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WO2021059463A1 - ５－フルオロウラシルおよび５－フルオロジヒドロウラシルの分析方法 - Google Patents

５－フルオロウラシルおよび５－フルオロジヒドロウラシルの分析方法 Download PDF

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WO2021059463A1
WO2021059463A1 PCT/JP2019/038058 JP2019038058W WO2021059463A1 WO 2021059463 A1 WO2021059463 A1 WO 2021059463A1 JP 2019038058 W JP2019038058 W JP 2019038058W WO 2021059463 A1 WO2021059463 A1 WO 2021059463A1
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WO
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reagent
analysis method
dispensing
container
reaction vessel
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2019/038058
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English (en)
French (fr)
Inventor
ステファン モロー
ドリアーヌ トワノン
アルバン ウトー
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shimadzu Corp
Original Assignee
Shimadzu Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shimadzu Corp filed Critical Shimadzu Corp
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Priority to EP19946781.2A priority patent/EP4036569A4/en
Priority to JP2021548105A priority patent/JP7400825B2/ja
Publication of WO2021059463A1 publication Critical patent/WO2021059463A1/ja
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    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
    • G01N2030/8822—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving blood
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    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers

Definitions

  • the present invention relates to a method for analyzing 5-fluorouracil and 5-fluorodihydrouracil. More specifically, the present invention relates to a method for analyzing uracil and dihydrouracil in human blood.
  • uracil 5-fluorouracil
  • DPD dihydropyrimidine dehydrogenase enzyme
  • the amount of uracil that effectively acts in the body due to the above metabolic action is about 10% of the dose. Due to the small amount that works effectively, uracil needs to be administered in a very large amount as compared with other usual drugs.
  • the activity and amount of DPD vary greatly from individual to individual, and when uracil is administered to patients with low DPD activity, more uracil than usual works effectively, and as a result, serious side effects may occur. Therefore, it is required to accurately monitor the DPD activity of each person.
  • uracil and 5-fluorodihydrouracil (hereinafter, may be abbreviated as dihydrouracil) in plasma.
  • monitoring TDM
  • uracil alone is also quantified.
  • the abundances of uracil and dihydrouracil in plasma are measured by liquid chromatography-mass spectrometry (LCMS), but cannot be measured directly from collected blood by LCMS, and liquid-liquid extraction from blood (eg, non-patent literature). After extracting plasma and dihydrouracil by 1) or solid-phase extraction (for example, Non-Patent Document 2), plasma and dihydrouracil were quantified.
  • LCMS liquid chromatography-mass spectrometry
  • An object of the present invention is to provide a simple method for measuring the abundance ratio of uracil and dihydrouracil in blood. Furthermore, it is an object of the present invention to provide a method for measuring the abundance ratio of uracil and dihydrouracil in a rapid manner in addition to convenience.
  • the present invention Dispensing step of sucking a certain amount of fluid from the sample container containing the blood collected from the subject and the reagent container containing the reagent and dispensing them into the reaction vessel.
  • Each component separated by the separation step is analyzed by a mass spectrometer, and based on the obtained mass spectrometry data, an analysis step of qualitatively and quantifying at least one of 5-fluorouracil and 5-fluorodihydrouracil in the blood is performed.
  • An analysis method comprising automatically performing each of the above steps and diluting the liquid obtained in at least one of the dispensing step, the mixing step, the stirring step, and the filtering step.
  • the present invention it is not necessary to extract uracil or dihydrouracil from blood in advance, and the abundance ratio of uracil and dihydrouracil in blood can be easily measured. Further, according to the present invention, in addition to convenience, the abundance ratio of uracil and dihydrouracil can be measured quickly.
  • Embodiment 1 of a pretreatment apparatus It is a top view which shows Embodiment 1 of a pretreatment apparatus. It is sectional drawing which shows an example of a reaction vessel. It is sectional drawing which shows an example of the collection container. It is sectional drawing which shows an example of the state which attached the recovery container to the reaction container. It is sectional drawing which shows the structure of a stirring part. It is sectional drawing which shows the operation state of a stirring part. It is sectional drawing which shows the structure of a filtration port. It is sectional drawing which shows the state which attached the reaction container and the recovery container to a filtration port. It is a schematic flow path block diagram which shows the structure of a negative pressure load mechanism. It is a top view which shows Embodiment 2 of a pretreatment apparatus.
  • Blood is first collected from a subject (hereinafter referred to as a subject) whose DPD activity needs to be examined, such as a patient to be administered uracil or a patient who may be administered in the future, and stored in a sample container.
  • a subject whose DPD activity needs to be examined
  • the method of collection is not particularly limited, and an amount required for LCMS analysis, which will be described later, may be collected with a syringe or the like.
  • the blood collected above is stored in the sample container, but the entire amount of the collected blood may be stored in the sample container.
  • the amount of blood stored in the plurality of sample containers is, for example, 5 to 50 ⁇ l.
  • the blood may be stored in the sample container as it is, but from the viewpoint of improving the analysis accuracy, the serum separated from the blood by, for example, centrifugation may be stored in the sample container.
  • the serum separated from the blood by, for example, centrifugation may be stored in the sample container.
  • plasma separated from blood by centrifugation or the like may be stored in a sample container.
  • the reagent is a reagent that removes (deproteinizes) protein from blood, and a mixture of acetonitrile and formic acid is preferable from the viewpoint of effectively removing protein.
  • the mixing ratio of acetonitrile and formic acid is such that the amount of formic acid is 0.2% to 5%, more preferably 0.5%, when the total weight of acetonitrile and formic acid is 100%. It is 2%.
  • Dispense a certain amount of blood or fluid, which is a reagent, from each of the above-mentioned sample container and reagent container into the reaction container (dispensing step).
  • a method of dispensing for example, a method of sucking a fluid with a syringe or the like can be exemplified.
  • the amount to be dispensed is determined within the range of the amount contained in each of the above-mentioned sample containers and reagent containers.
  • the reaction vessel is preferably disposable from the viewpoint of avoiding contamination of samples and reagents, and from the viewpoint of analysis accuracy and ease of operation. Therefore, prepare a reaction vessel for at least the number of times of analysis. It is preferable to keep it. Further, the reaction vessel may be used repeatedly instead of being disposable, and when it is used repeatedly, for example, it may be washed with an organic solvent that does not react with blood and reagents every time the analysis is completed.
  • the blood and reagents dispensed by the above dispensing step are mixed in the reaction vessel (mixing step).
  • the dispensed blood and reagents are injected into the reaction vessel, respectively, and the two are mixed to obtain a mixture.
  • stirring step for example, there is a method of using a reaction vessel provided with a stirring mechanism.
  • the stirring mechanism include a mechanism for rotating the internal stirrer or stirring blade from the outside by a motor, an electromagnet, or the like, and a mechanism for rotating, vibrating, or swinging the reaction vessel. Further, a plurality of mechanisms may be combined.
  • a filtrate is collected by filtering the formed precipitate (filtration step).
  • the precipitate produced is usually a protein and the desired uracil and dihydrouracil are present in the filtrate.
  • Examples of the filtration method include a method in which a liquid containing a precipitate is poured from the above-mentioned reaction vessel into a vessel provided with a separation membrane, the precipitate is separated by the separation membrane, and a filtrate is collected. From the viewpoint of ease of operation, it is preferable to use a reaction vessel equipped with a filtration mechanism such as a separation membrane. Filtration may be performed under atmospheric pressure, but from the viewpoint of speeding up the analysis method, for example, a method of negatively pressing the outside of the reaction vessel and filtering while sucking the filtrate is preferable.
  • Examples of separation membranes used include quartz fiber separation membranes, glass fiber separation membranes, and resin separation membranes.
  • the resin used for the resin separation film examples include polytetrafluoroethylene, nylon, polypropylene, polyvinylidene fluoride, acrylic copolymer, mixed cellulose, nitrocellulose, and polyether sulfone.
  • the separation membrane an ion exchange membrane, a glass fiber membrane or the like can be used.
  • polytetrafluoroethylene is particularly preferable from the viewpoint of chemical stability.
  • the separation membrane used in the filtration step in order to improve the separability, stability and reactivity of the precipitate, it is preferable to carry out a conditioning treatment in which the separation membrane is wetted with a predetermined solution.
  • a conditioning treatment in which the separation membrane is wetted with a predetermined solution.
  • alcohol is preferable, and for example, isopropanol, methanol and the like can be used.
  • the filtrate separated from the precipitate in a separate container or the like from the viewpoint of the simplicity of the dilution step described later.
  • the filtrate is collected by providing a liquid discharge port below the separation membrane and attaching a container for receiving the filtrate to the discharge port for filtration. can do.
  • the liquid used for dilution (hereinafter, may be referred to as a diluted liquid) is not particularly limited as long as it does not react with the liquid obtained in each step, but water is usually used.
  • a diluted liquid is not particularly limited as long as it does not react with the liquid obtained in each step, but water is usually used.
  • the stirring time is, for example, about 50 to 200 seconds from the viewpoint of the time required for the entire process and the fact that it can be diluted uniformly.
  • the filtrate obtained by the filtration step using an organic solvent such as acetonitrile or formic acid as described above contains the protein that precipitates by reacting with the organic solvent in the blood. It has been removed.
  • the liquid obtained in each step from the dispensing step to the filtering step contains a large amount of impurities other than uracil and dihydrouracil to be analyzed. Therefore, even if the filtrate after the filtration step is directly applied to the LCMS described later, when uracil or dihydrouracil is ionized, the contaminants present in the filtrate cause ion suppression or enhancement with respect to the signal intensity. It will be evoked and the result will be different from the actual signal intensity (matrix effect).
  • the liquid obtained in each step is diluted with a diluting liquid such as water before being subjected to LCMS to reduce the concentration of impurities to a certain concentration or less, whereby uracil or dihydrouracil is used in LCMS.
  • a diluting liquid such as water
  • LCMS liquid-liquid or solid-phase extraction
  • the dilution ratio is a value obtained by totaling the ratio of the volume of the added diluted solution to the volume 1 of the solution before dilution. That is, for example, when 4 diluting solutions are added in volume to 1 volume before dilution, the dilution ratio is 5, that is, 5-fold dilution. When a diluted solution having a volume of 1/10 is added to the volume 1 before dilution, the dilution ratio is 1.1 (1.1-fold dilution). In the present invention, even a very small amount of the diluent may be added in the dilution step, and the dilution ratio may be larger than 1.
  • the dilution ratio is preferably 1.1 times or more, more preferably 2 times or more.
  • the upper limit of the dilution rate is preferably 50 times or less from the viewpoint of reducing the matrix effect and accuracy in the separation step and the analysis step.
  • the dilution rate is preferably in the above range, but from the viewpoint of further improving the analysis accuracy, the dilution rate is preferably 5 to 50 times, more preferably 8 to 13 times. .. Dilution improves the quantitativeness of LCMS, which will be described later.
  • the diluted filtrate (hereinafter, may be referred to as diluted filtrate) may be collected in a separately prepared collection container (recovery step).
  • the recovered diluent is transported to LCMS, which will be described later (transportation step), and is used for analysis of uracil and dihydrouracil. Even if the recovery step is not included, a transport step may be provided after the dilution step.
