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WO2021261398A1 - 発光性ナノ粒子及び病理診断用発光性標識材 - Google Patents

発光性ナノ粒子及び病理診断用発光性標識材 Download PDF

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WO2021261398A1
WO2021261398A1 PCT/JP2021/023203 JP2021023203W WO2021261398A1 WO 2021261398 A1 WO2021261398 A1 WO 2021261398A1 JP 2021023203 W JP2021023203 W JP 2021023203W WO 2021261398 A1 WO2021261398 A1 WO 2021261398A1
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WO
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group
luminescent
electron
atom
substituted
Prior art date
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PCT/JP2021/023203
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康生 宮田
顕一 田畑
一磨 小田
公平 荻野
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Konica Minolta Inc
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Konica Minolta Inc
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    • C09K2211/1022—Heterocyclic compounds bridged by heteroatoms, e.g. N, P, Si or B

Definitions

  • the present invention relates to luminescent nanoparticles and luminescent labeling materials for pathological diagnosis, and more particularly, to enable high-sensitivity imaging capable of avoiding the adverse effects of autofluorescence of cells on bioimaging, and luminescent nanoparticles for pathological diagnosis.
  • luminescent labeling material Regarding luminescent labeling material.
  • a luminescent (for example, fluorescent) probe such as minute luminescent particles is specifically adsorbed on a target such as a cell or a protein, and then the luminescence from the luminescent probe is used. , Observing the structure of targets and their position and movement in the living body.
  • Long Stokes shift emission is an effective means for avoiding a wavelength range in which the emission intensity (also referred to as "brightness") of cell autofluorescence is strong by making a large difference between the excitation wavelength and the emission wavelength. ..
  • long Stokes shift light emission exceeding 100 nm has a problem of low light emission as typified by general exiplex light emission.
  • Delayed emission includes phosphorescence, thermally activated delayed fluorescence, exciplex emission, etc., and it is possible to emit light for a longer time of about 1 microsecond than the autofluorescence of cells that disappear in about 10 nanoseconds. .. Delayed luminescence is a promising means because it is possible to perform luminescence imaging in the time zone after the autofluorescence of cells disappears.
  • Non-Patent Document 1 and Non-Patent Document 2 disclose a cell imaging technique in time decomposition using nanoparticles using a dye showing thermally activated delayed fluorescence. In time-resolved imaging, the emission intensity of delayed emission itself is required in order to image in the time zone after the autofluorescence of cells disappears.
  • Non-Patent Document 1 has a problem in the quantum yield of emission
  • the technique disclosed in Non-Patent Document 2 has a problem that the emission intensity of delayed fluorescence is low. Therefore, in order to satisfy the above-mentioned high-sensitivity imaging application, it is necessary to further enhance the luminescence.
  • the present invention has been made in view of the above problems and situations, and the solution thereof is for luminescent nanoparticles and pathological diagnosis that enable high-sensitivity imaging capable of avoiding the adverse effects of cell autofluorescence on bioimaging. It is to provide a luminescent labeling material.
  • the present inventor has 2 to 4 linking groups connecting the electron-attracting group and the electron-donating group of the dye contained in the luminescent nanoparticles.
  • luminescent nanoparticles that enable high-sensitivity imaging that can avoid the adverse effects of autologous fluorescence of cells by having a skeleton composed of the atoms of the above, and have reached the present invention. That is, the above-mentioned problem according to the present invention is solved by the following means.
  • the luminescent dye is a compound having a structure represented by the following general formula (1), and is Luminescent nanoparticles characterized by having at least one of delayed luminescence or long Stokes shift luminescence.
  • A represents an electron-withdrawing group.
  • D represents an electron donating group.
  • L represents a linking group having a skeleton consisting of 2 to 4 atoms. The 2 to 4 atoms are a carbon atom, an oxygen atom, a nitrogen atom, a silicon atom, a sulfur atom, a boron atom or a phosphorus atom.
  • the linking group may have a hydrogen atom or a substituent.
  • A represents an electron-withdrawing group.
  • D represents an electron donating group.
  • X represents a cyclic saturated hydrocarbon group, a cyclic unsaturated hydrocarbon group, an aryl group or a heteroaryl group.
  • Y and Z represent a carbon atom, an oxygen atom, a nitrogen atom, a silicon atom, a sulfur atom, a boron atom or a phosphorus atom, and may have a hydrogen atom or a substituent.
  • Y in the general formulas (4) and (5) may be a linking group having a skeleton composed of two atoms.
  • A is a "substituted carbonyl group", “optionally substituted sulfonyl group”, “optionally substituted boryl group”, and the like.
  • “Fosphine oxide group optionally substituted” "aryl group optionally substituted with electron-attracting group”
  • cyano group, fluorine atom, alkyl group substituted with fluorine atom or nitrogen-containing aromatic six Represents an electron-donating heterocyclic group substituted with a membered ring-containing heterocyclic group, or an electron-withdrawing heterocyclic group which may be substituted, and D is substituted with an electron-donating group.
  • Aryl group an electron-donating heterocyclic group which may be substituted with a substituent other than a cyano group, a fluorine atom, an alkyl group substituted with a fluorine atom and a nitrogen-containing aromatic six-membered ring-containing heterocyclic group” , Or the luminescent property according to any one of the items 2 to 5, wherein the amino group may be substituted, and X represents an aryl group or a heteroaryl group.
  • A is "optionally substituted carbonyl group", “optionally substituted sulfonyl group”, “optionally substituted boryl group”, and the like.
  • “Fosphine oxide group optionally substituted” "aryl group optionally substituted with electron-attracting group”
  • cyano group, fluorine atom, alkyl group substituted with fluorine atom or nitrogen-containing aromatic six Represents an electron-donating heterocyclic group substituted with a membered ring-containing heterocyclic group, or an electron-withdrawing heterocyclic group which may be substituted, and D is substituted with an electron-donating group.
  • Aryl group an electron-donating heterocyclic group which may be substituted with a substituent other than a cyano group, a fluorine atom, an alkyl group substituted with a fluorine atom and a nitrogen-containing aromatic six-membered ring-containing heterocyclic group” , Or “an optionally substituted amino group", where X represents an aryl group or a heteroaryl group, and Y represents a carbon atom, an oxygen atom, or a silicon atom.
  • the luminescent nanoparticles according to any one of the items up to the fifth item.
  • Item 2 The luminescent nanoparticles according to Item 9, wherein the binder present on the surface of the luminescent nanoparticles among the binders has a hydrophilic group.
  • Item 6 The luminescent nanoparticles according to Item 9, wherein the binder and the luminescent dye form a covalent bond.
  • a luminescent labeling material for pathological diagnosis wherein a target-directing ligand is bound to the surface of the luminescent nanoparticles according to any one of paragraphs 1 to 11 via a covalent bond.
  • the electron donating group and the electron attracting group are connected by a connecting group having a skeleton consisting of 2 to 4 atoms to effectively transfer electrons between the electron donating group and the electron attracting group in the excited state.
  • a connecting group having a skeleton consisting of 2 to 4 atoms to effectively transfer electrons between the electron donating group and the electron attracting group in the excited state.
  • Luminescence in the solid state is also achieved by connecting an electron-donating group and an electron-withdrawing group with a linking group having a skeleton consisting of 2 to 4 atoms to donate electrons. This is achieved by keeping the distance between the sex group and the electron-withdrawing group close. The reason is that by keeping the distance between the electron donating group and the electron attracting group close to each other, it is possible to make rapid electronic transitions when excited and to form a highly stable excited state, and mutual intermolecular. This is because it is possible to avoid obstruction of extinguishing due to the action. As a result, it is presumed that solid-state luminescence can be exhibited by avoiding concentration quenching.
  • luminescent nanoparticles that enable high-sensitivity imaging that can avoid the adverse effects of cell autofluorescence on bioimaging.
  • the luminescent nanoparticles of the present invention are luminescent nanoparticles containing a luminescent dye, wherein the luminescent dye is a compound represented by the general formula (1), and the luminescent nanoparticles are delayed luminescent or long.
  • -It is characterized by having at least one of Stokes shift luminescence. This feature is a technical feature common to or corresponding to the following embodiments.
  • the general formula (1) is represented by at least one of the general formulas (2) to (6) from the viewpoint of exhibiting the effect of the present invention.
  • the luminescent nanoparticles of the present invention preferably have delayed luminescence from the viewpoint of reducing the influence of autofluorescence of cells. Further, it is more preferable to have an intramolecular exciplex luminescence property that emits delayed luminescence with high luminescence intensity. Further, it is also preferable to have a long Stokes shift luminescence.
  • A, D and X may represent the above-exemplified substituent or atom in the general formulas (2) to (6). preferable.
  • A, D, X and Y represent the above-exemplified substituent or atom in the general formulas (4) to (6) from the viewpoint of exhibiting the effect of the present invention. Is preferable.
  • the luminescent dye has a hydrophilic group. Further, it is preferable to contain a binder in that it is possible to give a special function to the particle surface via the binder. Further, it is preferable in that the dye is easily taken in in a state of being dispersed in the binder particles and the luminescence in the particles is enhanced.
  • the binder existing on the surface of the luminescent nanoparticles has a hydrophilic group in terms of suppressing aggregation of the particles.
  • the binder and the luminescent dye form a covalent bond in terms of preventing the luminescent dye from leaking from the particles.
  • the luminescent labeling material for pathological diagnosis of the present invention is characterized in that a target-directing ligand is bound to the surface of the luminescent nanoparticles via a covalent bond.
  • the luminescent nanoparticles of the present invention are luminescent nanoparticles containing a luminescent dye, and the luminescent dye has a structure represented by the general formula (1). It is a compound having, and is characterized by having at least one of delayed luminescence and long Stokes shift luminescence. Hereinafter, each component will be described in sequence.
  • Luminescent nanoparticles refer to particles containing luminescent dyes having an average particle size in the range of 1 to 1000 nm. It is preferably in the range of 30 to 500 nm, and more preferably in the range of 50 to 200 nm.
  • the average particle size of the produced luminescent nanoparticles can be measured by a method known in the art. Specifically, when an electron microscope photograph is taken at an appropriate magnification using a scanning electron microscope (SEM), the cross-sectional area of luminescent nanoparticles is measured, and the measured value is taken as the area of a corresponding circle. It can be measured as a diameter (diameter equivalent to an area circle).
  • SEM scanning electron microscope
  • the average particle size (average particle size) and coefficient of variation of the population of luminescent nanoparticles are determined after measuring the particle size (particle size) of a sufficient number (for example, 1000) of luminescent nanoparticles as described above. , The average particle size is calculated as its arithmetic average, and the coefficient of variation is calculated by the formula: 100 ⁇ standard deviation of particle size / average particle size.
  • the coefficient of variation indicating the variation in particle size is not particularly limited, but is usually 20% or less, preferably 5 to 15%.
  • the luminescent nanoparticles of the present invention are luminescent nanoparticles containing a luminescent dye, and the luminescent dye is represented by the general formula (1). It is a compound having such a structure, and is characterized by having at least one of delayed luminescence and long Stokes shift luminescence.
  • the luminescent nanoparticles of the present invention basically emit thermally activated delayed fluorescence or exciplex emission among delayed emission, but have the following emission characteristics.
  • fluorescence refers to the light emitted when an electron transitions from an excited singlet state to a base singlet state (allowable transition).
  • phosphorescence refers to the light emitted when an electron transitions from an excited triplet state to a base singlet state (forbidden transition).
  • the luminescent nanoparticles of the present invention have delayed luminescence, because the adverse effects of autofluorescence of cells can be avoided. Having delayed luminescence makes it possible to perform luminescence imaging in the time zone after the autofluorescence of cells disappears.
  • Delayed emission means that, for example, when intersystem crossing occurs to an excited triplet state (T 1 ) in which the lowest singlet excited state (S 1 ) is energetically low, the energy difference between S 1 and T 1 is small. of two states is the thermal equilibrium, the long fluorescence of the same as life and phosphorescence from T 1 state refers to a phenomenon that is released. It also refers to a phenomenon in which energy is once held in a metastable state such as a charge separation state, and then the energy released by charge recombination is released as light having a long life.
  • the emission lifetime (decay time) of normal fluorescence is a very short time of nanoseconds or less, but delayed fluorescence goes through a metastable state, so the emission lifetime may be extended to the order of minutes.
  • Phosphorescence, thermally activated delayed fluorescence, exciplex emission, etc. are available as emission methods that cause delayed emission. Since phosphorescence emits light due to a forbidden transition, it is less likely to occur than light emission due to a permissible transition, so that phosphorescence tends to exhibit delayed emission.
  • Thermal activated delayed fluorescence is the light emitted by the singlet excitons generated by the transition of triplet excitons due to the inverse intersystem crossing due to thermal energy. Thermally activated delayed fluorescence tends to exhibit delayed emission due to the involvement of inverted intersystem crossing.
  • the absolute value ( ⁇ E st ) of the difference between the lowest excited singlet energy level (S 1 ) and the lowest excited triplet energy level (T 1 ) must be extremely small for the inverse intersystem crossing to occur.
  • Excited light emission refers to the light emitted when the exciplex (excited complex) returns to the ground state.
  • the "exciplex” is an AB n * formed by the chemical species A * in the excited electronic state with the n chemical species B in the ground state. It is known that the Exciplex has an extremely small ⁇ Est, and it is easy to cause an intersystem crossing, so that it tends to show delayed light emission.
  • Heat activated delayed fluorescence While including the step of immediately emitting from S 1 without passing through the reverse intersystem crossing, for exciplex emission is emitted from only exciplex level, the intensity of delayed luminescence component exciplex Luminescence is more than thermally activated delayed fluorescence. Furthermore, the luminescent dye contained in the luminescent nanoparticles of the present invention has a structure capable of forming an intramolecular exciplex, which makes it possible to form a stronger exhibix than a general intermolecular exileplex. ing.
  • the luminescent nanoparticles of the present invention have long Stokes shift luminescence, because the adverse effects of autofluorescence of cells can be avoided. Having long-Stokes shift luminescence makes it possible to perform emission imaging in a wavelength range different from the wavelength range in which the emission intensity of autofluorescence of cells is strong.
  • “Long Stokes shift emission” refers to emission in which the difference between the two maximum wavelengths is larger than usual when the emission (maximum) wavelength shifts to the long wave side from the light absorption (maximum) wavelength in photoluminescence.
  • the difference between the light absorption wavelength and the emission wavelength is 100 nm or more.
  • the above-mentioned thermally activated delayed fluorescence, exciplex light emission, and the like are known.
  • the difference between the light absorption wavelength and the emission wavelength is more preferably 150 nm or more, and further preferably 200 nm or more.
  • the luminescent dye used in the present invention is a compound having a structure represented by the following general formula (1), and is also represented by the following general formulas (2) to (6). It is preferable that the compound has a structure to be used.
  • A represents an electron-withdrawing group.
  • D represents an electron donating group.
  • L represents a linking group having a skeleton consisting of 2 to 4 atoms.
  • the 2 to 4 atoms are a carbon atom, an oxygen atom, a nitrogen atom, a silicon atom, a sulfur atom, a boron atom or a phosphorus atom.
  • the linking group may have a hydrogen atom or a substituent.
  • A represents an electron-withdrawing group.
  • D represents an electron donating group.
  • X represents a cyclic saturated hydrocarbon group, a cyclic unsaturated hydrocarbon group, an aryl group or a heteroaryl group.
  • Y and Z represent a carbon atom, an oxygen atom, a nitrogen atom, a silicon atom, a sulfur atom, a boron atom or a phosphorus atom, and may have a hydrogen atom or a substituent.
  • Y in the general formulas (4) and (5) may be a linking group having a skeleton composed of two atoms.
  • the electron-attracting group represented by A is a "optionally substituted carbonyl group", a “optionally substituted sulfonyl group”, or “substituted”. May be a boryl group, “may be substituted phosphinoxide group”, “may be substituted with an electron-attracting group aryl group", “cyano group, fluorine atom, alkyl group substituted with fluorine atom” Alternatively, it is preferably an electron-donating heterocyclic group substituted with a nitrogen-containing aromatic six-membered ring-containing heterocyclic group, or an electron-withdrawing heterocyclic group which may be substituted.
  • alkyl group of the "alkyl group substituted with a fluorine atom" represented by A examples include the same as described below, and the same one is preferable.
  • Examples of the aryl group of the "optionally substituted aryl group" represented by A include the same as described below, and the same one is preferable.
  • the electron-withdrawing heterocyclic group of the "optionally substituted electron-withdrawing heterocyclic group" represented by A is derived from an electron-withdrawing heterocycle having 3 to 24 carbon atoms. Group is preferred.
  • heterocycles include dibenzothiophene oxide ring, dibenzothiophene dioxide ring, pyridine ring, pyridazine ring, pyrimidine ring, pyrazine ring, triazine ring, quinoline ring, isoquinoline ring, quinazoline ring, cinnoline ring, quinoxalin ring.
  • a phosphine ring is mentioned, more preferably a nitrogen-containing aromatic heterocycle, and particularly preferably a nitrogen-containing aromatic 6-membered ring, a dibenzofuran ring, an azadibenzofuran ring, a coumarin ring, a diazadibenzofuran ring, oxygen or nitrogen or sulfur or.
  • the electron-withdrawing heterocycle may be a combination of two or more identical or different heterocycles.
  • substituent of the "optionally substituted electron-attracting heterocyclic group" represented by A a heavy hydrogen atom, a fluorine atom, a cyano group, an alkyl group which may be substituted with a fluorine atom, and fluorine
  • substituents of the "optionally substituted electron-attracting heterocyclic group" represented by A include an aryl group that may be substituted with an alkyl group that may be substituted with an atom, an aryl group that may be substituted with a fluorine atom, and an aryl group that may be substituted with a cyano group.
