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WO2022010319A1 - 글루카곤-유사 펩타이드-1 및 인터루킨-1 수용체 길항제를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도 - Google Patents

글루카곤-유사 펩타이드-1 및 인터루킨-1 수용체 길항제를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도 Download PDF

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WO2022010319A1
WO2022010319A1 PCT/KR2021/008824 KR2021008824W WO2022010319A1 WO 2022010319 A1 WO2022010319 A1 WO 2022010319A1 KR 2021008824 W KR2021008824 W KR 2021008824W WO 2022010319 A1 WO2022010319 A1 WO 2022010319A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
fusion protein
glp
receptor antagonist
variant
dimer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/KR2021/008824
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
장명호
남수연
조영규
오영민
오나현
임혜진
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
GI Innovation Inc
Original Assignee
GI Innovation Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by GI Innovation Inc filed Critical GI Innovation Inc
Priority to EP21838782.7A priority Critical patent/EP4180452A4/en
Priority to US18/004,872 priority patent/US20230357346A1/en
Publication of WO2022010319A1 publication Critical patent/WO2022010319A1/ko
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/605—Glucagons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K—PEPTIDES
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    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
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    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/545—IL-1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Definitions

  • the present invention relates to a fusion protein dimer comprising glucagon-like peptide-1 (GLP-1) and an interleukin-1 receptor antagonist (IL-1Ra), and a composition for treating metabolic diseases using the same.
  • GLP-1 glucagon-like peptide-1
  • IL-1Ra interleukin-1 receptor antagonist
  • Metabolic disease is a generic term for diseases caused by metabolic disorders in a living body, and it is difficult to develop a clear treatment because the causes of the disease are diverse and complex.
  • glucagon-like peptide-1 is an incretin hormone secreted from L cells in the intestinal tract when stimulated by food, etc. and neuronal inflammation and arteriosclerosis treatment effects.
  • liraglutide an obesity treatment approved as a GLP-1 analogue, is approved as an adjunct to a low-calorie diet and exercise for weight control. This drug is approved for use in obese or overweight adults with obesity, hypertension, type 2 diabetes, or dyslipidemia.
  • Interleukin-1 receptor antagonist is a substance that inhibits IL-1, an inflammatory cytokine that exists in two forms, IL-1 ⁇ and IL-1 ⁇ . Inhibits the effect of IL-1 by competitively interfering with its receptor binding.
  • IL-1 ⁇ an important mediator of the inflammatory response, is produced by the inflammasome, and a recent study revealed that several metabolic diseases are related to the inflammasome (Dominic De Nardo et.al. , Trends Immunol. , 32(8):373-379, 2011).
  • the present inventors studied to develop a new combination fusion protein for effectively treating and preventing metabolic diseases.
  • the fusion protein dimer including GLP-1 and IL-1 receptor antagonist (IL-1Ra) is GLP-1 It was confirmed that, while acting as a hormone, it efficiently binds to the IL-1 receptor and inhibits IL-1 signaling, an inflammatory cytokine. Based on this, the present invention was completed by identifying that the fusion protein dimer can be usefully used as a therapeutic agent for metabolic diseases such as diabetes and obesity.
  • one aspect of the present invention provides a fusion protein comprising GLP-1 or a variant thereof and an IL-1 receptor antagonist (Interleukin-1 receptor antagonist) or a fragment thereof, and a dimer thereof.
  • an IL-1 receptor antagonist Interleukin-1 receptor antagonist
  • Another aspect of the present invention provides a polynucleotide encoding the fusion protein, an expression vector comprising the polynucleotide, and a transformed cell into which the expression vector is introduced.
  • Another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating metabolic diseases comprising the fusion protein dimer.
  • Another aspect of the present invention provides the use of the fusion protein dimer for preparing a medicament for the prevention or treatment of metabolic diseases.
  • Another aspect of the present invention provides the use of the fusion protein dimer for preventing or treating a metabolic disease for preventing or treating a metabolic disease.
  • Another aspect of the present invention provides a method for preventing or treating a metabolic disease comprising administering the dimer of the fusion protein to a subject.
  • the fusion protein dimer comprising GLP-1 and an IL-1 receptor antagonist (IL-1Ra) promotes insulin secretion according to the blood glucose concentration, and is a GLP-1 hormone known to have an anti-obesity effect. can have a significant effect as In addition, by binding to the IL-1 receptor (IL-R), the signal inhibitory effect on IL-1 ⁇ produced by the inflammasome is also excellent. Therefore, in terms of functionality, the fusion protein dimer can be effectively used for the prevention or treatment of metabolic diseases such as diabetes, obesity, and hyperlipidemia because the effects of GLP-1 and IL-1 receptor antagonists act in combination.
  • metabolic diseases such as diabetes, obesity, and hyperlipidemia
  • FIG. 1 is a view showing the structure of the fusion protein dimer GI-210B1 (GLP-1-IgG4 Fc-IL-1Ra) according to the present invention.
  • 2 is a view confirming the prepared GI-210B1 by SDS-PAGE.
  • 3 is a view confirming the prepared GI-210B1 by Western blot.
  • FIG. 4 is a graph showing the measurement of the binding ability of GI-210B1 to IL-1R ⁇ (interleukin-1 receptor alpha).
  • 5A is a diagram showing an experimental method for confirming the efficacy of GI-210B1 as an IL-1 receptor antagonist (IL-1Ra).
  • 5B is a view showing the experimental results confirming the efficacy of GI-210B1 as an IL-1 receptor antagonist (IL-1Ra).
  • FIG. 6 is a graph showing the results of confirming the efficacy of GI-210B1 as a GLP-1 hormone.
  • FIG. 7 is a view and graph showing the results of confirming the fat accumulation inhibitory ability in hepatocytes by palmitate and oleic acid of GI-210B1.
  • Fusion protein comprising GLP-1 and IL-1 receptor antagonist (IL-1Ra)
  • GLP-1 or a variant thereof
  • IL-1 receptor antagonist interleukin-1 receptor antagonist
  • GLP-1 glucagon-like peptide-1
  • glucagon-like peptide-1 is an incretin derived from a transcription product of a proglucagon gene, a prohormone. , a hormone secreted by L cells of the intestine when stimulated by the concentration of nutrients or blood sugar in the intestine.
  • GLP-1 consists of 30 amino acids, and the amino acid sequence of GLP-1 is known to be 100% identical in all mammals. It is known that glucagon is produced in islet ⁇ cells by post-transcriptional process from proglucagon and GLP-1 is produced in L-cells of the ileum and colon. Specifically, the GLP-1 may have the sequence of SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.
  • GLP-1 or a variant thereof is collectively referred to as "GLP-1".
  • GLP-1 and GLP-1 variants specifically bind to, for example, the GLP-1 receptor (GLP-1R, glucagon-like peptide-1 receptor). This specific binding can be confirmed by methods known to those skilled in the art.
  • GLP-1 mutant refers to a form in which a portion of the amino acid of full-length GLP-1 is substituted, deleted, added, and/or inserted. That is, the GLP-1 mutant may have an amino acid sequence different from that of wild-type GLP-1. However, the GLP-1 mutant may have an activity equivalent to or similar to that of wild-type GLP-1.
  • GLP-1 activity may refer to, for example, specific binding to a GLP-1 receptor, and this specific binding may be measured by a method known to those skilled in the art.
  • the GLP-1 mutant may include deletion, modification, substitution and/or addition of some amino acids of wild-type GLP-1, which may be prepared by a method known to those skilled in the art.
  • the GLP-1 variant may include at least 5 or more, at least 10 or more, at least 15 or more, or at least 20 or more amino acids of the wild-type GLP-1 sequence.
  • the GLP-1 mutant may be one in which a portion of the amino acid of wild-type GLP-1 is substituted and deleted.
  • the GLP-1 variant by amino acid substitution and deletion the second and 30th amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 are substituted with other amino acids, and one amino acid sequence is added to the C-terminus. .
  • the GLP-1 mutant may be one in which some amino acids of wild-type GLP-1 are substituted and added.
  • the GLP-1 variant by amino acid substitution and addition, in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, the 2nd, 10th, 12th, 13th, 14th, 16th, 17th, 19th, 20th, The 21st, 24th, 27th, 28th, and 30th amino acids are substituted with other amino acids, and a 9 amino acid sequence may be added to the C-terminus.
  • the 2nd and 30th amino acids are substituted with other amino acids, and one amino acid sequence is added to the C-terminus.
  • the "amino acid” introduced by the substitution and/or addition is glycine (G), leucine (L), lysine (K), glutamine (Q), methionine (M) , glutamic acid (E), valine (V), arginine (R), asparagine (N), proline (P), serine (S) and alanine (A) It may be any one selected from the group consisting of.
  • the GLP-1 variant may be one in which the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with A2G and R30G, and one amino acid sequence G is added to the C-terminus.
  • substitutions are made in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 with A2G, V10L, S12K, Y13Q, L14M, G16E, Q17E, A19V, K20R, E21L, A24E, V27K, K28N and R30G, and a 9 amino acid sequence PSSGAPPPS at the C-terminus (SEQ ID NO: 21) may be added.
  • the GLP-1 variant may have an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 2 to 4.
  • the GLP-1 variant may be characterized in that the action time in vivo is extended. Wild-type GLP-1 is cleaved and inactivated at a very high rate by the enzyme DPP-4 (dipeptidyl peptidase-4) in vivo, and there are many difficulties in developing it as a drug. Accordingly, the GLP-1 mutant reduced cleavage by the DPP-4 enzyme by mutating wild-type GLP-1, and has a biological half-life significantly longer than that of wild-type GLP-1 (1 to 2 minutes). may have
  • the wild-type GLP-1 is processed in vivo so that the first 6 amino acids are cleaved from the molecule. Accordingly, by practice in the art, the amino terminus of GLP-1 is designated at 7 and the carboxy-terminus at 37. According to the above processing, it can be processed from GLP-1 (1-37), which has no insulin secretion function, to GLP-1 (7-37), to become active GLP-1 (7-37), and the C-terminal It can be further modified in vivo to remove the glycine residue and replace it with an amide group to form GLP-1(7-36) amide (amino acid sequence of SEQ ID NO: 1).
  • GLP-1 or "glucagon-like peptide-1” refers to any vertebrate, including mammals, eg, primates (eg, humans) and rodents (eg, mice and rats), unless otherwise noted. means any wild-type GLP-1 obtained from a source.
  • the GLP-1 may be obtained from animal cells, but includes those obtained from recombinant cells capable of producing GLP-1.
  • the GLP-1 may be wild-type GLP-1 or a variant thereof.
  • IL-1 receptor antagonist interleukin-1 receptor antagonist
  • IL-1Ra is an antagonist for inhibiting IL-1 that exists in two forms: IL-1 ⁇ and IL-1 ⁇ .
  • IL-1Ra is structurally similar to IL-1 ⁇ and IL-1 ⁇ , thereby inhibiting IL-1, an inflammatory cytokine, by competitively binding to the IL-1 receptor (IL-1R). Therefore, IL-1Ra is recognized to play an important role in preventing it in diseases caused by IL-1.
  • the IL-1Ra is known to play an important pathophysiological action in type 2 diabetes and atherosclerosis.
  • the IL-1Ra may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, but is not limited thereto.
  • IL-1Ra an IL-1 receptor antagonist (IL-1Ra) or a fragment thereof is collectively referred to as "IL-1Ra".
  • IL-1Ra and IL-1Ra fragments specifically bind to, for example, IL-1 receptor (IL-1R, interleukin-1 receptor). This specific binding can be confirmed by methods known to those skilled in the art.
  • IL-1Ra fragment refers to a truncated form of IL-1Ra, in which a portion of the N-terminus or C-terminus of full-length IL-1Ra is truncated. It may contain fragments.
  • the IL-1Ra fragment can be used in the same context as "IL-1Ra mutant", which refers to a form in which a portion of the amino acid of full-length IL-1Ra is substituted, deleted, added and/or inserted. That is, the IL-1Ra mutant may have an amino acid sequence different from that of wild-type IL-1Ra. However, the IL-1Ra mutant may have an activity equivalent to or similar to that of wild-type IL-1Ra.
  • IL-1Ra activity may refer to, for example, specific binding to an IL-1 receptor, and this specific binding may be measured by a method known to those skilled in the art.
  • the IL-1Ra mutant may include deletion, modification, substitution and/or addition of some amino acids of wild-type IL-1Ra, which may be prepared by methods known to those skilled in the art.
