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WO2021260966A1 - アデノシン産生酵素を標的とする組成物 - Google Patents

アデノシン産生酵素を標的とする組成物 Download PDF

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WO2021260966A1
WO2021260966A1 PCT/JP2020/043886 JP2020043886W WO2021260966A1 WO 2021260966 A1 WO2021260966 A1 WO 2021260966A1 JP 2020043886 W JP2020043886 W JP 2020043886W WO 2021260966 A1 WO2021260966 A1 WO 2021260966A1
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WO
WIPO (PCT)
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adenosine
cells
producing enzyme
activity
test compound
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2020/043886
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English (en)
French (fr)
Inventor
雅章 川野
祥 松下
理英 高木
美枝子 戸叶
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Saitama Medical University
Original Assignee
Saitama Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Saitama Medical University filed Critical Saitama Medical University
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Publication of WO2021260966A1 publication Critical patent/WO2021260966A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/99—Enzyme inactivation by chemical treatment

Definitions

  • the present invention is a composition for suppressing the differentiation or activation of Th17 cells by targeting an adenosine-producing enzyme, and for treating, ameliorating or preventing a disease caused by an overreaction of Th17 cells by targeting an adenosine-producing enzyme.
  • the present invention relates to a composition and a method for evaluating a compound which is an active ingredient of these compositions.
  • Helper T cells which play a central role in acquired immunity, are classified into Th1 (type 1 helper T cells), Th2 (type 2 helper T cells), Th17 (type 17 helper T cells), etc., based on the differences in cytokines produced. Will be done.
  • the balance bias to Th1 cells can be a chronic inflammatory disease, rheumatoid arthritis, or an organ-specific autoimmune disease (eg, polysclerosis, type 1 diabetes, inflammatory bowel disease, glomerular nephritis, hepatitis, liver). It is thought to be involved in disorders, autoimmune hemolytic anemia, leukopenia, thrombocytopenia, demyelinating disease, Hashimoto thyroiditis, malignant anemia, psoriasis), and the balance bias to Th2 cells is allergic. It is thought to be involved in sexual disorders and many systemic autoimmune disorders.
  • organ-specific autoimmune disease eg, polysclerosis, type 1 diabetes, inflammatory bowel disease, glomerular nephritis, hepatitis, liver. It is thought to be involved in disorders, autoimmune hemolytic anemia, leukopenia, thrombocytopenia, demyelinating disease, Hashimoto thyroiditis, malignant anemia, psorias
  • Th17 cells are involved in the exacerbation of autoimmune inflammation by producing IL-17A exclusively, especially the aforementioned type 1 diabetes, inflammatory bowel disease, psoriasis, multiple sclerosis, and joints. It is believed that rheumatism is highly suspected to be due to this bias towards Th17 (Non-Patent Document 1).
  • Th1 bias a dopamine D1-like receptor on dendritic cells
  • Th17 a dopamine D1-like receptor on dendritic cells
  • the action of the antagonist on a dopamine D1-like receptor on dendritic cells suppresses the synthesis and storage of dopamine in dendritic cells, resulting in Th17 or Th2 cells of naive T cells. It has been shown that the induction of differentiation into Th1 cells is suppressed and the induction of differentiation into Th1 cells is promoted.
  • the antagonist when allowed to act on the dopamine D2-like receptor on the dendritic cells, the synthesis and storage of dopamine in the dendritic cells is promoted, and as a result, the induction of the differentiation of naive T cells into Th1 cells is suppressed. It has also been shown that the induction of differentiation into Th2 cells is promoted.
  • the present inventors not only act on various dopamine D2-like receptor agonists in inducing T cell differentiation, but also act on activated T cells to suppress their IL-17 production. It has also been found that these agonists are effective as therapeutic agents for neutrophil inflammation (Patent Document 2).
  • adenosine which is one of the bases constituting DNA, is also used as a neurotransmitter in the living body.
  • Adenosine as a neurotransmitter is produced by modifying adenosine triphosphate (ATP) released from nerve cells with an adenosine-producing enzyme localized on the cell membrane surface. More specifically, extracellularly released ATP and adenosine diphosphate (ADP) are hydrolyzed catalyzed by membrane-bound ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase-1 (CD39) to produce adenosine monophosphate. (AMP).
  • ATP adenosine triphosphate
  • ADP adenosine diphosphate
  • AMP is then converted to adenosine by a dephosphorylation reaction catalyzed by another adenosine-producing enzyme, ect-5'-nucleosidase (CD73). It is known that the extracellular adenosine thus produced acts on adenosine receptors, A1, A2a, A2b, and A3 on the surface of nerve cells to transmit signals into nerve cells.
  • CD73 ect-5'-nucleosidase
  • adenosine A2A receptor agonists have been reported to be effective in the treatment of asthma, chronic sinusitis, allergic dermatitis, etc. (Patent Document 3, paragraph 0004), and autoimmune diseases. , Asthma, atopic dermatitis, psoriasis and the like are reported to be effective (Patent Document 4, claims 10 and 12).
  • Interleukin 27 limits autoimmune encephhalomyelitis by supplessing the development of interleukin 17-producing T cells. Nat Immunol. 2006.7: 929-936.
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned prior art, and an object of the present invention is to identify a new chemical substance involved in the differentiation of helper T cells and a route for producing the same, and to develop a drug targeting the new chemical substance. To do.
  • ATP induces Th17 cells highly selectively in a bidirectional mixed lymphocyte culture reaction system (2-way MLR) and increases the secretion of IL-17A. From this, it was assumed that the conversion pathway from extracellular ATP to extracellular adenosine is involved in the differentiation and activation of Th17 cells. Then, in order to support this, the conversion was inhibited, and the subsequent behavior of Th17 cells was verified. Specifically, an inhibitor against adenosine-producing enzyme (CD39 inhibitor and / or CD73 inhibitor) was applied to a mixed lymphocyte culture reaction system in the presence of ATP, and the subsequent IL-17A production amount was detected.
  • CD39 inhibitor and / or CD73 inhibitor an inhibitor against adenosine-producing enzyme
  • the present inventors next examined whether or not the adenosine-producing enzyme inhibitor can improve the pathological condition of the disease caused by the overreaction of Th17 cells. Specifically, severe atopic dermatitis, neutrophil airway inflammation, and psoriasis were selected as examples of the disease, and the effect of the adenosine-producing enzyme inhibitor in each model mouse of these diseases was evaluated. As a result, it was found that the inhibitor significantly suppressed the activity of these diseases.
  • the present inventors can target the adenosine-producing enzyme involved in the adenosine production pathway and control the differentiation and activation of Th17 cells, and the inhibitor of the enzyme causes an overreaction of Th17 cells.
  • the adenosine-producing enzyme involved in the adenosine production pathway and control the differentiation and activation of Th17 cells, and the inhibitor of the enzyme causes an overreaction of Th17 cells.
  • it is effective as a drug for treating a disease caused by it, and have completed the present invention.
  • the present invention in more detail, provides the following.
  • a method for evaluating the probability that a test compound has an activity of suppressing differentiation or activation of Th17 cells or an activity of treating, ameliorating, or preventing a disease caused by an overreaction of Th17 cells (A) a step of contacting the test compound with the adenosine-producing enzyme, and (b) a step of detecting the binding between the test compound and the adenosine-producing enzyme. Including When the test compound binds to an adenosine-producing enzyme, it is evaluated that it has an activity of suppressing the differentiation or activation of Th17 cells or an activity of treating, ameliorating, or preventing a disease caused by an overreaction of Th17 cells. How to do it.
  • [3] A method for evaluating the probability that a test compound has an activity of suppressing differentiation or activation of Th17 cells or an activity of treating, ameliorating, or preventing a disease caused by an overreaction of Th17 cells.
  • test compound inhibits the binding between the substrate of the adenosine-producing enzyme and the adenosine-producing enzyme, the activity of suppressing the differentiation or activation of Th17 cells or the disease caused by the overreaction of Th17 cells is treated, ameliorated, or prevented.
  • a method for evaluating the probability that a test compound has an activity of suppressing differentiation or activation of Th17 cells or an activity of treating, ameliorating, or preventing a disease caused by an overreaction of Th17 cells (A) a step of contacting the test compound with an adenosine-producing enzyme, and (b) a step of detecting the enzyme activity of the adenosine-producing enzyme, Including When the test compound reduces the enzymatic activity of the adenosine-producing enzyme as compared to the case where the test compound is not contacted, the activity that suppresses the differentiation or activation of Th17 cells or the disease caused by the overreaction of Th17 cells is treated. , A method that is assessed as probable to have activity to improve or prevent.
  • Neutrophil airway inflammation including neutrophil bronchial asthma, periodontal disease, psoriasis, severe atopic dermatitis, acne vulgaris, endometriosis, chronic sinusitis, and various other autoimmune diseases, etc.
  • neutrophil bronchial asthma periodontal disease
  • psoriasis severe atopic dermatitis
  • acne vulgaris endometriosis
  • chronic sinusitis chronic sinusitis
  • various other autoimmune diseases etc.
  • pathological conditions mainly due to neutrophil inflammation.
  • no silver bullet has been known so far.
  • composition of the present invention targets an adenosine-producing enzyme and exerts an effect of suppressing the differentiation and activation of Th17 cells. Therefore, the compositions of the present invention are particularly useful as pharmaceuticals based on novel mechanisms of action for the treatment, amelioration, or prevention of diseases caused by Th17 cell overreaction, including neutrophil inflammation. According to the present invention, it is also possible to efficiently evaluate and screen such drug candidate compounds by targeting adenosine-producing enzymes.
  • composition containing a compound that inhibits the enzymatic activity of adenosine-producing enzyme as an active ingredient is a composition for treating, ameliorating, or preventing a disease caused by suppression of Th17 cell differentiation or activation or overreaction of Th17 cells, and a compound that inhibits the enzymatic activity of an adenosine-producing enzyme.
  • a composition contained as an active ingredient is provided.
  • Adenosine-producing enzyme means an enzyme involved in adenosine production, and more specifically, CD39 and / or CD73 can be mentioned.
  • CD39 is a protein also called ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase-1, which catalyzes the hydrolysis of ATP and ADP to produce AMP.
  • CD73 is a protein also called ect-5'-nucleosidase that catalyzes the dephosphorylation reaction of AMP to produce adenosine.
  • these enzymes usually take a membrane-bound form having a transmembrane region, but can also take a soluble form excluding the transmembrane region.
  • the adenosine-producing enzymes of the present invention also include such soluble CD39 and / or CD73.
  • adenosine-producing enzyme inhibitor which is the active ingredient of the composition of the present invention, is any one that inhibits the enzyme activity of the adenosine-producing enzyme. There are no particular restrictions. In addition, “inhibition” in the present invention includes both complete inhibition and partial inhibition.
  • the "adenosine-producing enzyme inhibitor” may be a known drug, or may be obtained by using, for example, the evaluation method of a test compound described later.
  • Known inhibitors for CD39 include, but are not limited to, ARL67156, POM1 (H 2 Na 6 O 40 W 12 ), PSB06126, PSB069.
