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WO2020230785A1 - 細胞融合を誘導するワクシニアウイルス及びその利用 - Google Patents

細胞融合を誘導するワクシニアウイルス及びその利用 Download PDF

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WO2020230785A1
WO2020230785A1 PCT/JP2020/018976 JP2020018976W WO2020230785A1 WO 2020230785 A1 WO2020230785 A1 WO 2020230785A1 JP 2020018976 W JP2020018976 W JP 2020018976W WO 2020230785 A1 WO2020230785 A1 WO 2020230785A1
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WO
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gene
vaccinia virus
virus
vgf
cancer
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PCT/JP2020/018976
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French (fr)
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貴史 中村
望 桑野
大夢 中武
創 黒▲崎▼
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Tottori University NUC
Evolve Biotherapeutics Co Ltd
Original Assignee
Tottori University NUC
Evolve Biotherapeutics Co Ltd
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Publication date
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Priority to US17/610,777 priority patent/US12409198B2/en
Priority to EP20806805.6A priority patent/EP3970740A4/en
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    • C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the present invention relates to a vaccinia virus that induces cell fusion of infected cells.
  • This cancer virus therapy is a method of utilizing the original property of the virus, which is to kill the infected cells / tissues while proliferating and propagating them, in the treatment of cancer.
  • This cancer virus therapy exerts anticancer effects by various mechanisms, firstly by oncolytic virus by virus growth and secondly by inducing antitumor immunity.
  • Non-Patent Document 1 There is a vaccine strain of vaccinia virus that was once established in Japan and used in humans as a smallpox vaccine and has been proven to be highly safe (see Non-Patent Document 1). However, since it still maintains weak proliferation in normal tissues, it was essential to improve its proliferation only in cancer cells in order to establish it as a safer cancer virus therapy. Therefore, based on this vaccine strain, we will improve it by gene recombination technology, and use the MAPK / ERK pathway control abnormality in a wide range of cancers as an index to develop a recombinant vaccinia virus that proliferates and destroys cancer cells specifically. Successful (see Patent Documents 1 and 2).
  • An object of the present invention is to provide a vaccinia virus that induces cell fusion of infected cells and a method for producing the same.
  • the present inventor In investigating the antitumor effect of vaccinia virus, the present inventor induces cell fusion of infected cells when a gene such as K2L gene or HA gene of vaccinia virus is deleted, resulting in cell death. I found that. That is, the anticancer effect was exhibited by infecting cancer cells with a vaccinia virus lacking the K2L gene or HA gene. Furthermore, they have found that a synergistic anticancer effect can be exerted by deleting the K2L gene or HA gene of an oncolytic vaccinia virus, and have completed the present invention.
  • the present invention is as follows.
  • [1] A vaccinia virus mutated to cause finely infected cell fusion.
  • the vaccinia virus of [1] which lacks the functions of the K2L gene or HA gene, or the K2L gene and HA gene, causes cell fusion in infected cells and induces cell death.
  • the vaccinia virus of [3] which does not proliferate in normal cells, but proliferates specifically in cancer cells and has oncolytic activity that specifically damages cancer cells.
  • a pharmaceutical composition for treating cancer which comprises the vaccinia virus according to any one of [1] to [5].
  • a pharmaceutical composition comprising the vaccinia virus vector of [7] or [8] for the treatment of cancer or for use as a vaccine against cancer, virus, bacteria or protozoan.
  • a combination pharmaceutical kit for treating cancer which comprises the vaccinia virus according to any one of [1] to [5] in combination with an immune checkpoint inhibitor.
  • the combination pharmaceutical kit of [14], wherein the immune checkpoint inhibitor is an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody.
  • the vaccinia virus according to any one of [1] to [5] to be used in combination with an immune checkpoint inhibitor for cancer treatment.
  • the vaccinia virus of [16], wherein the immune checkpoint inhibitor is an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody.
  • the vaccinia virus When a gene such as the K2L gene or HA gene of vaccinia virus is deleted, the vaccinia virus induces cell fusion of infected cells, and the anticancer effect is improved.
  • the oncolytic ability is improved by increasing the proliferation and transmission ability of the virus, and in addition, apoptosis and necrosis occur actively.
  • ICD is induced more efficiently, and CD8 T cell infiltration to the administered side and the non-administered side occurs actively.
  • cancer immunity becomes easier to work.
  • oncolytic viruses that induce cell fusion are more efficient than oncolytic viruses that do not induce cell fusion by converting COLD tumors, which are difficult to immunize, into HOT tumors, which are easily immune-attacked. Demonstrates anti-cancer effect.
  • FIGS. 1A-C show the structure of VGF-LucGFP / O1L-DsRed and the cell fusion induction gene recombinant vaccinia virus derived from it
  • FIGS. The structure of VGF-Luc / O1L-LacZ and its derived cell fusion-inducing transgenic vaccinia virus is shown.
  • FIG. 5-1A shows apoptosis that occurred in A549 and FIG.
  • FIG. 5-1B shows necrosis. It is a figure which shows the cell death by a cell fusion induction gene recombination vaccinia virus.
  • FIG. 5-2A shows the apoptosis that occurred in CT26 and FIG. 5-2B shows necrosis. It is a figure which shows the immunoprokaryotic cell death (ICD) by a cell fusion induction gene recombination vaccinia virus.
  • FIG. 6A shows the ICD of A549 and FIG. 6B shows the ICD of CT26. It is a figure which shows the experimental system of the allograft model mouse.
  • FIG. 7A shows direct administration of the virus to one side of the tumor and FIG. 7B shows the administration and detection schedule.
  • FIG. 8-2A shows the growth of vaccinia virus on the administration side
  • FIG. 8-2B shows the growth of vaccinia virus on the non-administration side.
  • FIG. 9A shows the tumor volume on the administration side
  • FIG. 9B shows the tumor volume on the non-administration side.
  • FIG. 11A shows the result of administration of isotype control
  • FIG. 11B shows the result of administration of anti-CD8 antibody.
  • FIG. 11A and 11B shows the results on the administration side, and the graph on the right shows the results on the non-administration side.
  • FIG. 12A shows direct administration of the virus to one side of the tumor and
  • FIG. 12B shows the administration and detection schedule.
  • FIG. 12A shows the growth distribution of the cell fusion induction gene recombinant vaccinia virus in the advanced allogeneic transplantation model mouse.
  • FIG. 17A shows direct administration of the virus to one side of the tumor and FIG. 17B shows the administration and detection schedule. It is a figure which shows the tumor volume after the cell fusion induction gene recombination vaccinia virus treatment in the allogeneic transplant model mouse which combined with the anti-PD-1 antibody.
  • FIG. 18A shows the result when the anti-PD-1 antibody was not used, and FIG.
  • FIGS. 18A and 18B shows the result when the anti-PD-1 antibody was used in combination.
  • the graph on the left of FIGS. 18A and 18B shows the results on the administration side, and the graph on the right shows the results on the non-administration side.
  • the vaccinia virus of the present invention is a vaccinia virus mutated so as to have cell fusion ability.
  • the cell fusion ability means that when a vaccinia virus infects a cell, it can cause cell fusion between the infected cells.
  • the vaccinia virus mutated to have cell fusion ability lacks the function of the gene that suppresses the cell fusion ability originally possessed by vaccinia virus, or a gene that promotes cell fusion is inserted and expressed. ..
  • Examples of the genes originally possessed by the vaccinia virus that is involved in cell fusion and suppresses the cell fusion ability include the K2L gene and the HA (A56R) gene, and the vaccinia virus of the present invention is the K2L gene or HA gene, or the K2L gene and HA.
  • the function of the gene is deficient, and therefore the phenotype is changed so as to have cell fusion ability.
  • Figure 8 on page 5159 of Wagenaar et al., Journal of Virology, Vol.82, No.11, June2008, p.5153-5160, HA in cells infected with the vaccinia virus.
  • a complex of (A56R) protein and K2L protein is immobilized on the cell membrane via the transmembrane region of HA.
  • the entry / fusion complex (EFC) composed of multiple viral proteins (A21L, A28L, G3L, H2R, J5L, L5R) is fixed on the membrane of the mature virus in cooperation with the viral proteins G9R and A16L. It is considered that G9R and A16L act on HA and K2L on the cell membrane to inhibit the fusion between the virus and infected cells. From this, the dysfunction of HA and K2L eliminates the inhibitory function and can induce cell fusion.
  • genes inherent in vaccinia virus that is involved in cell fusion and suppresses cell fusion ability in addition to K2L and HA that encode viral proteins, A16L, A21L, A25L, A26L, A28L, G3L, G9R, H2R, Examples include J5L and L5R genes.
  • G9R by mutating H at position 44 to Y, fusion is induced even if the molecule that suppresses fusion is normal. Therefore, cell fusion can be induced or enhanced by deficient in one or more of these functions or by introducing mutations. Examples of combinations include deficiency of K2L and mutation of the 44th H of G9R to Y.
  • viral proteins with fusion ability are known, and by inserting this gene into a virus containing different oncolytic viruses and expressing it, it can be mutated so as to have cell fusion ability.
  • examples of such genes include genes encoding H (hemagglutinin) protein and F (fusion) protein derived from measles virus.
  • H hemagglutinin
  • F fusion protein derived from measles virus.
  • VSV vesicular stomatitis virus
  • GaLV GaLV envelope derived from the Tenagazaru leukemia virus
  • GaLV Tenagazaru leukemia virus
  • VSV that expresses FAST protein derived from Reovirus adenovirus that expresses HIV envelope derived from HIV
  • VSV that expresses F protein derived from Newcastle disease virus (NDV) VSV that expresses F protein derived from Newcastle disease virus (NDV)
  • NDV Newcastle disease virus
  • Adenoviruses that express proteins have been reported (Krabee et al., Cancers 2018, 10, 216; doi: 10.3390 / cancers10070216).
  • genes that promote cell fusion genes encoding FAST protein derived from leovirus, genes encoding HIV envelope derived from HIV, genes encoding F protein derived from NDV, and F protein derived from SV5 are encoded. Genes and the like can also be mentioned.
  • the K2L gene is known as a serine protease inhibitor, but there are many unclear points about its function.
  • the HA gene is a glycoprotein induced on the surface of infected cells and is known as an hemagglutinin.
  • the base sequence of the wild-type K2L gene is represented by SEQ ID NO: 20, and the base sequence of the wild-type HA gene is represented by SEQ ID NO: 21.
  • a deficiency in the function of the K2L gene or HA gene of vaccinia virus means that the K2L gene or HA gene is not expressed, or that the expressed protein does not retain the normal function of the K2L protein or HA protein even if it is expressed.
  • all or part of the K2L gene or HA gene may be deleted.
  • the gene may be mutated by substituting, deleting or adding a base to prevent normal K2L protein or HA protein from being expressed.
  • a foreign gene may be inserted into the K2L gene or the HA gene.
  • Deletion of gene function can be performed by, for example, known genome editing, homologous recombination, RNA interference method, antisense method, gene insertion method, artificial mutation method, PTGS method using a viral vector, or the like.
  • RNA interference method for example, known genome editing, homologous recombination, RNA interference method, antisense method, gene insertion method, artificial mutation method, PTGS method using a viral vector, or the like.
  • Homologous recombination is a phenomenon in which two DNA molecules recombined with each other via the same base sequence in a cell, and is a method often used for recombination of viruses having huge genomic DNA such as vaccinia virus. is there.
  • a plasmid (called a transfer vector) in which other DNAs are linked is constructed by dividing the sequence of the K2L gene or HA gene site of the target vaccinia virus in the center, and this is used as a cell infected with the vaccinia virus.
  • the viral DNA that became naked in the process of virus replication and the same sequence part on the transfer vector are exchanged, and the sandwiched DNA is integrated into the target gene of the viral genome, and the gene is integrated into the target gene. Loss of function.
  • the cells used at this time include BSC-1 cells, HTK-143 cells, Hep2 cells, MDCK cells, Vero cells, HeLa cells, CV1 cells, COS cells, RK13 cells, BHK-21 cells, primary rabbit kidney cells, and other vaccinia viruses. Can use cells that can infect.
  • the vector may be introduced into cells by a known method such as a calcium phosphate method, a cationic ribosome method, or an electroporation method.
  • Genome editing is a method of modifying a target gene using a site-specific nuclease.
  • ZFN zinc finger CRISPR
  • the method using the CRISPR / Cas9 system is preferable.
  • any sequence is cleaved by guideRNA (crRNA, tracrRNA) containing a sequence complementary to the target sequence of the gene whose function is to be deleted by cleaving and Cas9 which is a nuclease.
  • crRNA, tracrRNA guideRNA
  • Cas9 which is a nuclease.
  • NHEJ non-homologous end binding
  • base deletion and the like are induced, and the gene can be knocked out.
  • HDR homologous recombination type repair
  • HDR homologous recombination type repair
  • a target sequence in the gene may be selected and a guide RNA sequence containing a sequence complementary to the sequence may be designed.
  • the base length of guideRNA is preferably 20 or more.
  • genome editing is performed by the CRISPR / Cas9 system, the Cas9 protein and guideRNA may be co-expressed. For example, a vector that co-expresses both may be introduced.
  • Genome editing with CRISPR / Cas9 can be performed using a commercially available CRISPR / Cas9 tool.
  • the strain of the vaccinia virus for producing the vaccinia virus of the present invention is not limited, but the Lister strain, the LC16 strain established from the Lister strain, the LC16mO strain, and the LC16m8 strain (Hashizume So, Clinical and Virus vol.3, No.3, 269, 1975, etc.), New York City Board of Health (NYBH), Wyeth, Copenhagen, Western Reserve (WR), Modified Vaccinia Ankara (MVA), EM63, Ikeda, Dalian , Tian Tan stock, etc.
  • the LC16mO strain is a strain created from the Lister strain via the LC16 strain, and the LC16m8 strain has a frame shift mutation in the B5R gene, which is a gene encoding a virus membrane protein, further produced from the LC16mO strain. It is a strain that has been attenuated due to the expression and non-function of the protein (protein nucleic acid enzyme Vol.48 No.12 (2003), p.1693-1700).
  • the vaccinia virus used in the present invention is preferably attenuated and has no pathogenicity in that the safety when administered to humans has been established.
  • attenuated strains include strains in which the B5R gene is partially or completely deleted.
  • the B5R gene encodes a protein present in the envelope of vaccinia virus, and the B5R gene product is involved in virus infection and proliferation.
  • the B5R gene product is present on the surface of infected cells and on the envelope of the virus, and acts to increase the efficiency of infection when the virus infects and propagates to adjacent cells or other parts of the host body, and the plaque size and host of the virus. It is also involved in the region. Deletion of the B5R gene reduces plaque size and pock size when infecting animal cells.
  • the vaccinia virus in which the B5R gene is partially or completely deleted, does not have the normal function of the gene product of the B5R gene, has low skin proliferation, and does not cause side effects even when administered to humans.
  • the attenuated strain in which the B5R gene is deleted include the m8 ⁇ strain (also referred to as LC16m8 ⁇ strain) established by completely deleting the B5R gene from the above LC16m8 strain. It is also possible to use an mO ⁇ strain (also referred to as LCmO ⁇ strain) established by completely deleting the B5R gene from the LC16mO strain.
  • vaccinia virus strain in which these B5R genes are partially or completely deleted is described in WO 2005/054451 and can be obtained based on the description. Whether the vaccinia virus partially or completely deletes the B5R gene and lacks the function of the B5R protein can be determined, for example, by plaque size, pock size, and Vero cells formed when infecting RK13 cells. It can be judged by using the virus growth in the virus, the skin pathogenicity in rabbits, etc. as indicators. In addition, the gene sequence of vaccinia virus may be examined.
  • the vaccinia virus having the B5R gene expresses the B5R gene in cancer cells and causes damage to the cancer cells by the action of the B5R protein. Therefore, it is desirable that the vaccinia virus used in the present invention express the complete B5R gene.
  • the complete B5R gene is newly introduced into the vaccinia virus lacking the B5R gene.
  • the B5R gene may be inserted into the vaccinia virus genome.
  • the B5R gene may be inserted into the vaccinia virus by any method, for example, by a known homologous recombination method. Further, the position where the B5R gene is inserted in this case may be between the B4R gene and the B6R gene in which the B5R gene originally existed, or may be an arbitrary site in the genome of the vaccinia virus. Furthermore, the B5R gene may be constructed in advance as a DNA construct and introduced into the vaccinia virus.
  • the K2L gene or HA gene of vaccinia virus is deficient, and the K2L or HA function does not work, which increases the growth and transmission ability of the virus, which improves the oncolytic ability and induces cell death of infected cancer cells.