  • IL-1Ra variants include at least 5 or more, at least 10 or more, at least 15 or more, at least 20 or more, at least 30 or more, at least 40 or more, at least 50 or more, at least 60 or more, at least 70 or more, at least 80 or more, at least 90 or more, or 100 or more amino acids.
  • IL-1Ra or “IL-1 receptor antagonist (IL-1Ra)” includes mammals, such as primates (eg, humans) and rodents (eg, mice and rats), unless otherwise noted. means any wild-type IL-1Ra obtained from any vertebrate source.
  • the IL-1Ra may be obtained from animal cells, but includes those obtained from recombinant cells capable of producing IL-1Ra.
  • the IL-1Ra may be wild-type IL-1Ra or a fragment thereof.
  • the fusion protein may include an immunoglobulin Fc region.
  • the Fc domain of the immunoglobulin includes the heavy chain constant region 2 (CH2) and the heavy chain constant region 3 (CH3) of the immunoglobulin, and includes the variable regions and the light chain constant region 1 (CL1) of the heavy and light chains of the immunoglobulin protein that does not
  • the immunoglobulin may be IgG, IgA, IgE, IgD or IgM, preferably IgG4.
  • the Fc domain of the immunoglobulin may be a wild-type Fc domain as well as an Fc domain variant.
  • the term "Fc domain variant" is different from the glycosylation pattern of the wild-type Fc domain, increased sugar chains compared to the wild-type Fc domain, decreased sugar chains compared to the wild-type Fc domain, or the sugar chains are removed ( It may be in a deglycosylated form.
  • an aglycosylated Fc domain is also included.
  • the Fc domain or variant may have a number of sialic acid, fucosylation, and glycosylation adjusted through culture conditions or host genetic manipulation.
  • the sugar chain of the Fc domain of an immunoglobulin can be modified by a conventional method such as a chemical method, an enzymatic method, and a genetic engineering method using microorganisms.
  • the Fc domain variant may be a mixed form of the immunoglobulin Fc region of IgG, IgA, IgE, IgD or IgM.
  • the Fc domain variant may be a form in which some amino acids of the Fc domain are substituted with other amino acids.
  • One embodiment of the Fc domain variant may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
  • the fusion protein may be of the following structural formula (I) or (II):
  • the N' is the N-terminus of the fusion protein
  • X is GLP-1 or a variant thereof
  • Y is an IL-1 receptor antagonist or a fragment thereof
  • linker (1) and linker (2) are peptide linkers
  • n and m are each independently O or 1.
  • the GLP-1 or variant thereof and the IL-1 receptor antagonist or fragment thereof are as described above.
  • the peptide linker (1) consists of 5 to 80 consecutive amino acids, 10 to 70 consecutive amino acids, 15 to 60 consecutive amino acids, 20 to 50 consecutive amino acids, or 25 to 40 amino acids. can In one embodiment, the peptide linker (1) may consist of 30 amino acids. In addition, the peptide linker (1) may include at least one cysteine. Specifically, it may contain one, two or three cysteines. In addition, the peptide linker (1) may be derived from the hinge of an immunoglobulin. In one embodiment, the peptide linker (1) may be a peptide linker consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.
  • the peptide linker (2) may consist of 1 to 50 consecutive amino acids, or 3 to 30 consecutive amino acids, or 5 to 20 amino acids.
  • the peptide linker (2) may include (G 4 S)n (in this case, n is an integer of 1 to 10), and may further include (G)n.
  • n in (G 4 S)n and (G)n may each independently be 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10.
  • the peptide linker (2) may be a peptide linker consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7.
  • amino acid sequence of the fusion protein is as shown in Table 1 below.
  • amino acid sequence of GI-210B1 may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.
  • fusion protein dimer in which two of the above-described fusion proteins are bound.
  • the fusion protein may be bound by a cysteine included in a linker connecting GLP-1 or a variant thereof and the immunoglobulin Fc region.
  • the linker may include a hinge region of an immunoglobulin.
  • polynucleotide encoding a fusion protein comprising the GLP-1 or a variant thereof and an IL-1 receptor antagonist (IL-1Ra) or a fragment thereof.
  • IL-1Ra IL-1 receptor antagonist
  • one embodiment of the polynucleotide may include SEQ ID NO: 18 or SEQ ID NO: 20.
  • the GLP-1 or variant thereof and the IL-1 receptor antagonist or fragment thereof are as described above.
  • the polynucleotide may additionally include a signal sequence or a leader sequence.
  • signal sequence refers to a nucleic acid encoding a signal peptide that directs secretion of a target protein.
  • the signal peptide is cleaved after translation in the host cell.
  • the signal sequence of the present invention is a nucleotide encoding an amino acid sequence that initiates the movement of a protein through the ER (endoplasmic reticulum) membrane.
  • the signal sequence is well-known in the art, and typically contains 16 to 30 amino acid residues, but may include more or fewer amino acid residues.
  • a typical signal peptide consists of three regions: a basic N-terminal region, a central hydrophobic region, and a more polar C-terminal region.
  • the central hydrophobic region contains 4 to 12 hydrophobic residues that anchor the signal sequence through the membrane lipid bilayer during migration of the immature polypeptide.
  • the signal sequence is cleaved in the lumen of the ER by cellular enzymes commonly known as signal peptidases.
  • the signal sequence may be tissue Plasminogen Activation (tPa), a signal sequence of Herpes simplex virus glycoprotein D (HSV gDs), an IgG signal sequence, or a growth hormone secretion signal sequence.
  • tPa tissue Plasminogen Activation
  • HSV gDs Herpes simplex virus glycoprotein D
  • IgG signal sequence an IgG signal sequence
  • a secretion signal sequence used in higher eukaryotic cells, including mammals, may be used.
  • Signal sequences useful in the present invention include an antibody light chain signal sequence, eg, antibody 14.18 (Gillies et al., J. Immunol. Meth 1989. 125: 191-202), an antibody heavy chain signal sequence, eg, MOPC141 antibody heavy chain signal. sequence (Sakano et al., Nature, 1980. 286: 676-683), and other signal sequences known in the art (see, eg, Watson et al., Nucleic Acid Research, 1984. 12:5145-5164). do.
  • a signal sequence composed of amino acids of SEQ ID NO: 9 was used as a signal sequence.
  • Another aspect of the present invention provides an expression vector comprising a polynucleotide encoding a fusion protein comprising the GLP-1 or variant thereof and an IL-1 receptor antagonist or fragment thereof.
  • the polynucleotide may have the sequence of SEQ ID NO: 18.
  • the term "vector" can be introduced into a host cell, recombination and insertion into the host cell genome. or said vector is understood as a nucleic acid means comprising a nucleotide sequence capable of spontaneous replication as an episome.
  • the vector may be operably linked to an appropriate promoter so that the polynucleotide can be expressed in a host cell, and linear nucleic acids, plasmids, phagemids, cosmids, RNA vectors, viral vectors, mini-chromosomes and analogs thereof include Examples of viral vectors include, but are not limited to, retroviruses, adenoviruses, and adeno-associated viruses.
  • the plasmid may contain a selectable marker such as an antibiotic resistance gene, and host cells maintaining the plasmid may be cultured under selective conditions.
  • the term "gene expression” or “expression” of a protein of interest is understood to mean transcription of a DNA sequence, translation of an mRNA transcript, and secretion of a fusion protein product or fragment thereof.
  • a useful expression vector may be RcCMV (Invitrogen, Carlsbad) or a variant thereof.
  • the expression vector may contain a human cytomegalovirus (CMV) promoter to promote continuous transcription of the target gene in mammalian cells and a bovine growth hormone polyadenylation signal sequence to increase the stable-state level of RNA after transcription.
  • CMV human cytomegalovirus
  • Another aspect of the present invention provides a transformed cell into which an expression vector comprising a polynucleotide encoding a fusion protein comprising the GLP-1 or a variant thereof and an IL-1 receptor antagonist or a fragment thereof is introduced.
  • transformed cell refers to prokaryotic and eukaryotic cells into which a recombinant expression vector can be introduced.
  • the transformed cell may be prepared by introducing a vector into a host cell and transforming it.
  • the fusion protein of the present invention can be produced by expressing the polynucleotide contained in the vector.
  • the transformation can be performed by various methods. As long as it can produce the fusion protein of the present invention, it is not particularly limited thereto. Specifically, the transformation method is CaCl 2 precipitation method, CaCl 2 Hanahan increased efficiency by using a reducing material called DMSO (dimethyl sulfoxide) in the precipitation method Method, electroporation (electroporation), calcium phosphate precipitation method, protoplast fusion method, agitation method using silicon carbide fiber, agrobacterium mediated transformation method, transformation method using PEG, dextran sulfate, lipofectamine and drying /inhibition-mediated transformation methods and the like can be used.
  • the infection infection
  • a target object can be delivered into a cell using virus particles.
  • the vector can be introduced into the host cell by gene bombardment or the like.
  • the host cell may include a prokaryotic cell, a progressive cell, a cell of mammalian, plant, insect, fungal or cellular origin.
  • the prokaryotic cell E. coli may be used.
  • yeast may be used as an example of the eukaryotic cell.
  • the mammalian cells include CHO cells, F2N cells, COS cells, BHK cells, Bowes melanoma cells, HeLa cells, 911 cells, AT1080 cells, A549 cells, SP2/0 cells, and human lymphoblastoid cells.
  • NSO cells HT-1080 cells, PERC.6 cells, HEK 293 cells, HEK293T cells, etc. may be used, but are not limited thereto, and any mammalian host cell known to those skilled in the art may be used.
  • Another aspect of the present invention provides a method for preparing a dimer of a fusion protein comprising the GLP-1 or a variant thereof and an IL-1 receptor antagonist or a fragment thereof.
  • the production method of the fusion protein comprises the steps of i) culturing the transformed cell; and ii) recovering a fusion protein dimer comprising GLP-1 or a variant thereof and an IL-1 receptor antagonist or fragment thereof.
  • culture refers to a method of growing microorganisms in an artificially and appropriately controlled environmental condition.
  • the method of culturing the transformed cells can be performed using a method well known in the art.
  • the culture is not particularly limited as long as it can be produced by expressing the fusion protein of the present invention.
  • the culture may be continuously cultured in a batch process or in a fed batch or repeated fed batch process.
  • the step of recovering the fusion protein from the culture may be performed by a method known in the art.
  • the recovery method is not particularly limited as long as it can recover the produced fusion protein of the present invention.
  • the recovery method is centrifugation, filtration, extraction, spraying, drying, evaporation, precipitation, crystallization, electrophoresis, fractional dissolution (eg ammonium sulfate precipitation), chromatography (eg ion exchange, affinity , hydrophobicity and size exclusion) and the like.
  • Another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating metabolic diseases comprising the fusion protein dimer.
  • the use of the pharmaceutical composition may be for preventing or treating metabolic diseases.
  • the fusion protein may include GLP-1 or a variant thereof and an IL-1 receptor antagonist or a fragment thereof.
  • metabolic disease is a generic term for diseases caused by metabolic disorders in vivo, but is not limited thereto, but from the group consisting of diabetes, obesity, hyperlipidemia, hypertension, arteriosclerosis and hyperinsulinemia. can be selected.
  • the preferred dosage of the pharmaceutical composition varies depending on the condition and weight of the patient, the degree of disease, the drug form, the route and duration of administration, but may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the fusion protein dimer exhibits metabolic disease therapeutic activity, or, in particular, as long as it can exhibit a therapeutic effect on diseases such as diabetes and obesity, use, formulation, and purpose of blending and the like.
  • the term "effective amount" refers to an amount of an active ingredient capable of inducing an improvement or treatment effect of a disease, particularly an improvement or therapeutic effect of a metabolic disease such as diabetes or obesity. Such an effective amount can be determined empirically within the ordinary ability of one of ordinary skill in the art.