  • Known inhibitors for CD73 include, for example, AMP-CP (adenosine 5'-( ⁇ , ⁇ -methylene) diphosphate), AB-680, PSB-12379, CD73-IN-1. Not limited. The structural formulas of these known drugs are shown below in order.
  • examples of the inhibitor against CD73 include pyrimidine derivatives that inhibit the enzymatic activity of CD73, JP-A-2020-515559, JP-A-2019-535720, as disclosed in JP-A-2020-517655.
  • examples thereof include purine derivatives (adenosine derivatives and the like) that inhibit the enzymatic activity of CD73 as disclosed in JP-A-2017-513955.
  • Japanese Patent Laid-Open No. 2011-510953 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2015-057405 or Japanese Patent Application Laid-Open No. 2019-509014, or Japanese Patent Application Laid-Open No. 2019-503709, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2018-501197, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2017-534648.
  • CD39 as disclosed in Gazette, Publication No. 2018-502051, WO2018 / 110555, WO2016 / 075176, WO2016 / 055609 or WO2016 / 081748.
  • antibodies and functional fragments thereof that bind to CD73 and inhibit the enzyme activity of each enzyme can also be used as adenosine-producing enzyme inhibitors.
  • short-chain oligonucleotides siRNA, shRNA, miRNA, antisense oligonucleotides
  • Nucleotides, etc. can also be used as adenosine-producing enzyme inhibitors.
  • the adenosine-producing enzyme inhibitor also includes a pharmacologically acceptable salt, hydrate or solvate as long as it has the inhibitory activity.
  • a pharmacologically acceptable salt is not particularly limited and may be appropriately selected depending on each structure of the adenosine-producing enzyme inhibitor, for example, an acid addition salt (for example, hydrochloride, bromide).
  • Inorganic acid salts such as hydrogen salt, sulfate, hydrogen sulfate, nitrate, carbonate, hydrogen carbonate, phosphate, monohydrogen phosphate, dihydrogen phosphate, acetate, propionate, lactate, Organic acid salts such as citrate and tartrate), base addition salts (eg, alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt, alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt, zinc salt, aluminum salt, ammonium Salts, tetramethylammonium salts), organic amine addition salts (eg, morpholin, piperidine and other addition salts), amino acid addition salts (eg, lysine, glycine, phenylalanine and other addition salts).
  • the hydrate or solvate is not particularly limited, and examples thereof include those in which 0.1 to 10 molecules of water or a solvent are added to one molecule of an adenosine-producing enzyme inhibitor or a salt thereof.
  • adenosine-producing enzyme inhibitors include all isomers and isomer mixtures such as homozygous, geometric isomers, asymmetric carbon-based optical isomers, stereoisomers, etc., as long as they have their inhibitory activity. included. Furthermore, adenosine-producing enzyme inhibitors are still undergoing metabolism such as oxidation, reduction, hydrolysis, amination, deamination, hydroxylation, phosphorylation, dehydration, alkylation, dealkylation, and conjugation in vivo. The present invention also includes compounds exhibiting the inhibitory activity, and the present invention also includes compounds that undergo metabolism such as oxidation, reduction, and hydrolysis in vivo to produce an adenosine-producing enzyme inhibitor.
  • adenosine-producing enzyme inhibitor As mentioned above, many compounds have been developed and are commercially available, so they can be obtained by purchasing. In addition, many reports have been made on methods for producing these compounds, even if they are not commercially available. Therefore, those skilled in the art can appropriately prepare according to the production method.
  • composition of the present invention is used for pharmaceutical compositions (pharmaceutical products, non-pharmaceutical products, veterinary drugs, etc.), foods and drinks (including animal feeds), or for research purposes (for example, in vitro or in vivo experiments). It can be in the form of a reagent to be used.
  • composition of the present invention can be used for suppressing the differentiation or activation of Th17 cells, or for treating, ameliorating, or preventing a disease caused by an overreaction of Th17 cells.
  • adenosine The physiological roles of adenosine are known to include vasodilation, sleep, and regulation of neural activity.
  • the relationship between adenosine produced by adenosine-producing enzymes and Th17 cell differentiation and activation is found. It was issued. Since the relationship between the differentiation / activation of IL-17 and neutrophil inflammation is known (Patent Document 2), the composition of the present invention should be applied to diseases caused by an overreaction of Th17 cells. Is possible.
  • the "disease caused by the overreaction of Th17 cells" a disease whose main pathological condition is neutrophil inflammation is suitable.
  • Specific diseases include, for example, neutrophil airway inflammation including neutrophil bronchial asthma, periodontal disease, psoriasis, ulcerative colitis, severe atopic dermatitis, acne vulgaris, and endometriosis. , Chronic sinusitis, and various other autoimmune diseases (eg, rheumatoid arthritis, polysclerosis, type 1 diabetes, nephritis), but are not limited thereto.
  • the dosage form is not particularly limited as long as it contains an adenosine-producing enzyme inhibitor as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be formulated into various dosage forms including a pharmacologically acceptable carrier by a known pharmaceutical method.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the desired administration method, for example, an oral solid preparation (tablet, coated tablet, granule, powder, capsule, etc.). , Oral solutions (internal solutions, syrups, elixirs, etc.), external preparations (suppositories, ointments, patches, gels, creams, external powders, sprays, inhalants, etc.), injections (solutions, suspensions, etc.) Turbid liquid, solid agent for errands, etc.), other oral agents (gum agent, troche agent, sublingual tablet, buccal tablet, adhesive, etc.), oral spray agent, oral semi-solid agent, dentifrice, gargle Examples include agents.
  • an excipient such as an adenosine-producing enzyme inhibitor
  • an additive such as a binder, a disintegrant, a lubricant, a colorant, and a flavoring / flavoring agent are added. It can be manufactured by the method.
  • excipients include lactose, sucrose, sodium chloride, glucose, starch, calcium carbonate, kaolin, microcrystalline cellulose, silicic acid and the like.
  • binder include water, ethanol, propanol, simple syrup, glucose solution, starch solution, gelatin solution, carboxymethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl starch, methyl cellulose, ethyl cellulose, shelac, calcium phosphate, polyvinylpyrrolidone and the like.
  • disintegrant include dried starch, sodium alginate, canten powder, sodium hydrogencarbonate, calcium carbonate, sodium lauryl sulfate, stearate monoglyceride, lactose and the like.
  • Examples of the lubricant include purified talc, stearate, borax, polyethylene glycol and the like.
  • Examples of the colorant include titanium oxide and iron oxide.
  • Examples of the flavoring / flavoring agent include sucrose, orange peel, citric acid, tartaric acid and the like.
  • the oral solution for example, it can be produced by a conventional method by adding additives such as a flavoring / flavoring agent, a buffering agent, and a stabilizer to an adenosine-producing enzyme inhibitor.
  • additives such as a flavoring / flavoring agent, a buffering agent, and a stabilizer to an adenosine-producing enzyme inhibitor.
  • Examples of the flavoring / flavoring agent include sucrose, orange peel, citric acid, tartaric acid and the like.
  • Examples of the buffer include sodium citrate and the like.
  • Examples of the stabilizer include tragant, gum arabic, gelatin and the like.
  • the suppository examples include an adenosine-producing enzyme inhibitor, a known carrier for suppository preparations such as polyethylene glycol, lanolin, cocoa butter, and fatty acid triglyceride, and, if necessary, a surfactant such as Tween (registered trademark). After adding an agent or the like, it can be manufactured by a conventional method.
  • an adenosine-producing enzyme inhibitor such as polyethylene glycol, lanolin, cocoa butter, and fatty acid triglyceride
  • a surfactant such as Tween (registered trademark).
  • ointment for example, a known base, stabilizer, wetting agent, preservative, etc. can be blended with an adenosine-producing enzyme inhibitor and mixed by a conventional method to produce the ointment.
  • Examples of the base include liquid paraffin, white petrolatum, bleached beeswax, octyldodecyl alcohol, paraffin and the like.
  • Examples of the preservative include methyl paraoxybenzoate, ethyl paraoxybenzoate, propyl paraoxybenzoate and the like.
  • a cream, a gel, a paste, or the like as an ointment can be applied to a known support by a conventional method to produce the patch.
  • the support include woven fabrics made of cotton, rayon, and chemical fibers, non-woven fabrics, films such as soft vinyl chloride, polyethylene, and polyurethane, and foam sheets.
  • a pH adjuster, a buffer, a stabilizer, an tonicity agent, a local anesthetic, etc. are added to an adenosine-producing enzyme inhibitor, and subcutaneous, intramuscular, or intravenous. It is possible to manufacture injections for use.
  • Examples of the pH adjuster and buffer include sodium citrate, sodium acetate, sodium phosphate and the like.
  • examples of the stabilizer include sodium metabisulfite, EDTA, thioglycolic acid, thiolactic acid and the like.
  • examples of the tonicity agent include sodium chloride, glucose and the like.
  • Examples of the local anesthetic include procaine hydrochloride, lidocaine hydrochloride and the like.
  • a preparation to be applied to the oral cavity can also be formulated by a known pharmaceutical method according to its properties.
  • composition of the present invention When the composition of the present invention is used as a pharmaceutical composition, one or more other components effective for treating a disease (preferably neutrophil inflammation) caused by an overreaction of Th17 cells. Can be blended. It may also be used in combination with other pharmaceutical compositions effective for this purpose.
  • a disease preferably neutrophil inflammation
  • the administration target of the pharmaceutical composition is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, and examples thereof include humans and non-human animals.
  • non-human animals include, but are not limited to, mice, rats, cows, pigs, monkeys, dogs, cats and the like.
  • the administration method can be appropriately selected depending on the dosage form and the like, and examples thereof include oral administration, external administration, and administration by injection.
  • the dose can be appropriately selected according to the type, age, body weight, sex, symptoms, etc. of the administration target, and for example, as the amount of the adenosine-producing enzyme inhibitor which is an active ingredient per day for a human adult, for example. , An amount selected in the range of 0.04 to 500 mg is considered preferred.
  • the frequency of administration is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • the daily dose may be administered once a day or divided into a plurality of doses. You may. Further, it may be administered not daily but, for example, 1 to 4 times a week.
  • the food and drink may be, for example, a health food, a functional food, a food for specified health use, a nutritional supplement, a food for the sick, or a food additive.
  • Specific examples of foods and drinks include liquid foods such as drinks, soups, dairy drinks, soft drinks, tea drinks, alcoholic drinks, jelly-like drinks, and functional drinks; oils such as cooking oil, dressings, mayonnaise, and margarine.
  • the food and drink in the present invention can be manufactured by a manufacturing technique known in the art.
  • one or more components effective for diseases caused by Th17 cell overreaction preferably neutrophil inflammation
  • it may be a multifunctional food and drink by combining it with other ingredients or other functional foods that exhibit this desired function.
  • the target of food and drink can be appropriately selected according to the purpose, and examples thereof include humans and non-human animals.
  • non-human animals include, but are not limited to, mice, rats, cows, pigs, monkeys, dogs, cats and the like.
  • the intake amount can be appropriately selected according to the type, age, body weight, sex, symptoms, etc. of the intake target, and for example, as the amount of the adenosine-producing enzyme inhibitor which is an active ingredient per day for a human adult, for example. , An amount selected in the range of 0.04 to 500 mg is considered preferred.
