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WO2022114074A1 - 細胞塊の製造方法 - Google Patents

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WO2022114074A1
WO2022114074A1 PCT/JP2021/043257 JP2021043257W WO2022114074A1 WO 2022114074 A1 WO2022114074 A1 WO 2022114074A1 JP 2021043257 W JP2021043257 W JP 2021043257W WO 2022114074 A1 WO2022114074 A1 WO 2022114074A1
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WO
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cells
cell
region
cell mass
culture substrate
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PCT/JP2021/043257
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豪士 久野
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Tosoh Corp
Original Assignee
Tosoh Corp
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Publication date
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Priority to CN202180078445.XA priority patent/CN116472338A/zh
Priority to JP2022565416A priority patent/JPWO2022114074A1/ja
Priority to US18/037,879 priority patent/US20230416690A1/en
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    • C12N2537/10—Cross-linking
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    • C12N2539/10—Coating allowing for selective detachment of cells, e.g. thermoreactive coating

Definitions

  • the present invention is a cell mass containing two or more types of cells including mesenchymal cells and ectoderm-derived cells, wherein the content of the ectoderm-derived cells is high and the content of the cells is low (between).
  • the present invention relates to a method for producing a cell mass capable of efficiently producing a cell mass having at least two sites (which have a high content of foliate cells) and stably transporting the cell mass.
  • organ primordium As a cell source for regenerative medicine, in addition to the method of utilizing pluripotent stem cells such as iPS cells, a method of transplanting a cell mass prepared from epithelial cells and mesenchymal cells called organ primordium has been reported. There is. As a method for producing an organ primordium, a method of arranging two types of cell masses, a cell mass of epithelial cells and a cell mass of mesenchymal cells, adjacent to each other in a collagen gel has been reported (for example, patent). See Document 1). However, in this method, it is necessary to individually prepare the organ primordiums one by one in the gel, and there is a problem that the mass productivity of the organ primordium is poor.
  • epithelial cells and mesenchymal cells are cultured by culturing a mixture of epithelial cells and mesenchymal cells using a U-bottom-shaped cell culture substrate to which cells do not adhere.
  • a method is known in which lineage cells spontaneously form a cell mass in which they are gathered together (see, for example, Patent Document 2).
  • this method is excellent in mass productivity of organ primordium, since the cell mass exists in a floating state, the cell mass is easily moved by the shaking of the medium during the culture work or during the transportation of the organ primordium, and the organ primordium is easily moved. There was a problem that it was easily damaged.
  • An object of the present invention is a cell mass containing two or more types of cells, in which a site having a high content of ectodermal cell-derived cells in a state where the cells are adhered to a substrate and a site having a low content of the cells (between). It is an object of the present invention to provide a method for producing a cell mass capable of efficiently producing a cell mass having at least two sites (which have a high content of foliar cells) and stably transporting the cell mass.
  • the present invention ⁇ 1> A method for producing a cell mass adherently cultured on a cell culture substrate, wherein the cell culture substrate has the following two regions (A) and (B), and the following (1) to (B). 3) A method for producing a cell mass, which comprises a step.
  • a step of preparing a cell suspension containing mesenchymal cells and ectoderm-derived cells (2) A step of contacting the cell suspension prepared in the step (1) with the cell culture substrate and randomly adhering the mesenchymal cells and the ectodermal cell-derived cells to the region (A). A step in which the total number of cells of the mesenchymal cells and the ectodermal cell-derived cells on the contact surface between the cell suspension and the cell culture substrate is 100 to 100,000 cells per unit area. (3) A step of culturing cells adhering to the region (A) to form a cell mass containing the mesenchymal cells and the ectoderm-derived cells.
  • the cell mass has a higher content of the mesenchymal cells than the ectodermal cells and a higher content of the ectodermal cells than the mesenchymal cells.
  • the maximum cross-sectional area in the in-plane direction of the substrate of the site including the site and the content ratio of the mesenchymal cells is higher than that of the ectodermal cells, and the site where the proportion of the ectodermal cells is higher than that of the mesenchymal cells.
  • (4) A step of culturing the cell mass formed in the step (3) to form an organ primordium.
  • A A circular region having cell proliferation and an area of 0.001 to 1 mm 2 .
  • B A region adjacent to the region (A) and having no cell proliferation.
  • the method for producing a cell mass of the present invention is a cell mass containing two or more types of cells including mesenchymal cells and ectodermal cell-derived cells, the site having a high content of ectodermal-derived cells, and the above-mentioned cells.
  • a method for producing a cell mass capable of efficiently producing a cell mass having at least two sites having a low content (high content ratio of mesenchymal cells) and stably transporting the cell mass. be able to.
  • a tissue structure similar to that in the living body is produced by forming a site having a high content of ectoderm-derived cells and a site having a high content of mesenchymal cells.
  • the produced cell mass can be differentiated into a mature state having the ability to regenerate the human body.
  • the present embodiment a mode for carrying out the present invention (hereinafter, simply referred to as “the present embodiment”) will be described in detail.
  • the following embodiments of the present invention are examples for explaining the present invention, and are not intended to limit the present invention to the following contents.
  • the present invention can be appropriately modified and carried out within the scope of the purpose.
  • the "cell mass” refers to a three-dimensional aggregate of cells formed by a collection of a plurality of cells.
  • the “organ primordium” is a cell mass formed from epithelial cells and mesenchymal cells, and indicates a cell mass that can be transplanted into a living body to regenerate tissues and organs.
  • co-culture means that two or more types of cells are mixed and cultured.
  • stimulation responsiveness means that the structure is changed or the degree of hydrophilicity / hydrophobicity is changed by an external stimulus.
  • external stimulus refers to mechanical stimuli such as ultrasonic waves, vibrations, and convection, electromagnetic stimuli such as light, electricity, and magnetism, and thermodynamic stimuli such as heating and cooling. , Excludes those caused by biological reactions such as enzymatic reactions.
  • temperature responsiveness means that the degree of hydrophilicity / hydrophobicity changes depending on the temperature change. Further, the boundary temperature at which the degree of hydrophilicity / hydrophobicity changes is referred to as "response temperature”.
  • cell adhesion indicates the ease of adhesion to a cell culture substrate at a temperature at which cells are cultured.
  • having cell adhesion means that cells can adhere to a substrate or a cell culture substrate directly or via a biological substance at a culture temperature.
  • not having cell adhesion means that cells cannot adhere to the substrate or the cell culture substrate at the culture temperature.
  • cell proliferation means the ease of cell proliferation at the culture temperature
  • having cell proliferation means that the cell becomes a substrate or a cell culture substrate at the culture temperature. It adheres directly or through biogenic substances, indicating that it is capable of further proliferation.
  • not having cell proliferation means that the cells cannot adhere to the substrate or the cell culture substrate at the culture temperature, or they adhere but cannot proliferate.
  • high cell proliferation means that the cells proliferate into more cells when compared in the same culture period.
  • the "living substance” is a substance existing in the body of an organism, but may be a natural substance or an artificially synthesized substance by a gene recombination technique or the like. Further, it may be a substance chemically synthesized based on the biological substance.
  • the substances derived from living organisms are not particularly limited, but may be, for example, nucleic acids, proteins, polysaccharides, which are the basic materials constituting the living body, nucleotides, nucleosides, amino acids, various sugars, lipids, vitamins, and hormones which are the constituents thereof. be.
  • One aspect of the present invention is a method for producing a cell mass adherently cultured on a cell culture substrate, wherein the cell culture substrate has the following two regions (A) and (B), and the following (
  • the present invention relates to a method for producing a cell mass, which comprises the steps 1) to (3).
  • (B) Region adjacent to the region (A) and not having cell proliferation (1)
  • Membrane cells and outside Step of preparing a cell suspension containing embryo leaf-derived cells (2) The cell suspension prepared in the above step (1) is brought into contact with a cell culture substrate, and the mesenchymal cells and ectodermal cells are subjected to the above.
  • the total number of cells of the mesenchymal cells and the ectodermal cell-derived cells on the contact surface between the cell suspension and the cell culture substrate is determined.
  • Step of 100 to 100,000 cells per unit area (3) Step of culturing cells adhering to the region (A) to form a cell mass containing mesenchymal cells and ectodermal cell-derived cells.
  • the cell culture substrate used in the present invention has the following two regions (A) and (B).
  • A An island-like region having cell proliferation and an area of 0.001 to 1 mm 2 .
  • B A region adjacent to the region (A) and having no cell proliferation.
  • the region (A) has cell proliferation.
  • the cell culture substrate of the present invention can culture cells to produce a cell mass. Without cell proliferation, cells cannot be cultured to form cell clumps.
  • the region (A) is also an island-shaped region having an area of 0.001 to 1 mm 2 . Since it is an island-shaped region having an area of 0.001 to 1 mm 2 , when two or more types of cells are adherently cultured, one type of cell can spontaneously aggregate to form a site having a high content ratio. If the area is less than 0.001 mm 2 , cells cannot be uniformly co-cultured in all regions (A). In addition, when the area exceeds 1 mm 2 , when two or more types of cells are co-cultured, all the cells become a uniformly dispersed cell mass, and one type of cells spontaneously aggregates and the content ratio is high. It is not possible to produce a cell mass having.
  • an area of 0.005 to 0.5 mm 2 is preferable, and an area of 0.01 to 0.5 mm 2 is more preferable.
  • An area of 0.015 to 0.25 mm 2 is particularly preferable, and an area of 0.02 to 0.2 mm 2 is most preferable.
  • an area of 0.001 to 0.2 mm 2 is preferable, an area of 0.001 to 0.1 mm 2 is more preferable, an area of 0.001 to 0.05 mm 2 is particularly preferable, and an area of 0 is 0. Most preferably .005 to 0.05 mm 2 .
  • the standard deviation / average area of the area of the region (A) is preferably 80% or less, and preferably 50% or less. More preferably, it is particularly preferably 20% or less, and most preferably 5% or less.
  • the shape of the region (A) is not particularly limited and can be appropriately set according to the shape of the target cell mass, but is closed, for example, consisting of a circle, an ellipse, a polygon, an amorphous straight line or a curved line. The shape and the like can be mentioned.
  • a circle or an ellipse or a polygon is preferable, a circle or an ellipse or a polygon is more preferable, a circle or an ellipse or a square is particularly preferable, and a circle or an ellipse is preferable. Is the most preferable.
  • the region (B) is adjacent to the region (A) and does not have cell proliferation. Since the region is adjacent to the region (A) and does not have cell proliferation, the cells can be grown only in the region (A) when the cells are cultured. When the region (B) is not adjacent to the region (A) or has cell proliferation, when the cells are cultured, the cells spread around the region (A), so that one type of cell Are spontaneously aggregated, and it is not possible to produce a cell mass having a site having a high content ratio. Further, since it is suitable for uniformizing the size and shape of the cell mass produced, it is preferable that the region (B) has not only cell proliferation but also cell adhesion.
  • the shape of the region (B) is not limited except that it is adjacent to the region (A), but since it is suitable for producing a cell mass having a uniform size and shape, it is a boundary with the region (A). It is preferable that the region (B) is adjacent to the length of 20% or more of the line, more preferably 50% or more, particularly preferably 80% or more, and the entire periphery of the region (A) is the region (B). Is most preferable.
  • the area ratio of the region (A) and the region (B) is not particularly limited, but is suitable for increasing the amount of cell mass that can be produced per unit area of the culture medium, and thus the region (A).
  • the area of the substrate is preferably 10% or more, more preferably 30% or more, particularly preferably 50% or more, and most preferably 70% or more. Further, since it is suitable to provide a sufficient distance between the plurality of (A) regions and suppress the fusion of the cell masses of the plurality of (A) regions into a non-uniform shape, (B). )
  • the area of the region is preferably 20% or more, more preferably 40% or more, particularly preferably 60% or more, and most preferably 80% or more of the entire substrate.
  • the cell culture substrate used in the present invention is suitable for forming a cell mass of uniform size, a layer made of a hydrophilic polymer is contained on the surface, and the region (A) is plasma-treated, ultraviolet-treated, or corona. It is preferable that the region is a region in which a part of the layer made of the hydrophilic polymer is decomposed or modified by any one of the discharge treatments or a combination thereof.
  • the region (A) is a plasma-treated region because it is suitable for enhancing the cell adhesion and cell proliferation of the region (A) and forming a cell mass in a short time.
  • cell adhesion is promoted or inhibited only in a part of the region on the cell culture substrate by a photolithography method, an inkjet method, a screen printing method, or the like.
  • a method of coating a substance to be coated can be mentioned.
  • the layer thickness of the layer made of the hydrophilic polymer is preferably 10 nm or more, more preferably 50 nm or more, and further preferably 100 nm or more because the region (B) is suitable for forming a region having no cell adhesion or cell proliferation. It is particularly preferable, and 500 nm or more is most preferable. Further, since the region (A) is suitable for a region having cell adhesion and cell proliferation, the layer thickness is preferably 1000 nm or less, more preferably 500 nm or less, particularly preferably 100 nm or less, and most preferably 50 nm or less.
  • the method for forming the layer with the hydrophilic polymer at least one of a method of forming a chemical bond and a method of physical interaction can be used.
  • the method for forming a chemical bond include a method for forming a reactive functional group such as ultraviolet irradiation, electron beam irradiation, gamma ray irradiation, plasma treatment, and corona treatment. It is also possible to carry out a cross-linking reaction to the surface of the substrate by an organic reaction using ions or radicals as a reaction source.