  • cell death includes apoptosis and necrosis. It also causes cell fusion in infected cancer cells.
  • ICD immunoprokaryotic cell death
  • the ability to induce immunoprokaryotic cell death (ICD) is improved.
  • ICD immunoprokaryotic cell death
  • the infiltration of CD8 T cells into the cancer cells occurs actively and attacks the cancer cells.
  • systemic anti-cancer immune activity is improved.
  • a decrease in immunosuppressive cells such as Treg, TAM, and MDSC is also observed.
  • the K2L gene or HA gene of vaccinia virus is deleted, and the function of K2L or HA does not work, so that the anticancer effect of vaccinia virus is improved.
  • the vaccinia virus used in the present invention is preferably an oncolytic virus that has tumor cell-specific cytolytic properties and can infect cancer cells and kill the cancer cells.
  • gene modification is added such that the function of a specific protein is deleted or the expression of a specific gene or protein is suppressed.
  • Such genes include hemagglutinin (HA) gene; thymidine kinase (TK) gene; F fragment; F3 gene; vaccinia virus growth factor (VGF) gene (US Patent Application Publication No. 2003/0031681); O1L Hemorrhage region or A-type inclusion region (US Pat. No. 6,596,279); Hind IIIF, F13L or Hind IIIM region (US Pat. No. 6,548,068); A33R, A34R or A36R gene (Katz et al.
  • HA hemagglutinin
  • TK thymidine kinase
  • F fragment F3 gene
  • VVF vaccinia virus growth factor
  • a plurality of these genes may be deleted.
  • two genes, the VGF gene and the O1L gene may be deleted.
  • a vaccinia virus lacking the functions of two genes, the VGF gene and the O1L gene, is described in International Publication No. WO 2015/076422.
  • vaccinia virus proliferation occurs. Significantly declines.
  • the Ras / Raf / MEK / ERK metabolic pathway is abnormally activated, which supplements the activation function of ERK by VGF and O1L of vaccinia virus, so that vaccinia virus can proliferate.
  • the vaccinia virus proliferates specifically in cancer cells, destroying the cancer cells and causing injury.
  • the ability to synergistically bring about cell death to cancer cells is improved in combination with the increase in cell fusion ability due to the deletion of the K2L gene or HA gene.
  • Deletion of these genes can be performed by the above-mentioned genome editing, homologous recombination, RNA interference method, antisense method, gene insertion method, artificial mutation method, PTGS method using a viral vector, or the like.
  • Cancers targeted for cancer virus treatment with vaccinia virus are not limited, and ovarian cancer, lung cancer, pancreatic cancer, skin cancer, gastric cancer, liver cancer, hepatocellular carcinoma, colon cancer, anal / rectal cancer, esophageal cancer, uterine cancer, breast cancer , Bladder cancer, prostate cancer, testicular cancer, head and neck cancer, brain / nerve tumor, thoracic adenocarcinoma, lymphoma / leukemia, bone / osteosarcoma, smooth myoma, rhombic myoma, melanoma and all other cancer types can be mentioned.
  • the pharmaceutical composition for treating cancer containing the vaccinia virus of the present invention contains a pharmaceutically effective amount of the vaccinia virus of the present invention as an active ingredient, and is a sterile aqueous or non-aqueous solution, suspension, or emulsion. It may be in the form. Further, pharmaceutically acceptable diluents such as salts, buffers and adjuvants, auxiliaries, carriers and the like may be contained. Administration may be by various parenteral routes, such as subcutaneous, intravenous, intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intranasal, and transdermal routes. In addition, it may be locally administered to the cancerous part.
  • the effective dose can be appropriately determined depending on the age, sex, health, body weight, etc. of the subject. For example, for human adults, about 10 2 to 10 10 plaque-forming units (PFU) per dose, but not limited.
  • the present invention also includes a method for treating cancer, which comprises administering the above-mentioned vaccinia virus to a cancer patient.
  • the vaccinia virus of the present invention may contain a foreign gene (foreign DNA or foreign polynucleotide).
  • foreign genes foreign DNA or foreign polynucleotides
  • the marker gene is also called a reporter gene, and is a luciferase (LUC) gene, a fluorescent protein gene such as green fluorescent protein (GFP), a fluorescent protein gene such as red fluorescent protein (DsRed), a ⁇ -glucuronidase (GUS) gene, and a black.
  • LOC luciferase
  • GFP green fluorescent protein
  • DsRed red fluorescent protein
  • GUS ⁇ -glucuronidase
  • Examples thereof include a lamphenocor acetyltransferase (CAT) gene and a ⁇ -galactosidase (LacZ) gene.
  • CAT lamphenocor acetyltransferase
  • LacZ ⁇ -galactosidase
  • An oncolytic vaccinia virus containing these foreign genes can be called a vaccinia virus vector.
  • the therapeutic genes are genes that can be used for the treatment of specific diseases such as cancer and infectious diseases, and are tumor suppressor genes such as p53 and Rb, interleukin 1 (IL-1), IL-2, IL-3, and IL. -4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-17 , IL-18, IL-24, Chemokin 2 (CCL2), CCL5, CCL19, CCL21, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CD40L, CD70, CD80, CD137L, OX-40L, GITRL, LIGHT, ⁇ -interferon, ⁇ -interferon , ⁇ -Interferon, angiostatin, thrombospondin, endostatin, METH-1, METH-2, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, MIP1a, FLT3L, HP
  • Examples thereof include genes encoding physiologically active substances and genes encoding antibodies having an inhibitory effect on CTLA4, PD1 and PD-L1.
  • a vaccinia virus that expresses luciferase or GFP can easily and quickly detect cancer cells that are infected cells.
  • the therapeutic gene for cancer can exert a cancer therapeutic effect as well as the oncolytic property of the vaccinia virus.
  • the vaccinia virus vector into which the foreign genes have been introduced can be used as a vaccine against various viruses, bacteria, protozoa and cancer. Can be done.
  • infection defense antigens such as human immunodeficiency virus, hepatitis virus, herpes virus, mycobacteria, malaria protozoa, severe acute respiratory syndrome (SARS) virus, or WT1, MART-1, NY- ESO-1, MAGE-A1, MAGE-A3, MAGE-A4, Glypican-3, KIF20A, Survivin, AFP-1, gp100, MUC1, PAP-10, PAP-5, TRP2-1, SART-1, VEGFR1, VEGFR2, NEIL3, MPHOSPH1, DEPDC1, FOXM1, CDH3, TTK, TOMM34, URLC10, KOC1, UBE2T, TOPK, ECT2, MESOTHELIN, NKG2D, P1A, 5T4, B7-H6, BCMA, CD123, CD133, CD138, CD171, CD19 CD20, CD22, CD23, CD30, CD33, CD38, CD44, CEA, cMet, CS
  • These foreign genes can be introduced, for example, by using a method of homologous recombination. Homologous recombination may be carried out by the method described above.
  • a plasmid transfer vector in which a foreign gene to be introduced is linked into a DNA sequence at a site to be introduced may be prepared and introduced into cells infected with vaccinia virus.
  • the foreign gene transfer region is preferably in a gene that is not essential for the life cycle of vaccinia virus.
  • the promoter is not limited, but the above-mentioned PSFJ1-10, PSFJ2-16, p7.5K promoter, p11K promoter, T7.10 promoter, CPX promoter, HF promoter, H6 promoter, T7 hybrid promoter and the like can be used. ..
  • the method for introducing a foreign gene into the vaccinia virus vector of the present invention can be carried out by a known method for constructing a recombinant vaccinia virus vector.
  • the present invention also includes combined treatment of a vaccinia virus having cell fusion ability and an immune checkpoint inhibitor.
  • Immune checkpoint inhibitors are anti-PD-1 (Programmed cell death 1) antibody, anti-PD-L1 (Programmed cell-death ligand 1) antibody, anti-CTLA-4 antibody, anti-PD-L2 antibody, anti-LAG-3 antibody. , PD-1 antagonist, PD-L1 antagonist, etc.
  • anti-PD-1 antibody and anti-PD-L1 antibody are preferable.
  • the anti-PD-1 antibody include Nivolumab, Pembrolizumab, Spartanizumab, Cemiplimab, Tislelizumab, Camrelizumab and the like
  • examples of the anti-PD-L1 antibody include Avelumab, Durvalumab and Atezolizumab.
  • the immune checkpoint inhibitor may be administered by a known method.
  • the dose of the immune checkpoint inhibitor varies depending on symptoms, age, body weight and other conditions, but for example, a dose of 0.001 mg to 100 mg is injected subcutaneously at intervals of days, weeks or months, intramuscularly. It may be administered by injection, intravenous injection, or the like.
  • Immune checkpoint inhibitors may contain carriers, diluents, excipients and the like commonly used in the field of formulation.
  • lactose, magnesium stearate and the like are used as carriers and excipients for tablets.
  • aqueous solution for injection physiological saline, isotonic solution containing glucose and other auxiliary agents, etc. are used, and alcohol, polyalcohol such as propylene glycol, and solubilizing agent such as nonionic surfactant are used in combination. May be.
  • a solubilizing agent such as benzyl benzoate and benzyl alcohol may be used in combination.
  • the vaccinia virus and immune checkpoint inhibitor having cell fusion ability of the present invention can exert a synergistic effect in the treatment of cancer.
  • the cancer therapeutic effect when the vaccinia virus having cell fusion ability and the immune checkpoint inhibitor are used in combination is when the vaccinia virus having cell fusion ability is used alone or when the immune checkpoint inhibitor is used alone. Significantly higher than the cancer treatment effect.
  • the vaccinia virus having cell fusion ability of the present invention can be administered at the same time as, separately, or continuously from the administration of the immune checkpoint inhibitor.
  • the vaccinia virus having cell fusion ability can also be administered before or after administration of the immune checkpoint inhibitor.
  • the vaccinia virus capable of cell fusion is administered prior to administration of the immune checkpoint inhibitor.
  • the present invention also includes a combination, combination formulation or combination pharmaceutical kit containing a vaccinia virus having cell fusion ability and an immune checkpoint inhibitor.
  • the present invention also includes a method of using a combination of a vaccinia virus having cell fusion ability and an immune checkpoint inhibitor in the manufacture of a drug for treating cancer.
  • the present invention also includes a medicament containing a vaccinia virus having cell fusion ability and an immune checkpoint inhibitor.
  • the present invention further includes a vaccinia virus capable of cell fusion for use in combination with an immune checkpoint inhibitor.
  • Example 1 Structure of vaccinia virus capable of cell fusion In mitogen-activated protein kinase-dependent recombinant vaccinia virus (International Publication No. W02015 / 076422) in which both VGF and O1L do not function, the VGF gene and O1L gene
  • the BFP gene region was amplified by two primers (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2) using the DNA of pTagBFP-N (FP172, Evrogen) as a template.
  • Each PCR product was cleaved with restriction enzymes SfiI and EcoRI, cloned into the same restriction enzyme site of the pTK-SP-LG vector (International Publication No.
  • Shuttle vector pTNshuttle for expressing BFP in the opposite direction to VGF by cleaving the pUC19-O1L vector (International Publication No. WO2015 / 076422) with the restriction enzyme XbaI and cloning it to the Blunt-treated site.
  • pUC19-O1L-P-DsRed for expressing DsRed in the same direction as O1L was constructed under the p7.5K promoter instead of the synthetic vaccinia virus promoter by the same method as in International Publication No. WO2015 / 076422. did.
  • the medium was removed, and the plaque expressing BFP was scraped off with the tip of a chip and suspended in opti-MEM medium (Invitrogen). This operation was repeated 3 times or more on BSC1 cells to purify plaque.
  • genomic DNA was extracted from 200 ⁇ L of the plaque using the High Pure Viral Nucleic Acid Kit (Roche) according to the manual and subjected to PCR screening. For O1L, PCR was performed with two primers (SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4), and the nucleotide sequence of the PCR product was confirmed by direct sequence for the clone in which the PCR product of a predetermined size was detected.
  • VGF-LucGFP / O1L-BFP A virus clone VGF-LucGFP / O1L-BFP, which has no problem with the base sequence, was selected, amplified in A549 cells, and then the virus titer was measured in RK13 cells and used for the experiment. Based on this vaccinia virus (VGF-LucGFP / O1L-BFP) and transfer vector plasmid DNA (pUC19-O1L-P-DsRed), the recombinant virus was recovered by the same method as above using the expression of DsRed as an index. , VGF-LucGFP / O1L-DsRed.
  • K2L is a gene with a total length of 1110 bp, and guanine at position 762 bp was mutated to adenine. This revealed that the 254th amino acid was mutated from tryptophan to a stop codon, resulting in a nonsense mutation.
  • HA was a gene with a total length of 933 bp, and adenine at 70 bp was deficient. This revealed that a frameshift mutation occurred.
  • the obtained virus clones with cell fusion ability are VGF-LucGFP / K2Lmut / O1L against the parent virus VGF-LucGFP / O1L-DsRed (International Publication No. W02015 / 076422) (Fig. 1A).
  • each recombinant virus was mass-cultured and purified in A549 cells, and then the virus titer was measured in RK13 cells for experiments. Served.
  • the Luc2 gene region was amplified with two primers (SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8) using the DNA of pGL4.20 (F6751, Promega) as a template.
  • Each PCR product is cleaved with restriction enzymes BspEI and NheI, cloned into the AgeI and NheI restriction enzyme sites of the pTNshuttle / VGF-SP-BFP vector to replace it with the BFP gene, and pTNshuttle / VGF-SP-Luc It was constructed.
  • the E. coli LacZ gene (SEQ ID NO: 9) synthesized for codon optimization in H.
  • sapiens is cleaved with restriction enzymes AgeI and NheI, and the same pTNshuttle / O1L-SP-BFP vector is used to replace it with the BFP gene. Cloning was performed at the restriction enzyme site to construct pTNshuttle / O1L-SP-LacZ.
  • VGF-LucGFP Vaccinia virus
  • VGF-LucGFP transfer vector plasmid DNA
  • pTNshuttle transfer vector plasmid DNA
  • the recombinant virus was recovered by the same method as above using the disappearance of GFP expression as an index, and used as VGF-Luc / O1L-DsRed or VGF-Luc / K2Lmut / O1L-DsRed. ..
  • VGF-Luc / O1L-DsRed or VGF-Luc / K2Lmut / O1L-DsRed the transfer vector plasmid DNA
  • pTNshuttle / O1L-SP-LacZ the transfer vector plasmid DNA
  • the nucleotide sequence of the PCR product was confirmed by direct sequence.
  • the virus clone VGF-Luc / O1L-LacZ or VGF-Luc / K2Lmut / O1L-LacZ having no problem with the base sequence was used (Fig. 1D and E).
  • Each recombinant virus was mass-cultured in A549 cells, purified, and then the virus titer was measured in RK13 cells and used for experiments.
  • Example 2 Characteristic analysis of vaccinia virus having cell fusion ability VGF-LucGFP / O1L-DsRed not having cell fusion ability and VGF-LucGFP / K2Lmut / O1L-DsRed and VGF-LucGFP / O1L-BFP / having cell fusion ability
  • Each virus was infected to compare HAmut.
  • First, put various cancer cells human ovarian cancer RMG1 cells, human colon cancer CaCO2 cells, human lung cancer A549 cells, mouse colon cancer CT26 cells
  • RMG1 cells human ovarian cancer RMG1 cells, human colon cancer CaCO2 cells, human lung cancer A549 cells, mouse colon cancer CT26 cells
  • VGF-LucGFP / O1L-DsRed VGF-LucGFP / K2Lmut / O1L-DsRed
  • VGF-LucGFP / O1L-DsRed As a result, compared to VGF-LucGFP / O1L-DsRed, VGF-LucGFP / K2Lmut / O1L-DsRed and VGF-LucGFP / O1L-BFP / HAmut infect various cancer cells while fusing cells. It turned out (Fig. 2).
  • VGF-LucGFP / O1L-DsRed and VGF-LucGFP / K2Lmut / O1L-DsRed were used to verify whether the cell fusion changes affect the anticancer effect.
  • FIG. 3-1 shows an image of infected cells.
  • cell viability was measured using CellTiter96 (registered trademark) Aqueous Non-radioactive Cell Proliferation Assay (Promega).
  • Figure 3-2 shows cytotoxicity by cell viability.
  • the amount of virus produced by VGF-LucGFP / O1L-DsRed and VGF-LucGFP / K2Lmut / O1L-DsRed was measured for virus titer ( Titeration).
