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WO2021193763A1 - ヒトｉｖ型コラーゲン７ｓドメインを含む断片の測定方法及びこれに用いるためのキット - Google Patents

ヒトｉｖ型コラーゲン７ｓドメインを含む断片の測定方法及びこれに用いるためのキット Download PDF

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WO2021193763A1
WO2021193763A1 PCT/JP2021/012389 JP2021012389W WO2021193763A1 WO 2021193763 A1 WO2021193763 A1 WO 2021193763A1 JP 2021012389 W JP2021012389 W JP 2021012389W WO 2021193763 A1 WO2021193763 A1 WO 2021193763A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
collagen
domain
antibody
type
monoclonal antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2021/012389
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
典子 ▲片▼桐
慎太郎 八木
克己 青柳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fujirebio Inc
Original Assignee
Fujirebio Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fujirebio Inc filed Critical Fujirebio Inc
Priority to EP21776675.7A priority Critical patent/EP4130740A4/en
Priority to CN202180020619.7A priority patent/CN115280146B/zh
Priority to US17/913,363 priority patent/US20230296594A1/en
Priority to JP2022510627A priority patent/JP7680425B2/ja
Publication of WO2021193763A1 publication Critical patent/WO2021193763A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/08—Hepato-biliairy disorders other than hepatitis
    • G01N2800/085—Liver diseases, e.g. portal hypertension, fibrosis, cirrhosis, bilirubin

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring a fragment containing a human type IV collagen 7S domain in a sample and a kit for use thereof.
  • Type IV collagen is a major protein that constitutes the basement membrane together with laminin, and has a trimer having a helical structure consisting of three ⁇ chains as a structural unit. Although the subunits constituting the trimer differ depending on the tissue, in many tissues including the liver, the trimer is composed of two ⁇ 1 chains and one ⁇ 2 chain.
  • the type IV collagen molecule has a structure peculiar to the type IV collagen molecule at both ends of the TH domain (Triple Helical collagenous domain) forming the spiral structure, the N-terminal structure is the 7S domain, and the C-terminal structure is NC1. It is called a domain (Non-collagen domain).
  • the C-terminal NC1 domain forms a dimer with the NC1 domain of another type IV collagen molecule
  • the N-terminal 7S domain forms a tetramer with the 7S domain of another type IV collagen molecule. All of these multimers are tightly bound by covalent bonds, and by polymerization of these, the type IV collagen molecule forms a network structure (Chicken-wire network).
  • liver fibrosis gradually develops due to prolonged chronic hepatitis B and C viral and chronic alcoholic hepatitis, and progressive non-alcoholic steatohepatitis (NASH). It progresses to liver cirrhosis and liver cancer, and it is known that type IV collagen increases at that time. Since the amount of type IV collagen leaking from the basement membrane into the blood increases with the progress of such liver fibrosis, the blood concentration of the component derived from the type IV collagen molecule is an indicator of the progress of liver fibrosis. Become.
  • the 7S domain which is strongly bound by covalent bonds, is considered to be less susceptible to proteolytic enzymes and stable in blood, and is used for diagnosing the degree of progression (severity) of liver fibrosis and liver cirrhosis. It is used as a biomarker.
  • Type IV Collagen 7S Kit (manufactured by DENIS Pharma Co., Ltd.)" which is a diagnostic agent using radioimmunoassay (RIA), is available.
  • the type IV collagen 7S kit is a reagent using an anti-human type IV collagen rabbit polyclonal antibody.
  • Patent Document 1 a monoclonal antibody that cross-reacts with a pepsin-solubilized human type IV collagen 7S domain is used as an enzyme-labeled antibody, and a monoclonal antibody that reacts only with the human type IV collagen 7S domain is used.
  • the type IV collagen 7S kit uses a polyclonal antibody against human type IV collagen and is based on the principle of inhibition of binding competition, the measurement accuracy is still insufficient.
  • the present inventors have found that there is a problem that the measured value in a sample derived from a healthy person becomes high and the false positive rate becomes high, which makes it unsuitable for screening and differentiation of patients in the early stage of liver fibrosis. ..
  • the present inventors have a problem that these conventional methods are likely to reduce the measurement accuracy due to being easily affected by sites other than the 7S domain of type IV collagen contained in the sample and other components. Found.
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned problems newly discovered by the present inventors, and the sample derived from a healthy person (negative sample) without reducing the specificity for the sample derived from the patient (positive sample). ), And a measurement method capable of measuring a fragment containing a human type IV collagen 7S domain in a sample with high accuracy, and a kit for use thereof.
  • the purpose a measurement method capable of measuring a fragment containing a human type IV collagen 7S domain in a sample with high accuracy, and a kit for use thereof.
  • the present inventors conducted a sandwich immunoassay combining a monoclonal antibody capable of site-specific binding to the human type IV collagen 7S domain, and obtained a sample derived from a patient (positive).
  • the measured value of the sample (negative sample) derived from a healthy person can be sufficiently lowered without lowering the measured value of the sample), and the measurement is higher than before, especially in the low concentration range of the fragment containing the human IV type collagen 7S domain.
  • accuracy can be achieved.
  • the type IV collagen fragment containing the 7S domain any form of collagen fragment can be comprehensively measured, and further, substances other than the substances present in the sample and the 7S domain of type IV collagen can be measured.
  • the labeled antibody is brought into contact with a fragment containing the human type IV collagen 7S domain captured by the capture antibody, and the fragment containing the human type IV collagen 7S domain captured by the capture antibody is labeled.
  • the present invention it is possible to reduce the non-specificity for a sample derived from a healthy person (negative sample) without reducing the specificity for a sample derived from a patient (positive sample), and in the sample with high accuracy. It is possible to provide a measuring method capable of measuring a fragment containing the human type IV collagen 7S domain, and a kit for use thereof.
  • the amount of light emitted from each fraction of the sample LC58 (a), the amount of light emitted from each fraction of the type IV collagen 7S fragment (b), It is a graph which shows. It is a graph which shows the light emission amount of each fraction of the sample LC51 when the CIV09 antibody-immobilized magnetic particle or the CIV03 antibody-immobilized magnetic particle is used. It is a graph which shows the quantitative value (pool recovery value) of each pool of pools 1 to 6 of FIG.
  • the present invention comprises a capture antibody in which a first monoclonal antibody that can specifically bind to the human type IV collagen 7S domain is immobilized on a carrier, and a second monoclonal antibody that can specifically bind to the human type IV collagen 7S domain.
  • a method for measuring a fragment containing a human type IV collagen 7S domain which measures a fragment containing a human type IV collagen 7S domain in a sample by a sandwich immunoassay using a labeled antibody formed by binding the antibody to a labeling substance (a method for measuring a fragment containing a human type IV collagen 7S domain).
  • the measuring method of the present invention simply referred to as "the measuring method of the present invention" will be provided.
  • the "sample” is not particularly limited as long as it is a sample in which a fragment containing the human type IV collagen 7S domain can exist.
  • a blood sample collected from a diagnosis target human
  • examples of the blood sample include serum, plasma, and whole blood, preferably serum or plasma, and more preferably serum. be.
  • the sample may be appropriately diluted or suspended with the following diluted solution or pretreated, if necessary. Examples of the pretreatment include collagenase treatment.
  • fragments of various aspects of the human type IV collagen molecule may be present as components derived from the human type IV collagen molecule.
  • examples of such fragments include, for example, a fragment consisting of a 7S domain that does not contain the TH domain and the NC1 domain (hereinafter, sometimes referred to as “type IV collagen 7S fragment”); TH that does not contain the NC1 domain and the 7S domain.
  • the "7S domain” includes both a 7S domain that does not form a multimer and a 7S domain that forms a dimer to a tetramer
  • the "TH domain” has a spiral structure. Both the TH domain that does not form and the TH domain that forms the spiral structure are included, and the "NC1 domain” includes an NC1 domain that does not form a multimer and an NC1 domain that forms a dimer. Both are included.
  • the "IV-type collagen 7S fragment” is a degradation product obtained by further collagenase-treating a pepsin-solubilized type IV collagen fragment, which is preferably composed of a tetramer of the 7S domain and solubilized by pepsin digestion.
  • Gel filtration fraction of molecular weight corresponding to the tetramer of human type IV collagen 7S domain more specifically, molecular weight of 200,000 (or mass of 200 kDa) or more and around 400,000 (for example, 300 kDa). It shows a fragment contained in a gel filtration fraction of ⁇ 440 kDa) or a fragment of human type IV collagen containing a 7S domain having a molecular weight equivalent thereto.
  • the time of the collagenase treatment varies depending on the concentration of collagenase to be added, but is preferably, for example, 30 minutes to 14 hours, and the treatment temperature is preferably 30 to 37 ° C.
  • the "pepsin-solubilized type IV collagen fragment” is a human type IV collagen fragment solubilized by pepsin digestion, and is composed of a fragment consisting of a 7S domain (type IV collagen 7S fragment) and a TH domain. A mixture containing two or more of a fragment, a fragment consisting of NC1 domains, and a fragment containing two or more of each of these domains in whole or in part is shown.
  • the pepsin-solubilized type IV collagen fragment can be appropriately obtained by a conventionally known method. For example, it can be obtained by treating an extract containing a human type IV collagen molecule from a human placenta with pepsin, and may be commercially available.
  • the "fragment containing the human IV collagen 7S domain" to be measured may be a fragment of human IV collagen containing the 7S domain.
  • the molecular weight is large and the 7S domain may not be sufficiently exposed. Even if a sexual fragment is contained, any of them can be measured, and a fragment containing a human type IV collagen 7S domain can be measured with higher accuracy than before.
  • a first monoclonal antibody capable of specifically binding to a human type IV collagen 7S domain and "a second monoclonal antibody capable of specifically binding to a human type IV collagen 7S domain” (hereinafter, in some cases). These are collectively referred to as "anti-7S domain antibody”), which is a monoclonal antibody capable of specifically recognizing and binding only the human type IV collagen 7S domain. That is, the anti-7S domain antibody does not bind to a site other than the 7S domain of human type IV collagen.
  • the fact that the antibody is the anti-7S domain antibody means that, for example, the type IV collagen 7S fragment can be specifically recognized and bound; or, in the gel filtration fraction of the sample, the human type IV collagen 7S domain.
  • Type IV collagen fragment eg, pepsin solubilized by pepsin treatment
  • Type IV collagen fragment that can bind to the molecule contained in the fraction corresponding to the molecular weight of (preferably tetramer) and contains the TH domain and NC1 domain. It can be confirmed that it can bind not only to the type IV collagen fragment) but also to the type IV collagen 7S fragment;
  • the "antibody” in the present invention includes a complete antibody, an antibody fragment (for example, Fab, Fab', F (ab') 2 , Fv, a single chain antibody, a diabody, etc.) and a variable region of the antibody. Bound low molecular weight antibodies are also included.
  • the anti-7S domain antibody according to the present invention can be produced by appropriately adopting and improving a conventionally known method.
  • a method for producing a monoclonal antibody by a cell (hybridoma) in which an antibody-producing cell and a myeloma cell are fused Typically, it can be produced by the method by Koehler & Milstein (Kohler & Milstein, Nature, 256: 495, 1975)).
  • antibody-producing cells examples include spleen cells, lymph node cells, and peripheral blood leukocytes of immunogen-immunized animals (eg, mice, rats, hamsters, rabbits, monkeys, goats, sheep, donkeys, camels, alpaca, and chickens). And the like, antibody-producing cells obtained by allowing an immunogen to act on the above-mentioned cells or lymphocytes previously isolated from an immunized animal in a medium can also be used.
  • immunogen-immunized animals eg, mice, rats, hamsters, rabbits, monkeys, goats, sheep, donkeys, camels, alpaca, and chickens.
  • the immunogen is not particularly limited as long as it is a fragment containing the human type IV collagen 7S domain, and for example, the type IV collagen 7S fragment, the pepsin solubilized type IV collagen fragment, and the pepsin solubilized.
  • examples thereof include fragments obtained by partially digesting type IV collagen with collagenase (corresponding to “collagenase partially digested type IV collagen fragment” in the example).
  • the myeloma cell various known cell lines can be used.
  • the antibody-producing cells and the myeloma cells may be of different animal species origin as long as they can be fused, but are preferably of the same animal species origin.
  • the hybridoma is obtained, for example, by cell fusion between spleen cells obtained from a mouse immunized with the immunogen and mouse myeloma cells. From among the many hybridomas obtained, a hybridoma that produces a monoclonal antibody that exhibits high reactivity with the type IV collagen 7S fragment is screened, and if necessary, a selected hybridoma is further produced. Monoclonal antibody that can specifically bind to the human type IV collagen 7S domain (anti-7S domain) by identifying the clone that produces the monoclonal antibody that binds to the type IV collagen 7S fragment by performing an epitope analysis of the monoclonal antibody. A hybridoma that produces an antibody) can be obtained. Such a monoclonal antibody can be obtained by culturing the hybridoma or from the ascites of a mammal to which the hybridoma has been administered.
  • the anti-7S domain antibody for example, if the DNA encoding the antibody can be obtained, it can be produced by the recombinant DNA method.
  • DNA encoding the antibody is cloned from a hybridoma, the antibody-producing cell, or the like, incorporated into an appropriate vector, and this is incorporated into a host cell (for example, mammalian cell line, Escherichia coli, yeast cell, insect cell). , Plant cells, etc.) and produced as a recombinant antibody (for example, PJ Delves, Antibodies Production: Essential Technologies, 1997, WILEY; P. Shepherd and C. Dean Monoclonial Antibi.
  • the DNA encoding the heavy chain or the light chain may be separately incorporated into the expression vector to transform the host cell, and the DNA encoding the heavy chain and the light chain may be single.
  • the host cell may be transformed by incorporating it into an expression vector of (eg, the method described in WO 94/11523).
  • the recombinant antibody can be obtained in a substantially pure and uniform form by culturing the host cell and separating / purifying it in the cultured host cell or from the culture solution.
  • the method used in the usual purification of a polypeptide can be used.
  • a transgenic animal for example, cow, goat, sheep, pig, etc.
  • a monoclonal antibody derived from the antibody gene is produced from the milk of the transgenic animal. It is also possible to obtain a large amount of.
  • the first monoclonal antibody and the second monoclonal antibody may be the same or different from each other.
  • the human type IV collagen 7S domain usually forms a dimer to a tetramer (preferably a tetramer) in the blood sample, so that the first monoclonal antibody is used.
  • the second monoclonal antibody is the same type of antibody that recognizes and binds to the same site, each of them can bind to the human type IV collagen 7S domain of any of the multimers.
  • Capture antibody In the measurement method of the present invention, as a capture antibody that captures the fragment containing the human type IV collagen 7S domain, a capture antibody in which the first monoclonal antibody is immobilized on a carrier is used.
  • the "carrier” is not particularly limited as long as it can immobilize and support the first monoclonal antibody.
  • the material of such a carrier is not particularly limited as long as it is generally used for immunoassay, and is, for example, a high molecular polymer (for example, polystyrene, (meth) acrylic acid ester, polymethylmethacrylate, polyimide, nylon). Etc.), gelatin, cellulose, nitrocellulose, glass, latex, silica, metals (eg, gold, platinum, iron, cobalt, nickel, etc.), metal compounds (eg, iron oxide, cobalt oxide, nickel ferrite, etc.), and these. Examples include composite materials and alloys.
  • the carrier examples include a carboxy group, an epoxy group, a tosyl group, an amino group, a hydroxy group, an isothiocyanate group, an isocyanate group, an azido group, an aldehyde group, a carbonate group, an allyl group, an aminooxy group and a maleimide group. It may be surface-modified with one or more active groups of a thiol group and an NHS ester (N-hydroxy ester) group.
  • the shape of the carrier is not particularly limited and may be any of plates, fibers, membranes, particles and the like, but the density of the first monoclonal antibody to be immobilized can be easily controlled. From the viewpoint that it tends to be uniform, particles are preferable. Further, the particles are preferably magnetic particles from the viewpoint of automation and shortening of time.
  • the carrier is a particle
  • its size is not particularly limited, but the particle size is preferably in the range of 0.01 to 100 ⁇ m, and more preferably in the range of 0.1 to 10 ⁇ m. ..
  • the particle size of the particles is less than the lower limit, more magnetism and time are required for magnetism in the case of magnetic particles, while when the particle size exceeds the upper limit, the specific surface area of the particles is small. Therefore, the amount of binding to the particles of the first monoclonal antibody tends to decrease.
  • conventionally known particles can be appropriately used, for example, known particles such as magnetic particles (ferrite-coated particles, carboxylated ferrite particles) described in JP-A-3-115862, and dyna.
  • known particles such as magnetic particles (ferrite-coated particles, carboxylated ferrite particles) described in JP-A-3-115862, and dyna.
  • Commercially available particles such as beads (manufactured by Thermo Fisher Co., Ltd.), Magnosphere (manufactured by JSR Corporation), and Magrapid (manufactured by Sanyo Kasei Kogyo Co., Ltd.) can be appropriately used.
  • the particles one of these particles may be used alone or in combination of two or more.
  • a method for producing the capture antibody according to the present invention as a method for immobilizing the first monoclonal antibody on the carrier, a conventionally known method or a method similar thereto can be appropriately adopted, and the method is directly applied to the surface of the carrier. It may be fixed to or indirectly.
  • a method of directly binding for example, the active group is imparted to the carrier, or a carrier having these active groups is used, and the first monoclonal antibody is bound by covalent bonding with the active group. There is a way to do it.