  • coating, brush coating, dip coating, spin coating, bar coding, sink coating, and spraying using a matrix with excellent compatibility with the target hydrophilic polymer as a coating material It is possible to use techniques such as painting, roll coating, air knife coating, blade coating, gravure coating, microgravia coating, slot die coating and the like.
  • the type of the hydrophilic polymer is not particularly limited, and examples thereof include those having a polar group such as a hydroxy group, an amino group and a polyethylene glycol group, and those having an amphoteric ionic structure such as a betaine structure and a phosphorylcholine group.
  • a hydroxy group, a phosphorylcholine group, or a polyethylene glycol group is preferable, a hydroxy group or a phosphorylcholine group is more preferable, and a phosphorylcholine group is particularly preferable, because the region (B) is suitable for a region having no cell adhesion and cell proliferation. preferable.
  • BIOSURFINE-AWP manufactured by Toyo Gosei Co., Ltd.
  • Lipidure-CM5206 manufactured by NOF CORPORATION
  • the like can be preferably used.
  • the hydrophilic polymer is suitable for suppressing the elution of the hydrophilic polymer from the cell culture substrate and suppressing the influence on the quality due to the contamination of the cell aggregate or the cell mass with the polymer. Therefore, it is preferable that the random copolymer or block polymer has both a hydrophilic monomer unit and a hydrophobic / reactive monomer unit, and the hydrophilic monomer unit and the hydrophobicity are preferable. / It is more preferably a random copolymer having both reactive monomeric units. Further, as for the composition ratio of the copolymer, the hydrophilic monomer unit is 30 wt% or more because it is suitable to make the region (B) a region having no cell adhesion and cell proliferation.
  • the hydrophilic monomer unit is preferably 80 wt% or less, more preferably 50 wt% or less, and particularly preferably 30 wt% or less. Most preferably 10 wt% or less.
  • the hydrophilic monomer unit is not particularly limited except that it is hydrophilic, and for example, 2-dimethylaminoethyl acrylate, 2-dimethylaminoethyl methacrylate, 2-diethylaminoethyl acrylate, and 2-diethylaminoethyl.
  • Those having an amino group such as methacrylate, N- [3- (dimethylamino) propyl] acrylamide; N- (3-sulfopropyl) -N-methacloyloxyethyl-N, N-dimethylammonium betaine, N-methacryloyloxy Those having betaine such as ethyl-N, N-dimethylammonium- ⁇ -N-methylcarboxybetaine; hydroxyethyl acrylate, hydroxyethyl methacrylate, N- (2-hydroxyethyl) acrylamide, polyethylene glycol monoacrylate, polyethylene glycol monomethacrylate.
  • the hydrophobic monomer unit is not particularly limited except that it is hydrophobic, but for example, n-butyl acrylate, n-butyl methacrylate, isobutyl acrylate, isobutyl methacrylate, t-butyl acrylate, and t-butyl.
  • n-hexyl acrylate, n-hexyl methacrylate, n-octyl acrylate, n-octyl methacrylate, n-decyl acrylate, n-decyl methacrylate, n-dodecyl acrylate, n-dodecyl methacrylate, n-tetradecyl acrylate, n- Tetradecyl methacrylate and the like can be mentioned.
  • a UV-reactive monomer unit is preferable because it is possible to immobilize a hydrophilic polymer on a substrate by a short-time treatment, for example, 4-.
  • Examples thereof include azidophenyl acrylate, 4-azidophenyl methacrylate, 2-((4-azidobenzoyl) oxy) ethyl acrylate, 2-((4-azidobenzoyl) oxy) ethyl methacrylate and the like.
  • the cell culture substrate used in the present invention may also have stimulus responsiveness. Since the cell culture substrate has stimulus responsiveness, the cell mass can be detached from the cell culture substrate by an external stimulus, and the cells can be recovered while suppressing damage to the cells.
  • the stimulus responsiveness is not particularly limited as long as the cell mass can be exfoliated by an external stimulus, but may include temperature responsiveness, photoresponsiveness, pH responsiveness, magnetic responsiveness, electric field responsiveness, and mechanical stimulus responsiveness. It can be mentioned, preferably any one of temperature responsiveness, photoresponsiveness, pH responsiveness, mechanical stimulus responsiveness, or a combination thereof, and preferably temperature responsiveness, photoresponsiveness, and mechanical stimulus responsiveness. Any one of the sexes, or a combination thereof, is more preferable, and any one of the temperature responsiveness and the mechanical stimulus responsiveness, or a combination thereof is particularly preferable, and the temperature responsiveness is the most preferable. ..
  • the temperature response is not particularly limited, but the response temperature is preferably 50 ° C. or lower, and 35.
  • the temperature is more preferably 25 ° C or lower, and 25 ° C or lower is particularly preferable, and 15 ° C or lower is the most preferable because it is suitable for suppressing cell detachment during operations such as medium exchange during culturing. preferable.
  • the lower limit of the response temperature is preferably 0 ° C. or higher, more preferably 1 ° C. or higher, and further preferably 3 ° C. or higher.
  • a method for imparting the temperature responsiveness to the cell culture substrate a method of providing a layer made of a temperature responsive polymer on the surface of the substrate is preferable because the cell culture substrate is excellent in mass productivity.
  • the type of polymer is not particularly limited, but is immobilized on the substrate via a block copolymer immobilized on the substrate by a physical action such as a hydrophobic interaction, or a reactive group such as an azido group.
  • a polymer immobilized on the base material by applying the same copolymer or monomer to the base material and performing electron beam polymerization or radical polymerization on the base material can be preferably used.
  • the type of the temperature-responsive polymer is not particularly limited, but the monomer unit for imparting temperature-responsiveness is, for example, a (meth) acrylamide compound such as acrylamide or methacrylamide; N, N-diethylacrylamide, N-Ethylacrylamide, Nn-propylacrylamide, Nn-propylmethacrylate, N-Isopropylacrylamide, N-Isopropylmethacrylamide, N-Cyclopropylacrylamide, N-Cyclopropylmethacrylate, Nt-Butylacrylamide , N-alkyl substituted (meth) acrylamide derivatives such as N-ethoxyethyl acrylamide, N-ethoxyethyl methacrylamide, N-tetrahydrofuruffle acrylamide, N-tetrahydrofuryl methacrylamide; N, N-dimethyl (meth) acrylamide, N, N-dialkyl-substituted (meth
  • N, N-diethylacrylamide, Nn-propylacrylamide, N-isopropylacrylamide, Nn-propylmethacrylate N, N-diethylacrylamide, Nn-propylacrylamide, N-isopropylacrylamide, Nn-propylmethacrylate.
  • N-ethoxyethylacrylamide, N-tetrahydrofurfurylacrylamide, N-tetrahydrofurfurylmethacrylamide are preferred
  • Nn-propylacrylamide, N-isopropylacrylamide are more preferred
  • N-isopropylacrylamide is particularly preferred.
  • the temperature-responsive constituent unit ratio contained in the temperature-responsive polymer is preferably 70 wt% or more, preferably 80 wt%, because it is suitable for rapidly forming a cell mass from a cell mass.
  • the above is more preferable, 90 wt% or more is particularly preferable, and 92 wt% or more is most preferable.
  • the temperature-responsive polymer suppresses the elution of the temperature-responsive polymer from the cell culture substrate, and suppresses the influence on the quality due to the contamination of the cell aggregate or cell mass with the polymer. Since it is suitable, it is preferably a random copolymer or a block polymer having both a temperature-responsive monomer unit and a hydrophobic monomer unit, and a hydrophilic monomer unit and a hydrophobic monomer unit are preferable. More preferably, it is a block copolymer having both sex monomer units. As the hydrophobic monomer unit, the same one as in the case of the above-mentioned hydrophilic polymer can be preferably used.
  • the temperature-responsive polymer may also contain a monomeric unit for controlling the response temperature.
  • a monomeric unit for controlling the response temperature For example, hydrophilic or hydrophobic monomeric units can be mentioned, and the present invention is not particularly limited, and examples thereof include 2-dimethylaminoethyl acrylate, 2-dimethylaminoethyl methacrylate, 2-diethylaminoethyl acrylate, and 2-diethylaminoethyl methacrylate.
  • the molecular weight of the temperature-responsive polymer in the present invention is not particularly limited, but the number average molecular weight is preferably 10 to 1,000,000 and 2000 to 50 because it is suitable for increasing the strength of the temperature-responsive polymer. It is more preferably 10,000 to 300,000, particularly preferably 10,000 to 200,000.
  • the component contained in the temperature-responsive polymer having a number average molecular weight of 5000 or less is 50% or less. Is more preferable, 30% or less is more preferable, 10% or less is particularly preferable, and 5% or less is most preferable. Further, the component having a number average molecular weight of 10,000 or less is preferably 50% or less, more preferably 30% or less, particularly preferably 10% or less, and most preferably 5% or less. Further, the component having a number average molecular weight of 30,000 or less is preferably 50% or less, more preferably 30% or less, particularly preferably 10% or less, and most preferably 5% or less. The content of components having a specific molecular weight or less contained in the block copolymer can be measured by gel permeation chromatography.
  • the hydrophilic / temperature-responsive polymer in the present invention may contain a chain transfer agent, a polymerization initiator, a polymerization inhibitor and the like, if necessary.
  • the chain transfer agent is not particularly limited, and commonly used ones can be preferably used.
  • Examples include Neuc Acid, 2-Cyanopropane-2-yl N-methyl-N- (Pyridine-4-yl) carbamodithioart, and Methyl 2-propionate (4-pyridinyl) carbamodithioart. ..
  • the polymerization initiator is not particularly limited, and generally used ones can be preferably used.
  • azobisisobutyronitrile 1,1'-azobis (cyclohexanecarbonitrile), di-tert.
  • tert-butyl hydroperoxide hydrogen peroxide
  • potassium peroxobisulfate benzoyl peroxide
  • triethylborane diethyl zinc and the like
  • the polymerization inhibitor is not particularly limited, and generally used ones can be preferably used, but hydroquinone, p-methoxyphenol, triphenylfeldadyl, 2,2,6,6-tetramethylpiperidi Nyl-1-oxyl, 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidinyl-1-oxyl and the like can be mentioned.
  • the method for synthesizing the hydrophilic / temperature-responsive polymer in the present invention is not particularly limited, but is published by NTS Co., Ltd., "Radical Polymerization Handbook", p.
  • the living radical polymerization technique according to 161 to 225 (2010) can be used.
  • the layer thickness of the temperature-responsive polymer is preferably 1000 nm or less, more preferably 200 nm or less, particularly preferably 100 nm or less, and particularly preferably 50 nm, because it is suitable for enhancing cell proliferation.
  • the following are the most preferable.
  • the layer thickness of the layer made of a temperature-responsive polymer is preferably 5 nm or more, more preferably 20 nm or more, and further preferably 30 nm. The above is particularly preferable, and 35 nm or more is most preferable.
  • the cell culture substrate may contain a biological substance on the surface, if necessary.
  • the biological substance is not particularly limited, and examples thereof include matrigel, laminin, fibronectin, vitronectin, and collagen.
  • These biological substances may be natural products or artificially synthesized by gene recombination technology or the like, fragments cleaved with restriction enzymes or the like, and synthetic proteins based on these biological substances. Alternatively, it may be a synthetic peptide.
  • Matrigel for example, Matrigel (manufactured by Corning Inc.) or Geltrex (manufactured by Thermo Fisher Scientific) can be preferably used as a commercially available product because of its availability.
  • laminin is not particularly limited, but for example, laminin 511, laminin 521 or laminin 511- are reported to show high activity against ⁇ 6 ⁇ 1 integrin expressed on the surface of human iPS cells. E8 fragments can be used.
  • the laminin may be a natural product, may be artificially synthesized by a genetic recombination technique or the like, or may be a synthetic protein or a synthetic peptide based on the laminin. From the viewpoint of availability, for example, iMatrix-511 (manufactured by Nippi Co., Ltd.) can be preferably used as a commercially available product.
  • the vitronectin may be a natural product, may be artificially synthesized by a gene recombination technique or the like, or may be a synthetic protein or a synthetic peptide based on the vitronectin.
  • vitronectin human plasma-derived (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), synthemax (manufactured by Corning Inc.), and Vitronectin (VTN-N) (manufactured by Thermo Fisher Scientific) are preferably used as commercially available products. be able to.
  • the fibronectin may be a natural product, may be artificially synthesized by a genetic recombination technique or the like, or may be a synthetic protein or a synthetic peptide based on the fibronectin.
  • fibronectin solution human plasma-derived (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and Retronectin (manufactured by Takara Bio Inc.) can be preferably used as commercially available products.
  • the type of collagen is not particularly limited, but for example, typeI collagen and typeIV collagen can be used.
  • the collagen may be a natural product, may be artificially synthesized by a genetic recombination technique or the like, or may be a synthetic peptide based on the collagen. From the viewpoint of availability, for example, collagen I, human (manufactured by Corning Incorporated) or collagen IV, human (manufactured by Corning Incorporated) can be preferably used as a commercially available product.