  • the number of collection containers is appropriately set depending on the amount of the diluted filtrate.
  • the diluted filtrate is subjected to liquid chromatography analysis and separated for each component contained in the diluted filtrate (separation step). If a transport step is included, a separation step is performed after the transport step. Liquid chromatography conditions such as column, column temperature, and flow rate are appropriately set so that the components contained in the diluent can be separated accurately.
  • the mobile phase used in liquid chromatography it is preferable to use either a mixture of water and acetic acid or a mixture of acetonitrile and acetic acid from the viewpoint of separability of uracil and dihydrouracil.
  • the amount of acetic acid is preferably 0.05 to 1.0% by mass, more preferably 0.1 to 0.8% by mass, assuming that the total mass of water and acetic acid is 100%.
  • the total mass of acetonitrile and acetic acid is 100%, and the amount of acetic acid is preferably 0.05 to 1.0% by mass. It is preferable to use the above two types as the mobile phase.
  • the uracil or dihydrouracil separated in the above separation step is subjected to qualitative and quantitative analysis based on the mass spectrometry data obtained by mass spectrometry (analysis step).
  • the measurement conditions for mass spectrometry are appropriately set from the viewpoint of analysis accuracy.
  • Each step of the above dispensing step, mixing step, stirring step, filtration step, diluting step, separation step, and analysis step is automatically performed.
  • the collection step and the transfer step it is preferable that both steps are automatically performed.
  • control method In order to perform each process automatically, it is preferable to control various functions so as to operate under preset conditions.
  • Examples of the control method include a method using software executed by a personal computer or a dedicated computer. It is preferable to automatically perform the above steps using a personal computer that controls each step or a control unit having a dedicated computer.
  • the filtration step from the dispensing step is performed by one device (hereinafter, may be referred to as a pretreatment device). It is preferable from the viewpoint of convenience and speed.
  • the pretreatment device is used.
  • a sample rack that holds one or more sample containers that contain blood collected from the subject by the pretreatment device.
  • a reagent rack configured to hold one or more reagent containers,
  • a dispensing mechanism capable of sucking a certain amount of fluid from the sample container and the reagent container and dispensing the fluid into the reaction vessel.
  • a pretreatment device including a control unit that controls the dispensing mechanism to suck blood from a sample container and dispense it into a reaction vessel, and to suck reagent from a reagent container and dispense it into a reaction vessel.
  • a control unit controls the dispensing mechanism to suck blood from a sample container and dispense it into a reaction vessel, and to suck reagent from a reagent container and dispense it into a reaction vessel.
  • the pretreatment apparatus can be further moved between at least the first position and the second position.
  • a holding mechanism for holding and transporting the collection container is provided.
  • the control unit controls the holding mechanism to transport the recovery container from the first position to the second position after the dilution step. It is preferably a pretreatment device.
  • the collection process and the transfer process can be performed by one pretreatment device.
  • analysis of uracil and dihydrouracil can be performed more rapidly, which is more preferable.
  • the pretreatment apparatus 1 of the first embodiment has a pretreatment kit including a set of a prepared reaction vessel 50 and a recovery vessel 54, and corresponds to each step in order to execute the filtration step from the above-mentioned dispensing step.
  • the processing port is installed.
  • the reaction container 50 and the recovery container 54 forming the pretreatment kit are conveyed by the transfer arm 24 forming the transfer mechanism.
  • the transport arm 24 has a holding portion 25 for holding the reaction vessel 50 and the recovery vessel 54 on the tip side, and rotates a vertical shaft 29 that holds the base end portion so that the holding portion 25 draws an arcuate trajectory. It rotates in the horizontal plane as the center.
  • the dispensing port, the stirring port, and the filtration port, which are the transport destinations of the reaction vessel 50 and the recovery vessel 54, are all provided along the arc-shaped trajectory drawn by the holding portion 25.
  • a sample rack 2 for installing the sample container 6 containing blood is provided, and a sampling arm 20 which is a sampling unit for collecting a sample from the sample container installed in the sample rack 2 is provided in the vicinity thereof. ..
  • a rack 4 for holding a plurality of sample containers 6 is installed in an annular shape.
  • the sample rack 2 rotates in a horizontal plane so as to move the rack 4 in the circumferential direction thereof, and the rotation of the sample rack 2 causes the desired sample container 6 to be arranged at a predetermined sampling position.
  • the sampling position is a position along the trajectory of the sampling nozzle 20a at the tip of the sampling arm 20, and is a position where a sample is collected by the sampling nozzle 20a.
  • the vertical shaft 22 penetrates the base end of the sampling arm 20, and rotates in a horizontal plane centered on the shaft 22 and moves up and down in the vertical direction along the shaft 22.
  • the sampling nozzle 20a is held on the tip side of the sampling arm 20 so that its tip faces vertically downward, and the sampling arm 20 moves in an arcuate trajectory in a horizontal plane and moves up and down in the vertical direction.
  • the dispensing port 32 is provided on the orbit of the sampling nozzle 20a and at a position on the orbit of the holding portion 25 of the transport arm 24.
  • the dispensing port 32 is a port for the sampling nozzle 20a to dispense blood to the unused reaction vessel 50.
  • the unused reaction vessel 50 is installed in the dispensing port by the transport arm 24.
  • a reagent rack 8 for installing the reagent container 10 is provided, and a reagent arm 26 (reagent addition section) for collecting reagents from the reagent container installed in the reagent rack 8 is provided.
  • the base end of the reagent arm 26 is supported by a vertical shaft 29 common to the transport arm 24, and the reagent arm 26 rotates in a horizontal plane and moves up and down.
  • a reagent addition nozzle 26a is provided at the tip of the reagent arm 26 so that the tip of the reagent arm 26 faces vertically downward, and the reagent addition nozzle 26a is a horizontal plane that draws an arc-shaped trajectory that is the same as the holding portion 25 of the transfer arm 24. Move in and up and down.
  • the reagent rack 8 rotates in a horizontal plane independently of the sample rack 2.
  • a plurality of reagent containers 10 are arranged in an annular shape in the reagent rack 8, and the reagent container 10 is conveyed in the rotation direction by rotating the reagent rack 8, and a desired reagent container 10 is arranged at a predetermined reagent collection position. It has become so.
  • the reagent collection position is a position along the trajectory of the reagent addition nozzle 26a of the reagent arm 26, and is a position for collecting the reagent by the reagent addition nozzle 26a.
  • the reagent addition nozzle 26a adds the reagent to the blood by inhaling the predetermined reagent and then dispensing the inhaled reagent into the reaction vessel 50 installed in the dispensing port 32.
  • the pretreatment kit installation unit 12 is provided at a position different from the sample rack 2 and the reagent rack 8.
  • the pretreatment kit installation unit 12 is adapted to install a plurality of sets of pretreatment kits in a state in which an unused reaction container 50 and a recovery container 54 are stacked in an annular shape.
  • the pretreatment kit installation unit 12 rotates in a horizontal plane to move the pretreatment kit in the circumferential direction, and arranges an arbitrary set of pretreatment kits at positions along the trajectory of the holding portion 25 of the transport arm 24.
  • the transport arm 24 can hold the unused reaction vessel 50 or recovery vessel 54 arranged at a position along the trajectory of the holding portion 25.
  • reaction vessel 50 and the recovery vessel 54 forming the pretreatment kit will be described with reference to FIGS. 2A, 2B and 2C.
  • the reaction vessel 50 is a cylindrical vessel having an internal space 50a for accommodating blood and reagents.
  • a separation membrane 52 is provided at the bottom of the internal space 50a. As the separation membrane 52, the separation membrane exemplified above is installed.
  • An opening 50b for injecting blood or a reagent is provided on the upper surface of the reaction vessel 50, and an extraction port 50d for extracting the liquid through which the separation membrane 52 is passed is provided on the lower surface.
  • a flange portion 50c protruding in the circumferential direction is provided on the upper part of the outer peripheral surface in order to engage the holding portion 25 of the transport arm 24 described later.
  • a skirt portion 51 is provided below the collar portion 50c, which projects in the circumferential direction and extends downward by a certain distance to surround the outer peripheral surface. As will be described later, the skirt portion 51 is for making the space inside the skirt portion 51 a closed space by being brought into close contact with the edge of the filtration port 30 when the skirt portion 51 is housed in the filtration port 30 together with the collection container 54. ..
  • the recovery container 54 is a cylindrical container that accommodates the lower portion of the reaction container 50 and collects the filtrate discharged from the extraction port 50d of the reaction container 50.
  • the upper surface has an opening 54b into which the lower portion of the reaction vessel 50 is inserted, and the inside has a space 54a for accommodating a portion below the skirt portion 51 of the reaction vessel 50.
  • a flange portion 54c protruding in the circumferential direction is provided on the upper part of the outer peripheral surface in order to engage the holding portion 25 of the transport arm 24.
  • the upper part of the collection container 54 enters the inside of the skirt portion 51 when attached to the reaction container 50.
  • the outer diameter of the reaction vessel 50 and the inner diameter of the recovery vessel 54 are set between the outer peripheral surface of the reaction vessel 50 and the inner peripheral surface of the recovery vessel 54 when the reaction vessel 50 is housed in the internal space 54a of the recovery vessel 54. It is designed to create a slight gap.
  • the reaction vessel 50 and the recovery vessel 54 are installed in the processing kit installation unit 12 in a state where the lower portion of the reaction vessel 50 is housed in the recovery vessel 54 (state of FIG. 2C).
  • the pretreatment device 1 shown in FIG. 1 is also provided with a filtration port 30 and a stirring port 36a.
  • the filtration ports 30 are provided at two positions inside the pretreatment kit installation portion 12.
  • Three agitation ports 36a are provided in the agitation unit 36 provided in the vicinity of the pretreatment kit installation unit 12.
  • FIGS. 3A and 3B show one stirring port 36a of the stirring unit 36.
  • the stirring port 36a of the stirring unit 36 is a container for accommodating the reaction vessel 50.
  • the stirring port 36a is driven by a stirring mechanism provided below the stirring port 36a.
  • the stirring mechanism for driving the stirring port 36a will be described.
  • the rotating body 76 is arranged below the stirring port 36a, and the drive shaft 74 arranged vertically is attached at a position deviated from the center of the upper surface of the rotating body 76.
  • the upper end of the drive shaft 74 is inserted into a support hole 72 provided on the lower surface of the stirring port 36a.
  • the rotating body 76 is supported by a rotating shaft 78 rotated by the motor 80, and the rotating body 76 is rotated by the drive of the motor 80, and the drive shaft 74 is swiveled in a horizontal plane accordingly.
  • a support frame 82 is attached to the motor 80.
  • the support frame 82 has a side wall extending vertically upward from the motor 80 side, and one end of an elastic member 83 such as a coil spring is attached to the upper end of the side wall.
  • the other end of the elastic member 83 is attached to the upper outer surface of the stirring port 36a, and elastically holds the upper portion of the stirring port 36a.
  • the elastic members 83 are provided at a plurality of even locations (for example, four locations) around the stirring port 36a.
  • the drive shaft 74 rotates in a horizontal plane as shown in FIG. 3B, so that the lower end of the collection vessel 72 is driven. The part turns along with it.
