WO2020209389A1

WO2020209389A1 - 生体組織様構造体の製造方法

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Publication number: WO2020209389A1
Application number: PCT/JP2020/016642
Authority: WO
Inventors: 秀行日吉; 泰佑持田; 則子山添; 順司山浦; 太郎豊田; 周平小長谷
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd; Kyoto University NUC
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd; Kyoto University NUC
Priority date: 2019-04-10
Filing date: 2020-04-09
Publication date: 2020-10-15
Anticipated expiration: 2021-10-10
Also published as: CA3136401A1; KR20210151903A; BR112021020115A2; EP3954436A1; JPWO2020209389A1; TW202104590A; US12268715B2; AU2020270703B2; IL287063B1; EP3954436B1; EP3954436A4; IL287063A; SG11202111123SA; JP2025000878A; US20220168357A1; AU2020270703A1; JP7630830B2; CN113993528A; IL287063B2

Abstract

本発明は、多能性幹細胞から誘導される分化細胞を包含する生体組織様構造体の新規製造方法を提供することを目的とし、多能性幹細胞由来の細胞を生体適合性材料中に分散して配置された含む組成物を、生体組織中に移植することにより、細胞を分化誘導し、ホスト由来の血管や結合組織と共に、生体組織様構造体を形成させる方法を提供する。

Description

生体組織様構造体の製造方法

　本発明は、多能性幹細胞由来の分化細胞より構成される生体組織様構造体、ならびに、その製造法及び用途に関する。

　人工多能性細胞や胚性幹細胞（ＥＳ細胞）等の多能性幹細胞から誘導される機能性分化細胞は、移植再生医療の細胞供給源として期待されている。今日では、組織工学を用いた移植治療に向け、そのような機能性分化細胞を利用して生体器官や組織と同等又は類似する機能を有する構造体（以下、「生体組織様構造体」と記載する）を構築する試みがなされている。しかしながら、厚みのある、３次元的な構造体を作製しようとした場合、全ての細胞に酸素や栄養分等を十分に供給することができない場合があり、構造体中の細胞を維持・管理することはｉｎ　ｖｉｔｒｏ及びｉｎ　ｖｉｖｏのいずれにおいても容易ではなかった。そのため、従来の構造体にはその厚みや大きさに制限があり、生体器官や組織と同等又は類似する機能を発揮するには十分ではない場合があった。当該分野においては依然として、厚みのある、３次元的な生体組織様構造体を簡便に作製することができる新たな手法が切望されていた。

　人工多能性細胞や胚性幹細胞等の多能性幹細胞から、膵β細胞や膵α細胞といったホルモン分泌を行う内分泌細胞を分化誘導し、糖尿病の治療に応用する研究が進められている。これまでに、多能性幹細胞から膵前駆細胞へと分化誘導し、それを生体内に移植し、成熟化させることで内分泌細胞を製造する手法が報告されている。例えば、非特許文献１には、多能性幹細胞から分化誘導された、膵前駆細胞をマウスに移植し、成熟化させることでインスリン陽性細胞及びグルカゴン陽性細胞を含む内分泌細胞を製造する方法が記載されている。しかしながら、これまでにインスリン陽性細胞やグルカゴン陽性細胞などの内分泌細胞を含み、厚みがあり、膵管（ｄｕｃｔ）や嚢胞（ｃｙｓｔ）を含まない、３次元的な生体組織様構造体は製造されていない。

Ｒｏｂｅｒｔ　Ｔ　ｅｔ　ａｌ，Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ．２０１８　Ｍａｒ　１３；１０（３）：７３９−７５０．

　本発明は、多能性幹細胞から誘導される分化細胞を包含する生体組織様構造体の新規製造方法を提供することを目的とする。

　本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、生体適合性材料中に分散して配置された多能性幹細胞由来の細胞を含む組成物を、生体組織中に移植することにより、細胞は生着し、分化誘導され成熟し、ホスト由来の血管や結合組織と共に、生体組織様構造体を構築できることを見出した。

　本発明はこれらの知見に基づくものであり、以下の発明を包含する。
［１］　生体組織様構造体をホスト動物の生体組織内に作製する方法において使用される、生体適合性材料とヒト多能性幹細胞由来の細胞とを含む組成物であって、ヒト多能性幹細胞由来の細胞が生体適合性材料中に分散して配置されている、組成物。
［２］　生体適合性材料がフィブリンゲルである、［１］の組成物。
［３］　フィブリンゲルが、前記組成物の使用の直前に、ヒト多能性幹細胞由来の細胞とフィブリノーゲンとトロンビンを混合してゲル化されたものである、［２］の組成物。
［４］　ヒト多能性幹細胞由来の細胞が複数のスフェロイドの形態で存在する、［１］~［３］のいずれかの組成物。
［５］　ヒト多能性幹細胞由来の細胞におけるＫｉ６７陽性細胞の割合が３％未満である、［１］~［４］のいずれかの組成物。
［６］　ヒト多能性幹細胞由来の細胞がインスリン産生細胞である、［１］~［５］のいずれかの組成物。
［７］　前記方法が、前記組成物をホスト動物の生体組織中に移植して、生体適合性材料中に分散して配置されたヒト多能性幹細胞由来の細胞を分化誘導することを含む、［１］~［６］のいずれかの組成物。
［８］　ホスト動物の生体組織が皮下組織である、［７］の組成物。
［９］　生体組織様構造体が、ヒト多能性幹細胞由来の細胞より分化誘導して得られた分化細胞からなる複数のクラスター、ホスト動物由来の結合組織、ならびにホスト動物由来の血管を含み、該分化細胞からなる複数のクラスターが生体組織様構造体中に分散して存在し、該結合組織が該分化細胞からなる複数のクラスターの周囲を取り囲み、該血管が該分化細胞からなる複数のクラスターへと侵入している、［１］~［８］のいずれかの組成物。
［１０］　前記分化細胞が外分泌細胞を含まない、［９］の組成物。
［１１］　ヒト多能性幹細胞由来の細胞より分化誘導して得られた分化細胞からなる複数のクラスター、ホスト動物由来の結合組織、ならびにホスト動物由来の血管を含む生体組織様構造体であって、該分化細胞からなる複数のクラスターが生体組織様構造体中に分散して存在し、該結合組織が該分化細胞からなる複数のクラスターの周囲を取り囲み、該血管が該分化細胞からなる複数のクラスターへと侵入している、生体組織様構造体。
［１２］　前記分化細胞が膵β細胞を含む、［１１］の生体組織様構造体。
［１２−Ａ］前記分化細胞が膵β細胞及び膵α細胞を含む、［１１］の生体組織様構造体。
［１３］　前記分化細胞が外分泌細胞を含まない、［１１］~［１２−Ａ］のいずれかの生体組織様構造体。
［１４］　前記生体組織様構造体が移植された被検体の血糖値を正常値にコントロールするために用いられる、［１１］~［１４］のいずれかの生体組織様構造体。
［１５］　生体組織様構造体の製造方法であって、
　生体適合性材料とヒト多能性幹細胞由来の細胞とを含む組成物であって、ヒト多能性幹細胞由来の細胞が生体適合性材料中に分散して配置されている、組成物をホスト動物の生体組織中に移植して分化誘導することを含む、方法。
［１６］　生体適合性材料がフィブリンゲルである、［１５］の方法。
［１７］　フィブリンゲルが、前記組成物の使用の直前に、ヒト多能性幹細胞由来の細胞とフィブリノーゲンとトロンビンを混合してゲル化される、［１６］の方法。
［１８］　ヒト多能性幹細胞由来の細胞が複数のスフェロイドの形態で存在する、［１５］~［１７］のいずれかの方法。
［１９］　ヒト多能性幹細胞由来の細胞におけるＫｉ６７陽性細胞の割合が３％未満である、［１５］~［１８］のいずれかの方法。
［２０］　ヒト多能性幹細胞由来の細胞がインスリン産生細胞である、［１５］~［１９］のいずれかの方法。
［２１］　ホスト動物の生体組織が皮下組織である、［１５］~［２０］のいずれかの方法。
［２２］　生体組織様構造体が、分散したヒト多能性幹細胞由来の細胞より分化誘導して得られた分化細胞からなる複数のクラスター、ホスト動物由来の結合組織、ならびにホスト動物由来の血管を含み、該分化細胞からなる複数のクラスターが生体組織様構造体中に分散して存在し、該結合組織が該分化細胞からなる複数のクラスターの周囲を取り囲み、該血管が該分化細胞からなる複数のクラスターへと侵入している、［１５］~［２１］のいずれかの方法。
［２３］　前記分化細胞が外分泌細胞を含まない、［１５］~［２２］のいずれかの方法。

　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１９−０７５１００号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。

　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

　本発明によれば、多能性幹細胞から誘導される分化細胞を包含する生体組織様構造体の新規製造方法を提供することができる。

図１は移植前のインスリン産生細胞について、フローサイトメトリーによりタンパク質発現を解析した結果を示す。図２はインスリン産生細胞が分散されたフィブリンゲルを移植したストレプトゾトシン（ＳＴＺ）により糖尿病を誘発した免疫不全ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける血中ヒトＣ−ペプチド濃度（Ａ）及び血糖値（Ｂ）を経時的に測定した結果を示す。図３はストレプトゾトシン（ＳＴＺ）により糖尿病を誘発した免疫不全ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの生体内に形成されたインスリン産生細胞由来生体組織様構造体のグルコース負荷に対する応答の解析結果を示す。グルコース負荷後の血中ヒトＣ−ペプチド濃度（Ａ）および血漿中グルコース濃度（Ｂ）を経時的に測定した結果を示す。図４は移植から６ヶ月後に生体内より摘出されたインスリン産生細胞由来生体組織様構造体の写真図を示す。図５は移植から６ヶ月後に生体内より摘出されたインスリン産生細胞由来生体組織様構造体のＨＥ染色像を示す。図６は移植から６ヶ月後に生体内より摘出されたインスリン産生細胞由来生体組織様構造体のマッソントリクローム染色像を示す。図７は移植から６ヶ月後に生体内より摘出されたインスリン産生細胞由来生体組織様構造体のヒト核（ＨｕＮ）及びＰＤＸ１の免疫組織染色像を示す。図８は移植から６ヶ月後に生体内より摘出されたインスリン産生細胞由来生体組織様構造体のインスリン（ＩＮＳ）及びグルカゴン（ＧＣＧ）の免疫組織染色像を示す。図９は移植から６ヶ月後に生体内より摘出されたインスリン産生細胞由来生体組織様構造体のマウスＣＤ３１（ｍＣＤ３１）及びクロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）の免疫組織染色像を示す。図１０は移植から６ヶ月後に生体内より摘出されたインスリン産生細胞由来生体組織様構造体のヒト核（ＨｕＮ）及びＫｉ６７の免疫組織染色像を示す。矢印：Ｋｉ６７陽性細胞。図１１はストレプトゾトシン（ＳＴＺ）により糖尿病を誘発した免疫不全ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに対してフィブリンゲルに分散させたインスリン産生細胞を移植し、移植後に経時的に測定した血中ヒトＣ−ペプチド、グルカゴンおよび血糖値を示す。図１２はストレプトゾトシン（ＳＴＺ）により糖尿病を誘発した免疫不全ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス及び非糖尿病のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに対してフィブリンゲルに分散させたインスリン産生細胞を移植し、移植から２８週後に生体内より摘出したインスリン産生細胞由来生体組織様構造体におけるインスリンおよびグルカゴン含量の測定結果を示す。上段はインスリン含量の測定結果、下段はグルカゴン含量の測定結果を示し、また、各段において左は各マウスの膵臓における各ホルモン含量の測定結果（対照）を示し、右は摘出したインスリン産生細胞由来生体組織様構造体における各ホルモン含量の測定結果を示す。図１３はフィブリンゲルに分散させたインスリン産生細胞を移植して高血糖が完全に改善したＡｋｉｔａ遺伝子変異を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに対し、グルコースを負荷した後に経時的に測定したグルカゴン及びグルカゴン様ペプチド−１を示す。図１４はフィブリンゲルに分散させたインスリン産生細胞を移植して高血糖が完全に改善したＳＴＺ糖尿病ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに対し、グルカゴン受容体アンタゴニストＭＫ−０８９３を処置した後にグルコースを負荷し、その後経時的に測定した血糖値及び血中ヒトＣ−ペプチド濃度を示す。図１５はフィブリンゲルに分散させたインスリン産生細胞を移植して高血糖が完全に改善したＡｋｉｔａ糖尿病ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに対し、グルカゴン様ペプチド−１受容体アンタゴニストＥｘｅｎｄｉｎ−９を３日間処置し、処置前後に測定した飽食時血中ヒトＣ−ペプチド濃度を示す。

１．用語
　本明細書において、「約」とは、基準値に対してプラス又はマイナスそれぞれ２５％、２０％、１０％、８％、６％、５％、４％、３％、２％又は１％まで変動する値を示す。好ましくは、「約」又は「およそ」という用語は、基準値に対してプラス又はマイナスそれぞれ１５％、１０％、５％、又は１％の範囲を示す。

　本明細書において、「~を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ）又はｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、その語句に続く要素の包含を示すがこれに限定されないことを意味する。したがって、その語句に続く要素の包含は示唆するが、他の任意の要素の除外は示唆しない。

　本明細書において、「~からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ（ｓ）　ｏｆ又はｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ　ｏｆ）」とは、その語句に続くあらゆる要素を包含し、かつ、これに限定されることを意味する。したがって、「~からなる」という語句は、列挙された要素が要求されるか又は必須であり、他の要素は実質的に存在しないことを示す。

　本明細書において、「フィーダー細胞を使用」しないとは、基本的にフィーダー細胞を含まないこと、フィーダー細胞を培養することによってプレコンディショニングした培地などを使用しないことを意味する。したがって、培地中にはフィーダー細胞から分泌される成長因子及びサイトカインなどの物質は含まれない。

　なお、「フィーダー細胞」又は「フィーダー」とは、別な種類の細胞と共培養され、その細胞を支持し、成長することができる環境をもたらす細胞を意味する。フィーダー細胞は、それらが支持する細胞とは同じ種由来であっても、異なる種由来であってもよい。例えば、ヒト細胞のフィーダーとして、ヒト皮膚線維芽細胞又はヒト胚性幹細胞を使用してもよいし、マウス胚線維芽細胞の初代培養物、及び不死化マウス胚線維芽細胞を使用してもよい。フィーダー細胞は、放射線照射又はマイトマイシンＣ処理などによって不活性化することができる。

　本明細書において、「接着」とは、細胞が容器に付着していること、例えば、細胞が適切な培地の存在下で滅菌プラスチック（又はコーティングされたプラスチック）の細胞培養ディッシュ又はフラスコに付着していることを指す。細胞のなかには、細胞培養容器に接着させなければ培養物中で維持できない、あるいは成長しないものもある。これに対し、非接着性細胞は、容器に接着させることなく培養物中で維持され、増殖できる。

　本明細書において、「培養」とは、細胞をインビトロ環境において維持し、成長させ、かつ／又は分化させることを指す。「培養する」とは、組織又は体外で、例えば、細胞培養ディッシュ又はフラスコ中で細胞を持続させ、増殖させ（成長させ）、かつ／又は分化させることを意味する。培養には２次元培養（平面培養）や、３次元培養（浮遊培養）が含まれる。