  • treatment may be used to include both therapeutic treatment and prophylactic treatment. In this case, prevention may be used in the sense of alleviating or reducing a pathological condition or disease of an individual.
  • treatment includes any form of administration or application for treating a disease in a mammal, including a human. The term also includes inhibiting or slowing the progression of a disease; restoring or repairing damaged or missing function, thereby partially or completely alleviating the disease; or stimulate inefficient processes; It includes the meaning of alleviating serious diseases.
  • Pharmacokinetic parameters such as bioavailability and underlying parameters such as clearance rate may also affect efficacy.
  • "enhanced efficacy” eg, improvement in efficacy
  • improved efficacy can be attributed to improved pharmacokinetic parameters and improved efficacy, measured by comparing parameters such as clearance rate and metabolic disease treatment or amelioration in a test animal or human subject.
  • composition of the present invention is administered in a "therapeutically effective amount".
  • the term “administration” refers to introducing a predetermined substance to an individual by an appropriate method, and the administration route of the composition may be administered through any general route as long as it can reach a target tissue.
  • Intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration may be administered intrarectally, but is not limited thereto.
  • the term "therapeutically effective amount” or “pharmaceutically effective amount” refers to an amount of a compound or composition effective to prevent or treat a target disease, and treat the disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment. It means an amount that is sufficient for treatment and does not cause side effects.
  • the level of the effective amount may be determined by the patient's health condition, disease type, severity, drug activity, drug sensitivity, administration method, administration time, administration route and excretion rate, treatment period, factors including the combination or concurrently used drugs; It may be determined according to factors well known in the medical field.
  • a therapeutically effective amount refers to an amount of a drug effective to treat a metabolic disease.
  • the pharmaceutical composition may further include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier may be any non-toxic material suitable for delivery to a patient. Distilled water, alcohol, fats, waxes and inert solids may be included as carriers. Pharmaceutically acceptable adjuvants (buffers, dispersants) may also be included in the pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition may be prepared as a parenteral formulation according to the route of administration by a conventional method known in the art, including a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically acceptable means that it does not inhibit the activity of the active ingredient and does not have toxicity beyond what the application (prescription) target can adapt.
  • the pharmaceutical composition When the pharmaceutical composition is prepared for parenteral use, it may be formulated in the form of injections, transdermal administrations, nasal inhalants and suppositories together with suitable carriers according to methods known in the art.
  • a suitable carrier may be sterile water, ethanol, polyol such as glycerol or propylene glycol, or a mixture thereof, preferably Ringer's solution, PBS (phosphate buffered saline) containing triethanolamine, or sterilized for injection. Water, an isotonic solution such as 5% dextrose, etc. may be used.
  • Formulation of pharmaceutical compositions is known in the art, and specifically, reference may be made to the literature [Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)] and the like. This document is considered a part of this specification.
  • a preferred dosage of the pharmaceutical composition is in the range of 0.01 ⁇ g/kg to 10 g/kg, or 0.01 mg/kg to 1 g/kg per day, depending on the patient's condition, weight, sex, age, severity of the patient, and the route of administration. can be Administration may be performed once or divided into several times a day. These dosages should not be construed as limiting the scope of the invention in any respect.
  • Subjects to which the pharmaceutical composition can be applied are mammals and humans, particularly preferably humans.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include any compound or natural extract known to have a therapeutic effect on metabolic diseases.
  • Another aspect of the present invention provides the use of the fusion protein dimer for preparing a medicament for the prevention or treatment of metabolic diseases.
  • Another aspect of the present invention provides the use of the fusion protein dimer for preventing or treating a metabolic disease for preventing or treating a metabolic disease.
  • the fusion protein dimer, metabolic disease, prevention and treatment are the same as described above.
  • Another aspect of the present invention provides a method for preventing or treating a metabolic disease comprising administering the dimer of the fusion protein to a subject.
  • the fusion protein dimer, administration, metabolic disease, prevention and treatment are the same as described above.
  • the subject may be a mammal, preferably a human.
  • the subject may be a patient suffering from a metabolic disease or an individual with a high probability of suffering from a metabolic disease.
  • the administration route, dosage, and frequency of administration of the fusion protein dimer may be administered to a subject in various methods and amounts depending on the patient's condition and presence or absence of action, and the optimal administration method, dosage, and frequency of administration are conventional. A technician can select within an appropriate range.
  • the fusion protein dimer may be administered in combination with any compound or natural extract known to have a therapeutic effect on metabolic diseases, or formulated in the form of a combination preparation with other drugs.
  • GLP-1 (SEQ ID NO: 2) to produce a fusion protein dimer containing GLP-1 (glucagon-like peptide-1), an Fc domain and an IL-1 receptor antagonist (interleukin-1 receptor antagonist, IL-1Ra) , NL028 hinge linker (SEQ ID NO: 5), an IgG4 Fc domain (SEQ ID NO: 6), a linker (SEQ ID NO: 7) and a polynucleotide encoding a fusion protein (FIG. 1) comprising IL-1Ra (SEQ ID NO: 8) (SEQ ID NO: 8) No. 20) was loaded into pcDNA3.4 vector (Genscript).
  • the vector was introduced into a CHO cell (ExpiCHO-S cell) to express a fusion protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. After introducing the vector, it was cultured for 14 days using a serum-free ExpiCHO TM expression medium (Thermo Fisher Scientific) at 37° C., CO 2 8% condition. After culturing, the culture medium was collected, and the fusion protein was purified using affinity chromatography (Affinity purification column).
  • the fusion protein dimer was named "GI-210B1 (also called GLP-1-IgG4 Fc-IL-1Ra)".
  • GLP-1 (SEQ ID NO: 2), NL028 hinge linker (SEQ ID NO: 5) and an IgG4 Fc domain (SEQ ID NO: 5) to produce a fusion protein dimer comprising GLP-1 (glucagon-like peptide-1) and an Fc domain
  • the polynucleotide (SEQ ID NO: 23) encoding the fusion protein including No. 6) was loaded into pcDNA3.4 vector (Genscript).
  • the vector was introduced into CHO cells (ExpiCHO-S cells) to express a fusion protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22.
  • the vector After introducing the vector, it was cultured for 14 days using a serum-free ExpiCHO TM expression medium (Thermo Fisher Scientific) at 37° C., CO 2 8% condition. After culturing, the culture medium was collected, and the fusion protein was purified using affinity chromatography (Affinity purification column).
  • GI-210B1 The binding ability of GI-210B1 to IL-1R ⁇ (interleukin-1 receptor alpha), obtained through the method of Preparation Example 1, was measured. At this time, IL-1R ⁇ binding ability was confirmed using Octet RED 384 (ForteBio). It was immersed in AR2G (Amine Reactive 2 nd generation) 1 ⁇ the biosensor 10 minutes kinetic buffer (kinetic buffer) was used. IL-1R ⁇ (R&D systems) was prepared at 1 ⁇ g/ml and coated on the biosensor, and GI-210B1 was serially diluted to 15.6 ⁇ 1,000 nM, and the binding ability was confirmed at each concentration. The binding force between GI-210B1 and IL-1R ⁇ is shown in FIG. 4 and Table 2 below.
  • K a (Association rate, 1/Ms)
  • K d (Dissociation rate, 1/s)
  • K D (K d / K a, M) 2.20E+04 9.30E-03 423 nM
  • THP-1 cells ATCC
  • culture medium RPMI-1640 + 10% FBS + 1% penicillin/streptomycin + 0.05 nM 2-mercaptoethanol.
  • THP-1 cells Prior to analysis, THP-1 cells were precipitated by centrifugation at 1,500 rpm for 5 minutes, the medium was removed, and the cells were resuspended. Cells were inoculated with 3 ⁇ 10 5 cells in each well of a 96-well plate, and then LPS (1 ⁇ g/ml) was added and incubated for 3 hours.
  • adenosine triphosphate (ATP) as an inducer of inflammasome, a mediator of the inflammatory reaction, was treated and cultured overnight.
  • the supernatant was precipitated by centrifugation at 1,500 rpm for 5 minutes, and the supernatant was transferred to a new tube and stored.
  • ATP adenosine triphosphate
  • HEK-Blue TM -IL-1 ⁇ cells (Invitrogen) were cultured in a culture medium (DMEM + 10% FBS + 1% penicillin/streptomycin + 100 ⁇ g/ml normocin). Prior to analysis, HEK-Blue TM -IL-1 ⁇ cells were precipitated by centrifugation at 1,500 rpm for 5 min, the medium was removed, and the cells were seeded in assay medium (RPMI-1640 + 10% FBS + 1% penicillin/streptomycin). resuspended.
  • DMEM + 10% FBS + 1% penicillin/streptomycin + 100 ⁇ g/ml normocin Prior to analysis, HEK-Blue TM -IL-1 ⁇ cells were precipitated by centrifugation at 1,500 rpm for 5 min, the medium was removed, and the cells were seeded in assay medium (RPMI-1640 + 10% FBS + 1% penicillin/streptomycin). resuspended.
  • Cells were seeded with 4.5 ⁇ 10 4 cells in each well of a 96-well plate in assay medium, and then GI-210B1 at various concentrations (0.2 ng/ml, 2 ng/ml, 20 ng/ml and 200 ng/ml) 50 ⁇ l of the fusion protein and THP-1 supernatant were added and incubated overnight.
  • the supernatant was precipitated by centrifugation at 1,500 rpm for 5 minutes, and 20 ⁇ l of the supernatant and 180 ⁇ l of QUANTI-Blue solution were dispensed into each well of a 96-well plate, followed by reaction for 3 hours. The absorbance at 650 nm wavelength was then recorded using a plate reader. Data were analyzed using GraphPad Prism software. As a result, it was confirmed that the GI-210B1 fusion protein inhibited the IL-1 signal in a concentration-dependent manner ( FIGS. 5A and 5B ).
  • PC-12 cells (ATCC, #CRL-1721 TM ) were cultured in a culture medium (RPMI-1640 + 10% FBS + 1% penicillin/streptomycin). Prior to analysis, PC-12 cells were precipitated by centrifugation at 1,500 rpm for 5 minutes, the medium was removed, and the cells were resuspended in FBS-free assay medium. Cells were seeded with 5 ⁇ 10 4 cells in each well of a 96-well plate in assay medium.
  • a culture medium RPMI-1640 + 10% FBS + 1% penicillin/streptomycin
  • GI-210B1 fusion protein Various concentrations (0.1 nM, 0.2 nM, 0.4 nM, 0.8 nM, 1.6 nM, 3.1 nM, 6.25 nM, 12.5 nM, 25 nM, 50 nM and 100 nM) of GI-210B1 fusion protein were added to the wells. Assay plates were incubated at 5% CO 2 , 37° C. for 24 hours. Thereafter, 10 ⁇ l of WST-1 (Roche) was added to each well and incubated for 4 hours. After that period, the absorbance at 450 nm wavelength was recorded using a plate reader. Data were analyzed using GraphPad Prism software. As a result, it was found that the GI-210B1 fusion protein increased the growth of PC-12 cells in a concentration-dependent manner ( FIG. 6 ).
  • Huh1 cells were cultured using a culture medium (DMEM + 10% FBS + 1% penicillin/streptomycin) in 5% CO 2 , 37° C. in an incubator. For the experiment, cells were detached using 0.05% Trypsin-EDTA, and then centrifuged at 1,500 rpm for 5 minutes to precipitate. Then, resuspended in fresh medium, 1 ⁇ 10 4 cells were inoculated into each well of a 96-well plate, and cultured for 24 hours.
  • DMEM + 10% FBS + 1% penicillin/streptomycin 5% CO 2 , 37° C. in an incubator.
  • cells were detached using 0.05% Trypsin-EDTA, and then centrifuged at 1,500 rpm for 5 minutes to precipitate. Then, resuspended in fresh medium, 1 ⁇ 10 4 cells were inoculated into each well of a 96-well plate, and cultured for 24 hours.
  • GI-210B1 In order to induce fat accumulation, 100 ⁇ M palmitate and 200 ⁇ M oleic acid were mixed with 2% BSA-serum free DMEM and reacted at 55° C. for 15 minutes. When treated with cells, 1 ⁇ g /ml IL-1Ra (peprotech, 200-01RA), 3.6 ⁇ g/ml GLP-1-Fc or 4.6 ⁇ g/ml GI-210B1 were treated, respectively. After 24 hours of treatment, cells were fixed with 4% paraformaldehyde to check the degree of fat accumulation, stained with BODIPY 493/503 and DAPI, and then the degree of fat accumulation per cell was quantified using a cytation 5 imager. As a result, it was confirmed that the GI-210B1 fusion protein significantly inhibited the fat accumulation induced by palmitate and oleic acid compared to IL-1Ra or GLP-1-Fc (FIG. 7).