  • the inside of the reaction vessel 50 housed in the stirring port 36a is stirred, and blood and the reagent are mixed. After the blood and reagents are mixed, they are transported from the stirring port to the filtration port.
  • a negative pressure load mechanism 55 (see FIGS. 4A and 4B) as a pressure load unit is connected to the filtration port 30 so as to apply negative pressure to the pretreatment kit installed in the filtration port 30. It is configured.
  • the filtration port 30 will be described with reference to FIGS. 4A and 4B.
  • the filtration port 30 is composed of a reaction vessel 50 in which the lower portion of the reaction vessel 50 is housed in the recovery container 54 and a recess for accommodating the recovery container 54.
  • An elastic ring-shaped sealing member 60 is provided on the edge of the filtration port 30.
  • the material of the sealing member 60 is an elastic material such as silicone rubber or EPDM (ethylene-propylene-diene rubber).
  • the inner side surface of the filtration port 30 is connected to the negative pressure applying mechanism 55 via the flow path 56.
  • the specific configuration of the negative pressure addition mechanism 55 will be described later, but the negative pressure addition mechanism 55 applies a negative pressure to the filtration port 30 side by a vacuum pump.
  • FIG. 5 An example of the negative pressure applying mechanism 55 is shown in FIG.
  • Each flow path 57 connecting between each filtration port 30 and the vacuum tank 66 includes a pressure sensor 62 and a three-way valve 64.
  • the pressure sensor 62 detects the pressure in the filtration port 30.
  • the three-way valve 64 is connected between the filtration port 30 and the vacuum tank 62, the filtration port 30 side of the flow path 57 is open to the atmosphere (the state shown in the figure), or the filtration port 30 side of the flow path 57. The end of the can be in any of the sealed states.
  • a pressure sensor 68 is connected to the vacuum tank 66, and a vacuum pump 58 is connected via a three-way valve 70. If necessary, the vacuum pump 58 is connected to the vacuum tank 66, and the vacuum tank 66 is connected. The pressure inside can be adjusted.
  • the value of the pressure sensor 62 that connects between the filtration port 30 and the vacuum tank 66 and detects the pressure of the filtration port 30 becomes a predetermined value. After adjusting so as to be, the end of the flow path 57 on the filtration port 30 side is sealed. As a result, the inside of the filtration port 30 becomes a closed system, the depressurized state in the filtration port 30 is maintained, and the filtrate is extracted.
  • the pretreatment device 1 is provided with a collection container discharge unit 42 at the side edge of the housing in order to send the filtrate collected in the collection container 54 to the next dilution step.
  • the collection container discharge unit 42 includes a moving unit 44 that moves in one direction (in the direction of the arrow in FIG. 1) in the horizontal plane by a drive mechanism having a rack and pinion mechanism.
  • a discharge port 43 for installing a collection container 54 for accommodating the filtrate is provided on the upper surface of the moving portion 44.
  • Specimen rack 2 Specimen rack 8, reagent rack 8, pretreatment kit 12, sampling arm 20, transfer arm 24, reagent arm 26, stirring unit 36, recovery container discharge unit 42, and negative pressure load mechanism 55 provided in the pretreatment device 1.
  • the operation of is controlled by the control unit.
  • the control unit is realized by a computer provided in the preprocessing device 1 and software executed by the computer.
  • An arithmetic processing unit realized by, for example, a personal computer (PC) or a dedicated computer is connected to the control unit, and the analyst manages the preprocessing unit 1 via the arithmetic processing unit.
  • the control unit is provided with preprocessing means, processing status management means, and random access means. Each of these means is a function obtained by executing software by a computer forming a control unit. As described above, a plurality of sample containers are installed in the sample setting unit 2, and the samples contained in the sample containers should be sequentially dispensed into the reaction container 50 and executed for the samples. It is transported to the port corresponding to the preprocessing item.
  • the random access means confirms the next processing item to be performed for each sample, confirms the availability of the port corresponding to the processing item, and if there is a vacancy, the reaction vessel 50 or the recovery vessel 54 containing the sample. Is configured to carry to that port. If there is no vacancy in the port corresponding to the processing item, the target reaction container 50 or collection container 54 is transported to the port as soon as the port is vacant.
  • the random access means is configured to check the processing status at each port and control the transport arm 24 so as to transport the reaction vessel 50 that has completed processing at that port to the port for performing the next processing. ing.
  • the processing status management means is configured to manage the availability status of each port and the processing status of each port.
  • the availability of each port can be managed by storing in which port the reaction vessel 50 or the recovery vessel 54 is installed. Further, a sensor for detecting whether or not the reaction container 50 or the collection container 54 is installed in each port may be provided, and the availability of each port may be managed based on the signal from the sensor.
  • the processing status at each port can be managed depending on whether or not the time required for the processing executed at that port has elapsed since the reaction container 50 or the collection container 54 was installed at that port.
  • a reaction vessel 50 or a recovery vessel 54 When a reaction vessel 50 or a recovery vessel 54 is installed in each port, it is configured to perform a predetermined process at that port.
  • two filtration ports 30 and three agitation ports 36a are provided, but priority is set between the ports provided to perform the same processing, and the random access means is It is configured to be used in order from the port with the highest priority.
  • a collection container 54 is installed in the filtration port 30 having a high priority, and the reaction container 50 is placed on the collection container 54. Install.
  • the transport arm 24 sets an unused reaction vessel 50 for accommodating the blood in the pretreatment kit installation unit 12. And install it in the dispensing port 32.
  • the reaction vessel 50 and the recovery vessel 54 are installed in the pretreatment kit installation section 12 in a state of being overlapped (the state shown in FIG. 2C), but the transport arm 24 holds only the upper reaction vessel 50 in the holding section 25. Hold and transport to the dispensing port 32.
  • Blood is dispensed into the reaction vessel 50 by the sampling nozzle 20a.
  • the sampling nozzle 20a which dispenses blood into the reaction vessel 50, is then washed at the washing port 45 to prepare for the next blood dispensing.
  • Reagents are collected from the reagent container 10 by the reagent dispensing nozzle 26a with respect to the blood dispensed into the reaction vessel 50, and dispensed into the reaction vessel 50 of the dispensing port 32.
  • the reagent may be dispensed into the reaction vessel 50 before the blood is dispensed.
  • a reagent dispensing port for dispensing reagents is provided at a position different from that of the dispensing port 32, and a reaction vessel 50 is installed at the reagent dispensing port by the transfer arm 24, and at that position. Reagents may be dispensed.
  • the reaction vessel 50 of the dispensing port 32 is installed in the vacant stirring port 36a by the transfer arm 24 to perform stirring.
  • This stirring step is performed for a preset period of time, whereby the blood and the reagent in the reaction vessel 50 are mixed.
  • the availability of the filtration port 30 is confirmed, and if there is a vacancy in the filtration port 30, the collection container 54 is installed in the filtration port 30 by the transport arm 24.
  • the collection container 54 installed in the filtration port 30 is a collection container 54 paired with the reaction container 50 being stirred in the stirring port 36a, and is installed so as to be overlapped with the reaction container 50 being stirred in the pretreatment kit installation unit 12. It is the collection container 54 that had been used.
  • the transport arm 24 can also transport another blood reaction container 50 or collection container 54.
  • the transport arm 24 installs the reaction vessel 50 on the recovery vessel 54 of the filtration port 30 to bring it into the state shown in FIG. 4B.
  • a predetermined negative pressure is applied to the filtration port 30 containing the reaction vessel 50 and the recovery vessel 54 by the negative pressure addition mechanism 55.
  • the transport arm 24 can transport the other reaction vessel 50 and the recovery vessel 54.
  • the collection container 50 holding the filtrate as described above is discharged from the collection container discharge unit.
  • the diluent is added to the recovery container containing the discharged filtrate, the diluted filtrate is stirred as necessary, and the separation step of separating each component by liquid chromatography, and each separated component is analyzed by mass spectrometry. At least one of uracil and dihydrouracil is analyzed through the analysis process.
  • the pretreatment device 1 described above is further movable between at least the first position and the second position, and further includes a holding mechanism for holding and transporting the collection container.
  • the control unit has a function of controlling the holding mechanism so as to transport the recovery container from the first position to the second position after the dilution step.
  • the pretreatment device 1 further has a dilution port 60 and can be moved from the filtration port 30 (first position) of the pretreatment device 1 to the dilution port 60 (second position). Yes, it has a holding function to hold the collection container that stores the filtrate collected at the filtration port.
  • the transfer arm used in the above-described first embodiment may be used, or a new transfer arm may be provided.
  • the transport arm is provided with a holding function for holding the collection container, and transports the collection container from the filtration port to the dilution port.
  • the diluent is dispensed from a separately provided diluent tank (not shown) using a separately provided dilution arm (not shown) by the same control method as above, and added to the collection container transported to the dilution port.
  • the filtrate is diluted to the desired amount.
  • the diluent tank may be separately provided in the pretreatment device 1 or may be mounted outside the pretreatment device.
  • the collection container in the filtration port is conveyed to the dilution port by the transfer arm. After a preset amount of the diluent is added to the transported collection container, the collection container is transported to the above-mentioned collection container discharge unit and discharged from the pretreatment device.
  • the discharged collection container is used for the separation process and analysis process as described above.
  • the dilution port may be provided with a stirring mechanism having the same structure as the stirring mechanism described above.
  • the diluted filtrate held in the collection container discharged from the pretreatment device is subjected to the separation step and the analysis step in the same manner as described above.
  • Example 1 Using the pretreatment apparatus 1 (FIG. 1) shown in the above-described first embodiment, the reagent is dispensed into a sample containing uracil and dihydrouracil, the sample and the reagent are mixed and stirred, and the obtained precipitate is filtered. did.
  • the recovery container containing the filtrate was recovered, diluted by adding a diluent, and then subjected to a separation step.
  • the dilution ratio of the filtrate was 5 times, 10 times, 40 times, and 50 times.
  • the liquids of each dilution were separated for each component by liquid chromatography, and each separated component was analyzed by a mass spectrometer.
  • Target ion M / z 112.95 (selected as precursor ion) is passed through the first-stage MS, and m / z 70.1 is created by breaking it with a CID cell, and m / z 70.1 (product ion) is passed through the second-stage MS.
  • the mass spectrometric results of uracil having a dilution ratio of 5 times, 10 times, 40 times, and 50 times are shown in FIGS. 7 to 10, and the mass spectrometric results of dihydrouracil are shown in FIGS. 11 to 14, respectively.
  • the obtained filtrate was separated by liquid chromatography without dilution in the same manner as in the above example, and mass spectrometry of the separated uracil and dihydrouracil is shown in FIGS. 15 and 16, respectively.
  • Example 2 Using the pretreatment device 100 (FIG. 2) of the second embodiment described above, the reagent is dispensed into a sample containing uracil and dihydrouracil, the sample and the reagent are mixed and stirred, and the obtained precipitate is filtered and diluted. Dilute with diluent at the port.
  • the same result as in Example 1 can be obtained by separating the diluted solution for each component by liquid chromatography and analyzing each separated component with a mass spectrometer.
