ｎｍ）クロマトグラムの面積比から算出し９６．４２％であった。　
　分析条件：保持時間＝５．０７分；カラム：Ｋｉｎｅｔｅｘ（登録商標）　ＥＶＯ　Ｃ１８　２．６　μｍ　２．１　ｘ　１５０ｍｍ，　１００Å；移動相：Ａ　＝　０．０２５％　ＴＦＡ　ｉｎ　Ｈ２Ｏ，Ｂ　＝　０．０２５％　ＴＦＡ　ｉｎ　ＭｅＣＮ；温度：６０　℃；グラジエント（％Ｂ　ｃｏｎｃ）：７．１５分間かけて２０－６０％，その後０．３０分間かけて　６０－９５％，その後１．５５分間かけて９５－９５％；流量：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
ＥＳＩ－ＭＳ（＋）　観測値ｍ／ｚ＝　１１７７．２（Ｍ＋４Ｈ）４＋　理論値ｍ/ｚ＝４７０３．２５
　［実施例６－３］
　ＧＦｓ＿ｃ－Ｍｅｔ－０００１４３０５（ＧＦｓ＿ｃ－Ｍｅｔ－０００１４３０５－ＰＥＧ１７ダイマー；表４におけるペプチド複合体Ｎｏ．５０）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　実施例６－１にて合成した環状ペプチド（ＧＦｓ＿ｃ－Ｍｅｔ－０００１４２３４）（８．０ｍｇ、３．５１μｍｏｌ）をＤＭＦ（０．２５ｍＬ）に溶かし、トリエチルアミン（２．０μＬ、１４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（２０μＬ）及びビス（２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）４，７，１０，１３，１６，１９，２２，２５，２８，３１，３４，３７，４０，４３，４６，４９，５２－ヘプタデカオキサペンタペンタコンタンジオエート（１．７５ｍｇ、１．６５μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１８μＬ）を加え２５℃で１６時間攪拌した。
　得られた混合物は以下の条件を用いて精製した（カラム：Ｗａｔｅｒｓ　ＸＳｅｌｅｃｔ（登録商標）　Ｃ１８　５　μｍ　１９　ｘ　１５０ｍｍ；移動相：Ａ　＝　０．１％　ＴＦＡ　ｉｎ　Ｈ２Ｏ，Ｂ　＝　０．１％　ＴＦＡ　ｉｎ　ＭｅＣＮ；温度：４０　℃；グラジエント（％Ｂ　ｃｏｎｃ）：３分間かけて１２－３７％，その後８分間かけて３７－４２％，その後１分間かけて４２－６０％；流量：１７ｍＬ／ｍｉｎ。
目的物の純度は以下の分析条件のＬＣ／ＭＳ（ＵＶ波長２２５　ｎｍ）クロマトグラムの面積比から算出し９４．１９％であった。　
分析条件：保持時間＝５．９２分；カラム：Ｋｉｎｅｔｅｘ（登録商標）　ＥＶＯ　Ｃ１８　２．６　μｍ　２．１　ｘ　１５０ｍｍ，　１００Å；移動相：Ａ　＝　０．０２５％　ＴＦＡ　ｉｎ　Ｈ２Ｏ，Ｂ　＝　０．０２５％　ＴＦＡ　ｉｎ　ＭｅＣＮ；温度：６０　℃；グラジエント（％Ｂ　ｃｏｎｃ）：７．１５分間かけて２０－６０％，その後０．３０分間かけて　６０－９５％，その後１．５５分間かけて９５－９５％；流量：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
ＥＳＩ－ＭＳ（＋）　観測値ｍ／ｚ＝　１２３５．３　（Ｍ＋４Ｈ）４＋　理論値ｍ/ｚ＝４９３５．４１
　［実施例６－４］
　ＧＦｓ＿ｃ－Ｍｅｔ－０００１４３１８（ＧＦｓ＿ｃ－Ｍｅｔ－０００１４３１８－ＰＥＧ９ダイマー；表４におけるペプチド複合体Ｎｏ．５１）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　ＧＦｓ＿ｃ－Ｍｅｔ－０００１４２３４（８．０ｍｇ、３．５１μｍｏｌ）をＤＭＦ（０．２５ｍＬ）に溶かし、トリエチルアミン（２．０μＬ、１４μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（２０μＬ）及びビス（２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）４，７，１０，１３，１６，１９，２２，２５，２８－ノナオキサヘントリアコンタンジオエート（１．１７ｍｇ、１．６５μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１２μＬ）を加え２５℃で１６時間攪拌した。
　得られた混合物は以下の条件を用いて精製した（カラム：Ｗａｔｅｒｓ　ＸＳｅｌｅｃｔ（登録商標）　Ｃ１８　１９　ｘ　１５０ｍｍ；移動相：Ａ　＝　０．１％　ＴＦＡ　ｉｎ　Ｈ２Ｏ，Ｂ　＝　０．１％　ＴＦＡ　ｉｎ　ＭｅＣＮ；温度：４０　℃；グラジエント（％Ｂ　ｃｏｎｃ）：３分間かけて１１－３６％，その後８分間かけて３６－４１％，その後１分間かけて４１－６０％；流量：１７ｍＬ／ｍｉｎ。