　本明細書において、「富化する（ｅｎｒｉｃｈ）」及び「富化すること（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）」とは、細胞の組成物などの組成物中の特定の構成成分の量を増加させることを指し、「富化された（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）」とは、細胞の組成物、例えば、細胞集団を説明するために使用される場合、特定の構成成分の量が、富化される前の細胞集団におけるそのような構成成分の割合と比較して増加している細胞集団を指す。例えば、細胞集団などの組成物を、標的細胞型に関して富化することができ、したがって、標的細胞型の割合は、富化される前の細胞集団内に存在する標的細胞の割合と比較して増加する。細胞集団は、当技術分野で公知の細胞選択及び選別方法によって、標的細胞型について富化することもできる。細胞集団は、本明細書に記載した特定の選別又は選択プロセスによって富化することもできる。本発明の特定の実施形態では、標的細胞集団を富化する方法により、細胞集団が標的細胞集団に関して少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％富化される。

　本明細書において、「枯渇する（ｄｅｐｌｅｔｅ）」及び「枯渇すること（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）」とは、細胞もしくは細胞の組成物などの組成物中の特定の構成成分の量を減少させることを指し、「枯渇された（ｄｅｐｌｅｔｅｄ）」とは、細胞もしくは細胞の組成物、例えば、細胞集団を説明するために使用される場合、特定の構成成分の量が、枯渇される前の細胞集団におけるそのような構成成分の割合と比較して減少している細胞集団を指す。例えば、細胞集団などの組成物を、標的細胞型に関して枯渇させることができ、したがって、標的細胞型の割合は、枯渇される前の細胞集団内に存在する標的細胞の割合と比較して減少する。細胞集団は、当技術分野で公知の細胞選択及び選別方法によって、標的細胞型について枯渇させることもできる。細胞集団は、本明細書に記載した特定の選別又は選択プロセスによって枯渇させることもできる。本発明の特定の実施形態では、標的細胞集団を枯渇させる方法により、細胞集団は標的細胞集団に関して少なくとも５０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％減少（枯渇）している。

　本明細書において、「純化する（ｐｕｒｉｆｙ）」及び「純化すること（ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」とは、細胞の組成物などの組成物中の不純物を取り除き、特定の構成成分について純粋なものにすることを指し、「純化された（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」とは、細胞の組成物、例えば、細胞集団を説明するために使用される場合、不純物の量が、純化される前の細胞集団におけるそのような構成成分の割合と比較して減少し、特定の構成成分の純度が向上している細胞集団を指す。例えば、細胞集団などの組成物を、標的細胞型に関して純化することができ、したがって、標的細胞型の割合は、純化する前の細胞集団内に存在する標的細胞の割合と比較して増加する。細胞集団は、当技術分野で公知の細胞選択及び選別方法によって、標的細胞型について純化させることもできる。細胞集団は、本明細書に記載した特定の選別又は選択プロセスによって純化することもできる。本発明の特定の実施形態では、標的細胞集団を純化する方法により、標的細胞集団の純度は、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％になるか、不純物（夾雑細胞を含む）は検出できない程度になりうる。

　本明細書において、「ＣＤＫ８／１９阻害活性を有する因子」とは、ＣＤＫ８／１９の阻害活性を有するあらゆる物質を意味する。同じＣＤＫファミリーの他のタンパク質とは対照的に、ＣＤＫ８は、細胞増殖には必要とされず、ＣＤＫ８の阻害は、通常の条件下では大きな効果はない。ＣＤＫ１９とＣＤＫ８は類似しており、ＣＤＫ８阻害は通常ＣＤＫ１９の阻害も伴う。

　「増殖因子」は特定の細胞の分化及び／又は増殖を促す内因性タンパク質である。「増殖因子」としては、例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、インスリン様増殖因子２（ＩＧＦ−２）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、トランスフェリン、種々のインターロイキン（例えば、ＩＬ−１~ＩＬ−１８）、種々のコロニー−刺激因子（例えば、顆粒球／マクロファージコロニー−刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ））、種々のインターフェロン（例えば、ＩＦＮ−γなど）及び幹細胞に対する効果を有する他のサイトカイン、例えば、幹細胞因子（ＳＣＦ）及びエリスロポエチン（Ｅｐｏ）が挙げられる。

　本明細書において、「ＲＯＣＫ阻害剤」とは、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ：Ｒｈｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ，ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ）を阻害する物質を意味し、ＲＯＣＫ　ＩとＲＯＣＫ　ＩＩのいずれを阻害する物質であってもよい。ＲＯＣＫ阻害剤は、上記の機能を有する限り特に限定されず、例えば、Ｎ−（４−ピリジニル）−４β−［（Ｒ）−１−アミノエチル］シクロヘキサン−１α−カルボアミド（Ｙ−２７６３２と称することもある）、Ｆａｓｕｄｉｌ（ＨＡ１０７７）、（２Ｓ）−２−メチル−１−［（４−メチル−５−イソキノリニル］スルホニル］ヘキサヒドロ−１Ｈ−１，４−ジアゼピン（Ｈ−１１５２）、４β−［（１Ｒ）−１−アミノエチル］−Ｎ−（４−ピリジル）ベンゼン−１ゼンカルボアミド（Ｗｆ−５３６）、Ｎ−（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−４−イル）−４ＰＥＲ（Ｒ）−１−アミノエチル］シクロヘキサン−１α−カルボアミド（Ｙ−３０１４１）、Ｎ−（３−｛［２−（４−アミノ−１，２，５−オキサジアゾール−３−イル）−１−エチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−６−イル］オキシ｝フェニル）−４−｛［２−（４−モルホリニル）エチル］−オキシ｝ベンズアミド（ＧＳＫ２６９９６２Ａ）、Ｎ−（６−フルオロ−１Ｈ−インダゾール−５−イル）−６−メチル−２−オキソ−４−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−３，４−ジヒドロ−１Ｈ−ピリジン−５−カルボキサミド（ＧＳＫ４２９２８６Ａ）を挙げることができる。ＲＯＣＫ阻害剤はこれらに限定されるものではなく、ＲＯＣＫのｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやｓｉＲＮＡ、ＲＯＣＫに結合する抗体、ドミナントネガティブＲＯＣＫ変異体等もＲＯＣＫ阻害剤として使用することができ、商業的に入手可能であるか公知の方法に従って合成することができる。

　本明細書において、「ＧＳＫ３β阻害剤」とは、ＧＳＫ３β（グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β）に対する阻害活性を有する物質である。ＧＳＫ３（グリコーゲンシンターゼキナーゼ３）は、セリン／スレオニンプロテインキナーゼの一種であり、グリコーゲンの産生やアポトーシス、幹細胞の維持などにかかわる多くのシグナル経路に関与する。ＧＳＫ３にはαとβの２つのアイソフォームが存在する。本発明で用いられる「ＧＳＫ３β阻害剤」は、ＧＳＫ３β阻害活性を有すれば特に限定されず、ＧＳＫ３β阻害活性と合わせてＧＳＫ３α阻害活性を併せ持つ物質であってもよい。

　ＧＳＫ３β阻害剤としては、ＣＨＩＲ９８０１４（２−［［２−［（５−ニトロ−６−アミノピリジン−２−イル）アミノ］エチル］アミノ］−４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）ピリミジン）、ＣＨＩＲ９９０２１（６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］ニコチノニトリル）、ＴＤＺＤ−８（４−ベンジル−２−メチル−１，２，４−チアジアゾリジン−３，５−ジオン）、ＳＢ２１６７６３（３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）、ＴＷＳ−１１９（３−［６−（３−アミノフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イルオキシ］フェノール）、ケンパウロン（Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）、１−アザケンパウロン（Ａｚａｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）、ＳＢ２１６７６３（３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）、ＳＢ４１５２８６（３−［（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニル）アミノ］−４−（２−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）及びＡＲ−ＡＯ１４４−１８、ＣＴ９９０２１、ＣＴ２００２６、ＢＩＯ、ＢＩＯ−アセトキシム、ピリドカルバゾール−シクロペンタジエニルルテニウム複合体、ＯＴＤＺＴ、アルファ−４−ジブロモアセトフェノン、リチウム等が例示される。ＧＳＫ３βはこれらに限定されるものではなく、ＧＳＫ３βのｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやｓｉＲＮＡ、ＧＳＫ３βに結合する抗体、ドミナントネガティブＧＳＫ３β変異体等もＧＳＫ３β阻害剤として使用することができ、商業的に入手可能であるか公知の方法に従って合成することができる。

　本明細書において「血清代替物」とは、例えば、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＳｔｅｍＳｕｒｅ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｗａｋｏ）、Ｂ−２７サプリメント、Ｎ２−サプリメント、アルブミン（例えば、脂質リッチアルブミン）、インスリン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素（例えば亜鉛、セレン（例えば、亜セレン酸ナトリウム））、２−メルカプトエタノール、３’チオールグリセロール又はこれらの混合物（例えば、ＩＴＳ−Ｇ）が挙げられる。血清代替物としては、Ｂ−２７サプリメント、ＫＳＲ、ＳｔｅｍＳｕｒｅ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、ＩＴＳ−Ｇが好ましい。培地に血清代替物を添加する場合の培地中の濃度は０．０１~１０重量％、好ましくは０．１~２重量％である。本発明においては、血清に代えて「血清代替物」を使用することが好ましい。

　本明細書において「ＦＧＦＲ１阻害剤」とは、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）１に対する阻害活性を有する物質である。ＦＧＦＲ１は、成長因子であるＦＧＦ１~ＦＧＦ１７に対して高い親和性を有する受容体として、４回膜貫通型チロシンキナーゼのファミリー（ＦＧＦＲ１，２，３，４）のメンバーである。ＦＧＦＲ１阻害剤は、ＦＧＦＲ１阻害活性を有すれば特に限定されず、ＦＧＦＲ１阻害活性と合わせてその他のＦＧＦＲの阻害活性を併せ持つ物質であってもよい。本明細書において「ＦＧＦＲ１阻害剤」とは、ＦＧＦＲ１阻害活性を少しでも有している物質が含まれるが、好ましくは、ＦＧＦＲ１を５０％以上阻害する物質を指し、より好ましくはＦＧＦＲ１の５０％阻害濃度（ＩＣ_５０）が１μＭ以下、さらに好ましくは１００ｎＭ以下である物質を指す。ＦＧＦＲ１阻害活性の判定方法としては、公知の方法から選択すればよく、例えばＥｎｚｙＣｈｒｏｍ　Ｋｉｎａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（ＢｉｏＡｓｓａｙＳｙｓｔｅｍｓ社）を使った判定方法などが挙げられる。ＦＧＦＲ１阻害剤は従来公知のものを利用することが可能であり、特許文献又は非特許文献から見つけることができる。

　具体的には、本発明において利用可能なＦＧＦＲ１阻害剤としては、ＰＤ−１６６８６６（１−［２−アミノ−６−（３，５−ジメトキシフェニル）−ピリド（２，３−ｄ）ピリミジン−７−イル］−３−ｔｅｒｔ−ブチルウレア：ＣＡＳ　Ｎｏ．：１９２７０５−７９−６）、Ｅ−３８１０（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１０５８１３７−２３−７）、ＰＤ−１７３０７４（ＣＡＳ　Ｎｏ．：２１９５８０−１１−７）、ＦＧＦＲ４−ＩＮ−１（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１７０８９７１−７２−５）、ＦＧＦＲ−ＩＮ−１（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１４４８１６９−７１−８）、ＦＩＩＮ−２（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１６３３０４４−５６−０）、ＡＺＤ４５４７（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１０３５２７０−３９−３）、ＦＩＩＮ−３（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１６３７７３５−８４−２）、ＮＶＰ−ＢＧＪ３９８（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１３１０７４６−１０−１）、ＮＶＰ−ＢＧＪ３９８（ＣＡＳ　Ｎｏ．：８７２５１１−３４−７）、ＣＨ５１８３２８４（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１２６５２２９−２５−１）、Ｄｅｒａｚａｎｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１２３４３５６−６９−４）、Ｄｅｒａｚａｎｔｉｎｉｂ　Ｒａｃｅｍａｔｅ、Ｆｅｒｕｌｉｃ　ａｃｉｄ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１１３５−２４−６）、ＳＳＲ１２８１２９Ｅ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：８４８３１８−２５−２）、ＳＳＲ１２８１２９Ｅ　ｆｒｅｅ　ａｃｉｄ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：８４８４６３−１３−８）、Ｅｒｄａｆｉｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１３４６２４２−８１−６）、ＢＬＵ９９３１（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１５３８６０４−６８−０）、ＰＲＮ１３７１（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１８０２９２９−４３−６）、Ｓ４９０７６（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１２６５９６５−２２−７）、ＬＹ２８７４４５５（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１２５４４７３−６４−７）、Ｌｉｎｓｉｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：８６７１６０−７１−２）、Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：４０５１６９−１６−６）、Ａｎｌｏｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１０５８１５６−９０−３）、Ｂｒｉｖａｎｉｂ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６４９７３５−４６−６）、Ｄｅｒａｚａｎｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１２３４３５６−６９−４）、Ａｎｌｏｔｉｎｉｂ　Ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１３６０４６０−８２−７）、ＡＣＴＢ−１００３（ＣＡＳ　Ｎｏ．：９３９８０５−３０−８）、ＢＬＵ−５５４（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１７０７２８９−２１−１）、Ｒｏｇａｒａｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１４４３５３０−０５−９）、ＢＩＢＦ　１１２０　ｅｓｙｌａｔｅ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６５６２４７−１８−６）、ＴＧ　１００５７２　Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：８６７３３１−６４−４）、ＥＮＭＤ−２０７６（ＣＡＳ　Ｎｏ．：９３４３５３−７６−１）、Ｂｒｉｖａｎｉｂ　ａｌａｎｉｎａｔｅ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６４９７３５−６３−７）、ＴＧ　１００５７２（ＣＡＳ　Ｎｏ．：８６７３３４−０５−２）、ＢＩＢＦ　１１２０（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６５６２４７−１７−５）、ＥＮＭＤ−２０７６　Ｔａｒｔｒａｔｅ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１２９１０７４−８７−７）、ＴＳＵ−６８（ＣＡＳ　Ｎｏ．：２５２９１６−２９−３）、Ｐｏｎａｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：９４３３１９−７０−８）、Ｓｕｌｆａｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１３０８６７２−７４−３）、ＬＹ２７８４５４４（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１２２９２３６−８６−５）、Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ　ｌａｃｔａｔｅ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６９２７３７−８０−７）、ＳＵ　５４０２（ＣＡＳ　Ｎｏ．：２１５５４３−９２−３）、ＦＧＦ−４０１（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１７０８９７１−５５−４）、Ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ−ＩＮ−１（ＣＡＳ　Ｎｏ．：７０５９４６−２７−６）、ＰＰ５８（ＣＡＳ　Ｎｏ．：２１２３９１−５８−７）、ＴＧ　１００８０１　Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１０１８０６９−８１−２）、Ｃｒｅｎｏｌａｎｉｂ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６７０２２０−８８−９）、ＴＧ　１００８０１（ＣＡＳ　Ｎｏ．：８６７３３１−８２−６）、Ｐａｚｏｐａｎｉｂ　Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６３５７０２−６４−６）、Ｐａｚｏｐａｎｉｂ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：４４４７３１−５２−６）、ＰＤ１６８３９３（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１９４４２３−１５−９）、Ａｐａｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１２１８７７９−７５−９）、Ｐａｌｂｏｃｉｃｌｉｂｉｓｅｔｈｉｏｎａｔｅ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：８２７０２２−３３−３）、Ｆｏｒｅｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：８４９２１７−６４−７）、Ｌｅｎｖａｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：４１７７１６−９２−８）、Ｔａｎｄｕｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：３８７８６７−１３−２）、等又はその塩（これらの化合物を、化合物群Ｄとする）が例示される。また、これらの化合物は、ＦＧＦＲ１阻害活性を有する限り、好ましくはＦＧＦＲ１の５０％阻害濃度（ＩＣ_５０）が１００ｎＭ以下である限り、上記より選択される一又は複数の置換基を有していてもよい。
　また、これらの化合物は、ＦＧＦＲ１阻害活性を有する限り、好ましくはＦＧＦＲ１の５０％阻害濃度（ＩＣ_５０）が１００ｎＭ以下である限り、一部の部分構造（置換基、環等）が変換されていてもよい。

