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WO2021201276A1 - Ｉｌ－２３発現を特異的に抑制する二本鎖ｒｎａおよびそれを含む医薬組成物 - Google Patents

Ｉｌ－２３発現を特異的に抑制する二本鎖ｒｎａおよびそれを含む医薬組成物 Download PDF

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WO2021201276A1
WO2021201276A1 PCT/JP2021/014321 JP2021014321W WO2021201276A1 WO 2021201276 A1 WO2021201276 A1 WO 2021201276A1 JP 2021014321 W JP2021014321 W JP 2021014321W WO 2021201276 A1 WO2021201276 A1 WO 2021201276A1
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WO
WIPO (PCT)
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double
stranded rna
sirna
pharmaceutical composition
ionic liquid
Prior art date
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PCT/JP2021/014321
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English (en)
French (fr)
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泰司 三輪
濱本　英利
竜弘 石田
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
MedRx Co Ltd
Original Assignee
MedRx Co Ltd
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Publication date
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Priority to US17/916,060 priority patent/US12442001B2/en
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    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/50—Methods for regulating/modulating their activity
    • C12N2320/51—Methods for regulating/modulating their activity modulating the chemical stability, e.g. nuclease-resistance

Definitions

  • the present invention relates to a double-stranded RNA that specifically suppresses IL-23 expression, and a pharmaceutical composition containing the double-stranded RNA. More specifically, it relates to a siRNA that specifically suppresses IL-23 expression, and a preparation containing the siRNA and an ionic liquid.
  • Psoriasis is a local skin disease accompanied by erythema that causes the skin to turn red, fine silver-white scab scales that cover the surface, thickening due to overgrowth of keratinocytes, and inflammation due to infiltration of immune cells.
  • psoriasis is classified into multiple types, psoriasis vulgaris, psoriatic arthritis (psoriatic arthritis), psoriasis drip, psoriatic erythema and pustular psoriasis.
  • steroidal or non-steroidal anti-inflammatory drugs were often used to relieve symptoms.
  • long-term treatment with such agents leads to chronic inflammation and side effects, such as gastric ulcers caused by non-steroidal anti-inflammatory drugs, and thus can be safely used as a therapeutic agent for psoriasis.
  • Development is wished.
  • Patent Document 1 describes that modulating Th17T cell differentiation is useful in the treatment of autoimmune diseases and / or inflammatory disorders, and shows the association between IL-23 and those diseases. I have.
  • IL-23 may be useful in the treatment of the onset and progression of various diseases such as psoriasis, and thus IL-23 has become a new target for the treatment of various diseases such as psoriasis.
  • Patent Documents 2 and 3 the development of a monoclonal antibody that specifically inhibits p19, which is a subunit protein of IL-23, has progressed (Patent Documents 2 and 3), and Tremfia, a human anti-human IL-23p19 monoclonal antibody preparation as a therapeutic agent for psoriasis. (Registered trademark) is approved.
  • siRNA is a double-stranded RNA consisting of about 21 to 23 base pairs (molecular weight of about 13300), and specific gene expression can be suppressed by specifically cleaving the mRNA of the target protein, and the gene can be used as the gene. It is expected to bring about a high therapeutic effect on related diseases. Further, siRNA has an advantage that it can be produced relatively easily and inexpensively as compared with an antibody drug because it can be produced by a chemical synthesis technique like a low molecular weight compound.
  • Non-Patent Document 2 The existence of siRNA that suppresses the expression of IL-23 has already been reported (Non-Patent Document 2). However, the type of psoriasis is an embodiment, and more effective siRNA is required so that a therapeutic agent can be appropriately selected accordingly.
  • siRNA is a water-soluble polymer, it is very difficult to deliver it into the skin by passive diffusion by simple application, and it is easily hydrolyzed by nuclease, which is a nucleic acid hydrolase existing inside and outside cells. Since it is cleaved and cleaved, there is a problem that the expression of the gene cannot be suppressed in vivo, and it has been considered extremely difficult to use it as a preparation other than an injection. In fact, a preparation for transdermal administration using siRNA has not yet been put on the market.
  • the present invention finds a novel double-stranded RNA that specifically suppresses IL-23 expression, overcomes the problems of low cell membrane permeability and undergoes degradation by nucleases, and is a clinically applicable siRNA-containing preparation.
  • the present inventors have found that a specific siRNA targeting the mRNA of the p19 subunit of IL-23 effectively suppresses IL-23 expression in cells. We also found that it improves psoriasis symptoms in psoriasis model mice. Furthermore, they have found that the use of an aliphatic carboxylic acid-based ionic liquid improves the stability of siRNA and the permeability of siRNA into the skin, and has completed the present invention.
  • a double-stranded RNA comprising the indicated base sequence and its complementary base sequence.
  • Item 2 according to Item 1 or Item 2, wherein one or more nucleotides in the chain of each chain are chemically modified, or the nucleotides at the 5'end or 3'end of each chain are chemically modified.
  • Positive-strand RNA [Item 4] The two items according to Item 3, wherein the chemical modification is selected from the group consisting of phosphorothioate modification, 2'-F modification, 2'-OMe modification, 2'-MOE modification, LNA modification and ENA modification. Strand RNA.
  • Item 5 The double-stranded RNA according to any one of Items 1 to 4, wherein 1 to 10 deoxyribonucleotides are bound to the 3'end of the sense strand and the 5'end of the antisense strand.
  • Item 6 The double-stranded RNA according to Item 5, wherein two thymidines (dT) are bound to the 3'end of the sense strand and the 5'end of the antisense strand.
  • Item 7 The double-stranded RNA according to any one of Items 1 to 6, for specifically suppressing IL-23 expression.
  • Item 8 A pharmaceutical composition containing the double-stranded RNA according to any one of Items 1 to 7.
  • the fatty acid-based mixed ionic liquid is a) A type or more of an aliphatic carboxylic acid-based ionic liquid having 2 to 7 carbon atoms composed of a lower aliphatic carboxylic acid having 2 to 7 carbon atoms and any one of ethanolamine, diethanolamine, and triethanolamine.
  • RNA is an aliphatic carboxylic acid-based ionic liquid having 2 to 20 carbon atoms having a solubility of 1 w / w% or less.
  • RNA is an aliphatic carboxylic acid-based ionic liquid having 2 to 20 carbon atoms having a solubility of 1 w / w% or less.
  • Item 14 The pharmaceutical composition according to Item 13, wherein the disease is psoriasis.
  • the present invention also provides the following aspects.
  • a method for treating a disease caused by IL-23 expression which comprises administering the double-stranded RNA according to any one of Items 1 to 6 to a patient in need of treatment.
  • Item 16. The treatment method according to Item 15, wherein the disease is psoriasis.
  • Item 20 The double-stranded RNA according to Item 19, wherein the disease is psoriasis.
  • Item 21 Below: (1) A step of mixing an aliphatic carboxylic acid and an organic amine to obtain an ionic liquid; (2) A step of dissolving the double-stranded RNA according to any one of Items 1 to 6 in the ionic liquid obtained in (1) to obtain a double-stranded RNA-containing ionic liquid solution; (3) A method for producing a double-stranded RNA-containing transdermal administration preparation, which comprises a step of mixing the double-stranded RNA-containing ionic liquid solution obtained in (2) with a separately prepared ionic liquid to obtain a main drug solution. ..
  • Item 23 A cell containing the expression vector according to Item 22.
  • the double-stranded RNA of the present invention can specifically suppress the expression of IL-23, and may be useful for the treatment of diseases caused by IL-23 expression such as psoriasis.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can achieve high stability and skin permeability of double-stranded RNA by using an ionic liquid, and can efficiently deliver double-stranded RNA, which is an active ingredient, to the affected area. It can be used as a preparation for percutaneous absorption. Since the double-stranded RNA of the present invention is highly stable in a pharmaceutical product, it can be used at a low dose and is expected as a safe and economical therapeutic agent for psoriasis.
  • FIG. 1 shows the results of Western blotting of controls (Control, LPS, LPS + GFP siRNA) and siRNAs of the present invention (LPS + siRNA (No. 1) to siRNA (No. 5)) in a cell solution supplemented with LPS only.
  • the ratio of the IL-23 expression level in Control, GFP siRNA and siRNA (No. 1) to siRNA (No. 5) when the IL-23 expression level is 1 is shown.
  • FIG. 2 shows images of fluorescently labeled siRNA in the absence and presence of ionic liquids in normal mice and psoriasis model mice and overlay images of the images with brightfield images of skin tissue.
  • FIG. 3 shows images of HE staining of skin tissue of normal mice and mild psoriasis model mice of each group and the thickness ( ⁇ m) of the epidermis of each mouse.
  • FIG. 4 shows images of Ki-67 immunostaining of skin tissue of normal mice and mild psoriasis model mice of each group.
  • FIG. 5 shows images of HE staining of skin tissue of normal mice and severe psoriasis model mice of each group and the thickness ( ⁇ m) of the epidermis of each mouse.
  • FIG. 6 shows images of Ki-67 immunostaining of skin tissue of normal mice and severe psoriasis model mice of each group.
  • FIG. 7 shows the results of Western blots of the untreated group, the GFP siRNA treated group and the IL-23 siRNA treated group in the severe psoriasis model mouse, and the expression level of IL-23 in the skin tissue of each group.
  • FIG. 8 shows the CD spectra of siRNA dissolved in an ionic liquid (IL), siRNA dissolved in water, and an ionic liquid (IL).
  • FIG. 9 shows the results of agarose gel electrophoresis of siRNA dissolved in a diluting solvent (Tris-EDTA (TE), HEPES buffer (HBS), RPMI1640 medium or ionic liquid (IL)).
  • Tris-EDTA TE
  • HBS HEPES buffer
  • RPMI1640 RPMI1640 medium or ionic liquid (IL)
  • the present invention includes double-stranded RNA that specifically suppresses the expression of IL-23, and said double-stranded RNA for treating diseases caused by IL-23 expression, such as skin diseases (eg, psoriasis). It provides a pharmaceutical composition.
  • double-stranded RNA refers to a double-stranded nucleic acid molecule in which a target base sequence and an RNA chain having a base sequence complementary thereto are bound in opposite directions. Examples thereof include, but are not limited to, siRNA, shRNA, miRNA, and the like.
  • the double-stranded RNA of the present invention is preferably siRNA.
  • the double-stranded RNA of the present invention is obtained by hybridizing an antisense strand complementary to the target sequence of mRNA of the p19 subunit of IL-23 and a sense strand complementary to the antisense strand. It has an action of cleaving target RNA (RNA interference action) and a function of suppressing the expression of IL-23.
  • RNA interference action RNA interference action
  • the lengths of the sense strand and antisense strand of the double-stranded RNA of the present invention may be the same or different. Its length is 19-30 nucleotides, preferably 19-25 nucleotides, more preferably 19-23 nucleotides, still more preferably 19-21 nucleotides or 19 nucleotides.
  • one or more nucleotides in each strand may be chemically modified, and the 5'end or 3'end of each strand may be chemically modified.
  • Chemical modification imparts resistance to nuclease, which is a nucleic acid hydrolase, and improves stability in vivo and the like. Examples of chemical modifications include, but are not limited to, phosphorothioate modification, 2'-F modification, 2'-OMe modification, 2'-MOE modification, LNA modification, ENA modification, and the like.
