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WO2020162036A1 - 培養装置及び培養方法 - Google Patents

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Publication number
WO2020162036A1
WO2020162036A1 PCT/JP2019/048496 JP2019048496W WO2020162036A1 WO 2020162036 A1 WO2020162036 A1 WO 2020162036A1 JP 2019048496 W JP2019048496 W JP 2019048496W WO 2020162036 A1 WO2020162036 A1 WO 2020162036A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
culture
tank
cells
culturing
lower space
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2019/048496
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
啓介 渋谷
近藤　健之
憲一郎 岡
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hitachi Ltd
Original Assignee
Hitachi Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hitachi Ltd filed Critical Hitachi Ltd
Publication of WO2020162036A1 publication Critical patent/WO2020162036A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to a culture device and a culture method suitable for cell expansion culture.
  • the expansion culture in which the culture scale is expanded stepwise nutrients are supplied and secreted in order to replenish the culture medium in which the cells are cultured with fresh medium at each scale-up. Waste is diluted.
  • the expansion culture since the culture scale is expanded in a state where the cells easily grow, it is difficult for the cell density in the culture solution to reach the ceiling, and a large number of cells suitable for the production of the substance can be obtained.
  • a general substance production process includes a step A in which a culturing operation is manually performed in a safety cabinet, a step B in which a culturing operation is performed semi-automatically using a bioreactor, and a purpose for cells. And the stage C of the production culture for producing the substance.
  • the scale-up is performed a plurality of times.
  • the magnification for enlarging the culture scale is fixed at multiple times through multiple scale-ups.
  • the magnification for enlarging the culture scale is usually set to about 5 to 10 times. If the cell density is too low due to the supplementation of fresh medium, the culture efficiency after scale-up will be poor, so a multiplication factor that maintains a cell density above a certain level is set.
  • the latter-stage expansion culture using the bioreactor 55 is performed in a culture environment in which the culture temperature and the gas concentration are variably controlled.
  • the culture fluid in the bioreactor 55 is maintained at a culture temperature near 37° C. under forced ventilation, the dissolved oxygen concentration and the carbon dioxide concentration are controlled.
  • automatic transfer of the culture solution is performed aseptically by a transportation system including steel pipes and tubes.
  • the number of seeded cells and the number of transferred cells will change for each work due to the difference in the technique of the operator. Therefore, there is a problem in that variations occur in the production amount of the target substance, the purity of the target substance, and the quality of the product such as the non-denaturing degree of protein. Further, since manual work is required, incidental equipment such as a safety cabinet is required, and there is a problem that a culture facility for containment becomes large.
  • an object of the present invention is to provide a culturing apparatus and a culturing method capable of stepwise performing a plurality of culturing steps having different culturing liquid amounts and culturing methods in a single culturing tank.
  • the inventors of the present invention have conducted a plurality of culturing steps in which the amount of broth and the culturing method are different from each other, by optimizing the shape and structure of the inner space of the culturing tank, to achieve a specific growth rate and a survival rate of cells.
  • the present invention has been completed by finding that it can be carried out stepwise in one culture tank without significantly reducing the temperature.
  • the culturing method according to the present invention statically culturing the cells in the culture medium in the lower space of the culture tank, after the static culture, supplement the fresh medium in the culture tank, the fresh medium of The cells are cultivated with stirring in the culture medium increased by supplementation.
  • a plurality of culture steps having different culture liquid amounts and culture methods can be performed stepwise in one culture tank.
  • FIG. 3 is a diagram showing a relationship between a liquid surface area-volume ratio of a culture solution and cell viability.
  • FIG. 3 is a diagram showing a relationship between a liquid surface area-volume ratio of a culture solution and a cell growth amount. It is a figure which shows the example of a shape of the lower space of the culture tank with which a culture device is equipped. It is a figure which shows the example of a shape of the lower space of the culture tank with which a culture device is equipped.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing an example of a culture device according to an embodiment of the present invention.
  • a culture device 100 according to the present embodiment includes a culture tank 1, an agitator 2, an air diffuser 3, a temperature control device 4, a culture medium tank 5, a valve 6, and a supply pump 7.
  • the analyzer 8, the controller 9, the recovery tank 10, the supply pipe 20, and the discharge pipe 21 are provided.
  • the culture device 100 is a device for expanding and culturing cells, and has a function of replenishing the culture tank 1 in the expansion culture with a fresh medium (culture solution) to expand the culture scale.
  • the culture scale is expanded stepwise by supplementing the culture tank 1 with a fresh medium, and a multi-step culturing process is performed.
  • the culturing apparatus 100 shown in FIG. 1 is configured such that each culturing process is performed in a batch culturing mode in which a medium is not supplied during culturing.
  • the culture method can be switched from static culture to stirring culture while the culture scale is being expanded stepwise. Therefore, batch culture type expansion culture with a large scale as the final target can be performed in a single culture tank 1.
  • the culture tank 1 a shape and structure of the internal space are optimized in order to improve the efficiency of such expansion culture.
  • the cells to be cultured in the culture device 100 are not particularly limited, but cells acclimated to floating cells and cells having low adhesiveness are preferably used.
  • various monoclonal antibodies such as human antibodies, humanized antibodies, chimeric antibodies, mouse antibodies, various physiologically active substances, and other various useful raw materials such as pharmaceutical raw materials, chemical raw materials, and food raw materials. Cells that produce the useful substances of are preferred.
  • the cells to be cultured include animal cells such as Chinese hamster ovary cells (CHO cells), baby hamster kidney cells (BHK cells), human fetal kidney cells (HEK cells), mouse myeloma cells, and other blood cells. Can be mentioned.
  • the cells to be cultured are not limited to animal cells, and may be insect cells, plant cells, microalgae, cyanobacteria, bacteria, yeasts, fungi, algae, yeasts and the like.
  • the culture tank 1 is a tank for culturing cells in the culture medium, and is a closed reactor in which the space for containing the culture medium is sealed.
  • the culture tank 1 can be formed of an appropriate material such as stainless steel, aluminum alloy, plastic, or glass.
  • the culture tank 1 can be provided as a single-use type flexible culture bag.
  • the flexible culture bag can be formed using, for example, a multilayer film made of a resin such as ethylene vinyl acetate, ethylene vinyl alcohol, low density polyethylene, or polyamide.
  • the culture tank 1 is provided with a stirrer 2 for stirring the culture solution and an air diffuser 3 for aerating the culture solution with air, oxygen, nitrogen, carbon dioxide, etc. Be prepared.
  • the air diffuser 3 various devices such as a ring sparger, a micro sparger, a sintered metal sparger, a membrane sparger, and an air diffuser can be used by connecting them to the gas supply device.
  • the culture tank 1 can also include an air diffuser (not shown) for aerating a predetermined gas in the gas phase.
  • the culture tank 1 is provided with a temperature adjusting device 4 for adjusting the temperature inside the tank.
  • a temperature control device 4 for example, an appropriate device such as a water jacket, an air jacket, or an electric heater can be used.
  • the culture tank 1 can be equipped with a sensor (not shown) in order to measure the culture conditions in the tank and the culture state of cells online.
  • a sensor for example, a temperature sensor such as a thermocouple, a dissolved oxygen sensor, a carbon dioxide sensor, a pH sensor, a cell counter using a capacitance meter or an absorptiometer, and a liquid level sensor can be provided.
  • the data measured by the sensor can be output to the analyzer 8.
  • the culture tank 1 can be provided with a sampling port used for collecting the culture solution in order to measure the culture conditions in the tank and the culture state of the cells off-line.
  • the culture tank 1 is equipped with replenishing devices (5, 7) for replenishing the culture medium with fresh medium.
  • a supply pipe 20 for supplying a fresh medium into the culture tank 1 is connected to the culture tank 1.
  • a culture medium tank 5 that constitutes a replenishing device is connected.
  • the supply pipe 20 is provided with a supply pump 7 which constitutes a replenishing device.
  • the supply pump 7 is provided to supply the fresh medium from the medium tank 5 to the culture tank 1.
  • the culture tank 1 When enlarging the culture scale, it is possible to replenish the culture tank 1 with fresh medium by opening only some of the plurality of valves 6. By sequentially using only some of the medium tanks 5, it is possible to minimize the risk of contamination associated with supplementation of fresh medium.
  • the analyzer 8 is provided to analyze the state of cells cultured in the culture tank 1 and the state of the culture solution in the culture tank 1. Items to be analyzed include the amount of state having a correlation with cell growth, the concentration of culture solution components, the osmotic pressure, and the like.
  • the cell growth state can be determined by analyzing the amount of the state having a correlation with the cell growth and the concentration of the culture solution component. That is, it is possible to determine the progress of the culturing process, whether the cells have sufficiently grown in a certain culture scale.
  • State quantities that correlate with cell proliferation include cell number density, specific proliferation rate, survival rate, metabolic reaction rate of cells (metabolic production rate of target substance, metabolic consumption rate of nutrients, metabolic secretion rate of waste products, etc.) , Cell cumulative metabolism (cumulative metabolic production of target substance, cumulative metabolic consumption of nutrients, cumulative metabolic secretion of waste products, etc.), cell cycle (proportion of cells in G2 phase and M phase in cell population) Etc.
  • concentration of the culture solution component include concentrations of glucose, glutamine, lactic acid, ammonia, amino acids, vitamins, metabolites, growth factors, serum components and the like.
  • the cell number density, specific growth rate, and survival rate among the state quantities that correlate with cell proliferation can be determined by measuring the cell number.
  • the number of cells can be measured by microscopic observation using a hemocytometer, dry weight method, turbidity method, capacitance method, NAD measurement for quantifying oxidized NAD + or reduced NADH, and various types of flow cytometry. It can be measured using a measuring method.
  • the number of living cells and the number of dead cells can be counted by utilizing the discrimination by the trypan blue staining method.
  • the specific growth rate can be determined by measuring the change over time in the number of viable cells.
  • the metabolic reaction rate of cells (metabolic production rate of target substances, metabolic consumption rate of nutrients, metabolic secretion rate of waste products, etc.) and cumulative metabolic rate of cells (purpose The cumulative metabolic production amount of a substance, the cumulative metabolic consumption amount of nutrients, the cumulative metabolic secretion amount of waste products, etc.) can be obtained by the following method by conducting an actual culture test in advance.
  • the rate of metabolic consumption of nutrients and the rate of metabolic secretion of waste products can be obtained by measuring the change over time in the concentration in the culture tank and converting it into the amount of change per unit time and number of cells.
  • the concentration of nutrients and the concentration of waste products can be determined by high performance liquid chromatography (HPLC), liquid chromatography mass spectrometry (Liquid Chromatography-Mass spectrometry: LC/MS), liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC/MS-MS).
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • LC/MS liquid chromatography mass spectrometry
  • LC/MS-MS liquid chromatography tandem mass spectrometry
  • the cells can be quantified by subjecting the cell-free culture solution to gas chromatography mass spectrometry (GC/MS), gas chromatography tandem mass spectrometry (GC/MS-MS), and the like.
  • the cumulative metabolic production of target substances, the cumulative metabolic consumption of nutrients, and the cumulative metabolic secretion of waste products can be determined by the method of integrating the obtained metabolic rate or by measuring the cumulative amount.
  • the metabolic reaction rate of cells (the metabolic production rate of a target substance, the metabolic consumption rate of nutrients, the metabolic secretion rate of waste products) can also be determined by conducting an actual culture test in advance and analyzing the intracellular metabolic flux.
  • G2 phase and M phase cells are about to start cell division, while G1 phase and G0 phase cells have time until cell division, and G0 phase has an indefinite length.
  • G2 phase or M phase in the cell cycle When the proportion of cells in the G2 phase or M phase in the cell cycle is high, it can be said that most of the cultured cells are about to start cell division and the cells are prone to proliferate.
  • a state in which the proportion of cells in the G1 phase or G0 phase of the cell cycle is high is a state in which most of the cultured cells are in the interphase, and it can be said that the growth of the cells is suppressed.
  • the culture scale By performing fluorescence detection by flow cytometry and calculating the integrated area of each curve on the frequency distribution, it is possible to know the number and ratio of cells in G2 phase and M phase.
  • the number or ratio of such cells is used as an index for judging the progress of the culturing process, the culture scale can be efficiently expanded in time while giving priority to the state in which the cell population easily grows.
  • the control device 9 is provided for controlling the cell culture conditions and the operation of the culture device 100.
  • the control device 9 operates, stops, outputs rotation of the stirrer 2, operates and stops the air diffuser 3, operates and stops the temperature controller 4, adjusts temperature, opens and closes the valve 6, and supplies a pump.