  • An analysis method comprising automatically performing each of the above steps and diluting the liquid obtained in at least one of the dispensing step, the mixing step, the stirring step, and the filtering step.
  • the quantification step of quantifying the concentration of at least one of 5-fluorouracil and 5-fluorodihydrouracil in the blood whose presence has been confirmed based on the mass spectrometric data is further included [1].
  • the filtrate collected by the filtration step is diluted.
  • the accuracy of the separation process can be improved by the methods [9] to [11] above, and the analysis accuracy of uracil and dihydrouracil can be further improved.
  • a sample rack that holds one or more sample containers that contain blood collected from the subject by the pretreatment device.
  • a dispensing mechanism capable of sucking a certain amount of fluid from the sample container and the reagent container and dispensing the fluid into the reaction vessel.
  • the pretreatment apparatus including a control unit that controls the dispensing mechanism to suck blood from a sample container and dispense it into a reaction vessel, and to suck reagent from a reagent container and dispense it into a reaction vessel.
  • the pretreatment apparatus is further movable between at least a first position and a second position, further comprising a holding mechanism for holding and transporting the collection container.

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Abstract

被験者から採取した血液を収納した検体容器および試薬が収納された試薬容器から、それぞれ一定量の流体を吸引して反応容器に分注する分注工程、 前記分注工程で分注された前記血液と前記試薬を前記反応容器内で混合する混合工程、 前記混合工程で得られた混合物を撹拌する撹拌工程、 前記撹拌工程で生成した沈殿物をろ過してろ液を採取するろ過工程、 前記工程により得られたろ液を液体クロマトグラフィーにより成分ごとに分離する分離工程、 前記分離工程により分離された各成分を質量分析装置により分析し、得られた質量分析データに基づき、前記血液中の５－フルオロウラシルおよび５－フルオロジヒドロウラシルの少なくとも一方をについて定性および定量する分析工程を含み、 前記各工程を自動的に行うとともに、前記分注工程、前記混合工程、前記撹拌工程、前記ろ過工程のうち、の少なくとも一つの工程で得られた液を希釈する希釈工程を含む、分析方法を提供する。該方法を用いれば、簡便に血液中のウラシルとジヒドロウラシルの存在比を測定することができる。さらに本方法によれば、簡便性に加えて、迅速にウラシルとジヒドロウラシルの存在比を測定することができる。

Description

５－フルオロウラシルおよび５－フルオロジヒドロウラシルの分析方法
　本発明は、５－フルオロウラシルおよび５－フルオロジヒドロウラシルの分析方法に関する。より詳細には本発明は人の血液中のウラシルおよびジヒドロウラシルの分析方法に関する。
　消化器系癌、中咽頭癌、乳がん等の悪性腫瘍に対する抗がん剤として５－フルオロウラシル（以下ウラシルと略す場合がある）を患者に投与することが一般的に知られている。しかしながら、ウラシルは静脈に投与されると、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ酵素（dihydropyrimidine dehydrogenase　enzyme、以下ＤＰＤと略する場合がある）の作用により、肝臓で即座に代謝されることが知られている。
　上記代謝作用により、体内で有効に作用するウラシルの量は投与量のおおよそ１０％程度である。このように有効に働く量が少ないため、ウラシルは通常の他の薬剤に比較して、非常に多量に投与する必要がある。
　一方、ＤＰＤの活性および量は個人によって大きく異なっており、ＤＰＤ活性の低い患者にウラシルを投与すると、通常より多くのウラシルが有効に働き、その結果、重篤な副作用が発生することがある。したがって各人のＤＰＤ活性を正確にモニタリングすることが求められている。
　ＤＰＤ活性の評価方法として、血漿中のウラシルと５－フルオロジヒドロウラシル（以下、ジヒドロウラシルと略する場合がある）の存在比を利用する方法がある。また、近年個々の患者に適した投与設計を行い，適正な薬物療法を行うためのモニタリング（TDM）の重要性も指摘されており、抗がん剤として５－フルオロウラシルを被験者に投与後、当該被験者の５－フルオロウラシルの血中濃度を測定し、適切な量の投与が実施されているか等を確認する上でも、ウラシル単体での定量も行われている。血漿中のウラシルとジヒドロウラシルの各存在量は液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）により測定されるが、採取した血液から直接ＬＣＭＳで測定することはできず、血液から液液抽出（例えば非特許文献１）または固相抽出（例えば非特許文献２）によりウラシルとジヒドロウラシルを抽出した後、ウラシルとジヒドロウラシルを定量していた。
Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis Volume 142, 5 August 2017, Pages 125-135 Journal of Chromatographic Science, Volume 50, Issue 10, November/December 2012, Pages 877–884
　しかしながら、上記方法は、分析者の処理が煩雑であり、抽出工程に一定の時間を要するため、より迅速で簡便なウラシルおよび/またはジヒドロウラシルの分析方法が求められていた。
　本発明は、血液中のウラシルとジヒドロウラシルの存在比を測定する簡便な方法を提供することを目的とする。 またさらに本発明は簡便性に加えて迅速なウラシルとジヒドロウラシルの存在比を測定する方法を提供することを目的とする。
　すなわち本発明は、
被験者から採取した血液を収納した検体容器および試薬が収納された試薬容器から、それぞれ一定量の流体を吸引して反応容器に分注する分注工程、
前記分注工程で分注された前記血液と前記試薬を前記反応容器内で混合する混合工程、
前記混合工程で得られた混合物を撹拌する撹拌工程、
前記撹拌工程で生成した沈殿物をろ過してろ液を採取するろ過工程、
前記工程により得られたろ液を液体クロマトグラフィーにより成分ごとに分離する分離工程、
前記分離工程により分離された各成分を質量分析装置により分析し、得られた質量分析データに基づき、前記血液中の５－フルオロウラシルおよび５－フルオロジヒドロウラシルの少なくとも一方について定性および定量する分析工程を含み、
前記各工程を自動的に行うとともに、前記分注工程、前記混合工程、前記撹拌工程、前記ろ過工程のうち、の少なくとも一つの工程で得られた液を希釈する希釈工程を含む、分析方法。
　本発明によれば、血液から事前にウラシルまたはジヒドロウラシルを抽出する必要がなく、簡便に血液中のウラシルとジヒドロウラシルの存在比を測定することができる。さらに本発明によれば、簡便性に加えて、迅速にウラシルとジヒドロウラシルの存在比を測定することができる。
 
前処理装置の実施態様１を示す平面図である。 反応容器の一例を示す断面図である。 回収容器の一例を示す断面図である。 反応容器に回収容器を装着した状態の一例を示す断面図である。 撹拌部の構造を示す断面構成図である。 撹拌部の動作状態示す断面構成図である。 ろ過ポートの構造を示す断面構成図である。 ろ過ポートに反応容器と回収容器を装着した状態を示す断面構成図である。 負圧負荷機構の構成を示す概略流路構成図である。 前処理装置の実施態様２を示す平面図である。 図１に示した前処理装置を用いて得られたろ液を希釈率５倍に希釈し、液体クロマトグラフィーにより成分ごとに分離し、分離されたウラシルを質量分析した結果を示すグラフである。 図１に示した前処理装置を用いて得られたろ液を希釈率１５倍に希釈し、液体クロマトグラフィーにより成分ごとに分離し、分離されたウラシルを質量分析した結果を示すグラフである。 図１に示した前処理装置を用いて得られたろ液を希釈率４０倍に希釈し、液体クロマトグラフィーにより成分ごとに分離し、分離されたウラシルを質量分析した結果を示すグラフである。 図１に示した前処理装置を用いて得られたろ液を希釈率５０倍に希釈し、液体クロマトグラフィーにより成分ごとに分離し、分離されたウラシルを質量分析した結果を示すグラフである。 図１に示した前処理装置を用いて得られたろ液を希釈率５倍に希釈し、液体クロマトグラフィーにより成分ごとに分離し、分離されたジヒドロウラシルを質量分析した結果を示すグラフである。 図１に示した前処理装置を用いて得られたろ液を希釈率１５倍に希釈し、液体クロマトグラフィーにより成分ごとに分離し、分離されたジヒドロウラシルを質量分析した結果を示すグラフである。 図１に示した前処理装置を用いて得られたろ液を希釈率４０倍に希釈し、液体クロマトグラフィーにより成分ごとに分離し、分離されたジヒドロウラシルを質量分析した結果を示すグラフである。 図１に示した前処理装置を用いて得られたろ液を希釈率５０倍に希釈し、液体クロマトグラフィーにより成分ごとに分離し、分離されたジヒドロウラシルを質量分析した結果を示すグラフである。 図１に示した前処理装置を用いて得られたろ液を希釈せず、液体クロマトグラフィーにより成分ごとに分離し、分離されたウラシルを質量分析した結果を示すグラフである。 図１に示した前処理装置を用いて得られたろ液を希釈せず、液体クロマトグラフィーにより成分ごとに分離し、分離されたジヒドロウラシルを質量分析した結果を示すグラフである。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　ウラシルを投与する患者や将来投与する可能性のある患者等、ＤＰＤ活性を調べる必要のある対象者（以下、被験者という）からまず血液を採取し、検体容器に収納する。採取の方法は特に制限はなく、注射器等により後述するＬＣＭＳ分析に必要な量を採取すればよい。