  • Specific examples of the alkyl group and the aryl group include the same as above, and the same ones are preferable.
  • it may be an electron-donating substituent as long as it does not impair the electron-withdrawing property of the electron-withdrawing heterocyclic group, and examples thereof include a carbazole group and the like.
  • the electron-attracting group of the "aryl group optionally substituted with an electron-attracting group" represented by A includes a fluorine atom, a cyano group, an alkyl group substituted with a fluorine atom, and even if substituted. Examples thereof include a good carbonyl group, a optionally substituted sulfonyl group, a optionally substituted phosphinoxide group, a optionally substituted boryl group, and an optionally substituted electron-withdrawing heterocyclic group.
  • a fluorine atom, a cyano group, an alkyl group substituted with a fluorine atom, or an electron-withdrawing heterocyclic group which may be substituted is preferable.
  • heterocyclic group substituted with cyano group, fluorine atom, alkyl group substituted with fluorine atom or nitrogen-containing aromatic six-membered ring-containing heterocyclic group represented by A
  • heterocyclic group include the same as those described below, and the same ones are preferable.
  • the "six-membered ring-containing heterocycle” is a group derived from a heterocycle containing a nitrogen-containing aromatic six-membered ring.
  • heterocycles containing a nitrogen-containing aromatic six-membered ring include a pyridine ring, a pyridazine ring, a pyrimidine ring, a pyrazine ring, a triazine ring, a quinoline ring, an isoquinoline ring, a quinazoline ring, a cinnoline ring, a quinoxalin ring, a phthalazine ring, and a pteridine.
  • Examples thereof include a ring, a phenanthridine ring, a phenanthrolin ring, an azacarbazole ring, a diazacarbazole ring, an azadibenzofuran ring, and a diazadibenzofuran ring.
  • Preferred examples thereof include a pyridine ring, a pyrimidine ring, a triazine ring, an azacarbazole ring, a diazacarbazole ring, an azadibenzofuran ring and a diazadibenzofuran ring, and more preferably a pyridine ring, a pyrimidine ring, a triazine ring and an azacarbazole ring. Azadibenzofuran ring is mentioned.
  • substituents include a fluorine atom, a cyano group, an alkyl group optionally substituted with a fluorine atom, an aryl group optionally substituted, and an electron-withdrawing heterocyclic group optionally substituted. Specific examples include the same as above, and the same is preferable.
  • the electron-attracting group A is "an aryl group that may be substituted with an electron-attracting group” because it easily interacts with another electron-attracting group A or an electron-donating group D.
  • Aryl groups optionally substituted with electron-attracting groups "electron donations substituted with cyano groups, fluorine atoms, alkyl groups substituted with fluorine atoms or nitrogen-containing aromatic six-membered ring-containing heterocyclic groups.
  • the "sexual heterocyclic group” or the “optionally substituted electron-attracting heterocyclic group” is preferably substituted with an aryl group or a cyano group substituted with a cyano group from the viewpoint of having high electron-attracting properties. May be electron-withdrawing heterocyclic group, unsubstituted nitrogen-containing aromatic 6-membered ring group, nitrogen-containing aromatic 6-membered ring group substituted with fluorine atom, nitrogen-containing aromatic group substituted with cyano group.
  • Group 6-membered ring group electron-donating heterocyclic group substituted with cyano group, electron-donating heterocyclic group substituted with azacarbazole, electron-donating heterocyclic group substituted with azadibenzofuran, fluorine substitution It is a nitrogen-containing aromatic 6-membered ring group substituted with an alkyl group, or a nitrogen-containing aromatic 6-membered ring group substituted with an optionally substituted aryl group.
  • the electron-donating group represented by D is an "aryl group substituted with an electron-donating group", a "cyano group, a fluorine atom, or an alkyl group substituted with a fluorine atom”.
  • an electron-donating heterocyclic group that may be substituted with a substituent other than the nitrogen-containing aromatic six-membered ring-containing heterocyclic group, or an “amino group that may be substituted” is preferable.
  • aryl group of the "aryl group substituted with an electron donating group" represented by D a group derived from an aromatic hydrocarbon ring having 6 to 24 carbon atoms is preferable.
  • aromatic hydrocarbon rings include benzene ring, inden ring, naphthalene ring, azulene ring, fluorene ring, phenanthrene ring, anthracene ring, acenaphtylene ring, biphenylene ring, naphthalene ring, pyrene ring, pentalene ring, acetylene ring.
  • benzene ring, naphthalene ring, fluorene ring, phenanthrene ring, anthracene ring, biphenylene ring, chrysene ring, pyrene ring, triphenylene ring, chrysene ring, fluoranthene ring, perylene ring, biphenyl ring, and terphenyl ring can be mentioned. ..
  • An electron-donating heterocyclic group represented by D which may be substituted with a substituent other than "cyano group, fluorine atom, alkyl group substituted with fluorine atom and nitrogen-containing aromatic six-membered ring-containing heterocyclic group".
  • a substituent other than "cyano group, fluorine atom, alkyl group substituted with fluorine atom and nitrogen-containing aromatic six-membered ring-containing heterocyclic group As the "electron-donating heterocyclic group”, a group derived from an electron-donating heterocycle having 4 to 24 carbon atoms is preferable.
  • heterocycles include pyrrole ring, indole ring, carbazole ring, indole ring, 9,10-dihydroacridine ring, 10,11-dihydrodibenzoazepine, 5,10-dihydrodibenzoazacillin, 5 , 10-dihydrodiphenazine, phenoxazine ring, phenothiazine ring, dibenzothiophene ring, benzofurylindole ring, benzothienoindole ring, indolecarbazole ring, benzofurylcarbazole ring, benzothienocarbazole ring, benzothioenobenzothiophene ring, benzo Examples thereof include a carbazole ring, a dibenzocarbazole ring, a tetrathiafluvalene ring, a thiantolene, a quasi-plane or a triaryl
  • a carbazole ring an indole ring, a 9,10-dihydroacridin ring, a phenoxazine ring, a phenothiazine ring, a dibenzothiophene ring, a benzofurindol ring, a benzocarbazole ring, a dibenzofuran ring, oxygen or nitrogen or sulfur or carbon.
  • Examples thereof include a triarylamine ring fixed to a quasi-plane or a plane by single-atom cross-linking or a single bond such as an atom.
  • the electron-donating heterocycle may be a combination of two or more of the same or different heterocycles.
  • the dibenzofuran ring when the dibenzofuran ring is substituted with an electron-donating substituent (for example, a carbazole group), the dibenzofuran ring can function as an electron-donating group D as a whole, but is substituted with an unsubstituted or electron-withdrawing substituent. If so, it can function as an electron attracting group A.
  • an electron-donating substituent for example, a carbazole group
  • the "electron-donating group" of the "electron-donating group substituted with an electron-donating group” represented by D includes an alkyl group which may be substituted, an alkoxy group which may be substituted, and an alkoxy group which may be substituted. Examples thereof include a good amino group, an electron-donating heterocyclic group which may be substituted, and the like. Preferred examples include a optionally substituted amino group and a optionally substituted electron-donating group heterocyclic group.
  • the alkyl group as the "electron-donating group” of the "aryl group substituted with the electron-donating group” represented by D may be linear, branched, or cyclic, and has, for example, 1 to 20 carbon atoms. Examples thereof include linear, branched, or cyclic alkyl groups of, specifically, methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, n-butyl group, s-butyl group, t-butyl group, n.
  • -Pentyl group neopentyl group, n-hexyl group, cyclohexyl group, 2-ethylhexyl group, n-heptyl group, n-octyl group, 2-hexyloctyl group, n-nonyl group, n-decyl group, n-undecyl group.
  • Preferred examples include a methyl group, an ethyl group, an isopropyl group, a t-butyl group, a cyclohexyl group, a 2-ethylhexyl group, a 2-hexyloctyl group and an adamantyl group.
  • the alcoholic group of the "electron-donating group” of the "aryl group substituted with the electron-donating group” represented by D may be linear, branched or cyclic, and may have, for example, 1 to 20 carbon atoms. Examples thereof include a linear, branched or cyclic alkyl group, and specific examples thereof include a methoxy group, an ethoxy group, an n-propoxy group, an isopropoxy group, an n-butoxy group, an isobutoxy group, a t-butoxy group and an n-pentyl group.
  • the substituent of the "optionally substituted amino group" of the "electron donating group” of the "electron donating group substituted aryl group” represented by D is an alkyl group which may be substituted.
  • Aryl ring substituted with an optionally substituted alkyl group, aryl ring optionally substituted with an alkoxy group optionally substituted, or substituted with an amino group optionally substituted A good aryl ring is mentioned, and the same as above can be mentioned as an alkyl group, an alkoxy group, an amino group and an aryl group, and the same one is preferable.
  • An electron-donating heterocyclic group represented by D which may be substituted with a substituent other than a cyano group, a fluorine atom, an alkyl group substituted with a fluorine atom and a nitrogen-containing aromatic six-membered ring-containing heterocyclic group.
  • substituents other than cyano group, fluorine atom, alkyl group substituted with fluorine atom and nitrogen-containing aromatic six-membered ring-containing heterocyclic group means alkyl substituted with cyano group, fluorine atom and fluorine atom.
  • electron-donating groups or aryl groups include alkyl groups, alkoxy groups, aryl groups optionally substituted with alkyl groups, aryl rings optionally substituted with alkoxy groups, and substituted.
  • Examples thereof include an aryl ring which may be substituted with an amino group which may be present, an amino group which may be substituted, and the like, and specific examples thereof include the same ones as described above, and the same ones are preferable.
  • it may be an electron-withdrawing substituent as long as it does not impair the electron-donating property of the electron-donating heterocyclic group, and examples thereof include a dibenzofuryl group and the like.
  • Examples of the "optionally substituted electron-donating heterocyclic group" of the "electron-donating group” of the “electron-donating aryl group substituted with the electron-donating group” represented by D include the same as described above. And similar ones are preferred.
  • Examples of the substituent of the "optionally substituted amino group” represented by D include the same substituents as the above-mentioned "optionally substituted amino group", and the same ones are preferable.
  • the electron donating group D is "an aryl group substituted with an electron donating group” or “substituted” because it easily interacts with another electron donating group D or an electron attracting group A. It is preferably an electron-donating heterocyclic group. This is because these groups have high planarity and therefore easily overlap with other electron-donating groups D or electron-withdrawing groups A and easily interact with each other.
  • the "aryl group substituted with an electron-donating group” or “optionally substituted electron-donating heterocyclic group” is preferably a phenyl group substituted with an electron-donating group, or optionally substituted carbazolyl.
  • L represents a linking group having a skeleton consisting of 2 to 4 atoms.
  • the 2-4 atoms are a carbon atom, an oxygen atom, a nitrogen atom, a silicon atom, a sulfur atom, a boron atom or a phosphorus atom.
  • the linking group may have a hydrogen atom or a substituent.
  • X represents a cyclic saturated hydrocarbon group, a cyclic unsaturated hydrocarbon group, an aryl group or a heteroaryl group.
  • Y and Z represent a carbon atom, an oxygen atom, a nitrogen atom, a silicon atom, a sulfur atom, a boron atom or a phosphorus atom, and may have a hydrogen atom or a substituent.
  • X represents an aryl group or a heteroaryl group in the general formulas (2) to (6). Further, in the general formulas (4) to (6), it is preferable that X represents an aryl group or a heteroaryl group, and Y represents a carbon atom, an oxygen atom, or a silicon atom.
  • the luminescent dye contained in the luminescent nanoparticles of the present invention has a hydrophilic group because it is easily incorporated in a state where the dye is dispersed in the binder particles and the luminescent property in the particles is enhanced.
  • a "hydrophilic group” is an atomic group having a strong interaction with water.
  • the compound having the structure represented by the general formula (1) is, for example, the method described in International Publication No. 2014/022008 or the references described in these documents. It can be synthesized by referring to the method described in 1.
  • the luminescent nanoparticles of the present invention may contain a binder having a fixing material-like or binder-like action, so that the particle surface can have a special function via the binder. Preferred in terms of points.
  • the luminescent dye contained in the luminescent nanoparticles is in the range of 20 to 500 ⁇ mol with respect to 1 g of the binder in terms of the effect of the binder.
  • the binder is preferably an organic resin or metal alkoxide having a carbon atom in the main chain and a molecular weight of 300 or more.
  • organic resin include polyolefin resins such as polypropylene, polymethylpentene and polycyclohexylene methylene terephthalate (PCT), polyamides, polyacetals, polyethylene terephthalates, polybutylene terephthalates, polyphenylene sulfides, polycarbonates, ABS resins and AS resins.
  • Acrylic resin amino resin, polyester resin, epoxy resin, mixed resin of acrylic resin and amino resin, polyester resin and amino resin, cellulose resin, polyethylene resin, polypropylene resin, polystyrene resin, polyvinyl chloride Resin, polymethylmethacrylate resin, polyacrylonitrile resin, polyacrylamide resin, polyalcohol resin, polyallycacelic allyl resin, polyoxymethylene resin, poly-n-butyl isocyanate resin, polyethylene oxide resin, 6-nylon resin, poly- ⁇ -Oxypropionic acid ester resin, phenol resin, urea resin, melamine resin, alkyd melamine resin, unsaturated polyester resin, polyvinyl alcohol resin, poly (N-vinylformamide) resin, poly (N-vinylisobutylamide) resin, polyacrylic Examples thereof include acid resin, poly (N-isopropylacrylamide) resin, poly (N-vinylpyrrolidinone) resin, polyhydroxyethyl methacrylate resin, polyoxyethylene
  • the metal of the metal alkoxide include magnesium, calcium, strontium, scandium, ittrium, ruthenium, lawrencium, lanthanum, titanium, zirconium, hafnium, cerium, vanadium, niobium, tantalum, chromium, molybdenum, tungsten, manganese, and ruthenium.
  • Examples include cobalt, rhodium, iridium, nickel, platinum, palladium, copper, silver, gold, zinc, aluminum, gallium, indium, silicon, germanium and tin.
  • the binder present on the surface of the luminescent nanoparticles of the present invention has a hydrophilic group in that the particles can be dispersed in water by suppressing aggregation of the particles.
  • a hydrophilic group is an atomic group having a strong interaction with water.
  • binder having a hydrophilic group examples include urea resin, melamine resin, polyvinyl alcohol resin, poly (N-vinylformamide) resin, poly (N-vinylisobutylamide) resin, and polyacrylic acid resin.
  • the binder contained therein and the luminescent dye form a covalent bond from the viewpoint of preventing the luminescent dye from leaking from the particles.
  • the luminescent dye becomes the above-mentioned binder such as, for example, a melamine group, a methylol melamine group, a trialkoxysilyl group and the like. It is preferable to have a polymerizable group that reacts with an organic resin or a metal alkoxy.
  • the binder according to the present invention may be a thermosetting resin.
  • the luminescent dye can be immobilized inside a dense crosslinked structure, and is thermosetting such as a melamine resin. Resin is preferred.
  • thermosetting resin examples include those containing a structural unit formed of at least one monomer selected from the group consisting of melamine, urea, guanamines (including benzoguanamine, acetoguanamine, etc.) and derivatives thereof. .. Any one of these monomers may be used alone, or two or more thereof may be used in combination. If desired, one or more comonomer other than the above compounds may be used in combination.
  • thermosetting resin examples include melamine / formaldehyde resin and urea / formaldehyde resin.
  • thermosetting resins not only the monomer itself as described above, but also a prepolymer obtained by reacting the monomer with a compound such as formaldehyde or another cross-linking agent in advance may be used.
  • a prepolymer obtained by reacting the monomer with a compound such as formaldehyde or another cross-linking agent in advance
  • a compound such as formaldehyde or another cross-linking agent in advance
  • trimethylolpropane prepared by condensing melamine and formaldehyde under alkaline conditions is generally used as a prepolymer, and the compound is further alkyl etherified (in water). It may be methylated to improve the stability of formaldehyde, butylated to improve the solubility in an organic solvent, etc.).
  • thermosetting resin may have at least a part of hydrogen contained in the constituent unit replaced with a charged substituent or a substituent capable of forming a covalent bond.
  • a thermosetting resin can be synthesized by using a monomer in which at least one hydrogen is replaced with the above-mentioned substituent (derivatized) as a raw material by a known method.
  • thermosetting resin can be synthesized according to a known method.
  • the melamine / formaldehyde resin can be synthesized by polycondensing the methylol melamine prepared in advance as described above by heating it after adding a reaction accelerator such as an acid, if necessary.
  • the binder according to the present invention may be a thermoplastic resin.
  • the thermoplastic resin for example, at least one monofunctional monomer selected from the group consisting of (meth) acrylic acid and its alkyl ester, acrylonitrile, and derivatives thereof (a group involved in a polymerization reaction in one molecule, described above. For example, those containing a structural unit formed from a monomer having one vinyl group) can be mentioned. Any one of these monomers may be used alone, or two or more thereof may be used in combination.
  • thermoplastic resin is a structural unit formed from a polyfunctional monomer such as divinylbenzene (a group involved in a polymerization reaction in one molecule, a monomer having two or more vinyl groups in the above example), that is, a crosslink. It may include a site. For example, a crosslinked product of polymethyl methacrylate can be mentioned.
  • thermoplastic resin may contain a structural unit having a functional group for surface-modifying the luminescent nanoparticles in the present invention.
  • a monomer such as glycidyl methacrylate having an epoxy group as a raw material
  • luminescent nanoparticles having an epoxy group oriented on the surface can be prepared.