  • a substance that binds to the first monoclonal antibody is immobilized on the surface of the carrier, and the first monoclonal antibody is bound to the substance, whereby the first monoclonal antibody is attached to the carrier. It can be indirectly fixed to the surface.
  • the substance that binds to the first monoclonal antibody is not particularly limited, and examples thereof include a secondary antibody capable of binding to the first monoclonal antibody, protein G, protein A, and a linker such as a linker molecule having the active group. Be done.
  • the carrier is avidinated (or streptavidinized) or biotinylated to biotin and avidin (or streptavidin). ) May fix the antibody.
  • the first monoclonal antibody is directly or indirectly immobilized on the carrier from the first monoclonal antibody and the carrier capable of binding to the first monoclonal antibody in advance.
  • the capture antibody may be produced and then subjected to the sandwich immunoassay.
  • the first monoclonal antibody and the carrier capable of binding to the first monoclonal antibody are separately provided in the reaction system of the sandwich immunoassay, and the antibody is used in the reaction system.
  • Examples of the combination of the "first monoclonal antibody and the carrier capable of binding to the first monoclonal antibody” at this time include any combination of the above-mentioned first monoclonal antibody and the carrier, and these are included in the reaction system.
  • the combination of the first monoclonal antibody and the carrier on which the substance binding to the first monoclonal antibody is immobilized which is described in the method for indirectly immobilizing the first monoclonal antibody on the carrier.
  • a combination of the first monoclonal antibody that has been biotinylated or avidized (or streptavizinated) with an avidized (or streptavizinated) or biotinylated carrier is preferred.
  • the capture antibody according to the present invention contains at least the first monoclonal antibody and the carrier, but may also contain the linker, blocking agent and the like, if necessary.
  • Labeled antibody In the measuring method of the present invention, as a labeled antibody that labels the fragment containing the human type IV collagen 7S domain, a labeled antibody obtained by binding a second monoclonal antibody to a labeling substance is used.
  • the "labeling substance” is not particularly limited as long as it can be detected by binding to a second monoclonal antibody, and is, for example, an enzyme; a luminescent substance such as an acridinium derivative; a fluorescent substance such as europium; allophycocyanin.
  • Fluorescent proteins such as (APC) and phycoerythrin (R-PE); radioactive substances such as 125 I; low molecular weight labeling substances such as fluorescein isothiocyanate (FITC) and rhodamine isothiocyanate (RITC); gold particles; avidin; biotin Latex; dinitrophenyl (DNP); digoxigenin (DIG).
  • the enzyme and Luminescent substances are preferred, and enzymes are more preferred.
  • the enzyme include, but are not limited to, horseradish peroxidase (HRP), alkaline phosphatase (ALP), ⁇ -galactosidase ( ⁇ -gal), glucose oxidase, and luciferase.
  • a method for producing a labeled antibody according to the present invention as a method for binding the labeling substance to the second monoclonal antibody, a conventionally known method or a method similar thereto can be appropriately adopted and directly bound. Alternatively, they may be indirectly combined. Examples of such a binding method include the same methods as those mentioned as the binding method between the carrier and the first monoclonal antibody in the capture antibody according to the present invention.
  • the labeling substance and the second monoclonal antibody are directly or indirectly from the labeling substance capable of binding to the second monoclonal antibody and the second monoclonal antibody in advance.
  • the labeled antibody formed by binding may be produced and then subjected to the sandwich immunoassay.
  • the second monoclonal antibody and the labeling substance capable of binding to the second monoclonal antibody are separately provided in the reaction system of the sandwich immunoassay, and the same.
  • the labeling substance and the second monoclonal antibody are formed. It may be a combination with the second monoclonal antibody.
  • the combination of the "second monoclonal antibody and the labeling substance capable of binding to the second monoclonal antibody" at this time includes an arbitrary combination of the above-mentioned second monoclonal antibody and the labeling substance, and is a reaction system.
  • a combination of a second monoclonal antibody and a labeling substance in which a substance that binds to the second monoclonal antibody is bound, and biotinylated or avidinated (or streptavidinized) are performed.
  • a combination of the second monoclonal antibody with an avidized (or streptavidinized) or biotinylated labeling substance is preferred.
  • the substance that binds to the second monoclonal antibody include substances similar to those listed as the substance that binds to the first monoclonal antibody.
  • the labeled antibody according to the present invention contains at least the second monoclonal antibody and the labeling substance, but may also contain the linker, blocking agent and the like, if necessary.
  • a fragment containing a human type IV collagen 7S domain in a sample is measured by a sandwich immunoassay using the capture antibody and the labeled antibody.
  • measurement includes detection of extracting the presence / absence and amount of a target substance in a sample as a signal, as well as quantification or semi-quantification of the amount of the target substance.
  • the measurement of the target substance is preferably carried out by detecting a signal generated by the labeling substance and quantifying it as necessary.
  • the "signal” includes coloration (color development), reflected light, light emission, fluorescence, radiation by a radioisotope, etc., and can be confirmed by a measuring method / device according to the type of signal, in addition to those that can be confirmed with the naked eye. Things are also included.
  • the "sandwich immunoassay” is a capture antibody (immobilized) immobilized on a solid phase (“capture antibody” in the present invention) and a target substance (“fragment containing human IV collagen 7S domain” in the present invention).
  • the target substance is captured and recognized by a detection antibody (“labeled antibody” in the present invention) to which the labeling substance is bound to form a complex of a capturing antibody-target substance-labeled antibody, if necessary.
  • This is a method of performing detection according to the type of the labeling substance after cleaning the antibody.
  • an antibody for capture fixed (immobilized) to a solid phase (“ capture antibody “in the present invention) and a target substance (in the present invention,” human IV type collagen 7S domain "is included.
  • “Capturing a fragment” is a complex of a first antibody (“first monoclonal antibody” in the present invention) not immobilized on a solid phase ("carrier” in the present invention) and the target substance.
  • first monoclonal antibody in the present invention
  • carrier in the present invention
  • the combination of the first antibody and the solid phase at this time includes the combination described in "The first monoclonal antibody and the carrier capable of binding to the first monoclonal antibody" of the capture antibody, including its preferred embodiment. The same is true.
  • labeling antibody "in the present invention) recognize the target substance is a second antibody that is not bound to the labeling substance.
  • the labeling substance and the second antibody forming the complex are bound to the labeling substance via the second antibody, and the target substance (or , The target substance and the capture antibody).
  • the combination of the second antibody and the labeling substance at this time is the combination described in "The second monoclonal antibody and the labeling substance capable of binding to the second monoclonal antibody" of the above-mentioned labeled antibody. Is similar to.
  • sandwich immunoassays include, for example, the sandwich CLIA method, which is one aspect of the chemiluminescent immunoassay (CLIA method), the sandwich CLEIA method, which is one aspect of the chemiluminescent enzyme immunoassay (CLEIA method), and radioimmunoassay.
  • CLIA method chemiluminescent immunoassay
  • CLIA method sandwich CLEIA method
  • RIA method chemiluminescent immunoassay
  • FIA method fluorescent radioimmunoassay method
  • the sandwich FIA method can be mentioned.
  • a reaction system of a fragment containing the human type IV collagen 7S domain and a first monoclonal antibody preferably a reaction system for capturing the fragment containing the human type IV collagen 7S domain with the capture antibody.
  • the salt concentration is more preferably 0.35 to 1.3 M, more preferably 0.42 to 1.0 M, and even more preferably 0.43 to 0.99 M.
  • the salt concentration is within the above range, the non-specific reaction in the sample derived from a healthy person can be further reduced, and the measuring accuracy can be further improved.
  • the present inventors determined the salt concentration at the time of binding to the first monoclonal antibody (preferably when capturing with the capture antibody) in a conventional sandwich immunoassay. By making it higher than the salt concentration in (for example, about 0.15 M), the binding to the human type IV collagen 7S domain contained in the sample derived from a healthy person is attenuated, and liver fibrosis occurs. It has been found that it is possible to maintain and enhance the binding to the 7S domain contained in the sample derived from a patient (patient with liver cirrhosis, NASH, etc.).
  • the composition of the collagen fragment contained in the sample derived from the patient and the collagen fragment contained in the sample derived from the healthy person are different as the fragment containing the human type IV collagen 7S domain, and according to the measurement method of the present invention, it is high. It is considered that one of the causes is that the non-specificity to the collagen fragment contained in the sample derived from a healthy person decreased in the salt concentration. Further, in the sample, depending on the length of the TH domain and the like contained and the size of the network structure of collagen, there are a wide variety of collagen fragments having different degrees of exposure of the 7S domain, from those having a large molecular weight, so that the sample is low.
  • the mask can be made by increasing the salt concentration. It is considered that one of the reasons is that the 7S domain was exposed and the divergence could be resolved.
  • reaction system preferably a reaction system for capturing with the capture antibody
  • the sample and the first monoclonal antibody preferably the capture antibody
  • the reaction system containing the above-mentioned salt and the above-mentioned salt is not particularly limited, but is preferably an aqueous solution, and in addition, physiological saline, purified water; MES, Tris, CFB, MOPS, PIPES, HEPES, tricin buffer, bicin buffer. , Buffer solution such as glycine buffer; stabilizing protein such as BSA; various surfactants may be further contained, and when the reverse sandwich method or the one-step method is adopted, the labeled antibody is further contained. You may.
  • the salt concentration of the reaction system also includes the concentration of the salt.
  • the salt concentration of the reaction system also includes the concentration of the salt.
  • Blood samples (whole blood, serum, plasma) generally contain a total of 140 mM to 150 mM worth of salt.
  • a blood sample whole blood, serum, plasma, etc.
  • 50 ⁇ L of a particle (capture antibody) suspension containing a salt of 0.6 M to 1.5 M is used as in the following examples.
  • the salt concentration of the reaction system for capturing the fragment containing the human type IV collagen 7S domain with the capture antibody becomes 0.43M to 0.99M.
  • the salt is not particularly limited, but is preferably at least one selected from the group consisting of an alkali metal ion, an inorganic salt of an alkali metal ion, and an organic salt of an alkali metal ion, and is preferably an inorganic salt of the alkali metal ion.
  • the salt include alkali metal chloride, alkali metal tartrate, alkali metal nitrate, and alkali metal sulfate.
  • the alkali metal ion sodium ion and potassium ion are preferable.
  • the salt concentration indicates a concentration corresponding to the concentration of alkali metal ions.
  • the first monoclonal antibody and the carrier capable of binding to the first monoclonal antibody eg, the capture antibody
  • the sample e.g. the sample
  • the second monoclonal antibody and the second monoclonal antibody are bound.
  • the obtained labeling substance for example, the labeling antibody
  • the complex capture antibody-fragment containing human IV type collagen 7S domain (target substance) -labeled antibody
  • the contact method is not particularly limited, and a conventionally known method or a method similar thereto can be appropriately adopted.
  • the first monoclonal antibody and the carrier for example, the capture antibody
  • a second monoclonal antibody and the labeling substance eg, the labeling antibody
  • the capture antibody solution eg, a particle suspension if the carrier is a particle
  • a method of adding the sample or the like to the labeled antibody solution can be mentioned.
  • a sample a sample diluted or suspended with a diluent may be appropriately used.
  • a reaction buffer may be further appropriately added.
  • the solvent of the capture antibody solution, the solvent of the labeled antibody solution, the diluted solution, and the reaction buffer are not particularly limited, but for example, physiological saline, purified water; and buffer (sodium phosphate buffer) are independently used. , MES, Tris, CFB, MOPS, PIPES, HEPES, tricine buffer, bicine buffer, glycine buffer, etc.), and each may be independently added with a stabilizing protein such as BSA. ..
  • the salt concentration of the reaction system also includes the concentration of the salt.
  • the salt concentration of the reaction system also includes the concentration of the salt.
  • the content of the first monoclonal antibody in the reaction system is not particularly limited, and the type and concentration of the sample are not particularly limited. It is not particularly limited because it is appropriately adjusted according to the detection method and the like, but from the viewpoint of efficient capture in a short time, for example, it is preferably 0.000001 to 0.01 w / v%, and 0. More preferably, it is 0.001 to 0.001 w / v%.
  • the indication of "w / v%" indicates a weight / volume percentage (g / 100 mL).
  • the content of the second monoclonal antibody in the reaction system is not particularly limited, and the type of sample is not particularly limited.
  • the concentration is appropriately adjusted according to the concentration, detection method, etc., and is not particularly limited. However, from the viewpoint of efficient labeling in a short time, for example, 0.000001 to 0.01 w / v% is preferable. More preferably, it is 0.00001 to 0.001 w / v%.
  • the conditions for the contact are not particularly limited and can be adjusted independently and appropriately, for example, 4 to 45 ° C., preferably 20 to 37 ° C.; pH 6 to 9, preferably pH 6.5. With ⁇ 8, it can be carried out for about 30 seconds to 12 hours, preferably about 1 minute to 1 hour, but is not limited to these conditions.
  • the sandwich immunoassay includes a two-step forward sandwich method (capture by a carrier (preferably a reaction between a capture antibody and a fragment containing a human type IV collagen 7S domain in a sample), and recognition by a labeling substance (preferably,).
  • a carrier preferably a reaction between a capture antibody and a fragment containing a human type IV collagen 7S domain in a sample
  • recognition by a labeling substance preferably,.
  • a reverse sandwich method preliminarily recognized by a labeling substance (preferably, the labeled antibody and a human in a sample).
  • the measuring method of the present invention is preferably a two-step method, and more preferably a forward sandwich method, from the viewpoint of measurement accuracy.
  • a forward sandwich method for example, A capture step of contacting the sample with the capture antibody and capturing the fragment containing the human type IV collagen 7S domain with the capture antibody. After the capture step, the labeled antibody is brought into contact with a fragment containing the human type IV collagen 7S domain captured by the capture antibody, and the fragment containing the human type IV collagen 7S domain captured by the capture antibody is labeled. Labeling process and A measurement method including the above can be mentioned.
  • the capture antibody is brought into contact with the sample, and the fragment containing the human IV collagen 7S domain is obtained through the binding of the fragment containing the human IV collagen 7S domain to the first monoclonal antibody. It is captured by the capture antibody, that is, forms a first immune complex of the first monoclonal antibody and the fragment containing the human type IV collagen 7S domain.
  • the method of contacting the capture antibody with the sample and the conditions at that time are not particularly limited, but it is preferable to satisfy the conditions of the salt concentration, and the capture antibody, the sample, and the labeled antibody are used, respectively. The methods and conditions described in Contacting Methods and Conditions can be applied.
  • the fragment containing the human type IV collagen 7S domain captured by the capture antibody and the other capture antibody are bound to each other. It is preferable to further include a cleaning step of separating the uncaptured (uncaptured) contaminants and removing the contaminants.
  • the method for removing the contaminants is not particularly limited, and a conventionally known method or a method similar thereto can be appropriately adopted.
  • the captured antibody is recovered by centrifugation or magnetic collection after the capture step. A method of removing the liquid phase (supernatant) can be mentioned. Further, in the cleaning step, injection and removal of the cleaning liquid may be repeated, if necessary.
  • cleaning solution examples include neutral (preferably pH 6-9) known buffer solutions (sodium phosphate buffer, MES, Tris, CFB, MOPS, PIPES, HEPES, tricine buffer, bicine buffer, glycine buffer, etc.).
  • neutral preferably pH 6-9
  • buffer solutions sodium phosphate buffer, MES, Tris, CFB, MOPS, PIPES, HEPES, tricine buffer, bicine buffer, glycine buffer, etc.
  • a stabilizing protein such as BSA, a buffer agent, or the like may be added.
  • the labeled antibody is brought into contact with a fragment containing the human type IV collagen 7S domain captured by the capture antibody, and the fragment containing the human type IV collagen 7S domain captured by the capture antibody is labeled. That is, a second immune complex is formed between the second monoclonal antibody and the fragment containing the human type IV collagen 7S domain captured by the capture antibody.
  • the method and conditions for contacting the labeled antibody with the fragment containing the human type IV collagen 7S domain captured by the capture antibody are not particularly limited, and the capture antibody, the sample, and the label are not particularly limited. The methods and conditions described in the methods and conditions for contacting the antibodies, respectively, can be applied.
  • the complex (second immune complex) containing the capture antibody-fragment containing the human type IV collagen 7S domain-labeled antibody is formed.
  • a washing step may be included, if necessary, in order to remove the labeled antibody or the like that did not form the complex.
  • the cleaning step is the same as the above-mentioned cleaning step.
  • the labeling substance of the complex is measured by a predetermined method according to the labeling substance.
  • the labeling substance of the labeled antibody is an enzyme
  • a signal color development, luminescence
  • a color-developing substrate a luminescent substrate, a chemically luminescent substrate, or the like corresponding to the enzyme and reacting the enzyme with the substrate. Etc.
  • the presence / absence and amount of the fragment containing the human type IV collagen 7S domain in the sample can be detected as a signal.
  • the amount of the fragment containing the human type IV collagen 7S domain in the sample is generally quantified by comparison with the measured value with a standard solution containing the fragment containing the human type IV collagen 7S domain at each concentration.
  • the fragment containing the human type IV collagen 7S domain used in the standard solution is not particularly limited, and examples thereof include the type IV collagen 7S fragment and the collagenase partially digested type IV collagen fragment.
  • the human type IV collagen 7S domain in the sample can be determined by examining at which position on the standard curve created based on the measured value by the standard solution the measured value obtained in the sample is positioned. The amount of fragment contained can be determined.
  • the measuring method of the present invention can be used for diagnosing diseases related to abnormal blood concentration of type IV collagen (evaluation of morbidity and its risk) and assisting the diagnosis.