  • Titer measurement was performed by infecting a 12-well plate with each virus serially diluted (10 -1 to 10-5 times diluted) in RK13 seeded with 80% confluent, and using Eagle MEM containing 0.8% methylcellulose and 5% FBS medium 3 After culturing for one day, the virus titer was calculated by measuring the number of virus plaques formed. As a result, it was confirmed that there was no change in the amount of virus produced between VGF-LucGFP / O1L-DsRed and VGF-LucGFP / K2Lmut / O1L-DsRed.
  • Figure 3-3 shows the production amount by titer.
  • Example 3 Anticancer effect of vaccinia virus having cell fusion ability
  • Human ovarian cancer cells (SKOV3: 2.0 ⁇ 10 4 / well), human pancreatic cancer cells (Panc1: 2.0 ⁇ 10 4 / well), human colon cancer cells (CaCO2: 2.0 ⁇ 10 4 / well), human breast cancer cells (MDA) -MB-231: 2.0 x 10 4 / well
  • human lung cancer cells (A549: 1.0 x 10 4 / well)
  • human prostate cancer cells PC3: 2.5 x 10 4 / well
  • human skin cancer cells A431: 2.0) ⁇ 10 4 / well
  • mouse melanoma cells B16-F10: 1.5 ⁇ 10 4 / well
  • mouse colon cancer cells (CT26: 1.0 ⁇ 10 4 / well) and mouse lung cancer cells (TC1: 4.0 ⁇ 10 3 / well)
  • CT26 1.0 ⁇ 10 4 / well
  • mouse lung cancer cells (TC1: 4.0 ⁇ 10 3 / well)
  • Example 4 Analysis of anticancer effect mechanism of vaccinia virus having cell fusion ability in vitro Apoptotic / Necrotic whether apoptosis and necrosis are significantly occurring in human lung cancer cell line (A549) and mouse colon cancer cell line (CT26) / Validated using Healthy Cells Detection Kit (Takara Bio).
  • A549 or CT26 is seeded on a 96-well plate at 1.0 ⁇ 10 4 / well, and after culturing at 37 ° C for 24 hours, each virus solution of VGF-Luc / O1L-lacZ or VGF-Luc / K2Lmut / O1L-lacZ is applied to A549 as MOI.
  • Example 5 Therapeutic effect of vaccinia virus having cell fusion ability in vivo
  • a mouse colorectal cancer cell line (CT26) was transplanted subcutaneously into both sides of the abdomen of BALB / cAjcl mice in 5.0 ⁇ 10 5 cells and grown for 5 or 6 days until the tumor became 42-94 mm 3 (mean 60 mm 3 ) (Fig.). 7A).
  • VGF-Luc / O1L-lacZ and VGF-Luc / K2Lmut / O1L-lacZ were administered directly into one tumor at 5.0 ⁇ 10 7 PFU three times every other day (Day 0, 2, 4).
  • Vivo Glo Luciferin Promega
  • FLuc luminescence of the virus was detected non-invasively using an in vivo imaging system (Berthold, NightSHADE LB985) (Day 1, 3, 5, 7). ) (Fig. 7B).
  • FIG. 8-1 shows the detection results of virus FLuc 3 days after virus administration.
  • VGF-Luc / K2Lmut / O1L-lacZ expressed a higher signal on the virus administration side than VGF-Luc / O1L-lacZ 3 days after virus administration.
  • no virus signal could be confirmed even when the virus was administered.
  • the expression of virus FLuc was quantified, it was found that there was a significant difference in the two-way ANOVA statistical analysis on the administration side 3 days after the administration of the virus (* P ⁇ 0.05) (Fig. 8-Fig. 8-). 2). From this, it was confirmed that VGF-Luc / K2Lmut / O1L-lacZ is more actively propagated and transmitted in vivo than VGF-Luc / O1L-lacZ.
  • VGF-Luc / K2Lmut / O1L-lacZ virus-administered mice suppressed tumor growth on the virus-administered side and non-administered side compared with virus-non-administered (PBS) mice and VGF-Luc / O1L-lacZ virus-administered mice. It was.
  • VGF-Luc / K2Lmut / O1L-lacZ virus-administered mice had a significant difference between the tumor volumes of the PBS mice and the VGF-Luc / O1L-lacZ virus-administered mice on the virus-administered side and the non-administered side. This was confirmed by Two-Way ANOVA statistical analysis (** P ⁇ 0.01, *** P ⁇ 0.001) (Fig. 9).
  • Example 6 Analysis of therapeutic effect mechanism of vaccinia virus having cell fusion ability in vivo
  • immunological analysis was performed using flow cytometry.
  • a mouse colon cancer cell line (CT26) was transplanted subcutaneously into both sides of the abdomen of BALB / cAjcl mice in 5.0 ⁇ 10 5 cells and grown for 5 days until the tumor became 50 to 111 mm 3 (mean 60 mm 3 ).
  • VGF-Luc / O1L-lacZ and VGF-Luc / K2Lmut / O1L-lacZ were administered directly into one tumor at 5.0 ⁇ 10 7 PFU three times every other day (Day 0, 2, 4).
  • Tumors on both sides of the abdomen were collected in Serum free RPMI 5 days after virus administration (Day 5), and the tumor tissue was dispersed using gentleMACS (Miltenyi Biotec). After filtering the cells with a 100 ⁇ m strainer and performing hemolysis treatment, the cells were counted and adjusted to 5.0 ⁇ 10 5 cells. The prepared cells were blocked with Fc block (BD Bioscience), cell surface antigen staining and intracellular antigen staining were performed, and CD8, CD4, Treg, TAM, and MDSC were analyzed by CytoFLEX (BECKMAN COULTER).
  • immunosuppressive cells such as Treg, TAM, and MDSC
  • the result of verifying the therapeutic effect by measuring the tumor volume is shown in FIG. FIG. 11A shows the result when isotype control was administered, and FIG. 11B shows the result when the anti-CD8 antibody was administered.
  • Example 7 Therapeutic effect of vaccinia virus having cell fusion ability in advanced cancer-bearing model mice The same species of virus growth and transmission in vivo when the tumor volume becomes larger in the mouse body and examination of the therapeutic effect of the virus. It was examined by a transplantation model. Transplanted into the abdominal side skin of BALB / cAJcl mouse mouse colon cancer cell line (CT26) at 5.0 ⁇ 10 5 cells, tumors were allowed to grow 87 ⁇ 253 mm 3 about 10 days until the (average 150 mm 3) ( Figure 12A ).
  • CT26 BALB / cAJcl mouse mouse colon cancer cell line
  • FIG. 13-1 shows the detection results of virus FLuc expression on the first day after virus administration.
  • VGF-Luc / K2Lmut / O1L-lacZ expressed a higher signal than VGF-Luc / O1L-lacZ one day after virus administration (Fig. 13-1). Furthermore, when FLuc was quantified, it was found that there was a significant difference in the two-way ANOVA statistical analysis 1 day after virus administration (Fig. 13-2) (*** P ⁇ 0.001). From this, it was confirmed that VGF-Luc / K2Lmut / O1L-lacZ actively propagates and propagates the virus in vivo. After that, the anticancer effect of the virus was examined by measuring the tumor diameter.
  • VGF-Luc / K2Lmut / O1L-lacZ virus-administered mice significantly suppressed tumor volume 19 days after virus administration compared to virus-non-administered (PBS) mice and VGF-Luc / O1L-lacZ virus-administered mice. It was confirmed by Two-Way ANOVA statistical analysis (* ⁇ 0.05, *** ⁇ 0.001) (Fig. 14).
  • Example 8 Anticancer effect of vaccinia virus having both cell fusion ability and tumor targeting ability
  • the improvement of anticancer effect by cell fusion is not limited to cell fusion to the above K2L mutation, but by any mutation, deletion or foreign gene insertion.
  • VGF-LucGFP / ⁇ K2L-BFP / O1L-DsRed (Fig. 15-1A) Clone deficient in K2L and capable of cell fusion, and deficient in VGF and O1L to ensure tumor specificity
  • VGF-LucGFP (Fig. 15-1B) Clone that guarantees tumor specificity by deficiency of VGF TK-GFP
  • Fig. 15-1C Clone that guarantees tumor specificity by TK deficiency unmodified Virus
  • a plasmid with pTNshuttle / ⁇ K2L-BFP was prepared. Based on the vaccinia virus (VGF-LucGFP / O1L-DsRed) and the transfer vector plasmid DNA (pTNshuttle / ⁇ K2L-BFP), the recombinant virus was recovered by the same method as above using the expression of BFP as an index, and by PCR. It was used for screening.
  • K2L For K2L, PCR was performed with the same primers (SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13) as above, and for clones in which a PCR product of a predetermined size was detected, the base sequence of the PCR product was confirmed by direct sequence, and VGF- It was designated as LucGFP / ⁇ K2L-BFP / O1L-DsRed (Fig. 15-1A).
  • the K2L gene region was amplified by two primers (SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17) using the genomic DNA of the LC16mO strain as a template.
  • the PCR product was cleaved with restriction enzymes XbaI and MfeI and cloned into the restriction enzyme sites XbaI and EcoRI of the pUC19 vector to construct pUC19-K2L.
  • pTNshuttle / TK-SP-BFP was cleaved with restriction enzymes SphI and EcoRI, and after Blunt treatment, the SP-BFP fragment was cloned into the site where pUC19-K2L vector was cleaved with restriction enzyme ClaI and treated with Blunt.
  • vaccinia virus LC16mO strain, which is an unmodified unmodified virus that has not been genetically modified
  • transfer vector plasmid DNA pTNshuttle / K2L-SP-BFP
  • the recombinant virus was collected at the site and used for screening by PCR.
  • K2L PCR was performed with the same primers (SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13) as above, and for clones in which a PCR product of a predetermined size was detected, the base sequence of the PCR product was confirmed by direct sequence, and K2L- It was designated as BFP (Fig. 15-1G).
  • pEGFP-N1 (Clontech Co., Ltd.) was cleaved with restriction enzymes AgeI and NotI, and the pTNshuttle / TK-SP-BFP vector was used to replace it with the BFP gene. Cloning was performed at the same restriction enzyme site to construct pTNshuttle / TK-SP-GFP. Based on the vaccinia virus (LC16mO strain, which is an unmodified unmodified virus that has not been genetically modified) and the transfer vector plasmid DNA (pTNshuttle / TK-SP-GFP), the same method as above using the expression of GFP as an index.
  • vaccinia virus LC16mO strain, which is an unmodified unmodified virus that has not been genetically modified
  • pTNshuttle / TK-SP-GFP transfer vector plasmid DNA
  • the recombinant virus was collected at the site and used for screening by PCR.
  • PCR was performed with two primers (SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19), and for clones in which a PCR product of a predetermined size was detected, the base sequence of the PCR product was confirmed by direct sequence, and TK-GFP was obtained.
  • Fig. 15-1C Recombinant vaccinia virus VGF-LucGFP (International Publication No. W02015 / 076422) in which VGF does not function or the above-mentioned recombinant vaccinia virus in which TK does not function in order to produce a vaccinia virus having both cell fusion ability and tumor targeting ability.
  • TK-GFP transfer vector plasmid DNA
  • transfer vector plasmid DNA pTNshuttle / K2L-SP-BFP
  • the recombinant virus was recovered by the same method as above using the expression of BFP as an index, and subjected to PCR screening.
  • VGF use the same primers as above (SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11)
  • K2L use the same primers as above (SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13)
  • TK use the same primers as above (SEQ ID NO: 18).
  • the nucleotide sequence of the PCR product was confirmed by direct sequence, and VGF-LucGFP / K2L-BFP (Fig. 15-1E), Alternatively, it was designated as K2L-BFP / TK-GFP (Fig. 15-1F). After mass culturing each recombinant virus in A549 cells, the virus titer was measured in RK13 cells and used for the experiment.
  • VGF-LucGFP / O1L-DsRed (Fig. 1A), VGF-LucGFP / K2Lmut / O1L-DsRed (Fig. 1B), VGF-LucGFP / ⁇ K2L-BFP / O1L-" are shown in FIGS. 15-2 and 15-3.
  • DsRed (Fig. 15-1A), VGF-LucGFP / O1L-BFP / HAmut (Fig. 1C), VGF-LucGFP (Fig. 15-1B), VGF-LucGFP / K2L-BFP (Fig. 15-1E), TK-GFP (Fig.
  • VGF-LucGFP / O1L-DsRed compared to the virus without deletion (VGF-LucGFP / O1L-DsRed), the cell viability was significantly reduced in all of the natural mutations of K2L, total deficiency of K2L, and spontaneous mutations of HA.
  • VF-LucGFP / K2Lmut / O1L-DsRed VGF-LucGFP / ⁇ K2L-BFP / O1L-DsRed
  • VGF-LucGFP / O1L-BFP / HAmut *** P ⁇ 0.0001). From this, it was shown that the anticancer effect is improved when cell fusion is induced by the inactivity of K2L or HA regardless of the method of mutation or deletion.
  • VGF-LucGFP recombinant virus
  • TK-GFP recombinant virus
  • Unmodified Virus Unmodified Virus
  • the anticancer effect is improved by causing cell fusion by vaccinia virus.
  • the mechanism was analyzed, it was found that it was caused by the following three points.
  • the oncolytic ability is improved by increasing the proliferation and transmission ability of the virus, and in addition, apoptosis and necrosis occur actively.
  • ICD is induced more efficiently, and CD8 T cell infiltration to the administered side and the non-administered side occurs actively.
  • cancer immunity becomes easier to work.
  • oncolytic viruses that induce cell fusion are higher than oncolytic viruses that do not induce cell fusion by converting COLD tumors, which are difficult to immunize more efficiently, into HOT tumors, which are more susceptible to immune attack. It exerts an anticancer effect (Fig. 16).
  • Example 8 Combination therapeutic effect of vaccinia virus capable of cell fusion and anti-PD-1 antibody Since it was suggested that the action of CD8 T cells is important for the therapeutic effect of the virus, especially the therapeutic effect on the non-administered side, immunity
  • the action of CD8 T cells was promoted in combination with the anti-PD-1 antibody, which is a checkpoint inhibitor. Transplanted into the abdominal sides subcutaneously BALB / cAJcl mouse mouse colon cancer cell line (CT26) at 5.0 ⁇ 10 5 cells, tumors were allowed to grow 5 days until 42 ⁇ 135mm 3 (average 70 mm 3).
  • VGF-Luc / O1L-lacZ and VGF-Luc / K2Lmut / O1L-lacZ were administered directly into one tumor at 5.0 ⁇ 10 7 PFU three times every other day (Day 0, 2, 4).
  • PBS or InVivoPlus anti-mouse PD-1 Clone RMP1-14 BioXCell
  • the antibody was administered the day after the administration of vaccinia virus. From the second administration of vaccinia virus, vaccinia virus and antibody were administered alternately every day, and the virus was administered 3 times in total and the antibody was administered 5 times in total. The result of verifying the therapeutic effect by measuring the tumor volume is shown in FIG.
  • FIG. 19 shows the survival curve of mice combined with anti-PD-1 antibody after virus administration.
  • mice were retransplanted into the completely cured mouse.
  • a mouse colon cancer cell line (CT26) was administered to the abdomen with 5.0 ⁇ 10 5 cells 101 days after virus administration. It was transplanted again subcutaneously on both sides. For comparison, similar subcutaneous tumor cell transplantation was performed on naive BALB / cAjcl mice of the same age.
  • FIG. 20 shows the transition of the tumor diameter after tumor retransplantation. The comparative mice showed the same tumor growth as in FIG. 9, but no tumor growth was observed in the mice re-transplanted after the tumor was completely healed.
  • anti-PD-1 antibody greatly enhances the therapeutic effect of vaccinia virus, which has cell fusion ability, and promotes induction of anti-tumor immunity and establishment of immune memory.
  • Vaccinia virus which induces cell fusion of infected cells, can be used for cancer treatment. All publications, patents and patent applications cited herein are incorporated herein by reference in their entirety.

