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WO2022009959A1 - 核酸オリゴマーの製造方法 - Google Patents

核酸オリゴマーの製造方法 Download PDF

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WO2022009959A1
WO2022009959A1 PCT/JP2021/025835 JP2021025835W WO2022009959A1 WO 2022009959 A1 WO2022009959 A1 WO 2022009959A1 JP 2021025835 W JP2021025835 W JP 2021025835W WO 2022009959 A1 WO2022009959 A1 WO 2022009959A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
group
nucleic acid
trichloroacetic acid
formula
formaldehyde
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2021/025835
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
雄樹 田中
英貴 奥村
俊史 加納
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sumitomo Chemical Co Ltd
Original Assignee
Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sumitomo Chemical Co Ltd filed Critical Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority to US18/003,630 priority Critical patent/US20230242570A1/en
Priority to JP2022535389A priority patent/JP7759323B2/ja
Priority to KR1020227045527A priority patent/KR20230034969A/ko
Priority to EP21836863.7A priority patent/EP4180442A4/en
Priority to CN202180047319.8A priority patent/CN115867559A/zh
Publication of WO2022009959A1 publication Critical patent/WO2022009959A1/ja
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C51/00—Preparation of carboxylic acids or their salts, halides or anhydrides
    • C07C51/42—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives
    • C07C51/43—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives by change of the physical state, e.g. crystallisation
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    • C07C51/46—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives by change of the physical state, e.g. crystallisation by distillation by azeotropic distillation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07C53/00—Saturated compounds having only one carboxyl group bound to an acyclic carbon atom or hydrogen
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
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    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a nucleic acid oligomer.
  • nucleic acid oligomers include nucleic acids that induce RNA interference (RNAi) such as antisense nucleic acids, aptamers, ribozymes, and siRNA, which are called nucleic acid drugs.
  • RNAi RNA interference
  • the nucleic acid oligomer can be synthesized by a solid-phase synthesis method, and the nucleic acid oligomer synthesized by extending the nucleic acid on the solid-phase carrier is cut out from the solid-phase carrier, and then the nucleic acid oligomer containing ribose is 2'of ribose.
  • the desired nucleic acid oligomer is produced by deprotecting and removing the protecting group of the hydroxyl group at the position.
  • phosphoramidite of nucleoside (hereinafter referred to as "amidite”) is used as a raw material, and it is known that the protecting group of the hydroxyl group at the 5'position is deprotected by using a trichloroacetic acid solution.
  • the yield of the nucleic acid oligomer synthesized using the conventional trichloroacetic acid solution was not always satisfactory, and the synthesis was not efficient (Patent Document 1).
  • An object of the present invention is to provide an efficient method for producing a nucleic acid oligomer.
  • the present inventors used a trichloroacetic acid solution having a formaldehyde concentration below a certain level or improved the quality of trichloroacetic acid when synthesizing a nucleic acid oligomer. Provided is an efficient method for producing a nucleic acid oligomer, which is used later.
  • Equation (1) (During the ceremony, G 2 represents a hydroxyl-protecting group.
  • B a is independently, the same or different and each represents a nucleic acid base which may be protected by a protecting group, R 1 , R 2 and R 3 independently represent a hydrogen atom or an alkoxy group, which are the same or different from each other.
  • R independently represents the same or differently protected hydroxyl group, hydrogen atom, fluorine atom, methoxy group, 2-methoxyethyl group, or OQ'group.
  • Q' is independently the same or different from the methylene group bonded to the carbon atom at the 4'position of ribose, the ethylene group bonded to the carbon atom at the 4'position of ribose, or the ribose.
  • Y independently represents an oxygen atom or a sulfur atom, which is the same or different from each other.
  • n represents an integer of 1 to 200 and represents W 1 represents an OZ group and X 1 represents an R group, or W 1 represents an OV group and X 1 represents an OZ group.
  • V represents a hydroxyl-protecting group
  • Z is a group having a structure consisting of a solid phase carrier and a linking group.
  • n is an integer of 2 or more
  • the nucleic acid oligomer represented by the formula (1) may have a non-nucleotide linker incorporated between the respective nucleotides.
  • the formula (2) includes a step of reacting the nucleic acid oligomer represented by (2) with a trichloroacetic acid solution having a molar ratio of formaldehyde to trichloroacetic acid (formaldehyde mol / trichloroacetic acid mol) of 11 ⁇ 10-5 or less.
  • G 2 , Ba , R, Y, X 1 , W 1 and n are as described above, and As defined in formula (1), a non-nucleotide linker may be incorporated between the nucleotides.
  • the formula includes the step described in the preceding item 1, a step of removing the group represented by Z from the nucleic acid oligomer represented by the formula (2) produced in the step, and a step of removing the protecting group of the hydroxyl group and the nucleobase. (2'):
  • B c represents a nucleobase independently, identically or differently.
  • G 4 are each, independently, the same or different and each represents a hydrogen atom, an alkali metal ion, an ammonium ion, an alkyl ammonium ion, or a hydroxyalkyl ammonium ion, R'independently represents the same or different, hydroxyl group, hydrogen atom, fluorine atom, methoxy group, 2-methoxyethyl group, or OQ'group.
  • Q' is as described above, and X 3 and W 3 each independently represent a hydroxyl group, or X 3 represents an R'group and W 3 represents a hydroxyl group.
  • the nucleic acid oligomer represented by the formula (2) is arbitrarily extended in chain length by the amidite method (3):
  • G 4 are each, independently, the same or different and each represents a hydrogen atom, an alkali metal ion, an ammonium ion, an alkyl ammonium ion, or a hydroxyalkyl ammonium ion
  • B C are each independently the same or different, it represents a nucleobase
  • X 2 represents a hydroxyl group and W 2 represents an OV group
  • X 2 represents an R group and W 2 represents a hydroxyl group
  • V represents a hydroxyl-protecting group.
  • G 4 , B c , Y and m are as described above, and R'is independently the same or different from each other, and is a hydroxyl group, a hydrogen atom, a fluorine atom, a methoxy group, a 2-methoxyethyl group, or Represents the OQ'group Q'is as described above, and X 3 and W 3 each independently represent a hydroxyl group, or X 3 represents an R'group and W 3 represents a hydroxyl group.
  • Item 5 The production method according to item 4 above, wherein the linker consisting of an amino acid skeleton is a linker having a structure selected from the group consisting of the following formulas (A14-1), (A14-2) and (A14-3).
  • R a and R b independently represent a methyl group, an ethyl group or a hydrogen atom, which are the same or different from each other.
  • the * mark indicates the bond point with the oxygen atom derived from the hydroxyl group at the 2'position of ribose, and E W represents an electron-withdrawing group.
  • Item 11 R a and R b are hydrogen atoms at the same time, and, E W is a cyano group, a manufacturing method according to item 10.
  • Item 13 The production method according to any one of the above items 1 to 11, wherein the nucleic acid oligomer is an oligomer having a length of 40 chains or more.
  • nucleic acid oligomer is an oligomer having a length of 50 chains or more.
  • nucleic acid oligomer is an oligomer having a length of 60 chains or more.
  • nucleic acid oligomer is an oligomer having a length of 80 chains or more.
  • nucleic acid oligomer is an oligomer having a chain length of 100 or more.
  • Item 18 The trichloroacetic acid solution according to item 17, wherein the molar ratio of formaldehyde to trichloroacetic acid (formaldehyde mol / trichloroacetic acid mol) is 54 ⁇ 10-6 or less.
  • the present invention provides an efficient method for producing a nucleic acid oligomer.
  • the production method of the present invention can be expected to improve the yield of the produced nucleic acid oligomer.
  • FIG. 1 is Scheme A showing a typical example of producing the nucleic acid oligomer represented by the formula (5) from the nucleic acid oligomer represented by the formula (1).
  • the G 1 can be used without particular limitation so long as it can function as a protecting group of a hydroxyl group, can be widely used known protecting groups used in amidite compound.
  • G 3 may independently represent an alkyl group, which is the same or different from each other, or two G 3s may be bonded to each other to form a cyclic structure.
  • the G 3 each independently, the same or different from each other, alkyl groups such as methyl group, ethyl group, preferably a propyl group or an isopropyl group, and more preferably both are isopropyl.
  • alkyl groups such as methyl group, ethyl group, preferably a propyl group or an isopropyl group, and more preferably both are isopropyl.
  • Other symbols are as described above.
  • a method of reacting the nucleic acid oligomer represented by the formula (1) with a trichloroacetic acid solution having a formaldehyde concentration of a certain level or less to obtain the nucleic acid oligomer represented by the formula (2) will be described.
  • the molar ratio of formaldehyde to trichloroacetic acid (mol of formaldehyde / mol of trichloroacetic acid) in the trichloroacetic acid solution of the present invention is usually 11 ⁇ 10-5 or less, preferably 54 ⁇ 10-6 or less, more preferably 27 ⁇ . It is 10-6 or less.
  • Examples of the trichloroacetic acid solution of the present invention include those containing formaldehyde within the range of the molar ratio of formaldehyde to trichloroacetic acid.
  • the concentration of trichloroacetic acid in the trichloroacetic acid solution is usually 0.1 to 1.2 M, preferably 0.1 to 0.6 M, and more preferably 0.1 to 0.3 M.
  • the diluting solvent for trichloroacetic acid is not particularly limited as long as it is not involved in the reaction, and examples thereof include dichloromethane, acetonitrile, aromatic organic solvent, water or any mixed solvent, preferably dichloromethane, acetonitrile, and aromatic organic. At least one solvent selected from the group consisting of solvents can be mentioned, and more preferably aromatic organic solvents can be mentioned. As the aromatic organic solvent, toluene can be mentioned.
  • the reaction temperature in the above reaction is preferably 0 to 40 ° C, more preferably 10 to 30 ° C.
  • Formaldehyde in the trichloroacetic acid solution can be removed by co-boiling with any solvent or any mixed solvent, and the amount thereof can be reduced.
  • the co-boiling solvent any solvent having a lower boiling point than trichloroacetic acid can be used.
  • the aromatic organic solvent toluene can be mentioned.
  • the boiling point of the azeotropic solvent is preferably 200 ° C. or lower, more preferably 198 ° C. or lower.
  • a glass container, a plastic container, or a metal container can be used for storing the trichloroacetic acid solution.
  • a container made of polyethylene or polypropylene can be used
  • a container made of SUS or Hastelloy can be used as the plastic container.
  • the oxidizing solution can be stored under an air atmosphere or an inert gas atmosphere, and as the inert gas, argon, nitrogen, carbon dioxide, helium or the like can be used.
  • nucleic acid compound having a protecting group at the hydroxyl group at the 5'position examples include the nucleic acid compound of the above formula (1).
  • nucleic acid compound produced by reacting the trichloroacetic acid solution examples include the nucleic acid compound represented by the above formula (2).
  • the methylene group represented by Q' which is independently the same or different from the carbon atom at the 4'position of ribose, and the 4'position of ribose.
  • LNA-1, LNA-2, or LNA-2 of the following formula (7) examples include the structure represented by LNA-3.
  • B a represents a nucleic acid base which may be protected.
  • the group As a group having a structure consisting of a solid-phase carrier represented by Z and a linking group connecting the solid-phase carrier and the oxygen atom of the hydroxyl group at the 2'-position or 3'-position of ribose at the 3'end of the nucleic acid oligomer, the group is more suitable. Specifically, the structure represented by the following formula (8) can be mentioned.
  • Sp represents a spacer.
  • Examples of the spacer (Sp) include those having the structural formula shown in the following formula (9).
  • the Linker may be, for example, a structure represented by the following formula (10), or a structure having no hexamethyleneamino group moiety in the structure of the formula (10) and having an aminopropyl group bonded to Si. ..
  • the Linker may have a structure represented by the following formula (11).
  • A may be either a hydroxyl group, an alkoxy group, or an alkyl group.
  • the alkoxy group include a methoxy group and an ethoxy group.
  • the alkyl group include a methyl group, an ethyl group, an isopropyl group and an n-propyl group. It is shown that Si is bound to oxygen of the hydroxyl group on the surface of the carrier.
  • the solid support include an inorganic porous carrier and an organic resin carrier.
  • the inorganic porous carrier include Controlled Pore Glass (CPG).
  • the organic resin carrier include a carrier made of polystyrene.
  • the nucleosides (ribose and deoxyribose) contained in the nucleic acid oligomer used in the present invention include DNA, RNA, 2'-O-MOE (2'-O-methoxyethyl), 2'-O-Me, and the like.
  • 2'-F RNA and the above-mentioned LNA are exemplified, but the above-mentioned nucleoside is not limited thereto.
  • the method for synthesizing a nucleic acid oligomer by a solid phase synthesis method typically includes the following steps. (1) A step of deprotecting the 5'-position hydroxyl group of a nucleoside in which the hydroxyl group bonded to the solid phase carrier via a linker is protected. (2) A step of coupling the 5'-position hydroxyl group generated in the above step with a phosphoramidite compound to obtain a phosphorous acid triester compound.
  • the above steps (1) to (3) that is, a deprotecting step of the 5'-position hydroxyl group of the produced nucleic acid molecule, a coupling step of the 5'-position hydroxyl group and the amidite compound, and the produced subphosphorus.
  • a series of reaction cycles consisting of an acid triester oxidation step is repeated an arbitrary number of times to synthesize a nucleic acid molecule on the solid phase carrier, and (5) on the solid phase carrier produced in step (4).
  • the method for synthesizing the nucleic acid oligomer includes a step of capping the hydroxyl group at the 5'position in which the coupling reaction with the phosphoramidite compound has not proceeded, following the step (2) or (3). Also, a capping step may be added between any steps of the series of reaction cycles constituting step (4).
  • the step (5) is carried out by using the nucleic acid molecules on the solid-phase carrier produced in the step (4) in the order of the following steps (5-1) and (5-2). Then, it is carried out by subjecting it to the reaction of step (5-3).
  • the reaction of the step (5-1) may be carried out arbitrarily, or the reaction of the step (5-2) may be carried out by using the method described in Japanese Patent No. 4705716.
  • step (1) or step (4) shown in FIG. 1 The schemes of the steps (1) to (5) are shown in FIG.
  • the deprotection reaction in step (1) or step (4) shown in FIG. 1 is carried out using the above-mentioned trichloroacetic acid solution.
  • the definition of the substituent in the chemical formula in Scheme A is as described above.
  • the nucleic acid compound of the formula (1) can be further extended by an arbitrary chain length using a nucleotide-type or non-nucleotide-type linker by the amidite method, and used for producing the nucleic acid compound represented by the formula (3). can. Only the nucleic acid compound is cut out from the nucleic acid compound bound to the solid phase carrier of the formula (3) to obtain the nucleic acid oligomer represented by the formula (4), and then further deprotected and represented by the formula (5). Nucleic acid oligomers can also be obtained.
  • the substituents in each formula will be described in more detail.
  • B nucleobase represented by protected nucleic acid base which may be protected by a group and B c represented by a is not particularly limited.
  • the nucleobase include adenine, cytosine, guanine, uracil, thymine, 5-methylcytosine, pseudouracil, 1-methyl uracil and the like. Further, the nucleobase may be substituted with a substituent.
  • Examples of such a substituent include a halogen atom such as a fluoro group, a chloro group, a bromo group and an iodine group, an acyl group such as an acetyl group, an alkyl group such as a methyl group and an ethyl group, and a benzyl group.
  • protecting group of the nucleic acid base which may be protected by a protecting group represented by B a
  • B a is not particularly limited, can be used protecting groups used in the known nucleic acid chemistry, as such protecting groups
  • protecting groups For example, benzoyl group, 4-methoxybenzoyl group, 4-methylbenzoyl group, acetyl group, propionyl group, butyryl group, isobutyryl group, phenylacetyl group, phenoxyacetyl group, 4-tert-butylphenoxyacetyl group, 4-isopropyl.