　好ましくは、本発明においてＦＧＦＲ１阻害剤は、ＣＡＳ１９２７０５−７９−６（１−［２−アミノ−６−（３，５−ジメトキシフェニル）−ピリド（２，３−ｄ）ピリミジン−７−イル］−３−ｔｅｒｔ−ブチルウレア：ＣＡＳ　Ｎｏ．：１９２７０５−７９−６）、Ｅ−３８１０（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１０５８１３７−２３−７）、ＰＤ１７３０７４（ＣＡＳ　Ｎｏ．：２１９５８０−１１−７）である。

　ＦＧＦＲ１阻害剤は上記に示した化合物に限定されるものではなく、ＦＧＦＲ１のｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやｓｉＲＮＡ、ＦＧＦＲ１に結合する抗体、ドミナントネガティブＦＧＦＲ１変異体等もＦＧＦＲ１阻害剤として使用することができ、商業的に入手可能であるか公知の方法に従って合成することができる。

　本明細書において、「マーカー」とは、「マーカータンパク質」、「マーカー遺伝子」など、所定の細胞型により特異的に発現される細胞抗原又はその遺伝子を意味する。好ましくは、マーカーは細胞表面マーカーであり、その場合、生存細胞の濃縮、単離、及び／又は検出が実施可能となる。マーカーは、陽性選択マーカー、又は陰性選択マーカーでありうる。

　マーカータンパク質の検出は、当該マーカータンパク質に特異的な抗体を用いた免疫学的アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫染色、フローサイトメトリーを利用して行うことができる。マーカー遺伝子の検出は、当該分野で公知の核酸増幅方法及び／又は核酸検出方法、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ、バイオチップ等を利用して行うことができる。本明細書中において、マーカータンパク質が「陽性」であるとは、フローサイトメトリーで陽性と検出されることを意味し、「陰性」とは、フローサイトメトリーで検出限界以下であることを意味する。また、マーカー遺伝子が「陽性」であるとは、ＲＴ−ＰＣＲにより検出されることを意味し、「陰性」とはＲＴ−ＰＣＲで検出限界以下であることを意味する。

　本明細書において、「発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」とは、細胞内のプロモーターにより駆動される特定のヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳として定義される。

　本明細書において、「細胞」とは特記しない限り、細胞の組成物、すなわち細胞集団を意味する。したがって、「細胞」には特定の細胞だけでなく、一又は複数の別の細胞も含まれ得る。「細胞」における特定の細胞は、富化又は純化することによって、あるいは一又は複数の別の細胞を枯渇することによって高めることができる。
　また、本明細書において、「細胞」とは、ヒト細胞が好ましい。

２．多能性幹細胞由来の細胞と生体適合性材料を含む組成物
２−１．多能性幹細胞由来の細胞
　本明細書において、「多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）」とは、種々の異なった形態や機能を持つ組織や細胞に分化でき、３胚葉のどの系統の細胞にも分化し得る能力を意味する。「多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）」は、胚盤には分化できず、したがって個体を形成する能力はないという点で、胚盤を含めて、生体のあらゆる組織に分化しうる「全能性（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）」とは区別される。

　本明細書において「多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）」とは、複数の限定的な数の系統の細胞へと分化できる能力を意味する。例えば、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞はｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔだが、ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔではない。

　本明細書において、「多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）」とは、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）及びこれと同様の分化多能性、すなわち生体の様々な組織（内胚葉、中胚葉、外胚葉の全て）に分化する能力を潜在的に有する細胞を指す。ＥＳ細胞と同様の分化多能性を有する細胞としては、「人工多能性幹細胞」（本明細書中、「ｉＰＳ細胞」と称することもある）が挙げられる。好ましくは、本発明において、多能性幹細胞とはヒト多能性幹細胞である。

　「ＥＳ細胞」としては、マウスＥＳ細胞であれば、ｉｎＧｅｎｉｏｕｓ社、理研等が樹立した各種マウスＥＳ細胞株が利用可能であり、ヒトＥＳ細胞であれば、ＮＩＨ、理研、京都大学、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ社が樹立した各種ヒトＥＳ細胞株が利用可能である。たとえばＥＳ細胞株としては、ＮＩＨのＣＨＢ−１~ＣＨＢ−１２株、ＲＵＥＳ１株、ＲＵＥＳ２株、ＨＵＥＳ１~ＨＵＥＳ２８株等、ＷｉｓＣｅｌｌ　ＲｅｓｅａｒｃｈのＨ１株、Ｈ９株、理研のＫｈＥＳ−１株、ＫｈＥＳ−２株、ＫｈＥＳ−３株、ＫｈＥＳ−４株、ＫｈＥＳ−５株、ＳＳＥＳ１株、ＳＳＥＳ２株、ＳＳＥＳ３株等を利用することができる。

　「人工多能性幹細胞」とは、哺乳動物体細胞又は未分化幹細胞に、特定の因子（核初期化因子）を導入して再プログラミングすることにより得られる細胞を指す。現在、「人工多能性幹細胞」にはさまざまなものがあり、山中らにより、マウス線維芽細胞にＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃの４因子を導入することにより、樹立されたｉＰＳ細胞（Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ　Ｓ．，Ｃｅｌｌ，（２００６）１２６：６６３−６７６）のほか、同様の４因子をヒト線維芽細胞に導入して樹立されたヒト細胞由来のｉＰＳ細胞（Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ　Ｓ．，ｅｔ　ａｌ．Ｃｅｌｌ，（２００７）１３１：８６１−８７２．）、上記４因子導入後、Ｎａｎｏｇの発現を指標として選別し、樹立したＮａｎｏｇ−ｉＰＳ細胞（Ｏｋｉｔａ，Ｋ．，Ｉｃｈｉｓａｋａ，Ｔ．，ａｎｄ　Ｙａｍａｎａｋａ，Ｓ．（２００７）．Ｎａｔｕｒｅ　４４８，３１３−３１７．）、ｃ−Ｍｙｃを含まない方法で作製されたｉＰＳ細胞（Ｎａｋａｇａｗａ　Ｍ，Ｙａｍａｎａｋａ　Ｓ．，ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（２００８）２６，１０１−１０６））、ウイルスフリーで６因子を導入して樹立されたｉＰＳ細胞（Ｏｋｉｔａ　Ｋ　ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　２０１１　Ｍａｙ；８（５）：４０９−１２，Ｏｋｉｔａ　Ｋ　ｅｔ　ａｌ．Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ．３１（３）：４５８−６６．）も用いることができる。また、Ｔｈｏｍｓｏｎらにより作製されたＯＣＴ３／４・ＳＯＸ２・ＮＡＮＯＧ・ＬＩＮ２８の４因子を導入して樹立された人工多能性幹細胞（Ｙｕ　Ｊ．，Ｔｈｏｍｓｏｎ　ＪＡ．ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００７）３１８：１９１７−１９２０．）、Ｄａｌｅｙらにより作製された人工多能性幹細胞（Ｐａｒｋ　ＩＨ，Ｄａｌｅｙ　ＧＱ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００７）４５１：１４１−１４６）、桜田らにより作製された人工多能性幹細胞（特開２００８−３０７００７号）等も用いることができる。

　このほか、公開されているすべての論文（例えば、Ｓｈｉ　Ｙ．，Ｄｉｎｇ　Ｓ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ，（２００８）Ｖｏｌ３，Ｉｓｓｕｅ　５，５６８−５７４；、Ｋｉｍ　ＪＢ．，Ｓｃｈｏｌｅｒ　ＨＲ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，（２００８）４５４，６４６−６５０；Ｈｕａｎｇｆｕ　Ｄ．，Ｍｅｌｔｏｎ，ＤＡ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（２００８）２６，Ｎｏ　７，７９５−７９７）、あるいは特許（例えば、特開２００８−３０７００７号、特開２００８−２８３９７２号、ＵＳ２００８／２３３６６１０、ＵＳ２００９／０４７２６３、ＷＯ２００７／０６９６６６、ＷＯ２００８／１１８２２０、ＷＯ２００８／１２４１３３、ＷＯ２００８／１５１０５８、ＷＯ２００９／００６９３０、ＷＯ２００９／００６９９７、ＷＯ２００９／００７８５２）に記載されている当該分野で公知の人工多能性幹細胞のいずれも用いることができる。

　人工多能性細胞株としては、ＮＩＨ、理化学研究所（理研）、京都大学等が樹立した各種ｉＰＳ細胞株が利用可能である。例えば、ヒトｉＰＳ細胞株であれば、理研のＨｉＰＳ−ＲＩＫＥＮ−１Ａ株、ＨｉＰＳ−ＲＩＫＥＮ−２Ａ株、ＨｉＰＳ−ＲＩＫＥＮ−１２Ａ株、Ｎｉｐｓ−Ｂ２株、京都大学のＦｆ−ＷＪ−１８株、Ｆｆ−Ｉ０１ｓ０１株、Ｆｆ−Ｉ０１ｓ０２株、Ｆｆ−Ｉ０１ｓ０４株、Ｆｆ−Ｉ０１ｓ０６株、Ｆｆ−Ｉ１４ｓ０３株、Ｆｆ−Ｉ１４ｓ０４株、ＱＨＪＩ０１ｓ０１株、ＱＨＪＩ０１ｓ０４株、ＱＨＪＩ１４ｓ０３株、ＱＨＪＩ１４ｓ０４株、ＲＷＭＨ１５ｓ０２株、Ｆｆ−ＭＨ１５ｓ０２株、２５３Ｇ１株、２０１Ｂ７株、４０９Ｂ２株、４５４Ｅ２株、６０６Ａ１株、６１０Ｂ１株、６４８Ａ１株、ＣＤＩ社のＭｙＣｅｌｌ　ｉＰＳ　Ｃｅｌｌｓ（２１５２５．１０２．１０Ａ）株、ＭｙＣｅｌｌ　ｉＰＳ　Ｃｅｌｌｓ（２１５２６．１０１．１０Ａ）株、等が挙げられる。

　本明細書において、「多能性幹細胞由来の細胞」とは、多能性幹細胞より分化誘導して得られた細胞を意味し、このような細胞としては、多能性幹細胞より分化誘導された外胚葉系統の細胞、中胚葉系統の細胞、もしくは内胚葉系統の細胞、またはそれらの組み合わせからなる細胞が挙げられる。より詳細には、多能性幹細胞より分化誘導された、表皮、神経、脳、脊髄、食道、胃、小腸、大腸、膀胱、尿道、肺、甲状腺、膵臓、肝臓、筋肉、骨格、心臓、血管、脾臓、腎臓等（これらに限定はされない）の器官や組織を構成する細胞やその前駆細胞と同等又は類似する機能を有する細胞を意味する。

　好ましくは本発明において「多能性幹細胞由来の細胞」は、細胞同士が集合・凝集化した細胞集合体の状態、すなわちスフェロイドの形態を有する。多能性幹細胞由来の細胞のスフェロイドは浮遊培養等の従来公知の手法により作製することが可能であり、あるいは」、培養底面に微細空間が配置されたスフェロイド形成用の培養プレート（例えば、商品名：エルプラシア（株式会社クラレ）、商品名：ＥＺＳＰＨＥＲＥ（ＡＧＣテクノグラス株式会社）、商品名：Ｃｏｒｎｉｎｇスフェロイドマイクロプレート（コーニングインターナショナル株式会社）を使用してもよい。スフェロイドは直径が約１０μｍ~１０００μｍ、好ましくは約５０μｍ~５００μｍ、より好ましくは約５０μｍ~３００μｍ、さらに好ましくは約５０μｍ~２００μｍ程度の大きさを有する。ならびに／あるいは、スフェロイドは約１００~約１０００個、好ましくは約２００~約８００個、より好ましくは約３００個~約５００個程度の細胞からなる。

　本発明の一実施形態において「多能性幹細胞由来の細胞」は、多能性幹細胞から膵β細胞へと分化する過程において出現する、胚体内胚葉細胞、原腸管細胞、後方前腸細胞、膵前駆細胞、内分泌前駆細胞、インスリン産生細胞であり、特に好ましくはインスリン産生細胞である。

　多能性幹細胞から膵β細胞へと分化する過程においては、分化段階に応じて異なる特徴を有する細胞が出現することが知られている（ＷＯ２００９／０１２４２８、ＷＯ２０１６／０２１７３４）。例えば、この分化段階は比較的未分化な順に、多能性幹細胞、胚体内胚葉細胞、原腸管細胞、後方前腸細胞、膵前駆細胞、内分泌前駆細胞、インスリン産生細胞、膵β細胞に大きく分類することができる。

　「胚体内胚葉細胞」とは、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＢＭＰ２、ＣＥＲ、及びＣＸＣＲ４の少なくとも一つのマーカーの発現によって特徴付けられる細胞を意味する。

　「原腸管細胞」とは、ＨＮＦ１Ｂ、及びＨＮＦ４Ａの少なくとも一つのマーカーの発現によって特徴付けられる細胞を意味する。

　「後方前腸細胞」とは、ＰＤＸ−１、ＨＮＦ６、及びＨＬＸＢ９の少なくとも一つのマーカーの発現によって特徴付けられる細胞を意味する。

　「膵前駆細胞」とは、ＰＤＸ−１、ＮＫＸ６．１、ＰＴＦ−１α、ＧＡＴＡ４及びＳＯＸ９の少なくとも一つのマーカーの発現によって特徴付けられる細胞を意味する。

　「内分泌前駆細胞」とは、クロモグラニンＡ、ＮｅｕｒｏＤ及びＮＧＮ３の少なくとも一つのマーカーの発現、及び膵関連のホルモン系（例えば、インスリン等）のマーカーが発現していないことによって特徴付けられる細胞を意味する。内分泌前駆細胞は、ＰＡＸ−４、ＮＫＸ２−２、Ｉｓｌｅｔ−１、ＰＤＸ−１、ＰＴＦ−１αなどのマーカーが発現していてもよい。