  • the frequency of intake can be appropriately selected depending on the intended purpose. For example, the daily intake may be taken once a day or may be divided into a plurality of times. It may also be taken, for example, 1 to 4 times a week instead of daily.
  • the product of the composition of the invention (pharmaceutical composition, food and drink, reagents, instruments containing these, etc.) or instructions thereof is used, for example, to suppress the differentiation and activation of Th17 cells, and / or Th17 cells. It may be labeled as being used for the treatment, amelioration, or prevention of diseases caused by the overreaction of.
  • "marked on the product or instruction manual” means that the label is attached to the main body, container, packaging, etc. of the product, or the instruction manual, package insert, advertisement, or other printed matter that discloses the information of the product. It means that the display is attached to.
  • the present invention provides a method for evaluating the probability that a test compound has an activity of suppressing differentiation or activation of Th17 cells or an activity of treating, ameliorating, or preventing a disease caused by an overreaction of Th17 cells.
  • the first aspect of the evaluation method of the present invention is a method using the binding between the test compound and the adenosine-producing enzyme as an index, (a) a step of bringing the test compound into contact with the adenosine-producing enzyme, and (b) a subject.
  • the step of detecting the binding between the test compound and the adenosine-producing enzyme is included.
  • This aspect can be mainly used as a primary evaluation method for the evaluation of the aspect described later.
  • test compound to be the target of the evaluation method of the present invention is not particularly limited, and for example, a synthetic small molecule compound library, an expression product of a gene library, a peptide library, a polynucleotide library, an antibody, and a bacterial release.
  • synthetic small molecule compound library examples include extracts and culture supernatants of substances, cells (microorganisms, plant cells, animal cells), purified or partially purified polypeptides, extracts from marine organisms, plants, or animals.
  • the test compound may be synthesized based on an in silico design based on the three-dimensional structure of the adenosine-producing enzyme.
  • the "adenosine-producing enzyme" used in the evaluation method of the present invention is, for example, a protein consisting of the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to 6 (NCBI Reference Sequence: NP_001767, NP_001091645, NP_001157650, NP_001157651, NP_001157653, or NP_001157654) and partial peptides thereof can be mentioned.
  • a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7 or 8 NCBI Reference Sequence: NP_001191742 or NP_002517
  • individual differences may occur in the amino acid sequence of adenosine-producing enzymes.
  • adenosine-producing enzyme in addition to the natural protein and its partial peptide, a modified or modified product thereof can be used as needed.
  • proteins eg, enzymes such as alkaline phosphatase (SEAP), ⁇ -galactosidase, fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP), glutathione-S-transferase (GST)).
  • SEAP alkaline phosphatase
  • GFP green fluorescent protein
  • GST glutathione-S-transferase
  • fusion proteins can be used.
  • the adenosine-producing enzyme can also be used in the form expressed on the cell surface.
  • Contact between the test compound and the adenosine-producing enzyme can be performed by adding the test compound to the evaluation system or the like.
  • a known method can be appropriately adopted for "detection of binding between the test compound and the adenosine-producing enzyme". For example, a method of contacting a fixed adenosine-producing enzyme with a test compound to identify a compound that binds to the adenosine-producing enzyme can be mentioned.
  • a means for detecting the binding between the test compound and the adenosine-producing enzyme various known means can be used, and one example of a suitable means is a biosensor using a surface plasmon resonance phenomenon.
  • test compound is a synthetic small molecule compound library
  • a high-throughput method by combinatorial chemistry technology (Writton NC et al., Science. 26; 273 (5274) 458-464 (1996), Verdine, GL, Nature. 384: 11-13 (1996), Hogan JC, Jr Directed combinatorial chemistry. Nature. 384: 17-19 (1996) can be used.
  • test compound is a polynucleotide library
  • an in vitro selection method can be used (SELEX method) (Tuerk C. & Gold L., Science. 3; 249 (496): 505). -510 (1990), Green R. et al., Methods Compan Methods Enzymol. 2: 75-86 (1991), Gold L. et al., Annu Rev Biochem 64: 763-97 (1995), Uphoff K.W. Et al., Curr. Opin. Structure. Biol. 6: 281-288 (1996)).
  • test compound a method using FRET (fluorescence resonance energy transfer), an immunoprecipitation method, a yeast two-hybrid system, etc. can also be used.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • immunoprecipitation method a method using immunoprecipitation method, a yeast two-hybrid system, etc.
  • test compound when the test compound binds to an adenosine-producing enzyme, it is likely that it has an activity of suppressing the differentiation or activation of Th17 cells or an activity of treating, ameliorating, or preventing a disease caused by an overreaction of Th17 cells. It is evaluated as being.
  • the second aspect of the evaluation method of the present invention is a method using the inhibition of the binding between the substrate of the adenosine-producing enzyme and the adenosine-producing enzyme by the test compound as an index, and (a) adenosine in the presence of the test compound. It comprises contacting the substrate of the producing enzyme with the adenosine producing enzyme, and (b) detecting the binding between the substrate of the adenosine producing enzyme and the adenosine producing enzyme.
  • adenosine-producing enzyme substrate examples include ATP and ADP when the adenosine-producing enzyme is CD39, and AMP, for example, when the adenosine-producing enzyme is CD73.
  • the test compound inhibits the binding between the fixed adenosine-producing enzyme or the adenosine-producing enzyme expressed on the cell surface and the labeled substrate such as a radioactive substance or a fluorescent substance. It may be detected by using the sign as an index.
  • the test compound inhibits the binding between the substrate of the adenosine-producing enzyme and the adenosine-producing enzyme, the activity of suppressing the differentiation or activation of Th17 cells or the disease caused by the overreaction of Th17 cells is treated and improved. Or, it is evaluated that it has a probable activity to prevent it.
  • the third aspect of the evaluation method of the present invention is a method using the suppression of the enzyme activity of the adenosine-producing enzyme by the test compound as an index, (a) a step of contacting the test compound with the adenosine-producing enzyme, and (b). ) Steps to detect the enzyme activity of adenosine-producing enzymes, including.
  • the enzyme activity of the adenosine-producing enzyme which is an index of the evaluation method of the present invention, is the amount of the product (AMP for CD39, adenosine for CD73) obtained by the reaction catalyzed by each enzyme in the presence of each substrate.
  • AMP for CD39, adenosine for CD73
  • enzyme activity includes not only the above-mentioned AMP or adenosine producing ability but also various events occurring in signal transduction induced by the produced adenosine and the like. Examples of such signal transduction include, but are not limited to, an increase in cAMP and activation of PKA. Methods for measuring these activities are known and may be measured using ordinary methods or measurement kits.
  • test compound when the test compound reduces the activity of the adenosine-producing enzyme as compared with the case where the test compound is not contacted, it is caused by the activity of suppressing the differentiation or activation of Th17 cells or the overreaction of Th17 cells. It is evaluated that there is a probability that it has the activity of treating, ameliorating, or preventing the disease.
  • the evaluation method of the present invention is carried out for a plurality of test compounds, and the above-mentioned binding to the adenosine-producing enzyme, the substrate of the adenosine-producing enzyme and the adenosine-producing enzyme are used. If a compound is selected based on the inhibition of the binding of the adenosine or the suppression of the enzyme activity of the adenosine-producing enzyme, the activity of suppressing the differentiation or activation of Th17 cells or the disease caused by the overreaction of Th17 cells can be treated, ameliorated, or treated. Compounds with prophylactic activity can be screened. Therefore, the present invention also provides such a screening method.
  • Th17 cells whether or not to actually suppress the differentiation or activation of Th17 cells, and to treat, improve or prevent the disease caused by the overreaction of Th17 cells. It is preferable to verify whether or not it has activity. Suppression of Th17 cell differentiation and activation is evaluated by, for example, as described in this example, whether or not the production of Th17 cytokine IL-17A or the like is suppressed by using 2-way MLR or the like. be able to.
  • the activity of treating, ameliorating, or preventing a disease caused by an overreaction of Th17 cells is a model for a disease caused by an overreaction of Th17 cells, as shown in the example of atopic dermatitis in this example. It can be evaluated in animal experiments. Furthermore, in clinical trials, it is possible to actually evaluate the effect in humans.
  • Example 1 Effect of CD39 inhibitor and / or CD73 inhibitor on 2-way MLR Mononucleosis was separated using Ficoll solution to prepare spleen cells. Specifically, the spleen was taken out from 8 to 10 week old female H-2 different BALB / c and SJL / J mice, and the spleen was homogenized (GPE Scientific, ten-block homogenizer, Pastele diameter: 15 mm). After adding 5 mL of DMEM, the cells were homogenized by rotating 5 times. Further 5 mL of DMEM was added, and a total volume of 10 mL of spleen cell solution was transferred to a 50 mL tube.
  • GPE Scientific ten-block homogenizer, Pastele diameter: 15 mm
  • Ficoll Ficoll-Paque premium 1.084, GE healthcare
  • 7 mL of Ficoll Ficoll-Paque premium 1.084, GE healthcare
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • the recovered fraction was transferred to a new 50 mL tube.
  • DMEM was added to this recovered fraction to make a total of 40 mL, suspended, and again at room temperature for 10 minutes at 1,500 r. p. m. Centrifugal at (430 xg). After centrifugation, the supernatant was aspirated with an ejector, leaving 2 cm from the lower end, suspended and transferred to a 15 mL tube.
  • DMEM was added to make a total of 12 mL, and at room temperature for 10 minutes 1,500 r. p. m. Centrifugal at (430 xg).
  • the cell pellet was suspended in 2 mL of D10 medium, a portion of the prepared cells was added to the Turkic solution, and the number of mononuclear cells was calculated using the Bürkerturk hemocytometer. After calculation, prepare D10 medium (in DMEM, the final concentration is 10% FCS, 0.1 mg / mL streptomycin, 100 U / mL penicillin, 1 mM sodium pyruvate, 50 ⁇ M 2-mercaptoethanol, respectively. added medium), and the mixture was adjusted to be the 3 ⁇ 10 6 cells / mL.
  • AMP-CP AMP-CP sodium salt
  • TOCRIS TOCRIS
  • Example 2 Effect of CD39 inhibitor or CD73 inhibitor on atopic dermatitis model mice
  • the back of NC / Nga mice was shaved with hair clippers, and 2% 2,4,6-trinitrochlorobenzene (TNCB)
  • TNCB 2,4,6-trinitrochlorobenzene
  • CD39 inhibitor ARL67156 trisodium salt (TOCRIS)
  • CD73 inhibitor adenosine 5'-( ⁇ , ⁇ -methylene) diphosphate (AMP-CP) sodium salt (TOCRIS)
  • TOCRIS adenosine 5'-( ⁇ , ⁇ -methylene) diphosphate
  • TOCRIS adenosine 5'-( ⁇ , ⁇ -methylene) diphosphate
  • TOCRIS adenosine 5'-( ⁇ , ⁇ -methylene) diphosphate
  • TOCRIS adenosine 5'-( ⁇ , ⁇ -methylene) diphosphate
  • Example 3 Effect of CD39 inhibitor or CD73 inhibitor on neutrophil airway inflammation model mice A neutrophil airway inflammation model was prepared according to the protocol shown in FIG. 3A, and the IL of the pulmonary lymphocytes was prepared. The inhibitory effect of the CD39 inhibitor or CD73 inhibitor on -17A production was evaluated as follows.