　上述にて採取した血液を検体容器に収納するが、採取した血液は全量を検体容器に収納してもよい。複数の検体容器に収納する血液の量は例えば、５から５０μｌである。
　また血液はそのまま検体容器に収納してもよいが、分析精度の向上の観点から、例えば遠心分離等で血液から分離した血清を検体容器に収納してもよい。または血液に抗凝固剤等を添加した後、遠心分離等により血液から分離した血漿を検体容器に収納してもよい。
　一方、試薬が収納された試薬容器を別途、用意する。試薬は血液からタンパク質を除去（除タンパク）する試薬であり、効果的にタンパク質が除かれるという観点から、アセトニトリルとギ酸の混合物が好ましい。アセトニトリルとギ酸の混合比はタンパク質の除去効率の観点から、アセトニトリルとギ酸の重量の合計量を１００％とした時、ギ酸の量は０．２％から５％、より好ましくは０．５％から２％である。
　上述の検体容器および試薬容器のそれぞれから、一定量の血液または試薬である流体を反応容器に分注する（分注工程）。分注する方法は、例えば流体をシリンジ等で吸引する方法が例示できる。分注する量は上述の各検体容器および試薬容器に収納されている量の範囲で決められる
　反応容器は、検体や試薬のコンタミネーションを回避するとともに、分析精度および操作の簡便性の観点から、ディスポ―サブルであることが好ましく、そのため、少なくとも分析を行う回数分の反応容器を用意しておくことが好ましい。また、反応容器については、ディスポーザブルではなく、繰り返し利用してもよく、繰り返し利用する場合は、例えば、分析完了毎に、血液および試薬と反応しないような有機溶媒で洗浄してもよい。
　上記分注工程により分注された血液および試薬を反応容器内で混合する（混合工程）。分注された血液および試薬をそれぞれ反応容器内へ注入し、両者を混合し混合物が得られる。
　次に上記混合工程で得られた混合物を撹拌する（撹拌工程）。撹拌工程における撹拌の方法は、例えば撹拌機構を備えた反応容器を用いる方法がある。撹拌機構としては外部からモータ、電磁石等により内部の撹拌子または撹拌翼を回転させる機構、反応容器を旋回、振動または揺動させる機構が例示できる。また複数の機構を組み合わせてもよい。
　上記撹拌工程では沈殿物が生成するので、生成した沈殿物をろ過によりろ液を採取する（ろ過工程）。生成する沈殿物は通常、たんぱく質であり、目的とするウラシルおよびジヒドロウラシルはろ液中に存在する。
　ろ過の方法は、例えば上述した反応容器から沈殿物を含んだ液体を分離膜を備えた容器に注ぎ、分離膜で沈殿物を分離し、ろ液を採取する方法が例示できる。操作の簡便性の観点から、分離膜等のろ過機構を備えた反応容器を用いるのが好ましい。ろ過は大気圧下で行ってもよいが、分析方法の迅速化の観点から、例えば反応容器の外部を負圧し、ろ液を吸引しながらろ過する方法が好ましい。用いる分離膜の例は石英繊維分離膜、ガラス繊維分離膜、樹脂製分離膜がある。
　樹脂製分離膜に用いられる樹脂は例えば、ポリテトラフルオロエチレン、ナイロン、ポリプロピレン、ポリフッ化ビニリデン、アクリル共重合体、混合セルロース、ニトロセルロース、ポリエーテルスルホン等がある。また分離膜としてイオン交換膜、グラスファイバー膜などを用いることができる。これらの中でも化学的安定性の観点から、ポリテトラフルオロエチレンが特に好ましい。
　ろ過工程で使用する分離膜については、上記沈殿物の分離性、安定性、さらに反応性を高める上で、所定の溶液により当該分離膜を濡らすコンディショニング処理を行うことが好ましい。溶液の例としては、アルコールが好ましく、例えば、イソプロパノールやメタノールなどを用いることができる。
　沈殿物と分離されたろ液は別の容器等に回収する方が後述する希釈工程の簡便性の観点から好ましい。例えば分離膜等のろ過機構を備えた反応容器を用いる場合、分離膜よりも下部に液の排出口を設け、排出口にろ液を受ける容器を装着してろ過することで、ろ液を回収することができる。
　上記分注工程からろ過工程のいずれかの工程で得られた液を希釈する（希釈工程）。希釈に用いる液（以下、希釈液と称する場合がある）は、各工程で得られた液と反応しない液であれば特に制限はないが、通常、水が用いられる。希釈工程では、均一に希釈する観点から、希釈液を当該液に加えたあと、容器を揺動等により撹拌することが好ましい。全工程に要する時間と均一に希釈できるという観点から、撹拌の時間は例えば５０秒から２００秒程度である。
　従来の固相抽出や液液抽出とは異なり、上記のようなアセトニトリルやギ酸等の有機溶媒を利用したろ過工程により得られたろ液については、血液中の有機溶媒と反応して沈殿するたんぱく質は除去されている。しかしながら分注工程からろ過工程の各工程で得られる液には分析対象となるウラシル、ジヒドロウラシル以外の夾雑物 が多く含まれている。したがって、後述するＬＣＭＳにろ過工程後のろ液を直接供したとしても、ウラシルやジヒドロウラシルをイオン化する際、ろ液中に存在する夾雑物により、そのシグナル強度に対して、イオンサプレッションやエンハンスが引き起され、実際のシグナル強度とは異なる結果が得られることになる（マトリックス効果）。
　そこで、上記の通り、本発明では、ＬＣＭＳに供する前に各工程で得られた液を水等の希釈液により希釈して夾雑物を一定の濃度以下にすることで、ＬＣＭＳでウラシルやジヒドロウラシルをイオン化する際に、当該夾雑物によるマトリックス効果を低減し、後述の分離工程および分析工程で高精度の結果を得ることができる。また希釈液は、通常、検体または試薬とは反応しない液であるため、検体と試薬が混合された混合液中の各濃度は変化するが、後述する質量分析を行う工程におけるウラシルやジヒドロウラシルのイオン化には影響しないことが確認されている。この方法により、従来のような液液や固相抽出など、成分を特定した抽出工程を経ることなく、希釈により、ＬＣＭＳ簡便かつ迅速にウラシルやジヒドロウラシルの分析が行える。
　本明細書において希釈の倍率（希釈率）とは、希釈前の液の体積１に対して、加えた希釈液の体積の割合を合計した値である。すなわち、例えば希釈前の体積１に対して希釈液を体積にして４加えた場合、希釈率は５、すなわち５倍の希釈となる。希釈前の体積１に対して１０分の１の体積の希釈液を加えた場合、希釈率は１．１（１．１倍の希釈）となる。
　本発明において、希釈工程で希釈液をごく少量でも添加すればよく、希釈率としては１より大きければよい。希釈率は１．１倍以上が好ましく、２倍以上がより好ましい。希釈率の上限は上記マトリックス効果の低減と分離工程および分析工程での精度の観点から５０倍以下が好ましい。
　希釈工程をろ過工程の前に実施する場合、希釈率は上述の範囲が好ましいが、より分析精度を高めるという観点から、希釈率は５倍から５０倍が好ましく、８倍から１３倍がより好ましい。希釈することで後述するＬＣＭＳの定量性が向上する。
　上記希釈工程の後、希釈されたろ液（以下、希釈ろ液と称する場合がある）を別途用意した回収容器に回収してもよい（回収工程）。回収した希釈ろ液は後述するＬＣＭＳに搬送され（搬送工程）、ウラシル、ジヒドロウラシルの分析に供される。なお回収工程を含まない場合であっても、上記希釈工程のあとに搬送工程を設けてもよい。
　回収容器は一つでも複数でもよい。希釈ろ液の量により回収容器の数は適宜設定される。
　上記希釈工程または回収工程の後、希釈ろ液は液体クロマトグラフィーの分析に供され、希釈ろ液中に含まれている成分ごとに分離される（分離工程）。搬送工程が含まれる場合は、搬送工程の後に分離工程が行われる。カラム、カラム温度、流速等の液体クロマトグラフィーの条件は、希釈ろ液中に含まれている成分が精度よく分離できるように、適宜設定される。
　液体クロマトグラフィーで用いる移動相は、ウラシル、ジヒドロウラシルの分離性の観点から、水と酢酸の混合物、およびアセトニトリルと酢酸の混合物のいずれかを用いるのが好ましい。水と酢酸の混合物の場合、水と酢酸の全質量を１００％として、酢酸の量は０．０５から１．０質量％が好ましく、０.１から０．８質量％がより好ましい。
　アセトニトリルと酢酸の混合物の場合、アセトニトリルと酢酸の全質量を１００％として、酢酸の量は０．０５から１．０質量％が好ましい。移動相としては上記２種を用いるのが好ましい。
　上記分離工程で分離されたウラシルまたはジヒドロウラシルは質量分析により得られた質量分析データにより定性および定量分析が行われる（分析工程）。質量分析の測定条件は分析精度の観点から適宜、設定される。
　上記分注工程、混合工程、撹拌工程、ろ過工程、希釈工程、分離工程、分析工程の各工程は自動的に行われる。また回収工程、搬送工程を含む場合は両工程を自動で行われるのが好ましい。各工程は上述した操作を達成する各種機能を有した装置を用い自動で行うことで、分析者が個々のすべての操作を行う必要なしに簡便にウラシルおよびジヒドロウラシルを分析することができる。
　各工程を自動で行うために、各種機能を予め設定された条件で作動するように制御することが好ましい。制御の方法は、例えばパーソナルコンピュータや専用のコンピュータにより実行されるソフトウェアを用いる方法が挙げられる。各工程を制御するパーソナルコンピュータや専用のコンピュータを有する制御部を用いて上記工程を自動で行うことが好ましい。
　上記各工程はその内のいくつかをまとめて一つの装置で行なってもよいが、前記分注工程からろ過工程を一つの装置（以下前処理装置と称する場合がある）で行うことが、分析の簡便性と迅速性の観点から、好ましい。前記分注工程からろ過工程を一つの前処理装置で行う場合、該前処理装置は、
前記前処理装置が
被験者から採取した血液を収容した検体容器を1以上保持する検体ラックと、
１以上の試薬容器を保持するように構成された試薬ラックと、
前記検体容器と前記試薬容器とから一定量の流体を吸引して前記反応容器に分注するように動作可能な分注機構と、
前記反応容器に収容された混合物を撹拌するための撹拌機構と、
前記反応容器内の沈殿物をろ過してろ液を採取するろ過機構と、
前記分注機構を、検体容器から血液を吸引して反応容器に分注し、試薬容器から試薬を吸引して反応容器に分注するように制御する制御部と
を備える前処理装置であることが、分析の簡便性と迅速性の観点から、より好ましい。
　本発明の分析方法が上記希釈工程と分離工程の間に回収工程と搬送工程をさらに含む場合、上記前処理装置が、さらに
少なくとも第１の位置と第２の位置との間で移動可能であり、前記回収容器を保持して搬送する保持機構をさらに備え、
前記制御部は、前記保持機構を、希釈工程後に前記回収容器を第１の位置から第２の位置に搬送するように制御する、
前処理装置であることが好ましい。
　上記機構をさらに備えることで、回収工程、搬送工程も一つの前処理装置で行うことができる。このような装置を用いることで、ウラシル、ジヒドロウラシルの分析をさらに迅速に行うことができ、より好ましい。