　「インスリン産生細胞」は、インスリンのマーカーの発現によって特徴付けられる細胞を意味する。より詳細には、「インスリン産生細胞」は、インスリン及びＮＫＸ６．１の両方のマーカーを発現する細胞（すなわち、インスリン陽性かつＮＫＸ６．１陽性の細胞以下、「Ｉｎｓ＋ＮＫＸ＋細胞」と記載する）を約３０％以上の割合で含み、かつマーカーとしてインスリン及びＮＫＸ６．１のうちインスリンのみを発現する細胞（すなわち、インスリン陽性かつＮＫＸ６．１陰性の細胞、以下、「Ｉｎｓ＋ＮＫＸ−細胞」と記載する）を約１５％超の割合で含むことによって特徴付けられる。インスリン産生細胞における、Ｉｎｓ＋ＮＫＸ＋細胞の割合の上限は特に限定されないが、好ましくは約５０％以下とすることができる。

　インスリン産生細胞における、Ｉｎｓ＋ＮＫＸ−細胞の割合は好ましくは約２０％以上、より好ましくは約２５％以上、さらに好ましくは約３０％以上とすることができる。また、インスリン産生細胞における、Ｉｎｓ＋ＮＫＸ−細胞の割合の上限は特に限定されないが、好ましくは約４０％以下とすることができる。

　例えば、インスリン産生細胞は、Ｉｎｓ＋ＮＫＸ＋細胞を約３０％以上、約５０％以下の割合で含み、かつＩｎｓ＋ＮＫＸ−細胞を約１５％超、約４０％以下の割合、好ましくは、約２０％以上、約４０％以下の割合、より好ましくは約２５％以上、約４０％以下の割合、さらに好ましくは約３０％以上、約４０％以下の割合で含む。

　なお、本明細書中、インスリン産生細胞における所定の細胞の割合とは、インスリン産生細胞に含まれる全細胞数に対する割合を意味する。また、各細胞の割合は、膵島様細胞への分化誘導に付される（すなわち、生体内への移植に付される）インスリン産生細胞における値を示す。

　Ｉｎｓ＋ＮＫＸ−細胞は、成熟していない（分化段階の早い）インスリン産生細胞に多く見られることから、Ｉｎｓ＋ＮＫＸ−細胞の割合が高いほど、より成熟していない（分化段階の早い）インスリン産生細胞であることを示す。

　インスリン産生細胞はさらに、以下のａ．~ｆ．：
　ａ．　ＭＡＦＡ遺伝子又はそのタンパク質の発現量が低いこと、
　ｂ．　Ｋｉ６７陽性細胞の割合が低いこと、
　ｃ．　グルカゴン陽性かつインスリン陰性細胞の割合が低いこと、
　ｄ．　グルコース刺激性インスリン分泌応答を示すこと、
　ｅ．　クロモグラニンＡ陽性細胞の割合が高いこと、
　ｆ．　アルカリフォスファターゼ陽性の多能性幹細胞の割合が低いこと、
から選択される一又は複数により特徴付けることができる。ここで「複数」とは、２，３，４，５又は６を意味する。

　ａ．　ＭＡＦＡ遺伝子又はその遺伝子産物の発現量が低いこと
　本発明におけるインスリン産生細胞は、ＭＡＦＡ遺伝子又はそのタンパク質の発現量が、膵島におけるＭＡＦＡ遺伝子又はそのタンパク質の発現量と比べて低いことを特徴とする。

　「膵島」とは、インスリン産生細胞よりも分化段階が進んだ細胞を意味し、成熟した膵β細胞を含み、成熟した膵β細胞のマーカーであるＭＡＦＡ、ＵＣＮ３、及びＩＡＰＰの少なくとも一つの発現により特徴付けられる細胞である。膵島は、健常人より単離されたものを用いることができる。

　インスリン産生細胞と膵島間のＭＡＦＡ遺伝子又はそのタンパク質の発現量の比較は、当該分野で公知の手法を用いて行うことができ、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ、バイオチップ、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫染色、フローサイトメトリー等の手法を用いて検出・定量されたＭＡＦＡ遺伝子又はそのタンパク質の発現量を、内部標準遺伝子又はそのタンパク質の発現量で補正して得られた相対値を比較することにより行うことができる。「内部標準遺伝子」は特に限定されないが、例えば、ＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、β−アクチン、β２−マイクログロブリン、ＨＰＲＴ　１（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　１）等を利用することができる。

　インスリン産生細胞におけるＭＡＦＡ遺伝子又はそのタンパク質の発現量は、膵島におけるＭＡＦＡ遺伝子又はそのタンパク質の発現量の約２０％以下、好ましくは約１５％以下、より好ましくは約１０％以下、さらに好ましくは約５％以下、とりわけ好ましくは約１％以下である。

　ＭＡＦＡ遺伝子又はそのタンパク質は成熟した膵β細胞のマーカーであることから、本特徴は本発明のインスリン産生細胞が、成熟した膵β細胞をほとんど含まないか、低い割合で含む程度の分化段階にあることを示す。

　ｂ．　Ｋｉ６７陽性細胞の割合が低いこと
　本発明におけるインスリン産生細胞は、Ｋｉ６７陽性細胞を３％未満の割合で含むことを特徴とする。

　「Ｋｉ６７陽性細胞」とは、多能性幹細胞から分化誘導されたインスリン産生細胞中に混在する、マーカーとしてＫｉ６７の発現によって特徴付けられる増殖性の高い細胞を意味する。「Ｋｉ６７」は細胞周期関連核タンパク質として公知であり、増殖中の細胞のＧ１期、Ｓ期、Ｇ２期、Ｍ期において発現が認められ、増殖を休止しているＧ０期においては発現が認められないため、細胞増殖と細胞周期のマーカーとしても知られている。

　以下、本明細書中において「Ｋｉ６７陽性」を「Ｋｉ６７＋」と記載する場合がある。また、「Ｋｉ６７陽性細胞」を「Ｋｉ６７＋細胞」と記載する場合がある。

　インスリン産生細胞におけるＫｉ６７＋細胞の割合は、約３％未満、好ましくは約１％未満、より好ましくは約０．８％未満、さらに好ましくは約０．５％未満である。

　本特徴はインスリン産生細胞において、Ｋｉ６７＋細胞の混入・残存がほとんどないか、低い割合であることを示す。Ｋｉ６７＋細胞はその増殖性の高さから、最終的に得られる生体組織様構造体への悪影響や生着に影響を及ぼす虞があり、その混入・残存は好ましくない場合がある。

　ｃ．　グルカゴン陽性かつインスリン陰性細胞の割合が低いこと
　本発明におけるインスリン産生細胞は、グルカゴン陽性かつＩｎｓ−細胞を３％未満の割合で含むことを特徴とする。以下、本明細書中において「グルカゴン陽性」を「Ｇｃｇ＋と記載する場合がある。また、「グルカゴン陽性かつインスリン陰性細胞」を「Ｇｃｇ＋Ｉｎｓ−細胞」と記載する場合がある。

　インスリン産生細胞におけるＧｃｇ＋Ｉｎｓ−細胞の割合は、約２．５％以下、好ましくは約２％以下、より好ましくは約１％以下、さらに好ましくは約０．５％以下である。

　Ｇｃｇ＋Ｉｎｓ−は成熟した膵α細胞のマーカーであることから、本特徴は本発明のインスリン産生細胞が、成熟した膵α細胞をほとんど含まないか、低い割合で含む程度の分化段階にあることを示す。

　ｄ．　グルコース刺激性インスリン分泌応答を示すこと
　本発明におけるインスリン産生細胞は、グルコース刺激性インスリン分泌（ＧＳＩＳ：Ｇｌｕｃｏｓｅ　Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ　Ｉｎｓｕｌｉｎ　Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ）応答を示す。
　インスリン産生細胞におけるＧＳＩＳ応答は、従来公知の手法（例えば、米国出願第１１／７７３，９４４号）に準じて行うことができ、例えば、培地中に分泌されるＣ−ペプチドの量を測定することにより評価することができる。Ｃ−ペプチドは、プロインスリンの成熟化の間に、インスリンに対して等モル量にて産生される分解産物である。Ｃ−ペプチドの量を測定は、例えば、抗Ｃ−ペプチドモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡにより行うことができる。

　ｅ．　クロモグラニンＡ陽性細胞の割合が高いこと
　本発明におけるインスリン産生細胞は、クロモグラニンＡ陽性細胞を約４５％超の割合で含むことを特徴とする。

　以下、本明細書中において「クロモグラニンＡ陽性」を「Ｃｈｇａ＋と記載する場合がある。また、「クロモグラニンＡ陽性細胞」を「Ｃｈｇａ＋細胞」と記載する場合がある。

　インスリン産生細胞における、Ｃｈｇａ＋細胞の割合は好ましくは約５０％以上（例えば、約５５％以上）、より好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、よりさらに好ましくは約８０％以上、とりわけ好ましくは約９０％以上とすることができる。インスリン産生細胞におけるＣｈｇａ＋細胞の割合の上限は特に限定されないが、例えば、約９９％以下とすることができる。

　Ｃｈｇａ＋細胞にはインスリン等のホルモンを分泌する細胞（内分泌細胞）が含まれ、これには上記Ｉｎｓ＋ＮＫＸ＋細胞やＩｎｓ＋ＮＫＸ−細胞も含まれる。したがって、本特徴は本発明のインスリン産生細胞が、内分泌細胞を高い割合で含むことを示す。

　ｆ．　アルカリフォスファターゼ陽性の多能性幹細胞の割合が低いこと
　本発明におけるインスリン産生細胞は、アルカリフォスファターゼ陽性の多能性幹細胞を約０．０１％未満の割合で含むことを特徴とする。

　インスリン産生細胞における、アルカリフォスファターゼ陽性の多能性幹細胞の割合は好ましくは約０．００８％以下、より好ましくは約０．００５％以下、さらに好ましくは約０．００１％以下とすることができる。

　アルカリフォスファターゼは多能性幹細胞の未分化状態を示すマーカーであることから、本特徴は本発明のインスリン産生細胞が、分化誘導されていない目的外の多能性幹細胞をほとんど含まないか、低い割合で含むことを示す。

　アルカリフォスファターゼ陽性の多能性幹細胞は、多能性を示す他のマーカーをさらに発現していてもよい。多能性幹細胞の多能性を示す他のマーカーとしては、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１等から選択される少なくとも一つを利用することができる。

　多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞、原腸管細胞、後方前腸細胞、膵前駆細胞、内分泌前駆細胞、及びインスリン産生細胞への分化誘導は、以下の分化誘導工程を利用して行うことができる：
　工程１）多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞へと分化誘導する；
　工程２）胚体内胚葉細胞から原腸管細胞へと分化誘導する；
　工程３）原腸管細胞から後方前腸細胞へと分化誘導する；
　工程４）後方前腸細胞から膵前駆細胞へと分化誘導する；
　工程５）膵前駆細胞から内分泌前駆細胞へと分化誘導する；
　工程６）内分泌前駆細胞からインスリン産生細胞へと分化誘導する。
　以下、各工程を説明するが、各細胞への分化誘導はこれらの手法に限定されない。

工程１）胚体内胚葉細胞への分化
　多能性幹細胞は、低用量のアクチビンＡを含む培地中で培養して、胚体内胚葉細胞に分化させる。

　本工程で用いる培地としては、ＲＰＭＩ培地、ＭＥＭ培地、ｉＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＭＥＭ　Ｚｉｎｃ　Ｏｐｔｉｏｎ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＭＥＭ／１％Ｂ−２７サプリメント／Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ培地、ＭＣＤＢ１３１／１０ｍＭ　Ｇｌｕｃｏｓｅ／２０ｍＭ　Ｇｌｕｃｏｓｅ／ＮａＨＣＯ_３／ＦＡＦ−ＢＳＡ／ＩＴＳ−Ｘ／Ｇｌｕｔａｍａｘ／アスコルビン酸／Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ培地など、哺乳類細胞の培養に使用される基本培地を使用することができる。

　アクチビンＡは培地中に低用量にて、例えば、５~１０ｎｇ／ｍＬの量にて含めることができる。
　別の態様として、アクチビンＡの培地中の濃度は、約０．１~１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１~５０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約３~１０ｎｇ／ｍｌである。

　培地にはさらに、ＲＯＣＫ阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤を添加することができる。

　ＧＳＫ３β阻害剤の培地中の濃度は、用いるＧＳＫ３β阻害剤の種類によって適宜設定され、例えばＧＳＫ３β阻害剤としてＣＨＩＲ９９０２１を使用する場合の濃度は、通常２~５μＭ、好ましくは２~４μＭ、特に好ましくは約３μＭである。

　ＲＯＣＫ阻害剤の培地中の濃度は、用いるＲＯＣＫ阻害剤の種類によって適宜設定されるが、例えばＲＯＣＫ阻害剤としてＹ２７６３２を使用する場合の濃度は、通常５~２０μＭ、好ましくは５~１５μＭ、特に好ましくは約１０μＭである。

　培地にはさらに、インスリンを添加することができる。インスリンは培地中に０．０１~２０μＭ、好ましくは０．１~１０μＭ、より好ましくは０．５~５μＭの量で含めることができる。培地中のインスリンの濃度は、添加したＢ−２７サプリメントに含まれるインスリンの濃度であってもよいが、これに限定されない。

　培養は２次元培養及び３次元培養のいずれで行ってもよい。培養開始時の細胞数は、特に限定されないが、２次元培養であれば、約５万~１００万細胞個／ｃｍ^２、好ましくは約１０万~８０万細胞個／ｃｍ^２、より好ましくは約１０~３０万細胞個／ｃｍ^２とすることができる。また、培養開始時の細胞数は、特に限定されないが、３次元培養であれば、約１万~１００万細胞個／ｍＬ、好ましくは約１０万~８０万細胞個／ｍＬ、より好ましくは約３０万~６０万細胞個／ｍＬとすることができる。培養期間は１日~４日、好ましくは１日~３日、特に好ましくは３日である。

　培養温度は、特に限定されないが、３０~４０℃（例えば、３７℃）で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば５％程度である。

　あるいは、本発明において胚体内胚葉細胞は、低用量のアクチビンＡの存在下、多能性幹細胞を、インスリンが作用する条件下の培地中で第１の培養を行い、続いて、インスリンが作用しない条件下の培地中で第２の培養を行うことにより製造することができる。

（１）第１の培養
　「インスリンが作用する条件」とは、インスリンによって細胞におけるインスリンシグナル伝達経路の活性化を生じる条件を意味する。通常、インスリンは、細胞膜表面上に存在するインスリンレセプターと結合し、レセプターに内在するチロシンキナーゼを活性化させ、インスリンレセプター基質タンパクファミリー（ＩＲＳ：ＩＲＳ−１，２，３）をチロシンリン酸化する。本明細書においては、インスリンとインスリンレセプターとの結合により開始されるこれら一連の反応が生じることを、「インスリンシグナル伝達経路の活性化を生じる」という。

　インスリンが作用する条件としては、例えば、培地中にインスリンを含む場合が挙げられる。インスリンは、多能性幹細胞におけるインスリンシグナル伝達経路を活性化できるものであればよく、組換え法で製造したものであっても、固相合成法で合成して製造したものであってもよい。インスリンは、ヒト、非ヒト霊長類、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ラマ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、モルモット等に由来するものを利用することができるが、好ましくはヒトインスリンである。