  • non-covalent bond in the present invention means electrostatic interaction, water-insoluble interaction, hydrogen bond, ⁇ - ⁇ interaction, bipolar-dipolar interaction, London dispersive force, and other van der Waals. It shows a binding force other than a covalent bond derived from an intermolecular force such as an interaction. Immobilization of a biological substance on a block copolymer may be due to a single binding force or may be a combination of a plurality.
  • the method for immobilizing the biological substance is not particularly limited, but for example, a method for immobilizing the cell culture substrate by applying a solution of the biological substance for a predetermined time, or for culturing cells. At that time, a method of adsorbing and immobilizing the biological substance on the cell culture substrate by adding the biological substance to the culture solution can be preferably used.
  • the material of the base material is not particularly limited, but not only substances such as glass and polystyrene usually used for cell culture, but also substances that can be generally morphologically imparted, such as polycarbonate and polyethylene terephthalate.
  • Polymer compounds such as vinylidene fluoride, polytetrafluoroethylene, polyethylene, polypropylene, and polymethylmethacrylate, ceramics, metals, and the like can be used.
  • the material of the base material contains at least one of glass, polystyrene, polycarbonate, polyethylene terephthalate, polyethylene and polypropylene, and at least one of glass, polystyrene, polycarbonate, polyethylene terephthalate and polyethylene.
  • polystyrene, polycarbonate, polyethylene terephthalate, and polyethylene are particularly preferable because they are suitable for increasing flexibility.
  • polystyrene, polycarbonate, and polyethylene terephthalate are most preferable because they are suitable for imparting cell proliferation by patterning by a hydrophilization treatment described later.
  • the shape of the base material is not particularly limited, and may be a flat shape such as a plate or a film, or may be a fiber, a porous particle, a porous film, or a hollow fiber.
  • a container generally used for cell culture or the like (cell culture dish such as Petri dish, flask, plate, bag, etc.) may be used. From the viewpoint of ease of culturing operation, a planar shape such as a plate or a film, or a porous membrane of a flat membrane is preferable.
  • a structure for dividing each cell mass may be provided by providing a partition plate on the base material as needed.
  • the base material is a porous base material and the pore diameter of the porous base material is smaller than that of cells.
  • the pore diameter is preferably 0.01 to 8 ⁇ m, more preferably 0.01 to 3 ⁇ m. It is particularly preferably 0.01 to 1 ⁇ m, and most preferably 0.1 to 1 ⁇ m.
  • the "pore diameter" of the porous substrate indicates the average value of the diameters of the pores of the porous substrate along the in-plane direction of the porous substrate, and indicates the average value of the diameters of the porous substrate along the in-plane direction. It can be calculated by measuring the diameters of 20 or more pores in a laser microscope image, a scanning electron microscope image, or a transmission electron microscope image and obtaining an average value.
  • the porosity is preferably 0.01 to 60%, preferably 0.01 to 20. % Is more preferable, 0.01 to 4% is particularly preferable, and 0.01 to 1.5% is most preferable.
  • the "void ratio" of the porous substrate is a value obtained by dividing the total area of the pore portions by the substrate area with respect to one main surface of the surface of the porous substrate, and is based on the area ratio. It shows how many voids are present on the surface of the material, and is 200 times or more the pore diameter of the pores of the porous substrate in the laser microscope image, scanning electron microscope image, and transmission electron microscope image of the porous substrate. It can be measured by observing a square area with a length as one side.
  • the cell culture substrate of the present invention may be sterilized.
  • the sterilization method is not particularly limited, but high-pressure steam sterilization, UV sterilization, ⁇ -ray sterilization, ethylene oxide gas sterilization and the like can be used.
  • High-pressure steam sterilization, UV sterilization, and ethylene oxide gas sterilization are preferable because they are suitable for suppressing modification of the block copolymer, and UV sterilization or ethylene oxide gas sterilization is preferable because they are suitable for suppressing deformation of the substrate. Is more preferable, and ethylene oxide gas sterilization is particularly preferable because it is excellent in mass productivity.
  • the cells used in the method for producing a cell mass of the present invention are not particularly limited as long as they can adhere to a cell culture substrate.
  • a cell culture substrate for example, in addition to various established cells such as Chinese hamster ovary-derived CHO cells, mouse binding tissue L929, human fetal kidney-derived HEK293 cells, and human cervical cancer-derived HeLa cells, for example, epithelium constituting each tissue and organ in the living body.
  • Cells and endothelial cells contractile skeletal muscle cells, smooth muscle cells, myocardial cells, neurological cells that make up the nervous system, glia cells, fibroblasts, hepatic parenchymal cells involved in biological metabolism, hepatic parenchymal cells and As fat cells and cells having differentiation potential, stem cells existing in various tissues such as mesenchymal stem cells, bone marrow cells, and Muse cells, and stem cells having differentiation pluripotency such as ES cells and iPS cells (pluripotency). Sexual stem cells), cells induced to differentiate from them, and the like can be used. Since it is suitable for forming an organ primordium, it is preferable to use epithelial cells and mesenchymal cells.
  • the method for producing a cell mass of the present invention has the following steps (1) to (3).
  • (1) A step of preparing a cell suspension containing mesenchymal cells and ectoderm-derived cells.
  • (3) A step of culturing cells adhering to the region (A) to form a cell mass containing mesenchymal cells and ectoderm-derived cells.
  • the method for producing a cell mass of the present invention may have the following step (4).
  • a cell suspension containing two types of cells, mesenchymal cells and ectoderm-derived cells is prepared.
  • the method for preparing the cell suspension is not particularly limited, and two or more types of cells previously cultured separately are exfoliated and collected in the form of a single cell by an enzyme or the like, and mixed in a medium at a desired ratio. Since the mixing ratio of two or more types of cells is suitable for forming a site having a high content ratio of one type of cell, the cell ratio when all the cells are mixed in a uniform ratio according to the number of cells is used.
  • the ratio of the number of mesenchymal cells to ectoderm-derived cells in the cell suspension may be 1:10 to 10: 1, may be 1: 5 to 5: 1, or 1: 1 is preferable.
  • the ratio of the number of cells of mesenchymal cells to ectoderm-derived cells in the cell suspension is in these ranges, it is possible to form a site having a high content of mesenchymal cells or ectoderm-derived cells. It becomes suitable.
  • the cell suspension prepared in the step (1) is brought into contact with the cell culture substrate, and the mesenchymal cells and the ectoderm-derived cells are randomly adhered to the region (A).
  • the total number of cells of the mesenchymal cells and the ectoderm-derived cells on the contact surface between the cell suspension and the cell culture substrate is 100 to 100,000 cells per unit area.
  • the number of seeded cells per area of the cell culture substrate in order to adhere a sufficient amount of cells to the region (A) and facilitate the formation of a site having a high content of one type of cells.
  • the total number of cells of mesenchymal cells and ectodermal cells on the contact surface with the substrate is preferably 1000 cells / cm 2 or more, more preferably 3000 cells / cm 2 or more, and particularly preferably 5000 cells / cm 2 or more.
  • 10000 cells / cm 2 or more is most preferable.
  • the number of seeded cells per area of the cell culture substrate (derived from mesenchymal cells and ectodermal leaves on the contact surface between the cell suspension and the cell culture substrate).
  • the total number of cells with cells is preferably 100,000 cells / cm 2 or less, more preferably 80,000 cells / cm 2 or less, particularly preferably 50,000 cells / cm 2 or less, and most preferably 20,000 cells / cm 2 or less.
  • the cells adhered to the region (A) are cultured to form a cell mass containing mesenchymal cells and ectoderm-derived cells.
  • the cell culture substrate having the present application at least two sites, one is a site having a high content of ectoderm-derived cells and the other is a site having a low content of the cells (a high content of mesenchymal cells).
  • the cell mass is a site where the content ratio of ectoderm-derived cells is higher than that of mesenchymal cells (simply, the site where the content ratio of ectoderm-derived cells is higher). Also referred to as.). Further, the cell mass may further contain a site having a higher content of mesenchymal cells than ectoderm-derived cells (also referred to simply as a site having a higher content of mesenchymal cells).
  • the cell mass contains a site having a high content of mesenchymal cells and a site having a high content of ectoderm-derived cells, it is more suitable for the formation of organ primordia, and therefore the content ratio of mesenchymal cells.
  • the ratio of the maximum cross-sectional area in the in-plane direction of the substrate of the site having a large proportion of ectoderm-derived cells to the maximum in-plane cross-sectional area of the substrate of the site having a large proportion of ectoderm-derived cells is 2: 1 to 1:20. It is preferable, 2: 1 to 1:10 is more preferable, 1: 1 to 1: 5 is particularly preferable, and 1: 1 to 1: 2 is most preferable.
  • the cell mass formed in the step (3) is cultured to form an organ primordium.
  • Versican protein which is a marker for dermal papilla cells, may be expressed in the organ primordium.
  • the cell mass has at least two sites, a site consisting of cells adhering to the region (A) and a substantially spherical site adhering to the adhered cell, and the diameter of the substantially spherical site. Is preferably smaller than the diameter of the region (A).
  • the type of medium used in the present invention is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the cells to be cultured.
  • mesenchymal cells and epithelial cells mesenchymal cells and epithelial cells
  • DMEM mesenchymal cells and epithelial cells
  • keratinized cell growth medium manufactured by Takara Bio Inc.
  • the medium mixed with is preferable.
  • the content ratio of one type of cells is high, which means that only specific cells are fluorescent.
  • the content ratio of one type of cells is low when the above ratio is less than 50%. It means that there is.
  • Another aspect of the present invention relates to a hair follicle primordium differentiation induction kit containing a cell culture substrate having the following two regions (A) and (B).
  • the cell culture substrate included in this kit the same substrate as the cell culture substrate used in the method for producing a cell mass can be used.
  • A A circular region having cell proliferation and an area of 0.001 to 1 mm 2 .
  • B A region adjacent to the region (A) and having no cell proliferation.
  • the hair follicle primordium differentiation induction kit may further contain a medium in which mesenchymal cells and epithelial cells are proliferative.
  • a medium in which the mesenchymal cells and epithelial cells have proliferation for example, DMEM (manufactured by Takara Bio Co., Ltd.)
  • the keratinized cell proliferation medium Tikara Bio (Takara Bio).
  • the same medium as the medium) in which (manufactured by Co., Ltd.) is mixed 1: 1 can be used.
  • Example 1 A dish (manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd., trade name: Prime Surface) coated with a hydrophilic polymer having a diameter of 35 mm on the surface is covered with a metal mask (manufactured by Mitani Micronics Co., Ltd.) having a plurality of circular holes having a diameter of 0.2 mm.
  • the mesenchymal cells (marrow-derived mesenchymal stem cells) and epithelial cells (human gingival epithelial cells) cultured in a polystyrene flask are exfoliated with a 0.5 ⁇ TrypLE-EDTA solution and centrifuged to separate the cells from DMEM.
  • DMEM fetal mesenchymal serum
  • keratinized cell proliferation medium manufactured by Takara Bio Co., Ltd.
  • the number of cells was counted, and a cell suspension was prepared by mixing mesenchymal cells and epithelial cells at a ratio of 1: 1.
  • the cell suspension was added to the patterned cell culture substrate, and cells were seeded at 4500 cells / cm 2 .
  • the cells were cultured for 12 days in an environment of 37 ° C. and a CO 2 concentration of 5%.
  • phase-contrast microscopy cells were randomly adhered in the region (A) on the first day of culture, but epithelial cells gathered on the fourth day of culture, and the proportion of epithelial cells was high. It was confirmed that a cell mass having a site was formed. Further, as of the 11th day of culture, the cell mass has at least two sites, a site consisting of cells adhering to the region (A) and a substantially spherical site adhering to the adhered cells.
  • a site consisting of cells adhering to the region (A) and a substantially spherical site adhering to the adhered cells.
  • Example 2 Instead of the metal mask having a plurality of circular holes having a diameter of 0.2 mm in Example 1, a metal mask having a plurality of circular holes having a diameter of 0.5 mm was used. In addition, instead of the cell seeding density of 4500 cells / cm 2 in Example 1, the culture was carried out at a cell seeding density of 15000 cells / cm 2 . At the time of the 1st day of the culture, the cells were randomly adhered in the region (A), but at the 6th day of the culture, the epithelial cells gathered and the cell mass having a site having a large proportion of the epithelial cells was formed. Formed.
  • Example 3 Human dermal papilla cells fluorescently stained with Vybrant DiO Cell-Labeling Solution were used as mesenchymal cells, and the other cells were cultured in the same manner as in Example 1.
  • the cultured cells were observed with a phase difference microscope and a fluorescent microscope.
  • mesenchymal cells and epithelial cells were randomly present in the region (A), and on the seventh day of the culture, the mesenchymal cells were present. It was confirmed that a cell mass was formed including a site having a high proportion of epithelial cells (a site having a low proportion of epithelial cells) and a site having a low proportion of mesenchymal cells (a site having a high proportion of epithelial cells). .. Images of the cell mass taken with a phase-contrast microscope and a fluorescence microscope from the vertical direction of the cell culture substrate were acquired.
  • the maximum cross-sectional area in the in-plane direction of the substrate of the site where the content of mesenchymal cells is high (the site where the proportion of epithelial cells is low) and the site where the proportion of mesenchymal cells is low (the epithelial cells).
  • the ratio of the maximum cross-sectional area in the in-plane direction of the base material (the portion having a large proportion) was 1: 8.5.