  • protecting groups include phenoxyacetyl groups, and (dimethylamino) methylene groups, as well as combinations of two or more of them protecting groups.
  • R 4 represents a hydrogen atom, a methyl group, phenoxyacetyl group, 4-tert-butyl-phenoxyacetyl, 4-isopropyl phenoxyacetyl, phenylacetyl group, an acetyl group or a benzoyl group
  • R 5 represents a hydrogen atom, an acetyl group, an isobutyryl group or a benzoyl group.
  • R 6 represents a hydrogen atom, a phenoxyacetyl group, a 4-tert-butylphenoxyacetyl group, a 4-isopropylphenoxyacetyl group, a phenylacetyl group, an acetyl group or an isobutyryl group.
  • R 7 represents a 2-cyanoethyl group.
  • R 8 represents a hydrogen atom, a methyl group, a benzoyl group, a 4-methoxybenzoyl group or a 4-methylbenzoyl group, and R 9 represents a dimethylaminomethylene group.
  • examples of B c include a group obtained by removing a protecting group from the specific example of B a.
  • G 5 is preferably the following groups.
  • R 1 , R 2 and R 3 independently represent a hydrogen atom or an alkoxy group, which are the same or different from each other.
  • R 1, R 2 and R 3 is one a hydrogen atom, preferably remaining two are the same or different (the same is preferred) alkoxy group, the alkoxy group and particularly preferably a methoxy group. More preferably, G 5 is a 4,4'-dimethoxytrityl group (DMTr group).
  • DMTr group 4,4'-dimethoxytrityl group
  • G 2 any one that can function as a protecting group for a hydroxyl group can be used without particular limitation, and a known protecting group used in an amidite compound can be widely used.
  • Examples of G 2 include an alkyl group, an alkyl group, an alkynyl group, a cycloalkyl group, a haloalkyl group, an aryl group, a heteroaryl group, an arylalkyl group, a cycloalkyl group, a cycloalkylalkyl group, a cyclylalkyl group, and a hydroxyalkyl.
  • aminoalkyl group alkoxyalkyl group, heterocyclylalkyl alkyl group, heterocyclylalkyl group, heteroarylalkyl group, silyl group, silyloxyalkyl group, mono, di or trialkylsilyl group, mono, di or trialkylsilyloxyalkyl group Etc., which may be substituted with one or more electron attractants.
  • G 2 is preferably an alkyl group substituted with an electron attracting group.
  • the electron-withdrawing group include a cyano group, a nitro group, an alkylsulfonyl group, a halogen atom, an arylsulfonyl group, a trihalomethyl group, a trialkylamino group and the like, and a cyano group is preferable.
  • the alkyl group in the definition of R 1 , R 2 , R 3 and G 2 may be linear or branched, preferably an alkyl group having 1 to 12 carbon atoms, and more preferably 1 to 6 carbon atoms.
  • Alkyl group of. Specific examples of the alkyl group include, for example, a methyl group, an ethyl group, an n-provyl group, an isopropyl group, an n-butyl group, an isobutyl group, a tert-butyl group, an n-pentyl group, an isopentyl group, and a hexyl group. Can be mentioned.
  • the alkyl group moiety constituting the alkoxy group in the definition of the substituent has the same definition as the definition of the alkyl group here.
  • the amidite compound can be used in a free state or in a salt state.
  • the salt of the amidite compound include a base addition salt and an acid addition salt, but the salt is not particularly limited.
  • Specific examples of the base addition salt include salts with inorganic bases such as sodium salt, magnesium salt, potassium salt, calcium salt and aluminum salt; salts with organic bases such as methylamine, ethylamine and ethanolamine; lysine, Salts with basic amino acids such as ornithine, arginine; and ammonium salts.
  • the acid addition salt include mineral acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, sulfuric acid, nitric acid, and phosphoric acid; formic acid, acetic acid, propionic acid, oxalic acid, malonic acid, and malic acid.
  • Organic acids such as tartrate acid, fumaric acid, succinic acid, lactic acid, maleic acid, citric acid, methanesulfonic acid, trifluoromethanesulfonic acid, ethanesulfonic acid; and acid addition salts with acidic amino acids such as aspartic acid and glutamic acid. Be done.
  • Amidite compounds also include forms such as salts, hydrates, solvates, and polymorphs.
  • R preferably represents a protected hydroxyl group.
  • the protecting group when R indicates a protected hydroxyl group or the protecting group of a hydroxyl group represented by V may be any one that can be used in the amidite method, for example, a 2'-tert-butyldimethylsilyl (TBS) group, 2'-bis (2-acetoxy) methyl (ACE) group, 2'-(triisopropylsilyloxy) methyl (TOM) group, 2'-(2-cyanoethoxy) ethyl (CEE) group, 2'-(2'-(2) -Cyanoethoxy) methyl (CEM) group, 2'-para-toluylsulfonylethoxymethyl (TEM) group, 2'-EMM group (International Publication No.
  • V is preferably a 2'-tert-butyldimethylsilyl (TBS) group.
  • TBS 2'-tert-butyldimethylsilyl
  • ribose is contained in the nucleic acid oligomer, such as when the nucleic acid oligomer produced by the method of the present invention is ribonucleic acid (RNA), the above formula (6) is used as a protecting group for the 2'-position hydroxyl group of the ribose.
  • the protecting group represented by the formula (12) can be synthesized, for example, according to the description in International Publication No. 2013/027843 and International Publication No. 2019/208571, and an amidite compound having such a protecting group can be used to prepare a nucleic acid compound. Can be used for.
  • the amidite compound of the formula (13) shown in Scheme A of FIG. 1 is used.
  • non-nucleotide linker examples include a linker having an amino acid skeleton (for example, a linker having an amino acid skeleton described in Japanese Patent No. 5157168 or Japanese Patent No. 5554881). Specifically, as a non-limiting example, it is represented by, for example, the formula (A14-1) or (A14-2) or (A14-3) (for example, described in International Publication No. 2019/0741010). A linker is exemplified. In addition to these linkers, the linkers described in International Publication No. 2012/005368, International Publication No. 2018/182008, or International Publication No. 2019/0741110 are exemplified.
  • Nucleotides and amidites in which the R group in the formula (13) and the R'group in the formula (5) are substituents other than hydroxyl groups are known methods described in Japanese Patent No. 3745226 and the like, International Publication No. 2001/053528. It can also be produced from JP-A-2014-221817 and a nucleoside synthesized by a known method cited therein, and further, commercially available products can be used in Examples described later. It can be produced according to the described methods or by a method obtained by appropriately modifying these methods.
  • G 4 represents a hydrogen atom, an alkali metal ion, an ammonium ion, an alkylammonium ion, or a hydroxyalkylammonium ion.
  • the alkali metal ion include sodium ion and lithium ion.
  • the alkylammonium ion specific examples of the alkyl group include, for example, a methyl group, an ethyl group, an n-provyl group, an isopropyl group, an n-butyl group, an isobutyl group, a tert-butyl group and an n-pentyl group.
  • Isopentyl group, and hexyl group more specifically, for example, diethylammonium ion, triethylammonium ion, tetrabutylammonium ion, hexylammonium ion, dibutylammonium ion and the like.
  • examples of a specific hydroxyalkyl moiety include, for example, hydroxymethyl, hydroxyethyl, hydroxy-n-provyl, hydroxyisopropyl, hydroxy-n-butyl, and trishydroxymethyl.
  • G 4 are preferably a hydrogen atom.
  • G 5 represents a protecting group of a hydrogen atom or the hydroxyl group, and when representing a protecting group, G 1 also represents the same protecting group.
  • G 5 is a hydrogen atom when deprotected, in which case the nucleotide compound is also subject to a series of nucleic acid extension reaction steps.
  • Y is preferably an oxygen atom.
  • W 1 and X 1 preferably W 1 represents an OZ group and X 1 represents an R group.
  • W 2 and X 2 preferably W 2 represents a hydroxyl group and X 2 represents an R group.
  • W 3 and X 3 preferably each independently represent a hydroxyl group.
  • R' is preferably a hydroxyl group.
  • nucleic acid extension reaction means a reaction in which an oligonucleotide is extended by sequentially binding nucleotides via a phosphodiester bond.
  • the nucleic acid extension reaction can be carried out according to the procedure of a general phosphoramidite method.
  • the nucleic acid extension reaction may be carried out using an automatic nucleic acid synthesizer or the like that employs a phosphoramidite method.
  • the chain length of the nucleic acid oligomer is, for example, 20 mer or more (that is, n ⁇ 19), 40 mer or more (that is, n ⁇ 39), 50 mer or more (that is, n ⁇ 49), 60 mer or more (that is, n ⁇ 59), 80 mer or more.
  • n ⁇ 79 100 mer or more (that is, n ⁇ 99), 2 to 200 mer (that is, 1 ⁇ n ⁇ 199), 10 to 150 mer (that is, 9 ⁇ n ⁇ 149), 15 to 110 mer (that is, that is). , 14 ⁇ n ⁇ 109).
  • the deprotection step of the step (1) is a step of deprotecting the protecting group of the 5'hydroxyl group at the terminal of the oligonucleotide chain supported on the solid phase carrier.
  • a general protecting group a 4,4'-dimethoxytrityl group (DMTr group), a 4-monomethoxytrityl group, and a 4,4', 4 "-trimethoxytrityl group are used.
  • Deprotection uses an acid.
  • deprotecting acid examples include trifluoroacetic acid, trichloroacetic acid, trifluoromethanesulfonic acid, dichloroacetic acid, methanesulfonic acid, hydrochloric acid, acetic acid, p-toluenesulfonic acid and the like. ..
  • the nucleoside phosphoramidite represented by the following formula (13) shown in the scheme A of FIG. 1 is applied to the 5'hydroxyl group at the terminal of the oligonucleotide chain deprotected by the deprotection step. It is a reaction to bind.
  • amidite compounds represented by the formulas (13) or (A9) to (A12) are used.
  • a protecting group eg, DMTr group
  • the condensation step can be carried out using an activator or a condensing agent that activates the nucleoside phosphoramidite.
  • activator or condensing agent examples include 5-benzylthio-1H-tetrazole (BTT) (also referred to as 5-benzylmercapto-1H-tetrazole), 1H-tetrazole, 4,5-dicyanoimidazole (DCI), 5-.
  • BTT 5-benzylthio-1H-tetrazole
  • DCI 4,5-dicyanoimidazole
  • Ethylthio-1H-tetrazole Ethylthio-1H-tetrazole
  • N-MeBIT N-methylbenzimidazolium trifurate
  • BIT benzimidazolium trifurate
  • N-PhIMT N-phenylimidazolium trifurate
  • IMT imidazolium trifurate
  • NBT 5 -Nitrobenzimidazolium trifurate
  • HOBT 1-hydroxybenzotriazole
  • 5- (bis-3,5-trifluoromethylphenyl) -1H-tetrazole and the like can be mentioned.
  • amidite The nucleoside phosphoramidite (hereinafter referred to as amidite) represented by the formula (13) shown in Scheme A of FIG. 1 is as follows. formula:
  • Capping can be performed using a known capping solution such as acetic anhydride-tetrahydrofuran solution or phenoxyacetic acid anhydride / N-methylimidazole solution.
  • the oxidation step of the step (3) is a step of converting the phosphorous acid group formed by the condensation step into a phosphorous acid group or a thiophosphate group.
  • This step is a reaction for converting trivalent phosphorus to pentavalent phosphorus using an oxidizing agent, and can be carried out by reacting the oligonucleic acid derivative supported on the solid phase carrier with the oxidizing agent. ..
  • iodine can be used as an "oxidizing agent".
  • the oxidizing agent can be prepared and used so as to have a concentration of 0.005 to 2M.
  • Water can be used as the oxygen source for oxidation, and pyridine, N-methylimidazole (NMI), N-methylmorpholin, triethylamine, or the like can be used as the base for advancing the reaction.
  • the solvent is not particularly limited as long as it does not participate in the reaction, and examples thereof include acetonitrile, tetrahydrofuran (THF), or a mixed solvent of any ratio thereof.
  • acetonitrile acetonitrile
  • THF tetrahydrofuran
  • iodine / water / pyridine / acetonitrile, iodine / water / pyridine, iodine / water / pyridine / NMI, or iodine / water / pyridine / THF can be used.
  • the reaction temperature is preferably 5 ° C to 50 ° C.
  • the reaction time is usually 1 to 30 minutes.
  • the amount of the reagent used is preferably 1 to 100 mol, more preferably 1 to 10 mol, based on 1 mol of the compound supported on the solid phase carrier.
  • the "oxidizing agent” may be, for example, sulfur, 3H-1,2-benzodithiol-3-one-1,1-dioxide (Beaucage reagent). ), 3-Amino-1,2,4-dithiazole-5-thione (ADTT), 5-phenyl-3H-1,2,4-dithiazole-3-one (POS), [(N, N-dimethylamino) Methylidene) amino] -3H-1,2,4-dithiazolin-3-thione (DDTT), and phenylacetyldisulfide (PADS) can be used.
  • ADTT 3-Amino-1,2,4-dithiazole-5-thione
  • POS 5-phenyl-3H-1,2,4-dithiazole-3-one
  • DDTT [(N, N-dimethylamino) Methylidene) amino] -3H-1,2,4-dithiazolin-3-thione
  • PADS pheny
  • the oxidizing agent can be diluted with a suitable solvent so as to have a concentration of 0.001 to 2M before use.
  • the solvent used in the reaction is not particularly limited as long as it is not involved in the reaction, and examples thereof include dichloromethane, acetonitrile, pyridine, and a mixed solvent of any ratio thereof.
  • the oxidation step may be performed after the capping operation, or conversely, the capping operation may be performed after the oxidation step, and the order is not limited.
  • step (5-1) the protecting group at the 5'position of the nucleotide introduced at the end of extension is cleaved from the solid phase carrier described later and the protecting group is deprotected, and then the protecting group at the 5'position is protected. It may be used for column purification using a group as a tag, or after column purification, the protecting group of the hydroxyl group at the 5'position may be deprotected.
  • step (5-2) the step of deprotecting a phosphate protecting group is to allow an amine compound to act to deprotect the protecting group of the phosphate moiety after the synthesis of the nucleic acid having the desired sequence is completed.
  • the amine compound include diethylamine described in Japanese Patent No. 4705716.
  • the nucleic acid oligomer extended to a desired chain length on the solid-phase carrier is usually cut out from the solid-phase carrier using concentrated ammonia water as a cutting agent.
  • the oligonucleotide chain is cleaved from the solid-phase carrier and recovered.
  • the amine compound include methylamine, ethylamine, isopropylamine, ethylenediamine, diethylamine and the like.
  • step (5-3) the protecting group for the hydroxyl group at the 2'- or 3'-position of ribose of the nucleic acid compound (4) excised from the solid-phase carrier in step (5-2) is International Publication No. 2006/022233.
  • the deprotected nucleic acid oligomer (5) can be obtained by removing the nucleic acid oligomer (5) according to the method described in JP-A), WO2013 / 027843, or WO2019 / 208571.
  • the nucleoside contained in the nucleic acid oligomer has RNA, DNA, and 2'-O-MOE, 2'-O-Me, and 2'-F.
  • examples include, but are not limited to, RNA and nucleic acid oligomers which are LNAs.
  • RNA and nucleic acid oligomers which are LNAs.
  • the nucleic acid oligomer produced by the method of the invention is RNA.