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Abstract

本発明は、感染した細胞の細胞融合を誘導するワクシニアウイルス及びその製造方法の提供を目的とする。　本発明は、K2L遺伝子又はHA遺伝子、あるいはK2L遺伝子及びHA遺伝子の機能が欠損しており、感染した細胞に細胞融合を引き起こし、細胞死を誘導する、感染した細細に細胞胞融合を引き起こすように変異したワクシニアウイルスである。

Description

細胞融合を誘導するワクシニアウイルス及びその利用
　本発明は感染した細胞の細胞融合を誘導するワクシニアウイルスに関する。
　現在世界中において、生きたウイルスを利用した癌治療の前臨床研究や臨床試験が積極的に行われている。この癌ウイルス療法は、感染した細胞・組織内で増殖伝播しながらそれらを死滅させるというウイルス本来の性質を癌治療に利用する方法である。従来の放射線・化学療法に比べ、第一にウイルス増殖による腫瘍溶解、第二にそれに伴う抗腫瘍免疫の誘導により多様なメカニズムで抗癌作用を発揮する。
　かつて日本国内で樹立され痘瘡ワクチンとしてヒトに使われ、高い安全性が証明されているワクシニアウイルスのワクチン株がある（非特許文献１を参照）。しかし、依然正常組織における弱い増殖性を維持しているため、より安全な癌ウイルス療法として確立するには、癌細胞でのみ増殖させる改良が必須であった。そこで、このワクチン株を基に遺伝子組換え技術により改良を加え、広範な癌におけるMAPK/ERK経路の制御異常を指標にして、癌細胞特異的に増殖し破壊する遺伝子組換えワクシニアウイルスの開発に成功した（特許文献１及び２を参照）。
国際公開第WO2011/125469号 国際公開第WO2015/076422号
蛋白質　核酸　酵素　Vol.48 No.12(2003), p.1693-1700
　本発明は、感染した細胞の細胞融合を誘導するワクシニアウイルス及びその製造方法の提供を目的とする。
　本発明者はワクシニアウイルスの抗腫瘍効果についての検討を行う中で、ワクシニアウイルスのK2L遺伝子又はHA遺伝子等の遺伝子を欠損させると感染した細胞の細胞融合を誘導し、その結果、細胞死を引き起こすことを見出した。すなわち、K2L遺伝子又はHA遺伝子を欠損させたワクシニアウイルスを癌細胞に感染させることにより、抗癌効果を発揮した。さらに、腫瘍溶解性のワクシニアウイルスのK2L遺伝子又はHA遺伝子を欠損させることにより、相乗的な抗癌効果を発揮させることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]　感染した細細に細胞融合を引き起こすように変異したワクシニアウイルス。
[２]　K2L遺伝子又はHA遺伝子、あるいはK2L遺伝子及びHA遺伝子の機能が欠損しており、感染した細胞に細胞融合を引き起こし、細胞死を誘導する、[１]のワクシニアウイルス。
[３]　腫瘍溶解性ワクシニアウイルスである、[１]又は[２]のワクシニアウイルス。
[４]　正常細胞内では増殖しないが、癌細胞内で特異的に増殖し、癌細胞を特異的に障害する腫瘍溶解性を有する[３]のワクシニアウイルス。
[５]　ワクシニアウイルスが、LC16株、LC16mO株又はB5R遺伝子が発現するように改変されたLC16m8株である、[１]～[４]のいずれかのワクシニアウイルス。
[６]　[１]～[５]のいずれかのワクシニアウイルスを含む癌治療のための医薬組成物。
[７]　[１]～[５]のいずれかのワクシニアウイルスに外来DNAを導入したワクシニアウイルスベクター。
[８]　外来DNAがマーカーDNA、細胞毒性効果若しくは免疫賦活効果を有する治療用遺伝子、又は癌、ウイルス、細菌若しくは原虫の抗原をコードするDNAである、[７]のワクシニアウイルスベクター。
[９]　[７]又は[８]のワクシニアウイルスベクターを含む、癌治療のための、又は癌、ウイルス、細菌若しくは原虫に対するワクチンとして使用するための医薬組成物。
[１０]　ワクシニアウイルスのK2L遺伝子又はHA遺伝子、あるいはK2L遺伝子及びHA遺伝子の機能を欠損させることを含む、感染した細胞に細胞融合を引き起こし、細胞死を誘導するワクシニアウイルスの製造方法。
[１１]　腫瘍溶解性ワクシニアウイルスである、[１０]の製造方法。
[１２]　さらに、ワクシニアウイルス増殖因子（VGF)遺伝子又はO1L遺伝子、あるいはワクシニアウイルス増殖因子（VGF)遺伝子及びO1L遺伝子の機能を欠損させることを含む、[１０]又は[１１]の製造方法。
[１３]　ワクシニアウイルスが、LC16株、LC16mO株又はB5R遺伝子が発現するように改変されたLC16m8株である、[１０]～[１２]のいずれかの製造方法。
[１４]　[１]～[５]のいずれかのワクシニアウイルスを免疫チェックポイント阻害剤と組合せて含む、がん治療のための組合せ医薬キット。
[１５]　免疫チェックポイント阻害剤が抗PD-1抗体又は抗PD-L1抗体である、[１４]の組合せ医薬キット。
[１６]　免疫チェックポイント阻害剤とがん治療のために併用するための、[１]～[５]のいずれかのワクシニアウイルス。
[１７]　免疫チェックポイント阻害剤が抗PD-1抗体又は抗PD-L1抗体である、[１６]のワクシニアウイルス。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2019-91609号の開示内容を包含する。
　ワクシニアウイルスのK2L遺伝子又はHA遺伝子等の遺伝子を欠損させると、ワクシニアウイルスが感染細胞の細胞融合を引き起こすことで抗癌効果が向上する。まず、ウイルスの増殖、伝播能が上がることで腫瘍溶解能が向上し、加えてアポトーシス、ネクローシスが盛んに起こる。次に、融合することでより効率良くICDが誘導され投与側、非投与側へのCD8 T細胞の浸潤が盛んに起こる。最後に投与側、非投与側の腫瘍内免疫環境が改善されることで癌免疫が働きやすくなる。すなわち、細胞融合を誘導する腫瘍溶解性ウイルスは、細胞融合を誘導しない腫瘍溶解性ウイルスと比べ、より効率良く免疫が働き難いCOLD腫瘍を免疫が攻撃し易いHOT腫瘍へ転換することによって、より高い抗癌効果を発揮する。
細胞融合誘導遺伝子組換えワクシニアウイルスの構造を示す図であり、図１Ａ～ＣはVGF-LucGFP/O1L-DsRed及びそれに由来する細胞融合誘導遺伝子組換えワクシニアウイルスの構造を示し、図１Ｄ及びＥはVGF-Luc/O1L-LacZ及びそれに由来する細胞融合誘導遺伝子組換えワクシニアウイルスの構造を示す。 細胞融合誘導遺伝子組換えワクシニアウイルスの感染細胞像を示す図である。 細胞融合誘導遺伝子組換えワクシニアウイルスの感染細胞像を示す図である。 細胞融合誘導遺伝子組換えワクシニアウイルスの細胞傷害性を示す図である。 細胞融合誘導遺伝子組換えワクシニアウイルスの産生量を示す図である。 10種類の腫瘍細胞における細胞融合誘導遺伝子組換えワクシニアウイルスの感染細胞像を示す図である。 10種類の腫瘍細胞における細胞融合誘導遺伝子組換えワクシニアウイルス感染後の細胞生存率を示す図である。 細胞融合誘導遺伝子組換えワクシニアウイルスによる細胞死を示す図である。図５－１ＡはA549に生じたアポトーシスを示し、図５－１Ｂはネクローシスを示す。 細胞融合誘導遺伝子組換えワクシニアウイルスによる細胞死を示す図である。図５－２ＡはCT26に生じたアポトーシスを示し、図５－２Ｂはネクローシスを示す。 細胞融合誘導遺伝子組換えワクシニアウイルスによる免疫原生細胞死(ICD)を示す図である。図６ＡはA549のICDを示し、図６ＢはCT26のICDを示す。 同種移植モデルマウスの実験系を示す図である。図７Ａはウイルスの片側の腫瘍への直接投与を示し、図７Ｂは投与及び検出スケジュールを示す。 同種移植モデルマウスにおける細胞融合誘導遺伝子組換えワクシニアウイルスの増殖分布を示す図である。 同種移植モデルマウスにおける細胞融合誘導遺伝子組換えワクシニアウイルスの増殖を数値化した図である。図８－２Ａは投与側におけるワクシニアウイルスの増殖を示し、図８－２Ｂは非投与側におけるワクシニアウイルスの増殖を示す。 同種移植モデルマウスにおける細胞融合誘導遺伝子組換えワクシニアウイルス治療後の腫瘍体積を示す図である。図９Ａは投与側の腫瘍体積を示し、図９Ｂは非投与側の腫瘍体積を示す。 同種移植モデルマウスにおける細胞融合誘導遺伝子組換えワクシニアウイルス治療後の免疫学的解析の結果を示す図である（その１）。 同種移植モデルマウスにおける細胞融合誘導遺伝子組換えワクシニアウイルス治療後の免疫学的解析の結果を示す図である（その２）。 CD8の働きを抑制した同種移植モデルマウスにおける細胞融合誘導遺伝子組換えワクシニアウイルス治療後の腫瘍体積を示す図である。図１１Ａはisotype controlを投与したコントロールの結果を示し、図１１Ｂは抗CD8抗体を投与した結果を示す。図１１Ａ及び図１１Ｂの左のグラフは投与側の結果を示し、右のグラフは非投与側の結果を示す。 進行した同種移植モデルマウスの実験系を示す図である。図１２Ａはウイルスの片側の腫瘍への直接投与を示し、図１２Ｂは投与及び検出スケジュールを示す。 進行した同種移植モデルマウスにおける細胞融合誘導遺伝子組換えワクシニアウイルスの増殖分布を示す図である。 進行した同種移植モデルマウスにおける細胞融合誘導遺伝子組換えワクシニアウイルスの増殖を数値化した図である。 進行した同種移植モデルマウスにおける細胞融合誘導遺伝子組換えワクシニアウイルス治療後の腫瘍体積を示す図である。 細胞融合能と腫瘍標的化能を併せ持つワクシニアウイルスの構造を示す図である。 細胞融合能と腫瘍標的化能を併せ持つワクシニアウイルス感染後の細胞生存率を示す図である（その１）。 細胞融合能と腫瘍標的化能を併せ持つワクシニアウイルス感染後の細胞生存率を示す図である（その２）。 細胞融合能と腫瘍標的化能を併せ持つワクシニアウイルス感染後の免疫原生細胞死を示す図である（その１）。 細胞融合能と腫瘍標的化能を併せ持つワクシニアウイルス感染後の免疫原生細胞死を示す図である（その２）。 細胞融合を誘導する腫瘍溶解性ウイルスによる抗癌効果向上のメカニズムをまとめた図である。 抗PD-1抗体を併用した同種移植モデルマウス実験系を示す図である。図１７Ａはウイルスの片側の腫瘍への直接投与を示し、図１７Ｂは投与及び検出スケジュールを示す。 抗PD-1抗体を併用した同種移植モデルマウスにおける細胞融合誘導遺伝子組換えワクシニアウイルス治療後の腫瘍体積を示す図である。図１８Ａは抗PD-1抗体を用いない場合の結果を示し、図１８Ｂは抗PD-1抗体を併用した場合の結果を示す。図１８Ａ及び図１８Ｂの左のグラフは投与側の結果を示し、右のグラフは非投与側の結果を示す。 抗PD-1抗体を併用した同種移植モデルマウスにおける細胞融合誘導遺伝子組換えワクシニアウイルス治療後の生存率を示す図である。 細胞融合誘導遺伝子組換えワクシニアウイルスと抗PD-1抗体により腫瘍が寛解したマウスに対し、腫瘍を再移植した後の腫瘍体積を示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明のワクシニアウイルスは、細胞融合能を有するように変異させたワクシニアウイルスである。ここで、細胞融合能とは、ワクシニアウイルスが細胞に感染したときに、感染した細胞同士の細胞融合を引き起こし得ることをいう。細胞融合能を有するように変異させたワクシニアウイルスは、ワクシニアウイルスが本来有している細胞融合能を抑制する遺伝子の機能が欠損しているか、あるいは細胞融合を促進する遺伝子が挿入発現されている。
　細胞融合に関与し、細胞融合能を抑制するワクシニアウイルスが本来有する遺伝子としては、K2L遺伝子及びHA（A56R)遺伝子が挙げられ、本発明のワクシニアウイルスはK2L遺伝子又はHA遺伝子、あるいはK2L遺伝子及びHA遺伝子の機能が欠損しており、そのために細胞融合能を有するように表現形が変化している。Wagenaar et al., Journal of Virology, Vol.82, No.11, June 2008, p.5153-5160の第5159頁の図８に示されているように、ワクシニアウイルスが感染した細胞においては、HA（A56R）タンパク質とK2Lタンパク質の複合体が、HAの膜貫通領域を介して細胞膜上に固定される。複数のウイルスタンパク質（A21L, A28L, G3L, H2R, J5L, L5R）で構成されるentry/fusion complex（EFC）はウイルスタンパク質G9RとA16Lともに連携して成熟ウイルスの膜上に固定される。このG9RとA16Lが細胞膜上のHAとK2Lに作用することで、ウイルスと感染した細胞間の融合を阻害していると考えられる。これより、HAとK2Lの機能不全により、阻害機能がなくなり細胞融合を誘導できる。従って、細胞融合に関与する、および細胞融合能を抑制するワクシニアウイルスが本来有する遺伝子として、ウイルスタンパク質をコードするK2LやHAに加えてA16L、A21L、A25L、A26L、A28L、G3L、G9R、H2R、J5L、L5R遺伝子等が挙げられる。例えば、G9Rについては44番目のHをYに変異させることで、融合を抑制している分子が正常であっても融合が誘導される。従って、これらの１つ又は複数の機能を欠損させる、あるいは変異を導入することにより細胞融合を誘導、又は増強することができる。組合せの例として、K2Lを欠損させ、かつG9Rの44番目のHをYに変異させること等が挙げられる。
　融合能を持つウイルスタンパク質は、数種類知られており、この遺伝子を異なる腫瘍溶解性ウイルスを含むウイルスに挿入して発現させることにより、細胞融合能を有するように変異させることができる。このような遺伝子として、麻疹ウイルス（measles virus）に由来するＨ（hemagglutinin)タンパク質及びＦ(fusion)タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。さらに米国特許第7,635,752号明細書に示すように、Ｈ遺伝子の改良によって特定の細胞に融合を引き起こすことも可能であり、アデノウイルスや水胞性口炎ウイルス（vesicular stomatitis virus（VSV））に発現させることによって、癌治療に応用できることも実証している（Nakamura et al., NATURE BIOTECHNOLOGY, VOLUME 22, NUMBER 3, MARCH 2004, pp.331-336)。また、テナガザル白血病ウイルス（Gibbon ape leukemia virus（GaLV））に由来するGaLVエンベロープをコードする遺伝子も挙げられ、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、レンチウイルスに発現されることよって、癌治療に応用できることも実証している（Krabee et al., Cancers 2018, 10, 216; doi: 10.3390/cancers10070216）。
　その他、レオウイルス（Reovirus）に由来するFASTタンパク質を発現するVSV、HIVに由来するHIVエンベロープを発現するアデノウイルス、ニューカッスル病ウイルス（NDV)に由来するＦタンパク質を発現するVSV、SV5に由来するＦタンパク質を発現するアデノウイルスが報告されている（Krabee et al., Cancers 2018, 10, 216; doi: 10.3390/cancers10070216）。
　すなわち、細胞融合を促進する遺伝子として、レオウイルス由来のFASTタンパク質をコードする遺伝子、HIV由来のHIVエンベロープをコードする遺伝子、NDV由来のFタンパク質をコードする遺伝子、SV5に由来するFタンパク質をコードする遺伝子等も挙げられる。
　K2L遺伝子は、セリンプロテアーゼインヒビターとして知られているが、その機能としては不明な点が多い。HA遺伝子は、感染細胞表面に誘導される糖蛋白質であり、赤血球凝集素として知られている。野生型のK2L遺伝子の塩基配列を配列番号２０に表し、野生型のHA遺伝子の塩基配列を配列番号２１に表す。
　ワクシニアウイルスのK2L遺伝子又はHA遺伝子の機能の欠損とは、K2L遺伝子又はHA遺伝子が発現しないか、あるいは発現してもその発現タンパク質がK2Lタンパク質又はHAタンパク質の正常な機能を保持していないことをいう。ワクシニアウイルスのK2L遺伝子又はHA遺伝子の機能を欠損させるためには、K2L遺伝子又はHA遺伝子の総て又は一部を欠失させればよい。また、塩基を置換、欠失又は付加することにより遺伝子を変異させ、正常なK2Lタンパク質又はHAタンパク質が発現できないようにしてもよい。また、K2L遺伝子又はHA遺伝子中に外来遺伝子を挿入してもよい。尚、K2LとHAの欠損で細胞融合を引き起こしたが、本発明は細胞融合を引き起こすことが抗癌効果に重要であって、それ以外のウイルス遺伝子の欠損でもよい。
　遺伝子の機能の欠損は、例えば公知のゲノム編集、相同組換え、RNA干渉法、アンチセンス法、遺伝子挿入法、人為的突然変異法、ウイルスベクターを利用したPTGS法等により行うことができる。本発明において、遺伝子の欠失や変異により正常な遺伝子産物が発現されない場合、遺伝子が欠損しているという。