  • Example 4 Human dermal papilla cells were used as the mesenchymal cells, and the other cells were cultured in the same manner as in Example 1, and then Human Versican Isoform V0 Antibody (manufactured by R & D SYSTEMS) and Donkey anti-Goat IgG (H + L) Cross-Adosorb. Fluorescent staining of Versican was performed using Antibody, Alexa Fluor 488 (manufactured by Thermo Fisher).
  • the cultured cells were observed with a phase difference microscope and a fluorescent microscope. On the first day of the culture, mesenchymal cells and epithelial cells were randomly present in the region (A), and on the seventh day of the culture, the mesenchymal cells were present. It was confirmed that a cell mass was formed including a site having a high proportion of epithelial cells (a site having a low proportion of epithelial cells) and a site having a low proportion of mesenchymal cells (a site having a high proportion of epithelial cells). In addition, the cultured cells were observed with a fluorescence microscope, and it was confirmed that Versican was expressed.
  • Example 5 Instead of the metal mask having a plurality of circular holes having a diameter of 0.2 mm in Example 1, a metal mask having a plurality of circular holes having a diameter of 0.1 mm was used, and cells having cell adhesion and cell proliferation regions were used. A culture substrate was prepared. Human dermal papilla cells were used as mesenchymal cells, and the other cells were cultured in the same manner as in Example 4.
  • the cultured cells were observed with a phase difference microscope and a fluorescent microscope. On the first day of the culture, mesenchymal cells and epithelial cells were randomly present in the region (A), and on the seventh day of the culture, the mesenchymal cells were present. It was confirmed that a cell mass was formed including a site having a high proportion of epithelial cells (a site having a low proportion of epithelial cells) and a site having a low proportion of mesenchymal cells (a site having a high proportion of epithelial cells). In addition, the cultured cells were observed with a fluorescence microscope, and it was confirmed that Versican was expressed.
  • Example 1 The mesenchymal cells in Example 1 were not used, and instead, only epithelial cells were cultured, and the others were cultured in the same manner as in Example 1. Even when the culture was continued for 12 days, only a cell mass in which all cells were uniformly distributed was formed, and a cell mass having a site having a high proportion of one type of cell was not formed.
  • Example 2 The epithelial cells in Example 1 were not used, and instead, only the mesenchymal cells were cultured, and the others were cultured in the same manner as in Example 1. Even when the culture was continued for 12 days, only a cell mass in which all cells were uniformly distributed was formed, and a cell mass having a site having a high proportion of one type of cell was not formed.
  • Example 3 instead of the metal mask having a plurality of circular holes having a diameter of 0.2 mm in Example 1, a metal mask having a plurality of circular holes having a diameter of 1.5 mm was used. In addition, instead of the cell seeding density of 4500 cells / cm 2 in Example 1, the culture was carried out at a cell seeding density of 15000 cells / cm 2 . Even when the culture was continued for 12 days, only a cell mass in which all cells were uniformly distributed was formed, and a cell mass having a site having a high proportion of one type of cell was not formed.
  • Example 4 Using a cell-non-adherent U-bottom container (manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd., trade name: PrimeSurface 96-well plate) as a cell culture substrate, culture at a cell seeding density of 2400 cells / well in the same manner as in Example 1. Was carried out. It was confirmed that epithelial cells gathered at the 4th day of culture and formed a cell mass having a site having a high proportion of epithelial cells.
  • a cell-non-adherent U-bottom container manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd., trade name: PrimeSurface 96-well plate
  • Example 5 Culturing was performed at a cell seeding density of 150,000 cells / cm 2 instead of the cell seeding density of 4500 cells / cm 2 in Example 1. On the 7th day of culture, cell clusters were formed in a floating state. When the cell culture substrate was shaken with a shaker for 1 hour, the cell mass was damaged and the original shape was not maintained.
  • Region A Region B
  • Region 1 Epithelial cells 2
  • Membranous cells 3
  • Cell clumps 4 Sites with a high content of epithelial cells (low content of mesenchymal cells) and the content of the cells Cell mass having at least two sites with few sites (high content of mesenchymal cells)

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Abstract

細胞培養基材上で接着培養された細胞塊の製造方法であって、細胞培養基材は（Ａ）及び（Ｂ）の２領域と、（１）～（３）工程とを有する製造方法。 （Ａ）細胞増殖性を有し、面積０．００１～１ｍｍ２の島状の領域 （Ｂ）（Ａ）領域に隣接し、細胞増殖性を有しない領域 （１）間葉系細胞と外胚葉由来細胞を含む細胞懸濁液を調製する工程 （２）細胞懸濁液を細胞培養基材と接触させ、上記２種の細胞を（Ａ）領域に無作為に接着させ、細胞懸濁液と細胞培養基材との接触面における、上記２種の細胞の合計細胞数が、１００～１０００００細胞／ｃｍ２である工程 （３）（Ａ）領域に接着した細胞を培養し、上記２種の細胞を含む細胞塊を形成する工程

Description

細胞塊の製造方法
　本発明は、間葉系細胞及び外胚葉由来細胞を含む２種類以上の細胞を含有する細胞塊であって、外胚葉由来細胞の含有量が多い部位と、前記細胞の含有量が少ない（間葉系細胞の含有割合が多い）部位の少なくとも２つの部位を有する細胞塊を効率的に製造可能にすると共に、安定的に輸送が可能な細胞塊の製造方法に関する。
近年、生体外で培養した細胞を人体に移植することによって、損傷した臓器などを再生させる試みが活発に行われている。再生医療の細胞ソースとしては、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞を活用する方法の他に、器官原基と呼ばれる上皮系細胞と間葉系細胞から作製した細胞塊を移植する方法が報告されている。
器官原基の製造方法として、上皮系細胞の細胞塊と、間葉系細胞の細胞塊の２種類の細胞塊をコラーゲンゲル内で隣接するように配置する方法が報告されている（例えば、特許文献１参照。）。しかしながら、この方法では器官原基を１つずつゲル内に個別に作製する必要があり、器官原基の量産性に乏しいという問題があった。
　器官原基を作製する別の方法として、細胞が接着しないＵ底形状の細胞培養基材を用い、上皮系細胞と間葉系細胞を混合した状態で培養することで、上皮系細胞と間葉系細胞がそれぞれ寄り集まった細胞塊を自発的に形成させる方法が知られている（例えば、特許文献２参照。）。この方法は器官原基の量産性に優れるものの、細胞塊が浮遊した状態で存在することから、培養作業中や器官原基の輸送時に、培地の揺動によって細胞塊が動きやすく、器官原基が傷つきやすいという問題があった。
特許第５９３２６７１号公報 特許第６４２５３１９号公報
　本発明の目的は、２種類以上の細胞を含有する細胞塊であって、細胞が基材に接着した状態で外胚葉由来細胞の含有量が多い部位と、前記細胞の含有量が少ない（間葉系細胞の含有割合が多い）部位の少なくとも２つの部位を有する細胞塊を効率的に製造可能にすると共に、安定的に輸送が可能な細胞塊の製造方法を提供することにある。
　本発明者らは、以上の点を鑑み鋭意研究を重ねた結果、細胞接着領域がパターニングされた細胞培養基材上で２種類以上の細胞を接着培養することによって上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
＜１＞細胞培養基材上で接着培養された細胞塊の製造方法であって、前記細胞培養基材は下記（Ａ）及び（Ｂ）の２つの領域を有し、下記（１）～（３）工程を有することを特徴とする細胞塊の製造方法。
（Ａ）細胞増殖性を有し、面積０．００１～１ｍｍ２の島状の領域。
（Ｂ）前記（Ａ）領域に隣接し、細胞増殖性を有しない領域。
（１）間葉系細胞と外胚葉由来細胞を含有する細胞懸濁液を調製する工程。
（２）前記（１）工程で調製された細胞懸濁液を前記細胞培養基材と接触させ、前記間葉系細胞と前記外胚葉由来細胞を前記（Ａ）領域に無作為に接着させる工程であって、前記細胞懸濁液と前記細胞培養基材との接触面における、前記間葉系細胞と前記外胚葉由来細胞との合計細胞数が、単位面積当たり１００～１０００００細胞である工程。
（３）前記（Ａ）領域に接着した細胞を培養し、前記間葉系細胞と前記外胚葉由来細胞とを含む細胞塊を形成する工程。
＜２＞前記細胞懸濁液中の、前記間葉系細胞と前記外胚葉由来細胞との細胞数の比が１：１０～１０：１である、＜１＞に記載の製造方法。