　目的物の純度は以下の分析条件のＬＣ／ＭＳ（ＵＶ波長２２５　ｎｍ）クロマトグラムの面積比から算出し９４．５６％であった。　
　分析条件：保持時間＝５．０３分；カラム：Ｋｉｎｅｔｅｘ（登録商標）　ＥＶＯ　Ｃ１８　２．６　μｍ　２．１　ｘ　１５０ｍｍ，　１００Å；移動相：Ａ　＝　０．０２５％　ＴＦＡ　ｉｎ　Ｈ２Ｏ，Ｂ　＝　０．０２５％　ＴＦＡ　ｉｎ　ＭｅＣＮ；温度：６０　℃；グラジエント（％Ｂ　ｃｏｎｃ）：７．１５分間かけて２０－６０％，その後０．３０分間かけて　６０－９５％，その後１．５５分間かけて９５－９５％；流量：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
ＥＳＩ－ＭＳ（＋）　観測値ｍ／ｚ＝　１１４７．１（Ｍ＋４Ｈ）４＋　　理論値ｍ/ｚ＝４５８２．２
　Ｔｕｂｅ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ評価
　ヒト近位尿細管上皮細胞（ＲＰＴＥＣ）を　増殖培地（Ｒｅｎａｌ　Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂａｓａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ　（ＲＥＢＭ）　＋　０．５％　ＦＢＳ　＋　２．４　ｍＭ　Ｌ－Ａｌａｎｙｌ－Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ　＋　１０　ｎＭ　Ｔｒｉｉｏｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅ　＋　１０　ｎｇ／ｍＬ　ｒｈ　ＥＧＦ　＋　１００　ｎｇ／ｍＬ　Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ　Ｈｅｍｉｓｕｃｃｉｎａｔｅ　＋　５　μｇ／ｍＬ　ｒｈ　Ｉｎｓｕｌｉｎ　＋　１　μＭ　Ｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ　＋　５　ｕｇ／ｍＬ　Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）（ＡＴＣＣ）で培養した。Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡを用いて細胞を剥離し、アッセイ培地（ＲＥＢＭ　＋　０．５％　ＦＢＳ　＋　２．４　ｍＭ　Ｌ－Ａｌａｎｙｌ－Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ　＋　１０　ｎＭ　Ｔｒｉｉｏｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅ　＋　１００　ｎｇ／ｍＬ　Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ　Ｈｅｍｉｓｕｃｃｉｎａｔｅ　＋　１　μＭ　Ｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ　＋　５　μｇ／ｍＬ　Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ　＋　１．８　ｍＭ　ＣａＣｌ２）に再懸濁した。
　氷上においたＣｅｌｌｍａｔｒｉｘ（登録商標）　Ｔｙｐｅ　Ｉ－Ａ　（新田ゼラチン社）と　濃縮培養液　（新田ゼラチン社）と再構成用緩衝液（新田ゼラチン社）を説明書に従って混合したものにＲＰＴＥＣを再懸濁し、１ウェルあたり２０００００細胞となるように４８ウェルプレートに３００　ｕＬずつ分注した。ＣＯ２インキュベーター内　（３７℃、５％　ＣＯ２）にて６０分間静置することで上記懸濁液をゲル化させた。
　アッセイ培地にＨＧＦを２ｎＭ、ＥＧＦを１．６ｎＭ、もしくは実施例２で合成したペプチド（配列番号３４）とリンカー（配列番号３７）の複合体（ＧＦｓ＿ｃ－Ｍｅｔ－０００１４３３６－ＰＥＧ１３ダイマー；表４におけるペプチド複合体Ｎｏ．４９）を０．０８，０．４，２，　１０ｎＭとなるように加え、前述のとおりゲル化させた懸濁液が添加されている４８ウェルプレートの各ウェルに４００　μＬずつ添加した。ＣＯ２インキュベーター中（３７℃、５％　ＣＯ２）にて静置し、３日毎に培地を交換し培養開始から３日後及び８日後に位相差顕微鏡を用いて管腔形成の有無を観察し評価した。
　その結果を図３及び図４に示す。なお、図３は３日後の結果であり、ａはＭＯＣＫ（無添加）、ｂは１．６ｎＭ　ＥＧＦ、ｃは２ｎＭ　ＨＧＦ、ｄは２ｎＭのペプチド複合体（表４におけるペプチド複合体Ｎｏ．４９）を添加したウェルの観察結果である。また、図４　は８日後の結果であり、ａは　ＭＯＣＫ（無添加）、ｂは２ｎＭ　ＨＧＦ、ｃは０．０８ｎＭ、ｄは０．４ｎＭ、ｅは２ｎＭ、ｆは１０ｎＭの濃度で実施例２で合成したペプチド（配列番号３４）とリンカー（配列番号３７）の複合体（ＧＦｓ＿ｃ－Ｍｅｔ－０００１４３３６－ＰＥＧ１３ダイマー；表４におけるペプチド複合体Ｎｏ．４９）を添加したウェルの観察結果である。
