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WO2022050300A1 - 新規エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ - Google Patents

新規エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ Download PDF

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WO2022050300A1
WO2022050300A1 PCT/JP2021/032083 JP2021032083W WO2022050300A1 WO 2022050300 A1 WO2022050300 A1 WO 2022050300A1 JP 2021032083 W JP2021032083 W JP 2021032083W WO 2022050300 A1 WO2022050300 A1 WO 2022050300A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
endo
sugar chain
amino acid
seq
molecule
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2021/032083
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English (en)
French (fr)
Inventor
華子 西澤
泰典 小野
充広 岩本
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Daiichi Sankyo Co Ltd
Original Assignee
Daiichi Sankyo Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Daiichi Sankyo Co Ltd filed Critical Daiichi Sankyo Co Ltd
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Priority to KR1020237006587A priority patent/KR20230061360A/ko
Priority to JP2022546941A priority patent/JP7798773B2/ja
Priority to CA3191395A priority patent/CA3191395A1/en
Priority to AU2021338014A priority patent/AU2021338014A1/en
Priority to EP21864357.5A priority patent/EP4209506A4/en
Priority to US18/024,258 priority patent/US20240336907A1/en
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    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01096—Mannosyl-glycoprotein endo-beta-N-acetylglucosaminidase (3.2.1.96)

Definitions

  • the present invention relates to endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase (Endo-Si), a gene encoding the enzyme, a recombinant plasmid, a transformant transformed with the plasmid and its use, and a sugar chain using the enzyme.
  • Endo-Si endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase
  • the present invention relates to a method for producing a remodeling antibody or the like.
  • the antibody is a glycoprotein molecule having an N-linked sugar chain (N297-linked sugar chain) bound to the 297th Asn side chain located in the Fc region of the heavy chain molecule.
  • Antibodies are important molecules in basic research and medical fields, and research and development as antibody drugs are being actively promoted, and various effects of sugar chains are being clarified (Non-Patent Document 1).
  • medical antibodies mainly used are IgG class molecules, and such antibodies are generally produced using cultured animal cells typified by CHO cells and NS0 cells, and these animal cells are produced.
  • the N297-binding sugar chain of the antibody produced in the above is a biological complex type sugar chain, but non-uniform ones are obtained in core fucose, terminal sial group, galactosyl group, and visting GlcNAc (Non-Patent Document 2). It has been clarified that the N297-binding sugar chain of an antibody has a great influence on the effector activity including ADCC activity (Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity) and CDC activity (Complement-Dependent Cytotoxicity) of the antibody (Non-Patent Document 3). , Non-Patent Document 4), it has been pointed out that it may also affect the blood half-life of the antibody (Non-Patent Document 5).
  • ADCC activity Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity
  • CDC activity Complement-Dependent Cytotoxicity
  • Non-Patent Document 6 an antibody in which the non-reducing end of an N297-bound sugar chain is 2,6-sialyl-ized is the main medicinal component in IVIG (intravenous immunoglobulin) (Non-Patent Document 6). Further, in medical molecules containing IgG and Fc fragments, it is considered that the heterogeneity of the N297-linked sugar chain has a great influence on the properties and quality as an active ingredient, and a trace amount of the heterogeneous sugar chain modifying molecule is considered. It cannot be denied that the contamination may significantly change the characteristics of the final product.
  • Non-Patent Documents 7 to 9 a sugar chain transfer reaction using an enzyme is known (Non-Patent Documents 7 to 9). This is a multi-step process consisting of cleavage of a sugar chain (hydrolysis reaction) and condensation of another sugar chain (sugar chain transfer reaction) in an in vitro environment. Particularly for the purpose of conversion of N-type sugar chains, a group of enzyme families called endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase (ENGase) is used.
  • ENGase endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase
  • This enzyme is required to be 1) the ability to hydrolyze complex sugar chains as substrate specificity, and 2) the ability to carry out sugar chain transfer reactions to specific structures.
  • a method of transferring a sugar chain whose reducing end is oxazolined to a GlcNAc (N-acetylglucosamine) acceptor using a single ENGase (Non-Patent Documents 7 to 8) and two types of ENGase are used.
  • a one-pot method for directly transferring a sugar chain to a GlcNAc acceptor is known (Non-Patent Document 9, Patent Document 1).
  • ENGase is isolated from various species, and wild type and its mutant enzyme are used properly according to the type of sugar chain as a substrate.
  • Endo-A (enzyme derived from Arteria bacterium) (Non-Patent Document 10)
  • Endo-D enzyme derived from Streptococcus pneumoniae
  • Non-Patent Document 11 Endo-M (Enzyme derived from Mucor hyemalis) (Non-patent document 12).
  • Endo-H (Non-Patent Document 13), Endo-F2 (Flavobacteriaum meningocepticum-derived enzyme), Endo-F3 (Flavobacteriaum meningocepticum-derived enzyme) (Non-patent Document 14), Endo-E (Non-Bacteria-derived Enzyme) 15), Endo-S (Streptococcus pygenes-derived enzyme) (Non-Patent Document 16), Endo-Tsp1006 (derived from Tannerella bacterium), Endo-Tsp1263 (derived from Tannerella bacterium), Endo-Bno1263 (Bacteroides) -Tsp1457 (derived from Tannerella bacterium), Endo-Bac1008 (derived from Muribaculum bacterium), Endo-Tsp1603 (derived from Tannerella bacterium), Endo-Tsp1263 (derived from Tannerella bacterium) (Patent Document 2), derived from S
  • Endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase (ORF3750) derived from Sphingobacterium spp., Endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase derived from Cordyceps filamentous fungus, Endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase derived from Beauveria filamentous fungus.
  • Non-Patent Document 17 Endo-CC1 (Enzyme derived from Corpriapsis bacterium), Endo-CC2 (Enzyme derived from Corpriapsis cinerea) (Non-Patent Document 18), Endo-Om (Enzyme derived from Ogatea minor) (Non-Patent Document 19), Endo.
  • Non-Patent Document 20 (Caenobacteria elegans-derived enzyme) (Non-Patent Document 20), Endo -BH (Enzyme derived from Bacillus hallodurans C-125) (Non-Patent Document 21), EndoSd (Enzyme derived from Streptococcus dysgalactiae), EndoS2d (Enzyme derived from Streptococcus dysgalactiae) (Non-Patent Document) Equi-derived enzyme) (Non-Patent Document 23), Endo-Rp (Rhizomucor pseudolus-derived enzyme) (Patent Document 3), EndoS2 or EndoS49 (Non-Patent Document 24) and the like are known.
  • Non-Patent Document 23 Endo-Rp (Rhizomucor pseudolus-derived enzyme)
  • EndoS2 or EndoS49 (Non-Patent Document 24) and the like are known.
  • EndoS Non-Patent Document 25
  • EndoS2 Non-Patent Document 25
  • Non-Patent Document 26 Non-Patent Document 26
  • Endo-F3 Non-Patent Document 27
  • EndoS it is known that its mutant enzyme, EndoS D233Q, suppresses the hydrolysis activity to some extent. It is known that this mutant enzyme selectively proceeds the sugar chain transfer reaction under the condition that a large amount of intermediates in which the reducing end of the sugar chain is oxazolined is present in the reaction system (Patent Document 4, Non-Patent Document 4). Patent Document 8).
  • EndoS2 mutant enzyme (D184Q) is known to exhibit increased sugar chain transfer activity and decreased hydrolysis activity as compared with the wild-type EndoS2 enzyme (Patent Documents 6 to 8, Non-Patent Document 28).
  • the Endo-F3 mutant enzyme (D165A or D165Q) has a reduced hydrolyzing activity on the product and an increased sugar chain transfer activity of glycoxazoline as compared with the wild-type Endo-F3 enzyme.
  • the Endo-F3 mutant enzyme can use bi-branched and tri-branched sugar chain oxazolines as a substrate for a sugar chain transfer reaction (Non-Patent Document 27).
  • the ENGase used in the one-pot method for directly transferring a sugar chain to a GlcNAc acceptor includes two types of enzymes, EndoS / EndoS mutant enzyme and Endo-M / Endo-M mutant enzyme or Endo-CC / Endo-CC mutant enzyme. Combinations are known (Patent Document 1, Non-Patent Document 9).
  • Non-Patent Document 29 Streptococcus iniae
  • Non-Patent Document 30 M-back inie (Matsuken Yakuhin Kogyo Co., Ltd.) is sold as an inactivated vaccine for flatfish ⁇ -hemolytic streptococcus.
  • Strains of the genus Streptococcus, which are pathogenic bacteria that have a serious impact on humans and agriculture, forestry and fisheries, are actively classified by genome analysis (Non-Patent Document 31). Although the existence of the ENGase sequence was known for iniae, the enzyme activity was never investigated (Non-Patent Document 24).
  • An object of the present invention is to provide a novel endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase having a hydrolytic activity and / or a sugar chain transfer activity of a glycoprotein for an N297-binding sugar chain.
  • Endo-Si endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase
  • the present invention provides the following inventions.
  • the polypeptide of [1], wherein the mutation has a mutation at 1 to 3 amino acid sites selected from the group consisting of amino acids D241, T190, Q311 and E360.
  • [3] The polypeptide of [1] or [2] having one or more mutations selected from the group consisting of the following (A) to (D);
  • polypeptide according to any one of [1] to [4], which comprises the amino acid sequences described in the following (A) to (C);
  • A An amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11.
  • B An amino acid sequence having at least 90% homology or identity with respect to an amino acid sequence other than the 241st, 190th, 311th, or 360th amino acids in each sequence of (A), or an amino acid sequence.
  • the polypeptide of [6], wherein the N-linked sugar chain is an N-linked sugar chain in a glycoprotein.
  • the polypeptide of [6] or [7], wherein the glycoprotein is an antibody or a molecule containing an Fc region of an antibody (Fc region-containing molecule).
  • N297-linked sugar chain N297-linked sugar chain
  • the polypeptide of [9] which is a complex type sugar chain in which the non-reducing end of the N297-bound sugar chain may be chemically modified.
  • an antibody having a core GlcNAc to which fucose may be added as an N297-binding sugar chain or an acceptor molecule which is an Fc region-containing molecule thereof.
  • a method for producing an antibody or an Fc region-containing molecule thereof which comprises reacting with a sugar chain donor molecule containing activated GlcNAc at the reducing end.
  • the sugar chain donor molecule may have non-reducing ends chemically modified SG (10) -Ox, MSG1 (9) -Ox, MSG2 (9) -Ox or MSG1 (9) -Ox and MSG2 ( 9)
  • the sugar chain donor molecule is [N 3 -PEG (3)] 2 -SG (10) -Ox, [N 3 -PEG (3)] -MSG1 (9) -Ox, [N 3 -PEG ( 3)]-MSG2-Ox, or a mixture of [N 3 -PEG (3)]-MSG1 (9) -Ox and [N 3 -PEG (3)]-MSG2 (9) -Ox.
  • the production method according to any one of [17] to [20].
  • the method for producing [21] which comprises a step of reacting an azido group (N 3- ) with a molecule having an alkyne structure.
  • Mole having an alkin structure is a chemotherapeutic agent, a molecular target agent, an immunostimulator, a toxin, an antibacterial agent, an antiviral agent, a diagnostic agent, a protein, a peptide, an amino acid, a nucleic acid, an antigen, a lipid, a liposome,
  • the production method of [22] which is selected from vitamins and hormones.
  • the method for producing [23], wherein the chemotherapeutic agent is selected from camptothecin, pyrolobenzodiazepine, doxorubicin, auristatin, taxane or a derivative thereof.
  • Immune activators include STING agonists, TLR agonists, A2AR antagonists, IDO inhibitors, CTLA-4, LAG-3 and PD-1 pathway antagonists, checkpoint inhibitors, vascular endothelial growth factor (VEGF) acceptance.
  • the sugar chain donor molecule is ([N 3 -PEG (3)] 2 -SG-) Asn-PEG (3) -N 3 , ([N 3 -PEG (3)]-MSG1-) Asn- PEG (3) -N 3 , ([N 3 -PEG (3)]-MSG2-) Asn-PEG (3) -N 3 , or ([N 3 -PEG (3)]-MSG1-) Asn-PEG (3)
  • the production method according to any one of [28] to [31], which is a mixture of -N 3 and ([N 3 -PEG (3)]-MSG2-) Asn-PEG (3) -N 3 .
  • chemotherapeutic agent is selected from camptothecin, pyrolobenzodiazepine, doxorubicin, auristatin, taxane or a derivative thereof.
  • Immune activators include STING agonists, TLR agonists, A2AR antagonists, IDO inhibitors, CTLA-4, LAG-3 and PD-1 pathway antagonists, checkpoint inhibitors, vascular endothelial growth factor (VEGF) acceptance.
  • the method for producing [34] which is selected from a body inhibitor, a smoothen inhibitor, an alkylating agent, an antimetabolite, a retinoid, an anticancer vaccine, and an adjuvant.
  • Mutants with reduced hydrolytic activity are Endo-Rp N172Q, Endo-Rp N172H, Endo-Rp N172A, Endo-Rp N172C, Endo-Rp N172D, Endo-Rp N172E, Endo -Rp N172I, Endo-Rp N172L, Endo-Rp N172M, Endo-Rp N172P, Endo-Rp N172S, Endo-Rp N172T, Endo-Rp N172V, Endo-RpN172V, Endo-RpN172V, Endo-RpN172V Rp W278F / D276N, Endo-Rp W278F / A310D, Endo-Rp W278F / N172D / F307Y, Endo-Rp W278F / N172D / F307H, Endo-Rp W278F / N172D / N172D / A310 The production
  • the Endo-Si enzyme of the present invention has good hydrolysis activity and acts on N-linked sugar chains containing N297 bonds of glycoproteins to act on ⁇ 1,4 between GlcNAc having a core chitobiose structure present in the sugar chains. -Glycoside bonds can be efficiently cleaved.
  • the released sugar chain can be used as a sample for analyzing the sugar chain structure of glycoprotein and as a raw material for a sugar chain derivative.
  • the glycoprotein obtained by hydrolyzing the sugar chain can be used as an acceptor molecule for sugar chain remodeling.
  • the Endo-Si mutant enzyme in which a mutation is introduced into Endo-Si has a reduced hydrolysis activity and an enhanced sugar chain transfer activity as compared with the wild-type Endo-Si, sugar chain remodeling is performed. Therefore, an antibody having a uniform sugar chain or a sugar chain-containing molecule (including a molecule containing an Fc region) can be obtained efficiently or with high purity. Therefore, it is possible to reduce the molecular weight of the sugar chain donor used in the sugar chain remodeling, which leads to a reduction in the production cost of the sugar chain remodeled antibody or the sugar chain-containing molecule.
  • FIG. 1 It is a schematic diagram of a sugar chain transfer reaction using Endo-Si or Endo-Si mutant enzyme with a sugar chain oxazoline as a donor. It is a figure which shows the sequence (Endo-Si base sequence) of SEQ ID NO: 1. It is a figure which shows the sequence (Endo-Si amino acid sequence) of SEQ ID NO: 2. It is a figure which shows the sequence of SEQ ID NO: 3 (Endo-Si amino acid sequence D241Q). It is a figure which shows the sequence of SEQ ID NO: 4 (Endo-Si amino acid sequence D241Q / Q311L).
  • a mutation to an amino acid site means that an amino acid is substituted, deleted, inserted or added, and preferably, it means that an amino acid is substituted.
  • the mutation the one-letter notation of the wild-type amino acid (or nucleic acid), its number and the one-letter notation of the amino acid (or nucleic acid) after the mutation (for example, the mutation in which the 241st Asp is replaced with Gln is "D241Q”. ).
  • a specific mutant enzyme having a mutation is represented by a molecular name and a mutation (for example, a mutant enzyme in which the 241st Asp of Endo-Si is replaced with Gln is "Endo-Si D241Q") and has a plurality of mutations.
  • the mutations are separated by "/" (for example, in Endo-Si D241Q, the mutant enzyme having an additional mutation in which the 241st Gln is replaced with Leu is "Endo-Si D241Q / Q311L”). show.
  • the "N 297-linked sugar chain” means an N-linked sugar chain that binds to the side chain of Asn at position 297 of the IgG heavy chain.
  • the N297-linked sugar chain in IgG produced in animals or the like has a basic structure having the structure of the following formula (I) or (II), and the non-reducing terminal thereof may be further chemically modified.
  • galactose (Gal) or sialic acid (Sia) may be added.
  • N297-bound sugar chains of IgG produced by cells have a sugar chain structure in which sugar chains are further bound at the reducing end GlcNAc (core GlcNAc), non-reducing end, branched sugar, etc. in this basic structure.
  • core GlcNAc reducing end GlcNAc
  • fucose Fuc
  • ⁇ 1,6 (Fuc ⁇ 1,6) GlcNAc)
  • a tribranched sugar chain may be formed in which a sugar chain containing GlcNAc is further bound to the 5-position thereof.
  • a sugar chain containing galactose or sialic acid may be further bound.
  • the sialyl glycan (hereinafter referred to as "SG") has a basic structure consisting of the following structural formulas and sequence formulas.
  • a sugar chain contained in a sialyl glycopeptide (hereinafter referred to as “SGP”) contained in the yolk of a chicken egg can be exemplified.
  • SGP sialyl glycopeptide
  • MSG1 Those having sialic acid only in the 1-3 sugar chains are referred to as MSG1 (9), and those having sialic acid only in the 1-6 sugar chains of the branched chain are referred to as MSG2 (9) (Patent Document 1). , WO2019 / 065964).
  • the "sugar chain donor molecule” is a sugar chain-containing molecule having a GlcNAc in which the reducing end of the sugar chain is activated, preferably an oxazolined GlcNAc, and a molecule having various sugar chain structures can be used. Can be used. Activation refers to a state in which the reactivity of the sugar anomeric position is enhanced, and includes oxazoline formation or halogenation.
  • Examples of the sugar chain donor molecule include [N3-PEG ( 3 )]-MSG1 (9) -Ox (FIG. 1), SG (9) -Ox (oxazoline), and MSG1 (9) used in Example 6. -Ox, MSG2 (9) -Ox or a mixture of MSG1 (9) -Ox and MSG2 (9) -Ox can be mentioned.
  • a sugar chain-containing molecule having GlcNAc in which the reducing end of the sugar chain is not activated preferably SGP (FIG. 2), (SG-) Asn, (MSG1-) Asn. , (MSG2-) Asn or a mixture of (MSG1-) Asn, (MSG2-) Asn.
  • the partial structure when linked to a sugar chain in the side chain of an amino acid is expressed in parentheses, for example, "(SG-) Asn". It shall be.
  • the sugar chain donor molecule may be chemically modified, for example, SGP, (SG-) Asn, (MSG1-) Asn, (MSG2-) Asn, (MSG1-) Asn with chemically modified non-reducing ends. It contains a mixture of (MSG2-) Asn, SG (10) -Ox, MSG1 (9) -Ox, MSG2 (9) -Ox, or a mixture of MSG1 (9) -Ox and MSG2 (9) -Ox.
  • sugar chains are sugar chains that are known not to exhibit antigenicity in the human body, and N-linked sugar chains include high mannose type, hybrid type, and complex type. It has been known. These three have a common basic structure.
  • the high mannose type is a sugar chain having a mannose-rich structure in which a plurality of mannoses are continuous on two branched chains (1-3 chains and 1-6 chains) branched from mannose ( ⁇ -mannose) located near the reducing end. Is.
  • the mixed molding has a structure in which one of the two branched chains (1-3 chain and 1-6 chain) branched from the mannose ( ⁇ -mannose) located near the reducing end has GlcNAc. ..
  • the complex type has a structure in which GlcNAc is contained in two branched chains (1-3 chain and 1-6 chain) branched from mannose ( ⁇ -mannose) located near the reducing end, and the presence or absence of galactose and sial It has a variety of structures including the presence or absence of these, and their binding isomers and positional isomers.
  • the complex type sugar chain is known to be a two-branched type, a three-branched type, or a four-branched type.
  • the "acceptor molecule” is a molecule containing a sugar structure having GlcNAc at the non-reducing end, and is a sugar chain donor molecule in the presence of Endo-Si or a mutant enzyme thereof.
  • the oxazoline ring or the active intermediate of the sugar chain donor molecule reacts with the 4-position of GlcNAc at the non-reducing end, and a chitobiose structure can be formed.
  • a typical acceptor molecule is an IgG or Fc fragment thereof derived from a monoclonal antibody and having an N297-bound sugar chain consisting only of core GlcNAc to which core Fuc may be bound.
  • the core Fuc may or may not be bound to the core GlcNAc depending on the antibody from which it is derived or the method for producing the core GlcNAc.
  • the origin of the acceptor molecule is various monoclonal antibodies or sugar chain-containing molecules or Fc region-containing molecules (Fc, CH consisting only of the constant region in which the variable region is deleted from the heavy chain, and CL consisting only of the constant region of the light chain.
  • Combined CLCH, etc. can be utilized, but preferably (Fuc ⁇ 1,6) -GlcNAc-IgG (eg, (Fuc ⁇ 1,6) GlcNAc-mAb1 in FIG. 4), (Fuc ⁇ 1,6) -GlcNAc-Fc, (Fuc ⁇ 1,6) -GlcNAc-CLCH and the like can be mentioned (Patent Document 1).
  • Endo-Si is a kind of endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase (ENGase) derived from Streptococcus iniae, and has a base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
  • amino acids 1 to 33 indicate a signal sequence.
  • SignalP-5.0 which is a tool provided by CBS, was used to predict the signal sequence).
  • 241st amino acid is an enzyme (EC 3.2.1.96, GH18) consisting of an amino acid sequence in which Asp is used.
  • Endo-Si specifically recognizes an N-linked sugar chain (for example, N297-linked sugar chain), and has both hydrolysis activity and sugar chain transfer activity.
  • the hydrolyzing activity of Endo-Si is an activity of specifically hydrolyzing ⁇ 1,4 glycoside bonds contained in the core chitobiose of an N-linked sugar chain having the above-mentioned basic structure (unless otherwise specified in the present specification, " "Hydrolyzing activity” means this activity.
  • a schematic reaction diagram is shown in FIG. 4).
  • the sugar chain transfer activity of Endo-Si is such that the sugar chain donor molecule (reducing end) is added to an acceptor molecule containing an Fc site having only core GlcNAc (with or without core fucose added) to N297.
  • the activity of glycosidic-binding the reducing end of GlcNAc activated by GlcNAc or a sugar chain-containing molecule having GlcNAc whose reducing end is not activated (hereinafter referred to as "sugar chain transfer activity" is referred to as FIG. 5 or FIG. 5 or It is shown in FIG. 17).
  • the substrate specificity of Endo-Si for various antibodies is as follows. It exhibits glycan hydrolyzing activity for all four subclasses of IgG, but does not exhibit glycan hydrolyzing activity for IgA and IgE.
  • the substrate specificity for various N-linked sugar chains is as follows. Although it exhibits hydrolysis activity for both hymannose-type sugar chains and complex-type bifurcated sugar chains, it has higher specificity for complex-type bifurcated sugar chains than hymannose-type sugar chains, and in particular, water for G0 sugar chains. Highest degrading activity. Furthermore, it also exhibits hydrolysis activity for sialyl sugar chains and fucosylated sugar chains, but does not show hydrolysis activity for complex tri-branched sugar chains.
  • the G0 sugar chain is a GlcNAc in which the non-reducing end is bound to two branched chains (1-3 chain and 1-6 chain), and refers to a bibranched complex type sugar chain having no galactose residue.
  • the enzyme of the present invention is not limited to the enzyme having the specific sequence obtained in the examples as long as it has the above-mentioned characteristics, and even if it is an enzyme isolated from nature, the present invention is used. It may be an enzyme artificially prepared or modified based on the sequence information of the enzyme.
  • the organism species used as the isolation source is not particularly limited, but is preferably a bacterium, more preferably a bacterium belonging to the genus Streptococcus, and further preferably a bacterium belonging to the genus Streptococcus.
  • Endo-Si and the Carbohydrate-binding model are sequenced with EndoS (B. Trastoy et al., PNAS (2014) vol111, No.18, pp6714-6719) for which crystal structure analysis has been performed. From the comparison, it is inferred that they are the regions of amino acid numbers 106 to 447 and amino acid numbers 762 to 897 of SEQ ID NO: 2, respectively, and these two sites are important for the interaction between the hydrolysis activity and / or the transfer activity and the antibody. Is considered to be.