  • This epoxy group can be converted to an amino group by reacting with excess aqueous ammonia.
  • biomolecules can be introduced into the amino group thus formed according to a known method (via a molecule serving as a linker, if necessary).
  • the luminescent nanoparticles of the present invention are produced according to a known polymerization step for various binders after using a luminescent dye that satisfies specific conditions. be able to.
  • a reaction mixture containing a luminescent dye, a resin raw material (monomer, oligomer or prepolymer), preferably a surfactant and a polymerization reaction accelerator is heated to promote the polymerization reaction of the resin, and the luminescent dye is used.
  • a resin raw material monomer, oligomer or prepolymer
  • a surfactant and a polymerization reaction accelerator is heated to promote the polymerization reaction of the resin, and the luminescent dye is used.
  • the order of addition of each component contained in the reaction mixture is not particularly limited. Typically, an order is used in which a surfactant is added to an aqueous solution of a luminescent dye, then a resin raw material is added, and finally a polymerization reaction accelerator is added. Alternatively, the order may be such that the resin raw material is added to the aqueous solution of the surfactant, and then the polymerization reaction accelerator is added to proceed the synthesis reaction of the resin particles, and the aqueous solution of the luminescent dye is added.
  • the concentration of the aqueous solution of the specific luminescent dye used in such a polymerization step according to the present invention is in a range relatively higher than the concentration of the conventional aqueous solution of luminescent dye (for example, 2,500 to 10,000 ⁇ M). ) Can be adjusted.
  • the conditions (temperature, time, etc.) of the polymerization reaction can be appropriately set while considering the type of resin, the composition of the raw material mixture, and the like.
  • the polymerization method is not particularly limited as long as it is a known polymerization method.
  • Known polymerization methods include, for example, bulk polymerization, emulsion polymerization, soap-free emulsion polymerization, seed polymerization, suspension polymerization and the like.
  • resin particles having a desired particle size can be obtained by pulverizing and then classifying.
  • Emulsion polymerization is a polymerization method in which a medium such as water, a monomer that is difficult to dissolve in the medium, and an emulsifier (surfactant) are mixed, and a polymerization initiator that is soluble in the medium is added thereto. It is characterized by a small variation in the obtained particle size.
  • Soap-free emulsion polymerization is emulsion polymerization that does not use an emulsifier. It is characterized in that particles having a uniform diameter can be obtained.
  • Seed polymerization is a polymerization carried out by inserting seed particles separately prepared at the start of polymerization. As seed particles, the particle size, particle size distribution, and amount (number) are arbitrarily determined for polymerization, and there is a feature that polymerization can be performed aiming at a desired particle size and particle size distribution.
  • Suspension polymerization is a polymerization method in which a monomer and water as a solvent are mechanically stirred and suspended. The feature is that particles with a small particle diameter and well-organized can be obtained.
  • the reaction temperature is usually 70 to 200 ° C., and the reaction time is usually 20 to 120 minutes. It is appropriate that the reaction temperature is a temperature (within the heat resistant temperature range) at which the performance of the luminescent dye does not deteriorate.
  • the heating may be performed in a plurality of stages, for example, the reaction may be carried out at a relatively low temperature for a certain period of time, then the temperature may be raised and the reaction may be carried out at a relatively low temperature for a certain period of time.
  • reaction solution is centrifuged to remove the supernatant containing impurities, and then ultrapure water is added and ultrasonically irradiated to disperse and wash the reaction solution again. It is preferable to repeat these operations a plurality of times until no absorption or luminescence derived from the resin or luminescent dye is observed in the supernatant.
  • Luminescent nanoparticles using a thermosetting resin can be basically produced according to an emulsion polymerization method, but it is preferably produced by a polymerization step as described above using a surfactant and a polymerization reaction accelerator.
  • most of the luminescent dyes are preferably immobilized in a state where substantially all of them are contained in the resin particles, but some of them are luminescent. It is not excluded that the dye is immobilized in a state of being bonded or adhered to the surface of the resin particles.
  • the luminescent dye is immobilized on the resin particles in the state where the luminescent dye is contained.
  • a derivatization step for covalently bonding the resin raw material and the luminescent dye in advance or introducing a positively charged substituent into the resin raw material prior to the polymerization step ().
  • surfactant As the surfactant, a known emulsifier for emulsion polymerization can be used.
  • Surfactants include anionic (anionic), nonionic (nonionic), and cationic (cationic) surfactants.
  • anionic anionic
  • nonionic nonionic
  • cationic cationic surfactants.
  • anionic or nonionic surfactant when synthesizing a (cationic) thermosetting resin having a positively charged substituent or moiety, it is preferable to use an anionic or nonionic surfactant.
  • cationic or nonionic surfactant When synthesizing a (cationic) thermosetting resin having a negatively charged substituent or moiety, it is preferable to use a cationic or nonionic surfactant.
  • anionic surfactant examples include sodium dodecylbenzenesulfonate (product name “Neoperex” series, Kao Corporation).
  • nonionic surfactant examples include polyoxyethylene alkyl ether-based compounds (product name “Emargen” series, Kao Corporation), polyvinylpyrrolidone (PVP), and polyvinyl alcohol (PVA).
  • cationic surfactant examples include dodecyltrimethylammonium bromide.
  • the particle size of the resin particles can be adjusted, and the coefficient of variation of the particle size is small, that is, luminescent nanoparticles having the same particle size can be produced. ..
  • the amount of the surfactant added is, for example, 10 to 60% by mass with respect to the resin raw material, or 0.1 to 3.0% by mass with respect to the entire raw material mixture. Increasing the amount of the surfactant added tends to reduce the particle size, and conversely, decreasing the amount of the surfactant added tends to increase the particle size.
  • the polymerization reaction accelerator promotes the polycondensation reaction of a thermosetting resin such as a melamine resin, and imparts a proton (H + ) to a functional group such as an amino group contained in the resin or a luminescent dye to charge the resin. It has a function of facilitating electrostatic interaction.
  • the reaction of the thermosetting resin proceeds only by heating, but when a polymerization reaction accelerator is added, the reaction proceeds at a lower temperature, so that the reaction and performance can be controlled within a controllable range.
  • Examples of such a polymerization reaction accelerator include acids such as formic acid, acetic acid, sulfuric acid, p-toluenesulfonic acid, and dodecylbenzenesulfonic acid.
  • acids such as formic acid, acetic acid, sulfuric acid, p-toluenesulfonic acid, and dodecylbenzenesulfonic acid.
  • the luminescent dye is a compound having a carboxy group or a sulfo group, the luminescent dye can also donate a proton in the same manner as the above acid.
  • the luminescent labeling material for pathological diagnosis of the present invention is characterized in that a target-directing ligand is bound to the surface of the above-mentioned luminescent nanoparticles of the present invention via a covalent bond. ..
  • the use of the luminescent nanoparticles of the present invention is not particularly limited, but typically, for labeling a substance to be detected contained in a sample (tissue section) and enabling fluorescence observation in immunostaining. , Use as a luminescent labeling material for pathological diagnosis. That is, it is preferable that the luminescent nanoparticles of the present invention as described above are used as a complex (conjugate) by linking a target-directing ligand according to the embodiment of immunostaining.
  • the substance to be detected is not particularly limited, but in pathological diagnosis, an antigen according to the purpose is generally selected.
  • HER2 can be a detection target substance in the pathological diagnosis of breast cancer.
  • the substance to be detected does not have to be unique to the living body.
  • the substance to be detected may be a drug.
  • the “target-directed ligand” is a molecule having specific binding property to a specific tissue or cell (detection target substance).
  • the target-directed ligand of the present invention is a molecule selected from the group consisting of an antibody, an organelle-affinitive substance, and a protein having a binding property to a sugar chain in that non-specific adsorption is suppressed. preferable.
  • target-directing ligand is not particularly limited, and the optimum one can be selected according to the purpose.
  • Specific examples of the target-directed ligand include the following.
  • a primary example of a target-directing ligand is a primary antibody (an antibody that specifically binds to a substance to be detected).
  • the luminescent labeling material for pathological diagnosis in which the target-directing ligand is the primary antibody, can be directly bound to the substance to be detected and fluorescently labeled (primary antibody method).
  • a second example of a target-directing ligand is a secondary antibody (an antibody that binds to a primary antibody).
  • the primary antibody is an antibody (IgG) produced from a rabbit
  • the secondary antibody will be an anti-rabbit IgG antibody.
  • the detection target substance can be indirectly fluorescently labeled by binding to the primary antibody bound to the detection target substance with a luminescent labeling material for pathological diagnosis in which the target-directing ligand is a secondary antibody (2). Next antibody method).
  • a third example of a target-directed ligand is avidin, streptavidin or biotin.
  • a secondary antibody-biotin complex is used in combination.
  • a secondary antibody-biotin complex binds to the primary antibody bound to the substance to be detected, and a luminescent labeling material for pathological diagnosis in which avidin or streptavidin is a target-directing ligand further binds to the complex.
  • the substance to be detected can be indirectly fluorescently labeled (biotin-avidin method or sandwich method).
  • a luminescent labeling material for pathological diagnosis in which the target-directing ligand is biotin can also be used in combination with a secondary antibody-avidin complex or a secondary antibody-streptavidin.
  • the primary antibody may be selected to specifically bind to the selected substance to be detected.
  • an anti-HER2 monoclonal antibody can be used as the primary antibody.
  • Such a primary antibody can be produced by a general method using mice, rabbits, cows, goats, sheep, dogs, chickens and the like as immune animals.
  • the secondary antibody one that binds to the selected primary antibody may be selected.
  • the primary antibody is a rabbit anti-HER2 monoclonal antibody
  • an anti-rabbit IgG antibody can be used as the secondary antibody.
  • Such a secondary antibody can also be produced by a general method.
  • nucleic acid molecule as the substance to be detected and a nucleic acid molecule having a base sequence complementary to the nucleic acid molecule as the corresponding targeting ligand.
  • the luminescent labeling material for pathological diagnosis may be produced by any known method. For example, amidation by the reaction of amine and carboxylic acid, sulfidation by reaction of maleimide and thiol, imination by reaction of aldehyde and amine, and amination by reaction of epoxy and amine can be utilized.
  • the functional group involved in such a reaction may be one that is pre-existing on the surface of the luminescent nanoparticles (a functional group derived from the raw material monomer of the binder) or a functional group that is present on the surface of the luminescent nanoparticles. It may be a functional group obtained by converting a group according to a known method, or a functional group introduced by surface modification or the like. Appropriate linker molecules may be utilized as needed.
  • kits for tissue immunostaining using the luminescent nanoparticles of the present invention contains at least the luminescent labeling material for pathological diagnosis of the present invention or the luminescent nanoparticles of the present invention, target-directed ligands and reagents.
  • the kit further forms the desired complex, optionally with a primary antibody, a secondary antibody, another targeting ligand (eg biotin) used in combination with said targeting ligand (eg streptavidin). It may contain reagents for the purpose, other reagents used for immunohistochemical staining, and the like.
  • a luminescent label (luminous nanoparticles in the present invention) is bound to a target-directed ligand or the like via a covalent bond.
  • Various methods for producing a luminescent labeling material for pathological diagnosis are known, and such methods can also be used in the present invention.
  • a luminescent labeling material for pathological diagnosis (one of the reactive functional groups existing on the surface thereof) is used.
  • the group) and the target-directed ligand can be attached via a covalent bond.
  • the functional groups contained therein cannot be directly bonded to each other, they can be bonded to both ends of the molecule via "linker molecules" having predetermined functional groups.
  • Such a reaction can be carried out by adding necessary reagents and allowing a predetermined time to elapse.
  • a silane coupling agent for example, aminopropyltrimethoxysilane
  • a luminescent nanoparticles having a hydroxy group on the surface to introduce an amino group
  • a thiol group introducing reagent for example, N
  • streptavidin a thiol group introducing reagent
  • -Succimidyl S acetylthioacetic acid is reacted to introduce a thiol group
  • a PEG (polyethylene glycol) -based linker molecule having a maleimide group reactive with both an amino group and a thiol group is reacted at both ends.
  • an epoxy group derived from the monomer appears on the surface of the luminescent nanoparticles.
  • the epoxy group can be converted into an amino group, and a desired target-directing ligand or the like can be linked to the amino group.
  • Example 2 Preparation of luminescent nanoparticles using a water-soluble dye ⁇ Luminescent nanoparticles No. Preparation of (2-1) to (2-12)> 20 mL of water was added to a solution of the luminescent dye (types and addition amounts shown in Table I) in 0.2 mL of water so that the surfactant (Emulgen 409PV) was 0.5 vol%. This solution was heated to 80 ° C. while stirring on a hot stirrer, and then the same operation as in Example 1 was performed except that 2.0 g of melamine resin was added. Particle No. (2-1) to (2-12) were obtained.
  • Luminescent dyes (types and addition amounts listed in Table I) at 5 ° C. with 48 mL of 99% ethanol, 0.6 mL of tetraethoxysilane (TEOS), 2 mL of ultrapure water, and 2.0 mL of 28% by weight aqueous ammonia. It was mixed for 3 hours.
  • TEOS tetraethoxysilane
  • the mixture prepared in the above step was centrifuged at 10000 G for 20 minutes to remove the supernatant. Ethanol was added to this precipitate to disperse the precipitate, and the precipitate was rinsed again for centrifugation. Further, the same rinsing was repeated twice to obtain No. 2 luminescent nanoparticles (luminescent dye-containing silica particles) having an average particle size of 130 nm. (3-1) to (3-4) were obtained.
  • Example 4 Preparation of luminescent nanoparticles having a covalent bond with a binder ⁇ Luminescent nanoparticles No. Preparation of (4-1) to (4-2)> Luminous nanoparticles No. with an average particle size of 130 nm were according to the same conditions as in Example 1 except that the luminescent dyes (types and addition amounts shown in Table I) were changed. (4-1) to (4-2) were obtained.
  • the quantum yield is prepared by dispersing luminescent nanoparticles in PBS so as to have a particle molar concentration of 0.01 mmol / L, and the quantum yield of the dispersion is measured by the absolute PL quantum yield measuring device C9920-02 ( Hamamatsu Photonics Co., Ltd.) measured by exciting each nanoparticle at the maximum absorption wavelength.
  • the brightness is prepared by dispersing luminescent nanoparticles in PBS so that the particle molar concentration is 0.01 mmol / L, and the brightness of the dispersion is measured with a fluorometer (Hitachi High Technologies, Inc .; F-7000). The measurement was performed by exciting the nanoparticles at the maximum absorption wavelength of each nanoparticle at room temperature.
  • the luminescent nanoparticles of the present invention have solid luminescent properties, the result was obtained that the quantum yield increased or maintained when the amount of dye added was increased. Furthermore, since the absorbance also increases as the amount of dye added increases, the result is that the brightness increases in all cases. As a result, the luminescent nanoparticles of the present invention were superior to the luminescent nanoparticles of the comparative example, and the effectiveness of the present invention was confirmed.
  • Luminous nanoparticles No. which is a comparative example.
  • the luminescent dye (C-1) has aggregation-induced luminescence, No. Compared with (1-1), when the amount of dye added was increased, the quantum yield increased and the luminance also increased, but the increase range was limited.
  • Luminous nanoparticles No. which is a comparative example.
  • (1-4) No. Compared with (1-3), when the amount of dye added was increased, concentration quenching occurred and both the quantum yield and the brightness decreased.
  • the luminescent nanoparticles of the examples were dispersed in water, and absorption, emission spectrum measurement, and delayed emission measurement were performed. The results are shown in Table II.
  • Table II the long Stokes shift luminescence is indicated by ⁇ when the Stokes shift is 100 to 200 nm and ⁇ when the Stokes shift is 200 nm or more. Delayed luminescence was observed for all luminescent nanoparticles in Table II.
  • the ratio of the delayed emission intensity to the immediate emission intensity after 100 nsec is 1/10 or more, it is indicated by ⁇ , and when it is less than 1/10, it is indicated by ⁇ .
  • the delayed emission measurement was performed using a streak camera C4334 (manufactured by Hamamatsu Photonics Co., Ltd.) while exciting the dispersion with a laser beam.
  • the long Stokes shift was 200 nm or more in the intramolecular exileplex dye-containing dye particles. Furthermore, the ratio of the delayed emission intensity to the immediate emission intensity was higher in the intramolecular exileplex dye-containing particles than in the thermally active delayed fluorescent dye-containing particles.
  • Luminous nanoparticles No. Luminescent labeling material for pathological diagnosis consisting of (1-1) to (1-22), (2-1) to (2-12) and (4-1) to (4-2) ⁇ maleimide group at the end Preparation of luminescent nanoparticles surface-modified with PEG chains having The luminescent nanoparticles No. 1 which are melamine particles containing a luminescent dye. Disperse 0.1 mg of each of the particles (1-1) to (1-22), (2-1) to (2-12) and (4-1) to (4-2) in 1.5 mL of ethanol.
  • hydroxylamine treatment was used to generate free thiol groups (-SH) from the protected thiol groups, completing the process of introducing thiol groups (-SH) into streptavidin.
  • This solution was passed through a gel filtration column (Zaba Spin Desalting Colors: Funakoshi) and desalted to obtain streptavidin into which a thiol group was introduced.
  • Luminous nanoparticles No. Luminescent labeling material for pathological diagnosis consisting of (3-1) to (3-4) ⁇ Preparation of luminescent nanoparticles having a maleimide group at the end>
  • the above-mentioned luminescent nanoparticles No. 2 which are luminescent dye-containing silica particles.