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Abstract

본 발명은 글루카곤-유사 펩타이드-1(GLP-1) 및 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-1Ra)를 포함하는 융합단백질 이량체 및 이를 이용한 대사성 질환 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 상기 융합단백질 이량체가 GLP-1 호르몬으로서 유의미하게 작용함과 동시에 IL-1 수용체와 효율적으로 결합하여 인플라마솜에 의해 생성되는 IL-1β에 대한 신호 억제 효과 또한 우수함을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 융합단백질 이량체는 GLP-1과 IL-1 수용체 길항제의 효능이 복합적으로 작용하므로, 당뇨병, 비만, 고지혈증과 같은 대사성 질환의 치료 및 예방에 효과적으로 활용할 수 있어 산업적 활용 가능성이 높다.

Description

글루카곤-유사 펩타이드-1 및 인터루킨-1 수용체 길항제를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도
본 발명은 글루카곤-유사 펩타이드-1(GLP-1) 및 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-1Ra)를 포함하는 융합단백질 이량체 및 이를 이용한 대사성 질환 치료용 조성물에 관한 것이다.
현대사회는 가공식품 및 외식 증가에 따른 과다 영양 섭취, 자동화에 따른 신체활동량 감소 등 다양한 원인으로 인해 비만 인구가 빠르게 증가하고 있으며, 이에 따라 고혈압, 당뇨병, 동맥경화증, 고지혈증, 인슐린 저항성, 이상지질혈증과 같은 대사성 질환이 증가되고 있다.
대사성 질환(metabolic disease)은 생체 내 물질대사 장애에 의해서 발생하는 질환의 총칭으로, 그 질환의 원인이 다양하고 복합적으로 작용하기 때문에 명확한 치료법을 개발하기 어려운 실정이다.
한편, 글루카곤 유사 펩타이드-1(glucagon-like peptide-1, GLP-1)은 장관 내 L 세포에서 음식물 등의 자극을 받아 분비되는 인크레틴(incretin) 호르몬으로, 당뇨병, 비만, 심장병, 뇌혈관 질환 및 신경세포 염증, 동맥경화증 치료 효과 등과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 이와 관련하여 GLP-1 유사체로 승인을 받은 비만 치료제인 리라글루티드(liraglutide)는 체중 조절을 위한 저칼로리 식이 요법 및 운동의 보조 요법으로 허가 받았다. 이 약물은 비만, 고혈압, 제2형 당뇨병 또는 이상지질혈증을 갖는 비만 또는 과체중인 성인에서 사용이 승인되었다. 그러나, 여전히 안전성 및 부작용의 문제가 존재한다.
IL-1 수용체 길항제(Interleukin-1 receptor antagonist, IL-1Ra)는 IL-1α와 IL-1β 두 가지 형태로 존재하는 염증성 사이토카인인 IL-1을 억제하는 물질로서, IL-1이 IL-1 수용체에 결합하는 것을 경쟁적으로 방해하여 IL-1의 효과를 억제한다. 한편, 염증반응에 중요한 매개체인 IL-1β는 인플라마솜(inflammasome)에 의해 생성되며, 최근 연구 결과에 의하면 여러 대사성 질환이 인플라마솜과 관련되어 있음이 밝혀졌다(Dominic De Nardo et.al., Trends Immunol., 32(8):373-379, 2011). 이에, 인플라마솜 및 그 대사산물인 IL-1β를 억제함으로써 이와 관련된 대사성 질환과 같은 여러 질환을 치료하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다(Charles A Dinarello et.al., Nat Rev Drug Discov., 11(8):633-652, 2012).
이에 본 발명자들은 대사성 질환을 효과적으로 치료 및 예방하기 위한 새로운 조합의 융합단백질을 개발하기 위해 연구한 결과, GLP-1 및 IL-1 수용체 길항제(IL-1Ra)를 포함하는 융합단백질 이량체가 GLP-1 호르몬으로서 작용함과 동시에 IL-1 수용체와 효율적으로 결합하여 염증성 사이토카인인 IL-1 신호를 억제함을 확인하였다. 이를 기반으로, 상기 융합단백질 이량체가 당뇨병, 비만 등과 같은 대사성 질환 치료제로 유용하게 활용될 수 있음을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 목적 달성을 위해, 본 발명의 일 측면은, GLP-1 또는 이의 변이체 및 IL-1 수용체 길항제(Interleukin-1 receptor antagonist) 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질 및 이의 이량체를 제공한다.
본 발명의 다른 측면은, 상기 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환 세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 융합단백질 이량체를 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약제를 제조하기 위한 상기 융합단백질 이량체의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 대사성 질환을 예방하거나 치료하기 위한 상기 융합단백질 이량체의 대사성 질환 예방 또는 치료용 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 융합단백질 이량체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 대사성 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 GLP-1 및 IL-1 수용체 길항제(IL-1Ra)를 포함하는 융합단백질 이량체는 혈중의 포도당 농도에 따라 인슐린 분비를 촉진시키고, 비만 억제 효과가 있는 것으로도 알려진 GLP-1 호르몬으로서 유의미하게 작용할 수 있다. 뿐만 아니라, IL-1 수용체(IL-R)와 결합하여, 인플라마솜에 의해 생성되는 IL-1β에 대한 신호 억제 효과 또한 우수하다. 따라서, 기능적 측면에 있어서 상기 융합단백질 이량체는 GLP-1과 IL-1 수용체 길항제의 효능이 복합적으로 작용하여 당뇨병, 비만, 고지혈증과 같은 대사성 질환의 예방 또는 치료에 효과적으로 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 융합단백질 이량체인 GI-210B1(GLP-1-IgG4 Fc-IL-1Ra)의 구조를 나타낸 도면이다.
도 2는 제조된 GI-210B1을 SDS-PAGE로 확인한 도면이다.
도 3은 제조된 GI-210B1을 웨스턴 블롯으로 확인한 도면이다.
도 4는 GI-210B1의 IL-1Rα(interleukin-1 receptor alpha)에 대한 결합능을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 5a는 GI-210B1의 IL-1 수용체 길항제(IL-1Ra)로서의 효능을 확인하기 위한 실험 방법을 나타낸 도면이다.
도 5b는 GI-210B1의 IL-1 수용체 길항제(IL-1Ra)로서의 효능을 확인한 실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 GI-210B1의 GLP-1 호르몬으로서의 효능을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 GI-210B1의 팔미테이트와 올레익산에 의한 간세포 내 지방축적억제능 확인한 결과를 나타낸 도면 및 그래프이다.
GLP-1 및 IL-1 수용체 길항제(IL-1Ra)를 포함하는 융합단백질
본 발명의 일 측면은, GLP-1 또는 이의 변이체; 및 IL-1 수용체 길항제(interleukin-1 receptor antagonist) 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질을 제공한다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "GLP-1(glucagon-like peptide-1)" 또는 "글루카곤 유사 펩타이드-1"은 전구호르몬인 전구글루카곤(proglucagon) 유전자의 전사 산물로부터 유래한 인크레틴(incretin)으로서, 장의 L 세포에서 장관 내 영양분 또는 혈당 농도에 자극을 받아 분비되는 호르몬이다.
GLP-1은 30개의 아미노산으로 구성되어 있으며 GLP-1의 아미노산 서열은 모든 포유류에서 100% 동일한 것으로 알려져 있다. 전구글루카곤으로부터 전사 후 과정에 의해 췌도 α 세포에서는 글루카곤이 만들어지며 회장과 대장의 L-세포에서는 GLP-1이 만들어지는 것으로 알려져 있다. 구체적으로, 상기 GLP-1은 서열번호 1의 서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서는 GLP-1 혹은 이의 변이체를 총칭하여 "GLP-1"의 용어로 표현하기도 한다. GLP-1 및 GLP-1 변이체는 예를 들어 GLP-1 수용체(GLP-1R, glucagon-like peptide-1 receptor)에 특이적으로 결합한다. 이 특이적인 결합은 당업자에게 알려진 방법을 통해 확인할 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "GLP-1 변이체"는 전장(full-length) GLP-1의 아미노산 일부가 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 형태를 의미한다. 즉, GLP-1 변이체는 야생형 GLP-1과 다른 아미노산 서열을 가질 수 있다. 그러나, 상기 GLP-1 변이체는 야생형 GLP-1과 동등하거나 유사한 활성을 가질 수 있다. 여기에서, "GLP-1 활성"은 예를 들어 GLP-1 수용체에 특이적으로 결합하는 것을 의미할 수 있으며, 이 특이적 결합은 당업자에게 알려진 방법을 통해 측정할 수 있다.
구체적으로, 상기 GLP-1 변이체는 야생형 GLP-1의 아미노산 일부가 결실, 변형, 치환 및/또는 부가된 것일 수 있으며, 이는 당업자에게 알려진 방법으로 제조될 수 있다. 상기 GLP-1 변이체는 야생형 GLP-1 서열의 적어도 5개 이상, 적어도 10개 이상, 적어도 15개 이상, 또는 적어도 20개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 GLP-1 변이체는 야생형 GLP-1의 아미노산 일부가 치환 및 결실된 것일 수 있다. 아미노산 치환 및 결실에 의한 GLP-1 변이체의 일 구체예로는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 2번째 및 30번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되고, C-말단에 1개의 아미노산 서열이 부가된 것일 수 있다.
또한, 상기 GLP-1 변이체는 야생형 GLP-1의 아미노산 일부가 치환 및 부가된 것일 수 있다. 아미노산 치환 및 부가에 의한 GLP-1 변이체의 일 구체예로는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 2번째, 10번째, 12번째, 13번째, 14번째, 16번째, 17번째, 19번째, 20번째, 21번째, 24번째, 27번째, 28번째 및 30번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되고, C-말단에 9개의 아미노산 서열이 부가된 것일 수 있다. 더 나아가, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 2번째 및 30번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되고, C-말단에 1개의 아미노산 서열이 부가된 것일 수 있다.
이때, 상기 치환 및/또는 부가에 의해 도입되는 "아미노산"은 글리신(glycine, G), 류신(leucine, L), 리신(lysine, K), 글루타민(glutamine, Q), 메티오닌(methionine, M), 글루탐산(glutamic acid, E), 발린(valine, V), 아르기닌(arginine, R), 아스파라긴(asparagine, N), 프롤린(proline, P), 세린(serine, S) 및 알라닌(alanine, A)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
일 구체예로, 상기 GLP-1 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 A2G, R30G로 치환이 일어나고, C-말단에 1개의 아미노산 서열 G가 부가된 것일 수 있다. 또한, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 A2G, V10L, S12K, Y13Q, L14M, G16E, Q17E, A19V, K20R, E21L, A24E, V27K, K28N 및 R30G로 치환이 일어나고, C-말단에 9개의 아미노산 서열 PSSGAPPPS(서열번호 21)이 부가된 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 GLP-1 변이체는 서열번호 2 내지 4 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