  • the enzyme of the present invention contains the amino acid sequences set forth in amino acid numbers 106 to 447 and / or amino acid numbers 762 to 897 of SEQ ID NO: 2, preferably the amino acid sequence set forth in amino acid numbers 106 to 897 of SEQ ID NO: 2. , More preferably comprising the amino acid sequence set forth in amino acid numbers 106-928 of SEQ ID NO: 2, more preferably comprising the amino acid sequence set forth in amino acid numbers 34-928 of SEQ ID NO: 2, and hydrolytic activity and /.
  • a polypeptide showing sugar chain transfer activity can be mentioned.
  • the present invention is selected from the group consisting of the 241st (D241), 190th (T190), 311th (Q311) and 360th (E360) amino acids in the amino acid sequences set forth in amino acid numbers 34 to 928 of SEQ ID NO: 2.
  • an Endo-Si mutated enzyme having an amino acid sequence containing an amino acid sequence containing a mutation to one or more amino acid sites, and exhibiting sugar chain hydrolyzing activity and / or sugar chain transfer activity.
  • the amino acid sequence set forth in amino acid numbers 34 to 928 of SEQ ID NO: 2 contains a region required for sugar chain transfer activity, and the activity of IgG on N297-bound sugar chains.
  • Endo-Si WT a wild strain having no amino acid sequence mutation introduced
  • WT a wild strain having no amino acid sequence mutation introduced
  • the amino acid substitution / mutation of the present invention is a substitution / mutation exhibiting the above-mentioned characteristics, and is preferably a substitution / mutation of at least one or more amino acid sites selected from T190, D241, Q311 and E360 of SEQ ID NO: 2. It is a mutation, more preferably D241Q, D241M, D241A, T190Q, Q311L, E360Q, E360A, E360N, or E360D, still more preferably D241Q, D241M, T190Q, Q311L, E360Q, and most preferably D241Q.
  • Endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase has both hydrolysis activity and sugar chain transfer activity (hereinafter, having both activities together is referred to as having "this enzyme activity"). Therefore, the enzyme that retains strong hydrolysis activity also uses the sugar chain transferred to the core GlcNAc of the acceptor molecule (an antibody having core GlcNAc as an N297-binding sugar chain or a molecule containing the Fc region thereof) by sugar chain transfer activity as a substrate. It may be hydrolyzed and the desired sugar chain transfer product may not be properly obtained. Therefore, in the synthesis of sugar chain remodeling antibodies and the like or sugar chain modifying compounds, mutant enzymes having improved sugar chain transfer activity are useful.
  • the mutant enzyme of the present invention is characterized by having both reduced hydrolysis activity and enhanced sugar chain transfer activity as compared with Endo-Si WT.
  • the sugar chain transfer activity of the mutant enzyme can be evaluated by the method of Example 6 or Example 7 described later.
  • the sugar chain transfer activity exceeds the sugar chain transfer activity of Endo-Si WT. That is, the pH is 7 to 8 (for example, pH 7.5), and the sugar chain donor (for example, the sugar chain containing GlcNac whose reduction end is activated (such as oxazolinated GlcNAc)) is 5 to 10 equal amounts (for example) of the acceptor molecule.
  • the sugar chain transfer rate under the existing condition (8 equal amounts) shows a sugar chain transfer rate higher than Endo-Si WT after any time point from 1 to 24 hours or 48 hours after the start of the reaction.
  • the sugar chain transfer rate exceeds 50% by 24 hours or 48 hours after the start of the reaction, and more preferably, the sugar chain transfer rate exceeds 60% by 24 hours after the start of the reaction. Even more preferably, the sugar chain transfer rate exceeds 80% by 24 hours after the start of the reaction, and even more preferably, the sugar chain transfer rate exceeds 95% by 24 hours after the start of the reaction.
  • Another aspect of the sugar chain transfer activity of the mutant enzyme of the present invention is a mode that exceeds the sugar chain transfer activity of Endo-Si WT. That is, the sugar chain transfer under the condition that the sugar chain donor containing GlcNac whose reducing end is not activated is present in 10 to 100 equal amounts (for example, 50 equal amounts) of the acceptor molecule at pH 7 to 8 (for example, pH 7.5).
  • the rate shows a sugar chain transfer rate equal to or higher than the sugar chain transfer rate of Endo-Si WT after any time point from 1 to 48 hours after the start of the reaction.
  • the sugar chain transfer rate exceeds 50% by 24 hours or 48 hours after the start of the reaction, and more preferably, the sugar chain transfer rate exceeds 60% by 48 hours after the start of the reaction. Even more preferably, the sugar chain transfer rate exceeds 80% by 48 hours after the start of the reaction, and even more preferably, the sugar chain transfer rate exceeds 90% by 48 hours after the start of the reaction.
  • the mutant enzyme of the present invention is one or more (preferably 1 to 3, more preferably 1 to 3) selected from the group consisting of D241, T190, Q311 and E360 in the amino acid sequence of amino acid numbers 34 to 928 of SEQ ID NO: 2. Does not need to be the full-length sequence as long as it has a mutation to one or two amino acid sites) and retains a region important for the sugar chain transfer activity of Endo-Si. From the domain analysis of EndoS, it is known that the catalytic domain (amino acid numbers 106 to 447 of SEQ ID NO: 2) and / or CBM (amino acid numbers 762 to 897 of SEQ ID NO: 2) are important and include them. As long as it can be used as the mutant enzyme of the present invention.
  • the mutant enzyme of the present invention is a polypeptide containing the mutation described in the above-mentioned "Amino acid substitution / mutation of the present invention", and specifically, SEQ ID NO: 3 (Endo-Si D241Q) and SEQ ID NO: 4 (Endo-). Si D241Q / Q311L), SEQ ID NO: 5 (Endo-Si D241Q / E360Q), SEQ ID NO: 6 (Endo-Si D241M), SEQ ID NO: 7 (Endo-Si D241M / Q311L), SEQ ID NO: 8 (Endo-Si D241M / E360Q).
  • SEQ ID NO: 9 Endo-Si T190Q / D241Q
  • SEQ ID NO: 10 Endo-Si T190Q
  • SEQ ID NO: 11 Endo-Si T190Q / D241M
  • amino acid sequence of the mutant enzyme of the present invention one to several amino acids are substituted, deleted, inserted, and at sites other than essential mutations (D241, T190, Q311 or E360) as long as the activity of the enzyme is not affected. / Or may be added.
  • sites other than essential mutations D241, T190, Q311 or E360
  • all sites may be selected as long as it does not affect the activity of this enzyme, but amino acids other than the 241st, 190th, 311th, or 360th amino acids are more preferable.
  • the number is 30 or 20 or less, preferably 10 or less, more preferably 5 or less, and most preferably 4, 3, 2, or 1. be.
  • the amino acid after substitution by mutation is not particularly limited as long as the finally obtained mutant enzyme has the activity of this enzyme, and naturally occurring amino acids, artificially synthesized amino acids, and the like.
  • Various amino acids such as modified amino acids can be adopted, but they are preferably naturally occurring amino acids, more preferably naturally occurring L-amino acids, and even more preferably essential amino acids.
  • amino acid sequence of the mutant enzyme of the present invention at least 80% or more, preferably 85% or more, with respect to the amino acid sequence other than the amino acid of the essential mutation (D241, T190, Q311 or E360), as long as it does not affect the activity of the present enzyme.
  • amino acid sequences having 90% or more, more preferably 95%, 96%, 97%, 98% or 99% or more homology or identity.
  • the identity or homology between two types of amino acid sequences is Blast algorithm version 2.2.2 Blast algorithm version 2.2.2 (Altschul, SF, et al). It can be determined by using the default parameters of Nucleic Acids Res. 1997, 25, 3389-3402). Blast algorithm can be used, for example, on the Internet at http: // blast. ncbi. nlm. nih. It can also be used by accessing gov /.
  • the present invention further comprises a recombinant gene encoding the above Endo-Si (SEQ ID NO: 1) or Endo-Si mutant enzyme, a gene construct such as a plasmid or expression vector containing the recombinant gene, and a host transformed with the gene construct.
  • a method for producing an enzyme of the present invention which comprises a step of recovering the Endo-Si or Endo-Si transformant of the present invention from a cell or a culture of the host cell.
  • These recombinant genes, gene constructs, host cells and the like can be produced according to known genetic engineering techniques based on the amino acid sequences of the mutant enzymes of the present invention.
  • the base sequence of Endo-Si for E. coli is shown in SEQ ID NO: 16.
  • the host cells transformed by the introduction of the gene encoding the enzyme of the present invention depend on the cell type. It is cultivated under appropriate conditions, and the enzyme of the present invention can be recovered from the culture.
  • the enzyme is recovered by appropriately combining ordinary purification methods by utilizing the physical properties of the enzyme, but in order to recover the enzyme easily, a tag peptide such as a His tag or a GST tag is linked to the enzyme in advance. By designing the gene construct so that it can be expressed, recovery using the affinity of the tag peptide can be performed.
  • the tag peptide may be removed after purification, but if the enzyme activity is not affected, the enzyme with the tag peptide linked may be used for a reaction such as sugar chain remodeling.
  • the enzyme of the present invention includes an enzyme having an amino acid sequence in which such a tag peptide is linked.
  • the present invention is based on a method for remodeling a sugar chain of a glycoprotein using the Endo-Si or Endo-Si mutant enzyme of the present invention, and a substantially uniform structure produced by the sugar chain remodeling.
  • a glycoprotein having a sugar chain Provides a glycoprotein having a sugar chain.
  • the present invention provides a method for producing a glycoprotein having a sugar chain having a substantially uniform structure by the sugar chain remodeling.
  • One embodiment of the present invention is a method for sugar chain remodeling of an N-linked sugar chain containing N297 binding in an antibody or an Fc region-containing molecule thereof using the Endo-Si or Endo-Si mutant enzyme of the present invention.
  • a sugar protein having an N-linked glycosylation containing an N297 bond having a substantially uniform structure produced by the sugar chain remodeling preferably an antibody or an Fc region-containing molecule.
  • the present invention provides a method for producing a sugar protein having an N-linked sugar chain containing an N297 bond having a substantially uniform structure, preferably an antibody or an Fc region-containing molecule, by the sugar chain remodeling.
  • the antibody is preferably IgG.
  • IgG will be described.
  • the glycoprotein is at least one O-linked sugar chain or N-linked sugar chain in the amino acid sequence of the protein present in the tissues of animals and plants, the cell membrane and cell wall of eukaryotic microorganisms, and the like.
  • the protein is bound as described above, and may be naturally derived or synthesized.
  • CLCH Patent Document 1, WO2018 / 003983
  • Glycan remodeling means that the core GlcNAc (core fucose) is an N297-binding sugar chain of a specific glycoprotein, for example, an IgG or IgG Fc fragment of a monoclonal antibody or an Fc region-containing molecule such as CLCH consisting of a constant region only.
  • the acceptor molecule was excised, leaving the acceptor molecule (which may be added), and then the sugar chain was transferred to the core GlcNAc of the acceptor molecule by utilizing the sugar chain transfer activity of the Endo-Si mutant enzyme of the present invention.
  • transferring a sugar chain derived from a chain donor it means a method for producing IgG or an Fc region-containing molecule thereof having a uniform sugar chain structure in which an N297-linked sugar chain is derived from a sugar chain donor.
  • the IgG or Fc region-containing molecule used for sugar chain remodeling may be preferably derived from an IgG heavy chain having the same amino acid sequence and produced in a form having an N297-bound sugar chain.
  • the production method is not limited, and IgG, IgG CLCH produced by a generally known method for producing a monoclonal antibody, or an Fc fragment obtained by enzymatically treating the IgG can be used. ..
  • IgG or Fc fragments may adopt a mixture of samples obtained by different production methods or different lots.
  • the above-mentioned IgG or Fc region-containing molecule is specifically subjected to 1,4-glycosidic bond (GlcNAc ⁇ 1-4GlcNAc) between GlcNAc in the core chitobiose structure of the N297-bound sugar chain. It can be prepared by treatment with an ENGase that retains its hydrolyzing activity.
  • various ENGases such as Endo-Si WT, Endo-A, Endo-D, Endo-E, Endo-F3, Endo-H, EndoS, and EndoS2 can be adopted.
  • sugar chain donor molecule used for sugar chain remodeling those having various sugar chain structures can be adopted, but when the purpose is to use the remodeled antibody as an antibody drug, a sugar possessed by humans. It is preferable to employ a sugar chain donor having a human-type sugar chain or a human-compatible sugar chain structure similar to or the same as the chain structure.
  • a molecule in which the core GlcNAc is removed and the second GlcNAc from the reducing end is activated can be mentioned. ..
  • SG (10) -Ox ([N 3 -PEG (3)] 2 -SG (10))-Ox, [N 3 -PEG (3)]-MSG1 (9) -Ox, [N 3- PEG (3)]-MSG2 (9) -Ox, or a mixture of [N3-PEG (3)]-MSG1 (9) -Ox and [N 3 -PEG ( 3 )]-MSG2 (9) -Ox (WO2019 / 065964).
  • a molecule in which GlcNAc second from the reducing end is not activated can be mentioned.
  • endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase enzyme A
  • Endo-Si or Endo-Si mutant enzyme of the present invention which use the complex type sugar chain of the sugar chain donor molecule as a substrate but not the N297-bound sugar chain as a substrate.
  • the sugar chain of the donor molecule is bound to the core GlcNAc residue of the IgG or Fc region-containing molecule in which the sugar chain which is the acceptor molecule is cleaved.
  • the enzyme A used here has a sugar chain transfer activity from SGP, which is a sugar chain donor, to an acceptor having GlcNAc
  • the enzyme A exhibits high sugar chain transfer efficiency in the one-pot method. That is, the enzyme A is GlcNAc from among endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidases that use a complex sugar chain of a sugar chain donor molecule whose reducing end is not activated as a substrate but do not use an N297-bound sugar chain as a substrate. It can be selected by using the sugar chain transfer activity to the acceptor having the above as an index.
  • endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidases that do not use N297-linked sugar chains as a substrate include Endo-M, Endo-Rp, Endo-Om, Endo-CC, and mutant enzymes having reduced hydrolytic activity thereof. .. Known mutant enzymes having reduced hydrolysis activity include Endo-Rp N172Q, Endo-Rp N172H (Patent Document 3), Endo-M N175Q (Umekawa M. et al., J Biol Chem. 2010, 285, 511). -521), Endo-CC N180H or Endo-Om N194Q (Chiba Y. Kagaku to Seibutusu 2015, 53, 236-244) and the like.
  • Endo-Rp N172Q Endo-Rp N172H, Endo-Rp N172A, Endo-Rp N172C, Endo-Rp N172D, Endo-Rp N172E, Endo-Rp N172E, Endo-Rp N172L, End examples thereof include Rp N172M, Endo-Rp N172P, Endo-Rp N172S, Endo-Rp N172T, and Endo-Rp N172V.
  • mutant enzymes in which two amino acids are substituted include Endo-Rp W278F / S216V, Endo-Rp W278F / N246D, Endo-Rp W278F / D276N, and Endo-Rp W278F / A310D. Further, as mutant enzymes in which three amino acids are substituted, Endo-Rp W278F / N172D / F307Y, Endo-Rp W278F / N172D / F307H, Endo-Rp W278F / N172D / A310D, Endo-Rp W214F / F307Y are listed. Will be.
  • amino acid sequence of the mutant enzyme of Endo-Rp is designated by SEQ ID NO: 17 to 43
  • amino acid sequence of Endo-M is designated by SEQ ID NO: 44
  • amino acid sequence of Endo-Om is designated by SEQ ID NO: 45
  • amino acid sequence of Endo-CC is designated by SEQ ID NO: Shown in 46.
  • Examples of the combination of the Endo-Si mutant enzyme of the present invention and the enzyme A include the combinations of Tables 1 and 2.
  • the combination of the Endo-Si mutant enzyme of the present invention and the enzyme A is preferably the combination shown in Table 3. ..
  • Endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase using the complex sugar chain of the polypeptide exhibiting sugar chain transfer activity of the present invention and the sugar chain donor molecule whose reducing end is not activated as a substrate, but not using the N297-bound sugar chain as a substrate.
  • an antibody having a core GlcNAc to which fucose may be added as an N297-binding sugar chain or an acceptor molecule which is a molecule containing the Fc region thereof is used as a sugar chain whose reducing end is not activated. It may be reacted with the containing sugar chain donor molecule (Fig. 17).
  • the reaction conditions for the hydrolysis reaction for the preparation of acceptor molecules in sugar chain remodeling can be appropriately selected according to the conditions known for other enzymes, and the enzyme activity, antibody properties, and recovery rate in the purification step can be appropriately selected. , Working time, etc. can be taken into consideration when selecting.
  • the reaction is carried out in buffer, but citrate buffer (pH 3.5-5.5), acetate buffer (pH 4.5-6.0), phosphate buffer (pH 6.0-7.5), It is possible to appropriately select from buffers used in normal enzymatic reactions such as MOPS-NaOH buffer (pH 6.5 to 8.0) and Tris-HCl buffer (pH 7.0 to 9.0). be.
  • a phosphate buffer pH 6.0 to 7.5
  • Tris-hydrochloric acid buffer pH 7.0 to 9.0
  • An additive that does not inhibit the enzyme reaction may or may not be added to the reaction solution for the purpose of stabilizing the enzyme.
  • the reaction temperature can be appropriately selected from 4 ° C. to 50 ° C., but is preferably 15 ° C. to 45 ° C., more preferably 18 ° C. to 40 ° C., and more preferably 20 ° C. to 35 ° C. ..
  • the reaction pH of the hydrolysis reaction of Endo-Si can be appropriately selected from pH 5.8 to 9.5, but is preferably pH 6.2 to pH 8.0, more preferably pH 6.5 to pH 7. It is 5.
  • the reaction time can be appropriately selected from 10 minutes to 96 hours, but is preferably 0.5 to 80 hours, more preferably 1 to 60 hours, and more preferably 8 to 48 hours. It is preferably 12 to 24 hours, and a small amount of the reaction solution may be collected over time to determine the end of the reaction while checking the progress of hydrolysis.
  • the progress of the sugar chain hydrolysis reaction can be monitored by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), a fully automated electrophoresis system, liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS), or the like. ..
  • the reaction conditions for the sugar chain transfer reaction using GlcNAc whose reducing end is activated as a sugar chain donor are other enzymes. It can be appropriately selected according to the conditions known in (Patent Document 1, WO2019 / 066964, etc.).
  • the reaction is carried out in a buffer solution, but it is desirable that GlcNAc whose reducing end is activated or not activated does not promote the decomposition of the sugar chain donor, and a phosphate buffer solution (pH 6.0 to 7.5) is desirable. ), MOPS-NaOH buffer (pH 6.5 to 8.0), Tris-hydrochloric acid buffer (pH 7.0 to 9.0) and the like can be appropriately selected. Preferred is Tris-hydrochloric acid buffer (pH 7.0-9.0).
  • an additive that does not inhibit the enzyme reaction may or may not be added to the reaction solution.
  • the reaction temperature can be appropriately selected from 4 ° C. to 50 ° C., but is 15 ° C. to 45 ° C., more preferably 20 ° C. to 40 ° C., and more preferably 25 ° C. to 40 ° C.
  • the reaction pH of the hydrolysis reaction of Endo-Si can be appropriately selected from pH 5.8 to 9.5, but is preferably pH 6.2 to pH 8.0, more preferably pH 6.5 to pH 7. It is 5.
  • the reaction time can be appropriately selected from 10 minutes to 96 hours, but is preferably 0.5 hours to 80 hours, more preferably 2 hours to 70 hours, and more preferably 12 hours to 60 hours. It is preferably 16 to 48 hours, more preferably 16 to 28 hours, and a small amount of the reaction solution may be collected over time to determine the end of the reaction while confirming the progress of the sugar chain transfer reaction. ..
  • the progress of the sugar chain transfer reaction can be monitored by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), a fully automatic electrophoresis system, liquid chromatography mass analysis (LC-MS), or the like.
  • sugar chain remodeling was performed on both ENGase and the above-mentioned enzyme A, which retained the activity of specifically hydrolyzing 1,4-glycosidic bonds (GlcNAc ⁇ 1-4GlcNAc) between GlcNAc in the core chitobiose structure of N297-bound sugar chains. It can also be carried out by a one-pot method in which the sugar chain of the sugar chain donor molecule is directly transferred to an antibody having a core GlcNAc or an Fc region-containing molecule thereof to which fucose may be added as an N297-binding sugar chain which is an acceptor molecule. ..
  • the above-mentioned Endo-Si mutant enzyme is preferable as the ENGase having the activity of specifically hydrolyzing the 1,4-glycosidic bond (GlcNAc ⁇ 1-4GlcNAc) between GlcNAc in the core chitobiose structure of the N297-bound sugar chain, and the enzyme A is preferable.
  • a mutant enzyme of Endo-Rp having a reduced hydrolytic activity is preferable.
  • the sugar chain donor molecules include, for example, SGP, (SG-) Asn, (MSG1-) Asn, (MSG2-) Asn, (MSG1-) Asn and (MSG2-) whose non-reducing ends are chemically modified.
  • It contains a mixture of Asn, SG (10) -Ox, MSG1 (9) -Ox, MSG2 (9) -Ox or a mixture of MSG1 (9) -Ox and MSG2 (9) -Ox and the like.
  • Glycoproteins (antibodies or Fc region-containing molecules) produced by the sugar chain remodeling method can be further chemically or biochemically modified.
  • the azide group (N 3- ) forms a 1,2,3-triazole ring by reacting with an alkyne structure such as a (hetero) cycloalkynyl group (eg, DBCO (Dibenzocyclooctyne), etc.) (SPAAC (SPAAC). Strine-promoted alkyne azide chemistry: Agard NJ, et al., J Am Chem Soc. 2004, 126, 46, 15046-15847)).
  • the sugar chain remodeling antibody obtained by using the donor molecule having the above-mentioned azido group ( N3- ) is a molecule having a (hetero) cycloalkynyl group and having a desired activity (pharmaceutically active).
  • Compounds eg, chemotherapeutic agents, molecular targeting agents, immunostimulators (eg, STING antagonists (WO2020 / 050406, WO2014 / 099824, WO2014 / 179335, WO2014 / 189805, WO2014 / 189806, WO2015 / 074145, WO2015 / 185565).
  • camptothecin eg, WO2014 / 057687
  • pyrolobenzodiazepine eg, WO2013 / 1734496, WO2014 / 130879, WO2017 / 004330, WO2017 / 0042525.
  • WO2017 / 020972 WO2016 / 036804, WO2015 / 095124, WO2015 / 052322, WO2015 / 052534, WO2016 / 011519, WO2015 / 052321, WO2015 / 031693, WO2 011/130613, WO2019 / 069564), doxorubicin, auristatin, taxanes or derivatives thereof can be mentioned.
  • Examples of the donor molecule having the azido group (N 3- ) include the drug linkers described in WO2020 / 050406 and WO2019 / 069564.
  • the protein concentration described in the present specification was quantified using an ultra-trace spectrophotometer NanoDrop1000 (manufactured by Thermo Fisher Scientific) or NanoDrop2000 (manufactured by Thermo Fisher Scientific).
  • [N3-PEG (3)]-MSG1 (9) -Ox in the examples represent the compound of FIG.
  • SGP shows the compound of FIG. mAb1 indicates a commercially available Trastuzumab (purchased from Chugai Pharmaceutical).
  • (Fuc ⁇ 1,6) GlcNAc-mAb1 represents a sugar chain hydrolyzate of Trastuzumab.
  • mAb2 indicates an antibody produced by the method described in Example 136 of WO20190659664.
  • the amino acid sequences of the light and heavy chains of mAb2 are shown in SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13.
  • GlcNAc-mAb2 represents a sugar chain hydrolyzate (Fuc ⁇ 1,6) GlcNAc-anti-CLDN6 antibody (H1L1) prepared by the method described in Example 61-Step 1 of WO2019 / 065964.
  • Patent Document 4 The progress of sugar chain hydrolysis and sugar chain transfer reaction was confirmed by using a protein gel electrophoresis method (Patent Document 4, Non-Patent Document 8).
  • a protein gel electrophoresis method As a fully automatic protein electrophoresis system, LabChip GX II (manufactured by PerkinElmer) was used as an apparatus, and Protein Express LabChip and Protein Express Reagent Kit (manufactured by PerkinElmer) were used as reagents.
  • Example 1 S. Acquisition of endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase derived from iniae By the following method, S. The gene sequence of endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase was obtained from the iniae SIO1002 strain.