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • SM SM
  • This streptavidin solution was desalted with a gel filtration column (Zaba Spin Desalting Colors: Funakoshi) to obtain streptavidin capable of binding to the silica particles.
  • Example 7 Evaluation of luminescent labeling material for pathological diagnosis >> ⁇ Tissue staining process> [Immunohistochemical staining] Immunostaining of human breast tissue was performed using a tissue staining stain containing a luminescent marker for pathological diagnosis composed of luminescent nanoparticles prepared in Examples 5 and 6.
  • the stain for tissue staining was prepared using a PBS buffer solution containing 1% BSA.
  • a tissue array slide (manufactured by Cosmo Bio Co., Ltd., product number CB-A712) was used as the stained section.
  • the FISH score for each spot was calculated in advance using the Pathvision HER2 DNA probe kit (manufactured by Abbott). This FISH score was calculated according to the procedure described in the document attached to the HER2 Gene Kit Path Vision®; HER2 DNA Probe Kit, manufactured by Abbott Japan Co., Ltd.
  • the tissue array slide was deparaffinized, replaced with water, washed, and autoclaved in 10 mM citrate buffer (pH 6.0) for 15 minutes to activate the antigen.
  • the tissue array slide after the antigen activation treatment was washed with PBS buffer, and then the anti-HER2 rabbit monoclonal antibody (4B5) diluted to 0.05 nM with PBS buffer containing 1% BSA was reacted with the tissue section for 2 hours. I let you. After washing with PBS, it was reacted with biotin-labeled anti-rabbit antibody diluted with PBS buffer containing 1% BSA for 30 minutes.
  • immunohistochemical staining is performed using the above-mentioned stain for tissue staining, that is, by reacting with the above-mentioned manufactured luminescent labeling material for pathological diagnosis (luminous nanoparticles having streptavidin) for 2 hours, and then washing. Sections were obtained. The obtained immunohistochemically stained sections were immersed in a 4% neutral paraformaldehyde aqueous buffer solution for 10 minutes for fixation treatment.
  • the present invention can be used for luminescent nanoparticles and luminescent labeling materials for pathological diagnosis, which enable high-sensitivity imaging that can avoid the adverse effects of cell autofluorescence on bioimaging.

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Abstract

本発明の課題は、バイオイメージングに対する細胞の自家蛍光の悪影響を回避し得る高感度イメージングを可能にする発光性ナノ粒子及び病理診断用発光性標識材を提供することである。　本発明の発光性ナノ粒子は、発光性色素を含有する発光性ナノ粒子であって、前記発光性色素が、特定の一般式（１）で表される構造を有する化合物であり、かつ、遅延発光性又はロング・ストークスシフト発光性のうち少なくともいずれか一つを有することを特徴とする。

Description

発光性ナノ粒子及び病理診断用発光性標識材
　本発明は、発光性ナノ粒子及び病理診断用発光性標識材に関し、より詳しくは、バイオイメージングに対する細胞の自家蛍光の悪影響を回避し得る高感度イメージングを可能にする発光性ナノ粒子及び病理診断用発光性標識材に関する。
　発光性色素を用いた「バイオイメージング」における、イメージング像内でのナノ粒子の輝点によるタンパク質の位置や定量が可能な高感度イメージングに向けて、発光性色素の発光と細胞の自家蛍光との分離することが大きな課題となっている。
　なお、「バイオイメージング」とは、細胞やたんぱく質等のターゲットに対して微小な発光性粒子等の発光（例えば蛍光）プローブを特異的に吸着させた後、当該発光プローブからの発光を利用して、ターゲットの構造や生体内におけるそれらの位置や移動の様子を観察することをいう。
　前記バイオイメージングに対する自家蛍光の悪影響を回避するための手段として、近赤外発光、ロング・ストークスシフト発光及び遅延発光等の現象を利用する手段が挙げられる。
　その中でも、近赤外発光は最も利用されている手段ではあるが、協同的に働く細胞内の生体分子を解析する上で重要な多色染色が困難であるという問題がある。
　ロング・ストークスシフト発光は、励起波長と発光波長に大きな差を持たせることで、細胞の自家蛍光の発光強度（「輝度」ともいう。）が強い波長域を回避するのに有効な手段である。しかしながら、１００ｎｍを超えるロング・ストークスシフト発光は一般的なエキサイプレックス発光に代表されるように発光性が低いという問題がある。
　遅延発光にはリン光発光、熱活性型遅延蛍光、エキサイプレックス発光等が挙げられ、１０ナノ秒前後に消失する細胞の自家蛍光よりも、１マイクロ秒前後の長い時間発光することが可能である。遅延発光では細胞の自家蛍光が消失後の時間帯で発光イメージングすることが可能であり、有望な手段である。
　非特許文献１及び非特許文献２では、熱活性型遅延蛍光を示す色素を用いたナノ粒子を用いて、時間分解での細胞イメージング技術が開示されている。時間分解イメージングでは細胞の自家蛍光が消失後の時間帯でイメージングするために遅延発光自体の発光強度が必要である。しかし、非特許文献１で開示されている技術では発光の量子収率に課題があり、非特許文献２で開示されている技術では遅延蛍光の発光強度が低いという課題がある。そのため、上述の高感度イメージング用途を満たすには、さらに発光性を高める必要がある。
　従って、ロング・ストークスシフト発光、遅延発光ともに、上述の高感度イメージング用途への応用には発光性に問題がある。その回避策として、イメージングの回数を積算させる方法があるが、この方法では励起パルス光の照射を繰り返すために細胞や発光性色素の劣化を引き起こし、イメージングの精度を低下させる原因となる。そのため、イメージングの積算時間を短くするために、発光性ナノ粒子自体の輝度（＝吸光度×量子収率）を高める必要がある。ナノ粒子の輝度を上げるには、ナノ粒子中の吸光度を向上させながら量子収率を維持しなければならない。
　発光性色素の吸光度（＝モル吸光係数×モル濃度）を向上させるには、色素自体のモル吸光係数を上げるか、粒子中の色素濃度を上げる方法がある。ここで、ロング・ストークスシフト発光や遅延発光の色素の発光性を維持するには、励起される配位子部位、ドナー部位（電子供与性基）及びアクセプター部位（電子求引性基）等が消光現象を抑制する高い最低三重項励起状態（Ｔ１）のエネルギー準位を維持することが必要であることから、Ｔ１準位を低下させるπ共役系の拡張を回避しなければならず、その結果としてモル吸光係数の大幅な向上は分子設計的に困難である。
　低いモル吸光係数を補完するために、色素を粒子中に高濃度で集積して色素のモル数を稼ぐことで、吸光度を上昇させる方法が有効である。一方、従来技術においては、粒子中に色素を高濃度で集積させることによって、濃度消光による量子収率の低下がトレードオフとして生じている。濃度消光を回避するためには、固体発光性を付与した色素を用いる必要がある。
　最近、高発光性の凝集誘起発光性の色素含有粒子が報告されているが（特許文献１及び非特許文献３参照）、細胞の自家蛍光が回避できないことや、非特許文献１で開示されている凝集誘起発光性と遅延発光性を両立している発光粒子の課題は上述のとおりであり、そのため従来技術では高感度イメージング用途においては課題があった。
特開２０１６－１９９７５１号公報
Ｔ．Ｌｉ，ｅｔ　ａｌ．，Ａｄｖ．Ｓｃｉ．２０１７，４，１６００１６６ Ｙ．Ｔｓｕｃｈｉｙａ，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．２０１９，５５，５２１５ Ｋ．Ｌｉ，ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　３，Ａｒｔｉｃｌｅ　ｎｕｍｂｅｒ：１１５０（２０１３）
　本発明は、上記問題・状況に鑑みてなされたものであり、その解決課題は、バイオイメージングに対する細胞の自家蛍光の悪影響を回避し得る高感度イメージングを可能にする発光性ナノ粒子及び病理診断用発光性標識材を提供することである。
　本発明者は、上記課題を解決すべく、上記課題の原因等について検討した結果、発光性ナノ粒子が含有する色素の電子求引性基と電子供与性基を繋ぐ連結基を２～４個の原子からなる骨格を有するものとすることで、細胞の自家蛍光の悪影響を回避し得る高感度イメージングを可能にする発光性ナノ粒子を見出し本発明に至った。
　すなわち、本発明に係る上記課題は、以下の手段により解決される。
　１．発光性色素を含有する発光性ナノ粒子であって、
　前記発光性色素が、下記一般式（１）で表される構造を有する化合物であり、かつ、
　遅延発光性又はロング・ストークスシフト発光性のうち少なくともいずれか一つを有することを特徴とする発光性ナノ粒子。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 〔式中、Ａは、電子求引性基を表す。Ｄは、電子供与性基を表す。Ｌは、２～４個の原子からなる骨格を有する連結基を表す。前記２～４個の原子は、炭素原子、酸素原子、窒素原子、ケイ素原子、硫黄原子、ホウ素原子又はリン原子である。前記連結基は、水素原子又は置換基を有していてもよい。〕
　２．前記一般式（１）が、下記一般式（２）～（６）の少なくともいずれかで表されることを特徴とする第１項に記載の発光性ナノ粒子。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 〔式中、Ａは、電子求引性基を表す。Ｄは、電子供与性基を表す。Ｘは、環状飽和炭化水素基、環状不飽和炭化水素基、アリール基又はヘテロアリール基を表す。Ｙ及びＺは、炭素原子、酸素原子、窒素原子、ケイ素原子、硫黄原子、ホウ素原子又はリン原子を表し、水素原子又は置換基を有していてもよい。一般式（４）及び（５）におけるＹは２個の原子からなる骨格を有する連結基であってもよい。〕
　３．遅延発光性を有することを特徴とする第１項又は第２項に記載の発光性ナノ粒子。
　４．分子内エキサイプレックス発光性を有することを特徴とする第１項から第３項までのいずれか一項に記載の発光性ナノ粒子。
　５．ロング・ストークスシフト発光性を有することを特徴とする第１項から第４項までのいずれか一項に記載の発光性ナノ粒子。
　６．前記一般式（２）～（６）の式中において、Ａが「置換されていてもよいカルボニル基」、「置換されていてもよいスルホニル基」、「置換されていてもよいボリル基」、「置換されていてもよいホスフィンオキシド基」、「電子求引性基で置換されていてもよいアリール基」、「シアノ基、フッ素原子、フッ素原子で置換されたアルキル基若しくは含窒素芳香族六員環含有複素環基で置換された電子供与性の複素環基」、又は「置換されていてもよい電子求引性の複素環基」を表し、Ｄが「電子供与性基で置換されたアリール基」、「シアノ基、フッ素原子、フッ素原子で置換されたアルキル基及び含窒素芳香族六員環含有複素環基以外の置換基で置換されていてもよい電子供与性の複素環基」、又は「置換されていてもよいアミノ基」を表し、かつ、Ｘがアリール基又はヘテロアリール基を表すことを特徴とする第２項から第５項までのいずれか一項に記載の発光性ナノ粒子。
　７．前記一般式（４）～（６）の式中において、Ａが「置換されていてもよいカルボニル基」、「置換されていてもよいスルホニル基」、「置換されていてもよいボリル基」、「置換されていてもよいホスフィンオキシド基」、「電子求引性基で置換されていてもよいアリール基」、「シアノ基、フッ素原子、フッ素原子で置換されたアルキル基若しくは含窒素芳香族六員環含有複素環基で置換された電子供与性の複素環基」、又は「置換されていてもよい電子求引性の複素環基」を表し、Ｄが「電子供与性基で置換されたアリール基」、「シアノ基、フッ素原子、フッ素原子で置換されたアルキル基及び含窒素芳香族六員環含有複素環基以外の置換基で置換されていてもよい電子供与性の複素環基」、又は「置換されていてもよいアミノ基」を表し、Ｘがアリール基又はヘテロアリール基を表し、かつ、Ｙが炭素原子、酸素原子、又はケイ素原子を表すことを特徴とする第２項から第５項までのいずれか一項に記載の発光性ナノ粒子。
　８．前記発光性色素が親水性基を有することを特徴とする第１項から第７項までのいずれか一項に記載の発光性ナノ粒子。
　９．バインダーを含有することを特徴とする第１項から第８項までのいずれか一項に記載の発光性ナノ粒子。
　１０．前記バインダーのうち発光性ナノ粒子の表面に存在するバインダーが、親水性基を有することを特徴とする第９項に記載の発光性ナノ粒子。
　１１．前記バインダーと前記発光性色素が共有結合を形成していることを特徴とする第９項又は第１０項に記載の発光性ナノ粒子。
　１２．第１項から第１１項までのいずれか一項に記載の発光性ナノ粒子の表面に標的指向性リガンドが共有結合を介して結合していることを特徴とする病理診断用発光性標識材。
　本発明の上記手段により、バイオイメージングに対する細胞の自家蛍光の悪影響を回避し得る高感度イメージングを可能にする発光性ナノ粒子及び病理診断用発光性標識材を提供することができる。
　本発明の効果の発現機構又は作用機構については、明確にはなっていないが、以下のように推察している。
　電子供与性基と電子求引性基の間を２～４個の原子からなる骨格を有する連結基で繋ぎ、励起状態における電子供与性基と電子求引性基の間の電子移動を有効に起こさせることにより、電子供与性基と電子求引性基を捩じれ構造にすることで熱活性型遅延蛍光を、又は電子供与性基と電子求引性基の間を非共役原子で繋ぐことで分子内エキサイプレックス発光を、高い発光性を有する遅延発光で放射することを可能にしている。さらには同様の理由で、ロング・ストークスシフトを有する発光も高い発光性で発現させることができている。
　固体状態（分子凝集状態）での発光性すなわち「固体発光性」も、電子供与性基と電子求引性基の間を２～４個の原子からなる骨格を有する連結基で繋ぎ、電子供与性基と電子求引性基の距離を近い状態に維持することで達成される。その理由は、電子供与性基と電子求引性基の距離を近い状態に維持することで、励起された際の迅速な電子遷移及び安定性の高い励起状態の形成が可能となり、分子間相互作用による消光の妨げを回避できるためである。その結果、濃度消光を回避して固体発光性を発現させることができると推察される。
　このため、バイオイメージングに対する細胞の自家蛍光の悪影響を回避し得る高感度イメージングを可能にする発光性ナノ粒子を提供することができると考えられる。
　本発明の発光性ナノ粒子は、発光性色素を含有する発光性ナノ粒子であって、前記発光性色素が、前記一般式（１）で表される化合物であり、かつ、遅延発光性又はロング・ストークスシフト発光性のうち少なくともいずれか一つを有することを特徴とする。
　この特徴は、下記実施態様に共通する又は対応する技術的特徴である。
　本発明の実施形態としては、本発明の効果発現の観点から、前記一般式（１）が、前記一般式（２）～（６）の少なくともいずれかで表されることが好ましい。
　本発明の発光性ナノ粒子は、細胞の自家蛍光の影響を低減する観点から、遅延発光性を有することが好ましい。また、高い発光強度で遅延発光を放射する分子内エキサイプレックス発光性を有することがさらに好ましい。さらに、ロング・ストークスシフト発光性を有することも好ましい。