＜３＞前記（３）工程において、前記細胞塊が、前記外胚葉由来細胞より前記間葉系細胞の含有割合が多い部位と、前記間葉系細胞より前記外胚葉由来細胞の含有割合が多い部位とを含み、前記外胚葉由来細胞より前記間葉系細胞の含有割合が多い部位の基材面内方向の最大断面積と、前記間葉系細胞より前記外胚葉由来細胞の割合が多い部位の基材面内方向の最大断面積との比が、２：１～１：２０であることを特徴とする＜１＞又は＜２＞に記載の細胞塊の製造方法。
＜４＞下記（４）工程をさらに有することを特徴とする請求項＜１＞～＜３＞のいずれかに記載の細胞塊の製造方法。
（４）前記（３）工程で形成した前記細胞塊を培養し、器官原基を形成する工程。
＜５＞前記器官原基にＶｅｒｓｉｃａｎが存在していることを特徴とする、＜４＞に記載の細胞塊の製造方法。
＜６＞下記（Ａ）及び（Ｂ）の２つの領域を有する細胞培養基材を含む、毛包原基の分化誘導キット。
（Ａ）細胞増殖性を有し、面積０．００１～１ｍｍ２の円形の領域。
（Ｂ）前記（Ａ）領域に隣接し、細胞増殖性を有しない領域。
＜７＞間葉系細胞及び上皮系細胞が増殖性を有する培地を更に含む、＜６＞に記載の毛包原基の分化誘導キット。
　本発明の細胞塊の製造方法は、間葉系細胞及び外胚葉由来細胞を含む２種類以上の細胞を含有する細胞塊であって、外胚葉由来細胞の含有量が多い部位と、前記細胞の含有量が少ない（間葉系細胞の含有割合が多い）部位の少なくとも２つの部位を有する細胞塊を効率的に製造可能にすると共に、安定的に輸送が可能な細胞塊の製造方法を提供することができる。
更に、本発明の細胞塊の製造方法は、外胚葉由来細胞の含有割合が多い部位及び間葉系細胞の含有割合が多い部位を形成することにより、生体内と同じような組織構造が生まれ、製造した細胞塊が人体再生能を有する成熟状態に分化が可能となる。
本発明の細胞塊の製造方法を示す模式図。 実施例１の培養１日目における細胞塊の位相差顕微鏡画像。 実施例１の培養６日目における細胞塊の位相差顕微鏡画像。 実施例１の培養１１日目における細胞塊の位相差顕微鏡画像。 実施例３の培養１日目における細胞塊の位相差顕微鏡画像。 実施例３の培養１日目における細胞塊の蛍光顕微鏡画像。 実施例３の培養７日目における細胞塊の位相差顕微鏡画像。 実施例３の培養７日目における細胞塊の蛍光顕微鏡画像。 実施例４の培養７日目における細胞塊の位相差顕微鏡画像。 実施例４の培養７日目における細胞塊の蛍光顕微鏡画像。 実施例５の培養７日目における細胞塊の位相差顕微鏡画像。 実施例５の培養７日目における細胞塊の蛍光顕微鏡画像。 比較例４の培養６日目における細胞塊の位相差顕微鏡画像。
　以下、本発明を実施するための形態（以下、単に「本実施の形態」という。）について詳細に説明する。以下の本実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明を以下の内容に限定する趣旨ではない。本発明は、その趣旨の範囲内で適宜に変形して実施できる。
　本明細書において、「細胞塊」とは、複数の細胞が集まって形成される細胞の三次元凝集塊を示す。また、「器官原基」とは、上皮系細胞と間葉系細胞から形成される細胞塊で、生体に移植することで組織や臓器の再生が可能となる細胞塊を示す。
　また、本明細において、「共培養」とは、２種類以上の細胞を混合して培養することを示す。
　また、本明細書において、「刺激応答性」とは、外部刺激によって構造が変化又は親水性／疎水性の程度が変化することを示す。ここで、本明細書において「外部刺激」とは、超音波や振動、対流等の力学的刺激、光や電気、磁気等の電磁気学的刺激、加温や冷却等の熱力学的刺激を示し、酵素反応等の生物反応によるものを除く。
　また、本明細書において、「温度応答性」とは、温度変化によって親水性／疎水性の程度が変化することを示す。さらに、親水性／疎水性の程度が変化する境界温度を「応答温度」と表記する。
　また、本明細書において、「細胞接着性」とは、細胞を培養する温度における細胞培養基材への接着しやすさを示す。「細胞接着性を有する」とは、細胞が培養温度において基材又は細胞培養基材に直接又は生体由来物質を介して接着可能であることを示す。また、「細胞接着性を有しない」とは、培養温度において細胞が基材又は細胞培養基材に接着できないことを示す。
　また、本明細書において、「細胞増殖性」とは、培養温度における細胞の増殖しやすさを示し、「細胞増殖性を有する」とは、細胞が培養温度において基材又は細胞培養基材に直接又は生体由来物質を介して接着し、さらに増殖可能であることを示す。また、「細胞増殖性を有しない」とは、培養温度において細胞が基材又は細胞培養基材に接着できないか、又は、接着はするが増殖できないことを示す。さらに、「細胞増殖性が高い」とは、同一の培養期間で比較した際により多くの細胞へと増殖することを示す。
　また、本明細書において、「生体由来物質」とは、生物の体内に存在する物質であるが、天然物であってもよく、遺伝子組み換え技術等で人工的に合成したものであってもよく、また、前記生体由来物質をベースとして化学的に合成した物質であっても良い。生体由来物質に特に限定はないが、例えば、生体を構成する基本材料である核酸、タンパク質、多糖や、これらの構成要素であるヌクレオチドやヌクレオシド、アミノ酸、各種の糖、あるいは脂質やビタミン、ホルモンである。
　本発明の一側面は、細胞培養基材上で接着培養された細胞塊の製造方法であって、前記細胞培養基材は下記（Ａ）及び（Ｂ）の２つの領域を有し、下記（１）～（３）工程を有することを特徴とする細胞塊の製造方法に関する。
（Ａ）細胞増殖性を有し、面積０．００１～１ｍｍ２の島状の領域
（Ｂ）前記（Ａ）領域に隣接し、細胞増殖性を有しない領域
（１）間葉系細胞と外胚葉由来細胞を含有する細胞懸濁液を調製する工程
（２）前記（１）工程で調製された細胞懸濁液を細胞培養基材と接触させ、間葉系細胞と外胚葉由来細胞を前記（Ａ）領域に無作為に接着させる工程であって、前記細胞懸濁液と前記細胞培養基材との接触面における、前記間葉系細胞と前記外胚葉由来細胞との合計細胞数が、単位面積当たり１００～１０００００細胞である工程
（３）前記（Ａ）領域に接着した細胞を培養し、間葉系細胞と外胚葉由来細胞とを含む細胞塊を形成する工程
　本発明で用いる細胞培養基材は、下記（Ａ）及び（Ｂ）の２つの領域を有する。
（Ａ）細胞増殖性を有し、面積０．００１～１ｍｍ２の島状の領域。
（Ｂ）前記（Ａ）領域に隣接し、細胞増殖性を有しない領域。
　前記（Ａ）領域は、細胞増殖性を有する。細胞増殖性を有することによって、本発明の細胞培養基材は細胞を培養して細胞塊を製造することができる。細胞増殖性を有しない場合、細胞を培養して細胞塊を形成することができない。
　（Ａ）領域はまた、面積０．００１～１ｍｍ２の島状の領域である。面積０．００１～１ｍｍ２の島状の領域であることにより、２種類以上の細胞を接着培養した際に、１種類の細胞が自発的に集合し、その含有割合が多い部位を形成できる。面積０．００１ｍｍ２未満である場合、全ての（Ａ）領域で均一に細胞を共培養することができない。また、面積１ｍｍ２を超える場合、２種類以上の細胞を共培養した際に、全ての細胞が均一に分散した細胞塊となり、１種類の細胞が自発的に集合し、その含有割合が多い部位を有する細胞塊を製造することができない。また、器官原基等の人体再生能を有する細胞塊を形成するのに好適であることから、面積０．００５～０．５ｍｍ２が好ましく、面積０．０１～０．５ｍｍ２がさらに好ましく、面積０．０１５～０．２５ｍｍ２が特に好ましく、面積０．０２～０．２ｍｍ２が最も好ましい。また、毛包原基の培養においては面積０．００１～０．２ｍｍ２が好ましく、面積０．００１～０．１ｍｍ２がさらに好ましく、面積０．００１～０．０５ｍｍ２が特に好ましく、面積０．００５～０．０５ｍｍ２が最も好ましい。
　また、均一なサイズ及び形状の細胞塊を製造するのに好適であることから、（Ａ）領域の面積の標準偏差／平均面積が８０％以下であることが好ましく、５０％以下であることがさらに好ましく、２０％以下であることが特に好ましく、５％以下であることが最も好ましい。前記（Ａ）領域の形状としては特に限定はなく、目的とする細胞塊の形状に応じて適宜設定可能であるが、例えば、円や楕円、多角形、不定形の直線又は曲線からなる閉じた形状等を挙げることができる。また、球に近い形状の細胞塊を製造するのに好適であることから、円又は楕円、多角形が好ましく、円又は楕円、長方形がさらに好ましく、円又は楕円、正方形が特に好ましく、円又は楕円が最も好ましい。
　前記（Ｂ）領域は、前記（Ａ）領域に隣接し、細胞増殖性を有しない。（Ａ）領域に隣接し、細胞増殖性を有しない領域であることにより、細胞を培養した際に、（Ａ）領域のみに細胞を増殖させることができる。（Ｂ）領域が（Ａ）領域に隣接していないか、又は細胞増殖性を有する場合、細胞を培養した際に、（Ａ）領域の周囲にも細胞が広がっていくため、１種類の細胞が自発的に集合し、その含有割合が多い部位を有する細胞塊を製造することができない。また、製造される細胞塊のサイズ及び形状を均一化するのに好適であることから、（Ｂ）領域が細胞増殖性だけでなく細胞接着性も有しないものであることが好ましい。
　（Ｂ）領域の形状としては、（Ａ）領域に隣接すること以外に限定はないが、均一なサイズ及び形状の細胞塊を製造するのに好適であることから、（Ａ）領域との境界線の２０％以上の長さに（Ｂ）領域が隣接していることが好ましく、５０％以上がさらに好ましく、８０％以上が特に好ましく、（Ａ）領域の周囲が全て（Ｂ）領域であることが最も好ましい。
　（Ａ）領域及び（Ｂ）領域の面積比としては、特に限定はないが、培養基材の単位面積当たりに製造可能な細胞塊の量を高めるのに好適であることから、（Ａ）領域の面積が基材全体の１０％以上であることが好ましく、３０％以上がさらに好ましく、５０％以上が特に好ましく、７０％以上が最も好ましい。また、複数の（Ａ）領域の間に十分な距離を設け、複数の（Ａ）領域の細胞塊が融合して不均一な形状となることを抑制するのに好適であることから、（Ｂ）領域の面積が基材全体の２０％以上であることが好ましく、４０％以上がさらに好ましく、６０％以上が特に好ましく、８０％以上が最も好ましい。
　本発明で用いる細胞培養基材は、均一サイズの細胞塊を形成するのに好適であることから、親水性高分子による層を表面に含有し、（Ａ）領域がプラズマ処理、紫外線処理、コロナ放電処理のいずれか、またはこれらの組み合わせによって前記親水性高分子による層の一部を分解又は改質した領域であることが好ましい。細胞培養基材が親水性高分子による層を表面に有することにより、（Ｂ）領域における基材－細胞間接着に寄与するタンパク質の吸着を抑制し、細胞接着性又は細胞増殖性を有しない領域とすることができる。また、親水性高分子による層の一部が分解又は改質されていることで、（Ａ）領域に細胞接着性又は細胞増殖性を付与することができる。また、前記（Ａ）領域の細胞接着性及び細胞増殖性を高め、短時間で細胞塊を形成するのに好適のため、（Ａ）領域がプラズマ処理領域であることがさらに好ましい。
　また、本発明で用いる細胞培養基材の別の作製方法としては、フォトリソグラフィー法やインクジェット法、スクリーン印刷法等により、細胞培養基材上の一部の領域のみに細胞接着性を促進又は阻害する物質を被覆する方法を挙げることができる。
　前記親水性高分子による層の層厚は、（Ｂ）領域を細胞接着性又は細胞増殖性を有しない領域とするのに好適のため、１０ｎｍ以上が好ましく、５０ｎｍ以上がさらに好ましく、１００ｎｍ以上が特に好ましく、５００ｎｍ以上が最も好ましい。また、（Ａ）領域を細胞接着性及び細胞増殖性を有する領域とするのに好適のため、層厚１０００ｎｍ以下が好ましく、５００ｎｍ以下がさらに好ましく、１００ｎｍ以下が特に好ましく、５０ｎｍ以下が最も好ましい。
　前記親水性高分子による層の形成方法としては、化学的な結合を形成させる方法、及び物理的な相互作用による方法の内、少なくとも一つを用いて行うことができる。化学的な結合を形成させる方法としては、紫外線照射、電子線照射、ガンマ線照射、プラズマ処理、コロナ処理等の反応性官能基を形成させる手法が挙げられる。また、イオンやラジカルを反応源とした有機反応による基材表面への架橋反応も可能である。物理的な相互作用による方法としては、対象とする親水性高分子との相溶性に優れたマトリクスを塗材とした、塗布、はけ塗り、ディップコーティング、スピンコーティング、バーコーディング、流し塗り、スプレー塗装、ロール塗装、エアーナイフコーティング、ブレードコーティング、グラビアコーティング、マイクログラビアコーティング、スロットダイコーティング等の手法を用いることが可能である。
　前記親水性高分子の種類としては特に限定はないが、ヒドロキシ基、アミノ基、ポリエチレングリコール基等の極性基を有するもの、ベタイン構造、ホスホリルコリン基等の両性イオン構造を有するものが挙げられる。（Ｂ）領域を細胞接着性及び細胞増殖性を有しない領域とするのに好適のため、ヒドロキシ基、ホスホリルコリン基、又はポリエチレングリコール基が好ましく、ヒドロキシ基又はホスホリルコリン基がさらに好ましく、ホスホリルコリン基が特に好ましい。市販品としては例えば、ＢＩＯＳＵＲＦＩＮＥ－ＡＷＰ（東洋合成（株）製）、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ－ＣＭ５２０６（日油（株）製）等を好適に用いることができる。
　前記親水性高分子は、細胞培養基材から親水性高分子が溶出するのを抑制し、細胞凝集体や細胞塊に高分子が混入することによる品質への影響を抑制するのに好適であることから、親水性の単量体単位と疎水性／反応性の単量体単位の両方を有するランダム共重合体又はブロック共重合体であることが好ましく、親水性の単量体単位と疎水性／反応性の単量体単位の両方を有するランダム共重合体であることがさらに好ましい。また、前記共重合体の組成比としては、（Ｂ）領域を細胞接着性及び細胞増殖性を有しない領域とするのに好適のため、親水性の単量体単位が３０ｗｔ％以上であることが好ましく、４０ｗｔ％以上がさらに好ましく、５０ｗｔ％以上が特に好ましく、６０ｗｔ％以上が最も好ましい。さらに、親水性高分子が溶出するのを抑制するのに好適のため、親水性の単量体単位が８０ｗｔ％以下であることが好ましく、５０ｗｔ％以下がさらに好ましく、３０ｗｔ％以下が特に好ましく、１０ｗｔ％以下が最も好ましい。
