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WO2021060460A1 - 生体組織損傷の修復剤の製造方法および生体組織損傷の修復剤 - Google Patents

生体組織損傷の修復剤の製造方法および生体組織損傷の修復剤 Download PDF

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WO2021060460A1
WO2021060460A1 PCT/JP2020/036252 JP2020036252W WO2021060460A1 WO 2021060460 A1 WO2021060460 A1 WO 2021060460A1 JP 2020036252 W JP2020036252 W JP 2020036252W WO 2021060460 A1 WO2021060460 A1 WO 2021060460A1
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WO
WIPO (PCT)
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mesenchymal stem
stem cells
serum
cells
cultured
Prior art date
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Application number
PCT/JP2020/036252
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English (en)
French (fr)
Inventor
加藤　幸夫
前田　悟
辻　紘一郎
金昌 邵
歩 中島
崇生 正木
盛博 土井
直樹 石内
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hiroshima University NUC
Two Cells Co Ltd
Original Assignee
Hiroshima University NUC
Two Cells Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to KR1020227013725A priority patent/KR20220066959A/ko
Priority to JP2021549037A priority patent/JP7560816B2/ja
Priority to US17/762,978 priority patent/US20220331366A1/en
Priority to EP20867960.5A priority patent/EP4035670A4/en
Priority to AU2020354743A priority patent/AU2020354743B2/en
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    • C12N2501/70—Enzymes
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a living tissue damage repairing agent and a living tissue damage repairing agent.
  • MSCs Mesenchymal stem cells
  • non-mesenchymal cells eg, neural progenitor cells, and hepatocytes
  • mesenchymal cells eg, osteoblasts, fat cells, and chondrocytes
  • a medium (serum medium) containing fetal bovine serum (FBS) is used, and a medium (serum-free medium) containing less protein derived from different animals is used.
  • FBS fetal bovine serum
  • a medium (serum-free medium) containing less protein derived from different animals is used.
  • the method can be mentioned.
  • Patent Documents 1 to 3 describe serum-free media used for culturing mesenchymal stem cells.
  • Patent Document 4 describes an agent for repairing biological tissue damage containing mesenchymal stem cells cultured in a serum-free medium, and a method for producing the repair agent.
  • mesenchymal stem cells are cultured at a normal oxygen concentration of about the atmosphere, and the mesenchymal stem cells are used as an active ingredient of a repair agent.
  • the repair agent for biological tissue damage described in Patent Document 4 has a sufficient therapeutic effect, but it is effective in the medical field if a repair agent for biological tissue damage having a higher therapeutic effect can be obtained.
  • one aspect of the present invention provides a new agent for repairing biological tissue damage, which has a significantly higher effect of repairing biological tissue damage than conventional agents for repairing biological tissue damage, and a method for producing the repair agent.
  • the purpose is.
  • the method for producing a repair agent for biological tissue damage includes a step of culturing mesenchymal stem cells at an oxygen concentration of less than 5% in a serum-free medium.
  • the serum-free medium is FGF (fibroblast growth factor), PDGF (platlet derived growth factor), EGF (epidermal growth factor), or at least one phosphorus. It contains lipids and at least one fatty acid.
  • mesenchymal stem cells are subcultured at least once in the above-mentioned culturing step.
  • the agent for repairing biological tissue damage according to the homogeneity of the present invention is compared with mesenchymal stem cells cultured in a serum-containing medium at an oxygen concentration of 5% or more.
  • a gene encoding like 4 a gene encoding Fatty Acid Binding Protein 3, a gene encoding delta-like 2 homolog (Drosophila), a gene encoding Fractose-Biphosphate Aldolase C, a gene encoding TRPM8 ,
  • the agent for repairing living tissue damage is (i) for suppressing fibrosis of living tissue, (ii) for suppressing infiltration of inflammatory cells, or (iii) macrophages. It is for controlling the activity of.
  • the biological tissue damage is acute nephropathy, chronic kidney disease, chronic renal failure, chronic glomerular nephritis, diabetic nephropathy, nephrosclerosis, and rapid progression.
  • Gloscular nephritis multiple cystic kidneys, tubulointerstitial nephritis, drug-induced nephritis, lupus nephritis, hydronephropathy, gout kidney, liver cirrhosis, pulmonary fibrosis, burns, interstitial pneumonia, drug-induced pneumonia, radiation pneumonia , Chronic obstructive pulmonary disease, acute respiratory promotion syndrome, cartilage injury, bone defect, spinal cord injury, periodontal disease, multiple sclerosis, rheumatoid arthritis, systemic erythematosus, Crohn's disease, diabetes, arteriosclerosis, myocardial infarction, stroke, Alzheimer's disease, jaundice degeneration, viral hepatitis, alcoholic hepatitis, non-alcoholic steatosis, jawbone reconstruction, palatal fissure, bone replacement material, bone defect, bone system disease, dry eye, corneal disorder, pharyngitis, arthritis, cancer , Pericance
  • the effect of repairing living tissue damage is significantly higher than that of a living tissue damage repairing agent containing mesenchymal stem cells cultured in a serum-free medium at a normal oxygen concentration of about the atmosphere.
  • a new repair agent for biological tissue damage, and a method for producing the repair agent can be provided.
  • 3 is a graph comparing the expression levels of VEGF and HGF in human bone marrow-derived mesenchymal stem cells under conditions of different oxygen concentrations in one example of the present invention.
  • 3 is a graph comparing the expression levels of VEGF in human bone marrow-derived mesenchymal stem cells under conditions of different culture times in one example of the present invention. It is a graph which compared the expression level of the gene expressed in the human bone marrow-derived mesenchymal stem cell in one Example of this invention. It is a graph which contrasted the cell number of the human bone marrow-derived mesenchymal stem cell in one Example of this invention.
  • 3 is a graph comparing the expression levels of VEGF and HGF in human bone marrow-derived mesenchymal stem cells under conditions of different media and oxygen concentrations in one example of the present invention.
  • the method for producing a repair agent for biological tissue damage is to produce mesenchymal stem cells in a serum-free medium at an oxygen concentration of less than 5%. It has a step of culturing.
  • the composition of the serum-free medium is not particularly limited as long as it is a serum-free medium capable of culturing mesenchymal stem cells, and a known serum-free medium can be appropriately used.
  • Known serum-free media include, for example, STK1 (TWOCELLS Co., Ltd.), STK2 (TWOCELLS Co., Ltd.), a complete synthetic medium kit for human mesenchymal stem cells (MSCGM-CD BulletKit) (Lonza), and mesenchymal stem cell proliferation medium DXF.
  • Stem Pro MSC SFM Xeno Free Thermo Fish Stem Cell Technology, Stem Cell, Stem Cell, Stem Cell, Stem Cell, Stem Cell, Stem Cell, Stem Cell, Stem Cell, Stem Cell, Stem Cell, Stem Cell, Stem Cell, Stem Cell, Stem Cell, Stem Cell, Stem Cell, Stem Cell, Stem Cell, Stem Cell, Stem Cell, Stem Cell, Stem Cell, Stem Cell it can.
  • compositions of the serum-free medium include, for example, (i) a serum-free medium containing (i) FGF, PDGF, EGF, at least one phospholipid, and at least one fatty acid, (ii) FGF, PDGF.
  • EGF, TGF- ⁇ (transforming growth factor- ⁇ ), serum-free medium containing at least one phospholipid and at least one fatty acid
  • a serum-free medium containing at least one phospholipid and at least one fatty acid
  • a serum-free medium containing at least one fatty acid can be mentioned. If the serum-free medium contains at least one of dexamethasone, insulin, and serum albumin, it has the effect of prolonging the survival period of mesenchymal stem cells and enhancing the proliferation of mesenchymal stem cells.
  • the serum-free mediums (i) and (iii) above may not contain TGF- ⁇ and / or HGF. Moreover, the serum-free medium of the above (ii) and (iv) may not contain HGF.
  • the phospholipid is not particularly limited, and is, for example, phosphatidic acid, lysophosphatidic acid, phosphatidylinositol, phosphatidylserine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, and phosphatidylglycerol. These phospholipids may be used alone or in combination (for example, in combination with phosphatidic acid and phosphatidylcholine). These phospholipids may be of animal origin or of plant origin.
  • the fatty acid is not particularly limited, and examples thereof include linoleic acid, oleic acid, linoleic acid, arachidonic acid, myristic acid, palmitic acid, palmitic acid, stearic acid, and the like, and these fatty acids may be used alone. It may be used in combination.
  • the serum-free medium used in the present embodiment may optionally contain components other than those having the above-mentioned compositions (for example, cholesterol and / or HGF (hepatocyte growth factor), etc.).
  • the final concentration of HGF in the basal medium described later is preferably 0.1 to 50 ng / ml, more preferably 5 ng / ml.
  • these components are not essential components for the present invention.
  • a serum-free medium containing, for example, FGF, PDGF, TGF- ⁇ , EGF, at least one phospholipid, and at least one fatty acid, more preferably dexamethasone, insulin and Mesenchymal stem cells may be cultured in a serum-free medium further containing at least one of serum albumin (hereinafter referred to as "preculture step").
  • the pre-culture step is not essential for the present invention. According to this configuration, a large amount of mesenchymal stem cells having an improved ability to repair biological tissue damage can be efficiently obtained.
  • the serum-free medium may not contain HGF or may be a basal medium such as DMEM medium.
  • the oxygen concentration when culturing mesenchymal stem cells in the pre-culture step is not particularly limited.
  • the oxygen concentration may be 21% or less, or 5% or less.
  • the lower limit of the oxygen concentration is not particularly limited and may be, for example, 1%, 3%, 5%, 10%, or 20%.
  • the basal medium for forming the serum-free medium used in the pre-culture step is not particularly limited as long as it is a medium for animal cells well known in the art, and preferred basal media include, for example, Ham's F12 medium, DMEM medium, and the like. Examples include RPMI-1640 medium, MCDB medium and the like. These basal media may be used alone or in combination of two or more.
  • the basal medium for constituting the serum-free medium is preferably a medium in which MCDB and DMEM are mixed at a ratio of 1: 1.
  • a serum-free medium obtained by adding FGF, PDGF, EGF, at least one phospholipid, and at least one fatty acid to the above-mentioned basal medium may be used for the pre-culture step.
  • the final concentration of FGF in the basal medium is preferably 0.1 to 100 ng / ml, more preferably 3 ng / ml.
  • the final concentration of PDGF in the basal medium is preferably 0.5 to 100 ng / ml, more preferably 10 ng / ml.
  • the final concentration of EGF in the basal medium is preferably 0.5 to 200 ng / ml, more preferably 20 ng / ml.
  • the total content of phospholipids in the basal medium is preferably 0.1 to 30 ⁇ g / ml, more preferably 10 ⁇ g / ml at the final concentration.
  • the total content of fatty acids with respect to the basal medium is preferably 1/1000 to 1/10 of the weight of the basal medium, and more preferably 1/100.
  • the final concentration of dexamethasone in the basal medium is preferably 10-10 to 10-5 M, more preferably 10-9 to 10-6 M.
  • the final concentration of insulin in the basal medium is preferably 0.01 to 500 ⁇ g / ml, more preferably 0.1 to 50 ⁇ g / ml.
  • the final concentration of serum albumin in the basal medium is preferably 0.01 to 50 mg / ml, more preferably 0.1 to 5 mg / ml.
  • the phospholipids and fatty acids contained in the serum-free medium can be the specific phospholipids and fatty acids already described.
  • FGF is intended to be a growth factor selected from the fibroblast growth factor (FGF) family, preferably FGF-2 (bFGF), but FGF. It may be selected from other FGF families such as -1.
  • FGF fibroblast growth factor
  • bFGF FGF-2
  • PDGF is intended to be a growth factor selected from the platelet-derived growth factor (PDGF) family, preferably PDGF-BB or PDGF-AB. ..
  • the EGF is intended to be a growth factor selected from the epidermal growth factor (EGF) family.
  • the serum-free medium is selected from the group consisting of connective tissue growth factor (CTGF: connective tissue growth factor), vascular endothelial growth factor (VEGF: vascular endothelial growth factor), and ascorbic acid compound. It may further contain one factor.
  • CTGF connective tissue growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • ascorbic acid compound it may further contain one factor.
  • the ascorbic acid compound is intended to be ascorbic acid (vitamin C) or ascorbic acid diphosphate, or a compound similar thereto.
  • the serum-free medium preferably contains a lipid antioxidant.
  • the lipid antioxidant contained in the serum-free medium can be DL- ⁇ -tocopherol acetate (vitamin E).
  • the serum-free medium may further contain a surfactant.
  • the surfactant contained in the serum-free medium can be Pluronic F-68 or Tween 80.
  • the serum-free medium may further contain insulin, transferrin, dexamethasone, serum albumin and serenate.
  • insulin may be insulin-like growth factor, derived from native cells, or produced by genetic recombination.
  • mesenchymal stem cells isolated from animal tissues such as humans by a conventionally known method are seeded in the above-mentioned serum-free medium and cultured until they grow to a desired number of cells (of course, pre-culture).
  • mesenchymal stem cells may only be maintained in serum-free medium without proliferation).
  • the culture conditions it is preferable to seed 1 to 500 mg of mesenchymal stem cells separated from tissue pieces (including mesenchymal stem cells) with respect to 1 ml of the medium, and the culture temperature is 37 ° C. ⁇ 1 ° C. and the mesenchymal stem cells.
  • the concentration of carbon dioxide (CO 2 ) in the environment in which the stem cells are cultured is preferably 10% or less.
  • the content of TGF- ⁇ with respect to the above-mentioned basal medium is preferably 0.5 to 100 ng / ml, more preferably 10 ng / ml at the final concentration.
  • mesenchymal stem cells are seeded and cultured until they grow to a desired number of cells.
  • the culture conditions it is preferable to seed 1 to 2 ⁇ 10 4 mesenchymal stem cells in 1 ml of the medium, the culture temperature is 37 ° C. ⁇ 1 ° C., and carbon dioxide in an environment for culturing the mesenchymal stem cells ( The concentration of CO 2 ) is preferably 5% or less.
  • the cell culture time is not particularly limited as long as the target number of cells can be sufficiently obtained.
  • the culturing time may be 1 to 5 hours, 1 to 10 hours, 1 to 20 hours, or 1 hour to 1 day. It may be 1 hour to 10 days, 1 hour to 30 days, or 1 hour to 50 days.
  • the culture vessel used for culturing is not particularly limited as long as the mesenchymal stem cells can proliferate.
  • the cell culture may be affected by the type of culture vessel used. Therefore, in order to culture the mesenchymal stem cells more efficiently, each mesenchymal stem cell (hereinafter, also referred to as “culture target cell”) to be cultured is pre-cultured using a culture vessel suitable for culturing. It is preferable to carry out the step.
  • the mesenchymal stem cells used in the pre-culture step are not particularly limited, but may be early mesenchymal stem cells, that is, cells that have never undergone subculture since they were collected from animal tissues such as humans. preferable.
  • each mesenchymal stem cell to be cultured in the pre-culture step (hereinafter, also referred to as “pre-culture target cell”) is suitable for culturing. It is preferable to carry out the pre-culture step using the same culture vessel. Examples of the method for selecting a culture container suitable for culturing the target cells in the pre-culture step include a method in which the target cells in the pre-culture step select the optimum culture container.
  • a method known in which a plurality of types of culture vessels are prepared, cells targeted for the pre-culture step are proliferated under the same culture conditions except that the types of culture vessels are different, and the number of cells 2 weeks after the start of culture is known. It can be determined that the culture vessel is suitable for culturing the target cells in the pre-culture step in order from the one having the largest number of cells. When the growth rate of the cells targeted for the pre-culture step is high, the pre-culture step is performed in order from the one with the shortest period for reaching 80 to 90% of the number of cells in the confluent state, even before two weeks have passed from the start of the culture. It can be determined that the culture vessel is suitable for culturing the target cells.
  • the production method of the present embodiment uses a culture vessel suitable for culturing the target cells in the pre-culture step.
  • a "culture container selection step" for selection may be further included before the pre-culture step.
  • the serum-free medium may be used in the preculture step. It is preferable to further contain cell adhesion molecules. Examples of the above-mentioned "cell adhesion molecule” include fibronectin, collagen, gelatin and the like. One type of these cell adhesion molecules may be used alone, or a plurality of types may be used in combination.
  • mesenchymal stem cells may be passaged at least once. Since mesenchymal stem cells proliferate in a scaffold-dependent manner, when the mesenchymal stem cells are locally biased and proliferate, the mesenchymal stem cells are cultured by subculturing them in the middle of the preculture step. The conditions can be improved.
  • the pre-culture step is preferably carried out during the period from the primary culture (P0) to the third subculture (P3).
  • the method for substituting mesenchymal stem cells is not particularly limited, and subculture can be performed using a conventionally known method for substituting mesenchymal stem cells. Since the condition of the mesenchymal stem cells after passage is good, in the above-mentioned pre-culture step, the above-mentioned mesenchymal system is used by using a cell release agent containing no components derived from mammals and microorganisms at the time of passage. It is preferable to detach the stem cells. Examples of the above-mentioned "cell exfoliating agent containing no components derived from mammals and microorganisms" include ACCUTASE (Innovative Cell Technologies, Inc.).
  • the mesenchymal stem cells are subjected to serum-free medium (for example, FGF, PDGF, EGF, at least one phospholipid, and at least one fatty acid).
  • serum-free medium for example, FGF, PDGF, EGF, at least one phospholipid, and at least one fatty acid.
  • Mesenchymal stem cells are cultured at an oxygen concentration of less than 5% in a medium, more preferably a serum-free medium further containing at least one of dexamethasone, insulin and serum albumin (hereinafter, "hypoxic culture step”). ").
  • the serum-free medium may or may not contain TGF- ⁇ and / or HGF.
  • a gas that can be contacted with the mesenchymal stem cells (more specifically, the medium used for culturing the mesenchymal stem cells) when culturing the mesenchymal stem cells (hereinafter, also referred to as "environment for culturing the mesenchymal stem cells"".
  • the concentration of oxygen contained in may be less than 5%, 4% or less, 3% or less, 2% or less, or 2% or less. It may be 1% or less, but is preferably 3% or less, and even more preferably 1% or less.
  • the lower limit of the concentration of oxygen contained in the gas is not particularly limited and may be set higher than, for example, 0%.
  • the lower limit of the concentration of oxygen contained in the gas may be such that the mesenchymal stem cells can grow and do not die.
  • the repairing action of biological tissue damage in the cultured mesenchymal stem cells is enhanced.
  • the environment for culturing mesenchymal stem cells may contain gas components other than oxygen.
  • the gas component is not particularly limited as long as it is a gas component that can grow without killing mesenchymal stem cells in the gas component, and a gas component other than oxygen contained in the atmosphere (for example, nitrogen, carbon dioxide, etc.) It may be argon or a mixture thereof).
  • % indicating the concentration of a gas component such as oxygen is more specifically intended to be “volume%”.
  • the gas may be filled inside a device such as an incubator that is usually used when culturing the mesenchymal stem cells, or the inside of the device such as an incubator is airtight.