또한, 상기 GLP-1 변이체는 생체 내에서 작용 시간이 연장된 것을 특징으로 하는 것일 수 있다. 야생형 GLP-1은 생체 내에서 DPP-4(dipeptidyl peptidase-4) 효소에 의해 매우 빠른 속도로 절단되어 불활성화되는 등 약물로 개발하는 데에 많은 어려움이 있다. 이에, 상기 GLP-1 변이체는 야생형 GLP-1에 변이를 일으켜 DPP-4 효소에 의한 절단을 줄인 것으로, 야생형 GLP-1의 생물학적 반감기(1 내지 2분)에 비하여 현저히 길어진 생물학적 반감기를 갖는 특징을 지닌 것일 수 있다.
한편, 상기 야생형 GLP-1은 처음 6개의 아미노산이 분자로부터 절단되도록 생체 내에서 가공된다. 따라서, 당업계에서의 관행에 의해, GLP-1의 아미노 말단은 7번으로, 카르복시-말단은 37번으로 지정된다. 상기 가공에 따라 인슐린 분비 기능이 없는 형태인 GLP-1(1-37)에서 GLP-1(7-37) 형태로 프로세싱되어 활성형 GLP-1(7-37)이 될 수 있으며, C-말단 글리신 잔기가 제거되고 아미드기로 대체되도록 생체 내에서 추가로 변형되어 GLP-1(7-36) 아미드(서열번호 1의 아미노산 서열)의 형태가 될 수 있다.
상기 "GLP-1" 또는 "글루카곤 유사 펩타이드-1"은 달리 언급되지 않는 한, 포유동물, 예를 들어, 영장류(예, 인간) 및 설치류(예, 마우스 및 래트)를 포함하여 임의의 척추동물 공급원으로부터 수득한 임의의 야생형 GLP-1을 의미한다. 상기 GLP-1은 동물 세포에서 수득된 것일 수도 있으나, GLP-1을 생산할 수 있는 재조합 세포로부터 수득된 것도 포함한다. 또한, 상기 GLP-1은 야생형 GLP-1 또는 이의 변이체일 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "IL-1 수용체 길항제(interleukin-1 receptor antagonist)" 또는 "IL-1Ra"는 IL-1α, IL-1β의 두 가지 형태로 존재하는 IL-1을 억제하는 길항제로, IL-1Ra는 구조적으로 IL-1α, IL-1β와 비슷하여 IL-1 수용체(IL-1R)에 경쟁적으로 결합하여 염증성 사이토카인인 IL-1을 억제한다. 따라서, IL-1Ra는 IL-1으로 야기되는 질환에서 이를 막는 데 중요한 역할을 담당하는 것으로 인식된다. 한편, 상기 IL-1Ra는 제2형 당뇨병과 죽상동맥경화증에서 병태생리적으로 중요한 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 구체적으로, 상기 IL-1Ra는 서열번호 8의 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서는 IL-1 수용체 길항제(IL-1Ra) 혹은 이의 단편을 총칭하여 "IL-1Ra"의 용어로 표현하기도 한다. IL-1Ra 및 IL-1Ra 단편은 예를 들어 IL-1 수용체(IL-1R, interleukin-1 receptor)에 특이적으로 결합한다. 이 특이적인 결합은 당업자에게 알려진 방법을 통해 확인할 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "IL-1Ra 단편"은 IL-1Ra의 절단형을 의미하는 것으로, 전장(full-length) IL-1Ra의 N-말단 또는 C-말단의 일부가 결실된(truncated) 단편을 포함할 수 있다. 또한, 상기 IL-1Ra 단편은 "IL-1Ra 변이체"와 동일한 맥락으로 사용 가능하며, 이는 전장 IL-1Ra의 아미노산 일부가 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 형태를 의미한다. 즉, IL-1Ra 변이체는 야생형 IL-1Ra와 다른 아미노산 서열을 가질 수 있다. 그러나, 상기 IL-1Ra 변이체는 야생형 IL-1Ra와 동등하거나 유사한 활성을 가질 수 있다. 여기에서, "IL-1Ra 활성"은 예를 들어 IL-1 수용체에 특이적으로 결합하는 것을 의미할 수 있으며, 이 특이적 결합은 당업자에게 알려진 방법을 통해 측정할 수 있다.
구체적으로, 상기 IL-1Ra 변이체는 야생형 IL-1Ra의 아미노산 일부가 결실, 변형, 치환 및/또는 부가된 것일 수 있으며, 이는 당업자에게 알려진 방법으로 제조될 수 있다. IL-1Ra 변이체는 야생형 IL-1Ra의 적어도 5개 이상, 적어도 10개 이상, 적어도 15개 이상, 적어도 20개 이상, 적어도 30개 이상, 적어도 40개 이상, 적어도 50개 이상, 적어도 60개 이상, 적어도 70개 이상, 적어도 80개 이상, 적어도 90개 이상, 또는 100개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.
상기 "IL-1Ra" 또는 "IL-1 수용체 길항제(IL-1Ra)"는 달리 언급되지 않는 한, 포유동물, 예를 들어, 영장류(예, 인간) 및 설치류(예, 마우스 및 래트)를 포함하여 임의의 척추동물 공급원으로부터 수득한 임의의 야생형 IL-1Ra를 의미한다. 상기 IL-1Ra은 동물 세포에서 수득된 것일 수도 있으나, IL-1Ra을 생산할 수 있는 재조합 세포로부터 수득된 것도 포함한다. 또한, 상기 IL-1Ra은 야생형 IL-1Ra 또는 이의 단편일 수 있다.
이때, 상기 융합단백질은 면역글로불린 Fc 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 면역글로불린의 Fc 도메인은 면역글로불린의 중쇄 불변 영역 2(CH2) 및 중쇄 불변 영역 3(CH3)을 포함하며, 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 및 경쇄 불변 영역 1(CL1)은 포함하지 않는 단백질을 의미한다. 상기 면역글로불린은 IgG, IgA, IgE, IgD 또는 IgM일 수 있으며, 바람직하게는 IgG4일 수 있다.
또한, 상기 면역글로불린의 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인뿐만 아니라, Fc 도메인 변이체일 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용하는 용어 "Fc 도메인 변이체"는 야생형 Fc 도메인의 당쇄 형태(glycosylation pattern)와 다르거나, 야생형 Fc 도메인에 비해 증가된 당쇄, 야생형 Fc 도메인에 비해 감소한 당쇄, 또는 당쇄가 제거(deglycosylated)된 형태일 수 있다. 또한, 무당쇄(aglycosylated) Fc 도메인도 포함된다. Fc 도메인 혹은 변이체는 배양조건 혹은 호스트의 유전자 조작을 통해 조정된 숫자의 시알산(sialic acid), 퓨코실화(fucosylation), 당화(glycosylation)를 갖도록 한 것일 수 있다.
또한, 화학적 방법, 효소적 방법 및 미생물을 사용한 유전공학적 엔지니어링 방법 등과 같이 통상적인 방법으로 면역글로불린의 Fc 도메인의 당쇄를 변형시킬 수 있다. 또한, 상기 Fc 도메인 변이체는 면역글로불린은 IgG, IgA, IgE, IgD 또는 IgM의 Fc 영역이 혼합된 형태일 수 있다. 또한, 상기 Fc 도메인 변이체는 상기 Fc 도메인의 일부 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 형태일 수 있다. 상기 Fc 도메인 변이체의 일 구체예로는 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 융합단백질은 하기 구조식 (I) 또는 (II)로 이루어진 것일 수 있다:
N'-X-[링커(1)]n-Fc 영역 단편 또는 이의 변이체-[링커(2)]m-Y-C' (I)
N'-Y-[링커(1)]n-Fc 영역 단편 또는 이의 변이체-[링커(2)]m-X-C' (II)
이때, 상기 구조식 (I) 및 (II)에 있어서,
상기 N'은 융합단백질의 N-말단이고,
상기 C'는 융합단백질의 C-말단이며,
상기 X는 GLP-1 또는 이의 변이체이고,
상기 Y는 IL-1 수용체 길항제 또는 이의 단편이며,
상기 링커(1) 및 링커(2)는 펩타이드 링커이고,
상기 n 및 m은 각각 독립적으로, O 또는 1이다.
이때, 상기 GLP-1 또는 이의 변이체와 IL-1 수용체 길항제 또는 이의 단편은 전술한 바와 같다.
이때, 상기 펩타이드 링커(1)은 5 내지 80개의 연속된 아미노산, 10 내지 70개의 연속된 아미노산, 15개 내지 60개의 연속된 아미노산, 20 내지 50개의 연속된 아미노산, 또는 25 내지 40개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 일 구체예로 펩타이드 링커(1)은 30개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 또한, 펩타이드 링커(1)은 적어도 하나의 시스테인을 포함할 수 있다. 구체적으로, 한 개, 두 개 또는 세 개의 시스테인을 포함할 수 있다. 또한, 상기 펩타이드 링커(1)은 면역글로불린의 힌지에서 유래된 것일 수 있다. 일 구체예에서는, 상기 펩타이드 링커(1)이 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 링커일 수 있다.
상기 펩타이드 링커(2)는 1 내지 50개의 연속된 아미노산, 또는 3 내지 30개의 연속된 아미노산, 또는 5 내지 20개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 상기 펩타이드 링커(2)는 (G4S)n(이때, n은 1 내지 10의 정수)를 포함할 수 있고, (G)n을 추가로 더 포함할 수 있다. 이때, (G4S)n 및 (G)n에서 n은 각각 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 수 있다. 일 구체예에서는, 상기 펩타이드 링커(2)는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 링커일 수 있다.
상기 융합단백질의 각각의 아미노산 서열은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다. 또한, 상기 GI-210B1(GLP-1-IgG4 Fc-IL-1Ra)의 아미노산 서열의 일 구체예는 서열번호 10의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
구분 아미노산 서열 서열번호
hGLP-1 HAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR 1
GLP-1 변이체-1 HGEGTFTSDV SSYLEEQAAK EFIAWLVKGG G 2
GLP-1 변이체-2 HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPPS 3
GLP-1 변이체-3 HAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVRGR G 4
제1 링커 GGGGSGGGGS GGGGSGGAES KYGPPCPPCP 5
hIgG4Fc APEAAGGPSVFLFPPKPKDQLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVLHEALHNHYTQKSLSLSLG 6
제2 링커 GGGGSGGGGSGGGGSGG 7
IL-1Ra RPSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVPIEPHALFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQEDE 8
GI-210B1
(GLP-1-IgG4 Fc-IL-1Ra)		 HGEGTFTSDV SSYLEEQAAK EFIAWLVKGG G
GGGGSGGGGSGGGGSGGAESKYGPPCPPCP
APEAAGGPSVFLFPPKPKDQLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVLHEALHNHYTQKSLSLSLG
GGGGSGGGGSGGGGSGG
RPSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVPIEPHALFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQEDE		 10
융합단백질 이량체
본 발명의 다른 측면은, 전술한 융합단백질이 두 개가 결합된 융합단백질 이량체를 제공한다. 이때, 상기 융합단백질은 GLP-1 또는 이의 변이체와 면역글로불린 Fc 영역을 연결하는 링커에 포함된 시스테인에 의해 결합될 수 있다. 이때, 상기 링커는 면역글로불린의 힌지 영역을 포함할 수 있다.
융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 GLP-1 또는 이의 변이체 및 IL-1 수용체 길항제(IL-1Ra) 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이때, 상기 폴리뉴클레오티드의 일 구체예는 서열번호 18 또는 서열번호 20을 포함할 수 있다.
상기 GLP-1 또는 이의 변이체 및 IL-1 수용체 길항제 또는 이의 단편은 전술한 바와 같다.