　この結果より、本発明のペプチド複合体はＨＧＦと同じく管腔形成を促進することが示された。また、図４ｆより、管腔形成だけではなく分岐形成も促進されることが示された。管腔形成は細胞の増殖、遊走及びコラーゲン分解等の多機能作用が必要であるため、本発明のペプチド複合体はＨＧＦと同様の生理活性を有することが示された。
　ヒト Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＲＴＫアレイアッセイ
　Ａ４３１細胞を１０％　ＦＢＳ　（Ｇｉｂｃｏ社）を含むＤＭＥＭ，　ｈｉｇｈ　ｇｌｕｃｏｓｅ，　ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，　ｐｙｒｕｖａｔｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）で培養した。Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ　ｃｅｌｌ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて細胞を剥離後、１ウェルあたり１００００００細胞となるように６ウェルプレートに播種し、一晩培養した。
　翌日スタベーションの為、アッセイ培地（０．１％　ＢＳＡ　（Ｓｉｇｍａ社）を含むＤＭＥＭ，　ｈｉｇｈ　ｇｌｕｃｏｓｅ，　ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，　ｐｙｒｕｖａｔｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社））に交換し更に一晩培養した。その後７．８ｎＭのＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　ＨＧＦ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ社）、もしくは２ｎＭの実施例２で合成したペプチド（配列番号３４）とリンカー（配列番号３６）の複合体（ＧＦｓ＿ｃ－Ｍｅｔ－０００１４３３６－ＰＥＧ９ダイマー；表４におけるペプチド複合体Ｎｏ．５１）を加え、１０分刺激後Ｐｒｏｔｅｏｍｅ　Ｐｒｏｆｉｌｅｒ　Ｈｕｍａｎ　Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＲＴＫ　Ａｒｒａｙ　Ｋｉｔ　（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ）　に付属するＬｙｓｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒで細胞を溶解した。その後は当該キットのプロトコールに沿って実施し、ＷｅｓｔｅｒｎＳｕｒｅ（登録商標）　ＰＲＥＭＩＵＭ化学発光基質キット（ＬＩ－ＣＯＲ）化学発光シグナルはＣ－ＤｉＧｉｔ（登録商標）（スクラム社）を用いて検出した。
　その結果を図５に示す。なお、図５（２）の　ａは無添加、ｂはＨＧＦ添加、及びｃはペプチド複合体添加の結果であり、ペプチド複合体添加時及びＨＧＦ添加時において、ＨＧＦ　Ｒのみが特異的にリン酸化された。よって、本発明のペプチド複合体はＨＧＦと同様の特異的リン酸化パターンを有することが示された。
　この発明は，医薬産業や生物工学産業において利用されうる。

Claims (16)

  1. 　ｃ－Ｍｅｔタンパク質と結合するペプチドＡを含むペプチド複合体であって，
    　前記ペプチドＡは，
    　　　Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｖ－Ｓ－Ｘ４－Ｄ－Ｘ５－Ｄ－Ｘ６－Ｐ－Ｒ－Ｗ－Ｘ７－ＭｅＣ（配列番号１）に記載のアミノ酸配列からなるペプチドであるか，又は配列番号１に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が，置換，欠失，付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり，
    　　Ｘ１は，Ｎ－アルキル化されてもよいアミノ酸であり，
    　　Ｘ２は，任意のアミノ酸であり，
    　　Ｘ３は，任意のアミノ酸であり，
    　　Ｘ４は，Ｎ－アルキル化されてもよい疎水性アミノ酸であり，
    　　Ｘ５は，任意のアミノ酸であり，