　本発明においては、多能性幹細胞におけるインスリンシグナル伝達経路の活性化を生じる限り、インスリン変異体、インスリン誘導体又はインスリンアゴニストも、「インスリン」として用いることができる。「インスリン変異体」とは、インスリンのアミノ酸配列において１~２０個、好ましくは１~１０個、さらに好ましくは１~５個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列からなり、かつインスリンシグナル伝達経路の活性化を生じることが可能なポリペプチドや、インスリンのアミノ酸配列と８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつインスリンシグナル伝達経路の活性化を生じることが可能なポリペプチドを有するものが挙げられる。アミノ酸配列の比較は公知の手法によって行うことができ、例えば、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ　ａｔ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等を例えば、デフォルトの設定で用いて実施できる。「インスリン誘導体」とは、インスリン又はインスリン変異体のアミノ酸残基の一部の基が化学的に置換（例えば、α−メチル化、α−ヒドロキシル化）、欠失（例えば、脱アミノ化）、又は修飾（例えば、Ｎ−メチル化）されたアミノ酸配列からなり、かつインスリンシグナル伝達経路の活性化を生じることが可能なポリペプチドまたは同様の作用を有する物質を意味する。「インスリンアゴニスト」とは、インスリンの構造に関係なく、インスリンレセプターと結合してインスリンシグナル伝達経路の活性化を生じることが可能なポリペプチドまたは同様の作用を有する物質を意味する。

　第１の培養の培地には、インスリンを０．０１~２０μＭ、好ましくは０．１~１０μＭ、より好ましくは０．５~５μＭの量で含めることができる。培地中のインスリンの濃度は、添加したＢ−２７サプリメントに含まれるインスリンの濃度であってもよいが、これに限定されない。

　培地にはさらに、ＲＯＣＫ阻害剤、及び／又はＧＳＫ３β阻害剤を含めることができる。ＲＯＣＫ阻害剤の培地中の濃度は、用いるＲＯＣＫ阻害剤の種類によって適宜設定されるが、例えばＲＯＣＫ阻害剤としてＹ−２７６３２を使用する場合の濃度は、通常５~２０μＭ、好ましくは５~１５μＭ、特に好ましくは約１０μＭとすることができる。ＧＳＫ３β阻害剤の培地中の濃度は、用いるＧＳＫ３β阻害剤の種類によって適宜設定され、例えばＧＳＫ３β阻害剤としてＣＨＩＲ９９０２１を使用する場合の濃度は、通常２~５μＭ、好ましくは２~４μＭ、特に好ましくは約３μＭとすることができる。

　培地にはさらに、ピルビン酸塩（ナトリウム塩等）、Ｌ−アラニルＬ−グルタミン、及びグルコースからなる群から選択される一以上を含めることができる。ピルビン酸塩は培地中に、１０~１０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは３０~５００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは５０~２００ｍｇ／Ｌ、特に好ましくは約１１０ｍｇ／Ｌの量で含めることができる。Ｌ−アラニルＬ−グルタミンは培地中に、５０~２０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは１００~１５００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは５００~１０００ｍｇ／Ｌ、特に好ましくは約８６０ｍｇ／Ｌの量で含めることができる。グルコースは培地中に、１５ｍＭ以上、好ましくは１５~３０ｍＭ、より好ましくは１５~２５、特に好ましくは約２５ｍＭの量で含めることができる。培地中のピルビン酸塩、Ｌ−アラニルＬ−グルタミン及びグルコースの濃度は、ＤＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ，ｈｉｇｈ　ｇｌｕｃｏｓｅ，ＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ，ｐｙｒｕｖａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））またはその他のＤＭＥＭ培地に含まれるピルビン酸塩、Ｌ−アラニルＬ−グルタミン及びグルコースの濃度であってもよいが、これに限定されない。

　培地は、上記基本培地をベースとし上記成分の一又はそれ以上を添加したものを用いることができる。基本培地としては、好ましくはＤＭＥＭ培地であり、より好ましくはピルビン酸塩、Ｌ−アラニルＬ−グルタミン、及びグルコースを上記の量で含むＤＭＥＭ培地である。

　第１の培養の培養期間は６時間~４８時間、好ましくは１２~２４時間より選択される範囲とすることができる。培養温度は、特に限定されないが、３０~４０℃（例えば、３７℃）で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば５％程度である。培養は２次元培養及び３次元培養のいずれで行ってもよい。培養開始時の細胞数は、特に限定されないが、２次元培養であれば、約５万~１００万細胞個／ｃｍ^２、好ましくは約１０万~８０万細胞個／ｃｍ^２、より好ましくは約１０~３０万細胞個／ｃｍ^２とすることができる。また、培養開始時の細胞数は、特に限定されないが、３次元培養であれば、約１万~１００万細胞個／ｍＬ、好ましくは約１０万~８０万細胞個／ｍＬ、より好ましくは約３０万~６０万細胞個／ｍＬとすることができる。

（２）第２の培養
　「インスリンが作用しない条件」とは、インスリンによる細胞におけるインスリンシグナル伝達経路の活性化が生じない条件を意味する。「細胞におけるインスリンシグナル伝達経路の活性化を生じない」とは、当該インスリンシグナル伝達経路の活性化が全く生じないことを意味するだけでなく、インスリン非存在下における当該インスリンシグナル伝達経路の活性化と比べて有意な差が認められない程度のわずかな活性化しか生じない場合も意味するものである。したがって、「インスリンが作用しない条件」とは、例えば、培地中にインスリンが含まれないこと、あるいは、培地中にインスリンが含まれる場合であっても、その量が前記有意な差が認められない程度のわずかな活性化しか生じない量で含まれる条件が挙げられる。あるいは、培地中にインスリンが含まれる場合であっても、一緒にインスリンシグナル阻害剤を含むことによって、前記インスリンシグナル伝達経路の活性化が生じない場合も意味する。「インスリンシグナル阻害剤」は、インスリンシグナル伝達経路をいずれかの位置で遮断することが可能な成分を意味する。このようなインスリンシグナル阻害剤としては、インスリン、インスリンレセプター、シグナル伝達物質として作用する各種タンパク質等に結合して又は競合し、これら因子が関与する分子間の相互作用を阻害するポリペプチドや化合物等が挙げられる。例えば、このようなインスリンシグナル阻害剤としては、ＰＩ３キナーゼの触媒サブユニットへのＡＴＰ結合を競合阻害するＬＹ２９４００２［２−（４−モルホリニル）−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン］等が挙げられる。インスリンシグナル阻害剤はこれらに限定されるものではなく、インスリン、インスリンレセプター、シグナル伝達物質として作用する各種タンパク質に結合する抗体やそれらのドミナントネガティブ型変異体、ならびにインスリンレセプターやシグナル伝達物質として作用する各種タンパク質のｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやｓｉＲＮＡ等もインスリンシグナル阻害剤として使用することができる。インスリンシグナル阻害剤は、商業的に入手可能であるか公知の方法に従って合成することができる。

　培地にはさらに、ＲＯＣＫ阻害剤、及び／又はＧＳＫ３β阻害剤を含めることができる。培地中のＲＯＣＫ阻害剤、及び／又はＧＳＫ３β阻害剤の量は上記第１の培養において記載した範囲より選択することができ、第１の培養にて用いられるのと同じ量であってもよいし、異なっていてもよい。

　培地にはさらに、ピルビン酸塩、Ｌ−アラニルＬ−グルタミン、及びグルコースからなる群から選択される一以上を含めることができる。培地中のピルビン酸塩、Ｌ−アラニルＬ−グルタミン、及びグルコースの量は上記第１の培養において記載した範囲より選択することができ、第１の培養にて用いられるのと同じ量であってもよいし、異なっていてもよい。

　第２の培養で用いる培地培地は、哺乳類細胞の培養に使用される基本培地をベースとし上記成分の一又はそれ以上を添加したものを用いることができる。基本培地としては、上記第１の培養において記載したものを用いることができ、第１の培養にて用いられるものと同じ基本培地であってもよいし、異なっていてもよい。好ましくは、ＤＭＥＭ培地であり、より好ましくはピルビン酸塩、Ｌ−アラニルＬ−グルタミン、及びグルコースを上記の量で含むＤＭＥＭ培地である。

　第２の培養の培養期間は少なくとも６時間、好ましくは６~７２時間、さらに好ましくは２４時間~７２時間より選択される範囲とすることができる。培養温度は、特に限定されないが、３０~４０℃（例えば、３７℃）で行う。培養は２次元培養及び３次元培養のいずれで行ってもよい。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば５％程度である。

　第１の培養及び第２の培養の培地には、アクチビンＡを上記低用量にて含めることができる。第１の培養及び第２の培養の培地に含まれるアクチビンＡの量は同じ量であってもよいし、異なっていてもよい。

　第１の培養及び第２の培養の培地にはさらに、ジメチルスルホキシドを添加してもよい。

　多能性幹細胞を、低用量のアクチビンＡの存在下にて培養を行うことによって、あるいは、多能性幹細胞を、低用量のアクチビンＡの存在下、インスリンが作用する条件下の培地中で第１の培養を行い、続いて、インスリンが作用しない条件下の培地中で第２の培養を行うことによって、工程６）以降にて、得られる内分泌細胞の割合を高めることができる。

工程２）原腸管細胞への分化
　工程１）で得られた胚体内胚葉細胞を、さらに増殖因子を含む培地で培養して原腸管細胞に分化誘導する。培養期間は２日~８日、好ましくは約４日である。
　培養温度は、特に限定されないが、３０~４０℃（例えば、３７℃）で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば５％程度である。培養は２次元培養及び３次元培養のいずれで行ってもよい。

　培地は、上記工程１）にて記載される、哺乳類細胞の培養に用いられる基本培地を用いることができる。培地には、増殖因子のほか、血清代替物、ビタミン、抗生物質等を適宜添加してもよい。

　増殖因子としては、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ１０が好ましく、ＥＧＦ及び／又はＫＧＦがより好ましく、ＫＧＦがさらに好ましい。

　増殖因子の培地中の濃度は、用いる増殖因子の種類によって適宜設定されるが、通常約０．１ｎＭ~１０００μＭ、好ましくは約０．１ｎＭ~１００μＭである。ＥＧＦの場合、その濃度は、約５~２０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．８~３２０ｎＭ）、好ましくは約５~１０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．８~１６０ｎＭ）、より好ましくは約１０~１０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約１．６~１６０ｎＭ）である。ＦＧＦ１０の場合、その濃度は、約５~２０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．３~１１６ｎＭ）、好ましくは約１０~１０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．６~５８ｎＭ）、より好ましくは約１０~１０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．６~５８ｎＭ）である。例えば増殖因子としてＫＧＦを使用する場合の濃度は、通常５~１５０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは３０~１００ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬである。

工程３）後方前腸細胞への分化
　工程２）で得られた原腸管細胞を、さらに増殖因子、シクロパミン、ノギン等を含む培地で培養し、後方前腸細胞に分化誘導する。培養期間は１日~５日、好ましくは約２日程度である。培養は２次元培養及び３次元培養のいずれで行ってもよい。

　シクロパミンの培地中の濃度は、特に限定するものではないが、通常０．５~１．５μＭ、好ましくは０．３~１．０μＭ、特に好ましくは約０．５μＭである。

　ノギンの培地中の濃度は、特に限定するものではないが、通常１０~２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０~１５０ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬである。
　また培地にはジメチルスルホキシドを添加してもよい。

工程４）膵前駆細胞への分化
　工程３）で得られた後方前腸細胞を、さらにＣＤＫ８／１９阻害活性を有する因子を含む培地、好ましくはＣＤＫ８／１９阻害活性を有する因子と増殖因子を含む培地で培養し、膵前駆細胞に分化誘導してもよい。培養期間は２日~１０日、好ましくは約５日程度である。培養は２次元培養及び３次元培養のいずれで行ってもよい。２次元培養の場合には、工程３）で得られた後方前腸細胞を、既報（Ｔｏｙｏｄａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１５）１４，１８５−１９７）に従い、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡで処理後にピペッティングすることにより分散し、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡを遠心分離して懸濁した後、工程４）の新しい培地に再播種する。

　培地は、工程１）と同様に、哺乳類細胞の培養に用いられる基本培地を用いることができる。培地には、増殖因子のほか、血清代替物、ビタミン、抗生物質等を適宜添加してもよい。

　ＣＤＫ８／１９阻害活性を有する因子としては、前述した各種化合物又はその塩を用いることができ、用いる化合物又はその塩に応じて、培地への添加量は適宜決定されるが、通常約０．００００１μＭ−５μＭ、好ましくは０．００００１μＭ−１μＭである。ＣＤＫ８／１９阻害活性を有する因子の培地中の濃度としては、ＣＤＫ８／１９に対して５０％以上の阻害活性に達する濃度が好ましい。

　増殖因子としては、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ１０が好ましく、ＫＧＦ及び／又はＥＧＦがより好ましく、ＫＧＦ及びＥＧＦがさらに好ましい。

　増殖因子の培地中の濃度は、用いる増殖因子の種類によって適宜設定されるが、通常約０．１ｎＭ~１０００μＭ、好ましくは約０．１ｎＭ~１００μＭである。ＥＧＦの場合、その濃度は、約５~２０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．８~３２０ｎＭ）、好ましくは約５~１０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．８~１６０ｎＭ）、より好ましくは約１０~１０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約１．６~１６０ｎＭ）である。ＦＧＦ１０の場合、その濃度は、約５~２０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．３~１１６ｎＭ）、好ましくは約１０~１０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．６~５８ｎＭ）、より好ましくは約１０~１０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．６~５８ｎＭ）である。例えば増殖因子としてＫＧＦ及びＥＧＦを使用する場合の濃度は、ＥＧＦは通常通常５~１５０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは３０~１００ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬ、ＫＧＦは通常１０~２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０~１５０ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬである。

　工程４）における培養の最初の１日はＲＯＣＫ阻害剤の存在下で行い、以後はＲＯＣＫ阻害剤を含まない培地で培養してもよい。

　また、培地にはＰＫＣ活性化剤を含めても良い。ＰＫＣ活性化剤としては、ＰｄＢＵ（ＰＫＣ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ＩＩ）、ＴＰＢ（ＰＫＣ　ａｃｔｏｖａｔｏｒ　Ｖ）などを使用するが、その限りでない。ＰＫＣ活性化剤の濃度は約０．１~１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１~５０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約３~１０ｎｇ／ｍｌで添加する。
　また、培地にはジメチルスルホキシド、アクチビン（１~５０ｎｇ／ｍｌ）を添加してもよい。

　いずれの工程においても、培地には、上記した成分のほか、血清代替物（例えば、Ｂ−２７サプリメント、ＩＴＳ−Ｇ）を添加してもよい。また、必要に応じて、アミノ酸、Ｌ−グルタミン、ＧｌｕｔａＭＡＸ（製品名）、非必須アミノ酸、ビタミン、ニコチンアミド、抗生物質（例えば、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（本明細書中、ＡＡと称することがある）、ペニシリン、ストレプトマイシン、又はこれらの混合物）、抗菌剤（例えば、アンホテリシンＢ）、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を添加してもよい。培地に抗生物質を添加する場合には、その培地中の濃度は通常０．０１~２０重量％、好ましくは０．１~１０重量％である。
　培養は２次元培養及び３次元培養のいずれで行ってもよい。培養温度は、特に限定されないが、３０~４０℃（例えば、３７℃）で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば５％程度である。