　本発明の実施形態としては、本発明の効果発現の観点から、前記一般式（２）～（６）の式中において、Ａ、Ｄ及びＸが、前記例示した置換基又は原子を表すことが好ましい。
　本発明の実施形態としては、本発明の効果発現の観点から、前記一般式（４）～（６）の式中において、Ａ、Ｄ、Ｘ及びＹが前記例示した置換基又は原子を表すことが好ましい。
　本発明の発光性ナノ粒子は、前記発光性色素が、親水性基を有することが好ましい。また、バインダーを含有することが、バインダーを介して、粒子表面に特別な機能を持たせることを可能にすることができる点で好ましい。また、バインダー粒子に色素が分散した状態で取り込まれやすくなり、粒子中での発光性を高める点で好ましい。
　さらに、前記バインダーのうち前記発光性ナノ粒子の表面に存在するバインダーが親水性基を有することが、粒子同士の凝集を抑制する点で好ましい。
　実施形態としては、前記バインダーと前記発光性色素が共有結合を形成していることは、粒子から発光性色素が漏れることを防ぐ点で好ましい。
　本発明の病理診断用発光性標識材は、上記発光性ナノ粒子の表面に標的指向性リガンドが共有結合を介して結合していることを特徴としている。
　以下、本発明とその構成要素、及び本発明を実施するための形態・態様について詳細な説明をする。なお、本願において、「～」は、その前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む意味で使用する。
１．本発明の発光性ナノ粒子の概要
　本発明の発光性ナノ粒子は、発光性色素を含有する発光性ナノ粒子であって、前記発光性色素が、前記一般式（１）で表される構造を有する化合物であり、かつ、遅延発光性又はロング・ストークスシフト発光性のうち少なくともいずれか一つを有することを特徴とする。
　以下、各構成要素について順次説明する。
＜１．１＞　発光性ナノ粒子の形状
　「発光性ナノ粒子」とは、発光性色素を含有する粒子であって、平均粒径が１～１０００ｎｍの範囲であるものをいう。好ましくは３０～５００ｎｍの範囲内であり、さらに好ましくは５０～２００ｎｍの範囲内である。
　製造した発光性ナノ粒子の平均粒径の測定は、当該分野で知られた方法により行うことができる。具体的には、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて電子顕微鏡写真を適切な倍率で撮影し、発光性ナノ粒子の断面積を計測し、その計測値を相当する円の面積としたときの直径（面積円相当径）として測定することができる。
　発光性ナノ粒子の集団の粒子サイズの平均（平均粒径）及び変動係数は、十分な数（例えば１０００個）の発光性ナノ粒子について上記のようにして粒子サイズ（粒径）を測定した後、平均粒径はその算術平均として算出され、変動係数は式：１００×粒径の標準偏差／平均粒径、により算出される。
　本発明において、粒径のばらつきを示す変動係数は特に限定されないが、通常は２０％以下であり、好ましくは５～１５％である。
＜１．２＞　発光性ナノ粒子の発光特性
　本発明の発光性ナノ粒子は、発光性色素を含有する発光性ナノ粒子であって、前記発光性色素が、前記一般式（１）で表される構造を有する化合物であり、かつ、遅延発光性又はロング・ストークスシフト発光性のうち少なくともいずれか一つを有することを特徴とする。
　本発明の発光性ナノ粒子は、基本的には、遅延発光のうち、熱活性型遅延蛍光発光又はエキサイプレックス発光するが、下記のような発光特性を有する。
　ここで、「蛍光」とは、電子が励起一重項状態から基底一重項状態へ遷移（許容遷移）する際に発する光をいう。
　これに対し、「リン光」とは、電子が励起三重項状態から基底一重項状態へ遷移（禁制遷移）する際に発する光をいう。
＜遅延発光＞
　本発明の発光性ナノ粒子は、遅延発光性を有することが、細胞の自家蛍光の悪影響を回避できる点で好ましい。遅延発光性を有することで、細胞の自家蛍光が消失後の時間帯で発光イメージングをすることが可能となる。
　「遅延発光」とは、例えば最低一重項励起状態（Ｓ１）がエネルギー的に低い励起三重項状態（Ｔ１）へと項間交差が起こる場合、Ｓ１－Ｔ１間のエネルギー差が小さいと二つの状態が熱的平衡状態になり、Ｔ１状態からのリン光と同じように寿命の長い蛍光が放出される現象をいう。また、電荷分離状態のような準安定状態に一度エネルギーが保持され、その後電荷再結合により放出されたエネルギーが、寿命の長い光として放出される現象をもいう。
　例えば、通常の蛍光の発光寿命（減衰時間）はナノ秒以下のごく短時間であるが、遅延蛍光は、準安定状態を経るため、発光寿命が分オーダーまで長くなる場合がある。
　遅延発光性を生じさせる発光方式として、リン光、熱活性型遅延蛍光、エキサイプレックス発光等がある。なお、リン光は、禁制遷移による発光なので、許容遷移による発光と比べて起こりにくいため、リン光は遅延発光性を示しやすい。
（熱活性型遅延蛍光）
　「熱活性型遅延蛍光」とは、熱エネルギーによる逆項間交差によって三重項励起子が遷移して生じた一重項励起子が発する光のことである。逆項間交差を伴うため、熱活性型遅延蛍光は遅延発光性を示しやすい。逆項間交差が起こるには最低励起一重項エネルギー準位（Ｓ１）と最低励起三重項エネルギー準位（Ｔ１）の差の絶対値（ΔＥｓｔ）が極めて小さい必要がある。
（エキサイプレックス発光）
　「エキサイプレックス発光」とは、エキサイプレックス（励起錯体）が基底状態に戻る際に発する光のことをいう。
　ここで、「エキサイプレックス」とは、励起電子状態にある化学種Ａ＊が、基底状態にあるｎ個の化学種Ｂと形成するＡＢｎ ＊のことである。エキサイプレックスはΔＥｓｔが極めて小さいことが知られており、逆項間交差を起こしやすいため、遅延発光性を示しやすい。
　熱活性型遅延蛍光は逆項間交差を経ずにＳ１から即時発光する過程を含む一方で、エキサイプレックス発光はエキサイプレックス準位のみからの放射であるため、遅延発光成分の強度はエキサイプレックス発光の方が熱活性型遅延蛍光より多い。さらに本発明の発光性ナノ粒子が含有する発光性色素は分子内でエキサイプレックスを形成できる構造を有しており、一般的な分子間のエキサイプレックスよりも強いエキサイプレックスを形成することを可能にしている。
＜ロング・ストークスシフト発光＞
　本発明の発光性ナノ粒子は、ロング・ストークスシフト発光性を有することが、細胞の自家蛍光の悪影響を回避できる点で好ましい。ロング・ストークスシフト発光性を有することで、細胞の自家蛍光の発光強度が強い波長域と異なる波長域で発光イメージングすることが可能となる。
　「ロング・ストークスシフト発光」とは、フォトルミネッセンスにおいて、発光（極大）波長が光吸収（極大）波長より長波側にシフトするとき、両者の極大波長の差が通常より大きい発光のことをいい、本発明においては、光吸収波長と発光波長の差が１００ｎｍ以上であるものをいう。ロング・ストークスシフト発光性を示しやすい発光方式として、上述した熱活性型遅延蛍光やエキサイプレックス発光等が知られている。
　光吸収波長と発光波長の差が１５０ｎｍ以上であることがより好ましく、２００ｎｍ以上であることがさらに好ましい。
＜１．３＞　発光性色素の構造
　本発明で用いる発光性色素は、下記一般式（１）で表される構造を有する化合物であり、また、下記一般式（２）～（６）で表される構造を有する化合物であることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 〔式中、Ａは、電子求引性基を表す。Ｄは、電子供与性基を表す。Ｌは、２～４個の原子からなる骨格を有する連結基を表す。前記２～４個の原子は、炭素原子、酸素原子、窒素原子、ケイ素原子、硫黄原子、ホウ素原子又はリン原子である。前記連結基は、水素原子又は置換基を有していてもよい。〕
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 〔式中、Ａは、電子求引性基を表す。Ｄは、電子供与性基を表す。Ｘは、環状飽和炭化水素基、環状不飽和炭化水素基、アリール基又はヘテロアリール基を表す。Ｙ及びＺは、炭素原子、酸素原子、窒素原子、ケイ素原子、硫黄原子、ホウ素原子又はリン原子を表し、水素原子又は置換基を有していてもよい。一般式（４）及び（５）におけるＹは２個の原子からなる骨格を有する連結基であってもよい。〕
（電子求引性基：Ａ）
　一般式（１）～（６）において、Ａで表される電子求引性基は、「置換されていてもよいカルボニル基」、「置換されていてもよいスルホニル基」、「置換されていてもよいボリル基」、「置換されていてもよいホスフィンオキシド基」、「電子求引性基で置換されていてもよいアリール基」、「シアノ基、フッ素原子、フッ素原子で置換されたアルキル基若しくは含窒素芳香族六員環含有複素環基で置換された電子供与性の複素環基」、又は「置換されていてもよい電子求引性の複素環基」であることが好ましい。
　Ａで表される「フッ素原子で置換されたアルキル基」のアルキル基としては、後述と同様のものが挙げられ、同様のものが好ましい。
　Ａで表される「置換されていてもよいアリール基」のアリール基としては、後述と同様のものが挙げられ、同様のものが好ましい。
　Ａで表される「置換されていてもよい電子求引性の複素環基」の電子求引性の複素環基としては、炭素数が３～２４の電子求引性の複素環から誘導される基が好ましい。そのような複素環の例には、ジベンゾチオフェンオキシド環、ジベンゾチオフェンジオキシド環、ピリジン環、ピリダジン環、ピリミジン環、ピラジン環、トリアジン環、キノリン環、イソキノリン環、キナゾリン環、シンノリン環、キノキサリン環、フタラジン環、プテリジン環、フェナントリジン環、フェナントロリン環、アザカルバゾール環、ジアザカルバゾール環、ジベンゾフラン環、ジベンゾシロール環、アザジベンゾフラン環、ジアザジベンゾフラン環、ジベンゾボロール環、ジベンゾホスホールオキシド環、キノン環、テトラシアノキノジメタン環、準平面又は平面に固定されたトリアリールボラン環、準平面又は平面に固定されたトリアリールホスフィン環等が挙げられる。より好ましくは、ピリジン環、ピリミジン環、ピラジン環、トリアジン環、キノリン環、イソキノリン環、キナゾリン環、キノキサリン環、フェナントリジン環、フェナントロリン環、ジベンゾフラン環、アザジベンゾフラン環、ジアザジベンゾフラン環、クマリン環、ｐ－ベンゾキノン環、テトラシアノキノジメタン環、１原子架橋又は単結合により準平面又は平面に固定されたトリアリールボラン環、１原子架橋又は単結合により準平面又は平面に固定されたトリアリールホスフィン環が挙げられ、さらに好ましくは含窒素芳香族複素環であり、特に好ましくは含窒素芳香族６員環、ジベンゾフラン環、アザジベンゾフラン環、クマリン環、ジアザジベンゾフラン環、酸素又は窒素又は硫黄又は炭素原子で架橋された準平面又は平面に固定されたトリアリールボラン環、酸素又は窒素又は硫黄又は炭素原子で架橋された準平面又は平面に固定されたトリアリールホスフィン環である。なお、電子求引性の複素環は、同一の又は異なる２以上の上記複素環を連結したものであってもよい。
　Ａで表される「置換されていてもよい電子求引性の複素環基」の置換基としては、重水素原子、フッ素原子、シアノ基、フッ素原子で置換されていてもよいアルキル基、フッ素原子で置換されていてもよいアルキル基で置換されていてもよいアリール基、フッ素原子で置換されていてもよいアリール基、シアノ基で置換されていてもよいアリール基が挙げられる。アルキル基、アリール基の具体例としては、上記と同様のものが挙げられ、同様のものが好ましい。また、電子求引性の複素環基の電子求引性を損なわない範囲であれば電子供与性の置換基であってもよく、その例にはカルバゾール基等も含まれる。
　Ａで表される「電子求引性基で置換されていてもよいアリール基」の電子求引性基としては、フッ素原子、シアノ基、フッ素原子で置換されたアルキル基、置換されていてもよいカルボニル基、置換されていてもよいスルホニル基、置換されていてもよいホスフィンオキサイド基、置換されていてもよいボリル基、置換されていてもよい電子求引性の複素環基が挙げられ、フッ素原子、シアノ基、フッ素原子で置換されたアルキル基、又は置換されていてもよい電子求引性の複素環基が好ましい。
　Ａで表される「シアノ基、フッ素原子、フッ素原子で置換されたアルキル基若しくは含窒素芳香族六員環含有複素環基で置換された電子供与性の複素環基」の「電子供与性の複素環基」としては、後述と同様のものが挙げられ、同様のものが好ましい。
　Ａで表される「シアノ基、フッ素原子、フッ素原子で置換されたアルキル基若しくは含窒素芳香族六員環含有複素環基で置換された電子供与性の複素環基」の「含窒素芳香族六員環含有複素環」とは、含窒素芳香族六員環を含む複素環に由来する基である。含窒素芳香族六員環を含む複素環の例には、ピリジン環、ピリダジン環、ピリミジン環、ピラジン環、トリアジン環、キノリン環、イソキノリン環、キナゾリン環、シンノリン環、キノキサリン環、フタラジン環、プテリジン環、フェナントリジン環、フェナントロリン環、アザカルバゾール環、ジアザカルバゾール環、アザジベンゾフラン環、ジアザジベンゾフラン環等が挙げられる。好ましくは、ピリジン環、ピリミジン環、トリアジン環、アザカルバゾール環、ジアザカルバゾール環、アザジベンゾフラン環、ジアザジベンゾフラン環が挙げられ、より好ましくは、ピリジン環、ピリミジン環、トリアジン環、アザカルバゾール環、アザジベンゾフラン環が挙げられる。
　Ａで表される「置換されていてもよいカルボニル基」、「置換されていてもよいスルホニル基」、「置換されていてもよいボリル基」、「置換されていてもよいホスフィンオキシド基」の置換基としては、フッ素原子、シアノ基、フッ素原子で置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよい電子求引性の複素環基が挙げられる。具体例としては、上記と同様のものが挙げられ、同様のものが好ましい。
　これらの中でも、電子求引性基Ａは、他の電子求引性基Ａ又は電子供与性基Ｄと相互作用しやすい点から、「電子求引性基で置換されていてもよいアリール基」、「シアノ基、フッ素原子、フッ素原子で置換されたアルキル基若しくは含窒素芳香族六員環含有複素環基で置換された電子供与性の複素環基」又は「置換されていてもよい電子求引性の複素環基」であることが好ましい。これらの基は、平面性が高いことから、他の電子求引性基Ａ又は電子供与性基Ｄと空間的に重なり合いやすく、相互作用しやすいからである。
　「電子求引性基で置換されていてもよいアリール基」、「シアノ基、フッ素原子、フッ素原子で置換されたアルキル基若しくは含窒素芳香族六員環含有複素環基で置換された電子供与性の複素環基」又は「置換されていてもよい電子求引性の複素環基」は、高い電子求引性を有する点から、好ましくはシアノ基で置換されたアリール基、シアノ基で置換されていてもよい電子求引性の複素環基、無置換の含窒素芳香族６員環基、フッ素原子で置換された含窒素芳香族６員環基、シアノ基で置換された含窒素芳香族６員環基、シアノ基で置換された電子供与性の複素環基、アザカルバゾールで置換された電子供与性の複素環基、アザジベンゾフランで置換された電子供与性の複素環基、フッ素置換アルキル基で置換された含窒素芳香族６員環基、又は置換されていてもよいアリール基で置換されている含窒素芳香族６員環基である。より好ましくはシアノ基で置換されたフェニル基、シアノ基で置換されたカルバゾリル基、アザカルバゾールで置換されたカルバゾリル基、アザジベンゾフランで置換されたカルバゾリル基、シアノ基で置換されたジベンゾフリル基、アザジベンゾフリル基、ジアザジベンゾフリル基、シアノ基で置換されたピリジル基、置換されてもよいピラジル基、置換されていてもよいピリミジル基、置換されていてもよいトリアジル基が挙げられ、さらに好ましくはシアノフェニル基、ｍ－ジシアノフェニル基、３－シアノカルバゾリル基、３－（９－アザカルバゾリル）カルバゾリル基、３－アザジベンゾフリルカルバゾリル基、９－アザジベンゾフリルカルバゾリル基、６－シアノカルバゾリル基、２－シアノ基ジベンゾフリル基、アザジベンゾフリル基、ジアザジベンゾフリル基、２－シアノピリジル基、３－シアノピリジル基、２，６－ジシアノピリジル基、２－シアノピラジル基、２－シアノピリミジル基、５－シアノピリミジル基、置換されていてもよい２，４－ジフェニルピリミジル基、置換されていてもよいジフェニルトリアジル基、置換されていてもよいトリフェニルトリアジル基、ｐ－キノン基、テトラシアノキノジメタン基、フッ素で置換されたテトラシアノキノジメタン基、１原子架橋又は単結合により準平面又は平面に固定されたトリアリールボラン基、１原子架橋又は単結合により準平面又は平面に固定されたトリアリールホスフィン基である。
（電子供与性基：Ｄ）
　一般式（１）～（６）において、Ｄで表される電子供与性基は、「電子供与性基で置換されたアリール基」、「シアノ基、フッ素原子、フッ素原子で置換されたアルキル基及び含窒素芳香族六員環含有複素環基以外の置換基で置換されていてもよい電子供与性の複素環基」、又は「置換されていてもよいアミノ基」であることが好ましい。
　Ｄで表される「電子供与性基で置換されたアリール基」のアリール基としては、炭素数が６～２４の芳香族炭化水素環から誘導される基が好ましい。そのような芳香族炭化水素環の例には、ベンゼン環、インデン環、ナフタレン環、アズレン環、フルオレン環、フェナントレン環、アントラセン環、アセナフチレン環、ビフェニレン環、ナフタセン環、ピレン環、ペンタレン環、アセアントリレン環、ヘプタレン環、トリフェニレン環、ａｓ－インダセン環、クリセン環、ｓ－インダセン環、プレイアデン環、フェナレン環、フルオランテン環、ペリレン環、アセフェナントリレン環、ビフェニル環、ターフェニル環、テトラフェニル環等から誘導される基が挙げられる。より好ましくは、ベンゼン環、ナフタレン環、フルオレン環、フェナントレン環、アントラセン環、ビフェニレン環、クリセン環、ピレン環、トリフェニレン環、クリセン環、フルオランテン環、ペリレン環、ビフェニル環、及びターフェニル環が挙げられる。