  • the method of applying the chemical modification is not particularly limited, but a known method can be used.
  • Both ends of the sense strand and antisense strand of the double-stranded RNA of the present invention may be blunt ends or overhangs.
  • each strand of the double-stranded RNA of the present invention is 1 to 10 nucleotides, preferably 1 to 5 nucleotides, and more preferably 1 to 2 nucleotides.
  • the length of the protruding end of each chain may be the same or different.
  • the nucleotide at the protruding end portion may be a deoxyribonucleotide.
  • the double-stranded RNA of the present invention preferably contains two thymidines (dT) at the 3'end of the sense strand and the 5'end of the antisense strand.
  • the double-stranded RNA of the present invention forms a loop structure with several nucleotides at the 3'end of the sense strand and the 5'end of the antisense strand or the 5'end of the sense strand and the 3'end of the antisense strand. May be good.
  • Examples of the double-stranded RNA having a loop structure include siRNA in which 2 nucleotides at the 3'end of the sense strand and 2 nucleotides at the 5'end of the antisense strand form a loop.
  • the double-stranded RNA of the present invention may have at least one mismatch as long as the antisense strand of the double-stranded RNA of the present invention hybridizes with the target sequence to bring about an IL-23 expression inhibitory effect. ..
  • the double-stranded RNA of the present invention has one substituted base.
  • the double-stranded RNA of the present invention is preferably a siRNA formed from the sense sequence and antisense sequence shown in (1) to (5) in the table below.
  • the siRNAs to which two thymidines (dT) are bound to the 3'end of the sense strand and the 5'end of the antisense strand of the siRNAs (No. 1) to (No. 5) are as follows. be.
  • the double-stranded RNA of the present invention can be produced by a known production method, for example, chemical synthesis in vitro.
  • chemical synthesis can be carried out by a nucleic acid synthesizer using an amidide resin containing a nucleic acid molecule which is a double-stranded RNA component as a raw material.
  • the double-stranded RNA of the present invention reduces the expression level of IL-23 in dendritic cells, and further improves the skin symptoms of psoriasis such as reduction of epidermal thickening and suppression of keratinocyte proliferation in the skin of psoriasis model mice. Demonstrate. Therefore, the double-stranded RNA of the present invention can be useful as a pharmaceutical composition (pharmaceutical).
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains double-stranded RNA.
  • a preferred embodiment is a pharmaceutical composition containing double-stranded RNA and an aliphatic carboxylic acid ionic liquid, and a more preferred embodiment is an external preparation containing double-stranded RNA and an aliphatic carboxylic acid ionic liquid. be.
  • the "aliphatic carboxylic acid-based ionic liquid” refers to a room temperature viscous liquid blended salt formed from an aliphatic carboxylic acid and an organic cation and having a melting point of 100 ° C. or lower.
  • Aliphatic carboxylic acid-based ionic liquids can be prepared by mixing an aliphatic carboxylic acid and an organic cation in an equimolar amount or an excess amount at room temperature or under heating. The excess amount of the aliphatic carboxylic acid and / or the organic cation is preferably within 0.2 times the molar amount.
  • the aliphatic carboxylic acid-based ionic liquid of the present invention can also be formed from an aliphatic carboxylic acid and an agent having an amine structure.
  • the "aliphatic carboxylic acid” refers to a carboxylic acid having one or more carboxyl groups.
  • the carbon chain in the aliphatic carboxylic acid may be linear or branched, and may be saturated or unsaturated. Further, it may have a substituent other than the carboxyl group, and the number and types of the substituents are not particularly limited. Examples of the substituent include an amino group, a hydroxyl group and the like. Examples of the aliphatic carboxylic acid include an aliphatic carboxylic acid having 2 to 20 carbon atoms.
  • Examples of the aliphatic carboxylic acid having 2 to 20 carbon atoms include lower fatty acids having 2 to 7 carbon atoms and keto acids, intermediate fatty acids having 8 to 12 carbon atoms and higher fatty acids having 13 to 20 carbon atoms.
  • Examples of the aliphatic carboxylic acid of the present invention include glycolic acid, methoxyacetic acid, levulinic acid, hexanoic acid, 2-ethylhexanoic acid, octanoic acid, decanoic acid, lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, isostearic acid, Examples include oleic acid. Among them, levulinic acid and isostearic acid are preferable.
  • the "organic cation” is a cationic organic compound, and examples thereof include an organic amine, an organic quaternary ammonium cation, and an organic quaternary phosphonium cation.
  • examples of the organic amine include organic amines having 4 to 12 carbon atoms, and ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, isopropanolamine, diisopropanolamine and triisopropanolamine are preferable.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain a double-stranded RNA and an aliphatic carboxylic acid-based mixed ionic liquid.
  • the "aliphatic carboxylic acid-based mixed ion liquid” is a mixture of two or more of the above-mentioned aliphatic carboxylic acid-based ion liquids (for example, an aliphatic carboxylic acid-based ion liquid having 2 to 20 carbon atoms).
  • Those having a common aliphatic carboxylic acid but different organic cations include a) one or more of a lower aliphatic carboxylic acid having 2 to 7 carbon atoms and an aliphatic carboxylic acid ionic liquid having 2 to 7 carbon atoms consisting of either ethanolamine, diethanolamine or triethanolamine.
  • an aliphatic carboxylic acid mixed ionic liquid consisting of an aliphatic carboxylic acid ionic liquid having 2 to 20 carbon atoms having a solubility of double-stranded RNA of 1 w / w% or less, and the aliphatic carboxylic acid ionic liquid.
  • an aliphatic carboxylic acid-based mixed ionic liquid which is dissolved in an aliphatic carboxylic acid-based ionic liquid and contains an organic solvent having a solubility of double-stranded RNA of 1 w / w% or less can be mentioned.
  • the "lower aliphatic carboxylic acid-based ionic liquid having 2 to 7 carbon atoms” refers to a lower aliphatic carboxylic acid having 2 to 7 carbon atoms and three kinds of organic amines of ethanolamine, diethanolamine, and triethanolamine. An equimolar molten salt or an equimolar equilibrium mixture with any of them.
  • the aliphatic carboxylic acid and / or the above-mentioned organic amine may be added in an excessive amount in consideration of the concentration of the double-stranded RNA used and the influence of the additive. The excess amount thereof is preferably within 0.2 times the molar amount.
  • the aliphatic carboxylic acid-based ionic liquid having 2 to 7 carbon atoms may be used alone or as a mixed ionic liquid of two or more kinds (including an ionic liquid when only the organic amine compound is different). ..
  • the aliphatic carboxylic acid-based ionic liquid having 2 to 7 carbon atoms is preferably a diethanolamine salt of glycolic acid, a triethanolamine salt of glycolic acid, a diethanolamine salt of methoxyacetic acid, a triethanolamine salt of methoxyacetic acid, or a diethanolamine of levulinic acid. It is a salt or a triethanolamine salt of levulinic acid, more preferably a diethanolamine salt of levulinic acid or a triethanolamine salt of levulinic acid.
  • An "aliphatic carboxylic acid mixed ionic liquid" obtained by diluting an aliphatic carboxylic acid fatty acid ionic liquid having 2 to 7 carbon atoms is necessary for dissolving double-stranded RNA and maintaining appropriate solubility. Can be used in quantity. The amount used depends on the amount of double-stranded RNA in the preparation, but is preferably 0.1 to 30 w / w%, and more preferably 0.1 to 10 w / w%.
  • the "aliphatic carboxylic acid-based ionic liquid having 2 to 20 carbon atoms" is an equimolar molten salt of an aliphatic carboxylic acid having 2 to 20 carbon atoms and an organic amine having 4 to 12 carbon atoms.
  • the aliphatic carboxylic acid and / or the above-mentioned organic amine may be added in an excessive amount in consideration of the concentration of the double-stranded RNA used and the influence of the additive. The excess amount thereof is preferably within 0.2 times the molar amount.
  • the aliphatic carboxylic acid-based ionic liquid may be a salt of ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, isopropanolamine, diisopropanolamine or triisopropanolamine. preferable. More preferably, it is a diisopropanolamine salt of decanoic acid and a triisopropanolamine salt of decanoic acid.
  • the aliphatic carboxylic acid-based ionic liquid is preferably a salt with an organic amine similar to that of the intermediate fatty acid. More preferably, it is a diisopropanolamine salt of isostearic acid and a triisopropanolamine salt of isostearic acid.
  • an expression vector capable of expressing the double-stranded RNA in the administration subject or a cell containing the expression vector may be used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can treat and / or prevent a disease caused by IL-23 expression.
  • disease caused by IL-23 expression refers to psoriasis, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, reactive arthritis, psoriatic arthritis, bone loss, airway hyperresponsiveness, chronic obstructive pulmonary disease, demyelination disorder, etc.
  • sclerosis multiple sclerosis, skin hypersensitivity, acute transplant rejection, chronic transplant rejection, allogeneic transplant rejection, implant-to-host disease, systemic sclerosis, systemic erythematosus, autoimmune inflammatory bowel disease, urinary inflammatory disease , Cardiovascular disease, vasculitis, periodic fever, glucose metabolism disorder, lung disease, cancer, periodontitis, herpes interstitial keratitis, allergies, inflammatory pain, spondyloarthropathies, septicemia, septic shock or internal Toxic shock, meningitis, surgical trauma, autoimmune blood disorders, Alzheimer's disease, sarcoidosis, liver cirrhosis, hepatitis (including autoimmune hepatitis), primary biliary cirrhosis, vegetation, thyroiditis, Atherosclerosis, alopecia, Wilson's disease, glomerular nephritis, and dyslipidemia. Among them, psoriasis is preferable.
  • treatment means any treatment of diseases caused by IL-23 expression or symptoms associated therewith, such as curing or ameliorating psoriasis, alleviating or suppressing symptoms associated with psoriasis. It also includes prevention of recurrence of diseases such as psoriasis.
  • prevention means preventing the onset of a disease caused by IL-23 expression, delaying the onset of a disease, and reducing the risk of developing a disease.
  • the "patient” refers to humans and animals, such as dogs, cats, and horses. Among them, human is preferable.
  • the "therapeutically effective amount” is an amount that brings about a therapeutic effect on a disease caused by IL-23 expression and the symptoms associated therewith, or an amount that causes a delay in the progression of the disease, as compared with an untreated patient. To say.
  • the term also includes, within that range, an amount effective in promoting normal physiological function.
  • Such effective amounts include the amount of double-stranded RNA of the present invention alone, the amount of combination of double-stranded RNA of the present invention, and other active ingredients useful in the treatment of diseases caused by IL-23 expression such as psoriasis.
  • the amount of double-stranded RNA of the present invention can be mentioned.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable active ingredient other than double-stranded RNA.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain commonly used known additives such as antioxidants, preservatives, thickeners and preservatives. Each of these additives may be used alone, or two or more thereof may be used in combination in an appropriate amount.
  • antioxidants examples include ascorbic acid, sodium hydrogen sulfite, sodium sulfite, erythorbic acid, tocopherol acetate, dibutylhydroxytoluene, tocopherol, sodium pyrosulfite, butylhydroxyanisole, and propyl gallate. Among them, sodium bisulfite and propyl gallate are preferable.