　以下実施形態により、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施形態に制限されるものではない。
　＜実施形態１＞
　前記処理装置を用いて血液中のウラシル、ジヒドロウラシルを分析する分析方法の一実施形態について図１を用いて説明する。
　この実施形態１の前処理装置１は、用意された反応容器５０と回収容器５４の組からなる前処理キットを有し、上述した分注工程からろ過工程を実行するために、各工程に対応した処理ポートが設置されている。
　前処理キットをなす反応容器５０および回収容器５４は、搬送機構をなす搬送アーム２４によって搬送される。搬送アーム２４は先端側に反応容器５０および回収容器５４を保持するための保持部２５を有し、保持部２５が円弧状の軌道を描くようにその基端部を保持する鉛直軸２９を回転中心として水平面内において回転する。反応容器５０および回収容器５４の搬送先である分注ポート、撹拌ポートおよびろ過ポートは、すべて保持部２５が描く円弧状の軌道に沿って設けられている。
　血液を収容した検体容器６を設置するための検体ラック２が設けられ、その近傍に検体ラック２に設置された検体容器から検体を採取するためのサンプリング部であるサンプリングアーム２０が設けられている。検体ラック２には複数の検体容器６を保持するラック４が円環状に設置される。検体ラック２はラック４をその周方向に移動させるように水平面内において回転し、検体ラック２の回転によって所望の検体容器６が所定のサンプリング位置に配置されるようになっている。サンプリング位置とは、サンプリングアーム２０の先端のサンプリングノズル２０ａの軌道に沿った位置であって、サンプリングノズル２０ａにより検体を採取する位置である。
　サンプリングアーム２０は、基端部を鉛直軸２２が貫通し、軸２２を中心とする水平面内での回転動作および軸２２に沿った鉛直方向への上下動を行なう。サンプリングノズル２０ａはサンプリングアーム２０の先端側でその先端が鉛直下方向を向くように保持されており、サンプリングアーム２０によって水平面内における円弧状の軌道を描く移動と鉛直方向への上下動を行なう。
　サンプリングノズル２０ａの軌道上で、かつ搬送アーム２４の保持部２５の軌道上の位置に分注ポート３２が設けられている。分注ポート３２は未使用の反応容器５０に対してサンプリングノズル２０ａが血液を分注するためのポートである。未使用の反応容器５０は搬送アーム２４によって分注ポートに設置される。
　検体ラック２の内側に、試薬容器１０を設置するための試薬ラック８が設けられ、試薬ラック８に設置された試薬容器から試薬を採取するための試薬アーム２６（試薬添加部）が設けられている。試薬アーム２６は基端が搬送アーム２４と共通の鉛直軸２９によって支持されており、水平面内において回転するとともに上下動を行なうようになっている。試薬アーム２６の先端部にその先端が鉛直下方向を向くようにして試薬添加ノズル２６ａが設けられており、試薬添加ノズル２６ａは搬送アーム２４の保持部２５と同一の円弧状の軌道を描く水平面内の移動と上下動を行なう。
　試薬ラック８は検体ラック２とは独立して水平面内で回転する。試薬ラック８には複数の試薬容器１０が円環状に配置され、試薬ラック８が回転することによって試薬容器１０がその回転方向に搬送され、所望の試薬容器１０が所定の試薬採取位置に配置されるようになっている。試薬採取位置とは、試薬アーム２６の試薬添加ノズル２６ａの軌道に沿った位置であって、試薬添加ノズル２６ａにより試薬の採取を行なうための位置である。試薬添加ノズル２６ａは所定の試薬を吸入した後、分注ポート３２に設置された反応容器５０に対して吸入した試薬を分注することで、血液への試薬の添加を行なうものである。
　検体ラック２や試薬ラック８とは異なる位置に、前処理キット設置部１２が設けられている。前処理キット設置部１２は、未使用の反応容器５０と回収容器５４が重ねられた状態の複数組の前処理キットを円環状に設置するようになっている。前処理キット設置部１２は水平面内において回転して前処理キットを円周方向に移動させ、任意の一組の前処理キットを搬送アーム２４の保持部２５の軌道に沿った位置に配置する。搬送アーム２４は、保持部２５の軌道に沿った位置に配置された未使用の反応容器５０または回収容器５４を保持することができる。
　前処理キットをなす反応容器５０および回収容器５４について、図２Ａ、図２Ｂおよび図２Ｃを用いて説明する。
　反応容器５０は、図２Ａに示されているように、血液や試薬を収容する内部空間５０ａを有する円筒状の容器である。内部空間５０ａの底部に分離膜５２が設けられている。分離膜５２としては、上記で例示した分離膜が設置される。
　反応容器５０の上面に血液や試薬を注入するための開口５０ｂが設けられ、下面に分離膜５２を通液した液を抽出するための抽出口５０ｄが設けられている。外周面の上部に、後述する搬送アーム２４の保持部２５を係合させるために周方向へ突出した鍔部５０ｃが設けられている。
　鍔部５０ｃの下方に、周方向へ突起し、そこから下方へ一定距離だけ延びて外周面の周囲を取り囲むスカート部５１が設けられている。後述するが、スカート部５１は、ろ過ポート３０に回収容器５４とともに収容されたときに、ろ過ポート３０の縁に密接することによってスカート部５１の内側の空間を密閉空間にするためのものである。
　回収容器５４は、図２Ｂおよび図２Ｃに示されているように、反応容器５０の下部を収容し、反応容器５０の抽出口５０ｄから排出されたろ液を回収する円筒状の容器である。上面に反応容器５０の下部を挿入させる開口５4ｂを有し、内部に反応容器５０のスカート部５１よりも下側の部分を収容する空間５４ａを有する。外周面の上部に、反応容器５０と同様に、搬送アーム２４の保持部２５を係合させるために周方向へ突出した鍔部５４ｃが設けられている。
　回収容器５４の上部は、反応容器５０に装着されたときにスカート部５１の内側に入り込む。反応容器５０の外径と回収容器５４の内径は、回収容器５４の内部空間５４ａに反応容器５０が収容されたときに、反応容器５０の外周面と回収容器５４の内周面との間に僅かな隙間が生じるように設計されている。前記処理キット設置部１２には、反応容器５０と回収容器５４が、反応容器５０の下部が回収容器５４に収容された状態（図２Ｃの状態）で設置される。
　図１に示した前処理装置１は、またろ過ポート３０、撹拌ポート３６ａが設けられている。ろ過ポート３０は前処理キット設置部１２の内側の２ヶ所の位置に設けられている。撹拌ポート３６ａは、前処理キット設置部１２の近傍に設けられた撹拌部３６に３つ設けられている。
　攪拌部３６の構造について図３Ａおよび図３Ｂを用いて説明する。図３Ａおよび図３Ｂは撹拌部３６の一つの撹拌ポート３６ａについて示している。
　攪拌部３６の撹拌ポート３６ａは反応容器５０を収容する容器である。撹拌ポート３６ａはその下方に設けられた撹拌機構によって駆動される。
　撹拌ポート３６ａを駆動する撹拌機構について説明する。撹拌ポート３６ａの下方に回転体７６が配置され、回転体７６の上面の中心からずれた位置に鉛直向きに配置された駆動軸７４が取り付けられている。駆動軸７４の上端は撹拌ポート３６ａの下面に設けられた支持穴７２に挿入されている。回転体７６はモータ８０によって回転させられる回転軸７８に支持されており、モータ８０の駆動により回転体７６が回転し、それに伴って駆動軸７４が水平面内で旋回するようになっている。
　モータ８０に支持フレーム８２が取り付けられている。支持フレーム８２はモータ８０側から鉛直上向きに延びた側壁を有し、その側壁の上端に例えばコイルバネなどの弾性部材８３の一端が取り付けられている。弾性部材８３の他端は撹拌ポート３６ａの上部外面に取り付けられており、撹拌ポート３６ａの上部を弾性的に保持している。弾性部材８３は撹拌ポート３６ａの周囲の均等な複数箇所（例えば４箇所）に設けられている。
　撹拌ポート３６ａに血液と試薬を収容した反応容器５０を収容してモータ８０を駆動すると、図３Ｂに示されているように、駆動軸７４が水平面内で旋回することにより、回収容器７２の下端部がそれに伴なって旋回する。これにより、撹拌ポート３６ａに収容された反応容器５０内が攪拌され、血液と試薬が混合される。血液と試薬が混合されたのち、撹拌ポートからろ過ポートに搬送される。
　ろ過ポート３０には圧力負荷部としての負圧負荷機構５５（図４Ａおよび図４Ｂ参照。）が接続されており、ろ過ポート３０に設置された前処理キットに対して負圧を付加するように構成されている。
　ろ過ポート３０について図４Ａおよび図４Ｂを用いて説明する。
　ろ過ポート３０は、回収容器５４に反応容器５０の下部が収容された状態の反応容器５０および回収容器５４を収容する凹部によって構成されている。ろ過ポート３０の縁に弾力性を有するリング状の封止部材６０が設けられている。封止部材６０の材質は、例えばシリコーンゴムやＥＰＤＭ（エチレン-プロピレン-ジエンゴム）などの弾性材料である。図４Ｂに示されているように、ろ過ポート３０に回収容器５４に反応容器５０の下部が収容された状態の反応容器５０および回収容器５４が収容されたときに、反応容器５０のスカート部５１の下端が封止部材６０に当接し、スカート部５１の内側側面とろ過ポート３０の内側側面によって囲まれた空間が密閉される。
　ろ過ポート３０の内側側面は流路５６を介して負圧付加機構５５と接続されている。負圧付加機構５５の具体的な構成については後述するが、負圧付加機構５５は真空ポンプによってろ過ポート３０側に負圧を付加するものである。
　ろ過ポート３０に反応容器５０および回収容器５４が収容された状態で負圧負荷機構５５によってそのろ過ポート３０に負圧を負荷することで、スカート部５０の内側側面とろ過ポート３０の内側側面によって囲まれた空間が減圧状態となる。この減圧状態の空間には回収容器５４の内部空間５４ａが通じている。反応容器５０の上面は大気開放されているため、反応容器５０の内部空間５０ａと回収容器５４の内部空間５４ａとの間に分離膜５２を介して圧力差が生じ、反応容器５０の内部空間５０ａに収容されている試料溶液のうち分離膜５２を通過してろ液が回収容器５４の内部空間５４ａ側へ排出されることでろ液が採取される。
　負圧付加機構５５の一例を図５に示す。
　２つのろ過ポート３０は共通の真空タンク６６に接続されている。各ろ過ポート３０と真空タンク６６の間を接続するそれぞれの流路５７は、圧力センサ６２および３方バルブ６４を備えている。圧力センサ６２によりろ過ポート３０の圧力が検知される。３方バルブ６４は、ろ過ポート３０と真空タンク６２の間を接続した状態、流路５７のうちろ過ポート３０側を大気開放した状態（図の状態）、または流路５７のうちろ過ポート３０側の端部を密閉した状態のいずれかの状態にすることができる。
　真空タンク６６には、圧力センサ６８が接続されているとともに、３方バルブ７０を介して真空ポンプ５８が接続されており、必要に応じて真空タンク６６に真空ポンプ５８を接続し、真空タンク６６内の圧力を調節することができる。
　いずれかのろ過ポート３０においてろ液の採取処理を実行する際は、そのろ過ポート３０と真空タンク６６の間を接続し、そのろ過ポート３０の圧力を検知する圧力センサ６２の値が所定値になるように調節した後、流路５７のうちろ過ポート３０側の端部を密閉した状態にする。これにより、ろ過ポート３０内が密閉系となり、ろ過ポート３０内の減圧状態が維持され、ろ液の抽出が行なわれる。