상기 폴리뉴클레오티드는 신호서열(signal sequence) 또는 리더 서열(leader sequence)을 추가적으로 포함할 수 있다. 여기에서 사용된 용어 "신호서열"은 목적 단백질의 분비를 지시하는 신호펩타이드를 코딩하는 핵산을 의미한다. 상기 신호펩타이드는 숙주 세포에서 번역된 후에 절단된다. 구체적으로, 본원 발명의 신호서열은 ER(endoplasmic reticulum) 막을 관통하는 단백질의 이동을 개시하는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드이다.
신호서열은 당업계에 그 특징이 잘 알려져 있으며, 통상 16 내지 30개의 아미노산 잔기를 포함하나, 그보다 더 많거나 적은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 통상적인 신호 펩타이드는 기본 N-말단 영역, 중심의 소수성 영역, 및 보다 극성인(polar) C-말단 영역의 세 영역으로 구성된다. 중심 소수성 영역은 미성숙 폴리펩타이드가 이동하는 동안 막지질 이중층을 통하여 신호서열을 고정시키는 4 내지 12개의 소수성 잔기를 포함한다.
개시 이후에, 신호서열은 흔히 신호 펩티다아제(signal peptidases)로 알려진 세포 효소에 의하여 ER의 루멘(lumen) 내에서 절단된다. 이때, 상기 신호서열은 tPa(tissue Plasminogen Activation), HSV gDs(signal sequence of Herpes simplex virus glycoprotein D), IgG 신호서열 또는 성장 호르몬(growth hormone)의 분비신호서열일 수 있다. 바람직하게, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵 세포에서 사용되는 분비 신호서열을 사용할 수 있다.
본원 발명에서 유용한 신호서열은 항체 경쇄 신호서열, 예를 들면 항체 14.18(Gillies et al., J. Immunol. Meth 1989. 125:191-202), 항체 중쇄 신호서열, 예를 들면, MOPC141 항체 중쇄 신호서열(Sakano et al., Nature, 1980. 286: 676-683), 및 당업계에 알려진 다른 신호서열(예, Watson et al., Nucleic Acid Research, 1984. 12:5145-5164를 참조)을 포함한다. 일 실시예로 신호서열로서 서열번호 9의 아미노산으로 구성된 신호서열이 이용되었다.
폴리뉴클레오티드가 적재된 벡터
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 GLP-1 또는 이의 변이체 및 IL-1 수용체 길항제 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 이때, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 18의 서열을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "벡터"는 숙주 세포에 도입되어 숙주 세포 유전체 내로 재조합 및 삽입될 수 있다. 또는 상기 벡터는 에피좀으로서 자발적으로 복제될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 수단으로 이해된다. 이때, 벡터는 숙주세포에서 상기 폴리뉴클레오티드가 발현될 수 있도록 적절한 프로모터에 작동가능하도록 연결된 것일 수 있으며, 선형 핵산, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, RNA 벡터, 바이러스 벡터, 미니-염색체 및 이의 유사체들을 포함한다. 바이러스 벡터의 예로는 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 플라스미드는 항생제 내성 유전자와 같은 선별 마커를 포함할 수 있고, 플라스미드를 유지하는 숙주 세포는 선택적인 조건하에서 배양될 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어, 목적 단백질의 "유전자 발현" 또는 "발현"은 DNA 서열의 전사, mRNA 전사체의 번역 및 융합 단백질 생산물 또는 이의 단편의 분비를 의미하는 것으로 이해된다. 유용한 발현 벡터는 RcCMV(Invitrogen, Carlsbad) 또는 이의 변이체일 수 있다. 상기 발현 벡터는 포유류 세포에서 목적 유전자의 연속적인 전사를 촉진하기 위한 인간 CMV(cytomegalovirus) 프로모터 및 전사 후 RNA의 안정상태 수준을 높이기 위한 우태 성장 인자(bovine growth hormone) 폴리아데닐레이션 신호서열을 포함할 수 있다.
융합단백질을 발현하는 형질전환 세포
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 GLP-1 또는 이의 변이체 및 IL-1 수용체 길항제 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터가 도입된 형질전환 세포를 제공한다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "형질전환 세포"는 재조합 발현 벡터가 도입될 수 있는 원핵 세포 및 진핵 세포를 나타낸다. 상기 형질전환 세포는 벡터를 숙주 세포에 도입하여 형질전환시켜서 제작될 수 있다. 또한, 상기 벡터에 포함된 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 본 발명의 융합단백질을 생산할 수 있다.
상기 형질전환은 다양한 방법에 의하여 수행될 수 있다. 본 발명의 융합단백질을 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않는다, 구체적으로, 상기 형질전환 방법은 CaCl2 침전법, CaCl2 침전법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 사용될 수 있다. 또한, 감염(infection)을 수단으로 하여 바이러스 입자를 사용하여 목적물을 세포 내로 전달시킬 수 있다. 또한, 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 도입할 수 있다.
또한, 상기 형질전환 세포의 제작에 사용되는 숙주 세포 역시 본 발명의 융합단백질을 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않는다. 구체적으로 상기 숙주 세포는 원핵 세포, 진행 세포, 포유동물, 식물, 곤충, 균류 또는 세포성 기원의 세포를 포함할 수 있다. 상기 원핵 세포의 일 예로는 대장균을 사용할 수 있다. 또한, 진핵 세포의 일 예로는 효모를 사용할 수 있다. 또한, 상기 포유동물 세포로 CHO 세포, F2N 세포, COS 세포, BHK 세포, 바우스(Bowes) 흑색종 세포, HeLa 세포, 911 세포, AT1080 세포, A549 세포, SP2/0 세포, 인간 림프아구(human lymphoblastoid), NSO 세포, HT-1080 세포, PERC.6 세포, HEK 293 세포 또는 HEK293T 세포 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 당업자에게 알려진 포유동물 숙주 세포로 사용 가능한 세포는 모두 이용 가능하다.
융합단백질의 생산방법
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 GLP-1 또는 이의 변이체 및 IL-1 수용체 길항제 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질 이량체의 제조 방법을 제공한다.
상기 융합단백질의 생산방법은 i) 상기 형질전환 세포를 배양하는 단계; 및 ii) GLP-1 또는 이의 변이체 및 IL-1 수용체 길항제 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질 이량체를 회수하는 단계를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "배양"이란, 미생물을 인공적으로 적당히 조절한 환경조건에서 생육시키는 방법을 의미한다.
상기 형질전환 세포를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로, 상기 배양은 본 발명의 융합단백질을 발현시켜서 생산할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 배양은 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다.
또한, 배양물로부터 상기 융합단백질을 회수하는 단계는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 회수 방법은 생산된 본 발명의 융합단백질을 회수할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 회수 방법은 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증발, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄설페이트 침전), 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법일 수 있다.
융합단백질 이량체의 용도
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 융합단백질 이량체를 포함하는 대사성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 이때, 약학 조성물의 용도는 대사성 질환을 예방 또는 치료하기 위한 것일 수 있다.
전술한 바와 같이, 상기 융합단백질은 GLP-1 또는 이의 변이체 및 IL-1 수용체 길항제 또는 이의 단편을 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "대사성 질환"은 생체 내 물질대사 장애에 의해서 발생하는 질환의 총칭으로, 이에 제한되지는 않으나, 당뇨병, 비만, 고지혈증, 고혈압, 동맥경화 및 고인슐린혈증으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
상기 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 대사성 질환 치료용 또는 예방용 약학 조성물에서 상기 융합단백질 이량체는 대사성 질환 치료 활성을 나타내거나, 특히, 당뇨병, 비만 등의 질환에 치료 효과를 나타낼 수 있는 한, 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함될 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량% 내지 20.0 중량% 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 질환의 상태 개선 또는 치료(treatment) 효과, 특히 당뇨병, 비만 등과 같은 대사성 질환의 상태 개선 또는 치료 효과를 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "치료"는 치료학적 처리 및 예방적 처리를 모두 포함하는 의미로 사용될 수 있다. 이때, 예방은 개체의 병리학적 상태 또는 질환을 완화시키거나 감소시키는 의미로 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 용어 "치료"는 인간을 포함한 포유류에서 질환을 치료하기 위한 적용이나 어떠한 형태의 투약을 모두 포함한다. 또한, 상기 용어는 질환의 진행을 억제하거나 늦추는 것을 포함하며; 손상되거나, 결손된 기능을 회복시키거나, 수리하여, 질환을 부분적이거나 완전하게 완화시키거나; 또는 비효율적인 프로세스를 자극하거나; 심각한 질환을 완화하는 의미를 포함한다.
생체이용률과 같은 약동학적 파라미터(Pharmacokinetic parameters) 및 클리어런스율(clearance rate)과 같은 기본적인 파라미터(underlying parameters)도 효능에 영향을 줄 수 있다. 따라서, "향상된 효능"(예를 들어, 효능의 개선)은 향상된 약동학적 파라미터 및 향상된 효능에 기인할 수 있으며, 시험 동물 또는 인간 대상체에서 클리어런스율 및 대사성 질환 치료 또는 개선과 같은 파라미터를 비교하여 측정될 수 있다.
한편, 본 발명의 약학적 조성물은 "치료학적으로 유효한 양"으로 투여한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "투여"란, 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "치료학적으로 유효한 양" 또는 "약학적으로 유효한 양"이란 대상 질환을 예방 또는 치료하는데 유효한 화합물 또는 조성물의 양으로서, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다. 상기 유효량의 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 일 구현예에서 치료학적으로 유효한 양은 대사성 질환을 치료하는데 효과적인 약물의 양을 의미한다.