  • the content of the antioxidant in the pharmaceutical composition of the present invention can be appropriately adjusted depending on the type of the antioxidant and the like, but is, for example, 0.001 to 5 w / w%, preferably 0.003 to 2 w / w. It is w%, more preferably 0.005 to 1 w / w%. Moreover, you may use 1 type or 2 or more types of antioxidants together.
  • preservatives include benzoic acid, sodium benzoate, sorbic acid, sodium sorbate, sodium dehydroacetate, paraoxybenzoic acid, sodium paraoxybenzoate, ethyl paraoxybenzoate, propyl paraoxybenzoate (propylparaben), paraoxybenzoic acid.
  • examples thereof include butyl, isopropyl paraoxybenzoate, isobutyl paraoxybenzoate, propionic acid, sodium propionate, benzalkonium chloride, and salicylic acid.
  • methylparaben, propylparaben, benzalkonium chloride, salicylic acid or a mixture thereof is preferable.
  • the content of the preservative in the pharmaceutical composition of the present invention can be appropriately adjusted depending on the type of the preservative and the like, and is, for example, 0.01 to 0.5 w / w%, preferably 0.02 to 0. It is 3 w / w%, more preferably 0.03 to 0.2 w / w%.
  • one kind or two or more kinds of preservatives may be used together.
  • the thickener includes an inorganic material and an organic material, and examples of the inorganic material include amorphous silicon dioxide, kaolin (plaster), diatomaceous earth, talc, hydrous silicon dioxide, light anhydrous silicic acid, magnesium silicate, and calcium silicate. , Calcium phosphate, barium sulfate, and examples of the organic material include crystalline cellulose. Among them, light silicic anhydride is preferable.
  • the content of the thickener in the pharmaceutical composition of the present invention can be appropriately adjusted depending on the type of thickener and the like, but is, for example, 0.01 to 10 w / w%, preferably 0.05 to 5 w / w. It is w%, more preferably 0.1 to 1 w / w%. Further, the thickener may be used alone or in combination of two or more.
  • the chelating agent is preferably a chelating agent used for removing divalent metal ions such as Zn in order to suppress the activity of DNA degrading enzymes existing on the skin surface, and a chelate having less skin irritation.
  • the agent is more preferred.
  • the preservative include acetylacetate esters such as edetonic acid disodium salt (EDTA.2Na), acetylacetate methyl ester, and acetylacetate ethyl ester. Of these, EDTA ⁇ 2Na is preferable.
  • the content of the preservative in the pharmaceutical composition of the present invention can be appropriately adjusted depending on the type of the preservative and the like, but is, for example, 0.05 to 5 w / w%, preferably 0.03 to 3 w / w%. It is more preferably 0.01 to 2 w / w%. Moreover, you may use 1 type or 2 or more types of preservatives together.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is suitable for parenteral (for example, transdermal) administration.
  • Parenteral administration of the pharmaceutical composition of the present invention includes transdermal administration, intestinal administration (eg, intrarectal transport, intranasal transport), intravascular administration (eg, intravenous bolus injection, intravenous injection, intraarterial bolus). Injection, intraarterial infusion, catheter infusion into the vascular system), peri-tissue and intra-tissue administration, subcutaneous administration, inhalation administration.
  • transdermal administration is preferable.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can also be orally administered.
  • the content of the double-stranded RNA of the present invention in the pharmaceutical composition for transdermal administration is not particularly limited as long as it is absorbed transdermally and reaches a therapeutically effective amount. Its content is, for example, 0.01 to 5 w / w%, preferably 0.02 to 1 w / w%.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention can be appropriately prepared according to the physical condition, health condition, etc. of the patient.
  • oral administrations such as tablets, capsules, granules, powders, liquids, syrups, or injections, external preparations, inhalants, suppositories, eye drops, eye ointments, ear drops, nasal drops, etc.
  • a parenteral preparation such as an external preparation, a spray preparation, an ointment preparation, a cream preparation, a gel preparation, or a patch.
  • the pharmaceutical composition of the present invention dissolves or mixes an aliphatic carboxylic acid-based mixed ion liquid in which a double-stranded RNA, which is a medicinal ingredient, is dissolved in the base of the preparation. It can be dispersed, suspended and prepared as an external preparation.
  • the base of the external preparation include bases used for ointments, liquids, patches and the like.
  • the base of the ointment include white petrolatum, liquid paraffin, gelled hydrocarbon and the like.
  • the gelled hydrocarbon is a gelled hydrocarbon such as liquid paraffin, paraffin, isoparaffin, squalane, squalene, and polybutene.
  • liquid paraffin gelled with polyethylene resin and fats and oils gelled with rubber / elastomer are preferable.
  • the base of the liquid preparation include a mixed solution of alcohols such as isopropanol, ethanol, propylene glycol and glycerin and fats and oils such as olive oil and soybean oil.
  • the base of the patch include an adhesive.
  • the pressure-sensitive adhesive as the base of the patch is mainly composed of an elastomer, a pressure-sensitive adhesive, a softener, a filler, an antioxidant and the like. It should be noted that the softener, filler and antioxidant may not be contained.
  • the amount used varies depending on the patient's symptoms, age, etc., but in general, it is preferably applied once to several times a day to adults. .. Further, the external preparation of the present invention is more preferably applied once or twice a day, but the number of administrations may be increased depending on the symptom.
  • Example 1 In vitro evaluation of IL-23 expression-suppressing effect of siRNA (1) Preparation of siRNA Using the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, GC Score (containing the GC base of siRNA) was used by sequence design software (SISNIPER). Rate), Load Score (bias of siRNA internal energy), Position Score (position in target mRNA), Specificity Score (sequence specificity in genome), Profile Score (sequence characteristics common to active siRNA) Comparison) was calculated, and the total score was calculated based on this. Five target sequences capable of suppressing the expression of IL-23 having a total score of 81.0 or higher are selected, siRNA (No. 1) to siRNA (No.
  • siRNAs (No. 1) to (No. 5) are double-stranded RNAs having sequences represented by SEQ ID NOs: 2 to 6 and target sequences which are complementary sequences thereof, respectively.
  • SEQ ID NO: 1 is the nucleotide sequence of the mRNA of the p19 subunit of hedgehog-derived IL-23, which has a total length of 1358 nucleotides, and the sequence information is registered in GenBank as GenBank Accession No. AF301619.
  • IL-23 expression-suppressing effect of the five prepared siRNAs (No. 1) to (No. 5) was evaluated. Specifically, after culturing JAWSII cells (2 ⁇ 10 6 cells / mL), which is a dendritic cell line, for 24 hours under the conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 , 5 types of siRNA are used as transfection reagents, Lipofectamine. Was introduced into cells using (30 pmol / mL). After 24 hours, LPS was added (100 ng / mL), and after an additional 6 hours, cells were collected and lysed. IL-23 in cell lysate was evaluated by Western blot.
  • a cell solution without siRNA and LPS As controls, a cell solution without siRNA and LPS, a cell solution with LPS only, and a cell solution with siRNA against GFP, which is a siRNA that does not suppress the expression of IL-23 (hereinafter, also referred to as GFP siRNA) and LPS, are used. board.
  • FIG. 1 shows that the addition of LPS increases the expression level of IL-23, and the addition of siRNA of the present invention decreases the expression level of IL-23. It was observed that siRNA (No. 2) most reduced the expression level of IL-23. Therefore, siRNA (No. 2) was used as a test siRNA in the following tests.
  • Example 2 In vivo skin permeability test of siRNA-containing preparation (1) Preparation of siRNA-containing preparation Each component was weighed according to the content shown in Table 3 below, and the siRNA-containing preparation was prepared according to the following production method.
  • An ionic liquid (hereinafter referred to as ionic liquid A) is prepared by mixing levulinic acid and triethanolamine, sodium hydrogen sulfite and propyl gallate are added to the prepared ionic liquid A, and the mixture is dissolved at 60 ° C. to further add siRNA. It was added and dissolved at 60 ° C. to prepare a siRNA-containing ionic liquid A solution.
  • ionic liquid B an ionic liquid
  • siRNA-containing ionic liquid A solution and the ionic liquid B were mixed, and the obtained solution was used as the main drug solution.
  • the main drug solution, sodium edetate, light anhydrous silicic acid and gelled hydrocarbon were mixed to obtain an ointment preparation.
  • mice were prepared using the mouse according to the method described in J. Control. Release, 2017, 246, 120-132. Specifically, the back of a 5-week-old male C57BL / 6N mouse (source: Nippon SLC, weight: about 20 g) was shaved, and Imikimodo cream (Versena cream 5%, Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.) was applied to the back. In mice in which psoriasis symptoms were induced by applying 60 mg once a day for 4 days, erythema associated with skin inflammation, thickening due to hyperproliferation of keratinocytes, and an increase in the expression level of IL-23 were observed. Since these symptoms are consistent with those of psoriasis, it was shown that they can be used as psoriasis model mice.
  • siRNA-containing preparation prepared in (1) fluorescently labeled with FAM ( The test product) was applied to the back of the mouse to perform a skin permeability test.
  • FAM The test product
  • test preparation and the control preparation were applied to the shaved back of normal mice (C57BL / 6N mice) and psoriasis model mice, and 6 hours after application, the skin at the application site of each mouse was collected to prepare frozen sections by a conventional method. Then, the distribution of fluorescently labeled siRNA in the skin tissue was observed with a fluorescence microscope.
  • Example 3 Drug efficacy test of siRNA-containing preparation in mild psoriasis model mouse
  • the therapeutic effect of siRNA of the present invention on psoriasis was evaluated using the mild psoriasis model mouse.
  • imiquimod cream Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.
  • Example 2 (1) Example 3
  • Treatment was performed by applying 100 mg of the prepared siRNA-containing preparation or commercially available tacrolimus ointment 0.1% (Polapharma) once a day for 3 days, and on the 8th day, the skin was collected to collect the siRNA treatment group and tacrolimus. Frozen sections of the treatment group were prepared. In addition, the application site of the mouse was not treated from the 5th day, and the skin was collected on the 8th day to prepare a frozen section of the untreated group. The sections were stained with HE and immunostained with Ki-67, a cell proliferation marker, to evaluate the degree of epidermal thickening and the degree of skin overgrowth. The untreated group and the tacrolimus-treated group were used as controls. In addition, the degree of epidermal thickening and the degree of skin overgrowth were compared with the skin of normal mice.
  • FIG. 1 The images of HE staining of the skin tissue of normal mice and mild psoriasis model mice (untreated group, siRNA treated group and tacrolimus treated group) and the thickness ( ⁇ m) of the epidermis of each mouse are shown in FIG.
  • Treatment with siRNA and tacrolimus improved skin symptoms in all mice and recovered to the same extent as the skin of normal mice. No difference was found between the siRNA and tacrolimus treatment groups.
  • the siRNA preparation of the present invention has the same therapeutic effect as the existing therapeutic agent for psoriasis. Furthermore, it has been shown that the siRNA-containing preparation of the present invention has excellent skin permeability and can be useful as a preparation for transdermal administration.
  • Example 4 Drug efficacy test of siRNA-containing preparation in severe psoriasis model mouse
  • the therapeutic effect of siRNA of the present invention on psoriasis was evaluated using the severe psoriasis model mouse.