  • the operation, stop, discharge output, etc. of No. 7 are controlled by an appropriate control method such as PID control, proportional control, ON/OFF control and the like.
  • the data necessary for controlling the cell culture conditions can be preset and stored in the control device 9 according to the cell type, the purpose of the expansion culture, and the like. Further, in order to control the operation of the culture device 100, a predetermined culture schedule can be set.
  • the culture schedule should be set according to the target cell culture volume, target production volume of the target substance, etc. so that the size of the cell can be increased a specified number of times or the culture method can be switched at a specified time during expansion. You can
  • the controller 9 controls each device to increase the amount of culture solution in the culture tank 1 stepwise and switch the culture method from static culture to stirring culture during the process.
  • the control device 9 receives the analysis data acquired by the analysis device 8, determines based on the analysis data whether or not the culture process of each culture scale is completed, and according to the determination result, the culture scale by supplementing the fresh medium. And the switching from static culture to stirring culture by starting the stirrer 2 is performed.
  • the collection tank 10 is provided to collect the cultured cells and the substances produced by the cells.
  • the culture tank 1 is connected to a discharge pipe 21 for discharging cells cultured in the tank and substances produced by the cells.
  • the recovery tank 10 is connected to the other end of the discharge pipe 21.
  • the cells recovered in the recovery tank 10 can be used for larger-scale production culture.
  • the target substance can be separated and purified from the contaminants by subjecting it to a separation and purification treatment together with the substance produced by the cells.
  • FIG. 2 is a diagram illustrating the shape and structure of the internal space of the culture tank provided in the culture device.
  • the culture tank 1 included in the culture apparatus 100 has an inner width that is not uniform in the height direction, and is relatively deep in the tank with a lower space 110 having a relatively narrow inner width. And an upper space 120 having a wide inner width.
  • the lower space 110 is in the shape of a cone protruding downward from the culture tank 1.
  • the upper space 120 has an inner width that is uniform in the height direction, but the lower space 110 has an inner width that is narrower than the lower end of the upper space 120.
  • the upper space 120 of the culture tank 1 is used for stirring culture.
  • the culture solution is put in the culture tank 1 until the liquid surface reaches a predetermined height in the upper space 120.
  • the height of the liquid surface in the upper space 120 can be rounded up step by step by supplementing with fresh medium according to a predetermined culture schedule, as indicated by lines V to VI in FIG.
  • the culture tank 1 can be equipped with a mechanical stirring type stirrer 2.
  • the mechanical stirring type stirrer 2 includes a stirring blade 2a for stirring the culture solution, a rotating shaft 2b for rotating the stirring blade 2a, and a motor 2c for rotating the rotating shaft 2b.
  • the stirring blade 2a may have any suitable shape such as a turbine blade, a paddle blade, a propeller blade, or a lattice blade. Further, the number of blade stages, the blade diameter, the blade height, etc. of the stirrer 2 can be set to appropriate conditions depending on the culture scale and the like as long as the stirring blades 2a fit in the upper space 120.
  • test cell As a test cell, a floating cell line CHO cell was used. As the medium, Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM medium) was used. As the culture vessel, two types of flasks (T75 flask and T225 flask) having different surface areas on the culture surface were used.
  • DMEM medium Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • a liquid medium was placed in each of the two types of flasks such that the liquid surface area S of the culture solution and the culture solution amount V were various conditions.
  • the test cells were seeded in the medium at a cell density of 0.2 ⁇ 10 6 cells/mL.
  • the gas composition of the gas phase was 5% CO 2 in the atmosphere
  • the temperature of the culture solution was 37° C.
  • the dissolved oxygen concentration of the culture solution was adjusted to 40% of the saturated dissolved oxygen concentration, and 2
  • the culture was allowed to stand for a day.
  • Table 1 the type of culture container used in the culture experiment, the liquid surface area S of the culture solution (area S of the interface between the culture solution and the gas phase), the culture solution volume V (volume of the culture solution V), the liquid surface area -Volume ratio S/V (ratio S/V between the area S of the interface between the culture solution and the gas phase and the volume V of the culture solution) is shown.
  • FIG. 3 is a diagram showing the relationship between the liquid surface area-volume ratio of the culture solution and the cell viability.
  • the horizontal axis represents the liquid surface area-volume ratio S/V [cm ⁇ 1 ] of the culture solution in the culture experiment, and the vertical axis represents the cell viability [%] confirmed after the culture experiment. ..
  • the plot of ⁇ is the result of the culture experiment using the T75 flask, and the plot of ⁇ is the result of the culture experiment using the T225 flask.
  • FIG. 4 is a diagram showing the relationship between the liquid surface area-volume ratio of the culture solution and the amount of cell growth.
  • the horizontal axis represents the liquid surface area-volume ratio S/V [cm ⁇ 1 ] of the culture solution in the culture experiment, and the vertical axis represents the relative value of the number of viable cells confirmed after the culture experiment.
  • the plot of ⁇ is the result of the culture experiment using the T75 flask, and the plot of ⁇ is the result of the culture experiment using the T225 flask.
  • the culture results are determined by S/V regardless of the size and shape of the culture container.
  • S/V preferably satisfies S/V ⁇ 8 [cm ⁇ 1 ] and S/V ⁇ 4 [from the viewpoint of maintaining a high specific growth rate and viability of cells and achieving good culture efficiency. It can be said that it is more preferable to satisfy cm ⁇ 1 ].
  • the volume of the culture solution contained in the lower space 110 is V [cm 3 ] and the area of the interface between the culture solution contained in the lower space 110 and the gas phase is S [cm 2 ].
  • the liquid surface area-volume ratio S/V has a shape that satisfies the relationship of the following mathematical expression (I). S/V ⁇ 8 [cm ⁇ 1 ]... (I)
  • the specific growth rate and survival rate of cells can be increased regardless of the size and shape of the culture tank 1. Therefore, the culture efficiency of static culture can be improved for any culture scale that is gradually increased in size. In addition, the survival rate of the cells becomes high, and it becomes difficult for contaminants to be generated in the culture solution, so that the efficiency of separation and purification of the substances produced by the cells and the quality of the products can be improved. From the viewpoint of further improving the culture efficiency, S/V ⁇ 4 [cm ⁇ 1 ] is more preferable.
  • the lower space 110 of the culture tank 1 can be provided, for example, in such a shape that the inner width becomes narrower toward the lower side of the culture tank 1.
  • a shape for example, a stepped shape in which the inner width gradually narrows toward the lower side of the culture tank 1, or the inner width continuously narrows toward the lower side of the culture tank 1.
  • a taper shape etc. are mentioned.
  • FIGS. 5, 6 and 7 are diagrams showing examples of the shape of the lower space of the culture tank provided in the culture device.
  • the lower space 110 of the culture tank 1 can be provided in a cone shape.
  • FIG. 5 is a diagram illustrating an inverted conical cone shape
  • FIG. 6 is a diagram illustrating an inverted quadrangular pyramid cone shape
  • FIG. 7 is an inverted triangular pyramid cone shape.
  • reference numeral 50 indicates the culture solution contained in the lower space 110
  • reference numeral S represents the area of the interface between the culture solution 50 contained in the lower space 110 and the gas phase
  • the reference numeral h indicates the height of the culture solution 50 placed in the lower space 110.
  • the lower space 110 of the culture tank 1 has a cross-sectional area s [cm 2 ] at an arbitrary height and is lower than the height, as in the culture medium 50. It can be said that the volume v [cm 3 ] preferably satisfies s/v ⁇ 8 [cm ⁇ 1 ] and more preferably s/v ⁇ 4 [cm ⁇ 1 ]. Therefore, when the lower space 110 is provided in a cone shape under this condition, it can be said that the total height of the lower space 110 is preferably larger than 3/8 cm, and more preferably larger than 3/4 cm.
  • FIG. 8 is a diagram showing an example of the shape of the lower space of the culture tank provided in the culture device.
  • the lower space 110 of the culture tank 1 can be provided in a columnar shape.
  • FIG. 8: is a figure which illustrates the rectangular parallelepiped columnar shape.
  • reference numeral 50 represents the culture solution contained in the lower space 110
  • reference symbol S represents the area of the interface between the culture solution 50 contained in the lower space 110 and the gas phase
  • reference symbol h represents the lower space 110.
  • the height of the culture solution 50 placed in the table is shown.
  • the lower space 110 of the culture tank 1 has a cross-sectional area s [cm 2 ] at an arbitrary height and a lower side than the height, similarly to the culture solution 50. It can be said that the volume v [cm 3 ] preferably satisfies s/v ⁇ 8 [cm ⁇ 1 ] and more preferably s/v ⁇ 4 [cm ⁇ 1 ]. Therefore, under this condition, when the lower space 110 is provided in a columnar shape, the total height of the lower space 110 is preferably larger than 1/8 cm, and more preferably larger than 1/4 cm.
  • FIG. 9 is a diagram showing an example of the shape of the lower space of the culture tank provided in the culture device.
  • the lower space 110 of the culture tank 1 can be provided in a partially spherical shape.
  • FIG. 9: is a figure which illustrates the spherical shape.
  • reference numeral 50 indicates the culture solution 50 placed in the lower space 110
  • reference symbol S indicates the area of the interface between the culture solution 50 placed in the lower space 110 and the gas phase
  • the reference symbol r indicates the sphere.
  • a radius is shown
  • symbol h shows the height of the culture solution 50 contained in the lower space 110
  • symbol c shows the radius of the interface between the culture solution 50 contained in the lower space 110 and the gas phase.
  • the height h [cm] of the culture solution 50 placed in the lower space 110 is V [cm 3 ] as the volume of the culture solution 50 placed in the lower space 110, and the volume of the culture solution 50 placed in the lower space 110 and the gas phase
  • S[cm 2 ] is the area of the interface
  • r[cm] is the radius of the spherical shape
  • c[cm] is the radius of the interface between the culture solution 50 and the gas phase in the lower space 110.
  • V ⁇ h(3c 2 +h 2 )/6 (II)
  • S ⁇ h(2r-h) (III)
  • the lower space 110 of the culture tank 1 when provided in a pyramidal shape, in addition to the illustrated shape example, it may be another polygonal pyramid such as an inverted pentagonal pyramid, an inverted hexagonal pyramid, or an inverted elliptic cone. It can also be provided. Further, they can be provided in a polygonal pyramid shape with rounded corners or a polygonal pyramid shape with slightly curved sides, which is substantially equivalent to these shapes. Regarding these shapes, the height of the culture solution and the total height of the lower space 110 are preferably larger than 3/8 cm, and more preferably larger than 3/4 cm.
  • the lower space 110 of the culture tank 1 is provided in a columnar shape
  • other polygonal columnar shapes such as a cubic shape, a triangular columnar shape, a pentagonal columnar shape, and a hexagonal columnar shape, a columnar shape, an elliptic columnar shape. Etc. can also be provided. Further, it may be provided in a polygonal column with rounded corners or a polygonal column with slightly curved sides, which is substantially equivalent to these shapes.
  • the height of the culture solution and the total height of the lower space 110 are preferably larger than 1/8 cm, and more preferably larger than 1/4 cm.
  • FIGS. 10 and 11 are views showing an example of the shape of the lower space of the culture tank provided in the culture device.
  • the lower space 110 of the culture tank 1 can be provided in other discontinuous shapes in addition to the illustrated pyramidal shape, columnar shape, and spherical shape.
  • FIG. 8: is a figure which illustrates the discontinuous shape of an inverted truncated cone shape which notched a part of inverted cone.
  • FIG. 8: is a figure which illustrates the multistage convex discontinuous shape which combined the rectangular parallelepiped from which size differs mutually.
  • the lower space 110 of the culture tank 1 also has a spherical truncated cone shape in which a part of a sphere is cut out in two parallel planes, or an inverted truncated cone shape in which a part of an inverted polygonal cone, an inverted elliptical cone, etc. is cut out. It can also be provided in a discontinuous shape.
  • the lower space 110 of the culture tank 1 is a multi-step convex discontinuous shape that is a combination of polygonal columns, cylinders, elliptic columns, inverted polygonal truncated cones, inverted truncated cones, inverted elliptical truncated cones, spheres, etc. Can also be provided.
  • the culture tank 1 is of an upper mechanical agitation type in which the agitator 2 is arranged on the upper side in FIG.
  • the upper mechanical stirring type stirrer 2 is installed such that all the stirring blades 2 a are located in the upper space 120, and the lowermost end of the stirring blade 2 a is located above the lower space 110.
  • the rotary shaft 2b supports the stirring blade 2a from above the culture tank 1.
  • the rotating shaft 2b is parallel to the central axis of the culture tank 1, hangs from the center of the top of the culture tank 1 to the center of the upper space 120, and fixes the stirring blade 2a to the lower part of the center of the upper space 120.