이때, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 환자에게 전달하기에 적절한 비-독성 물질이면 어떠한 담체라도 가능하다. 증류수, 알코올, 지방, 왁스 및 비활성 고체가 담체로 포함될 수 있다. 약물학적으로 허용되는 애쥬번트(완충제, 분산제) 또한 약학 조성물에 포함될 수 있다.
구체적으로, 상기 약학 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 여기서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다.
상기 약학 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사제로 제제화할 경우 적합한 담체로서는 멸균수, 에탄올, 글리세롤이나 프로필렌 글리콜 등의 폴리올 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 약제학적 조성물의 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 구체적으로 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주된다.
상기 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 1일 0.01 ㎍/㎏ 내지 10 g/㎏ 범위, 또는 0.01 ㎎/㎏ 내지 1 g/㎏ 범위일 수 있다. 투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.
상기 약학 조성물이 적용(처방)될 수 있는 대상은 포유동물 및 사람이며, 특히 사람인 경우가 바람직하다. 본 발명의 약학 조성물은 대사성 질환 치료 효과를 갖는 것으로 공지된 임의의 화합물이나 천연 추출물을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약제를 제조하기 위한 상기 융합단백질 이량체의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 대사성 질환을 예방하거나 치료하기 위한 상기 융합단백질 이량체의 대사성 질환 예방 또는 치료용 용도를 제공한다. 여기서 융합단백질 이량체, 대사성 질환, 예방 및 치료는 전술한 바와 같다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 융합단백질 이량체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 대사성 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 여기서 융합단백질 이량체, 투여, 대사성 질환, 예방 및 치료는 전술한 바와 같다. 상기 개체는 포유동물일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다. 또한, 상기 개체는 대사성 질환을 앓는 환자이거나 대사성 질환을 앓을 가능성이 큰 개체일 수 있다.
상기 융합단백질 이량체의 투여경로, 투여량 및 투여횟수는 환자의 상태 및 바작용의 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 대상에게 투여될 수 있고, 최적의 투여방법, 투여량 및 투여횟수는 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택할 수 있다. 또한, 상기 융합단백질 이량체는 대사성 질환 치료 효과를 갖는 것으로 공지된 임의의 화합물이나 천연 추출물과 병용하여 투여되거나, 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
제조예 1. GLP-1-IgG4 Fc-IL-1Ra 융합단백질 이량체의 제조: GI-210B1
GLP-1(glucagon-like peptide-1), Fc 도메인 및 IL-1 수용체 길항제(interleukin-1 receptor antagonist, IL-1Ra)를 포함하는 융합단백질 이량체를 생산하기 위하여 GLP-1(서열번호 2), NL028 힌지 링커(서열번호 5), IgG4 Fc 도메인(서열번호 6), 링커(서열번호 7) 및 IL-1Ra(서열번호 8)를 포함하는 융합단백질(도 1)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 20)를 pcDNA3.4 벡터(Genscript)에 적재하였다. 상기 벡터를 CHO 세포(ExpiCHO-S cell)에 도입하여 서열번호 10의 아미노산 서열을 가지는 융합단백질을 발현시켰다. 벡터를 도입한 후 37℃, CO2 8% 조건에서 무혈청(serum-free) ExpiCHOTM 발현 배지(Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 14일간 배양하였다. 배양 후 배양액을 수거하고, 이를 친화크로마토그래피(Affinity purification column)를 이용하여 융합단백질을 정제하였다.
상기 정제된 융합단백질에 대하여 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯(western blot)을 수행하여 분자량 및 순도를 확인하였다. SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석 결과, 비환원(non-reducing) 조건 및 환원(reducing) 조건하에서 단백질이 검출되는 것으로 확인되었다. 이를 통해 상기 정제된 융합단백질이 이량체를 형성하고 있음을 알 수 있었다(도 2 및 도 3). 상기 융합단백질 이량체를 "GI-210B1(GLP-1-IgG4 Fc-IL-1Ra로도 칭함)"으로 명명하였다.
제조예 2. GLP-1-IgG4 Fc 융합단백질 이량체의 제조
대조군으로서 GLP-1(glucagon-like peptide-1) 및 Fc 도메인을 포함하는 융합단백질 이량체를 생산하기 위하여 GLP-1(서열번호 2), NL028 힌지 링커(서열번호 5) 및 IgG4 Fc 도메인(서열번호 6)을 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 23)를 pcDNA3.4 벡터(Genscript)에 적재하였다. 상기 벡터를 CHO 세포(ExpiCHO-S cell)에 도입하여 서열번호 22의 아미노산 서열을 가지는 융합단백질을 발현시켰다. 벡터를 도입한 후 37℃, CO2 8% 조건에서 무혈청(serum-free) ExpiCHOTM 발현 배지(Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 14일간 배양하였다. 배양 후 배양액을 수거하고, 이를 친화크로마토그래피(Affinity purification column)를 이용하여 융합단백질을 정제하였다.
실험예 1. GI-210B1 융합단백질 이량체의 IL-1Rα 결합능 확인
상기 제조예 1의 방법을 통해 수득한, GI-210B1의 IL-1Rα(interleukin-1 receptor alpha)에 대한 결합능을 측정하였다. 이때, IL-1Rα 결합능은 Octet RED 384(ForteBio)를 이용하여 확인하였다. AR2G(Amine Reactive 2nd generation) 바이오센서를 10분간 1Х 카이네틱 버퍼(kinetic buffer)에 침지시켜 사용하였다. IL-1Rα(R&D systems)를 1 ㎍/㎖로 만들어 바이오센서에 코팅하고, GI-210B1을 15.6~1,000 nM로 단계 희석시킨 다음 각각의 농도에서 결합능을 확인하였다. GI-210B1와 IL-1Rα의 결합력은 도 4 및 하기 표 2에 나타낸 바와 같다.
Ka
(Association rate, 1/Ms)		 Kd
(Dissociation rate, 1/s)		 KD
(Kd/Ka, M)
2.20E+04 9.30E-03 423 nM
실험예 2. GI-210B1 융합단백질 이량체의 IL-1Ra 효능 확인
GI-210B1의 IL-1 수용체 길항제(IL-1Ra)로서의 효능을 확인하였다. 첫째날, THP-1 세포(ATCC)를 배양 배지(RPMI-1640 + 10% FBS + 1% 페니실린/스트렙토마이신 + 0.05 nM 2-머캅토에탄올)에서 배양하였다. 분석에 앞서, THP-1 세포를 5분 동안 1,500 rpm에서 원심분리하여 침전시키고, 배지를 제거한 다음 세포를 재현탁시켰다. 세포를 96-웰(well) 플레이트의 각 웰에 3Х105 개의 세포를 접종한 후, LPS(1 ㎍/㎖)를 추가하여 3시간 동안 배양하였다. 그 후, 염증 반응의 매개물질인 인플라마솜(Inflammasome)의 유도물질로서 ATP(adenosine triphosphate)를 5 mM 처리하여 밤새 배양하였다. 상층액을 5분 동안 1,500 rpm에서 원심분리하여 침전시키고, 상층액을 새로운 튜브에 옮겨 보관하였다.
둘째 날, HEK-BlueTM-IL-1β 세포(Invitrogen)를 배양 배지(DMEM + 10% FBS + 1% 페니실린/스트렙토마이신 + 100 ㎍/㎖ 노르모신(normocin))에서 배양하였다. 분석에 앞서, HEK-BlueTM-IL-1β 세포를 5분 동안 1,500 rpm에서 원심분리하여 침전시키고 배지를 제거한 다음 분석 배지(RPMI-1640 + 10% FBS + 1% 페니실린/스트렙토마이신)에 세포를 재현탁시켰다. 세포를 분석 배지내 96-웰 플레이트의 각 웰에 4.5Х104 개의 세포를 접종한 후, 다양한 농도(0.2 ng/㎖, 2 ng/㎖, 20 ng/㎖ 및 200 ng/㎖)의 GI-210B1 융합단백질 및 THP-1 상층액을 50 ㎕ 추가하여 밤새 배양하였다.
셋째 날, 상층액을 5분 동안 1,500 rpm에서 원심분리하여 침전시키고, 상층액 20 ㎕와 QUANTI-Blue 용액 180 ㎕를 96-웰 플레이트의 각 웰에 분주한 후, 3시간 동안 반응시켰다. 그 다음 플레이트 판독기를 사용하여 650 ㎚ 파장에서의 흡광도를 기록하였다. 데이터는 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 그 결과, GI-210B1 융합단백질이 농도 의존적으로 IL-1 신호를 억제함을 확인할 수 있었다(도 5a 및 도 5b).
실험예 3. GI-210B1 융합단백질 이량체의 GLP-1 효능 확인
GI-210B1에 포함된 GLP-1의 효능을 확인하고자, 세포 성장에 있어서 GLP-1에 의존적인 세포주인 PC-12 세포를 이용하여 실험을 수행하였다. 즉, PC-12 세포 내에서 GI-210B1 융합단백질에 포함된 GLP-1에 의해 매개되는 세포 증식을 측정하였다.
먼저, PC-12 세포(ATCC, #CRL-1721TM)를 배양 배지(RPMI-1640 + 10% FBS + 1% 페니실린/스트렙토마이신)에서 배양하였다. 분석에 앞서, PC-12 세포를 5분 동안 1,500 rpm에서 원심분리하여 침전시키고, 배지를 제거한 다음 세포를 FBS가 불포함된 분석 배지에 재현탁시켰다. 세포를 분석 배지 내에서 96-웰 플레이트의 각 웰에 5Х104 개의 세포를 접종하였다. 다양한 농도(0.1 nM, 0.2 nM, 0.4 nM, 0.8 nM, 1.6 nM, 3.1 nM, 6.25 nM, 12.5 nM, 25 nM, 50 nM 및 100 nM)의 GI-210B1 융합단백질을 웰에 첨가하였다. 분석 플레이트를 5% CO2, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 4시간 동안 WST-1(Roche)을 각 웰에 10 ㎕씩 추가하여 배양하였다. 그 기간 후에, 플레이트 판독기를 사용하여 450 ㎚ 파장에서의 흡광도를 기록하였다. 데이터는 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 그 결과, GI-210B1 융합단백질이 PC-12 세포 성장을 농도 의존적으로 증가시키는 것으로 나타났다(도 6).
실험예 4. GI-210B1 융합단백질 이량체의 팔미테이트와 올레익산에 의한 간세포 내 지방축적억제능 확인
GI-210B1이 IL-1β에 의해 유도되는 간세포 내 지방축적을 억제하는지 확인하고자, 간세포인 Huh1 세포를 이용하여 실험을 수행하였다. Huh1 세포는 배양 배지(DMEM + 10% FBS + 1% 페니실린/스트렙토마이신)를 이용하여 5% CO2, 37℃ 인큐베이터에서 배양하였다. 실험을 위해 세포를 0.05% Trypsin-EDTA를 이용하여 떼어낸 후, 5분 동안 1,500 rpm에서 원심분리하여 침전시켰다. 그 후, 새 배지에 재현탁시켜 96-웰 플레이트의 각 웰에 1Х104개의 세포를 접종하고 24시간 배양하였다. 지방 축적을 유도하기 위해, 100 μM 팔미테이트(palmitate)와 200 μM 올레익산(oleic acid)을 2% BSA-serum free DMEM에 섞어 55℃에서 15분 동안 반응시킨 후, 세포에 처리할 때 1 ㎍/㎖ IL-1Ra(peprotech, 200-01RA), 3.6 ㎍/㎖ GLP-1-Fc 또는 4.6 ㎍/㎖ GI-210B1을 각각 처리하였다. 24시간 처리 후, 지방 축적 정도를 확인하기 위해 세포를 4% 파라포름알데하이드로 고정하고 BODIPY 493/503과 DAPI로 염색한 후 cytation 5 이미지 장비를 사용하여 세포당 지방 축적 정도를 수치화하였다. 그 결과, GI-210B1 융합단백질이 IL-1Ra 또는 GLP-1-Fc에 비해 팔미테이트와 올레익산에 의해 유도되는 지방 축적을 유의하게 억제함을 확인하였다(도 7).