  • nucleic acid oligomers that can be used in the production method of the present invention are shown below in addition to the examples described in Examples, but the present invention is not limited thereto.
  • U indicates uridine
  • C indicates cytidine
  • A indicates adenosine
  • G indicates guanosine.
  • a typical example is a nucleic acid oligomer having the following sequence (C). Sequence (C): 5'-AGAGCCAGCCUUCUUAUUGUUUUAGAGCUAUGCUGU-3'(SEQ ID NO: 3) 36mer Examples thereof include nucleic acid oligomers described in Japanese Patent No. 4965745. A typical example is a nucleic acid oligomer having the following sequence (D). Sequence (D): 5'-CCAUGAGAAGUAUGACAACAGCC-P-GGCUGUUGUCAUACUUCUCAUGGUU-3'(SEQ ID NO: 4, 5) 49mer In the sequence (D), "P” is represented by a partial structure separated by wavy lines in the following formula (A5).
  • SEQ ID NO: 4 indicates the base sequence of the following sequence (D1) from the 5'end of the sequence (D) to the front of "P", and the description of SEQ ID NO: 5 indicates the sequence (? The base sequence of the following sequence (D2) from after "P” of D) to the 3'end is shown.
  • Examples thereof include nucleic acid oligomers having the following sequence (E) described in Nucleic Acids Research, 2019, Vol. 47, No. 2: 547.
  • Examples thereof include nucleic acid oligomers having the following sequence (F) described in JP-A-2015-523856, page 173.
  • Examples thereof include nucleic acid oligomers described in JP-A-2017-537626.
  • Typical examples include nucleic acid oligomers having the following sequences (G), (H), (I), and (J).
  • U indicates 2'-O-methyluridine
  • Am indicates 2'-O-methyladenosine
  • Gm indicates 2'-O-methylguanosine
  • s indicates phosphorothioate modification.
  • Oligonucleotide purity was measured using HPLC.
  • the HPLC measurement conditions are shown in Table 1 below. (Measurement method 1: Measurement of oligonucleotide purity)
  • trichloroacetic acid solutions having different formaldehyde concentrations used in the following tests were prepared by preparing a trichloroacetic acid solution having a low formaldehyde concentration in advance and adding an aqueous formaldehyde solution to the obtained trichloroacetic acid solution.
  • C is represented by a partial structure separated by a wavy line in the following equation (A2).
  • G is represented by a partial structure separated by wavy lines in the following equation (A3).
  • U is represented by a partial structure separated by wavy lines in the following equation (A4).
  • the "U” at the 3'end is represented by a partial structure separated by a wavy line in the following equation (A8).
  • the "G” at the 5'end is represented by a partial structure separated by a wavy line in the following formula (A6), and the "A” at the 5'end in the sequences (II) and (III). Is represented by a partial structure separated by wavy lines in the following equation (A7).
  • CPG Controlled Pole Glass
  • NTS M-4MX-E manufactured by Nippon Techno Service Co., Ltd.
  • the above-mentioned sequence (I) was carried out by a phosphoramidite solid-phase synthesis method.
  • (II) and (III) were synthesized from the 3'side to the 5'side. The synthesis was carried out on a scale of about 1 ⁇ mol.
  • the guanosine EMM amidite (A10) described in Example 5 is used, a 3% trichloroacetate toluene solution is used as a deblocking solution, 5-benzyl mercapto-1H-tetrazole is used as a condensing agent, and an iodine solution is used as an oxidizing agent.
  • a phenoxyacetic acid anhydride solution and an N-methylimidazole solution were used as capping solutions.
  • the oligonucleotide produced by the production method of the present invention in the following examples is an oligonucleotide having the sequences (I), (II) and (III).
  • the uridine derivative described in the following Examples and Comparative Examples means a compound represented by the following structural formula.
  • the circles illustrated in the following structural formula schematically represent CPG.
  • Example 1 The Control Pole Glass (CPG) carrying a 0.99 ⁇ mol uridine derivative and the amidite represented by the formula (A9), the formula (A10), the formula (A11), or the formula (A12) are shown in the sequence (I).
  • Nucleic acid oligomers were automatically synthesized from the 3'side to the 5'side by NTS M-4MX-E (manufactured by Nippon Techno Service Co., Ltd.). The procedure for automatic synthesis was as follows: First, a 3% toluene trichloroacetate solution was sent to CPG to deprotect the trityl protecting group at the 5'position.
  • the concentration of formaldehyde in the trichloroacetic acid solution used can be measured by the measuring method 3, and the molar ratio of formaldehyde to trichloroacetic acid (mol formaldehyde mol / mol trichloroacetic acid) in the trichloroacetic acid solution is 33 ⁇ 10 ⁇ . It was 7. Subsequently, 5-benzyl mercapto-1H-tetrazole was sent to CPG as a condensing agent with various amidites, and the coupling reaction was allowed to proceed to the hydroxyl group at the 5'position.
  • the protecting group (DMTr group) at the 5'-terminal base is deprotected with a 3% toluene trichloroacetate solution, and the nucleic acid oligonucleotide of the sequence shown in sequence (I) is CPG. Synthesized on a carrier. Then, 1.5 mL of 28% ammonia water and 0.5 mL of ethanol were poured into the CPG carrier carrying 0.99 ⁇ mol of oligonucleotide, and the mixture was kept warm at 40 ° C. for 4 hours to solidify the nucleic acid oligomer. After liberation from the carrier, the solvent was removed by concentration.
  • 1 M tetra-n-butylammonium fluoride (1M tetra-n-butylammonium fluoride) was prepared by dissolving the free oligonucleotide in 1.5 mL of dimethyl sulfoxide, adding 1.0 mL of acetonitrile, 20 ⁇ L of nitromethane and agitator, and then dehydrating with molecular sieve 4A. 2.08 mL of TBAF) dimethyl sulfoxide solution was flowed in at room temperature under stirring with a stirrer, and the mixture was kept warm at 33 ° C. for 4 hours to deprotect the 2'-EMM protecting group.
  • the product of the nucleic acid oligomer was obtained by a precipitation operation.
  • the purity was 72.6%.
  • the yield of the oligonucleotide was measured using the method described in the above-mentioned measurement method 2
  • the yield was 4369 ⁇ g, which was 4413 ⁇ g in terms of the yield per CPG carrying a 1.00 ⁇ mol uridine derivative. The results are shown in Table 2.
  • Example 2 In the experiment of Example 1, a Controlled Pole Glass (CPG) carrying a 1.00 ⁇ mol uridine derivative and a 3% trichloroacetic acid having a molar ratio of formaldehyde to trichloroacetic acid (formaldehyde mol / trichloroacetic acid mol) of 11 ⁇ 10-5.
  • the nucleic acid oligomer of sequence (I) was obtained in the same manner except that a solution of toluene acetate was used.
  • the purity of the product was 71.4%.
  • the yield per CPG carrying a 1.00 ⁇ mol uridine derivative was 4236 ⁇ g.
  • Table 2 The results are shown in Table 2.
  • Example 3 The Control Pole Glass (CPG) carrying a 1.01 ⁇ mol uridine derivative and the amidite represented by the formula (A9), the formula (A10), the formula (A11), or the formula (A12) are shown in the sequence (II).
  • Nucleic acid oligomers were automatically synthesized from the 3'side to the 5'side by NTS M-4MX-E (manufactured by Nippon Techno Service Co., Ltd.). The procedure for automatic synthesis was as follows: First, a 3% toluene trichloroacetate solution was sent to CPG to deprotect the trityl protecting group at the 5'position.
  • the concentration of formaldehyde in the trichloroacetic acid solution used can be measured by the measuring method 3, and the molar ratio of formaldehyde to trichloroacetic acid (mol formaldehyde mol / mol trichloroacetic acid) in the trichloroacetic acid solution is 33 ⁇ 10 ⁇ . It was 7. Subsequently, 5-benzyl mercapto-1H-tetrazole was sent to CPG as a condensing agent with various amidites, and the coupling reaction was allowed to proceed to the hydroxyl group at the 5'position.
  • the protecting group (DMTr group) at the 5'-terminal base is deprotected with a 3% toluene trichloroacetate solution, and the nucleic acid oligonucleotide of the sequence shown in sequence (II) is CPG.
  • the nucleic acid oligonucleotide of the sequence shown in sequence (II) is CPG. Synthesized on a carrier. Then, 1.5 mL of 28% ammonia water and 0.5 mL of ethanol were flowed into the CPG carrier carrying 1.01 ⁇ mol of oligonucleotide, and the mixture was kept warm at 40 ° C. for 4 hours to solidify the nucleic acid oligomer. After liberation from the carrier, the solvent was removed by concentration.
  • 1 M tetra-n-butylammonium fluoride (1M tetra-n-butylammonium fluoride) was prepared by dissolving the free oligonucleotide in 1.5 mL of dimethyl sulfoxide, adding 1.0 mL of acetonitrile, 20 ⁇ L of nitromethane and agitator, and then dehydrating with molecular sieve 4A. 2.08 mL of TBAF) dimethyl sulfoxide solution was flowed in at room temperature under stirring with a stirrer, and the mixture was kept warm at 33 ° C. for 4 hours to deprotect the 2'-EMM protecting group.
  • the product of the nucleic acid oligomer was obtained by a precipitation operation.
  • the purity was 43.1%.
  • the yield of the oligonucleotide was measured using the method described in the measurement method 2
  • the yield was 9941 ⁇ g, which was 9843 ⁇ g in terms of the yield per CPG carrying a 1.00 ⁇ mol uridine derivative. The results are shown in Table 2.
  • Example 4 In the experiment of Example 3, Controlled Pole Glass (CPG) carrying 1.01 ⁇ mol of uridine derivative and 3% trichloroacetic acid having a molar ratio of formaldehyde to trichloroacetic acid (formaldehyde mol / trichloroacetic acid mol) of 11 ⁇ 10-5.
  • the nucleic acid oligomer of sequence (II) was obtained in the same manner except that a solution of toluene acetate was used.
  • the purity of the product was 36.5%.
  • Example 5 The Control Pole Glass (CPG) carrying a 1.00 ⁇ mol uridine derivative and the amidite represented by the formula (A9), the formula (A10), the formula (A11), or the formula (A12) are shown in the sequence (III).
  • Nucleic acid oligomers were automatically synthesized from the 3'side to the 5'side by NTS M-4MX-E (manufactured by Nippon Techno Service Co., Ltd.). The procedure for automatic synthesis was as follows: First, a 3% toluene trichloroacetate solution was sent to CPG to deprotect the trityl protecting group at the 5'position.
  • the concentration of formaldehyde in the trichloroacetic acid solution used can be measured by the measuring method 3, and the molar ratio of formaldehyde to trichloroacetic acid (mol formaldehyde mol / mol trichloroacetic acid) in the trichloroacetic acid solution is 33 ⁇ 10 ⁇ . It was 7. Subsequently, 5-benzyl mercapto-1H-tetrazole was sent to CPG as a condensing agent with various amidites, and the coupling reaction was allowed to proceed to the hydroxyl group at the 5'position.
  • the protecting group (DMTr group) at the 5'-terminal base is deprotected with a 3% toluene trichloroacetate solution, and the nucleic acid oligonucleotide of the sequence shown in sequence (III) is CPG. Synthesized on a carrier. Then, 1.5 mL of 28% ammonia water and 0.5 mL of ethanol were poured into the CPG carrier carrying 1.00 ⁇ mol of oligonucleotide, and the mixture was kept warm at 40 ° C. for 4 hours to solidify the nucleic acid oligomer. After liberation from the carrier, the solvent was removed by concentration.
  • 1 M tetra-n-butylammonium fluoride (1M tetra-n-butylammonium fluoride) was prepared by dissolving the free oligonucleotide in 1.5 mL of dimethyl sulfoxide, adding 1.0 mL of acetonitrile, 20 ⁇ L of nitromethane and agitator, and then dehydrating with molecular sieve 4A. 2.08 mL of TBAF) dimethyl sulfoxide solution was flowed in at room temperature under stirring with a stirrer, and the mixture was kept warm at 33 ° C. for 4 hours to deprotect the 2'-EMM protecting group.
  • the product of the nucleic acid oligomer was obtained by a precipitation operation.
  • the purity was 32.8%.
  • the yield of the oligonucleotide was measured using the method described in the above-mentioned measurement method 2
  • the yield per CPG carrying a 1.00 ⁇ mol uridine derivative was 15722 ⁇ g. The results are shown in Table 2.
  • Example 6 In the experiment of Example 5, Controlled Pole Glass (CPG) carrying 1.01 ⁇ mol of uridine derivative and 3% trichloroacetic acid having a molar ratio of formaldehyde to trichloroacetic acid (formaldehyde mol / trichloroacetic acid mol) of 11 ⁇ 10-5.
  • the nucleic acid oligomer of sequence (III) was obtained in the same manner except that a solution of toluene acetate was used.
  • the purity of the product was 30.9%.
  • Example 7 Add 300 mL of toluene to 30 g of trichloroacetic acid having a molar ratio of formaldehyde to trichloroacetic acid (mol formaldehyde mol / mol trichloroacetic acid) of 25 ⁇ 10-5 , and azeotropically distill off toluene and formaldehyde at 40 ° C. using an evaporator. , A colorless oily trichloroacetic acid solution (34 g) was obtained. When the formaldehyde contained in the obtained trichloroacetic acid solution was analyzed by the method described in Measurement Method 3, the molar ratio of formaldehyde to trichloroacetic acid was 25 ⁇ 10 -7 .
  • the present invention provides an efficient method for producing a nucleic acid oligomer. Further, it is expected that the yield of the nucleic acid oligomer produced according to the method for producing the nucleic acid oligomer will be improved.
  • SEQ ID NOs: 1 to 14 in the sequence listing represent the base sequences of oligonucleotides produced according to the production method of the present invention.