  • FIG. 12 is a diagram showing a structural example of a culture tank provided in the culture device.
  • the culture tank 1 may be of a lower mechanical stirring type in which the stirrer 2 is arranged on the lower side.
  • the lower mechanical stirring type stirrer 2 is installed such that all the stirring blades 2 a are located in the upper space 120, and the lowermost end of the stirring blade 2 a is located above the lower space 110.
  • the rotating shaft 2b supports the stirring blade 2a from below the culture tank 1 which is eccentric from the central axis of the culture tank 1.
  • the rotating shaft 2b is inclined with respect to the center axis of the culture tank 1, extends through the lower space 110 from the outside separated from the center of the bottom of the culture tank 1 to the center side of the upper space 120, and the stirring blade 2a. Is fixed to the lower part near the center of the upper space 120.
  • the hub 2e is located below the shaking table 2d and is rotatably supported by bearings (not shown).
  • the shaking table 2d is supported in a shakeable state by a hub 2e and an eccentric pin 2f, and a support member (not shown) configured similarly to the hub 2e and the eccentric pin 2f.
  • the center axis of the culture tank 1 and the rotation axis of the shaking table 2d do not coincide with each other, and the position and the direction are displaced, so that the culture tank 1 is eccentric, and Are mixed. Since it is not necessary to install a stirring blade or a rotating shaft in the culture tank 1, cells do not adhere or aggregate to the stirring blade or the rotating shaft. Therefore, it is possible to prevent a strong mechanical stress from being applied to the cells at the time of the transition to the stirring culture, and an inaccurate counting of the cell number. Further, when a single-use type culture bag is used as the culture tank 1, it is easy to attach/detach the agitator 2 and hermetically seal the culture tank 1.
  • the shaking and stirring type stirrer 2 shown in FIG. 13 is configured such that the culture tank 1 is shaken and stirred by using the hub 2e, the eccentric pin 2f, and the like, but the stirrer 2 is the shaking motion of the shaking table 2d.
  • Other mechanisms such as a slider/crank mechanism and a cam mechanism, or a combination thereof may be used as a mechanism for converting the rotational motion of the rotating member that drives the shaft into a shaking motion.
  • the shaking and stirring type stirrer 2 may be provided with a device for performing other shaking motions such as horizontal reciprocating motion, vertical reciprocating motion, two-dimensional or three-dimensional orbital motion, and seesaw type tilting motion. Good.
  • FIG. 14 is a flowchart showing the culture method according to the embodiment of the present invention.
  • FIG. 14 illustrates a flow of expanding and culturing cells that produce a target substance using the culturing apparatus 100.
  • the amount of the culture solution in the culture tank 1 is expanded stepwise by supplementing the fresh medium, and a plurality of culture steps having different culture solution amounts are performed stepwise.
  • the culture system is switched from static culture to agitation culture, and static culture and agitation culture in the culture solution increased by supplementing the fresh medium are performed stepwise in a single culture tank 1.
  • the items of the culture conditions to be set include a culture schedule, for example, the target passage number of cells (target value of the number of times of size up) for each static culture and stirring culture, and the culture of the culture tank 1 for each stepwise culture process.
  • the liquid volume (culture scale) can be mentioned.
  • the culture temperature, the gas composition of the gas phase during stationary culture, the rotation speed of the stirrer 2 during stirring culture, the dissolved oxygen concentration, the pH and the like can be mentioned.
  • the target state amount of cells target value such as cell number density
  • the target concentration of the component can be set.
  • the cells to be expanded and cultured are seeded in the medium (step S20).
  • Fresh medium is placed in the culture tank 1 until the liquid surface reaches a predetermined height in the lower space 110.
  • the air diffuser 3, the temperature controller 4, etc. are controlled so that the set culture conditions are achieved, and the cell suspension diluted to an appropriate cell number density is aseptically charged.
  • the culture tank 1 be provided with an inlet for seeding cells at a predetermined height in the lower space 110.
  • the cells are statically cultured in the culture medium in the lower space 110 of the culture tank 1 (step S30).
  • the static culture is performed while the agitator 2 is stopped and the culture scale is maintained such that the liquid surface has a predetermined height in the lower space 110.
  • the gas concentration and composition of the gas phase in the culture tank 1 are controlled to a constant level by aeration of air, oxygen, carbon dioxide, nitrogen, etc. Further, the temperature of the culture solution is controlled to be constant. According to such a constant control, the cells are less likely to be disturbed, and the cells can be stably grown to a predetermined cell density. It is preferable that the gas concentration and the gas composition of the gas phase portion are the same as the atmosphere in the normally used incubator.
  • an index value indicating the growth state of cells is acquired (step S40).
  • the index value indicating the growth state of cells a state quantity having a correlation with the growth of cells, for example, cell number density, specific growth rate, survival rate, metabolic reaction rate of cells, cumulative metabolic rate of cells, cell cycle, etc. , Can be acquired by actual measurement by the analyzer 8. The actual measurement may be performed online using a sensor, or may be performed offline by sampling the culture solution.
  • the culture time for each culture process may be acquired by a timer.
  • the concentration of the culture solution component for each culture step may be acquired by actual measurement by the analyzer 8.
  • the number of passages during static culture is 4 times. If the relationship with the passage number is confirmed in advance, the state amount of the cells, or the concentration of the culture solution component, the index value obtained by actual measurement, and the preset target value in static culture , May be compared. It is also possible to determine the progress of subculture based on whether or not the index value obtained by actual measurement exceeds the target value in static culture and switch the culture method.
  • step S60 If the result of determination is that the target passage number has not been reached (step S60; No), the supply pump 7 is operated, and a predetermined amount of fresh medium is replenished from the medium tank 5 into the culture tank 1, and the next-stage culture scale is added.
  • the amount of culture solution is expanded to (step S70).
  • the control device 9 adds a parameter representing the actual passage number. Then, the static culture of the expanded culture scale is continued in the lower space 110 of the culture tank 1 (step S30).
  • step S60 when the target passage number has been reached (step S60; Yes), the culture system is switched from static culture to stirring culture, the stirrer 2 is operated, and the lower space 110 and the upper space 120 of the culture tank 1 are operated.
  • step S80 the cells are cultivated with stirring in the culture medium increased by supplementing the fresh medium.
  • the stirring culture is performed while stirring the culture solution by the stirring blade 2a located in the upper space 120 in the culture tank 1 and maintaining the culture scale such that the liquid surface has a predetermined height in the upper space 120.
  • the control device 9 receives the analysis data acquired by the analysis device 8, and presets the index value acquired by actual measurement for the state quantity of the cell, the culture time, or the concentration of the culture solution component, and is preset.
  • the target value for each culture process is compared.
  • the progress of the culturing process can be determined based on whether or not the index value acquired by actual measurement exceeds the target value for each culturing process.
  • step S100 If the result of determination is that the target growth state has not been reached (step S100; No), stirring culture of the same culture scale is continued in the lower space 110 and the upper space 120 of the culture tank 1 (step S80).
  • step S110 a determination is made as to whether or not the end conditions necessary for the end of the culture have been satisfied.
  • the control device 9 compares the actual passage number (number of times of size-up) in the stirring culture with the target passage number defined as the culture schedule. The continuation/termination of the expansion culture is determined depending on whether or not the parameter representing the actual passage number has reached the target passage number.
  • the passage number during stirring culture is two. If the relationship with the number of passages is confirmed in advance, the state amount of cells, or, for the concentration of the culture solution components, the index value obtained by actual measurement, and the target value in the preset stirring culture, May be compared. It is also possible to determine the progress of subculture and determine whether to continue or end the expansion culture based on whether or not the index value acquired by actual measurement exceeds the target value in the stirring culture.
  • step S110 If the result of determination is that the target passage number has not been reached (step S110; No), the supply pump 7 is activated, and a predetermined amount of fresh medium is replenished from the medium tank 5 into the culture tank 1, and the next-stage culture scale is added.
  • the amount of culture solution is expanded to (step S120).
  • the control device 9 adds a parameter representing the actual passage number. Then, the stirring culture of the expanded culture scale is continued in the lower space 110 and the upper space 120 of the culture tank 1 (step S80).
  • the fresh culture medium can be replenished in the culture tank having a predetermined shape and structure, so that the culture solution volume is increased stepwise and the culture method is static culture in the middle thereof.
  • the expansion culture for switching from the culture culture to the stirring culture can be performed using the single culture tank 1.
  • the bottom is often flat and the shape/structure is not optimized. Therefore, the lower space 110 of the culture tank 1 has a shape satisfying the relationship of the mathematical expression (I), If the structure of an appropriate stirring system is adopted, the specific growth rate and survival rate of the cells become high. Therefore, it is possible to perform a plurality of culturing steps in which the amount of culturing solution and the culturing method are different from each other stepwise in one culturing tank while maintaining good culturing efficiency.
  • the culture device 100 and the culture method described above it is possible to eliminate the need to transfer the culture solution, so that there is a problem regarding the complexity of the transfer operation of the culture solution and a problem regarding the handling of the culture solution and the cells. Therefore, it is possible to solve the problem of contamination such as transfer of the culture solution.
  • the culturing apparatus 100 it is possible to automate all the culturing steps in a completely closed system, and it becomes difficult for manual work to intervene. Therefore, reproducibility of culturing and production amount/quality of a target substance are improved. be able to. Further, since it is not necessary to prepare an individual bioreactor for each culture scale, it is possible to downsize the culture device and the culture facility. Further, since the batch culture type expansion culture is performed, the culture environment can be easily stabilized as compared with the perfusion culture type.
  • FIG. 15 is a figure which shows typically an example of the culture apparatus which concerns on embodiment of this invention.
  • the culture device 200 includes a culture tank 1, an agitator 2, an air diffuser 3, a temperature control device 4, a culture medium tank 5, a valve 6, and a supply pump 7. , Analysis device 8, control device 9, recovery tank 10, cell separation device 11, extraction pump 12, suction pump 13, supply pipe 20, extraction pipe 22, return pipe 23, and collection pipe 24, and.
  • the culturing device 200 is a device for expanding and culturing cells, like the above-mentioned culturing device 100, and has a function of replenishing the culture tank 1 during expansion culture with fresh medium (culture solution) to expand the culture scale.
  • the culture scale is expanded stepwise by supplementing the culture tank 1 with a fresh medium, and a multi-step culturing process is performed.
  • the culture apparatus 200 shown in FIG. 15 performs each culture step in the form of perfusion culture (continuous culture) in which a medium is continuously supplied during the culture and the same amount of the medium is continuously discharged. Has been done.
  • the culture method can be switched from static culture to stirring culture while the culture scale is being expanded stepwise. Therefore, perfusion culture type expansion culture with a large scale as the final target can be performed in a single culture tank 1.
  • the configuration of the culturing device 200 and the main operating method are substantially the same as those of the culturing device 100, except for the cell separation device 11 and the pumps and pipes corresponding thereto.
  • a pull-out tube 22 for pulling out the culture solution and the cultured cells from the culture tank 1 is connected to the culture tank 1 of the culture device 200.
  • the other end of the drawing tube 22 is connected to a cell separation device 11 that separates the culture solution withdrawn from the culture tank 1 from the cells.
  • the drawing tube 22 is provided with a drawing pump 12 for drawing the culture solution and the cultured cells from the culture tank 1 to the cell separation device 11.
  • the cell separation device 11 is connected with a return pipe 23 for returning the cells separated from the culture solution into the culture tank 1.
  • the other end of the return pipe 23 is connected to the culture tank 1.
  • the cell separation device 11 is connected to a collection pipe 24 for collecting the culture solution in which the cells have been separated.
  • the recovery tank 10 is connected to the other end of the recovery pipe 24.
  • the collection tube 24 is provided with a suction pump 13 that sucks the culture solution from the cell separation device 11.
  • the cell separation device 11 is, for example, a tangential flow membrane separation (TFF) method in which a liquid is flowed in a direction orthogonal to the separation membrane, a liquid is flowed in a direction orthogonal to the separation membrane, and suction and release are performed on the separation membrane.
  • TFF tangential flow membrane separation
  • ATF Alternate Tangential Flow Filtration
  • gravity sedimentation separation method Grav sedimentation separation method
  • sound wave separation method that separates differences in size and density by ultrasonic vibration it can.
  • FIG. 16 is a diagram for explaining the shape and structure of the internal space of the culture tank provided in the culture device.
  • the culture tank 1 included in the culture apparatus 200 has an inner width that is not uniform in the height direction, and is relatively deep in the tank with a lower space 110 having a relatively narrow inner width. And an upper space 120 having a wide inner width.