  • DO11.10 mice which are transgenic mice expressing chicken ovalbumin (OVA) -specific TCR, were subjected to 10 days before pulmonary lymphocyte collection described later (Day).
  • -10, -8, -6, -4, -2, and -1 in 100 [mu] L of ultrapure water, CD39 inhibitors (ARL67156 trisodium salt (TOCRIS)) 100 ⁇ L (5mg / mL H 2 O), or CD73 inhibitors - a (adenosine 5 '(alpha, beta-methylene) diphosphate (AMP-CP) sodium salt (TOCRIS)) 100 ⁇ L (5mg / mL H 2 O) was orally administered with gastric tube.
  • TOCRIS adenosine 5 '(alpha, beta-methylene) diphosphate
  • the OVA protein was injected into the transgenic mice for the purpose of inducing acquired immunity to OVA. Specifically, first, the OVA protein (Sigma) was dissolved in calcium- and magnesium-free PBS (PBS ( ⁇ )) to prepare 2 mg / mL OVA in PBS ( ⁇ ). The OVA solution was then mixed with a complete Freund's adjuvant (DIFCO, adjuvant, complete, H37 Ra) in equal volumes (eg, 500 ⁇ L of OVA solution mixed with 500 ⁇ L of complete Freund's adjuvant), two 2 mL. Syringe (Inject, B.
  • DIFCO complete Freund's adjuvant
  • Brown Medical was connected with a syringe connector (GP Syringe Connecta, Nipro) and emulsified by the two-syringe method.
  • An emulsified 100 ⁇ L (100 ⁇ g as OVA) of OVA-dissolved complete Freund's adjuvant was subcutaneously injected into the inguinal region of DO11.10 mice.
  • pulmonary lymphocytes were collected. Specifically, the lungs of mice were transferred to a 6 cm dish, finely divided using scissors, 10 mL of D10 medium was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. In addition to the above composition, 10% FCS, 0.1 mg / mL streptomycin, 100 U / mL penicillin, 1 mM sodium pyruvate and 50 ⁇ M 2-mercaptoethanol were added to the D10 medium here (each). The concentration of all additives is the final concentration).
  • the medium containing the lung tissue fragment is filtered with a cell strainer (FALCON, 40 ⁇ m mesh) connected to a 50 mL tube, and the lung tissue fragment remaining in the cell strainer is celled using a cell scraper (IWAKI). It was mashed on a strainer, and 10 mL of DMEM was passed through a cell strainer that mashed the lung tissue and co-washed. After co-washing, a total volume of 20 mL of the solution containing the collected lung cells in a 50 mL tube was added to room temperature at 1,200 r. p. m. Centrifugation was carried out at (270 ⁇ g) for 5 minutes.
  • a cell strainer FALCON, 40 ⁇ m mesh
  • IWAKI cell scraper
  • the pellets were loosened and suspended in 10 mL DMEM at room temperature of 1,200 r. p. m. Centrifugation was carried out at (270 ⁇ g) for 5 minutes. After removing the supernatant, the pellet is loosened, suspended in 10 mL DMEM, transferred to a new 15 mL tube, and again at room temperature, 1,200 r. p. m. Centrifugation was carried out at (270 ⁇ g) for 5 minutes.
  • D10 + gentamicin + amphotericin medium was added to the prepared mononuclear cells, and 1 ⁇ 10 6 cells / 200 ⁇ L were seeded on a round-bottomed 96-well plate. Cell supernatants were collected on Days 1, 2, 3, and 4 (1-4 days after the start of culture). Then, the concentration of IL-17A contained in the collected cell supernatant was quantified by the ELISA method.
  • the ELISA method was performed using a Duo set kit (R & D systems) according to the attached manual.
  • IL-17A production was suppressed in each drug-administered group as compared with the control group to which ultrapure water was administered. This suggests that administration of a CD39 inhibitor or a CD73 inhibitor suppresses neutrophil airway inflammation.
  • Example 4 Effect of CD39 inhibitor or CD73 inhibitor on psoriasis model mice Imikimodo cream (IMQ, product name: Beselna® cream 5%) 12.5 mg was applied to the auricles of C57BL / 6 mice. Further, water, a CD39 inhibitor, or a CD73 inhibitor (10 mM, 30 ⁇ L / day) was dropped daily into the auricle of the mouse, and its thickening was observed. As a negative control, a group to which petrolatum was applied instead of imiquimod cream was also prepared.
  • IMQ Imikimodo cream
  • the CD39 inhibitor dropping group and the CD73 inhibitor dropping group were compared with the control group in which water was dropped. Thickening was significantly suppressed. This suggests that administration of a CD39 inhibitor or a CD73 inhibitor suppresses the pathological condition of psoriasis.
  • the present invention is useful for the treatment of diseases caused by the overreaction of Th17 cells, and mainly contributes to the medical field.
  • the present invention also contributes to basic research for regulating Th17 cell differentiation and activation.

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Abstract

ヘルパーＴ細胞の分化に関与する新たな化学物質およびその生成経路を同定し、それを標的とした医薬を開発することを目的とし、アデノシン産生酵素がＴｈ１７細胞の分化と活性化の制御に関与していることを見出した。また、アデノシン産生酵素の阻害剤がＴｈ１７細胞の過剰反応に起因する疾患に対する医薬として有効であることを見出した。

Description

アデノシン産生酵素を標的とする組成物
　本発明は、アデノシン産生酵素を標的としてＴｈ１７細胞の分化または活性化を抑制するための組成物、アデノシン産生酵素を標的としてＴｈ１７細胞の過剰反応に起因する疾患を治療、改善、または予防するための組成物、および、これら組成物の有効成分となる化合物の評価方法に関する。
　獲得免疫の中心的役割を担うヘルパーＴ細胞は、産生するサイトカインの違いなどから、Ｔｈ１（タイプ１ヘルパーＴ細胞）、Ｔｈ２（タイプ２ヘルパーＴ細胞）、Ｔｈ１７（タイプ１７ヘルパーＴ細胞）などに分類される。
　従来から、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスの異常は様々な免疫関連疾患の発症に関与すると考えられている。例えば、Ｔｈ１細胞へのバランス偏向は、慢性炎症性疾患である関節リウマチや、臓器特異的自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症、１型糖尿病、炎症性腸疾患、糸球体腎炎、肝炎、肝障害、自己免疫性溶血性貧血、白血球減少症、血小板減少症、脱髄疾患、橋本甲状腺炎、悪性貧血、乾癬）などに関与すると考えられており、また、Ｔｈ２細胞へのバランス偏向は、アレルギー性疾患や、多くの全身性自己免疫疾患に関与すると考えられている。一方、Ｔｈ１７細胞は、もっぱらＩＬ－１７Ａを産生することにより、自己免疫性炎症の増悪に関与しており、特に前述の、１型糖尿病、炎症性腸疾患、乾癬、多発性硬化症、および関節リウマチは、このＴｈ１７への偏向に起因する疑いが強いと考えられている（非特許文献１）。