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Abstract

本発明は、核酸オリゴマーの効率的な製造方法を提供することを目的とする。本発明は、式（１）（式中、記号は明細書に記載の意味を有する。）で示される核酸オリゴマーと、ホルムアルデヒドとトリクロロ酢酸のモル比（ホルムアルデヒドｍｏｌ／トリクロロ酢酸ｍｏｌ）が、１１×１０－５以下であるトリクロロ酢酸溶液を反応させる工程を含む、式（２）（式中、記号は明細書に記載の意味を有する。）で示される核酸オリゴマーの製造方法を提供することを目的とする。

Description

核酸オリゴマーの製造方法
　本特許出願は、日本国特許出願２０２０－１１８３１６号（２０２０年７月９日出願）に基づくパリ条約上の優先権および利益を主張するものであり、ここに引用することによって、上記出願に記載された内容の全体が本明細書中に組み込まれるものとする。
　本発明は、核酸オリゴマーの製造方法に関する。
　近年、核酸オリゴマーの医療分野への応用に関心が高まっている。例えば、アンチセンス核酸、アプタマー、リボザイム、およびｓｉＲＮＡなどのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を誘導する核酸などが挙げられ、これらは核酸医薬品と呼ばれている。
　核酸オリゴマーは、固相合成法により合成可能であり、固相担体上で核酸を伸長して合成された核酸オリゴマーは、固相担体から切り出し、次いで、リボースを含む核酸オリゴマーは、リボースの２’位の水酸基の保護基を脱保護して除いて、目的とする核酸オリゴマーが製造されている。固相合成法ではヌクレオシドのホスホロアミダイト（以下、「アミダイト」と称する）が原料として用いられ、５’位の水酸基の保護基は、トリクロロ酢酸溶液を用いて脱保護することが知られているが、従来のトリクロロ酢酸溶液を用いて合成された核酸オリゴマーの収率は、必ずしも満足いくものではなく、合成は効率的ではなかった（特許文献１）。
国際公開第２００６／０２２３２３号公報
　本発明は、核酸オリゴマーの効率的な製造方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、核酸オリゴマーを合成する際に、ホルムアルデヒド濃度が一定以下であるトリクロロ酢酸溶液を使用する、またはトリクロロ酢酸の品質を向上させた後に使用する、ことを特徴とする、核酸オリゴマーの効率的な製造方法を提供する。
　本発明は、以下の態様を包含するが、これらに限定されるものではない。
項１．　式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 （式中、
　Ｇ２は、水酸基の保護基を示し、
　Ｂａは、それぞれ独立して、同一又は相異なって、保護基で保護されていてもよい核酸塩基を表し、
　Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、同一又は相異なって、水素原子又はアルコキシ基を表し、
　Ｒは、それぞれ独立して、同一又は相異なって、保護された水酸基、水素原子、フッ素原子、メトキシ基、２－メトキシエチル基、またはＯＱ’基を表し、
　Ｑ’は、それぞれ独立して、同一又は相異なって、リボースの４’位の炭素原子と結合しているメチレン基、リボースの４’位の炭素原子と結合しているエチレン基、またはリボースの４’位の炭素原子と結合しているエチリデン基を表し、
　Ｙは、それぞれ独立して、同一又は相異なって、酸素原子または硫黄原子を表し、
　ｎは、１～２００の何れかの整数を表し、
　Ｗ１は、ＯＺ基を表し、かつ、Ｘ１は、Ｒ基を表すか、あるいは
　Ｗ１は、ＯＶ基を表し、かつ、Ｘ１は、ＯＺ基を表し、
　Ｖは、水酸基の保護基を表し、
　Ｚは、固相担体および連結基からなる構造を有する基である。
　そして、ｎが２以上の整数のとき、式（１）で示される核酸オリゴマーは、それぞれのヌクレオチドの間に、非ヌクレオチドリンカーが組み込まれていてもよい。）
で示される核酸オリゴマーと、ホルムアルデヒドとトリクロロ酢酸のモル比（ホルムアルデヒドｍｏｌ／トリクロロ酢酸ｍｏｌ）が、１１×１０－５以下であるトリクロロ酢酸溶液とを反応させる工程を含む、式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 （式中、
　Ｇ２、Ｂａ、Ｒ、Ｙ、Ｘ１、Ｗ１およびｎは、前記のとおりであり、そして、
　式（１）において定義されたとおり、ヌクレオチドの間に、非ヌクレオチドリンカーが組み込まれていてもよい。）
で示される核酸オリゴマーの製造方法。
項２．前項１に記載の工程と、さらに、当該工程で生成する式（２）で示される核酸オリゴマーからＺで表される基を除く工程、ならびに水酸基および核酸塩基の保護基を除く工程を含む、式（２’）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 （式中、
　Ｙおよびｎは、前記のとおりであり、
　Ｂｃは、それぞれ独立して、同一又は相異なって、核酸塩基を表し、
　Ｇ４は、それぞれ独立して、同一又は相異なって、水素原子、アルカリ金属イオン、アンモニウムイオン、アルキルアンモニウムイオン、またはヒドロキシアルキルアンモニウムイオンを表し、
　Ｒ’は、それぞれ独立して、同一又は相異なって、水酸基、水素原子、フッ素原子、メトキシ基、２－メトキシエチル基、またはＯＱ’基を表し、
　Ｑ’は、前記のとおりであり、そして、
　Ｘ３およびＷ３は各々、それぞれ独立して、水酸基を表すか、あるいは
　Ｘ３は、Ｒ’基を表し、かつ、Ｗ３は、水酸基を表す。）
で示される核酸オリゴマーの製造方法。
項３．式（２）で示される核酸オリゴマーを、アミダイト法で任意に鎖長を伸長した式（３）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 （式中、
　Ｇ２、Ｂａ、Ｒ、Ｙ、Ｘ１およびＷ１は、前記のとおりであり、
　Ｇ５は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 で示される水酸基の保護基、または水素原子を示し、
　Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、前記のとおりであり、そして、
　ｍは、ｍ≧ｎを満たす整数である。）
で示される核酸化合物を得る工程、ならびに
　式（３）で示される化合物から、式（４）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 （式中、
　Ｇ５、Ｒ、Ｙおよびｍは、前記のとおりであり、
　Ｇ４は、それぞれ独立して、同一又は相異なって、水素原子、アルカリ金属イオン、アンモニウムイオン、アルキルアンモニウムイオン、またはヒドロキシアルキルアンモニウムイオンを表し、
　ＢＣは、それぞれ独立して、同一又は相異なって、核酸塩基を表し、
　Ｘ２は、水酸基を表し、かつ、Ｗ２は、ＯＶ基を表すか、あるいは
　Ｘ２は、Ｒ基を表し、かつ、Ｗ２は、水酸基を表し、そして、
　Ｖは、水酸基の保護基を表す。）
で示される化合物を切り出し、
　さらに式（４）で示される化合物を脱保護して、式（５）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 （式中、
　Ｇ４、Ｂｃ、Ｙおよびｍは、前記のとおりであり、Ｒ’は、それぞれ独立して、同一又は相異なって、水酸基、水素原子、フッ素原子、メトキシ基、２－メトキシエチル基、またはＯＱ’基を表し、
　Ｑ’は、前記のとおりであり、そして、
　Ｘ３およびＷ３は各々、それぞれ独立して、水酸基を表すか、あるいは
　Ｘ３は、Ｒ’基を表し、かつ、Ｗ３は、水酸基を表す。）
で示される核酸オリゴマーを製造する工程をさらに含む、前項１に記載の製造方法。
項４．非ヌクレオチドリンカーが、アミノ酸骨格からなるリンカーである、前項１～３の何れか一項に記載の製造方法。
項５．アミノ酸骨格からなるリンカーが、下記式（Ａ１４－１）、（Ａ１４－２）および（Ａ１４－３）からなる群から選ばれる構造を有するリンカーである、前項４に記載の製造方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
 （式中、Ｙは、前記のとおりである。）
項６．トリクロロ酢酸溶液が、ジクロロメタン、アセトニトリル、および芳香族有機溶媒からなる群から選ばれる少なくとも１つの溶媒を含む、前項１～５の何れか一項に記載の製造方法。
項７．トリクロロ酢酸溶液中のホルムアルデヒドとトリクロロ酢酸のモル比（ホルムアルデヒドｍｏｌ／トリクロロ酢酸ｍｏｌ）が、５４×１０－６以下である、前項１～６の何れか一項に記載の製造方法。
項８．トリクロロ酢酸溶液中のホルムアルデヒドとトリクロロ酢酸のモル比（ホルムアルデヒドｍｏｌ／トリクロロ酢酸ｍｏｌ）が、２７×１０－６以下である、前項１～６の何れか一項に記載の製造方法。
項９．核酸オリゴマーが、リボ核酸（ＲＮＡ）である、前項１～８の何れか一項に記載の製造方法。
項１０．核酸オリゴマーが、リボ核酸（ＲＮＡ）であり、そのリボースの２’位の水酸基の保護基が、式（６）で示される保護基である、前項１～８の何れか一項に記載の製造方法。
　式（６）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 （式中、
　ｑは、１～５の何れかの整数を表し、
　ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、同一又は相異なって、メチル基、エチル基または水素原子を表し、
　＊印は、リボースの２’位の水酸基由来の酸素原子との結合点を表し、そして、
　ＥＷは、電子求引基を表す。）
項１１．ＲａおよびＲｂが同時に水素原子であり、かつ、ＥＷがシアノ基である、前項１０に記載の製造方法。
項１２．核酸オリゴマーが、４０鎖長以上のオリゴマーである、前項１～１１の何れか一項に記載の製造方法。
項１３．核酸オリゴマーが、５０鎖長以上のオリゴマーである、前項１～１１の何れか一項に記載の製造方法。
項１４．核酸オリゴマーが、６０鎖長以上のオリゴマーである、前項１～１１の何れか一項に記載の製造方法。
項１５．核酸オリゴマーが、８０鎖長以上のオリゴマーである、前項１～１１の何れか一項に記載の製造方法。
項１６．核酸オリゴマーが、１００鎖長以上のオリゴマーである、前項１～１１の何れか一項に記載の製造方法。
項１７．ホルムアルデヒドとトリクロロ酢酸のモル比（ホルムアルデヒドｍｏｌ／トリクロロ酢酸ｍｏｌ）が、１１×１０－５以下である、トリクロロ酢酸溶液。
項１８．ホルムアルデヒドとトリクロロ酢酸のモル比（ホルムアルデヒドｍｏｌ／トリクロロ酢酸ｍｏｌ）が、５４×１０－６以下である、前項１７に記載のトリクロロ酢酸溶液。
項１９．ホルムアルデヒドとトリクロロ酢酸のモル比（ホルムアルデヒドｍｏｌ／トリクロロ酢酸ｍｏｌ）が、２７×１０－６以下である、前項１７に記載のトリクロロ酢酸溶液。
項２０．ホルムアルデヒドを含む未精製トリクロロ酢酸と、ホルムアルデヒドと共沸する溶媒とを含む溶液から、ホルムアルデヒドを共沸させて留去することにより精製トリクロロ酢酸を得る工程を含む、前項１７～１９の何れか一項に記載のトリクロロ酢酸の製造方法。
項２１．共沸溶媒の沸点が、１９８℃以下である、前項２０に記載の製造方法。
項２２．共沸溶媒が、ジクロロメタン、アセトニトリルまたは芳香族有機溶媒である、前項２０または２１に記載の製造方法。
項２３．芳香族有機溶媒がトルエンである、前項２２に記載の製造方法。
項２４．前項２０に記載のトリクロロ酢酸の精製工程、および当該工程で得られた精製トリクロロ酢酸を使用する前項１～３の何れか一項に記載の工程を含む、核酸オリゴマーの製造方法。
項２５．トリクロロ酢酸溶液として、前項１７、１８および１９の何れか一項に記載のトリクロロ酢酸溶液を選択する工程を含む、前項１～１６および２０～２４の何れか一項に記載の製造方法。
　本発明は、効率的な核酸オリゴマーの製造方法を提供する。本発明の製造方法により、製造される核酸オリゴマーの収率向上が期待できる。
図１は、式（１）で示される核酸オリゴマーから式（５）で示される核酸オリゴマーを製造する典型例を示すスキームＡである。図中、Ｇ１としては、水酸基の保護基として機能し得るものであれば特に制限なく使用することができ、アミダイト化合物で使用される公知の保護基を広く使用することができる。また、Ｇ３は、それぞれ独立して、同一又は相異なって、アルキル基を表し、あるいは２つのＧ３は互いに結合して環状構造を形成していてもよい。Ｇ３としては、それぞれ独立して、同一又は相異なって、アルキル基、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、またはイソプロピル基であることが好ましく、両方がイソプロピル基であることがより好ましい。その他の記号は前記のとおりである。
　前記式（１）で示される核酸オリゴマーに、ホルムアルデヒド濃度が一定以下であるトリクロロ酢酸溶液を反応させ、前記式（２）で示される核酸オリゴマーを得る方法について説明する。
　本発明のトリクロロ酢酸溶液中のホルムアルデヒドとトリクロロ酢酸のモル比（ホルムアルデヒドｍｏｌ／トリクロロ酢酸ｍｏｌ）は、通常、１１×１０－５以下、好ましくは、５４×１０－６以下、より好ましくは、２７×１０－６以下である。本発明のトリクロロ酢酸溶液としては、前記のホルムアルデヒドとトリクロロ酢酸のモル比の範囲内でホルムアルデヒドを含むものが例示される。トリクロロ酢酸溶液中のホルムアルデヒド濃度測定方法には、高速液体クロマトグラフ法がある。高速液体クロマトグラフ法では、ホルムアルデヒドとアセチルアセトンを反応させ、得られた３，５－ジアセチル－１，４－ジヒドロルチジンの量を測定し、ホルムアルデヒドの濃度を算出する。かくして前記のホルムアルデヒドとトリクロロ酢酸のモル比の範囲の溶液を選択することができる。前記溶液は、例えば、下記の共沸による方法で直接調製してもよいし、所望のものを選択してもよい。
　トリクロロ酢酸溶液中のトリクロロ酢酸の濃度は、通常、０．１～１．２Ｍ、好ましくは、０．１～０．６Ｍ、より好ましくは、０．１～０．３Ｍである。
　トリクロロ酢酸の希釈溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、ジクロロメタン、アセトニトリル、芳香族有機溶媒、水または任意の混合溶媒を挙げることができ、好ましくはジクロロメタン、アセトニトリル、および芳香族有機溶媒からなる群から選ばれる少なくとも１つの溶媒を挙げることができ、より好ましくは芳香族有機溶媒を挙げることができる。芳香族有機溶媒としては、トルエンを挙げることができる。
　上記反応における反応温度は、０～４０℃が好ましく、より好ましくは、１０～３０℃である。
　トリクロロ酢酸溶液中のホルムアルデヒドは、任意の溶媒または任意の混合溶媒との共沸により除去し、その量を低減することができ、共沸溶媒としては、トリクロロ酢酸よりも沸点が低い溶媒であれば、特に限定されないが、ジクロロメタン、アセトニトリル、芳香族有機溶媒または任意の混合溶媒を挙げることができ、好ましくはジクロロメタン、アセトニトリル、または芳香族有機溶媒を挙げることができ、より好ましくは芳香族有機溶媒を挙げることができる。芳香族有機溶媒としては、トルエンを挙げることができる。
　共沸溶媒の沸点は、２００℃以下が好ましく、より好ましくは、１９８℃以下である。
　トリクロロ酢酸溶液の保管には、ガラス製容器、プラスチック製容器、または金属製容器を使用することができる。プラスチック製容器としては、ポリエチレンまたはポリプロピレン製等の容器を使用することができ、金属製容器としては、ＳＵＳ製容器またはハステロイ製等の容器を使用することができる。
　空気雰囲気下または不活性ガス雰囲気下で酸化溶液を保管することができ、不活性ガスとしては、アルゴン、窒素、二酸化炭素またはヘリウム等を使用することができる。
　５’位の水酸基に保護基を有する核酸化合物としては、前記式（１）の核酸化合物が例示される。トリクロロ酢酸溶液を反応させて生成する核酸化合物としては、前記式（２）で示される核酸化合物が例示される。
　前記式（１）および（２）において、Ｑ’で表される、それぞれ独立して同一又は相異なって、リボースの４’位の炭素原子と結合しているメチレン基、リボースの４’位の炭素原子と結合しているエチレン基、またはリボースの４’位の炭素原子と結合しているエチリデン基を表す化合物として、具体的には下記式（７）のＬＮＡ－１、ＬＮＡ－２、またはＬＮＡ－３で示される構造が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 （式中、Ｂaは、保護されていてもよい核酸塩基を表す。）
　Ｚで示される、固相担体、および固相担体と核酸オリゴマーの３’末端のリボースの２’位もしくは３’位の水酸基の酸素原子とをつなぐ連結基からなる構造を有する基としては、より具体的には、下記式（８）で示される構造が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
 　式（８）において、Ｓｐは、スペーサーを表す。
　スペーサー（Ｓｐ）としては、例えば、下記式（９）に示す構造式を有するものが例示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　Ｌｉｎｋｅｒは、例えば、下記式（１０）に示す構造でもよいし、または式（１０）の構造においてヘキサメチレンアミノ基部分を有さない構造であって、アミノプロピル基がＳｉに結合した構造でもよい。または、Ｌｉｎｋｅｒは下記式（１１）で示す構造でもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
 （式中、
　Ａは、水酸基、アルコキシ基、またはアルキル基のいずれかであってもよい。アルコキシ基としては、例えばメトキシ基およびエトキシ基が挙げられる。アルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、イソプロピル基、ｎ－プロピル基が挙げられる。Ｓｉは、担体表面の水酸基の酸素と結合していることを示す。）
　Ｓｏｌｉｄ　ｓｕｐｐｏｒｔとしては、無機多孔質担体や有機系樹脂担体などが挙げられる。無機多孔質担体には、例えば、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｐｏｒｅ　Ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）が挙げられる。有機系樹脂担体には、例えば、ポリスチレンからなる担体が挙げられる。