  • the drawing tube 22 is connected to the bottom of the lower space 110 that protrudes downward of the culture tank 1.
  • the amount of the culture liquid in the culture tank 1 is expanded stepwise by supplementing the fresh medium, and a plurality of culture steps having different culture liquid amounts are performed stepwise.
  • the culture system is switched from static culture to agitation culture, and static culture and agitation culture in the culture solution increased by supplementing the fresh medium are performed stepwise in a single culture tank 1.
  • Perfusion culture type expansion culture using the culture device 200 can be performed in the flow shown in FIG.
  • the extraction pump 12 is operated to draw out the culture solution and the cultured cells from the culture tank 1. Further, the supply pump 7 is operated to replenish the culture solution from the medium tank 5 into the culture tank 1. Then, the cell separation device 11 separates the extracted culture fluid and cells from each other. Then, the separated cells are returned to the culture tank and the suction pump 13 is operated to collect the culture solution containing the substance produced by the cells in the recovery tank 10.
  • perfusion culture when performing perfusion culture in the culture process of stirring culture (see step S80 in FIG. 14), while stirring the culture solution, while maintaining the culture scale at which the liquid surface has a predetermined height in the upper space 120.
  • Perfusion culture is performed under variably controlled culture conditions.
  • the culture process of agitation culture is perfusion culture, not only can the cells be grown to a higher cell density per predetermined culture scale, but also the substances secreted by the cells into the culture medium can be continuously recovered. Since it is possible to continuously produce the target substance in a state where cell growth is difficult to be inhibited, high productivity can be realized.
  • a fresh medium can be replenished in the culturing tank having a predetermined shape and structure. Therefore, as in the batch culturing type culturing apparatus 100 and the culturing method described above, the amount of the culture solution can be increased. Can be increased stepwise, and in the middle of this, expansion culture in which the culture system is switched from static culture to stirring culture can be performed using a single culture tank 1.
  • the lower space 110 of the culture tank 1 has a shape satisfying the relationship of the formula (I) and has a structure of an appropriate stirring system, the specific growth rate of cells and the survival rate are increased. Therefore, it is possible to perform a plurality of culturing steps in which the amount of culturing solution and the culturing method are different from each other stepwise in one culturing tank while maintaining good culturing efficiency.
  • the culture device 200 and the culture method since perfusion culture type expansion culture is performed, it is possible to grow to a higher cell density as compared with the batch culture type, and the culture device or culture facility can be used. , And can be more easily downsized. Even when cells secrete a large amount of a substance that inhibits growth, a large number of cells and a large amount of a target substance can be obtained by setting a culture schedule with a reduced number of size ups.
  • the present invention is not limited to the above-described embodiments and modifications, and various modifications can be made without departing from the spirit of the present invention.
  • the present invention is not necessarily limited to those having all the configurations of the above-described embodiments and modifications. A part of the configuration of a certain embodiment or a modification is replaced with another configuration, a part of the configuration of a certain embodiment or a modification is added to another configuration, the configuration of a certain embodiment or the modification Can be omitted.
  • the culture tank 1 can have an appropriate form shown in the shape example and the structure example, and not only the stirrer 2 but also the arrangement of the air diffuser 3 and the connection position of the pipes are the same as the stirrer 2. Can be optimized.
  • the above-mentioned culture devices 100 and 200 can also be provided with an air diffuser (not shown) for ventilating a predetermined gas in the gas phase part.
  • the air diffuser 3 that diffuses the culture solution may be opened in either the lower space 110 or the upper space 120.
  • the culture tank 1 and the replenishing device (5, 7) may be connected in advance, or may be connected during culture.
  • the agitator 2 may be fixed in advance so as to have a predetermined arrangement, or may be fixed at a predetermined position during culture.
  • the culture devices 100 and 200 are provided with a culture medium tank 5 and a supply pump 7 as a replenishing device.
  • a culture medium tank 5 may be provided instead of the supply pump 7.
  • the replenishing device may include only the medium tank 5 that replenishes the fresh medium by utilizing gravity or pressure difference.
  • the culture medium tank 5 various containers, a flexible bag, or the like may be provided.
  • the production culturing is performed after the expansion culturing in the culturing tank 1 is completed.
  • the production culture step may be performed using the culture tank 1 or may be performed by transferring the culture tank 1 or the recovery tank 10 to another culture tank.
  • the culture method using the culture devices 100 and 200 may have a culture schedule in which the culture process of static culture and the culture process of agitation culture are each one-step culture process.
  • the timing of operating/stopping the supply pump 7 and the stirrer 2 may be changed to an appropriate condition, or the fed-batch type expansion culture may be performed within a range in which the culture scale does not significantly change. Good.
  • a single culture tank is used for expansion culture that switches the culture method from static culture to agitation culture, in the case of batch culture and perfusion culture. The results of culturing were compared.