　前記親水性の単量体単位としては、親水性であること以外に特に限定はないが、例えば、２－ジメチルアミノエチルアクリレート、２－ジメチルアミノエチルメタクリレート、２－ジエチルアミノエチルアクリレート、２－ジエチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ－［３－（ジメチルアミノ）プロピル］アクリルアミド等のアミノ基を有するもの；Ｎ－（３－スルホプロピル）－Ｎ－メタクロイルオキシエチル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムベタイン、Ｎ－メタクリロイルオキシエチル－Ｎ、Ｎ－ジメチルアンモニウム－α－Ｎ－メチルカルボキシベタイン等のベタインを有するもの；ヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）アクリルアミド、ポリエチレングリコールモノアクリレート、ポリエチレングリコールモノメタクリレート、ポリプロピレングリコールモノアクリレート、ポリプロピレングリコールモノメタクリレート、メトキシポリエチレングリコールモノアクリレート、メトキシポリエチレングリコールモノメタクリレート、ジエチレングリコールモノメチルエーテルアクリレート、ジエチレングリコールモノメチルエーテルメタクリレート、ジエチレングリコールモノエチルエーテルアクリレート、ジエチレングリコールモノエチルエーテルメタクリレート、２－メトキシエチルアクリレート、２－メトキシエチルメタクリレート、２－エトキシエチルアクリレート、２－エトキシエチルメタクリレート、３－ブトキシエチルアクリレート、３－ブトキシエチルメタクリレート、３－ブトキシエチルアクリルアミド、フルフリルアクリレート、フルフリルメタクリレート、テトラヒドロフルフリルアクリレート、テトラヒドロフルフリルメタクリレート等のポリエチレングリコール基、メトキシエチル基を有するもの；メトキシメチルアクリレート、メトキシメチルメタクリレート、２－エトキシメチルアクリレート、２－エトキシメチルメタクリレート、３－ブトキシメチルアクリレート、３－ブトキシメチルメタクリレート、３－ブトキシメチルアクリルアミド等のアクリレート基を有するもの；２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２－アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、３－（メタ）アクリロイルオキシプロピルホスホリルコリン、４－（メタ）アクリロイルオキシブチルホスホリルコリン、６－（メタ）アクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、１０－（メタ）アクリロイルオキシデシルホスホリルコリン、ω－（メタ）アクリロイル（ポリ）オキシエチレンホスホリルコリン、２－アクリルアミドエチルホスホリルコリン、３－アクリルアミドプロピルホスホリルコリン、４－アクリルアミドブチルホスホリルコリン、６－アクリルアミドヘキシルホスホリルコリン、１０－アクリルアミドデシルホスホリルコリン、ω－（メタ）アクリルアミド（ポリ）オキシエチレンホスホリルコリン等のホスホリルコリン基を有するものを挙げることができる。
　前記疎水性の単量体単位としては、疎水性であること以外に特に限定はないが、例えば、ｎ－ブチルアクリレート、ｎ－ブチルメタクリレート、イソブチルアクリレート、イソブチルメタクリレート、ｔ－ブチルアクリレート、ｔ－ブチルメタクリレート、ｎ－ヘキシルアクリレート、ｎ－ヘキシルメタクリレート、ｎ－オクチルアクリレート、ｎ－オクチルメタクリレート、ｎ－デシルアクリレート、ｎ－デシルメタクリレート、ｎ－ドデシルアクリレート、ｎ－ドデシルメタクリレート、ｎ－テトラデシルアクリレート、ｎ－テトラデシルメタクリレート等を挙げることができる。前記反応性の単量体単位としては、短時間の処理で親水性高分子を基材に固定化することが可能であることからＵＶ反応性を有する単量体単位が好ましく、例えば、４－アジドフェニルアクリレート、４－アジドフェニルメタクリレート、２－（（４－アジドベンゾイル）オキシ）エチルアクリレート、２－（（４－アジドベンゾイル）オキシ）エチルメタクリレート等を挙げることができる。
　本発明で用いる細胞培養基材はまた、刺激応答性を有していてもよい。細胞培養基材が刺激応答性を有することにより、外部刺激により細胞塊を細胞培養基材から剥離することができ、細胞へのダメージを抑制しつつ細胞を回収可能である。前記刺激応答性としては、外部刺激によって細胞塊を剥離可能であれば特に限定はないが、温度応答性、光応答性、ｐＨ応答性、磁気応答性、電場応答性、力学的刺激応答性を挙げることができ、温度応答性、光応答性、ｐＨ応答性、力学的刺激応答性のいずれか、又はこれらの複数の組み合わせであることが好ましく、温度応答性、光応答性、力学的刺激応答性のいずれか、又はこれらの複数の組み合わせであることがさらに好ましく、温度応答性、力学的刺激応答性のいずれか、又はこれらの複数の組み合わせであることが特に好ましく、温度応答性が最も好ましい。
　また、細胞培養基材上で細胞を培養する際に、体温に近い温度で細胞を培養可能であることから、前記温度応答性としては、特に限定はないが応答温度５０℃以下が好ましく、３５℃以下がさらに好ましく、また、培養中に培地交換等の作業を行う際に細胞が剥離してしまうことを抑制するのに好適であることから、２５℃以下が特に好ましく、１５℃以下が最も好ましい。さらに、細胞にダメージを与えない温度での冷却操作によって細胞塊を形成することが可能であることから、応答温度の下限値は０℃以上が好ましく、１℃以上がさらに好ましく、３℃以上が特に好ましく、４℃以上が最も好ましい。前記温度応答性を細胞培養基材に付与する方法としては、細胞培養基材の量産性に優れることから、温度応答性高分子による層を基材表面に設ける方法が好ましい。高分子の種類としては特に限定はないが、基材に疎水性相互作用等の物理的作用によって固定化されたブロック共重合体、アジド基等の反応性基を介して基材に固定化された共重合体、モノマーを基材に塗布して基材上で電子線重合又はラジカル重合を行うことにより基材上に固定化された重合体等を好適に用いることができる。
　前記温度応答性高分子の種類に特に限定はないが、温度応答性を付与するための単量体単位としては例えば、アクリルアミド、メタクリルアミド等の（メタ）アクリルアミド化合物；Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド、Ｎ－エチルアクリルアミド、Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド、Ｎ－ｎ－プロピルメタクリルアミド、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド、Ｎ－イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ－シクロプロピルアクリルアミド、Ｎ－シクロプロピルメタクリルアミド、Ｎ－ｔ－ブチルアクリルアミド、Ｎ－エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ－エトキシエチルメタクリルアミド、Ｎ－テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ－テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド等のＮ－アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体；Ｎ，Ｎ－ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－エチルメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド等のＮ，Ｎ－ジアルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体；１－（１－オキソ－２－プロペニル）－ピロリジン、１－（１－オキソ－２－プロペニル）－ピペリジン、４－（１－オキソ－２－プロペニル）－モルホリン、１－（１－オキソ－２－メチル－２－プロペニル）－ピロリジン、１－（１－オキソ－２－メチル－２－プロペニル）－　ピペリジン、４－（１－オキソ－２－メチル－２－プロペニル）－モルホリン等の環状基を有する（メタ）アクリルアミド誘導体；メチルビニルエーテル等のビニルエーテル；Ｎ－プロリンメチルエステルアクリルアミド等のプロリン誘導体を挙げることができ、応答温度を０～５０℃とするのに好適であることから、Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド、Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド、Ｎ－ｎ－プロピルメタクリルアミド、Ｎ－エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ－テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ－テトラヒドロフルフリルメタクリルアミドが好ましく、Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドがさらに好ましく、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドが特に好ましい。また、培養操作における培地交換の際に室温の培地を用いる場合においては、ブロック共重合体の応答温度を室温よりも低い温度とするのに好適であることから、Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド、Ｎ－プロリンメチルエステルアクリルアミドが好ましい。
　本発明において、温度応答性高分子に含まれる温度応答性の構成単位比率は、細胞塊から細胞塊を形成する工程を迅速に行うのに好適であることから、７０ｗｔ％以上が好ましく、８０ｗｔ％以上がさらに好ましく、９０ｗｔ％以上が特に好ましく、９２ｗｔ％以上が最も好ましい。
　前記温度応答性高分子としては、細胞培養基材から温度応答性高分子が溶出するのを抑制し、細胞凝集体や細胞塊に高分子が混入することによる品質への影響を抑制するのに好適であることから、温度応答性の単量体単位と疎水性の単量体単位の両方を有するランダム共重合体又はブロック共重合体であることが好ましく、親水性の単量体単位と疎水性の単量体単位の両方を有するブロック共重合体であることがさらに好ましい。疎水性の単量体単位は前述の親水性高分子の場合と同じものを好適に用いることができる。
　本発明において、温度応答性高分子はまた、応答温度を制御するための単量体単位を含んでいてもよい。例えば、親水性又は疎水性の単量体単位を挙げることができ、特に限定はないが例えば、２－ジメチルアミノエチルアクリレート、２－ジメチルアミノエチルメタクリレート、２－ジエチルアミノエチルアクリレート、２－ジエチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ－［３－（ジメチルアミノ）プロピル］アクリルアミド等のアミノ基を有するもの；Ｎ－（３－スルホプロピル）－Ｎ－メタクロイルオキシエチル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムベタイン、Ｎ－メタクリロイルオキシエチル－Ｎ、Ｎ－ジメチルアンモニウム－α－Ｎ－メチルカルボキシベタイン等のベタインを有するもの；ヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）アクリルアミド、ポリエチレングリコールモノアクリレート、ポリエチレングリコールモノメタクリレート、ポリプロピレングリコールモノアクリレート、ポリプロピレングリコールモノメタクリレート、メトキシポリエチレングリコールモノアクリレート、メトキシポリエチレングリコールモノメタクリレート、ジエチレングリコールモノメチルエーテルアクリレート、ジエチレングリコールモノメチルエーテルメタクリレート、ジエチレングリコールモノエチルエーテルアクリレート、ジエチレングリコールモノエチルエーテルメタクリレート、２－メトキシエチルアクリレート、２－メトキシエチルメタクリレート、２－エトキシエチルアクリレート、２－エトキシエチルメタクリレート、３－ブトキシエチルアクリレート、３－ブトキシエチルメタクリレート、３－ブトキシエチルアクリルアミド、フルフリルアクリレート、フルフリルメタクリレート、テトラヒドロフルフリルアクリレート、テトラヒドロフルフリルメタクリレート等のポリエチレングリコール基、メトキシエチル基を有するもの；メトキシメチルアクリレート、メトキシメチルメタクリレート、２－エトキシメチルアクリレート、２－エトキシメチルメタクリレート、３－ブトキシメチルアクリレート、３－ブトキシメチルメタクリレート、３－ブトキシメチルアクリルアミド等のアクリレート基を有するもの；２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２－アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、３－（メタ）アクリロイルオキシプロピルホスホリルコリン、４－（メタ）アクリロイルオキシブチルホスホリルコリン、６－（メタ）アクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、１０－（メタ）アクリロイルオキシデシルホスホリルコリン、ω－（メタ）アクリロイル（ポリ）オキシエチレンホスホリルコリン、２－アクリルアミドエチルホスホリルコリン、３－アクリルアミドプロピルホスホリルコリン、４－アクリルアミドブチルホスホリルコリン、６－アクリルアミドヘキシルホスホリルコリン、１０－アクリルアミドデシルホスホリルコリン、ω－（メタ）アクリルアミド（ポリ）オキシエチレンホスホリルコリン等のホスホリルコリン基を有するものを挙げることができる。
　本発明における温度応答性高分子の分子量としては特に制限はないが、温度応答性高分子の強度を高めるのに好適のため、数平均分子量で１０００～１００万であることが好ましく、２０００～５０万であることがさらに好ましく、５０００～３０万であることが特に好ましく、１万～２０万であることが最も好ましい。
　本発明において、温度応答性高分子が細胞塊へ混入することを抑制するのに好適であることから、温度応答性高分子が含有する数平均分子量５０００以下の成分が、５０％以下であることが好ましく、３０％以下であることがさらに好ましく、１０％以下であることが特に好ましく、５％以下であることが最も好ましい。また、数平均分子量１００００以下の成分が、５０％以下であることが好ましく、３０％以下であることがさらに好ましく、１０％以下であることが特に好ましく、５％以下であることが最も好ましい。さらに、数平均分子量３００００以下の成分が、５０％以下であることが好ましく、３０％以下であることがさらに好ましく、１０％以下であることが特に好ましく、５％以下であることが最も好ましい。ブロック共重合体に含まれる特定分子量以下の成分の含有量は、ゲル浸透クロマトグラフィーによって測定することができる。
　本発明における親水性／温度応答性高分子は、必要に応じて連鎖移動剤や重合開始剤、重合禁止剤等を含んでいてもよい。連鎖移動剤としては特に制限はなく、一般に使用されるものを好適に用いることができるが、例えば、ジチオベンゾエート、トリチオカルボナート、４－シアノ－４－［（ドデシルスルフォニルチオカルボニル）スルフォニル］ペンタノイックアシッド、２－シアノプロパン－２－イル　Ｎ－メチル－Ｎ－（ピリジン－４－イル）カルバモジチオアート、２－プロピオン酸メチルメチル（４－ピリジニル）カルバモジチオアートを挙げることができる。また、重合開始剤としては特に制限はなく、一般に使用されるものを好適に用いることができるが、例えば、アゾビスイソブチロニトリル、１，１’－アゾビス（シクロヘキサンカルボニトリル）、ジ－ｔｅｒｔ－ブチルペルオキシド、ｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシド、過酸化水素、ペルオキソ二硫酸カリウム、過酸化ベンゾイル、トリエチルボラン、ジエチル亜鉛等を挙げることができる。さらに、重合禁止剤としては特に制限はなく、一般に使用されるものを好適に用いることができるが、ヒドロキノン、ｐ－メトキシフェノール、トリフェニルフェルダジル、２，２，６，６－テトラメチルピペリジニル－１－オキシル、４－ヒドロキシ－２，２，６，６－テトラメチルピペリジニル－１－オキシル等を挙げることができる。