　相同組換えとは、細胞内で２つのDNA分子が同じ塩基配列を介して相互に組換えを起こす現象で、ワクシニアウイルスのような巨大なゲノムDNAを持つウイルスの組換えにしばしば用いられる方法である。まず、標的とするワクシニアウイルスのK2L遺伝子又はHA遺伝子部位の配列を中央で分断する形で、他のDNAを連結したプラスミド（トランスファーベクターという）を構築し、これを、ワクシニアウイルスを感染させた細胞に導入してやると、ウイルス複製の過程で裸になったウイルスDNAとトランスファーベクター上の同じ配列部分との間で入れ換えが起こり、挟み込まれたDNAがウイルスゲノムの標的遺伝子中に組み込まれ、該遺伝子は機能を欠損する。このとき用いる細胞としては、BSC-1細胞、HTK-143細胞、Hep2細胞、MDCK細胞、Vero細胞、HeLa細胞、CV1細胞、COS細胞、RK13細胞、BHK-21細胞、初代ウサギ腎臓細胞等ワクシニアウイルスが感染し得る細胞を用い得る。また、ベクターの細胞への導入は、リン酸カルシウム法、カチオニックリボゾーム法、エレクトロポレーション法等の公知の方法で行えばよい。
　ゲノム編集は、部位特異的なヌクレアーゼを利用して標的遺伝子を改変する方法である。ゲノム編集の方法として、用いるヌクレアーゼにより、ZFN(zinc finger nuclease)法（Urnov, Fyodor D. et al., Natur, Vol 435, 2 June 2005, pp.642-651)、TALEN(Tale nuclease)法(Mahfouz, Magdy M et al., PNAS February 8, 2011, 108(6), pp.2623-2628)、CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9(Crispr Associated protein 9)(Jinek, Martin, et al., Science, Vol 337, 17 August 2012, pp.816-821)、CRISPR/Cas3等のCRISPR/Casシステムによる方法等が挙げられる。これらの方法には、ニッカーゼ改変型Casを用いた方法等のヌクレアーゼを改変した方法も含む。このうち、CRISPR/Cas9システムによる方法が好ましい。CRISPR/Cas9システムにおいては、切断することにより機能を欠損させたい遺伝子の標的配列に相補的な配列を含むguide RNA(crRNA、tracrRNA)及びヌクレアーゼであるCas9により任意の配列を切断する。ゲノムの切断後にNHEJ（非相同性末端結合）により修復が起こり、塩基の欠損等が誘導され、遺伝子をノックアウトすることができる。あるいは、ゲノム切断後にHDR（相同組換え型修復）により、標的遺伝子に相同組換えにより変異を誘導することができる。ゲノム編集によりGBSS遺伝子及び／又はSBE遺伝子を破壊する場合は、遺伝子中の標的配列を選択し、該配列に相補的な配列を含むguide RNAの配列を設計すればよい。guide RNAの塩基長は、20以上が好ましい。CRISPR/Cas9システムによりゲノム編集を行う場合、Cas9タンパク質とguide RNAを共発現させればよく、例えば、両方を共発現させるベクターを導入すればよい。CRISPR/Cas9によるゲノム編集は、市販のCRISPR/Cas9ツールを用いて行うことができる。
　本発明のワクシニアウイルスを製造するためのワクシニアウイルスの株は限定されないが、リスター（Lister)株、リスター株から確立されたLC16株、LC16mO株、LC16m8株（橋爪　壮、臨床とウイルス vol.3, No.3, 269, 1975等）、New York City Board of Health（NYBH）株、Wyeth株、コペンハーゲン株、Western Reserve（WR）株、Modified Vaccinia Ankara（MVA）株、EM63株、池田株、大連株、Tian Tan株等が挙げられる。LC16mO株は、Lister株からLC16株を経て作出された株であり、LC16m8株は、さらにLC16mO株から作出された、ウイルス膜タンパク質をコードする遺伝子であるB5R遺伝子にフレームシフト変異が認められ、このタンパク質が発現、機能しなくなったことで弱毒化された株である（蛋白質　核酸　酵素　Vol.48 No.12(2003), p.1693-1700）。
　ヒトに投与する場合の安全性が確立されているという点で、本発明において用いるワクシニアウイルスは弱毒化され、病原性を有していないものが好ましい。このような弱毒化された株として、B5R遺伝子を部分的に又は完全に欠失した株が挙げられる。B5R遺伝子は、ワクシニアウイルスのエンベロープに存在するタンパク質をコードしており、B5R遺伝子産物は、ウイルスの感染・増殖に関与している。B5R遺伝子産物は感染細胞表面及びウイルスのエンベロープに存在し、隣接の細胞、あるいは宿主体内の他の部位にウイルスが感染・伝播するときに、感染効率を高める働きをし、ウイルスのプラークサイズ及び宿主域にも関与している。B5R遺伝子を欠失させると、動物細胞に感染させた場合のプラークサイズが小さくなり、ポックサイズも小さくなる。また、皮膚増殖能が低下し、皮膚病原性が低下する。B5R遺伝子が部分的に又は完全に欠失したワクシニアウイルスは、B5R遺伝子の遺伝子産物がその正常機能を有さず、皮膚増殖性も小さく、ヒトに投与した場合でも副作用を起こさない。B5R遺伝子を欠失している弱毒化株として、例えば上記のLC16m8株からB5R遺伝子を完全に欠失させて確立されたm8Δ株（LC16m8Δ株とも呼ぶ）が挙げられる。また、LC16mO株からB5R遺伝子を完全に欠失して確立されたmOΔ株（LCmOΔ株とも呼ぶ）を用いることもできる。これらのB5R遺伝子を部分的に又は完全に欠失した弱毒されたワクシニアウイルス株は国際公開第WO2005/054451号に記載されており、その記載に基づいて入手することができる。ワクシニアウイルスがB5R遺伝子を部分的に又は完全に欠失し、B5Rタンパク質の機能が欠失しているかどうかは、例えば、RK13細胞に感染させたときに形成されるプラークサイズ、ポックサイズ、Vero細胞でのウイルス増殖性、ウサギにおける皮膚病原性等を指標に判断することができる。また、ワクシニアウイルスの遺伝子配列を調べてもよい。
　B5R遺伝子を有するワクシニアウイルスは、B5R遺伝子を癌細胞中で発現させ、B5Rタンパク質の作用により、癌細胞の傷害をもたらす。従って、本発明において用いるワクシニアウイルスは完全なB5R遺伝子を発現することが望ましい。上記のようにB5R遺伝子を有しておらず、弱毒化され安全性が確立されているワクシニアウイルスを用いる場合、該B5R遺伝子を欠失したワクシニアウイルスにあらためて完全なB5R遺伝子を導入する。B5R遺伝子を部分的に又は完全に欠失したワクシニアウイルスを用いる場合、該ワクシニアウイルスゲノムに、B5R遺伝子を挿入して用いればよい。B5R遺伝子のワクシニアウイルスへの挿入は如何なる方法で行ってもよいが、例えば公知の相同組換え法により行うことができる。また、この場合のB5R遺伝子を挿入する位置は、もともとB5R遺伝子が存在していたB4R遺伝子とB6R遺伝子の間でもよいし、ワクシニアウイルスのゲノムの任意の部位であってもよい。さらに、あらかじめ、B5R遺伝子をDNAコンストラクトとして構築し、それをワクシニアウイルスに導入してもよい。
　ワクシニアウイルスのK2L遺伝子又はHA遺伝子が欠損し、K2L又はHAの機能が働かなくなることでウイルスの増殖、伝播能が上がることで腫瘍溶解能が向上し、加えて感染した癌細胞の細胞死が誘導される。ここで、細胞死はアポトーシス及びネクローシスを含む。また、感染した癌細胞に細胞融合が引き起こされる。細胞融合が引き起こされることにより、免疫原生細胞死（ICD:Immunogenic cell death）誘導能が向上する。この結果、癌細胞へのCD8 T細胞の浸潤が盛んに起こり、癌細胞を攻撃する。さらに、全身的な抗癌免疫活性が向上する。また、Treg、TAM、MDSC等の免疫抑制細胞の減少も認められる。
　この結果、ワクシニアウイルスのK2L遺伝子又はHA遺伝子が欠損し、K2L又はHAの機能が働かなくなることでワクシニアウイルスの抗癌効果が向上する。
　上記のように、ワクシニアウイルスが感染した細胞において、細胞融合が起こることにより、抗癌効果が向上し、その抗癌効果やICD誘導能は、腫瘍特異性の有無に関係なく向上する。ただし、さらに、ワクシニアウイルスが腫瘍特異性を有する場合、抗癌効果は相乗的に向上する。従って、本発明において用いるワクシニアウイルスは、腫瘍細胞特異的な細胞溶解性を有し、癌細胞に感染して癌細胞を細胞死させ得る腫瘍溶解性ウイルス（oncolytic virus)が好ましい。その方法としては、特定の蛋白質の機能を欠損したり、特定の遺伝子又は蛋白質の発現を抑制したりするような遺伝子改変が加えられる。
　そのような遺伝子として、赤血球凝集素（HA）遺伝子；チミジンキナーゼ（TK）遺伝子；Fフラグメント；F3遺伝子；ワクシニアウイルス増殖因子（VGF）遺伝子（米国特許出願公開第2003/0031681号明細書）；O1L；出血領域又はA型封入体領域（米国特許第6,596,279号明細書）；Hind III F、F13L若しくはHind III M領域（米国特許第6,548,068号明細書）；A33R、A34R若しくはA36R遺伝子（Katz et al.,J.Virology 77:12266-12275(2003)）；SalF7L遺伝子（Moore et al.,EMBO J.1992 11:1973-1980）；N1L遺伝子（Kotwal et al.,Virology 1989 171:579-58）；M1遺伝子（Child et al.,Virology,1990 174:625-629）；HR、HindIII-MK、HindIII-MKF、HindIII-CNM、RR若しくはBamF領域（Lee et al.,J Virol.1992 66:2617-2630）；C21L遺伝子（Isaacs et al.,Proc Natl Acad Sci USA.1992 89:628-632）等が挙げられる。これらの遺伝子の中でも、VGF遺伝子、O1L遺伝子、TK遺伝子、HA遺伝子、Fフラグメントが好ましい。
　また、複数の遺伝子改変を組合せてもよい。複数の遺伝子改変として以下の改変が挙げられる。
・TK及びHA並びにF14.5Lの機能の欠損(Cancer Research, 2007, Vol.67, p.10038-10046)・TK及びB18Rの機能の欠損（PLoS Medicine, 2007, Vol.4, p.e353）
・TK及びリボヌクレオチド還元酵素の機能の欠損（PLoS Pathogens, 2010, Vol.6, p.e1000984）
・SPI-1及びSPI-2の機能の欠損（Cancer Research, 2005, Vol.65, p.9991-9998）
・SPI-1、SPI-2及びTKの機能の欠損（Gene Therapy, 2007, Vol.14, p.638-647）
・E3L及びK3L領域に変異の導入（国際公開第2005/007824号）
　これらの遺伝子の機能が欠損しており、腫瘍溶解性を有するワクシニアウイルスを腫瘍溶解性ワクシニアウイルスと呼ぶ。
　これらの遺伝子の複数を欠損させてもよい。例えば、VGF遺伝子及びO1L遺伝子の２つの遺伝子が欠損していてもよい。VGF遺伝子及びO1L遺伝子の２つの遺伝子の機能が欠損したワクシニアウイルスは、国際公開第WO2015/076422号に記載されている。
　例えば、TK遺伝子の機能が欠損すると、正常細胞におけるワクシニアウイルスの増殖能が低下する。一方、癌細胞にはこの遺伝子の機能を補う酵素が豊富に存在するため癌細胞では増殖能は低下しない。正常細胞において増殖能が低下することは正常細胞に対する病原性が低下することを意味し、すなわち、生体に適用した場合の安全性が向上する。また、VGF遺伝子及びO1L遺伝子の２つの遺伝子の機能が欠損したワクシニアウイルスが正常細胞に感染した場合、正常細胞ではERKが活性化されないため、細胞増殖は促進されず、その結果、ワクシニアウイルス増殖は著明に低下する。一方、癌細胞ではRas/Raf/MEK/ERK代謝経路が異常に活性化しているため、それがワクシニアウイルスのVGF及びO1LによるERKの活性化機能を補うので、ワクシニアウイルスは増殖できる。この結果、ワクシニアウイルスは癌細胞特異的に増殖し、癌細胞を破壊し傷害をもたらす。
　腫瘍溶解性であるワクシニアウイルスを用いることにより、K2L遺伝子又はHA遺伝子の欠損による細胞融合能の上昇と相まって相乗的に癌細胞に細胞死をもたらす能力が向上する。
　これらの遺伝子の欠損は、上記のゲノム編集、相同組換え、RNA干渉法、アンチセンス法、遺伝子挿入法、人為的突然変異法、ウイルスベクターを利用したPTGS法等により行うことができる。
　ワクシニアウイルスによる癌ウイルス治療の対象とする癌は限定されず、卵巣癌、肺癌、膵癌、皮膚癌、胃癌、肝臓癌、肝細胞癌、結腸癌、肛門・直腸癌、食道癌、子宮癌、乳癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、頭頚部癌、脳・神経腫瘍、胸腺癌、リンパ腫・白血病、骨・骨肉腫、平滑筋腫、横紋筋腫、黒色腫等あらゆる癌種を挙げることができる。
　本発明のワクシニアウイルスを含む癌治療用医薬組成物は、医薬的に有効量の本発明のワクシニアウイルスを有効成分として含んでおり、無菌の水性又は非水性の溶液、懸濁液、又はエマルションの形態であってもよい。さらに、塩、緩衝剤、アジュバント等の医薬的に許容できる希釈剤、助剤、担体等を含んでいてもよい。投与は種々の非経口経路、例えば、皮下経路、静脈内経路、皮内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、鼻内経路、経皮経路によればよい。また、癌部に局所投与してもよい。有効投与量は被験体の年齢、性別、健康、及び体重等により適宜決定することができる。例えば、限定されないが、ヒト成人に対して、投与当たり約102～1010プラーク形成単位(PFU)である。
　本発明は、上記のワクシニアウイルスを癌患者に投与することを含む癌の治療方法も包含する。
　さらに、本発明のワクシニアウイルスは、外来遺伝子（外来DNA又は外来ポリヌクレオチド）を含んでいてもよい。外来遺伝子（外来DNA又は外来ポリヌクレオチド）としては、マーカー遺伝子、細胞毒性や免疫賦活効果を有する産物をコードする治療用遺伝子が挙げられ、さらに、癌、ウイルス、細菌、原虫等のタンパク質抗原をコードするDNAが挙げられる。マーカー遺伝子はレポーター遺伝子ともいい、ルシフェラーゼ(LUC)遺伝子、緑色蛍光タンパク質（Green fluorescent protein；GFP)等の蛍光タンパク質遺伝子、赤色蛍光タンパク質（DsRed)等の蛍光タンパク質遺伝子、βグルクロニダーゼ（GUS)遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT)遺伝子、β-ガラクトシダーゼ(LacZ)遺伝子等が挙げられる。これらの外来遺伝子を含む腫瘍溶解性ワクシニアウイルスをワクシニアウイルスベクターと呼ぶことができる。
　治療用遺伝子は、癌や感染症等の特定の疾患の治療に用い得る遺伝子であり、p53、Rb等の腫瘍抑制遺伝子、インターロイキン1（IL-1）、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-17、IL-18、IL-24、ケモカイン2（CCL2）、CCL5、CCL19、CCL21、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CD40L、CD70、CD80、CD137L、OX-40L、GITRL、LIGHT、α-インターフェロン、β-インターフェロン、γ-インターフェロン、アンジオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、METH-1、METH-2、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、MIP1a、FLT3L、HPGD、TRIF、DAI、腫瘍壊死因子等の生理活性物質をコードする遺伝子、CTLA4、PD1、PD-L1の阻害作用を有する抗体等をコードする遺伝子が挙げられる。ルシフェラーゼやGFPを発現するワクシニアウイルスは、その感染細胞である癌細胞を簡便、迅速に検出することが可能となる。本発明のワクシニアウイルスを癌治療に用いる場合、ワクシニアウイルスの有する腫瘍溶解性と共に癌に対する治療用遺伝子が癌治療効果を発揮することができる。