　獲得免疫システムには様々な要因が複雑に関与しており、どの免疫関連疾患に、Ｔｈ１偏向、Ｔｈ２偏向、Ｔｈ１７偏向のいずれが関与しているかは、いまだ不明な点も多いが、本発明者らは、既に、樹状細胞を介したＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７分化誘導機構に、ドーパミンの働きが大きく関与していることを見出している（特許文献１）。この報告においては、樹状細胞上のドーパミンＤ１様受容体に、そのアンタゴニストを作用させると、樹状細胞におけるドーパミンの合成と貯蔵が抑制され、その結果、ナイーブＴ細胞のＴｈ１７細胞またはＴｈ２細胞への分化の誘導が抑制され、Ｔｈ１細胞への分化の誘導が促進されることが示されている。さらに、樹状細胞上のドーパミンＤ２様受容体に、そのアンタゴニストを作用させると、樹状細胞におけるドーパミンの合成・貯蔵が促進され、その結果、ナイーブＴ細胞のＴｈ１細胞への分化の誘導が抑制され、Ｔｈ２細胞への分化の誘導が促進されることも示されている。
　また、本発明者らは、種々のドーパミンＤ２様受容体アゴニストが、Ｔ細胞の分化誘導において作用することのみならず、活性化後のＴ細胞にも作用して、そのＩＬ－１７産生を抑制することや、これらアゴニストが好中球性炎症の治療薬として有効であることも見出している（特許文献２）。
　しかしながら、ヘルパーＴ細胞の分化や活性化には、ドーパミン以外の化学物質も関与している可能性が考えられることから、そのような化学物質およびその生成経路を同定し、それを標的とした新たな医薬の開発が望まれている。
　ところで、ＤＮＡを構成する塩基の一つであるアデノシンは、生体内において、神経伝達物質としても用いられている。神経伝達物質としてのアデノシンは、神経細胞から放出されたアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）が、細胞膜表面に局在するアデノシン産生酵素によって修飾されることで生成される。より具体的には、細胞外に放出されたＡＴＰやアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）は、膜結合型エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ－１（ＣＤ３９）が触媒する加水分解によって、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）となる。次いで、もう一つのアデノシン産生酵素である、エクト－５’－ヌクレオシダーゼ（ＣＤ７３）が触媒する脱リン酸化反応によって、ＡＭＰはアデノシンに変換される。そして、このようにして産生された細胞外アデノシンは、神経細胞表面のアデノシン受容体、Ａ１、Ａ２ａ、Ａ２ｂ、Ａ３に作用して、神経細胞内にシグナルを伝達することが知られている。
　また、神経伝達のみならず、アデノシンＡ２Ａ受容体のアゴニストが、喘息、慢性副鼻腔炎、アレルギー性皮膚炎などの治療に有効であるとの報告（特許文献３、段落０００４）や、自己免疫疾患、喘息、アトピー性皮膚炎、乾癬などの治療に有効であるとの報告（特許文献４、請求項１０、１２）がある。
国際公開第２００８－０１６１１８号 国際公開第２０１８－２２１５６２号 特表２００５－５１３０４３号公報 特開２００６－１６０６２８号公報
Ｂａｔｔｅｎ，Ｍ　ｅｔ　ａｌ．；Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ　２７　ｌｉｍｉｔｓ　ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ　ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ　ｂｙ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ　１７－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　Ｔ　ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６．７：９２９－９３６．
　本発明は、上記従来技術の状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、ヘルパーＴ細胞の分化に関与する新たな化学物質およびその生成経路を同定し、それを標的とした医薬を開発することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った。その結果、ＡＴＰが、双方向混合リンパ球培養反応系（２ウェイＭＬＲ）において、Ｔｈ１７細胞を高選択的に誘導し、ＩＬ－１７Ａの分泌を増大させることを見出した。このことから、細胞外ＡＴＰから細胞外アデノシンへの変換経路が、Ｔｈ１７細胞の分化・活性化に関与していると想定した。そして、これを裏付けるため、前記変換を阻害し、その後のＴｈ１７細胞の挙動の検証を行った。具体的には、アデノシン産生酵素に対する阻害剤（ＣＤ３９阻害剤及び／又はＣＤ７３阻害剤）を、ＡＴＰ存在下での混合リンパ球培養反応系に適用し、その後のＩＬ－１７Ａ産生量を検出した。その結果、アデノシン産生酵素阻害剤の作用により、ＡＴＰによるＴｈ１７細胞からのＩＬ－１７Ａの分泌が濃度依存的に抑制されることが判明した。これら事実から、アデノシン産生酵素がＴｈ１７細胞の分化・活性化の制御に関与していることが裏付けられた。
　そこで、本発明者らは、次に、アデノシン産生酵素阻害剤が、Ｔｈ１７細胞の過剰反応に起因する疾患の病態を改善できるか否かの検証を行った。具体的には、疾患の例として、重症アトピー性皮膚炎、好中球性気道炎症、および乾癬を選択し、これら疾患の各モデルマウスにおけるアデノシン産生酵素阻害剤の効果を評価した。その結果、当該阻害剤が、有意にこれら疾患の活動性を抑制することが判明した。
　以上から、本発明者らは、アデノシン生成経路に関与するアデノシン産生酵素を標的とし、Ｔｈ１７細胞の分化・活性化を制御することが可能であり、前記酵素の阻害剤がＴｈ１７細胞の過剰反応に起因する疾患の治療などのための薬剤として有効であることを見出し、本発明を完成するに至った。
　本発明は、より詳しくは、以下を提供するものである。
　［１］　Ｔｈ１７細胞の分化もしくは活性化の抑制またはＴｈ１７細胞の過剰反応に起因する疾患の治療、改善、もしくは予防のための組成物であって、アデノシン産生酵素の酵素活性を阻害する化合物を有効成分として含有する組成物。
　［２］　被検化合物が、Ｔｈ１７細胞の分化もしくは活性化を抑制する活性またはＴｈ１７細胞の過剰反応に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性を評価する方法であって、
　（ａ）被検化合物をアデノシン産生酵素に接触させる工程、および
　（ｂ）被検化合物とアデノシン産生酵素との結合を検出する工程、
を含み、
　被検化合物がアデノシン産生酵素と結合する場合、Ｔｈ１７細胞の分化もしくは活性化を抑制する活性またはＴｈ１７細胞の過剰反応に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性があると評価される方法。
　［３］　被検化合物が、Ｔｈ１７細胞の分化もしくは活性化を抑制する活性またはＴｈ１７細胞の過剰反応に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性を評価する方法であって、
　（ａ）被検化合物の存在下で、アデノシン産生酵素の基質をアデノシン産生酵素に接触させる工程、および
　（ｂ）アデノシン産生酵素の基質とアデノシン産生酵素との結合を検出する工程、
を含み、
　被検化合物がアデノシン産生酵素の基質とアデノシン産生酵素との結合を阻害する場合、Ｔｈ１７細胞の分化もしくは活性化を抑制する活性またはＴｈ１７細胞の過剰反応に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性があると評価される方法。
　［４］　被検化合物が、Ｔｈ１７細胞の分化もしくは活性化を抑制する活性またはＴｈ１７細胞の過剰反応に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性を評価する方法であって、
　（ａ）被検化合物をアデノシン産生酵素に接触させる工程、および
　（ｂ）アデノシン産生酵素の酵素活性を検出する工程、
を含み、
　被検化合物を接触させない場合と比較して、被検化合物がアデノシン産生酵素の酵素活性を低下させる場合、Ｔｈ１７細胞の分化もしくは活性化を抑制する活性またはＴｈ１７細胞の過剰反応に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性があると評価される方法。
　好中球性気管支喘息を含む好中球性気道炎症、歯周病、乾癬、重症アトピー性皮膚炎、尋常性ざ瘡、子宮内膜症、慢性副鼻腔炎、その他の各種自己免疫病など、好中球性炎症を主体とする病態は多い。しかしながら、特効薬は、これまで知られていない。
　本発明の組成物は、アデノシン産生酵素を標的として、Ｔｈ１７細胞の分化や活性化の抑制効果を発揮するものである。従って、本発明の組成物は、特に、好中球性炎症を含むＴｈ１７細胞の過剰反応に起因する疾患の治療、改善、または予防のための新規作用機序に基づく医薬として有用である。本発明によれば、アデノシン産生酵素を標的として、このような医薬の候補化合物を効率的に評価し、スクリーニングすることも可能となる。
ＡＴＰ存在下の２ウェイＭＬＲにおける、ＣＤ３９阻害剤（ＡＲＬ６７１５６）及び／又はＣＤ７３阻害剤（ＡＭＰ－ＣＰ）の効果を示すグラフである。一元配置分散分析で、ｐ値が０．０５以下で有意差ありと判断し、さらにＴｕｒｋｅｙ検定を行って２群間の有意差を分析した。図中「＊＊」および「＊」は、ＡＴＰのみを加えた群に対し、更にＡＲＬ６７１５６及び／又はＡＭＰ－ＣＰを加えた群が「Ｐ＜０．０１」および「Ｐ＜０．０５」であることを示す。 重症アトピー性皮膚炎モデルマウスにおける、ＡＲＬ６７１５６または、ＡＭＰ－ＣＰの効果を示す写真である。 重症アトピー性皮膚炎モデルマウスにおける、ＡＲＬ６７１５６または、ＡＭＰ－ＣＰの効果を示すグラフである。 好中球性気道炎症モデルマウスを作製および解析するためのプロトコールを示す、概略図である。 好中球性気道炎症モデルマウスにおけるＡＲＬ６７１５６の効果を示すグラフである。図中「Ｎ．Ｄ．」は未検出であることを示す。「＊＊」はＰ＜０．０１であることを示す。 好中球性気道炎症モデルマウスにおけるＡＭＰ－ＣＰの効果を示すグラフである。図中「Ｎ．Ｄ．」は未検出であることを示す。「＊＊」はＰ＜０．０１であることを示す。 乾癬モデルマウスにおけるＡＲＬ６７１５６またはＡＭＰ－ＣＰの効果を示すグラフである。なお、グラフの縦軸は、耳介の肥厚度を示し、各個体の耳介の厚さから陰性対照で生じた肥厚分を差し引いた値で表している。「＊」はＰ＜０．０５であることを示す。
　＜アデノシン産生酵素の酵素活性を阻害する化合物を有効成分とする組成物＞
　本発明は、Ｔｈ１７細胞の分化もしくは活性化の抑制またはＴｈ１７細胞の過剰反応に起因する疾患の治療、改善、もしくは予防のための組成物であって、アデノシン産生酵素の酵素活性を阻害する化合物を有効成分として含有する組成物を提供する。
　「アデノシン産生酵素」は、アデノシン産生に関与する酵素を意味し、より具体的に、ＣＤ３９及び／又はＣＤ７３が挙げられる。「ＣＤ３９」は、エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ－１とも称されるタンパク質であり、ＡＴＰおよびＡＤＰの加水分解を触媒し、ＡＭＰを生成する。「ＣＤ７３」は、エクト－５’－ヌクレオシダーゼとも称されるタンパク質であり、ＡＭＰの脱リン酸化反応を触媒し、アデノシンを生成する。また、これらの酵素は、通常、膜貫通領域を有する膜結合型の形態をとるが、膜貫通領域を除いた可溶性の形態もとりうる。本発明のアデノシン産生酵素には、かかる可溶性のＣＤ３９及び／又はＣＤ７３も含まれる。
　本発明の組成物の有効成分となる「アデノシン産生酵素の酵素活性を阻害する化合物」（以下、「アデノシン産生酵素阻害剤」とも称する）は、アデノシン産生酵素の酵素活性を阻害するものであれば特に制限はない。なお、本発明における「阻害」には、完全な阻害および部分的な阻害の双方が含まれる。
　本発明において、「アデノシン産生酵素阻害剤」は公知の薬剤であってもよく、また、例えば、後述の被検化合物の評価法を利用して得られるものであってもよい。ＣＤ３９に対する公知の阻害剤として、例えば、ＡＲＬ６７１５６、ＰＯＭ１（Ｈ２Ｎａ６Ｏ４０Ｗ１２）、ＰＳＢ０６１２６、ＰＳＢ０６９が挙げられるが、これらに制限されない。ＣＤ７３に対する公知の阻害剤として、例えば、ＡＭＰ－ＣＰ（アデノシン５’－（α，β－メチレン）二リン酸）、ＡＢ－６８０、ＰＳＢ－１２３７９、ＣＤ７３－ＩＮ－１が挙げられるが、これらに制限されない。これら公知の薬剤の構造式を順に以下に示す。