  • a container may be installed and the gas may be filled inside the container, or an airtight container (for example, a room) may be installed so as to surround equipment such as an incubator, and the gas may be installed inside the airtight container. May be satisfied.
  • the gas preferably contains about 5% carbon dioxide (CO 2 ) in order to adjust the pH of the medium.
  • the "serum-free medium” in the hypoxic culture step may contain TGF- ⁇ .
  • the serum-free medium used in the pre-culture step may be referred to as "serum-free medium A”
  • the serum-free medium used in the low oxygen culture step may be referred to as "serum-free medium B”.
  • the serum-free medium A in the above preculture step section As described above, the description thereof is omitted here.
  • the content of the above-mentioned components contained in the serum-free medium A used in the pre-culture step may be the same as the content described for the serum-free medium B.
  • the serum-free medium A the serum-free medium B may be used.
  • the culturing time in the hypoxic culturing step is not particularly limited as long as the culturing time reaches the target number of mesenchymal stem cells.
  • the culturing time may be 6 to 12 hours, 6 hours to 24 hours (1 day), 6 hours to 48 hours, or 12 hours to 24 hours. It may be 24 hours to 48 hours, but it is preferably 12 hours or more, and even more preferably 24 hours.
  • the method for selecting a culture vessel suitable for the growth of the target cells in the hypoxic culture step is as described in the section of "pre-culture step" above, and thus the description thereof is omitted here.
  • the serum-free medium B may further contain cell adhesion molecules. Since the cell adhesion molecule is as described in the section of "pre-culture step", the description thereof is omitted here.
  • mesenchymal stem cells may be passaged at least once. Culture conditions can be improved by subculturing mesenchymal stem cells during the hypoxic culture process.
  • mesenchymal stem cells after the first passage (P1) after collection from animal tissues such as humans.
  • the production method of the present embodiment further includes a culture vessel selection step of selecting a culture vessel suitable for the proliferation of mesenchymal stem cells before the low oxygen culture step (or before the preculture step). You may.
  • the method for selecting a culture vessel suitable for the proliferation of mesenchymal stem cells is as described in the above section “Pre-culture step”, and thus the description thereof will be omitted here.
  • the production method of the present embodiment further includes a screening step of screening non-neoplastic mesenchymal stem cells from mesenchymal stem cells after a preculture step and / or a hypoxic culture step. It is also possible that the screening process may not be included.
  • a repair agent containing mesenchymal stem cells having no tumorigenicity can be realized, and the safety of the repair agent can be realized. Can be improved.
  • the tumorigenicity of mesenchymal stem cells can be examined by a tumorigenicity test method using in vivo high-sensitivity immunodeficient mice (NOG mice).
  • mesenchymal stem cells for example, 1,000,000 cells
  • Hela cells for example, 1,000 cells
  • NOG mice are transplanted subcutaneously at 10 locations.
  • repair agent for biological tissue damage is a mesenchymal stem cell cultured in a serum-containing medium at an oxygen concentration of 5% or more.
  • the gene encoding angiopoietin-like 4 (or its homolog), the gene encoding Fatty Acid Binding Protein 3 (or its homolog), the gene encoding delta-like 2 homolog (Drosophila), Fructo
  • the expression level of the gene encoding Bifosphate Aldolase C (or its homolog), the gene encoding TRPM8 channel-associated factor 2 (or its homolog), and the gene encoding REST corepressor 2 (or its homolog) Mesenchymal stem cells that are at least 3 times or more (preferably 3 times or more, 4 times or more, 5 times or more, 10 times or more, 20 times or more, 40 times or more, or 50 times or more independently of each gene). Contains.
  • the repair agent of the present embodiment is a gene encoding Angiopoietin-like 4 (or its homolog), Fatty, as compared with mesenchymal stem cells cultured in a serum-containing medium at an oxygen concentration of 1% or less.
  • the expression level of the gene encoding (or its homolog) and the gene encoding REST corepressor 2 (or its homolog) is at least 2 times or more (preferably, each gene is independently 3 times or more and 4 times or more). It contains mesenchymal stem cells that are 5 times or more, 10 times or more, or 15 times or more).
  • the repair agent of the present embodiment is a gene encoding Angiopoietin-like 4 (or its homolog), Fatty Acid, as compared with mesenchymal stem cells cultured in a serum-free medium at an oxygen concentration of 5% or more.
  • the expression level of the gene encoding the homolog) and the gene encoding REST corepressor 2 (or the homolog) is 2 times or more (preferably, each gene is independently 3 times or more or 4 times or more).
  • the agent for repairing biological tissue damage may contain mesenchymal stem cells cultured in a serum-free medium at an oxygen concentration of less than 5%.
  • Angiopoietin-like 4 is a protein involved in glucose metabolism and lipid metabolism, and is encoded by the ANGPTL4 gene in humans.
  • Fatty Acid Binding Protein 3 is a fatty acid-binding protein, which is encoded by the FABP3 gene in humans.
  • Delta-like 2 Homolog is an epidermal growth factor-like protein, encoded by the DLK2 gene.
  • Fructose-Biphate Aldolase C is a C-type aldolase, which is encoded by the ALDOC gene in humans.
  • TRPM8 channel-associated factor 2 is a protein that regulates transient receptor potential melastatin member 8 (TRPM8), and is encoded by the TCAF2 gene in humans.
  • REST corepressor 2 is a protein that regulates gene expression in neurons and is encoded by the RCOR2 gene in humans.
  • the repair agent of the present embodiment is intended to be a drug having an effect of promoting the repair of biological tissue damage.
  • the repair agent of the present embodiment can be said to be a drug for suppressing fibrosis of living tissue (in other words, a fibrosis inhibitor), and a drug for suppressing infiltration of inflammatory cells (in other words, a drug for suppressing infiltration of inflammatory cells). It can be said that it is an infiltration inhibitor of inflammatory cells), and it can be said that it is a drug for controlling macrophage activity (in other words, a macrophage activity regulator).
  • “suppressing fibrosis of living tissue” is intended to suppress tissue hardening due to abnormal growth of connective tissue or abnormal accumulation of collagen in connective tissue.
  • the connective tissue constituting the living tissue may overgrow in the process of healing.
  • “Suppressing fibrosis of living tissue” means, for example, that after the living tissue is damaged, the connective tissue constituting the living tissue suppresses tissue hardening due to abnormal proliferation or abnormal accumulation of collagen in the connective tissue. Intended to be.
  • inflammatory cells for example, macrophages, lymphocytes, and neutrophils
  • inflammatory cells for example, macrophages, lymphocytes, and neutrophils
  • controlling macrophage activity is intended to change the phenotype of macrophages.
  • controlling macrophage activity is intended, for example, to transform macrophages from Pro-inflammatory phenotype (M1 type) macrophages that promote tissue inflammation to Immuno-regularity phenotype (M2 type) macrophages. By changing macrophages from M1 type to M2 type, as an example, tissue inflammation can be calmed down.
  • the mesenchymal stem cells When culturing mesenchymal stem cells, the mesenchymal stem cells may be cultured only in a single serum-free medium, or the mesenchymal stem cells may be cultured in a plurality of serum-free media. Good. When culturing mesenchymal stem cells in a plurality of serum-free media, for example, after culturing the mesenchymal stem cells in a desired serum-free medium, the desired serum-free medium is replaced with another serum-free medium. Then, the mesenchymal stem cells may be further cultured in the other serum-free medium.
  • composition of the serum-free medium described above is described in [1. Since it has been described in the section of [Method for manufacturing a repair agent], the description thereof will be omitted here.
  • the mesenchymal stem cells used in the repair agent of the present embodiment include not only mesenchymal stem cells isolated from tissues such as bone marrow, fat, synovium, pulp, and root membrane, but also placenta, umbilical cord blood, and umbilical cord. It also includes mesenchymal stem cells isolated from tissues such as. Mesenchymal stem cells isolated from adipose tissue are preferable from the viewpoint of realizing a repair agent having a higher repair action.
  • the mesenchymal stem cells used in the repair agent of the present embodiment may be human mesenchymal stem cells (for example, collected human mesenchymal stem cells), rats, and target biological tissues.
  • the pharynx can be raised. That is, the repair agent may repair damage to these living tissues.
  • the mesenchymal stem cells used in the present invention have a significantly higher effect of suppressing tissue fibrosis, suppressing inflammatory cell infiltration, and promoting inflammation, which are significantly higher than those of mesenchymal stem cells cultured in a serum-free medium at a normal oxygen concentration of about the atmosphere. It has the effect of transforming type macrophages (M1) into anti-inflammatory macrophages (M2).
  • Pathological conditions include, for example, acute nephropathy, chronic kidney disease, chronic renal failure, chronic glomerulonephritis (IgA nephropathy, membranous nephropathy, membranous proliferative glomerulonephritis, focal glomerulonephritis, etc.), and others.
  • Kidney disease eg, diabetic nephropathy, nephrosclerosis, rapidly progressive glomerulonephritis, multiple cystic kidney, tubulointerstitial nephritis, drug-induced nephritis, lupus nephritis, hydronephritis, ventilated kidney, etc.
  • liver cirrhosis Pulmonary fibrosis, burns, interstitial pneumonia, drug-induced pneumonia, radiation pneumonia, chronic obstructive pulmonary disease, acute respiratory promotion syndrome, cartilage damage, bone defects, spinal cord damage, periodontal disease, multiple sclerosis, joints Rheumatoid, systemic erythematosus, clonosis, diabetes, arteriosclerosis, myocardial infarction, stroke, Alzheimer's disease, luteal degeneration, viral hepatitis, alcoholic hepatitis, non-alcoholic steatosis, jawbone reconstruction, palatal fissure, bone replacement material, Examples thereof include bone
  • the repair agent of the present embodiment is a gene encoding Angiopoietin-like 4, a gene encoding Fatty Acid Binding Protein 3, as compared with mesenchymal stem cells cultured in a serum-containing medium at an oxygen concentration of 5% or more.
  • pharmaceutically acceptable additives eg, buffers, antioxidants, thickeners, and excipients
  • pharmaceutically acceptable additives eg, buffers, antioxidants, thickeners, and excipients
  • the amount of the additive is not particularly limited, but for example, 0.01 to 50% by weight, 0.01 to 40% by weight, 0.01 to 30% by weight, 0.01 to 20% by weight of the restoration agent of the present embodiment. It can be% by weight, 0.01 to 10% by weight, or 0.01 to 1% by weight.
  • the number of mesenchymal stem cells contained in the repair agent of the present embodiment is not particularly limited, and can be appropriately set according to the body weight of the administration target. For example, 1 ⁇ 10 2 cells to 1 ⁇ 10 10 cells, 1 ⁇ 10 3 cells to 1 ⁇ 10 10 cells, 1 ⁇ 10 4 cells to 1 ⁇ 10 10 cells, 1 ⁇ 10 5 per dose (1 administration). cells ⁇ 1 ⁇ 10 10 cells may be 1 ⁇ 10 6 cells ⁇ 1 ⁇ 10 10 cells. Of course, the number of cells may be 10 10 or more per dose (administration).
  • Examples of the method for administering the repair agent include vascular injection and injection into a local area (spinal cord (for example, spinal cord cavity), muscle, joint, brain, etc.).
  • spinal cord for example, spinal cord cavity
  • muscle for example, joint, brain, etc.
  • the subject of administration of the agent for repairing biological tissue damage according to the embodiment of the present invention is not particularly limited.
  • Examples of the administration target include humans and mammals other than humans (cattle, pigs, sheep, goats, horses, dogs, cats, rabbits, mice, rats, etc.).
  • the single dose of the repair agent of the present embodiment is not particularly limited, but the number of mesenchymal stem cells administered per 1 kg of body weight in the administration subject is 1 ⁇ 10 6 cells to 1 ⁇ 10 7 cells, 1 It may be ⁇ 10 5 cells to 1 ⁇ 10 8 cells, 1 ⁇ 10 4 cells to 1 ⁇ 10 9 cells.
  • the number of mesenchymal stem cells administered per human can be 1 ⁇ 10 4 cells to 1 ⁇ 10 9 cells, and 2 ⁇ 10 3 considering the difference in body surface area between the administration target and humans. Cells ⁇ 2 x 108 cells can be.
  • the present invention can also be configured as follows.
  • the "method for repairing biological tissue damage” described below may be a “method for preventing biological tissue damage” or a “method for treating biological tissue damage”.
  • a gene encoding angiopoietin-like 4 Compared with mesenchymal stem cells cultured in a serum-containing medium at an oxygen concentration of 5% or more, a gene encoding angiopoietin-like 4, a gene encoding Fatty Acid Binding Protein 3, and delta-like 2
  • the expression level of the gene encoding homolog (Drosophila), the gene encoding Fluctose-Biphosphate Aldolase C, the gene encoding TRPM8 channel-associated factor 2 and the gene encoding REST corepressor 2 at least 3 times or more are 3 times or more.
  • Repair agents for tissue damage containing foliar stem cells to target organisms eg, humans or non-human mammals (cattle, pigs, sheep, goats, horses, dogs, cats, rabbits, mice, rats, etc.)
  • a method for repairing biological tissue damage which comprises a step of administration.
  • the above-mentioned repair agent for biological tissue damage is (i) for suppressing fibrosis of biological tissue, (ii) for suppressing infiltration of inflammatory cells, or (iii) macrophage activity.
  • the repair method according to ⁇ 1> which is for controlling.
  • the above-mentioned biological tissue damage includes acute renal disorder, chronic kidney disease, chronic renal failure, chronic glomerulonephritis, diabetic nephropathy, nephrosclerosis, rapidly progressive glomerulonephritis, multiple cystic kidney, and intertubal tubules.
  • Example 1 We investigated the inhibitory effect of renal fibrosis by transplanting mesenchymal stem cells cultured in a serum-free medium.
  • Example 1 Preparation of MSC>
  • serum-free medium STK2 medium, TWOCELLS Co., Ltd .: corresponding to "Serum-free medium containing FGF, PDGF, EGF, at least one phospholipid, and at least one fatty acid"
  • Human mesenchymal stem cells cultured in the medium were used.
  • human bone marrow-derived mesenchymal stem cells 1% O 2 hMSC
  • human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (21% O 2 hMSC) cultured for 24 hours in a 21% oxygen environment were used. All human bone marrow-derived mesenchymal stem cells were cultured under atmospheric pressure.
  • a renal fibrosis model was created by blocking the left renal artery of a male Sprague Dawley rat (SD rat) for 60 minutes at 8 weeks of age and then opening the block (renal ischemia-reperfusion injury (IRI)). IRI followed a well-known method.
  • N 2 (left kidney collected from 2 IRI-treated SD rats) in the "21% O 2 hMSC group”
  • n 3 (3 animals ) in the "PBS group” and "1% O 2 hMSC group”
  • the effect of the drug was evaluated using the left kidney collected from SD rats subjected to IRI.
  • ⁇ Method Slaughter and data collection> Twenty-one days after administration of the drug (1% O 2 hMSC, 21% O 2 hMSC, or PBS), the left kidney of SD rats was collected. Renal fibrosis and renal fibrosis were performed on the collected kidneys by Western blotting using an anti- ⁇ -SMA antibody and immunostaining using an anti- ⁇ -SMA antibody, an anti-collagen type I antibody, and an anti-collagen type III antibody. The increase and decrease of extracellular matrix associated with this was evaluated. The Western blotting method was confirmed based on a well-known Western blotting protocol. In addition, immunostaining was performed using a commercially available antibody based on a well-known protocol.
  • FIG. 1 shows the results of Western blotting using an anti- ⁇ -SMA antibody
  • FIG. 2 shows the results of immunostaining using an anti- ⁇ -SMA antibody, an anti-collagen type I antibody, and an anti-collagen type III antibody.
  • ⁇ -SMA which is a molecular marker of renal fibrosis induced by applying IRI to SD rats
  • collagen type I which is an extracellular matrix whose expression is enhanced with renal fibrosis.
  • collagen type III was suppressed in the "21% O 2 h MSC group” as compared to the "PBS group”. Furthermore, the expression of ⁇ -SMA, collagen type I and collagen type III was more strongly suppressed in the "1% O 2 hMSC group” than in the "21% O 2 hMSC group”.
  • Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (1% O 2 hMSC group) cultured for 24 hours in a low oxygen concentration environment were defined as human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (21% O 2 hMSC group) cultured for 24 hours in a normal oxygen concentration environment. Compared with the group), it was found that the effect of suppressing the development of renal fibrosis was enhanced.
  • Example 2-1 The effect of suppressing fibrosis was examined by using the culture supernatant of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells cultured in a serum-free medium.
  • Fibrosis was induced in human proximal tubule cells (HK2) by TGF- ⁇ 1 stimulation, and the culture supernatant of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells was added to the human proximal tubule cells (HK2) (hereinafter, “MSC”). -CM ”) was added to evaluate the expression level of ⁇ -SMA.
  • Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells were cultured in STK2 medium for 24 hours in a 21% oxygen environment. After removing STK2 medium from the culture to obtain human bone marrow-derived mesenchymal stem cells, the human mesenchymal stem cells were cultured for 24 hours in a 21% oxygen environment using serum-free DMEM. The culture supernatant of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells after culturing for 24 hours was designated as "21% O 2 MSC-CM".
  • human bone marrow-derived mesenchymal stem cells were cultured in STK2 medium for 24 hours in a 1% oxygen environment. After removing STK2 medium from the culture to obtain human bone marrow-derived mesenchymal stem cells, the human bone marrow-derived mesenchymal stem cells were cultured for 24 hours in a 1% oxygen environment using serum-free DMEM. The culture supernatant of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells after culturing for 24 hours was designated as "1% O 2 MSC-CM". In addition, in both "21% O 2 MSC-CM" and "1% O 2 MSC-CM", human bone marrow-derived mesenchymal stem cells were cultured under atmospheric pressure.
  • ⁇ Evaluation method Human proximal tubule cells (HK2), were seeded at 1 ⁇ 10 5 cells / well in 6-well plates, and cultured for 18 hours with 10% bovine serum-containing DMEM medium (Sigma-Aldrich Co.), the number of cells after culturing Was confirmed to be subconfluent (80-90% of cells in the confluent state). Then, DMEM medium containing 10% bovine serum was removed by suction, and HK2 was washed with PBS. The HK2 was seeded in serum-free DMEM, 21% O 2 MSC-CM or 1% O 2 MSC-CM was added, and the cells were cultured in an air atmosphere for 24 hours. After culturing for 24 hours, TGF- ⁇ 1 was added to the culture. After adding TGF- ⁇ 1 to the culture, the cells were cultured for another 12 hours, and then the expression of ⁇ -SMA in HK2 was evaluated by the Western plot method.
  • FIG. 3 shows the results of Western blotting using an anti- ⁇ -SMA antibody in HK2.
  • FIG. 3 shows that (i) culture supernatant and TGF- ⁇ 1 were not added (serum-free).