　外来遺伝子(外来DNA)としてウイルス、細菌、原虫及び癌等の抗原をコードするDNAを導入することにより、外来遺伝子を導入したワクシニアウイルスベクターを種々のウイルス、細菌、原虫及び癌に対するワクチンとして用いることができる。例えば、ヒト免疫不全ウイルス、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、ミコバクテリア、マラリア原虫、重症急性呼吸器症候群(SARS＝サーズ)ウイルス等の感染防御抗原（中和抗原）、あるいはWT1、MART-1、NY-ESO-1、MAGE-A1、MAGE-A3、MAGE-A4、Glypican-3、KIF20A、Survivin、AFP-1、gp100、MUC1、PAP-10、PAP-5、TRP2-1、SART-1、VEGFR1、VEGFR2、NEIL3、MPHOSPH1、DEPDC1、FOXM1、CDH3、TTK、TOMM34、URLC10、KOC1、UBE2T、TOPK、ECT2、MESOTHELIN、NKG2D、P1A、5T4、B7-H6、BCMA、CD123、CD133、CD138、CD171、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD33、CD38、CD44、CEA、cMet、CS1、EGFR、EGFRvIII、EphA2、ErbB2、FAP、FR-α、HER2、IL13Ra2、MUC1、MUC16、NKG2D、PSCA、PSMA、ROR1、TARP、DLL3、PRSS21、Claudin18.2、Claudin18、CAIX、L1-CAM、FAP-α、CTAG1B、FR-α等のタンパク質や、GD2、GM2等の糖脂質などの癌抗原をコードする遺伝子を導入すればよい。
　これらの外来遺伝子は、例えば、相同組換えの手法を用いることにより導入することができる。相同組換えは上述の方法で行えばよい。例えば、導入したい部位のDNA配列中に導入すべき外来遺伝子を連結したプラスミド（トランスファーベクター）を作製し、これを、ワクシニアウイルスを感染させた細胞の中に導入すればよい。外来遺伝子の導入領域は、ワクシニアウイルスの生活環に必須でない遺伝子中が好ましい。
　また、外来遺伝子を導入する際、外来遺伝子の上流に適当なプロモーターを機能し得る形で連結させるのが望ましい。プロモーターは、限定はないが、上述のPSFJ1-10や、PSFJ2-16、p7.5Kプロモーター、p11Kプロモーター、T7.10プロモーター、CPXプロモーター、HFプロモーター、H6プロモーター、T7ハイブリッドプロモーター等を用いることができる。本発明のワクシニアウイルスベクターに外来遺伝子を導入する方法は、組換えワクシニアウイルスベクターを構築する公知の方法により行うことができ、例えば別冊　実験医学　ザ・プロトコールシリーズ　遺伝子導入＆発現解析実験法　斎藤泉他編集、羊土社（1997年９月１日発行）、あるいは、D. M. Glover他編、加藤郁之進 監訳DNAクローニング4－哺乳類のシステム－（第2版）TaKaRa、EMBO Journal（1987年　６巻　p.3379-3384等の記載に従えばよい。
　本発明は、細胞融合能を有するワクシニアウイルスと免疫チェックポイント阻害剤との併用治療も包含する。
　免疫チェックポイント阻害剤は、抗PD-1(Programmed cell death 1)抗体、抗PD-L1(Programmed cell-death ligand 1)抗体、抗CTLA-4抗体、抗PD-L2抗体、抗LAG-3抗体、PD-1拮抗剤、PD-L1拮抗剤等を含む。これらの中でも抗PD-1抗体及び抗PD-L1抗体が好ましい。抗PD-1抗体として、Nivolumab、Pembrolizumab、Spartalizumab、Cemiplimab、Tislelizumab、Camrelizumabなどが挙げられ、抗PD-L1抗体として、Avelumab、Durvalumab、Atezolizumab等が挙げられる。
　免疫チェックポイント阻害剤は、公知の方法で投与すればよい。免疫チェックポイント阻害剤の投与量は、症状、年齢、体重および他の状態により変化するが、例えば、0.001mg～100mgの用量を数日、数週間又は数ヶ月の間隔で、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射等により、投与すればよい。
　免疫チェックポイント阻害剤は、製剤の分野で一般的に用いられる担体、希釈剤、賦形剤等を含んでいてもよい。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、ラクトース、ステアリン酸マグネシウムなどが使用される。注射用の水性液としては、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが使用され、アルコール、プロピレングリコールなどのポリアルコール、非イオン界面活性剤等の溶解補助剤を併用してもよい。油性液としては、ゴマ油、大豆油などが使用され、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等の溶解補助剤を併用してもよい。
　本発明の細胞融合能を有するワクシニアウイルス及び免疫チェックポイント阻害剤は、がんの治療において相乗的効果を奏することができる。細胞融合能を有するワクシニアウイルスと免疫チェックポイント阻害剤を併用した場合のがん治療効果は、細胞融合能を有するワクシニアウイルスを単独で使用した場合又は免疫チェックポイント阻害剤を単独で使用した場合のがん治療効果よりも顕著に高い。
　本発明の細胞融合能を有するワクシニアウイルスは、免疫チェックポイント阻害剤の投与と同時に若しくは別々に、又は連続して投与することができる。細胞融合能を有するワクシニアウイルスは、免疫チェックポイント阻害剤の投与前又は投与後に投与することもできる。好ましくは、細胞融合能を有するワクシニアウイルスは、免疫チェックポイント阻害剤の投与前に投与される。
　本発明はまた、細胞融合能を有するワクシニアウイルス及び免疫チェックポイント阻害剤を含む組合せ、組合せ製剤または組合せ医薬キットを包含する。
　本発明はまた、がんを治療するための医薬品の製造における細胞融合能を有するワクシニアウイルスと免疫チェックポイント阻害剤とを組合せて使用する方法を包含する。
　本発明はまた、細胞融合能を有するワクシニアウイルス及び免疫チェックポイント阻害剤を含む医薬を含む。
　本発明はさらに、免疫チェックポイント阻害剤と併用するための細胞融合能を有するワクシニアウイルスを包含する。
　本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
実施例１　細胞融合能を有するワクシニアウイルスの構造
　VGFとO1Lの両方が機能しない分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ依存性遺伝子組換えワクシニアウイルス（国際公開第W02015/076422号）において、VGF遺伝子及びO1L遺伝子に異なる外来遺伝子の発現ユニットを挿入するため、pTagBFP-N(FP172、Evrogen社)のDNAを鋳型として、２つのプライマー（配列番号１と配列番号２）によって、BFP遺伝子領域を増幅した。その各PCR産物を制限酵素SfiIとEcoRIで切断し、それをpTK-SP-LGベクター(国際公開第WO2015/076422号)の同じ制限酵素部位にクローニングし、合成ワクシニアウイルスプロモーター（Hammond JM. et al., Journal of Virological Methods. 1997; 66(1):135-138）下にBFPを連結したpTNshuttle/TK-SP-BFPを構築した。次に、pTNshuttle/TK-SP-BFPを制限酵素SphIとEcoRIで切断し、Blunt処理後、そのSP-BFP断片を、pUC19-VGFベクター(国際公開第WO2015/076422号)を制限酵素AccIで切断しBlunt処理した部位へ、又はpUC19-O1Lベクター(国際公開第WO2015/076422号)を制限酵素XbaIで切断しBlunt処理した部位へクローニングし、VGFと逆向きにBFPを発現させるためのシャトルベクターpTNshuttle/VGF-ST-BFP、又はO1Lと逆向きにBFPを発現させるためのpTNshuttle/O1L-SP-BFPを構築した。一方、国際公開第WO2015/076422号と同様の方法にて、合成ワクシニアウイルスプロモーターではなく、p7.5Kプロモーターの下、O1Lと同向きにDsRedを発現させるためのpUC19-O1L-P-DsRedを構築した。24wellプレートに80%コンフルエントに培養されたCV1細胞にVGF-LucGFP/O1L-DsRedをMOI=0.1～0.5で感染させ、室温で1時間吸着させた。その後、FuGENE HD(Roche)と混合したトランスファーベクタープラスミドpTNshuttle/O1L-SP-BFPをマニュアルに従って細胞に添加して取り込ませ、37℃にて2～3日間培養した。細胞を回収し凍結融解後、ソニケーション処理し、ほぼコンフルエントになったBSC1細胞に適当に希釈して接種し、0.5%メチルセルロースを含むEagle MEM、5%FBS培地を加え、37℃で2～4日間培養した。培地を除き、BFPを発現したプラークをチップの先で掻き取り、opti-MEM培地(Invitrogen)に浮遊させた。BSC1細胞にてさらに3回以上この作業を繰り返し、プラーク純化をした。プラーク純化後に採取したプラークの浮遊液をソニケーション後、その200μLよりHigh Pure Viral Nucleic Acid Kit（Roche）を用いマニュアルに従ってゲノムDNAを抽出し、PCRによるスクリーニングに供した。O1Lに関しては２つのプライマー（配列番号３と配列番号４）によってPCRを行い、所定の大きさのPCRプロダクトが検出されたクローンについて、PCRプロダクトの塩基配列をダイレクトシーケンスにより確認した。塩基配列に問題が無いウイルスクローンVGF-LucGFP/O1L-BFP、を選択し、A549細胞にて増幅させた後、RK13細胞にてウイルス力価を測定し実験に供した。このワクシニアウイル(VGF-LucGFP/O1L-BFP）とトランスファーベクタープラスミドDNA（pUC19-O1L-P-DsRed）を基に、DsRedの発現を指標に、上記と同様の方法にて組換えウイルスを回収し、VGF-LucGFP/O1L-DsRedとした。
　この遺伝子組換えワクシニアウイルスを作出する工程の中で、通常では見られない細胞融合能を有するウイルスが極めて高い頻度で出現した。そこで培地を除き、この融合形質プラークをチップの先で掻き取り、opti-MEM培地(Invitrogen)に浮遊させた。BSC1細胞にてさらに3回以上この作業を繰り返し、プラーク純化によって、２つの細胞融合能を有するウイルスクローンを取得した。この2つのクローンを次世代シークエンサーPacBio RSII（Pacific Bioscience社）やPCRによるダイレクトシークエンシングを行い、得られた配列情報からK2L、又はHA遺伝子に変異が見つかり、配列番号５又は配列番号６で示される塩基配列を有していた。K2Lは全長1110bpの遺伝子であり、その中の762bp目のグアニンがアデニンに変異していた。このことで254番目のアミノ酸がトリプトファンから終止コドンに変異し、ナンセンス変異が起きていることが分かった。また、HAは全長933bpの遺伝子であり、70bp目のアデニンが欠損していた。このことでフレームシフト変異が起きていることが分かった。以上より、取得した２つの細胞融合能を有するウイルスクローンは、親ウイルスであるVGF-LucGFP/O1L-DsRed（国際公開第W02015/076422号）(図１A）に対し、VGF-LucGFP/K2Lmut /O1L-DsRed及びVGF-LucGFP/O1L-BFP/HAmutと称し（図１B及びC）、各組換えウイルスはA549細胞にて大量培養し精製した後、RK13細胞にてウイルス力価を測定し、実験に供した。
　次に、pGL4.20(F6751、プロメガ社)のDNAを鋳型として、２つのプライマー（配列番号７と配列番号８）によって、Luc2遺伝子領域を増幅した。その各PCR産物を制限酵素BspEIとNheIで切断し、それをBFP遺伝子と置換するようにpTNshuttle/VGF-SP-BFPベクターのAgeIとNheI制限酵素部位にクローニングし、pTNshuttle/VGF-SP-Lucを構築した。一方、H.sapiensにコドン最適化するよう合成した大腸菌LacZ遺伝子（配列番号９）を制限酵素AgeIとNheIで切断し、それをBFP遺伝子と置換するようにpTNshuttle/O1L-SP-BFPベクターの同じ制限酵素部位にクローニングし、pTNshuttle/O1L-SP-LacZを構築した。
　図１Bに示すウイルスゲノムを持つ組換えワクシニアウイルスの回収のため、ワクシニアウイルス（VGF-LucGFP/O1L-DsRed、又はVGF-LucGF P/K2Lmut/O1L-DsRed）とトランスファーベクタープラスミドDNA（pTNshuttle/VGF-SP-Luc）を基に、GFP発現の消失を指標に、上記と同様の方法にて組換えウイルスを回収し、VGF-Luc/O1L-DsRed、又はVGF-Luc/K2Lmut /O1L-DsRedとした。このワクシニアウイルス（VGF-Luc/O1L-DsRed、又はVGF-Luc/K2Lmut /O1L-DsRed）とトランスファーベクタープラスミドDNA（pTNshuttle/O1L-SP-LacZ）を基に、DsRed発現の消失を指標に、上記と同様の方法にて組換えウイルスを回収し、PCRによるスクリーニングに供した。VGFに関しては２つのプライマー（配列番号１０と配列番号１１）によって、K2Lに関しては２つのプライマー（配列番号１２と配列番号１３）によってPCRを行い、所定の大きさのPCRプロダクトが検出されたクローンについて、PCRプロダクトの塩基配列をダイレクトシーケンスにより確認した。塩基配列に問題が無いウイルスクローンVGF-Luc/O1L-LacZ、又はVGF-Luc/K2Lmut/O1L-LacZとした（図１D及びE）。各組換えウイルスはA549細胞にて大量培養し精製した後、RK13細胞にてウイルス力価を測定し、実験に供した。
実施例２　細胞融合能を有するワクシニアウイルスの特性解析
　細胞融合能を持たないVGF-LucGFP/O1L-DsRedと細胞融合能を有するVGF-LucGFP/K2Lmut/O1L-DsRed及びVGF-LucGFP/O1L-BFP/HAmutを比較するべく、各ウイルスを感染させた。まず96wellプレートに様々な癌細胞（ヒト卵巣癌RMG1細胞、ヒト大腸癌CaCO2細胞、ヒト肺癌A549細胞、マウス大腸癌CT26細胞）をRMG1, CaCO2 2.0×104/well、A549 1.0×104/well、CT26 6.0×103/wellで播種し、24時間培養後80％コンフルエントになったところでVGF-LucGFP/O1L-DsRed、VGF-LucGFP/K2Lmut/O1L-DsRed、又はVGF-LucGFP/O1L-BFP/HAmutをRMG1、CaCO2、A549はMOI=0.1、CT26はMOI=10に調整し感染させた。感染から72時間後、BZ-X700(キーエンス)を用い感染像の観察を行った。その結果、VGF-LucGFP/O1L-DsRedに比べて、VGF-LucGFP/K2Lmut/O1L-DsRed及びVGF-LucGFP/O1L-BFP/HAmutは、様々な癌細胞において、細胞を融合させながら感染していくことが分かった（図２）。
　次に細胞融合変化を起こしたことで抗癌効果に影響を及ぼすのかをVGF-LucGFP/O1L-DsRedとVGF-LucGFP/K2Lmut/O1L-DsRedを用い検証した。まず、96wellプレートにA549を1.0×104/well播種し、24時間培養後80～90％コンフルエントになったところで各ウイルス液をMOI=0.01, 0.1, 1で感染させた。感染から72時間後、BZ-X700(キーエンス)を用い感染像の観察を行った。その結果、VGF-LucGFP/K2Lmut/O1L-DsRedはVGF-LucGFP/O1L-DsRedに比べて、MOI依存的に細胞を融合させながら感染していくことが分かった。図３－１に感染細胞像を示す。また、感染から72時間後にCellTiter96（登録商標） Aqueous Non-radioactive Cell Proliferation Assay（Promega）を用いた細胞生存率測定を行った。その結果、VGF-LucGFP/K2Lmut/O1L-DsRedはVGF-LucGFP/O1L-DsRedに比べMOI=0.1, 1のとき細胞生存率の減少が見られ、抗癌効果が向上していることが示された。図３－２に細胞傷害性を細胞生存率により示す。また、細胞融合変化を起こしたことでウイルスの産生量が変化するかを調べるべく、VGF-LucGFP/O1L-DsRedとVGF-LucGFP/K2Lmut/O1L-DsRedの産生するウイルス量をウイルス力価測定（タイトレーション）により比較した。まず、24wellプレートに5.0×104/wellで宿主としてヒト肺癌細胞株A549細胞を播種し、24時間培養後60～80%コンフルエントになったところで各ウイルス液をMOI=0.1で感染させた。感染から24、48、72時間後スクレーパーにより細胞と上清を回収し、凍結融解、ソニケーション処理により細胞を破砕し、2000rpmで4℃、10分遠心後に上清を回収した。ウイルスの力価測定にはRK13細胞を播種し、想定されるウイルス力価に応じて希釈率を変化させた。力価の測定は12wellプレートに80%コンフルエントで播種したRK13へ段階希釈（10-1～10-5倍希釈）した各ウイルスを感染させ、0.8%メチルセルロースを含むEagle MEM、5% FBS培地で3日間培養後、形成されるウイルスプラーク数を測定することでウイルス力価を算出した。その結果、VGF-LucGFP/O1L-DsRedとVGF-LucGFP/K2Lmut/O1L-DsRedではウイルスの産生量に変化が見られないことが確認できた。図３－３に産生量を力価により示す。