  • S. Genomic DNA was obtained from iniae SIO1002 strain formalin inactivated cells (Japanese strain, purchased from Kyoritsu Seiyaku Co., Ltd.). 1 mL of 0.1% (w / v) formalin solution was centrifuged (6,000 rpm, 10 min, 4 ° C), and the precipitate was washed with 1 mL of sterile water. The precipitate was centrifuged again under the same conditions, and the precipitate was suspended in 200 ⁇ L of InstaGene DNA purification matrix (manufactured by Bio-Rad). This suspension was heat-treated at 56 ° C. for 30 minutes and then at 99 ° C. for 8 minutes, centrifuged (12,000 rpm, 10 min, 4 ° C.), and the obtained supernatant was used as a DNA extract.
  • InstaGene DNA purification matrix manufactured by Bio-Rad
  • Primer 1 SEQ ID NO: 14
  • Primer 2 SEQ ID NO: 15
  • PrimeSTAR Max DNA Polymerase manufactured by Takara Bio Inc.
  • This gene encodes a protein with a molecular weight of 104,644 consisting of 2787 bases (SEQ ID NO: 1) including a stop codon and consisting of 928 amino acid residues (SEQ ID NO: 2), and this protein was named Endo-Si. ..
  • Example 2 Expression of Endo-Si using Escherichia coli Based on the endo- ⁇ -N-acetylglucosaminidase gene obtained in Example 1, it was optimized for heterologous expression of Escherichia coli with a 6 ⁇ His tag added to the C-terminal.
  • a nucleic acid sequence (SEQ ID NO: 16) was designed and an artificially synthesized gene was prepared by Eurofins Genomics. This was cloned into a pET24b (+) vector, and E.I. It was transformed into coli BL21 (DE3).
  • the collected cells were suspended in 5 mL of binding buffer (50 mM HEPES (pH 8.0), 0.5 M NaCl, 20 mM Imidazole, 5% (w / v) Glycerol), and ultrasonically disrupted and centrifuged.
  • the separated supernatant was purified with Ni Sepharose 6 Fast Flow (manufactured by GE Healthcare).
  • the yield (A 280 , equivalent to the extinction coefficient) was 8.43 mg / 100 mL bouillon.
  • Example 3 Hydrolytic activity of Endo-Si on antibody sugar chains
  • the hydrolysis activity of the enzyme obtained in Example 2 was measured by the following method. At this time, EndoS was used as a comparison target.
  • mAb1 60 mg was dissolved in 5 mL of sterile water and replaced with 50 mM Tris-hydrochloric acid buffer (pH 7.5) while concentrating with Vivaspin 20 (30,000 MWCO, PES, manufactured by Sartorius).
  • reaction solution (total volume 50 ⁇ L) containing 0.1 mg of this mAb1 and 10 ng of the enzyme was prepared and incubated at 37 ° C. Reactions were sampled for 0.5 hours, 1 hour, and 2 hours and analyzed by the fully automated protein electrophoresis system described above. From the obtained chromatogram, it is confirmed as a peak in which the unreacted product and the hydrolyzate are separated. The sugar chain hydrolysis rate was calculated from the peak area ratio of the unreacted product and the hydrolyzate by the following formula.
  • Sugar chain hydrolysis rate (%) [[(Fuc ⁇ 1,6) H chain peak area derived from GlcNAc-mAb1] / ⁇ [H chain peak area derived from mAb1] + [(Fuc ⁇ 1,6) derived from GlcNAc-mAb1] Peak area of H chain] ⁇ ] ⁇ 100
  • the change over time in the reaction yield is shown in FIG.
  • the sugar chain hydrolysis rate after 0.5 hours was 57.4% for Endo-Si and 41.8% for EndoS, and Endo-Si showed stronger hydrolysis activity than EndoS.
  • Endo-Si has an optimum temperature (the temperature at which the enzyme functions well) in the hydrolysis reaction in the range of 25 ° C to 45 ° C, better in the range of 30 ° C to 42 ° C, especially 35 ° C near 37 ° C. It was confirmed that the hydrolyzability was good at about 39 ° C., and the hydrolytic activity at each temperature was higher than that of EndoS.
  • Endo-Si has an optimum pH (pH at which the enzyme functions well) in the hydrolysis reaction in the range of pH 6.3 to 9.0, more preferably in the range of pH 6.7 to 8.8, particularly. Good hydrolyzability was shown at pH 7.2-8.0 near pH 7.5. It was confirmed that Endo-Si has higher activity under pH conditions of around pH 6.7 or higher than EndoS.
  • HPLC appliance 1200 Infinity LC (manufactured by Agilent Technologies) Column: ACQUITY UPLC Glycan Amide 130 ⁇ , 1.7 ⁇ m, 2.1 x 150 mm (manufactured by Waters) Column temperature: 40 ° C Detector: Fluorescence detector RF-20Axs (manufactured by Shimadzu Corporation) Mobile phase A: H2O + 0.1% HCOOH Mobile phase B: acetonitrile + 0.1% HCOOH Gradient (mobile phase B%): 90% (0 minutes), 40% (25 minutes) Flow velocity: 0.2 mL / min
  • the enzyme activity was calculated from the peak area ratio of the substrate and its hydrolyzate, GlcNAc-2AB.
  • Table 4 shows the relative activity for various sugar chains when the activity for G0 sugar chains is 100%. Endo-Si was active against both high mannose type sugar chains and complex type bifurcated sugar chains, but it was more specific to complex type bifurcated sugar chains than high mannose type sugar chains, especially G0. It had the highest activity against sugar chains. It was also active against sialyl sugar chains and fucosylated sugar chains, but not against complex tri-branched sugar chains. [Table 4] Hydrolysis activity of Endo-Si in various sugar chains
  • Example 6 Modification of Endo-Si and measurement of transfer activity (6-1) [N3-PEG (3)]-Preparation of MSG1 (9) -Ox Used as a sugar chain donor in subsequent examples [N] 3 -PEG (3)]-MSG1 (9) -Ox was produced by the method described in Example 56 of WO2019 / 065964.
  • the evaluation of the sugar chain transfer activity was performed as follows. (Fuc ⁇ 1,6) GlcNAc-mAb2 0.5 mg, sugar chain oxazoline compound [N3-PEG (3)]-MSG1 (9) -Ox 50.4 ⁇ g (8 eq.), Enzyme 1.25 ⁇ g 50 45 ⁇ L of mM Tris-hydrochloric acid buffer (pH 7.5) was prepared and incubated at 28 ° C. Reactions 1, 2, 4, 6, and 24 hours of reaction were sampled and analyzed on the protein fully automated electrophoresis system described above. From the obtained chromatogram, the unreacted product and the sugar chain transfer agent mAb2- (MSG1-N 3 ) 2 are confirmed as separated peaks. The sugar chain transfer rate was calculated from the peak area ratio of the unreacted product and the sugar chain transfer product by the following formula.
  • each Endo-Si mutant enzyme showed high sugar chain transfer activity.
  • Example 7 Measurement of glycan transfer activity using SGP as a glycan donor
  • the evaluation of the sugar chain transfer activity was performed as follows. (Fuc ⁇ 1,6) GlcNAc-mAb2 0.5 mg, SGP 0.485 mg (50 eq.), Endo-MN175Q (manufactured by Tokyo Chemical Industry) 2.5 mU, and various Endo-Si mutant enzymes 10 ⁇ g. 17 ⁇ L of 50 mM phosphate (sodium) buffer (pH 7.5) was prepared and incubated at 23 ° C. Reactions 2, 4, 6, 24, and 48 hours of reaction were sampled and analyzed on the protein fully automated electrophoresis system described above. From the obtained chromatogram, the unreacted product and the sugar chain transfer agent mAb2- (SG) 2 are confirmed as separated peaks. The sugar chain transfer rate was calculated from the peak area ratio of the unreacted product and the sugar chain transfer product by the following formula.
  • each Endo-Si mutant enzyme showed high sugar chain transfer activity.
  • Endo-Rp mutant enzymes having low activity to transfer SGP to GlcNAc derivatives for example, N172F, N172K, N172L, N172R, N172W, N172Y mutant enzymes in which no transfer activity was observed in Patent Document 3, are also transferred by the one-pot method. The result was low efficiency.
  • the enzyme A's own sugar chain transfer activity is correlated with the sugar chain raw material activation ability, and an appropriate enzyme A having a sugar chain raw material activation ability is obtained by using the transfer activity from SGP to a GlcNAc derivative as an index. It is thought that it can be identified.
  • Endo-M, Endo-Om, and Endo-CC are considered to have the same reactivity as Endo-Rp. Therefore, Endo-Rp is referred to as Endo-M, Endo-Om, and Endo-CC. It is possible to identify the enzyme A that is effective for the one-pot method by substituting. Furthermore, this method can also be applied to Endo-S and Endo-S2, which have a sugar chain transfer activity to an antibody as in Endo-Si.
  • Example 9 Examination of a one-pot method using a chemically modified sugar chain derivative as a donor As a sugar chain derivative donor other than SGP, which is a natural sugar chain, a derivative in which the non-reducing end side and the reducing end amino acid are azide-modified is used.
  • a sugar chain transfer reaction in the one-pot method (9-1) Preparation of ([N 3 -PEG (3)] -MSG1-) Asn-PEG (3) -N 3 Used as a sugar chain donor in the following examples ([N 3 -PEG (3) )]-MSG1-) Asn-PEG (3) -N 3 was produced by the method described in step 3 of Example 154 of WO2019066964.
  • sugar chain transfer rate (%) [[peak area of H chain derived from mAb2- (SG-N 3 ) 2 ] / ⁇ [(Fuc ⁇ 1,6) H chain peak area derived from GlcNAc-mAb2] + [mAb2-( SG-N 3 ) Peak area of H chain derived from 2 ] ⁇ ] ⁇ 100
  • Table 8 Changes in sugar chain transfer activity to antibodies of various sugar chain donors using the one-pot method over time
  • An antibody or sugar chain-containing molecule having a uniform sugar chain obtained by using the Endo-Si enzyme of the present invention can be obtained efficiently or with high purity, and the antibody or the like can be used as a medicine. can.
  • SEQ ID NO: 1 Endo-Si base sequence
  • SEQ ID NO: 2 Endo-Si amino acid sequence
  • SEQ ID NO: 3 Endo-Si amino acid sequence
  • D241Q SEQ ID NO: 4: Endo-Si amino acid sequence D241Q / Q311L
  • SEQ ID NO: 5 Endo-Si amino acid sequence D241Q / E360Q
  • SEQ ID NO: 6 Endo-Si amino acid sequence D241M
  • SEQ ID NO: 8 Endo-Si amino acid sequence D241M / E360Q
  • 9 Endo-Si amino acid sequence T190Q / D241Q
  • 10 Endo-Si amino acid sequence T190Q
  • 11 Endo-Si amino acid sequence T190Q / D241M
  • SEQ ID NO: 12 mAb2 light chain amino acid
  • SEQ ID NO: 13 mAb2

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Abstract

本発明は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｉｎｉａｅに属する菌株からクローニングされたエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（Ｅｎｄｏ－Ｓｉ）及びその変異酵素、当該酵素をコードする遺伝子、組み換えプラスミド、当該プラスミドにより形質転換された形質転換体及びその使用、ならびに当該酵素を用いた糖鎖リモデリング抗体等の製造方法等を提供する。　配列番号２のアミノ酸番号３４乃至９２８に記載のアミノ酸配列、又は、前記アミノ酸配列において、２４１番目（Ｄ２４１）、１９０番目（Ｔ１９０）、３１１番目（Ｑ３１１）及び３６０番目（Ｅ３６０）からなる群より選択される１又は２以上のアミノ酸部位への変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、加水分解活性及び／又は糖鎖転移活性を示すポリペプチド。

Description

新規エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ
　本発明は、エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（Ｅｎｄｏ－Ｓｉ）、当該酵素をコードする遺伝子、組み換えプラスミド、当該プラスミドにより形質転換された形質転換体及びその使用、ならびに当該酵素を用いた糖鎖リモデリング抗体等の製造方法等に関する。
　抗体は、重鎖分子中のＦｃ領域に位置する２９７番目のＡｓｎ側鎖に結合したＮ結合型糖鎖（Ｎ２９７結合糖鎖）を有する糖タンパク質分子である。抗体は、基礎研究や医療分野において重要な分子であり、特に抗体医薬としての研究開発が盛んに進められており、糖鎖の様々な影響が明らかにされつつある（非特許文献１）。現在、主に使われている医療用抗体は、ＩｇＧクラスの分子であり、このような抗体は、一般的にＣＨＯ細胞やＮＳ０細胞に代表される培養動物細胞を用いて産生され、これら動物細胞で産生される抗体のＮ２９７結合糖鎖はｂｉａｎｔｅｎｎａｒｙ複合型糖鎖であるが、コアフコースや末端のシアル基やガラクトシル基そしてｂｉｓｅｃｔｉｎｇ　ＧｌｃＮＡｃにおいて不均一なものが取得される（非特許文献２）。抗体のＮ２９７結合糖鎖が、抗体のＡＤＣＣ活性（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｃｅｌｌ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）やＣＤＣ活性（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を含むエフェクター活性に大きく影響することが明らかになっており（非特許文献３、非特許文献４）、抗体の血中半減期にも影響を及ぼす可能性が指摘されている（非特許文献５）。また、Ｎ２９７結合糖鎖の非還元末端が２，６－ｓｉａｌｙｌ化された抗体がＩＶＩＧ（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）における主要薬効成分であることが明らかになっている（非特許文献６）。また、ＩｇＧやＦｃ断片を含む医療用分子において、Ｎ２９７結合糖鎖の不均一性が有効成分としての性質や品質に大きな影響を与えると考えられており、不均一な糖鎖修飾分子の微量の混入が最終生産物の特性を大きく変えてしまう可能性を否定できない。
　この様な現状から、医療用の抗体や抗体Ｆｃ領域を含む糖タンパク質分子の製造において、糖鎖を均一化させる技術が開発されつつある。糖タンパク質に付加する糖鎖を均一にする方法としては、酵素を使った糖鎖転移反応が知られている（非特許文献７～９）。これは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ環境での糖鎖の切断（加水分解反応）と別の糖鎖の縮合（糖鎖転移反応）からなる、多段階プロセスである。特にＮ型糖鎖の変換を目的とする場合、エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（ＥＮＧａｓｅ）と呼ばれる一群の酵素ファミリーが用いられる。この酵素の特性として、１）基質特異性として複合型糖鎖に対する加水分解反応を行う能力を持つこと、及び、２）特定の構造に対する糖鎖転移反応を行う能力を持つことが要求される。糖鎖転移反応では、単独のＥＮＧａｓｅを用いて還元末端をオキサゾリン化した糖鎖をＧｌｃＮＡｃ（Ｎ－アセチルグルコサミン）アクセプターに転移する方法（非特許文献７～８）と２種類のＥＮＧａｓｅを使用して糖鎖をＧｌｃＮＡｃアクセプターに直接転移するワンポット法が知られている（非特許文献９、特許文献１）。ＥＮＧａｓｅは様々な生物種から分離されており、基質とする糖鎖の種類に応じて野生型やその変異酵素が使い分けられる。
　ＥＮＧａｓｅとして、Ｅｎｄｏ－Ａ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｐｒｏｔｏｐｈｏｒｍｉａｅ由来酵素）（非特許文献１０）、Ｅｎｄｏ－Ｄ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来酵素）（非特許文献１１）、Ｅｎｄｏ－Ｍ（Ｍｕｃｏｒ　ｈｉｅｍａｌｉｓ由来酵素）（非特許文献１２）、Ｅｎｄｏ－Ｈ（非特許文献１３）、Ｅｎｄｏ－Ｆ２（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ由来酵素）、Ｅｎｄｏ－Ｆ３（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ由来酵素）（非特許文献１４）、Ｅｎｄｏ－Ｅ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ由来酵素）（非特許文献１５）、Ｅｎｄｏ－Ｓ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｇｅｎｅｓ由来酵素）（非特許文献１６）、Ｅｎｄｏ－Ｔｓｐ１００６（Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ属細菌由来）、Ｅｎｄｏ－Ｔｓｐ１２６３（Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ属細菌由来）、Ｅｎｄｏ－Ｂｎｏ１２６３（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属細菌由来）、Ｅｎｄｏ－Ｔｓｐ１４５７（Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ属細菌由来）、Ｅｎｄｏ－Ｂａｃ１００８（Ｍｕｒｉｂａｃｕｌｕｍ属細菌由来）、Ｅｎｄｏ－Ｔｓｐ１６０３（Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ属細菌由来）、Ｅｎｄｏ－Ｔｓｐ１２６３（Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ属細菌由来）（特許文献２）、スフィンゴバクテリウム属細菌由来のエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（ＯＲＦ１１５２）、スフィンゴバクテリウム属細菌由来のエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（ＯＲＦ１１８８））、スフィンゴバクテリウム属細菌由来のエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（ＯＲＦ３０４６）、スフィンゴバクテリウム属細菌由来のエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（ＯＲＦ３７５０）、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ属糸状菌由来のエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、Ｂｅａｕｖｅｒｉａ属糸状菌由来のエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（非特許文献１７）、Ｅｎｄｏ－ＣＣ１（Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ　ｃｉｎｅｒｅａ由来酵素）、Ｅｎｄｏ－ＣＣ２（Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ　ｃｉｎｅｒｅａ由来酵素）（非特許文献１８）、Ｅｎｄｏ－Ｏｍ（Ｏｇａｔａｅａ　ｍｉｎｕｔａ由来酵素）（非特許文献１９）、Ｅｎｄｏ－ＣＥ（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ　ｅｌｅｇａｎｓ由来酵素）（非特許文献２０）、Ｅｎｄｏ－ＢＨ　（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ　Ｃ－１２５由来酵素）（非特許文献２１）、ＥｎｄｏＳｄ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ由来酵素）、ＥｎｄｏＳ２ｄ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ由来酵素）（非特許文献２２）、ＥｎｄｏＳｅ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｑｕｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｅｑｕｉ由来酵素）（非特許文献２３）、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ　ｐｕｓｉｌｌｕｓ由来酵素）（特許文献３）、ＥｎｄｏＳ２もしくはＥｎｄｏＳ４９（非特許文献２４）などが知られている。