  • test cell As a test cell, a floating cell line CHO cell was used. As the medium, a liquid medium of DMEM medium was used. Frozen CHO cells were thawed in a water bath at 37° C., and a fresh medium was added to prepare a cell suspension having a cell density of 0.2 ⁇ 10 6 cells/mL. 5 mL of this cell suspension was placed in a culture tank, the gas composition of the gas phase was adjusted to 5% CO 2 in the atmosphere, and the temperature of the culture solution was adjusted to 37° C., and expansion culture was started.
  • medium a liquid medium of DMEM medium was used. Frozen CHO cells were thawed in a water bath at 37° C., and a fresh medium was added to prepare a cell suspension having a cell density of 0.2 ⁇ 10 6 cells/mL. 5 mL of this cell suspension was placed in a culture tank, the gas composition of the gas phase was adjusted to 5% CO 2 in the atmosphere, and the temperature of the culture solution was adjusted to 37
  • the culture scale of expansion culture, the number of times of size increase, the timing of switching the stirring method, etc. were the same as in the conventional example shown in FIG. Table 2 shows an outline of the culture schedule for expansion culture.
  • the number of viable cells and cell viability were calculated. Then, the culture results were compared between the case where the whole culture process was a batch culture system and the case where the whole culture process was a perfusion culture system.
  • FIG. 18 is a diagram showing the results of expansion culture in a single culture tank.
  • the left axis is the number density of live cells confirmed in the culture tank [ ⁇ 10 5 cells/mL]
  • the right axis is the cell survival rate [%] confirmed in the culture tank, the horizontal axis.
  • Plots of ⁇ are results of number density of live cells in batch culture
  • plots of ⁇ are results of viability in batch culture
  • plots of ⁇ are results of number density of live cells in perfusion culture
  • the plot is the result of viability in perfusion culture.

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Abstract

本発明は、培養液量及び培養方式が互いに異なる複数の培養工程を、一つの培養槽で段階的に行うことができる培養装置及び培養方法を提供するものである。培養装置（１００）は、培養液中で細胞を培養するための培養槽（１）と、培養液を攪拌するための攪拌機（２）と、培養槽（１）内に新鮮培地を補充する補充装置（５，７）とを備え、培養槽（１）内の下部空間（１１０）は、上部空間（１２０）よりも狭い内幅を有する下方に突出した形状である。培養方法は、培養槽（１）内の下部空間（１１０）において培養液中で細胞を静置培養し、静置培養の後に、培養槽（１）内に新鮮培地を補充し、新鮮培地の補充により増量した培養液中で細胞を攪拌培養するものである。

Description

培養装置及び培養方法
　本発明は、細胞の拡大培養に適した培養装置及び培養方法に関する。
　抗体医薬をはじめとするバイオ医薬品は、細胞を培養し、細胞が産生した物質を夾雑物から分離・精製することによって製造されている。目的の物質を産生する細胞は、物質の生産に適した細胞数となるまで拡大培養された後、大スケールの培養液を用いる生産培養に供されている。一般に、抗体医薬等の生産には、ＣＨＯ細胞等を用いる浮遊細胞系が利用されている。
　図１７は、従来の拡大培養の流れについて説明する図である。
　図１７に示すように、従来一般的な拡大培養は、培養液の容量を、数ｍＬの小スケールから数千Ｌの大スケールまで、段階的に増やすことによって行われている。細胞は培養液中で増殖しながら目的の物質を産生し、最終的に、数千Ｌまで拡大された培養液中で目的の物質を大量生産している。
　通常の回分培養では、細胞が増殖して培養液中の細胞密度が高くなると、栄養の枯渇や、細胞が分泌した老廃物の蓄積が原因で、細胞が死滅し易くなる。回分培養を続けると、増殖による細胞数の増加と死滅による細胞数の減少とが釣り合う状態になるため、培養液中の細胞密度が頭打ちになり、物質の生産に適した細胞数に増殖させるのが困難になる。
　その一方で、培養スケールを段階的に拡大していく拡大培養によると、細胞を培養している培養液に、スケールアップ毎に新鮮培地を補充するため、栄養が補給されるし、分泌された老廃物が希釈される。拡大培養では、細胞が増殖し易い状態で培養スケールが拡大されていくため、培養液中の細胞密度が頭打ちになり難く、物質の生産に適した大量の細胞を得ることができる。
　図１７に示すように、一般的な物質生産プロセスは、安全キャビネット中で手作業で培養操作を行う段階Ａと、バイオリアクタを利用して半自動的に培養操作を行う段階Ｂと、細胞に目的の物質を生産させる生産培養の段階Ｃとによって構成される。一般に、手作業による段階Ａや、半自動化された段階Ｂでは、それぞれ、複数回のスケールアップが行われている。
　培養スケールを拡大する倍率は、複数回のスケールアップを通して、一定の倍率とするのが一般的である。培養スケールを拡大する倍率は、通常、５～１０倍程度に設定されている。新鮮培地の補充によって細胞密度が低下し過ぎると、スケールアップ後の培養効率が悪くなるため、ある程度以上の細胞密度が保たれる倍率が設定される。
　図１７に示すように、培養液量が数ｍＬから数百ｍＬ程度である拡大培養の初期には、培養容器を用いた小スケールの静置培養が行われている。培養容器としては、図に示すフラスコ５３の他に、ディッシュ、ボトル、ウェルプレート等も用いられている。バイアル５２等に用意された種細胞は、種々の大きさや種々の形状の培養容器に移し替えられて継代される。培養液量が数百ｍＬ程度に達すると、スピナーフラスコ５４を用いた攪拌培養や振盪培養が行われることもある。
　一般に、フラスコ５３やスピナーフラスコ５４を用いた初期の拡大培養は、一定の培養温度、一定のガス濃度に制御されたインキュベータ内で行われている。ガス交換可能なキャップ、シリコ栓等を用いた培養容器が、庫内雰囲気が一定に制御されたインキュベータ内に静置されて、容器内の培養環境が調整されている。培養スケールを拡大する際には、安全キャビネット中で手作業による培養液の移し替えが行われている。
　また、図１７に示すように、培養液の容量が数Ｌ程度に達した拡大培養の後期には、バイオリアクタ５５を用いた大スケールの攪拌培養が行われている。種々の容量のバイオリアクタ５５が用意され、バイオリアクタ５５同士は、鋼管、チューブ等で構成される輸送系で互いに接続されている。
　一般に、バイオリアクタ５５を用いた後期の拡大培養は、培養温度やガス濃度が可変的に制御される培養環境で行われている。バイオリアクタ５５内の培養液は、強制的な通気下で、溶存酸素濃度や、二酸化炭素濃度が制御され、３７℃付近の培養温度に維持されている。培養スケールを拡大する際には、自動による培養液の移し替えが、鋼管、チューブ等で構成される輸送系によって無菌的に行われている。
　従来、培養スケールを段階的に拡大していく拡大培養に関して、培養液の移し替えに伴う問題への対策が検討されている。拡大培養時には、培養液の移し替えを手作業で行う必要があるため、作業の煩雑性の問題がある。また、培養液の移し替え中に、細胞にせん断力、圧力等が加わるため、細胞にダメージが加わる問題がある。また、安全キャビネット等の半開放的な空間で作業を行うため、コンタミネーションの問題がある。これらの問題を解消するために、培養液の移し替えを不要化する技術が提案されている。
　特許文献１には、可撓性材料からなる容器の底面を部分的に隆起させて複数の区画に仕切り、区画毎に細胞を培養した後に、区画を解消する細胞培養方法が記載されている。特許文献１では、可撓性材料からなる容器に生じさせた隆起を解消することにより、養生培養から拡大培養への移行を実現している。
特開２０１６－１４０２９５号公報
　細胞の拡大培養時には、特許文献１に記載されるような、培養液の移し替え作業の煩雑性に関する課題、細胞にダメージを与えないような培養液及び細胞の取り扱いに関する課題、培養液の移し替え時等のコンタミネーションに関する課題に加え、拡大培養の再現性に関する課題や、拡大培養に用いる設備上の課題もある。
　例えば、手作業が必要な初期の拡大培養では、作業者の手技の違いにより、作業毎に、播種される細胞数や、移し替えられる細胞数が変わる。そのため、目的の物質の生産量や、目的の物質の純度、タンパクの非変性度をはじめとする生産物の品質に関して、ばらつきを生じることが問題となる。また、手作業が必要なため、安全キャビネット等の付帯設備が必要であり、封じ込めのための培養施設が大型化してしまう問題もある。
　また、バイオリアクタを用いる後期の拡大培養では、培養スケール毎に、個別のバイオリアクタが必要になる。そのため、多数のバイオリアクタを設置する場所が必要になるという問題がある。バイオリアクタ同士を、鋼管、チューブ等で互いに接続する場合、これらを敷設する空間や、配管作業が必要になるし、配管中で、細胞が損傷したり、細胞が死滅したりするリスクが生じる。
　一般に、浮遊細胞を培養対象とし、大スケールを最終目標として拡大培養を行う場合には、拡大培養の初期に、機械的ストレスが少ない静置培養を行い、培養スケールがある程度拡大した拡大培養の後期に、ガス交換効率や物質拡散に有利な攪拌培養を行うことが好ましい。そのため、拡大培養中には、培養液の移し替えだけでなく、培養方式の切り替えも望まれる。細胞の比増殖速度や生存率を高く保って良好な培養効率を維持しつつ、培養液量や培養方式を変えることができる技術が求められている。
　そこで、本発明は、培養液量及び培養方式が互いに異なる複数の培養工程を、一つの培養槽で段階的に行うことができる培養装置及び培養方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、鋭意研究した結果、培養槽の内部空間の形状・構造を適正化することにより、培養液量及び培養方式が互いに異なる複数の培養工程を、細胞の比増殖速度や生存率を大きく低下させることなく、一つの培養槽で段階的に行うことができることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、前記課題を解決するために本発明に係る培養装置は、培養液中で細胞を培養するための培養槽と、前記培養液を攪拌するための攪拌機と、前記培養槽内に新鮮培地を補充する補充装置と、を備え、前記培養槽内の下部空間は、上部空間よりも狭い内幅を有する下方に突出した形状である。
　また、本発明に係る培養方法は、培養槽内の下部空間において培養液中で細胞を静置培養し、前記静置培養の後に、前記培養槽内に新鮮培地を補充し、前記新鮮培地の補充により増量した培養液中で前記細胞を攪拌培養する。
　本発明に係る培養装置及び培養方法は、培養液量及び培養方式が互いに異なる複数の培養工程を、一つの培養槽で段階的に行うことができる。
本発明の実施形態に係る培養装置の一例を模式的に示す図である。 培養装置に備えられる培養槽の内部空間の形状・構造を説明する図である。 培養液の液面面積－体積比と細胞の生存率との関係を示す図である。 培養液の液面面積－体積比と細胞の増殖量との関係を示す図である。 培養装置に備えられる培養槽の下部空間の形状例を示す図である。 培養装置に備えられる培養槽の下部空間の形状例を示す図である。 培養装置に備えられる培養槽の下部空間の形状例を示す図である。 培養装置に備えられる培養槽の下部空間の形状例を示す図である。 培養装置に備えられる培養槽の下部空間の形状例を示す図である。 培養装置に備えられる培養槽の下部空間の形状例を示す図である。 培養装置に備えられる培養槽の下部空間の形状例を示す図である。 培養装置に備えられる培養槽の構造例を示す図である。 培養装置に備えられる培養槽の構造例を示す図である。 本発明の実施形態に係る培養方法を示すフローチャートである。 本発明の実施形態に係る培養装置の一例を模式的に示す図である。 培養装置に備えられる培養槽の内部空間の形状・構造を説明する図である。 従来の拡大培養の流れについて説明する図である。 単一の培養槽で拡大培養を行った結果を示す図である。