  • diseases related to abnormal blood concentration of type IV collagen include diseases in which liver fibrosis progresses, and for example, type B and type C viral chronic hepatitis, alcoholic hepatitis, and non-disease.
  • examples include alcoholic steatohepatitis (NASH), cirrhosis, and liver cancer.
  • the measuring method of the present invention can be used for diagnosing or assisting or differentiating the degree of progression (severity) of hepatic fibrosis, and for screening patients who may have hepatic fibrosis. ..
  • the measurement method of the present invention it is possible to reduce the non-specificity for a sample derived from a healthy person (negative sample) without reducing the specificity for a sample derived from a patient (positive sample), and human IV. Since high measurement accuracy can be achieved in the low concentration range of the fragment containing the type collagen 7S domain, it is used for screening patients in the early stage of hepatic fibrosis progression from the healthy group and for differentiating from healthy subjects. It is useful as a measurement method.
  • the present invention is a kit for use in the measurement method of the present invention.
  • a kit for measuring a fragment containing a human type IV collagen 7S domain hereinafter, in some cases, simply referred to as “the kit of the present invention”.
  • the first monoclonal antibody, the carrier capable of binding to the first monoclonal antibody, the second monoclonal antibody, the labeling substance capable of binding to the second monoclonal antibody, the capture antibody, and the labeling antibody included in the kit of the present invention are as described in the measuring method of the present invention, including preferred embodiments.
  • the first monoclonal antibody, the carrier capable of binding to the first monoclonal antibody, the second monoclonal antibody, the labeling substance capable of binding to the second monoclonal antibody, the capture antibody, and the labeled antibody included in the kit of the present invention may be in the form of a solid (powder) or in the form of a liquid dissolved in a buffer solution or the like.
  • the kit of the present invention may further include configurations that should be provided in a usual sandwich assay such as ELISA, CLEIA, ECLIA, CLIA, FIA, and immunochromatography.
  • a usual sandwich assay such as ELISA, CLEIA, ECLIA, CLIA, FIA, and immunochromatography.
  • the standard solution each concentration
  • the control reagent the diluent
  • the solvent of the capture antibody solution particle suspension medium, etc.
  • the solvent of the labeled antibody solution the reaction buffer, the washing solution, and the dilution cartridge.
  • It may further comprise at least one selected from the group consisting of.
  • the labeling substance is an enzyme, it may further contain a substrate, a reaction terminator, and the like necessary for detecting and quantifying the labeling substance.
  • a pretreatment liquid for pretreating the sample, an instruction manual for the kit, and the like may be further included.
  • Example 1 Collagenase Treatment Type IV collagen 7S fragments were prepared based on the method of Listeri et al. (Eur J Biochem, 108, p.239-250). That is, first, a pepsin-solubilized type IV collagen fragment (derived from human placenta, Sigma, C-7521) prepared by pepsin digestion was dissolved in 0.5 M acetic acid, and 50 mM containing 0.2 M NaCl and 2 mM CaCl 2. It was dialyzed against Tris (pH 7.2).
  • FIG. 1 shows MW Marker (No. 1, molecular weight / 1000), pepsin-solubilized type IV collagen fragment (No.
  • the "IV type collagen 7S fragment” is a human type IV collagen fragment consisting of a 7S domain that does not contain a TH domain, and is thus treated with collagenase and a gel filtration fraction is obtained. It could be obtained by selection.
  • a collagenase partially digested type IV collagen fragment was used as the immunogen below.
  • Collagenase partially digested type IV collagen fragment is a pepsin-solubilized type IV collagen fragment (manufactured by SIGMA) that is mainly composed of collagenase having a molecular weight of 500 k or more and is treated with collagenase at a temperature of 25 ° C. for 1 hour.
  • pepsin-solubilized type IV collagen fragment is a fragment prepared by solubilizing by pepsin digestion, and is a human type IV collagen fragment composed of a 7S domain, a TH domain, or an NC1 domain, and these. It is a mixture of human type IV collagen fragments containing two or more of each of them in whole or in part.
  • a monoclonal antibody was prepared using the "collagenase partially digested type IV collagen fragment" prepared in (1) above as an immunogen. Specifically, BALB / c mice mixed with 10 ⁇ g (1 mg / mL) of collagenase partially digested type IV collagen fragment with an equal amount of complete Freund's adjuvant were intraperitoneally twice at intervals of 2 weeks. I was immunized. In addition, abdominal immunization was performed twice with an incomplete Freund's adjuvant at intervals of 2 weeks. Furthermore, 10 ⁇ g of collagenase partially digested type IV collagen fragment dissolved in PBS was administered intravenously to the tail vein as final immunity.
  • the spleen was removed from the mouse, loosened into individual cells, and washed 3 times with RPMI-1640 medium.
  • the mouse myeloma cell line Sp2 / OAg14 in the logarithmic growth phase was washed 3 times with RPMI-1640 medium, mixed with the spleen cells, and fused.
  • the resulting fusion cells were subjected to PEG removal by centrifugation (200 xg, 5 minutes) and then placed in 10% fetal bovine serum and RPMI-1640 medium containing hypoxanthine, aminopterin, and thymidine (HAT). It was suspended and seeded on 96-well cell culture plates. Only hybridomas were grown by culturing for about 10 days.
  • blocking buffer 1% BSA, 3% sucrose, 0.1% ProClin300, in PBS
  • hybridoma strains (CIV09 strain, CIV13 strain) producing anti-IV collagen 7S domain monoclonal antibody (anti-7S domain antibody) that bind to the plate on which the type IV collagen 7S fragment was immobilized were selected.
  • the CIV09 strain and CIV13 strain selected in this manner bind to both the pepsin-solubilized type IV collagen fragment and the type IV collagen 7S fragment.
  • a hybridoma strain that produces an anti-IV collagen monoclonal antibody that binds to a plate on which the pepsin-solubilized type IV collagen fragment is immobilized but does not bind to a plate on which the type IV collagen 7S fragment is immobilized. (CIV03 strain) was selected.
  • Each hybridoma strain was cultured in a serum-free medium (Hybridoma SFM, Gibco), purified from the obtained culture supernatant using a protein A column, and each anti-IV collagen 7S domain monoclonal antibody and anti-IV collagen. An antibody solution containing each monoclonal antibody was obtained. The protein concentration of each antibody solution was determined by the absorbance at a wavelength of 280 nm.
  • concentration (Ab cone. (Ng / mL)) and absorbance of each monoclonal antibody when a pepsin-solubilized type IV collagen fragment was used as an antigen is shown in FIG. The results showing are shown in FIG. 3, respectively.
  • a monoclonal antibody (CIV09, CIV13: anti-IV collagen 7S domain monoclonal antibody) that specifically binds to the type IV collagen 7S fragment obtained by the collagenase treatment and a pepsin-solubilized type IV collagen fragment that binds to the IV It was confirmed that a monoclonal antibody (CIV03 :: anti-IV collagen monoclonal antibody) that does not bind to the type collagen 7S fragment was obtained.
  • CIV09 antibody anti-IV collagen 7S domain monoclonal antibody CIV09 (hereinafter, sometimes referred to as "CIV09 antibody”) is prepared according to the product manual. Chemically bonded to magnetic particles (manufactured by Fujirebio) to obtain CIV09 antibody-immobilized magnetic particles. Similarly, the anti-IV type collagen monoclonal antibody CIV03 (hereinafter, sometimes referred to as “CIV03 antibody”) was chemically bonded to the magnetic particles to obtain CIV03 antibody-immobilized magnetic particles.
  • alkaline phosphatase-labeled CIV13 antibody was obtained by adding 2-mercaptoethylamine hydrochloride and iodoacetamide to the coupling solution and terminating the reaction.
  • Type IV collagen 7S fragment (Type IV COL 7S) prepared in (1) above, diluted with Tris buffer (50 mM Tris, 2% BSA, 0.15M NaCl, pH 7.2), and pepsin solubilized type IV, respectively.
  • a collagen fragment (Type IV COL) and a collagenase partially digested type IV collagen fragment (partially digested Type IV COL) were used.
  • the particle suspension contains 0.15M, 0.3M, 0.6M, 1.0M, 1.2M, 1.5M NaCl, the salt concentration of the reaction system to which each sample is added is 0, respectively. It becomes .15M, 0.24M, 0.43M, 0.68M, 0.80M, 0.99M.
  • B / F was separated with a magnet, washed with Lumipulse (registered trademark) washing solution (manufactured by Fujirebio), and then labeled body fluid (50 mM) containing 1 ⁇ g / mL of the ALP-labeled CIV13 antibody prepared in (5) above.
  • Bis-Tris 600 mM NaCl, 2% BSA, 1 mM MgCl 2 , 0.3 mM ZnCl 2 ) were added in an amount of 50 ⁇ L, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 8 minutes.
  • a standard solution 50 mM Tris, 0.15 M NaCl, 2% BSA, pH 7.2
  • concentration of the human type IV collagen fragment containing the 7S domain in each sample was calculated from the amount of light emitted from each sample.
  • each value of the patient sample shows an average value (average of liver disease) of 15 samples derived from liver disease patients, and each value of a healthy person sample is a sample derived from 130 healthy people. Shows the average value (average of healthy people).
  • the patient sample and the healthy person sample show the values of 5 of each sample (samples 1 to 5), respectively.
  • the amount of luminescence did not change depending on the salt concentration, whereas the type IV collagen 7S fragment was solubilized with pepsin solubilized type IV collagen fragment (Type IV COL) and partially digested collagenase IV.
  • the type collagen fragment partially digested Type IV COL
  • the salt concentration was 0.6 M (0.43 M as the salt concentration of the reaction system) or more
  • the amount of luminescence increased as the salt concentration increased.
  • the 7S domain is masked in the fragment containing a part or all of the TH domain other than the type IV collagen 7S fragment contained in the pepsin-solubilized type IV collagen fragment and the collagenase partially digested type IV collagen fragment. It is probable that the mask was removed due to the increase in concentration.
  • the human type IV collagen fragment containing the 7S domain such as the fragment containing the TH domain contained in the pepsin-solubilized type IV collagen fragment and the collagenase partially digested type IV collagen fragment.
  • the degree of exposure becomes constant and a more accurate measured value can be obtained. It is probable that it has become.
  • the anti-IV collagen 7S domain monoclonal antibody was immobilized by setting the salt concentration of the reaction system to 0.35 M or higher (for example, 0.43 M (salt concentration of particle suspension 0.6 M) or higher).
  • the sandwich immunoassay of the present invention using a combination of magnetic particles and a labeled anti-IV collagen 7S domain monoclonal antibody, it was confirmed that the non-specific reaction in a healthy human sample was particularly reduced.
  • FIG. 4 shows the relationship between the concentration of type IV collagen 7S fragment (7S conc. (Ng / mL)) and the amount of luminescence (Signal, average value) in the standard solution.
  • the actual concentration of type IV collagen 7S fragment in the standard solution (7S conc. (Ng / mL)) and the fluctuation count (value) of the concentration (quantitative value) of the human type IV collagen fragment containing the 7S domain quantified by the calibration curve (Value) The result showing the relationship with CV (%) and the average value) is shown in FIG.
  • the detection limit was set so that the average value of the measurement count of 0 ng / mL + 2 SD was lower than the average value of the luminescence amount (Signal) of the low-concentration standard solution-2SD (SD: standard deviation).
  • the limit of quantification was a concentration at which the fluctuation count (Value CV (%)) was 10% or less. From FIG. 4, the detection limit was 0.1 ng / mL or less, and from FIG. 5, the quantification limit was 0.3 ng / mL or less.
  • Example 2 ⁇ Comparison with the conventional method (comparative example)> (Example 2) As samples, 30 cases of serum derived from a healthy person (healthy person group), 56 cases of serum derived from a patient with liver cirrhosis (liver cirrhosis group), and 38 cases of serum derived from a patient with NASH (NASH group) were used. The amount of luminescence was measured in the same manner as in (7) of Example 1 above except that each of these samples was used, and the concentration of the fragment containing the type IV collagen 7S domain in each sample was determined using a calibration curve. Calculated.
  • Example 1 The same sample as in Example 2 was attached using a type IV collagen 7S kit (manufactured by DENIS Pharma, hereinafter referred to as “RIA kit” in some cases), which is a radioimmunoassay using an anti-human type IV collagen rabbit polyclonal antibody. Measurements were performed according to the document, and the concentration of the fragment containing the type IV collagen 7S domain in each sample was calculated. According to the RIA kit, the fragment containing the type IV collagen 7S domain in the sample (“type IV collagen 7S” in the RIA kit, target substance) reacts with the anti-human type IV collagen rabbit polyclonal antibody and reacts with the type IV collagen.
  • RIA kit manufactured by DENIS Pharma, hereinafter referred to as “RIA kit” in some cases
  • a fragment containing the 7S domain-anti-human type IV collagen rabbit polyclonal antibody complex (complex 1) is formed. Then, when a fragment containing the iodide type IV collagen 7S domain (“Type IV collagen 7S ( 125 I)” in the RIA kit) (labeled antigen) was added, the antibody that could not bind to the target substance in the sample was added. The human type IV collagen rabbit polyclonal antibody reacts with the labeled antigen to form a labeled antigen-anti-human type IV collagen rabbit polyclonal antibody complex (complex 2).
  • the goat antibody reacts with complex 2 to form a labeled antigen-anti-human type IV collagen rabbit polyclonal antibody-goat antibody complex and precipitates. do.
  • the concentration of the target substance fragment containing the type IV collagen 7S domain
  • the concentration of the target substance can be determined by measuring the radioactivity of the precipitate after removing the unreacted labeled antigen.
  • Example 2 The measurement result of Example 2 (CL 7S: the concentration of the fragment containing the IV collagen 7S domain in the sample (ng / mL)) and the measurement result of Comparative Example 1 (RIA 7S: the IV collagen 7S domain in the sample).
  • the correlation with the concentration of the contained fragment (ng / mL)) is shown in FIG.
  • FIG. 7 shows the correlation only for the healthy group. Note that FIG. 6 does not include the following LC51 and LC28 (that is, liver cirrhosis group: 54 cases). As shown in FIG.
  • the measurement result (CL 7S) by a sandwich immunoassay in which the anti-IV collagen 7S domain monoclonal antibody-immobilized magnetic particles of the present invention and the labeled anti-IV collagen 7S domain monoclonal antibody are combined is obtained.
  • the correlation with the measurement result (RIA 7S) by the RIA kit was very high with a correlation coefficient of 0.947.
  • the correlation coefficient was as low as 0.581 only in the healthy subject group, and it was found that the measured value of the healthy subject sample was clearly decreased by the sandwich immunoassay of the present invention. rice field.
  • the measured values of the liver cirrhosis group and the NASH group are not decreased, but only the measured values of the healthy subject group can be decreased, as compared with the conventional RIA kit. , It is shown that the patient group and the healthy person group can be divided with higher accuracy.
  • Example 3 Evaluation of diagnostic ability 1 (Example 3) As samples, 25 cases of serum derived from a healthy person (healthy person group 1) and 30 cases of serum derived from a healthy person (healthy person group 1) were used, respectively. The amount of luminescence was measured in the same manner as in Example 2 above except that each of these samples was used, and the concentration of the fragment containing the type IV collagen 7S domain in each sample was calculated using a calibration curve.
  • Comparative Example 2 The concentration of the fragment containing the type IV collagen 7S domain in each sample was calculated using the RIA kit in the same manner as in Comparative Example 1 except that the same sample as in Example 3 was used.
  • Example 3 ((b) CL 7S) and Comparative Example 2 ((a) RIA 7S) (measurement value: concentration of the fragment containing the type IV collagen 7S domain in the sample (ng / mL) ))
  • FIG. 2 the distribution of the measurement results of Example 3 ((b) CL 7S) and Comparative Example 2 ((a) RIA 7S) is shown in FIG.
  • Example 2 (CL 7S) and Comparative Example 1 (RIA 7S) was compared by ROC (Receiving Operating Characteristic) analysis.
  • the ROC curve of the liver cirrhosis group (FPR (false positive rate, 1-specificity) -TPR (positive rate, sensitivity) curve) is shown in FIG. 10, and the ROC curve of the NASH group is shown in FIG.
  • the AUC value in Comparative Example 1 (RIA 7S) was 0.824
  • the AUC value in Example 2 (CL 7S) was 0.898.
  • Example 4 First, apply 500 ⁇ L of each sample to Superose 6 FPLC 10/300 equilibrated with fractionation buffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.05% CHAPS, 0.09% NaN 3, pH 7.2). Then, the mixture was developed at 0.5 mL / min of the buffer for fractionation and gel-filtered. The sample was fractionated to 0.25 mL per fraction, and the luminescence amount (CL signal) of each fraction was measured in the same manner as in (7) of Example 1 above. Further, as a control sample, the type IV collagen 7S fragment prepared in (1) above was also fractionated and measured in the same manner.
  • fractionation buffer 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.05% CHAPS, 0.09% NaN 3, pH 7.2
  • Example 3 As a comparison target, the amount of light emitted from each fraction of each sample was measured in the same manner as in Example 4 except that the CIV03 antibody-immobilized magnetic particles were used as the antibody-immobilized magnetic particles.
  • Example 4 solid line
  • CIV03 antibody-immobilized magnetic particles Comparative Example 3, dotted line
  • the sandwich immunoassay of the present invention using a monoclonal antibody specific for the type IV collagen 7S domain as both the capture antibody and the labeled antibody, a fragment containing the type IV collagen 7S domain in a sample derived from a patient such as liver cirrhosis was obtained. It was shown that it can be measured more accurately.