実施例３　細胞融合能を有するワクシニアウイルスの抗癌効果
　次にA549以外での細胞生存率を多様なヒト、マウス癌細胞を用い調査した。ヒト卵巣癌細胞（SKOV3：2.0×104/well）、ヒト膵臓癌細胞（Panc1：2.0×104/well）、ヒト大腸癌細胞（CaCO2：2.0×104/well）、ヒト乳癌細胞（MDA-MB-231：2.0×104/well）、ヒト肺癌細胞（A549：1.0×104/well）、ヒト前立腺癌細胞（PC3：2.5×104/well）、ヒト皮膚癌細胞（A431：2.0×104/well）、マウスメラノーマ細胞（B16-F10：1.5×104/well）、マウス大腸癌細胞（CT26：1.0×104/well）及びマウス肺癌細胞（TC1：4.0×103/well）を96wellプレートに播種し、37℃、24時間培養後VGF-LucGFP/O1L-DsRed又はVGF-LucGFP/K2Lmut/O1L-DsRedの各ウイルス液をPanc1, CaCO2, MDA-MB-231, A549, A431はMOI=0.1、SKOV3, PC3はMOI＝1、B16-F10, CT26, TC1はMOI=5のいずれかにより感染させた（n=3）。そして、感染からTC1は48時間後、それ以外は72時間後にCellTiter 96（登録商標） Aqueous Nonradioactive Cell Proliferation Assay（Promega）により細胞生存率の測定を行った。
　この時、感染像を観察するとVGF-LucGFP/K2Lmut/O1L-DsRedでは細胞融合感染像が確認でき、幅広い癌種でVGF-LucGFP/O1L-DsRedと感染像が異なることが示された（図４－１）。さらに、細胞生存率においてもVGF-LucGFP/K2Lmut/O1L-DsRedではt検定でVGF-LucGFP/O1L-DsRedに比べ有意な減少が見られた（SKOV3：**P= 0.0021, Panc1：***P-= 0.0003, CaCO2：***P < 0.0001, MDA-MB-231：***P= 0.0004, A549：***P < 0.0001, PC3：*P= 0.0284, A431：*P= 0.0480, B16-F10：***P= 0.0004, CT26：**P= 0.0030, TC1：***P-=0.0006）。このことよりにVGF-LucGFP/K2Lmut/O1L-DsRedは幅広い癌種で抗腫瘍効果が向上していることが示された（図４－２）。
実施例４　In vitroにおける細胞融合能を有するワクシニアウイルスの抗癌効果メカニズム解析
　ヒト肺癌細胞株（A549）とマウス大腸癌細胞株（CT26）においてアポトーシス、ネクローシスが有意に起きているのかをApoptotic / Necrotic / Healthy Cells Detection Kit（タカラバイオ）を用い検証した。まず、A549又はCT26を96wellプレートに1.0×10４/well播種し、37℃、24時間培養後VGF-Luc/O1L-lacZ又はVGF-Luc/K2Lmut/O1L-lacZの各ウイルス液をA549はMOI=1、CT26はMOI=10で感染させた（n=3）。感染から30時間又は22時間後に前述のキットを用いアッセイを行いBZ-X700（キーエンス）で撮影をした後、数値化を行った。結果、A549、CT26の両方でVGF-Luc/O1L-lacZに比べVGF-Luc/K2Lmut/O1L-lacZのアポトーシスとして検出された細胞がt検定で優位に向上していた（A549：*P=0.0355, CT26：*P=0.0264）。さらに、アポトーシスのみならずネクローシスとして検出された細胞もt検定で優位に向上していた（図５）（A549：*P=0.0181, CT26：*P=0.0264）。さらに、抗腫瘍免疫誘導において重要だと言われているImmunogenic cell death（ICD）（免疫原生細胞死）についても検証した。ICDによる免疫誘導のメカニズムとして、HMGB1の細胞外放出やCalreticulinの細胞表面露出などが報告されている。今回は細胞外HMGB1をHMGB1 ELISA KitII（シノテスト）により定量した。A549又はCT26を24wellプレートにA549は5.25×104/well、CT26は3.15×104/well播種し、37℃、24時間培養後VGF-Luc/O1L-lacZ又はVGF-Luc/K2Lmut/O1L-lacZの各ウイルス液をA549はMOI=1、CT26はMOI= 5で感染させた（n=3）。感染から60時間後に細胞上清を回収し、ELISAを行った。結果、A549、CT26の両方でVGF-Luc/O1L-lacZに比べVGF-Luc/K2Lmut/O1L-lacZのHMGB1細胞外放出が有意に上昇していることがt検定により確認できた（図６）（A549：***P=0.0006、CT26：***P=0.0004）。これらの結果よりVGF-Luc/K2Lmut/O1L-lacZではアポトーシス、ネクローシス誘導能の向上、ICDによる抗腫瘍免疫惹起能向上が抗癌効果増強に寄与することが示唆された。
実施例５　In vivoにおける細胞融合能を有するワクシニアウイルスの治療効果
　次に同種移植モデルを用い、ウイルスの生体内での増殖、伝播とウイルスの治療効果検討を行った。
　マウス大腸癌細胞株（CT26）を5.0×105cellsでBALB/cAjclマウスの腹部両側皮下に移植し、腫瘍が42～94mm3（平均60mm3）になるまで5又は6日間成長させた（図７Ａ）。腫瘍成長後にVGF-Luc/O1L-lacZとVGF-Luc/K2Lmut/O1L-lacZを隔日3回5.0×107PFUで片側の腫瘍内へ直接投与した（Day0, 2, 4）。また、Vivo Glo Luciferin（Promega）の投与によりウイルスのFLuc発光（≒ウイルス増殖、伝播）をin vivoイメージングシステム（Berthold、NightSHADE LB985）を用いて非侵襲的に検出した（Day1, 3, 5, 7）（図７Ｂ）。図８－１にウイルス投与後3日時点でのウイルスFLucの検出結果を示す。ウイルスFLucはウイルス投与後3日目でVGF-Luc/K2Lmut/O1L-lacZがVGF-Luc/O1L-lacZよりウイルス投与側で高いシグナルを発現していた。一方、ウイルス非投与側ではウイルスを投与した場合でもウイルスのシグナルは確認できなかった。さらに、ウイルスFLuc発現の数値化を行ったとき、投与側ではウイルス投与後3日目でTwo-Way ANOVA統計解析において有意な差があることが認められた（*P<0.05）（図８－２）。このことよりVGF-Luc/K2Lmut/O1L-lacZはVGF-Luc/O1L-lacZに比べin vivoにおいて盛んにウイルス増殖、伝播が行われていることが確認できた。次に腫瘍径測定によりウイルスの治療効果を検討した。その結果、VGF-Luc/K2Lmut/O1L-lacZウイルス投与マウスはウイルス非投与（PBS）マウス及びVGF-Luc/O1L-lacZウイルス投与マウスと比べウイルス投与側、非投与側の腫瘍増殖を抑制していた。さらに、VGF-Luc/K2Lmut/O1L-lacZウイルス投与マウスは22日後、PBSマウス及びVGF-Luc/O1L-lacZウイルス投与マウスの腫瘍体積と比べ、ウイルス投与側、非投与側において有意な差があることがTwo-Way ANOVA統計解析によって確認できた（**P<0.01, ***P<0.001）（図９）。
実施例６　In vivoにおける細胞融合能を有するワクシニアウイルスの治療効果メカニズム解析
　次にin vivoにおける治療効果向上のメカニズムを解析するため、フローサイトメトリーを用いて免疫学的解析を行った。マウス大腸癌細胞株（CT26）を5.0×105cellsでBALB/cAjclマウスの腹部両側皮下に移植し、腫瘍が50～111mm3（平均60mm3）になるまで5日間成長させた。腫瘍成長後にVGF-Luc/O1L-lacZとVGF-Luc/K2Lmut/O1L-lacZを隔日3回5.0×107PFUで片側の腫瘍内へ直接投与した（Day0, 2, 4）。ウイルス投与後5日（Day5）で腹部両側の腫瘍をSerum free RPMIに回収し、gentleMACS（Miltenyi Biotec）を用い腫瘍組織を分散した。100μmストレイナーで細胞をろ過し溶血処理を行った後、細胞をカウントし5.0×105cellsになるよう調整した。調整した細胞をFcブロック（BD Bioscience）でブロッキングし、細胞表面抗原染色、細胞内抗原染色を行いCytoFLEX（BECKMAN COULTER）によりCD8、CD4、Treg、TAM、MDSCの解析を行った。死細胞染色には7AAD（BECKMAN COULTER）、細胞表面抗原染色の抗体はCD45（30-F11；BioLegend）、CD3（145-2C11；BioLegend）、CD8（53-6.7；BioLegend）、CD4（GK1.5；Thermo）、CD25（PC61.5；Thermo）、F4/80（BM8；BioLegend）、CD11b（M1/70；BioLegend）、Ly6G（1A8；BioLegend）、Ly6C（AL21；BD Bioscience）、細胞内抗原染色の抗体はFoxP3（FJK-16s；Thermo）を用いた。免疫学的解析により明らかになった免疫細胞浸潤の結果を図１０－１及び１０－２に記す。CD8 T細胞の浸潤はウイルス投与側ではVGF-Luc/K2Lmut/O1L-lacZ投与により増加の傾向が見られるのみにとどまったが、非投与側ではVGF-Luc/O1L-lacZに比べt検定で有意に上昇していた（*P=0.0413）。次にCD4 T細胞の浸潤は投与側においてはPBSに比べVGF-Luc/K2Lmut/O1L-lacZで有意に減少していた一方で、非投与側では変化していなかった（**P=0.0025）。また、Tregにおいてもウイルス投与側ではPBSに比べVGF-Luc/K2Lmut/O1L-lacZは減少していたが、非投与側での減少は見られなかった（*P=0.0362, **P=0.0094）。さらに、TAMはVGF-luc/K2Lmut/O1L-lacZ投与によりウイルス投与側、非投与側ともPBSに比べ有意に減少していた（*P=0.0383, ***P=0.0002）。最後に、MDSCのG-MDSCはウイルス投与により有意に投与側で上昇していた（*P=0.0179, **P=0.0051）。その一方で、M-MDSCはVGF-Luc/K2Lmut/O1L-lacZ投与の場合のみPBSに比べ投与側で減少していた（*P=0.0417）。このことより、ウイルス投与側ではTreg、TAM、MDSCといった免疫抑制細胞の減少、非投与側ではCD8 T細胞の浸潤増加が治療効果に重要であることが示唆された。
　免疫学的解析の結果よりCD8 T細胞の浸潤がウイルス非投与側の治療効果に重要であることが示唆されたため、CD8 T細胞の働きをインヒビターにより抑制した。マウス大腸癌細胞株（CT26）を5.0×105cellsでBALB/cAjclマウスの腹部両側皮下に移植し、腫瘍が42～128mm3（平均60mm3）になるまで5日間成長させた。腫瘍成長後にVGF-Luc/O1L-lacZとVGF-Luc/K2Lmut/O1L-lacZを隔日3回 5.0×107PFUで片側の腫瘍内へ直接投与した（Day0, 2, 4）。加えて、InVivoPlus rat IgG2b isotype control, anti-keyhole limpet hemocyanin clone LTF-2（isotype control）及びInVivoPlus anti-mouse CD8α Clone 2.43（BioXCell）をDay -4, -2, 1, 3, 5, 7に200μg/mouse腹腔内投与した。腫瘍体積の測定により治療効果を検証した結果を図１１に記す。図１１Ａはisotype controlを投与した場合の結果を示し、図１１Ｂは抗CD8抗体を投与した結果を示す。isotype controlを投与したコントロールの場合には、図９と同様ウイルス投与側、非投与側ともPBSマウスに比べ、VGF-Luc/O1L-lacZ投与マウス及びVGF-Luc/K2Lmut/O1L-lacZマウスの腫瘍体積が抑制されており、Two-Way ANOVA統計解析により有意に差があることが分かった（*P<0.05, ***P<0.001）。一方で抗CD8抗体を投与した場合には、ウイルス投与側ではPBSに比べウイルス投与群で若干の減少は見られ、非投与側ではすべての群で差が見られなくなった。よって、CD8 T細胞の浸潤がウイルス非投与側のみならず、投与側においても重要であることが示唆された。
実施例７　進行した担癌モデルマウスにおける細胞融合能を有するワクシニアウイルスの治療効果
　マウス生体内で腫瘍体積がさらに大きくなった場合におけるウイルスの生体内での増殖、伝播とウイルスの治療効果検討を同種移植モデルにより検討した。
　マウス大腸癌細胞株（CT26）を5.0×105cellsでBALB/cAjclマウスの腹部片側皮下に移植し、腫瘍が87～253mm3（平均150mm3）になるまで約10日間成長させた（図１２Ａ）。腫瘍成長後にVGF-Luc/O1L-lacZとVGF-Luc/K2Lmut/O1L-lacZを隔日3回 5.0×107PFUで腫瘍内へ直接投与した（Day0, 2, 4）。また、Vivo Glo Luciferin（Promega）の投与によりウイルスのFLuc発光（≒ウイルス増殖、伝播）をin vivoイメージングシステム（Berthold、NightSHADE LB985）を用いて非侵襲的に検出した（Day1, 3, 5, 7）（図１２Ｂ）。図１３－１にウイルス投与後1日目でのウイルスFLuc発現の検出結果を示す。ウイルスFLuc発現の検出結果を見るとウイルス投与後1日でVGF-Luc/K2Lmut/O1L-lacZがVGF-Luc/O1L-lacZより高いシグナルを発現していた（図１３－１）。さらにFLucの数値化を行ったとき、ウイルス投与後1日でTwo-Way ANOVA統計解析において有意な差があることが認められた（図１３－２）（***P<0.001）。このことよりVGF-Luc/K2Lmut/O1L-lacZはin vivoにおいて盛んにウイルス増殖、伝播が行われることが確認できた。その後、腫瘍径測定によりウイルスの抗癌効果を検討した。その結果、VGF-Luc/K2Lmut/O1L-lacZウイルス投与マウスはウイルス非投与（PBS）マウス及びVGF-Luc/O1L-lacZウイルス投与マウスと比べ、ウイルス投与後19日目で腫瘍体積が有意に抑制されていることがTwo-Way ANOVA統計解析により確認できた（*<0.05, ***<0.001）（図１４）。
実施例８　細胞融合能と腫瘍標的化能を併せ持つワクシニアウイルスの抗癌効果
　細胞融合による抗癌効果の向上は、上記のK2L変異に細胞融合だけではなく、あらゆる変異や欠失もしくは外来遺伝子挿入によっても適用すること、及び上記のVGFとO1の欠失させることによる腫瘍特異性だけではなく、あらゆる方法と組み合わせることが可能であることを実証するため、以下の様々な細胞融合能と腫瘍標的化能を併せ持つワクシニアウイルスを作製し、In vitroにおける抗癌効果を比較評価した。
　細胞融合能と腫瘍標的化能を併せ持つワクシニアウイルスとして以下のクローンを用いた。
VGF-LucGFP/ΔK2L-BFP/O1L-DsRed(図１５－１Ａ)
　K2Lが欠損し細胞融合能を有しており、かつVGF及びO1Lが欠損し腫瘍特異性を担保しているクローン
VGF-LucGFP(図１５－１Ｂ)
　VGFが欠損することで腫瘍特異性を担保しているクローン
TK-GFP（図１５－１Ｃ)
　TKが欠損することで腫瘍特異性を担保しているクローン
unmodified Virus(図１５－１Ｄ)