＜培養装置（回分培養式）＞
　はじめに、本発明の一実施形態に係る培養装置について、図を参照しながら説明する。なお、以下の各図において共通する構成については同一の符号を付し、重複した説明を省略する。
　図１は、本発明の実施形態に係る培養装置の一例を模式的に示す図である。
　図１に示すように、本実施形態に係る培養装置１００は、培養槽１と、攪拌機２と、散気装置３と、温度調節装置４と、培地タンク５と、バルブ６と、供給ポンプ７と、分析装置８と、制御装置９と、回収タンク１０と、供給管２０と、排出管２１と、を備えている。
　培養装置１００は、細胞を拡大培養するための装置であり、拡大培養中の培養槽１に新鮮培地（培養液）を補充して培養スケールを拡大する機能を有している。培養装置１００では、培養槽１に新鮮培地を補充することにより、培養スケールが段階的に拡大されて、多段階の培養工程が行われる。図１に示す培養装置１００は、それぞれの培養工程を、培養中に培地を供給しない回分培養の形式で行う形態とされている。
　培養装置１００では、培養スケールを段階的に拡大していく途中に、培養方式を静置培養から攪拌培養に切り替えることができる。そのため、大スケールを最終目標とした回分培養式の拡大培養を、単一の培養槽１で行うことができる。培養槽１としては、このような拡大培養の効率化のため、内部空間の形状・構造が適正化されたものを用いる。
　培養装置１００で培養する細胞としては、特に制限されるものではないが、浮遊細胞に馴化された細胞や、接着性が低い細胞が好ましく用いられる。培養する細胞としては、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、マウス抗体等の各種のモノクローナル抗体や、各種の生理活性物質や、その他、医薬品原料、化学原料、食品原料等として有用な各種の有用物質を産生する細胞が好ましい。
　培養する細胞の具体例としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ細胞）、ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ細胞）、マウス骨髄腫細胞、その他の血球細胞等の動物細胞が挙げられる。但し、培養する細胞は、動物細胞に制限されるものではなく、昆虫細胞、植物細胞、微細藻類、ラン藻類、細菌、酵母、真菌、藻類、酵母等であってもよい。
　培養槽１は、培養液中で細胞を培養するための槽であり、培養液を入れる空間が密閉される密閉型リアクタとされる。培養槽１は、ステンレス鋼、アルミニウム合金、プラスチック、ガラス等の適宜の材料で形成することができる。或いは、培養槽１は、シングルユース式の可撓性の培養バックとして設けることもできる。可撓性の培養バックは、例えば、エチレンビニルアセテート、エチレンビニルアルコール、低密度ポリエチレン、ポリアミド等の樹脂製の多層フィルムを用いて形成することができる。
　図１に示すように、培養槽１には、培養液を攪拌するための攪拌機２や、培養液に空気、酸素、窒素、二酸化炭素等を通気するための散気装置３が、槽内に備えられる。散気装置３としては、リングスパージャ、マイクロスパージャ、焼結金属スパージャ、膜スパージャ、散気管等の各種の機器をガス供給装置に接続して用いることができる。培養槽１は、培養液に通気する散気装置３に加え、気相部に所定のガスを通気する不図示の散気装置を備えることもできる。
　また、培養槽１には、槽内の温度を調節するための温度調節装置４が、周囲に備えられる。温度調節装置４としては、例えば、ウォータージャケット、エアージャケット、電熱ヒータ等の適宜の装置を用いることができる。
　培養槽１は、槽内の培養条件や細胞の培養状態をオンラインで測定するために、不図示のセンサを備えることができる。センサとしては、例えば、熱電対等の温度センサ、溶存酸素センサ、二酸化炭素センサ、ｐＨセンサ、静電容量計や吸光光度計等を用いたセルカウンタ、液面レベルセンサ等を備えることができる。センサが測定したデータは、分析装置８に出力することができる。また、培養槽１は、槽内の培養条件や細胞の培養状態をオフラインで測定するために、培養液の採取に用いるサンプリングポートを備えることができる。
　図１に示すように、培養槽１には、槽内に新鮮培地を補充する補充装置（５，７）が備えられる。培養槽１には、培養槽１内に新鮮培地を供給するための供給管２０が接続される。供給管２０の他端には、補充装置を構成する培地タンク５が接続される。また、供給管２０には、補充装置を構成する供給ポンプ７が備えられる。
　培地タンク５は、用意された滅菌済みの新鮮培地を、培養スケールを拡大する新鮮培地の補充時まで無菌的に貯留する。培養装置１００には、複数の培地タンク５を備えることができる。個々の培地タンク５には、供給管２０の管路を開閉するバルブ６が備えられる。
　供給ポンプ７は、培地タンク５から培養槽１に向けて新鮮培地を供給するために備えられる。培養スケールを拡大する際には、複数のバルブ６のうち、一部のみを開放して、培養槽１内に新鮮培地を補充することができる。一部の培地タンク５のみを、順次用いることにより、新鮮培地の補充に伴うコンタミネーションのリスクを最小限に抑えることができる。
　分析装置８は、培養槽１内で培養されている細胞の状態や培養槽１内の培養液の状態を分析するために備えられる。分析する項目としては、細胞の増殖と相関を有する状態量、培養液成分の濃度、浸透圧等が挙げられる。細胞の増殖と相関を有する状態量や、培養液成分の濃度を分析することにより、細胞の増殖状態を判定することができる。すなわち、或る培養スケールにおいて細胞が十分に増殖したかどうか、培養工程の進捗を判定することができる。
　細胞の増殖と相関を有する状態量としては、細胞数密度、比増殖速度、生存率、細胞の代謝反応速度（目的物質の代謝生産速度、栄養素の代謝消費速度、老廃物の代謝分泌速度等）、細胞の累積代謝量（目的物質の累積代謝生産量、栄養素の累積代謝消費量、老廃物の累積代謝分泌量等）、細胞周期（細胞集団中でＧ２期及びＭ期にある細胞の割合）等が挙げられる。また、培養液成分の濃度としては、グルコース、グルタミン、乳酸、アンモニア、アミノ酸、ビタミン類、代謝生成物、成長因子、血清成分等の濃度が挙げられる。
　細胞の増殖と相関を有する状態量のうち、細胞数密度、比増殖速度、生存率は、細胞数を測定することによって求めることができる。細胞数は、血球計算盤等を用いた顕微鏡観察、乾燥重量法、濁度法、静電容量法や、酸化型ＮＡＤ＋や還元型ＮＡＤＨを定量するＮＡＤ測定や、フローサイトメトリー等の各種の測定法を用いて測定することができる。また、生細胞数や死細胞数は、トリパンブルー染色法による判別を利用して計数することができる。比増殖速度は、生細胞数の経時変化を測定して求めることができる。
　また、細胞の増殖と相関を有する状態量のうち、細胞の代謝反応速度（目的物質の代謝生産速度、栄養素の代謝消費速度、老廃物の代謝分泌速度等）や、細胞の累積代謝量（目的物質の累積代謝生産量、栄養素の累積代謝消費量、老廃物の累積代謝分泌量等）は、事前に実際の培養試験を行うことにより、次の方法で求めることができる。
　目的物質の代謝生産速度は、産生される目的物質の濃度の経時変化を測定し、単位時間当たり、単位細胞数当たりの生産量に換算して求めることができる。目的物質の濃度は、例えば、目的物質がタンパクである場合、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）法により定量することができる。測定対象のタンパクと抗原抗体反応を生じる抗体を使用し、標識の蛍光分析、酵素活性分析等を行う。ＥＬＩＳＡ法としては、直接法、間接法、サンドイッチ法、競合法等のいずれを用いてもよい。
　栄養素の代謝消費速度、老廃物の代謝分泌速度は、培養槽内の濃度の経時変化を測定し、単位時間当たり、単位細胞数当たりの変化量に換算して求めることができる。栄養素の濃度や老廃物の濃度は、高速液体クロマトグラフィ（High Performance Liquid Chromatography：ＨＰＬＣ）、液体クロマトグラフィ質量分析（Liquid Chromatography-Mass spectrometry：ＬＣ／ＭＳ）、液体クロマトグラフィタンデム質量分析（ＬＣ／ＭＳ－ＭＳ）、ガスクロマトグラフィ質量分析（Gas Chromatography-Mass spectrometry：ＧＣ／ＭＳ）、ガスクロマトグラフィタンデム質量分析（ＧＣ／ＭＳ－ＭＳ）等に、細胞を除いた培養液を供して定量することができる。
　目的物質の累積代謝生産量、栄養素の累積代謝消費量、老廃物の累積代謝分泌量は、求めた代謝速度を時間積分する方法や、累積量を実測する方法で求めることができる。細胞の代謝反応速度（目的物質の代謝生産速度、栄養素の代謝消費速度、老廃物の代謝分泌速度）は、事前に実際の培養試験を行い、細胞内代謝フラックスを解析して求めることもできる。
　また、細胞の増殖と相関を有する状態量のうち、細胞周期は、ヨウ化プロピジウム（Propidium Iodide：ＰＩ）染色法による判別を利用し、フローサイトメトリーを行うことによって求めることができる。
　Ｇ２期やＭ期の細胞は、細胞分裂を開始しようとしている一方で、Ｇ１期やＧ０期の細胞は、細胞分裂までに時間があり、Ｇ０期は不定の長さである。細胞周期がＧ２期やＭ期にある細胞の割合が高い状態は、培養されている細胞の多くが細胞分裂を開始しようとしている状態であり、細胞が増殖し易い状態であるといえる。一方、細胞周期がＧ１期やＧ０期にある細胞の割合が高い状態は、培養されている細胞の多くが間期にある状態であり、細胞の増殖が抑制される状態であるといえる。
　フローサイトメトリーで蛍光検出を行い、度数分布上の各曲線の積分面積を計算すると、Ｇ２期やＭ期にある細胞の細胞数や割合を知ることができる。このような細胞の細胞数や割合を、培養工程の進捗を判定する指標とすると、細胞集団が増殖し易い状態を優先させながら、時間的に効率良く培養スケールを拡大していくことができる。
　制御装置９は、細胞の培養条件や培養装置１００の運転を制御するために備えられる。制御装置９は、攪拌機２の作動、停止、回転出力や、散気装置３の作動、停止、通気量や、温度調節装置４の作動、停止、調節温度や、バルブ６の開閉や、供給ポンプ７の作動、停止、吐出出力等を、ＰＩＤ制御、比例制御、オン・オフ制御等の適宜の制御方式で制御する。
　制御装置９には、細胞の培養条件の制御に必要なデータを、細胞の種類や拡大培養の目的等に応じて予め設定して記憶させることができる。また、培養装置１００の運転の制御のために、予め定めた培養スケジュールを設定することができる。培養スケジュールは、拡大培養中に、指定した回数のサイズアップや、指定した時期の培養方式の切り替えが行われるように、細胞の目標培養量、目的の物質の目標生産量等に応じて定めることができる。
　培養槽１内の培養液量を段階的に増やし、その途中に、培養方式を静置培養から攪拌培養に切り替える運転は、制御装置９が、各機器を制御することにより行う。制御装置９は、分析装置８が取得した分析データを受信し、この分析データに基づいて、各培養スケールの培養工程が終了したか判定し、その判定結果にしたがって、新鮮培地の補充による培養スケールのサイズアップや、攪拌機２の起動による静置培養から攪拌培養への切り替えを実行する。
　回収タンク１０は、培養された細胞や、細胞が産生した物質を、回収するために備えられる。培養槽１には、槽内で培養された細胞や細胞が産生した物質を排出するための排出管２１が接続される。排出管２１の他端には、回収タンク１０が接続される。回収タンク１０に回収された細胞は、より大スケールの生産培養に供することができる。或いは、細胞が産生した物質と共に分離精製処理に供し、目的の物質を夾雑物から分離・精製することができる。
　ここで、培養槽１の内部空間の形状・構造について具体的に説明する。
　図２は、培養装置に備えられる培養槽の内部空間の形状・構造を説明する図である。
　図２に示すように、培養装置１００に備えられる培養槽１は、内幅が高さ方向に一様でなく、槽内に、相対的に狭い内幅を有する下部空間１１０と、相対的に広い内幅を有する上部空間１２０と、を有している。図２に示す培養槽１では、下部空間１１０が、培養槽１の下方に向けて突出した錐体形状とされている。上部空間１２０は、内幅が高さ方向に一様とされているが、下部空間１１０は、上部空間１２０の下端よりも狭い内幅とされている。
　培養槽１の下部空間１１０は、静置培養に用いられる。細胞を静置培養する培養工程において、培養槽１には、下部空間１１０内の所定の高さに液面がくるまで培養液が入れられる。下部空間１１０内における液面の高さは、図２にＩ線～IV線で示すように、予め定めた培養スケジュールにしたがって、新鮮培地の補充により、段階的に切り上げていくことができる。
　培養槽１の上部空間１２０は、攪拌培養に用いられる。細胞を攪拌培養する培養工程において、培養槽１には、上部空間１２０内の所定の高さに液面がくるまで培養液が入れられる。上部空間１２０内における液面の高さは、図２にＶ線～VI線で示すように、予め定めた培養スケジュールにしたがって、新鮮培地の補充により、段階的に切り上げていくことができる。
　図２に示すように、培養槽１には、機械攪拌式の攪拌機２を備えることができる。機械攪拌式の攪拌機２は、培養液を攪拌する攪拌翼２ａと、攪拌翼２ａを回転させる回転軸２ｂと、回転軸２ｂを回動させるモータ２ｃと、を備えている。攪拌翼２ａは、タービン翼、パドル翼、プロペラ翼、格子翼等の適宜の形状とすることができる。また、攪拌機２の翼段数、翼径、翼高さ等は、攪拌翼２ａが上部空間１２０に納まる限り、培養スケール等に応じて、適宜の条件にすることができる。
＜培養実験＞
　ここで、培養槽１の内部空間の形状・構造と、細胞の培養効率との関係を、培養実験で確認した結果を示す。
　細胞の培養においては、温度、溶存酸素濃度、その他ガス濃度等が環境因子として重要である。静置培養では、ガス交換が培養液と気相との界面を介してなされるため、細胞の培養効率は、培養液と気相との界面の面積Ｓや、培養液の体積Ｖに影響されると考えられる。このような予測の妥当性と、面積Ｓ・体積Ｖの適正範囲を調べるために、種々の培養条件で細胞を静置培養して、面積Ｓ・体積Ｖと細胞の生存率・細胞の増殖量との関係を調べた。
（実験方法）