  • Example 5 As samples, each sample in the liver cirrhosis group was diluted 5-fold or 10-fold with a standard solution diluent (50 mM Tris, 0.15 M NaCl, 2% BSA, pH 7.2), respectively. The amount of luminescence was measured in the same manner as in Example 2 above except that each of these samples was used, and the concentration of the fragment containing the type IV collagen 7S domain in each sample was calculated using a calibration curve.
  • a standard solution diluent 50 mM Tris, 0.15 M NaCl, 2% BSA, pH 7.2
  • Example 5 LC27, LC28, LC37, LC51, and LC58, which include LC51 and LC28 in which the difference between Example 2 and Comparative Example 1 was large, were described in Example 5 (CL 7S) and Table 4 below shows each measured value and its recovery rate (measured value ⁇ measured value when dilution ratio / dilution ratio 1 ⁇ 100 (%)) in Comparative Example 4 (RIA 7S).
  • Example 6 (Analysis of measured value deviation sample) (Example 6)
  • the sample LC51 having the largest difference in measured values between Example 2 and Comparative Example 1 was gel-filtered in the same manner as in the above (measurable form of type IV collagen), and the amount of luminescence of each fraction was emitted. (Signal) was measured.
  • the amount of light emitted from each fraction was measured in the same manner as this except that CIV03 antibody-immobilized magnetic particles were used as the control antibody-immobilized magnetic particles.
  • each of the obtained fractions was divided into pools 1 to 6, and the emission amount (Signal) of each pool was measured in the same manner as in (7) of Example 1.
  • the sample LC51 before gel filtration was also measured in the same manner and used as a direct measurement value.
  • Comparative Example 5 The amount of light emitted from each pool was measured using the RIA kit in the same manner as in Comparative Example 1 except that the same pool as in Example 6 was used. On the other hand, the sample LC51 before gel filtration was also measured in the same manner and used as a direct measurement value.
  • recovery rate (%) recovery value / direct measurement value ⁇ 100.
  • the recovery rate was 87%, whereas in the RIA kit (Comparative Example 5, RIA), the directly measured value was low and the recovery rate was high. It was 237%, which was much higher than 100%. From this, it is presumed that the CIV03 antibody and the anti-human type IV collagen polyclonal antibody used in the RIA kit are greatly affected by the substances present in the sample and the sites other than the 7S domain of type IV collagen, and these are used. It is probable that the correct value was not given in the measurement. On the other hand, in the sandwich immunoassay using the monoclonal antibody of the present invention, it was shown that the fragment containing the type IV collagen 7S domain could be specifically detected.
  • the present invention it is possible to reduce the non-specificity for a sample derived from a healthy person (negative sample) without reducing the specificity for a sample derived from a patient (positive sample), and in the sample with high accuracy. It is possible to provide a measuring method capable of measuring a fragment containing the human type IV collagen 7S domain, and a kit for use thereof.
  • Fragments containing the human type IV collagen 7S domain in blood are mainly used as biomarkers for the diagnosis of liver cirrhosis and non-alcoholic steatohepatitis (NASH).
  • NASH non-alcoholic steatohepatitis

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Abstract

ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインに特異的に結合可能な第一のモノクローナル抗体が担体に固定されてなる捕捉抗体と、ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインに特異的に結合可能な第二のモノクローナル抗体が標識物質に結合してなる標識抗体と、を用いて、サンドイッチイムノアッセイにより、試料中のヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片を測定する、測定方法。

Description

ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片の測定方法及びこれに用いるためのキット
　本発明は、試料中のヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片の測定方法及びこれに用いるためのキットに関する。
　ＩＶ型コラーゲンは、ラミニン（Ｌａｍｉｎｉｎ）と共に基底膜を構成する主要なタンパク質であり、３本のα鎖からなるらせん構造を有する３量体を構造単位とする。組織によって、前記３量体を構成するサブユニットは異なるが、肝臓をはじめとする多くの組織において、前記３量体は、２本のα１鎖と１本のα２鎖とから構成される。ＩＶ型コラーゲン分子は、前記らせん構造を形成するＴＨドメイン（Ｔｒｉｐｌｅ　Ｈｅｌｉｃａｌ　ｃｏｌｌａｇｅｎｏｕｓ　ｄｏｍａｉｎ）の両端にＩＶ型コラーゲン分子特有の構造を有しており、Ｎ末端の構造を７Ｓドメイン、Ｃ末端の構造をＮＣ１ドメイン（Ｎｏｎｃｏｌｌａｇｅｎｏｕｓ　ｄｏｍａｉｎ）と呼ぶ。Ｃ末端のＮＣ１ドメインは他のＩＶ型コラーゲン分子のＮＣ１ドメインと２量体を形成し、また、Ｎ末端の７Ｓドメインは他のＩＶ型コラーゲン分子の７Ｓドメインと４量体を形成する。これらの多量体はいずれも共有結合によってそれぞれ強固に結合しており、これらの重合によって、ＩＶ型コラーゲン分子は網目構造（Ｃｈｉｃｋｅｎ－ｗｉｒｅ　ｎｅｔｗｏｒｋ）を形成する。
　ヒトの肝臓では、Ｂ型、Ｃ型のウイルス性慢性肝炎やアルコール性慢性肝炎の長期化、進行性の非アルコール性脂肪性肝炎（ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ　ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ：ＮＡＳＨ）等によって、徐々に肝線維化が進行して肝硬変や肝癌へと進展するが、その際には、ＩＶ型コラーゲンが増加することが知られている。ＩＶ型コラーゲンは、このような肝線維化の進行に伴って基底膜から血中に漏出する量が増加するため、ＩＶ型コラーゲン分子に由来する成分の血中濃度は肝線維化進行の指標となる。特に、共有結合によって強固に結合している７Ｓドメインはタンパク質分解酵素の影響を受けにくく血中でも安定であると考えられており、肝線維化の進展度（重症度）や肝硬変の診断のためのバイオマーカーとして用いられている。
　しかしながら、診断薬として認可されている、このような７Ｓドメインの測定試薬としては、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を用いた診断薬である「ＩＶ型コラーゲン・７Ｓキット（ＤＥＮＩＳファーマ株式会社製）」のみである。ＩＶ型コラーゲン・７Ｓキットは、抗ヒトＩＶ型コラーゲンウサギポリクローナル抗体を用いた試薬である。
　また、特開平２－１５５３号公報（特許文献１）には、ペプシン可溶化ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインと交差反応するモノクローナル抗体を酵素標識抗体とし、ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインのみに反応するモノクローナル抗体を固相担体に結合させて抗体結合固相担体（捕捉抗体）として、ワンステップのサンドイッチイムノアッセイによってヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを定量する方法が記載されている。
特開平２－１５５３号公報
　しかしながら、前記ＩＶ型コラーゲン・７Ｓキットでは、ヒトＩＶ型コラーゲンに対するポリクローナル抗体を用い、かつ、結合競合阻害を原理とするため、未だ測定精度が十分ではなかった。特に、健常人由来の検体における測定値が高くなって偽陽性率が高くなり、肝線維化の初期段階における患者のスクリーニングや鑑別には適さないという課題があることを本発明者らは見い出した。
　また、肝線維化が起きている患者（肝硬変患者、ＮＡＳＨ患者等）由来の血中には、７Ｓドメインを含むＩＶ型コラーゲン断片として、小～大分子まで、様々な態様のコラーゲン断片が存在するのに対して、前記ＩＶ型コラーゲン・７Ｓキットや、ペプシン可溶化ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインと交差反応するモノクローナル抗体を酵素標識抗体として用いる特許文献１に記載の方法では、小分子化されたコラーゲン断片を十分に検出できないためにこれらのコラーゲン断片を全て網羅して測定することが困難であり、それによって、検体によっては測定精度が低下する場合があるという課題もあることを本発明者らは見い出した。
　さらに、これら従来の方法では、試料中に含まれるＩＶ型コラーゲンの７Ｓドメイン以外の部位や他の成分の影響を受けやすいことによっても測定精度が低下しやすいという課題もあることを本発明者らは見い出した。
　本発明は、上記の本発明者らが新たに見い出した課題に鑑みてなされたものであり、患者由来の試料（陽性検体）に対する特異性を低減させることなく、健常人由来の試料（陰性検体）に対する非特異性を低減させることができ、かつ、高精度で試料中のヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片を測定することができる測定方法、及びこれに用いるためのキットを提供することを目的とする。
　上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、本発明者らは、ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインに対して部位特異的に結合可能なモノクローナル抗体を組み合わせたサンドイッチイムノアッセイにより、患者由来の試料（陽性検体）の測定値を低下させることなく、健常人由来の試料（陰性検体）の測定値を十分に低下でき、特にヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片の低濃度域で、従来よりも高い測定精度を達成できることを見い出した。また、この方法によれば、７Ｓドメインを含むＩＶ型コラーゲン断片として、いずれの態様のコラーゲン断片であっても網羅的に測定でき、さらに、試料中に存在する物質やＩＶ型コラーゲンの７Ｓドメイン以外の部位の影響も受けにくくなることによっても、従来より高い測定精度を達成できることを見い出し、本発明を完成するに至った。
　かかる知見により得られた本発明の態様は次のとおりである。
［１］
　ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインに特異的に結合可能な第一のモノクローナル抗体が担体に固定されてなる捕捉抗体と、ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインに特異的に結合可能な第二のモノクローナル抗体が標識物質に結合してなる標識抗体と、を用いて、サンドイッチイムノアッセイにより、試料中のヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片を測定する、測定方法。
［２］
　前記試料と前記捕捉抗体とを接触させ、前記ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片を前記捕捉抗体で捕捉する捕捉工程と、
　前記捕捉工程の後に、前記標識抗体と、前記捕捉抗体に捕捉されたヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片とを接触させ、前記捕捉抗体に捕捉されたヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片を標識する標識工程と、
を含む、［１］に記載の測定方法。
［３］
　前記ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片と第一のモノクローナル抗体との反応系の塩濃度が０．３５Ｍ以上である、［１］又は［２］に記載の測定方法。
［４］
　請求項１～３のうちのいずれか一項に記載の測定方法に用いるためのキットであり、
　ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインに特異的に結合可能な第一のモノクローナル抗体と、第一のモノクローナル抗体に結合し得る担体と、
　ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインに特異的に結合可能な第二のモノクローナル抗体と、第二のモノクローナル抗体に結合し得る標識物質と、
を含む、キット。
［５］
　第一のモノクローナル抗体が前記担体に固定されてなる捕捉抗体と、
　第二のモノクローナル抗体が前記標識物質に結合してなる標識抗体と、
を含む、［４］に記載のキット。
　本発明によれば、患者由来の試料（陽性検体）に対する特異性を低減させることなく、健常人由来の試料（陰性検体）に対する非特異性を低減させることができ、かつ、高精度で試料中のヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片を測定することができる測定方法、及びこれに用いるためのキットを提供することが可能となる。
実施例１（１）のコラゲナーゼ処理におけるＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す電気泳動写真である。 ＩＶ型コラーゲン７Ｓ断片を抗原としたときの、各モノクローナル抗体の濃度と吸光度との関係を示すグラフである。 ペプシン可溶化ＩＶ型コラーゲン断片を抗原としたときの、各モノクローナル抗体の濃度と吸光度との関係を示すグラフである。 標準溶液におけるＩＶ型コラーゲン７Ｓ断片の濃度と発光量との関係を示すグラフである。 標準溶液におけるＩＶ型コラーゲン７Ｓ断片の実濃度と定量値の変動計数との関係を示すグラフである。 実施例２の測定結果（ＣＬ　７Ｓ）と比較例１の測定結果（ＲＩＡ　７Ｓ）との相関関係を示す分散図である。 健常人群のみについて、実施例２の測定結果（ＣＬ　７Ｓ）と比較例１の測定結果（ＲＩＡ　７Ｓ）との相関関係を示す分散図である。 健常人群１について、実施例３（（ｂ）ＣＬ　７Ｓ）及び比較例２（（ａ）ＲＩＡ　７Ｓ）の測定値の分布を示すグラフである。 健常人群２について、実施例３（（ｂ）ＣＬ　７Ｓ）及び比較例２（（ａ）ＲＩＡ　７Ｓ）の測定値の分布を示すグラフである。 肝硬変群について、実施例２（ＣＬ　７Ｓ）及び比較例１（ＲＩＡ　７Ｓ）のＲＯＣ曲線を示す図である。 ＮＡＳＨ群について、実施例２（ＣＬ　７Ｓ）及び比較例１（ＲＩＡ　７Ｓ）のＲＯＣ曲線を示す図である。 ＣＩＶ０９抗体固相化磁性粒子を用いたときの、検体ＬＣ５８の各分画の発光量（ａ）、検体ＬＣ５１の各分画の発光量（ｂ）、健常人検体の各分画の発光量（ｃ）、を示すグラフである。 ＣＩＶ０９抗体固相化磁性粒子又はＣＩＶ０３抗体固相化磁性粒子を用いたときの、検体ＬＣ５８の各分画の発光量（ａ）、ＩＶ型コラーゲン７Ｓ断片の各分画の発光量（ｂ）、を示すグラフである。 ＣＩＶ０９抗体固相化磁性粒子又はＣＩＶ０３抗体固相化磁性粒子を用いたときの、検体ＬＣ５１の各分画の発光量を示すグラフである。 図１４のｐｏｏｌ　１～６の各ｐｏｏｌの定量値（ｐｏｏｌ回収値）を示すグラフである。
　以下、本発明をその好適な実施形態に即して詳細に説明する。
　＜ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片の測定方法＞
　本発明は、ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインに特異的に結合可能な第一のモノクローナル抗体が担体に固定されてなる捕捉抗体と、ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインに特異的に結合可能な第二のモノクローナル抗体が標識物質に結合してなる標識抗体と、を用いて、サンドイッチイムノアッセイにより、試料中のヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片を測定する、ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片の測定方法（以下、場合により単に「本発明の測定方法」という）を提供する。