　図１に戻って、この前処理装置１は回収容器５４に採取されたろ液を次の希釈工程に送るため、回収容器排出部４２を、筐体側縁部に備えている。回収容器排出部４２はラックピニオン機構を有する駆動機構により水平面内で一方向（図１の矢印の方向）へ移動する移動部４４を備えている。移動部４４の上面に、ろ液を収容する回収容器５４を設置するための排出ポート４３が設けられている。
　前処理装置１に設けられている検体ラック２、試薬ラック８、前処理キット１２、サンプリングアーム２０、搬送アーム２４、試薬アーム２６、攪拌部３６、回収容器排出部４２、および負圧負荷機構５５の動作は、制御部により制御される。制御部は、前処理装置１内に設けられたコンピュータおよびそのコンピュータによって実行されるソフトウェアによって実現される。制御部には、例えばパーソナルコンピュータ（ＰＣ）や専用のコンピュータによって実現される演算処理装置が接続されており、分析者は演算処理装置を介してこの前処理装置１を管理する。
　制御部は、前処理手段、処理状況管理手段およびランダムアクセス手段を備えている。これらの各手段は、制御部をなすコンピュータがソフトウェアを実行することによって得られる機能である。上述のように、試料設置部２には複数の試料容器が設置されており、それらの試料容器に収容されている試料が反応容器５０に順次分注され、その試料に対して実行されるべき前処理項目に対応したポートに搬送される。
　ランダムアクセス手段は、各試料に対して次に行なうべき処理項目を確認し、その処理項目に対応したポートの空き状況を確認し、空きがあればその試料を収容した反応容器５０または回収容器５４をそのポートへ搬送するように構成されている。また、その処理項目に対応するポートに空きがない場合には、そのポートが空き次第、対象の反応容器５０または回収容器５４をそのポートへ搬送する。ランダムアクセス手段は、各ポートにおける処理の状況を確認し、そのポートでの処理が終了した反応容器５０を次の処理を行なうためのポートに搬送するように搬送アーム２４を制御するように構成されている。
　処理状況管理手段は、各ポートの空き状況や各ポートでの処理状況を管理するように構成されている。各ポートの空き状況は、どのポートに反応容器５０または回収容器５４を設置したかを記憶しておくことにより管理することができる。また、各ポートに反応容器５０または回収容器５４が設置されているか否かを検知するセンサを設け、そのセンサからの信号に基づいて各ポートの空き状況を管理してもよい。各ポートにおける処理状況は、そのポートに反応容器５０または回収容器５４が設置されてからそのポートで実行される処理に要する時間が経過したか否かにより管理することができる。
　各ポートに反応容器５０または回収容器５４が設置されたときに、そのポートにおける所定の処理を実行するように構成されている。
ここで、ろ過ポート３０は２つ、撹拌ポート３６ａは３つ設けられているが、これらの同じ処理を実行するために設けられたポート間には優先順位が設定されており、ランダムアクセス手段は優先順位の高いポートから順に使用するように構成されている。例えば、試料のろ過を実行する際に２つのろ過ポート３０のいずれも空いている場合には、優先順位の高いろ過ポート３０に回収容器５４を設置し、その回収容器５４上に反応容器５０を設置する。
　実施形態１の試料についての動作の一例について説明する。まず、分注ポート３２が空いているか否かを確認し、分注ポート３２が空いていれば、搬送アーム２４がその血液を収容するための未使用の反応容器５０を前処理キット設置部１２から取り出して分注ポート３２に設置する。前処理キット設置部１２には反応容器５０と回収容器５４とは重ねられた状態（図２Ｃの状態。）で設置されているが、搬送アーム２４は上側の反応容器５０のみを保持部２５で保持して分注ポート３２へ搬送する。
　サンプリングノズル２０ａによって血液をその反応容器５０に分注する。血液を反応容器５０に分注したサンプリングノズル２０ａはその後洗浄ポート４５において洗浄を行ない、次の血液の分注に備える。反応容器５０に分注された血液に対して試薬分注ノズル２６ａによって試薬容器１０から試薬を採取し、分注ポート３２の反応容器５０に分注する。なお、反応容器５０への試薬の分注を血液の分注の前に実行してもよい。また、試薬を分注するための試薬分注用ポートを分注ポート３２とは別の位置に設けておき、搬送アーム２４によってその試薬分注用ポートに反応容器５０を設置し、その位置において試薬の分注を行なってもよい。
　反応容器５０に血液と試薬を分注した後、撹拌ポート３６ａの空き状況を確認する。撹拌ポート３６ａに空きがあれば、搬送アーム２４によって分注ポート３２の反応容器５０を空いている撹拌ポート３６ａに設置して撹拌を行なう。この攪拌工程は予め設定された一定時間行なわれ、これによって反応容器５０内の血液と試薬が混合される。この撹拌工程中に、ろ過ポート３０の空き状況を確認し、ろ過ポート３０に空きがある場合は搬送アーム２４によって回収容器５４をろ過ポート３０に設置する。ろ過ポート３０に設置する回収容器５４は、撹拌ポート３６ａにおいて撹拌中の反応容器５０と対をなす回収容器５４であり、前処理キット設置部１２において撹拌中の反応容器５０と重ねられて設置されていた回収容器５４である。なお、この攪拌処理中に、搬送アーム２４は別の血液の反応容器５０や回収容器５４の搬送を行なうこともできる。
　攪拌部３６における攪拌工程が終了すると、搬送アーム２４は、反応容器５０をろ過ポート３０の回収容器５４上に設置し、図４Ｂに示された状態にする。反応容器５０および回収容器５４を収容した濾過ポート３０に対し、負圧付加機構５５によって所定の負圧を付加する。ろ過ポート３０に負圧が付加された状態で一定時間維持されることにより、反応容器５０中の沈殿物がろ過され回収容器５４にろ液が採取される。このろ過処理中にも、搬送アーム２４は他の反応容器５０や回収容器５４の搬送を行なうことができる。
　上述のようにしてろ液を保持する回収容器５０は前記回収容器排出部から排出される。排出されたろ液を含む回収容器に希釈液を添加し、必要に応じて希釈ろ液を撹拌して、液体クロマトグラフィーで成分ごとに分離する分離工程、分離された各成分を質量分析により分析する分析工程をへて、ウラシルとジヒドロウラシルの少なくとも一方が分析される。
　液体クロマトグラフィーの分析条件の一例としては、以下の条件が挙げられる。
装置：ＮＥＸＥＲＡ（登録商標）　Ｘ２　またはＸＲ　（株式会社　島津製作所製）
　カラム：Ｈｙｐｅｒｃａｒｂ、３μｍ、１５０＊２、１ｍｍ
　温度：２５℃
　移動相　Ａ：水＋０．５％酢酸
　移動相　Ｂ：アセトニトリル＋０．５％酢酸
　流速：２５０μＬ／分
　質量分析の分析条件の一例としては、以下の条件が挙げられる。
　装置：ＬＣＭＳ－８０６０ ＥＳＩキャピラリー付き
　温度：３８０℃（ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）、　５００℃（ｈｅａｔ　ｂｌｏｃｋ）、　３００℃（ＤＬ）
　ガス流速：３Ｌ（噴霧ガス）、１４Ｌ／分（ヒートガス）、３Ｌ／分（乾燥ガス）
　移動相　Ｂ：アセトニトリル＋０．５％酢酸
　流速：２５０μＬ／分
　＜実施形態２＞
　実施形態２について図６を参照して説明する。なお以下の説明では前述した実施形態１との相違点を中心に説明する。その他の点については実施形態１と同様である。
本実施形態２では上述した前処理装置１が、さらに少なくとも第１の位置と第２の位置との間で移動可能であり、前記回収容器を保持して搬送する保持機構をさらに備え、
前記制御部は、前記保持機構を、希釈工程後に前記回収容器を第１の位置から第２の位置に搬送するように制御する機能を有する。
　本実施形態では、前記前処理装置１がさらに希釈ポート６０を有し、前処理装置１のろ過ポート３０（第１の位置）から希釈ポート６０（第２の位置）との間で移動可能であり、ろ過ポートで採取したろ液を収納している回収容器を保持する保持機能を備えている。
　第１の位置から第２の位置までの搬送は、上述した実施形態１で使用した搬送アームを用いてもよいし、新たに搬送アームを設けてもよい。該搬送アームには回収容器を保持する保持機能が備えられており、ろ過ポートから希釈ポートまで回収容器を搬送する。
　別途設けられた希釈液タンク（図示せず）から別途設けた希釈アーム（図示せず）にて、希釈液を上記と同様の制御方法で分注し、希釈ポートに搬送された回収容器に添加し、ろ液が所望の量まで希釈される。希釈液タンクは前記前処理装置１内に別途、設けてもよいし、前処理装置の外側に取付けてもよい。
　上記実施形態１と同様にして、ろ過工程まで完了した後、希釈ポートが空いていれば、ろ過ポートにある回収容器は上記搬送アームにより希釈ポートに搬送される。搬送された回収容器に予め設定された量の希釈液が加えられたのち、回収容器は上述した回収容器排出部に搬送され、前処理装置より排出される。
　排出された回収容器は先述のとおり分離工程、分析工程に供される。
　なお、希釈ポートでは上述した撹拌機構と同様の構造の撹拌機構を備えたものとしてもよい。
　前処理装置より排出された回収容器に保持されている希釈ろ液は上述と同様に分離工程、分析工程に供される。
　以下実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらによって限定されない。
 
実施例１
　上述した実施態様１で示した前処理装置１（図１）を用いて、ウラシルとジヒドロウラシルを含む検体に試薬を分注し、検体と試薬を混合、撹拌し、得られた沈殿物をろ過した。ろ液を含む回収容器を回収し、希釈液の添加により稀釈した後、分離工程に供した。ろ液の希釈率は５倍、１０倍、４０倍、５０倍とした。各稀釈率の液を液体クロマトグラフィーにより成分ごとに分離し、分離された各成分を質量分析装置により分析した。
　液体クロマトグラフィーおよび質量分析の条件は以下のとおりであった。
　液体クロマトグラフィーの分析条件
　装置：ＮＥＸＥＲＡ（登録商標）　Ｘ２　（株式会社　島津製作所製）
　カラム：Ｈｙｐｅｒｃａｒｂ、３μｍ、１５０＊２、１ｍｍ
　温度：２５℃
　移動相　Ａ：水＋０．５％酢酸
　移動相　Ｂ：アセトニトリル＋０．５％酢酸
　流速：２５０μＬ／分
　質量分析の分析条件
　装置：ＬＣＭＳ－８０６０ ＥＳＩキャピラリー付き
　温度：３８０℃（ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）、　５００℃（ｈｅａｔ　ｂｌｏｃｋ）、　３００℃（ＤＬ）
　ガス流速：３Ｌ（噴霧ガス）、１４Ｌ／分（ヒートガス）、３Ｌ／分（乾燥ガス）
　移動相　Ｂ：アセトニトリル＋０．５％酢酸
　流速：２５０μＬ／分
　また質量分析において、同定用の確認イオンと定量用のターゲットイオンの条件は以下のとおりであった。
（ウラシルの分析）
　確認イオン
1段目のMSでm/z　112.95（プリカーサイオンとして選択）を通し、CIDセル（コリジョンセル）で壊して96,050m/z をつくり、２段目のMSでm/z ：96,050（プロダクトイオン）を通過したもの
　ターゲットイオン
1段目のMSでm/z 112.95（プリカーサイオンとして選択）を通し、CIDセルで壊してm/z 70.1をつくり、２段目のMSでm/z 70.1（プロダクトイオン）を通過したもの
（ジヒドロウラシルの分析）
　確認イオン