　供試細胞としては、浮遊細胞系であるＣＨＯ細胞を用いた。また、培地としては、ダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco's Modified Eagle's Medium：ＤＭＥＭ培地）を用いた。培養容器としては、培養面の表面積が異なる２種類のフラスコ（Ｔ７５フラスコ，Ｔ２２５フラスコ）を用いた。
　表１に示すように、２種類のフラスコのそれぞれに、培養液の液面面積Ｓ、及び、培養液量Ｖが種々の条件となるように液体培地を入れた。また、その培地に、０．２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度となるように供試細胞を播種した。そして、気相部のガス組成が大気中５％ＣＯ２、培養液の温度が３７℃、培養液の溶存酸素濃度が飽和溶存酸素濃度に対して４０％となる培養条件に調整して、２日間にわたって静置培養した。
　静置培養後、生死細胞オートアナライザ　Ｖｉ－Ｃｅｌｌ（ベックマン・コールター社製）を用いて生細胞数及び死細胞数を計数し、全細胞中の生細胞の割合（細胞の生存率）と、培養後の全生細胞数（細胞の増殖量）を求めた。
　表１に、培養実験で使用した培養容器の種類、培養液の液面面積Ｓ（培養液と気相との界面の面積Ｓ）、培養液量Ｖ（培養液の体積Ｖ）、液面面積－体積比Ｓ／Ｖ（培養液と気相との界面の面積Ｓと、培養液の体積Ｖとの比Ｓ／Ｖ）を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（実験結果１）
　図３は、培養液の液面面積－体積比と細胞の生存率との関係を示す図である。
　図３において、横軸は、培養実験における培養液の液面面積－体積比Ｓ／Ｖ［ｃｍ－１］を示し、縦軸は、培養実験後に確認された細胞の生存率［％］を示す。●のプロットは、Ｔ７５フラスコを使用した培養実験の結果、▲のプロットは、Ｔ２２５フラスコを使用した培養実験の結果である。
　図３に示すように、Ｔ７５フラスコを使用した場合、及び、Ｔ２２５フラスコを使用した場合のいずれにおいても、Ｓ／Ｖが小さいほど、細胞の生存率が高くなる傾向が確認された。培養容器の種類にかかわらず、Ｓ／Ｖ≦８［ｃｍ－１］の場合に、生存率が顕著に高くなり、Ｓ／Ｖ≦４［ｃｍ－１］の場合に、９０％を超える十分に高い生存率が得られた。
（実験結果２）
　図４は、培養液の液面面積－体積比と細胞の増殖量との関係を示す図である。
　図４において、横軸は、培養実験における培養液の液面面積－体積比Ｓ／Ｖ［ｃｍ－１］を示し、縦軸は、培養実験後に確認された生細胞数の相対値を示す。●のプロットは、Ｔ７５フラスコを使用した培養実験の結果、▲のプロットは、Ｔ２２５フラスコを使用した培養実験の結果である。
　図４に示すように、Ｔ７５フラスコを使用した場合、及び、Ｔ２２５フラスコを使用した場合のいずれにおいても、Ｓ／Ｖが小さいほど、細胞の増殖量が多くなる傾向が確認された。培養容器の種類にかかわらず、Ｓ／Ｖ≦８［ｃｍ－１］の場合に、比増殖速度が高くなって生細胞数が増え易くなり、Ｓ／Ｖ≦４［ｃｍ－１］の場合に、最大の生細胞数が得られた。
　これらの実験結果から、静置培養では、培養容器の大きさや形状にかかわらず、Ｓ／Ｖによって、培養成績が決まることが分かる。Ｓ／Ｖは、細胞の比増殖速度や生存率を高く保ち、良好な培養効率を実現する観点からは、Ｓ／Ｖ≦８［ｃｍ－１］を満たすことが好ましく、Ｓ／Ｖ≦４［ｃｍ－１］を満たすことがより好ましいといえる。
　一般に、細胞の増殖は、高濃度の二酸化炭素によって阻害されることが知られている。通常の静置培養を続けた場合、培養液の二酸化炭素濃度が、気相部からの溶解や細胞の呼吸によって上昇するため、培養時間が経過するほど、細胞の増殖が阻害され易くなる。これに対し、Ｓ／Ｖが小さいと、二酸化炭素の気相部からの溶解や、二酸化炭素の培養液全体にわたる拡散に時間がかかる。そのため、細胞の比増殖速度が高くなると共に、対数期のピーク時に得られる生細胞数も多くなり、静置培養の培養効率が向上することになる。
　したがって、培養槽１の下部空間１１０は、下部空間１１０に入れた培養液の体積をＶ［ｃｍ３］、下部空間１１０に入れた培養液と気相との界面の面積をＳ［ｃｍ２］としたとき、液面面積－体積比Ｓ／Ｖが、次の数式（Ｉ）の関係を満たす形状であることが好ましい。
　　Ｓ／Ｖ≦８［ｃｍ－１］　・・・（Ｉ）
　培養槽１の下部空間１１０が数式（Ｉ）の関係を満たす形状であると、培養槽１の大きさや形状にかかわらず、細胞の比増殖速度や生存率を高くすることができる。そのため、段階的にサイズアップさせる任意の培養スケールについて、静置培養の培養効率を向上させることができる。また、細胞の生存率が高くなり、培養液中に夾雑物が生じ難くなるため、細胞が産生した物質の分離精製効率や、生産物としての品質を向上させることができる。培養効率をより向上させる観点からは、より好ましくはＳ／Ｖ≦４［ｃｍ－１］である。
＜培養槽の形状例＞
　培養槽１の下部空間１１０は、上部空間１２０よりも狭い内幅を有し、培養槽１の下方に向けて突出した形状であれば、任意の形状に設けることができる。培養槽１の下部空間１１０は、数式（Ｉ）の関係を満たす形状であることが好ましいが、所定の培養液量を入れた状態のみで数式（Ｉ）の関係を満たす形状であってもよいし、任意の培養液量を入れた全ての状態で数式（Ｉ）の関係を満たす形状であってもよい。
　培養槽１の下部空間１１０は、例えば、培養槽１の下方に向かうに連れて内幅が狭くなる形状に設けることができる。このような形状としては、例えば、培養槽１の下方に向かうに連れて内幅が段階的に狭くなる有段差形状や、培養槽１の下方に向かうに連れて内幅が連続的に狭くなるテーパ形状等が挙げられる。
　図５、図６及び図７は、培養装置に備えられる培養槽の下部空間の形状例を示す図である。
　図５、図６及び図７に示すように、培養槽１の下部空間１１０は、錐体形状に設けることができる。図５は、逆円錐状の錐体形状を例示する図であり、図６は、逆四角錐状の錐体形状を例示する図であり、図７は、逆三角錐状の錐体形状を例示する図である。図５、図６及び図７において、符号５０は、下部空間１１０に入れた培養液を示し、符号Ｓは、下部空間１１０に入れた培養液５０と気相との界面の面積を示し、符号ｈは、下部空間１１０に入れた培養液５０の高さを示す。
　下部空間１１０を錐体形状に設けた場合、下部空間１１０に入れた培養液５０の体積Ｖは、Ｖ＝Ｓ・ｈ／３となり、培養液５０のＳ／Ｖは、３／ｈとなる。Ｓ／Ｖ≦８［ｃｍ－１］を満たすことが好ましく、Ｓ／Ｖ≦４［ｃｍ－１］を満たすことがより好ましいため、この条件の下で下部空間１１０を錐体形状に設けた場合、下部空間１１０に入れた培養液５０の高さｈは、３／８ｃｍより大きいことが好ましく、３／４ｃｍより大きいことがより好ましいといえる。
　下部空間１１０を錐体形状に設けた場合、培養槽１の下部空間１１０は、培養液５０と同様にして、任意の高さにおける断面積ｓ［ｃｍ２］と、その高さよりも下側の体積ｖ［ｃｍ３］とが、ｓ／ｖ≦８［ｃｍ－１］を満たすことが好ましく、ｓ／ｖ≦４［ｃｍ－１］を満たすことがより好ましいといえる。よって、この条件の下で下部空間１１０を錐体形状に設けた場合、下部空間１１０の全高は、３／８ｃｍより大きいことが好ましく、３／４ｃｍより大きいことがより好ましいといえる。
　図８は、培養装置に備えられる培養槽の下部空間の形状例を示す図である。
　図８に示すように、培養槽１の下部空間１１０は、柱体形状に設けることもできる。図８は、直方体状の柱体形状を例示する図である。図８において、符号５０は、下部空間１１０に入れた培養液を示し、符号Ｓは、下部空間１１０に入れた培養液５０と気相との界面の面積を示し、符号ｈは、下部空間１１０に入れた培養液５０の高さを示す。
　下部空間１１０を柱体形状に設けた場合、下部空間１１０に入れた培養液５０の体積Ｖは、Ｖ＝Ｓ・ｈとなり、培養液５０のＳ／Ｖは、１／ｈとなる。Ｓ／Ｖ≦８［ｃｍ－１］を満たすことが好ましく、Ｓ／Ｖ≦４［ｃｍ－１］を満たすことがより好ましいため、この条件の下で下部空間１１０を柱体形状に設けた場合、下部空間１１０に入れた培養液５０の高さｈは、１／８ｃｍより大きいことが好ましく、１／４ｃｍより大きいことがより好ましいといえる。
　下部空間１１０を柱体形状に設けた場合、培養槽１の下部空間１１０は、培養液５０と同様にして、任意の高さにおける断面積ｓ［ｃｍ２］と、その高さよりも下側の体積ｖ［ｃｍ３］とが、ｓ／ｖ≦８［ｃｍ－１］を満たすことが好ましく、ｓ／ｖ≦４［ｃｍ－１］を満たすことがより好ましいといえる。よって、この条件の下で下部空間１１０を柱体形状に設けた場合、下部空間１１０の全高は、１／８ｃｍより大きいことが好ましく、１／４ｃｍより大きいことがより好ましいといえる。
　図９は、培養装置に備えられる培養槽の下部空間の形状例を示す図である。
　図９に示すように、培養槽１の下部空間１１０は、部分球形状に設けることもできる。図９は、球欠形状を例示する図である。図９において、符号５０は、下部空間１１０に入れた培養液５０を示し、符号Ｓは、下部空間１１０に入れた培養液５０と気相との界面の面積を示し、符号ｒは、球の半径を示し、符号ｈは、下部空間１１０に入れた培養液５０の高さを示し、符号ｃは、下部空間１１０に入れた培養液５０と気相との界面の半径を示す。
　下部空間１１０を球欠形状に設けた場合、下部空間１１０に入れた培養液５０の体積Ｖは、Ｖ＝π・ｈ（３ｃ２＋ｈ２）／６となり、下部空間１１０に入れた培養液５０と気相との界面の面積Ｓは、Ｓ＝π・ｈ（２ｒ－ｈ）となる。Ｓ／Ｖ≦８［ｃｍ－１］を満たすことが好ましく、ｓ／ｖ≦４［ｃｍ－１］を満たすことがより好ましいため、この条件の下で下部空間１１０を球欠形状に設けた場合、下部空間１１０に入れた培養液５０の高さｈ［ｃｍ］は、下部空間１１０に入れた培養液５０の体積をＶ［ｃｍ３］、下部空間１１０に入れた培養液５０と気相との界面の面積をＳ［ｃｍ２］、球欠形状の半径をｒ［ｃｍ］、下部空間１１０に入れた培養液５０と気相との界面の半径をｃ［ｃｍ］としたとき、前記の数式（Ｉ）に加え、次の数式（II）及び（III）の関係を満たすことが好ましい。
　　Ｖ＝π・ｈ（３ｃ２＋ｈ２）／６　・・・（II）
　　Ｓ＝π・ｈ（２ｒ－ｈ）　・・・（III）
　また、培養槽１の下部空間１１０は、錐体形状に設ける場合、図示した形状例の他に、逆五角錐状、逆六角錐状等のその他の多角錐状や、逆楕円錐状等に設けることもできる。また、これらの形状と実質的に同等な、角が丸い多角錐状や、辺が僅かに湾曲した多角錐状に設けることもできる。これらの形状については、培養液の高さや下部空間１１０の全高が、３／８ｃｍより大きいことが好ましく、３／４ｃｍより大きいことがより好ましい。
　また、培養槽１の下部空間１１０は、柱体形状に設ける場合、図示した形状例の他に、立方体状、三角柱状、五角柱状、六角柱状等のその他の多角柱状や、円柱状、楕円柱状等に設けることもできる。また、これらの形状と実質的に同等な、角が丸い多角柱状や、辺が僅かに湾曲した多角柱状に設けることもできる。これらの形状については、培養液の高さや下部空間１１０の全高が、１／８ｃｍより大きいことが好ましく、１／４ｃｍより大きいことがより好ましい。
　図１０及び図１１は、培養装置に備えられる培養槽の下部空間の形状例を示す図である。
　図１０及び図１１に示すように、培養槽１の下部空間１１０は、図示した錐体形状、柱体形状、球欠形状の他に、その他の不連続形状に設けることもできる。図８は、逆円錐の一部を切り欠いた逆円錐台状の不連続形状を例示する図である。図８は、互いに大きさが異なる直方体を組み合わせた多段凸状の不連続形状を例示する図である。
　また、培養槽１の下部空間１１０は、その他、球の一部を平行な二面で切り欠いた球台形状や、逆多角錐、逆楕円錐等の一部を切り欠いた逆錐台状の不連続形状に設けることもできる。また、培養槽１の下部空間１１０は、互いに大きさが異なる多角柱、円柱、楕円柱、逆多角錐台、逆円錐台、逆楕円錐台、球台等を組み合わせた多段凸状の不連続形状に設けることもできる。
＜培養槽の構造例＞
　培養槽１は、図２において、攪拌機２が上部側に配置された上部機械攪拌式とされている。上部機械攪拌式の攪拌機２は、全ての攪拌翼２ａが上部空間１２０に位置し、攪拌翼２ａの最下端が下部空間１１０よりも上方に位置するように設置されている。また、回転軸２ｂは、培養槽１の上方から攪拌翼２ａを支持している。回転軸２ｂは、培養槽１の中心軸と平行であり、培養槽１の頂部の中央から上部空間１２０の中央に垂下し、攪拌翼２ａを上部空間１２０の中央の下部に固定している。
　このような上部機械攪拌式の構造によると、下部空間１１０を用いる静置培養中、攪拌翼２ａや回転軸２ｂに、細胞が接着・凝集し難くなる。そのため、攪拌培養への移行時に細胞に強い機械的ストレスが加わったり、細胞数の計数が不正確になったりするのを防止できる。
　但し、培養槽１は、図２に示すような上部機械攪拌式に代えて、その他の攪拌方式を適用することもできる。例えば、回転軸及びモータを備える機械攪拌式の他に、攪拌翼を磁力で回動させる磁力攪拌式とすることもできる。また、攪拌翼を備えない振盪攪拌式や、エアーフロー攪拌式とすることもできる。
　図１２は、培養装置に備えられる培養槽の構造例を示す図である。
　図１２に示すように、培養槽１は、攪拌機２が下部側に配置された下部機械攪拌式とすることもできる。下部機械攪拌式の攪拌機２は、全ての攪拌翼２ａが上部空間１２０に位置し、攪拌翼２ａの最下端が下部空間１１０よりも上方に位置するように設置されている。一方、回転軸２ｂは、培養槽１の中心軸から偏心した培養槽１の下方から攪拌翼２ａを支持している。回転軸２ｂは、培養槽１の中心軸に対して傾斜しており、培養槽１の底部の中央から離隔した外側から下部空間１１０を貫通して上部空間１２０の中央側に延び、攪拌翼２ａを上部空間１２０の中央付近の下部に固定している。
　このような下部機械攪拌式の構造によると、モータ２ｃを上部に固定しなくとも、下部空間１１０を用いる静置培養中に、攪拌翼２ａや回転軸２ｂに、細胞が接着・凝集し難くなる。そのため、攪拌培養への移行時に細胞に強い機械的ストレスが加わったり、細胞数の計数が不正確になったりするのを防止できる。
　図１３は、培養装置に備えられる培養槽の構造例を示す図である。
　培養槽１は、攪拌翼のない振盪攪拌式とすることもできる。図１３に示す振盪攪拌式の攪拌機２は、回転軸２ｂを回転させるモータ２ｃと、培養槽１を支持する振盪台２ｄと、振盪台２ｄの振盪運動を回転運動によって駆動するハブ（回転部材）２ｅと、ハブ２ｅの回転運動を振盪運動に変換する偏心ピン（変換部材）２ｆと、回転軸２ｂの回転運動をハブ２ｅに伝達するベルト２ｇ（伝達部材）と、を備えている。ハブ２ｅは、振盪台２ｄの下方に位置しており、不図時の軸受によって回転自在に支持されている。振盪台２ｄは、ハブ２ｅ及び偏心ピン２ｆや、ハブ２ｅ及び偏心ピン２ｆと同様に構成される不図示の支持部材によって振盪可能な状態で支持される。