　本発明において、「試料」としては、ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片が存在し得る試料である限り特に制限はない。一般的には、診断対象（ヒト）から採取された血液検体が用いられ、前記血液検体としては、血清、血漿、全血が挙げられ、好ましくは血清又は血漿が挙げられ、より好ましくは血清である。また、前記試料としては、必要に応じて下記の希釈液で適宜希釈又は懸濁されたものであっても前処理を施されたものであってもよい。前記前処理としては、例えば、コラゲナーゼ処理が挙げられる。
　（ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片）
　前記試料（好ましくは血液検体）中には、ヒトＩＶ型コラーゲン分子に由来する成分として、小～大分子まで、ヒトＩＶ型コラーゲン分子の様々な態様の断片が存在し得る。このような断片の態様としては、例えば、ＴＨドメイン及びＮＣ１ドメインを含まない、７Ｓドメインからなる断片（以下、場合により「ＩＶ型コラーゲン７Ｓ断片」という）；ＮＣ１ドメイン及び７Ｓドメインを含まない、ＴＨドメインからなる断片；ＴＨドメイン及び７Ｓドメインを含まない、ＮＣ１ドメインからなる断片；及びこれらのドメインの各全部又は一部を２以上含む断片；これらの断片と他の基底膜成分、例えばラミニンとの複合体が挙げられる。なお、本発明において、「７Ｓドメイン」には、多量体を形成していない７Ｓドメイン及び２～４量体を形成している７Ｓドメインをいずれも含み、「ＴＨドメイン」には、らせん構造を形成していないＴＨドメイン及び前記らせん構造を形成しているＴＨドメインをいずれも含み、「ＮＣ１ドメイン」には、多量体を形成していないＮＣ１ドメイン及び２量体を形成しているＮＣ１ドメインをいずれも含む。
　本発明において、「ＩＶ型コラーゲン７Ｓ断片」とは、好ましくは７Ｓドメインの４量体からなり、ペプシン消化により可溶化されたペプシン可溶化ＩＶ型コラーゲン断片をさらにコラゲナーゼ処理して得られる分解産物の、ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインの４量体に相当する分子量のゲルろ過分画、より具体的には、分子量が２００，０００（又は質量が２００ｋＤａ）以上、かつ、４００，０００付近（例えば、３００ｋＤａ～４４０ｋＤａ）のゲルろ過分画に含まれる断片、又はそれに相当する分子量を有する、７Ｓドメインを含むヒトＩＶ型コラーゲンの断片を示す。前記コラゲナーゼ処理の時間としては、添加するコラゲナーゼの濃度によって異なるが、例えば、３０分～１４時間であることが好ましく、処理温度としては、３０～３７℃であることが好ましい。なお、本発明において、「ペプシン可溶化ＩＶ型コラーゲン断片」とは、ペプシン消化により可溶化されたヒトＩＶ型コラーゲン断片であり、７Ｓドメインからなる断片（ＩＶ型コラーゲン７Ｓ断片）、ＴＨドメインからなる断片、ＮＣ１ドメインからなる断片、及びこれらのドメインの各全部又は一部を２以上含む断片、のうちの２種以上を含む混合物を示す。ペプシン可溶化ＩＶ型コラーゲン断片は、適宜従来公知の方法によって取得することができる。例えば、ヒト胎盤からのヒトＩＶ型コラーゲン分子を含む抽出物をペプシンで処理することによって得ることができ、市販されているものであってもよい。
　本発明において、測定対象である「ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片」としては、７Ｓドメインを含むヒトＩＶ型コラーゲンの断片であればよく、例えば、前記ＩＶ型コラーゲン７Ｓ断片；７ＳドメインとＴＨドメインの全部又は一部とからなる断片；７ＳドメインとＴＨドメインの全部又は一部とＮＣ１ドメインとからなる断片が挙げられ、これらのうちの１種を単独であっても２種以上の混合物であってもよい。本発明の測定方法によれば、前記ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片として、分子量の小さい前記ＩＶ型コラーゲン７Ｓ断片が含まれていても、分子量が大きく７Ｓドメインが十分に露出していない可能性がある断片が含まれていても、いずれも測定可能であり、従来よりも高い精度でヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片を測定することができる。
　（モノクローナル抗体）
　本発明において、「ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインに特異的に結合可能な第一のモノクローナル抗体」及び「ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインに特異的に結合可能な第二のモノクローナル抗体」（以下、場合によりこれらを総称して「抗７Ｓドメイン抗体」という）は、ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインのみを特異的に認識し、結合することができるモノクローナル抗体である。すなわち、前記抗７Ｓドメイン抗体は、ヒトＩＶ型コラーゲンの７Ｓドメイン以外の部位には結合しない。抗体が前記抗７Ｓドメイン抗体であることは、例えば、前記ＩＶ型コラーゲン７Ｓ断片を特異的に認識して結合することができること；又は、試料のゲルろ過分画のうち、ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメイン（好ましくは４量体）の分子量に相当する分画に含まれる分子に結合することができ、かつ、ＴＨドメインやＮＣ１ドメインを含むＩＶ型コラーゲン断片（例えば、ペプシン処理で可溶化したペプシン可溶化ＩＶ型コラーゲン断片）だけでなく前記ＩＶ型コラーゲン７Ｓ断片にも結合できること；で確認することができる。
　なお、本発明における「抗体」には、完全な抗体の他、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単鎖抗体、ダイアボディー等）や抗体の可変領域を結合させた低分子化抗体も含まれる。
　本発明に係る抗７Ｓドメイン抗体は、従来公知の方法を適宜採用、改良することによって産生することができ、例えば、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合した細胞（ハイブリドーマ）によるモノクローナル抗体の産生方法（代表的には、ケーラー及びミルスタインによる方法（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５，１９７５））によって産生することができる。
　前記抗体産生細胞としては、免疫原で免疫された動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、サル、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ラクダ、アルパカ、ニワトリ）の脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血白血球等が挙げられ、免疫されていない動物から予め単離された上記の細胞又はリンパ球などに対して、免疫原を培地中で作用させることによって得られた抗体産生細胞も使用することができる。
　本発明において、前記免疫原としては、前記ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片であれば特に限定されず、例えば、前記ＩＶ型コラーゲン７Ｓ断片、前記ペプシン可溶化ＩＶ型コラーゲン断片、前記ペプシン可溶化ＩＶ型コラーゲンをコラゲナーゼにより部分消化して得られた断片（実施例の「コラゲナーゼ部分消化ＩＶ型コラーゲン断片」に相当）が挙げられる。
　前記ミエローマ細胞としては、公知の種々の細胞株を使用することが可能である。前記抗体産生細胞及び前記ミエローマ細胞としては、これらが融合可能であれば、異なる動物種起源のものであってもよいが、同一の動物種起源のものであることが好ましい。
　前記ハイブリドーマは、例えば、前記免疫原で免疫されたマウスから得られた脾臓細胞と、マウスミエローマ細胞との間の細胞融合によって得られる。得られた多くのハイブリドーマの中から、前記ＩＶ型コラーゲン７Ｓ断片に対して高い反応性を示すモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングし、また、必要に応じてその中からさらに、選抜したハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のエピトープ解析を行って、前記ＩＶ型コラーゲン７Ｓ断片に結合するモノクローナル抗体を産生するクローンを同定することによって、ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインに特異的に結合可能なモノクローナル抗体（抗７Ｓドメイン抗体）を産生するハイブリドーマを得ることができる。かかるモノクローナル抗体は、このハイブリドーマを培養することにより、或いは、このハイブリドーマを投与した哺乳動物の腹水から、取得することができる。
　また、抗７Ｓドメイン抗体としては、例えば、当該抗体をコードするＤＮＡが取得できれば、組換えＤＮＡ法によって作製することもできる。前記組換えＤＮＡ法としては、上記抗体をコードするＤＮＡをハイブリドーマや前記抗体産生細胞等からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主細胞（例えば哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞など）に導入し、組換え抗体として産生させる方法（例えば、Ｐ．Ｊ．Ｄｅｌｖｅｓ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９７，ＷＩＬＥＹ；Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ　ａｎｄ　Ｃ．Ｄｅａｎ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２０００，ＯＸＦＯＲＤ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ　ＰＲＥＳＳ；Ｖａｎｄａｍｍｅ　Ａ．Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９２：７６７－７７５，１９９０）が挙げられる。上記抗体をコードするＤＮＡの発現においては、重鎖又は軽鎖をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよく、重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよい（例えば、国際公開第９４／１１５２３号に記載の方法）。
　前記組換え抗体は、前記宿主細胞を培養し、培養した宿主細胞内又は培養液から分離・精製することにより、実質的に純粋で均一な形態で取得することができる。前記組換え抗体の分離・精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている方法を使用することができる。トランスジェニック動物作製技術を用いて、抗体遺伝子が組み込まれたトランスジェニック動物（例えば、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ等）を作製すれば、そのトランスジェニック動物のミルクから、抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得することも可能である。
　本発明において、第一のモノクローナル抗体と第二のモノクローナル抗体とは互いに同一であっても異なっていてもよい。前記試料が血液検体である場合、当該血液検体中においては、通常、ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインは２～４量体（好ましくは４量体）を形成しているため、第一のモノクローナル抗体と第二のモノクローナル抗体とが同一の部位を認識・結合する同種の抗体であっても、各々が多量体のうちのいずれかのヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインに結合することが可能である。
　（捕捉抗体）
　本発明の測定方法においては、前記ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片を捕捉する捕捉抗体として、第一のモノクローナル抗体が担体に固定されてなる捕捉抗体を用いる。
　本発明において、「担体」としては、第一のモノクローナル抗体を固定させて担持できるものである限り特に制限はない。このような担体の材質としても一般的に免疫測定に用いられるものであれば特に制限はされず、例えば、高分子ポリマー（例えば、ポリスチレン、（メタ）アクリル酸エステル、ポリメチルメタクリレート、ポリイミド、ナイロン等）、ゼラチン、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、ラテックス、シリカ、金属（例えば、金、白金、鉄、コバルト、ニッケル等）、金属化合物（例えば、酸化鉄、酸化コバルト、ニッケルフェライト等）、及びこれらの複合材や合金が挙げられる。また、前記担体としては、例えば、カルボキシ基、エポキシ基、トシル基、アミノ基、ヒドロキシ基、イソチオシアネート基、イソシアネート基、アジド基、アルデヒド基、カーボネート基、アリル基、アミノオキシ基、マレイミド基、チオール基、ＮＨＳエステル（Ｎ－ヒドロキシエステル）基のうちの１種又は２種以上の活性基で表面修飾されたものであってもよい。
　また、本発明において、前記担体の形状としても特に制限はされず、例えば、プレート、繊維、膜、粒子等のいずれであってもよいが、固定させる第一のモノクローナル抗体の密度を制御しやすく、均一にしやすい傾向にある観点からは、粒子であることが好ましい。さらに、前記粒子としては、自動化・短時間化の観点からは、磁性粒子であることが好ましい。
　前記担体が粒子である場合、その大きさとしては、特に制限されないが、粒子径が０．０１～１００μｍの範囲内にあることが好ましく、０．１～１０μｍの範囲内にあることがより好ましい。前記粒子の粒子径が前記下限未満であると、磁性粒子の場合に集磁に必要な磁気及び時間がより多く必要となる傾向にあり、他方、前記上限を超えると、粒子の比表面積が小さくなり、第一のモノクローナル抗体の粒子へ結合量が少なくなる傾向にある。
　このような粒子としては、従来公知のものを適宜用いることができ、例えば、特開平３－１１５８６２号公報に記載の磁性粒子（フェライト被覆粒子、カルボキシル化フェライト粒子）等の公知の粒子や、ダイナビーズ（サーモフィッシャー社製）、Ｍａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ（ＪＳＲ株式会社製）、マグラピッド（三洋化成工業株式会社製）等の市販の粒子を適宜用いることができる。また、前記粒子としては、これらのうちの１種を単独であっても２種以上の組み合わせであってもよい。
　本発明に係る捕捉抗体の製造方法として、前記担体に第一のモノクローナル抗体を固定する方法としては、従来公知の方法又はそれに準じた方法を適宜採用することができ、前記担体の表面に直接的に固定しても、間接的に固定してもよい。直接的に結合する方法としては、例えば、前記担体に前記活性基を付与し、或いは、前記担体としてこれらの活性基を有するものを用い、当該活性基による共有結合によって第一のモノクローナル抗体を結合する方法が挙げられる。
　間接的に固定する方法としては、例えば、第一のモノクローナル抗体に結合する物質を前記担体表面に固定し、当該物質に第一のモノクローナル抗体を結合させることにより、第一のモノクローナル抗体を前記担体表面に間接的に固定することができる。第一のモノクローナル抗体に結合する物質としては、特に制限されず、例えば、第一のモノクローナル抗体に結合可能な二次抗体、プロテインＧ、プロテインＡ、前記活性基を有するリンカー分子等のリンカーが挙げられる。また、第一のモノクローナル抗体がビオチン化又はアビジン化（若しくはストレプトアビジン化）されている場合には、前記担体をアビジン化（若しくはストレプトアビジン化）又はビオチン化させて、ビオチンとアビジン（若しくはストレプトアビジン）との相互作用により、同抗体を固定してもよい。
　また、本発明の測定方法に係る捕捉抗体としては、予め第一のモノクローナル抗体及び第一のモノクローナル抗体に結合し得る担体より前記担体に第一のモノクローナル抗体が直接的又は間接的に固定されてなる捕捉抗体を製造してからサンドイッチイムノアッセイに供してもよいが、サンドイッチイムノアッセイの反応系に第一のモノクローナル抗体と第一のモノクローナル抗体に結合し得る担体とを別々に供し、同反応系内で前記担体に第一のモノクローナル抗体を固定したものや、第一のモノクローナル抗体とヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片との複合体を形成させた後に前記担体に第一のモノクローナル抗体を固定したものであってもよい。このときの「第一のモノクローナル抗体及び第一のモノクローナル抗体に結合し得る担体」の組み合わせとしては、上記の第一のモノクローナル抗体と前記担体との任意の組み合わせが挙げられるが、反応系にこれらを別々に供する場合には、前記担体に第一のモノクローナル抗体を間接的に固定する方法に述べた、第一のモノクローナル抗体と第一のモノクローナル抗体に結合する物質を固定した担体との組み合わせ、並びに、ビオチン化又はアビジン化（若しくはストレプトアビジン化）された第一のモノクローナル抗体と、アビジン化（若しくはストレプトアビジン化）又はビオチン化された担体との組み合わせが好ましい。
　本発明に係る捕捉抗体は、少なくとも第一のモノクローナル抗体及び前記担体を含むが、他に、必要に応じて、前記リンカーや、ブロッキング剤等を含んでいてもよい。
　（標識抗体）
　本発明の測定方法においては、前記ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片を標識する標識抗体として、第二のモノクローナル抗体が標識物質に結合してなる標識抗体を用いる。
　本発明において、「標識物質」としては、第二のモノクローナル抗体に結合させて検出できるものであれば特に制限されず、例えば、酵素；アクリジニウム誘導体等の発光物質；ユーロピウム等の蛍光物質；アロフィコシアニン（ＡＰＣ）及びフィコエリスリン（Ｒ－ＰＥ）等の蛍光タンパク質；１２５Ｉ等の放射性物質；フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）及びローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）等の低分子量標識物質；金粒子；アビジン；ビオチン；ラテックス；ジニトロフェニル（ＤＮＰ）；ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）が挙げられる。これらの中でも、本発明に係る標識物質としては、簡便かつ安定性のある試験を可能とする傾向にある観点、及び簡便迅速かつ高感度の測定を行うことが可能である観点からは、酵素及び発光物質が好ましく、酵素がより好ましい。前記酵素としては、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、β－ガラクトシダーゼ（β－ｇａｌ）、グルコースオキシダーゼ、ルシフェラーゼを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
　本発明に係る標識抗体の製造方法として、前記標識物質と第二のモノクローナル抗体とを結合させる方法としては、従来公知の方法又はそれに準じた方法を適宜採用することができ、直接的に結合させても、間接的に結合させてもよい。このような結合方法としては、本発明に係る捕捉抗体において前記担体と第一のモノクローナル抗体との結合方法として挙げた方法と同様の方法が挙げられる。