工程５）内分泌前駆細胞への分化
　工程４）で得られた膵前駆細胞を、さらに増殖因子を含む培地で培養して内分泌前駆細胞に分化誘導する。培養は２次元培養及び３次元培養のいずれで行ってもよい。２次元培養の場合には、工程４）で得られた膵前駆細胞を、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡで処理後にピペッティングすることにより分散し、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡを遠心分離して懸濁した後、工程５）の新しい培地に再播種する。培養期間は２日~３日、好ましくは約２日である。

　培地は、上記工程１）にて記載される、哺乳類細胞の培養に用いられる基本培地を用いることができる。培地には、既報（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２０１４；３２：１１２１−１１３３）に従い、ＳＡＮＴ１、レチノイン酸、ＡＬＫ５インヒビターＩＩ、Ｔ３、ＬＤＮを添加し、さらに、Ｗｎｔ阻害薬、ＲＯＣＫ阻害剤、ＦＧＦ（好ましくはＦＧＦ２）、血清代替物、ビタミン、抗生物質等を適宜添加してもよい。また、培地にはジメチルスルホキシドを添加してもよい。

　培養は、フィーダー細胞を使用せず、非接着培養にて行う。培養時には、ディッシュ、フラスコ、マイクロプレート、多孔プレート（Ｎｕｎｃ社）等あるいはバイオリアクターが使用される。培養容器は、細胞との接着性を低下させるための表面処理されていることが好ましい。
　培養温度は、特に限定されないが、３０~４０℃（例えば、３７℃）で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば５％程度である。

工程６）インスリン産生細胞への分化
　工程５）で得られた内分泌前駆細胞を、さらにＦＧＦＲ１阻害剤を含む培地で培養してインスリン産生細胞に分化誘導する。培養期間は１０日~３０日、好ましくは約１０~２０日である。

　培地は、上記工程１）にて記載される、哺乳類細胞の培養に用いられる基本培地を用いることができる。培地には、既報（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２０１４；３２：１１２１−１１３３）に従い、ＡＬＫ５インヒビターＩＩ、Ｔ３、ＬＤＮ、γ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤ＸＸ、γ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤ＲＯ、Ｎ−システイン、ＡＸＬインヒビター、アスコルビン酸を添加し、さらに、Ｗｎｔ阻害薬、ＲＯＣＫ阻害剤、ＦＧＦ（好ましくはＦＧＦ２）、血清代替物、ビタミン、抗生物質等を適宜添加してもよい。例えば、培地にはＡＬＫ５インヒビターＩＩ、Ｔ３、ＬＤＮ、γ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤ＲＯ、及びアスコルビン酸を添加してもよく、あるいはＴ３、ＡＬＫ５インヒビターＩＩ、ＺｎＳＯ_４、ヘパリン、Ｎ−アセチルシステイン、Ｔｒｏｌｏｘ、及びＲ４２８を添加してもよい。

　培養は２次元培養及び３次元培養のいずれで行ってもよい。好ましくは、培養は、フィーダー細胞を使用せず、非接着培養にて行う。培養時には、ディッシュ、フラスコ、マイクロプレート、多孔プレート（Ｎｕｎｃ社）等あるいはバイオリアクターが使用される。培養容器は、細胞との接着性を低下させるための表面処理されていることが好ましい。

　培地には、ＦＧＦＲ１阻害剤を、ＦＧＦＲ１活性を阻害することが可能な任意の量にて含めることができ、例えば、１０μＭ以下、又は５μＭ以下の量にて、好ましくは５μＭ未満、４μＭ未満、３μＭ未満、２μＭ未満の量にて含めることができる。ＦＧＦＲ１阻害剤の添加量の下限は、特に限定されないが、０．１μＭ以上、好ましくは０．５μＭ以上とすることができる。ＦＧＦＲ１阻害剤の添加量は、好ましくは、５μＭ未満０．１μＭ以上であり、より好ましくは５μＭ未満０．５μＭ以上である。ＦＧＦＲ１阻害剤の存在下における培養は、少なくとも１２時間、好ましくは２４時間以上、２日以上、４日以上、８日以上、１０日以上、又は１５日以上行うことができる。ＦＧＦＲ１阻害剤の存在下における培養は、４日以上行うことが好ましい。例えば、工程６）の最後の約４~１５日、好ましくは最後の約４~７日間について、ＦＧＦＲ１阻害剤の存在下における培養を行うことができる。ＦＧＦＲ１阻害剤による処理期間中も培地の交換は可能であり、培養スケジュールにしたがって、ＦＧＦＲ１阻害剤が添加された交換前と同じ組成を有する培地又は異なる組成を有する培地と交換することができる。
　ＦＧＦＲ１阻害剤を含む培地中で、細胞を培養することによって、得られるインスリン産生細胞におけるＫｉ６７陽性細胞の増殖を抑制することができる。

　工程６）で得られたインスリン産生細胞は、トリプシン等の酵素を用いて解離し回収することができる。回収されたインスリン産生細胞は使用するまで凍結保存することができる。次いで、回収されたインスリン産生細胞を上記培地中に、１培養器または１ウェルあたり、約５０万~５００万個、好ましくは約１００万~４００万個、より好ましくは約２００万~３００万個の量で播種して３次元培養を行い、インスリン産生細胞をスフェロイドの形態で得ることができる。各スフェロイドは約１００~約１０００個、好ましくは約２００~約８００個、より好ましくは約３００個~約５００個程度の細胞からなる。

２−２．生体適合性材料
　本明細書において「生体適合性材料」とは生体内に移植し、短期又は長期留置した場合に、顕著な免疫応答や有害な生体反応（例えば、毒性反応、凝血等）を誘導しない任意の材料を意味する。好ましくは、「生体適合性材料」は移植後、ホストの血管新生、結合組織の産生を促すものである。また、「生体適合性材料」は生分解性材料であることが好ましい。このような材料としては、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリウレタン（ＰＵ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸−ｃｏ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−ヒドロキシバリレート）（ＰＨＢＶ）、ポリ（エチレン−ｃｏ−ビニルアセテート）（ＰＥＶＡ）ポリアクリルアミド、ポリエチレンオキシド、ポリエチレンアミン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリビニルアルコール、ポリフマル酸プロピレン、ポリアクリル酸、ポリｅ−カプロラクトン、ポリメタクリル酸、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）、ペクチン酸、ヒアルロン酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ヘパリン、キチン、キトサン、キサンタン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルキトサン、アルギン酸、アルギン酸エステル、コラーゲン、セルロース、シルクフィブロイン、ケラチン、ゼラチン、フィブリン、プルラン、ラミニン、ゲラン、シリコン、ウレタン、エラスチン等及びそれらの修飾体、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。「生体適合性材料」の表面は必要に応じて、細胞の接着を可能とする表面修飾（例えば、細胞接着用基質（コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ラミニン、フィブロネクチン、マトリゲル、ビトロネクチン等）によるコーティング）や、細胞の増殖、分化や機能を制御することが知られている官能基（例えば、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、メタクリル酸基、アクリル酸基等）での改変、が施されていてもよい。「生体適合性材料」は、ブロック状、ビーズ状、ペレット状、球状、シート状、ゲル状、等の任意の形態を有することができ、中実又は多孔性とすることができる。「生体適合性材料」の形状としては、立体形状が好ましく、例えば、球体、四面体、六面体等の多面体、円柱、角柱、円錐、円錐台、角錐、角錐台、トーラス体、円盤体、楕円体それらの変形立体などであってもよく、細胞が生体適合性材料内に分散できる形状であればよい。「生体適合性材料」は生体内への移植及び留置が可能な大きさであればよく、例えば、辺の長さが最も長いところで（円であれば直径）約０．１~３．０ｃｍ、好ましくは約０．５~２．０ｃｍであり、厚さが約０．１~２．０ｃｍ、好ましくは約０．３~１．５ｃｍとすることができる。生体適合性材料中に含まれる細胞は約５０万個~５００万個、好ましくは約１００万個~３００万個程度からなる。

　別の態様としては、例えば、「生体適合性材料」の大きさは、辺の長さが最も長いところで（円であれば直径）約１~３０ｃｍ、好ましくは約１~１５ｃｍ、より好ましくは約２~１０ｃｍとすることができる。

　「生体適合性材料」は、複数移植及び留置してもよい。

　本発明において、好ましくは「生体適合性材料」はゲル（ハイドロゲル）状である。生体適合性材料のゲル化は各生体適合性材に応じた公知の手段に従って行うことができ、例えば、生体適合性材料の水溶液に架橋剤（例えば、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオン等の金属カチオンやその塩形態）を添加することによって、あるいは、水中にてフィブリノーゲンとトロンビンとを作用させることによって行うことができる。本発明において、特に好ましくは「生体適合性材料」はフィブリンゲルである。ゲルは適当な溶媒（例えば、水、生理食塩水、培地等）中に生体適合性材料を約０．０１~１０重量％程度の任意の量で含めることができる。

　本発明において、多能性幹細胞由来の細胞は生体適合性材料中に分散して配置される。「分散して配置」とは、多能性幹細胞由来の細胞をいずれかの部位に限局させることなく、生体適合性材料中に広く分布させて配置することを意味する。例えば、多能性幹細胞由来の細胞がスフェロイドの形態を有する場合、隣接するスフェロイドが生体適合性材料を介在させて存在することを意味する。例えば、多能性幹細胞由来の細胞がスフェロイドの形態を有する場合、隣接するスフェロイドとが約１μｍ以上、好ましくは約５μｍ以上の間隔を有して配置されることを意味する。

　別の態様としては、「分散して配置」とは、多能性幹細胞由来の細胞がスフェロイドの形態を有する場合、生体適合性材料の中のスフェロイドの一定の割合以上（３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上）が互いに接触しないように配置され、好ましくは生体適合性材料の中のスフェロイドの９５％以上が互いに接触しないように配置されることを意味する。

　別の態様としては、「分散して配置」とは、多能性幹細胞由来の細胞がスフェロイドの形態を有する場合、生体適合性材料の中のスフェロイドが、一定の割合以上（３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上）が直径５０~５００μｍのスフェロイドであり（互いに接触して大きなスフェロイドとなっていないことを意味する）、好ましくは生体適合性材料の中のスフェロイドの９５％以上が直径５０~５００μｍのスフェロイドであることを意味する。

　別の態様としては、「分散して配置」とは、多能性幹細胞由来の細胞がスフェロイドの形態を有する場合、生体適合性材料の中にスフェロイドが水玉状（ｐｉｎ　ｄｏｔ）に三次元的に配置されていることを意味する。「水玉状（ｐｉｎ　ｄｏｔ）に三次元的に配置」とは、各スフェロイドが周囲のスフェロイドと間隔を開けて三次元的に存在するだけでなく、周囲のスフェロイドと接触して存在する場合も意味する。各スフェロイドはそれぞれ同じ大きさであってもよいし、異なる大きさであってもよい。ここで「分散して配置」とは、各スフェロイドが生体適合性材料の中に配置された後、凝集・融合してより大きなスフェロイドを形成することを意味するものではない。

　「分散して配置」は任意の手段により達成することが可能であるが、多能性幹細胞由来の細胞液を十分に攪拌混合して生体適合性材料に播種することにより、ならびに／あるいは、生体適合性材料に播種する多能性幹細胞由来の細胞の濃度を調整することにより、ならびに／あるいは、生体適合性材料の溶液に多能性幹細胞由来の細胞を添加し十分に攪拌混合することにより、行うことができる。例えば、生体適合性材料がゲル状である場合、ゲル化させる前の生体適合性材料の溶液に、多能性幹細胞由来の細胞を５０~２００μＬあたり、１００~６００万細胞個、好ましくは２００~５００万細胞個の量となるように混合して攪拌し、細胞が沈降する前にゲル化することにより、多能性幹細胞由来の細胞は生体適合性材料中に分散して配置することができる。

　別の態様としては、例えば、生体適合性材料がゲル状である場合、ゲル化させる前の生体適合性材料の溶液に、多能性幹細胞由来の細胞を１５~５０ｍＬあたり、１×１０^７~１×１０^１０細胞個、好ましくは３×１０^８~１×１０^９細胞個の量となるように混合して攪拌し、細胞が沈降する前にゲル化することにより、多能性幹細胞由来の細胞は生体適合性材料中に分散して配置することができる。

３．生体組織様構造体
　本明細書において「生体組織様構造体」とは、表皮、神経、脳、脊髄、食道、胃、小腸、大腸、膀胱、尿道、肺、甲状腺、膵臓、肝臓、筋肉、骨格、心臓、血管、脾臓、腎臓等（これらに限定はされない）の生体器官や組織と同等又は類似する機能を有する構造体を意味する。生体組織様構造体は、多能性幹細胞由来の細胞が生体適合性材料中に分散して配置されてなる組成物を動物生体内に移植し、留置して、多能性幹細胞由来の細胞を分化誘導することにより得ることができる。

　「動物」は哺乳動物が好ましく、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ラマ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、モルモット等が挙げられるが、好ましくはヒトである。

　移植は、前記組成物を一定の位置で固定できる生体内領域に行うことが好ましく、例えば、動物の皮下、腹腔内、腹膜上皮、大網、脂肪組織、筋肉組織や膵臓、腎臓等の各臓器の被膜下などに行うことできる。

　移植後、組成物内の多能性幹細胞由来の細胞は生体内環境において分化誘導され分化・成熟し、用いた「多能性幹細胞由来の細胞」に応じて、表皮、神経、脳、脊髄、食道、胃、小腸、大腸、膀胱、尿道、肺、甲状腺、膵臓、肝臓、筋肉、骨格、心臓、血管、脾臓、腎臓等（これらに限定はされない）の器官や組織と同等又は類似する機能を有する構造体を得ることができる。

　得られた生体組織様構造体は、その後、回収されてもよいし、そのまま生体内に留置してもよい。

　生体組織様構造体は、多能性幹細胞由来の細胞より分化誘導して得られた分化細胞からなる複数のクラスター、ホスト動物由来の結合組織、ならびにホスト動物由来の血管を含んでいてもよい。

　多能性幹細胞由来の細胞より分化誘導して得られた分化細胞は複数のクラスターを形成して、生体組織様構造体中に分散して存在する。各クラスターは、直径が約１０μｍ~１０００μｍ、好ましくは約５０μｍ~５００μｍ程度、より好ましくは約５０μｍ~３００μｍ程度の大きさを有する。ならびに／あるいは、各クラスターは約１００~約１０００個、好ましくは約２００~約８００個、より好ましくは約３００個~約５００個程度の細胞からなる。生体組織様構造体中には、クラスターが約５０個~２０００個、好ましくは約１００個~５００個程度分散して存在し得るが、この数は生体適合性材料中に分散して配置された多能性幹細胞由来の細胞数に応じて変化し得る。「分散して存在」とは、分化細胞の各クラスターがいずれかの部位に限局することなく、生体組織様構造体中に広く分布して存在することを意味する。また、「分散して存在」とは隣接するクラスターがホスト動物由来の結合組織を介在させて存在することを意味する。