  • the expression level of ⁇ -SMA (1 to 3 lanes from the left in FIG. 3) when DMEM was added and TGF- ⁇ 1 was not added, and (ii) TGF- ⁇ 1 was added without adding the culture supernatant.
  • the expression level of ⁇ -SMA when serum-free DMEM and TGF- ⁇ 1 were added was that of ⁇ -SMA when serum-free DMEM was added and TGF- ⁇ 1 was not added.
  • the expression level of ⁇ -SMA was increased as compared with the expression level. This indicates that TGF- ⁇ can induce human proximal tubular cells into a fibrotic state.
  • the expression level of ⁇ -SMA when 21% O 2 MSC-CM was added as the culture supernatant and TGF- ⁇ 1 was further added was the expression level of ⁇ -SMA when serum-free DMEM and TGF- ⁇ 1 were added. In comparison with, suppression of ⁇ -SMA expression was observed.
  • the expression level of ⁇ -SMA when 1% O 2 MSC-CM was added as the culture supernatant and TGF- ⁇ 1 was further added was as follows: 21% O 2 MSC-CM was added as the culture supernatant and TGF- ⁇ 1 was further added. Compared with the expression level of ⁇ -SMA when added, the expression level of ⁇ -SMA was more suppressed.
  • Example 2-2 Using human adipose-derived mesenchymal stem cells as the MSC, the culture supernatant of human adipose-derived mesenchymal stem cells cultured in a serum-free medium, as in [Example 2-1], has an effect of suppressing fibrosis. Study was carried out.
  • Human adipose-derived mesenchymal stem cells were cultured in STK2 medium for 24 hours in a 21% oxygen environment. After removing STK2 medium from the culture to obtain human adipose-derived mesenchymal stem cells, the human adipose-derived mesenchymal stem cells were cultured for 24 hours in a 21% oxygen environment using serum-free DMEM. The culture supernatant of human adipose-derived mesenchymal stem cells after culturing for 24 hours was designated as "21% O 2 AMSC-CM".
  • human adipose-derived mesenchymal stem cells were cultured in STK2 medium for 24 hours in a 1% oxygen environment. After removing STK2 medium from the culture to obtain human adipose-derived mesenchymal stem cells, the human adipose-derived mesenchymal stem cells were cultured for 24 hours in a 1% oxygen environment using serum-free DMEM. The culture supernatant of human adipose-derived mesenchymal stem cells after culturing for 24 hours was designated as "1% O 2 AMSC-CM". In addition, human adipose-derived mesenchymal stem cells were cultured under atmospheric pressure for both "21% O 2 AMSC-CM" and "1% O 2 AMSC-CM".
  • ⁇ Evaluation method Human proximal tubule cells (HK2), were seeded at 1 ⁇ 10 5 cells / well in 6-well plates, and cultured for 18 hours with 10% bovine serum-containing DMEM medium (Sigma-Aldrich Co.), the number of cells after culturing Was confirmed to be subconfluent (80-90% of cells in the confluent state). Then, DMEM medium containing 10% bovine serum was removed by suction, and HK2 was washed with PBS. The HK2 was seeded in serum-free DMEM, 21% O 2 AMSC-CM or 1% O 2 AMSC-CM was added, and the cells were cultured in an air atmosphere for 24 hours. After culturing for 24 hours, TGF- ⁇ 1 was added to the culture. After adding TGF- ⁇ 1 to the culture, the cells were cultured for another 12 hours, and then the expression of ⁇ -SMA in HK2 was evaluated by the Western plot method.
  • FIG. 4 shows the results of Western blotting using an anti- ⁇ -SMA antibody in HK2.
  • FIG. 4 shows the expression level of ⁇ -SMA when (i) the culture supernatant and TGF- ⁇ 1 were not added (serum-free DMEM was added and TGF- ⁇ 1 was not added) (left of FIG. 4). 1 to 3 lanes), (ii) Expression level of ⁇ -SMA when TGF- ⁇ 1 was added without adding the culture supernatant (from the left of FIG. 4) when TGF- ⁇ 1 was added (serum-free DMEM and TGF- ⁇ 1 were added).
  • the expression level of ⁇ -SMA when serum-free DMEM and TGF- ⁇ 1 were added was that of ⁇ -SMA when serum-free DMEM was added and TGF- ⁇ 1 was not added.
  • the expression level of ⁇ -SMA was increased as compared with the expression level. This indicates that TGF- ⁇ can induce human proximal tubular cells into a fibrotic state.
  • the expression level of ⁇ -SMA when 21% O 2 AMSC-CM was added as the culture supernatant and TGF- ⁇ 1 was further added was the expression level of ⁇ -SMA when serum-free DMEM and TGF- ⁇ 1 were added. In comparison with, suppression of ⁇ -SMA expression was observed.
  • the expression level of ⁇ -SMA when 1% O 2 AMSC-CM was added as the culture supernatant and TGF- ⁇ 1 was further added was as follows: 21% O 2 AMSC-CM was added as the culture supernatant and TGF- ⁇ 1 was further added. Suppression of the expression level of ⁇ -SMA was observed to the same extent as the expression level of ⁇ -SMA when added.
  • ⁇ Summary> Human adipose-derived mesenchymal stem cells (21% O 2 AMSC-CM) cultured in an environment with an oxygen concentration of 21% and human adipose-derived mesenchymal cells cultured in an environment with a low oxygen concentration (oxygen concentration of 1%) for 24 hours or longer. Both lineage stem cells (1% O 2 AMSC-CM) strongly suppressed the induction of fibrosis stimulated by TGF- ⁇ 1.
  • human adipose-derived mesenchymal stem cells (21% O 2 AMSC-CM) cultured in an environment with an oxygen concentration of 21% and human adipose-derived cells cultured in an environment with a low oxygen concentration (oxygen concentration of 1%) for 24 hours or more.
  • Both mesenchymal stem cells 1% O 2 AMSC-CM
  • returned ⁇ -SMA expression levels which were increased by TGF- ⁇ 1 stimulation, to normal ⁇ -SMA expression levels.
  • the mesenchymal stem cells cultured in an environment with an oxygen concentration of 21% are mesenchymal stem cells cultured in an environment with a low oxygen concentration (oxygen concentration of 1%).
  • the inhibitory effect on the induction of fibrosis by stimulation with TGF- ⁇ 1 is weak.
  • human adipose-derived mesenchymal stem cells (21% O 2 AMSC-CM) cultured in an environment with a weak oxygen concentration of 21% which has a weak inhibitory effect on the induction of fibrosis stimulated by TGF- ⁇ 1.
  • FIG. 5 shows human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hereinafter, also referred to as “STK”) cultured for 24 hours in an oxygen environment similar to that of the atmosphere using STK2 medium (in other words, in an environment in which gas components are not prepared). And human bone marrow-derived mesenchymal stem cells cultured for 24 hours in a 1% oxygen environment after culturing in STK2 medium at an oxygen concentration equivalent to that of the atmosphere (in other words, in an environment where gas components are not prepared). , Also referred to as “STK H”), the results of comparison of the expression levels of surface antigens of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells are shown.
  • STK H human bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • the gas was supplied to the environment for culturing human mesenchymal stem cells from a gas cylinder that stores a gas prepared to contain oxygen (1%), carbon dioxide 5%, and nitrogen (94%).
  • HLA Human leukocyte antigen
  • B C antibody
  • BioLegend San Diego, CA
  • HLA class II anti-HLA-DR antibody BioLegend
  • mesenchymal stem cell marker BD with anti-CD-29 antibody (BioLegend), anti-CD-44 antibody (BioLegend), anti-CD-73 antibody (BioLegend), anti-CD-90 antibody (BioLegend), and anti-CD-44 antibody (BioLegend).
  • the expression level of the surface antigen was analyzed by the Flow cytometry method using FACSVerse (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ).
  • a graph showing the expression level of HLA-A, B, C antibody is shown in 101, and the count value of the expression level of HLA-A, B, C antibody is shown in 102. Further, a graph showing the expression level of the HLA-DR antibody is shown in 103, and a count value of the expression level of the HLA-DR antibody is shown in 104. The graph showing the expression level of the CD-29 antibody is shown in 105, and the count value of the expression level of the CD-29 antibody is shown in 106. The graph showing the expression level of the CD-44 antibody is shown in 107, and the count value of the expression level of the CD-44 antibody is shown in 108.
  • the graph showing the expression level of the CD-73 antibody is shown in 109, and the count value of the expression level of the CD-73 antibody is shown in 110.
  • the graph showing the expression level of the CD-90 antibody is shown in 111, and the count value of the expression level of the CD-90 antibody is shown in 112.
  • Anti-HLA-A, B, C antibodies expressed in STK as shown in Graph 101 showing the expression levels of HLA-A, B, C antibodies and the count value 102 of the expression levels of HLA-A, B, C antibodies.
  • Graph 101 showing the expression levels of HLA-A, B, C antibodies and the count value 102 of the expression levels of HLA-A, B, C antibodies.
  • the graph 103 showing the expression level of the HLA-DR antibody and the count value 104 of the expression level of the HLA-DR antibody, the expression of the HLA-DR antibody was not observed in either STK or STKH.
  • CD-29, CD-44, CD-73 and CD-90 expressed in mesenchymal stem cells was observed in both STK and STKH, and no difference was observed in the expression levels between the two. (See 105-112).
  • CD-11b, CD-34, and CD-45 which are markers (negative markers) that are not expressed in human mesenchymal stem cells, were not observed in either of them.
  • Example 4 The expression levels of VEGF and HGF contained in the culture supernatant of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells cultured in a serum-free medium were examined.
  • Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells passaged three or more times were seeded on a 6-well plate using STK2 medium and cultured until subconfluent. After culturing, the culture broth was changed from STK2 medium to serum-free DMEM, and the cells were cultured in a 3% oxygen environment for 24 hours. The culture supernatant of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells after culturing for 24 hours in a 3% oxygen environment was defined as "3% O 2 ".
  • Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells passaged three or more times were seeded on a 6-well plate and cultured using STK2 medium until they became subconfluent. After culturing, the culture broth was changed from STK2 medium to serum-free DMEM, and the cells were cultured in a 1% oxygen environment for 24 hours. The culture supernatant of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells after culturing for 24 hours in a 1% oxygen environment was defined as "1% O 2 ".
  • control human bone marrow-derived mesenchymal stem cells passaged three or more times were seeded on a 6-well plate using STK2 medium and cultured until they became subconfluent. After culturing, the culture broth was changed from STK2 medium to serum-free DMEM, and the cells were cultured in a 21% oxygen environment for 24 hours. The culture supernatant of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells after culturing for 24 hours in a 21% oxygen environment was designated as "control".
  • oxygen 1% or 21%), carbon dioxide 5%, and nitrogen (94% or 74%) are added to the 1% oxygen environment and the 21% oxygen environment.
  • the gas was supplied from a gas cylinder containing the gas prepared to contain the gas.
  • a gas obtained by mixing a gas supplied to the 1% oxygen environment and a gas supplied to the 21% oxygen environment in an appropriate ratio was supplied.
  • VEGF contained in culture supernatants (5% O 2 , 3% O 2 , 1% O 2 , and control) collected by the ELISA kit (R & D Systems, Minneapolis, Mn, USA) for measuring VEGF concentration. The concentration was measured in each group n 6. The average value of VEGF concentration is shown in the upper figure of FIG. The measured value was corrected by the total amount of protein contained in the culture supernatant, and a significant difference test from the control was performed by the Mann-Whitney U test.
  • the oxygen concentration required to enhance the secretory capacity of VEGF and HGF was less than 5%, preferably 3% or less, and most preferably 1% or less.
  • Example 5 The time course of the amount of VEGF contained in the culture supernatant when human bone marrow-derived mesenchymal stem cells were cultured in a serum-free medium under a 1% oxygen environment was investigated.
  • Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells that had been passaged three or more times were seeded on a 6-well plate using STK2 medium and cultured until they became subconfluent. After culturing, the culture broth was changed from STK2 medium to serum-free DMEM, cultured in a 21% oxygen environment for 12 hours, and then cultured in a 1% oxygen environment for 12 hours. The culture supernatant of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells after culturing for 12 hours in a 1% oxygen environment was defined as "1% O 2 12 hr".
  • Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells that had been passaged three or more times were seeded on a 6-well plate using STK2 medium and cultured until they became subconfluent. After culturing, the culture broth was changed from STK2 medium to serum-free DMEM, and the cells were cultured in a 1% oxygen environment for 24 hours. The culture supernatant of human mesenchymal stem cells after culturing for 24 hours in a 1% oxygen environment was defined as "1% O 2 24 hr".
  • control human bone marrow-derived mesenchymal stem cells passaged three or more times were seeded on a 6-well plate using STK2 medium and cultured until they became subconfluent. After culturing, the culture broth was changed from STK2 medium to serum-free DMEM, and the cells were cultured in a 21% oxygen environment for 24 hours. The culture supernatant of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells after culturing for 24 hours in a 21% oxygen environment was designated as "control".
  • the culture time is preferably 12 hours or more, more preferably 24 hours or more, in order to enhance the secretory capacity of VEGF of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells under hypoxic conditions.
  • Example 6 ⁇ Cell culture and RNA collection>
  • Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells were cultured in DMEM medium containing 10% FBS for 3 or more passages. Then, the human bone marrow-derived mesenchymal stem cells were cultured in DMEM medium containing 10% FBS under a 21% oxygen environment for 24 hours. Then, mRNA was collected from the human bone marrow-derived mesenchymal stem cells according to a known method. Hereinafter, the mRNA is referred to as mRNA (1).
  • mRNA (2) Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells were cultured in STK medium for 3 or more passages. Then, the human bone marrow-derived mesenchymal stem cells were cultured in a serum-free medium in a 1% oxygen environment for 24 hours. Then, mRNA was collected from the human bone marrow-derived mesenchymal stem cells according to a known method. Hereinafter, the mRNA is referred to as mRNA (2).
  • mRNA (3) Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells were cultured in STK medium for 3 or more passages. Then, the human bone marrow-derived mesenchymal stem cells were cultured in a serum-free medium in a 21% oxygen environment for 24 hours. Then, mRNA was collected from the human bone marrow-derived mesenchymal stem cells according to a known method. Hereinafter, the mRNA is referred to as mRNA (3).
  • mRNA (4) Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells were cultured in DMEM medium containing 10% FBS for 3 or more passages. Then, the human bone marrow-derived mesenchymal stem cells were cultured in DMEM medium containing 10% FBS under a 1% oxygen environment for 24 hours. Then, mRNA was collected from the human bone marrow-derived mesenchymal stem cells according to a known method. Hereinafter, the mRNA is referred to as mRNA (4).
  • Intra-environment by supplying gas containing oxygen (1% or 21%), carbon dioxide (5%), and nitrogen (94% or 74%) to the environment in which human bone marrow-derived mesenchymal stem cells are cultured. Oxygen concentration was adjusted.
  • the value of “amount of mRNA of gene A contained in mRNA (2) / amount of mRNA of gene A contained in mRNA (1)” is shown as “hypoxia + serum-free” and “mRNA (3).
  • the value of "amount of mRNA of gene A contained in (1) / amount of mRNA of gene A contained in (1)” is shown as “serum-free”, and "amount of mRNA of gene A contained in mRNA (4) / mRNA (mRNA)
  • the value of "amount of mRNA of gene A contained in 1)" is shown as "hypoxia”.
  • 201 of FIG. 8 is a graph showing a comparison of the expression levels of ANGPTL4, 202 of FIG. 8 is a graph showing a comparison of the expression levels of FABP3, and 203 of FIG. 8 shows a comparison of the expression levels of DLK2.
  • 204 is a graph showing a comparison of the expression level of ALDOC, 205 of FIG. 8 is a graph showing a comparison of the expression level of TCAF2, and 206 of FIG. 8 is a graph showing the comparison of the expression level of RCOR2. It is a graph which shows the comparison of.
  • the expression level of ANGPTL4 in hypoxia + serum-free is about 52 times
  • the expression level of ANGPTL4 in serum-free is about 22 times
  • the expression level of ANGPTL4 in hypoxia is about 22 times. It was about 6 times.
  • the expression level of FABP3 in hypoxia + serum-free is about 45 times
  • the expression level of FABP3 expression level in serum-free is about 15 times
  • the expression level of FABP3 in hypoxia is about 15 times. The amount was about three times.
  • the expression level of DLK2 in hypoxia + serum-free is about 24 times
  • the expression level of DLK2 in serum-free is about 8 times
  • the expression level of DLK2 in hypoxia is about 8 times. It was about double.
  • the expression level of ALDOC in hypoxia + serum-free is about 18 times
  • the expression level of ALDOC in serum-free is about 2 times
  • the expression level of ALDOC in hypoxia is about 2 times. It was about 7 times.
  • the expression level of TCAF2 in hypoxia + serum-free is about 14 times
  • the expression level of TCAF2 in serum-free is about 3 times
  • the expression level of TCAF2 in hypoxia is about 3 times. It was about 5 times.
  • the ratio of the expression level of RCOR2 in hypoxia + serum-free is about 13 times, the expression level of RCOR2 in serum-free is about 3 times, and the expression level of RCOR2 in hypoxia is about 3 times.
  • the ratio of the expression level of RCOR2 in hypoxia + serum-free is about 13 times, the expression level of RCOR2 in serum-free is about 3 times, and the expression level of RCOR2 in hypoxia is about 3 times.
  • the ratio of the expression level of RCOR2 in hypoxia + serum-free is about 13 times, the expression level of RCOR2 in serum-free is about 3 times, and the expression level of RCOR2 in hypoxia is about 3 times.
  • ⁇ Summary> The expression level of gene A in mRNA collected from human bone marrow-derived mesenchymal stem cells cultured in a serum-free medium for 24 hours under a 1% oxygen environment is a 21% oxygen environment in a DMEM medium containing 10% FBS. Compared with the expression level of gene A in the mRNA collected from human bone marrow-derived mesenchymal stem cells cultured for 24 hours in the above, all of them were more than 3 times.
  • the expression level of DLK2 in mRNA collected from human bone marrow-derived mesenchymal stem cells cultured in DMEM medium containing 10% FBS for 24 hours in a 1% oxygen environment was 21 in DMEM medium containing 10% FBS.
  • the expression level of DLK2 in mRNA collected from human bone marrow-derived mesenchymal stem cells cultured in a% oxygen environment for 24 hours was approximately twice.
  • the expression level of gene A other than DLK2 in mRNA collected from human bone marrow-derived mesenchymal stem cells cultured for 24 hours in a DMEM medium containing 10% FBS in a 1% oxygen environment contains 10% FBS.
  • the expression level of mRNA collected from human bone marrow-derived mesenchymal stem cells cultured for 24 hours in a 21% oxygen environment in DMEM medium was more than 3 times the expression level other than DLK2.
  • the expression level of ALDOC in mRNA collected from human bone marrow-derived mesenchymal stem cells cultured for 24 hours in a serum-free medium in a 21% oxygen environment is in a DMEM medium containing 10% FBS under a 21% oxygen environment.
  • the expression level of ALDOC in mRNA collected from human bone marrow-derived mesenchymal stem cells cultured for 24 hours was approximately twice.