　また、本発明の測定方法に係る標識抗体としては、予め第二のモノクローナル抗体及び第二のモノクローナル抗体に結合し得る標識物質より前記標識物質と第二のモノクローナル抗体とが直接的又は間接的に結合してなる標識抗体を製造してからサンドイッチイムノアッセイに供してもよいが、サンドイッチイムノアッセイの反応系に第二のモノクローナル抗体と第二のモノクローナル抗体に結合し得る標識物質とを別々に供し、同反応系内で前記標識物質と第二のモノクローナル抗体とを結合させたものや、第二のモノクローナル抗体とヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片との複合体を形成させた後に前記標識物質と第二のモノクローナル抗体とを結合させたものであってもよい。このときの「第二のモノクローナル抗体及び第二のモノクローナル抗体に結合し得る標識物質」の組み合わせとしては、上記の第二のモノクローナル抗体と前記標識物質との任意の組み合わせが挙げられるが、反応系にこれらを別々に供する場合には、第二のモノクローナル抗体と第二のモノクローナル抗体に結合する物質を結合させた標識物質との組み合わせ、並びに、ビオチン化又はアビジン化（若しくはストレプトアビジン化）された第二のモノクローナル抗体とアビジン化（若しくはストレプトアビジン化）又はビオチン化された標識物質との組み合わせが好ましい。第二のモノクローナル抗体に結合する物質としては、第一のモノクローナル抗体に結合する物質として挙げたものと同様のものが挙げられる。
　本発明に係る標識抗体は、少なくとも第二のモノクローナル抗体及び前記標識物質を含むが、他に、必要に応じて、前記リンカーや、ブロッキング剤等を含んでいてもよい。
　（サンドイッチイムノアッセイ）
　本発明の測定方法は、前記捕捉抗体と、前記標識抗体と、を用いて、サンドイッチイムノアッセイにより、試料中のヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片を測定する。
　本発明において、「測定」には、試料中の対象物質の存在の有無及び量をシグナルとして取り出す検出の他、前記対象物質の量の定量又は半定量が含まれる。本発明において、前記対象物質の測定は、標識物質によって生じるシグナルを検出し、必要に応じてこれを定量することによって行うことが好ましい。前記「シグナル」には、呈色（発色）、反射光、発光、蛍光、放射性同位体による放射線等が含まれ、肉眼で確認できるものの他、シグナルの種類に応じた測定方法・装置によって確認できるものも含まれる。
　「サンドイッチイムノアッセイ」は、固相に固定した（固相化した）捕捉用の抗体（本発明では「捕捉抗体」）で対象物質（本発明では「ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片」）を捕捉し、また、前記対象物質を標識物質が結合した検出用の抗体（本発明では「標識抗体」）に認識させて、捕捉抗体－対象物質－標識抗体の複合体を形成させ、必要に応じてそれを洗浄後、前記標識物質の種類に応じた検出を行う方法である。
　なお、本発明の測定方法において、「固相に固定した（固相化した）捕捉用の抗体（本発明では「捕捉抗体」）で対象物質（本発明では「ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片」）を捕捉すること」には、固相（本発明では「担体」）に固定されていない第一の抗体（本発明では「第一のモノクローナル抗体」）と前記対象物質との複合体、又は、固相に固定されていない第一の抗体と、前記対象物質と、前記標識抗体（若しくは下記の第二の抗体）との複合体を形成させた後に、前記固相に、前記複合体を形成した第一の抗体を固定し、同固相に、第一の抗体を介して前記対象物質（又は、前記対象物質及び前記標識抗体）を捕捉することを含む。このときの第一の抗体と固相との組み合わせとしては、その好ましい態様も含めて、上記捕捉抗体の「第一のモノクローナル抗体及び第一のモノクローナル抗体に結合し得る担体」で挙げた組み合わせと同様である。
　さらに、本発明の測定方法において、「対象物質を標識物質が結合した検出用の抗体（本発明では「標識抗体」）に認識させること」には、標識物質に結合していない第二の抗体（本発明では「第二のモノクローナル抗体」）と前記対象物質との複合体、又は、標識物質に結合していない第二の抗体と、前記対象物質と、前記捕捉抗体（若しくは上記の第一の抗体）との複合体を形成させた後に、前記標識物質と、前記複合体を形成した第二の抗体とを結合させ、同標識物質に、第二の抗体を介して前記対象物質（又は、前記対象物質及び前記捕捉抗体）を認識させることを含む。このときの第二の抗体と標識物質との組み合わせとしては、その好ましい態様も含めて、上記標識抗体の「第二のモノクローナル抗体及び第二のモノクローナル抗体に結合し得る標識物質」で挙げた組み合わせと同様である。
　このようなサンドイッチイムノアッセイとしては、例えば、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ法）の一態様であるサンドイッチＣＬＩＡ法、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）の一態様であるサンドイッチＣＬＥＩＡ法、放射免疫測定法（ＲＩＡ法）の一態様であるＩＲＭＡ法（免疫放射定量法）、電気化学免疫測定法（ＥＣＬＩＡ法）の一態様であるサンドイッチＥＣＬＩＡ法、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）の一態様であるサンドイッチＦＩＡ法が挙げられる。
　本発明の測定方法においては、前記ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片と第一のモノクローナル抗体との反応系（好ましくは前記ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片を前記捕捉抗体で捕捉する反応系）の塩濃度が０．３５Ｍ（Ｍ：ｍｏｌ／Ｌ、以下同じ）以上であることが好ましい。前記塩濃度としては、０．３５～１．３Ｍであることがより好ましく、０．４２～１．０Ｍであることがより好ましく、０．４３～０．９９Ｍであることがさらに好ましい。本発明の測定方法においては特に、前記塩濃度が前記範囲内にあることによって、健常人由来の検体における非特異反応がより軽減され、また、測定精度をより高くすることができる。
　本発明者らは、ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片の測定において、これと第一のモノクローナル抗体との結合の際（好ましくは前記捕捉抗体で捕捉する際）の塩濃度を従来のサンドイッチイムノアッセイにおける塩濃度（例えば、０．１５Ｍ程度）よりも高くすることによって、特に、健常人由来の試料中に含まれるヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインへの結合を減弱させ、かつ、肝線維化が起きている患者（肝硬変患者、ＮＡＳＨ患者等）由来の試料中に含まれる７Ｓドメインへの結合を維持・増強させることが可能となることを見い出した。これは、ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片として、患者由来の試料に含まれるコラーゲン断片と健常人由来の試料に含まれるコラーゲン断片との組成が異なり、本発明の測定方法によれば、高塩濃度において健常人由来の試料に含まれるコラーゲン断片への非特異性が低下したことが一因と考えられる。また、試料中においては、含まれるＴＨドメイン等の長さやコラーゲンの網目構造の大きさに応じて、分子量の大きいものまで、７Ｓドメインの露出度が異なるコラーゲン断片のバリエーションが多岐に亘るため、低塩濃度では抗７Ｓドメイン抗体による測定値と実際の試料中のヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片量との間に乖離が生じやすいのに対して、塩濃度を高くすることによって、当該マスクが外れて７Ｓドメインが露出し、前記乖離を解消できたことも一因と考えられる。
　前記ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片と第一のモノクローナル抗体との反応系（好ましくは前記捕捉抗体で捕捉する反応系）としては、前記試料と第一のモノクローナル抗体（好ましくは前記捕捉抗体）と前記塩とを含む反応系であれば特に限定されないが、水溶液であることが好ましく、他に、生理食塩水、精製水；ＭＥＳ、Ｔｒｉｓ、ＣＦＢ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＨＥＰＥＳ、トリシンバッファー、ビシンバッファー、グリシンバッファー等の緩衝液；ＢＳＡ等の安定化タンパク質；各種界面活性剤をさらに含んでいてもよく、また、リバースサンドイッチ法や１ステップ法を採用する場合には、前記標識抗体をさらに含んでいてもよい。なお、これらの他の成分に塩が含まれる場合、前記反応系の塩濃度には、当該塩の濃度も含まれる。
　また、前記試料に塩が含まれる場合、前記反応系の塩濃度には、当該塩の濃度も含まれる。血液検体（全血、血清、血漿）には、一般的に合計で１４０ｍＭ～１５０ｍＭ相当の塩が含まれる。前記試料として、例えば、血液検体（全血、血清、血漿等）を用いる場合、下記実施例のように、０．６Ｍ～１．５Ｍの塩を含む粒子（捕捉抗体）懸濁液５０μＬに、試料として血清検体３０μＬを加えると、前記ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片を前記捕捉抗体で捕捉する反応系の塩濃度は、０．４３Ｍ～０．９９Ｍとなる。
　前記塩としては、特に限定されないが、アルカリ金属イオン、アルカリ金属イオンの無機塩、及びアルカリ金属イオンの有機塩からなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましく、前記アルカリ金属イオンの無機塩としては、例えば、アルカリ金属の塩化物、アルカリ金属の酒石酸塩、アルカリ金属の硝酸塩、アルカリ金属の硫酸塩が挙げられる。前記アルカリ金属イオンとしては、ナトリウムイオン、カリウムイオンが好ましい。この場合、前記塩濃度とは、アルカリ金属イオンの濃度に相当する濃度を示す。
　このようなサンドイッチイムノアッセイにおいては、第一のモノクローナル抗体及び第一のモノクローナル抗体に結合し得る担体（例えば前記捕捉抗体）、前記試料、並びに、第二のモノクローナル抗体及び第二のモノクローナル抗体に結合し得る標識物質（例えば前記標識抗体）を接触させることにより、最終的に、前記複合体（捕捉抗体－ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片（対象物質）－標識抗体）を形成させる。このような接触方法としては、特に制限されず、従来公知の方法又はそれに準じた方法を適宜採用することができ、例えば、前記試料中に第一のモノクローナル抗体及び前記担体（例えば前記捕捉抗体）、及び／又は、第二のモノクローナル抗体及び前記標識物質（例えば前記標識抗体）を添加する方法；又は、例えば、前記捕捉抗体液（例えば、前記担体が粒子の場合には粒子懸濁液）及び／又は前記標識抗体液中に前記試料等を添加する方法が挙げられる。また、前記試料としては、希釈液で希釈又は懸濁したものを適宜用いてもよい。
　第一のモノクローナル抗体及び第一のモノクローナル抗体に結合し得る担体（例えば前記捕捉抗体）、前記試料、並びに、第二のモノクローナル抗体及び第二のモノクローナル抗体に結合し得る標識物質（例えば前記標識抗体）をそれぞれ接触させる際には、第一のモノクローナル抗体（好ましくは前記捕捉抗体）と前記試料とを接触させる際の塩濃度が前記条件を満たすことが好ましいが、他は特に制限されず、例えば、前記捕捉抗体液の溶媒（例えば、前記担体が粒子の場合には粒子懸濁媒）、前記標識抗体液の溶媒、前記希釈液の他に、反応用バッファーをさらに適宜添加してもよい。前記捕捉抗体液の溶媒、前記標識抗体液の溶媒、前記希釈液、前記反応用バッファーとしては、特に制限されないが、例えば、それぞれ独立に、生理食塩水、精製水；緩衝液（ナトリウムリン酸バッファー、ＭＥＳ、Ｔｒｉｓ、ＣＦＢ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＨＥＰＥＳ、トリシンバッファー、ビシンバッファー、グリシンバッファー等）が挙げられ、また、それぞれ独立に、ＢＳＡ等の安定化タンパク質等が添加されたものであってもよい。なお、これらの溶液に塩が含まれる場合、前記反応系の塩濃度には、当該塩の濃度も含まれる。また、前記試料に塩が含まれる場合、前記反応系の塩濃度には、当該塩の濃度も含まれる。
　前記複合体の形成において、反応系における第一のモノクローナル抗体の含有量（２種以上の組み合わせである場合にはそれらの合計量、以下同じ）としては、特に制限されず、試料の種類、濃度、検出方法等に応じて適宜調整されるものであるため特に制限されないが、短時間に効率よく捕捉する観点から、例えば、０．０００００１～０．０１ｗ／ｖ％であることが好ましく、０．００００１～０．００１ｗ／ｖ％であることがより好ましい。なお、本明細書中「ｗ／ｖ％」の表示は、重量／容量パーセント（ｇ／１００ｍＬ）を示す。
　また、前記複合体の形成において、反応系における第二のモノクローナル抗体の含有量（２種以上の組み合わせである場合にはそれらの合計量、以下同じ）としても、特に制限されず、試料の種類、濃度、検出方法等に応じて適宜調整されるものであるため特に制限されないが、短時間に効率よく標識する観点から、例えば、０．０００００１～０．０１ｗ／ｖ％であることが好ましく、０．００００１～０．００１ｗ／ｖ％であることがより好ましい。
　さらに、前記接触の際の条件としても特に制限されず、それぞれ独立に、適宜調整することができ、例えば、４～４５℃、好ましくは２０～３７℃；ｐＨ６～９程度、好ましくはｐＨ６．５～８で、３０秒～１２時間程度、好ましくは１分～１時間程度行うことができるが、これらの条件に限定されるものではない。
　前記サンドイッチイムノアッセイとしては、２ステップ法であるフォワードサンドイッチ法（担体による捕捉（好ましくは、捕捉抗体と試料中のヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片との反応）、標識物質による認識（好ましくは、捕捉抗体に結合したヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片と標識抗体との反応）を逐次的に行う方法）、リバースサンドイッチ法（予め標識物質により認識させ（好ましくは、標識抗体と試料中のヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片とを反応させ）、生成した複合体を担体で捕捉（好ましくは、捕捉抗体と反応）させる方法）、及び１ステップ法（捕捉抗体、試料中のヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片、及び標識抗体の反応を同時に１ステップで行う方法）を挙げることができるが、これらのいずれも採用可能である。
　これらの中でも、本発明の測定方法としては、測定精度の観点から、２ステップ法であることが好ましく、フォワードサンドイッチ法であることがより好ましい。このようなフォワードサンドイッチ法である本発明の測定方法の態様としては、例えば、
　前記試料と前記捕捉抗体とを接触させ、前記ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片を前記捕捉抗体で捕捉する捕捉工程と、
　前記捕捉工程の後に、前記標識抗体と、前記捕捉抗体に捕捉されたヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片とを接触させ、前記捕捉抗体に捕捉されたヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片を標識する標識工程と、
を含む測定方法が挙げられる。
　〔捕捉工程〕
　前記捕捉工程においては、前記捕捉抗体と前記試料とを接触させ、前記ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片と第一のモノクローナル抗体との結合を介して前記ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片を前記捕捉抗体に捕捉させる、すなわち、第一のモノクローナル抗体と前記ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片との第一の免疫複合体を形成させる。前記捕捉抗体と前記試料とを接触させる方法及びその際の条件としては、特に制限されないが、前記塩濃度の条件を満たすことが好ましく、上記の前記捕捉抗体、前記試料、及び前記標識抗体をそれぞれ接触させる方法及び条件に記載の方法及び条件を適用できる。
　〔洗浄工程〕
　本発明の測定方法としては、前記捕捉工程の後、かつ、下記の標識工程の前に、前記捕捉抗体に捕捉されたヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片と、それ以外の前記捕捉抗体に結合していない（捕捉されていない）夾雑物とを分離し、前記夾雑物を除去する洗浄工程をさらに含むことが好ましい。前記夾雑物を除去する方法としては、特に制限されず、従来公知の方法又はそれに準じた方法を適宜採用することができ、例えば、前記捕捉工程の後に前記捕捉抗体を遠心や集磁によって回収して液相（上清）を除去する方法が挙げられる。また、前記洗浄工程においては、次いで、必要に応じて、洗浄液の注入及び除去を繰り返してもよい。前記洗浄液としては、例えば、中性（好ましくは、ｐＨ６～９）の公知の緩衝液（ナトリウムリン酸バッファー、ＭＥＳ、Ｔｒｉｓ、ＣＦＢ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＨＥＰＥＳ、トリシンバッファー、ビシンバッファー、グリシンバッファー等）が挙げられ、また、ＢＳＡ等の安定化タンパク質や界面活性剤等が添加されたものであってもよい。
　〔標識工程〕
　前記標識工程においては、前記標識抗体と、前記捕捉抗体に捕捉されたヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片とを接触させ、前記捕捉抗体に捕捉されたヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片を標識する、すなわち、第二のモノクローナル抗体と前記捕捉抗体に捕捉されたヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片との第二の免疫複合体を形成させる。前記標識抗体と前記捕捉抗体に捕捉されたヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片とを接触させる方法及びその際の条件としては、特に制限されず、上記の前記捕捉抗体、前記試料、及び前記標識抗体をそれぞれ接触させる方法及び条件に記載の方法及び条件を適用できる。
　上記捕捉工程及び標識工程により、捕捉抗体－ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片－標識抗体を含む前記複合体（第二の免疫複合体）が形成される。前記標識工程の後には、前記複合体を形成しなかった標識抗体等を除去するために、必要に応じて洗浄工程を含んでもよい。かかる洗浄工程としては、上記の洗浄工程と同様である。
　本発明の測定方法においては、前記複合体（捕捉抗体－ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片－標識抗体）の標識物質を、当該標識物質に応じた所定の方法で測定する。例えば、前記標識抗体の標識物質が酵素である場合には、当該酵素に対応する発色基質、発光基質、化学発光基質等を添加し、酵素と基質とを反応させることによって生じるシグナル（発色、発光等）を検出する。これにより、試料中のヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片の存在の有無及び量をシグナルとして検出することができる。また、試料中のヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片の量の定量は、一般的に、各濃度のヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片を含む標準溶液による測定値との比較により行う。前記標準溶液に用いるヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片としては、特に制限されないが、例えば、前記ＩＶ型コラーゲン７Ｓ断片、前記コラゲナーゼ部分消化ＩＶ型コラーゲン断片が挙げられる。この場合、例えば、標準溶液による測定値に基づいて作成された標準曲線上のどの位置に、試料において得られた測定値が位置づけられるかを調べることにより、試料中のヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片の量を求めることができる。