　これらの中で、抗体のコアフコースを有する複合型のＮ２９７結合糖鎖を基質とし、加水分解活性と糖鎖転移活性を併せ持つことが確認できている酵素として、ＥｎｄｏＳ（非特許文献２５）、ＥｎｄｏＳ２（非特許文献２６）、Ｅｎｄｏ－Ｆ３（非特許文献２７）が知られている。
　ＥｎｄｏＳにおいては、その変異酵素であるＥｎｄｏＳ　Ｄ２３３Ｑは、加水分解活性がある程度抑制されることが知られている。この変異酵素は反応系中に糖鎖の還元末端をオキサゾリン化した中間体が大量に存在する条件下で、糖鎖転移反応が選択的に進行することが知られている（特許文献４、非特許文献８）。
　また、ＥｎｄｏＳ　Ｄ２３３Ｑに、更なる変異を追加して導入することでＥｎｄｏＳ　Ｄ２３３Ｑ酵素と比較して糖鎖転移活性が高くなるか、あるいは、加水分解活性が低くなることが知られている（特許文献５）。
　ＥｎｄｏＳ２変異酵素（Ｄ１８４Ｑ）は野生型ＥｎｄｏＳ２酵素と比較して増加した糖鎖転移活性および減少した加水分解活性を示すことが知られている（特許文献６～８、非特許文献２８）。
　Ｅｎｄｏ－Ｆ３変異酵素（Ｄ１６５Ａ、またはＤ１６５Ｑ）は野生型Ｅｎｄｏ－Ｆ３酵素と比較して生成物に対する加水分解活性が減少し、糖オキサゾリンの糖鎖転移活性が高くなることが知られている。また、Ｅｎｄｏ－Ｆ３変異酵素は、糖鎖転移反応の基質として二分岐および三分岐糖鎖オキサゾリンの使用が可能である（非特許文献２７）。
　糖鎖を直接ＧｌｃＮＡｃアクセプターに転移するワンポット法で使用されるＥＮＧａｓｅとしては、ＥｎｄｏＳ／ＥｎｄｏＳ変異酵素とＥｎｄｏ－Ｍ／Ｅｎｄｏ－Ｍ変異酵素もしくはＥｎｄｏ－ＣＣ／Ｅｎｄｏ－ＣＣ変異酵素の２種類の酵素の組合せが知られている（特許文献１、非特許文献９）。
　Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｉｎｉａｅ（非特許文献２９）は魚の病原菌として知られており、日本ではヒラメやマダイの養殖で被害が大きい（非特許文献３０）。そのためヒラメβ溶血性レンサ球菌症不活化ワクチンとしてＭバックイニエ（松研薬品工業株式会社）が販売されている。ヒトや農林水産業に深刻な影響を与える病原菌であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の菌株はゲノム解析による分類が盛んに行われており（非特許文献３１）、Ｓ．ｉｎｉａｅについてもＥＮＧａｓｅ配列の存在は知られていたが、酵素活性が調べられたことはなかった（非特許文献２４）。
ＷＯ２０１８／００３９８３ ＪＰ２０２０－０２２４４０ ＷＯ２０１８／１０１４５１ ＷＯ２０１３／１２００６６ ＷＯ２０１７／０１０５５９ ＷＯ２０１７／１２４０８４ ＷＯ２０１８／０３９３７３ ＪＰ２０２０－５００５４９
Ａｒｎｏｌｄ　ＪＮ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎｎｕ　Ｒｅｖ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　２００７，　２５，　２１－５０ Ｊｅｆｆｅｒｉｓ　Ｒ，　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｐｒｏｇ．　２００５，　２１，　１１－１６ Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ　Ｆ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔ　Ｒｅｖ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　２００８，　８，　３４－４７ Ｊｅｆｆｅｒｉｓ　Ｒ，　Ｎａｔ　Ｒｅｖ　Ｄｒｕｇ　Ｄｉｓｃｏｖ．　２００９，　８，　２２６－２３４ Ｂｕｍｂａｃａ　Ｄ，　ｅｔ　ａｌ．，　ＡＡＰＳ　Ｊ．　２０１２，　１４，　５５４－５５８ Ａｎｔｈｏｎｙ　ＲＭ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ．　２００８，　３２０，　３７３－３７６ Ｗａｎｇ　ＬＸ，　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｌｙｃｏｓｃｉ　Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌ．　２０１１，　２３，　３３－５２ Ｈｕａｎｇ　Ｗ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ　Ａｍ　Ｃｈｅｍ　Ｓｏｃ．　２０１２，　１３４，　１２３０８－１２３１８ Ｉｗａｍｏｔｏ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．，　ＰＬｏＳ　ＯＮＥ　２０１８，　１３，　ｅ０１９３５３４ Ｔａｋｅｇａｗａ　Ｋ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｉｎｔ．　１９９１，　２４，　８４９－８５５ Ｆａｎ　ＳＱ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．　２０１２，　２８７，　１１２７２－１１２８１ Ｙａｍａｍｏｔｏ　Ｋ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ．　１９９４，　２０３，　２４４－２５２ Ｒｏｂｂｉｎｓ　ＰＷ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．　１９８４，　２５９，　７５７７－７５８３ Ｈｕａｎｇ　Ｗ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．　２０１１，　１２，　９３２－９４１ Ｃｏｌｌｉｎ　Ｍ　ａｎｄ　Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉ　ＶＡ．　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．　２００４，　２７９，　２２５５８－２２５７０ Ｃｏｌｌｉｎ　Ｍ　ａｎｄ　Ｏｌｓeｎ　Ａ．，　ＥＭＢＯ　Ｊ．　２００１，　２０，　３０４６－３０５５ Ｈｕａｎｇ　Ｙ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉ　Ｒｅｐ．　２０１８，　８，　２４６ Ｅｓｈｉｍａ　Ｙ，　ｅｔ　ａｌ．，　ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ．　２０１５，　１０，　ｅ０１３２８５９ Ｍｕｒａｋａｍｉ　Ｓ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．　２０１３，　２３，　７３６－７４４ Ｋａｔｏ　Ｔ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．　２００２，　１２，　５８１－５８７ Ｆｕｊｉｔａ　Ｋ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｓｃｉ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　２００４，　６８，　１０５９－１０６６ Ｓｈａｄｎｅｚｈａｄ　Ａ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｆｕｔｕｒｅ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　２０１６，　１１，　７２１－７３６ Ｆｌｏｃｋ　Ｍ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｉｎｆｅｃｔ　Ｉｍｍｕｎ．　２０１２，　８０，　２９１４－２９１９ Ｓｊｏｇｒｅｎ　Ｊ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ．　２０１３，　４５５，　１０７－１１８ Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ　ＪＪ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ　Ａｍ　Ｃｈｅｍ　Ｓｏｃ．　２０１２，　１３４，　８０３０－８０３３ Ｓｈｉｖａｔａｒｅ　ＳＳ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｈｅｍ　Ｃｏｍｍｕｎ　（Ｃａｍｂ）．　２０１８，　５４，　６１６１－６１６４ Ｇｉｄｄｅｎｓ　ＪＰ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．　２０１６，　２９１，　９３５６－９３７０ Ｌｉ　Ｔ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．　２０１６，　２９１，　１６５０８－１６５１８ Ｐｉｅｒ　ＧＢ　ａｎｄ　Ｍａｄｉｎ　ＳＨ．，　Ｉｎｔ　Ｊ　Ｓｙｓｔ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　１９７６　２６，　５４５－５５３ Ｙｏｓｈｉｄａ　Ｔ．，　Ｆｉｓｈ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．　２０１６，　５１，　４４－４８ Ｖｉｎｃｅｎｔ　Ｐ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，　２０１４，　６，　７４１－７５３
　本発明は、糖タンパク質のＮ２９７結合糖鎖に対する加水分解活性及び／又は糖鎖転移活性を有する新規エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼを提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｉｎｉａｅに属する菌株からクローニングされたエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（Ｅｎｄｏ－Ｓｉ）がＮ２９７結合糖鎖に対する加水分解活性を有すること、またＥｎｄｏ－Ｓｉに変異を導入することにより、加水分解活性がより抑えられ、かつ、一定以上の糖鎖転移活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
　本発明は、以下の発明を提供する。
[１]　配列番号２のアミノ酸番号３４乃至９２８に記載のアミノ酸配列、又は、前記アミノ酸配列において、２４１番目（Ｄ２４１）、１９０番目（Ｔ１９０）、３１１番目（Ｑ３１１）及び３６０番目（Ｅ３６０）のアミノ酸からなる群より選択される１又は２以上のアミノ酸部位への変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、糖鎖加水分解活性及び／又は糖鎖転移活性を示すポリペプチド。
[２]　変異が、Ｄ２４１、Ｔ１９０、Ｑ３１１及びＥ３６０のアミノ酸からなる群より選択される１～３個のアミノ酸部位に変異を有することを特徴とする、[１]のポリペプチド。
[３]　以下の（Ａ）～（Ｄ）からなる群から選択される１又は２以上の変異を有する、[１]又は[２]のポリペプチド；
（Ａ）配列番号２のアミノ酸配列において、２４１番目のアミノ酸（Ｄ２４１）が、グルタミン（Ｄ２４１Ｑ）、メチオニン（Ｄ２４１Ｍ）、若しくはアラニン（Ｄ２４１Ａ）へ変異、
（Ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１９０番目のアミノ酸（Ｔ１９０）が、グルタミン（Ｔ１９０Ｑ）へ変異、
（Ｃ）配列番号２のアミノ酸配列において、３１１番目のアミノ酸（Ｑ３１１）が、ロイシン（Ｑ３１１Ｌ）へ変異、並びに、
（Ｄ）配列番号２のアミノ酸配列において、３６０番目のアミノ酸（Ｅ３６０）が、グルタミン（Ｅ３６０Ｑ）、アラニン（Ｅ３６０Ａ）、アスパラギン（Ｅ３６０Ｎ）、若しくはアスパラギン酸（Ｅ３６０Ｄ）へ変異。
[４]　以下の（Ａ）～（Ｄ）からなる群から選択される１又は２以上の変異
を有する、[１]～[３]のいずれかのポリペプチド；
（Ａ）Ｄ２４１Ｑ又はＤ２４１Ｍ、
（Ｂ）Ｔ１９０Ｑ、
（Ｃ）Ｑ３１１Ｌ、及び、
（Ｄ）Ｅ３６０Ｑ。
[５]　以下の（Ａ）～（Ｃ）に記載のアミノ酸配列を含む、[１]～[４]のいずれかのポリペプチド； 
（Ａ）配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１からなる群より選択されるアミノ酸配列、
（Ｂ）（Ａ）の各配列における２４１番目、１９０番目、３１１番目、又は、３６０番目のアミノ酸以外のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上の相同性もしくは同一性を有するアミノ酸配列、又は、
（Ｃ）（Ａ）の配列において２４１番目、１９０番目、３１１番目、又は、３６０番目のアミノ酸以外のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、および／または付加されたアミノ酸配列。
[６]　Ｎ結合型糖鎖に対して、加水分解活性及び／糖鎖転移活性を示す、[１]～[５]のいずれかのポリペプチド。
[７]　Ｎ結合型糖鎖が、糖タンパク質におけるＮ結合型糖鎖である、[６]のポリペプチド。
[８]　糖タンパク質が、抗体又は抗体のＦｃ領域を含む分子（Ｆｃ領域含有分子）である、[６]又は[７]のポリペプチド。
[９]　Ｎ結合型糖鎖が、抗体の２９７番目のＡｓｎに結合するＮ結合型糖鎖（Ｎ２９７結合糖鎖）である、[６]～[８]のいずれかのポリペプチド。
[１０]　Ｎ２９７結合糖鎖の非還元末端が化学修飾されていてもよい複合型糖鎖である、[９]のポリペプチド。
[１１]　Ｎ２９７結合糖鎖が、コアＧｌｃＮＡｃにフコースが付加していてもよいＮ２９７結合糖鎖である、[９]又は[１０]のポリペプチド。
[１２]　[１]～[１１]のいずれかのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
[１３]　[１２]のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
[１４]　[１３]の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞。
[１５]　[１４]の宿主細胞を培養する工程、および当該工程で得られた培養物から目的のポリペプチドを採取する工程を含むことを特徴とする、[１]～[１１]のいずれかのポリペプチドの製造方法。
[１６][１５]の製造方法によって得られた、ポリペプチド。
[１７]　[１]～[１１]のいずれかのポリペプチドの存在下で、Ｎ２９７結合糖鎖としてフコースが付加していてもよいコアＧｌｃＮＡｃを有する抗体又はそのＦｃ領域含有分子であるアクセプター分子を、還元末端が活性化されたＧｌｃＮＡｃを含む糖鎖ドナー分子と反応させることを特徴とする、抗体又はそのＦｃ領域含有分子の製造方法。
[１８]　還元末端が活性化されたＧｌｃＮＡｃがオキサゾリン化されたＧｌｃＮＡｃである、[１７]の製造方法。
[１９]　糖鎖ドナー分子が、非還元末端が化学修飾されていてもよい複合型糖鎖である、[１７]又は[１８]の製造方法。
[２０]　糖鎖ドナー分子が、非還元末端が化学修飾されていてもよいＳＧ（１０）－Ｏｘ、ＭＳＧ１（９）－Ｏｘ、ＭＳＧ２（９）－Ｏｘ又はＭＳＧ１（９）－ＯｘとＭＳＧ２（９）－Ｏｘの混合物である、[１７]～[１９]のいずれかの製造方法。
[２１]　糖鎖ドナー分子が、［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］２－ＳＧ（１０）－Ｏｘ、［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ１（９）－Ｏｘ、［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ２（９）－Ｏｘ、又は［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ１（９）－Ｏｘと［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ２（９）－Ｏｘの混合物である、[１７]～[２０]のいずれかの製造方法。
[２２]　更に、アジド基（Ｎ３－）にアルキン構造を有する分子と反応させる工程を含む、[２１]の製造方法。
[２３]　アルキン構造を有する分子が、化学療法剤、分子標的薬、免疫活性化剤、毒素、抗菌剤、抗ウイルス剤、診断用薬剤、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、抗原、脂質、リポソーム、ビタミン、ホルモンから選択される、[２２]の製造方法。
[２４]　化学療法剤が、カンプトテシン、ピロロベンゾジアゼピン、ドキソルビシン、オーリスタチン、タキサンもしくはその誘導体から選択される、[２３]の製造方法。
[２５]　免疫活性化剤が、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＴＬＲアゴニスト、Ａ２ＡＲアンタゴニスト、ＩＤＯ阻害剤、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３及びＰＤ－１経路のアンタゴニスト、チェックポイント阻害剤、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体阻害剤、スムーズン（ｓｍｏｏｔｈｅｎ）阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、レチノイド、抗がんワクチン、アジュバントから選択される、[２３]の製造方法。
[２６]　アルキン構造を有する分子が、（Ａ）～（Ｅ）からなる群から選択される、[２３]～[２５]のいずれかの製造方法。
（Ａ）Ｎ－［４－（１１，１２－ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－４－オキソブタノイル］グリシルグリシル－Ｌ－バリル－Ｎ－｛４－［（｛［（１１’Ｓ，１１ａ’Ｓ）－１１’－ヒドロキシ－７’－メトキシ－８’－［（５－｛［（１１ａＳ）－７－メトキシ－２－（４－メトキシフェニル）－５－オキソ－５，１０，１１，１１ａ－テトラヒドロ－１Ｈ－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン－８－イル］オキシ｝ペンチル）オキシ］－５’－オキソ－１１’，１１ａ’－ジヒドロ－１’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－１０’（５’Ｈ）－イル］カルボニル｝オキシ）メチル］フェニル｝－Ｌ－アラニンアミド、
（Ｂ）Ｎ－［４－（１１，１２－ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－４－オキソブタノイル］グリシルグリシル－Ｌ－バリル－Ｎ－［４－（｛［（１１’Ｓ，１１’ａＳ）－１１’－ヒドロキシ－７’－メトキシ－８’－（３－｛［（１１ａＳ）－７－メトキシ－２－（４－メトキシフェニル）－５－オキソ－５，１０，１１，１１ａ－テトラヒドロ－１Ｈ－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン－８－イル］オキシ｝プロポキシ）－５’－オキソ－１１’，１１’ａ－ジヒドロ－１’Ｈ，３’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－１０’（５’Ｈ）－カルボニル］オキシ｝メチル）フェニル］－Ｌ－アラニンアミド、
（Ｃ）Ｎ－［４－（１１，１２－ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－４－オキソブタノイル］グリシルグリシル－Ｌ－バリル－Ｎ－｛４－［（｛［（１１’Ｓ，１１ａ’Ｓ）－１１’－ヒドロキシ－７’－メトキシ－８’－［（５－｛［（１１ａ’Ｓ）－７’－メトキシ－５’－オキソ－５’，１１ａ’－ジヒドロ－１’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－８’－イル］オキシ｝ペンチル）オキシ］－５’－オキソ－１１’，１１ａ’－ジヒドロ－１’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－１０’（５’Ｈ）－イル］カルボニル｝オキシ）メチル］フェニル｝－Ｌ－アラニンアミド、
（Ｄ）Ｎ－［４－（１１，１２－ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－４－オキソブタノイル］グリシルグリシル－Ｌ－バリル－Ｎ－｛４－［（｛［（１１’Ｓ，１１ａ’Ｓ）－１１’－ヒドロキシ－７’－メトキシ－８’－［（５－｛［（１１ａ’Ｓ）－７’－メトキシ－５’－オキソ－５’，１０’，１１’，１１ａ’－テトラヒドロ－１’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－８’－イル］オキシ｝ペンチル）オキシ］－５’－オキソ－１１’，１１ａ’－ジヒドロ－１’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－１０’（５’Ｈ）－イル］カルボニル｝オキシ）メチル］フェニル｝－Ｌ－アラニンアミド、並びに、
（Ｅ）（ビス（Ｎ，Ｎ－ジエチルエタンアミニウム）　Ｎ－［４－（１１，１２－ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－４－オキソブタノイル］グリシルグリシル－Ｌ－フェニルアラニル－Ｎ－［（２－｛９－［（５Ｒ，７Ｒ，８Ｒ，１２ａＲ，１４Ｒ，１５Ｒ，１５ａＲ，１６Ｒ）－１５－フルオロ－１６－ヒドロキシ－２，１０－ジオキソ－２，１０－ジスルフィド－１４－（６，７，８，９－テトラヒドロ－２Ｈ－２，３，５，６－テトラアザベンゾ［ｃｄ］アズレン－２－イル）オクタヒドロ－２Ｈ，１０Ｈ，１２Ｈ－５，８－メタノ－２λ５，１０λ５－フロ［３，２－ｌ］［１，３，６，９，１１，２，１０］ペンタオキサジホスファシクロテトラデシン－７－イル］－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－１－イル｝エトキシ）メチル］グリシンアミド。
[２７]　アクセプター分子が、フコースが付加していてもよいコアＧｌｃＮＡｃからなるＮ２９７結合糖鎖を有する抗体又はＦｃ領域含有分子である[１７]～[２６]のいずれかの製造方法。
[２８]　[１]～[１１]のいずれかのポリペプチド及び還元末端が活性化されていない糖鎖ドナー分子の複合型糖鎖を基質とするがＮ２９７結合糖鎖を基質としないエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（酵素Ａ（Ｅｎｚｙｍｅ　Ａとも記載する））の存在下で、
Ｎ２９７結合糖鎖としてフコースが付加していてもよいコアＧｌｃＮＡｃを有する抗体若しくはそのＦｃ領域含有分子であるアクセプター分子を、還元末端が活性化されていないＧｌｃＮＡｃを含む糖鎖ドナー分子と反応させることを特徴とする、抗体又はＦｃ領域含有分子の製造方法。
[２９]　[１]～[１１]のいずれかのポリペプチド、酵素Ａ、アクセプター分子及び糖鎖ドナー分子を同一の反応液中で反応させることを特徴とする、[２７]の製造方法。
[３０]　糖鎖ドナー分子が、非還元末端が化学修飾されていてもよい複合型糖鎖である、[２８]又は[２９]の製造方法。
[３１]　糖鎖ドナー分子が、非還元末端が化学修飾されていても良いＳＧＰ、（ＳＧ－）Ａｓｎ、（ＭＳＧ１－）Ａｓｎ、（ＭＳＧ２－）Ａｓｎ、（ＭＳＧ１－）Ａｓｎと（ＭＳＧ２－）Ａｓｎの混合物である、[２８]～[３０]のいずれかの製造方法。
[３２]　糖鎖ドナー分子が、（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］２－ＳＧ－）Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３、（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ１－）Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３、（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ２－）Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３、又は（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ１－）Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３と（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ２－）Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３の混合物である、[２８]～[３１]のいずれかの製造方法。
[３３]　更に、アジド基（Ｎ３－）にアルキン構造を有する分子と反応させる工程を含む、[３２]の製造方法。
[３４]　アルキン構造を有する分子が、化学療法剤、分子標的薬、免疫活性化剤、毒素、抗菌剤、抗ウイルス剤、診断用薬剤、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、抗原、脂質、リポソーム、ビタミン、ホルモンから選択される、[３３]の製造方法。
[３５]　化学療法剤が、カンプトテシン、ピロロベンゾジアゼピン、ドキソルビシン、オーリスタチン、タキサンもしくはその誘導体から選択される、[３４]の製造方法。
[３６]　免疫活性化剤が、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＴＬＲアゴニスト、Ａ２ＡＲアンタゴニスト、ＩＤＯ阻害剤、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３及びＰＤ－１経路のアンタゴニスト、チェックポイント阻害剤、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体阻害剤、スムーズン（ｓｍｏｏｔｈｅｎ）阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、レチノイド、抗がんワクチン、アジュバントから選択される、[３４]の製造方法。
[３７]　アルキン構造を有する分子が、（Ａ）～（Ｅ）からなる群から選択される、[３４]～[３６]のいずれかの製造方法；
（Ａ）Ｎ－［４－（１１，１２－ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－４－オキソブタノイル］グリシルグリシル－Ｌ－バリル－Ｎ－｛４－［（｛［（１１’Ｓ，１１ａ’Ｓ）－１１’－ヒドロキシ－７’－メトキシ－８’－［（５－｛［（１１ａＳ）－７－メトキシ－２－（４－メトキシフェニル）－５－オキソ－５，１０，１１，１１ａ－テトラヒドロ－１Ｈ－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン－８－イル］オキシ｝ペンチル）オキシ］－５’－オキソ－１１’，１１ａ’－ジヒドロ－１’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－１０’（５’Ｈ）－イル］カルボニル｝オキシ）メチル］フェニル｝－Ｌ－アラニンアミド、
（Ｂ）Ｎ－［４－（１１，１２－ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－４－オキソブタノイル］グリシルグリシル－Ｌ－バリル－Ｎ－［４－（｛［（１１’Ｓ，１１’ａＳ）－１１’－ヒドロキシ－７’－メトキシ－８’－（３－｛［（１１ａＳ）－７－メトキシ－２－（４－メトキシフェニル）－５－オキソ－５，１０，１１，１１ａ－テトラヒドロ－１Ｈ－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン－８－イル］オキシ｝プロポキシ）－５’－オキソ－１１’，１１’ａ－ジヒドロ－１’Ｈ，３’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－１０’（５’Ｈ）－カルボニル］オキシ｝メチル）フェニル］－Ｌ－アラニンアミド、
（Ｃ）Ｎ－［４－（１１，１２－ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－４－オキソブタノイル］グリシルグリシル－Ｌ－バリル－Ｎ－｛４－［（｛［（１１’Ｓ，１１ａ’Ｓ）－１１’－ヒドロキシ－７’－メトキシ－８’－［（５－｛［（１１ａ’Ｓ）－７’－メトキシ－５’－オキソ－５’，１１ａ’－ジヒドロ－１’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－８’－イル］オキシ｝ペンチル）オキシ］－５’－オキソ－１１’，１１ａ’－ジヒドロ－１’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－１０’（５’Ｈ）－イル］カルボニル｝オキシ）メチル］フェニル｝－Ｌ－アラニンアミド、
（Ｄ）Ｎ－［４－（１１，１２－ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－４－オキソブタノイル］グリシルグリシル－Ｌ－バリル－Ｎ－｛４－［（｛［（１１’Ｓ，１１ａ’Ｓ）－１１’－ヒドロキシ－７’－メトキシ－８’－［（５－｛［（１１ａ’Ｓ）－７’－メトキシ－５’－オキソ－５’，１０’，１１’，１１ａ’－テトラヒドロ－１’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－８’－イル］オキシ｝ペンチル）オキシ］－５’－オキソ－１１’，１１ａ’－ジヒドロ－１’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－１０’（５’Ｈ）－イル］カルボニル｝オキシ）メチル］フェニル｝－Ｌ－アラニンアミド、並びに、
（Ｅ）（ビス（Ｎ，Ｎ－ジエチルエタンアミニウム）　Ｎ－［４－（１１，１２－ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－４－オキソブタノイル］グリシルグリシル－Ｌ－フェニルアラニル－Ｎ－［（２－｛９－［（５Ｒ，７Ｒ，８Ｒ，１２ａＲ，１４Ｒ，１５Ｒ，１５ａＲ，１６Ｒ）－１５－フルオロ－１６－ヒドロキシ－２，１０－ジオキソ－２，１０－ジスルフィド－１４－（６，７，８，９－テトラヒドロ－２Ｈ－２，３，５，６－テトラアザベンゾ［ｃｄ］アズレン－２－イル）オクタヒドロ－２Ｈ，１０Ｈ，１２Ｈ－５，８－メタノ－２λ５，１０λ５－フロ［３，２－ｌ］［１，３，６，９，１１，２，１０］ペンタオキサジホスファシクロテトラデシン－７－イル］－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－１－イル｝エトキシ）メチル］グリシンアミド。