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　さらに、ＣＤ７３に対する阻害剤としては、特表２０２０－５１７６５５号公報に開示されているような、ＣＤ７３の酵素活性を阻害するピリミジン誘導体、特表２０２０－５１５５５９号公報、特表２０１９－５３５７２０号公報または特表２０１７－５１３９５５号公報に開示されているような、ＣＤ７３の酵素活性を阻害するプリン誘導体（アデノシン誘導体など）が挙げられる。
　また、特表２０１１－５１０９５３号公報、特開２０１５－０５７４０５号公報もしくは特表２０１９－５０９０１４号公報、または、特表２０１９－５０３７０９号公報、特表２０１８－５０１１９７号公報、特表２０１７－５３４６４８号公報、特表２０１８－５０２０５１号公報、国際公開第２０１８／１１０５５５号、国際公開第２０１６／０７５１７６号、国際公開第２０１６／０５５６０９号もしくは国際公開第２０１６／０８１７４８号に開示されているように、ＣＤ３９またはＣＤ７３に結合し、各酵素の酵素活性を阻害する、抗体およびその機能的断片も、アデノシン産生酵素阻害剤として利用し得る。さらにまた、特表２０１９－５３４０４２号公報または特表２０１９－５３１０９５号公報に開示されているように、ＣＤ３９またはＣＤ７３の転写産物にハイブリダイズする短鎖オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドなど）も、アデノシン産生酵素阻害剤として利用し得る。
　また、アデノシン産生酵素阻害剤には、その阻害活性を有する限り、薬理学上許容される塩、水和物または溶媒和物も含まれる。このような薬理学上許容される塩としては、特に制限はなく、アデノシン産生酵素阻害剤の各構造などに応じて適宜選択することができ、例えば、酸付加塩（例えば、塩酸塩、臭化水素塩、硫酸塩、硫酸水素塩、硝酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩などの無機酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩などの有機酸塩）、塩基付加塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、亜鉛塩、アルミニウム塩、アンモニウム塩、テトラメチルアンモニウム塩）、有機アミン付加塩（例えば、モルホリン、ピペリジンなどの付加塩）、アミノ酸付加塩（例えば、リジン、グリシン、フェニルアラニンなどの付加塩）が挙げられる。また、水和物または溶媒和物としては、特に制限はなく、例えば、アデノシン産生酵素阻害剤またはその塩１分子に対し、０．１～１０分子の水または溶媒が付加したものが挙げられる。
　さらに、アデノシン産生酵素阻害剤には、その阻害活性を有する限り、互変異性体、幾何異性体、不斉炭素に基づく光学異性体、立体異性体などの総ての異性体および異性体混合物が含まれる。さらにまた、アデノシン産生酵素阻害剤が生体内で酸化、還元、加水分解、アミノ化、脱アミノ化、水酸化、リン酸化、脱水酸化、アルキル化、脱アルキル化、抱合などの代謝を受けてなおその阻害活性を示す化合物をも包含し、また本発明は生体内で酸化、還元、加水分解などの代謝を受けてアデノシン産生酵素阻害剤を生成する化合物をも包含する。
　なお、アデノシン産生酵素阻害剤に関しては、上述のとおり、多くの化合物が開発され市販もされているため、購入することによって入手することができる。また市販されていなくとも、それら化合物の製造方法についても多々報告がなされている。そのため、当業者であれば、当該製造方法に沿って適宜調製することもできる。
　本発明の組成物は、医薬組成物（医薬品、医薬部外品、動物用医薬品など）、飲食品（動物用飼料を含む）、あるいは研究目的（例えば、ｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏの実験）に用いられる試薬の形態でありうる。
　本発明の組成物は、Ｔｈ１７細胞の分化もしくは活性化の抑制、またはＴｈ１７細胞の過剰反応に起因する疾患の治療、改善、もしくは予防に利用することができる。
　アデノシンの生理的役割としては、血管拡張、睡眠、神経活動制御などが知られているが、本発明において、アデノシン産生酵素によって産生されるアデノシンと、Ｔｈ１７細胞の分化および活性化との関係が見出された。ＩＬ－１７の分化・活性化と好中球性炎症との関係は知られていることから（特許文献２）、本発明の組成物は、Ｔｈ１７細胞の過剰反応に起因する疾患に適用することが可能である。「Ｔｈ１７細胞の過剰反応に起因する疾患」としては、好中球性炎症を主な病態とする疾患が好適である。具体的な疾患としては、例えば、好中球性気管支喘息を含む好中球性気道炎症、歯周病、乾癬、潰瘍性大腸炎、重症アトピー性皮膚炎、尋常性ざ瘡、子宮内膜症、慢性副鼻腔炎、その他の種々の自己免疫病（例えば、関節リウマチや、多発性硬化症、１型糖尿病、腎炎）などが挙げられるが、これらに制限されない。
　本発明の組成物を医薬組成物として用いる場合、アデノシン産生酵素阻害剤を有効成分として含有するものであれば、その剤形は特に限定されない。本発明の医薬組成物は、公知の製剤学的方法により、薬理学上許容される担体を含む、種々の剤形として製剤化することができる。
　医薬組成物の剤型としては、特に制限はなく、例えば、所望の投与方法に応じて適宜選択することができ、例えば、経口固形剤（錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤など）、経口液剤（内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤など）、外用剤（坐剤、軟膏剤、貼付剤、ゲル剤、クリーム剤、外用散剤、スプレー剤、吸入剤など）、注射剤（溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤など）、その他、口腔用剤（ガム剤、トローチ剤、舌下錠、バッカル錠、付着剤など）、口腔用スプレー剤、口腔用半固形剤、歯磨剤、含嗽剤などが挙げられる。
　経口固形剤としては、例えば、アデノシン産生酵素阻害剤に、賦形剤、さらには必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤などの添加剤を加え、常法により製造することができる。
　賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸などが挙げられる。結合剤としては、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖などが挙げられる。滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。着色剤としては、例えば、酸化チタン、酸化鉄などが挙げられる。矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。
　経口液剤としては、例えば、アデノシン産生酵素阻害剤に、矯味・矯臭剤、緩衝剤、安定化剤などの添加剤を加え、常法により製造することができる。
　矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。安定化剤としては、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチンなどが挙げられる。
　坐剤としては、例えば、アデノシン産生酵素阻害剤に、ポリエチレングリコール、ラノリン、カカオ脂、脂肪酸トリグリセリドなどの公知の坐剤製剤用担体と、必要に応じてツイーン（ＴＷＥＥＮ：登録商標）などの界面活性剤などを加えた後、常法により製造することができる。
　軟膏剤としては、例えば、アデノシン産生酵素阻害剤に、公知の基剤、安定剤、湿潤剤、保存剤などを配合し、常法により混合し、製造することができる。
　基剤としては、例えば、流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィンなどが挙げられる。保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピルなどが挙げられる。
　貼付剤としては、例えば、公知の支持体に軟膏剤としてのクリーム剤、ゲル剤、ペースト剤などを、常法により塗布し、製造することができる。支持体としては、例えば、綿、スフ、化学繊維からなる織布、不織布、軟質塩化ビニル、ポリエチレン、ポリウレタンなどのフィルム、発泡体シートなどが挙げられる。
　注射剤としては、例えば、アデノシン産生酵素阻害剤に、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤などを添加し、常法により皮下用、筋肉内用、静脈内用などの注射剤を製造することができる。
　ｐＨ調節剤および緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。局所麻酔剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどが挙げられる。
　口腔内に適用する製剤も、その性状に応じて、公知の製剤学的方法により製剤化することができる。
　本発明の組成物を医薬組成物として用いる場合には、Ｔｈ１７細胞の過剰反応に起因する疾患（好ましくは、好中球性炎症）の治療などに有効な１種もしくは２種以上の他の成分を配合することができる。また、この目的に有効な他の医薬組成物と併用してもよい。
　医薬組成物の投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒトおよび非ヒト動物が挙げられる。非ヒト動物としては、例えば、マウス、ラット、ウシ、ブタ、サル、イヌ、ネコなどが挙げられるが、これらに制限されない。投与方法は、その剤型などに応じて適宜選択することができ、例えば、経口、外用、注射による投与などが挙げられる。投与量は、投与対象の種類、年齢、体重、性別、症状などに応じて適宜選択することができるが、例えば、ヒト成人１日あたり、有効成分であるアデノシン産生酵素阻害剤の量として、例えば、０．０４～５００ｍｇの範囲内で選択される量が好ましいと考えられる。投与頻度としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１日あたりの投与量を、１日に１回で投与してもよいし、複数回に分けて投与してもよい。また、毎日ではなく、例えば、週に１～４回で投与してもよい。
　本発明の組成物を飲食品として用いる場合、当該飲食品は、例えば、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品、病者用食品、あるいは食品添加物でありうる。飲食品の具体例としては、ドリンク類、スープ類、乳飲料、清涼飲料水、茶飲料、アルコール飲料、ゼリー状飲料、機能性飲料などの液状食品；食用油、ドレッシング、マヨネーズ、マーガリンなどの油分を含む製品；飯類、麺類、パン類などの炭水化物含有食品；ハム、ソーセージなどの畜産加工食品；かまぼこ、干物、塩辛などの水産加工食品；漬物などの野菜加工食品；ゼリー、ヨーグルトなどの半固形状食品；みそ、発酵飲料などの発酵食品；洋菓子類、和菓子類、キャンディー類、ガム類、グミ、冷菓、氷菓などの各種菓子類；カレー、あんかけ、中華スープなどのレトルト製品；インスタントスープ、インスタントみそ汁などのインスタント食品や電子レンジ対応食品などが挙げられる。さらには、粉末、穎粒、錠剤、カプセル剤、液状、ペースト状またはゼリー状に調製された健康飲食品も挙げられる。
　本発明における飲食品の製造は、当該技術分野に公知の製造技術により実施することができる。飲食品においては、Ｔｈ１７細胞の過剰反応に起因する疾患（好ましくは、好中球性炎症）に有効な１種もしくは２種以上の成分を配合してもよい。また、この目的の機能を発揮する他の成分あるいは他の機能性食品と組み合わせることによって、多機能性の飲食品としてもよい。
　飲食品の摂取対象としては、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒトおよび非ヒト動物が挙げられる。非ヒト動物としては、例えば、マウス、ラット、ウシ、ブタ、サル、イヌ、ネコなどが挙げられるが、これらに制限されない。摂取量は、摂取対象の種類、年齢、体重、性別、症状などに応じて適宜選択することができるが、例えば、ヒト成人１日あたり、有効成分であるアデノシン産生酵素阻害剤の量として、例えば、０．０４～５００ｍｇの範囲内で選択される量が好ましいと考えられる。摂取頻度は、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１日あたりの摂取量を、１日に１回で摂取してもよいし、複数回に分けて摂取してもよい。また、毎日ではなく、例えば、週に１～４回で摂取してもよい。