　本発明で使用される核酸オリゴマー内に含まれるヌクレオシド（リボース、およびデオキシリボース）としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、２’－Ｏ－ＭＯＥ（２’－Ｏ－メトキシエチル）、２’－Ｏ－Ｍｅ、２’－Ｆ　ＲＮＡ、および前記のＬＮＡが例示されるが、前記ヌクレオシドは、これらに限定されない。
　前記のトリクロロ酢酸溶液による脱保護工程を含む、固相合成法による核酸オリゴマーの合成方法は、典型的には、以下の工程を含む。
（１）固相担体にリンカーを介して結合している水酸基が保護されたヌクレオシドの５’位の水酸基を脱保護する工程、
（２）前記工程で生成した５’位の水酸基をホスホロアミダイト化合物とカップリング反応させて亜リン酸トリエステル化合物を得る工程、
（３）前記工程で生成した亜リン酸トリエステルを酸化してリン酸トリエステルに変換して伸長した核酸分子を製造する工程、あるいは、チオリン酸トリエステルに変換する任意の工程、
（４）前記工程（１）～（３）、すなわち、生成した核酸分子の５’位の水酸基の脱保護工程、５’位の水酸基とアミダイト化合物とのカップリング工程、および、生成した亜リン酸トリエステルの酸化工程、から構成される一連の反応のサイクルを、任意の回数繰り返し、固相担体上に核酸分子を合成する工程、および
（５）工程（４）で生成した固相担体上の核酸分子を、切り出しおよび脱保護する工程に供し、固相担体から遊離させて、保護基が除かれた核酸オリゴマーを製造する工程。
　ただし、前記核酸オリゴマーの合成方法においては、工程（２）または（３）に続けて、ホスホロアミダイト化合物とのカップリング反応が進行しなかった５’位の水酸基をキャッピングする工程を含んでいてもよく、工程（４）を構成する一連の反応のサイクルの何れかの工程の間にキャッピング工程が付加されていてもよい。
　前記（５）の工程は、より具体的には、工程（４）で生成した固相担体上の核酸分子を、以下の工程（５－１）および（５－２）の反応の順に実施し、次いで工程（５－３）の反応に供することにより実施される。ここで工程（５－１）の反応の実施は、任意であってもよいし、工程（５－２）の反応の実施は、特許第４７０５７１６号公報に記載の方法を用いてもよい。その結果、固相担体から遊離した核酸分子から保護基が除かれた核酸オリゴマー、あるいは、５’末端の水酸基が保護された核酸オリゴマーを製造することができる。
　　（５－１）核酸分子の５’末端の水酸基の保護基を脱保護する反応、
　　（５－２）核酸分子を固相担体から切りだして遊離させる反応、および、
　　（５－３）核酸分子を構成するリボースの２’位もしくは３’末端の３’位の水酸基の保護基を脱保護する反応。
　前記工程（１）から（５）のスキームを、図１に示す。図１に示される工程（１）または工程（４）における脱保護反応が、前記のトリクロロ酢酸溶液を用いて実施される。スキームＡにおける化学式中の置換基の定義は、前記定義のとおりである。
　前記式（１）の核酸化合物は、さらにアミダイト法によりヌクレオチド型または非ヌクレオチド型のリンカーを用いて任意の鎖長だけ伸長し、前記式（３）で示される核酸化合物の製造に使用することができる。前記式（３）の固相担体に結合した核酸化合物から核酸化合物のみを切り出して、前記式（４）で示される核酸オリゴマーを得たのち、更に脱保護して前記式（５）で示される核酸オリゴマーを得ることもできる。以下、各式中の置換基についてさらに詳細に説明する。
　Ｂａで示される保護基で保護されていてもよい核酸塩基およびＢｃで示される核酸塩基は、特に限定されない。当該核酸塩基としては、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、チミン、５－メチルシトシン、シュードウラシル、および１－メチルシュードウラシルなどが挙げられる。また、当該核酸塩基は、置換基により置換されていてもよい。そのような置換基としては、例えば、フルオロ基やクロロ基やブロモ基やヨード基のようなハロゲン原子、アセチル基のようなアシル基、メチル基やエチル基のようなアルキル基、ベンジル基のようなアリールアルキル基、メトキシ基のようなアルコキシ基、メトキシエチル基のようなアルコキシアルキル基、シアノエチル基のようなシアノアルキル基、ヒドロキシ基、ヒドロキシアルキル基、アシルオキシメチル基、アミノ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、カルボキシ基、シアノ基、およびニトロ基など、並びにそれらの２種類以上の置換基の組み合わせが挙げられる。
　Ｂａで示される保護基で保護されていてもよい核酸塩基の保護基としては、特に限定されず、公知の核酸化学で用いられる保護基を使用することができ、そのような保護基としては、例えば、ベンゾイル基、４－メトキシベンゾイル基、４－メチルベンゾイル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、フェニルアセチル基、フェノキシアセチル基、４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル基、４－イソプロピルフェノキシアセチル基、および（ジメチルアミノ）メチレン基など、並びにそれらの２種類以上の保護基の組み合わせが挙げられる。
　Ｂａは、より具体的には、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
（上記式中、
　Ｒ４は、水素原子、メチル基、フェノキシアセチル基、４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル基、４－イソプロピルフェノキシアセチル基、フェニルアセチル基、アセチル基又はベンゾイル基を表し、
　Ｒ５は、水素原子、アセチル基、イソブチリル基又はベンゾイル基を表し、
　Ｒ６は、水素原子、フェノキシアセチル基、４－ｔｅｒｔ－ブチルフェノキシアセチル基、４－イソプロピルフェノキシアセチル基、フェニルアセチル基、アセチル基又はイソブチリル基を表し、
　Ｒ７は、２－シアノエチル基を表し、
　Ｒ８は、水素原子、メチル基、ベンゾイル基、４－メトキシベンゾイル基又は４－メチルベンゾイル基を表し、そして、
　Ｒ９は、ジメチルアミノメチレン基を表す。）
のいずれかで表される基を表す。
　Ｂｃとしては、より具体的には、上記Ｂａの具体例から保護基を除いた基が挙げられる。
　Ｇ５は、好ましくは、以下の基である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
 （式中、
　Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、同一又は相異なって、水素原子又はアルコキシ基を表す。）
　Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、１つが水素原子であり、残りの２つが同一または相異なる（同一が好ましい）アルコキシ基であることが好ましく、アルコキシ基としてはメトキシ基が特に好ましい。より好ましくは、Ｇ５は、４，４’－ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ基）である。
　Ｇ２としては、水酸基の保護基として機能し得るものであれば特に制限なく使用することができ、アミダイト化合物で使用される公知の保護基を広く使用することができる。Ｇ２としては、例えば、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、ハロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アリールアルキル基、シクロアルケニル基、シクロアルキルアルキル基、シクリルアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アミノアルキル基、アルコキシアルキル基、ヘテロシクリルアルケニル基、ヘテロシクリルアルキル基、ヘテロアリールアルキル基、シリル基、シリルオキシアルキル基、モノ、ジ又はトリアルキルシリル基、モノ、ジ又はトリアルキルシリルオキシアルキル基などが挙げられ、これらは１つ以上の電子求引基で置換されていてもよい。
　Ｇ２は、好ましくは、電子求引基で置換されたアルキル基である。当該電子求引基としては、例えば、シアノ基、ニトロ基、アルキルスルホニル基、ハロゲン原子、アリールスルホニル基、トリハロメチル基、およびトリアルキルアミノ基などが挙げられ、好ましくはシアノ基である。
　Ｇ２としては、特に好ましいのは、以下の基である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
　前記Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＧ２の定義におけるアルキル基は、直鎖状又は分岐鎖状のいずれでもよく、好ましくは炭素数１～１２のアルキル基、より好ましくは炭素数１～６のアルキル基である。具体的なアルキル基の例としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロビル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、イソペンチル基、及びヘキシル基が挙げられる。前記置換基の定義におけるアルコキシ基を構成するアルキル基部分は、ここでのアルキル基の定義と同じ定義を有する。
　また、本発明の方法において、アミダイト化合物は、フリーの状態又は塩の状態で使用することができる。アミダイト化合物の塩としては、塩基付加塩または酸付加塩が挙げられるが、特に制限されない。塩基付加塩としては、具体的には、ナトリウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アルミニウム塩等の無機塩基との塩；メチルアミン、エチルアミン、エタノールアミン等の有機塩基との塩；リジン、オルニチン、アルギニン等の塩基性アミノ酸との塩；及びアンモニウム塩が挙げられる。酸付加塩としては、具体的には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の鉱酸；ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、リンゴ酸、酒石酸、フマル酸、コハク酸、乳酸、マレイン酸、クエン酸、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、エタンスルホン酸等の有機酸；および、アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸との酸付加塩が挙げられる。アミダイト化合物には、塩、水和物、溶媒和物、および結晶多形などの形態も含まれる。
　Ｒは、好ましくは、保護された水酸基を示す。Ｒが保護された水酸基を示すときの保護基、またはＶで示される水酸基の保護基は、アミダイト法において使用できるものであればよく、例えば、２’－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル（ＴＢＳ）基、２’－ビス（２－アセトキシ）メチル（ＡＣＥ）基、２’－（トリイソプロピルシリロキシ）メチル（ＴＯＭ）基、２’－（２－シアノエトキシ）エチル（ＣＥＥ）基、２’－（２－シアノエトキシ）メチル（ＣＥＭ）基、２’－パラ－トルイルスルホニルエトキシメチル（ＴＥＭ）基、２’－ＥＭＭ基（国際公開第２００６／０２２３２３号公報）の他に、国際公開第２０１３／０２７８４３号公報および国際公開第２０１９／２０８５７１号公報に記載のものが使用できる。Ｖは、好ましくは、２’－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル（ＴＢＳ）基である。また、本発明の方法で製造される核酸オリゴマーがリボ核酸（ＲＮＡ）である場合など、核酸オリゴマー内にリボースが含まれる場合、そのリボースの２’位の水酸基の保護基として、前記式（６）で示される保護基が好ましい保護基として例示される。さらに好ましくは、ＥＷで示される電子求引基としてシアノ基を有する式（１２）で示される保護基が例示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
 （式中、
　ｑ、ＲａおよびＲｂは、前記式（６）における定義と同義である。）
　さらに好ましくは、式（１２）で示される基において、ｑが１であり、ＲａおよびＲｂが同時に水素原子である基が例示される。
　式（１２）で示される保護基は、例えば国際公開第２０１３／０２７８４３号公報および国際公開第２０１９／２０８５７１号公報の記載に従って合成することができ、かかる保護基を有するアミダイト化合物を核酸化合物の製造に使用することができる。
　核酸の伸長反応には、図１のスキームＡに記載の式（１３）のアミダイト化合物が使用される。
　非ヌクレオチドリンカーとしては、アミノ酸骨格からなるリンカー（例えば、特許第５１５７１６８号公報または特許第５５５４８８１号公報に記載されたアミノ酸骨格からなるリンカー）が例示される。具体的には、非限定的な例として、例えば、式（Ａ１４－１）もしくは（Ａ１４－２）もしくは（Ａ１４－３）（例えば、国際公開第２０１９／０７４１１０号公報に記載）で表されるリンカーが例示される。これらのリンカー以外に国際公開第２０１２／００５３６８号公報、国際公開第２０１８／１８２００８号公報または国際公開第２０１９／０７４１１０号公報に記載のリンカーが例示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
 （式中、Ｙは、前記のとおりである。）
　式（１３）におけるＲ基および式（５）におけるＲ’基が、水酸基以外の置換基であるヌクレオチドおよびアミダイトは、特許第３７４５２２６号公報などに記載された公知の方法、国際公開第２００１／０５３５２８号公報あるいは特開２０１４－２２１８１７号公報およびそれらに引用される公知の方法で合成されるヌクレオシドから製造することもでき、さらには、市販品として入手可能なものを用いて、後述する実施例に記載の方法に則して又はこれらの方法に適宜変更を加えた方法により製造することができる。
　Ｇ４は、水素原子、アルカリ金属イオン、アンモニウムイオン、アルキルアンモニウムイオン、またはヒドロキシアルキルアンモニウムイオンを表す。アルカリ金属イオンとしては、例えば、ナトリウムイオン、およびリチウムイオンが挙げられる。また、アルキルアンモニウムイオンとして、具体的なアルキル基の例としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロビル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、イソペンチル基、及びヘキシル基が挙げられるが、より具体的には、例えば、ジエチルアンモニウムイオン、トリエチルアンモニウムイオン、テトラブチルアンモニウムイオン、ヘキシルアンモニウムイオン、およびジブチルアンモニウムイオンなどが挙げられる。また、ヒドロキシアルキルアンモニウムイオンとして、具体的なヒドロキシアルキル部分の例としては、例えば、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシ－ｎ－プロビル、ヒドロキシイソプロピル、ヒドロキシ－ｎ－ブチル、およびトリスヒドロキシメチルが挙げられるが、より具体的なヒドロキシアルキルアンモニウムイオンの例としては、トリスヒドロキシメチルアンモニウムイオンなどが挙げられる。Ｇ４は、好ましくは、水素原子を表す。
　Ｇ５は、水素原子、または前記水酸基の保護基を表し、保護基を表す場合はＧ１も同じ保護基を表す。Ｇ５は脱保護された場合には水素原子であるが、その場合のヌクレオチド化合物もまた、一連の核酸伸長反応の工程に供される。
　Ｙは、好ましくは、酸素原子である。
　Ｗ１およびＸ１は、好ましくは、Ｗ１がＯＺ基を表し、かつ、Ｘ１がＲ基を表す。
　Ｗ２およびＸ２は、好ましくは、Ｗ２が水酸基を表し、かつ、Ｘ２がＲ基を表す。
　Ｗ３およびＸ３は、好ましくは各々、それぞれ独立して、水酸基を表す。
　Ｒ’は、好ましくは、水酸基である。
　前記工程（１）から（５）のアミダイト法による核酸化合物の合成は、図１のスキーム中の工程（１）または工程（５）における、本発明に関わる脱保護工程以外は、一般的に公知の方法（例えば、前記の特許第５１５７１６８号公報または特許第５５５４８８１号公報に記載の方法）に従って、核酸伸長反応を行うことができる。以下、各工程について説明する。
（核酸伸長反応）
　本明細書において、「核酸伸長反応」とは、ホスホジエステル結合を介して、ヌクレオチドを順次結合させることにより、オリゴヌクレオチドを伸長させる反応を意味する。核酸伸長反応は、一般的なホスホロアミダイト法の手順に従い行うことができる。核酸伸長反応は、ホスホロアミダイト法を採用する核酸自動合成装置等を用いて行ってもよい。
　核酸オリゴマーの鎖長は、例えば、２０ｍｅｒ以上（すなわち、ｎ≧１９）、４０ｍｅｒ以上（すなわち、ｎ≧３９）、５０ｍｅｒ以上（すなわち、ｎ≧４９）、６０ｍｅｒ以上（すなわち、ｎ≧５９）、８０ｍｅｒ以上（すなわち、ｎ≧７９）、１００ｍｅｒ以上（すなわち、ｎ≧９９）、２～２００ｍｅｒ（すなわち、１≦ｎ≦１９９）、１０～１５０ｍｅｒ（すなわち、９≦ｎ≦１４９）、１５～１１０ｍｅｒ（すなわち、１４≦ｎ≦１０９）であってもよい。
　工程（１）の脱保護工程は、固相担体上に担持されたオリゴヌクレオチド鎖末端の５’水酸基の保護基を脱保護する工程である。一般的な保護基としては、４，４’－ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ基）や４－モノメトキシトリチル基、４，４’，４”－トリメトキシトリチル基が用いられる。脱保護は、酸を用いて行うことができる。脱保護用の酸としては、例えば、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、ジクロロ酢酸、メタンスルホン酸、塩酸、酢酸、およびｐ－トルエンスルホン酸等が挙げられる。