[３８]　アクセプター分子が、フコースが付加していてもよいコアＧｌｃＮＡｃからなるＮ２９７結合糖鎖を有する抗体又はもしくはＦｃ領域含有分子である[２８]～[３７]のいずれかの製造方法。
[３９]　酵素Ａが、ＳＧＰからＧｌｃＮＡｃを有するアクセプターへの糖鎖転移活性を有する酵素である、[２８]～[３８]のいずれかの製造方法。
[４０]　酵素Ａが、Ｅｎｄｏ－Ｍ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ、Ｅｎｄｏ－Ｏｍ、Ｅｎｄｏ－ＣＣ、又はそれらの加水分解活性を低下させた変異酵素である、[２８]～[３９]のいずれかの製造方法。
[４１]　加水分解活性を低下させた変異酵素が、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｑ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｈ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ａ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｃ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｄ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｅ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｇ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｉ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｌ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｍ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｐ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｓ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｔ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｖ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｗ２７８Ｆ／Ｓ２１６Ｖ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｗ２７８Ｆ／Ｎ２４６Ｄ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｗ２７８Ｆ／Ｄ２７６Ｎ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｗ２７８Ｆ／Ａ３１０Ｄ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｗ２７８Ｆ／Ｎ１７２Ｄ／Ｆ３０７Ｙ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｗ２７８Ｆ／Ｎ１７２Ｄ／Ｆ３０７Ｈ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｗ２７８Ｆ／Ｎ１７２Ｄ／Ａ３１０Ｄ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｗ２１４Ｆ／Ｆ３０７Ｙ／Ｌ３０６Ｉ、Ｅｎｄｏ－Ｍ　Ｎ１７５Ｑ、Ｅｎｄｏ－ＣＣ　Ｎ１８０Ｈ及びＥｎｄｏ－Ｏｍ　Ｎ１９４Ｑからなる群から選択される、[４０]の製造方法。
[４２]　[１７]～[４１]のいずれかの製造方法で得られた抗体又はＦｃ領域含有分子。
[４３]　抗体又はＦｃ領域含有分子に、配列番号２のアミノ酸番号３４乃至９２８に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを作用させることを特徴とする、フコースが付加していてもよいコアＧｌｃＮＡｃのみを有する抗体又はＦｃ領域含有分子の製造方法。
[４４]　[４３]の製造方法で得られたコアＧｌｃＮＡｃのみを有する抗体又はもしくはＦｃ領域含有分子。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０２０－１４７７４５号の開示内容を包含する。
　本発明のＥｎｄｏ－Ｓｉ酵素は、良好な加水分解活性を有し、糖タンパク質のＮ２９７結合を含むＮ結合型糖鎖に作用して、糖鎖中に存在するコアキトビオース構造のＧｌｃＮＡｃ間のβ１，４－グリコシド結合を効率よく切断することができる。遊離された糖鎖は、糖タンパク質の糖鎖構造解析のための試料、及び糖鎖誘導体の原料として利用することができる。糖タンパク質を基質に用いた場合、糖鎖が加水分解された糖タンパク質は、糖鎖リモデリングのアクセプター分子として利用することが可能である。
　また、Ｅｎｄｏ－Ｓｉに変異を導入したＥｎｄｏ－Ｓｉ変異酵素は野生型Ｅｎｄｏ－Ｓｉと比較して、加水分解活性が低減され、且つ、増強された糖鎖転移活性を有するため、糖鎖リモデリングにより、均一な糖鎖を有する抗体もしくは糖鎖含有分子（Ｆｃ領域含有分子を含む）を、効率よく、又は高純度で取得することが可能である。従って、糖鎖リモデリングにおいて用いる糖鎖ドナー分子量の削減も可能であるため、糖鎖リモデリングされた抗体もしくは糖鎖含有分子の製造コストの低減につながる。
［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ１（９）－Ｏｘの構造式を示す。 ＳＧＰの構造式を表す。 Ｅｎｄｏ－Ｓｉ（〇）及びＥｎｄｏ－Ｓ（Ｘ）の、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（ｍＡｂ１）に対する加水分解活性の経時変化を示すグラフである。Ｘ軸は反応開始後の経過時間、Ｙ軸は糖鎖加水分解率を表す。 Ｅｎｄｏ－Ｓｉ又はＥｎｄｏ－Ｓｉ変異酵素を用いた、抗体のＮ２９７結合糖鎖に対する加水分解反応の模式図である。 糖鎖オキサゾリン体をドナーとして、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ又はＥｎｄｏ－Ｓｉ変異酵素を用いた糖鎖転移反応の模式図である。 配列番号１の配列（Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　塩基配列）を示す図である。 配列番号２の配列（Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　アミノ酸配列）を示す図である。 配列番号３の配列（Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　アミノ酸配列　Ｄ２４１Ｑ）を示す図である。 配列番号４の配列（Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　アミノ酸配列　Ｄ２４１Ｑ／Ｑ３１１Ｌ）を示す図である。 配列番号５の配列（Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　アミノ酸配列Ｄ２４１Ｑ／Ｅ３６０Ｑ）を示す図である。 配列番号６の配列（Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　アミノ酸配列　Ｄ２４１Ｍ）を示す図である。 配列番号７の配列（Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　アミノ酸配列　Ｄ２４１Ｍ／Ｑ３１１Ｌ）を示す図である。 配列番号８の配列（Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　アミノ酸配列Ｄ２４１Ｍ／Ｅ３６０Ｑ）を示す図である。 配列番号９の配列（Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　アミノ酸配列　Ｔ１９０Ｑ／Ｄ２４１Ｑ）を示す図である。 配列番号１０の配列（Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　アミノ酸配列　Ｔ１９０Ｑ）を示す図である。 配列番号１１の配列（Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　アミノ酸配列　Ｔ１９０Ｑ／Ｄ２４１Ｍ）を示す図である。 ＳＧＰをドナーとして、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ変異酵素及び酵素Ａを用いた、糖鎖転移反応の模式図である。 Ｅｎｄｏ－ＳｉとＥｎｄｏＳの反応温度と糖鎖加水分解率の関係を示す図である。 Ｅｎｄｏ－ＳｉとＥｎｄｏＳの反応ｐＨと糖鎖加水分解率の関係を示す図である。 Ｅｎｄｏ－Ｓｉ、ＥｎｄｏＳ、ＰＮＧａｓｅＦの各種抗体に対する加水分解活性の比較を示す図である。 （［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ１－）Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３をドナーとして、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ変異酵素及び酵素Ａを用いた、糖鎖転移反応の模式図である。 （［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］２－ＳＧ－）Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３をドナーとして、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ変異酵素及び酵素Ａを用いた、糖鎖転移反応の模式図である。
　以下に、本発明を詳細に説明する。
　本明細書において、分子中に含まれるアミノ酸の表記法は、本分野の慣例に従い、変異箇所を示す場合は野生型のアミノ酸（又は核酸）の一文字表記とその番号（例えば、２４１番目のＡｓｐであれば「Ｄ２４１」）により表す。なお、本明細書において、アミノ酸部位への変異とは、アミノ酸を、置換、欠失、挿入又は付加させることを表し、好ましくは、アミノ酸を置換することを表す。また、変異については、野生型のアミノ酸（又は核酸）の一文字表記、その番号及び変異後のアミノ酸（又は核酸）の一文字表記（例えば、２４１番目のＡｓｐがＧｌｎに置換された変異は「Ｄ２４１Ｑ」）により表す。また、変異を有する特定の変異酵素は、分子名と変異（例えば、Ｅｎｄｏ－Ｓｉの２４１番目ＡｓｐがＧｌｎに置換された変異酵素は、「Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｄ２４１Ｑ」）により表し、複数の変異を有する場合は、変異の間を「／」で区切る形（例えば、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｄ２４１Ｑにおいて、２４１番目のＧｌｎがＬｅｕに置換された追加変異を有する変異酵素は、「Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｄ２４１Ｑ／Ｑ３１１Ｌ」）と表す。
　本発明において、「Ｎ２９７結合糖鎖」とは、ＩｇＧ重鎖の２９７番目のＡｓｎの側鎖に結合するＮ結合型糖鎖を意味する。ＩｇＧを断片化した場合、当該Ａｓｎを含むペプチド断片において、対応するＡｓｎに結合する糖鎖であっても、Ｎ２９７結合糖鎖に含まれる。通常、動物等で産生されたＩｇＧにおけるＮ２９７結合糖鎖は、下記式（I)又は（II)の構造からなる基本構造を有しており、その非還元末端は、さらに化学修飾されていてもよく、例えばガラクトース（Ｇａｌ）やシアル酸（Ｓｉａ）が付加していてもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 　細胞が産生するＩｇＧのＮ２９７結合糖鎖の多くは、この基本構造において、その還元末端のＧｌｃＮＡｃ（コアＧｌｃＮＡｃ）、非還元末端、分岐糖などにおいてさらに糖鎖が結合したものを含む、糖鎖構造の多様性を有している。コアＧｌｃＮＡｃの６位にはフコース（Ｆｕｃ）がα１，６結合したコアフコースを有する構造（（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ）に修飾されていてもよい。分岐糖であるＭａｎにおいては、その５位にさらにＧｌｃＮＡｃを含む糖鎖が結合した３分岐型の糖鎖を形成している場合もある。非還元末端のＧｌｃＮＡｃにおいては、ガラクトースやシアル酸を含む糖鎖がさらに結合している場合もある。
　本発明において、シアリルグリカン（Ｓｉａｌｙｌ　Ｇｌｙｃａｎ、以下、「ＳＧ」という）とは、下記の構造式および配列式からなる基本構造を有している。
　ＳＧの代表的なものとしては、鶏卵の卵黄に含まれるシアリルグリコペプチド（Ｓｉａｌｙｌ　ＧｌｙｃｏＰｅｐｔｉｄｅ：以下、「ＳＧＰ」という）に含まれる糖鎖を例示することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 （式中、「－（Ｎ／Ｑ）」は、Ａｓｎ又はＧｌｎの側鎖とＮグリコシド結合することを示す。）
　ＳＧの糖鎖部分において還元末端のＧｌｃＮＡｃが一つ欠損した糖鎖（以下、「ＳＧ（１０）」）のみからなるジシアロオクタサッカリド（東京化成（株）製）などが市販されている。本明細書において、ＳＧ（１０）のβマンノース（β－Ｍａｎ）の分岐鎖のいずれか一方のみで非還元末端のシアル酸が欠失した糖鎖構造をＭＳＧ（９）といい、分岐鎖の１－３糖鎖のみにシアル酸を有するものをＭＳＧ１（９）、分岐鎖の１－６糖鎖のみにシアル酸を有するものをＭＳＧ２（９）、とそれぞれ表記するものとする（特許文献１、ＷＯ２０１９／０６５９６４）。
　本発明において、「糖鎖ドナー分子」とは、糖鎖の還元末端が活性化されたＧｌｃＮＡｃ、好ましくは、オキサゾリン化されたＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖含有分子であり、多様な糖鎖構造の分子を用いることができる。活性化とは、糖アノマー位の反応性が高められた状態を指し、オキサゾリン化またはハロゲン化を含む。糖鎖ドナー分子の例としては、実施例６で使用した［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ１（９）－Ｏｘ（図１）やＳＧ（９）－Ｏｘ（オキサゾリン）、ＭＳＧ１（９）－Ｏｘ、ＭＳＧ２（９）－ＯｘもしくはＭＳＧ１（９）－ＯｘとＭＳＧ２（９）－Ｏｘの混合物が挙げられる。
　糖鎖ドナー分子の別の態様としては、糖鎖の還元末端が活性化されていないＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖含有分子、好ましくは、ＳＧＰ（図２）、（ＳＧ－）Ａｓｎ、(ＭＳＧ１－）Ａｓｎ、（ＭＳＧ２－）Ａｓｎもしくは（ＭＳＧ１－）Ａｓｎ、（ＭＳＧ２－）Ａｓｎの混合物が挙げられる。
　本発明において、特別な記載がない限り、アミノ酸の側鎖において糖鎖と連結した場合の部分構造は、側鎖部分を括弧で表示し、例えば、「（ＳＧ－）Ａｓｎ」のように表記するものとする。
　糖鎖ドナー分子は、化学修飾されていてもよく、例えば、非還元末端が化学修飾されたＳＧＰ、（ＳＧ－）Ａｓｎ、（ＭＳＧ１－）Ａｓｎ、（ＭＳＧ２－）Ａｓｎ、（ＭＳＧ１－）Ａｓｎと（ＭＳＧ２－）Ａｓｎの混合物やＳＧ（１０）－Ｏｘ、ＭＳＧ１（９）－Ｏｘ、ＭＳＧ２（９）－Ｏｘ又はＭＳＧ１（９）－ＯｘとＭＳＧ２（９）－Ｏｘの混合物等を含む。好ましくは、（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］２－ＳＧ（１０））－Ｏｘ、［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ１（９）－Ｏｘ、［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ２（９）－Ｏｘ、又は［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ１（９）－Ｏｘと［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ２（９）－Ｏｘの混合物、あるいは（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］２－ＳＧ－）Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３、（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ１－）Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３、（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ２－）Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３、又は（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ１－）Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３と（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ２－）Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３の混合物（特許文献１、ＷＯ２０１９／０６５９６４）などが挙げられる。
　創薬を目的とした糖鎖リモデリングに用いる場合、ヒトへ適用した際に問題の少ないヒト型糖鎖、又は、ヒト適合型糖鎖を有する糖鎖ドナーを採用することが好ましい。このような糖鎖は、ヒトの体内で抗原性を示さないことが知られている糖鎖であり、Ｎ結合型糖鎖では、ハイマンノース型、混成（ハイブリッド）型、複合（コンプレックス）型などが知られている。これら３つには共通の基本構造がある。ハイマンノース型は、還元末端に近い位置にあるマンノース（βマンノース）から枝分かれした２つの分岐鎖（１－３鎖、１－６鎖）に、複数のマンノースが連続したマンノースリッチ構造を有する糖鎖である。混成型とは、還元末端に近い位置にあるマンノース（βマンノース）から枝分かれした２つの分岐鎖（１－３鎖、１－６鎖）のうち、一方がＧｌｃＮＡｃを有する構造となったものである。複合型とは、還元末端に近い位置にあるマンノース（βマンノース）から枝分かれした２つの分岐鎖（１－３鎖、１－６鎖）にＧｌｃＮＡｃを有する構造となっており、ガラクトースの有無、シアルの有無、さらにこれらの結合異性や位置異性を含む多彩な構造を有するものである。複合型糖鎖は２分岐型、３分岐型、４分岐型が知られている。
　以下に、ハイマンノース型、混成型及び複合型の構造の例を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 ヒト型Ｎ結合糖鎖の種類
　本発明において、「アクセプター分子」とは、非還元末端にＧｌｃＮＡｃを有する糖構造を含む分子であり、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ又はその変異酵素存在下で、糖鎖ドナー分子と反応させることにより、当該非還元末端のＧｌｃＮＡｃの４位に糖鎖ドナー分子のオキサゾリン環又は活性中間体（非特許文献９）が反応し、キトビオース構造を形成することができる。
　アクセプター分子として典型的なものは、モノクローナル抗体に由来する、コアＦｕｃが結合していてもよいコアＧｌｃＮＡｃのみからなるＮ２９７結合糖鎖を有するＩｇＧ又はそのＦｃ断片である。コアＧｌｃＮＡｃには、その由来となる抗体又はその産生方法に応じて、コアＦｕｃが結合していても良く、結合していなくても良い。アクセプター分子の由来としては様々なモノクローナル抗体又は糖鎖含有分子若しくはＦｃ領域含有分子（Ｆｃ、重鎖から可変領域を欠失させた定常領域のみからなるＣＨと軽鎖の定常領域のみからなるＣＬと組み合わせたＣＬＣＨなど）を利用することができるが、好ましくは（Ｆｕｃα１，６）－ＧｌｃＮＡｃ－ＩｇＧ（例えば、図４の（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ１）、（Ｆｕｃα１，６）－ＧｌｃＮＡｃ－Ｆｃ、（Ｆｕｃα１，６）－ＧｌｃＮＡｃ－ＣＬＣＨなどが挙げられる（特許文献１）。
　本発明において、「Ｅｎｄｏ－Ｓｉ」とは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｉｎｉａｅに由来するエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（ＥＮＧａｓｅ：Ｅｎｄｏ－β－Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ）の一種であり、配列番号１に塩基配列を示し、配列番号２にアミノ酸配列を示す。配列番号２のアミノ酸番号３４～９２８（１～３３番目のアミノ酸はシグナル配列を示す。シグナル配列の予測には、ＣＢＳが提供するツールであるＳｉｇｎａｌＰ－５．０を利用した。）のアミノ酸配列において、２４１番目のアミノ酸がＡｓｐであるアミノ酸配列からなる酵素（ＥＣ　３．２．１．９６、ＧＨ１８）である。Ｅｎｄｏ－Ｓｉは、Ｎ結合型糖鎖（例えば、Ｎ２９７結合糖鎖）を特異的に認識し、加水分解活性と糖鎖転移活性を併せ持つ。
　Ｅｎｄｏ－Ｓｉの加水分解活性は上記の基本構造を有するＮ結合型糖鎖のコアキトビオースに含まれるβ１，４グリコシド結合を特異的に加水分解する活性（本明細書において、特に言及が無い限り、「加水分解活性」とは、この活性を意味する。反応模式図を図４に示す。）である。
　Ｅｎｄｏ－Ｓｉの糖鎖転移活性は、Ｎ２９７にコアＧｌｃＮＡｃ（コアフコースが付加していても、付加していなくても良い）のみを有するＦｃ部位を含むアクセプター分子に、上記糖鎖ドナー分子（還元末端が活性化されたＧｌｃＮＡｃ、もしくは還元末端が活性化されていないＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖含有分子）の還元末端をグリコシド結合させる活性（以下、「糖鎖転移活性」という。反応模式図を図５又は図１７に示す。）である。
　Ｅｎｄｏ－Ｓｉの各種抗体に対する基質特異性は、以下のとおりである。ＩｇＧの４つのサブクラス全てに対して糖鎖加水分解活性を示すが、ＩｇＡおよびＩｇＥに対する糖鎖加水分解活性は示さない。また、各種Ｎ結合型糖鎖に対する基質特異性は、以下のとおりである。ハイマンノース型糖鎖及び複合型２分岐糖鎖、いずれに対しても加水分解活性を示すが、ハイマンノース型糖鎖よりも複合型２分岐糖鎖に対する特異性が高く、中でもＧ０糖鎖に対する加水分解活性が最も高い。さらに、シアリル糖鎖やフコシル化糖鎖に対しても加水分解活性を示すが、複合型３分岐糖鎖に対する加水分解活性は示さない。
　なお、Ｇ０糖鎖とは、非還元末端が２つの分岐鎖（１－３鎖、１－６鎖）に結合したＧｌｃＮＡｃであり、ガラクトース残基を持たない２分岐複合型糖鎖をいう。
　本発明の酵素は、上記の特性を有するものであれば、実施例で取得された具体的な配列の酵素に限定されるものではなく、天然から分離された酵素であっても、本発明の酵素の配列情報に基づき人為的に作製又は改変された酵素であっても良い。天然から分離する場合、その分離源とする生物種は特に限定されないが、好ましくは細菌であり、より好ましくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌であり、更に好ましくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｉｎｉａｅに属する細菌である。
　Ｅｎｄｏ－Ｓｉの活性ドメインおよびＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｍｏｄｕｌｅ（ＣＢＭ）は、結晶構造解析が行われているＥｎｄｏＳ（Ｂ．　Ｔｒａｓｔｏｙ　ｅｔ　ａｌ．，　ＰＮＡＳ（２０１４）ｖｏｌ１１１，Ｎｏ．１８，　ｐｐ６７１４－６７１９）との配列比較から、それぞれ、配列番号２のアミノ酸番号１０６～４４７およびアミノ酸番号７６２～８９７の領域であると推察され、この２つが加水分解活性及び／又は転移活性と、抗体との相互作用に重要な部位であると考えられる。従って、本発明の酵素として、配列番号２のアミノ酸番号１０６～４４７及び／又はアミノ酸番号７６２～８９７に記載のアミノ酸配列を含み、好ましくは、配列番号２のアミノ酸番号１０６～８９７に記載のアミノ酸配列を含み、より好ましくは配列番号２のアミノ酸番号１０６～９２８に記載のアミノ酸配列を含み、さらに好ましくは配列番号２のアミノ酸番号３４～９２８に記載のアミノ酸配列を含み、かつ、加水分解活性及び／又は糖鎖転移活性を示すポリペプチドが挙げられる。
＜本発明の変異酵素＞
　本発明は、配列番号２のアミノ酸番号３４～９２８に記載のアミノ酸配列において、２４１番目（Ｄ２４１）、１９０番目（Ｔ１９０）、３１１番目（Ｑ３１１）及び３６０番目（Ｅ３６０）のアミノ酸からなる群より選択される１又は２以上のアミノ酸部位への変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、糖鎖加水分解活性及び／又は糖鎖転移活性を示すことを特徴とする、Ｅｎｄｏ－Ｓｉの変異酵素を提供し、好ましくは実施例６に示されるように、配列番号２のアミノ酸番号３４～９２８に記載のアミノ酸配列において糖鎖転移活性に必要な領域を含有し、且つ、ＩｇＧのＮ２９７結合糖鎖に対する活性として、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　ＷＴ（以下、アミノ酸配列に変異を導入していない野生株を「ＷＴ」という）と比較して加水分解活性が低減され、糖鎖転移活性が向上していることを特徴とする、Ｅｎｄｏ－Ｓｉの変異酵素を提供する。
　本発明のアミノ酸の置換／変異としては、上記特徴を示す置換／変異であり、好ましくは、配列番号２のＴ１９０、Ｄ２４１、Ｑ３１１、Ｅ３６０から選択される少なくとも一つ又は複数のアミノ酸部位の置換／変異であり、より好ましくは、Ｄ２４１Ｑ、Ｄ２４１Ｍ、Ｄ２４１Ａ、Ｔ１９０Ｑ、Ｑ３１１Ｌ、Ｅ３６０Ｑ、Ｅ３６０Ａ、Ｅ３６０Ｎ、又はＥ３６０Ｄであり、さらに好ましくは、Ｄ２４１Ｑ、Ｄ２４１Ｍ、Ｔ１９０Ｑ、Ｑ３１１Ｌ、Ｅ３６０Ｑであり、もっとも好ましくは、Ｄ２４１Ｑ、Ｄ２４１Ｑ／Ｑ３１１Ｌ、Ｄ２４１Ｑ／Ｅ３６０Ｑ、Ｄ２４１Ｍ、Ｄ２４１Ｍ／Ｑ３１１Ｌ、Ｄ２４１Ｍ／Ｅ３６０Ｑ、Ｔ１９０Ｑ／Ｄ２４１Ｑ、Ｔ１９０Ｑ、Ｔ１９０Ｑ／Ｄ２４１Ｍである。なお、上記特性を示す限り、配列番号２のＴ１９０、Ｄ２４１、Ｑ３１１、Ｅ３６０における置換／変異に加え、更なる置換／変異を含んでいても良い。
　エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼは、加水分解活性と糖鎖転移活性を併せ持つ（以下、両方の活性を併せ持つことを「本酵素活性」を有する、という）。そのため、強い加水分解活性を保持する酵素は、糖鎖転移活性によりアクセプター分子（Ｎ２９７結合糖鎖としてコアＧｌｃＮＡｃを有する抗体もしくはそのＦｃ領域含有分子）のコアＧｌｃＮＡｃに転移させた糖鎖をも基質として加水分解し、所望の糖鎖転移体を適切に取得できない場合がある。そのため、糖鎖リモデリング抗体等もしくは糖鎖修飾化合物の合成においては、糖鎖転移活性を向上させた変異酵素が有用である。本発明の変異酵素は、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　ＷＴよりも低減された加水分解活性、及び増強された糖鎖転移活性を併せ持つことを特徴とする。
　変異酵素の糖鎖転移活性は後述の実施例６、または実施例７の方法により評価することができる。
　本発明の変異酵素が有する本酵素活性のうち、糖鎖転移活性は、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　ＷＴの糖鎖転移活性を上回る。すなわち、ｐＨ７～８（例えば、ｐＨ７．５）、糖鎖ドナー（例えば、還元末端が活性化されたＧｌｃＮａｃ（オキサゾリン化されたＧｌｃＮＡｃ等）を含む糖鎖）がアクセプター分子の５～１０等量（例えば、８等量）存在する条件における糖鎖転移率が、反応開始から１～２４もしくは４８時間後までのいずれかの時間点以降において、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　ＷＴを上回る糖鎖転移率を示す。好ましくは、反応開始後２４時間もしくは４８時間までに糖鎖転移率が５０％を超えるものであり、より好ましくは、反応開始後２４時間までに糖鎖転移率が６０％を超えるものであり、さらに好ましくは、反応開始後２４時間までに糖鎖転移率が８０％を超えるものであり、さらにより好ましくは、反応開始後２４時間までに糖鎖転移率が９５％を超えるものである。
　本発明の変異酵素が有する糖鎖転移活性の別の態様として、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　ＷＴの糖鎖転移活性を上回る態様が挙げられる。すなわち、ｐＨ７～８（例えば、ｐＨ７．５）、還元末端が活性化されていないＧｌｃＮａｃを含む糖鎖ドナーがアクセプター分子の１０～１００等量（例えば、５０等量）存在する条件における糖鎖転移率が、反応開始から１～４８時間後までのいずれかの時間点以降において、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　ＷＴの糖鎖転移率と同等かそれ以上の糖鎖転移率を示す。好ましくは、反応開始後２４時間もしくは４８時間までに糖鎖転移率が５０％を超えるものであり、より好ましくは、反応開始後４８時間までに糖鎖転移率が６０％を超えるものであり、さらに好ましくは、反応開始後４８時間までに糖鎖転移率が８０％を超えるものであり、さらにより好ましくは、反応開始後４８時間までに糖鎖転移率が９０％を超えるものである。
　本発明の変異酵素は、配列番号２のアミノ酸番号３４～９２８のアミノ酸配列において、Ｄ２４１、Ｔ１９０、Ｑ３１１及びＥ３６０からなる群より選択される１又は２以上（好ましくは、１～３個、より好ましくは１もしくは２個）のアミノ酸部位への変異を有し、かつ、Ｅｎｄｏ－Ｓｉの糖鎖転移活性に重要な領域を保持していれば、その全長配列である必要はない。ＥｎｄｏＳのドメイン解析から、触媒ドメイン（配列番号２のアミノ酸番号１０６～４４７）、及び／又は、ＣＢＭ（配列番号２のアミノ酸番号７６２～８９７）が重要であることが知られており、これらを含む限り、本発明の変異酵素として使用できる。