　Ｄで表される「シアノ基、フッ素原子、フッ素原子で置換されたアルキル基及び含窒素芳香族六員環含有複素環基以外の置換基で置換されていてもよい電子供与性の複素環基」の「電子供与性の複素環基」としては、炭素数が４～２４の電子供与性の複素環から誘導される基が好ましい。そのような複素環の例には、ピロール環、インドール環、カルバゾール環、インドロインドール環、９，１０－ジヒドロアクリジン環、１０，１１－ジヒドロジベンゾアゼピン、５，１０－ジヒドロジベンゾアザシリン、５，１０－ジヒドロジフェナジン、フェノキサジン環、フェノチアジン環、ジベンゾチオフェン環、ベンゾフリルインドール環、ベンゾチエノインドール環、インドロカルバゾール環、ベンゾフリルカルバゾール環、ベンゾチエノカルバゾール環、ベンゾチエノベンゾチオフェン環、ベンゾカルバゾール環、ジベンゾカルバゾール環、テトラチアフルバレン環、チアントレン、準平面又は平面に固定されたトリアリールアミン環等が挙げられる。より好ましくは、カルバゾール環、インドロインドール環、９，１０－ジヒドロアクリジン環、フェノキサジン環、フェノチアジン環、ジベンゾチオフェン環、ベンゾフリルインドール環、ベンゾカルバゾール環、ジベンゾフラン環、酸素又は窒素又は硫黄又は炭素原子等の１原子架橋又は単結合により準平面又は平面に固定されたトリアリールアミン環が挙げられる。なお、電子供与性の複素環は、同一の又は異なる２以上の上記複素環を連結したものであってもよい。また、ジベンゾフラン環は、電子供与性の置換基（例えばカルバゾール基）で置換された場合は、全体として電子供与性基Ｄとして機能しうるが、無置換又は電子求引性の置換基で置換された場合は電子求引性基Ａとして機能しうる。
　Ｄで表される「電子供与性基で置換されたアリール基」の「電子供与性基」としては、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアルコキシ基、置換されていてもよいアミノ基、置換されていてもよい電子供与性の複素環基等が挙げられる。好ましくは、置換されていてもよいアミノ基、置換されていてもよい電子供与性基の複素環基が挙げられる。
　Ｄで表される「電子供与性基で置換されたアリール基」の「電子供与性基」としてのアルキル基としては、直鎖、分岐、又は環状のいずれでもよく、例えば、炭素数１～２０の直鎖、分岐、又は環状のアルキル基が挙げられ、具体的には、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、ｓ－ブチル基、ｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、ネオペンチル基、ｎ－ヘキシル基、シクロヘキシル基、２－エチルヘキシル基、ｎ－ヘプチル基、ｎ－オクチル基、２－ヘキシルオクチル基、ｎ－ノニル基、ｎ－デシル基、ｎ－ウンデシル基、ｎ－ドデシル基、ｎ－トリデシル基、ｎ－テトラデシル基、ｎ－ペンタデシル基、ｎ－ヘキサデシル基、ｎ－ヘプタデシル基、ｎ－オクタデシル基、ｎ－ノナデシル基、ｎ－イコシル基、アダマンチル基が挙げられる。好ましくは、メチル基、エチル基、イソプロピル基、ｔ－ブチル基、シクロヘキシル基、２－エチルヘキシル基、２－ヘキシルオクチル基、アダマンチル基が挙げられる。
　Ｄで表される「電子供与性基で置換されたアリール基」の「電子供与性基」のアルコシキ基としては、直鎖、分岐、又は環状のいずれでもよく、例えば、炭素数１～２０の直鎖、分岐、又は環状のアルキル基が挙げられ、具体的には、メトキシ基、エトキシ基、ｎ－プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ－ブトキシ基、イソブトキシ基、ｔ－ブトキシ基、ｎ－ペンチルオキシ基、ネオペンチルオキシ基、ｎ－ヘキシルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基、ｎ－ヘプチルオキシ基、ｎ－オクチルオキシ基、２－エチルヘキシルオキシ基、ノニルオキシ基、デシルオキシ基、３，７－ジメチルオクチルオキシ基、ｎ－ウンデシルオキシ基、ｎ－ドデシルオキシ基、ｎ－トリデシルオキシ基、ｎ－テトラデシルオキシ基、２－ｎ－ヘキシル－ｎ－オクチルオキシ基、ｎ－ペンタデシルオキシ基、ｎ－ヘキサデシルオキシ基、ｎ－ヘプタデシルオキシ基、ｎ－オクタデシルオキシ基、ｎ－ノナデシルオキシ基、ｎ－イコシルオキシ基が挙げられ、メトキシ基、エトキシ基、イソプロポキシ基、ｔ－ブトキシ基、シクロヘキシルオキシ基、２－エチルヘキシルオキシ基、２－ヘキシルオクチルオキシ基が好ましい。
　Ｄで表される「電子供与性基で置換されたアリール基」の「電子供与性基」の「置換されていてもよいアミノ基」の置換基としては、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアルキル基で置換されていてもよいアリール環、置換されていてもよいアルコキシ基で置換されていてもよいアリール環、置換されていてもよいアミノ基で置換されていてもよいアリール環が挙げられ、アルキル基、アルコキシ基、アミノ基及びアリール基については、上述と同様のものが挙げられ、同様のものが好ましい。
　Ｄで表される「シアノ基、フッ素原子、フッ素原子で置換されたアルキル基及び含窒素芳香族六員環含有複素環基以外の置換基で置換されていてもよい電子供与性の複素環基」の「シアノ基、フッ素原子、フッ素原子で置換されたアルキル基及び含窒素芳香族六員環含有複素環基以外の置換基」とは、シアノ基、フッ素原子、フッ素原子で置換されたアルキル基及び前述した含窒素芳香族六員環含有複素環基以外の置換基であり、電子供与性基又はアリール基であることが好ましい。電子供与性基又はアリール基の例には、アルキル基、アルコキシ基、アルキル基で置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアルコキシ基で置換されていてもよいアリール環、置換されていてもよいアミノ基で置換されていてもよいアリール環、置換されていてもよいアミノ基等が挙げられ、具体的には上述と同様のものが挙げられ、同様のものが好ましい。また、電子供与性の複素環基の電子供与性を損なわない範囲であれば電子求引性の置換基であってもよく、その例にはジベンゾフリル基等も含まれる。
　Ｄで表される「電子供与性基で置換されたアリール基」の「電子供与性基」の「置換されていてもよい電子供与性の複素環基」としては、上述と同様のものが挙げられ、同様のものが好ましい。
　Ｄで表される「置換されていてもよいアミノ基」の置換基としては、上述の「置換されていてもよいアミノ基」の置換基と同様のものが挙げられ、同様のものが好ましい。
　これらの中でも、電子供与性基Ｄは、他の電子供与性基Ｄ又は電子求引性基Ａと相互作用しやすい点から、「電子供与性基で置換されたアリール基」又は「置換されていてもよい電子供与性の複素環基」であることが好ましい。これらの基は、平面性が高いことから、他の電子供与性基Ｄ又は電子求引性基Ａと空間的に重なり合いやすく、相互作用しやすいからである。「電子供与性基で置換されたアリール基」又は「置換されていてもよい電子供与性の複素環基」は、好ましくは電子供与性基で置換されたフェニル基、置換されていてもよいカルバゾリル基、置換されていてもよいアザカルバゾリル基、置換されていてもよいジアザカルバゾリル基、置換されていてもよい９，１０－ジヒドロアクリジル基、置換されていてもよいフェノキサジル基、置換されていてもよいフェノチアジル基、置換されていてもよい５，１０－ジヒドロフェナジル基、テトラチアフルバレン環、又は酸素又は窒素又は硫黄又は炭素原子で架橋された準平面又は平面に固定されたトリアリールアミン環である。
（連結基：Ｌ又はＸ－Ｙ）
　一般式（１）において、Ｌは、２～４個の原子からなる骨格を有する連結基を表す。２～４個の原子は、炭素原子、酸素原子、窒素原子、ケイ素原子、硫黄原子、ホウ素原子又はリン原子である。前記連結基は水素原子又は置換基を有していてもよい。
　また、一般式（２）～（６）において、Ｘは、環状飽和炭化水素基、環状不飽和炭化水素基、アリール基又はヘテロアリール基を表す。Ｙ及びＺは、炭素原子、酸素原子、窒素原子、ケイ素原子、硫黄原子、ホウ素原子又はリン原子を表し、水素原子又は置換基を有していてもよい。
　実施形態としては、本発明の効果発現の観点から、前記一般式（２）～（６）の式中において、Ｘがアリール基又はヘテロアリール基を表すことが好ましい。さらに、前記一般式（４）～（６）の式中において、Ｘがアリール基又はヘテロアリール基を表し、Ｙが炭素原子、酸素原子、又はケイ素原子を表すことが好ましい。
（親水性基）
　本発明の発光性ナノ粒子が含有する発光性色素は、親水性基を有することがバインダー粒子に色素が分散した状態で取り込まれやすくなり、粒子中での発光性を高める点で好ましい。「親水性基」とは、水との相互作用の強い原子団のことで、具体的には、－ＯＨ、－ＳＨ、－ＣＯＯＨ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｈ、－Ｓ（＝Ｏ）2ＯＨ、－Ｓ（＝Ｏ）ＮＨ2、－Ｓ（＝Ｏ）2ＮＨ2、－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）3、－Ｐ（＝Ｏ）Ｒ（ＯＨ）2、－Ｐ（＝Ｏ）Ｒ2（ＯＨ）、－Ｐ（ＯＨ）3、－Ｐ（＝Ｏ）（ＮＨ2）3、－Ｐ（＝Ｏ）Ｒ（ＮＨ2）2、－Ｐ（＝Ｏ）Ｒ2（ＮＨ2）、－Ｐ（ＮＨ2）3、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ、－ＮＨ2、－ＮＨＲ、－ＮＨＣＯＮＨ2、－ＮＨＣＯＮＨＲ、－ＮＨＣＯＯＨ、－Ｓｉ（ＯＨ）3、－Ｓｉ（Ｒ）（ＯＨ）2、－Ｓｉ（Ｒ）2ＯＨ、－Ｇｅ（ＯＨ）3、－Ｇｅ（Ｒ）（ＯＨ）2、－Ｇｅ（Ｒ）2ＯＨ、－Ｔｉ（ＯＨ）3、－Ｔｉ（Ｒ）（ＯＨ）2、－Ｔｉ（Ｒ）2ＯＨ、－Ｓｉ（ＮＨ2）3、－Ｓｉ（Ｒ）（ＮＨ2）2、－Ｂ（ＯＨ）2、－Ｏ－Ｂ（ＯＨ）2、－Ｂ（ＮＨ2）2、－ＮＨＢ（ＯＨ）2、ポリエチレングリコール基等である。なお、前記Ｒはそれぞれ独立に水素又は炭素数１～２０のアルキル基を示す。他にも、ＮＨＳ基、マレイミド基等も親水性を示す親水基として挙げられる。
（発光性色素の具体例）
　以下に、本発明に係る一般式（１）で表される構造を有する化合物の好ましい具体例を挙げるが、これらの化合物はさらに置換基を有していたり、構造異性体等が存在していたりする場合もあり、以下に例示する化合物にのみ限定されない。
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＜１．４＞　発光性色素の製造方法
　一般式（１）で表される構造を有する化合物は、例えば、国際公開第２０１４／０２２００８号に記載の方法、又は、これらの文献に記載の参照文献に記載の方法を参照することにより合成することができる。
（合成例）
　以下に、一般式（１）で表される構造を有する化合物の合成フローを示す。
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＜１．５＞　バインダー
　本発明の発光性ナノ粒子は、固着材的又は結着材的作用を有するバインダーを含有することが、バインダーを介して、粒子表面に特別な機能を持たせることができる点で好ましい。
　バインダーを含有する場合、発光性ナノ粒子に含有する発光性色素がバインダー１ｇに対して２０～５００μｍｏｌの範囲内であることが、バインダーの効果の点で好ましい。
　バインダーとしては、主鎖に炭素原子を含む分子量が３００以上の有機樹脂又は金属アルコキシドであることが好ましい。有機樹脂の具体例としては、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン、ポリシクロヘキシレンジメチレンテレフタレート（ＰＣＴ）等のポリオレフィン樹脂、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリフェニレンサルファイド、ポリカーボネート、ＡＢＳ樹脂、ＡＳ樹脂、アクリル系樹脂、アミノ系樹脂、ポリエステル系樹脂、エポキシ系樹脂、アクリル系樹脂とアミノ系樹脂の混合樹脂及びポリエステル系樹脂とアミノ系樹脂、セルロース樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリ塩化ビニル樹脂、ポリメタクリル酸メチル樹脂、ポリアクリロニトリル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、ポリアルコール樹脂、ポリ酢酸アリル樹脂、ポリオキシメチレン樹脂、ポリ－ｎ－ブチルイソシアネート樹脂、ポリエチレンオキシド樹脂、６－ナイロン樹脂、ポリ－β－オキシプロピオン酸エステル樹脂、フェノール樹脂、尿素樹脂、メラミン樹脂、アルキッドメラミン樹脂、不飽和ポリエステル樹脂、ポリビニルアルコール樹脂、ポリ（Ｎ－ビニルホルムアミド）樹脂、ポリ（Ｎ－ビニルイソブチルアミド）樹脂、ポリアクリル酸樹脂、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）樹脂、ポリ（Ｎ－ビニルピロリジノン）樹脂、ポリヒドロキシエチルメタクリレート樹脂、ポリオキシエチレンメタクリレート樹脂、ポリエチレングリコールジメチルエーテル樹脂、ポリスチレンスルホン酸樹脂等が挙げられる。金属アルコキシドの金属の具体例としては、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、スカンジウム、イットリウム、ルテニウム、ローレンシウム、ランタン、チタン、ジルコニウム、ハフニウム、セリウム、バナジウム、ニオブ、タンタル、クロム、モリブデン、タングステン、マンガン、ルテニウム、コバルト、ロジウム、イリジウム、ニッケル、白金、パラジウム、銅、銀、金、亜鉛、アルミニウム、ガリウム、インジウム、ケイ素、ゲルマニウム及びスズが挙げられる。
（親水性基を有するバインダー）
　本発明の発光性ナノ粒子の表面に存在するバインダーが、親水性基を有することは、粒子同士の凝集を抑制して粒子を水中で分散できる点で好ましい。親水性基とは、水との相互作用の強い原子団のことで、具体的には、－ＯＨ、－ＳＨ、－ＣＯＯＨ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｈ、－Ｓ（＝Ｏ）2ＯＨ、－Ｓ（＝Ｏ）ＮＨ2、－Ｓ（＝Ｏ）2ＮＨ2、－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）3、－Ｐ（＝Ｏ）Ｒ（ＯＨ）2、－Ｐ（＝Ｏ）Ｒ2（ＯＨ）、－Ｐ（ＯＨ）3、－Ｐ（＝Ｏ）（ＮＨ2）3、－Ｐ（＝Ｏ）Ｒ（ＮＨ2）2、－Ｐ（＝Ｏ）Ｒ2（ＮＨ2）、－Ｐ（ＮＨ2）3、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ、－ＮＨ2、－ＮＨＲ、－ＮＨＣＯＮＨ2、－ＮＨＣＯＮＨＲ、－ＮＨＣＯＯＨ、－Ｓｉ（ＯＨ）3、－Ｓｉ（Ｒ）（ＯＨ）2、－Ｓｉ（Ｒ）2ＯＨ、－Ｇｅ（ＯＨ）3、－Ｇｅ（Ｒ）（ＯＨ）2、－Ｇｅ（Ｒ）2ＯＨ、－Ｔｉ（ＯＨ）3、－Ｔｉ（Ｒ）（ＯＨ）2、－Ｔｉ（Ｒ）2ＯＨ、－Ｓｉ（ＮＨ2）3、－Ｓｉ（Ｒ）（ＮＨ2）2、－Ｂ（ＯＨ）2、－Ｏ－Ｂ（ＯＨ）2、－Ｂ（ＮＨ2）2、－ＮＨＢ（ＯＨ）2、ポリエチレングリコール基等である。なお、前記Ｒはそれぞれ独立に水素又は炭素数１～２０のアルキル基を示す。他にも、ＮＨＳ基、マレイミド基等も親水性基として挙げられる。
　また、親水性基を有するバインダーとしては、具体的には、尿素樹脂、メラミン樹脂、ポリビニルアルコール樹脂、ポリ（Ｎ－ビニルホルムアミド）樹脂、ポリ（Ｎ－ビニルイソブチルアミド）樹脂、ポリアクリル酸樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）樹脂、ポリ（Ｎ－ビニルピロリジノン）樹脂、ポリヒドロキシエチルメタクリレート樹脂、ポリオキシエチレンメタクリレート樹脂、ポリエチレングリコールジメチルエーテル樹脂、ポリスチレンスルホン酸樹脂、チタンアルコキシド、ジルコニウムアルコキシド、ケイ素アルコキシド等が挙げられる。
（発光性色素との共有結合）
　本発明の発光性ナノ粒子は、含有するバインダーと発光性色素が共有結合を形成していることが、粒子から発光性色素が漏れることを防ぐ点で好ましい。本発明の発光性ナノ粒子が含有するバインダーと発光性色素が共有結合を形成するには、発光性色素が、例えば、メラミン基、メチロールメラミン基、トリアルコキシシリル基等の、上述のバインダーとなる有機樹脂又は金属アルコキシドと反応する重合基を有していることが好ましい
（熱硬化性樹脂）
　本発明に係るバインダーは、熱硬化性樹脂であってもよい。例えば、キシレンのような有機溶媒を用いる透徹工程において発光性色素が溶出しにくいという観点からは、緻密な架橋構造の内部に発光性色素を固定化することができる、メラミン樹脂等の熱硬化性樹脂が好ましい。
　熱硬化性樹脂としては、例えば、メラミン、尿素、グアナミン類（ベンゾグアナミン、アセトグアナミン等を含む）及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも一種のモノマーから形成される構成単位を含むものが挙げられる。これらのモノマーは、いずれか一種を単独で用いてもよいし、二種以上を組み合わせて用いてもよい。所望によりさらに、一種又は二種以上の上記化合物以外のコモノマーを併用してもよい。
　熱硬化性樹脂の具体例としては、メラミン・ホルムアルデヒド樹脂、尿素・ホルムアルデヒド樹脂が挙げられる。
　これらの熱硬化性樹脂の原料としては、上述したようなモノマーそのもののみならず、モノマーとホルムアルデヒドやその他の架橋剤等の化合物とをあらかじめ反応させて得られるプレポリマーを用いてもよい。例えば、メラミン・ホルムアルデヒド樹脂の製造においては一般的に、メラミンとホルムアルデヒドとをアルカリ条件下で縮合して調製されるメチロールメラミンがプレポリマーとして用いられており、当該化合物はさらにアルキルエーテル化（水中での安定性を向上させるためのメチル化、有機溶媒中での溶解性を向上させるためのブチル化等）されたものであってもよい。
　また、上記の熱硬化性樹脂は、その構成単位に含まれる水素の少なくとも一部が、電荷を持つ置換基、又は共有結合を形成しうる置換基に置き換えられたものでもよい。このような熱硬化性樹脂は、公知の手法により少なくとも一つの水素が上記の置換基に置き換えられた（誘導体化された）モノマーを原料として用いることにより合成することができる。