　工程（２）の縮合工程は、前記脱保護工程により脱保護したオリゴヌクレオチド鎖末端の５’水酸基に対して、図１のスキームＡに記載の下記式（１３）で示されるヌクレオシドホスホロアミダイトを結合させる反応である。なお、核酸伸長に用いるホスホロアミダイトとしては、式（１３）または（Ａ９）～（Ａ１２）で示されるアミダイト化合物を用いる。また、他に使用可能なホスホロアミダイトとして、２’－ＯＭｅ、２’－Ｆ、２’－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基、２’－Ｏ－メトキシエチル基、２’－Ｈ、および２’－フルオロ－２’－デオキシ－β－Ｄ－アラビノフラノシル基等が挙げられる。前記ヌクレオシドホスホロアミダイトとしては、５’水酸基が保護基（例、ＤＭＴｒ基）で保護されたものを用いる。縮合工程は、前記ヌクレオシドホスホロアミダイトを活性化する活性化剤または縮合剤を用いて行うことができる。活性化剤または縮合剤としては、例えば、５－ベンジルチオ－１Ｈ－テトラゾール（ＢＴＴ）（５－ベンジルメルカプト－１Ｈ－テトラゾールとも称する）、１Ｈ－テトラゾール、４，５－ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）、５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール（ＥＴＴ）、Ｎ－メチルベンズイミダゾリウムトリフラート（Ｎ－ＭｅＢＩＴ）、ベンズイミダゾリウムトリフラート（ＢＩＴ）、Ｎ－フェニルイミダゾリウムトリフラート（Ｎ－ＰｈＩＭＴ）、イミダゾリウムトリフラート（ＩＭＴ）、５－ニトロベンズイミダゾリウムトリフラート（ＮＢＴ）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）又は５－（ビス－３，５－トリフルオロメチルフェニル）－１Ｈ－テトラゾール等が挙げられる。
　図１のスキームＡに記載の式（１３）で示されるヌクレオシドホスホロアミダイト（以下、アミダイトと呼称する）とは、以下のとおりである。
　式:
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
 （式中、
　Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｂａ、およびＲは、前記の通りである。）で示される化合物。
　縮合工程の後は、適宜、未反応の５’水酸基をキャッピングしてもよい。キャッピングは、無水酢酸－テトラヒドロフラン溶液、またはフェノキシ酢酸無水物／Ｎ－メチルイミダゾール溶液等の公知のキャッピング溶液を用いて行うことができる。
　工程（３）の酸化工程は、前記縮合工程により形成された亜リン酸基をリン酸基又はチオリン酸基に変換する工程である。本工程は、３価のリンから５価のリンに酸化剤を使用して変換する反応であり、固相担体に担持されているオリゴ核酸誘導体に酸化剤を反応させることにより実施することができる。
　亜リン酸基をリン酸基に変換する場合には、「酸化剤」として、例えば、ヨウ素を使用することができる。該酸化剤は、０．００５～２Ｍの濃度になるように調製して使用することができる。酸化の酸素源としては水を用いることができ、反応を進行させる塩基としてはピリジン、Ｎ－メチルイミダゾール（ＮＭＩ）、Ｎ－メチルモルフォリン、またはトリエチルアミンなどを用いることができる。また、溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、アセトニトリル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）又はこれらの任意の割合の混合溶媒が挙げられる。例えば、ヨウ素／水／ピリジン／アセトニトリル、あるいはヨウ素／水／ピリジン、あるいはヨウ素／水／ピリジン／ＮＭＩ、あるいはヨウ素／水／ピリジン／ＴＨＦを用いることができる。反応温度は、５℃～５０℃が好ましい。反応時間は、通常１分～３０分が適当である。使用する試薬の量は固相担体に担持されている化合物１ｍｏｌに対して１～１００ｍｏｌが好ましく、より好ましくは１～１０ｍｏｌである。
　亜リン酸トリエステル基をチオリン酸トリエステル基に変換する場合には、「酸化剤」として、例えば、硫黄、３Ｈ－１，２－ベンゾジチオール－３－オン－１，１－ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬）、３－アミノ－１，２，４－ジチアゾール－５－チオン（ＡＤＴＴ）、５－フェニル－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－３－オン（ＰＯＳ）、［（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノメチリデン）アミノ］－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾリン－３－チオン（ＤＤＴＴ）、およびフェニルアセチルジスルフィド（ＰＡＤＳ）を使用することができる。該酸化剤は、０．００１～２Ｍの濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することができる。反応に使用する溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、ピリジン又はこれらの任意の割合の混合溶媒が挙げられる。酸化工程は、前記キャッピング操作の後で行ってもよいし、逆に、酸化工程の後でキャッピング操作を行ってもよいし、この順序は限定されない。
　工程（５－１）において、伸長の最後に導入したヌクレオチドの５’位の水酸基の保護基は、後述の固相担体からの切り出し及び保護基の脱保護の後、５’位の水酸基の保護基をタグとするカラム精製のために使用してもよく、カラム精製後、５’位の水酸基の保護基を脱保護してもよい。
　工程（５－２）において、リン酸保護基を脱保護する工程は、所望の配列を有する核酸の合成が完了した後は、リン酸部分の保護基を脱保護するためにアミン化合物を作用させる。アミン化合物としては、例えば、特許第４７０５７１６号公報に記載されるジエチルアミン等が挙げられる。
　工程（５－２）における、固相担体上で所望の鎖長に伸長した核酸オリゴマーの、固相担体からの切り出しは、通常、切り出し剤として濃アンモニア水を用いて実施される。
　更にアンモニア又はアミン化合物等を用いて、例えば、固相担体からオリゴヌクレオチド鎖を切断して回収する。アミン化合物としては、例えば、メチルアミン、エチルアミン、イソプロピルアミン、エチレンジアミン、またはジエチルアミン等が挙げられる。
　工程（５－３）において、工程（５－２）において固相担体から切り出された核酸化合物（４）のリボースの２’位もしくは３’位の水酸基の保護基は、国際公開第２００６／０２２３２３号公報）、国際公開第２０１３／０２７８４３号公報、または国際公開第２０１９／２０８５７１号公報に記載の方法に従って除くことができて、脱保護した核酸オリゴマー（５）を得ることができる。
　本発明の製造方法を用いて製造可能な核酸オリゴマーとしては、核酸オリゴマー内に含まれるヌクレオシドが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、並びに２’－Ｏ－ＭＯＥ、２’－Ｏ－Ｍｅ、２’－Ｆを有するＲＮＡ、およびＬＮＡである核酸オリゴマーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。例えば、Xiulong, Shenら著、Nucleic Acids Research, 2018, Vol. 46, No.46, 1584-1600、およびDaniel O'Reillyら著、Nucleic Acids Research, 2019, Vol. 47, No.2, 546-558に記載された、様々なヌクレオシドの例が挙げられる。好ましくは、本発明の方法で製造される核酸オリゴマーはＲＮＡである。
　本発明の製造方法において使用可能な核酸オリゴマーの典型的な例を、実施例に記載の例に加えて下記の例を示すが、これらに限定されるものではない。
　以下、配列の説明中、Uはウリジンを、Cはシチジンを、Aはアデノシンを、またGはグアノシンを示す。
　国際公開第２０１９／０６０４４２号公報に記載されている、下記の配列（Ａ）および（Ｂ）を有する核酸オリゴマーが挙げられる。
配列（Ａ）：５’－AUGGAAUmACUCUUGGUUmACdTdT－３’（Antisense）（配列番号１）２１ｍｅｒ
配列（Ｂ）：５’－GUmAACmCmAAGAGUmAUmUmCmCmAUmdTdT－３’（Sense）（配列番号２）２１ｍｅｒ
　配列（Ａ）および（Ｂ）中、Umは2'-O-メチルウリジンを、Cmは2'-O-メチルシチジンを、またdTはチミジンを示す。
　Daniel O'Reillyら著、Nucleic Acids Research, 2019, Vol. 47, No.2, 546-558に記載されている核酸オリゴマー（553頁参照）が挙げられる。典型例として、下記の配列（Ｃ）を有する核酸オリゴマーが挙げられる。
配列（Ｃ）：５’－AGAGCCAGCCUUCUUAUUGUUUUAGAGCUAUGCUGU－３’（配列番号３）３６ｍｅｒ
　特許第４９６５７４５号公報に記載されている核酸オリゴマーが挙げられる。典型例として、下記の配列（Ｄ）を有する核酸オリゴマーが挙げられる。
配列（Ｄ）：５’－CCAUGAGAAGUAUGACAACAGCC-P-GGCUGUUGUCAUACUUCUCAUGGUU－３’（配列番号４，５）４９ｍｅｒ
　配列（Ｄ）中、“Ｐ”は、以下の式（Ａ５）において波線で区切られる部分構造で示される。
　なお、配列表中の配列番号４の記載は、配列（Ｄ）の５’末端から「Ｐ」の前までの下記の配列（Ｄ１）の塩基配列を示し、配列番号５の記載は、配列（Ｄ）の「Ｐ」の後から３’末端までの下記の配列（Ｄ２）の塩基配列を示す。
　配列（Ｄ１）：５’－CCAUGAGAAGUAUGACAACAGCC－３’（配列番号４）２３ｍｅｒ
　配列（Ｄ２）：５’－GGCUGUUGUCAUACUUCUCAUGGUU－３’（配列番号５）２５ｍｅｒ
　Nucleic Acids Research, 2019, Vol. 47, No. 2: 547に記載されている、下記の配列（Ｅ）を有する核酸オリゴマーが挙げられる。
配列（Ｅ）：５’－ACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU－３’（配列番号６）６７ｍｅｒ
　特表２０１５－５２３８５６号公報、１７３頁に記載されている、下記の配列（Ｆ）を有する核酸オリゴマーが挙げられる。
配列（Ｆ）：５’－GUUUUCCCUUUUCAAAGAAAUCUCCUGGGCACCUAUCUUCUUAGGUGCCCUCCCUUGUUUAAACCUGACCAGUUAACCGGCUGGUUAGGUUUUU－３’（配列番号７）９４ｍｅｒ
　特表２０１７－５３７６２６号公報に記載されている核酸オリゴマーが挙げられる。典型例として、下記の配列（Ｇ）、（Ｈ）、（Ｉ）、および（Ｊ）を有する核酸オリゴマーが挙げられる。
配列（Ｇ）：５’－AGUCCUCAUCUCCCUCAAGCGUUUUAGAGCUAGUAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU－３’（配列番号８）１００ｍｅｒ
配列（Ｈ）：５’－GCAGAUGUAGUGUUUCCACAGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU－３’（配列番号９）１１３ｍｅｒ
配列（Ｉ）：５’－dAdGdTdCdCdTdCdAdTdCdTdCdCdCdTdCdAdAdGdCGUUUAAGAGCUAUGCUGGUAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU－３’（配列番号１０）１１３ｍｅｒ
　配列（Ｉ）中、dTはチミジンを、dCは2'-デオキシシチジンを、dAは2'-デオキシアデノシンを、またdGは2'-デオキシグアノシンを示す。
配列（Ｊ）：５’－AmsGmsUmsCCUCAUCUCCCUCAAGCGUUUAAGAGCUAUGCUGGUAACAGCAUAGC AAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUmsUmsUmsU－３’（配列番号１１）１１３ｍｅｒ
　配列（Ｊ）中、Umは2'-O-メチルウリジンを、Amは2'-O-メチルアデノシンを、Gmは2'-O-メチルグアノシンを、またsはホスホロチオエート修飾を示す。
　以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
＜測定方法＞
　まず、以下の試験で用いた各種測定方法を以下に示す。
　オリゴヌクレオチド純度は、ＨＰＬＣを用いて測定した。
　ＨＰＬＣ測定条件を下記表１に示す。
（測定方法１：オリゴヌクレオチド純度の測定）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
（測定方法２：オリゴヌクレオチド収量の測定）
　前記粗生成物のＯＤ２６０を測定した。ＯＤ２６０とは１ｍＬ溶液（ｐＨ＝７．５）における１０ｍｍ光路長あたりのＵＶ２６０ｎｍの吸光度を表す。一般的にＲＮＡでは１ＯＤ＝４０μｇであることが知られていることから、前記ＯＤ２６０の測定値に基づき、収量を算出した。
（測定方法３：ホルムアルデヒド濃度の測定）
　トリクロロ酢酸溶液中のホルムアルデヒド濃度測定方法には、高速液体クロマトグラフ法がある。高速液体クロマトグラフ法では、ホルムアルデヒドとアセチルアセトンを反応させ、得られた３，５－ジアセチル－１，４－ジヒドロルチジンの量を測定し、ホルムアルデヒドの濃度を算出する。
＜トリクロロ酢酸溶液の調製＞
　以下の試験で用いたホルムアルデヒド濃度の異なるトリクロロ酢酸溶液は、予めホルムアルデヒド濃度の低いトリクロロ酢酸溶液を調製し、得られたトリクロロ酢酸溶液にホルムアルデヒド水溶液を添加して調製した。
＜オリゴヌクレオチドの固相合成＞
　配列（Ｉ）：５’－GGCACCGAGUCGGUGCUUUU－３’（配列番号１２）２０ｍｅｒ
　配列（ＩＩ）：５’－AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU－３’（配列番号１３）５０ｍｅｒ
　配列（ＩＩＩ）：５’－AUAACUCAAUUUGUAAAAAAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU－３’（配列番号１４）１００ｍｅｒ
　前記配列（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）中、“Ａ”は、以下の式（Ａ１）において波線で区切られる部分構造で示される。“Ｃ”は、以下の式（Ａ２）において波線で区切られる部分構造で示される。“Ｇ”は、以下の式（Ａ３）において波線で区切られる部分構造で示される。Ｕは、以下の式（Ａ４）において波線で区切られる部分構造で示される。なお、３’末端の“Ｕ”は、以下の式（Ａ８）において波線で区切られる部分構造で示される。また、配列（Ｉ）中、５’末端の“Ｇ”は、以下の式（Ａ６）において波線で区切られる部分構造で示され、配列（ＩＩ）および（ＩＩＩ）中、５’末端の“Ａ”は、以下の式（Ａ７）において波線で区切られる部分構造で示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
　固相担体として、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｐｏｒｅ　Ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）を使用し、核酸合成機としてＮＴＳ　Ｍ－４ＭＸ－Ｅ（日本テクノサービス社製）を用いて、ホスホロアミダイト固相合成法により、前記配列（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）からなるオリゴヌクレオチドを３’側から５’側に向かって合成した。合成は、約１μｍｏｌスケールにて実施した。また、合成には、ＵＳ２０１２／００３５２４６の実施例２に記載のウリジンＥＭＭアミダイト（Ａ１１）、実施例３に記載のシチジンＥＭＭアミダイト（Ａ９）、実施例４に記載のアデノシンＥＭＭアミダイト（Ａ１２）、および実施例５に記載のグアノシンＥＭＭアミダイト（Ａ１０）を使用し、デブロッキング溶液として３％トリクロロ酢酸トルエン溶液を使用し、縮合剤として５－ベンジルメルカプト－１Ｈ－テトラゾールを使用し、酸化剤としてヨウ素溶液を使用し、キャッピング溶液としてフェノキシ酢酸無水物溶液とＮ－メチルイミダゾール溶液を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
　次に、本発明の製法により製造されるオリゴヌクレオチド（核酸オリゴマー）の具体的な製造例を示す。ここで、下記の実施例において本発明の製法により製造されるオリゴヌクレオチドは、前記配列（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）を有するオリゴヌクレオチドである。
　また、以下の実施例および比較例中に記載するウリジン誘導体とは、下記の構造式で示される化合物を意味する。下記構造式において図示されたサークルは、ＣＰＧを模式的に示すものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
（実施例１）