  • C57BL / 6N mice (15) were randomly classified into an untreated group, a siRNA (IL-23 siRNA and GFP siRNA) treated group, a tachlorimus treated group, and a normal mouse group in psoriasis model mice (each group).
  • n 3
  • the imikimod cream was continuously applied to the shaved back of the mouse for 7 days, and from the 5th day onward, in Example 2 (1).
  • 100 mg of the prepared siRNA-containing preparation, commercially available tacrolimus ointment or GFP siRNA is applied once a day for 3 days for treatment, and the skin is collected on the 8th day to collect IL-23 siRNA treatment group and tacrolimus treatment group.
  • frozen sections of the GFP siRNA treatment group were prepared.
  • the application site of the mouse was not treated from the 5th day, and the skin was collected on the 8th day to prepare a frozen section of the untreated group.
  • the sections were stained with HE and immunostained with Ki-67, a cell proliferation marker, to evaluate the degree of epidermal thickening and the degree of skin overgrowth.
  • the untreated group, tacrolimus-treated group, and GFP siRNA-treated group were used as controls.
  • the degree of epidermal thickening and the degree of skin overgrowth were compared with the skin of normal mice.
  • FIG. 6 HE-stained images of skin tissue of normal mice and model mice with severe psoriasis (untreated group, GFP siRNA treated group, IL-23 siRNA treated group and tachlorimus treated group) and the skin thickness ( ⁇ m) of each mouse are shown in FIG.
  • the images of Ki-67 immunostaining of the skin tissue of normal mice and severe psoriasis model mice in each group are shown in FIG. 6, and the untreated group, GFP siRNA treatment group and IL-23 siRNA treatment group in severe psoriasis model mice are shown in FIG.
  • the results of Western blot and the expression level of IL-23 in the skin tissue of each group are shown in FIG. In FIGS.
  • the siRNA of the present invention has been shown to exert a therapeutic effect even in severe psoriasis symptoms. Further, in FIG. 7, it was shown that the siRNA of the present invention causes a decrease in epidermal thickening, suppression of keratinocyte proliferation, and a decrease in the expression level of IL-23, but these effects were observed in the treatment of GFP siRNA. I could't. From the results of this study, it was shown that the siRNA preparation of the present invention exerts a therapeutic effect even in severe psoriasis symptoms, and the therapeutic effect is mediated by the specific suppression of IL-23. It was shown to be possible.
  • Example 5 Stabilization test of siRNA with ionic liquid The stabilizing action of siRNA with ionic liquid was evaluated. Specifically, siRNA (No. 2) (0.02 w / w%) was dissolved in an ionic liquid component (levulinic acid, triethanolamine, isostearic acid, diisopropanolamine) having the contents shown in Table 3 above, and the solution thereof was dissolved. The CD spectrum of the siRNA solution obtained by diluting with solution water was measured with a circular dichroic dispersometer J-1500 (JASCO Corporation). As a control, a siRNA solution dissolved in water and a mixture of the above ionic liquid component and water were used.
  • siRNA 0.02 w / w%
  • siRNA dissolved in an ionic liquid component prepared in the same manner as above and fetal bovine serum (Sigma) were mixed at a volume ratio of 1: 1 and incubated at 37 ° C. for 30 minutes, and then subjected to agarose gel electrophoresis. Degradation of siRNA was confirmed and the stability of siRNA was evaluated. In addition, the stability of siRNA was evaluated even in the absence of serum.
  • siRNA diluted with Tris-EDTA buffer (TE), HEPES buffer (HBS), or RPMI1640 medium (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used.
  • the CD spectra of siRNA, siRNA and the ionic liquid dissolved in the ionic liquid are shown in FIG. 8, and the results of agarose gel electrophoresis of the siRNA dissolved in the diluting solvent (TE, HBS, RPMI1640 medium or the ionic liquid (IL)) are shown in FIG. Shown in. It has been shown that lysing the siRNA in an ionic liquid stabilizes the association between the double strands of the siRNA. It was also shown that when siRNA is dissolved in a solvent other than an ionic liquid, siRNA is degraded in the serum, but when dissolved in an ionic liquid, the degradation of siRNA is suppressed. From the results of this test, it was shown that the ionic liquid contributes to the improvement of the stability of siRNA.
  • the double-stranded RNA of the present invention can specifically suppress the expression of IL-23, and may be useful for the treatment of diseases caused by IL-23 expression such as psoriasis.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can achieve high stability and skin permeability of double-stranded RNA by using an ionic liquid, and can efficiently deliver double-stranded RNA, which is an active ingredient, to the affected area. It can be used as a preparation for percutaneous absorption. Since the double-stranded RNA of the present invention is highly stable in a pharmaceutical product, it can be used at a low dose and is expected as a safe and economical therapeutic agent for psoriasis.

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Abstract

本発明は、ＩＬ－２３発現を特異的に抑制する新規ｓｉＲＮＡおよび当該ｓｉＲＮＡを含む医薬組成物、具体的には、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖ＲＮＡであって、各鎖が１９～３０ヌクレオチドからなり、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６で示される塩基配列およびその相補的な塩基配列を含む、二本鎖ＲＮＡ、および当該二本鎖ＲＮＡを含む医薬組成物を提供する。

Description

ＩＬ－２３発現を特異的に抑制する二本鎖ＲＮＡおよびそれを含む医薬組成物
　本発明は、ＩＬ－２３発現を特異的に抑制する二本鎖ＲＮＡ、および当該二本鎖ＲＮＡを含む医薬組成物に関する。より詳細には、ＩＬ－２３発現を特異的に抑制するｓｉＲＮＡ、および当該ｓｉＲＮＡおよびイオン液体を含む製剤に関する。
　乾癬とは、皮膚が赤くなる紅斑、その表面を覆う銀白色の細かいかさぶたの鱗屑、角質細胞の過増殖による肥厚、免疫細胞の浸潤による炎症を伴う、皮膚局所性疾患である。また、乾癬は、複数の類型、尋常性乾癬、関節症性乾癬（乾癬性関節炎）、滴状乾癬、乾癬性紅皮症および膿疱性乾癬に分類される。
　乾癬の治療では、多くの場合、症状を緩和させるためにステロイド系または非ステロイド系抗炎症剤が用いていた。しかしながら、このような薬剤での治療が長期間に及ぶと、炎症の慢性化、そして、副作用、例えば非ステロイド系抗炎症剤に起因する胃潰瘍の発生につながることから、安全に使用できる乾癬治療剤の開発が切望されている。
　乾癬の発症メカニズムについては未だ不明な点もあるが、自己抗原によって活性化された樹状細胞がＩＬ－２３を分泌してＴｈ１７細胞を活性化し、続いてＴｈ１７細胞がＩＬ－１７を分泌して角質細胞を刺激し、最終的に角質細胞の過増殖および種々の炎症反応が起こることで発症するとの報告がある（非特許文献１）。
　特許文献１には、Ｔｈ１７Ｔ細胞分化をモジュレートすることは自己免疫疾患および／または炎症障害の治療に有用であることが記載されており、ＩＬ－２３とそれらの疾患との関連性が示されています。
　そのため、ＩＬ－２３発現を抑制することは、乾癬などの種々の疾患の発症およびその進行の治療において有用となり得ることから、ＩＬ－２３は乾癬などの種々の疾患の治療の新たな標的となっている。実際に、ＩＬ－２３のサブユニットタンパク質であるｐ１９を特異的に阻害するモノクローナル抗体の開発が進み（特許文献２および３）、乾癬治療剤としてヒト型抗ヒトＩＬ－２３ｐ１９モノクローナル抗体製剤であるトレムフィア（登録商標）が認可されている。しかしながら、トレムフィア（登録商標）などの抗体医薬品は、高い治療効果を示す一方で、注射剤として使用するために全身性の副作用が現れるリスクがある。また、注射剤による強い痛みが生じ患者の精神的・肉体的な負担が大きいこと、注射のための設備が必要であり、また抗体が高価であるといったデメリットも存在する。
　そこで、抗体医薬品に代わる候補の一つとして核酸医薬品が注目されており、その中でもｓｉＲＮＡの研究が精力的に進められている。ｓｉＲＮＡは２１～２３程度の塩基対から成る二本鎖のＲＮＡであり（分子量約１３３００）、標的タンパク質のｍＲＮＡを特異的に切断することによって特定の遺伝子発現を抑制することができ、その遺伝子に関わる疾患に対して高い治療効果をもたらすことが期待されている。また、ｓｉＲＮＡは、低分子化合物と同様に化学的な合成技術で製造できることから抗体医薬品と比べると製造が比較的容易であり、また、安価に製造できるといった利点を有している。
　ＩＬ－２３の発現を抑制するｓｉＲＮＡの存在はすでに報告されている（非特許文献２）。しかしながら、乾癬の類型は態様であり、それに応じて治療剤を適宜選択できるようにより効果の高いｓｉＲＮＡが求められている。
　また、ｓｉＲＮＡを用いた医薬品研究開発は盛んに進められているが、現在のｓｉＲＮＡ医薬品候補のほとんどは注射剤である。ｓｉＲＮＡは、水溶性の高分子であるため単純塗布による受動拡散で皮膚内に送達させることが非常に困難であること、そして、細胞内外に存在する核酸加水分解酵素であるヌクレアーゼにより容易に加水分解され切断されてしまうことから、生体内で遺伝子の発現を抑制することができないといった問題が存在しており、注射剤以外の製剤としての使用は極めて困難と考えられていた。実際、ｓｉＲＮＡを用いた経皮投与用製剤はいまだ上市に至っていない。