　「ホスト動物由来の結合組織」とは、前記組成物が移植された動物由来の細胞が産生する細胞外マトリックスを意味し、エラスチン、フィブリリン、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン等が含まれる。ホスト動物由来の結合組織は、分化細胞は複数のクラスターの周囲を取り囲むように存在し、生体組織様構造体における各クラスターの間を埋める。

　「ホスト動物由来の血管」とは、前記組成物が移植された動物由来の細胞で形成され、生体組織様構造体外のホスト動物の血管とつながる血管を意味する。ホスト動物由来の血管は、生体組織様構造体における各クラスターへと侵入しており、各クラスターへと血液を循環し、酸素や栄養分等の供給や老廃物の排出を行う。

　本発明の一実施形態として、多能性幹細胞由来の細胞として、多能性幹細胞から膵β細胞へと分化する過程において出現する、胚体内胚葉細胞、原腸管細胞、後方前腸細胞、膵前駆細胞、内分泌前駆細胞、又はインスリン産生細胞、好ましくはインスリン産生細胞を用いた場合、生体内に移植された前述の組成物内でこれらの細胞は分化誘導され成熟し、膵島と同等又は類似する機能を有する分化細胞（以下、「膵島様細胞」と記載する）を含む生体組織様構造体を得ることができる。

　このようにして得られた生体組織様構造体において、膵島様細胞は、以下の（ａ）~（ｇ）：
　（ａ）ＭＡＦＡ、ＵＣＮ３、及びＩＡＰＰの少なくとも一つのマーカーを発現すること、
　（ｂ）クロモグラニンＡ陽性細胞（Ｃｈｇａ＋細胞）の割合が高いこと、
　（ｃ）Ｋｉ６７陽性細胞（Ｋｉ６７＋細胞）の割合が低いこと、
　（ｄ）グルカゴン陽性かつインスリン陰性細胞（Ｇｃｇ＋Ｉｎｓ−細胞）の割合が高いこと、
　（ｅ）低血糖に応答したインスリン分泌作用を有すること、
　（ｆ）外分泌細胞を含まないこと、
　（ｇ）インスリン陽性かつグルカゴン陰性細胞（Ｉｎｓ＋Ｇｃｇ−細胞）の割合が高いこと、
から選択される一又は複数により特徴付けることができる。ここで「複数」とは、２，３，４，５，６又は７を意味する。

　（ａ）~（ｇ）の特徴の有無は、インスリン産生細胞を分化誘導してから（すなわち、前述の組成物を生体内に移植してから）、４週間以降、好ましくは８週間以降に評価することができる。また、膵島様細胞における所定の細胞の割合とは、移植片に由来する細胞塊の全細胞数に対する割合を意味する。

　（ａ）ＭＡＦＡ、ＵＣＮ３、及びＩＡＰＰの少なくとも一つのマーカーを発現すること
　膵島様細胞には、膵β細胞が含まれる。膵β細胞は成熟マーカーであるＭＡＦＡ、ＵＣＮ３、及びＩＡＰＰの少なくとも一つのマーカーを発現する。また、膵β細胞はグルコース刺激によるインスリン分泌上昇反応によっても特徴付けることができる。

　（ｂ）Ｃｈｇａ＋細胞の割合が高いこと
　膵島様細胞は、Ｃｈｇａ＋細胞を約５０％以上の割合で含むことを特徴とする。好ましくは、膵島様細胞における、Ｃｈｇａ＋細胞の割合は約６０％以上であり、より好ましくは約７０％以上、よりさらに好ましくは約９０％以上、とりわけ好ましくは約９５％以上（例えば、約９７％以上、約９８％以上）である。

　Ｃｈｇａ＋細胞にはインスリンやグルカゴン等のホルモンを分泌する細胞（内分泌細胞）が含まれ、本特徴は膵島様細胞が、内分泌細胞を高い割合で含むことを示す。

　（ｃ）Ｋｉ６７＋細胞の割合が低いこと
　膵島様細胞は、Ｋｉ６７陽性細胞を約３％未満の割合で含むことを特徴とする。好ましくは、膵島様細胞における、Ｋｉ６７陽性細胞の割合は約１％未満、より好ましくは約０．８％未満、さらに好ましくは約０．５％未満である。

　本特徴は膵島様細胞において、その混入・残存が好ましくない場合があるＫｉ６７＋細胞はほとんどないか、非常に低い割合であることを示す。

　（ｄ）Ｇｃｇ＋Ｉｎｓ−細胞の割合が高いこと
　膵島様細胞は、Ｇｃｇ＋Ｉｎｓ−細胞を約１０％以上の割合で含むことを特徴とする。好ましくは、膵島様細胞における、Ｇｃｇ＋Ｉｎｓ−細胞の割合は約１５％以上であり、より好ましくは約２０％以上、よりさらに好ましくは約２５％以上である。膵島様細胞におけるＧｃｇ＋Ｉｎｓ−細胞の割合の上限は特に限定されないが、例えば、約５０％以下、好ましくは約４５％以下、より好ましくは約４０％以下とすることができる。

　Ｇｃｇ＋Ｉｎｓ−は成熟した膵α細胞のマーカーであることから、膵島様細胞が、成熟した膵α細胞をインスリン産生細胞よりも高い割合で含むことを示す。膵島様細胞が、インスリン産生細胞よりも成熟した分化段階にあることを示す。

　（ｅ）低血糖に応答したインスリン分泌作用を有すること
　膵島様細胞は、低血糖に応答したインスリン分泌作用を有することを特徴とする。「低血糖に応答したインスリン分泌作用」とは、低血糖時から１時間以内、２時間以内、３時間以内、４時間以内、又は５時間以内にインスリン分泌量が増加することを意味する。「低血糖」とは血中又は培地中のグルコース濃度が、約７０ｍｇ／ｄＬ以下である場合を意味する。インスリン分泌量の測定は従来公知の任意の手段で行うことができ、特に限定はされないが、血中又は培地中のＣ−ペプチド量を測定することにより行うことができる。

　通常、生体内では低血糖になると、グルカゴン等の分泌により血糖値の上昇が促されると共に、グルカゴンに拮抗してインスリンが分泌され、血糖値レベルがコントロールされる。本発明の膵島様細胞は同様に、低血糖に対する血糖値レベルのコントロールを可能とするものであり、低血糖に応答して血糖値の上昇を促すと共に、これに拮抗してインスリンを分泌する作用を有する。

　（ｆ）外分泌細胞を含まないこと
　膵島様細胞は、外分泌細胞を含まないことを特徴とする。すなわち、動物生体内の膵島において通常その大部分（約９５％）を構成する、アミラーゼやリパーゼなどの消化酵素を含む膵液を分泌する外分泌細胞は、膵島様細胞には含まれない。「外分泌細胞を含まない」との用語には、膵島様細胞において外分泌細胞が全く含まれない場合だけでなく、膵島様細胞において５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下、又は０．５％以下の低い割合で外分泌細胞が含まれる場合も包含し得る。

　（ｇ）Ｉｎｓ＋Ｇｃｇ−細胞の割合が高いこと
　膵島様細胞は、Ｉｎｓ＋Ｇｃｇ−細胞の割合が高いことを特徴とする。好ましくは、膵島様細胞における、Ｉｎｓ＋Ｇｃｇ−細胞の割合は約２０％以上であり、より好ましくは約３０％以上、よりさらに好ましくは約４０％以上である。膵島様細胞におけるＩｎｓ＋Ｇｃｇ−細胞の割合の上限は特に限定されないが、例えば、約８０％以下、好ましくは約７０％以下、より好ましくは約６０％以下とすることができる。

　Ｉｎｓ＋Ｇｃｇ−は成熟した膵β細胞のマーカーであることから、膵島様細胞が、成熟した膵β細胞をインスリン産生細胞よりも高い割合で含むことを示す。膵島様細胞が、インスリン産生細胞よりも成熟した分化段階にあることを示す。

　また、生体組織様構造体が膵島様細胞を含む場合、膵島様細胞はインスリン陽性細胞が内側に、グルカゴン陽性細胞が外側に配置されたクラスターを形成し得る。

５．用途
　本手法により得られた生体組織様構造体は、用いた「多能性幹細胞由来の細胞」に応じて、表皮、神経、脳、脊髄、食道、胃、小腸、大腸、膀胱、尿道、肺、甲状腺、膵臓、肝臓、筋肉、骨格、心臓、血管、脾臓、腎臓等（これらに限定はされない）の器官や組織と同等又は類似する機能を有し、それら器官や組織の機能を増強又は維持するために、あるいは、疾患や障害等の原因により低減又は消失したそれら器官や組織の機能を補助又は補充するために利用することができる。
　本発明の一実施形態として、生体組織様構造体が前述の膵島様細胞を含む場合、当該生体組織様構造体は膵島様細胞の分泌するインスリンやグルカゴンの働きにより患者における血糖値（グルコース）のレベルを改善及び／又は維持することができ、血糖値を正常値にコントロールすることができる。

　したがって、当該生体組織様構造体は、血糖値のレベルを改善及び／又は維持することが必要とされる疾患、障害、又は症状を治療又は予防するために用いることができる。このような疾患、障害、又は症状としては、糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病）、空腹時及び食後グルコースレベルの変調、低血糖症（例えば、糖尿病患者におけるインスリン投与による低血糖症）等が挙げられるが、これらに限定はされない。なお、「治療」とは、疾患、障害、又は症状の治療、治癒、防止もしくは、寛解の改善、又は、疾患、障害、又は症状の進行速度の低減を意味する。また、「予防」とは、疾患、障害、又は症状の発症の可能性、危険性を低下させる、又は疾患、障害、又は症状の発症を遅らせることを意味する。

　患者は哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒト）であり、好ましくはヒトである。

　以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１：インスリン産生細胞の作製、移植、機能・形態評価（ＳＴＺ−Ｎｏｄ−ｓｃｉｄマウス）
１．方法
（１）インスリン産生細胞の作製
　Ｆｆ−Ｉ１４ｓ０４　ｉＰＳ細胞株からインスリン産生細胞への分化誘導は、上記工程１）~６）や既報（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２０１４；３２：１１２１−１１３３）に従い、バイオリアクターを用いた３次元培養法により実施した。
すなわち、ｉＰＳ細胞をインスリンが作用する条件下で分化誘導因子（ＧＳＫ３β阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤及び低用量のアクチビンＡ）を含む培地（ＤＭＥＭ／１％Ｂ２７／Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ／ジメチルスルホキシド）で第１の培養を行い、続いて、インスリンが作用しない条件下で分化誘導因子（低用量のアクチビンＡ）を含む培地（ＤＭＥＭ／１％Ｂ２７／Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ／ジメチルスルホキシド）で第２の培養を行い胚体内胚葉細胞を得た。

　その胚体内胚葉細胞から分化誘導して得られた内分泌前駆細胞集団を分化誘導因子（ＡＬＫ５インヒビターＩＩ、Ｔ３、ＬＤＮ、γ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤ＲＯ、アスコルビン酸）とＦＧＦ受容体１阻害剤（ＰＤ−１６６８６６）を含む培地（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＭＥＭ／１％Ｂ２７／Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）で８日間培養した。さらに、一部異なる分化誘導因子（ＡＬＫ５インヒビターＩＩ、Ｔ３、ＺｎＳＯ_４、ヘパリン、Ｎ−アセチルシステイン、Ｔｒｏｌｏｘ、Ｒ４２８、Ｙ−２７６３２）とＦＧＦ受容体１阻害剤（ＰＤ−１６６８６６）を含む培地（ＭＣＤＢ／ＩＴＳ−Ｘ／２％ＢＳＡ／２０ｍＭ　ｇｌｕｃｏｓｅ／ＮａＨＣＯ_３／Ｇｌｕｔａｍａｘ／Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）で４日間培養し、スフェロイドの形態でインスリン産生細胞を得た。

（２）移植前のインスリン産生細胞のタンパク質発現評価
　（１）で作製したインスリン産生細胞のタンパク質発現（インスリン、ＮＫＸ６．１、クロモグラニン、Ｋｉ６７）をフローサイトメトリーにより測定した。

（３）インスリン産生細胞のフィブリンゲルへの分散・ゲル化
　フィブリンゲル作製用のフィブリノーゲン（メルクミリポア、３４１５７６−１００ＭＧ）を、事前に基礎培地（ＭＣＤＢ）に１０ｍｇ／ｍＬとなるように溶解し、使用まで−８０℃にて保存した。トロンビン（シグマ、１０６０２４００００１）を、ＰＢＳ（−）に５０Ｕ／ｍＬとなるように溶解し、使用まで−８０℃にて保存した。フィブリノーゲン溶液とトロンビン溶液は、使用直前に溶解して使用した。
　（１）で作製したインスリン産生細胞のスフェロイド（直径５０~５００μｍ程度の大きさを有し、総数としては３００万ｃｅｌｌｓを含む）を１．５ｍＬチューブに集め沈降させる。沈降後、培養液をできるだけ除き、１００μＬのフィブリノーゲン溶液を加え、良く攪拌した。次いで、凝集塊が沈降しないうちに、フィブリノーゲン溶液に対し１／２量（５０μＬ）のトロンビン溶液を加えた。トロンビン溶液を加えてから５分以上、室温で放置し、ゲル化させた。

（４）生体内へのインスリン産生細胞の移植と生体組織様構造体形成過程の機能評価
　（３）で作製したインスリン産生細胞が分散されたフィブリンゲルを、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）により糖尿病を誘発した免疫不全ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの皮下に移植した（ｉＰＩＣ群）。移植後、血液中のヒトＣ−ペプチド（インスリン産生細胞由来インスリンの指標）の濃度及び血糖値を測定し、インスリン産生細胞の生着および機能を評価した。対照として非移植個体（ｓｈａｍ群）および非糖尿病ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（ｃｏｎｔｒｏｌ群）を設け、同様の指標を測定、評価した。

（５）インスリン産生細胞由来生体組織様構造体のグルコース負荷に対する応答評価
　インスリン産生細胞が分散されたフィブリンゲルを皮下移植し、６ヶ月経過した時点で、一過的に血糖値を上昇させるためにグルコース強制経口投与を行い、その後のインスリン産生細胞の応答を血漿中グルコース濃度および血中ヒトＣ−ペプチド濃度を測定して評価した。

（６）インスリン産生細胞由来生体組織様構造体の一般染色およびタンパク質発現の評価
　移植から６ヶ月後に摘出したインスリン産生細胞由来生体組織様構造体をパラホルムアルデヒドにて固定した。固定した生体組織様構造体から、パラフィン切片および凍結切片を作製した。パラフィン切片を用いて、ＨＥ染色およびマッソントリクローム染色を行った。また、凍結切片を用いて、目的タンパク質発現（ヒト核（ＨｕＮ）、ＰＤＸ１、インスリン（ＩＮＳ）、グルカゴン（ＧＣＧ）、マウスＣＤ３１（ｍＣＤ３１）、クロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）、Ｋｉ６７）を免疫組織染色により評価した。