　本発明の変異酵素は、上記「本発明のアミノ酸の置換／変異」に記載した変異を含むポリペプチドであり、具体的には、配列番号３（Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｄ２４１Ｑ）、配列番号４（Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｄ２４１Ｑ／Ｑ３１１Ｌ）、配列番号５（Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｄ２４１Ｑ／Ｅ３６０Ｑ）、配列番号６（Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｄ２４１Ｍ）、配列番号７（Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｄ２４１Ｍ／Ｑ３１１Ｌ）、配列番号８（Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｄ２４１Ｍ／Ｅ３６０Ｑ）、配列番号９（Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｔ１９０Ｑ／Ｄ２４１Ｑ）、配列番号１０（Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｔ１９０Ｑ）及び配列番号１１（Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　Ｔ１９０Ｑ／Ｄ２４１Ｍ）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。
　本発明の変異酵素のアミノ酸配列において、本酵素活性に影響しない範囲で、必須変異（Ｄ２４１、Ｔ１９０、Ｑ３１１又はＥ３６０）以外の部位で、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は、付加していてもよい。このようなアミノ酸変異の部位としては、本酵素活性に影響しない限り、全部位を選択しても良いが、好ましくは、２４１番目、１９０番目、３１１番目、又は、３６０番目以外のアミノ酸、より好ましくは触媒ドメイン（配列番号２のアミノ酸番号１０６～４４７）、及び、ＣＢＭ（配列番号２のアミノ酸番号７６２～８９７）以外の部位であり、更に好ましくは、配列番号２のアミノ酸番号３４～１０５又はアミノ酸番号８９８～９２８の領域に含まれる部位である。
　本発明において、数個とは、３０個もしくは２０個以下であり、好ましくは１０個以下であり、さらに好ましくは５個以下であり、最も好ましくは４個、３個、２個又は１個である。
　本発明において、変異による置換後のアミノ酸は、最終的に得られる変異酵素が本酵素活性を有する限り特に限定されるものではなく、天然に存在するアミノ酸、人工的に合成されたアミノ酸、それらの修飾アミノ酸等、様々なアミノ酸を採用することができるが、好ましくは天然に存在するアミノ酸であり、より好ましくは天然に存在するＬ－アミノ酸であり、さらに好ましくは必須アミノ酸である。
　本発明の変異酵素のアミノ酸配列において、本酵素活性に影響しない範囲で、必須変異（Ｄ２４１、Ｔ１９０、Ｑ３１１又はＥ３６０）のアミノ酸以外のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％以上の相同性もしくは同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
　二種類のアミノ酸配列間の同一性あるいは相同性は、二種類のアミノ酸配列間の同一性あるいは相同性は、Ｂｌａｓｔ　ａｌｇｏｒｉｔｈｍ　ｖｅｒｓｉｏｎ　２．２．２Ｂｌａｓｔ　ａｌｇｏｒｉｔｈｍ　ｖｅｒｓｉｏｎ　２．２．２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，　ＳＦ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１９９７，　２５，　３３８９－３４０２）のデフォルトパラメーターを使用することによって決定することができる。Ｂｌａｓｔ　ａｌｇｏｒｉｔｈｍは、例えば、インターネットでｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／にアクセスすることによっても使用することができる。
＜遺伝子、宿主細胞、酵素産生方法＞
　本発明は、さらに上記のＥｎｄｏ－Ｓｉ（配列番号１）またはＥｎｄｏ－Ｓｉ変異酵素をコードする組み換え遺伝子、当該組み換え遺伝子を含むプラスミドや発現ベクター等の遺伝子構築物、当該遺伝子構築物により形質転換された宿主細胞、当該宿主細胞の培養物から本発明のＥｎｄｏ－ＳｉまたはＥｎｄｏ－Ｓｉ変異酵素を回収する工程を含む、本発明の酵素の製造方法などを提供する。これらの組み換え遺伝子、遺伝子構築物、宿主細胞等は、本発明の変異酵素のアミノ酸配列に基づき、公知の遺伝子工学的手法に従って作製することができる。大腸菌用のＥｎｄｏ－Ｓｉの塩基配列を配列番号１６に示す。
　本発明の酵素をコードする遺伝子の導入により形質転換された宿主細胞（動物細胞、植物細胞、大腸菌、酵母など、タンパク質産生に通常用いられる細胞等を適宜選択できる）は、細胞の種類に応じて適切な条件下で培養され、その培養物から本発明の酵素を回収することができる。酵素の回収は、当該酵素の物性を利用して、通常の精製手法を適宜組み合わせて行うが、簡便に回収するために、予めＨｉｓタグ、ＧＳＴタグ等のタグペプチドを酵素に連結させた形で発現させるように、遺伝子構築物を設計しておくことにより、当該タグペプチドの親和性を利用した回収を行うことができる。タグペプチドは、精製後に除去してもよいが、酵素活性に影響ない場合は、タグペプチドを連結させたままの酵素を、糖鎖リモデリング等の反応に使用してもよい。本発明の酵素には、このようなタグペプチドが連結したアミノ酸配列を有する酵素を含む。
＜糖鎖リモデリング＞
　本発明は、本発明のＥｎｄｏ－ＳｉまたはＥｎｄｏ－Ｓｉ変異酵素を使用した、糖タンパク質の糖鎖の糖鎖リモデリング方法、及び、当該糖鎖リモデリングにより製造された実質的に均一な構造からなる糖鎖を有する糖タンパク質を提供する。また、当該糖鎖リモデリングにより実質的に均一な構造からなる糖鎖を有する糖タンパク質を製造する方法を提供する。
　本発明の一実施態様は、本発明のＥｎｄｏ－ＳｉまたはＥｎｄｏ－Ｓｉ変異酵素を使用した、抗体又はそのＦｃ領域含有分子におけるＮ２９７結合を含むＮ結合型糖鎖の糖鎖リモデリング方法、及び、当該糖鎖リモデリングにより製造された実質的に均一な構造からなるＮ２９７結合を含むＮ結合型糖鎖を有する糖たんぱく質、好ましくは抗体又はＦｃ領域含有分子、を提供する。また、当該糖鎖リモデリングにより実質的に均一な構造からなるＮ２９７結合を含むＮ結合型糖鎖を有する糖たんぱく質、好ましくは抗体又はＦｃ領域含有分子を製造する方法を提供する。抗体は好ましくはＩｇＧである。以下、ＩｇＧについて説明する。なお、本発明において糖タンパク質とは、動植物の組織、真核微生物の細胞膜や細胞壁などに存在する、タンパク質のアミノ酸配列中に、Ｏ結合型糖鎖、または、Ｎ結合型糖鎖が少なくとも一つ以上結合しているタンパク質であり、天然由来であっても、合成したものでも良く、例えば、モノクローナル抗体のＩｇＧ又はＩｇＧのＦｃ断片や定常領域のみからなるＣＬＣＨ（特許文献１、ＷＯ２０１８／００３９８３）等のＦｃ領域含有分子等をいう。
　「糖鎖リモデリング」とは、まず、特定の糖タンパク質、例えば、モノクローナル抗体のＩｇＧ又はＩｇＧのＦｃ断片や定常領域のみからなるＣＬＣＨ等のＦｃ領域含有分子のＮ２９７結合糖鎖をコアＧｌｃＮＡｃ（コアフコースが付加していてもよい）を残して切除したアクセプター分子を作製し、次いで、当該アクセプター分子のコアＧｌｃＮＡｃに対して、本発明のＥｎｄｏ－Ｓｉ変異酵素の糖鎖転移活性を利用して、糖鎖ドナーに由来する糖鎖を転移させることにより、Ｎ２９７結合糖鎖が糖鎖ドナーに由来する均一な糖鎖構造であるＩｇＧ又はそのＦｃ領域含有分子を製造する方法を意味する。
　糖鎖リモデリングに用いられるＩｇＧ又はＦｃ領域含有分子は、好ましくは同一のアミノ酸配列からなるＩｇＧ重鎖に由来し、Ｎ２９７結合糖鎖を有する形で産生されたものであればよい。その産生方法は限定されるものではなく、通常知られたモノクローナル抗体の生産方法により産生されたＩｇＧ、ＩｇＧのＣＬＣＨ、又は、それを酵素処理して得られたＦｃ断片などを利用することができる。また、このようなＩｇＧ又はＦｃ断片は、異なる生産方法や異なるロットで得られたサンプルの混合物を採用してもよい。
　糖鎖リモデリングに用いるアクセプター分子の調製方法としては、上述のＩｇＧ又はＦｃ領域含有分子を、Ｎ２９７結合糖鎖のコアキトビオース構造におけるＧｌｃＮＡｃ間の１，４－グリコシド結合（ＧｌｃＮＡｃβ１－４ＧｌｃＮＡｃ）を特異的に加水分解する活性を保持したＥＮＧａｓｅで処理することにより調製することができる。この場合、ＥＮＧａｓｅとしては、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　ＷＴ、Ｅｎｄｏ－Ａ、Ｅｎｄｏ－Ｄ、Ｅｎｄｏ－Ｅ、Ｅｎｄｏ－Ｆ３、Ｅｎｄｏ－Ｈ、ＥｎｄｏＳ、ＥｎｄｏＳ２をはじめ様々なものを採用することができる。
　糖鎖リモデリングに用いる糖鎖ドナー分子としては、様々な糖鎖構造のものを採用することができるが、リモデリング後の抗体を抗体医薬とすることを目的とした場合、ヒトが保有する糖鎖構造と類似した、又は、同一の、ヒト型糖鎖、又は、ヒト適合型糖鎖構造を有する糖鎖ドナーを採用することが好ましい。
　このような糖鎖ドナー分子の代表的なものとして、上記のＮ結合型糖鎖の基本構造において、コアＧｌｃＮＡｃが除かれ、還元末端から２番目のＧｌｃＮＡｃが活性化された分子を挙げることができる。例えば、ＳＧ（１０）－Ｏｘや（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］２－ＳＧ（１０））－Ｏｘ、［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ１（９）－Ｏｘ、［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ２（９）－Ｏｘ、又は［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ１（９）－Ｏｘと［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ２（９）－Ｏｘの混合物が挙げられる（ＷＯ２０１９／０６５９６４）。
　糖鎖ドナー分子の他の態様として、還元末端から２番目のＧｌｃＮＡｃが活性化されていない分子を挙げることができる。例えば、（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］２－ＳＧ－）Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３、（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ１－）Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３、（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ２－）Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３、又は（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ１－）Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３と（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ２－）Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３の混合物（特許文献１、ＷＯ２０１９／０６５９６４）が挙げられる。
　この際、糖鎖ドナー分子の複合型糖鎖を基質とするがＮ２９７結合糖鎖を基質としないエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（酵素Ａ）と本発明のＥｎｄｏ－ＳｉまたはＥｎｄｏ－Ｓｉ変異酵素、好ましくはＥｎｄｏ－Ｓｉ変異酵素を共存させることで、ドナー分子の糖鎖をアクセプター分子である糖鎖を切断したＩｇＧ又はＦｃ領域含有分子のコアＧｌｃＮＡｃ残基に結合させる。ここで用いる酵素Ａが糖鎖ドナーであるＳＧＰからＧｌｃＮＡｃを有するアクセプターへの糖鎖転移活性を持つ場合に、酵素Ａはワンポット法において高い糖鎖転移効率を示す。すなわち、酵素Ａとしては、還元末端が活性化されていない糖鎖ドナー分子の複合型糖鎖を基質とするがＮ２９７結合糖鎖を基質としないエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼの中から、ＧｌｃＮＡｃを有するアクセプターへの糖鎖転移活性を指標として、選択することができる。Ｎ２９７結合糖鎖を基質としないエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼとしては、Ｅｎｄｏ－Ｍ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ、Ｅｎｄｏ－Ｏｍ、Ｅｎｄｏ－ＣＣ、又はそれらの加水分解活性を低下させた変異酵素が挙げられる。加水分解活性を低下させた変異酵素としては、公知のＥｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｑ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｈ（特許文献３）、Ｅｎｄｏ－Ｍ　Ｎ１７５Ｑ（Ｕｍｅｋａｗａ　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．　２０１０，　２８５，　５１１－５２１）、Ｅｎｄｏ－ＣＣ　Ｎ１８０Ｈ又はＥｎｄｏ－Ｏｍ　Ｎ１９４Ｑ（Ｃｈｉｂａ　Ｙ．　Ｋａｇａｋｕ　ｔｏ　Ｓｅｉｂｕｔｓｕ　２０１５，　５３，　２３６－２４４）等が挙げられる。好ましくは、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｑ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｈ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ａ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｃ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｄ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｅ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｇ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｉ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｌ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｍ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｐ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｓ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｔ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｖが挙げられる。また、２つのアミノ酸が置換された変異酵素として、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｗ２７８Ｆ／Ｓ２１６Ｖ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｗ２７８Ｆ／Ｎ２４６Ｄ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｗ２７８Ｆ／Ｄ２７６Ｎ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｗ２７８Ｆ／Ａ３１０Ｄが挙げられる。さらに、３つのアミノ酸が置換された変異酵素として、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｗ２７８Ｆ／Ｎ１７２Ｄ／Ｆ３０７Ｙ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｗ２７８Ｆ／Ｎ１７２Ｄ／Ｆ３０７Ｈ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｗ２７８Ｆ／Ｎ１７２Ｄ／Ａ３１０Ｄ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｗ２１４Ｆ／Ｆ３０７Ｙ／Ｌ３０６Ｉが挙げられる。
　Ｅｎｄｏ－Ｒｐの変異酵素のアミノ酸配列を配列番号１７～４３に、Ｅｎｄｏ－Ｍのアミノ酸配列を配列番号４４に、Ｅｎｄｏ－Ｏｍのアミノ酸配列を配列番号４５に、Ｅｎｄｏ－ＣＣのアミノ酸配列を配列番号４６に示す。
　本発明のＥｎｄｏ－Ｓｉ変異酵素と酵素Ａとの組合せとしては、例えば、表１及び表２の組合せが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000015
　糖鎖リモデリングにより実質的に均一な構造からなる糖鎖を有する糖タンパク質を製造する観点から、好ましくは本発明のＥｎｄｏ－Ｓｉ変異酵素と酵素Ａとの組合せとしては表３の組合せが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　本発明の糖鎖転移活性を示すポリペプチド及び還元末端が活性化されていない糖鎖ドナー分子の複合型糖鎖を基質とするがＮ２９７結合糖鎖を基質としないエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（酵素Ａ）の存在下で、Ｎ２９７結合糖鎖としてフコースが付加していてもよいコアＧｌｃＮＡｃを有する抗体若しくはそのＦｃ領域含有分子であるアクセプター分子を、還元末端が活性化されていない糖鎖を含む糖鎖ドナー分子と反応させればよい（図１７）。
　糖鎖リモデリングにおけるアクセプター分子調製のための加水分解反応の反応条件は他の酵素において知られている条件に準じて適宜選択することができ、また酵素活性、抗体の性質、精製工程における回収率、作業時間等も考慮し選択することができる。反応は緩衝液中で行うが、クエン酸緩衝液（ｐＨ３．５～５．５）、酢酸緩衝液（ｐＨ４．５～６．０）、リン酸緩衝液（ｐＨ６．０～７．５）、ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５～８．０）、トリス塩酸（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）緩衝液（ｐＨ７．０～９．０）など通常の酵素反応で用いられる緩衝液から適宜選ぶことが可能である。好ましくは、リン酸緩衝液（ｐＨ６．０～７．５）、またはトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０～９．０）である。反応液には、酵素を安定化させる目的で、酵素反応を阻害しない添加剤を加えてもよいが、加えなくてもよい。
　反応温度は、４℃から５０℃の間で、適宜選択できるが、好ましくは、１５℃～４５℃であり、より好ましくは１８℃～４０℃であり、より好ましくは２０℃～３５℃である。
　また、Ｅｎｄｏ－Ｓｉの加水分解反応の反応ｐＨは、ｐＨ５．８～９．５の間で、適宜選択できるが、好ましくは、ｐＨ６．２～ｐＨ８．０、より好ましくはｐＨ６．５からｐＨ７．５である。
　反応時間は、１０分から９６時間の間で、適宜選択できるが、好ましくは、０．５時間～８０時間であり、より好ましくは、１時間～６０時間、より好ましくは８時間～４８時間、より好ましくは１２～２４時間であり、反応液の少量を経時的に採取し、加水分解の進行度を確認しながら反応の終了を判断してもよい。一般に、糖鎖加水分解反応の進行度は、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）、全自動電気泳動システム、あるいは液体クロマトグラフィ質量分析（ＬＣ－ＭＳ）などによりモニタリングすることができる。本特許では、市販抗体あるいは糖鎖リモデリング抗体を重鎖と軽鎖にフラグメント化した後、全自動電気泳動システムを用いて、Ｎ２９７結合糖鎖が付加している重鎖側のみ保持時間が変化することで確認した。
　糖鎖リモデリングにおいて還元末端が活性化されたＧｌｃＮＡｃを糖鎖ドナー（オキサゾリン化されたＧｌｃＮＡｃ等）もしくは活性化されていないＧｌｃＮＡｃを糖鎖ドナーとして用いる糖鎖転移反応の反応条件は、他の酵素において知られている条件に準じて適宜選択することができる（特許文献１、ＷＯ２０１９／０６５９６４等）。
　反応は、緩衝液中で行うが、還元末端が活性化された、もしくは活性化されていないＧｌｃＮＡｃを糖鎖ドナーの分解を促進しないものが望ましく、リン酸緩衝液（ｐＨ６．０～７．５）、ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５～８．０）、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０～９．０）などから適宜選ぶことが可能である。好ましくは、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０～９．０）である。酵素を安定化させる目的で、反応液中に酵素反応を阻害しない添加剤を加えてもよいが、加えなくてもよい。
　反応温度は、４℃から５０℃の間で、適宜選択できるが、１５℃～４５℃であり、より好ましくは２０℃～４０℃であり、より好ましくは２５℃～４０℃である。
　また、Ｅｎｄｏ－Ｓｉの加水分解反応の反応ｐＨは、ｐＨ５．８～９．５の間で、適宜選択できるが、好ましくは、ｐＨ６．２～ｐＨ８．０、より好ましくはｐＨ６．５からｐＨ７．５である。
　反応時間は、１０分から９６時間の間で、適宜選択できるが、好ましくは、０．５時間～８０時間であり、より好ましくは、２時間～７０時間、より好ましくは１２時間～６０時間、より好ましくは１６～４８時間であり、より好ましくは１６～２８時間であり、反応液の少量を経時的に採取し、糖鎖転移反応の進行度を確認しながら反応の終了を判断してもよい。一般に、糖鎖転移反応の進行度は、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）、全自動電気泳動システム、あるいは液体クロマトグラフィ質量分析（ＬＣ－ＭＳ）などによりモニタリングすることができる。本特許では、市販抗体あるいは糖鎖リモデリング抗体を重鎖と軽鎖にフラグメント化した後、全自動電気泳動システムを用いて、Ｎ２９７結合糖鎖が付加している重鎖側のみ保持時間が変化することで確認した。
　また、糖鎖リモデリングを、Ｎ２９７結合糖鎖のコアキトビオース構造におけるＧｌｃＮＡｃ間の１，４－グリコシド結合（ＧｌｃＮＡｃβ１－４ＧｌｃＮＡｃ）を特異的に加水分解する活性を保持したＥＮＧａｓｅ及び上記の酵素Ａの両方を用いて、糖鎖ドナー分子の糖鎖をアクセプター分子であるＮ２９７結合糖鎖としてフコースが付加していてもよいコアＧｌｃＮＡｃを有する抗体若しくはそのＦｃ領域含有分子に直接転移するワンポット法で行うこともできる。Ｎ２９７結合糖鎖のコアキトビオース構造におけるＧｌｃＮＡｃ間の１，４－グリコシド結合（ＧｌｃＮＡｃβ１－４ＧｌｃＮＡｃ）を特異的に加水分解する活性を保持したＥＮＧａｓｅとしては、上記のＥｎｄｏ－Ｓｉの変異酵素が好ましく、酵素Ａとしては、上記の加水分解活性を低下させたＥｎｄｏ－Ｒｐの変異酵素が好ましい。ワンポット法において、糖鎖ドナー分子として、例えば、非還元末端が化学修飾されたＳＧＰ、（ＳＧ－）Ａｓｎ、（ＭＳＧ１－）Ａｓｎ、（ＭＳＧ２－）Ａｓｎ、（ＭＳＧ１－）Ａｓｎと（ＭＳＧ２－）Ａｓｎの混合物やＳＧ（１０）－Ｏｘ、ＭＳＧ１（９）－Ｏｘ、ＭＳＧ２（９）－Ｏｘ又はＭＳＧ１（９）－ＯｘとＭＳＧ２（９）－Ｏｘの混合物等を含む。好ましくは、（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］２－ＳＧ（１０））－Ｏｘ、［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ１（９）－Ｏｘ、［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ２（９）－Ｏｘ、又は［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ１（９）－Ｏｘと［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ２（９）－Ｏｘの混合物、あるいは（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］２－ＳＧ－）Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３、（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ１－）Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３、（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ２－）Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３、又は（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ１－）Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３と（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ２－）Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３の混合物（特許文献１、ＷＯ２０１９／０６５９６４）等を用いることができる。
　糖鎖リモデリング方法で製造された糖タンパク質（抗体又はＦｃ領域含有分子）は更に化学的に若しくは生化学的に修飾することができる。例えば、アジド基（Ｎ３－）は、（ヘテロ）シクロアルキニル基（例えば、ＤＢＣＯ（Ｄｉｂｅｎｚｏｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｅ）等）等のアルキン構造と反応させることにより、１，２，３－トリアゾール環を形成する（ＳＰＡＡＣ（ｓｔｒａｉｎ－ｐｒｏｍｏｔｅｄ　ａｌｋｙｎｅ　ａｚｉｄｅ　ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ：Ａｇａｒｄ　ＮＪ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ　Ａｍ　Ｃｈｅｍ　Ｓｏｃ．　２００４，　１２６，　４６，　１５０４６-１５０４７））。従って、上記アジド基（Ｎ３－）を有するドナー分子を用いて得られた糖鎖リモデリング抗体を、（ヘテロ）シクロアルキニル基を有し、かつ、所望の活性を有する分子（薬学的に活性な化合物（例えば、化学療法剤、分子標的薬、免疫活性化剤（例えば、ＳＴＩＮＧアゴニスト（ＷＯ２０２０／０５０４０６、ＷＯ２０１４／０９９８２４、ＷＯ２０１４／１７９３３５、ＷＯ２０１４／１８９８０５、ＷＯ２０１４／１８９８０６、ＷＯ２０１５／０７４１４５、ＷＯ２０１５／１８５５６５、ＷＯ２０１６／０９６７１４、ＷＯ２０１６／０１２３０５、ＷＯ２０１６／１４５１０２、ＷＯ２０１７／０２７６４６、ＷＯ２０１７／０２７６４５、ＷＯ２０１７／０７５４７７、ＷＯ２０１７／０９３９３３、ＷＯ２０１７／１００３０５、ＷＯ２０１７／１２３６６９、ＷＯ２０１７／１６１３４９、ＷＯ２０１７／１７５１４７、ＷＯ２０１７／１７５１５６、ＷＯ２０１８／００９４６６、ＷＯ２０１８／０４５２０４、ＷＯ２０１８／０６０３２３、ＷＯ２０１８／０６７４２３、ＷＯ２０１８／０６５３６０、ＷＯ２０１４／０９３９３６、ＷＯ２０１８／００９６４８、ＷＯ２０１８／１００５５８）、ＴＬＲアゴニスト、Ａ２ＡＲアンタゴニスト、ＩＤＯ阻害剤、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３及びＰＤ－１経路のアンタゴニスト、チェックポイント阻害剤、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体阻害剤、スムーズン（ｓｍｏｏｔｈｅｎ）阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、レチノイド及び抗がんワクチン、アジュバント、脂質、リポソーム、毒素、抗菌剤、抗ウイルス剤、診断用薬剤、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、抗原、ビタミン、ホルモン等））と反応させることで、更に修飾された所望の活性を有する抗体（例えば、抗体－薬物コンジュゲート等）を得ることができる。化学療法剤若しくは毒素として、カンプトテシン（例えば、ＷＯ２０１４／０５７６８７）、ピロロベンゾジアゼピン（例えば、ＷＯ２０１３／１７３４９６、ＷＯ２０１４／１３０８７９、ＷＯ２０１７／００４３３０、ＷＯ２０１７／００４０２５、ＷＯ２０１７／０２０９７２、ＷＯ２０１６／０３６８０４、ＷＯ２０１５／０９５１２４、ＷＯ２０１５／０５２３２２、ＷＯ２０１５／０５２５３４、ＷＯ２０１６／０１１５１９、ＷＯ２０１５／０５２３２１、ＷＯ２０１５／０３１６９３、ＷＯ２０１１／１３０６１３、ＷＯ２０１９／０６５９６４）、ドキソルビシン、オーリスタチン、タキサンもしくはその誘導体を挙げることができる。
　上記アジド基（Ｎ３－）を有するドナー分子として、例えば、ＷＯ２０２０／０５０４０６やＷＯ２０１９／０６５９６４に記載の薬物リンカーを挙げることができる。例えば、Ｎ－［４－（１１，１２－ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－４－オキソブタノイル］グリシルグリシル－Ｌ－バリル－Ｎ－｛４－［（｛［（１１’Ｓ，１１ａ’Ｓ）－１１’－ヒドロキシ－７’－メトキシ－８’－［（５－｛［（１１ａＳ）－７－メトキシ－２－（４－メトキシフェニル）－５－オキソ－５，１０，１１，１１ａ－テトラヒドロ－１Ｈ－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン－８－イル］オキシ｝ペンチル）オキシ］－５’－オキソ－１１’，１１ａ’－ジヒドロ－１’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－１０’（５’Ｈ）－イル］カルボニル｝オキシ）メチル］フェニル｝－Ｌ－アラニンアミド、