　本発明の組成物の製品（医薬組成物、飲食品、試薬、これらを含む器具など）またはその説明書は、例えば、Ｔｈ１７細胞の分化および活性化の抑制に用いられる旨、および／またはＴｈ１７細胞の過剰反応に起因する疾患の治療、改善、または予防に用いられる旨の表示を付したものでありうる。ここで「製品または説明書に表示を付した」とは、製品の本体、容器、包装などに表示を付したこと、あるいは製品の情報を開示する説明書、添付文書、宣伝物、その他の印刷物などに表示を付したことを意味する。
　＜被検化合物の活性評価法＞
　本発明は、被検化合物が、Ｔｈ１７細胞の分化もしくは活性化を抑制する活性またはＴｈ１７細胞の過剰反応に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性を評価する方法を提供する。
　－第一の態様－
　本発明の評価方法の第一の態様は、被検化合物とアデノシン産生酵素との結合を指標とする方法であり、（ａ）被検化合物をアデノシン産生酵素に接触させる工程、および（ｂ）被検化合物とアデノシン産生酵素との結合を検出する工程、を含む。本態様は、主として、後述の態様の評価のための一次的評価法として利用することができる。
　本発明の評価方法の対象とする「被検化合物」としては特に制限はなく、例えば、合成低分子化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、ペプチドライブラリー、ポリヌクレオチドライブラリー、抗体、細菌放出物質、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）の抽出液および培養上清、精製または部分精製ポリペプチド、海洋生物、植物、または動物から採取した抽出物などが挙げられる。被検化合物は、アデノシン産生酵素の立体構造を基にしたｉｎ　ｓｉｌｉｃｏでのデザインを基に合成したものであってもよい。
　本発明の評価方法において使用する「アデノシン産生酵素」は、ヒトＣＤ３９タンパク質の場合は、例えば、配列番号：１～６のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿００１７６７、ＮＰ＿００１０９１６４５、ＮＰ＿００１１５７６５０、ＮＰ＿００１１５７６５１、ＮＰ＿００１１５７６５３、または、ＮＰ＿００１１５７６５４）やその部分ペプチドが挙げられる。ヒトＣＤ７３タンパク質の場合は、例えば、配列番号：７または８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿００１１９１７４２、または、ＮＰ＿００２５１７）やその部分ペプチドが挙げられる。但し、アデノシン産生酵素のアミノ酸配列には、個体差が生じうることを理解されたい。
　アデノシン産生酵素は、前記天然型のタンパク質やその部分ペプチドに加え、必要に応じて、その改変体や修飾体などを用いることができる。例えば、検出や精製を容易にするために、他の蛋白質（例えば、アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）、β－ガラクトシダーゼなどの酵素、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）などの蛍光蛋白質、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）などのタグ）との融合蛋白質を用いることができる。また、アデノシン産生酵素は、細胞表面に発現させた形態で用いることもできる。
　被検化合物とアデノシン産生酵素との「接触」は、当該評価系への被検化合物の添加などにより行うことができる。
　「被検化合物とアデノシン産生酵素との結合の検出」には、公知の手法を適宜採用することができる。例えば、固定したアデノシン産生酵素に、被検化合物を接触させ、アデノシン産生酵素に結合する化合物を同定する方法が挙げられる。被検化合物とアデノシン産生酵素との結合を検出する手段としては、様々な公知の手段を利用することができるが、好適な手段の一例として、表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーが挙げられる。
　被検化合物が合成低分子化合物ライブラリーである場合には、例えば、コンビナトリアルケミストリー技術によるハイスループット法（Ｗｒｉｇｈｔｏｎ　Ｎ．Ｃ．ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２６；２７３（５２７４）４５８－４６４（１９９６）、Ｖｅｒｄｉｎｅ，Ｇ．Ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．３８４：１１－１３（１９９６）、Ｈｏｇａｎ　Ｊ.Ｃ．，Ｊｒ　Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｎａｔｕｒｅ．３８４：１７－１９（１９９６））を利用することができる。
　また、被検化合物がポリヌクレオチドライブラリーである場合には、例えば、インビトロセレクション法を利用することができる（ＳＥＬＥＸ法）（Ｔｕｅｒｋ　Ｃ．　＆　Ｇｏｌｄ　Ｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．３；２４９（４９６８）：５０５－５１０（１９９０）、Ｇｒｅｅｎ　Ｒ．ｅｔ　ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｃｏｍｐａｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．２：７５－８６（１９９１）、Ｇｏｌｄ　Ｌ．ｅｔ　ａｌ．，Ａｎｎｕ　Ｒｅｖ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　６４：７６３－９７（１９９５）、Ｕｐｈｏｆｆ　Ｋ．Ｗ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６：２８１－２８８（１９９６））。
　その他、被検化合物の種類などに応じて、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を利用した方法、免疫沈降法、酵母ツーハイブリッドシステムなどを利用することもできる。
　以上の結果、被検化合物がアデノシン産生酵素と結合する場合、Ｔｈ１７細胞の分化もしくは活性化を抑制する活性またはＴｈ１７細胞の過剰反応に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性があると評価される。
　－第二の態様－
　本発明の評価方法の第二の態様は、被検化合物によるアデノシン産生酵素の基質とアデノシン産生酵素との結合の阻害を指標とする方法であり、（ａ）被検化合物の存在下で、アデノシン産生酵素の基質をアデノシン産生酵素に接触させる工程、および（ｂ）アデノシン産生酵素の基質とアデノシン産生酵素との結合を検出する工程、を含む。
　「アデノシン産生酵素の基質」としては、アデノシン産生酵素がＣＤ３９である場合には、例えば、ＡＴＰ、ＡＤＰが挙げられ、アデノシン産生酵素がＣＤ７３である場合には、例えば、ＡＭＰが挙げられる。この評価方法においては、例えば、固定したアデノシン産生酵素や細胞表面に発現させたアデノシン産生酵素と、放射性物質や蛍光物質などの標識を行った基質との結合を、被検化合物が阻害するか否かを、当該標識を指標に検出すればよい。
　以上の結果、被検化合物がアデノシン産生酵素の基質とアデノシン産生酵素との結合を阻害する場合、Ｔｈ１７細胞の分化もしくは活性化を抑制する活性またはＴｈ１７細胞の過剰反応に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性があると評価される。
　－第三の態様－
　本発明の評価方法の第三の態様は、被検化合物によるアデノシン産生酵素の酵素活性の抑制を指標とする方法であり、（ａ）被検化合物をアデノシン産生酵素に接触させる工程、および（ｂ）アデノシン産生酵素の酵素活性を検出する工程、
を含む。
　本発明の評価方法の指標となるアデノシン産生酵素の酵素活性は、各基質の存在下、各酵素が触媒する反応によって得られる生成物（ＣＤ３９であればＡＭＰ、ＣＤ７３であればアデノシン）の量を、公知の手法（例えば、液体クロマトグラフィー質量分析法）にて測定することによって検出することができる。また、かかる酵素活性には、前述のＡＭＰまたはアデノシン生成能のみならず、生成されたアデノシンなどによって誘導されるシグナル伝達において生じる様々な事象も挙げられる。このようなシグナル伝達としては、例えば、ｃＡＭＰの上昇、ＰＫＡの活性化などが挙げられるが、これらに制限されない。これら活性の測定方法は公知であり、通常の方法や測定キットを用いて測定すればよい。
　以上の結果、被検化合物を接触させない場合と比較して、被検化合物がアデノシン産生酵素の活性を低下させる場合、Ｔｈ１７細胞の分化もしくは活性化を抑制する活性、またはＴｈ１７細胞の過剰反応に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性があると評価される。
　以上、本発明の評価方法について説明したが、複数の被検化合物に対して、本発明の評価方法を実施して、上記のアデノシン産生酵素への結合、アデノシン産生酵素の基質とアデノシン産生酵素との結合の阻害、あるいはアデノシン産生酵素の酵素活性の抑制を指標に化合物を選択すれば、Ｔｈ１７細胞の分化もしくは活性化を抑制する活性またはＴｈ１７細胞の過剰反応に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する化合物をスクリーニングすることができる。従って、本発明は、このようなスクリーニング方法をも提供する。
　本発明の評価方法やスクリーニング方法によって同定された化合物については、実際に、Ｔｈ１７細胞の分化もしくは活性化を抑制するか否か、Ｔｈ１７細胞の過剰反応に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有するか否かを検証することが好ましい。Ｔｈ１７細胞の分化や活性化の抑制は、例えば、本実施例に記載の通り、２ウェイＭＬＲなどを利用して、Ｔｈ１７サイトカインであるＩＬ－１７Ａなどの産生が抑制されるか否かにより評価することができる。また、Ｔｈ１７細胞の過剰反応に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性は、本実施例において、アトピー性皮膚炎を例に示したように、Ｔｈ１７細胞の過剰反応に起因する疾患に関するモデル動物実験において評価することができる。さらに、臨床試験において、実際にヒトにおける効果を評価することができる。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、各実施例における統計学的解析は、２群間の差はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用して分析した。３群以上の差は、一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ，ｏｎｅ－ｗａｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｖａｒｉａｎｃｅ）で、ｐ値（確率値，ｐ　ｖａｌｕｅ）が０．０５以下を有意差ありとし、ｏｎｅ－ｗａｙ　ＡＮＯＶＡで有意差ありと判定された場合は、さらにＴｕｒｋｅｙ検定（Ｔｕｒｋｅｙ　ｈｏｎｅｓｔｌｙ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）を行って２群間の有意差を分析した。各コントロールと比較して、Ｐ値が０．０５以下の群には＊印、０．０１以下の群には＊＊印を付加した。分析にはＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈソフトウェアを使用した。Ｐ値＜０．０５を統計的に有意であると見做した。
　（実施例１）　２ウェイＭＬＲにおける、ＣＤ３９阻害剤及び／又はＣＤ７３阻害剤の効果