  • the expression level of gene A other than ALDOC in mRNA collected from human bone marrow-derived mesenchymal stem cells cultured for 24 hours in a serum-free medium in a 21% oxygen environment was found in DMEM medium containing 10% FBS.
  • the expression level of DLK2 in mRNA collected from human bone marrow-derived mesenchymal stem cells cultured in a 21% oxygen environment for 24 hours was more than 3 times.
  • the amount of mRNA of gene A contained in human bone marrow-derived mesenchymal stem cells cultured in a serum-free medium for 24 hours in a 1% oxygen environment was cultured in a serum-free medium for 24 hours in a 21% oxygen environment.
  • the amount of each gene A was at least twice or more.
  • the amount of mRNA of gene A contained in human bone marrow-derived mesenchymal stem cells cultured for 24 hours in a serum-free medium in a 1% oxygen environment is in a 1% oxygen environment in a DMEM medium containing 10% FBS.
  • the amount of mRNA of gene A contained in human bone marrow-derived mesenchymal stem cells cultured in 24 hours was at least twice as much as that of all genes A. That is, by culturing human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in a serum-free medium for 24 hours in a 1% oxygen environment, the cells are cultured in a DMEM medium containing 10% FBS for 24 hours in a 1% oxygen environment. The expression level of gene A is significantly increased as compared with the case of culturing in a serum-free medium in a 21% oxygen environment for 24 hours.
  • the amount of mRNA of gene A contained in human bone marrow-derived mesenchymal stem cells cultured in a serum-free medium for 24 hours in a 1% oxygen environment was cultured in a serum-free medium for 24 hours in a 21% oxygen environment.
  • Example 7 Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells passaged three or more times using STK2 medium were cultured in STK2 medium in a 1% oxygen environment for 24 hours. The human bone marrow-derived mesenchymal stem cells were designated as "STK H”. In addition, human bone marrow-derived mesenchymal stem cells passaged three or more times using STK2 medium were cultured in STK2 medium in a 21% oxygen environment for 24 hours. The human bone marrow-derived mesenchymal stem cells were designated as "STK”.
  • Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells passaged three or more times using DMEM medium containing 10% bovine serum were cultured in DMEM medium containing 10% bovine serum for 24 hours in a 1% oxygen environment.
  • the human bone marrow-derived mesenchymal stem cells were designated as "10% FBS H”.
  • human bone marrow-derived mesenchymal stem cells passaged three or more times using DMEM medium containing 10% bovine serum were cultured in DMEM medium containing 10% bovine serum for 24 hours in a 21% oxygen environment.
  • the human bone marrow-derived mesenchymal stem cells were designated as "10% FBS”.
  • Example 8 The expression levels of VEGF and HGF contained in the culture supernatant of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells performed in DMEM medium containing FBS or STK2, which is a serum-free medium, were examined.
  • DMEM medium containing 10% FBS human bone marrow-derived mesenchymal stem cells passaged three or more times were seeded on a 6-well plate and cultured until subconfluent. After culturing, the culture medium was changed from DMEM medium containing 10% FBS to serum-free DMEM medium, and cultured in a 1% oxygen environment or a 21% oxygen environment for 24 hours.
  • the culture supernatant of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells after culturing for 24 hours in a 1% oxygen environment is defined as "DMEM 1% O 2 ", and human bone marrow-derived mesenchymal cells after culturing for 24 hours in a 21% oxygen environment.
  • the culture supernatant of the line stem cells was designated as "DMEM 21% O 2 ".
  • human bone marrow-derived mesenchymal stem cells that had been passaged three or more times were seeded on a 6-well plate and cultured using STK2 medium until they became subconfluent. After culturing, the culture medium was changed from STK2 medium to serum-free DMEM medium, and the cells were cultured in a 1% oxygen environment or a 21% oxygen environment for 24 hours.
  • the culture supernatant of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells after culturing for 24 hours in a 1% oxygen environment is defined as "STK2 1% O 2 ", and human bone marrow-derived mesenchymal cells after culturing for 24 hours in a 21% oxygen environment.
  • the culture supernatant of the line stem cells was designated as "STK2 21% O 2 ".
  • HK2 cells human renal proximal tubule epithelial cell cells
  • oxygen 1% or 21%), carbon dioxide 5%, and nitrogen (94% or 74%) are added to the 1% oxygen environment and the 21% oxygen environment.
  • the gas was supplied from a gas cylinder containing the gas prepared to contain the gas.
  • VEGF concentration and HGF concentration were measured by the same method as in Example 4.
  • VEGF and HGF The secretory capacity of VEGF and HGF in human bone marrow-derived mesenchymal stem cells was shown to be extremely high as compared with human renal proximal tubule epithelial cells.
  • human bone marrow-derived mesenchymal stem cells were subcultured in a serum-free medium, the secretory capacity of VEGF and HGF decreased, but the expression levels of VEGF and HGF were restored by culturing under 1% oxygen. was shown.
  • the repair agent produced by the present invention and the production method of the present invention can be used as a repair agent for biological tissue damage.

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Abstract

従来の生体組織損傷の修復剤よりも、生体組織損傷の修復効果が著しく高い、新たな生体組織損傷の修復剤、および、当該修復剤の製造方法を提供する。本発明の生体組織損傷の修復剤の製造方法は、無血清培地中において間葉系幹細胞を５％未満の酸素濃度で培養する工程を有する。

Description

生体組織損傷の修復剤の製造方法および生体組織損傷の修復剤
　本発明は、生体組織損傷の修復剤の製造方法および生体組織損傷の修復剤に関する。
　間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ：ＭＳＣ）は、骨髄、脂肪、滑膜、歯髄、および歯根膜等の組織からだけでなく、胎盤、臍帯血、および臍帯等の種々の組織からも単離することができる細胞であって、しかも生体外で培養して増殖させることができる細胞である。さらに、間葉系幹細胞は、間葉系の細胞（例えば、骨芽細胞、脂肪細胞、および軟骨細胞）だけでなく、非間葉系の細胞（例えば、神経前駆細胞、および肝細胞）に分化可能な、多分化能を有することから、再生医療または／および細胞治療に用いられる細胞を製造するための原料としての利用が期待されている。
　間葉系幹細胞の培養手段として、例えばウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ、ＦＢＳ）を含有する培地（血清培地）を用いる他に、異種動物由来のタンパク質の混入が少ない培地（無血清培地）を用いる手法が挙げられる。例えば、特許文献１～３には、間葉系幹細胞の培養に用いられる無血清培地が記載されている。
　間葉系幹細胞が有する機能は多種多様であって、未知の機能が多く存在することが期待されている。それ故に、間葉系幹細胞が有する未知の機能を見出そうとする試みがなされている。例えば、特許文献４には、無血清培地中で培養された間葉系幹細胞を含有している生体組織損傷の修復剤、および、当該修復剤の製造方法が記載されている。当該技術では、大気程度の通常酸素濃度にて間葉系幹細胞を培養し、当該間葉系幹細胞を修復剤の有効成分として用いている。
国際公開第２００７／０８０９１９号公報 国際公開第２０１１／１１１７８７号公報 国際公開第２０１５／０１６３５７号公報 国際公開第２０１８／１２３９６８号公報
　特許文献４に記載の生体組織損傷の修復剤は十分な治療効果を有するものであるが、更に治療効果の高い生体組織損傷の修復剤が得られれば医療分野において有効である。
　そこで、本発明の一態様は、従来の生体組織損傷の修復剤よりも、生体組織損傷の修復効果が著しく高い、新たな生体組織損傷の修復剤、および、当該修復剤の製造方法を提供することを目的とする。
　上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係る生体組織損傷の修復剤の製造方法は、無血清培地中において間葉系幹細胞を５％未満の酸素濃度で培養する工程を有する。
　本発明の一態様に係る生体組織損傷の修復剤の製造方法では、上記無血清培地は、ＦＧＦ（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）、ＰＤＧＦ（ｐｌａｔｅｌｅｔ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）、ＥＧＦ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）、少なくとも１つのリン脂質、および、少なくとも１つの脂肪酸を含有しているものである。
　本発明の一態様に係る生体組織損傷の修復剤の製造方法は、上記培養する工程では、間葉系幹細胞を少なくとも１回継代する。
　上記の課題を解決するために、本発明の一様態に係る生体組織損傷の修復剤は、５％以上の酸素濃度にて血清含有培地中で培養した間葉系幹細胞と比較して、ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－ｌｉｋｅ　４をコードする遺伝子、Ｆａｔｔｙ　Ａｃｉｄ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　３をコードする遺伝子、ｄｅｌｔａ－ｌｉｋｅ　２　ｈｏｍｏｌｏｇ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）をコードする遺伝子、Ｆｒｕｃｔｏｓｅ－Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ａｌｄｏｌａｓｅ　Ｃをコードする遺伝子、ＴＲＰＭ８　ｃｈａｎｎｅｌ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｆａｃｔｏｒ　２をコードする遺伝子、および、ＲＥＳＴ　ｃｏｒｅｐｒｅｓｓｏｒ　２をコードする遺伝子の発現量が少なくとも３倍以上である間葉系幹細胞を含有している。
　本発明の一態様に係る生体組織損傷の修復剤は、（ｉ）生体組織の線維化を抑制するためのもの、（ｉｉ）炎症細胞の浸潤を抑制するためのもの、または、（ｉｉｉ）マクロファージの活性を制御するためのものである。
　本発明の一態様に係る生体組織損傷の修復剤において、上記生体組織損傷は、急性腎障害、慢性腎臓病、慢性腎不全、慢性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、腎硬化症、急速進行性糸球体腎炎、多発性嚢胞腎、尿細管間質性腎炎、薬剤性腎炎、ループス腎炎、水腎症、痛風腎、肝硬変、肺線維症、熱傷、間質性肺炎、薬剤性肺炎、放射線肺臓炎、慢性閉塞性肺疾患、急性呼吸促進症候群、軟骨損傷、骨欠損、脊髄損傷、歯周病、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、クローン病、糖尿病、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、アルツハイマー病、黄斑変性症、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、非アルコール性脂肪肝炎、顎骨再建、口蓋裂、骨置換材、骨欠損、骨系統疾患、ドライアイ、角膜障害、咽頭炎、関節炎、癌、癌周囲線維化、または、線維症に伴う組織損傷である。
　本発明の一実施形態によれば、無血清培地を用いて大気程度の通常酸素濃度にて培養した間葉系幹細胞を含む生体組織損傷の修復剤よりも、生体組織損傷の修復効果が著しく高い、新たな生体組織損傷の修復剤、および、当該修復剤の製造方法を提供することができる。
本発明の一実施例における、ウエスタンブロット法によるα－ＳＭＡの検出結果を示す像である。 本発明の一実施例における、α－ＳＭＡ、Ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｔｙｐｅＩ、およびＣｏｌｌａｇｅｎ　ｔｙｐｅＩＩＩの免疫染色結果の像である。 本発明の一実施例における、ウエスタンブロット法によるα－ＳＭＡの検出結果を示す像である。 本発明の一実施例における、ウエスタンブロット法によるα－ＳＭＡの検出結果を示す像である。 本発明の一実施例における、修復剤として用いるヒト骨髄由来間葉系幹細胞に発現する表面抗原の発現量を対比したグラフである。 本発明の一実施例における、酸素濃度が異なる条件下にて、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞におけるＶＥＧＦおよびＨＧＦの発現量を対比したグラフである。 本発明の一実施例における、培養時間が異なる条件下にて、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞におけるＶＥＧＦの発現量を対比したグラフである。 本発明の一実施例における、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞に発現する遺伝子の発現量を対比したグラフである。 本発明の一実施例における、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞の細胞数を対比したグラフである。 本発明の一実施例における、培地および酸素濃度が異なる条件下にて、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞におけるＶＥＧＦおよびＨＧＦの発現量を対比したグラフである。
　本発明の実施の形態について以下に説明する。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態または実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態および実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。また、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ～Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意図する。
　〔１．修復剤の製造方法〕
　本発明の一実施形態に係る生体組織損傷の修復剤の製造方法（以下、「本実施形態の製造方法」とも称する）は、無血清培地中において間葉系幹細胞を５％未満の酸素濃度で培養する工程を有する。
　上記無血清培地の組成は、間葉系幹細胞の培養を行い得る無血清培地であれば特に限定されず、公知の無血清培地が適宜使用され得る。公知の無血清培地としては、例えばＳＴＫ１（株式会社ツーセル）、ＳＴＫ２（株式会社ツーセル）、ヒト間葉系幹細胞専用完全合成培地キット（ＭＳＣＧＭ－ＣＤ　ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ）（Ｌｏｎｚａ）、間葉系幹細胞増殖培地ＤＸＦ：Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ　ＤＸＦ　（Ｒｅａｄｙ－ｔｏｕｓｅ）（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ　ＧｍｂＨ．）、Ｓｔｅｍ　Ｐｒｏ　ＭＳＣ　ＳＦＭ　Ｘｅｎｏ　ｆｒｅｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ．）、および、ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ－ＡＣＦ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｋｉｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．）等を用いることができる。