　本発明における親水性／温度応答性高分子の合成方法としては、特に限定はないが、（株）エヌ・ティー・エス発行、“ラジカル重合ハンドブック”、ｐ．１６１～２２５（２０１０）に記載のリビングラジカル重合技術を用いることができる。
　本発明において、細胞増殖性を高めるのに好適であることから、温度応答性高分子による層の層厚が、１０００ｎｍ以下を有することが好ましく、２００ｎｍ以下がさらに好ましく、１００ｎｍ以下が特に好ましく、５０ｎｍ以下が最も好ましい。また、細胞塊から細胞塊を形成する工程を迅速に行うのに好適であることから、温度応答性高分子による層の層厚が、５ｎｍ以上を有することが好ましく、２０ｎｍ以上がさらに好ましく、３０ｎｍ以上が特に好ましく、３５ｎｍ以上が最も好ましい。
　本発明において、細胞培養基材は、必要に応じて生体由来物質を表面に含有していてもよい。前記生体由来物質としては特に限定はないが、例えば、マトリゲル、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン等を挙げることができる。
　これら生体由来物質は、天然物であってもよく、遺伝子組み換え技術等で人工的に合成したものであってもよく、制限酵素等で切断した断片や、これら生体由来物質をベースとした合成タンパク質あるいは合成ペプチドであっても良い。
　本発明において、前記マトリゲルとしては、入手容易性から、市販品としては例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製）やＧｅｌｔｒｅｘ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を好適に用いることができる。
　前記ラミニンの種類は特に限定されるものではないが、例えば、ヒトｉＰＳ細胞の表面に発現しているα６β１インテグリンに対して高活性を示すことが報告されているラミニン５１１、ラミニン５２１又はラミニン５１１－Ｅ８フラグメントを用いることができる。前記ラミニンは、天然物であってもよく、遺伝子組み換え技術等で人工的に合成したものであってもよく、また、前記ラミニンをベースとした合成タンパク質あるいは合成ペプチドであっても良い。入手容易性から、市販品としては例えば、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１（（株）ニッピ製）を好適に用いることができる。
　前記ビトロネクチンは、天然物であってもよく、遺伝子組み換え技術等で人工的に合成したものであってもよく、また、前記ビトロネクチンをベースとした合成タンパク質あるいは合成ペプチドであっても良い。入手容易性から、市販品としては例えば、ビトロネクチン，ヒト血漿由来（和光純薬工業（株）製）やｓｙｎｔｈｅｍａｘ（Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製）、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（ＶＴＮ－Ｎ）（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を好適に用いることができる。
　前記フィブロネクチンは、天然物であってもよく、遺伝子組み換え技術等で人工的に合成したものであってもよく、また、前記フィブロネクチンをベースとした合成タンパク質あるいは合成ペプチドであっても良い。入手容易性から、市販品としては例えば、フィブロネクチン溶液、ヒト血漿由来（和光純薬工業（株）製）やＲｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（タカラバイオ（株）製）を好適に用いることができる。
　前記コラーゲンの種類は特に限定されるものではないが、例えば、ｔｙｐｅＩコラーゲンやｔｙｐｅＩＶコラーゲンを用いることができる。前記コラーゲンは、天然物であってもよく、遺伝子組み換え技術等で人工的に合成したものであってもよく、また、前記コラーゲンをベースとした合成ペプチドであっても良い。入手容易性から、市販品としては例えば、コラーゲンＩ，ヒト（Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製）やコラーゲンＩＶ，ヒト（Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製）を好適に用いることができる。
　本発明において、生体由来物質の変性を抑制することができ、細胞増殖性を高めることができるため、生体由来物質は共有結合ではなく非共有結合により細胞培養基材上に固定化されていることが好ましい。ここで、本発明において「非共有結合」とは、静電相互作用、水不溶性相互作用、水素結合、π－π相互作用、双極子－双極子相互作用、ロンドン分散力、その他のファンデルワールス相互作用等、分子間力に由来する共有結合以外の結合力を示す。生体由来物質のブロック共重合体への固定化は、単一の結合力によるものであっても、複数の組み合わせであってもよい。
　本発明において、生体由来物質の固定化方法は特に限定されるものではないが、例えば、細胞培養基材に生体由来物質の溶液を所定時間塗布することで固定化させる方法や、細胞を培養する際に培養液中に生体由来物質を添加することで生体由来物質を細胞培養基材に吸着させ固定化する方法を好適に用いることができる。
　本発明において、基材の材質は特に限定されるものではないが、通常細胞培養に用いられるガラス、ポリスチレン等の物質のみならず、一般に形態付与が可能である物質、例えば、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルメタクリレート等の高分子化合物や、セラミックス、金属類などを用いることができる。培養操作の容易性から、基材の材質がガラス、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレン、ポリプロピレンの内少なくとも１種類を含むことが好ましく、ガラス、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンの内少なくとも１種類を含むことがさらに好ましく、可撓性を高めるのに好適であることからポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンが特に好ましい。また、後述する親水化処理によるパターニングによって細胞増殖性を付与するのに好適であることから、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレートが最も好ましい。
　基材の形状としては特に制限はなく、板、フィルムのような平面形状であってもよいし、ファイバー、多孔質粒子、多孔質膜、中空糸であってもよい。また、一般に細胞培養等に用いられる容器（ペトリ皿等の細胞培養皿、フラスコ、プレート、バッグ等）であっても差し支えない。培養操作の容易性から、板、フィルムのような平面形状、又は平膜の多孔質膜であることが好ましい。また、必要に応じて基材上に仕切り板を設ける等により、各細胞塊を区分するための構造を設けてもよい。
　本発明において、細胞塊から細胞塊を形成する工程を迅速に行うのに好適であり、さらに、大きな細胞塊を製造する場合にも、細胞塊の内部まで万遍なく栄養を行き渡らせることが可能であることから、基材が多孔質基材であり、多孔質基材の細孔径が細胞よりも小さなものであることが好ましい。また、細胞塊から細胞塊を形成する工程を迅速に行うのに好適であることから、前記細孔径が０．０１～８μｍであることが好ましく、０．０１～３μｍであることがさらに好ましく、０．０１～１μｍであることが特に好ましく、０．１～１μｍであることが最も好ましい。ここで、本発明において多孔質基材の「細孔径」とは、多孔質基材が有する細孔の、多孔質基材の面内方向に沿った直径の平均値を示し、多孔質基材のレーザー顕微鏡像や走査型電子顕微鏡像、透過型電子顕微鏡像において２０点以上の細孔について該直径を測定し、平均値を求めることによって算出することができる。
　前記多孔質基材としてはまた、細胞塊から細胞塊を形成する工程を迅速に行うのに好適であることから、空隙率が０．０１～６０％であることが好ましく、０．０１～２０％がさらに好ましく、０．０１～４％が特に好ましく、０．０１～１．５％が最も好ましい。ここで、本発明において多孔質基材の「空隙率」とは、多孔質基材の表面の一主面について、細孔部分の合計面積を基材面積で割った値で、面積割合で基材面にどの程度の空隙が存在するのかを示し、多孔質基材のレーザー顕微鏡像や走査型電子顕微鏡像、透過型電子顕微鏡像において、多孔質基材の細孔の孔径の２００倍以上の長さを一辺とする正方形の領域を観察することによって測定することができる。
　本発明の細胞培養基材は、滅菌を施してあってもよい。滅菌の方法に特に限定はないが、高圧蒸気滅菌、ＵＶ滅菌、γ線滅菌、エチレンオキシドガス滅菌等を用いることができる。ブロック共重合体の変性を抑制するのに好適であることから、高圧蒸気滅菌、ＵＶ滅菌、エチレンオキシドガス滅菌が好ましく、基材の変形を抑制するために好適であることからＵＶ滅菌又はエチレンオキシドガス滅菌がさらに好ましく、量産性に優れることからエチレンオキシドガス滅菌が特に好ましい。
　本発明の細胞塊の製造方法で用いる細胞としては、細胞培養基材に接着可能なものであれば特に限定されるものではない。例えばチャイニーズハムスター卵巣由来ＣＨＯ細胞やマウス結合組織Ｌ９２９、ヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞やヒト子宮頸部癌由来ＨｅＬａ細胞等の種々の株化細胞に加え、例えば生体内の各組織、臓器を構成する上皮細胞や内皮細胞、収縮性を示す骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、神経系を構成するニューロン細胞、グリア細胞、繊維芽細胞、生体の代謝に関与する肝実質細胞、肝非実質細胞や脂肪細胞、分化能を有する細胞として、間葉系幹細胞、骨髄細胞、Ｍｕｓｅ細胞のように種々の組織に存在する幹細胞、さらにはＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の分化多能性を有する幹細胞（多能性幹細胞）、それらから分化誘導した細胞等を用いることができる。器官原基を形成するのに好適であることから、上皮系細胞及び間葉系細胞を用いることが好ましい。
　本発明の細胞塊の製造方法は、下記（１）～（３）工程を有する。
（１）間葉系細胞と外胚葉由来細胞を含有する細胞懸濁液を調製する工程。
（２）前記（１）工程で調製された細胞懸濁液を細胞培養基材と接触させ、間葉系細胞と外胚葉由来細胞を（Ａ）領域に無作為に接着させる工程であって、前記細胞懸濁液と前記細胞培養基材との接触面における、前記間葉系細胞と前記外胚葉由来細胞との合計細胞数が、単位面積当たり１００～１０００００細胞である工程。
（３）前記（Ａ）領域に接着した細胞を培養し、間葉系細胞と外胚葉由来細胞とを含む細胞塊を形成する工程。
　また、本発明の細胞塊の製造方法は、下記（４）工程を有していてもよい。
（４）前記（３）工程で形成した細胞塊を培養し、器官原基を形成する工程。
　前記（１）工程では、間葉系細胞と外胚葉由来細胞の２種類の細胞を含有する細胞懸濁液を調製する。細胞懸濁液の調整方法として特に限定はなく、別々に予め培養しておいた２種類以上の細胞を酵素などにより単一細胞の状態で剥離回収し、培地中で所望の割合で混合する。２種類以上の細胞の混合比としては、１種類の細胞の含有割合が多い部位を形成するのに好適であることから、細胞数で各細胞が全て均一割合で混合された場合の細胞割合を基準として、０．５～１．５倍の範囲にあることが好ましく、０．８～１．２倍の範囲がさらに好ましく、０．９～１．１倍の範囲が特に好ましく、０．９５～１．０５倍の範囲が最も好ましい。細胞懸濁液中の、間葉系細胞と外胚葉由来細胞との細胞数の比は１：１０～１０：１であってよく、１：５～５：１であってもよく、１：１が好ましい。細胞懸濁液中の、間葉系細胞と外胚葉由来細胞との細胞数の比がこれらの範囲にあると、間葉系細胞又は外胚葉由来細胞の含有割合が多い部位を形成するのにより好適となる。
　前記（２）工程では、前記（１）工程で調製された細胞懸濁液を細胞培養基材と接触させ、間葉系細胞と外胚葉由来細胞を（Ａ）領域に無作為に接着させる。ここで、細胞懸濁液と細胞培養基材との接触面における、間葉系細胞と外胚葉由来細胞との合計細胞数は、単位面積当たり１００～１０００００細胞である。細胞を接着させることで、細胞塊が細胞培養基材に固定化されるため、培養作業や輸送時において揺動による細胞塊へのダメージを低減することができる。細胞を接着させない場合、培養作業や輸送時において細胞塊が細胞培養基材の壁面や他の細胞塊と衝突することで傷つきやすい。十分な量の細胞を（Ａ）領域に接着させ、１種類の細胞の含有割合が多い部位を形成しやすくするため、細胞培養基材の面積当たりの播種細胞数（細胞懸濁液と細胞培養基材との接触面における、間葉系細胞と外胚葉由来細胞との合計細胞数）としては、１０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上が好ましく、３０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上がさらに好ましく、５０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上が特に好ましく、１００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上が最も好ましい。また、細胞が浮遊状態で凝集することを抑制するため、細胞培養基材の面積当たりの播種細胞数（細胞懸濁液と細胞培養基材との接触面における、間葉系細胞と外胚葉由来細胞との合計細胞数）としては、１０００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下が好ましく、８００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下がさらに好ましく、５００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下が特に好ましく、２００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下が最も好ましい。
　前記（３）工程では、前記（Ａ）領域に接着した細胞を培養し、間葉系細胞と外胚葉由来細胞とを含む細胞塊を形成する。また、本願構成の細胞培養基材を採用することで外胚葉由来細胞の含有割合が多い部位と、前記細胞の含有量が少ない（間葉系細胞の含有割合が多い）部位の少なくとも２つの部位を有する細胞塊を形成する。２種類以上の細胞を前述の面積を有する領域内で培養することで、１種類の細胞のみが自発的に集合し、１種類の細胞の含有割合が多い部位を形成することができる。