　K2L、VGF、O1L及びTKのいずれも欠損していないクローン
VGF-LucGFP/K2L-BFP（図１５－１Ｅ)
　K2Lが欠損し細胞融合能を有しており、かつVGFが欠損することで腫瘍特異性を担保しているクローン
K2L-BFP/TK-GFP（図１５－１Ｆ)
　K2Lが欠損し細胞融合能を有しており、かつTKが欠損することで腫瘍特異性を担保しているクローン
K2L-BFP(図１５－１Ｇ)
　K2Lが欠損し細胞融合能を有しているクローン
　これらのクローンの作製方法を以下に示す。
　K2L遺伝子を全欠失した遺伝子組換えワクシニアウイルスを作製するため、K2L遺伝子とその5'、3'-flanking領域（配列番号１４）において、K2L遺伝子をBFP遺伝子に置き換えた配列（配列番号１５）を持つプラスミドpTNshuttle/ΔK2L-BFPを作製した。ワクシニアウイルス（VGF-LucGFP/O1L-DsRed）とトランスファーベクタープラスミドDNA（pTNshuttle/ΔK2L-BFP）を基に、BFPの発現を指標に、上記と同様の方法にて組換えウイルスを回収し、PCRによるスクリーニングに供した。K2Lに関しては上記と同様のプライマー（配列番号１２と配列番号１３）によってPCRを行い、所定の大きさのPCRプロダクトが検出されたクローンについて、PCRプロダクトの塩基配列をダイレクトシーケンスにより確認し、VGF-LucGFP/ΔK2L-BFP/O1L-DsRedとした（図１５－１Ａ）。K2L遺伝子に異なる外来遺伝子の発現ユニットを挿入するため、LC16mO株のゲノムDNAを鋳型として、２つのプライマー（配列番号１６と配列番号１７）によってK2L遺伝子領域を増幅した。そのPCR産物を制限酵素XbaIとMfeIで切断し、それをpUC19ベクターの制限酵素部位XbaIとEcoRIにクローニングし、pUC19-K2Lを構築した。次に、pTNshuttle/TK-SP-BFPを制限酵素SphIとEcoRIで切断し、Blunt処理後、そのSP-BFP断片を、pUC19-K2Lベクターを制限酵素ClaIで切断しBlunt処理した部位へクローニングし、pTNshuttle/K2L-SP-BFPを構築した。ワクシニアウイルス（遺伝子組換えをしていない無改良のunmodified VirusであるLC16mO株）とトランスファーベクタープラスミドDNA（pTNshuttle/K2L-SP-BFP）を基に、BFPの発現を指標に、上記と同様の方法にて組換えウイルスを回収し、PCRによるスクリーニングに供した。K2Lに関しては上記と同様のプライマー（配列番号１２と配列番号１３）によってPCRを行い、所定の大きさのPCRプロダクトが検出されたクローンについて、PCRプロダクトの塩基配列をダイレクトシーケンスにより確認し、K2L-BFPとした（図１５－１Ｇ）。TK遺伝子に異なる外来遺伝子の発現ユニットを挿入するため、pEGFP-N1(クロンテック株式会社)から制限酵素AgeIとNotIで切断し、それをBFP遺伝子と置換するようにpTNshuttle/TK-SP-BFPベクターの同じ制限酵素部位にクローニングし、pTNshuttle/TK-SP-GFPを構築した。ワクシニアウイルス（遺伝子組換えをしていない無改良のunmodified VirusであるLC16mO株）とトランスファーベクタープラスミドDNA（pTNshuttle/TK-SP-GFP）を基に、GFPの発現を指標に、上記と同様の方法にて組換えウイルスを回収し、PCRによるスクリーニングに供した。TKに関しては２つのプライマー（配列番号１８と配列番号１９）によってPCRを行い、所定の大きさのPCRプロダクトが検出されたクローンについて、PCRプロダクトの塩基配列をダイレクトシーケンスにより確認し、TK-GFPとした（図１５－１Ｃ）。細胞融合能と腫瘍標的化能を併せ持つワクシニアウイルスを作製するため、VGFが機能しない遺伝子組換えワクシニアウイルスVGF-LucGFP（国際公開第W02015/076422号）又は上記のTKが機能しない遺伝子組換えワクシニアウイルスTK-GFPとトランスファーベクタープラスミドDNA（pTNshuttle/K2L-SP-BFP）を基に、BFPの発現を指標に、上記と同様の方法にて組換えウイルスを回収し、PCRによるスクリーニングに供した。VGFに関しては上記と同様のプライマー（配列番号１０と配列番号１１）によって、K2Lに関しては上記と同様のプライマー（配列番号１２と配列番号１３）によって、TKに関しては上記と同様のプライマー（配列番号１８と配列番号１９）によってPCRを行い、所定の大きさのPCRプロダクトが検出されたクローンについて、PCRプロダクトの塩基配列をダイレクトシーケンスにより確認し、VGF-LucGFP/K2L-BFP(図１５－１Ｅ)、又はK2L-BFP/TK-GFP（図１５－１Ｆ）とした。各組換えウイルスはA549細胞にて大量培養した後、RK13細胞にてウイルス力価を測定し、実験に供した。
　次に、in vitroにて細胞生存率とICDについて検討を行った。図１５－２及び１５－３に10種類のウイルス（VGF-LucGFP/O1L-DsRed（図１Ａ)、VGF-LucGFP/K2Lmut/O1L-DsRed（図１Ｂ)、VGF-LucGFP/ΔK2L-BFP/O1L-DsRed(図１５－１Ａ)、VGF-LucGFP/O1L-BFP/HAmut（図１Ｃ)、VGF-LucGFP(図１５－１Ｂ)、VGF-LucGFP/K2L-BFP（図１５－１Ｅ)、TK-GFP（図１５－１Ｃ)、K2L-BFP/TK-GFP（図１５－１Ｆ)、unmodified Virus(図１５－１Ｄ)及びK2L-BFP(図１５－１Ｇ)）を感染させたときの細胞生存率の結果を示す。1.0×104/wellのヒト肺癌細胞（A549）を96wellプレートに播種し37℃、24時間培養後、図１と図１５－１に構造を示すウイルスをMOI＝0.1により感染させた（n=3）。そして、感染から72時間後にCellTiter 96（登録商標） Aqueous Nonradioactive Cell Proliferation Assay（Promega）により細胞生存率の測定を行った。その結果、欠失が起きていないウイルス（VGF-LucGFP/O1L-DsRed）と比べて、K2Lの自然変異、K2Lの全欠損、HAの自然変異の全てで有意に細胞生存率が減少していた（VGF-LucGFP/K2Lmut/O1L-DsRed,VGF-LucGFP/ΔK2L-BFP/O1L-DsRed, VGF-LucGFP/O1L-BFP/HAmut：***P<0.0001）。このことより、変異、欠失がどのような方法であってもK2L又はHAの機能が働かなくなることで細胞融合が引き起こされると、抗癌効果が向上することが示された。また、VGFが機能しない遺伝子組換えウイルス（VGF-LucGFP）、TKが機能しない遺伝子組換えウイルス（TK-GFP）、腫瘍特異性がない（Unmodified Virus）の全てでK2Lを挿入欠失させると有意に細胞生存率が減少していた（VGF-LucGFP/K2L-BFP, TK-GFP/K2L-BFP, K2L-BFP：***P≦0.0001）。よって、細胞融合が起きれば腫瘍特異性の種類、有無に関係なく抗癌効果が向上することが示された。図１５－４及び１５－５に上記と同じ10種類のウイルスを感染させたときのICD誘導の結果を示す。A549を24wellプレートに5.25×104/well播種し37℃ 24時間培養後、図１と図１５－１に構造を示すウイルスをMOI=1により感染させた（n=3）。そして、感染から60時間後に細胞上清を回収しHMGB1 ELISA KitII（シノテスト）により定量した。結果、K2Lへの自然変異、K2L全欠損、HAへの自然変異の全てで変異、欠失が起きていないウイルス（VGF-LucGFP/O1L-DsRed）より有意にHMGB1の細胞外放出が見られた（VGF-LucGFP/K2Lmut/O1L-DsRed：***P<0.0001, VGF-LucGFP/ΔK2L-BFP/O1L-DsRed：*P=0.0102, VGF-LucGFP/O1L-BFP/HAmut：**P=0.0011）。このことより、変異、欠失がどのような形であってもK2L又はHAの機能が働かなくなることで細胞融合が引き起こされると、ICD誘導能が向上することが示された。また、VGFが機能しない遺伝子組換えウイルス（VGF-LucGFP）、TKが機能しない遺伝子組換えウイルス（TK-GFP）、腫瘍特異性がない（Unmodified Virus）の全てでK2Lを挿入欠失させると有意にHMGB1の細胞外放出が向上していた（VGF-LucGFP/K2L-BFP：**P=0.0010, TK-GFP/K2L-BFP：***P=0.0002, K2L-BFP：**P＝0.0042）。よって、細胞融合が起きれば腫瘍特異性の種類、有無に関係なくICD誘導能が向上することが示された。
　以上の結果より、ワクシニアウイルスが細胞融合を引き起こすことで抗癌効果が向上することが示された。そのメカニズムを解析したところ、以下の3点に起因していることが分かった。まず、ウイルスの増殖、伝播能が上がることで腫瘍溶解能が向上し、加えてアポトーシス、ネクローシスが盛んに起こる。次に、融合することでより効率良くICDが誘導され投与側、非投与側へのCD8 T細胞の浸潤が盛んに起こる。最後に投与側、非投与側の腫瘍内免疫環境が改善されることで癌免疫が働きやすくなる。即ち、細胞融合を誘導する腫瘍溶解性ウイルスは、細胞融合を誘導しない腫瘍溶解性ウイルスと比べ、より効率良く免疫が働き難いCOLD腫瘍を免疫が攻撃し易いHOT腫瘍へ転換することによって、より高い抗癌効果を発揮する（図１６）。
実施例８　細胞融合能を有するワクシニアウイルスと抗PD-1抗体の併用治療効果
　CD8 T細胞の働きがウイルスの治療効果、特に非投与側への治療効果に重要であることが示唆されたため、免疫チェックポイント阻害薬である抗PD-1抗体との併用によりCD8 T細胞の働きを促進した。マウス大腸癌細胞株（CT26）を5.0×105cellsでBALB/cAjclマウスの腹部両側皮下に移植し、腫瘍が42～135mm3（平均70mm3）になるまで５日間成長させた。腫瘍成長後にVGF-Luc/O1L-lacZとVGF-Luc/K2Lmut/O1L-lacZを隔日３回 5.0×107PFUで片側の腫瘍内へ直接投与した（Day0, 2, 4）。加えて、PBSあるいはInVivoPlus anti-mouse PD-1 Clone RMP1-14（BioXCell）をDay 3, 5, 7, 9, 11に200μg / mouse腹腔内投与した（図１７）。この際、ワクシニアウイルス投与の翌日に抗体を投与した。ワクシニアウイルス投与２回目からワクシニアウイルスと抗体を１日ごとに交互に投与する形でウイルスは計３回、抗体は計５回投与した。腫瘍体積の測定により治療効果を検証した結果を図１８に記す。
　抗体非投与時には、図９と同様ウイルス投与側ではVGF-Luc/O1L-lacZ投与マウス及びVGF-Luc/K2Lmut/O1L-lacZ投与マウスの両方で腫瘍体積が抑えられており、Two-Way ANOVA統計解析によりPBS投与マウスと比較して有意に差があることが分かった（***P<0.001）。また非投与側も図９と同様、VGF-Luc/K2Lmut/O1L-lacZ投与によりPBS投与もしくはVGF-Luc/O1L-lacZ投与時以上の腫瘍抑制効果を得られたものの、ほとんどのマウスで腫瘍を寛解させるには至らなかった。一方で抗PD-1抗体を併用した場合には、ウイルス投与側ではウイルス投与時の腫瘍抑制効果が強まり、VGF-Luc/O1L-lacZ投与では3/5匹、VGF-Luc/K2Lmut/O1L-lacZ投与では全て（6/6匹）のマウスで投与した腫瘍を寛解させた。さらにウイルス非投与側においても抗PD-1抗体の併用はウイルスの治療効果を大きく増強させたが、VGF-Luc/O1L-lacZ投与マウスでは非投与側の腫瘍を寛解させるには至らなかった。一方でVGF-Luc/K2Lmut/O1L-lacZ投与マウスはVGF-Luc/O1L-lacZ投与マウスよりも有意に腫瘍体積を抑えていることがTwo-Way ANOVA統計解析により確認され（***<0.001）、3/6匹のマウスで投与・非投与側両方の腫瘍を寛解させた。図１９に抗PD-1抗体併用マウスのウイルス投与後の生存曲線を示す。Log-rank統計解析により、抗体非投与時にはVGF-Luc/K2Lmut/O1L-lacZ投与マウスはPBS投与マウスと比べ有意に生存期間を延長させていたが（*：P=0.0112）、VGF-Luc/O1L-lacZ投与マウスとの有意な差はなかった。一方抗PD-1抗体併用時には、VGF-Luc/K2Lmut/O1L-lacZ投与マウスはPBS投与マウス及びVGF-Luc/O1L-lacZ投与マウスの両方と比較しても有意な延命効果を示すこと確認できた（***：P=0.0007、**：P=0.0066）。
　続いて腫瘍が完治したマウスの腫瘍への免疫記憶の有無を確認するため、完治マウスへの腫瘍細胞の再移植を行った。VGF-Luc/K2Lmut/O1L-lacZと抗PD-1抗体の併用投与により腫瘍が寛解したマウスに対し、ウイルス投与から101日目にマウス大腸癌細胞株（CT26）を5.0×105cellsで腹部両側皮下へ再度移植した。また、比較のため同週齢のナイーブBALB/cAjclマウスに対しても同様の腫瘍細胞皮下移植を行った。図２０に腫瘍再移植後の腫瘍径の推移を示す。比較用マウスは図９までと同様の腫瘍成長を示したが、腫瘍完治後に再移植したマウスでは腫瘍の成長は全く見られなかった。
　以上より、抗PD-1抗体の併用は細胞融合能を有するワクシニアウイルスの治療効果を大きく増強し、抗腫瘍免疫の誘導及び免疫記憶の定着を促すことが示唆された。
　感染した細胞の細胞融合を誘導するワクシニアウイルスは、癌治療のために用いることができる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
１～４、７、８、１０～１３、１６～１９　プライマー

Claims (17)

  1. 　感染した細細に細胞融合を引き起こすように変異したワクシニアウイルス。
  2. 　K2L遺伝子又はHA遺伝子、あるいはK2L遺伝子及びHA遺伝子の機能が欠損しており、感染した細胞に細胞融合を引き起こし、細胞死を誘導する、請求項１記載のワクシニアウイルス。
  3. 　腫瘍溶解性ワクシニアウイルスである、請求項１又は２に記載のワクシニアウイルス。
  4. 　正常細胞内では増殖しないが、癌細胞内で特異的に増殖し、癌細胞を特異的に障害する腫瘍溶解性を有する請求項３記載のワクシニアウイルス。
  5. 　ワクシニアウイルスが、LC16株、LC16mO株又はB5R遺伝子が発現するように改変されたLC16m8株である、請求項１～４のいずれか１項に記載のワクシニアウイルス。
  6. 　請求項１～５のいずれか１項に記載のワクシニアウイルスを含む癌治療のための医薬組成物。
  7. 　請求項１～５のいずれか１項に記載のワクシニアウイルスに外来DNAを導入した、ワクシニアウイルスベクター。
  8. 　外来DNAがマーカーDNA、細胞毒性効果若しくは免疫賦活効果を有する治療用遺伝子、又は癌、ウイルス、細菌若しくは原虫の抗原をコードするDNAである、請求項７記載のワクシニアウイルスベクター。
  9. 　請求項７又は８に記載のワクシニアウイルスベクターを含む、癌治療のための、又は癌、ウイルス、細菌若しくは原虫に対するワクチンとして使用するための医薬組成物。
  10. 　ワクシニアウイルスのK2L遺伝子又はHA遺伝子、あるいはK2L遺伝子及びHA遺伝子の機能を欠損させることを含む、感染した細胞に細胞融合を引き起こし、細胞死を誘導するワクシニアウイルスの製造方法。
  11. 　腫瘍溶解性ワクシニアウイルスである、請求項１０記載の製造方法。
  12. 　さらに、ワクシニアウイルス増殖因子（VGF)遺伝子又はO1L遺伝子、あるいはワクシニアウイルス増殖因子（VGF)遺伝子及びO1L遺伝子の機能を欠損させることを含む、請求項１０又は１１に記載の製造方法。
  13. 　ワクシニアウイルスが、LC16株、LC16mO株又はB5R遺伝子が発現するように改変されたLC16m8株である、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の製造方法。
  14. 　請求項１～５のいずれか１項に記載のワクシニアウイルスを免疫チェックポイント阻害剤と組合せて含む、がん治療のための組合せ医薬キット。
  15. 　免疫チェックポイント阻害剤が抗PD-1抗体又は抗PD-L1抗体である、請求項１４記載の組合せ医薬キット。
  16. 　免疫チェックポイント阻害剤とがん治療のために併用するための、請求項１～５のいずれか１項に記載のワクシニアウイルス。
  17. 　免疫チェックポイント阻害剤が抗PD-1抗体又は抗PD-L1抗体である、請求項１６記載のワクシニアウイルス。
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