特表２０１６－５２５８７３号公報 国際公開第２００７／０７６５２４号パンフレット 特開２０１７－０６０４８２号公報
J. Allergy Clin. Immunol., 2017, 140, 645-653 Cytokine. 2017 Nov; 99: 310-315.
　本発明は、ＩＬ－２３発現を特異的に抑制する新規二本鎖ＲＮＡを見出すと共に、細胞膜透過性が低く、またヌクレアーゼによる分解を受けるといった問題を克服して、臨床適用可能なｓｉＲＮＡを含む製剤、特に経皮投与用製剤を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、ＩＬ－２３のｐ１９サブユニットのｍＲＮＡを標的とする特定のｓｉＲＮＡが、細胞においてＩＬ－２３発現を効果的に抑制し、また乾癬モデルマウスにおいて乾癬症状を改善することを見出した。さらに、脂肪族カルボン酸系イオン液体を用いることで、ｓｉＲＮＡの安定性が向上すると共に、ｓｉＲＮＡの皮膚への透過性が改善されることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、以下の態様を提供するものである。
［項１］　センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖ＲＮＡであって、各鎖が１９～３０ヌクレオチドからなり、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６で示される塩基配列およびその相補的な塩基配列を含む、二本鎖ＲＮＡ。
［項２］　各鎖が、１９～２５ヌクレオチドからなる、項１に記載の二本鎖ＲＮＡ。
［項３］　各鎖の鎖内の１つ以上のヌクレオチドが化学修飾されているかまたは各鎖の５’末端もしくは３’末端のヌクレオチドが化学修飾されている、項１または項２に記載の二本鎖ＲＮＡ。
［項４］　該化学修飾が、ホスホロチオエート修飾、２’－Ｆ修飾、２’－ＯＭｅ修飾、２’－ＭＯＥ修飾、ＬＮＡ修飾およびＥＮＡ修飾からなる群から選択される、項３に記載の二本鎖ＲＮＡ。
［項５］　センス鎖の３’末端およびアンチセンス鎖の５’末端に１～１０デオキシリボヌクレオチドが結合している、項１～項４のいずれかに記載の二本鎖ＲＮＡ。
［項６］　センス鎖の３’末端およびアンチセンス鎖の５’末端に２個のチミジン（ｄＴ）が結合している、項５に記載の二本鎖ＲＮＡ。
［項７］　ＩＬ－２３発現を特異的に抑制するための、項１～項６のいずれかに記載の二本鎖ＲＮＡ。
［項８］　項１～項７のいずれかに記載の二本鎖ＲＮＡを含む医薬組成物。
［項９］　さらに脂肪族カルボン酸系イオン液体を含む、項８に記載の医薬組成物。
［項１０］　該脂肪族カルボン酸系イオン液体が、２種以上の脂肪族カルボン酸系イオン液体を含む脂肪族カルボン酸系混合イオン液体である、項９に記載の医薬組成物。
［項１１］　該脂肪酸系混合イオン液体が、
　ａ）炭素数２～７の低級脂肪族カルボン酸と、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミンのいずれかとからなる炭素数２～７の脂肪族カルボン酸系イオン液体の一種以上と、
　ｂ）二本鎖ＲＮＡの溶解度が１ｗ／ｗ％以下である炭素数２～２０の脂肪族カルボン酸系イオン液体である、項１０に記載の医薬組成物。
［項１２］　経皮吸収型製剤である、項８～項１１のいずれかに記載の医薬組成物。
［項１３］　ＩＬ－２３発現に起因する疾患を治療するための、項８～項１２のいずれかに記載の医薬組成物。
［項１４］　該疾患が、乾癬である、項１３に記載の医薬組成物。
　さらに、本発明は、以下の態様も提供するものである。
［項１５］　治療が必要な患者に、項１～項６のいずれかに記載の二本鎖ＲＮＡを投与することを含む、ＩＬ－２３発現に起因する疾患の治療方法。
［項１６］　該疾患が、乾癬である、項１５に記載の治療方法。
［項１７］　ＩＬ－２３発現に起因する疾患を治療するための医薬の製造における、項１～項６のいずれかに記載の二本鎖ＲＮＡの使用。
［項１８］　該疾患が、乾癬である、項１７に記載の使用。
［項１９］　ＩＬ－２３発現に起因する疾患を治療するための、項１～項６のいずれかに記載の二本鎖ＲＮＡ。
［項２０］　該疾患が、乾癬である、項１９に記載の二本鎖ＲＮＡ。
［項２１］　以下：
（１）脂肪族カルボン酸と有機アミンを混合して、イオン液体を得る工程；
（２）項１～項６のいずれかに記載の二本鎖ＲＮＡを（１）で得られたイオン液体に溶解させ、二本鎖ＲＮＡ含有イオン液体溶液を得る工程；
（３）（２）で得られた二本鎖ＲＮＡ含有イオン液体溶液を別に調製したイオン液体と混合して、主薬液を得る工程
を含む、二本鎖ＲＮＡ含有経皮投与用製剤の製造方法。
［項２２］　項１～項６のいずれかに記載の二本鎖ＲＮＡを含む発現ベクター。
［項２３］　項２２に記載の発現ベクターを含む細胞。
　本発明の二本鎖ＲＮＡは、ＩＬ－２３の発現を特異的に抑制することができ、乾癬などのＩＬ－２３発現に起因する疾患の治療に有用でありうる。また、本発明の医薬組成物は、イオン液体を用いることにより、二本鎖ＲＮＡの高い安定性および皮膚透過性を達成し、効率よく有効成分である二本鎖ＲＮＡを患部に送達できるため、経皮吸収用製剤としての使用が可能となる。本発明の二本鎖ＲＮＡは、製剤中での安定性が高いことから、低用量で使用することができ、安全性および経済性に優れた乾癬治療剤として期待される。
図１は、対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ、ＬＰＳ、ＬＰＳ＋ＧＦＰ ｓｉＲＮＡ）および本発明のｓｉＲＮＡ（ＬＰＳ＋ｓｉＲＮＡ（Ｎｏ．１）～ｓｉＲＮＡ（Ｎｏ．５））のウェスタンブロットの結果を示し、ＬＰＳのみを添加した細胞溶液中のＩＬ－２３発現量を１とした場合のＣｏｎｔｒｏｌ、ＧＦＰ ｓｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ（Ｎｏ．１）～ｓｉＲＮＡ（Ｎｏ．５）におけるＩＬ－２３発現量の割合を示す。 図２は、正常マウスおよび乾癬モデルマウスにおけるイオン液体非存在下および存在下での蛍光標識ｓｉＲＮＡの画像およびその画像と皮膚組織の明視野画像との重ね合わせ画像を示す。ｓｉＲＮＡは、四角に囲まれた範囲に存在しており、主に角質層付近に存在し、一部表皮にも存在している。 図３は、正常マウスおよび各群の軽度乾癬モデルマウスの皮膚組織のＨＥ染色の画像および各マウスの表皮の厚さ（μｍ）を示す。 図４は、正常マウスおよび各群の軽度乾癬モデルマウスの皮膚組織のＫｉ－６７免疫染色の画像を示す。 図５は、正常マウスおよび各群の重度乾癬モデルマウスの皮膚組織のＨＥ染色の画像および各マウスの表皮の厚さ（μｍ）を示す。 図６は、正常マウスおよび各群の重度乾癬モデルマウスの皮膚組織のＫｉ－６７免疫染色の画像を示す。 図７は、重度乾癬モデルマウスにおける未治療群、ＧＦＰ ｓｉＲＮＡ治療群およびＩＬ－２３ ｓｉＲＮＡ治療群のウェスタンブロットの結果ならびに各群の皮膚組織中のＩＬ－２３の発現量を示す。 図８は、イオン液体（ＩＬ）に溶解したｓｉＲＮＡ、水に溶解したｓｉＲＮＡおよびイオン液体（ＩＬ）のＣＤスペクトルを示す。 図９は、希釈溶媒（Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ（ＴＥ）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ＨＢＳ）、ＲＰＭＩ１６４０培地またはイオン液体（ＩＬ））に溶解したｓｉＲＮＡのアガロースゲル電気泳動の結果を示す。
　本発明は、ＩＬ－２３の発現を特異的に抑制する二本鎖ＲＮＡ、および皮膚疾患（例えば、乾癬）などのＩＬ－２３発現に起因する疾患を治療するための前記二本鎖ＲＮＡを含む医薬組成物を提供するものである。
　本発明において、「二本鎖ＲＮＡ」とは、標的となる塩基配列とそれに相補的な塩基配列を有するＲＮＡ鎖が逆向きに結合している二本鎖核酸分子をいう。その例として、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。本発明の二本鎖ＲＮＡは、好ましくはｓｉＲＮＡである。
　本発明の二本鎖ＲＮＡは、ＩＬ－２３のｐ１９サブユニットのｍＲＮＡの標的配列に相補的なアンチセンス鎖と当該アンチセンス鎖に相補的な配列であるセンス鎖がハイブリダイズしてなるものであり、標的ＲＮＡを切断する作用（ＲＮＡ干渉作用）を有し、ＩＬ－２３の発現を抑制する機能を有する。
　本発明の二本鎖ＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖の長さは、同一であっても異なっていてもよい。その長さは、１９～３０ヌクレオチドであり、好ましくは１９～２５ヌクレオチドであり、より好ましくは１９～２３ヌクレオチドであり、さらに好ましくは１９～２１ヌクレオチドまたは１９ヌクレオチドである。
　本発明の二本鎖ＲＮＡは、各鎖の鎖内の１つ以上のヌクレオチドが化学修飾されていてもよく、また、各鎖の５’末端もしくは３’末端が化学修飾されていてもよい。化学修飾は、核酸加水分解酵素であるヌクレアーゼに対する抵抗性を付与し、生体内などでの安定性を向上させる。化学修飾の例として、ホスホロチオエート修飾、２’－Ｆ修飾、２’－ＯＭｅ修飾、２’－ＭＯＥ修飾、ＬＮＡ修飾、ＥＮＡ修飾などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、化学修飾を施す方法は、特に限定されないが、公知の方法を利用することができる。
　本発明の二本鎖ＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖の両端は、平滑末端であってもよく、突出末端（オーバーハング）であってもよい。
　本発明の二本鎖ＲＮＡの各鎖の突出末端部分は、１～１０ヌクレオチドであり、好ましくは１～５ヌクレオチドであり、より好ましくは１～２ヌクレオチドである。各鎖の突出末端の長さは、同一であっても異なっていてもよい。突出末端部分のヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドであってもよい。本発明の二本鎖ＲＮＡは、好ましくはセンス鎖の３’末端およびアンチセンス鎖の５’末端に２個のチミジン（ｄＴ）を含む。
　本発明の二本鎖ＲＮＡは、センス鎖の３’末端とアンチセンス鎖の５’末端またはセンス鎖の５’末端とアンチセンス鎖の３’末端の数個のヌクレオチドによってループ構造を形成してもよい。ループ構造を有する二本鎖ＲＮＡとして、例えば、センス鎖の３’末端の２ヌクレオチドとアンチセンス鎖の５’末端の２ヌクレオチドがループを形成したｓｉＲＮＡなどが挙げられる。
　本発明の二本鎖ＲＮＡは、本発明の二本鎖ＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列がハイブリダイズし、ＩＬ－２３発現抑制効果をもたらす限り、少なくとも１個のミスマッチを有していてもよい。例えば、本発明の二本鎖ＲＮＡは、１個の置換された塩基を有する。