　０．９９μｍｏｌのウリジン誘導体を担持したＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｐｏｒｅ　Ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）と、式（Ａ９）、式（Ａ１０）、式（Ａ１１）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトを用いて、配列（Ｉ）に示す核酸オリゴマーをＮＴＳ　Ｍ－４ＭＸ－Ｅ（日本テクノサービス社製）により、３’側から５’側に向かって自動合成した。自動合成の手順は、まず、３％トリクロロ酢酸トルエン溶液をＣＰＧに送液し、５’位のトリチル保護基を脱保護した。この際、使用したトリクロロ酢酸溶液中のホルムアルデヒド濃度は、測定方法３により測定することができ、トリクロロ酢酸溶液中のホルムアルデヒドとトリクロロ酢酸のモル比（ホルムアルデヒドｍｏｌ／トリクロロ酢酸ｍｏｌ）は、３３×１０－７であった。続いて、各種アミダイトと縮合剤として５－ベンジルメルカプト－１Ｈ－テトラゾールをＣＰＧに送液し、５’位の水酸基にカップリング反応を進行させた。続いて、５０ｍＭヨウ素を含む酸化溶液を送液し、亜リン酸基をリン酸基に変換した。続いて、キャッピング溶液として０．１Ｍフェノキシ酢酸無水物アセトニトリル溶液と１０％Ｎ－メチルイミダゾール／１０％２，６－ルチジンアセトニトリル溶液を使用し、カップリングが進行しなかった反応点にキャッピングを施した。更にこれらの工程を合計１９回繰り返した後、５’末端の塩基における保護基（ＤＭＴｒ基）を３％トリクロロ酢酸トルエン溶液で脱保護し、配列（Ｉ）に示される配列の核酸オリゴヌクレオチドをＣＰＧ担体上に合成した。その後、０．９９μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体に対して、２８％アンモニア水１．５ｍＬとエタノール０．５ｍＬを流入し、混合物を４０℃で４時間保温することで核酸オリゴマーを固相担体から遊離させた後、濃縮により溶媒を除去した。次いで遊離オリゴヌクレオチドをジメチルスルホキシド１．５ｍＬに溶解後、アセトニトリル１．０ｍＬ、ニトロメタン２０μＬと撹子を入れた後、モレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液２．０８ｍＬをスターラーによる攪拌下室温で流入し、混合物を３３℃で４時間保温することで２’－ＥＭＭ保護基の脱保護を行った。その後、核酸オリゴマーの生成物を沈殿操作により得た。得られた生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定した結果、純度は７２．６％であった。また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定したところ、収量は４３６９μｇであり、１．００μｍｏｌのウリジン誘導体を担持したＣＰＧあたりの収量に換算すると４４１３μｇであった。結果を表２に示す。
（実施例２）
　実施例１の実験において、１．００μｍｏｌのウリジン誘導体を担持したＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｐｏｒｅ　Ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）と、ホルムアルデヒドとトリクロロ酢酸のモル比（ホルムアルデヒドｍｏｌ／トリクロロ酢酸ｍｏｌ）が１１×１０－５である３％トリクロロ酢酸トルエン溶液を用いる以外は、同様の方法で配列（Ｉ）の核酸オリゴマーを得た。前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定した結果、生成物の純度は７１．４％であった。また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定したところ、１．００μｍｏｌのウリジン誘導体を担持したＣＰＧあたりの収量は４２３６μｇであった。結果を表２に示す。
（参考例１）
　実施例１の実験において、０．９７μｍｏｌのウリジン誘導体を担持したＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｐｏｒｅ　Ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）と、ホルムアルデヒドとトリクロロ酢酸のモル比（ホルムアルデヒドｍｏｌ／トリクロロ酢酸ｍｏｌ）が２６×１０－５である３％トリクロロ酢酸トルエン溶液を用いる以外は、同様の方法で配列（Ｉ）の核酸オリゴマーを得た。前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定した結果、生成物の純度は６９．７％であった。また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定したところ、収量は３９８２μｇであり、１．００μｍｏｌのウリジン誘導体を担持したＣＰＧあたりの収量に換算すると４１０５μｇであった。結果を表２に示す。
（実施例３）
　１．０１μｍｏｌのウリジン誘導体を担持したＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｐｏｒｅ　Ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）と、式（Ａ９）、式（Ａ１０）、式（Ａ１１）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトを用いて、配列（ＩＩ）に示す核酸オリゴマーをＮＴＳ　Ｍ－４ＭＸ－Ｅ（日本テクノサービス社製）により、３’側から５’側に向かって自動合成した。自動合成の手順は、まず、３％トリクロロ酢酸トルエン溶液をＣＰＧに送液し、５’位のトリチル保護基を脱保護した。この際、使用したトリクロロ酢酸溶液中のホルムアルデヒド濃度は、測定方法３により測定することができ、トリクロロ酢酸溶液中のホルムアルデヒドとトリクロロ酢酸のモル比（ホルムアルデヒドｍｏｌ／トリクロロ酢酸ｍｏｌ）は、３３×１０－７であった。続いて、各種アミダイトと縮合剤として５－ベンジルメルカプト－１Ｈ－テトラゾールをＣＰＧに送液し、５’位の水酸基にカップリング反応を進行させた。続いて、５０ｍＭヨウ素を含む酸化溶液を送液し、亜リン酸基をリン酸基に変換した。続いて、キャッピング溶液として０．１Ｍフェノキシ酢酸無水物アセトニトリル溶液と１０％Ｎ－メチルイミダゾール／１０％２，６－ルチジンアセトニトリル溶液を使用し、カップリングが進行しなかった反応点にキャッピングを施した。更にこれらの工程を合計４９回繰り返した後、５’末端の塩基における保護基（ＤＭＴｒ基）を３％トリクロロ酢酸トルエン溶液で脱保護し、配列（ＩＩ）に示される配列の核酸オリゴヌクレオチドをＣＰＧ担体上に合成した。その後、１．０１μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体に対して、２８％アンモニア水１．５ｍＬとエタノール０．５ｍＬを流入し、混合物を４０℃で４時間保温することで核酸オリゴマーを固相担体から遊離させた後、濃縮により溶媒を除去した。次いで遊離オリゴヌクレオチドをジメチルスルホキシド１．５ｍＬに溶解後、アセトニトリル１．０ｍＬ、ニトロメタン２０μＬと撹子を入れた後、モレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液２．０８ｍＬをスターラーによる攪拌下室温で流入し、混合物を３３℃で４時間保温することで２’－ＥＭＭ保護基の脱保護を行った。その後、核酸オリゴマーの生成物を沈殿操作により得た。得られた生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定した結果、純度は４３．１％であった。また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定したところ、収量は９９４１μｇであり、１．００μｍｏｌのウリジン誘導体を担持したＣＰＧあたりの収量に換算すると９８４３μｇであった。結果を表２に示す。
（実施例４）
　実施例３の実験において、１．０１μｍｏｌのウリジン誘導体を担持したＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｐｏｒｅ　Ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）と、ホルムアルデヒドとトリクロロ酢酸のモル比（ホルムアルデヒドｍｏｌ／トリクロロ酢酸ｍｏｌ）が１１×１０－５である３％トリクロロ酢酸トルエン溶液を用いる以外は、同様の方法で配列（ＩＩ）の核酸オリゴマーを得た。前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定した結果、生成物の純度は３６．５％であった。また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定したところ、収量は９７１０μｇであり、１．００μｍｏｌのウリジン誘導体を担持したＣＰＧあたりの収量に換算すると９６１４μｇであった。結果を表２に示す。
（参考例２）
　実施例３の実験において、１．０２μｍｏｌのウリジン誘導体を担持したＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｐｏｒｅ　Ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）と、ホルムアルデヒドとトリクロロ酢酸のモル比（ホルムアルデヒドｍｏｌ／トリクロロ酢酸ｍｏｌ）が２６×１０－５である３％トリクロロ酢酸トルエン溶液を用いる以外は、同様の方法で配列（ＩＩ）の核酸オリゴマーを得た。前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定した結果、生成物の純度は３３．２％であった。また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定したところ、収量は９１５８μｇであり、１．００μｍｏｌのウリジン誘導体を担持したＣＰＧあたりの収量に換算すると８９７８μｇであった。結果を表２に示す。
（実施例５）
　１．００μｍｏｌのウリジン誘導体を担持したＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｐｏｒｅ　Ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）と、式（Ａ９）、式（Ａ１０）、式（Ａ１１）、または式（Ａ１２）に示すアミダイトを用いて、配列（ＩＩＩ）に示す核酸オリゴマーをＮＴＳ　Ｍ－４ＭＸ－Ｅ（日本テクノサービス社製）により、３’側から５’側に向かって自動合成した。自動合成の手順は、まず、３％トリクロロ酢酸トルエン溶液をＣＰＧに送液し、５’位のトリチル保護基を脱保護した。この際、使用したトリクロロ酢酸溶液中のホルムアルデヒド濃度は、測定方法３により測定することができ、トリクロロ酢酸溶液中のホルムアルデヒドとトリクロロ酢酸のモル比（ホルムアルデヒドｍｏｌ／トリクロロ酢酸ｍｏｌ）は、３３×１０－７であった。続いて、各種アミダイトと縮合剤として５－ベンジルメルカプト－１Ｈ－テトラゾールをＣＰＧに送液し、５’位の水酸基にカップリング反応を進行させた。続いて、５０ｍＭヨウ素を含む酸化溶液を送液し、亜リン酸基をリン酸基に変換した。続いて、キャッピング溶液として０．１Ｍフェノキシ酢酸無水物アセトニトリル溶液と１０％Ｎ－メチルイミダゾール／１０％２，６－ルチジンアセトニトリル溶液を使用し、カップリングが進行しなかった反応点にキャッピングを施した。更にこれらの工程を合計９９回繰り返した後、５’末端の塩基における保護基（ＤＭＴｒ基）を３％トリクロロ酢酸トルエン溶液で脱保護し、配列（ＩＩＩ）に示される配列の核酸オリゴヌクレオチドをＣＰＧ担体上に合成した。その後、１．００μｍｏｌ分のオリゴヌクレオチドを担持したＣＰＧ担体に対して、２８％アンモニア水１．５ｍＬとエタノール０．５ｍＬを流入し、混合物を４０℃で４時間保温することで核酸オリゴマーを固相担体から遊離させた後、濃縮により溶媒を除去した。次いで遊離オリゴヌクレオチドをジメチルスルホキシド１．５ｍＬに溶解後、アセトニトリル１．０ｍＬ、ニトロメタン２０μＬと撹子を入れた後、モレキュラーシーブ４Ａにて脱水処理を施した１Ｍのフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）のジメチルスルホキシド溶液２．０８ｍＬをスターラーによる攪拌下室温で流入し、混合物を３３℃で４時間保温することで２’－ＥＭＭ保護基の脱保護を行った。その後、核酸オリゴマーの生成物を沈殿操作により得た。得られた生成物について、前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定した結果、純度は３２．８％であった。また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定したところ、１．００μｍｏｌのウリジン誘導体を担持したＣＰＧあたりの収量は１５７２２μｇであった。結果を表２に示す。
（実施例６）
　実施例５の実験において、１．０１μｍｏｌのウリジン誘導体を担持したＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｐｏｒｅ　Ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）と、ホルムアルデヒドとトリクロロ酢酸のモル比（ホルムアルデヒドｍｏｌ／トリクロロ酢酸ｍｏｌ）が１１×１０－５である３％トリクロロ酢酸トルエン溶液を用いる以外は、同様の方法で配列（ＩＩＩ）の核酸オリゴマーを得た。前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定した結果、生成物の純度は３０．９％であった。また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定したところ、収量は１４７５４μｇであり、１．００μｍｏｌのウリジン誘導体を担持したＣＰＧあたりの収量に換算すると１４６０８μｇであった。結果を表２に示す。
（参考例３）
　実施例５の実験において、０．９７μｍｏｌのウリジン誘導体を担持したＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｐｏｒｅ　Ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）と、ホルムアルデヒドとトリクロロ酢酸のモル比（ホルムアルデヒドｍｏｌ／トリクロロ酢酸ｍｏｌ）が２６×１０－５である３％トリクロロ酢酸トルエン溶液を用いる以外は、同様の方法で配列（ＩＩＩ）の核酸オリゴマーを得た。前記測定方法１に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの純度を測定した結果、生成物の純度は２６．７％であった。また、前記測定方法２に記載の方法を用いて、オリゴヌクレオチドの収量を測定したところ、収量は１３２８３μｇであり、１．００μｍｏｌのウリジン誘導体を担持したＣＰＧあたりの収量に換算すると１３６９４μｇであった。結果を表２に示す。
（実施例７）
　ホルムアルデヒドとトリクロロ酢酸のモル比（ホルムアルデヒドｍｏｌ／トリクロロ酢酸ｍｏｌ）が２５×１０－５であるトリクロロ酢酸３０ｇに、トルエン３００ｍＬを加え、エバポレーターを用いて、４０℃でトルエンとホルムアルデヒドを共沸留去し、無色油状のトリクロロ酢酸溶液３４ｇを得た。得られたトリクロロ酢酸溶液に含まれるホルムアルデヒドを測定方法３に記載の方法で分析したところ、ホルムアルデヒドとトリクロロ酢酸のモル比は、２５×１０－７であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000043
　上記表２の結果より、ホルムアルデヒド濃度が一定以下である本発明のトリクロロ酢酸溶液を使用した場合には、参考例１、参考例２および参考例３のトリクロロ酢酸溶液を使用した場合と比較して、高収率で核酸オリゴマーが得られた。
　本発明は、効率的な核酸オリゴマーの製造方法を提供する。また、核酸オリゴマーの製造方法に従って製造される核酸オリゴマーの収率向上が期待できる。
　配列表の配列番号１～１４は、本発明の製造方法に従って製造されるオリゴヌクレオチドの塩基配列を表す。

Claims (25)

  1. 　式（１）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、
    　Ｇ２は、水酸基の保護基を示し、
    　Ｂａは、それぞれ独立して、同一又は相異なって、保護基で保護されていてもよい核酸塩基を表し、
    　Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、同一又は相異なって、水素原子又はアルコキシ基を表し、
    　Ｒは、それぞれ独立して、同一又は相異なって、保護された水酸基、水素原子、フッ素原子、メトキシ基、２－メトキシエチル基、またはＯＱ’基を表し、
    　Ｑ’は、それぞれ独立して、同一又は相異なって、リボースの４’位の炭素原子と結合しているメチレン基、リボースの４’位の炭素原子と結合しているエチレン基、またはリボースの４’位の炭素原子と結合しているエチリデン基を表し、
    　Ｙは、それぞれ独立して、同一又は相異なって、酸素原子または硫黄原子を表し、
    　ｎは、１～２００の何れかの整数を表し、
    　Ｗ１は、ＯＺ基を表し、かつ、Ｘ１は、Ｒ基を表すか、あるいは
    　Ｗ１は、ＯＶ基を表し、かつ、Ｘ１は、ＯＺ基を表し、
    　Ｖは、水酸基の保護基を表し、
    　Ｚは、固相担体および連結基からなる構造を有する基である。
    　そして、ｎが２以上の整数のとき、式（１）で示される核酸オリゴマーは、それぞれのヌクレオチドの間に、非ヌクレオチドリンカーが組み込まれていてもよい。）
    で示される核酸オリゴマーと、ホルムアルデヒドとトリクロロ酢酸のモル比（ホルムアルデヒドｍｏｌ／トリクロロ酢酸ｍｏｌ）が、１１×１０－５以下であるトリクロロ酢酸溶液とを反応させる工程を含む、式（２）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式中、
    　Ｇ２、Ｂａ、Ｒ、Ｙ、Ｘ１、Ｗ１およびｎは、前記のとおりであり、そして、
    　式（１）において定義されたとおり、ヌクレオチドの間に、非ヌクレオチドリンカーが組み込まれていてもよい。）
    で示される核酸オリゴマーの製造方法。
  2. 　請求項１に記載の工程と、さらに、当該工程で生成する式（２）で示される核酸オリゴマーからＺで表される基を除く工程、ならびに水酸基および核酸塩基の保護基を除く工程を含む、式（２’）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （式中、
    　Ｙおよびｎは、前記のとおりであり、
    　Ｂｃは、それぞれ独立して、同一又は相異なって、核酸塩基を表し、