Ｎ－［４－（１１，１２－ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－４－オキソブタノイル］グリシルグリシル－Ｌ－バリル－Ｎ－［４－（｛［（１１’Ｓ，１１’ａＳ）－１１’－ヒドロキシ－７’－メトキシ－８’－（３－｛［（１１ａＳ）－７－メトキシ－２－（４－メトキシフェニル）－５－オキソ－５，１０，１１，１１ａ－テトラヒドロ－１Ｈ－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン－８－イル］オキシ｝プロポキシ）－５’－オキソ－１１’，１１’ａ－ジヒドロ－１’Ｈ，３’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－１０’（５’Ｈ）－カルボニル］オキシ｝メチル）フェニル］－Ｌ－アラニンアミド、Ｎ－［４－（１１，１２－ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－４－オキソブタノイル］グリシルグリシル－Ｌ－バリル－Ｎ－｛４－［（｛［（１１’Ｓ，１１ａ’Ｓ）－１１’－ヒドロキシ－７’－メトキシ－８’－［（５－｛［（１１ａ’Ｓ）－７’－メトキシ－５’－オキソ－５’，１１ａ’－ジヒドロ－１’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－８’－イル］オキシ｝ペンチル）オキシ］－５’－オキソ－１１’，１１ａ’－ジヒドロ－１’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－１０’（５’Ｈ）－イル］カルボニル｝オキシ）メチル］フェニル｝－Ｌ－アラニンアミド、Ｎ－［４－（１１，１２－ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－４－オキソブタノイル］グリシルグリシル－Ｌ－バリル－Ｎ－｛４－［（｛［（１１’Ｓ，１１ａ’Ｓ）－１１’－ヒドロキシ－７’－メトキシ－８’－［（５－｛［（１１ａ’Ｓ）－７’－メトキシ－５’－オキソ－５’，１０’，１１’，１１ａ’－テトラヒドロ－１’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－８’－イル］オキシ｝ペンチル）オキシ］－５’－オキソ－１１’，１１ａ’－ジヒドロ－１’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－１０’（５’Ｈ）－イル］カルボニル｝オキシ）メチル］フェニル｝－Ｌ－アラニンアミド、（ビス（Ｎ，Ｎ－ジエチルエタンアミニウム）　Ｎ－［４－（１１，１２－ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－４－オキソブタノイル］グリシルグリシル－Ｌ－フェニルアラニル－Ｎ－［（２－｛９－［（５Ｒ，７Ｒ，８Ｒ，１２ａＲ，１４Ｒ，１５Ｒ，１５ａＲ，１６Ｒ）－１５－フルオロ－１６－ヒドロキシ－２，１０－ジオキソ－２，１０－ジスルフィド－１４－（６，７，８，９－テトラヒドロ－２Ｈ－２，３，５，６－テトラアザベンゾ［ｃｄ］アズレン－２－イル）オクタヒドロ－２Ｈ，１０Ｈ，１２Ｈ－５，８－メタノ－２λ５，１０λ５－フロ［３，２－ｌ］［１，３，６，９，１１，２，１０］ペンタオキサジホスファシクロテトラデシン－７－イル］－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－１－イル｝エトキシ）メチル］グリシンアミドを挙げることができる。
　以下、実施例を用いて、本発明を具体的に説明する。実施例に示されたものは、本発明の実施形態の一例であり、本発明はこれに限定されるものではない。
　本明細書に記載されているタンパク質濃度は、超微量分光光度計ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）あるいはＮａｎｏＤｒｏｐ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を用いて定量した。
　実施例中の［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ１（９）－Ｏｘは、図１の化合物を示す。ＳＧＰは、図２の化合物を示す。ｍＡｂ１は、市販のＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（中外製薬から購入）を示す。（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ１は、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂの糖鎖加水分解体を示す。ｍＡｂ２は、ＷＯ２０１９０６５９６４の実施例１３６に記載された方法で作製した抗体を示す。ｍＡｂ２の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列を配列番号１２及び配列番号１３に示した。（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ２は、ＷＯ２０１９／０６５９６４の実施例６１－工程１に記載された方法で作製した糖鎖加水分解体（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－抗ＣＬＤＮ６抗体（Ｈ１Ｌ１）を示す。
　糖鎖加水分解、及び糖鎖転移反応の進行具合をタンパク質のゲル電気泳動法を用いて確認した(特許文献４、非特許文献８)。タンパク質の全自動電気泳動システムとして、装置にはＬａｂＣｈｉｐ　ＧＸ　II（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ製）、試薬はＰｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　ＬａｂＣｈｉｐおよびＰｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ製）を用いた。
＜実施例１＞　Ｓ．　ｉｎｉａｅ由来エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼの取得
　以下の方法により、Ｓ．　ｉｎｉａｅ　ＳＩＯ１００２株からエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼの遺伝子配列を取得した。
　まず、Ｓ．　ｉｎｉａｅ　ＳＩＯ１００２株ホルマリン不活化菌体（日本株、共立製薬株式会社より購入）より、ゲノムＤＮＡを取得した。０．１％（ｗ／ｖ）ホルマリン溶液１　ｍＬを遠心（６，０００ｒｐｍ、１０　ｍｉｎ、４℃）し、沈殿を滅菌水１　ｍＬで洗浄した。再度同条件で遠心し、沈殿をＩｎｓｔａＧｅｎｅ　ＤＮＡ　精製マトリックス（Ｂｉｏ－Ｒａｄ製）２００　μＬに懸濁した。この懸濁液を５６℃で３０分、その後９９℃で８分間、熱処理し、遠心（１２，０００ｒｐｍ、１０　ｍｉｎ、４℃）し、得られた上清をＤＮＡ抽出液として使用した。
　ＤＮＡ抽出液を鋳型に、プライマー１（配列番号１４）およびプライマー２（配列番号１５）、およびＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ製）を用いてエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼをコードする遺伝子を増幅し、配列を解析した。この遺伝子は終止コドンを含めて２７８７塩基（配列番号１）からなり、９２８アミノ酸残基（配列番号２）からなる分子量１０４，６４４のタンパク質をコードしており、このタンパク質をＥｎｄｏ－Ｓｉと命名した。
＜実施例２＞　大腸菌を用いたＥｎｄｏ－Ｓｉの発現
　実施例１で得たエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子を元にＣ末端に６×Ｈｉｓタグ付加した大腸菌の異種発現用に最適化した核酸配列（配列番号１６）を設計し、ユーロフィンジェノミクス社で人工合成遺伝子を作製した。これをｐＥＴ２４ｂ（＋）ベクターにクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。形質転換後の菌液を１２　ｍＬコニカルチューブ中の２　ｍＬ　ＬＢ培地（１％（ｗ／ｖ）　Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．５％（ｗ／ｖ）　Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ、０．５％（ｗ／ｖ）　ＮａＣｌ、５０　μｇ／ｍＬ　Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）に接種し、３７℃で一晩振とう培養を行った（６００　ｒｐｍ，　Ｏ／Ｎ）。この前培養液１．２　ｍＬを５００　ｍＬバッフル付きフラスコ中の１００　ｍＬ　ＴＢ培地（１．２％（ｗ／ｖ）　Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、２．４％（ｗ／ｖ）　Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ、０．９４％（ｗ／ｖ）　Ｋ２ＨＰＯ４、０．２２％（ｗ／ｖ）　ＫＨ２ＰＯ４、５０　μｇ／ｍＬ　Ｋａｎａｍｙｃｉｎ、０．０１％（ｗ／ｖ）　ａｎｔｉｆｏａｍ　２０４、２　ｍＭ　ＭｇＳＯ４）に植菌し、３７℃で振とう培養を開始した（２１０　ｒｐｍ）。３７℃で１．５時間培養した後にインキュベーターの温度を１６℃に下げて１時間培養を継続した。培養液の温度が１６℃に下がったことを確認した後に、終濃度０．２　ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、引き続き２４時間培養した。培養終了後に遠心分離により集菌した。
　集菌した菌体を５　ｍＬのｂｉｎｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ（５０　ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ　８．０）、０．５　Ｍ　ＮａＣｌ、２０　ｍＭ　Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、５％（ｗ／ｖ）　Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）に懸濁し、超音波破砕と遠心分離を行った上清を、Ｎｉ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア製）で精製した。収量（Ａ２８０、吸光係数換算）は８．４３　ｍｇ／１００　ｍＬ　ｂｒｏｔｈであった。
＜実施例３＞　Ｅｎｄｏ－Ｓｉの抗体糖鎖に対する加水分解活性
　実施例２で取得した酵素について、以下の方法により加水分解活性を測定した。この際、ＥｎｄｏＳを比較対象に用いた。
　ｍＡｂ１　６０ｍｇを滅菌水５ｍＬに溶解し、ビバスピン２０（３０，０００ＭＷＣＯ、ＰＥＳ、ザルトリウス製）で濃縮しながら５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に置換した。
　このｍＡｂ１　０．１　ｍｇ、および１０　ｎｇの酵素を含む反応液（総容量　５０　μＬ）を調製し、３７℃でインキュベートした。反応０．５時間、１時間、および２時間の反応液をサンプリングし、上述のタンパク質の全自動電気泳動システムで分析した。得られたクロマトグラムより、未反応物と加水分解体が分離したピークとして確認される。未反応物と加水分解体のピーク面積比から糖鎖加水分解率を、以下の算出式により算出した。
　糖鎖加水分解率（％）＝〔［（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ１由来のＨ　鎖のピーク面積］　／｛［ｍＡｂ１由来のＨ鎖ピーク面積］＋　［（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ１由来のＨ鎖のピーク面積］｝〕×１００
　反応収率の経時変化を図３に示す。０．５時間後の糖鎖加水分解率はＥｎｄｏ－Ｓｉが５７．４％、ＥｎｄｏＳが４１．８％であり、Ｅｎｄｏ－ＳｉはＥｎｄｏＳよりも強い加水分解活性を示した。
＜実施例４＞Ｅｎｄｏ－Ｓｉの反応条件の検討
　Ｅｎｄｏ－Ｓｉの反応温度およびｐＨを検討した。
（４－１）Ｅｎｄｏ－Ｓｉの反応温度の評価
Ｅｎｄｏ－ＳｉとＥｎｄｏＳの各温度における糖鎖加水分解率は、次のように測定した。０．１　ｍｇ　ｍＡｂ１、および１０　ｎｇ　Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　ＷＴまたはＥｎｄｏＳ　ＷＴを含む５０　ｍＭ　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ　７．５）５０μＬを調製し、２７、２９、３１、３５、３７、４０、４３、４６、４８、および５０℃の各温度でインキュベートした。反応０．５時間の反応液をサンプリングし、上述の方法で糖鎖加水分解率を算出した。
　結果を図１８に示す。Ｅｎｄｏ－Ｓｉは、加水分解反応における至適温度（酵素が良好に機能する温度）が、２５℃～４５℃の範囲、より良好には３０℃～４２℃の範囲、特に３７℃付近の３５℃～３９℃で良好な加水分解性を示し、また、各温度における加水分解活性がＥｎｄｏＳよりも高いことが確認された。
（４－２）Ｅｎｄｏ－Ｓｉの反応ｐＨの評価
Ｅｎｄｏ－ＳｉとＥｎｄｏＳの各ｐＨにおける糖鎖加水分解率は、次のよう次のように測定した。０．１　ｍｇ　ｍＡｂ１、および１０ｎｇ　Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　ＷＴまたはＥｎｄｏＳ　ＷＴを含む５０ｍＭ　クエン酸－リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ　５．０または５．５）、またはリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ　６．０、６．５、または７．０）、またはトリス塩酸緩衝液（ｐＨ　７．５、８．０、８．５、または９．０）５０　μＬを調製し、３７℃でインキュベートした。反応０．５時間の反応液をサンプリングし、上述の方法で糖鎖加水分解率を算出した。
　結果を図１９に示す。Ｅｎｄｏ－Ｓｉは、加水分解反応における至適ｐＨ（酵素が良好に機能するｐＨ）がｐＨ６．３～９．０の範囲であり、さらに好ましくはｐＨ６．７～８．８の範囲であり、特にｐＨ７．５付近のｐＨ７．２～８．０で良好な加水分解性を示した。Ｅｎｄｏ－Ｓｉの方がＥｎｄｏＳに比べｐＨ６．７付近以上のｐＨ条件での活性が高いことが確認された。
＜実施例５＞Ｅｎｄｏ－Ｓｉの基質特異性
（５－１）各種抗体におけるＥｎｄｏ－Ｓｉの基質特異性評価
　Ｅｎｄｏ－Ｓｉ、ＥｎｄｏＳ、ＰＮＧａｓｅＦの各種抗体に対する加水分解活性は次のように測定した。１０μｇの各種基質、および１　μｇ　Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　ＷＴを含む５０　ｍＭ　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ　７．５）５０　μＬを調製し、３７℃でインキュベートした。基質にはヒトＩｇＧ１－４、ＩｇＡ、およびＩｇＥ（全てシグマアルドリッチ製）を使用した。コントロールとして、１　μｇ　ＥｎｄｏＳ　ＷＴおよび５００　Ｕ　ＰＮＧａｓｅ　Ｆ　ＰＲＩＭＥ（Ｎ－ｚｙｍｅ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｓ製）を用いた。２時間後に反応液をサンプリングし、上述のタンパク質の全自動電気泳動システムで分析した。
　結果を図２０に示す。酵素の添加により糖鎖が加水分解された場合は、添加しない場合と比較してタンパク質のバンドが低分子量側にシフトする。実験の結果、Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　ＷＴはＩｇＧの４つのサブクラス全てに対して活性を示した。一方で、ＩｇＡおよびＩｇＥに対する加水分解活性は示さなかった。コントロールに用いたＥｎｄｏＳ　ＷＴにおいても、同様の基質特異性を示すことが確認された。
（５－２）各種糖鎖におけるＥｎｄｏ－Ｓｉの基質特異性評価
　各種糖鎖におけるＥｎｄｏ－Ｓｉの基質特異性は次のように測定した。５ｐｍｏｌの各種２－ＡＢラベル化糖鎖（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）、および２０μｇ　Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　ＷＴを含む５０ｍＭ　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ　７．５）１０μＬを調製した。３７℃で２４時間インキュベートし、その後９５℃で５分間処理することで反応を停止した。反応液を以下の条件でＨＰＬＣ分析した。
　［ＨＰＬＣ分析条件］
ＨＰＬＣ装置：１２００　Ｉｎｆｉｎｉｔｙ　ＬＣ　（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）
カラム：　ＡＣＱＵＩＴＹ　ＵＰＬＣ　Ｇｌｙｃａｎ　Ａｍｉｄｅ　１３０Å，　１．７　μｍ，　２．１　ｘ　１５０　ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ製）
カラム温度：４０℃
検出器：蛍光検出器ＲＦ－２０Ａｘｓ（島津製作所製）
移動相Ａ：Ｈ２Ｏ＋０．１％　ＨＣＯＯＨ
移動相Ｂ：アセトニトリル＋０．１％　ＨＣＯＯＨ
グラジエント（移動相Ｂ％）：９０％（０分）、４０％（２５分）
流速：０．２　ｍＬ／ｍｉｎ
　基質およびその加水分解物であるＧｌｃＮＡｃ－２ＡＢのピーク面積比から、酵素活性を算出した。Ｇ０糖鎖に対する活性を１００％とした場合の、各種糖鎖に対する相対活性を表４に示す。Ｅｎｄｏ－Ｓｉは、ハイマンノース型糖鎖及び複合型２分岐糖鎖、いずれに対しても活性を示したが、ハイマンノース型糖鎖よりも複合型２分岐糖鎖に対する特異性が高く、中でもＧ０糖鎖に対する活性が最も高かった。シアリル糖鎖やフコシル化糖鎖に対しても活性を示すが、一方で複合型３分岐糖鎖に対する活性は示さなかった。
[表４]各種糖鎖におけるＥｎｄｏ－Ｓｉの加水分解活性
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
＜実施例６＞Ｅｎｄｏ－Ｓｉの改変と転移活性の測定
（６－１）［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ１（９）－Ｏｘの調製
　以降の実施例で糖鎖ドナーとして使用する［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ１（９）－Ｏｘは、ＷＯ２０１９／０６５９６４の実施例５６に記載の方法で製造した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
（６－２）Ｅｎｄｏ－Ｓｉの改変と糖鎖転移活性の確認
　糖鎖転移活性の高いＥｎｄｏ－Ｓｉ変異酵素を取得すべく、変異導入を実施した。ＥｎｄｏＳの立体構造情報（ＰＤＢ　ＩＤ：４ＮＵＹ）に基づいて、表１に示す各種変異酵素をデザインし、その抗体に対する糖鎖転移活性を測定した。
　糖鎖転移活性の評価は次のように行った。（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ２　０．５　ｍｇ、糖鎖オキサゾリン体［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ１（９）－Ｏｘ　５０．４　μｇ（８　ｅｑ．）、　酵素１．２５　μｇを含む５０　ｍＭ　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ　７．５）　４５　μＬを調製し、２８℃でインキュベートした。反応１、２、４、６、および２４時間の反応液をサンプリングし、上述のタンパク質の全自動電気泳動システムで分析した。得られたクロマトグラムより、未反応物と糖鎖転移体ｍＡｂ２－（ＭＳＧ１－Ｎ３）２が分離したピークとして確認される。未反応物と糖鎖転移体のピーク面積比から糖鎖転移率を下記算出式により算出した。
　糖鎖転移率（％）　＝　〔［ｍＡｂ２－（ＭＳＧ１－Ｎ３）２由来のＨ鎖のピーク面積］　／｛［（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ２由来のＨ鎖ピーク面積］　＋　［ｍＡｂ２－（ＭＳＧ１－Ｎ３）２由来のＨ鎖のピーク面積］｝〕×１００
　同様にして、各Ｅｎｄｏ－Ｓｉ変異酵素の、各反応時間における糖鎖転移率を算出した（表５）。
[表５]オキサゾリン体を糖鎖ドナーに用いたＥｎｄｏ－Ｓｉ　ＷＴおよび各変異酵素の糖鎖転移率の経時変化
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
 　Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　ＷＴを除き、各Ｅｎｄｏ－Ｓｉ変異酵素はいずれも高い糖鎖転移活性を示した。
＜実施例７＞糖鎖ドナーにＳＧＰを用いた糖鎖転移活性の測定　
　糖鎖転移活性の評価は次のように行った。（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ２　０．５　ｍｇ、ＳＧＰ　０．４８５　ｍｇ（５０　ｅｑ．）、Ｅｎｄｏ－Ｍ　Ｎ１７５Ｑ（東京化成工業製）２．５　ｍＵ、および各種Ｅｎｄｏ－Ｓｉ変異酵素　１０　μｇを含む５０　ｍＭ　リン酸(ナトリウム) 緩衝液（ｐＨ　７．５）１７　μＬを調製し、２３℃でインキュベートした。反応２、４、６、２４、および４８時間の反応液をサンプリングし、上述のタンパク質の全自動電気泳動システムで分析した。得られたクロマトグラムより、未反応物と糖鎖転移体ｍＡｂ２－（ＳＧ）２が分離したピークとして確認される。未反応物と糖鎖転移体のピーク面積比から糖鎖転移率を下記算出式により算出した。
　糖鎖転移率（％）　＝　〔［ｍＡｂ２－（ＳＧ）２由来のＨ鎖のピーク面積］　／｛［（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ２由来のＨ鎖ピーク面積］　＋　［ｍＡｂ２－（ＳＧ）２由来のＨ鎖のピーク面積］｝］×１００
　同様にして、各Ｅｎｄｏ－Ｓｉ変異酵素の、各反応時間における糖鎖転移率を算出した（表６）。
[表６]ＳＧＰを糖鎖ドナーに用いたＥｎｄｏ－Ｓｉ　ＷＴおよび各変異酵素の糖鎖転移率の経時変化
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
 　Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　ＷＴを除き、各Ｅｎｄｏ－Ｓｉ変異酵素はいずれも高い糖鎖転移活性を示した。
＜実施例８＞Ｅｎｄｏ－Ｒｐとの組み合わせによるワンポット法の検討
　糖鎖ドナーであるＳＧＰからＧｌｃＮＡｃ誘導体への糖鎖転移が知られているＥｎｄｏ－Ｒｐを酵素Ａの代表例として使用し、Ｅｎｄｏ－Ｓｉと組み合わせることができる酵素Ａの性質を検討した。
　ワンポット法を利用した抗体への糖鎖転移活性の評価は、次のように行った。（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ２　０．５　ｍｇ、ＳＧＰ　０．４８５　ｍｇ（５０　ｅｑ．）、Ｅｎｄｏ－Ｍ　Ｎ１７５Ｑ（東京化成工業製）２．５　ｍＵまたは各種Ｅｎｄｏ－Ｒｐ変異酵素　８　μｇ、およびＥｎｄｏ－Ｓｉ　Ｄ２４１Ｑ　５　μｇを含む５０　ｍＭ　リン酸（ナトリウム）　緩衝液（ｐＨ　７．５）１７　μＬを調製し、２８℃でインキュベートした。反応２、４、６、２４、および４８時間の反応液をサンプリングし、上述のタンパク質の全自動電気泳動システムで分析した。得られたクロマトグラムより、実施例５に記載の算出式を用いて糖鎖転移率を算出した。
　結果を表７に示す。ＳＧＰをＧｌｃＮＡｃ誘導体に転移する活性が低いＥｎｄｏ－Ｒｐ変異酵素、例えば、特許文献３で転移活性が全く見られなかったＮ１７２Ｆ、Ｎ１７２Ｋ、Ｎ１７２Ｌ、Ｎ１７２Ｒ、Ｎ１７２Ｗ、Ｎ１７２Ｙ変異酵素は、ワンポット法においても転移効率が低い結果となった。
　上記より酵素Ａの自身の糖鎖転移活性は、糖鎖原料活性化能力と相関が見られ、ＳＧＰからＧｌｃＮＡｃ誘導体への転移活性を指標として、糖鎖原料活性化能力を有する適切な酵素Ａを特定できると考えられる。一般的に、Ｅｎｄｏ－Ｍ、Ｅｎｄｏ－Ｏｍ、Ｅｎｄｏ－ＣＣは、Ｅｎｄｏ－Ｒｐと同様の反応性を有していると考えられるため、Ｅｎｄｏ－ＲｐをＥｎｄｏ－Ｍ、Ｅｎｄｏ－Ｏｍ、Ｅｎｄｏ－ＣＣを置き換えて、ワンポット法に有効な酵素Ａの特定が可能である。さらに、Ｅｎｄｏ－Ｓｉと同様に抗体へ糖鎖転移活性を有しているＥｎｄｏ－ＳやＥｎｄｏ－Ｓ２の場合でも、この方法は適応できる。
　このように、上記特定法の応用範囲はＥｎｄｏ－ＳｉとＥｎｄｏ－Ｒｐの組み合わせに限定されず、それぞれの酵素と同様の性質をもつ酵素であれば、利用することが可能と考えられる。
[表７]ワンポット法を利用した各種変異酵素による抗体への糖鎖転移活性の経時変化
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
＜実施例９＞化学修飾した糖鎖誘導体をドナーに用いたワンポット法の検討
　天然型糖鎖であるＳＧＰ以外の糖鎖誘導体ドナーとして、非還元末端側と還元末端アミノ酸がアジド修飾された誘導体を準備し、ワンポット法における糖鎖転移反応を検討した。
（９－１）（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ１－）Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３の調製
　以降の実施例で糖鎖ドナ一として使用する（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ１－）Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３は、ＷＯ２０１９０６５９６４の実施例１５４の工程３に記載された方法で製造した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
（９－２）（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］２－ＳＧ－）Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３の調製
　以降の実施例で糖鎖ドナ一として使用する（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］２－ＳＧ－）Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３は、ＷＯ２０１８００３９８３の実施例１－１２、工程１－１２Ａに記載された方法で製造した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　（９－３）糖鎖転移活性評価
　糖鎖転移活性の評価は、次のように行った。（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ２　０．５　ｍｇ、ＳＧＰ　０．４８５　ｍｇ（５０　ｅｑ．）または（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ１－）Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３　０．４１５　ｍｇ（５０　ｅｑ．）または（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］２－ＳＧ－）Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３　０．４９５　ｍｇ（５０　ｅｑ．）、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｈ　８　μｇ、およびＥｎｄｏ－Ｓｉ　Ｄ２４１Ｍ／Ｑ３１１Ｌ　１０　μｇ／５０　ｍＭ　リン酸（ナトリウム）　緩衝液（ｐＨ　７．５）１７　μＬを調製し、２８℃でインキュベートした。反応２時間、４時間、６時間、２４時間、および４８時間の反応液をサンプリングし、上述のタンパク質の全自動電気泳動システムで分析した。転移反応物として、ＳＧＰをドナーに用いた場合は実施例７に記載のｍＡｂ２－（ＳＧ）２、（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ１－）Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３をドナーに用いた場合はｍＡｂ２－（ＭＳＧ１－Ｎ３）２（図２１）、（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］２－ＳＧ－）Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３をドナーに用いた場合はｍＡｂ２－[ＳＧ－（Ｎ３）２]２（図２２、式中ではｍＡｂ２－（ＳＧ－Ｎ３）２と呼称する）がそれぞれ生成する。得られたクロマトグラムより、未反応物と各糖鎖転移体が分離したピークとして確認される。ＳＧＰをドナーに用いた場合の糖鎖転移率は、実施例５に記載の式を用いて算出した。（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ１－）Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３をドナーに用いた場合の糖鎖転移率は、実施例４－２に記載の式を用いて算出した。また（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］２－ＳＧ－）Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３をドナーに用いた場合の糖鎖転移率は、以下の式を用いて算出した。
糖鎖転移率（％）　＝　〔［ｍＡｂ２－（ＳＧ－Ｎ３）２由来のＨ鎖のピーク面積］　／｛［（Ｆｕｃα１，６）ＧｌｃＮＡｃ－ｍＡｂ２由来のＨ鎖ピーク面積］　＋　［ｍＡｂ２－（ＳＧ－Ｎ３）２由来のＨ鎖のピーク面積］｝〕×１００
　結果を表８に示す。天然型の糖鎖構造だけでなく、化学修飾された糖鎖をドナーに用いた場合も、ワンポット転移反応が進行することが確認された。
[表８]ワンポット法を利用した各種糖鎖ドナーの抗体への糖鎖転移活性の経時変化
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
　本発明のＥｎｄｏ－Ｓｉ酵素を用いて得られた均一な糖鎖を有する抗体もしくは糖鎖含有分子を、効率よく、又は高純度で取得することができ、該抗体等を医薬として利用することができる。
配列番号１：Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　塩基配列
配列番号２：Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　アミノ酸配列
配列番号３：Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　アミノ酸配列　Ｄ２４１Ｑ
配列番号４：Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　アミノ酸配列　Ｄ２４１Ｑ／Ｑ３１１Ｌ
配列番号５：Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　アミノ酸配列Ｄ２４１Ｑ／Ｅ３６０Ｑ
配列番号６：Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　アミノ酸配列　Ｄ２４１Ｍ
配列番号７：Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　アミノ酸配列　Ｄ２４１Ｍ／Ｑ３１１Ｌ
配列番号８：Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　アミノ酸配列Ｄ２４１Ｍ／Ｅ３６０Ｑ