　上記無血清培地の具体的な組成としては、例えば、（ｉ）ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、少なくとも１つのリン脂質、および、少なくとも１つの脂肪酸を含有している無血清培地、（ｉｉ）ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ－β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ－β）、少なくとも１つのリン脂質、および、少なくとも１つの脂肪酸を含有している無血清培地、（ｉｉｉ）ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、デキサメタゾン、インスリン、血清アルブミン、少なくとも１つのリン脂質、および、少なくとも１つの脂肪酸を含有している無血清培地、（ｉＶ）ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ－β、デキサメタゾン、インスリン、血清アルブミン、少なくとも１つのリン脂質、および、少なくとも１つの脂肪酸を含有している無血清培地を挙げることができる。なお、無血清培地がデキサメタゾン、インスリンおよび血清アルブミンの少なくとも何れか１つを含有していれば、間葉系幹細胞の生存期間の延長、および間葉系幹細胞の増殖亢進という効果を奏する。
　なお、上記（ｉ）および（ｉｉｉ）の無血清培地は、ＴＧＦ－β、および／または、ＨＧＦを含有していないものであってもよい。また、上記（ｉｉ）および（ｉｖ）の無血清培地は、ＨＧＦを含有していないものであってもよい。
　上記リン脂質としては、特に限定されず、例えば、フォスファチジン酸、リゾフォスファチジン酸、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルセリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルコリン、およびフォスファチジルグリセロール等が挙げられ、これらのリン脂質を単独で用いてもよいし、組み合わせて（例えば、フォスファチジン酸とフォスファチジルコリンとを組み合わせて）用いてもよい。これらのリン脂質は、動物由来のものであっても、植物由来のものであってもよい。
　上記脂肪酸としては、特に限定されず、例えば、リノール酸、オレイン酸、リノレイン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、パルミトイル酸、パルミチン酸、およびステアリン酸等が挙げられ、これらの脂肪酸を単独で用いてもよいし、組み合わせて用いてもよい。
　本実施形態において使用される無血清培地は、任意で、上述した組成以外の成分（例えば、コレステロール、および／または、ＨＧＦ（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）等）を含有していてもよい。後述する基礎培地に対するＨＧＦの含有量は、終濃度で、０．１～５０ｎｇ／ｍｌであることが好ましく、さらに好ましくは５ｎｇ／ｍｌである。勿論、これらの成分は、本願発明にとって必須の成分ではない。
　以下に、本実施形態の製造方法をより具体的に説明する。
　（Ａ．前培養工程）
　本実施形態の製造方法では、無血清培地（例えば、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ－β、ＥＧＦ、少なくとも１つのリン脂質、および少なくとも１つの脂肪酸を含有する無血清培地、より好ましくは、デキサメタゾン、インスリンおよび血清アルブミンの少なくとも何れか１つをさらに含有する無血清培地）において、間葉系幹細胞を培養してもよい（以下、「前培養工程」と称する）。なお、当該前培養工程は、本発明にとって必須ではない。当該構成によれば、生体組織損傷の修復能が向上した間葉系幹細胞を効率よく大量に得ることができる。なお、無血清培地は、ＨＧＦを含有していないものであってもよく、ＤＭＥＭ培地などの基礎培地であってもよい。
　前培養工程にて間葉系幹細胞を培養するときの酸素濃度は、特に限定されない。例えば、２１％以下の酸素濃度、または、５％以下の酸素濃度であってもよい。当該酸素濃度の下限値は、特に限定されず、例えば、１％、３％、５％、１０％、または、２０％であり得る。
　前培養工程に用いる無血清培地を構成するための基礎培地は、当該分野において周知の動物細胞用培地であれば特に限定されず、好ましい基礎培地としては、例えば、Ｈａｍ’ｓＦ１２培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ－１６４０培地、ＭＣＤＢ培地等が挙げられる。これらの基礎培地は、単独で使用されても、複数を混合して使用されてもよい。一実施形態において、無血清培地を構成するための基礎培地は、ＭＣＤＢとＤＭＥＭとを１：１の比率で混合した培地が好ましい。一実施形態において、上記の基礎培地に、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、少なくとも１つのリン脂質、および少なくとも１つの脂肪酸を添加した無血清培地を前培養工程に用いればよい。
　基礎培地に対するＦＧＦの含有量は、終濃度で、０．１～１００ｎｇ／ｍｌであることが好ましく、さらに好ましくは３ｎｇ／ｍｌである。基礎培地に対するＰＤＧＦの含有量は、終濃度で、０．５～１００ｎｇ／ｍｌであることが好ましく、さらに好ましくは１０ｎｇ／ｍｌである。基礎培地に対するＥＧＦの含有量は、終濃度で、０．５～２００ｎｇ／ｍｌであることが好ましく、さらに好ましくは２０ｎｇ／ｍｌである。基礎培地に対するリン脂質の総含有量は、終濃度で、０．１～３０μｇ／ｍｌであることが好ましく、さらに好ましくは１０μｇ／ｍｌである。基礎培地に対する脂肪酸の総含有量は、基礎培地の重量の１／１０００～１／１０であることが好ましく、さらに好ましくは１／１００である。
　基礎培地に対するデキサメタゾンの含有量は、終濃度で、１０－１０～１０－５Ｍであることが好ましく、更に好ましくは１０－９～１０－６Ｍである。基礎培地に対するインスリンの含有量は、終濃度で、０．０１～５００μｇ／ｍｌであることが好ましく、更に好ましくは０．１～５０μｇ／ｍｌである。基礎培地に対する血清アルブミンの含有量は、終濃度で、０．０１～５０ｍｇ／ｍｌであることが好ましく、更に好ましくは０．１～５ｍｇ／ｍｌである。
　このような無血清培地を使用することによって、無血清培地中への異種タンパク質の混入を防ぎつつ、血清含有培地と同等以上の増殖促進効果が得られ、間葉系幹細胞を所望の通り増殖させることができる。
　無血清培地が含有しているリン脂質、および脂肪酸は、既に説明した具体的なリン脂質、および脂肪酸であり得る。
　本明細書中で使用される場合、ＦＧＦは、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ：ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）ファミリーから選択される増殖因子が意図され、ＦＧＦ－２（ｂＦＧＦ）であることが好ましいが、ＦＧＦ－１等他のＦＧＦファミリーから選択されてもよい。また、本明細書中で使用される場合、ＰＤＧＦは、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ：ｐｌａｔｅｌｅｔ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）ファミリーから選択される増殖因子が意図され、ＰＤＧＦ－ＢＢまたはＰＤＧＦ－ＡＢであることが好ましい。
　ＥＧＦは、上皮増殖因子（ＥＧＦ：ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）ファミリーから選択される増殖因子が意図される。
　また、一実施形態において、無血清培地は、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ：ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ　ｔｉｓｓｕｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ：ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）およびアスコルビン酸化合物からなる群より選択される少なくとも２つの因子をさらに含有していてもよい。
　本明細書中で使用される場合、アスコルビン酸化合物は、アスコルビン酸（ビタミンＣ）もしくはアスコルビン酸２リン酸、またはこれらに類似する化合物が意図される。
　１つの局面において、無血清培地は、脂質酸化防止剤を含有していることが好ましい。一実施形態において、無血清培地に含有される脂質酸化防止剤は、ＤＬ－α－トコフェロールアセテート（ビタミンＥ）であり得る。無血清培地は、界面活性剤をさらに含有していてもよい。一実施形態において、無血清培地に含有される界面活性剤は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ－６８またはＴｗｅｅｎ　８０であり得る。
　無血清培地は、インスリン、トランスフェリン、デキサメタゾン、血清アルブミンおよびセレネートをさらに含有していてもよい。本明細書中で使用される場合、インスリンは、インスリン様増殖因子であってもよく、天然の細胞由来であっても、遺伝子組換えによって製造されたものでもよい。
　前培養工程においては、上述した無血清培地に、ヒト等の動物組織から従来公知の方法により単離された間葉系幹細胞を播種し、所望の細胞数に増殖するまで培養する（勿論、前培養工程においては、間葉系幹細胞を増殖させることなく、無血清培地中に維持するのみであってもよい）。培養条件として、培地１ｍｌに対して、１～５００ｍｇの組織片（間葉系幹細胞を含む）から分離した間葉系幹細胞を播種することが好ましく、培養温度は３７℃±１℃、かつ間葉系幹細胞を培養する環境における二酸化炭素（ＣＯ２）の濃度が１０％以下であることが好ましい。
　一実施形態において、上記の基礎培地に対するＴＧＦ－βの含有量は、終濃度で、０．５～１００ｎｇ／ｍｌであることが好ましく、さらに好ましくは１０ｎｇ／ｍｌである。
　前培養工程においては、間葉系幹細胞を播種し、所望の細胞数に増殖するまで培養する。培養条件として、培地１ｍｌに対して１～２×１０４個の間葉系幹細胞を播種することが好ましく、培養温度は３７℃±１℃、かつ間葉系幹細胞を培養する環境における二酸化炭素（ＣＯ２）の濃度が５％以下であることが好ましい。
　細胞培養時間は、目的とする細胞数が十分に得られる培養時間であれば、特に限定されない。例えば、培養時間は、１～５時間であってもよいし、１～１０時間であってもよいし、１～２０時間であってもよいし、１時間～１日間であってもよいし、１時間～１０日間であってもよいし、１時間～３０日間であってもよいし、１時間～５０日間であってもよい。
　前培養工程では、培養に用いる培養容器は、間葉系幹細胞が増殖し得るものであれば特に限定されない。例えば、ファルコン社製７５ｃｍ２フラスコ、住友ベークライト社製７５ｃｍ２フラスコ等を好適に用いることができる。但し、細胞によっては、用いる培養容器の種類によって細胞の培養が影響を受ける場合がある。このため、間葉系幹細胞をより効率よく培養させるために、培養させる対象となる間葉系幹細胞（以下、「培養対象細胞」とも称する）毎に、培養に適した培養容器を用いて前培養工程を行うことが好ましい。
　前培養工程に供される間葉系幹細胞に特に制限はないが、初期の間葉系幹細胞、すなわち、ヒト等の動物組織から採取してから一度も継代培養を経ていない細胞であることが好ましい。
　また、前培養工程において間葉系幹細胞をより効率よく増殖させるために、前培養工程において培養させる対象となる間葉系幹細胞（以下、「前培養対象細胞」とも称する）毎に、培養に適した培養容器を用いて前培養工程を行うことが好ましい。前培養工程対象細胞の培養に適した培養容器の選択方法としては、例えば、最適な培養容器を前培養工程対象細胞に選択させる方法を挙げることができる。具体的に説明すると、複数種類の培養容器を準備し、培養容器の種類が異なる以外は同一の培養条件で前培養工程対象細胞を増殖させ、培養開始から２週間後の細胞数を公知の方法によって計測し、細胞数が多いものから順に前培養工程対象細胞の培養に適した培養容器であると判断することができる。また、上記前培養工程対象細胞の増殖速度が速い場合は、培養開始から２週間経過する前であっても、コンフルエント状態の８０～９０％の細胞数に達する期間が短いものから順に前培養工程対象細胞の培養に適した培養容器であると判断することができる。
　本実施形態の製造方法の前培養工程においては、前培養工程対象細胞の増殖に適した培養容器が既に明らかになっている場合は、その培養容器を用いればよい。これに対して、前培養工程対象細胞の培養に適した培養容器が明らかになっていない等の場合には、本実施形態の製造方法は、前培養工程対象細胞の培養に適した培養容器を選択するための「培養容器選択工程」を前培養工程の前にさらに包含していてもよい。
　なお、間葉系幹細胞の増殖には、細胞が培養容器に接着することが必須条件のため、培養容器に対する間葉系幹細胞の接着が弱い場合は、前培養工程において、上記無血清培地に、細胞接着分子をさらに含有させることが好ましい。上記「細胞接着分子」としては、例えば、フィブロネクチン、コラーゲン、ゼラチン等を挙げることができる。これらの細胞接着分子は、一種類を単独で用いてもよく、複数種類を組み合わせて用いてもよい。
　また、前培養工程では、間葉系幹細胞を少なくとも１回継代してもよい。間葉系幹細胞は足場依存的に増殖するので、間葉系幹細胞が局所的に偏って増殖している等の場合に、前記前培養工程の途中で間葉系幹細胞を継代することによって培養条件を改善することができる。なお、前培養工程は、初代培養（Ｐ０）～継代３回目（Ｐ３）までの期間行うことが好ましい。
　間葉系幹細胞の継代方法としては特に限定されず、従来公知の間葉系幹細胞の継代方法を用いて継代することできる。継代後の間葉系幹細胞の状態が良好であることから、上記前培養工程では、継代を行う場合に哺乳類および微生物由来の成分を含有していない細胞剥離剤を用いて上記間葉系幹細胞を剥離することが好ましい。上記「哺乳類および微生物由来の成分を含有していない細胞剥離剤」としては、例えば、ＡＣＣＵＴＡＳＥ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ,　Ｉｎｃ.）を挙げることができる。
　ここで、上記「哺乳類および微生物由来の成分を含有していない細胞剥離剤」としてＡＣＣＵＴＡＳＥを用いる場合の継代方法の一例を説明する。（ｉ）～（ｖｉ）の手順によって間葉系幹細胞を剥離し、継代する。なお、以下に説明する継代方法では、培養容器としてＴ－２５フラスコ（ファルコン社）を用いた場合について説明する。
　（ｉ）フラスコ上の細胞層をＰＢＳ（－）５ｍＬを用いて洗浄する。
　（ｉｉ）細胞層にＡＣＣＵＴＡＳＥを２ｍＬ添加する。
　（ｉｉｉ）細胞層を室温にて２分程度静置し、フラスコからの細胞の剥離を確認のうえ、遠心管に剥離した細胞を含むＰＢＳ（－）を移す。
　（ｉｖ）フラスコにＰＢＳ（－）を７ｍＬ添加し、当該フラスコの底面をリンスする。
　（ｖ）上記（ｉｉｉ）の遠心管に上記（ｉｖ）の溶液を移し、１５００ｒｐｍ（２００～１０００×ｇ）で５分間遠心する。
　（ｖｉ）遠心管から上清を除き、５，０００個－細胞／ｃｍ２の播種濃度にて、無血清培地を用いて、細胞を新しいフラスコ上に播種する。
　（Ｂ．低酸素培養工程）
　本実施形態の製造方法においては、上記前培養工程の後に、間葉系幹細胞を、無血清培地（例えば、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、少なくとも１つのリン脂質、および少なくとも１つの脂肪酸を含有する無血清培地、より好ましくは、デキサメタゾン、インスリンおよび血清アルブミンの少なくとも何れか１つをさらに含有する無血清培地）において、間葉系幹細胞を５％未満の酸素濃度で培養する（以下、「低酸素培養工程」と称する）。なお、無血清培地は、ＴＧＦ－β、および／または、ＨＧＦを含有していないものであってもよいし、含有しているものであってもよい。
　間葉系幹細胞の培養時に当該間葉系幹細胞（より具体的に、間葉系幹細胞の培養に用いられている培地）が接触可能なガス（以下、「間葉系幹細胞を培養する環境」とも称する）に含まれる酸素の濃度は、５％未満であってもよいし、４％以下であってもよいし、３％以下であってもよいし、２％以下であってもよいし、１％以下であってもよいが、３％以下であることが好ましく、１％以下であればさらによい。上記ガスに含まれる酸素の濃度の下限値は、特に限定されず、例えば０％よりも高く設定され得る。上記ガスに含まれる酸素の濃度の下限値は、間葉系幹細胞が生育可能で死滅しない程度であればよい。
　間葉系幹細胞を培養する環境における酸素濃度が、５％未満であることにより、培養した間葉系幹細胞における生体組織損傷の修復作用（例えば、抗線維化作用、炎症細胞の浸潤抑制作用、マクロファージの活性制御作用）が増強される。
　間葉系幹細胞を培養する環境には、酸素以外のガス成分が含まれ得る。当該ガス成分は、ガス成分中で間葉系幹細胞が死滅することなく生育可能なガス成分であれば特に限定されず、大気に含まれている酸素以外のガス成分（例えば、窒素、二酸化炭素、アルゴン、またはこれらの混合物）であってもよい。
　本明細書において、酸素等のガス成分の濃度を示す「％」は、より具体的に「体積％」を意図している。
　間葉系幹細胞の培養に用いるガスについては、間葉系幹細胞を培養する際に通常用いられるインキュベータ等の機器の内部に当該ガスを満たしてもよいし、インキュベータ等の機器の内部に気密性の容器を設置し、当該容器の内部に当該ガスを満たしてもよいし、インキュベータ等の機器を囲うように気密性の容器（例えば、部屋）を設置し、当該気密性の容器の内部に当該ガスを満たしてもよい。なお、当該ガスは、培地のｐＨを調整するため、二酸化炭素（ＣＯ２）を５％程度含むことが好ましい。
　ここで、低酸素培養工程における「無血清培地」は、ＴＧＦ－βを含有していてもよい。本明細では前培養工程で使用する無血清培地を「無血清培地Ａ」と称し、低酸素培養工程で使用する無血清培地を「無血清培地Ｂ」と称する場合がある。ＴＧＦ－β以外の成分（ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、デキサメタゾン、インスリン、血清アルブミン、少なくとも１つのリン脂質、および少なくとも１つの脂肪酸等）および基礎培地については、上記前培養工程の項で無血清培地Ａに関して説明したとおりであるので、ここでは説明を省略する。また、前培養工程で使用する無血清培地Ａに含有されている上記成分の含有量は、無血清培地Ｂに関して説明した含有量と同じであり得る。なお、無血清培地Ａとして、無血清培地Ｂを用いてよい。
　低酸素培養工程における培養時間は、間葉系幹細胞が目的とする細胞数に達する培養時間であれば、特に限定されない。例えば、培養時間は、６～１２時間であってもよいし、６時間～２４時間（１日間）であってもよいし、６時間～４８時間であってもよいし、１２時間～２４時間であってもよいし、２４時間～４８時間であってもよいが、１２時間以上であることが好ましく、２４時間であればさらによい。
　低酸素培養工程対象細胞の増殖に適した培養容器の選択方法としては、上記「前培養工程」の項で説明したとおりであるのでここでは説明を省略する。
　また、培養容器に対する間葉系幹細胞の接着が弱い場合には、上記無血清培地Ｂに、細胞接着分子をさらに含有させてもよい。上記細胞接着分子については、上記「前培養工程」の項で説明したとおりであるのでここでは説明を省略する。
　低酸素培養工程では、間葉系幹細胞を少なくとも１回継代してもよい。低酸素培養工程の途中で間葉系幹細胞を継代することによって培養条件を改善することができる。
　なお、低酸素培養工程には、ヒト等の動物組織から採取してから継代１回目（Ｐ１）以降の間葉系幹細胞を供することが好ましい。
　上記低酸素培養工程の途中で間葉系幹細胞を継代する方法および前培養工程後の細胞を低酸素培養工程に供する際の継代方法については、上記「前培養工程」の項で説明したとおりであるのでここでは説明を省略する。
　本実施の形態の製造方法は、上記低酸素培養工程の前（または上記前培養工程の前）に、間葉系幹細胞の増殖に適した培養容器を選択する培養容器選択工程をさらに包含していてもよい。間葉系幹細胞の増殖に適した培養容器の選択方法としては、上記「前培養工程」の項で説明したとおりであるのでここでは説明を省略する。
　（Ｃ．スクリーニング工程）
　本実施形態の製造方法は、前培養工程および／または低酸素培養工程の後に、間葉系幹細胞から、造腫瘍性を有していない間葉系幹細胞をスクリーニングするスクリーニング工程をさらに包含していてもよく、スクリーニング工程を包含しなくてもよい。
　スクリーニング工程にて選別した間葉系幹細胞を修復剤として使用することによって、造腫瘍性を有していない間葉系幹細胞を含有している修復剤を実現することができ、修復剤の安全性を向上させることができる。
　スクリーニング工程では、間葉系幹細胞の造腫瘍性について、ｉｎ　ｖｉｖｏの高感度免疫不全マウス（ＮＯＧマウス）による造腫瘍性試験法により検討することが可能である。
　具体的には、上述した無血清培地において５％未満の酸素濃度で培養した間葉系幹細胞（例えば、１,０００,０００個）、および、Ｈｅｌａ細胞（例えば、１,０００個）を、各々、ＮＯＧマウスの皮下１０ヵ所に移植する。このとき、Ｈｅｌａ細胞の造腫瘍性（具体的には、移植箇所における腫瘍の発生）が確認できる条件下（例えば、特定のマウス飼育時間等）において、無血清培地で培養した間葉系幹細胞の造腫瘍性が確認できなければ、当該間葉系幹細胞は、造腫瘍性を有していない間葉系幹細胞であると判定することができる。
　〔２．生体組織損傷の修復剤〕