　前記（３）工程において、器官原基の形成に好適であることから、細胞塊が、間葉系細胞より外胚葉由来細胞の含有割合が多い部位（単に外胚葉由来細胞の含有割合が多い部位ともいう。）を含んでいてよい。また、細胞塊は、外胚葉由来細胞より間葉系細胞の含有割合が多い部位（単に間葉系細胞の含有割合が多い部位ともいう。）を更に含んでいてよい。細胞塊が間葉系細胞の含有割合が多い部位と、外胚葉由来細胞の含有割合が多い部位と、を含む場合、器官原基の形成により好適であることから、間葉系細胞の含有割合が多い部位の基材面内方向の最大断面積と、外胚葉由来細胞の割合が多い部位の基材面内方向の最大断面積との比が、２：１～１：２０であることが好ましく、２：１～１：１０がさらに好ましく、１：１～１：５が特に好ましく、１：１～１：２が最も好ましい。
　前記（４）工程では、前記（３）工程で形成した細胞塊を培養し、器官原基を形成する。器官原基には、毛乳頭細胞のマーカーであるＶｅｒｓｉｃａｎタンパク質が発現していてよい。
　前記細胞塊は、前記（Ａ）領域に接着している細胞からなる部位と、前記接着した細胞に接着している略球状の部位の少なくとも２つの部位を有し、前記略球状の部位の直径は、前記（Ａ）領域の直径よりも小さなものであることが好ましい。細胞塊が前記形状であることにより、毛包原基等の器官原基への分化が起こりやすくなる。
　本発明で用いる培地の種類に特に制限はなく、培養する細胞に応じて適宜選択可能である。例えば、培養する細胞として間葉系細胞と上皮系細胞の２種類を用いる場合、ＤＭＥＭ（タカラバイオ株式会社（株）製）と角化細胞増殖培地（タカラバイオ（株）製）を１：１で混合した培地が好ましい。
　２種類以上の細胞（例えば間葉系細胞及び外胚葉由来細胞）を共培養した際に、１種類の細胞（例えば外胚葉由来細胞）の含有割合が多い、とは、特定の細胞のみに蛍光標識が可能な処理（免疫染色）を施した後、位相差顕微鏡及び蛍光顕微鏡を使用して細胞塊を観察した場合に、ある領域における細胞塊の断面中に含まれる細胞数に対する、１種類の細胞（例えば外胚葉由来細胞）の細胞数の割合が５０％以上であることを意味する。２種類以上の細胞（例えば間葉系細胞及び外胚葉由来細胞）を共培養した際に、１種類の細胞（例えば外胚葉由来細胞）の含有割合が少ないとは、上記割合が５０％未満であることを意味する。
　本発明の別の一側面は、下記（Ａ）及び（Ｂ）の２つの領域を有する細胞培養基材を含む、毛包原基の分化誘導キットに関する。本キットに含まれる細胞培養基材としては、細胞塊の製造方法で使用する細胞培養基材と同じ基材を用いることができる。
（Ａ）細胞増殖性を有し、面積０．００１～１ｍｍ２の円形の領域。
（Ｂ）前記（Ａ）領域に隣接し、細胞増殖性を有しない領域。
　毛包原基の分化誘導キットは、間葉系細胞及び上皮系細胞が増殖性を有する培地を更に含んでもよい。間葉系細胞及び上皮系細胞が増殖性を有する培地としては、細胞塊の製造方法で使用する培地（例えば、ＤＭＥＭ（タカラバイオ株式会社（株）製）と角化細胞増殖培地（タカラバイオ（株）製）を１：１で混合した培地）と同じ培地を用いることができる。
　以下、本発明を実施するための形態を挙げて本発明について詳細に説明するが、本発明を説明するための例示であり、本発明を以下の内容に限定する趣旨ではない。また本発明の要旨の範囲内で適宜に変更して実施することができる。なお、断りのない限り、試薬は市販品を用いた。
［実施例１］
　直径３５ｍｍの親水性高分子を表面に被覆したディッシュ（住友ベークライト（株）製、商品名：ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ）を直径０．２ｍｍの円形の孔を複数有するメタルマスク（ミタニマイクロニクス（株）製）で覆い、プラズマ照射装置（（株）真空デバイス製、商品名：プラズマイオンボンバーダＰＩＢ－２０）を用いてメタルマスク上部からプラズマ処理（２０Ｐａガス圧下、導電電流２０ｍＡ、照射時間３０秒間）を行うことで、細胞接着性及び細胞増殖性の領域を有する細胞培養基材を作製した。
　ポリスチレン製のフラスコで培養した間葉系細胞（骨髄由来の間葉系幹細胞）と上皮系細胞（ヒト歯肉上皮細胞）を０．５×ＴｒｙｐＬＥ－ＥＤＴＡ溶液で剥離し、遠心分離して細胞をＤＭＥＭ（タカラバイオ株式会社（株）製）と角化細胞増殖培地（タカラバイオ（株）製）を１：１で混合した培地に再分散させた。細胞数を計測し、間葉系細胞と上皮系細胞を１：１で混合した細胞懸濁液を作製した。
　前記パターニングした細胞培養基材に前記細胞懸濁液を添加し、４５００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で細胞を播種した。３７℃、ＣＯ２濃度５％の環境下で１２日間培養した。位相差顕微鏡観察により、培養１日目の時点では（Ａ）領域内で細胞が無作為に接着していたが、培養４日目の時点で上皮系細胞が集まり、上皮系細胞の割合が多い部位を有する細胞塊を形成することを確認した。また、培養１１日目の時点で前記細胞塊が、前記（Ａ）領域に接着している細胞からなる部位と、前記接着した細胞に接着している略球状の部位の少なくとも２つの部位を有していた。
　上記細胞塊を形成した細胞培養基材を振とう器にて１時間振とうさせたところ、全ての細胞が接着した状態で固定化されており、細胞塊の損傷は見られなかった。
［実施例２］
　実施例１における直径０．２ｍｍの円形の孔を複数有するメタルマスクの代わりに、直径０．５ｍｍの円形の孔を複数有するメタルマスクを使用した。また、実施例１における細胞播種密度４５００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の代わりに、細胞播種密度１５０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で培養を実施した。培養１日目の時点では（Ａ）領域内で細胞が無作為に接着していたが、培養６日目の時点で上皮系細胞が集まり、上皮系細胞の割合が多い部位を有する細胞塊を形成した。
　上記細胞塊を形成した細胞培養基材を振とう器にて１時間振とうさせたところ、全ての細胞が接着した状態で固定化されており、細胞塊の損傷は見られなかった。
［実施例３］
　間葉系細胞としてＶｙｂｒａｎｔ　ＤｉＯ　Ｃｅｌｌ－Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎで蛍光染色したヒト毛乳頭細胞を用い、その他は実施例１と同様にして培養を実施した。
　培養した細胞を位相差顕微鏡及び蛍光顕微鏡で観察し、培養１日目の時点では間葉系細胞と上皮系細胞が無作為に（Ａ）領域に存在し、培養７日目では間葉系細胞の割合が多い部位（上皮系細胞の割合が少ない部位）と、間葉系細胞の割合が少ない部位（上皮系細胞の割合が多い部位）とを含む細胞塊を形成していることを確認した。細胞塊を細胞培養基材の垂直方向から位相差顕微鏡及び蛍光顕微鏡で撮像した画像を取得した。当該画像において、間葉系細胞の含有割合が多い部位（上皮系細胞の割合が少ない部位）の基材面内方向の最大断面積と、間葉系細胞の割合が少ない部位（上皮系細胞の割合が多い部位）の基材面内方向の最大断面積の比は、１：８．５であった。
［実施例４］
　間葉系細胞としてヒト毛乳頭細胞を用い、その他は実施例１と同様にして培養を実施した後、Ｈｕｍａｎ　Ｖｅｒｓｉｃａｎ　Ｉｓｏｆｏｒｍ　Ｖ０　Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｒ＆Ｄ　ＳＹＳＴＥＭＳ製）及びＤｏｎｋｅｙ　ａｎｔｉ－Ｇｏａｔ　ＩｇＧ　（Ｈ＋Ｌ）　Ｃｒｏｓｓ－Ａｄｓｏｒｂｅｄ　Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ，　Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ製）を用いてＶｅｒｓｉｃａｎの蛍光染色を行った。
　培養した細胞を位相差顕微鏡及び蛍光顕微鏡で観察し、培養１日目の時点では間葉系細胞と上皮系細胞が無作為に（Ａ）領域に存在し、培養７日目では間葉系細胞の割合が多い部位（上皮系細胞の割合が少ない部位）と、間葉系細胞の割合が少ない部位（上皮系細胞の割合が多い部位）を含む細胞塊を形成していることを確認した。また、培養した細胞を蛍光顕微鏡で観察し、Ｖｅｒｓｉｃａｎを発現していることを確認した。細胞塊を細胞培養基材の垂直方向から位相差顕微鏡及び蛍光顕微鏡で撮像した画像を取得した。当該画像において、間葉系細胞の含有割合が多い部位（上皮系細胞の割合が少ない部位）の基材面内方向の最大断面積と、間葉系細胞の割合が少ない部位（上皮系細胞の割合が多い部位）の基材面内方向の最大断面積の比は、１：４．９であった。
［実施例５］
　実施例１における直径０．２ｍｍの円形の孔を複数有するメタルマスクの代わりに、直径０．１ｍｍの円形の孔を複数有するメタルマスクを使用し、細胞接着性及び細胞増殖性の領域を有する細胞培養基材を作製した。間葉系細胞としてヒト毛乳頭細胞を用い、その他は実施例４と同様にして培養を実施した。
　培養した細胞を位相差顕微鏡及び蛍光顕微鏡で観察し、培養１日目の時点では間葉系細胞と上皮系細胞が無作為に（Ａ）領域に存在し、培養７日目では間葉系細胞の割合が多い部位（上皮系細胞の割合が少ない部位）と、間葉系細胞の割合が少ない部位（上皮系細胞の割合が多い部位）を含む細胞塊を形成していることを確認した。また、培養した細胞を蛍光顕微鏡で観察し、Ｖｅｒｓｉｃａｎを発現していることを確認した。細胞塊を細胞培養基材の垂直方向から位相差顕微鏡及び蛍光顕微鏡で撮像した画像を取得した。当該画像において、間葉系細胞の含有割合が多い部位（上皮系細胞の割合が少ない部位）の基材面内方向の最大断面積と、間葉系細胞の割合が少ない部位（上皮系細胞の割合が多い部位）の基材面内方向の最大断面積の比は、１．５：１であった。
［比較例１］
　実施例１における間葉系細胞を用いず、代わりに上皮系細胞のみで培養を行い、その他は実施例１と同様にして培養を行った。培養を１２日間継続しても、全ての細胞が均一に分布した細胞塊のみが形成されており、１種類の細胞の割合が多い部位を有する細胞塊は形成されなかった。
［比較例２］
　実施例１における上皮系細胞を用いず、代わりに間葉系細胞のみで培養を行い、その他は実施例１と同様にして培養を行った。培養を１２日間継続しても、全ての細胞が均一に分布した細胞塊のみが形成されており、１種類の細胞の割合が多い部位を有する細胞塊は形成されなかった。
［比較例３］
　実施例１における直径０．２ｍｍの円形の孔を複数有するメタルマスクの代わりに、直径１．５ｍｍの円形の孔を複数有するメタルマスクを使用した。また、実施例１における細胞播種密度４５００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の代わりに、細胞播種密度１５０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で培養を実施した。培養を１２日間継続しても、全ての細胞が均一に分布した細胞塊のみが形成されており、１種類の細胞の割合が多い部位を有する細胞塊は形成されなかった。
［比較例４］
　細胞培養基材として細胞非接着のＵ底容器（住友ベークライト（社）製、商品名：ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ　９６ウェルプレート）を用い、２４００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞播種密度で、その他は実施例１と同様にして培養を実施した。培養４日目の時点で上皮系細胞が集まり、上皮系細胞の割合が多い部位を有する細胞塊を形成することを確認した。
　上記細胞塊を直径３５ｍｍの親水性高分子を表面に被覆したディッシュ（住友ベークライト（株）製、商品名：ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ）に全て回収し、細胞培養基材を振とう器にて１時間振とうさせたところ、細胞塊が損傷し、元の形状を保っていなかった。
［比較例５］
　実施例１における細胞播種密度４５００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の代わりに、細胞播種密度１５００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で培養を実施した。培養７日目では細胞が浮遊した状態で細胞塊を形成していた。細胞培養基材を振とう器にて１時間振とうさせたところ、細胞塊が損傷し、元の形状を保っていなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　Ａ　（Ａ）領域
　Ｂ　（Ｂ）領域
　１　上皮系細胞
　２　間葉系細胞
　３　細胞塊
　４　上皮系細胞の含有割合が多い部位（間葉系細胞の含有割合が少ない）と、前記細胞の含有割合が少ない部位（間葉系細胞の含有割合が多い）の少なくとも２つの部位を有する細胞塊

 

Claims (7)

  1. 　細胞培養基材上で接着培養された細胞塊の製造方法であって、前記細胞培養基材は下記（Ａ）及び（Ｂ）の２つの領域を有し、下記（１）～（３）工程を有することを特徴とする細胞塊の製造方法。
    （Ａ）細胞増殖性を有し、面積０．００１～１ｍｍ２の島状の領域。
    （Ｂ）前記（Ａ）領域に隣接し、細胞増殖性を有しない領域。
    （１）間葉系細胞と外胚葉由来細胞を含有する細胞懸濁液を調製する工程。
    （２）前記（１）工程で調製された細胞懸濁液を前記細胞培養基材と接触させ、前記間葉系細胞と前記外胚葉由来細胞を前記（Ａ）領域に無作為に接着させる工程であって、前記細胞懸濁液と前記細胞培養基材との接触面における、前記間葉系細胞と前記外胚葉由来細胞との合計細胞数が、単位面積当たり１００～１０００００細胞である工程。
    （３）前記（Ａ）領域に接着した細胞を培養し、前記間葉系細胞と前記外胚葉由来細胞とを含む細胞塊を形成する工程。
  2. 　前記細胞懸濁液中の、前記間葉系細胞と前記外胚葉由来細胞との細胞数の比が１：１０～１０：１である、請求項１に記載の細胞塊の製造方法。
  3. 　前記（３）工程において、前記細胞塊が、前記外胚葉由来細胞より前記間葉系細胞の含有割合が多い部位と、前記間葉系細胞より前記外胚葉由来細胞の含有割合が多い部位とを含み、
    　前記外胚葉由来細胞より前記間葉系細胞の含有割合が多い部位の基材面内方向の最大断面積と、前記間葉系細胞より前記外胚葉由来細胞の割合が多い部位の基材面内方向の最大断面積との比が、２：１～１：２０であることを特徴とする請求項１又は２に記載の細胞塊の製造方法。
  4. 　下記（４）工程をさらに有することを特徴とする請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞塊の製造方法。
    （４）前記（３）工程で形成した前記細胞塊を培養し、器官原基を形成する工程。
  5. 　前記器官原基にＶｅｒｓｉｃａｎが存在していることを特徴とする、請求項４に記載の細胞塊の製造方法。
  6. 　下記（Ａ）及び（Ｂ）の２つの領域を有する細胞培養基材を含む、毛包原基の分化誘導キット。
    （Ａ）細胞増殖性を有し、面積０．００１～１ｍｍ２の円形の領域。
    （Ｂ）前記（Ａ）領域に隣接し、細胞増殖性を有しない領域。
  7. 　間葉系細胞及び上皮系細胞が増殖性を有する培地を更に含む、請求項６に記載の毛包原基の分化誘導キット。

     
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