    　Ｇ４は、それぞれ独立して、同一又は相異なって、水素原子、アルカリ金属イオン、アンモニウムイオン、アルキルアンモニウムイオン、またはヒドロキシアルキルアンモニウムイオンを表し、
    　Ｒ’は、それぞれ独立して、同一又は相異なって、水酸基、水素原子、フッ素原子、メトキシ基、２－メトキシエチル基、またはＯＱ’基を表し、
    　Ｑ’は、前記のとおりであり、そして、
    　Ｘ３およびＷ３は各々、それぞれ独立して、水酸基を表すか、あるいは
    　Ｘ３は、Ｒ’基を表し、かつ、Ｗ３は、水酸基を表す。）
    で示される核酸オリゴマーの製造方法。
  3. 　式（２）で示される核酸オリゴマーを、アミダイト法で任意に鎖長を伸長した式（３）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     （式中、
    　Ｇ２、Ｂａ、Ｒ、Ｙ、Ｘ１およびＷ１は、前記のとおりであり、
    　Ｇ５は、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     で示される水酸基の保護基、または水素原子を示し、
    　Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、前記のとおりであり、そして、
    　ｍは、ｍ≧ｎを満たす整数である。）
    で示される核酸化合物を得る工程、ならびに
    　式（３）で示される化合物から、式（４）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     （式中、
    　Ｇ５、Ｒ、Ｙおよびｍは、前記のとおりであり、
    　Ｇ４は、それぞれ独立して、同一又は相異なって、水素原子、アルカリ金属イオン、アンモニウムイオン、アルキルアンモニウムイオン、またはヒドロキシアルキルアンモニウムイオンを表し、
    　ＢＣは、それぞれ独立して、同一又は相異なって、核酸塩基を表し、
    　Ｘ２は、水酸基を表し、かつ、Ｗ２は、ＯＶ基を表すか、あるいは
    　Ｘ２は、Ｒ基を表し、かつ、Ｗ２は、水酸基を表し、そして、
    　Ｖは、水酸基の保護基を表す。）
    で示される化合物を切り出し、
    　さらに式（４）で示される化合物を脱保護して、式（５）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     （式中、
    　Ｇ４、Ｂｃ、Ｙおよびｍは、前記のとおりであり、Ｒ’は、それぞれ独立して、同一又は相異なって、水酸基、水素原子、フッ素原子、メトキシ基、２－メトキシエチル基、またはＯＱ’基を表し、
    　Ｑ’は、前記のとおりであり、そして、
    　Ｘ３およびＷ３は各々、それぞれ独立して、水酸基を表すか、あるいは
    　Ｘ３は、Ｒ’基を表し、かつ、Ｗ３は、水酸基を表す。）
    で示される核酸オリゴマーを製造する工程をさらに含む、請求項１に記載の製造方法。
  4. 　非ヌクレオチドリンカーが、アミノ酸骨格からなるリンカーである、請求項１～３の何れか一項に記載の製造方法。
  5. 　アミノ酸骨格からなるリンカーが、下記式（Ａ１４－１）、（Ａ１４－２）および（Ａ１４－３）からなる群から選ばれる構造を有するリンカーである、請求項４に記載の製造方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
     （式中、Ｙは、前記のとおりである。）
  6. 　トリクロロ酢酸溶液が、ジクロロメタン、アセトニトリル、および芳香族有機溶媒からなる群から選ばれる少なくとも１つの溶媒を含む、請求項１～５の何れか一項に記載の製造方法。
  7. 　トリクロロ酢酸溶液中のホルムアルデヒドとトリクロロ酢酸のモル比（ホルムアルデヒドｍｏｌ／トリクロロ酢酸ｍｏｌ）が、５４×１０－６以下である、請求項１～６の何れか一項に記載の製造方法。
  8. 　トリクロロ酢酸溶液中のホルムアルデヒドとトリクロロ酢酸のモル比（ホルムアルデヒドｍｏｌ／トリクロロ酢酸ｍｏｌ）が、２７×１０－６以下である、請求項１～６の何れか一項に記載の製造方法。
  9. 　核酸オリゴマーが、リボ核酸（ＲＮＡ）である、請求項１～８の何れか一項に記載の製造方法。
  10. 　核酸オリゴマーが、リボ核酸（ＲＮＡ）であり、そのリボースの２’位の水酸基の保護基が、式（６）で示される保護基である、請求項１～８の何れか一項に記載の製造方法。
    　式（６）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
     （式中、
    　ｑは、１～５の何れかの整数を表し、
    　ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、同一又は相異なって、メチル基、エチル基または水素原子を表し、
    　＊印は、リボースの２’位の水酸基由来の酸素原子との結合点を表し、そして、
    　ＥＷは、電子求引基を表す。）
  11. 　ＲａおよびＲｂが同時に水素原子であり、かつ、ＥＷがシアノ基である、請求項１０に記載の製造方法。
  12. 　核酸オリゴマーが、４０鎖長以上のオリゴマーである、請求項１～１１の何れか一項に記載の製造方法。
  13. 　核酸オリゴマーが、５０鎖長以上のオリゴマーである、請求項１～１１の何れか一項に記載の製造方法。
  14. 　核酸オリゴマーが、６０鎖長以上のオリゴマーである、請求項１～１１の何れか一項に記載の製造方法。
  15. 　核酸オリゴマーが、８０鎖長以上のオリゴマーである、請求項１～１１の何れか一項に記載の製造方法。
  16. 　核酸オリゴマーが、１００鎖長以上のオリゴマーである、請求項１～１１の何れか一項に記載の製造方法。
  17. 　ホルムアルデヒドとトリクロロ酢酸のモル比（ホルムアルデヒドｍｏｌ／トリクロロ酢酸ｍｏｌ）が、１１×１０－５以下である、トリクロロ酢酸溶液。
  18. 　ホルムアルデヒドとトリクロロ酢酸のモル比（ホルムアルデヒドｍｏｌ／トリクロロ酢酸ｍｏｌ）が、５４×１０－６以下である、請求項１７に記載のトリクロロ酢酸溶液。
  19. 　ホルムアルデヒドとトリクロロ酢酸のモル比（ホルムアルデヒドｍｏｌ／トリクロロ酢酸ｍｏｌ）が、２７×１０－６以下である、請求項１７に記載のトリクロロ酢酸溶液。
  20. 　ホルムアルデヒドを含む未精製トリクロロ酢酸と、ホルムアルデヒドと共沸する溶媒とを含む溶液から、ホルムアルデヒドを共沸させて留去することにより精製トリクロロ酢酸を得る工程を含む、請求項１７～１９の何れか一項に記載のトリクロロ酢酸の製造方法。
  21. 　共沸溶媒の沸点が、１９８℃以下である、請求項２０に記載の製造方法。
  22. 　共沸溶媒が、ジクロロメタン、アセトニトリルまたは芳香族有機溶媒である、請求項２０または２１に記載の製造方法。
  23. 　芳香族有機溶媒がトルエンである、請求項２２に記載の製造方法。
  24. 　請求項２０に記載のトリクロロ酢酸の精製工程、および当該工程で得られた精製トリクロロ酢酸を使用する請求項１～３の何れか一項に記載の工程を含む、核酸オリゴマーの製造方法。
  25. 　トリクロロ酢酸溶液として、請求項１７、１８および１９の何れか一項に記載のトリクロロ酢酸溶液を選択する工程を含む、請求項１～１６および２０～２４の何れか一項に記載の製造方法。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023054350A1 (ja) * 2021-09-28 2023-04-06 住友化学株式会社 精製ジクロロ酢酸の製造方法
JPWO2023182274A1 (ja) * 2022-03-23 2023-09-28

Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001053528A1 (en) 2000-01-18 2001-07-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of ptp1b expression
JP3745226B2 (ja) 1998-09-29 2006-02-15 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド サービビン発現のアンチセンス・モジュレーション
WO2006022323A1 (ja) 2004-08-26 2006-03-02 Nippon Shinyaku Co., Ltd. ホスホロアミダイト化合物及びオリゴｒｎａの製法
JP4705716B2 (ja) 1999-02-05 2011-06-22 ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・コーポレイション オリゴヌクレオチドの脱保護法
WO2012005368A1 (ja) 2010-07-08 2012-01-12 株式会社ボナック 遺伝子発現制御のための一本鎖核酸分子
US20120035246A1 (en) 2010-08-03 2012-02-09 Bonac Corporation Single-stranded nucleic acid molecule having nitrogen-containing alicyclic skeleton
JP4965745B2 (ja) 2010-08-03 2012-07-04 株式会社ボナック 含窒素脂環式骨格を有する一本鎖核酸分子
WO2013027843A1 (ja) 2011-08-25 2013-02-28 株式会社ボナック 配糖体化合物、チオエーテルの製造方法、エーテル、エーテルの製造方法、配糖体化合物の製造方法、核酸の製造方法
JP2014221817A (ja) 2006-10-18 2014-11-27 アイシス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド アンチセンス化合物
WO2018182008A1 (ja) 2017-03-31 2018-10-04 株式会社ボナック 遺伝子発現制御機能を有する環状型核酸分子
WO2019060442A1 (en) 2017-09-19 2019-03-28 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATMENT OF TRANSTHYRETIN MEDIATED AMYLOSIS (TTR)
WO2019074110A1 (ja) 2017-10-13 2019-04-18 株式会社ボナック 一本鎖核酸分子およびその製造方法
WO2019208571A1 (ja) 2018-04-24 2019-10-31 住友化学株式会社 アミダイト化合物及び該化合物を用いたポリヌクレオチドの製造方法
JP2020118316A (ja) 2019-01-21 2020-08-06 シャープ株式会社 空気調和機およびシステム

Patent Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3745226B2 (ja) 1998-09-29 2006-02-15 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド サービビン発現のアンチセンス・モジュレーション
JP4705716B2 (ja) 1999-02-05 2011-06-22 ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・コーポレイション オリゴヌクレオチドの脱保護法
WO2001053528A1 (en) 2000-01-18 2001-07-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of ptp1b expression
JP5157168B2 (ja) 2004-08-26 2013-03-06 日本新薬株式会社 ホスホロアミダイト化合物及びオリゴｒｎａの製法
WO2006022323A1 (ja) 2004-08-26 2006-03-02 Nippon Shinyaku Co., Ltd. ホスホロアミダイト化合物及びオリゴｒｎａの製法
JP2014221817A (ja) 2006-10-18 2014-11-27 アイシス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド アンチセンス化合物
WO2012005368A1 (ja) 2010-07-08 2012-01-12 株式会社ボナック 遺伝子発現制御のための一本鎖核酸分子
JP4965745B2 (ja) 2010-08-03 2012-07-04 株式会社ボナック 含窒素脂環式骨格を有する一本鎖核酸分子
US20120035246A1 (en) 2010-08-03 2012-02-09 Bonac Corporation Single-stranded nucleic acid molecule having nitrogen-containing alicyclic skeleton
WO2013027843A1 (ja) 2011-08-25 2013-02-28 株式会社ボナック 配糖体化合物、チオエーテルの製造方法、エーテル、エーテルの製造方法、配糖体化合物の製造方法、核酸の製造方法
JP5554881B2 (ja) 2011-08-25 2014-07-23 株式会社ボナック 配糖体化合物、チオエーテルの製造方法、エーテル、エーテルの製造方法、配糖体化合物の製造方法、核酸の製造方法
WO2018182008A1 (ja) 2017-03-31 2018-10-04 株式会社ボナック 遺伝子発現制御機能を有する環状型核酸分子
WO2019060442A1 (en) 2017-09-19 2019-03-28 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATMENT OF TRANSTHYRETIN MEDIATED AMYLOSIS (TTR)
WO2019074110A1 (ja) 2017-10-13 2019-04-18 株式会社ボナック 一本鎖核酸分子およびその製造方法
WO2019208571A1 (ja) 2018-04-24 2019-10-31 住友化学株式会社 アミダイト化合物及び該化合物を用いたポリヌクレオチドの製造方法
JP2020118316A (ja) 2019-01-21 2020-08-06 シャープ株式会社 空気調和機およびシステム

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DANIEL O'REILLY ET AL., NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 47, no. 2, 2019, pages 547 - 558
FARRHIN NOWSHAD;MD.NAZIBUL ISLAM;MOHIDUSSAMAD KHAN: "Concentration and formation behavior of naturally occurring formaldehyde in foods", AGRICULTURE & FOOD SECURITY, vol. 7, no. 1, 11 June 2018 (2018-06-11), London, UK , pages 1 - 8, XP021257334, DOI: 10.1186/s40066-018-0166-4 *
See also references of EP4180442A4
SEPTAK M: "Kinetic studies on depurination and detritylation of CPG-bound intermediates during oligonucleotide synthesis", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 24, no. 15, 1 August 1996 (1996-08-01), pages 3053 - 3058, XP055784527, DOI: 10.1093/nar/24.15.3053 *
XIULONGSHEN ET AL., NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 46, no. 46, 2018, pages 1584 - 1600
YASUYOSHI CHINO, RYOJI SATO: "Recent Development of Automatic Synthesizing System", JOURNAL OF SYNTHETIC ORGANIC CHEMISTRY, JAPAN, vol. 44, no. 4, 1 April 1986 (1986-04-01), JP , pages 365 - 374, XP009542586, ISSN: 0037-9980, DOI: 10.5059/yukigoseikyokaishi.44.365 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023054350A1 (ja) * 2021-09-28 2023-04-06 住友化学株式会社 精製ジクロロ酢酸の製造方法
JPWO2023182274A1 (ja) * 2022-03-23 2023-09-28
WO2023182274A1 (ja) * 2022-03-23 2023-09-28 住友化学株式会社 核酸オリゴマーの製造方法
US20250145655A1 (en) * 2022-03-23 2025-05-08 Sumitomo Chemical Company, Limited Method for producing nucleic acid oligomer
US12509485B2 (en) * 2022-03-23 2025-12-30 Sumitomo Chemical Company, Limited Method for producing nucleic acid oligomer

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