　このような熱硬化性樹脂は、公知の手法に従って合成することができる。例えば、メラミン・ホルムアルデヒド樹脂は、前述したようにしてあらかじめ調製されたメチロールメラミンを、必要に応じて酸等の反応促進剤を添加した上で加熱して重縮合させることにより合成することができる。
（熱可塑性樹脂）
　本発明に係るバインダーは、熱可塑性樹脂であってもよい。
　熱可塑性樹脂としては、例えば、（メタ）アクリル酸及びそのアルキルエステル、アクリロニトリル、並びにこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも一種の単官能モノマー（一分子中に重合反応に関与する基、上記の例ではビニル基を一個持つモノマー）から形成される構成単位を含むものが挙げられる。これらのモノマーは、いずれか一種を単独で用いてもよいし、二種以上を組み合わせて用いてもよい。
　所望によりさらに、一種又は二種以上の上記化合物以外のコモノマーを併用してもよい。上記の熱可塑性樹脂は、例えばジビニルベンゼンのような多官能モノマー（１分子中に重合反応に関与する基、上記の例ではビニル基を２個以上持つモノマー）から形成される構成単位、つまり架橋部位を含んでいてもよい。例えば、ポリメタクリル酸メチルの架橋物が挙げられる。
　さらに、上記の熱可塑性樹脂は、本発明における発光性ナノ粒子を表面修飾するための官能基を有する構成単位を含んでいてもよい。例えば、エポキシ基を有するメタクリル酸グリシジルのようなモノマーを原料とすることにより、エポキシ基が表面に配向した発光性ナノ粒子を調製することができる。このエポキシ基は、過剰のアンモニア水と反応させることによりアミノ基に変換することができる。このようにして形成されるアミノ基には、公知の手法に従って（必要に応じてリンカーとなる分子を介して）、各種の生体分子を導入することができる。
＜１．６＞　発光性ナノ粒子の製造方法
　本発明の発光性ナノ粒子は、発光性色素として特定の条件を満たすものを用いた上で、各種のバインダーについて公知の重合工程に準じて製造することができる。
（重合工程）
　重合工程は、発光性色素、樹脂原料（モノマー、オリゴマー又はプレポリマー）、好ましくはさらに界面活性剤及び重合反応促進剤を含有する反応混合物を加熱して樹脂の重合反応を進行させ、発光性色素を含有する樹脂粒子を生成させる工程である。
　反応混合物に含まれる各成分の添加順序は特に限定されるものではない。典型的には、発光性色素の水溶液に界面活性剤を添加し、続いて樹脂原料を添加し、最後に重合反応促進剤を添加するという順序が用いられる。あるいは、界面活性剤の水溶液に樹脂原料を添加し、続いて重合反応促進剤を添加して樹脂粒子の合成反応を進行させながら、発光性色素の水溶液を添加するという順序であってもよい。なお、このような重合工程に用いられる、本発明による特定の発光性色素の水溶液の濃度は、従来の発光性色素の水溶液の濃度よりも比較的高めの範囲（例えば２，５００～１０，０００μＭ）で調節することができる。
　重合反応の条件（温度、時間等）は、樹脂の種類、原料混合物の組成等を考慮しながら適切に設定することができる。
　重合方法としては、公知の重合方法であれば特に限定されるものではない。公知の重合方法としては、例えば塊状重合、乳化重合、ソープフリー乳化重合、シード重合、懸濁重合等の方法が挙げられる。塊状重合の場合は、粉砕後、分級することで所望の粒径の樹脂粒子を得ることができる。乳化重合とは、水等の媒体と、媒体に溶解し難いモノマーと乳化剤（界面活性剤）を混合し、そこに媒体に溶解可能な重合開始剤を加えて行う重合方法である。得られる粒子径のバラツキが少ないという特徴がある。
　ソープフリー乳化重合とは、乳化剤を用いない乳化重合である。均一径の粒子が得られるという特徴がある。シード重合とは、重合開始の際に別途で作られた種（シード）粒子を入れて行われる重合である。種粒子として粒子径と粒子径分布、量（個数）を任意に定めて重合することになり、所望の粒子径と粒子径分布を狙って重合できるという特徴がある。懸濁重合とは、モノマーと溶媒の水とを機械的に攪拌して、懸濁させて行う重合方法である。粒子径が小さくかつ整った粒子を得られることが特徴である。
　具体例としてメラミン樹脂等の熱硬化性樹脂の合成を挙げると、反応温度は通常７０～２００℃、反応時間は通常２０～１２０分間である。なお、反応温度は発光性色素の性能が低下しない温度（耐熱温度範囲内）とすることが適切である。加熱は複数の段階に分けて行ってもよく、例えば、相対的に低温で一定時間反応させた後、昇温して相対的に降温で一定時間反応させるようにしてもよい。
　重合反応の終了後は、反応液から余剰の樹脂原料、発光性色素、界面活性剤等の不純物を除去し、生成した発光性ナノ粒子を回収して精製すればよい。例えば、反応液を遠心分離にかけ、不純物が含まれている上澄みを除去した後、超純水を加えて超音波照射して再度分散させて洗浄する。これらの操作は、上澄みに樹脂や発光性色素に由来する吸光、発光が見られなくなるまで複数回繰り返し行うことが好ましい。
　熱硬化性樹脂を用いた発光性ナノ粒子は、基本的に乳化重合法に従って製造することができるが、界面活性剤及び重合反応促進剤を用いる上記のような重合工程により製造することが好ましい。なお、このような製造方法により得られる発光性ナノ粒子において、発光性色素の大部分が、望ましくは実質的に全てが樹脂粒子に含有された状態で固定化されるが、一部の発光性色素が樹脂粒子の表面に結合又は付着した状態で固定化されることが排除されるものではない。
　また、発光性色素が含有された状態において、どのような化学的又は物理的な作用で発光性色素が樹脂粒子に固定化されているかは限定されるものではない。本発明では、重合工程に先立って、樹脂原料と発光性色素とをあらかじめ共有結合させたり、樹脂原料に積極的に荷電した置換基を導入したりするための誘導体化工程を設ける必要はない（そのような工程を用いなくても、発光強度や耐光性に優れた発光性ナノ粒子が得られる）が、所望によりそのような工程を併用することも排除されるものではない。
（界面活性剤）
　界面活性剤としては、公知の乳化重合用乳化剤を用いることができる。界面活性剤には、アニオン系（陰イオン系）、ノニオン系（非イオン系）、カチオン系（陽イオン系）のものがある。正に荷電した置換基又は部位を有する（カチオン系の）熱硬化性樹脂を合成する場合は、アニオン系又はノニオン系の界面活性剤を用いることが好ましい。逆に負に荷電した置換基又は部位を有する（アニオン系の）熱硬化性樹脂を合成する場合は、カチオン系又はノニオン系の界面活性剤を用いることが好ましい。
　アニオン系の界面活性剤としては、例えば、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（製品名「ネオペレックス」シリーズ、花王株式会社）が挙げられる。ノニオン系の界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系（製品名「エマルゲン」シリーズ、花王株式会社）の化合物、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）が挙げられる。カチオン系の界面活性剤としては、例えば、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミドが挙げられる。
　界面活性剤の添加量を調節することにより、樹脂粒子の粒子径を調節することができるとともに、その粒子径の変動係数が小さい、つまり粒子サイズの揃った発光性ナノ粒子を製造することができる。界面活性剤の添加量は、例えば、樹脂原料に対して１０～６０質量％の割合、あるいは原料混合物全体に対して０．１～３．０質量％である。界面活性剤の添加量を増やすと粒径が小さくなる傾向にあり、逆に界面活性剤の添加量を減らすと粒径が大きくなる傾向にある。
（重合反応促進剤）
　重合反応促進剤は、メラミン樹脂等の熱硬化性樹脂の重縮合反応を促進するとともに、当該樹脂又は発光性色素に含まれるアミノ基のような官能基にプロトン（Ｈ＋）を付与して荷電させ、静電的相互作用を起こしやすくする機能を有する。熱硬化性樹脂の反応は加温のみでも進行するが、重合反応促進剤を加えるとより低温で進行するので、反応や性能を制御できる範囲で添加することができる。このような重合反応促進剤としては、例えば、ギ酸、酢酸、硫酸、パラトルエンスルホン酸、ドデシルベンゼンスルホン酸等の酸が挙げられる。なお、発光性色素がカルボキシ基やスルホ基を有する化合物である場合、当該発光性色素も上記の酸と同様にプロトンを供与することもできる。
２．病理診断用発光性標識材
　本発明の病理診断用発光性標識材は、前述した本発明の発光性ナノ粒子の表面に標的指向性リガンドが共有結合を介して結合していることを特徴とする。
　本発明の発光性ナノ粒子の用途は特に限定されるものではないが、典型的には、試料（組織切片）に含まれる検出対象物質を標識し、免疫染色において蛍光観察できるようにするための、病理診断用発光性標識材としての用途が挙げられる。すなわち、上述したような本発明の発光性ナノ粒子は、免疫染色の実施形態に応じた標的指向性リガンドを連結させて、複合体（コンジュゲート）として使用することが好適である。
　検出対象物質は特に限定されるものではないが、病理診断においては一般的に、その目的に応じた抗原が選択される。例えば、乳癌に関する病理診断においてはＨＥＲ２を検出対象物質とすることができる。また、検出対象物質は、生体固有のものでなくても良い。例えば、検出対象物質は、薬剤であっても良い。
＜２．１＞　標的指向性リガンド
　本発明において、「標的指向性リガンド」とは、特定の組織又は細胞（検出対象物質）に対して特異的な結合性を有する分子のことである。本発明の標的指向性リガンドは、抗体、細胞小器官親和性物質、及び糖鎖との結合性を有するタンパク質とからなる群から選択される分子であることが非特異的吸着を抑制する点で好ましい。
　標的指向性リガンドの種類は特に限定されず、目的に応じて最適なものを選択することができる。標的指向性リガンドとしては、具体的には、以下のようなものがある。
　標的指向性リガンドの第一の例として、一次抗体（検出対象物質と特異的に結合する抗体）が挙げられる。標的指向性リガンドが一次抗体である病理診断用発光性標識材は、検出対象物質に直接結合して蛍光標識することができる（一次抗体法）。
　標的指向性リガンドの第二の例として、二次抗体（一次抗体に結合する抗体）が挙げられる。例えば、一次抗体がウサギから産生した抗体（ＩｇＧ）である場合、二次抗体は抗ウサギＩｇＧ抗体となる。検出対象物質に結合している一次抗体に、標的指向性リガンドが二次抗体である病理診断用発光性標識材が結合することにより、検出対象物質を間接的に蛍光標識することができる（二次抗体法）。
　標的指向性リガンドの第三の例として、アビジン、ストレプトアビジン又はビオチンが挙げられる。例えば、標的指向性リガンドがアビジン又はストレプトアビジンである病理診断用発光性標識材を用いる場合は、二次抗体―ビオチン複合体が組み合わされて用いられる。検出対象物質に結合している一次抗体に、二次抗体―ビオチン複合体が結合し、当該複合体にさらに、アビジン又はストレプトアビジンが標的指向性リガンドである病理診断用発光性標識材が結合することにより、検出対象物質を間接的に蛍光標識することができる（ビオチン－アビジン法又はサンドイッチ法）。これとは逆に、標的指向性リガンドがビオチンである病理診断用発光性標識材を、二次抗体―アビジン複合体又は二次抗体―ストレプトアビジンと組み合わせて用いることもできる。
　一次抗体は、選択された検出対象物質に応じて、それと特異的に結合するものを選択すればよい。例えば、検出対象物質がＨＥＲ２である場合、一次抗体としては抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体を用いることができる。このような一次抗体（モノクローナル抗体）は、マウス、ウサギ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、チキン等を免疫動物とする一般的な手法により産生することができる。
　二次抗体は、選択された一次抗体に応じて、それと結合するものを選択すればよい。例えば、一次抗体がウサギ抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体である場合、二次抗体としては抗ウサギＩｇＧ抗体を用いることができる。このような二次抗体も一般的な手法により産生することができる。
　その他にも、検出対象物質を核酸分子とし、それに対応する標的指向性リガンドとして、当該核酸分子と相補的な塩基配列を有する核酸分子を用いることも可能である。
　病理診断用発光性標識材は、公知のいかなる手法によって作製されたものであってもよい。例えば、アミンとカルボン酸の反応によるアミド化、マレイミドとチオールの反応によるスルフィド化、アルデヒドとアミンの反応によるイミン化、エポキシとアミンの反応によるアミノ化を利用することができる。このような反応に関与する官能基は、発光性ナノ粒子の表面にあらかじめ存在するもの（バインダーの原料モノマーに由来する官能基）であってもよいし、発光性ナノ粒子の表面に存在する官能基を公知の手法に従って変換した官能基や、表面修飾等により導入された官能基であってもよい。必要に応じて適切なリンカー分子を利用してもよい。
　本発明の別の側面において、本発明の発光性ナノ粒子を使用した組織免疫染色用キットが提供される。このキットは少なくとも、本発明の病理診断用発光性標識材又は本発明の発光性ナノ粒子、標的指向性リガンド及び試薬類を含む。このキットはさらに、必要に応じて、一次抗体、二次抗体、前記標的指向性リガンド（例えばストレプトアビジン）と組み合わせて用いられる他の標的指向性リガンド（例えばビオチン）、所望の複合体を形成するための試薬類、その他の免疫組織染色に用いられる試薬類等を含んでいてもよい。
＜２．２＞　病理診断用発光性標識材の製造方法
　本発明の属する技術分野においては、発光性標識体（本発明における発光性ナノ粒子）を標的指向性リガンド等と共有結合を介して結合させて病理診断用発光性標識材を製造するための様々な手法が知られており、本発明においてもそのような手法を利用することができる。
　例えばカルボキシ基、アミノ基、アルデヒド基、チオール基、マレイミド基等の反応性官能基同士の間で起きる反応を利用して、病理診断用発光性標識材（その表面に存在する一方の反応性官能基）と標的指向性リガンド（その分子中に存在するもう一方の反応性官能基）とを共有結合を介して結合させることができる。また、これらが有する官能基同士を直接的に結合することができない場合は、分子の両末端にそれぞれ所定の官能基を有する「リンカー分子」を介して結合させることもできる。このような反応は、必要な試薬類を添加して所定の時間経過させることにより行うことができる。
　具体例としては、表面にヒドロキシ基を有する発光性ナノ粒子にシランカップリング剤（例えばアミノプロピルトリメトキシシラン）を反応させてアミノ基を導入し、一方でストレプトアビジンにチオール基導入試薬（例えばＮ－スクシミジルＳアセチルチオ酢酸）を反応させてチオール基を導入し、最後に、アミノ基とチオール基の両方と反応性を有するマレイミド基を両端に有するＰＥＧ（ポリエチレングリコール）系のリンカー分子を反応させて、発光性ナノ粒子とストレプトアビジンとを連結させる方法が挙げられる。
　また、例えばグリシジルメタクリレートを原料モノマーとして用いて樹脂（アクリル系樹脂）を合成した場合、発光性ナノ粒子の表面には当該モノマーに由来するエポキシ基が表れている。この発光性ナノ粒子にアンモニア水を添加することにより、そのエポキシ基をアミノ基に変換し、さらにそのアミノ基に所望の標的指向性リガンド等を連結させることができる。
　以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、実施例において「部」あるいは「％」の表示を用いるが、特に断りがない限り「質量部」あるいは「質量％」を表す。
≪発光性色素≫
＜比較例で用いた発光性色素＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000078
＜実施例１で用いた発光性色素＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000079
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000080
＜実施例２で用いた発光性色素＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000081
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000082
＜実施例３で用いた発光性色素＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000083
＜実施例４で用いた発光性色素＞
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000084
≪発光性ナノ粒子の作製≫
［実施例１及び比較例］油溶性色素を用いた発光性ナノ粒子の作製
＜発光性ナノ粒子Ｎｏ．（１－１）～（１－２２）の作製＞
　発光性色素（表Ｉに記載の種類と添加量）を、ジクロロメタン０．２ｍＬに溶解した溶液に、界面活性剤（エマルゲン４３０）を０．５ｖｏｌ％になるように水２０ｍＬを加えた。この溶液をホットスターラー上で攪拌しながら、４０℃まで昇温させたのちに、メラミン樹脂１．２ｇを加えた。
　溶液に、ドデシルベンゼンスルホン酸０．０２ｍｍоｌを加え、発光性ナノ粒子を作製した。得られた分散液を遠心分離にかけて（２００００Ｇで９０分間）粒子を回収し、超純水で洗浄して精製した。
　遠心分離後の上澄み除去及び超純水への再分散による処理を５回繰り返し、平均粒径１３０ｎｍの発光性ナノ粒子Ｎｏ．（１－１）～（１－２２）を得た。
［実施例２］水溶性色素を用いた発光性ナノ粒子の作製
＜発光性ナノ粒子Ｎｏ．（２－１）～（２－１２）の作製＞
　発光性色素（表Ｉに記載の種類と添加量）を、水０．２ｍＬに溶解した溶液に、界面活性剤（エマルゲン４０９ＰＶ）を０．５ｖｏｌ％になるように水２０ｍＬを加えた。この溶液をホットスターラー上で攪拌しながら、８０℃まで昇温させたのちに、メラミン樹脂２．０ｇを加えた以外は、実施例１と同様の操作を行い、平均粒径１３０ｎｍの発光性ナノ粒子Ｎｏ．（２－１）～（２－１２）を得た。