２．結果
（１）移植前のインスリン産生細胞のタンパク質発現評価
　移植前のインスリン産生細胞について、フローサイトメトリーによる測定結果を図１に、また、インスリン陽性／ＮＫＸ６．１陽性細胞率、クロモグラニンＡ陽性細胞率、Ｋｉ６７陽性細胞率を表１に示す。移植前のインスリン産生細胞は、９５％以上がクロモグラニンＡ陽性の内分泌細胞であり、移植後β細胞に成熟するインスリン陽性／ＮＫＸ６．１陽性細胞が４２．６％、α細胞に成熟するインスリン陽性／ＮＫＸ６．１陰性細胞が３０．３％の細胞集団であった。また、増殖マーカーであるＫｉ６７陽性細胞は０．４％と極僅かであった。

（２）生体内に移植したインスリン産生細胞が生体組織様構造体を形成する過程の機能評価
　移植後の血中ヒトＣ−ペプチド濃度及び血糖値の測定結果を図２および表２に示す。インスリン産生細胞が分散されたフィブリンゲルを移植した動物では、移植から３ヶ月後には血液中に高濃度のヒトＣ−ペプチドが検出され、それに伴い高血糖が改善した。血糖値は６ヶ月後まで正常レベルを維持した。以上より、移植したインスリン産生細胞が分散されたフィブリンゲルが皮下においてホスト細胞と混ざり合いながら分化、成熟し、機能する生体組織様構造体を形成することが示唆された。

（３）インスリン産生細胞由来生体組織様構造体のグルコース負荷に対する応答評価
　グルコース負荷後の血中ヒトＣ−ペプチド濃度および血漿中グルコース濃度を図３に示す。インスリン産生細胞が分散されたフィブリンゲルの移植により形成された生体組織様構造体は、移植から６ヶ月の時点で、鋭敏なグルコース応答性の血中ヒトＣ−ペプチドを分泌を示した。移植部位が皮下にも関わらず、グルコース付加１５分後から明確な血中ヒトＣ−ペプチド上昇が認められており、豊富な血流を介した実際の膵島さながらの生体応答が確認された。また、血糖低下に伴い血中ヒトＣ−ペプチドも低下しており、低血糖の懸念も少ないと推察される。

（４）インスリン産生細胞由来生体組織様構造体の一般染色およびタンパク質発現の評価
　移植から６ヶ月時点のインスリン産生細胞由来生体組織様構造体の肉眼所見を図４に、摘出した生体組織様構造体のＨＥ染色像を図５に、マッソントリクローム染色像を図６に、目的タンパク質発現をそれぞれ免疫組織染色した結果を図７−１０に示す。
　インスリン産生細胞由来生体組織様構造体の肉眼所見（図４）は、目立った肥大もなく、米粒大の生体組織様構造体であり、容易に皮下から単離可能であった。同時期に計４匹解剖しているが、すべて同様の肉眼所見であった。組織学的評価から、生体組織様構造体は、１）直径５０~５００μｍのインスリン産生細胞由来の膵島様細胞クラスター、２）それを取り囲むように配置されたホスト由来の線維性組織、３）ホスト由来の血管構造により構成されていることが示された（図５−１０）。

　３）のホスト由来の血管構造（＝マウスＣＤ３１陽性、図９）は主に、１）の内分泌細胞クラスターに入り込んでおり、１）の膵島様細胞クラスター内には多数の赤血球が認められた（図５、６）。したがって、本生体組織様構造体は、実際の膵島と同様に、豊富な血流と、血流を介した鋭敏な生体反応を実現していることが強く示唆される。また、線維性組織を多く含むため（図６）、物理的な強度も高い。実際にインスリン産生細胞由来生体組織様構造体の切断を試みた際には、軟骨のような強度があり、容易には切断できなかった。

　ＨｕＮ陽性のインスリン産生細胞由来の細胞は、大部分が膵島様細胞（図７−１０）であり、目的外細胞の増殖も認められない。増殖マーカーであるＫｉ６７とＨｕＮ両陽性の細胞も０．５％以下と軽微であった（図１０）。インスリン陽性細胞は１）の膵島様細胞クラスターの内側に、グルカゴン陽性細胞は１）の膵島様細胞クラスターの外側に分布しており、このような配置は出生前の胎児ヒト膵臓、もしくはげっ歯類の膵島において観察される。したがって、本生体組織様構造体も、胎児ヒト膵島と同様に数十年単位で機能し得ることが示唆される。

　以上の結果から、インスリン産生細胞はフィブリンゲルに分散させて生体内に移植することで、皮下という血流や栄養の乏しい部位に長期生着し、さらにはホストの細胞と混ざり合いながら成熟して、新しい生体組織様構造体を形成することが示された。形成された皮下生体組織様構造体は、実際に生体内にある膵島と同様に、生理的かつ鋭敏なインスリン分泌調節に伴う血糖値制御機能を有することが示された。

実施例２：糖尿病病態を有する生体内におけるインスリン産生細胞由来生体組織様構造体の形成と機能評価
１．方法
　上記実施例１の（３）で作製したインスリン産生細胞が分散されたフィブリンゲルを、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）により糖尿病を誘発した免疫不全ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス、又は非糖尿病のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの皮下にそれぞれ移植した。移植２８週後まで、飽食時の血中ヒトＣ−ペプチド、グルカゴンおよび血糖値を測定した。
　２８週後に全個体についてインスリン産生細胞由来生体組織様構造体を摘出した。摘出した移植片生体組織様構造体の重量を測定し、破砕、酸エタノ−ル処理した後に移植片生体組織様構造体中のインスリンおよびグルカゴン含量を測定した。対照として各移植マウスの膵臓および非移植の非糖尿病ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの膵臓を採取し、同様にホルモン含量を測定した。

２．結果
　血液中のヒトＣ−ペプチドおよびグルカゴンの濃度ならびに血糖値の推移を図１１に示す。インスリン産生細胞が分散されたフィブリンゲルの移植２８週後まで持続的に血中にヒトＣ−ペプチドを検出した。血中グルカゴン濃度も上昇しており、糖尿病および非糖尿病の非移植マウスに比べて高値であった。インスリン産生細胞が分散されたフィブリンゲルは皮下環境で長期生着し、そして形成された生体組織様構造体は複数の膵島ホルモンを放出することが示唆された。糖尿病マウスの高血糖は移植１２週後までに改善し、血糖値は２８週後まで正常域を維持した。生体組織様構造体を摘出すると移植前の高血糖状態に完全に戻ったため、持続的かつ安定した高血糖改善作用は生体組織様構造体に由来することが示された。
　移植片生体組織様構造体中および膵臓中の各ホルモン含量を図１２に示す。膵臓（左）と比較して、移植片生体組織様構造体（右）は単位重量当たりのインスリンおよびグルカゴンの含量が多かった。移植片生体組織様構造体は、膵臓中の膵島のように膵内分泌細胞を高密度に含んでいることが示された。

実施例３：インスリン産生細胞由来生体組織様構造体の血糖制御機能
１．方法
　上記実施例１の（３）で作製したインスリン産生細胞が分散されたフィブリンゲルを、ＳＴＺにより糖尿病を誘発した免疫不全ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス、または糖尿病を自然発症するＡｋｉｔａ遺伝子変異を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの皮下に移植した。移植１４週後以降、高血糖が完全に改善したマウスを用いて以下の試験を実施した。

　試験（１）：一過的に血糖値を上昇させるためにグルコ−ス強制経口投与し、その後のインスリン産生細胞由来生体組織様構造体の応答を血中ヒトＣ−ペプチド、グルカゴンおよびグルカゴン様ペプチド−１濃度を測定して評価した。対照として非移植・非糖尿病ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを用い、内因性の各ホルモンの血中濃度を測定した。

　試験（２）：上記インスリン産生細胞由来生体組織様構造体の応答に対するグルカゴンの関与を評価するため、グルコ−ス強制投与前にグルカゴン受容体アンタゴニストＭＫ−０８９３を強制経口投与し、試験（１）と同様の試験を実施した。ＭＫ−０８９３は、マウスよりもヒトのグルカゴン受容体に対して強いアンタゴニスト活性を示す（Ｊ　Ｍｅｄ　Ｃｈｅｍ．２０１２　Ｊｕｌ　１２；５５（１３）：６１３７−４８）。

　試験（３）：インスリン産生細胞由来生体組織様構造体によるインスリン放出に対するグルカゴン様ペプチド−１の関与を評価するため、グルカゴン様ペプチド−１受容体アンタゴニストＥｘｅｎｄｉｎ−９を浸透圧ポンプにより３日間皮下持続投与し、投与前後の血中ヒトＣ−ペプチド濃度を測定した。

　試験（４）：低血糖を誘発するためにインスリン製剤グラルギンを皮下投与し、その後のインスリン産生細胞由来生体組織様構造体の応答を血中ヒトＣ−ペプチドを測定して評価した。対照として非移植・非糖尿病ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを用い、内因性膵島由来のマウスＣ−ペプチドの血中濃度を測定した。

２．結果
　試験（１）：グルコ−ス負荷後の血中グルカゴンおよびグルカゴン様ペプチド−１濃度を図１３に示す。グルコ−ス負荷により血中ヒトＣ−ペプチドおよびグルカゴン様ペプチド−１濃度は一過的に上昇し、血中グルカゴン濃度は低下傾向を示した。移植マウスでは非移植・非糖尿病マウスに比べて血中グルカゴン様ペプチド−１およびグルカゴンの血中濃度が高値を示し、生体組織様構造体がこれらのホルモンを放出していることが示唆された。

　試験（２）：グルコ−ス負荷後の血糖値および血中ヒトＣ−ペプチド濃度を図１４に示す。ＭＫ−０８９３を前処置すると、グルコ−ス負荷後の一過的な血糖値の上昇が減弱し、血中ヒトＣ−ペプチド濃度の上昇も減弱した。一方でＭＫ−０８９３は、非移植・非糖尿病マウスにおいて血糖値および内因性マウスＣ−ペプチドの血中濃度に影響を与えなかった。これらより、生体組織様構造体による血糖制御作用にグルカゴンが寄与していることが示された。

　試験（３）：Ｅｘｅｎｄｉｎ−９の３日間投与前後の飽食時血中ヒトＣ−ペプチド濃度を図１５に示す。血中ヒトＣ−ペプチド濃度はＥｘｅｎｄｉｎ−９の持続投与により低下し、投与を止めると投与前のレベルに戻った。生体組織様構造体によるヒトＣ−ペプチドの放出はグルカゴン様ペプチド−１による制御を受けることが示された。

　試験（４）：血中ヒトＣ−ペプチド濃度はグラルギン投与により低血糖を誘発すると大きく低下した。この変化は非移植・非糖尿病マウスにおける内因性マウスＣ−ペプチドの血中濃度推移と同様だった。低血糖誘発時に生体組織様構造体が内因性膵島に類似したインスリン分泌調節機能を示すことが示された。

　以上より、インスリン産生細胞が分散されたフィブリンゲルの移植により形成されたインスリン産生細胞由来生体組織様構造体は、内因性膵島に類似した、複数の膵島ホルモンが寄与する生理的な血糖制御機能を発揮することが示された。

Claims

　生体組織様構造体をホスト動物の生体組織内に作製する方法において使用される、生体適合性材料とヒト多能性幹細胞由来の細胞とを含む組成物であって、ヒト多能性幹細胞由来の細胞が生体適合性材料中に分散して配置されている、組成物。
　生体適合性材料がフィブリンゲルである、請求項１に記載の組成物。
　フィブリンゲルが、前記組成物の使用の直前に、ヒト多能性幹細胞由来の細胞とフィブリノーゲンとトロンビンを混合してゲル化されたものである、請求項２に記載の組成物。
　ヒト多能性幹細胞由来の細胞が複数のスフェロイドの形態で存在する、請求項１~３のいずれか一項に記載の組成物。
　ヒト多能性幹細胞由来の細胞におけるＫｉ６７陽性細胞の割合が３％未満である、請求項１~４のいずれか一項に記載の組成物。
　ヒト多能性幹細胞由来の細胞がインスリン産生細胞である、請求項１~５のいずれか一項に記載の組成物。
　前記方法が、前記組成物をホスト動物の生体組織中に移植して、生体適合性材料中に分散して配置されたヒト多能性幹細胞由来の細胞を分化誘導することを含む、請求項１~６のいずれか一項に記載の組成物。
　ホスト動物の生体組織が皮下組織である、請求項７に記載の組成物。
　生体組織様構造体が、ヒト多能性幹細胞由来の細胞より分化誘導して得られた分化細胞からなる複数のクラスター、ホスト動物由来の結合組織、ならびにホスト動物由来の血管を含み、該分化細胞からなる複数のクラスターが生体組織様構造体中に分散して存在し、該結合組織が該分化細胞からなる複数のクラスターの周囲を取り囲み、該血管が該分化細胞からなる複数のクラスターへと侵入している、請求項１~８のいずれか一項に記載の組成物。
　前記分化細胞が外分泌細胞を含まない、請求項９に記載の組成物。
　ヒト多能性幹細胞由来の細胞より分化誘導して得られた分化細胞からなる複数のクラスター、ホスト動物由来の結合組織、ならびにホスト動物由来の血管を含む生体組織様構造体であって、該分化細胞からなる複数のクラスターが生体組織様構造体中に分散して存在し、該結合組織が該分化細胞からなる複数のクラスターの周囲を取り囲み、該血管が該分化細胞からなる複数のクラスターへと侵入している、生体組織様構造体。
　前記分化細胞が膵β細胞を含む、請求項１１に記載の生体組織様構造体。
　前記分化細胞が外分泌細胞を含まない、請求項１１又は１２に記載の生体組織様構造体。
　前記生体組織様構造体が移植された被検体の血糖値を正常値にコントロールするために用いられる、請求項１１~１３のいずれか一項に記載の生体組織様構造体。
　生体組織様構造体の製造方法であって、
　生体適合性材料とヒト多能性幹細胞由来の細胞とを含む組成物であって、ヒト多能性幹細胞由来の細胞が生体適合性材料中に分散して配置されている、組成物をホスト動物の生体組織中に移植して分化誘導することを含む、方法。
　生体適合性材料がフィブリンゲルである、請求項１５に記載の方法。
　フィブリンゲルが、前記組成物の使用の直前に、ヒト多能性幹細胞由来の細胞とフィブリノーゲンとトロンビンを混合してゲル化される、請求項１６に記載の方法。
　ヒト多能性幹細胞由来の細胞が複数のスフェロイドの形態で存在する、請求項１５~１７のいずれか一項に記載の方法。
　ヒト多能性幹細胞由来の細胞におけるＫｉ６７陽性細胞の割合が３％未満である、請求項１５~１８のいずれか一項に記載の方法。
　ヒト多能性幹細胞由来の細胞がインスリン産生細胞である、請求項１５~１９のいずれか一項に記載の方法。
　ホスト動物の生体組織が皮下組織である、請求項１５~２０のいずれか一項に記載の方法。
　生体組織様構造体が、分散したヒト多能性幹細胞由来の細胞より分化誘導して得られた分化細胞からなる複数のクラスター、ホスト動物由来の結合組織、ならびにホスト動物由来の血管を含み、該分化細胞からなる複数のクラスターが生体組織様構造体中に分散して存在し、該結合組織が該分化細胞からなる複数のクラスターの周囲を取り囲み、該血管が該分化細胞からなる複数のクラスターへと侵入している、請求項１５~２１のいずれか一項に記載の方法。
　前記分化細胞が外分泌細胞を含まない、請求項１５~２２のいずれか一項に記載の方法。