    　　Ｘ６は，置換を有してもよいアルキル鎖を側鎖に有するアミノ酸又はＳであり，
    　　Ｘ７は，任意のアミノ酸である，
    ペプチド複合体。
  2. 　請求項１に記載のペプチド複合体であって，
    　　Ｘ１は，Ｎ－メチル化されてもよいＡ又はＮ－メチル化されてもよいＦであり，
    　　Ｘ２は，親水性アミノ酸，脂肪族・分岐鎖アミノ酸又は芳香族アミノ酸であり，
    　　Ｘ３は，親水性アミノ酸，脂肪族アミノ酸又は芳香族アミノ酸であり，
    　　Ｘ４は，Ｎ－メチル化されてもよい疎水性アミノ酸であり， 
    　　Ｘ５は，親水性アミノ酸，脂肪族・分岐鎖アミノ酸又はＰであり，
    　　Ｘ７は，親水性アミノ酸又は脂肪族アミノ酸である，
    　ペプチド複合体。
  3. 　請求項１に記載のペプチド複合体であって，
    　　Ｘ１は，Ｎ－メチル化されてもよいＡ又はＮ－メチル化されてもよいＦであり，
    　　Ｘ２は，Ｖ，Ｔ，Ｅ，Ｑ，又はＷであり，
    　　Ｘ３は，Ａ，Ｒ，Ｙ，又はＤであり，
    　　Ｘ４は，メチル化されてもよいＦ又はメチル化されてもよいＬであり，
    　　Ｘ５は，Ｄ，Ｅ，Ｓ，Ｐ又はＶであり，
    　　Ｘ６は，（Ｓ）－２－アミノヘプタン酸（Ａｈｐ），Ｒ，Ｌ－ノルロイシン（Ｎｌｅ），　（Ｓ）－２，７－ジアミノヘプタン酸（Ｈｔｙ），又はＳであり，
    　　Ｘ７は，Ｓ，Ａ，Ｌ－α－アミノブタン酸（Ａｂｕ），Ｄ，Ｑ，又はＶである，
    　ペプチド複合体。
  4. 　請求項１に記載のペプチド複合体であって，
    　前記ペプチド複合体は，
    　　第１のペプチドと，
    　　第２のペプチドと，
    　　第１のペプチド及び第２のペプチドをつなぐリンカーからなり，
    　第１のペプチド及び第２のペプチドの少なくとも一方は，前記ペプチドＡである，ペプチド複合体。
  5. 　請求項４に記載のペプチド複合体であって，
    　第１のペプチド及び第２のペプチドは，同一でも異なってもよく，前記ペプチドＡである，ペプチド複合体。
  6. 　請求項５に記載のペプチド複合体であって，
    　前記ペプチドＡは，
    　　ＭｅＦ－Ｔ－Ａ－Ｖ－Ｓ－ＭｅＦ－Ｄ－Ｅ－Ｄ－Ａｈｐ－Ｐ－Ｒ－Ｗ－Ｓ－ＭｅＣ（配列番号３４）に記載のアミノ酸配列からなるペプチドであるか，又は配列番号３４に記載のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が，置換，欠失，付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり，ｃ－Ｍｅｔタンパク質と結合するペプチドである，ペプチド複合体。
  7. 　請求項６に記載のペプチド複合体であって，前記ペプチドＡは，環状ペプチドである，ペプチド複合体。
  8. 　請求項７に記載のペプチド複合体であって，第１のペプチド及び第２のペプチドは，同一のペプチドＡであり，第１のペプチド及び第２のペプチドのＣ末端が前記リンカーと結合した，ペプチド複合体。
  9. 　請求項８に記載のペプチド複合体であって，前記ペプチドＡは，配列番号２～配列番号３４のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドである，ペプチド複合体。
  10. 　請求項９に記載のペプチド複合体であって，前記リンカーは，ＰＥＧリンカーである，ペプチド複合体。
  11. 　請求項９に記載のペプチド複合体であって，前記リンカーは，配列番号３５～４１のいずれかに記載の配列を有するか，配列番号３５～４１のいずれかに記載の配列において１～３個のアミノ酸が，置換，欠失，付加又は挿入された配列からなるリンカーである，ペプチド複合体。
  12. 　請求項１１に記載のペプチド複合体を含む，ｃ－Ｍｅｔタンパク質アゴニスト。
  13. 　請求項５～１２のいずれか１項に記載のペプチド複合体と薬学的に許容される担体とを含む，医薬組成物。
  14. 　請求項１３に記載の医薬組成物であって，
    　虚血性心疾患，急性肝炎，劇症肝炎，肝硬変，胆道閉鎖症，脂肪肝，急性腎不全，慢性腎不全，糖尿病性腎症，急性肺炎，肺線維症，血管障害，心筋梗塞，拡張型心筋症，皮膚潰瘍，脳梗塞，閉塞性動脈硬化症，胃潰瘍及び筋萎縮性側索硬化症からなる群より選択される疾患の治療又は予防に用いられる，医薬組成物。
  15. 　請求項１～１１のいずれか１項に記載のペプチド複合体を含む培養用培地添加物。
  16. 　請求項１５に記載の培養用培地添加物であって，ヒト由来の細胞又は組織を培養するために用いられる培養用培地添加物。
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