　本発明の一実施形態にかかる生体組織損傷の修復剤（以下、「本実施形態の修復剤」とも称する）は、５％以上の酸素濃度にて血清含有培地中で培養した間葉系幹細胞と比較して、ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－ｌｉｋｅ　４（または、そのホモログ）をコードする遺伝子、Ｆａｔｔｙ　Ａｃｉｄ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　３（または、そのホモログ）をコードする遺伝子、ｄｅｌｔａ－ｌｉｋｅ　２　ｈｏｍｏｌｏｇ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）をコードする遺伝子、Ｆｒｕｃｔｏｓｅ－Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ａｌｄｏｌａｓｅ　Ｃ（または、そのホモログ）をコードする遺伝子、ＴＲＰＭ８　ｃｈａｎｎｅｌ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｆａｃｔｏｒ　２（または、そのホモログ）をコードする遺伝子、および、ＲＥＳＴ　ｃｏｒｅｐｒｅｓｓｏｒ　２（または、そのホモログ）をコードする遺伝子の発現量が少なくとも３倍以上（好ましくは、各遺伝子独立して、３倍以上、４倍以上、５倍以上、１０倍以上、２０倍以上、４０倍以上、または５０倍以上）である間葉系幹細胞を含有している。
　また、本実施形態の修復剤は、１％以下の酸素濃度にて血清含有培地中で培養した間葉系幹細胞と比較して、ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－ｌｉｋｅ　４（または、そのホモログ）をコードする遺伝子、Ｆａｔｔｙ　Ａｃｉｄ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　３（または、そのホモログ）をコードする遺伝子、ｄｅｌｔａ－ｌｉｋｅ　２　ｈｏｍｏｌｏｇ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）をコードする遺伝子、Ｆｒｕｃｔｏｓｅ－Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ａｌｄｏｌａｓｅ　Ｃ（または、そのホモログ）をコードする遺伝子、ＴＲＰＭ８　ｃｈａｎｎｅｌ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｆａｃｔｏｒ　２（または、そのホモログ）をコードする遺伝子、および、ＲＥＳＴ　ｃｏｒｅｐｒｅｓｓｏｒ　２（または、そのホモログ）をコードする遺伝子の発現量が少なくとも２倍以上（好ましくは、各遺伝子独立して、３倍以上、４倍以上、５倍以上、１０倍以上、または１５倍以上）である間葉系幹細胞を含有している。
　さらに、本実施形態の修復剤は、５％以上の酸素濃度にて無血清培地で培養した間葉系幹細胞と比較して、ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－ｌｉｋｅ　４（または、そのホモログ）をコードする遺伝子、Ｆａｔｔｙ　Ａｃｉｄ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　３（または、そのホモログ）をコードする遺伝子、ｄｅｌｔａ－ｌｉｋｅ　２　ｈｏｍｏｌｏｇ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）をコードする遺伝子、Ｆｒｕｃｔｏｓｅ－Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ａｌｄｏｌａｓｅ　Ｃ（または、そのホモログ）をコードする遺伝子、ＴＲＰＭ８　ｃｈａｎｎｅｌ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｆａｃｔｏｒ　２（または、そのホモログ）をコードする遺伝子、および、ＲＥＳＴ　ｃｏｒｅｐｒｅｓｓｏｒ　２（または、そのホモログ）をコードする遺伝子の発現量が２倍以上（好ましくは、各遺伝子独立して、３倍以上、４倍以上、５倍以上、７倍以上、または１０倍以上）である間葉系幹細胞を含有している。換言すれば、本発明の一実施形態に係る生体組織損傷の修復剤は、無血清培地中において５％未満の酸素濃度で培養した間葉系幹細胞を含有していてもよい。
　ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－ｌｉｋｅ　４は、糖質代謝および脂質代謝に関与するタンパク質であり、ヒトではＡＮＧＰＴＬ４遺伝子によってコードされる。
　Ｆａｔｔｙ　Ａｃｉｄ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　３は、脂肪酸結合タンパク質であり、ヒトではＦＡＢＰ３遺伝子によってコードされる。
　ｄｅｌｔａ－ｌｉｋｅ　２　Ｈｈｏｍｏｌｏｇ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）は、上皮成長因子様タンパク質であり、ＤＬＫ２遺伝子によってコードされる。
　Ｆｒｕｃｔｏｓｅ－Ｂｉｓｐｈａｔｅ　Ａｌｄｏｌａｓｅ　Ｃは、Ｃ型アルドラーゼであり、ヒトではＡＬＤＯＣ遺伝子によってコードされる。
　ＴＲＰＭ８　ｃｈａｎｎｅｌ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｆａｃｔｏｒ　２は、ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｍｅｌａｓｔａｔｉｎ　ｍｅｍｂｅｒ　８（ＴＲＰＭ８）を調節するタンパク質であり、ヒトではＴＣＡＦ２遺伝子によってコードされる。
　ＲＥＳＴ　ｃｏｒｅｐｒｅｓｓｏｒ　２は、ニューロンの遺伝子発現を調節するタンパク質であり、ヒトではＲＣＯＲ２遺伝子によってコードされる。
　ここで、本実施形態の修復剤は、生体組織損傷の修復を促進する効果を有する薬剤を意図する。本実施形態の修復剤は、生体組織の線維化を抑制するための薬剤（換言すれば、線維化抑制剤）であるともいえ、また炎症細胞の浸潤を抑制するための薬剤（換言すれば、炎症細胞の浸潤抑制剤）であるともいえ、マクロファージの活性を制御するための薬剤（換言すれば、マクロファージ活性制御剤）であるともいえる。
　ここで「生体組織の線維化を抑制する」とは、結合組織の異常増殖あるいは結合組織でのコラーゲンの異常蓄積による組織硬化を抑制することを意図する。例えば、生体組織が損傷を受けると、治癒の過程において、生体組織を構成する結合組織が異常増殖する場合がある。「生体組織の線維化を抑制する」とは、例えば、生体組織が損傷を受けた後に、生体組織を構成する結合組織が異常増殖、あるいは結合組織でのコラーゲンの異常蓄積による組織硬化を抑制することを意図する。
　ここで「炎症細胞の浸潤を抑制する」とは、炎症細胞（例えば、マクロファージ、リンパ球、および好中球等）が、組織を破壊すること、または、組織の中に侵入して増殖することを抑制することを意図する。
　ここで「マクロファージ活性を制御する」とは、マクロファージの表現型を変化させることを意図する。「マクロファージ活性を制御する」とは、例えば、マクロファージを、組織の炎症を促進するＰｒｏ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ（Ｍ１型）マクロファージから、Ｉｍｍｕｎｅ－ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ（Ｍ２型）マクロファージへ変化させることを意図する。マクロファージをＭ１型からＭ２型へ変化させることにより、一例として、組織の炎症を鎮静化させることもできる。
　また、間葉系幹細胞を培養する場合には、単一の無血清培地中でのみ間葉系幹細胞を培養してもよいし、複数の無血清培地中で間葉系幹細胞を培養してもよい。複数の無血清培地中で間葉系幹細胞を培養する場合には、例えば、所望の無血清培地中で間葉系幹細胞を培養した後、当該所望の無血清培地を別の無血清培地に置換して、更に、当該別の無血清培地中で間葉系幹細胞を培養してもよい。
　上記無血清培地の組成は、上述した〔１．修復剤の製造方法〕の項にて説明したので、ここではその説明を省略する。
　本実施形態の修復剤に用いられる間葉系幹細胞は、骨髄、脂肪、滑膜、歯髄、および歯根膜等の組織から単離された間葉系幹細胞だけでなく、胎盤、臍帯血、および臍帯等の組織から単離された間葉系幹細胞をも包含する。より修復作用が高い修復剤を実現する観点から、脂肪から単離された間葉系幹細胞が好ましい。また、本実施の形態の修復剤に用いられる間葉系幹細胞は、ヒト間葉系幹細胞（例えば、採取されたヒト間葉系幹細胞）であってもよいし、ラット、および対象とする生体組織は、特に限定されず、例えば、腎臓、肝臓、肺、皮膚、軟骨、骨、脊髄、歯、関節、血管（動脈、および、静脈）、心臓、脳、顎、口、目、角膜、および、咽頭を挙げることができる。つまり、上記修復剤は、これらの生体組織の損傷を修復するものであり得る。
　本発明に用いる間葉系幹細胞は、無血清培地を用いて大気程度の通常酸素濃度にて培養した間葉系幹細胞に比べて著しく高い、組織線維化抑制効果、炎症細胞浸潤抑制効果および炎症促進型マクロファージ（Ｍ１）を炎症抑制型マクロファージ（Ｍ２）に変化させる効果を有する。
　上記修復剤が効能を奏する、生体組織損傷を伴う病態としては、特に限定されない。病態として、例えば、急性腎障害、慢性腎臓病、慢性腎不全、慢性糸球体腎炎（ＩｇＡ腎症、膜性腎症、膜性増殖性糸球体腎炎、巣状糸球体硬化症など）、その他の腎臓病（例えば、糖尿病性腎症、腎硬化症、急速進行性糸球体腎炎、多発性嚢胞腎、尿細管間質性腎炎、薬剤性腎炎、ループス腎炎、水腎症、通風腎など）、肝硬変、肺線維症、熱傷、間質性肺炎、薬剤性肺炎、放射線肺臓炎、慢性閉塞性肺疾患、急性呼吸促進症候群、軟骨損傷、骨欠損、脊髄損傷、歯周病、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、クローン症、糖尿病、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、アルツハイマー病、黄斑変性症、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、非アルコール性脂肪肝炎、顎骨再建、口蓋裂、骨置換材、骨欠損、骨系統疾患、ドライアイ、角膜障害、咽頭炎、関節炎、癌、癌周囲線維化、または、線維症等が挙げられる。
　本実施形態の修復剤は、５％以上の酸素濃度にて血清含有培地中で培養した間葉系幹細胞と比較して、ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－ｌｉｋｅ　４をコードする遺伝子、Ｆａｔｔｙ　Ａｃｉｄ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　３をコードする遺伝子、ｄｅｌｔａ－ｌｉｋｅ　２　ｈｏｍｏｌｏｇ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）をコードする遺伝子、Ｆｒｕｃｔｏｓｅ－Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ａｌｄｏｌａｓｅ　Ｃをコードする遺伝子、ＴＲＰＭ８　ｃｈａｎｎｅｌ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｆａｃｔｏｒ　２をコードする遺伝子、および、ＲＥＳＴ　ｃｏｒｅｐｒｅｓｓｏｒ　２をコードする遺伝子の発現量が少なくとも３倍以上である間葉系幹細胞の他に、薬学的に許容される添加剤（例えば、緩衝剤、酸化防止剤、増粘剤、および、賦形剤）を含み得る。
　上記添加剤の量は、特に限定されないが、例えば、本実施形態の修復剤の０．０１～５０重量％、０．０１～４０重量％、０．０１～３０重量％、０．０１～２０重量％、０．０１～１０重量％、または、０．０１～１重量％であり得る。
　本実施形態の修復剤に含まれる間葉系幹細胞の数は、特に限定されず、投与対象の体重に応じて適宜設定することが可能である。例えば、１服（１投与）あたり、１×１０２細胞～１×１０１０細胞、１×１０３細胞～１×１０１０細胞、１×１０４細胞～１×１０１０細胞、１×１０５細胞～１×１０１０細胞、１×１０６細胞～１×１０１０細胞であり得る。勿論、１服（投与）あたり、１０１０細胞以上であってもよい。
　上記修復剤の投与方法として、例えば、血管注射、および局所（脊髄（例えば、脊髄腔）、筋肉、関節、脳等）への注射が挙げられる。
　本発明の一実施形態に係る生体組織損傷の修復剤の投与対象は、特に限定されない。上記投与対象として、ヒトおよびヒト以外の哺乳類（ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット等）が挙げられる。
　本実施形態の修復剤の１回あたりの投与量は、特に限定されないが、投与対象において体重１ｋｇあたりに投与される間葉系幹細胞の数は１×１０６細胞～１×１０７細胞、１×１０５細胞～１×１０８細胞、１×１０４細胞～１×１０９細胞であってよい。ヒト１人あたりに投与される間葉系幹細胞の数は、１×１０４細胞～１×１０９細胞であり得、投与対象とヒトとの体表面積の違いを考慮すれば、２×１０３細胞～２×１０８細胞であり得る。
　〔３．その他〕
　本発明は、以下のように構成することも可能である。なお、以下に記載する「生体組織損傷の修復方法」は、「生体組織損傷の予防方法」または「生体組織損傷の治療方法」であってもよい。
　＜１＞５％以上の酸素濃度にて血清含有培地中で培養した間葉系幹細胞と比較して、ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－ｌｉｋｅ　４をコードする遺伝子、Ｆａｔｔｙ　Ａｃｉｄ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　３をコードする遺伝子、ｄｅｌｔａ－ｌｉｋｅ　２　ｈｏｍｏｌｏｇ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）をコードする遺伝子、Ｆｒｕｃｔｏｓｅ－Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ａｌｄｏｌａｓｅ　Ｃをコードする遺伝子、ＴＲＰＭ８　ｃｈａｎｎｅｌ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｆａｃｔｏｒ　２をコードする遺伝子、および、ＲＥＳＴ　ｃｏｒｅｐｒｅｓｓｏｒ　２をコードする遺伝子の発現量が少なくとも３倍以上である間葉系幹細胞を含有している生体組織損傷の修復剤を対象生物（例えば、ヒトまたはヒト以外の哺乳類（ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラットなど））に投与する工程を有することを特徴とする、生体組織損傷の修復方法。
　＜２＞上記生体組織損傷の修復剤は、（ｉ）生体組織の線維化を抑制するためのもの、（ｉｉ）炎症細胞の浸潤を抑制するためのもの、または、（ｉｉｉ）マクロファージの活性を制御するためのものであることを特徴とする、＜１＞に記載の修復方法。
　＜３＞上記生体組織損傷は、急性腎障害、慢性腎臓病、慢性腎不全、慢性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、腎硬化症、急速進行性糸球体腎炎、多発性嚢胞腎、尿細管間質性腎炎、薬剤性腎炎、ループス腎炎、水腎症、痛風腎、肝硬変、肺線維症、熱傷、間質性肺炎、薬剤性肺炎、放射線肺臓炎、慢性閉塞性肺疾患、急性呼吸促進症候群、軟骨損傷、骨欠損、脊髄損傷、歯周病、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、クローン病、糖尿病、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、アルツハイマー病、黄斑変性症、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、非アルコール性脂肪肝炎、顎骨再建、口蓋裂、骨置換材、骨欠損、骨系統疾患、ドライアイ、角膜障害、咽頭炎、関節炎、癌、癌周囲線維化、または、線維症に伴う組織損傷であることを特徴とする、＜１＞または＜２＞に記載の修復方法。
　〔実施例１〕
　無血清培地を用いて培養した間葉系幹細胞を移植することによる腎線維化の抑制効果の検討を行った。
　＜方法：ＭＳＣの作製＞
　本実施例１では、ＭＳＣとして、無血清培地（ＳＴＫ２培地、株式会社ツーセル：「ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、少なくとも１つのリン脂質、および少なくとも１つの脂肪酸を含有している無血清培地」に対応）を用いて培養したヒト間葉系幹細胞を用いた。
　実施例では、１％酸素環境下にて２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞（１％Ｏ２ｈＭＳＣ）を用いた。一方、比較例では、２１％酸素環境下にて２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞（２１％Ｏ２ｈＭＳＣ）を用いた。なお、いずれのヒト骨髄由来間葉系幹細胞においても、大気圧下で培養した。
　ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を培養する環境へ、酸素（１％または２１％）、二酸化炭素５％、および、窒素（９４％または７４％）を含むように調製したガスを格納するガスボンベから、当該ガスを供給した。
　＜方法：疾患のモデルの作製＞
　腎線維化モデルは、８週齢、雄のＳｐｒａｇｕｅ　Ｄａｗｌｅｙラット（ＳＤラット）の左腎動脈を６０分間遮断した後で当該遮断を開放すること（腎虚血再灌流障害（ＩＲＩ））によって作製した。ＩＲＩは、周知の方法にしたがった。
　＜方法：薬剤の投与＞
　作製したＭＳＣ（２１％Ｏ２ｈＭＳＣおよび１％Ｏ２ｈＭＳＣ）５０万ｃｅｌｌｓをそれぞれＰＢＳ２００μＬに懸濁させた。懸濁させたＭＳＣを、ＩＲＩを施したＳＤラットの血管内に投与した（２１％Ｏ２ｈＭＳＣを投与した群を「２１％Ｏ２ｈＭＳＣ群」、１％Ｏ２ｈＭＳＣを投与した群を「１％Ｏ２ｈＭＳＣ群」とも称する）。対照として、ＰＢＳ２００μＬのみを、ＩＲＩを施したＳＤラットの血管内に投与した（「ＰＢＳ群」とも称する）。
　「２１％Ｏ２ｈＭＳＣ群」ではｎ＝２（２匹のＩＲＩを施したＳＤラットから採取した左腎）、「ＰＢＳ群」および「１％Ｏ２ｈＭＳＣ群」では、ｎ＝３（３匹のＩＲＩを施したＳＤラットから採取した左腎）を用いて、薬剤の影響を評価した。
　＜方法：屠殺および採材＞
　薬剤（１％Ｏ２ｈＭＳＣ、２１％Ｏ２ｈＭＳＣ、または、ＰＢＳ）の投与後２１日経過した後、ＳＤラットの左腎を採取した。採取した腎臓に対して、抗α－ＳＭＡ抗体を用いたウエスタンブロット法、および、抗α－ＳＭＡ抗体、抗ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｔｙｐｅＩ抗体、抗ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｔｙｐｅＩＩＩ抗体を用いた免疫染色により、腎線維化および腎線維化に伴う細胞外基質の増減について評価した。なお、ウエスタンブロット法は、周知のウエスタンブロット法のプロトコールに基づいて確認した。また、免疫染色は、市販の抗体を用いて、周知のプロトコールに基づいて行った。
　＜結果＞
　図１に抗α－ＳＭＡ抗体を用いたウエスタンブロット法による結果を示し、図２に抗α－ＳＭＡ抗体、抗ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｔｙｐｅＩ抗体、および抗ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｔｙｐｅＩＩＩ抗体を用いた免疫染色の結果を示す。
　図１に示すように、「２１％Ｏ２ｈＭＳＣ群」では、「ＰＢＳ群」に比べ、腎線維化の分子マーカーであるα－ＳＭＡの発現が抑制された。さらに、「１％Ｏ２ｈＭＳＣ群」では、「２１％Ｏ２ｈＭＳＣ群」に比べ、α－ＳＭＡの発現が一層抑制された。
　図２に示す様に、ＳＤラットにＩＲＩを施すことによって誘導された、腎線維化の分子マーカーであるα－ＳＭＡと、腎線維化に伴って発現が増強される細胞外基質であるｃｏｌｌａｇｅｎ　ｔｙｐｅＩおよびｃｏｌｌａｇｅｎ　ｔｙｐｅＩＩＩとの発現は、「ＰＢＳ群」に比べ「２１％Ｏ２ｈＭＳＣ群」では抑制された。さらに、「１％Ｏ２ｈＭＳＣ群」では、「２１％Ｏ２ｈＭＳＣ群」に比べ一層強くα‐ＳＭＡ、ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｔｙｐｅＩおよびｃｏｌｌａｇｅｎ　ｔｙｐｅＩＩＩの発現が抑制された。
　＜総括＞
　低酸素濃度の環境において２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞（１％Ｏ２ｈＭＳＣ群）は、通常酸素濃度の環境において２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞（２１％Ｏ２ｈＭＳＣ群）と比較して、腎線維化の進展を抑制する作用が増強することが認められた。
　〔実施例２－１〕
　無血清培地で培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養上清による、線維化の抑制効果の検討を行った。
　ヒト近位尿細管細胞（ＨＫ２）に対してＴＧＦ－β１刺激による線維化誘導を行ない、当該ヒト近位尿細管細胞（ＨＫ２）にヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養上清（以下、「ＭＳＣ－ＣＭ」とも称する）を加え、α－ＳＭＡの発現レベルを評価した。
　＜培養上清の作製＞
　ＳＴＫ２培地を用いてヒト骨髄由来間葉系幹細胞を２１％酸素環境下で２４時間培養した。培養物からＳＴＫ２培地を除去してヒト骨髄由来間葉系幹細胞を得た後、ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ　ＤＭＥＭを用いて、当該ヒト間葉系幹細胞を２１％酸素環境下にて２４時間培養した。２４時間培養後のヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養上清を「２１％Ｏ２ＭＳＣ－ＣＭ」とした。
　また、ＳＴＫ２培地を用いてヒト骨髄由来間葉系幹細胞を１％酸素環境下で２４時間培養した。培養物からＳＴＫ２培地を除去してヒト骨髄由来間葉系幹細胞を得た後、ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ　ＤＭＥＭを用いて、当該ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を１％酸素環境下にて２４時間培養した。２４時間培養後のヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養上清を「１％Ｏ２ＭＳＣ－ＣＭ」とした。なお、「２１％Ｏ２ＭＳＣ－ＣＭ」および「１％Ｏ２ＭＳＣ－ＣＭ」ともに、大気圧下でヒト骨髄由来間葉系幹細胞を培養した。
　ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を培養する環境へ、酸素（１％または２１％）、二酸化炭素５％、および、窒素（９４％または７４％）を含むように調製したガスを格納するガスボンベから、当該ガスを供給した。
　＜評価方法＞