1段目のMSでm/z 115.050（プリカーサイオンとして選択）を通し、CIDセルで壊してm/z 30.00をつくり、２段目のMSでm/z 30.00（プロダクトイオン）を通過したもの
　ターゲットイオン
1段目のMSでm/z 115.050（プリカーサイオンとして選択）を通し、CIDセルで壊して55，1m/z をつくり、２段目のMSでm/z ：55，1（プロダクトイオン）を通過したもの
　希釈率５倍、１０倍、４０倍、５０倍のウラシルの質量分析結果を図７から図１０に、ジヒドロウラシルの質量分析結果を図１１から１４にそれぞれ示した。また比較のために上記実施例と同様にして、得られたろ液を稀釈せずに液体クロマトグラフィーにより分離し、分離されたウラシルおよびジヒドロウラシルの質量分析を図１５および１６にそれぞれ示した。
　図７から１０と図１５との比較から、ろ液の希釈により、夾雑物によるマトリックス効果が低減され、分離工程および分析工程で高精度の結果が得られた。この結果は図１１から１４と図１６との比較でも同様であった。
また前処理装置１を用いることで、簡便かつ迅速にウラシルとジヒドロウラシルの存在比を測定することができた。
実施例２
　上述した実施態様２の前処理装置１００（図２）を用いて、ウラシルとジヒドロウラシルを含む検体に試薬分注し、検体と試薬を混合、撹拌し、得られた沈殿物をろ過し、希釈ポートにて希釈液にて希釈する。希釈液を液体クロマトグラフィーにより成分ごとに分離し、分離された各成分を質量分析装置により分析することで上記実施例１と同様の結果が得られる。
［態様］
　上述の実施態様は以下の態様の好ましい具体例であることが当業者により理解される。
［１］　
　被験者から採取した血液を収納した検体容器および試薬が収納された試薬容器から、それぞれ一定量の流体を吸引して反応容器に分注する分注工程、
前記分注工程で分注された前記血液と前記試薬を前記反応容器内で混合する混合工程、
前記混合工程で得られた混合物を撹拌する撹拌工程、
前記撹拌工程で生成した沈殿物をろ過してろ液を採取するろ過工程、
前記工程により得られたろ液を液体クロマトグラフィーにより成分ごとに分離する分離工程、
前記分離工程により分離された各成分を質量分析装置により分析し、得られた質量分析データに基づき、前記血液中の５－フルオロウラシルおよび５－フルオロジヒドロウラシルの少なくとも一方をについて定性および定量する分析工程を含み、
前記各工程を自動的に行うとともに、前記分注工程、前記混合工程、前記撹拌工程、前記ろ過工程のうち、の少なくとも一つの工程で得られた液を希釈する希釈工程を含む、分析方法。
　上記方法によりウラシル、ジヒドロウラシルを簡便に分析することができる。
［２］
　前記定性工程の後、前記質量分析データに基づいて、存在が確認された前記血液中の５－フルオロウラシルおよび５－フルオロジヒドロウラシルの少なくとも一方の濃度を定量する定量工程をさらに含む、前記［１］に記載の分析方法。
［３］
　前記血液が、血漿または血清である前記［１］に記載の分析方法。
［４］
　前記試薬は、アセトニトリルとギ酸の混合物である前記［１］から［３］に記載の分析方法。
［５］
　前記希釈工程は、前記ろ過工程により採取したろ液を希釈し、
前記分離工程は、前記ろ過工程により希釈された希釈ろ液をクロマトグラフィ－により成分ごとに分離する前記［１］に記載の分析方法。
［６］
　前記希釈工程で、ろ液を希釈率５０倍未満に希釈する前記［５］に記載の分析方法。
［７］
　前希釈工程で、ろ液を希釈率５倍から４０倍に希釈する前記［６］に記載の分析方法。
［８］
　前記希釈工程で、水でろ液を希釈する前記［１］から［７］のいずれかに記載の分析方法。
　上記［２］から［８］の方法によりウラシル、ジヒドロウラシルを簡便に分析することができることに加えて、分析精度も高くすることができる。
［９］
　前記ろ過工程で樹脂製の分離膜を用いる前記［１］から［８］のいずれかに記載の分析方法。
［１０］
　前記樹脂製の分離膜がポリテトラフルオロエチレンからなる分離膜である前記［９］に記載の分析方法。
［１１］
　前記分離工程の移動相は、水と酢酸の混合物とアセトニトリルと酢酸の混合物の少なくともいずれかである前記［１］から［１０］のいずれかに記載の分析方法。
　上記［９］から［１１］の方法により分離工程の精度を上げることができ、ウラシル、ジヒドロウラシルの分析精度をさらに高くすることができる。
［１２］
　前記希釈工程の後、前記分離工程の前にさらに希釈されたろ液を回収容器に回収する回収工程をさらに含む前記［１］に記載の分析方法。
［１３］
　前記回収工程の後、前記分離工程の前に前記回収容器を前記液体クロマトグラフィーに搬送する搬送工程をさらに含む前記［１２］に記載の分析方法。
［１４］
　少なくとも前記分注工程からろ過工程を一つの前処理装置で行う前記［１］、［１２］および［１３］に記載の分析方法。
　上記［１２］から［１４］の方法により、ウラシル、ジヒドロウラシルの分析をより簡便に行うことができる。
［１５］
　前記分注工程から前記搬送工程までを一つの前処理装置で行う前記［１３］に記載の分析方法。
［１６］
　前記前処理装置が
被験者から採取した血液を収容した検体容器を1以上保持する検体ラックと、
１以上の試薬容器を保持するように構成された試薬ラックと、
前記検体容器と前記試薬容器とから一定量の流体を吸引して前記反応容器に分注するように動作可能な分注機構と、
前記反応容器に収容された混合物を撹拌するための撹拌機構と、
前記反応容器内の沈殿物をろ過してろ液を採取するろ過機構と、
前記分注機構を、検体容器から血液を吸引して反応容器に分注し、試薬容器から試薬を吸引して反応容器に分注するように制御する制御部と
を備える前処理装置である前記［１４］または［１５］に記載の分析方法。
［１７］
　前記前処理装置が、さらに
少なくとも第１の位置と第２の位置との間で移動可能であり、前記回収容器を保持して搬送する保持機構をさらに備え、
前記制御部は、前記保持機構を、希釈工程後に前記回収容器を第１の位置から第２の位置に搬送するように制御する、前記［１６］に記載の分析方法。
　上記［１５］から［１７］の方法により、ウラシル、ジヒドロウラシルの分析をより簡便にかつ迅速に行うことができる。
 
　　１，１００　前処理装置
　　２　　　　検体ラック
　　４　　　　ラック
　　６　　　　検体容器
　　８　　　　試薬ラック
　　１０　　　試薬容器
　　１２　　　前処理キット
　　２０　　　サンプリングアーム
　　２０ａ　　サンプリングノズル
　　２２、２９軸
　　２４　　　搬送アーム
　　２５　　　保持部
　　２６　　　試薬アーム
　　２６ａ　　試薬添加ノズル
　　３０　　　濾過ポート
　　３２　　　分注ポート
　　３４　　　廃棄ポート
　　３６　　　撹拌部
　　３６ａ　　撹拌ポート
　　４２　　　回収容器排出部
　　４３　　　排出ポート
　　４４　　　移動部
　　４５　　　洗浄ポート
　　５０　　　反応容器
　　５０ａ　　反応容器の内部空間
　　５０ｂ　　反応容器の開口
　　５０ｃ　　反応容器の鍔部
　　５０ｄ　　排出口
　　５１　　　スカート部
　　５２　　　分離膜
　　５４　　　回収容器
　　５４ａ　　回収容器の内部空間
　　５４ｂ　　回収容器の開口
　　５４ｃ　　回収容器の鍔部
　　６０　　　希釈ポート

 

Claims (17)

  1. 　被験者から採取した血液を収納した検体容器および試薬が収納された試薬容器から、それぞれ一定量の流体を吸引して反応容器に分注する分注工程、
    前記分注工程で分注された前記血液と前記試薬を前記反応容器内で混合する混合工程、
    前記混合工程で得られた混合物を撹拌する撹拌工程、
    前記撹拌工程で生成した沈殿物をろ過してろ液を採取するろ過工程、
    前記工程により得られたろ液を液体クロマトグラフィーにより成分ごとに分離する分離工程、
    前記分離工程により分離された各成分を質量分析装置により分析し、得られた質量分析データに基づき、前記血液中の５－フルオロウラシルおよび５－フルオロジヒドロウラシルの少なくとも一方をについて定性および定量する分析工程を含み、
    前記各工程を自動的に行うとともに、前記分注工程、前記混合工程、前記撹拌工程、前記ろ過工程のうち、の少なくとも一つの工程で得られた液を希釈する希釈工程を含む、分析方法。
  2. 　前記定性工程の後、前記質量分析データに基づいて、存在が確認された前記血液中の５－フルオロウラシルおよび/または５－フルオロジヒドロウラシルの濃度を定量する定量工程をさらに含む、請求項１に記載の分析方法。
  3. 　前記血液が、血漿または血清である請求項１に記載の分析方法。
  4. 　前記試薬は、アセトニトリルとギ酸の混合物である請求項１～３に記載の分析方法。
  5. 　前記希釈工程は、前記ろ過工程により採取したろ液を希釈し、
    前記分離工程は、前記ろ過工程により希釈された希釈ろ液をクロマトグラフィ－により成分ごとに分離する請求項１から４のいずれか１項に記載の分析方法。
  6. 　前記希釈工程で、ろ液を５０倍未満に希釈する請求項５に記載の分析方法。
  7. 　前記希釈工程で、ろ液を５倍から４０倍に希釈する請求項６に記載の分析方法。
  8. 　前記希釈工程で、水でろ液を希釈する請求項１から７のいずれか１項に記載の分析方法。
  9. 　前記ろ過工程で樹脂製の分離膜を用いる請求項１から７のいずれか１項に記載の分析方法。
  10. 　前記樹脂製の分離膜がポリテトラフルオロエチレンからなる分離膜である請求項９に記載の分析方法。
  11. 　前記分離工程の移動相は、水と酢酸の混合物とアセトニトリルと酢酸の混合物の少なくともいずれかである請求項１から１０のいずれか１項に記載の分析方法。
  12. 　前記希釈工程の後、前記分離工程の前にさらに希釈されたろ液を回収容器に回収する回収工程をさらに含む請求項１に記載の分析方法。
  13. 　前記回収工程の後、前記分離工程の前に前記回収容器を前記液体クロマトグラフィーに搬送する搬送工程をさらに含む請求項１２に記載の分析方法。
  14. 　少なくとも前記分注工程からろ過工程を一つの前処理装置で行う請求項１、１１および１３に記載の分析方法。
  15. 　前記分注工程から前記搬送工程までを一つの前処理装置で行う請求項１３に記載の分析方法。
  16. 　前記前処理装置が
    被験者から採取した血液を収容した検体容器を１以上保持する検体ラックと、
    １以上の試薬容器を保持するように構成された試薬ラックと、
    前記検体容器と前記試薬容器とから一定量の流体を吸引して前記反応容器に分注するように動作可能な分注機構と、
    前記反応容器に収容された混合物を撹拌するための撹拌機構と、
    前記反応容器内の沈殿物をろ過してろ液を採取するろ過機構と、
    前記分注機構を、検体容器から血液を吸引して反応容器に分注し、試薬容器から試薬を吸引して反応容器に分注するように制御する制御部と備える前処理装置である請求項１３または１４に記載の分析方法。
  17. 　前記前処理装置が、さらに
    少なくとも第１の位置と第２の位置との間で移動可能であり、前記回収容器を保持して搬送する保持機構をさらに備え、
    前記制御部は、前記保持機構を、希釈工程後に前記回収容器を第１の位置から第２の位置に搬送するように制御する、請求項１５に記載の分析方法。
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