　本発明の二本鎖ＲＮＡは、好ましくは下表の（１）～（５）に示すセンス配列とアンチセンス配列とから形成されるｓｉＲＮＡである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　また、上記ｓｉＲＮＡ（Ｎｏ．１）～（Ｎｏ．５）のセンス鎖の３’末端およびアンチセンス鎖の５’末端に２個のチミジン（ｄＴ）が結合しているｓｉＲＮＡは、以下のとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　本発明の二本鎖ＲＮＡは、公知の製造方法、例えば、in vitroでの化学的合成によって製造することができる。例えば、化学的合成は、二本鎖ＲＮＡ構成要素である核酸分子を含むアミダイド樹脂を原料として、核酸合成装置により実施することができる。
　本発明の二本鎖ＲＮＡは、樹状細胞においてＩＬ－２３発現量を低下させ、さらに乾癬モデルマウスの皮膚において表皮の肥厚の減少および角化細胞の増殖抑制などの乾癬の皮膚症状の改善効果を発揮する。したがって、本発明の二本鎖ＲＮＡは、医薬組成物（医薬）として有用でありうる。
　本発明の医薬組成物は、二本鎖ＲＮＡを含むものである。好ましい実施態様は、二本鎖ＲＮＡと脂肪族カルボン酸系イオン液体を含有する医薬組成物であり、より好ましい実施態様は、二本鎖ＲＮＡと脂肪族カルボン酸系イオン液体を含有する外用剤である。
　本発明において、「脂肪族カルボン酸系イオン液体」とは、脂肪族カルボン酸と有機カチオンから形成される常温粘稠液状のブレンステッド塩であって、融点が１００℃以下のものをいう。脂肪族カルボン酸系イオン液体は、脂肪族カルボン酸と有機カチオンを等モル量または過剰量で室温または加温下で混合することにより、調製することができる。脂肪族カルボン酸および／または有機カチオンの過剰量は、好ましくは０．２倍モル量以内である。本発明の脂肪族カルボン酸系イオン液体は、脂肪族カルボン酸およびアミン構造を有する薬剤からも形成されうる。
　本発明において、「脂肪族カルボン酸」とは、１個以上のカルボキシル基を有するカルボン酸をいう。脂肪族カルボン酸中の炭素鎖は、直鎖でも分枝であってもよく、飽和でも不飽和であってもよい。また、カルボキシル基以外にも置換基を有していてもよく、置換基の数およびその種類は特に限定されるものではない。置換基の例として、アミノ基、ヒドロキシル基などが挙げられる。
　脂肪族カルボン酸としては、例えば炭素数２～２０の脂肪族カルボン酸が挙げられる。炭素数２～２０の脂肪族カルボン酸としては、炭素数２～７の低級脂肪酸およびケト酸、炭素数８～１２の中級脂肪酸および炭素数１３～２０の高級脂肪酸が挙げられる。
　本発明の脂肪族カルボン酸の例として、グリコール酸、メトキシ酢酸、レブリン酸、ヘキサン酸、２－エチルヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸、オレイン酸などが挙げられる。その中でも、レブリン酸およびイソステアリン酸が好ましい。
　本発明において、「有機カチオン」とは、カチオン性有機化合物であり、例えば、有機アミン、有機４級アンモニウムカチオン、有機４級ホスホニウムカチオンなどが挙げられる。有機アミンとしては、例えば炭素数４～１２の有機アミンが挙げられ、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、イソプロパノールアミン、ジイソプロパノールアミンおよびトリイソプロパノールアミンが好ましい。
　本発明の医薬組成物は、二本鎖ＲＮＡと脂肪族カルボン酸系混合イオン液体を含むものであってもよい。本発明において、「脂肪族カルボン酸系混合イオン液体」とは、上記脂肪族カルボン酸系イオン液体（例えば、炭素数２～２０の脂肪族カルボン酸系イオン液体）が２種以上混合されているものをいい、脂肪族カルボン酸が共通であるが有機カチオン（有機アミン）が異なるもの、有機カチオン（有機アミン）が共通であるが脂肪族カルボン酸が異なるもの、脂肪族カルボン酸および有機カチオン（有機アミン）が異なるものである３種の混合イオン液体が存在する。その例として、ａ）炭素数２～７の低級脂肪族カルボン酸と、エタノールアミン、ジエタノールアミンまたはトリエタノールアミンのいずれかとからなる炭素数２～７の脂肪族カルボン酸系イオン液体の一つ以上と、ｂ）二本鎖ＲＮＡの溶解度が１ｗ／ｗ％以下である炭素数２～２０の脂肪族カルボン酸系イオン液体からなる脂肪族カルボン酸系混合イオン液体、その脂肪族カルボン酸系イオン液体にさらにｃ）脂肪族カルボン酸系イオン液体に溶解し且つ二本鎖ＲＮＡの溶解度が１ｗ／ｗ％以下の有機溶媒を含む脂肪族カルボン酸系混合イオン液体が挙げられる。
　本発明において、「炭素数２～７の低級脂肪族カルボン酸系イオン液体」とは、炭素数２～７の低級脂肪族カルボン酸とエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミンの３種の有機アミンのいずれかとの等モルの常温溶融塩または等モルの平衡混合物をいう。脂肪族カルボン酸および／または上記有機アミンは、使用する二本鎖ＲＮＡの濃度および添加剤の影響を考慮し、過剰量添加してもよい。それらの過剰量としては、０．２倍モル量以内が望ましい。
　また、炭素数２～７の脂肪族カルボン酸系イオン液体は単独で用いてもよく、２種以上の混合イオン液体（有機アミン化合物のみが相違する場合のイオン液体も含む）として用いてもよい。
　炭素数２～７の脂肪族カルボン酸系イオン液体は、好ましくは、グリコール酸のジエタノールアミン塩、グリコール酸のトリエタノールアミン塩、メトキシ酢酸のジエタノールアミン塩、メトキシ酢酸のトリエタノールアミン塩、レブリン酸のジエタノールアミン塩またはレブリン酸のトリエタノールアミン塩であり、より好ましくは、レブリン酸のジエタノールアミン塩またはレブリン酸のトリエタノールアミン塩である。
　炭素数２～７の脂肪族カルボン酸脂肪酸系イオン液体を希釈して得られる「脂肪族カルボン酸系混合イオン液体」は、二本鎖ＲＮＡを溶解させ、適切な溶解度を保持するために必要な量で使用することができる。その使用量は、製剤中の二本鎖ＲＮＡの量に依存するが、好ましくは０．１～３０ｗ／ｗ％であり、より好ましくは０．１～１０ｗ／ｗ％である。
　本発明において、「炭素数２～２０の脂肪族カルボン酸系イオン液体」とは、炭素数２～２０の脂肪族カルボン酸と炭素数４～１２の有機アミンとの等モルの常温溶融塩または等モルの平衡混合物をいう。脂肪族カルボン酸および／または上記有機アミンは、使用する二本鎖ＲＮＡの濃度および添加剤の影響を考慮し、過剰量添加してもよい。それらの過剰量としては、０．２倍モル量以内が望ましい。
　脂肪族カルボン酸として炭素数８～１２の中級脂肪酸を使用する場合、脂肪族カルボン酸系イオン液体は、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、イソプロパノールアミン、ジイソプロパノールアミンまたはトリイソプロパノールアミンとの塩が好ましい。より好ましくは、デカン酸のジイソプロパノールアミン塩およびデカン酸のトリイソプロパノールアミン塩である。
　脂肪族カルボン酸として炭素数が１３～２０の高級脂肪酸を使用する場合、脂肪族カルボン酸系イオン液体は、中級脂肪酸と同様の有機アミンとの塩が好ましい。より好ましくは、イソステアリン酸のジイソプロパノールアミン塩およびイソステアリン酸のトリイソプロパノールアミン塩である。
　本発明の医薬組成物は、本発明の二本鎖ＲＮＡに換えて、投与対象内で当該二本鎖ＲＮＡを発現可能な発現ベクターまたは当該発現ベクターを含む細胞を用いてもよい。
　本発明の医薬組成物は、二本鎖ＲＮＡがＩＬ－２３発現抑制作用を有することから、ＩＬ－２３発現に起因する疾患を治療および／または予防することができる。
　本発明において、「ＩＬ－２３発現に起因する疾患」とは、乾癬、関節リウマチ、骨関節炎、反応性関節炎、乾癬性関節炎、骨喪失、気道過敏症、慢性閉塞性肺疾患、脱髄障害、多発性硬化症、皮膚過敏症、急性移植拒絶、慢性移植拒絶、同種移植片拒絶、移植片対宿主病、全身性硬化症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性炎症性腸疾患、泌尿器系炎症性疾患、心血管疾患、血管炎、周期性発熱、グルコース代謝障害、肺疾患、癌、歯周炎、ヘルペス性間質性角膜炎、アレルギー、炎症性疼痛、脊椎関節症、敗血症、敗血症性ショックまたは内毒素性ショック、髄膜炎、外科手術による外傷、自己免疫性血液障害、アルツハイマー病、サルコイドーシス、肝硬変、肝炎（自己免疫性肝炎を含めた）、原発性胆汁性肝硬変、ブドウ膜炎、甲状腺炎、アテローム性動脈硬化、脱毛症、ウィルソン病、糸球体腎炎、および脂質異常症が挙げられる。その中でも、乾癬が好ましい。
　本発明において、「治療」とは、ＩＬ－２３発現に起因する疾患またはそれに伴う症状のあらゆる治療、例えば、乾癬を治癒または改善すること、乾癬に伴う症状を緩和または抑制することをいう。また、乾癬などの疾患の再発の防止も含まれる。
　本発明において、「予防」とは、ＩＬ－２３発現に起因する疾患の発症を阻止すること、疾患の発症を遅らせること、疾患の発症の危険性を低下させることをいう。
　本発明において、「患者」とは、ヒトおよび動物、例えば、イヌ、ネコ、ウマなどをいう。その中でも、ヒトが好ましい。
　本発明において、「治療上の有効量」とは、未治療患者と比べて、ＩＬ－２３発現に起因する疾患およびそれに伴う症状の治療効果をもたらす量、またはその疾患の進行の遅延をもたらす量をいう。当該用語は、その範囲内に、正常な生理的機能を促進するのに有効な量も含む。
　かかる有効量として、本発明の二本鎖ＲＮＡ単独の量、本発明の二本鎖ＲＮＡの組み合わせの量および乾癬などのＩＬ－２３発現に起因する疾患の治療に有用な他の活性成分と組み合わせた本発明の二本鎖ＲＮＡの量が挙げられる。
　本発明の医薬組成物は、二本鎖ＲＮＡ以外の医薬的に許容される活性成分を含んでいてもよい。
　本発明の医薬組成物は、一般に使用される公知の添加剤、例えば抗酸化剤、防腐剤、増粘剤、保存剤を含んでいてもよい。これらの添加剤は、それぞれ単独で用いてもよく、また、２種以上を適当な量で組み合わせて用いてもよい。
　抗酸化剤としては、例えばアスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、エリソルビン酸、酢酸トコフェロール、ジブチルヒドロキシトルエン、トコフェロール、ピロ亜硫酸ナトリウム、ブチルヒドロキシアニソール、没食子酸プロピルなどが挙げられる。その中でも、亜硫酸水素ナトリウム、没食子酸プロピルが好ましい。本発明の医薬組成物における抗酸化剤の含有量は、抗酸化剤の種類などにより適宜調整することができるが、例えば０．００１～５ｗ／ｗ％であり、好ましくは０．００３～２ｗ／ｗ％であり、より好ましくは０．００５～１ｗ／ｗ％である。また、抗酸化剤は１種または２種以上一緒に用いてもよい。
　防腐剤としては、例えば安息香酸、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、ソルビン酸ナトリウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、パラオキシ安息香酸、パラオキシ安息香酸ナトリウム、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル（プロピルパラベン)、パラオキシ安息香酸ブチル、パラオキシ安息香酸イソプロピル、パラオキシ安息香酸イソブチル、プロピオン酸、プロピオン酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、サリチル酸などが挙げられる。その中でも、メチルパラベン、プロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、サリチル酸またはそれらの混合物が好ましい。本発明の医薬組成物における防腐剤の含有量は、防腐剤の種類などにより適宜調整することができるが、例えば０．０１～０．５ｗ／ｗ％であり、好ましくは０．０２～０．３ｗ／ｗ％であり、より好ましくは０．０３～０．２ｗ／ｗ％である。また、防腐剤は１種または２種以上一緒に用いてもよい。