　脾臓細胞を調製するために、Ｆｉｃｏｌｌ液を用いて単核球を分離した。具体的には、８～１０週齢のメスのＨ－２の異なるＢＡＬＢ／ｃとＳＪＬ／Ｊマウスから脾臓を取り出し、その脾臓をホモジナイザー（ＧＰＥ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，テンブロック型ホモジナイザー，Ｐｅｓｔｌｅの直径：１５ｍｍ）に加えて、５ｍＬのＤＭＥＭを加えた後、５回転させてホモジナイズした。さらに５ｍＬのＤＭＥＭを加えて、総量１０ｍＬの脾臓細胞溶液を５０ｍＬチューブに移した。次いで、７ｍＬのＦｉｃｏｌｌ（Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ　ｐｒｅｍｉｕｍ　１．０８４，ＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、脾臓細胞溶液の入った５０ｍＬチューブの下端にピペッターを用いて、脾臓細胞溶液とＦｉｃｏｌｌの界面を乱さない様に静かに加え、室温で３０分１，５００ｒ．ｐ．ｍ．（４３０ｘｇ）で遠心した。遠心後、５０ｍＬチューブの下端から１ｃｍ離れた上部から、５０ｍＬチューブの中央付近のＦｉｃｏｌとＤＭＥＭの境界付近に白いバンドとして出現する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）の層までをパスツールピペットで回収し、その回収画分を新しい５０ｍＬチューブに移した。この回収画分に、合計４０ｍＬになるようにＤＭＥＭを加えて懸濁し、再び、室温で１０分１，５００ｒ．ｐ．ｍ．（４３０ｘｇ）で遠心した。遠心後、下端から２ｃｍを残して上清をアスピレーターで吸引し、懸濁して１５ｍＬチューブに移した。合計１２ｍＬになるようにＤＭＥＭを加え、室温で１０分１，５００ｒ．ｐ．ｍ．（４３０ｘｇ）で遠心した。遠心後、細胞ペレットを２ｍＬのＤ１０培地で懸濁し、チュルク溶液に調製した細胞の一部を加えて、ビュルケルチュルク血球計算版を用いて単核球の細胞数を算出した。算出した後、調製した単核球にＤ１０培地（ＤＭＥＭに、最終濃度が１０％　ＦＣＳ、０．１ｍｇ／ｍＬ　ストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍＬ　ペニシリン、１ｍＭ　ピルビン酸ナトリウム、５０μＭ　２－メルカプトエタノールとなるように各々加えた培地）を加えて、各３×１０６細胞／ｍＬになるよう調製した。
　そして、２ウェイＭＬＲ反応を誘導するために、このようにして調製したＨ－２の異なる、ＢＡＬＢ／ｃ由来の単核球、および、ＳＪＬ／Ｊ由来の単核球を１ｍＬずつ１２穴プレートで混合した（全体：６×１０６細胞／２ｍＬ）。次いで、ＡＴＰを最終濃度が１００μＭになるよう加えた後、ＣＤ３９阻害剤（ＡＲＬ６７１５６　三ナトリウム塩（ＴＯＣＲＩＳ））、及び／又は、ＣＤ７３阻害剤（アデノシン５’－（α，β－メチレン）二リン酸（ＡＭＰ－ＣＰ）ナトリウム塩（ＴＯＣＲＩＳ））を、最終濃度が各々０．１または１μＭになるように加え、共培養した。培養開始から７日後に培養上清を回収し、培養上清に含まれるＩＬ－１７Ａの濃度を、ＥＬＩＳＡ法にて定量した。なお、ＥＬＩＳＡ法は、Ｄｕｏ　ｓｅｔ　ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、その添付のマニュアルに従って行なった。
　その結果、図１に示すとおり、ＡＴＰを単核球に添加することによって、ＩＬ－１７Ａの産生が誘導されることが明らかになった。さらに、ＡＴＰによって誘導されたＩＬ－１７Ａの産生は、ＡＲＬ６７１５６及び／又はＡＭＰ－ＣＰを添加することによって、これらアデノシン産生酵素阻害剤の濃度依存的に抑制されることも明らかになった。
　（実施例２）　アトピー性皮膚炎モデルマウスにおける、ＣＤ３９阻害剤またはＣＤ７３阻害剤の効果
　ＮＣ／Ｎｇａマウスの背部をバリカンで剃毛し、２％　２，４，６－トリニトロクロロベンゼン（ＴＮＣＢ）（エタノールとアセトンを４：１に混合した液体にＴＮＣＢを溶解したもの）を１５０μＬ滴下することにより、アトピー性皮膚炎モデルマウスを調製した。
　ＣＤ３９阻害剤（ＡＲＬ６７１５６　三ナトリウム塩（ＴＯＣＲＩＳ））、または、ＣＤ７３阻害剤（アデノシン５’－（α，β－メチレン）二リン酸（ＡＭＰ－ＣＰ）ナトリウム塩（ＴＯＣＲＩＳ））を、１％の濃度になるようにワセリンに混合してクリームを調製した。そして、各クリームを、アトピー性皮膚炎モデルマウスの背部に塗布し、その病態変化を観察した。また、観察された病態をスコア化し（病態の項目およびスコアは、表１の欄外に示す）、各阻害剤による効果を評価した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　その結果、図２Ａに示すとおり、開始から１０日目において、誘導群と比較してクリーム塗布群で有意な病態抑制が観察された。また、表１および図２Ｂに示すとおり、皮膚炎スコアにおいても、クリーム塗布群は、誘導群に対し、統計学上有意な抑制効果を示した。
　（実施例３）　好中球性気道炎症モデルマウスにおける、ＣＤ３９阻害剤またはＣＤ７３阻害剤の効果
　図３Ａに示すプロトコールに沿って、好中球性気道炎症モデルを作製し、その肺リンパ球のＩＬ－１７Ａ産生に対する、ＣＤ３９阻害剤またはＣＤ７３阻害剤の抑制効果を、以下のようにして評価した。
　先ず、好中球性気道炎症モデルを作製するため、ニワトリのオボアルブミン（ＯＶＡ）特異的ＴＣＲを発現するトランスジェニックマウスであるＤＯ１１．１０マウスに、後述の肺リンパ球採取より１０日前から（Ｄａｙ　－１０，－８，－６，－４，－２，および－１）において、１００μＬの超純水、ＣＤ３９阻害剤（ＡＲＬ６７１５６　三ナトリウム塩（ＴＯＣＲＩＳ））　１００μＬ（５ｍｇ／ｍＬ　Ｈ２Ｏ）、またはＣＤ７３阻害剤（アデノシン５’－（α，β－メチレン）二リン酸（ＡＭＰ－ＣＰ）ナトリウム塩（ＴＯＣＲＩＳ））　１００μＬ（５ｍｇ／ｍＬ　Ｈ２Ｏ）を胃ゾンデで経口投与した。
　Ｄａｙ　－８において、ＯＶＡに対する獲得免疫を誘導する目的で、ＯＶＡタンパク質を前記トランスジェニックマウスに注射した。具体的には先ず、ＯＶＡタンパク質（Ｓｉｇｍａ）を、カルシウムおよびマグネシウム不含有ＰＢＳ（ＰＢＳ（－））に溶解し、２ｍｇ／ｍＬ　ＯＶＡ　ｉｎ　ＰＢＳ（－）を調製した。次いで、このＯＶＡ溶液と完全フロイントアジュバント（ＤＩＦＣＯ，ａｄｊｕｖａｎｔ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｆｒｅｕｎｄ，Ｈ３７　Ｒａ）とを、等しい体積にて混和し（例えば、５００μＬのＯＶＡ溶液と５００μＬの完全フロイントアジュバントを混和させた）、２つの２ｍＬのシリンジ（Ｉｎｊｅｃｔ，Ｂ．Ｂｒａｕｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ）をシリンジコネクター（ＧＰ　Ｓｙｒｉｎｇｅ　Ｃｏｎｎｅｃｔａ，Ｎｉｐｒｏ）で繋ぎ、ｔｗｏ－ｓｙｒｉｎｇｅ法で乳化させた。乳化した１００μＬ（ＯＶＡとして１００μｇ）のＯＶＡ溶解完全フロイントアジュバントをＤＯ１１．１０マウスの鼠径部に皮下注射した。
　Ｄａｙ　－１（皮下注射７日後）に、ＯＶＡに対する獲得免疫を再活性化させる目的で、０．５ｇ　ＯＶＡを溶解した１０ｍＬ　ＰＢＳ（－）をネブライザーで霧化し、２０分間ＤＯ１１．１０マウスに吸入させた。
　Ｄａｙ　０において、マウスを頚椎脱臼した後、肺リンパ球を採取した。具体的には、マウスの肺を、６ｃｍディッシュに移し、はさみを用いて細かくし、Ｄ１０培地　１０ｍＬを加え、３７℃で１時間インキュベートした。なお、ここでのＤ１０培地には、上述の組成に加え、１０％　ＦＣＳ、０．１ｍｇ／ｍＬ　ストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍＬ　ペニシリン、１ｍＭ　ピルビン酸ナトリウムおよび５０μＭ　２－メルカプトエタノールを添加して用いた（各添加物の濃度はいずれも最終濃度）。
　インキュベートした後、肺組織断片を含む培地を、５０ｍＬチューブを接続したセルストレーナー（ＦＡＬＣＯＮ、４０μｍ　ｍｅｓｈ）で濾過し、セルストレーナーに残存している、肺組織断片をセルスクレイパー（ＩＷＡＫＩ）を用いてセルストレーナー上で擦り潰し、肺組織を擦り潰したセルストレーナーに１０ｍＬのＤＭＥＭを通過させて共洗いした。共洗いした後、５０ｍＬチューブに回収した肺細胞を含む総量２０ｍＬの溶液を、室温、１，２００ｒ．ｐ．ｍ．（２７０×ｇ）で５分間遠心分離した。そして、上清を除いた後、ペレットをほぐし、１０ｍＬのＤＭＥＭで懸濁し、室温、１，２００ｒ．ｐ．ｍ．（２７０×ｇ）で５分間遠心分離した。上清を除いた後、ペレットをほぐし、１０ｍＬのＤＭＥＭで懸濁して、新しい１５ｍＬチューブに移し、再び室温、１，２００ｒ．ｐ．ｍ．（２７０×ｇ）で５分間遠心分離した。上清を除いて、最後に、５０μｇ／ｍＬ　ゲンタマイシンおよび１μｇ／ｍＬ　アンホテリシンを加えたＤ１０培地（Ｄ１０＋ゲンタマイシン＋アンホテリシン培地）　５００μＬで懸濁し、チュルク溶液に調製した細胞の一部を加えて、ビュルケルチュルク血球計算版を用いて単核球の細胞数を算出した。
　算出した後、調製した単核球にＤ１０＋ゲンタマイシン＋アンホテリシン培地を加えて、１×１０６ｃｅｌｌｓ／２００μＬずつ丸底９６穴プレートに播種した。Ｄａｙ　１，２，３，および４（培養開始から１～４日後）において細胞上清を回収した。そして、回収した細胞上清に含まれるＩＬ－１７Ａの濃度をＥＬＩＳＡ法で定量した。なお、ＥＬＩＳＡ法は、Ｄｕｏ　ｓｅｔ　ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、その添付のマニュアルに従って行なった。
　その結果、図３Ｂおよび３Ｃに示すとおり、各薬剤投与群では、超純水を投与したコントロール群と比較して、ＩＬ－１７Ａ産生が抑制された。このことからＣＤ３９阻害剤またはＣＤ７３阻害剤の投与によって、好中球性気道炎症が抑制されることが示唆された。
　（実施例４）　乾癬モデルマウスにおける、ＣＤ３９阻害薬またはＣＤ７３阻害薬の効果
　Ｃ５７ＢＬ／６マウスの耳介に、イミキモドクリーム（ＩＭＱ、製品名：ベセルナ（登録商標）クリーム５％）１２．５ｍｇを塗布し、さらに、水、ＣＤ３９阻害剤、またはＣＤ７３阻害剤（１０ｍＭ、３０μＬ／日）をマウスの耳介に毎日滴下し、その肥厚を観察した。なお、陰性対照として、イミキモドクリームの代わりにワセリンを塗布した群も調製した。
　その結果、図４に示すとおり、イミキモドクリームおよび各種薬剤等の添加開始から９日目において、ＣＤ３９阻害剤滴下群およびＣＤ７３阻害剤滴下群では、水を滴下したコントロール群と比較して耳介の肥厚が有意に抑制された。このことからＣＤ３９阻害薬またはＣＤ７３阻害薬の投与によって、乾癬の病態が抑制されることが示唆された。
　本発明は、Ｔｈ１７細胞の過剰反応に起因する疾患の治療などに有用であり、主として、医療分野に貢献するものである。また、本発明は、Ｔｈ１７細胞の分化や活性化の調節を行う基礎研究においても貢献するものである。

Claims (4)

  1. 　Ｔｈ１７細胞の分化もしくは活性化の抑制またはＴｈ１７細胞の過剰反応に起因する疾患の治療、改善、もしくは予防のための組成物であって、アデノシン産生酵素の酵素活性を阻害する化合物を有効成分として含有する組成物。
  2. 　被検化合物が、Ｔｈ１７細胞の分化もしくは活性化を抑制する活性またはＴｈ１７細胞の過剰反応に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性を評価する方法であって、
    　（ａ）被検化合物をアデノシン産生酵素に接触させる工程、および
    　（ｂ）被検化合物とアデノシン産生酵素との結合を検出する工程、
    を含み、
    　被検化合物がアデノシン産生酵素と結合する場合、Ｔｈ１７細胞の分化もしくは活性化を抑制する活性またはＴｈ１７細胞の過剰反応に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性があると評価される方法。
  3. 　被検化合物が、Ｔｈ１７細胞の分化もしくは活性化を抑制する活性またはＴｈ１７細胞の過剰反応に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性を評価する方法であって、
    　（ａ）被検化合物の存在下で、アデノシン産生酵素の基質をアデノシン産生酵素に接触させる工程、および
    　（ｂ）アデノシン産生酵素の基質とアデノシン産生酵素との結合を検出する工程、
    を含み、
    　被検化合物がアデノシン産生酵素の基質とアデノシン産生酵素との結合を阻害する場合、Ｔｈ１７細胞の分化もしくは活性化を抑制する活性またはＴｈ１７細胞の過剰反応に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性があると評価される方法。
  4. 　被検化合物が、Ｔｈ１７細胞の分化もしくは活性化を抑制する活性またはＴｈ１７細胞の過剰反応に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性を評価する方法であって、
    　（ａ）被検化合物をアデノシン産生酵素に接触させる工程、および
    　（ｂ）アデノシン産生酵素の酵素活性を検出する工程、
    を含み、
    　被検化合物を接触させない場合と比較して、被検化合物がアデノシン産生酵素の酵素活性を低下させる場合、Ｔｈ１７細胞の分化もしくは活性化を抑制する活性またはＴｈ１７細胞の過剰反応に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性があると評価される方法。
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