Claims (17)

  1. GLP-1 또는 이의 변이체 및 IL-1 수용체 길항제(interleukin-1 receptor antagonist) 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 융합단백질은 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 것인, 융합단백질.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 GLP-1은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것인, 융합단백질.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 GLP-1의 변이체는 서열번호 2 내지 4 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 것인, 융합단백질.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 IL-1 수용체 길항제는 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 것인, 융합단백질.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 융합단백질은 하기 구조식 (I) 또는 (II)로 이루어진 것인, 융합단백질:
    N'-X-[링커(1)]n-Fc 영역 단편 또는 이의 변이체-[링커(2)]m-Y-C' (I)
    N'-Y-[링커(1)]n-Fc 영역 단편 또는 이의 변이체-[링커(2)]m-X-C' (II)
    이때, 상기 구조식 (I) 및 (II)에 있어서,
    상기 N'은 융합단백질의 N-말단이고,
    상기 C'는 융합단백질의 C-말단이며,
    상기 X는 GLP-1 또는 이의 변이체이고,
    상기 Y는 IL-1 수용체 길항제 또는 이의 단편이며,
    상기 링커(1) 및 링커(2)는 펩타이드 링커이고,
    상기 n 및 m은 각각 독립적으로, O 또는 1이다.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 융합단백질의 Fc 영역은 인간 IgG4 유래인 것인, 융합단백질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 융합단백질 두 개가 결합된 융합단백질 이량체.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  10. 제9항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  11. 제10항의 벡터가 도입된 형질전환 세포.
  12. i) 제11항의 형질전환 세포를 배양하는 단계; 및
    ii) 융합단백질 이량체를 회수하는 단계;
    를 포함하는 GLP-1 또는 이의 변이체 및 IL-1 수용체 길항제(interleukin-1 receptor antagonist) 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질 이량체의 제조 방법.
  13. 제8항의 융합단백질 이량체를 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 대사성 질환은 당뇨병, 비만, 고지혈증, 고혈압, 동맥경화 및 고인슐린혈증으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것인, 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  15. 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약제를 제조하기 위한 제8항의 융합단백질 이량체의 용도.
  16. 대사성 질환을 예방하거나 치료하기 위한 제8항의 융합단백질 이량체의 대사성 질환 예방 또는 치료용 용도.
  17. 제8항의 융합단백질 이량체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 치료 방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023168411A1 (en) * 2022-03-03 2023-09-07 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Aav vectors for delivery of glp-1 receptor agonist fusions

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4464329A4 (en) * 2022-01-10 2025-06-11 GI Innovation, Inc. PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR THE PREVENTION OR TREATMENT OF DEGENERATIVE BRAIN DISEASES, CONTAINING A GLUCAGON-LIKE PEPTIDE-1 AND AN INTERLEUKIN-1 RECEPTOR ANTAGONIST

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012053828A2 (ko) * 2010-10-20 2012-04-26 주식회사 한독약품 인간 인터루킨-1 수용체 길항제-하이브리드 Ｆｃ 융합단백질
KR20150043505A (ko) * 2012-09-07 2015-04-22 사노피 대사 증후군의 치료용 융합 단백질
US20200002397A1 (en) * 2012-05-18 2020-01-02 Adda Biotech Inc. Protein and protein conjugate for diabetes treatment, and applications thereof

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014504588A (ja) * 2010-12-22 2014-02-24 アミリン・ファーマシューティカルズ，リミテッド・ライアビリティ・カンパニー 膵島細胞移植のためのｇｌｐ−１受容体アゴニスト
EP2723359A4 (en) * 2011-06-24 2015-03-11 Amylin Pharmaceuticals Llc METHOD FOR THE TREATMENT OF DIABETES WITH THE HELP OF DELAYED RELEASED FORMULATIONS FROM GLP-1 RECEPTOR AGONISTS

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012053828A2 (ko) * 2010-10-20 2012-04-26 주식회사 한독약품 인간 인터루킨-1 수용체 길항제-하이브리드 Ｆｃ 융합단백질
US20200002397A1 (en) * 2012-05-18 2020-01-02 Adda Biotech Inc. Protein and protein conjugate for diabetes treatment, and applications thereof
KR20150043505A (ko) * 2012-09-07 2015-04-22 사노피 대사 증후군의 치료용 융합 단백질

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Remington's Pharmaceutical Sciences", 1995
CHARLES A DINARELLO, NAT REV DRUG DISCOV., vol. 11, no. 8, 2012, pages 633 - 652
DOMINIC DE NARDO, TRENDS IMMUNOL., vol. 32, no. 8, 2011, pages 373 - 379
GILLIES ET AL., J. IMMUNOL. METH, vol. 125, 1989, pages 191 - 202
SAKANO ET AL., NATURE, vol. 286, 1980, pages 676 - 683
See also references of EP4180452A4
WANG Q, ET AL: "Novel GLP-1 Fusion chimera as potent long acting GLP-1 receptor agonist", PLOS ONE, PUBLIC LIBRARY OF SCIENCE, US, vol. 5, no. 9, 1 September 2010 (2010-09-01), US , pages 1 - 9, XP003028384, ISSN: 1932-6203, DOI: 10.1371/JOURNAL.PONE.0012734 *
WATSON ET AL., NUCLEIC ACID RESEARCH, vol. 12, 1984, pages 5145 - 5164
XIE BO, LIU SHAN, WU SHUYIN, CHANG ALAN, JIN WEIYUAN, GUO ZHIXIANG, YE SHUAIDONG, HUI MIZHOU: "A Novel Bifunctional Protein TNFR2-Fc-IL-1ra (TFI): Expression, Purification and its Neutralization Activity of Inflammatory Factors", MOLECULAR BIOTECHNOLOGY, SPRINGER US, NEW YORK, vol. 54, no. 2, 1 June 2013 (2013-06-01), New York, pages 141 - 147, XP055885491, ISSN: 1073-6085, DOI: 10.1007/s12033-012-9550-7 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023168411A1 (en) * 2022-03-03 2023-09-07 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Aav vectors for delivery of glp-1 receptor agonist fusions

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