　増粘剤は、無機材料および有機材料を含み、無機材料としては、例えば非晶性二酸化ケイ素、カオリン（石膏)、珪藻土、タルク、含水二酸化ケイ素、軽質無水ケイ酸、ケイ酸マグネシウム、ケイ酸カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸バリウムが挙げられ、有機材料としては、例えば結晶セルロースが挙げられる。その中でも、軽質無水ケイ酸が好ましい。本発明の医薬組成物における増粘剤の含有量は、増粘剤の種類などにより適宜調整することができるが、例えば０．０１～１０ｗ／ｗ％であり、好ましくは０．０５～５ｗ／ｗ％であり、より好ましくは０．１～１ｗ／ｗ％である。また、増粘剤は１種または２種以上一緒に用いてもよい。
　保存剤としては、二本鎖ＲＮＡの分解を抑制するためにキレート剤を使用することが好ましい。本発明において、キレート剤は、皮膚表面に存在するＤＮＡ分解酵素の活性を抑制するため、Ｚｎ等の２価金属イオンを除去することに使用されるキレート剤が好ましく、さらに皮膚刺激性の少ないキレート剤がより好ましい。保存剤としては、例えばエデト酸２ナトリウム塩（ＥＤＴＡ・２Ｎａ）、アセチル酢酸メチルエステル、アセチル酢酸エチルエステルなどのアセチル酢酸エステルが挙げられる。この中でも、ＥＤＴＡ・２Ｎａが好ましい。本発明の医薬組成物における保存剤の含有量は、保存剤の種類などにより適宜調整することができるが、例えば０．０５～５ｗ／ｗ％であり、好ましくは０．０３～３ｗ／ｗ％であり、より好ましくは０．０１～２ｗ／ｗ％である。また、保存剤は１種または２種以上一緒に用いてもよい。
　本発明の医薬組成物は、非経口（例えば、経皮）投与に適している。本発明の医薬組成物の非経口投与としては、経皮投与、経腸投与（例えば、直腸内輸送、鼻腔内輸送）、血管内投与（例えば、静脈内ボーラス注射、静脈内注入、動脈内ボーラス注射、動脈内注入、血管系へのカテーテル点滴注入）、組織周囲および組織内投与、皮下投与、吸入投与が挙げられる。その中でも、経皮投与が好ましい。また、本発明の医薬組成物は、経口投与することもできる。
　経皮投与用医薬組成物における本発明の二本鎖ＲＮＡの含有量は、経皮吸収されて治療上有効な量に到達する量であればよく、特に限定されるものではない。その含有量は、例えば０．０１～５ｗ／ｗ％であり、好ましくは０．０２～１ｗ／ｗ％である。
　本発明の医薬組成物の剤形は、患者の身体状況、健康状態などに応じて適宜調製することができる。例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、シロップ剤などの経口投与剤、または注射剤、外用剤、吸入剤、坐剤、点眼剤、眼軟膏剤、点耳剤、点鼻剤、外用剤、スプレー剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤などの非経口投与剤の剤形に、常法により調製されうる。
　本発明の医薬組成物を外用剤として使用する場合、本発明の医薬組成物は、薬効成分である二本鎖ＲＮＡを溶解した脂肪族カルボン酸系混合イオン液体を製剤の基剤に溶解または混合分散させ、懸濁して外用剤として調製されうる。外用剤の基剤としては、軟膏剤、液剤、貼付剤などに使用される基剤が挙げられる。
　軟膏剤の基剤としては、例えば、白色ワセリン、流動パラフィン、ゲル化炭化水素などが挙げられる。ゲル化炭化水素とは、流動パラフィン、パラフィン、イソパラフィン、スクワラン、スクワレン、ポリブテンなどの炭化水素をゲル化したものである。特に、流動パラフィンをポリエチレン樹脂でゲル化したもの、油脂をゴム・エラストマーでゲル化したものが好ましい。例えば、流動パラフィン（日局）を５～１０重量％のポリエチレン樹脂でゲル化したプラスチベース（商品名）、ポロイド（商品名）、ゲル化炭化水素にグリセリン脂肪酸エステルを加えて親水性を付与した親水ゲル化炭化水素（プラスチベースハイドロフィリック（商品名））などが挙げられる。
　液剤の基剤としては、例えば、イソプロパノール、エタノール、プロピレングリコール、グリセリンなどのアルコール類と、オリーブ油、ダイズ油などの油脂類との混合溶液が挙げられる。
　貼付剤の基剤としては、例えば、粘着剤が挙げられる。貼付剤の基剤としての粘着剤とは、主にエラストマーと粘着付与剤、軟化剤、充填剤、抗酸化剤などからなるものである。なお、軟化剤、充填剤および抗酸化剤は含まれていなくてもよい。
　本発明の医薬組成物を外用剤として使用する場合、その使用量は、患者の症状や年齢等により異なるが、一般的には、成人に対して１日１回～数回適用することが好ましい。また、本発明の外用剤は、１日１～２回適用することがさらに好ましいが、症状によっては投与回数を増やしてもよい。
　以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明する。本発明は以下の実施例に何ら限定されるものではない。
実施例１：ｓｉＲＮＡのＩＬ－２３の発現抑制効果のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価
（１）ｓｉＲＮＡの作製
　配列番号１で示される塩基配列を用いて、配列デザインソフトウェア（SISNIPER）によりGC Score（siRNAのGC塩基含有率）、Load Score（siRNA内部エネルギーの偏り）、Position Score（標的mRNA中の位置）、Specificity Score（ゲノム中での配列特異性）、Profile Score（活性のあるsiRNAに共通する配列的特徴との比較）を算出し、これを基にTotal scoreを算出した。Total scoreが81.0以上であるＩＬ－２３の発現抑制効果を有しうる５種の標的配列を選定し、ｓｉＲＮＡ（Ｎｏ．１）～ｓｉＲＮＡ（Ｎｏ．５）を設計して、各ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを化学的合成法によって合成した。ｓｉＲＮＡ（Ｎｏ．１）～（Ｎｏ．５）は、それぞれ配列番号２～６で表される配列とそれらに相補的な配列である標的配列を有する二本鎖ＲＮＡである。配列番号１は、ハリネズミ由来ＩＬ－２３のｐ１９サブユニットのｍＲＮＡの塩基配列であって、全長１３５８塩基長であり、当該配列情報は、ＧｅｎＢａｎｋに、GenBank Accession No. AF301619として登録されている。
（２）ＩＬ－２３の発現抑制効果の評価
　ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、作製した５種のｓｉＲＮＡ（Ｎｏ．１）～（Ｎｏ．５）におけるＩＬ－２３の発現抑制効果を評価した。具体的には、樹状細胞株であるＪＡＷＳＩＩ細胞（2×106 cells/mL）を３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養した後、５種類のｓｉＲＮＡをトランスフェクション試薬であるLipofectamineを用いて細胞に導入した（30 pmol/mL）。２４時間後にＬＰＳを加え（100 ng/mL）、さらに６時間後に細胞を回収して溶解した。細胞溶解液中のＩＬ－２３をウェスタンブロットによって評価した。対照として、ｓｉＲＮＡおよびＬＰＳ無添加の細胞溶液、ＬＰＳのみ添加の細胞溶液、ならびにＩＬ－２３の発現を抑制しないｓｉＲＮＡであるＧＦＰに対するｓｉＲＮＡ（以下、ＧＦＰ ｓｉＲＮＡとも称する）およびＬＰＳ添加の細胞溶液を用いた。
　対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ、ＬＰＳのみ、ＬＰＳ＋ＧＦＰ ｓｉＲＮＡ）および本発明のｓｉＲＮＡ（Ｎｏ．１）～ｓｉＲＮＡ（Ｎｏ．５）のウェスタンブロットの結果を図１に示す。図１は、ＬＰＳのみを添加した細胞溶液中のＩＬ－２３発現量を１とし、それに対するＣｏｎｔｒｏｌ、ＧＦＰ ｓｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ（Ｎｏ．１）～ｓｉＲＮＡ（Ｎｏ．５）におけるＩＬ－２３発現量の割合を示す。図１によれば、ＬＰＳの添加によりＩＬ－２３の発現量が増加すること、そして、本発明のｓｉＲＮＡの添加によりＩＬ－２３発現量が低下することを示している。ｓｉＲＮＡ（Ｎｏ．２）がＩＬ－２３の発現量を最も低下させることが観察された。そこで、ｓｉＲＮＡ（Ｎｏ．２）を以下の試験において試験用ｓｉＲＮＡとして用いた。
実施例２：ｓｉＲＮＡ含有製剤のｉｎ ｖｉｖｏ皮膚透過性試験
（１）ｓｉＲＮＡ含有製剤の調製
　下表３に示す含有量で各成分を秤取し、以下の製法にしたがってｓｉＲＮＡ含有製剤を調製した。
　レブリン酸およびトリエタノールアミンを混和して、イオン液体（以下、イオン液体Ａ）を調製し、調製したイオン液体Ａに亜硫酸水素ナトリウムおよび没食子酸プロピルを添加し、６０℃で溶解させ、さらにｓｉＲＮＡを添加して６０℃で溶解して、ｓｉＲＮＡ含有イオン液体Ａ溶液を調製した。別途、ステアリン酸およびジイソプロパノールアミンを混和し溶解させ、イオン液体（以下、イオン液体Ｂ）を調製した。次いで、ｓｉＲＮＡ含有イオン液体Ａ溶液およびイオン液体Ｂを混和し、得られた溶液を主薬液とした。主薬液、エデト酸ナトリウム、軽質無水ケイ酸およびゲル化炭化水素を混和し、軟膏製剤を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（２）乾癬モデルマウスの作製
　マウスを用いて、J. Control. Release, 2017, 246, 120-132に記載の方法にしたがって、乾癬モデルマウスを作製した。具体的には、５週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（入手元；日本エスエルシー、体重：約２０ｇ）の背部を剃毛し、その背部にイミキモドクリーム（ベルセナクリーム５％、持田製薬）を６０ｍｇ、１日１回、４日間塗布して、乾癬症状を誘発した
　マウスにおいて、皮膚の炎症に伴う紅班、角質細胞の過増殖による肥厚およびＩＬ－２３の発現量増加が認められた。これらの症状は乾癬の症状と一致していることから、乾癬モデルマウスとして使用可能であることが示された。
（３）ｓｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ皮膚透過性試験
　（１）で調製したｓｉＲＮＡ含有製剤を上記に塗布した際にｓｉＲＮＡが皮膚のどの部位まで到達するか確認するため、ＦＡＭで蛍光標識したｓｉＲＮＡ含有製剤（試験製剤）をマウスの背部に塗布して、皮膚透過性試験を行った。対照製剤として、レブリン酸、トリエタノールアミン、イソステアリン酸、ジイソプロパノールアミンを除く、（１）のｓｉＲＮＡ含有製剤を用いた。