　ヒト近位尿細管細胞（ＨＫ２）を、６ウェルプレートに１×１０５細胞／ウェルで播種し、１０％ウシ血清含有ＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）で１８時間培養し、培養後の細胞数がサブコンフルエント（コンフルエント状態の８０～９０％の細胞数）であることを確認した。そして、１０％ウシ血清含有ＤＭＥＭ培地を吸引除去し、ＰＢＳでＨＫ２を洗浄した。当該ＨＫ２を、ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ　ＤＭＥＭに播種した後、２１％Ｏ２ＭＳＣ－ＣＭまたは１％Ｏ２ＭＳＣ－ＣＭを加え、大気雰囲気下にて２４時間培養した。２４時間の培養の後、培養物に対してＴＧＦ－β１を添加した。ＴＧＦ－β１を培養物に添加後、更に１２時間培養し、その後、ＨＫ２におけるα－ＳＭＡの発現をウエスタンプロット法で評価した。
　＜結果＞
　図３に、ＨＫ２における抗α－ＳＭＡ抗体を用いたウエスタンブロット法の結果を示す。図３は、（ｉ）培養上清およびＴＧＦ－β１を添加しなかった（ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ
　ＤＭＥＭを添加し、ＴＧＦ－β１を添加しなかった）場合のα－ＳＭＡの発現レベル（図３の左から１～３レーン）、（ｉｉ）培養上清を添加せずＴＧＦ－β１を添加した（ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ　ＤＭＥＭおよびＴＧＦ－β１を添加した）場合のα－ＳＭＡの発現レベル（図３の左から４～６レーン）、（ｉｉｉ）培養上清として２１％Ｏ２ＭＳＣ－ＣＭを添加し、さらにＴＧＦ－β１を添加した場合におけるα－ＳＭＡの発現レベル（図３の左から７～９レーン）、（ｉｖ）培養上清として１％Ｏ２ＭＳＣ－ＣＭを添加し、さらにＴＧＦ－β１を添加した場合におけるα－ＳＭＡの発現レベル（図３の左から１０～１２レーン）を示す。
　図３に示すように、ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ　ＤＭＥＭおよびＴＧＦ－β１を添加した場合におけるα－ＳＭＡの発現レベルは、ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ　ＤＭＥＭを添加し、ＴＧＦ－β１を添加しなかった場合におけるα－ＳＭＡの発現レベルに比べ、α－ＳＭＡの発現レベルが上昇した。このことは、ＴＧＦ－βによって、ヒト近位尿細管細胞を線維化した状態に誘導できることを示している。
　培養上清として２１％Ｏ２ＭＳＣ－ＣＭを添加しさらにＴＧＦ－β１を添加した場合におけるα－ＳＭＡの発現レベルは、ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ　ＤＭＥＭおよびＴＧＦ－β１を添加した場合におけるα－ＳＭＡの発現レベルに比べ、α－ＳＭＡの発現の抑制が認められた。
　培養上清として１％Ｏ２ＭＳＣ－ＣＭを添加しさらにＴＧＦ－β１を添加した場合におけるα－ＳＭＡの発現レベルは、培養上清として２１％Ｏ２ＭＳＣ－ＣＭを添加しさらにＴＧＦ－β１を添加した場合におけるα－ＳＭＡの発現レベルと比較して、よりα－ＳＭＡの発現レベルの抑制が認められた。
　＜総括＞
　低酸素濃度（酸素濃度が１％）の環境において２４時間以上培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞（１％Ｏ２ＭＳＣ－ＣＭ）は、酸素濃度が２１％の環境において培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞（２１％Ｏ２ＭＳＣ－ＣＭ）と比較して、ＴＧＦ－β１の刺激による線維化の誘導をより強く抑制した。
　〔実施例２－２〕
　ＭＳＣとして、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞を用いて、〔実施例２－１〕と同様に、無血清培地で培養したヒト脂肪由来間葉系幹細胞の培養上清による、線維化の抑制効果の検討を行った。
　＜培養上清の作製＞
　ＳＴＫ２培地を用いてヒト脂肪由来間葉系幹細胞を２１％酸素環境下で２４時間培養した。培養物からＳＴＫ２培地を除去してヒト脂肪由来間葉系幹細胞を得た後、ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ　ＤＭＥＭを用いて、当該ヒト脂肪由来間葉系幹細胞を２１％酸素環境下にて２４時間培養した。２４時間培養後のヒト脂肪由来間葉系幹細胞の培養上清を「２１％Ｏ２ＡＭＳＣ－ＣＭ」とした。
　また、ＳＴＫ２培地を用いてヒト脂肪由来間葉系幹細胞を１％酸素環境下で２４時間培養した。培養物からＳＴＫ２培地を除去してヒト脂肪由来間葉系幹細胞を得た後、ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ　ＤＭＥＭを用いて、当該ヒト脂肪由来間葉系幹細胞を１％酸素環境下にて２４時間培養した。２４時間培養後のヒト脂肪由来間葉系幹細胞の培養上清を「１％Ｏ２ＡＭＳＣ－ＣＭ」とした。なお、「２１％Ｏ２ＡＭＳＣ－ＣＭ」および「１％Ｏ２ＡＭＳＣ－ＣＭ」ともに、大気圧下でヒト脂肪由来間葉系幹細胞を培養した。
　ヒト脂肪由来間葉系幹細胞を培養する環境へ、酸素（１％または２１％）、二酸化炭素５％、および、窒素（９４％または７４％）を含むように調製したガスを格納するガスボンベから、当該ガスを供給した。
　＜評価方法＞
　ヒト近位尿細管細胞（ＨＫ２）を、６ウェルプレートに１×１０５細胞／ウェルで播種し、１０％ウシ血清含有ＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）で１８時間培養し、培養後の細胞数がサブコンフルエント（コンフルエント状態の８０～９０％の細胞数）であることを確認した。そして、１０％ウシ血清含有ＤＭＥＭ培地を吸引除去し、ＰＢＳでＨＫ２を洗浄した。当該ＨＫ２を、ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ　ＤＭＥＭに播種した後、２１％Ｏ２ＡＭＳＣ－ＣＭまたは１％Ｏ２ＡＭＳＣ－ＣＭを加え、大気雰囲気下にて２４時間培養した。２４時間の培養の後、培養物に対してＴＧＦ－β１を添加した。ＴＧＦ－β１を培養物に添加後、更に１２時間培養し、その後、ＨＫ２におけるα－ＳＭＡの発現をウエスタンプロット法で評価した。
　＜結果＞
　図４に、ＨＫ２における抗α－ＳＭＡ抗体を用いたウエスタンブロット法の結果を示す。図４は、（ｉ）培養上清およびＴＧＦ－β１を添加しなかった（ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ　ＤＭＥＭを添加し、ＴＧＦ－β１を添加しなかった）場合のα－ＳＭＡの発現レベル（図４の左から１～３レーン）、（ｉｉ）培養上清を添加せずＴＧＦ－β１を添加した（ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ　ＤＭＥＭおよびＴＧＦ－β１を添加した）場合のα－ＳＭＡの発現レベル（図４の左から４～６レーン）、（ｉｉｉ）培養上清として２１％Ｏ２ＡＭＳＣ－ＣＭを添加し、さらにＴＧＦ－β１を添加した場合におけるα－ＳＭＡの発現レベル（図４の左から７～９レーン）、（ｉｖ）培養上清として１％Ｏ２ＡＭＳＣ－ＣＭを添加し、さらにＴＧＦ－β１を添加した場合におけるα－ＳＭＡの発現レベル（図４の左から１０～１２レーン）を示す。
　図４に示すように、ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ　ＤＭＥＭおよびＴＧＦ－β１を添加した場合におけるα－ＳＭＡの発現レベルは、ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ　ＤＭＥＭを添加し、ＴＧＦ－β１を添加しなかった場合におけるα－ＳＭＡの発現レベルに比べ、α－ＳＭＡの発現レベルが上昇した。このことは、ＴＧＦ－βによって、ヒト近位尿細管細胞を線維化した状態に誘導できることを示している。
　培養上清として２１％Ｏ２ＡＭＳＣ－ＣＭを添加しさらにＴＧＦ－β１を添加した場合におけるα－ＳＭＡの発現レベルは、ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ　ＤＭＥＭおよびＴＧＦ－β１を添加した場合におけるα－ＳＭＡの発現レベルに比べ、α－ＳＭＡの発現の抑制が認められた。
　培養上清として１％Ｏ２ＡＭＳＣ－ＣＭを添加しさらにＴＧＦ－β１を添加した場合におけるα－ＳＭＡの発現レベルは、培養上清として２１％Ｏ２ＡＭＳＣ－ＣＭを添加しさらにＴＧＦ－β１を添加した場合におけるα－ＳＭＡの発現レベルと同程度にα－ＳＭＡの発現レベルの抑制が認められた。
　＜総括＞
　酸素濃度が２１％の環境において培養したヒト脂肪由来間葉系幹細胞（２１％Ｏ２ＡＭＳＣ－ＣＭ）および低酸素濃度（酸素濃度が１％）の環境において２４時間以上培養したヒト脂肪由来間葉系幹細胞（１％Ｏ２ＡＭＳＣ－ＣＭ）は、共に、ＴＧＦ－β１の刺激による線維化の誘導を強力に抑制した。つまり、酸素濃度が２１％の環境において培養したヒト脂肪由来間葉系幹細胞（２１％Ｏ２ＡＭＳＣ－ＣＭ）および低酸素濃度（酸素濃度が１％）の環境において２４時間以上培養したヒト脂肪由来間葉系幹細胞（１％Ｏ２ＡＭＳＣ－ＣＭ）は、共に、ＴＧＦ－β１の刺激によって増加するα－ＳＭＡの発現レベルを、正常なα－ＳＭＡの発現レベルにまで戻した。
　上記〔実施例２－１〕にて既に示したように、酸素濃度が２１％の環境において培養した間葉系幹細胞は、低酸素濃度（酸素濃度が１％）の環境において培養した間葉系幹細胞と比較して、ＴＧＦ－β１の刺激による線維化の誘導の抑制作用が弱い。当該〔実施例２－２〕では、ＴＧＦ－β１の刺激による線維化の誘導の抑制作用が弱い酸素濃度が２１％の環境において培養したヒト脂肪由来間葉系幹細胞（２１％Ｏ２ＡＭＳＣ－ＣＭ）でさえ、ＴＧＦ－β１の刺激によって増加するα－ＳＭＡの発現レベルを正常なα－ＳＭＡの発現レベルにまで戻した。このことは、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞は、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞よりも、ＴＧＦ－β１の刺激による線維化の誘導の抑制作用が強力であることを示している。
　また、１％Ｏ２ＡＭＳＣ－ＣＭおよび２１％Ｏ２ＡＭＳＣ－ＣＭはＴＧＦ－β１の刺激による線維化の誘導を強力に抑制したことから、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞による強い線維化抑制作用は、低酸素下環境で培養したものでも高レベルに維持されることが示された。
　〔実施例３〕
　図５は、ＳＴＫ２培地を用いて大気程度の酸素環境下（換言すれば、ガス成分を調製しない環境下）にて２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞（以下、「ＳＴＫ」とも称する）およびＳＴＫ２培地を用いて大気程度の酸素濃度（換言すれば、ガス成分を調製しない環境下）にて培養した後、１％酸素環境下にて２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞（以下、「ＳＴＫ　Ｈ」とも称する）に発現する、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞の表面抗原の発現量の比較結果を示す。
　ヒト間葉系幹細胞を培養する環境へ、酸素（１％）、二酸化炭素５％、および、窒素（９４％）を含むように調製したガスを格納するガスボンベから、当該ガスを供給した。
　＜比較方法＞
　ヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）クラスＩの抗ＨＬＡ－Ａ,Ｂ,Ｃ抗体（BioLegend, San Diego, CA）、ＨＬＡクラスＩＩの抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体（BioLegend）、また、間葉系幹細胞マーカーである抗ＣＤ－２９抗体（BioLegend）、抗ＣＤ－４４抗体（BioLegend）、抗ＣＤ－７３抗体（BioLegend）、抗ＣＤ－９０抗体（BioLegend）、および抗ＣＤ－４４抗体（BioLegend）を用いて、ＢＤ　ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ）を用いたＦｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ法にて表面抗原の発現量を解析した。
　＜結果＞
　図５では、ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ抗体の発現量を示すグラフを１０１、ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ抗体の発現量のカウント値を１０２に示す。また、ＨＬＡ－ＤＲ抗体の発現量を示すグラフを１０３、ＨＬＡ－ＤＲ抗体の発現量のカウント値を１０４に示す。また、ＣＤ－２９抗体の発現量を示すグラフを１０５、ＣＤ－２９抗体の発現量のカウント値を１０６に示す。また、ＣＤ－４４抗体の発現量を示すグラフを１０７、ＣＤ－４４抗体の発現量のカウント値を１０８に示す。また、ＣＤ－７３抗体の発現量を示すグラフを１０９、ＣＤ－７３抗体の発現量のカウント値を１１０に示す。また、ＣＤ－９０抗体の発現量を示すグラフを１１１、ＣＤ－９０抗体の発現量のカウント値を１１２に示す。
　ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ抗体の発現量を示すグラフ１０１およびＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ抗体の発現量のカウント値１０２に示されるように、ＳＴＫに発現する抗ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ抗体は、ＳＴＫ　Ｈに発現するＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ抗体と同等の発現量であった。また、ＨＬＡ－ＤＲ抗体の発現量を示すグラフ１０３およびＨＬＡ－ＤＲ抗体の発現量のカウント値１０４に示されるように、ＳＴＫおよびＳＴＫ　ＨいずれにおいてもＨＬＡ－ＤＲ抗体の発現が認められなかった。さらに、間葉系幹細胞において発現するマーカーであるＣＤ－２９、ＣＤ－４４、ＣＤ－７３およびＣＤ－９０の発現はＳＴＫおよびＳＴＫ　Ｈ両者で認められ、両者における発現量に差は認められなかった（１０５～１１２ご参照）。なお、図５には示さないが、ヒト間葉系幹細胞では発現しないマーカー（ネガティブマーカー）であるＣＤ－１１ｂ、ＣＤ－３４、およびＣＤ－４５は、両者で認められなかった。
　＜総括＞
　ＳＴＫ２培地を用いて２１％Ｏ２環境下において２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞と、ＳＴＫ２培地を用いて１％Ｏ２環境下において２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞とでは、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞に発現する特定の表面抗原に変化が認められなかった。そのため、１％Ｏ２環境下において２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞の免疫寛容およびヒト骨髄由来間葉系幹細胞を移植する際の安全性には、影響を与えないことが示唆された。
　〔実施例４〕
　無血清培地で培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養上清に含まれる、ＶＥＧＦおよびＨＧＦの発現量の検討を行った。
　＜培養上清（conditioned medium）の作製＞
　ＳＴＫ２培地を用いて、３回以上継代したヒト骨髄由来間葉系幹細胞を６ウェルプレートに播種し、サブコンフルエントとなるまで培養した。培養後、培養液をＳＴＫ２培地からｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ　ＤＭＥＭに変更し、５％酸素環境下にて２４時間培養した。５％酸素環境下にて２４時間培養後のヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養上清を「５％Ｏ２」とした。
　ＳＴＫ２培地を用いて、３回以上継代したヒト骨髄由来間葉系幹細胞を６ウェルプレートに播種し、サブコンフルエントになるまで培養した。培養後、培養液をＳＴＫ２培地からｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ　ＤＭＥＭに変更し、３％酸素環境下にて２４時間培養した。３％酸素環境下にて２４時間培養後のヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養上清を「３％Ｏ２」とした。
　ＳＴＫ２培地を用いて、３回以上継代したヒト骨髄由来間葉系幹細胞を６ウェルプレートに播種しサブコンフルエントとなるまで培養した。培養後、培養液をＳＴＫ２培地からｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ　ＤＭＥＭに変更し、１％酸素環境下にて２４時間培養した。１％酸素環境下にて２４時間培養後のヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養上清を「１％Ｏ２」とした。
　対照として、ＳＴＫ２培地を用いて、３回以上継代したヒト骨髄由来間葉系幹細胞を６ウェルプレートに播種しサブコンフルエントとなるまで培養した。培養後、培養液をＳＴＫ２培地からｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ　ＤＭＥＭに変更し、２１％酸素環境下にて２４時間培養した。２１％酸素環境下にて２４時間培養後のヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養上清を「ｃｏｎｔｒｏｌ」とした。
　ヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養環境のうち、１％酸素環境および２１％酸素環境へは、酸素（１％または２１％）、二酸化炭素５％、および、窒素（９４％または７４％）を含むように調製したガスを格納するガスボンベから、当該ガスを供給した。一方、３％酸素環境および５％酸素環境へは、１％酸素環境へ供給するガスと、２１％酸素環境へ供給するガスとを適切な割合で混合したガスを供給した。
　＜評価方法＞
　ＶＥＧＦ濃度を測定するためのＥＬＩＳＡキット（R&D Systems, Minneapolis, Mn, USA）により、採取した培養上清（５％Ｏ２、３％Ｏ２、１％Ｏ２、およびｃｏｎｔｒｏｌ）に含まれるＶＥＧＦの濃度を、各群ｎ＝６で測定した。ＶＥＧＦ濃度の平均値を、図６の上の図に示す。なお、測定値は、培養上清に含まれる全タンパク量で補正し、Mann-Whitney U testによりｃｏｎｔｒｏｌとの有意差検定を行った。
　また、ＨＧＦ濃度を測定するためのＥＬＩＳＡキット（R&D Systems, Minneapolis, Mn, USA）により、採取した培養上清（５％Ｏ２、３％Ｏ２、１％Ｏ２、およびｃｏｎｔｒｏｌ）に含まれるＨＧＦの濃度を、各群ｎ＝６で測定した。ＨＧＦ濃度の平均値を、図６の下の図に示す。なお、測定値は、培養上清に含まれる全タンパク量で補正し、Mann-Whitney U testによりｃｏｎｔｒｏｌとの有意差検定を行った。
　＜結果＞
　図６の上の図に示すように、３％Ｏ２では、ｃｏｎｔｒｏｌと比較して、ＶＥＧＦの有意な増加が認められた。また、１％Ｏ２では、ｃｏｎｔｒｏｌに対し、３％Ｏ２よりもさらに強いＶＥＧＦの増加が認められた。
　図６の下の図に示すように、３％Ｏ２では、ｃｏｎｔｒｏｌと比較して、ＨＧＦの有意な増加が認められた。また、１％Ｏ２では、ｃｏｎｔｒｏｌに対し、３％Ｏ２よりさらに強いＨＧＦの増加が認められた。
　＜総括＞
　ヒト骨髄由来間葉系幹細胞において、ＶＥＧＦおよびＨＧＦの分泌能を高めるために必要な酸素濃度は、５％未満であり、好ましくは３％以下であり、最も好ましくは１％以下であった。
　〔実施例５〕
　１％酸素環境下の無血清培地でヒト骨髄由来間葉系幹細胞を培養したときの、培養上清に含まれるＶＥＧＦの量の経時的変化に関する検討を行った。
　＜培養上清の作製＞
　ＳＴＫ２培地を用いて、３回以上継代したヒト骨髄由来間葉系幹細胞を６ウェルプレートに播種し、サブコンフルエントとなるまで培養した。培養後、培養液をＳＴＫ２培地からｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ　ＤＭＥＭに変更し、２１％酸素環境下にて１８時間培養した後、１％酸素環境下にて６時間培養した。１％酸素環境下にて６時間培養後のヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養上清を「１％Ｏ２　６hr」とした。
　ＳＴＫ２培地を用いて、３回以上継代したヒト骨髄由来間葉系幹細胞を６ウェルプレートに播種し、サブコンフルエントとなるまで培養した。培養後、培養液をＳＴＫ２培地からｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ　ＤＭＥＭに変更し、２１％酸素環境下にて１２時間培養した後、１％酸素環境下にて１２時間培養した。１％酸素環境下にて１２時間培養後のヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養上清を「１％Ｏ２　１２hr」とした。
　ＳＴＫ２培地を用いて、３回以上継代したヒト骨髄由来間葉系幹細胞を６ウェルプレートに播種し、サブコンフルエントとなるまで培養した。培養後、培養液をＳＴＫ２培地からｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ　ＤＭＥＭに変更し、１％酸素環境下にて２４時間培養した。１％酸素環境下にて２４時間培養後のヒト間葉系幹細胞の培養上清を「１％Ｏ２　２４hr」とした。
　対照として、ＳＴＫ２培地を用いて、３回以上継代したヒト骨髄由来間葉系幹細胞を６ウェルプレートに播種し、サブコンフルエントとなるまで培養した。培養後、培養液をＳＴＫ２培地からｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ　ＤＭＥＭに変更し、２１％酸素環境下にて２４時間培養した。２１％酸素環境下にて２４時間培養後のヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養上清を「ｃｏｎｔｒｏｌ」とした。
　ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を培養する環境へ、酸素（１％または２１％）、二酸化炭素５％、および、窒素（９４％または７４％）を含むように調製したガスを格納するガスボンベから、当該ガスを供給した。