［実施例３］バインダーと共有結合を有する発光性ナノ粒子の作製
＜発光性ナノ粒子Ｎｏ．（３－１）～（３－４）の作製＞
　発光性色素（表Ｉに記載の種類と添加量）を、９９％エタノール４８ｍＬ、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）０．６ｍＬ、超純水２ｍＬ、及び２８質量％のアンモニア水２．０ｍＬと５℃で３時間混合した。
　上記工程で作製した混合液を１００００Ｇで２０分間遠心分離し、上澄みを除去した。この沈殿に対して、エタノールを加えて、沈殿物を分散させ、再度遠心分離をするリンスを行った。さらに同様のリンスを２回繰り返し、平均粒径１３０ｎｍの発光性ナノ粒子（発光性色素含有シリカ粒子）Ｎｏ．（３－１）～（３－４）を得た。
［実施例４］バインダーと共有結合を有する発光性ナノ粒子の作製
　＜発光性ナノ粒子Ｎｏ．（４－１）～（４－２）の作製＞
　発光性色素（表Ｉに記載の種類と添加量）を変えた以外は実施例１と同じ条件に従って、平均粒径１３０ｎｍの発光性ナノ粒子Ｎｏ．（４－１）～（４－２）を得た。
≪発光性ナノ粒子の評価≫
　実施例１で作製した油溶性色素を用いた発光性ナノ粒子、実施例２で作製した水溶性色素を用いた発光性ナノ粒子、実施例３及び実施例４で作製したバインダーと共有結合を有する発光性ナノ粒子の評価において、量子収率及び輝度を測定してそれらの相対値を表Ｉにまとめた。各粒子の相対値は発光性ナノ粒子Ｎｏ．（１－１）の測定値を１００としたものである。
　量子収率は、発光性ナノ粒子を粒子モル濃度０．０１ｍｍｏｌ／ＬになるようにＰＢＳ中に分散させて調製し、その分散液の量子収率を絶対ＰＬ量子収率測定装置Ｃ９９２０－０２（浜松ホトニクス社製）で、それぞれのナノ粒子の極大吸収波長で励起することにより測定した。
　輝度は、発光性ナノ粒子を粒子モル濃度０．０１ｍｍｏｌ／ＬになるようにＰＢＳ中に分散させて調製し、その分散液の輝度を蛍光光度計（日立ハイテクノロジーズ社；Ｆ－７０００）で、室温にてそれぞれのナノ粒子の極大吸収波長で励起することにより測定した。
　本発明の発光性ナノ粒子は、固体発光性を有しているため、色素添加量を増加すると量子収率が増加又は維持する結果が得られた。さらに、色素添加量を増加に伴って吸光度も増加するため、いずれの場合も輝度が増大する結果が得られた。その結果、本発明の発光性ナノ粒子は比較例の発光性ナノ粒子よりも優れており、本発明の有効性が確認できた。
　比較例である発光性ナノ粒子Ｎｏ．（１－２）は、発光性色素（Ｃ－１）が凝集誘起発光性を有しているため、Ｎｏ．（１－１）に比べると、色素添加量を増加させると量子収率が増大して輝度も増大しているが、その増大幅は限定的であった。
　比較例である発光性ナノ粒子Ｎｏ．（１－４）では、Ｎｏ．（１－３）に比べ、色素添加量を増加させると濃度消光が生じて量子収率及び輝度ともに低下する結果であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000085
　実施例の発光性ナノ粒子を水に分散して、吸収及び発光スペクトル測定、遅延発光測定を行った。その結果を表IIに示す。表II中、ロング・ストークスシフト発光性については、ストークスシフトが１００～２００ｎｍの場合は〇、２００ｎｍ以上の場合は◎で示す。遅延発光性については、表II中の全ての発光ナノ粒子において観測した。１００ｎ秒後の遅延発光強度と即時発光強度の比が、１／１０以上は◎、１／１０未満は〇で示す。
　なお、遅延発光測定はストリークカメラＣ４３３４（浜松ホトニクス社製）を用いて、分散液をレーザー光で励起させながら測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000086
　表IIのとおり、実施例の粒子の全てにおいて、ロング・ストークスシフト発光及び遅延発光性を確認することができた。その中においても、分子内エキサイプレックス色素含有色素粒子において、ロング・ストークスシフトが２００ｎｍ以上であった。さらに、遅延発光強度と即時発光強度の比は、分子内エキサイプレックス色素含有粒子の方が熱活性遅延蛍光色素含有粒子より高かった。
≪病理診断用発光性標識材の作製≫
［実施例５］発光性ナノ粒子Ｎｏ．（１－１）～（１－２２）、（２－１）～（２－１２）及び（４－１）～（４－２）からなる病理診断用発光性標識材
＜末端にマレイミド基を有するＰＥＧ鎖で表面修飾された発光性ナノ粒子の調製＞
　発光性色素含有メラミン粒子である上記発光性ナノ粒子Ｎｏ．（１－１）～（１－２２）、（２－１）～（２－１２）及び（４－１）～（４－２）の各粒子を０．１ｍｇをエタノール１．５ｍＬ中に分散し、アミノプロピルトリメトキシシラン「ＬＳ－３１５０」（信越化学工業株式会社製）２μＬを加えて８時間、撹拌しながら室温で反応させて表面アミノ化処理を行った。
　表面がアミノ化された発光性ナノ粒子の濃度を、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を２ｍＭ含有したＰＢＳ（リン酸緩衝液生理的食塩水）を用いて３ｎＭに調整し、この溶液にリンカー試薬「ＳＭ（ＰＥＧ）１２」（サーモサイエンティフィック社製、ｃａｔ．Ｎｏ．２２１１２）を最終濃度１０ｍＭとなるよう添加、混合して、撹拌しながら室温で１時間反応させた。
　反応液を１０，０００Ｇで２０分間の遠心分離にかけ、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加えて沈降物を分散させ、同一条件で再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行うことで、末端にマレイミド基を有するＰＥＧ鎖で表面修飾された発光性ナノ粒子を得た。
＜チオール基を導入したストレプトアビジンの調製＞
　まず、１ｍｇ／ｍＬに調整したストレプトアビジン（和光純薬工業株式会社製）の水溶液４０μＬに、６４ｍｇ／ｍＬに調整したＮ－スクシンイミジル－Ｓ－アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ、ｐｉｒｃｅ社製）の水溶液７０μＬを加え、室温で１時間より反応させることにより、ストレプトアビジンのアミノ基に対して保護されたチオール基（－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ２－Ｓ－ＣＯ－ＣＨ３）を導入した。
　続いて、ヒドロキシルアミン処理により、保護されたチオール基から遊離のチオール基（－ＳＨ）を生成させて、ストレプトアビジンにチオール基（－ＳＨ）を導入する処理を完了させた。この溶液をゲルろ過カラム（Ｚａｂａ　Ｓｐｉｎ　Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ　Ｃｏｌｕｍｎｓ：フナコシ）に通して脱塩し、チオール基を導入したストレプトアビジンを得た。
＜ストレプトアビジン修飾発光性ナノ粒子の調製＞
　調製した末端にマレイミド基を有するＰＥＧ鎖で表面修飾された発光性ナノ粒子と、調製したチオール基を導入したストレプトアビジンとを、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有するＰＢＳ中で混合し、１時間反応させることで、発光性ナノ粒子にＰＥＧ鎖を介してストレプトアビジンを結合させた。この反応液に１０ｍＭメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。得られた溶液を遠心フィルターで濃縮後、精製用ゲルろ過カラムを用いて未反応物を除去し、病理診断用発光性標識材（ストレプトアビジン修飾発光性ナノ粒子）を得た。
［実施例６］発光性ナノ粒子Ｎｏ．（３－１）～（３－４）からなる病理診断用発光性標識材
＜末端にマレイミド基がついた発光性ナノ粒子の調製＞
　発光性色素含有シリカ粒子である上記発光性ナノ粒子Ｎｏ．（３－１）～（３－４）の各粒子について、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を２ｍＭ含有したＰＢＳを用いて３ｎＭに調整し、この溶液に最終濃度１０ｍＭとなるようにＳＭ（ＰＥＧ）１２（サーモサイエンティフィック社製、スクシンイミジル－［（Ｎ－マレイミドプロピオンアミド）－ドデカンエチレングリコール］エステル）を混合し、５℃で１時間反応させた。
　この混合液を、１００００Ｇで２０分遠心分離を行い、上澄みを除去した後に、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行うことで、末端にマレイミド基がついた発光性ナノ粒子を得た。
＜チオール基を導入したストレプトアビジンの調製＞
　発光性ナノ粒子に結合可能なストレプトアビジンを以下のように調製した。
　まず、１ｍｇ／ｍＬに調整したストレプトアビジン（和光純薬工業社製）４０μＬを２１０μＬのボレートバッファーに加えた後、６４ｍｇ／ｍＬに調整した２－イミノチオラン塩酸塩（シグマアルドリッチ社製）７０μＬを加え、室温で１時間反応させた。これにより、ストレプトアビジンのアミノ基に対してチオール基（－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ２ ＋Ｃｌ－）－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＳＨ）を導入した。
　このストレプトアビジン溶液をゲルろ過カラム（Ｚａｂａ　Ｓｐｉｎ　Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ　Ｃｏｌｕｍｎｓ：フナコシ）により脱塩し、上記シリカ粒子に結合可能なストレプトアビジンを得た。
＜ストレプトアビジン修飾発光性ナノ粒子の調製＞
上記ストレプトアビジンの全量（０．０４ｍｇ含有）とＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを用いて上記０．６７ｎＭに調整した発光性ナノ粒子（シリカ粒子）７４０μＬとを混合し、室温で１時間反応させた。
　さらに、１０ｍＭメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。得られた溶液を遠心フィルタで濃縮後、精製用ゲルろ過カラムを用いて未反応ストレプトアビジン等を除去し、病理診断用発光性標識材（ストレプトアビジン修飾発光性ナノ粒子（発光性色素含有シリカ粒子））を得た。
≪実施例７：病理診断用発光性標識材の評価≫
＜組織染色工程＞
［免疫組織染色］
　実施例５及び実施例６で作製した発光性ナノ粒子からなる病理診断用発光性標識材を含む組織染色用染色剤を用いて、ヒト乳房組織の免疫染色を行った。ここで組織染色用染色剤は、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液を用いて作製した。染色切片は組織アレイスライド（コスモ・バイオ社製、品番ＣＢ－Ａ７１２）を用いた。
　染色切片はあらかじめパスビジョンＨＥＲ２　ＤＮＡプローブキット（アボット社製）を用いて、各スポット当りのＦＩＳＨスコアを算出した。このＦＩＳＨスコアは、アボットジャパン社製ＨＥＲ２遺伝子キット　パスビジョン（登録商標）；ＨＥＲ２　ＤＮＡプローブキットに添付されている文書に記載の手順に従って算出した。
　組織アレイスライドを脱パラフィン処理後、水に置換洗浄し、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で１５分間オートクレーブ処理することで、抗原の賦活化処理を行った。抗原の賦活化処理後の組織アレイスライドを、ＰＢＳ緩衝液を用いて洗浄後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液で０．０５ｎＭに稀釈した抗ＨＥＲ２ウサギモノクローナル抗体（４Ｂ５）を組織切片と２時間反応させた。ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液で稀釈したビオチン標識抗ウサギ抗体と、３０分間反応させた。さらに、上記組織染色用染色剤を用いて、すなわち上記製造した病理診断用発光性標識材（ストレプトアビジンを有する発光性ナノ粒子）と２時間反応させ、その後洗浄を行うことにより、免疫組織化学染色切片が得られた。得られた免疫組織化学染色切片を４％中性パラホルムアルデヒド水系緩衝液に１０分間浸漬することにより、固定処理を行った。
［形態染色］
　上記で固定処理した免疫組織化学染色切片に対してＨＥ染色を行い、染色後の切片をエタノールに浸漬することにより脱水し、脱水切片をさらにキシレンに浸漬し風乾させることにより透徹を行ったところ、二重染色切片が得られた。
［封入］
　上記形態染色を行なったものについて、キシレン系封入剤であるエンテランニュー（メルク社製）を滴下し、カバーガラスを被せ封入した。
＜組織サンプルの評価＞
　形態観察用染色像を用いた画像処理により、細胞の形状（細胞膜の位置）を特定し、免疫染色像と重ねあわせて、細胞膜上に発現しているＨＥＲ２タンパク質を標識した病理診断用発光性標識材（発光性ナノ粒子からなるストレプトアビジン修飾発光性ナノ粒子）を表す輝点を励起光照射により顕微鏡観察で確認することができた。この結果により、本発明の発光性ナノ粒子が病理診断用発光性標識材として使用できることが判明した。
　本発明は、バイオイメージングに対する細胞の自家蛍光の悪影響を回避し得る高感度イメージングを可能にする発光性ナノ粒子及び病理診断用発光性標識材に利用することができる。

Claims (12)

  1. 　発光性色素を含有する発光性ナノ粒子であって、
    　前記発光性色素が、下記一般式（１）で表される構造を有する化合物であり、かつ、
    　遅延発光性又はロング・ストークスシフト発光性のうち少なくともいずれか一つを有することを特徴とする発光性ナノ粒子。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     〔式中、Ａは、電子求引性基を表す。Ｄは、電子供与性基を表す。Ｌは、２～４個の原子からなる骨格を有する連結基を表す。前記２～４個の原子は、炭素原子、酸素原子、窒素原子、ケイ素原子、硫黄原子、ホウ素原子又はリン原子である。前記連結基は、水素原子又は置換基を有していてもよい。〕
  2. 　前記一般式（１）が、下記一般式（２）～（６）の少なくともいずれかで表されることを特徴とする請求項１に記載の発光性ナノ粒子。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     〔式中、Ａは、電子求引性基を表す。Ｄは、電子供与性基を表す。Ｘは、環状飽和炭化水素基、環状不飽和炭化水素基、アリール基又はヘテロアリール基を表す。Ｙ及びＺは、炭素原子、酸素原子、窒素原子、ケイ素原子、硫黄原子、ホウ素原子又はリン原子を表し、水素原子又は置換基を有していてもよい。一般式（４）及び（５）におけるＹは２個の原子からなる骨格を有する連結基であってもよい。〕
  3. 　遅延発光性を有することを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の発光性ナノ粒子。
  4. 　分子内エキサイプレックス発光性を有することを特徴とする請求項１から請求項３までのいずれか一項に記載の発光性ナノ粒子。
  5. 　ロング・ストークスシフト発光性を有することを特徴とする請求項１から請求項４までのいずれか一項に記載の発光性ナノ粒子。
  6. 　前記一般式（２）～（６）の式中において、Ａが「置換されていてもよいカルボニル基」、「置換されていてもよいスルホニル基」、「置換されていてもよいボリル基」、「置換されていてもよいホスフィンオキシド基」、「電子求引性基で置換されていてもよいアリール基」、「シアノ基、フッ素原子、フッ素原子で置換されたアルキル基若しくは含窒素芳香族六員環含有複素環基で置換された電子供与性の複素環基」、又は「置換されていてもよい電子求引性の複素環基」を表し、Ｄが「電子供与性基で置換されたアリール基」、「シアノ基、フッ素原子、フッ素原子で置換されたアルキル基及び含窒素芳香族六員環含有複素環基以外の置換基で置換されていてもよい電子供与性の複素環基」、又は「置換されていてもよいアミノ基」を表し、かつ、Ｘがアリール基又はヘテロアリール基を表すことを特徴とする請求項２から請求項５までのいずれか一項に記載の発光性ナノ粒子。
  7. 　前記一般式（４）～（６）の式中において、Ａが「置換されていてもよいカルボニル基」、「置換されていてもよいスルホニル基」、「置換されていてもよいボリル基」、「置換されていてもよいホスフィンオキシド基」、「電子求引性基で置換されていてもよいアリール基」、「シアノ基、フッ素原子、フッ素原子で置換されたアルキル基若しくは含窒素芳香族六員環含有複素環基で置換された電子供与性の複素環基」、又は「置換されていてもよい電子求引性の複素環基」を表し、Ｄが「電子供与性基で置換されたアリール基」、「シアノ基、フッ素原子、フッ素原子で置換されたアルキル基及び含窒素芳香族六員環含有複素環基以外の置換基で置換されていてもよい電子供与性の複素環基」、又は「置換されていてもよいアミノ基」を表し、Ｘがアリール基又はヘテロアリール基を表し、かつ、Ｙが炭素原子、酸素原子、又はケイ素原子を表すことを特徴とする請求項２から請求項５までのいずれか一項に記載の発光性ナノ粒子。
  8. 　前記発光性色素が親水性基を有することを特徴とする請求項１から請求項７までのいずれか一項に記載の発光性ナノ粒子。
  9. 　バインダーを含有することを特徴とする請求項１から請求項８までのいずれか一項に記載の発光性ナノ粒子。
  10. 　前記バインダーのうち発光性ナノ粒子の表面に存在するバインダーが、親水性基を有することを特徴とする請求項９に記載の発光性ナノ粒子。
  11. 　前記バインダーと前記発光性色素が共有結合を形成していることを特徴とする請求項９又は請求項１０に記載の発光性ナノ粒子。
  12. 　請求項１から請求項１１までのいずれか一項に記載の発光性ナノ粒子の表面に標的指向性リガンドが共有結合を介して結合していることを特徴とする病理診断用発光性標識材。
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