配列番号９：Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　アミノ酸配列　Ｔ１９０Ｑ／Ｄ２４１Ｑ
配列番号１０：Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　アミノ酸配列　Ｔ１９０Ｑ
配列番号１１：Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　アミノ酸配列　Ｔ１９０Ｑ／Ｄ２４１Ｍ
配列番号１２：ｍＡｂ２　軽鎖アミノ酸配列
配列番号１３：ｍＡｂ２　重鎖アミノ酸配列
配列番号１４：プライマー１
配列番号１５：プライマー２
配列番号１６：Ｅｎｄｏ－Ｓｉ　大腸菌用配列
配列番号１７：Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　アミノ酸配列　Ｎ１７２Ｑ
配列番号１８：Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　アミノ酸配列　Ｎ１７２Ｈ
配列番号１９：Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　アミノ酸配列　Ｎ１７２Ａ
配列番号２０：Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　アミノ酸配列　Ｎ１７２Ｃ
配列番号２１：Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　アミノ酸配列　Ｎ１７２Ｄ
配列番号２２：Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　アミノ酸配列　Ｎ１７２Ｅ
配列番号２３：Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　アミノ酸配列　Ｎ１７２Ｆ
配列番号２４：Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　アミノ酸配列　Ｎ１７２Ｇ
配列番号２５：Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　アミノ酸配列　Ｎ１７２Ｉ
配列番号２６：Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　アミノ酸配列　Ｎ１７２Ｋ
配列番号２７：Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　アミノ酸配列　Ｎ１７２Ｌ
配列番号２８：Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　アミノ酸配列　Ｎ１７２Ｍ
配列番号２９：Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　アミノ酸配列　Ｎ１７２Ｐ
配列番号３０：Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　アミノ酸配列　Ｎ１７２Ｒ
配列番号３１：Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　アミノ酸配列　Ｎ１７２Ｓ
配列番号３２：Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　アミノ酸配列　Ｎ１７２Ｔ
配列番号３３：Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　アミノ酸配列　Ｎ１７２Ｖ
配列番号３４：Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　アミノ酸配列　Ｎ１７２Ｗ
配列番号３５：Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　アミノ酸配列　Ｎ１７２Ｙ
配列番号３６：Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　アミノ酸配列　Ｗ２７８Ｆ／Ｓ２１６Ｖ
配列番号３７：Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　アミノ酸配列　Ｗ２７８Ｆ／Ｎ２４６Ｄ
配列番号３８：Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　アミノ酸配列　Ｗ２７８Ｆ／Ｄ２７６Ｎ
配列番号３９：Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　アミノ酸配列　Ｗ２７８Ｆ／Ａ３１０Ｄ
配列番号４０：Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　アミノ酸配列　Ｗ２７８Ｆ／Ｎ１７２Ｄ／Ｆ３０７Ｙ
配列番号４１：Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　アミノ酸配列　Ｗ２７８Ｆ／Ｎ１７２Ｄ／Ｆ３０７Ｈ
配列番号４２：Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　アミノ酸配列　Ｗ２７８Ｆ／Ｎ１７２Ｄ／Ａ３１０Ｄ
配列番号４３：Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　アミノ酸配列　Ｗ２７８Ｆ／Ｆ３０７Ｙ／Ｌ３０６Ｉ
配列番号４４：Ｅｎｄｏ－Ｍ　アミノ酸配列
配列番号４５：Ｅｎｄｏ－Ｏｍ　アミノ酸配列
配列番号４６：Ｅｎｄｏ－ＣＣ　アミノ酸配列
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (44)

  1. 配列番号２のアミノ酸番号３４乃至９２８に記載のアミノ酸配列、又は、
    前記アミノ酸配列において、２４１番目（Ｄ２４１）、１９０番目（Ｔ１９０）、３１１番目（Ｑ３１１）及び３６０番目（Ｅ３６０）のアミノ酸からなる群より選択される１又は２以上のアミノ酸部位への変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、糖鎖加水分解活性及び／又は糖鎖転移活性を示すポリペプチド。
  2. 変異が、Ｄ２４１、Ｔ１９０、Ｑ３１１及びＥ３６０のアミノ酸からなる群より選択される１～３個のアミノ酸部位に変異を有することを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 以下の（Ａ）～（Ｄ）からなる群から選択される１又は２以上の変異を有する、請求項１又は２に記載のポリペプチド；
    （Ａ）配列番号２のアミノ酸配列において、２４１番目のアミノ酸（Ｄ２４１）が、グルタミン（Ｄ２４１Ｑ）、メチオニン（Ｄ２４１Ｍ）、若しくはアラニン（Ｄ２４１Ａ）へ変異、
    （Ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１９０番目のアミノ酸（Ｔ１９０）が、グルタミン（Ｔ１９０Ｑ）へ変異、
    （Ｃ）配列番号２のアミノ酸配列において、３１１番目のアミノ酸（Ｑ３１１）が、ロイシン（Ｑ３１１Ｌ）へ変異、並びに、
    （Ｄ）配列番号２のアミノ酸配列において、３６０番目のアミノ酸（Ｅ３６０）が、グルタミン（Ｅ３６０Ｑ）、アラニン（Ｅ３６０Ａ）、アスパラギン（Ｅ３６０Ｎ）、若しくはアスパラギン酸（Ｅ３６０Ｄ）へ変異。
  4. 以下の（Ａ）～（Ｄ）からなる群から選択される１又は２以上の変異を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載のポリペプチド；
    （Ａ）Ｄ２４１Ｑ又はＤ２４１Ｍ、
    （Ｂ）Ｔ１９０Ｑ、
    （Ｃ）Ｑ３１１Ｌ、及び、
    （Ｄ）Ｅ３６０Ｑ。
  5. 以下の（Ａ）～（Ｃ）のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のポリペプチド；
    （Ａ）配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１からなる群より選択されるアミノ酸配列、
    （Ｂ）（Ａ）の各配列における２４１番目、１９０番目、３１１番目、又は、３６０番目のアミノ酸以外のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上の相同性もしくは同一性を有するアミノ酸配列、又は、
    （Ｃ）（Ａ）の配列において２４１番目、１９０番目、３１１番目、又は、３６０番目のアミノ酸以外のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、および／または付加されたアミノ酸配列。
  6. Ｎ結合型糖鎖に対して、加水分解活性及び／又は糖鎖転移活性を示す、請求項１～５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  7. Ｎ結合型糖鎖が、糖タンパク質におけるＮ結合型糖鎖である、請求項６に記載のポリペプチド。
  8. 糖タンパク質が、抗体又は抗体のＦｃ領域を含む分子（Ｆｃ領域含有分子）である、請求項６又は７に記載のポリペプチド。
  9. Ｎ結合型糖鎖が、抗体の２９７番目のＡｓｎに結合するＮ結合型糖鎖（Ｎ２９７結合糖鎖）である、請求項６～９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  10. Ｎ２９７結合糖鎖の非還元末端が化学修飾されていてもよい複合型糖鎖である、請求項９に記載のポリペプチド。
  11. Ｎ２９７結合糖鎖が、コアＧｌｃＮＡｃにフコースが付加していてもよいＮ２９７結合糖鎖である、請求項９又は１０に記載のポリペプチド。
  12. 請求項１～１１のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  13. 請求項１２に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  14. 請求項１３に記載の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞。
  15. 請求項１４に記載の宿主細胞を培養する工程、および当該工程で得られた培養物から目的のポリペプチドを採取する工程を含むことを特徴とする、請求項１～１１のいずれか一項に記載のポリペプチドの製造方法。
  16. 請求項１５に記載の製造方法によって得られた、ポリペプチド。
  17. 請求項１～１１のいずれか一項に記載のポリペプチドの存在下で、Ｎ２９７結合糖鎖としてフコースが付加していてもよいコアＧｌｃＮＡｃを有する抗体又はそのＦｃ領域含有分子であるアクセプター分子を、還元末端が活性化されたＧｌｃＮＡｃを含む糖鎖ドナー分子と反応させることを特徴とする、抗体又はそのＦｃ領域含有分子の製造方法。
  18. 還元末端が活性化されたＧｌｃＮＡｃが、オキサゾリン化されたＧｌｃＮＡｃである、請求項１７に記載の製造方法。
  19. 糖鎖ドナー分子が、非還元末端が化学修飾されていてもよい複合型糖鎖である、請求項１７又は１８に記載の製造方法。
  20. 糖鎖ドナー分子が、非還元末端が化学修飾されていてもよいＳＧ（１０）－Ｏｘ、ＭＳＧ１（９）－Ｏｘ、ＭＳＧ２（９）－Ｏｘ又はＭＳＧ１（９）－ＯｘとＭＳＧ２（９）－Ｏｘの混合物である、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の製造方法。
  21. 糖鎖ドナー分子が、［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］２－ＳＧ（１０）－Ｏｘ、［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ１（９）－Ｏｘ、［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ２（９）－Ｏｘ、又は［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ１（９）－Ｏｘと［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ２（９）－Ｏｘの混合物である、請求項１７～２０のいずれか一項に記載の製造方法。
  22. 更に、アジド基（Ｎ３－）にアルキン構造を有する分子と反応させる工程を含む、請求項２１に記載の製造方法。
  23. アルキン構造を有する分子が、化学療法剤、分子標的薬、免疫活性化剤、毒素、抗菌剤、抗ウイルス剤、診断用薬剤、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸分子、核酸、抗原、脂質、リポソーム、ビタミン、ホルモンから選択される、請求項２２に記載の製造方法。
  24. 化学療法剤が、カンプトテシン、ピロロベンゾジアゼピン、ドキソルビシン、オーリスタチン、タキサンもしくはその誘導体から選択される、請求項２３に記載の製造方法。
  25. 免疫活性化剤が、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＴＬＲアゴニスト、Ａ２ＡＲアンタゴニスト、ＩＤＯ阻害剤、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３及びＰＤ－１経路のアンタゴニスト、チェックポイント阻害剤、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体阻害剤、スムーズン（ｓｍｏｏｔｈｅｎ）阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、レチノイド、抗がんワクチン、アジュバントから選択される、請求項２３に記載の製造方法。
  26. アルキン構造を有する分子が、（Ａ）～（Ｅ）からなる群から選択される、請求項２３～２５のいずれか一項に記載の製造方法；
    （Ａ）Ｎ－［４－（１１，１２－ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－４－オキソブタノイル］グリシルグリシル－Ｌ－バリル－Ｎ－｛４－［（｛［（１１’Ｓ，１１ａ’Ｓ）－１１’－ヒドロキシ－７’－メトキシ－８’－［（５－｛［（１１ａＳ）－７－メトキシ－２－（４－メトキシフェニル）－５－オキソ－５，１０，１１，１１ａ－テトラヒドロ－１Ｈ－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン－８－イル］オキシ｝ペンチル）オキシ］－５’－オキソ－１１’，１１ａ’－ジヒドロ－１’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－１０’（５’Ｈ）－イル］カルボニル｝オキシ）メチル］フェニル｝－Ｌ－アラニンアミド、
    （Ｂ）Ｎ－［４－（１１，１２－ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－４－オキソブタノイル］グリシルグリシル－Ｌ－バリル－Ｎ－［４－（｛［（１１’Ｓ，１１’ａＳ）－１１’－ヒドロキシ－７’－メトキシ－８’－（３－｛［（１１ａＳ）－７－メトキシ－２－（４－メトキシフェニル）－５－オキソ－５，１０，１１，１１ａ－テトラヒドロ－１Ｈ－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン－８－イル］オキシ｝プロポキシ）－５’－オキソ－１１’，１１’ａ－ジヒドロ－１’Ｈ，３’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－１０’（５’Ｈ）－カルボニル］オキシ｝メチル）フェニル］－Ｌ－アラニンアミド、
    （Ｃ）Ｎ－［４－（１１，１２－ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－４－オキソブタノイル］グリシルグリシル－Ｌ－バリル－Ｎ－｛４－［（｛［（１１’Ｓ，１１ａ’Ｓ）－１１’－ヒドロキシ－７’－メトキシ－８’－［（５－｛［（１１ａ’Ｓ）－７’－メトキシ－５’－オキソ－５’，１１ａ’－ジヒドロ－１’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－８’－イル］オキシ｝ペンチル）オキシ］－５’－オキソ－１１’，１１ａ’－ジヒドロ－１’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－１０’（５’Ｈ）－イル］カルボニル｝オキシ）メチル］フェニル｝－Ｌ－アラニンアミド、
    （Ｄ）Ｎ－［４－（１１，１２－ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－４－オキソブタノイル］グリシルグリシル－Ｌ－バリル－Ｎ－｛４－［（｛［（１１’Ｓ，１１ａ’Ｓ）－１１’－ヒドロキシ－７’－メトキシ－８’－［（５－｛［（１１ａ’Ｓ）－７’－メトキシ－５’－オキソ－５’，１０’，１１’，１１ａ’－テトラヒドロ－１’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－８’－イル］オキシ｝ペンチル）オキシ］－５’－オキソ－１１’，１１ａ’－ジヒドロ－１’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－１０’（５’Ｈ）－イル］カルボニル｝オキシ）メチル］フェニル｝－Ｌ－アラニンアミド、並びに、
    （Ｅ）（ビス（Ｎ，Ｎ－ジエチルエタンアミニウム）　Ｎ－［４－（１１，１２－ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－４－オキソブタノイル］グリシルグリシル－Ｌ－フェニルアラニル－Ｎ－［（２－｛９－［（５Ｒ，７Ｒ，８Ｒ，１２ａＲ，１４Ｒ，１５Ｒ，１５ａＲ，１６Ｒ）－１５－フルオロ－１６－ヒドロキシ－２，１０－ジオキソ－２，１０－ジスルフィド－１４－（６，７，８，９－テトラヒドロ－２Ｈ－２，３，５，６－テトラアザベンゾ［ｃｄ］アズレン－２－イル）オクタヒドロ－２Ｈ，１０Ｈ，１２Ｈ－５，８－メタノ－２λ５，１０λ５－フロ［３，２－ｌ］［１，３，６，９，１１，２，１０］ペンタオキサジホスファシクロテトラデシン－７－イル］－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－１－イル｝エトキシ）メチル］グリシンアミド。
  27. アクセプター分子が、フコースが付加していてもよいコアＧｌｃＮＡｃからなるＮ２９７結合糖鎖を有する抗体又はＦｃ領域含有分子である請求項１７～２６のいずれか一項に記載の製造方法。
  28. 請求項１～１１のいずれか一項に記載のポリペプチド及び還元末端が活性化されていない糖鎖ドナー分子の複合型糖鎖を基質とするがＮ２９７結合糖鎖を基質としないエンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（酵素Ａ）の存在下で、
    Ｎ２９７結合糖鎖としてフコースが付加していてもよいコアＧｌｃＮＡｃを有する抗体若しくはそのＦｃ領域含有分子であるアクセプター分子を、還元末端が活性化されていないＧｌｃＮＡｃを含む糖鎖ドナー分子と反応させることを特徴とする、抗体又はＦｃ領域含有分子の製造方法。
  29. 請求項１～１１のいずれか一項に記載のポリペプチド、酵素Ａ、アクセプター分子及び糖鎖ドナー分子を同一の反応液中で反応させることを特徴とする、請求項２８に記載の製造方法。
  30. 糖鎖ドナー分子が、非還元末端が化学修飾されていてもよい複合型糖鎖である、請求項２８又は２９に記載の製造方法。
  31. 糖鎖ドナー分子が、非還元末端が化学修飾されていてもよいＳＧＰ、（ＳＧ－）Ａｓｎ、（ＭＳＧ１－）Ａｓｎ、（ＭＳＧ２－）Ａｓｎ、（ＭＳＧ１－）Ａｓｎと（ＭＳＧ２－）Ａｓｎの混合物である、請求項２８～３０のいずれか一項に記載の製造方法。
  32. 糖鎖ドナー分子が、（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］２－ＳＧ－）Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３、（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ１－）Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３、（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ２－）Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３、又は（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ１－）Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３と（［Ｎ３－ＰＥＧ（３）］－ＭＳＧ２－）Ａｓｎ－ＰＥＧ（３）－Ｎ３の混合物である、請求項２８～３１のいずれか一項に記載の製造方法。　
  33. 更に、アジド基（Ｎ３－）にアルキン構造を有する分子と反応させる工程を含む、請求項３２に記載の製造方法。
  34. アルキン構造を有する分子が、化学療法剤、分子標的薬、免疫活性化剤、毒素、抗菌剤、抗ウイルス剤、診断用薬剤、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、抗原、脂質、リポソーム、ビタミン、ホルモンから選択される、請求項３３に記載の製造方法。
  35. 化学療法剤が、カンプトテシン、ピロロベンゾジアゼピン、ドキソルビシン、オーリスタチン、タキサンもしくはその誘導体から選択される、請求項３４に記載の製造方法。
  36. 免疫活性化剤が、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＴＬＲアゴニスト、Ａ２ＡＲアンタゴニスト、ＩＤＯ阻害剤、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３及びＰＤ－１経路のアンタゴニスト、チェックポイント阻害剤、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体阻害剤、スムーズン（ｓｍｏｏｔｈｅｎ）阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、レチノイド、抗がんワクチン、アジュバントから選択される、請求項３５に記載の製造方法。
  37. アルキン構造を有する分子が、（Ａ）～（Ｅ）からなる群から選択される、請求項３４～３６のいずれかに記載の製造方法；
    （Ａ）Ｎ－［４－（１１，１２－ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－４－オキソブタノイル］グリシルグリシル－Ｌ－バリル－Ｎ－｛４－［（｛［（１１’Ｓ，１１ａ’Ｓ）－１１’－ヒドロキシ－７’－メトキシ－８’－［（５－｛［（１１ａＳ）－７－メトキシ－２－（４－メトキシフェニル）－５－オキソ－５，１０，１１，１１ａ－テトラヒドロ－１Ｈ－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン－８－イル］オキシ｝ペンチル）オキシ］－５’－オキソ－１１’，１１ａ’－ジヒドロ－１’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－１０’（５’Ｈ）－イル］カルボニル｝オキシ）メチル］フェニル｝－Ｌ－アラニンアミド、
    （Ｂ）Ｎ－［４－（１１，１２－ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－４－オキソブタノイル］グリシルグリシル－Ｌ－バリル－Ｎ－［４－（｛［（１１’Ｓ，１１’ａＳ）－１１’－ヒドロキシ－７’－メトキシ－８’－（３－｛［（１１ａＳ）－７－メトキシ－２－（４－メトキシフェニル）－５－オキソ－５，１０，１１，１１ａ－テトラヒドロ－１Ｈ－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン－８－イル］オキシ｝プロポキシ）－５’－オキソ－１１’，１１’ａ－ジヒドロ－１’Ｈ，３’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－１０’（５’Ｈ）－カルボニル］オキシ｝メチル）フェニル］－Ｌ－アラニンアミド、
    （Ｃ）Ｎ－［４－（１１，１２－ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－４－オキソブタノイル］グリシルグリシル－Ｌ－バリル－Ｎ－｛４－［（｛［（１１’Ｓ，１１ａ’Ｓ）－１１’－ヒドロキシ－７’－メトキシ－８’－［（５－｛［（１１ａ’Ｓ）－７’－メトキシ－５’－オキソ－５’，１１ａ’－ジヒドロ－１’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－８’－イル］オキシ｝ペンチル）オキシ］－５’－オキソ－１１’，１１ａ’－ジヒドロ－１’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－１０’（５’Ｈ）－イル］カルボニル｝オキシ）メチル］フェニル｝－Ｌ－アラニンアミド、
    （Ｄ）Ｎ－［４－（１１，１２－ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－４－オキソブタノイル］グリシルグリシル－Ｌ－バリル－Ｎ－｛４－［（｛［（１１’Ｓ，１１ａ’Ｓ）－１１’－ヒドロキシ－７’－メトキシ－８’－［（５－｛［（１１ａ’Ｓ）－７’－メトキシ－５’－オキソ－５’，１０’，１１’，１１ａ’－テトラヒドロ－１’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－８’－イル］オキシ｝ペンチル）オキシ］－５’－オキソ－１１’，１１ａ’－ジヒドロ－１’Ｈ－スピロ［シクロプロパン－１，２’－ピロロ［２，１－ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン］－１０’（５’Ｈ）－イル］カルボニル｝オキシ）メチル］フェニル｝－Ｌ－アラニンアミド、並びに、
    （Ｅ）（ビス（Ｎ，Ｎ－ジエチルエタンアミニウム）　Ｎ－［４－（１１，１２－ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－４－オキソブタノイル］グリシルグリシル－Ｌ－フェニルアラニル－Ｎ－［（２－｛９－［（５Ｒ，７Ｒ，８Ｒ，１２ａＲ，１４Ｒ，１５Ｒ，１５ａＲ，１６Ｒ）－１５－フルオロ－１６－ヒドロキシ－２，１０－ジオキソ－２，１０－ジスルフィド－１４－（６，７，８，９－テトラヒドロ－２Ｈ－２，３，５，６－テトラアザベンゾ［ｃｄ］アズレン－２－イル）オクタヒドロ－２Ｈ，１０Ｈ，１２Ｈ－５，８－メタノ－２λ５，１０λ５－フロ［３，２－ｌ］［１，３，６，９，１１，２，１０］ペンタオキサジホスファシクロテトラデシン－７－イル］－６－オキソ－６，９－ジヒドロ－１Ｈ－プリン－１－イル｝エトキシ）メチル］グリシンアミド。
  38. アクセプター分子が、フコースが付加していてもよいコアＧｌｃＮＡｃからなるＮ２９７結合糖鎖を有する抗体又はもしくはＦｃ領域含有分子である請求項２８～３７のいずれか一項に記載の製造方法。
  39. 酵素Ａが、ＳＧＰからＧｌｃＮＡｃを有するアクセプターへの糖鎖転移活性を有する酵素である、請求項２８～３８のいずれか一項に記載の製造方法。
  40. 酵素Ａが、Ｅｎｄｏ－Ｍ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ、Ｅｎｄｏ－Ｏｍ、Ｅｎｄｏ－ＣＣ、又はそれらの加水分解活性を低下させた変異酵素である、請求項２８～３９のいずれか一項に記載の製造方法。
  41. 加水分解活性を低下させた変異酵素が、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｑ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｈ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ａ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｃ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｄ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｅ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｇ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｉ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｌ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｍ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｐ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｓ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｔ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｎ１７２Ｖ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｗ２７８Ｆ／Ｓ２１６Ｖ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｗ２７８Ｆ／Ｎ２４６Ｄ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｗ２７８Ｆ／Ｄ２７６Ｎ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｗ２７８Ｆ／Ａ３１０Ｄ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｗ２７８Ｆ／Ｎ１７２Ｄ／Ｆ３０７Ｙ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｗ２７８Ｆ／Ｎ１７２Ｄ／Ｆ３０７Ｈ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｗ２７８Ｆ／Ｎ１７２Ｄ／Ａ３１０Ｄ、Ｅｎｄｏ－Ｒｐ　Ｗ２１４Ｆ／Ｆ３０７Ｙ／Ｌ３０６Ｉ、Ｅｎｄｏ－Ｍ　Ｎ１７５Ｑ、Ｅｎｄｏ－ＣＣ　Ｎ１８０Ｈ及びＥｎｄｏ－Ｏｍ　Ｎ１９４Ｑからなる群から選択される、請求項４０に記載の製造方法。
  42. 請求項１７～４１のいずれか一項に記載の製造方法で得られた抗体又はＦｃ領域含有分子。
  43. 抗体又はＦｃ領域含有分子に、配列番号２のアミノ酸番号３４乃至９２８に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを作用させることを特徴とする、フコースが付加していてもよいコアＧｌｃＮＡｃのみを有する抗体又はＦｃ領域含有分子の製造方法。
  44. 請求項４３に記載の製造方法で得られたコアＧｌｃＮＡｃのみを有する抗体又はＦｃ領域含有分子。
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