　本発明の測定方法は、ＩＶ型コラーゲンの血中濃度異常に関連する疾患の診断（罹患やそのリスクの評価）及びその補助に利用することができる。ここで「ＩＶ型コラーゲンの血中濃度異常に関連する疾患」としては、例えば、肝線維化が進行する疾患が挙げられ、例えば、Ｂ型、Ｃ型のウイルス性慢性肝炎、アルコール性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝癌が挙げられる。
　また、本発明の測定方法は、前記肝線維化の進展度（重症度）の診断若しくはその補助又は鑑別や、肝線維化が起きている可能性のある患者のスクリーニングにも利用することができる。特に、本発明の測定方法によれば、患者由来の試料（陽性検体）に対する特異性を低減させることなく、健常人由来の試料（陰性検体）に対する非特異性を低減させることができ、ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片の低濃度域で高い測定精度を達成できるため、肝線維化進展度が初期の段階の患者の、健常人群からのスクリーニング、及び、健常人との鑑別に用いるための測定方法として有用である。
　＜ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片の測定方法に用いるためのキット＞
　本発明は、前記本発明の測定方法に用いるためのキットであり、
　ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインに特異的に結合可能な第一のモノクローナル抗体と、第一のモノクローナル抗体に結合し得る担体と、
　ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインに特異的に結合可能な第二のモノクローナル抗体と、第二のモノクローナル抗体に結合し得る標識物質と、
を含む、ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片の測定方法用キット（以下、場合により単に「本発明のキット」という）も提供する。本発明のキットとしては、
　第一のモノクローナル抗体が前記担体に固定されてなる捕捉抗体と、
　第二のモノクローナル抗体が前記標識物質に結合してなる標識抗体と、
を含む態様であることが好ましい。
　本発明のキットに含まれる第一のモノクローナル抗体、第一のモノクローナル抗体に結合し得る担体、第二のモノクローナル抗体、第二のモノクローナル抗体に結合し得る標識物質、捕捉抗体、及び標識抗体としては、それぞれ、好ましい態様も含めて、本発明の測定方法で述べたとおりである。また、本発明のキットに含まれる第一のモノクローナル抗体、第一のモノクローナル抗体に結合し得る担体、第二のモノクローナル抗体、第二のモノクローナル抗体に結合し得る標識物質、捕捉抗体、及び標識抗体としては、それぞれ独立に、固体（粉末）状であっても緩衝液等に溶解された液体状であってもよい。
　本発明のキットとしては、ＥＬＩＳＡ、ＣＬＥＩＡ、ＥＣＬＩＡ、ＣＬＩＡ、ＦＩＡ、イムノクロマト等の通常のサンドイッチアッセイで備えるべき構成をさらに備えていてもよい。例えば、前記標準溶液（各濃度）、対照試薬、前記希釈液、前記捕捉抗体液の溶媒（粒子懸濁媒等）、前記標識抗体液の溶媒、前記反応用バッファー、前記洗浄液、及び希釈用カートリッジからなる群から選択される少なくとも１種をさらに備えていてもよい。また、例えば、前記標識物質が酵素である場合には、当該標識物質の検出・定量に必要な基質や反応停止液等をさらに含んでいてもよい。さらに、必要に応じて、試料の前処理を行うための前処理液や当該キットの使用説明書等をさらに含んでいてもよい。
　以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、各実施例及び比較例において、「％」の表示は、特に記載のない場合、重量／容量パーセント（ｗ／ｖ％：ｇ／１００ｍＬ）を示す。
　＜抗ＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインモノクローナル抗体を用いたサンドイッチイムノアッセイ＞
　（実施例１）
　（１）コラゲナーゼ処理
　ＩＶ型コラーゲン７Ｓ断片は、Ｒｉｓｔｅｌｉらの方法（Ｅｕｒ　Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１０８、ｐ．２３９－２５０）に基づいて調製した。すなわち、先ず、ペプシン消化によって調製されたペプシン可溶化ＩＶ型コラーゲン断片（ヒト胎盤由来、Ｓｉｇｍａ社、Ｃ－７５２１）を、０．５Ｍ酢酸に溶解し、０．２Ｍ　ＮａＣｌ、２ｍＭ　ＣａＣｌ２を含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ　７．２）に対して透析した。次いで、これにコラゲナーゼ（Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ”Ａｍａｎｏ”、Ｗａｋｏ社、６０７－１９０２１）を加えて、３７℃で１時間インキュベートし、ペプシン可溶化ＩＶ型コラーゲン断片をさらに消化（コラゲナーゼ処理）した。コラゲナーゼ処理後の処理液を遠心分離した上清を、ゲルろ過によってさらに分離した。ゲルろ過カラムとしてＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ　１６／６０を、ゲルろ過バッファーとして１ｍＭ　ＥＤＴＡ　３Ｎａ、ＰＢＳを、それぞれ用いた。図１には、ＭＷ　Ｍａｒｋｅｒ（Ｎｏ．１、分子量／１０００）、ペプシン可溶化ＩＶ型コラーゲン断片（Ｎｏ．２）、コラゲナーゼ処理後の処理液（Ｎｏ．３）並びにその沈殿（Ｎｏ．４）及び上清（Ｎｏ．５）、各分画（フラクション（ＧＦ　Ｆｒ．）３～７；Ｎｏ．６～１０）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ（２－１５％　ＰＡＧ　Ｎｏｎ－Ｒｅｄｕｃｅ）の結果を示す。ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインの４量体の分子量に相当する、分子量が２５０，０００（又は、質量が２５０ｋＤａ）以上、かつ、４００，０００付近（３００ｋＤａ～４４０ｋＤａ）に分布する分画を集めて、以下のＩＶ型コラーゲン７Ｓ断片として使用した。
　本実施例及び比較例において、「ＩＶ型コラーゲン７Ｓ断片」は、ＴＨドメインを含まない、７ＳドメインからなるヒトＩＶ型コラーゲン断片であり、このようにコラゲナーゼにより処理し、かつ、ゲルろ過分画を選択することにより得ることができた。また、下記の免疫原としては、コラゲナーゼ部分消化ＩＶ型コラーゲン断片を使用した。「コラゲナーゼ部分消化ＩＶ型コラーゲン断片」は、分子量が５００ｋ以上のものを主成分とする、コラゲナーゼによる処理温度を２５℃にしてペプシン可溶化ＩＶ型コラーゲン断片（ＳＩＧＭＡ社製）を１時間消化することにより調製した断片であり、主に、前記ＩＶ型コラーゲン７Ｓ断片と、７Ｓドメイン及びＴＨドメインの一部からなるヒトＩＶ型コラーゲン断片とからなる混合物である。なお、上記の「ペプシン可溶化ＩＶ型コラーゲン断片」は、ペプシン消化によって可溶化することにより調製される断片であり、７Ｓドメイン、ＴＨドメイン、又はＮＣ１ドメインからなるヒトＩＶ型コラーゲン断片、及びこれらのうちの各全部又は一部を２以上含むヒトＩＶ型コラーゲン断片の混合物である。
　（２）モノクローナル抗体の作製
　上記の（１）で調製した「コラゲナーゼ部分消化ＩＶ型コラーゲン断片」を免疫原として、モノクローナル抗体を作製した。具体的には、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、１０μｇ（１ｍｇ／ｍＬ）のコラゲナーゼ部分消化ＩＶ型コラーゲン断片を等量の完全フロイントアジュバントと混合したものを、２週間の間を空けて２回、腹腔内免疫した。さらに、不完全フロイントアジュバントで２週間の間を空けて２回、腹腔免疫した。さらに、ＰＢＳに溶解したコラゲナーゼ部分消化ＩＶ型コラーゲン断片１０μｇを最終免疫として尾静脈内に投与した。最終免疫後３日目にこのマウスより脾臓を摘出して個々の細胞にほぐし、ＲＰＭＩ－１６４０培地で３回洗浄した。対数増殖期のマウス骨髄腫細胞株Ｓｐ２／ＯＡｇ１４をＲＰＭＩ－１６４０培地で３回洗浄後、前記脾臓細胞と混合し、細胞融合させた。得られた融合細胞は、遠心分離（２００×ｇ、５分間）によってＰＥＧを除いた後、１０％ウシ胎児血清、並びに、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン（ＨＡＴ）を含むＲＰＭＩ－１６４０培地に懸濁し、９６ウェル細胞培養プレートに播種した。約１０日間培養してハイブリドーマのみを増殖させた。
　ペプシン可溶化ＩＶ型コラーゲン断片及び上記の（１）で調製したＩＶ型コラーゲン７Ｓ断片を抗原として、それぞれ、ＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈し、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ　Ｍａｘｉｓｏｒｐ社、４６９９１４）に１００μＬ／ウェルで分注した。４℃で一晩、各抗原を吸着させた後、プレートをブロッキングバッファー（１％　ＢＳＡ、３％　スクロース、０．１％　ＰｒｏＣｌｉｎ３００、ＰＢＳ中）で２時間ブロックした。次いで、上記で調製したハイブリドーマの培養上清を加えて１時間インキュベートした。洗浄バッファー（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０　ｉｎ　ＰＢＳ）で４回洗浄した後、５０００倍希釈のＰＯＤ－Ｇｏａｔ抗マウスＩｇＧＦｃγ（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、１１５－０３６－０７１）を各ウェルに１００μＬ／ウェル添加した。３０分間インキュベートした後、各ウェルを洗浄バッファーで４回洗浄し、ＴＭＢ溶液（Ｎａｃａｌａｉ社、０５２９８）で発色させた。発色反応をＨ２ＳＯ４で停止させ、各ウェルの吸光度をプレートリーダーで測定した。
　これにより、前記ＩＶ型コラーゲン７Ｓ断片を固相化したプレートに結合する、抗ＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインモノクローナル抗体（抗７Ｓドメイン抗体）を産生するハイブリドーマ株（ＣＩＶ０９株、ＣＩＶ１３株）を選択した。このようにして選択したＣＩＶ０９株及びＣＩＶ１３株は、前記ペプシン可溶化ＩＶ型コラーゲン断片及び前記ＩＶ型コラーゲン７Ｓ断片のいずれにも結合する。一方、前記ペプシン可溶化ＩＶ型コラーゲン断片を固相化したプレートには結合するが、前記ＩＶ型コラーゲン７Ｓ断片を固相化したプレートには結合しない、抗ＩＶ型コラーゲンモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ株（ＣＩＶ０３株）を選択した。それぞれのハイブリドーマ株は無血清培地（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　ＳＦＭ、Ｇｉｂｃｏ社）で培養し、得られた培養上清からプロテインＡカラムを用いて精製し、各抗ＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインモノクローナル抗体、及び抗ＩＶ型コラーゲンモノクローナル抗体をそれぞれ含む抗体溶液を得た。各抗体溶液のタンパク質濃度は、波長２８０ｎｍにおける吸光度によって決定した。
　（３）モノクローナル抗体の反応特異性の確認
　上記の（１）で調製したＩＶ型コラーゲン７Ｓ断片及びペプシン可溶化ＩＶ型コラーゲン断片を抗原として、それぞれ、ＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈し、９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェルで分注した。４℃で一晩、各抗原を吸着させた後、プレートを前記ブロッキングバッファーで２時間ブロックした。次いで、上記の（２）で得られた各抗体溶液を、１０００ｎｇ／ｍＬ～３．９ｎｇ／ｍＬに段階希釈して１００μＬ／ウェルで分注し、１時間インキュベートした。前記洗浄バッファーで４回洗浄した後、５０００倍希釈の前記ＰＯＤ－Ｇｏａｔ抗マウスＩｇＧ　Ｆｃγを各ウェルに１００μＬ／ウェル添加した。３０分間インキュベートした後、各ウェルを洗浄バッファーで４回洗浄し、ＴＭＢ溶液で発色させた。発色反応をＨ２ＳＯ４で停止させ、各ウェルの吸光度をプレートリーダーで測定した。
　上記の（１）で調製したＩＶ型コラーゲン７Ｓ断片を抗原としたときの、各モノクローナル抗体の濃度（Ａｂ　ｃｏｎｃ．（ｎｇ／ｍＬ））と吸光度（波長４５０ｎｍと６３０ｎｍとの比（Ａ４５０／６３０）、以下同じ）との関係を示した結果を図２に、ペプシン可溶化ＩＶ型コラーゲン断片を抗原としたときの、各モノクローナル抗体の濃度（Ａｂ　ｃｏｎｃ．（ｎｇ／ｍＬ））と吸光度との関係を示した結果を図３に、それぞれ示す。前記コラゲナーゼ処理で得られたＩＶ型コラーゲン７Ｓ断片に特異的に結合するモノクローナル抗体（ＣＩＶ０９、ＣＩＶ１３：抗ＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインモノクローナル抗体）と、ペプシン可溶化ＩＶ型コラーゲン断片には結合するが、ＩＶ型コラーゲン７Ｓ断片には結合しないモノクローナル抗体（ＣＩＶ０３：：抗ＩＶ型コラーゲンモノクローナル抗体）とが、それぞれ得られたことを確認した。
　（４）抗体結合粒子の作製
　カルボキシル－アミン架橋剤（カルボジイミド、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用い、製品マニュアルに従って、抗ＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインモノクローナル抗体ＣＩＶ０９（以下、場合により「ＣＩＶ０９抗体」という）を磁性粒子（富士レビオ社製）に化学結合させ、ＣＩＶ０９抗体固相化磁性粒子を得た。同様に、抗ＩＶ型コラーゲンモノクローナル抗体ＣＩＶ０３（以下、場合により「ＣＩＶ０３抗体」という）を磁性粒子に化学結合させ、ＣＩＶ０３抗体固相化磁性粒子を得た。
　（５）標識抗体の作製
　抗ＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインモノクローナル抗体ＣＩＶ１３（以下、場合により「ＣＩＶ１３抗体」という）とウシ小腸由来アルカリホスファターゼ（オリエンタル酵母社製）とをヨシタケらの方法（Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８２，９２（５），ｐ．１４１３－１４２４）により結合させ、アルカリホスファターゼ標識ＣＩＶ１３抗体を調製した。すなわち、先ず、通例行われるとおり、脱塩処理したＣＩＶ１３抗体とペプシンとを０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）中で混合し、３７℃で１時間静置してペプシン消化を行った。反応を停止させた後にゲルろ過精製を行い、Ｆｃ領域を除去したＣＩＶ１３抗体を得た。次いで、２－メルカプトエチルアミン塩酸塩を添加して、チオール化を行った。さらに、これを脱塩処理し、ＣＩＶ１３抗体のＦａｂ’断片を得た。
　Ｎ－（４－マレイミドブチリロキシ）－スクシンイミド（ＧＭＢＳ）処理をしたアルカリホスファターゼと、前記ＣＩＶ１３抗体のＦａｂ’断片とを混合し、カップリングを行った。カップリング液に２－メルカプトエチルアミン塩酸塩及びヨードアセトアミドを加え、反応を停止させることによって、アルカリホスファターゼ標識ＣＩＶ１３抗体（ＡＬＰ標識ＣＩＶ１３抗体）を得た。
　（６）塩濃度の検討
　先ず、上記の（４）で調製したＣＩＶ０９抗体固相化磁性粒子を０．０３％含む、塩濃度が異なる粒子懸濁液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１％　ＢＳＡ、０．１５Ｍ～１．５Ｍ　ＮａＣｌ）５０μＬに、試料３０μＬを加えて３７℃で８分間反応させた。前記試料としては、肝硬変若しくは非アルコール性脂肪性肝炎（肝疾患）、又は肝癌である患者由来の血清（患者検体）、及び健常人由来の血清（健常人検体）、並びに、１０ｎｇ／ｍＬになるようにそれぞれＴｒｉｓ緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、２％　ＢＳＡ、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）で希釈した、上記（１）で調製したＩＶ型コラーゲン７Ｓ断片（ＴｙｐｅＩＶ　ＣＯＬ　７Ｓ）、ペプシン可溶化ＩＶ型コラーゲン断片（ＴｙｐｅＩＶ　ＣＯＬ）、及びコラゲナーゼ部分消化ＩＶ型コラーゲン断片（部分消化ＴｙｐｅＩＶ　ＣＯＬ）を用いた。前記粒子懸濁液が０．１５Ｍ、０．３Ｍ、０．６Ｍ、１．０Ｍ、１．２Ｍ、１．５ＭのＮａＣｌを含む場合、各試料を加えた反応系の塩濃度は、それぞれ、０．１５Ｍ、０．２４Ｍ、０．４３Ｍ、０．６８Ｍ、０．８０Ｍ、０．９９Ｍとなる。
　反応後に、磁石にてＢ／Ｆ分離し、ルミパルス（登録商標）洗浄液（富士レビオ社製）で洗浄した後、上記の（５）で調製したＡＬＰ標識ＣＩＶ１３抗体を１μｇ／ｍＬ含む標識体液（５０ｍＭ　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ、６００ｍＭ　ＮａＣｌ、２％　ＢＳＡ、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．３ｍＭ　ＺｎＣｌ２）を５０μＬ加え、３７℃で８分間反応させた。磁石にてＢ／Ｆ分離し、ルミパルス洗浄液で洗浄後、３－（２’－スピロアダマンタン）－４－メトキシ－４－（３’’－ホスホリルオキシ）フェニル－１，２－ジオキセタン・２ナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ）を含むルミパルス（登録商標）基質液（富士レビオ社製）を２００μＬ添加して３７℃で４分間酵素反応を行い、波長４６３ｎｍにおける発光量を測定した。同様に、既知濃度の前記ＩＶ型コラーゲン７Ｓ断片を含む標準溶液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、２％　ＢＳＡ、ｐＨ７．２）を測定して検量線を作成した。作成した検量線を用いて、各試料の発光量から、各試料中の７Ｓドメインを含むヒトＩＶ型コラーゲン断片の濃度を算出した。
　結果を下記の表１～表３に示す。表１～表３中、塩濃度は、前記粒子懸濁液の塩濃度を示し、各値は、粒子懸濁液の塩濃度０．１５Ｍのときの発光量に対する、各条件における発光量の割合（％）を示す。また、表１において、患者検体の各値は、１５個の肝疾患患者由来の検体の平均値（肝疾患平均）を示し、健常人検体の各値は、１３０個の健常人由来の検体の平均値（健常人平均）を示す。他方、表３において、患者検体及び健常人検体は、各検体のうちの５個（検体１～５）の値をそれぞれ示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表１、表３に示したように、試料がＩＶ型コラーゲン７Ｓ断片（ＴｙｐｅＩＶ　ＣＯＬ　７Ｓ）の場合には、塩濃度によって発光量に変化は認められなかった。一方、表３に示したように、塩濃度を０．３Ｍ（反応系の塩濃度として０．２４Ｍ）にすると、患者検体、健常人検体、共に発光量が低下し、健常人検体では特に低下した。さらにそれから塩濃度を０．６Ｍ～１．０Ｍ（反応系の塩濃度として０．４３Ｍ～０．６８Ｍ）に上げると、患者検体の発光量は上昇したが、健常人検体では塩濃度が高くなるにしたがって発光量が低下し、その傾向は患者検体に対して有意に大きかった。そして、表１に示したように、塩濃度が０．６Ｍ～１．５Ｍ（反応系の塩濃度として０．４３Ｍ～０．９９Ｍ）では、健常人検体における発光量が有意に低くなった。これにより、高塩濃度において特に、健常人検体における非特異反応が軽減されることが示された。
　また、表１、表２に示したように、塩濃度によって発光量に変化が認められなかったＩＶ型コラーゲン７Ｓ断片に対して、ペプシン可溶化ＩＶ型コラーゲン断片（ＴｙｐｅＩＶ　ＣＯＬ）及びコラゲナーゼ部分消化ＩＶ型コラーゲン断片（部分消化ＴｙｐｅＩＶ　ＣＯＬ）が試料の場合には、塩濃度を０．６Ｍ（反応系の塩濃度として０．４３Ｍ）以上にすると、塩濃度が高くなるにしたがって発光量が増加した。これは、ペプシン可溶化ＩＶ型コラーゲン断片やコラゲナーゼ部分消化ＩＶ型コラーゲン断片に含まれる、ＩＶ型コラーゲン７Ｓ断片以外の、ＴＨドメインの一部又は全部を含む断片では７Ｓドメインがマスクされており、塩濃度が上昇することによってマスクが外れたためと考えられる。