　＜評価方法＞
　ＶＥＧＦ濃度を測定するためのＥＬＩＳＡキット（R&D Systems, Minneapolis, Mn, USA）により、採取した培養上清（１％Ｏ２　６hr、１％Ｏ２　１２hr、１％Ｏ２　２４hr、およびｃｏｎｔｒｏｌ）に含まれるＶＥＧＦの濃度を、各群ｎ＝６で測定した。ＶＥＧＦ濃度の平均値を、図７に示す。なお、測定値は、培養上清に含まれる全タンパク量で補正し、Mann-Whitney U testによりｃｏｎｔｒｏｌとの有意差検定を行った。
　＜結果＞
　図７に示すように、１％Ｏ２　１２hrでは、ｃｏｎｔｒｏｌと比較して、ＶＥＧＦの有意な増加が認められた。また、１％Ｏ２　２４hrでは、ｃｏｎｔｒｏｌと比較して、１％Ｏ２　１２hrよりさらに強いＶＥＧＦの増加が認められた。
　＜総括＞
　低酸素条件下にてヒト骨髄由来間葉系幹細胞のＶＥＧＦの分泌能を高めるためには、培養時間は、１２時間以上が好ましく、２４時間以上が更に好ましいことが明らかになった。
　〔実施例６〕
　＜細胞培養、および、ＲＮＡの採取＞
　（ｉ）ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地を用いて３継代以上培養した。その後、当該ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地中で２１％酸素環境下にて２４時間培養した。その後、公知の方法にしたがって、当該ヒト骨髄由来間葉系幹細胞からｍＲＮＡを採取した。以下では、当該ｍＲＮＡを、ｍＲＮＡ（１）と呼ぶ。
　（ｉｉ）ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を、ＳＴＫ培地を用いて３継代以上培養した。その後、当該ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を、無血清培地中で１％酸素環境下にて２４時間培養した。その後、公知の方法にしたがって、当該ヒト骨髄由来間葉系幹細胞からｍＲＮＡを採取した。以下では、当該ｍＲＮＡを、ｍＲＮＡ（２）と呼ぶ。
　（ｉｉｉ）ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を、ＳＴＫ培地を用いて３継代以上培養した。その後、当該ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を、無血清培地中で２１％酸素環境下にて２４時間培養した。その後、公知の方法にしたがって、当該ヒト骨髄由来間葉系幹細胞からｍＲＮＡを採取した。以下では、当該ｍＲＮＡを、ｍＲＮＡ（３）と呼ぶ。
　（ｉｖ）ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地を用いて３継代以上培養した。その後、当該ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地中で１％酸素環境下にて２４時間培養した。その後、公知の方法にしたがって、当該ヒト骨髄由来間葉系幹細胞からｍＲＮＡを採取した。以下では、当該ｍＲＮＡを、ｍＲＮＡ（４）と呼ぶ。
　ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を培養する環境へ、酸素（１％または２１％）、二酸化炭素（５％）、および、窒素（９４％または７４％）を含むガスを供給することによって、環境内の酸素濃度を調節した。
　＜マイクロアレイによる評価＞
　ＤＮＡマイクロアレイ（Agilent Gene Expression Microarray : SurePrint G3 Human Gene Expression）により、採取したｍＲＮＡ（１）～（４）の各々に含まれる、特定の遺伝子Ａ（例えば、ＡＮＧＰＴＬ４、ＦＡＢＰ３、ＤＬＫ２、ＡＬＤＯＣ、ＴＣＡＦ２、ＲＣＯＲ２など）のｍＲＮＡの量を測定した。
　次いで、各遺伝子に関して、「ｍＲＮＡ（２）に含まれる遺伝子ＡのｍＲＮＡ量／ｍＲＮＡ（１）に含まれる遺伝子ＡのｍＲＮＡ量」、「ｍＲＮＡ（３）に含まれる遺伝子ＡのｍＲＮＡ量／ｍＲＮＡ（１）に含まれる遺伝子ＡのｍＲＮＡ量」、および、「ｍＲＮＡ（４）に含まれる遺伝子ＡのｍＲＮＡ量／ｍＲＮＡ（１）に含まれる遺伝子ＡのｍＲＮＡ量」の値を算出した。
　なお、後述する図８では、「ｍＲＮＡ（２）に含まれる遺伝子ＡのｍＲＮＡ量／ｍＲＮＡ（１）に含まれる遺伝子ＡのｍＲＮＡ量」の値を「hypoxia＋serum-free」として示し、「ｍＲＮＡ（３）に含まれる遺伝子ＡのｍＲＮＡ量／ｍＲＮＡ（１）に含まれる遺伝子ＡのｍＲＮＡ量」の値を「serum-free」として示し、「ｍＲＮＡ（４）に含まれる遺伝子ＡのｍＲＮＡ量／ｍＲＮＡ（１）に含まれる遺伝子ＡのｍＲＮＡ量」の値を「hypoxia」として示している。
　＜結果＞
　図８の２０１は、ＡＮＧＰＴＬ４の発現量の比較を示すグラフであり、図８の２０２は、ＦＡＢＰ３の発現量の比較を示すグラフであり、図８の２０３は、ＤＬＫ２の発現量の比較を示すグラフであり、図８の２０４は、ＡＬＤＯＣの発現量の比較を示すグラフであり、図８の２０５は、ＴＣＡＦ２の発現量の比較を示すグラフであり、図８の２０６は、ＲＣＯＲ２の発現量の比較を示すグラフである。
　図８の２０１に示されるように、hypoxia＋serum-freeにおけるＡＮＧＰＴＬ４の発現量は、およそ５２倍であり、serum-freeにおけるＡＮＧＰＴＬ４の発現量は、およそ２２倍であり、hypoxiaにおけるＡＮＧＰＴＬ４の発現量は、およそ６倍であった。
　図８の２０２に示されるように、hypoxia＋serum-freeにおけるＦＡＢＰ３の発現量は、およそ４５倍であり、serum-freeにおけるＦＡＢＰ３の発現量の発現量は、およそ１５倍であり、hypoxiaにおけるＦＡＢＰ３の発現量は、およそ３倍であった。
　図８の２０３に示されるように、hypoxia＋serum-freeにおけるＤＬＫ２の発現量は、およそ２４倍であり、serum-freeにおけるＤＬＫ２の発現量は、およそ８倍であり、hypoxiaにおけるＤＬＫ２の発現量は、およそ２倍であった。
　図８の２０４に示されるように、hypoxia＋serum-freeにおけるＡＬＤＯＣの発現量は、およそ１８倍であり、serum-freeにおけるＡＬＤＯＣの発現量は、およそ２倍であり、hypoxiaにおけるＡＬＤＯＣの発現量は、およそ７倍であった。
　図８の２０５に示されるように、hypoxia＋serum-freeにおけるＴＣＡＦ２の発現量は、およそ１４倍であり、serum-freeにおけるＴＣＡＦ２の発現量は、およそ３倍であり、hypoxiaにおけるＴＣＡＦ２の発現量は、およそ５倍であった。
　図８の２０６に示されるように、hypoxia＋serum-freeにおけるＲＣＯＲ２の発現量の割合は、およそ１３倍であり、serum-freeにおけるＲＣＯＲ２の発現量は、およそ３倍であり、hypoxiaにおけるＲＣＯＲ２の発現量は、およそ３倍であった。
　＜総括＞
　無血清培地中で１％酸素環境下にて２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞から採取したｍＲＮＡにおける遺伝子Ａの発現量は、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地中で２１％酸素環境下にて２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞から採取したｍＲＮＡにおける遺伝子Ａの発現量と比べ、いずれも３倍以上であった。
　１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地中で１％酸素環境下にて２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞から採取したｍＲＮＡにおけるＤＬＫ２の発現量は、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地中で２１％酸素環境下にて２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞から採取したｍＲＮＡにおけるＤＬＫ２の発現量のおよそ２倍であった。また、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地中で１％酸素環境下にて２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞から採取したｍＲＮＡにおけるＤＬＫ２以外の遺伝子Ａの発現量は、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地中で２１％酸素環境下にて２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞から採取したｍＲＮＡにおけるＤＬＫ２以外の発現量の３倍以上であった。
　無血清培地中で２１％酸素環境下にて２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞から採取したｍＲＮＡにおけるＡＬＤＯＣの発現量は、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地中で２１％酸素環境下にて２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞から採取したｍＲＮＡにおけるＡＬＤＯＣの発現量のおよそ２倍であった。また、無血清培地中で２１％酸素環境下にて２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞から採取したｍＲＮＡにおけるＡＬＤＯＣ以外の遺伝子Ａの発現量は、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地中で２１％酸素環境下にて２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞から採取したｍＲＮＡにおけるＤＬＫ２の発現量の３倍以上であった。
　また、無血清培地中で１％酸素環境下にて２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞に含まれる遺伝子ＡのｍＲＮＡ量は、無血清培地中で２１％酸素環境下にて２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞に含まれる遺伝子ＡのｍＲＮＡ量に比べ、いずれの遺伝子Ａについても少なくとも２倍以上であった。また、無血清培地中で１％酸素環境下にて２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞に含まれる遺伝子ＡのｍＲＮＡ量は、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地中で１％酸素環境下にて２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞に含まれる遺伝子ＡのｍＲＮＡ量に比べ、いずれの遺伝子Ａについても少なくとも２倍以上であった。つまり、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を、無血清培地中で１％酸素環境下にて２４時間培養することにより、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地中で１％酸素環境下にて２４時間培養した場合、および無血清培地中で２１％酸素環境下にて２４時間培養した場合に比べ、遺伝子Ａの発現量が大幅に増加する。
　また、無血清培地中で１％酸素環境下にて２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞に含まれる遺伝子ＡのｍＲＮＡ量は、無血清培地中で２１％酸素環境下にて２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞に含まれる遺伝子ＡのｍＲＮＡ量と、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地中で１％酸素環境下にて２４時間培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞に含まれる遺伝子ＡのｍＲＮＡ量との合計より大きく、１％酸素環境下で培養することと、無血清培地中で培養することと、の相乗効果を示した。
　〔実施例７〕
　＜ＭＳＣの作製＞
　ＳＴＫ２培地を用いて３回以上継代したヒト骨髄由来間葉系幹細胞を、ＳＴＫ２培地中で１％酸素環境下にて２４時間培養した。当該ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を「ＳＴＫ　Ｈ」とした。また、ＳＴＫ２培地を用いて３回以上継代したヒト骨髄由来間葉系幹細胞を、ＳＴＫ２培地中で２１％酸素環境下にて２４時間培養した。当該ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を「ＳＴＫ」とした。
　１０％ウシ血清含有ＤＭＥＭ培地を用いて３回以上継代したヒト骨髄由来間葉系幹細胞を、１０％ウシ血清含有ＤＭＥＭ培地中で１％酸素環境下にて２４時間培養した。当該ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を「１０％ＦＢＳ　Ｈ」とした。また、１０％ウシ血清含有ＤＭＥＭ培地を用いて３回以上継代したヒト骨髄由来間葉系幹細胞を、１０％ウシ血清含有ＤＭＥＭ培地中で２１％酸素環境下にて２４時間培養した。当該ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を「１０％ＦＢＳ」とした。
　＜評価方法＞
　９６ウェルディッシュに１００μＬ／ウェルのＳＴＫ２培地または１０％ウシ血清含有ＤＭＥＭ培地を添加した。ＳＴＫ２培地には、ＳＴＫ　ＨまたはＳＴＫをそれぞれ２５００細胞／ウェルずつ播種した。１０％ウシ血清含有ＤＭＥＭ培地には、１０％ＦＢＳ　Ｈまたは１０％ＦＢＳをそれぞれ２５００細胞／ウェルずつ播種した。
　ＳＴＫ　Ｈおよび１０％ＦＢＳ　Ｈは１％酸素環境下で培養を継続し、ＳＴＫおよび１０％ＦＢＳは２１％酸素環境下で培養を継続した。それぞれのウェルに対して、０時間後、１２時間後、２４時間後に、Premix WST-1（Takara bio）を１０μＬ／ウェルずつ添加した。添加してから４時間後に、４５０ｎｍの波長で吸光度を測定して、当該測定値に基づいて、細胞数を定量した（各群ｎ＝５）。
　＜結果＞
　図９に示すように、１０％ＦＢＳと比較して、１０％ＦＢＳ　Ｈ、ＳＴＫ、ＳＴＫ　Ｈは、全ての時点（０時間、１２時間、２４時間）で有意に細胞数が多く、細胞増殖が亢進していることが示された。ＳＴＫ　Ｈは、細胞増殖能が最も高く、ＳＴＫと比較して、全ての時点で有意に細胞数が多かった。
　＜総括＞
　無血清培地での培養は、１０％ウシ血清含有ＤＭＥＭ培地と比較して、１％酸素環境下および２１％酸素環境下においてヒト骨髄由来間葉系幹細胞の増殖能が亢進することが示された。さらに、無血清培地を用いて１％酸素環境下で培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞は、最も細胞増殖能が亢進することが示された。
　〔実施例８〕
　継代培養をＦＢＳ含有のＤＭＥＭ培地または無血清培地であるＳＴＫ２で行ったヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養上清に含まれる、ＶＥＧＦおよびＨＧＦの発現量の検討を行った。
　＜培養上清（conditioned medium）の作製および評価方法＞
　１０％ＦＢＳ含有のＤＭＥＭ培地を用いて、３回以上継代したヒト骨髄由来間葉系幹細胞を６ウェルプレートに播種しサブコンフルエントとなるまで培養した。培養後、培養液を１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地からｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ　ＤＭＥＭ培地に変更し、１％酸素環境下または２１％酸素環境下にて２４時間培養した。１％酸素環境下にて２４時間培養後のヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養上清を「ＤＭＥＭ　１％Ｏ２」とし、２１％酸素環境下にて２４時間培養後のヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養上清を「ＤＭＥＭ　２１％Ｏ２」とした。
　また、ＳＴＫ２培地を用いて、３回以上継代したヒト骨髄由来間葉系幹細胞を６ウェルプレートに播種しサブコンフルエントとなるまで培養した。培養後、培養液をＳＴＫ２培地からｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ　ＤＭＥＭ培地に変更し、１％酸素環境下または２１％酸素環境下にて２４時間培養した。１％酸素環境下にて２４時間培養後のヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養上清を「ＳＴＫ２　１％Ｏ２」とし、２１％酸素環境下にて２４時間培養後のヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養上清を「ＳＴＫ２　２１％Ｏ２」とした。
　対照として、ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ　ＤＭＥＭ培地を用いて、ヒト腎近位尿細管上皮細胞細胞（ＨＫ２細胞）を、２１％酸素環境下にて２４時間培養した。２１％酸素環境下にて２４時間培養後のヒト腎臓細胞の培養上清を「ＨＫ２」とした。
　ヒト骨髄由来間葉系幹細胞の培養環境のうち、１％酸素環境および２１％酸素環境へは、酸素（１％または２１％）、二酸化炭素５％、および、窒素（９４％または７４％）を含むように調製したガスを格納するガスボンベから、当該ガスを供給した。
　それぞれの培養上清について、実施例４と同様の方法で、ＶＥＧＦ濃度およびＨＧＦ濃度を測定した。
　＜結果＞
　図１０に示すように、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で継代培養した場合と比較して、ＳＴＫ２培地で継代培養した場合、ＶＥＧＦおよびＨＧＦの発現量が低下することが示された。一方、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地およびＳＴＫ２培地で継代培養した両方の場合において、２１％酸素下で培養した場合と比較して、１％酸素下で培養した場合には、ＶＥＧＦおよびＨＧＦの発現量が上昇することが分かった。また、ＳＴＫ２培地で継代培養した場合のＶＥＧＦおよびＨＧＦの発現量は、ＨＫ２のＶＥＧＦおよびＨＧＦの発現量よりも非常に多いことが示された。
　＜総括＞
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞におけるＶＥＧＦおよびＨＧＦの分泌能は、ヒト腎近位尿細管上皮細胞と比較して極めて高いことが示された。また、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を無血清培地で継代培養した場合、ＶＥＧＦおよびＨＧＦの分泌能は低下するものの、１％酸素下で培養することによって、ＶＥＧＦおよびＨＧＦの発現量は回復することが示された。
　本発明および本発明の製造方法により作製した修復剤は、生体組織損傷の修復剤に利用することができる。

Claims (6)

  1. 　無血清培地中において間葉系幹細胞を５％未満の酸素濃度で培養する工程を有することを特徴とする、生体組織損傷の修復剤の製造方法。
  2. 　上記無血清培地は、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、少なくとも１つのリン脂質、および、少なくとも１つの脂肪酸を含有しているものであることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　上記培養する工程では、間葉系幹細胞を少なくとも１回継代することを特徴とする、請求項１または２に記載の製造方法。
  4. 　５％以上の酸素濃度にて血清含有培地中で培養した間葉系幹細胞と比較して、ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－ｌｉｋｅ　４をコードする遺伝子、Ｆａｔｔｙ　Ａｃｉｄ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　３をコードする遺伝子、ｄｅｌｔａ－ｌｉｋｅ　２　ｈｏｍｏｌｏｇ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）をコードする遺伝子、Ｆｒｕｃｔｏｓｅ－Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ａｌｄｏｌａｓｅ　Ｃをコードする遺伝子、ＴＲＰＭ８　ｃｈａｎｎｅｌ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｆａｃｔｏｒ　２をコードする遺伝子、および、ＲＥＳＴ　ｃｏｒｅｐｒｅｓｓｏｒ　２をコードする遺伝子の発現量が少なくとも３倍以上である間葉系幹細胞を含有していることを特徴とする、生体組織損傷の修復剤。
  5. 　上記生体組織損傷の修復剤は、（ｉ）生体組織の線維化を抑制するためのもの、（ｉｉ）炎症細胞の浸潤を抑制するためのもの、または、（ｉｉｉ）マクロファージの活性を制御するためのものであることを特徴とする、請求項４に記載の修復剤。
  6. 　上記生体組織損傷は、急性腎障害、慢性腎臓病、慢性腎不全、慢性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、腎硬化症、急速進行性糸球体腎炎、多発性嚢胞腎、尿細管間質性腎炎、薬剤性腎炎、ループス腎炎、水腎症、痛風腎、肝硬変、肺線維症、熱傷、間質性肺炎、薬剤性肺炎、放射線肺臓炎、慢性閉塞性肺疾患、急性呼吸促進症候群、軟骨損傷、骨欠損、脊髄損傷、歯周病、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、クローン病、糖尿病、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、アルツハイマー病、黄斑変性症、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、非アルコール性脂肪肝炎、顎骨再建、口蓋裂、骨置換材、骨欠損、骨系統疾患、ドライアイ、角膜障害、咽頭炎、関節炎、癌、癌周囲線維化、または、線維症に伴う組織損傷であることを特徴とする、請求項４または５に記載の修復剤。
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