　試験製剤および対照製剤を正常マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス）および乾癬モデルマウスの剃毛した背部に塗布し、塗布６時間後に各マウスの塗布部位の皮膚を回収して、常法により凍結切片を作製し、皮膚組織中での蛍光標識したｓｉＲＮＡの分布を蛍光顕微鏡で観察した。
　正常マウスおよび乾癬モデルマウスにおけるイオン液体非存在下および存在下でのｓｉＲＮＡの皮膚組織中での分布の結果を図２に示す。イオン液体非存在下では正常マウスおよび乾癬モデルマウスにおいてｓｉＲＮＡの皮膚透過は全く観察されなかった。一方、イオン液体存在下では正常マウスおよび乾癬モデルマウスにおいて大部分のｓｉＲＮＡの存在は皮膚表面の角質層付近であったが、一部のｓｉＲＮＡの存在が表皮で確認できた。
　表皮にはＩＬ－２３を発現するランゲルハンス細胞が存在しており、塗布されたｓｉＲＮＡは標的細胞に到達しうることが示された。
実施例３：軽度乾癬モデルマウスにおけるｓｉＲＮＡ含有製剤の薬効試験
　軽度乾癬モデルマウスを用いて、本発明のｓｉＲＮＡの乾癬に対する治療効果を評価した。初めに、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（２０匹）を、乾癬モデルマウスにおける未治療群、ｓｉＲＮＡ治療群およびタクロリムス治療群ならびに正常マウス群に無作為に分類した（各群ｎ＝５）。次いで、実施例２（２）の方法と同様の方法にしたがってマウスの剃毛した背部にイミキモドクリーム（持田製薬）を４日間塗布し、その塗布部位に５日目より実施例２（１）で調製したｓｉＲＮＡ含有製剤または市販のタクロリムス軟膏０．１％（ポーラファルマ）を１００ｍｇ、１日１回、３日間塗布して治療を行い、８日目に皮膚を回収して、ｓｉＲＮＡ治療群およびタクロリムス治療群の凍結切片を作製した。また、マウスの塗布部位を５日目より治療せずに、８日目に皮膚を回収して、未治療群の凍結切片を作製した。それらの切片をＨＥ染色および細胞の増殖マーカーであるＫｉ－６７で免疫染色を行い、表皮の肥厚の程度および皮膚の過増殖の程度を評価した。未治療群およびタクロリムス治療群をコントロールとした。また、正常マウスの皮膚とも表皮の肥厚の程度および皮膚の過増殖の程度を比較した。
　正常マウスおよび軽度乾癬モデルマウス（未治療群、ｓｉＲＮＡ治療群およびタクロリムス治療群）の皮膚組織のＨＥ染色の画像および各マウスの表皮の厚さ（μｍ）を図３に示し、正常マウスおよび各群の軽度乾癬モデルマウスの皮膚組織のＫｉ－６７免疫染色の画像を図４に示す。
　未治療群のマウスにおいて皮膚の肥厚および細胞の過増殖が観察されたが、自然治癒傾向を示すマウスも一部存在していた。ｓｉＲＮＡおよびタクロリムスの治療では、全てのマウスにおいて皮膚症状の改善が認められ、正常マウスの皮膚と同程度まで回復していた。ｓｉＲＮＡとタクロリムス治療群間において差異は見られなかった。
　本試験の結果より、本発明のｓｉＲＮＡ製剤は、既存の乾癬治療剤と同程度の治療効果を有することが示された。さらに、本発明のｓｉＲＮＡ含有製剤は、優れた皮膚透過性を有し、経皮投与用製剤として有用でありうることが示された。
実施例４：重度乾癬モデルマウスにおけるｓｉＲＮＡ含有製剤の薬効試験
　重度乾癬モデルマウスを用いて、本発明のｓｉＲＮＡの乾癬に対する治療効果を評価した。初めに、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（１５匹）を、乾癬モデルマウスにおける未治療群、ｓｉＲＮＡ（ＩＬ－２３ ｓｉＲＮＡおよびＧＦＰ ｓｉＲＮＡ）治療群およびタクロリムス治療群ならびに正常マウス群に無作為に分類した（各群ｎ＝３）。次いで、実施例２（２）の方法と同様の方法にしたがってマウスの剃毛した背部にイミキモドクリームを７日間継続して塗布するとともに、その塗布部位に５日目より実施例２（１）で調製したｓｉＲＮＡ含有製剤、市販のタクロリムス軟膏またはＧＦＰ ｓｉＲＮＡを１００ｍｇ、１日１回、３日間塗布して治療を行い、８日目に皮膚を回収して、ＩＬ－２３ ｓｉＲＮＡ治療群、タクロリムス治療群およびＧＦＰ ｓｉＲＮＡ治療群の凍結切片を作製した。また、マウスの塗布部位を５日目より治療せずに、８日目に皮膚を回収して、未治療群の凍結切片を作製した。それらの切片をＨＥ染色および細胞の増殖マーカーであるＫｉ－６７で免疫染色を行い、表皮の肥厚の程度および皮膚の過増殖の程度を評価した。未治療群、タクロリムス治療群およびＧＦＰ ｓｉＲＮＡ治療群をコントロールとした。また、正常マウスの皮膚とも表皮の肥厚の程度および皮膚の過増殖の程度を比較した。
　正常マウスおよび重度乾癬モデルマウス（未治療群、ＧＦＰ ｓｉＲＮＡ治療群、ＩＬ－２３ ｓｉＲＮＡ治療群およびタクロリムス治療群）の皮膚組織のＨＥ染色の画像および各マウスの表皮の厚さ（μｍ）を図５に示し、正常マウスおよび各群の重度乾癬モデルマウスの皮膚組織のＫｉ－６７免疫染色の画像を図６に示し、重度乾癬モデルマウスにおける未治療群、ＧＦＰ ｓｉＲＮＡ治療群およびＩＬ－２３ ｓｉＲＮＡ治療群のウェスタンブロットの結果および各群の皮膚組織中のＩＬ－２３の発現量を図７に示す。
　図５および図６において、本発明のｓｉＲＮＡは、重度の乾癬症状であっても治療効果を発揮することが示された。また、図７において、本発明のｓｉＲＮＡは表皮の肥厚の減少、角化細胞の増殖抑制、ＩＬ－２３の発現量低下をもたらすことが示されたが、ＧＦＰ ｓｉＲＮＡの治療ではこれらの効果は認められなかった。
　本試験の結果より、本発明のｓｉＲＮＡ製剤は、重度の乾癬症状であっても治療効果を発揮することが示され、さらに、その治療効果がＩＬ－２３の特異的な抑制を介するものでありうることが示された。
実施例５：イオン液体によるｓｉＲＮＡの安定化試験
　イオン液体によるｓｉＲＮＡの安定化作用について評価した。具体的には、ｓｉＲＮＡ（Ｎｏ．２）（０．０２ｗ／ｗ％）を上表３に示す含量のイオン液体成分（レブリン酸、トリエタノールアミン、イソステアリン酸、ジイソプロパノールアミン）で溶解し、その溶液水で希釈して得られたｓｉＲＮＡ溶液のＣＤスペクトルを円二色性分散計J-1500（日本分光）で測定した。対照として、水で溶解したｓｉＲＮＡ溶液および上記イオン液体成分と水の混合液を用いた。
　また、上記と同様の方法で調製された、イオン液体成分に溶解したＧＦＰ ｓｉＲＮＡとウシ胎児血清（Sigma）を１：１の容量比で混合して３７℃で３０分間インキュベーションし、アガロース電気泳動でｓｉＲＮＡの分解を確認し、ｓｉＲＮＡの安定性を評価した。また、血清非存在下でもｓｉＲＮＡの安定性評価を行った。対象物質として、ｓｉＲＮＡをＴｒｉｓ－ＥＤＴＡ緩衝液（ＴＥ）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ＨＢＳ）、またはＲＰＭＩ１６４０培地（富士フイルム和光純薬）で希釈したものを用いた。
　イオン液体に溶解したｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびイオン液体のＣＤスペクトルを図８に示し、希釈溶媒（ＴＥ、ＨＢＳ、ＲＰＭＩ１６４０培地またはイオン液体（ＩＬ））に溶解したｓｉＲＮＡのアガロースゲル電気泳動の結果を図９に示す。ｓｉＲＮＡをイオン液体に溶解することにより、ｓｉＲＮＡの二本鎖間の会合が安定化することが示された。また、イオン液体以外の溶媒でｓｉＲＮＡを溶解すると、血清中でｓｉＲＮＡは分解されるが、イオン液体で溶解するとｓｉＲＮＡの分解は抑制されることが示された。
　本試験の結果より、イオン液体はｓｉＲＮＡの安定性向上に寄与することが示された。
　本発明の二本鎖ＲＮＡは、ＩＬ－２３の発現を特異的に抑制することができ、乾癬などのＩＬ－２３発現に起因する疾患の治療に有用でありうる。また、本発明の医薬組成物は、イオン液体を用いることにより、二本鎖ＲＮＡの高い安定性および皮膚透過性を達成し、効率よく有効成分である二本鎖ＲＮＡを患部に送達できるため、経皮吸収用製剤としての使用が可能となる。本発明の二本鎖ＲＮＡは、製剤中での安定性が高いことから、低用量で使用することができ、安全性および経済性に優れた乾癬治療剤として期待される。

Claims (14)

  1. 　センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖ＲＮＡであって、各鎖が１９～３０ヌクレオチドからなり、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６で示される塩基配列およびその相補的な塩基配列を含む、二本鎖ＲＮＡ。
  2. 　各鎖が、１９～２５ヌクレオチドからなる、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡ。
  3. 　各鎖の鎖内の１つ以上のヌクレオチドが化学修飾されているかまたは各鎖の５’末端もしくは３’末端のヌクレオチドが化学修飾されている、請求項１または２に記載の二本鎖ＲＮＡ。
  4. 　該化学修飾が、ホスホロチオエート修飾、２’－Ｆ修飾、２’－ＯＭｅ修飾、２’－ＭＯＥ修飾、ＬＮＡ修飾およびＥＮＡ修飾からなる群から選択される、請求項３に記載の二本鎖ＲＮＡ。
  5. 　センス鎖の３’末端およびアンチセンス鎖の５’末端に１～１０デオキシリボヌクレオチドが結合している、請求項１～４のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡ。
  6. 　センス鎖の３’末端およびアンチセンス鎖の５’末端に２個のチミジン（ｄＴ）が結合している、請求項５に記載の二本鎖ＲＮＡ。
  7. 　ＩＬ－２３発現を特異的に抑制するための、請求項１～６のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡ。
  8. 　請求項１～７のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡを含む医薬組成物。
  9. 　さらに脂肪族カルボン酸系イオン液体を含む、請求項８に記載の医薬組成物。
  10. 　該脂肪族カルボン酸系イオン液体が、２種以上の脂肪族カルボン酸系イオン液体を含む脂肪族カルボン酸系混合イオン液体である、請求項９に記載の医薬組成物。
  11. 　該脂肪酸系混合イオン液体が、
    　ａ）炭素数２～７の低級脂肪族カルボン酸と、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミンのいずれかとからなる炭素数２～７の脂肪族カルボン酸系イオン液体の一種以上と、
    　ｂ）二本鎖ＲＮＡの溶解度が１ｗ／ｗ％以下である炭素数２～２０の脂肪族カルボン酸系イオン液体である、請求項１０に記載の医薬組成物。
  12. 　経皮吸収型製剤である、請求項８～１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  13. 　ＩＬ－２３発現に起因する疾患を治療するための、請求項８～１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  14. 　該疾患が、乾癬である、請求項１３に記載の医薬組成物。
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