　これらから、検体中においては、７Ｓドメインを含むヒトＩＶ型コラーゲン断片のバリエーションが多岐に亘り、前記ペプシン可溶化ＩＶ型コラーゲン断片やコラゲナーゼ部分消化ＩＶ型コラーゲン断片に含まれるＴＨドメインを含む断片のように、７Ｓドメインがマスクされて露出度が少ないコラーゲン断片が含まれるが、これに対して、塩濃度を上昇させたことで、当該露出度が一定となって、より正確な測定値が得られるようになったものと考えられる。
　以上より、特に反応系の塩濃度を０．３５Ｍ以上（例えば、０．４３Ｍ（粒子懸濁液の塩濃度０．６Ｍ）以上）にすることによって、抗ＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインモノクローナル抗体固相化磁性粒子と、標識抗ＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインモノクローナル抗体と、を組み合わせて用いた本発明のサンドイッチイムノアッセイにおいては特に、健常人検体中の非特異反応が軽減されることが確認された。
　（７）測定系の感度の検討
　試料として、上記の（１）で調製したＩＶ型コラーゲン７Ｓ断片を標準溶液希釈液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、２％　ＢＳＡ、ｐＨ７．２）にて重量希釈し、８種類の希釈系列の標準溶液を調製した。前記粒子懸濁液の塩濃度を０．６Ｍとして、調製した試料を用いたこと以外は上記の（６）と同様にして、発光量を測定し、また、検量線を用いて、各試料中の７Ｓドメインを含むヒトＩＶ型コラーゲン断片の濃度を算出した。測定は、各低濃度標準溶液（２．０ｎｇ／ｍＬ以下）を２０重測定、他を２重測定とした。
　標準溶液におけるＩＶ型コラーゲン７Ｓ断片の濃度（７Ｓ　ｃｏｎｃ．（ｎｇ／ｍＬ））と発光量（Ｓｉｇｎａｌ、平均値）との関係を示した結果を図４に示す。また、標準溶液におけるＩＶ型コラーゲン７Ｓ断片の実濃度（７Ｓ　ｃｏｎｃ．（ｎｇ／ｍＬ））と、検量線により定量した７Ｓドメインを含むヒトＩＶ型コラーゲン断片の濃度（定量値）の変動計数（Ｖａｌｕｅ　ＣＶ（％）、平均値）と、の関係を示した結果を図５に示す。検出限界は、低濃度標準溶液の発光量（Ｓｉｇｎａｌ）の平均値－２ＳＤ（ＳＤ：標準偏差）値よりも、０ｎｇ／ｍＬの測定カウントの平均値＋２ＳＤが下回る濃度とした。また、定量限界は、変動計数（Ｖａｌｕｅ　ＣＶ（％））が１０％以下となる濃度とした。図４より、検出限界は０．１ｎｇ／ｍＬ以下であり、図５より、定量限界は０．３ｎｇ／ｍＬ以下であった。
　＜従来法（比較例）との対比＞
　（実施例２）
　試料として、健常人由来の血清（健常人群）３０例、肝硬変である患者由来の血清（肝硬変群）５６例、ＮＡＳＨである患者由来の血清（ＮＡＳＨ群）３８例、の検体をそれぞれ用いた。これらの各検体を用いたこと以外は上記の実施例１の（７）と同様にして発光量を測定し、検量線を用いて、各検体中のＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片の濃度を算出した。
　（比較例１）
　実施例２と同じ検体について、抗ヒトＩＶ型コラーゲンウサギポリクローナル抗体を用いたラジオイムノアッセイであるＩＶ型コラーゲン・７Ｓキット（ＤＥＮＩＳファーマ社製、以下、場合により「ＲＩＡキット」という）を用いて、添付文書に従って測定を行い、各検体中のＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片の濃度を算出した。ＲＩＡキットによれば、検体中のＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片（ＲＩＡキット中、「ＩＶ型コラーゲン・７Ｓ」、標的物質）は、抗ヒトＩＶ型コラーゲンウサギポリクローナル抗体と反応し、ＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片－抗ヒトＩＶ型コラーゲンウサギポリクローナル抗体複合体（複合体１）を形成する。次いで、ヨウ化したＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片（ＲＩＡキット中、「ＩＶ型コラーゲン・７Ｓ（１２５Ｉ）」）（標識抗原）を加えると、検体中の標的物質と結合しえなかった抗ヒトＩＶ型コラーゲンウサギポリクローナル抗体は前記標識抗原と反応し、標識抗原―抗ヒトＩＶ型コラーゲンウサギポリクローナル抗体複合体（複合体２）を形成する。これに、抗ウサギγ－グロブリンヤギ血清（ヤギ抗体）を加えると、当該ヤギ抗体は複合体２と反応し、標識抗原―抗ヒトＩＶ型コラーゲンウサギポリクローナル抗体－ヤギ抗体複合体を形成し、沈殿する。これにより、未反応の標識抗原を除去した後に沈殿物の放射能を測定することによって、前記標的物質（ＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片）の濃度を求めることができる。
　（相関）
　実施例２の測定結果（ＣＬ　７Ｓ：検体中のＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片の濃度（ｎｇ／ｍＬ））と、比較例１の測定結果（ＲＩＡ　７Ｓ：検体中のＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片の濃度（ｎｇ／ｍＬ））との相関関係を図６に示す。また、このうち、健常人群のみについての相関関係を図７に示す。なお、図６には、下記のＬＣ５１、ＬＣ２８を含まない（すなわち、肝硬変群：５４例）。図６に示したように、本発明の抗ＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインモノクローナル抗体固相化磁性粒子と、標識抗ＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインモノクローナル抗体と、を組み合わせたサンドイッチイムノアッセイによる測定結果（ＣＬ　７Ｓ）と、ＲＩＡキットによる測定結果（ＲＩＡ　７Ｓ）との相関は、相関係数０．９４７と、非常に高かった。しかしながら、図７に示したように、健常人群のみでは、その相関係数は０．５８１と低くなり、本発明のサンドイッチイムノアッセイによれば、健常人検体の測定値が明らかに低下することがわかった。すなわち、本発明の前記モノクローナル抗体を用いたサンドイッチイムノアッセイによれば、肝硬変群及びＮＡＳＨ群の測定値は低下しないが、健常人群の測定値のみを低下させることができ、従来のＲＩＡキットに比べて、患者群と健常人群とをより高精度に分けることができることを示している。
　（診断能の評価１）
　（実施例３）
　試料として、健常人由来の血清（健常人群１）２５例、及び、健常人由来の血清（健常人群１）３０例、の検体をそれぞれ用いた。これらの各検体を用いたこと以外は上記の実施例２と同様にして発光量を測定し、検量線を用いて、各検体中のＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片の濃度を算出した。
　（比較例２）
　実施例３と同じ検体を用いたこと以外は比較例１と同様にして、ＲＩＡキットを用いて、各検体中のＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片の濃度を算出した。
　〔分布〕
　健常人群１について、実施例３（（ｂ）ＣＬ　７Ｓ）及び比較例２（（ａ）ＲＩＡ　７Ｓ）の測定結果（測定値：検体中のＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片の濃度（ｎｇ／ｍＬ））の分布を図８に示す。また、健常人群２について、実施例３（（ｂ）ＣＬ　７Ｓ）及び比較例２（（ａ）ＲＩＡ　７Ｓ）の測定結果の分布を図９に示す。
　図８～９に示したように、本発明の前記モノクローナル抗体を用いたサンドイッチイムノアッセイにおいては、いずれの健常人群においても、ＲＩＡキットに比べて、測定値が明らかに低下し、健常人群における偽陽性率を低下できることが確認された。
　（診断能の評価２）
　実施例２（ＣＬ　７Ｓ）及び比較例１（ＲＩＡ　７Ｓ）の診断精度をＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ　Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）解析で比較した。肝硬変群のＲＯＣ曲線（ＦＰＲ（偽陽性率、１－特異度）－ＴＰＲ（陽性率、感度）曲線）を図１０に、ＮＡＳＨ群のＲＯＣ曲線を図１１に、それぞれ示す。図１０に示したように、肝硬変群では、比較例１（ＲＩＡ　７Ｓ）におけるＡＵＣ値が０．８２４であったのに対し、実施例２（ＣＬ　７Ｓ）におけるＡＵＣ値は０．８９８となり、本発明の前記モノクローナル抗体を用いたサンドイッチイムノアッセイにおいては肝硬変の診断精度が特に高いことが示された。また、図１１に示したように、ＮＡＳＨ群でも、比較例１（ＲＩＡ　７Ｓ）におけるＡＵＣ値が０．６９８であったのに対し、実施例２（ＣＬ　７Ｓ）におけるＡＵＣ値は０．８４６となり、本発明のサンドイッチイムノアッセイにおいてはＮＡＳＨの診断精度が特に高いことが示された。
　（測定可能なＩＶ型コラーゲンの態様）
　上記の実施例２と比較例１との相関においては、肝硬変群の検体のうち、比較例１の測定値が実施例２の測定値に比べて非常に低い乖離検体（ＬＣ５１、ＬＣ２８）が見いだされた。そこで、この乖離の大きい肝硬変群の検体（ＬＣ５１）、測定値の乖離が比較的小さい肝硬変群の検体（ＬＣ５８）、及び健常人群の検体（健常人検体）、にそれぞれ含まれるＩＶ型コラーゲンの態様を比較した。
　（実施例４）
　先ず、各検体５００μＬを分画用緩衝液（５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１５０　ｍＭ　ＮａＣｌ、０．０５％　ＣＨＡＰＳ、０．０９％　ＮａＮ３、ｐＨ　７．２）で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ　６　ＦＰＬＣ　１０／３００にアプライし、当該分画用緩衝液０．５　ｍＬ／ｍｉｎで展開し、ゲルろ過した。フラクションあたり０．２５ｍＬとなるよう分画して試料とし、各分画の発光量（ＣＬ　ｓｉｇｎａｌ）を、上記の実施例１の（７）と同様に測定した。また、コントロール試料として、上記の（１）で調製したＩＶ型コラーゲン７Ｓ断片も同様に分画して測定した。
　（比較例３）
　比較対象として、ＣＩＶ０３抗体固相化磁性粒子を前記抗体固相化磁性粒子として用いたこと以外は実施例４と同様にして、各試料の各分画の発光量を測定した。
　〔結果〕
　ＣＩＶ０９抗体固相化磁性粒子を用いたとき（実施例４）の、検体ＬＣ５８の各分画の発光量（実線）を図１２の（ａ）に、検体ＬＣ５１の各分画の発光量（実線）を図１２の（ｂ）に、健常人検体の各分画の発光量（実線）を図１２の（ｃ）に、それぞれ示す。図１２の（ａ）～（ｂ）には、ＩＶ型コラーゲン７Ｓ断片の各分画の発光量（ＴｙｐｅＩＶ　ＣＯＬ　７Ｓ、点線）も合わせて示す。また、ＣＩＶ０９抗体固相化磁性粒子を用いたとき（実施例４、実線）又はＣＩＶ０３抗体固相化磁性粒子を用いたとき（比較例３、点線）の、検体ＬＣ５８の各分画の発光量を図１３の（ａ）に、ＩＶ型コラーゲン７Ｓ断片の各分画の発光量を図１３の（ｂ）に、それぞれ示す。
　図１２の（ａ）に示したように、検体ＬＣ５８では、高分子量分画にのみシグナルが検出された。一方、図１２の（ｂ）に示したように、実施例２と比較例１との間で乖離の大きかった検体ＬＣ５１では、前記高分子量分画に加えて、コラゲナーゼ処理によって得られたＩＶ型コラーゲン７Ｓ断片に相当する分子量の分画にもシグナルが検出された。また、図１３の（ａ）～（ｂ）に示したように、ＣＩＶ０３抗体固相化磁性粒子を用いて測定すると、ＩＶ型コラーゲン７Ｓ断片ではどの分画からもシグナルを検出することはできず（図１３の（ｂ））、同様に、検体ＬＣ５８中のＩＶ型コラーゲン７Ｓ断片に相当する分画にシグナルを検出することもできなかった（図１３の（ａ））。
　すなわち、肝硬変等の患者由来の検体中の「ＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片」を、小分子化されたＩＶ型コラーゲン７Ｓ断片も含めて全て網羅して測定するためには、ペプシン可溶化ＩＶ型コラーゲン断片には結合するがＩＶ型コラーゲン７Ｓ断片には結合しないモノクローナル抗体（例えば、ＣＩＶ０３抗体：比較例３）を少なくとも捕捉抗体又は標識抗体に用いたサンドイッチイムノアッセイでは十分ではないことが示された。したがって、ＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインに特異的なモノクローナル抗体を捕捉抗体及び標識抗体のいずれにも用いた本発明のサンドイッチイムノアッセイによって、肝硬変等の患者由来の検体中のＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片をより精度よく測定できることが示された。
　（定量性評価）
　上記の実施例２と比較例１との間で測定値が乖離している検体について、希釈直線性を検討した。特異的な反応によって測定値が得られている場合には、希釈して測定すると、希釈率に応じて低い測定値が得られるので、希釈直線性が認められる。
　（実施例５）
　試料として、肝硬変群の各検体を、標準溶液希釈液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、２％　ＢＳＡ、ｐＨ７．２）を用いて、５倍、又は１０倍希釈したものをそれぞれ用いた。これらの各検体を用いたこと以外は上記の実施例２と同様にして発光量を測定し、検量線を用いて、各検体中のＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片の濃度を算出した。
　（比較例４）
　実施例５と同じ検体を用いたこと以外は比較例１と同様にして、ＲＩＡキットを用いて、各検体中のＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片の濃度を算出した。
　〔結果〕
　肝硬変群の検体のうち、上記の実施例２と比較例１との間で乖離が大きかったＬＣ５１及びＬＣ２８を含む、ＬＣ２７、ＬＣ２８、ＬＣ３７、ＬＣ５１、及びＬＣ５８について、実施例５（ＣＬ　７Ｓ）及び比較例４（ＲＩＡ　７Ｓ）における、各測定値及びその回収率（測定値×希釈倍率／希釈倍率１のときの測定値×１００（％））をそれぞれ下記の表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４に示したように、いずれの検体においても、本発明の前記モノクローナル抗体を用いたサンドイッチイムノアッセイでは回収率がほぼ１００％であり、希釈直線性（定量性）を確認できたのに対して、ＲＩＡキットでは、希釈直線性が得られなかった。
　（測定値乖離検体の解析）
　（実施例６）
　上記の実施例２と比較例１との間で最も測定値の乖離が大きかった検体ＬＣ５１を、上記の（測定可能なＩＶ型コラーゲンの態様）と同様にゲルろ過し、各分画の発光量（Ｓｉｇｎａｌ）を測定した。また、対照の抗体固相化磁性粒子として、ＣＩＶ０３抗体固相化磁性粒子を用いたこと以外はこれと同様にして、各分画の発光量を測定した。さらに、得られた各分画をｐｏｏｌ　１～６に分けて、各ｐｏｏｌの発光量（Ｓｉｇｎａｌ）を実施例１の（７）と同様に測定した。他方、ゲルろ過をする前の検体ＬＣ５１も同様に測定し、直接測定値とした。
　（比較例５）
　実施例６と同じｐｏｏｌを用いたこと以外は比較例１と同様にして、ＲＩＡキットを用いて、各ｐｏｏｌの発光量を測定した。他方、ゲルろ過をする前の検体ＬＣ５１も同様に測定し、直接測定値とした。
　〔結果〕
　検体ＬＣ５１について、ＣＩＶ０９抗体固相化磁性粒子を用いたとき（実施例６、実線）の各分画の発光量及びＣＩＶ０３抗体固相化磁性粒子を用いたとき（点線）の各分画の発光量を図１４に示す。また、各ｐｏｏｌの測定値から各ｐｏｏｌ中のＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片の濃度をｐｏｏｌ回収値（ｎｇ／ｍＬ）として算出した。検体ＬＣ５１について、モノクローナル抗体を用いたサンドイッチイムノアッセイ（実施例６、ＣＬ　７Ｓ、実線）の各ｐｏｏｌ回収値、及びＲＩＡキットを用いたとき（比較例５、ＲＩＡ　７Ｓ、点線）の各ｐｏｏｌ回収値、をそれぞれ図１５に示す。
　また、ｐｏｏｌ　１～６のｐｏｏｌ回収値の合計を回収値とし、各直接測定値から、次式：回収率（％）＝回収値／直接測定値×１００より回収率を算出したところ、本発明のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチイムノアッセイ（実施例６、ＣＬ　７Ｓ）における回収率は８７％であったのに対して、ＲＩＡキット（比較例５、ＲＩＡ）においては直接測定値が低く、回収率は２３７％であり、１００％を大きく上回った。これより、ＣＩＶ０３抗体やＲＩＡキットに用いられる抗ヒトＩＶ型コラーゲンポリクローナル抗体では、試料中に存在する物質やＩＶ型コラーゲンの７Ｓドメイン以外の部位の影響を大きく受けていると推察され、これらを用いた測定では正しい値を与えていなかったと考えられる。一方、本発明の前記モノクローナル抗体を用いたサンドイッチイムノアッセイではＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片を特異的に検出できていることが示された。
　本発明によれば、患者由来の試料（陽性検体）に対する特異性を低減させることなく、健常人由来の試料（陰性検体）に対する非特異性を低減させることができ、かつ、高精度で試料中のヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片を測定することができる測定方法、及びこれに用いるためのキットを提供することが可能となる。
　血中のヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片は、肝硬変や非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の診断のためのバイオマーカーとして主に用いられているが、本発明を診断の補助に用いることにより、診断精度を高めることが可能になると共に、健常人由来の検体に対する非特異性を十分に軽減することができるため、肝線維化の初期段階における患者のスクリーニングや鑑別を可能にすることができる。

Claims (5)

  1. 　ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインに特異的に結合可能な第一のモノクローナル抗体が担体に固定されてなる捕捉抗体と、ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインに特異的に結合可能な第二のモノクローナル抗体が標識物質に結合してなる標識抗体と、を用いて、サンドイッチイムノアッセイにより、試料中のヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片を測定する、測定方法。
  2. 　前記試料と前記捕捉抗体とを接触させ、前記ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片を前記捕捉抗体で捕捉する捕捉工程と、
    　前記捕捉工程の後に、前記標識抗体と、前記捕捉抗体に捕捉されたヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片とを接触させ、前記捕捉抗体に捕捉されたヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片を標識する標識工程と、
    を含む、請求項１に記載の測定方法。
  3. 　前記ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインを含む断片と第一のモノクローナル抗体との反応系の塩濃度が０．３５Ｍ以上である、請求項１又は２に記載の測定方法。
  4. 　請求項１～３のうちのいずれか一項に記載の測定方法に用いるためのキットであり、
    　ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインに特異的に結合可能な第一のモノクローナル抗体と、第一のモノクローナル抗体に結合し得る担体と、
    　ヒトＩＶ型コラーゲン７Ｓドメインに特異的に結合可能な第二のモノクローナル抗体と、第二のモノクローナル抗体に結合し得る標識物質と、
    を含む、キット。
  5. 　第一のモノクローナル抗体が前記担体に固定されてなる捕捉抗体と、
    　第二のモノクローナル抗体が前記標識物質に結合してなる標識抗体と、
    を含む、請求項４に記載のキット。
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