　振盪台２ｄに支持される培養槽１の中心軸は、ハブ（回転部材）２ｅの中心軸から偏心している。偏心ピン２ｆは、ハブ２ｅの上面にハブ２ｅの中心軸から偏心して設けられており、偏心ピン２ｆの先端は、振盪台２ｄに回転自在に接続されている。ハブ２ｅとモータ２ｃに接続された回転軸２ｂには、プーリが備えられており、ベルト２ｇが架け渡されている。モータ２ｃが作動すると、回転軸２ｂの回転によってハブ２ｅが回転運動して、偏心ピン２ｆがハブ２ｅの中心軸の周りを運動する。振盪台２ｄは、この偏心ピン２ｆの運動で旋回振盪運動や往復振盪運動し得るように、不図示のガイドによって軌道を案内することができる。
　このような振盪攪拌式の構造では、培養槽１の中心軸と振盪台２ｄの回転軸とが一致せず、位置や方向がずらされていることで培養槽１が偏心し、培養槽１内の液が混合される。培養槽１内に攪拌翼や回転軸を設置する必要がないため、攪拌翼や回転軸に、細胞が接着・凝集しなくなる。そのため、攪拌培養への移行時に細胞に強い機械的ストレスが加わったり、細胞数の計数が不正確になったりするのを防止できる。また、培養槽１として、シングルユース式の培養バッグを用いる場合等に、攪拌機２への脱着や培養槽１の密閉が容易になる。
　なお、図１３に示す振盪攪拌式の攪拌機２は、培養槽１を、ハブ２ｅ、偏心ピン２ｆ等を利用して振盪攪拌する方式とされているが、攪拌機２は、振盪台２ｄの振盪運動を駆動する回転部材の回転運動を振盪運動に変換する機構として、スライダ・クランク機構、カム機構等、その他の機構や、それらの組合せを利用してもよい。また、振盪攪拌式の攪拌機２としては、水平往復運動、上下往復運動、二次元的又は三次元的な周回運動、シーソ型等の傾斜揺動等、その他の振盪運動を行う装置を備えてもよい。
＜培養方法（回分培養式）＞
　次に、本発明の一実施形態に係る培養方法について、培養装置１００を用いた場合の処理と共に、図を参照しながら説明する。
　図１４は、本発明の実施形態に係る培養方法を示すフローチャートである。
　図１４には、目的の物質を産生する細胞を、培養装置１００を用いて拡大培養する流れを例示する。培養装置１００では、培養槽１内の培養液量を新鮮培地の補充により段階的に拡大し、培養液量が互いに異なる複数の培養工程を段階的に行う。その途中には、培養方式を静置培養から攪拌培養に切り替え、静置培養と、新鮮培地の補充により増量した培養液中における攪拌培養とを、単一の培養槽１で段階的に行う。
　培養装置１００には、はじめに、細胞の培養に必要な培養条件を設定する（ステップＳ１０）。培養装置１００では、段階的に培養スケールを拡大していく拡大培養を、指定した回数のサイズアップや、指定した時期の培養方式の切り替えが行われるように、予め定めた培養スケジュールにしたがって実施する。
　設定する培養条件の項目としては、培養スケジュール、例えば、静置培養や攪拌培養毎の細胞の目標継代数（サイズアップの回数の目標値）や、段階的な培養工程毎の培養槽１の培養液量（培養スケール）が挙げられる。また、培養温度、静置培養時の気相部のガス組成、攪拌培養時の攪拌機２の回転速度、溶存酸素濃度、ｐＨ等が挙げられる。また、各培養工程の進捗を判定するために、培養工程毎の細胞の目標状態量（細胞数密度等の目標値）、又は、培養工程毎の目標培養時間、又は、培養工程毎の培養液成分の目標濃度を設定することができる。
　続いて、拡大培養する目的の細胞を培地に播種する（ステップＳ２０）。培養槽１内には、下部空間１１０内の所定の高さに液面がくるまで新鮮培地を入れる。そして、設定した培養条件になるように散気装置３、温度調節装置４等を制御し、適切な細胞数密度に希釈した細胞懸濁液を無菌的に投入する。培養槽１には、下部空間１１０内の所定の高さに、細胞を播種するための投入口を設けておくことが好ましい。
　続いて、培養槽１の下部空間１１０において培養液中で細胞を静置培養する（ステップＳ３０）。静置培養は、攪拌機２を停止した状態で、液面が下部空間１１０内の所定の高さとなる培養スケールを維持して行う。
　静置培養中には、空気、酸素、二酸化炭素、窒素等の通気によって、培養槽１内の気相部のガス濃度・ガス組成を一定に制御する。また、培養液の温度を一定に制御する。このような一定制御によると、細胞が撹乱され難くなり、所定の細胞密度まで安定に増殖させることができる。気相部のガス濃度・ガス組成は、通常用いるインキュベータの庫内雰囲気と一致させることが好ましい。
　続いて、静置培養中に、細胞の増殖状態を表す指標値を取得する（ステップＳ４０）。細胞の増殖状態を表す指標値としては、細胞の増殖と相関を有する状態量、例えば、細胞数密度、比増殖速度、生存率、細胞の代謝反応速度、細胞の累積代謝量、細胞周期等を、分析装置８による実測で取得することができる。実測は、センサを用いてオンラインで行ってもよいし、培養液をサンプリングしてオフラインで行ってもよい。
　或いは、細胞の増殖状態を表す指標値としては、培養工程毎の培養時間を、タイマによって取得してもよい。また、培養工程毎の培養液成分の濃度を、分析装置８による実測で取得してもよい。細胞の増殖状態との関係が予め確認されている場合、細胞の状態量だけでなく、或る培養スケールの培養工程を開始した後の培養時間の経過や、培養液成分の濃度変化も、細胞の増殖状態の指標として用いることができる。
　静置培養中、細胞の増殖状態を表す指標値が取得されると、静置培養されている細胞が目標増殖状態に達したか否かについて判定が行われる（ステップＳ５０）。制御装置９は、分析装置８が取得した分析データを受信し、細胞の状態量、又は、培養時間、又は、培養液成分の濃度について、実測で取得された指標値と、予め設定されている目標値と、を比較する。実測で取得された指標値が目標値を超えているか否かに基づいて、培養工程の進捗を判定することができる。
　判定の結果、目標増殖状態に達していないと（ステップＳ５０；Ｎｏ）、培養槽１の下部空間１１０で、同じ培養スケールの静置培養を続ける（ステップＳ３０）。
　一方、判定の結果、目標増殖状態に達していると（ステップＳ５０；Ｙｅｓ）、培養方式の切り替えに必要な切替条件が充足されたか否かについて判定が行われる（ステップＳ６０）。制御装置９は、静置培養における実際の継代数（サイズアップの回数）と、培養スケジュールとして定めた目標継代数と、を比較する。実際の継代数を表すパラメータが目標継代数値に達したか否かにより、培養方式の切り替えを行うことができる。
　例えば、下部空間１１０内における液面の高さを、図２にＩ線～IV線で示すように切り上げていく場合、静置培養中の継代数は４回となる。継代数との関係が予め確認されている場合には、細胞の状態量、又は、培養液成分の濃度について、実測で取得された指標値と、予め設定されている静置培養における目標値と、を比較してもよい。実測で取得された指標値が静置培養における目標値を超えているか否かに基づいて、継代の進捗を判定して、培養方式の切り替えを行うこともできる。
　判定の結果、目標継代数に達していないと（ステップＳ６０；Ｎｏ）、供給ポンプ７を作動し、培地タンク５から培養槽１内に所定量の新鮮培地を補充して、次段階の培養スケールまで培養液量を拡大する（ステップＳ７０）。このとき、制御装置９は、実際の継代数を表すパラメータを加算する。そして、培養槽１の下部空間１１０で、拡大された培養スケールの静置培養を続ける（ステップＳ３０）。
　一方、判定の結果、目標継代数に達していると（ステップＳ６０；Ｙｅｓ）、培養方式を静置培養から攪拌培養に切り替え、攪拌機２を作動し、培養槽１の下部空間１１０及び上部空間１２０において新鮮培地の補充により増量した培養液中で細胞を攪拌培養する（ステップＳ８０）。攪拌培養は、培養槽１内の上部空間１２０に位置する攪拌翼２ａにより培養液を攪拌すると共に、液面が上部空間１２０内の所定の高さとなる培養スケールを維持して行う。
　攪拌培養中には、温度センサ、溶存酸素センサ、二酸化炭素センサ、ｐＨセンサ等によって培養状態をモニタリングする。培養温度は、温度調節装置４で所定の範囲に制御する。また、培養液の溶存酸素濃度や二酸化炭素濃度は、散気装置２による空気、酸素、二酸化炭素、窒素等の通気で所定の範囲に制御する。また、培養液のｐＨは、アルカリ溶液の添加や二酸化炭素の通気で制御する。
　続いて、攪拌培養中に、細胞の増殖状態を表す指標値を取得する（ステップＳ９０）。細胞の増殖状態を表す指標値としては、静置培養における処理（ステップＳ４０参照）と同様に、細胞の状態量、又は、培養時間、又は、培養液成分の濃度を取得することができる。
　攪拌培養中、細胞の増殖状態を表す指標値が取得されると、攪拌培養されている細胞が目標増殖状態に達したか否かについて判定が行われる（ステップＳ１００）。制御装置９は、分析装置８が取得した分析データを受信し、細胞の状態量、又は、培養時間、又は、培養液成分の濃度について、実測で取得された指標値と、予め設定されている培養工程毎の目標値と、を比較する。実測で取得された指標値が培養工程毎の目標値を超えているか否かに基づいて、培養工程の進捗を判定することができる。
　判定の結果、目標増殖状態に達していないと（ステップＳ１００；Ｎｏ）、培養槽１の下部空間１１０及び上部空間１２０で、同じ培養スケールの攪拌培養を続ける（ステップＳ８０）。
　一方、判定の結果、目標増殖状態に達していると（ステップＳ１００；Ｙｅｓ）、培養の終了に必要な終了条件が充足されたか否かについて判定が行われる（ステップＳ１１０）。制御装置９は、攪拌培養における実際の継代数（サイズアップの回数）と、培養スケジュールとして定めた目標継代数と、を比較する。実際の継代数を表すパラメータが目標継代数値に達したか否かにより、拡大培養の継続・終了を決める。
　例えば、上部空間１２０内における液面の高さを、図２にＶ線～VI線で示すように切り上げていく場合、攪拌培養中の継代数は２回となる。継代数との関係が予め確認されている場合には、細胞の状態量、又は、培養液成分の濃度について、実測で取得された指標値と、予め設定されている攪拌培養における目標値と、を比較してもよい。実測で取得された指標値が攪拌培養における目標値を超えているか否かに基づいて、継代の進捗を判定して、拡大培養の継続・終了を決めることもできる。
　判定の結果、目標継代数に達していないと（ステップＳ１１０；Ｎｏ）、供給ポンプ７を作動し、培地タンク５から培養槽１内に所定量の新鮮培地を補充して、次段階の培養スケールまで培養液量を拡大する（ステップＳ１２０）。このとき、制御装置９は、実際の継代数を表すパラメータを加算する。そして、培養槽１の下部空間１１０及び上部空間１２０で、拡大された培養スケールの攪拌培養を続ける（ステップＳ８０）。
　一方、判定の結果、目標継代数に達していると（ステップＳ１１０；Ｙｅｓ）、攪拌機２を停止し、拡大培養を終了する（ステップＳ１３０）。その後、目的の物質を大量生産する生産培養の工程、又は、細胞が産生した物質の回収・精製を行う分離精製工程に移行する。
　以上の培養装置１００や培養方法によると、所定の形状・構造の培養槽内に新鮮培地を補充することができるため、培養液量を段階的に増やし、その途中に、培養方式を静置培養から攪拌培養に切り替える拡大培養を、単一の培養槽１を用いて行うことができる。一般的な培養容器やバイオリアクタは、底部が平面であることが多く、形状・構造が最適化されていないところ、培養槽１の下部空間１１０を、数式（Ｉ）の関係を満たす形状とし、適切な攪拌方式の構造とすると、細胞の比増殖速度や生存率が高くなる。よって、培養液量及び培養方式が互いに異なる複数の培養工程を、良好な培養効率を維持して、一つの培養槽で段階的に行うことができる。
　特に、以上の培養装置１００や培養方法によると、培養液の移し替えを不要化することができるため、培養液の移し替え作業の煩雑性に関する問題や、培養液及び細胞の取り扱い性に関する問題や、培養液の移し替え時等のコンタミネーションに関する問題を解消することができる。培養装置１００によると、全培養工程を完全閉鎖系で自動化させて行うことも可能であり、手作業が介在し難くなるため、培養の再現性や、目的の物質の生産量・品質を向上させることができる。また、培養スケール毎に個別のバイオリアクタを用意する必要がないため、培養装置や培養施設を小型化することができる。また、回分培養式の拡大培養を行うため、灌流培養式と比較して、培養環境を容易に安定させることができる。
＜培養装置（灌流培養式）＞
　次に、培養方式が異なる本発明の別の実施形態について、図を参照しながら説明する。
　図１５は、本発明の実施形態に係る培養装置の一例を模式的に示す図である。
　図１５に示すように、本実施形態に係る培養装置２００は、培養槽１と、攪拌機２と、散気装置３と、温度調節装置４と、培地タンク５と、バルブ６と、供給ポンプ７と、分析装置８と、制御装置９と、回収タンク１０と、細胞分離装置１１と、引抜ポンプ１２と、吸引ポンプ１３と、供給管２０と、引抜管２２と、返送管２３と、回収管２４と、を備えている。
　培養装置２００は、前記の培養装置１００と同様に、細胞を拡大培養するための装置であり、拡大培養中の培養槽１に新鮮培地（培養液）を補充して培養スケールを拡大する機能を有している。培養装置２００では、培養槽１に新鮮培地を補充することにより、培養スケールが段階的に拡大されて、多段階の培養工程が行われる。図１５に示す培養装置２００は、それぞれの培養工程を、培養中に連続的に培地を供給し、且つ、同量の培地を連続的に排出する灌流培養（連続培養）の形式で行う形態とされている。
　培養装置２００では、培養スケールを段階的に拡大していく途中に、培養方式を静置培養から攪拌培養に切り替えることができる。そのため、大スケールを最終目標とした灌流培養式の拡大培養を、単一の培養槽１で行うことができる。培養装置２００の構成や、主な運転方法は、細胞分離装置１１や、これに対応するポンプ・配管を除いて、前記の培養装置１００と略同様である。
　図１５に示すように、培養装置２００の培養槽１には、培養槽１内から培養液及び培養された細胞を引き抜くための引抜管２２が接続される。引抜管２２の他端には、培養槽１内から引き抜かれた培養液と細胞とを互いに分離する細胞分離装置１１が接続される。引抜管２２には、培養槽１から細胞分離装置１１に培養液及び培養された細胞を引き抜く引抜ポンプ１２が備えられる。
　細胞分離装置１１には、培養液から分離された細胞を培養槽１内に戻すための返送管２３が接続される。返送管２３の他端は、培養槽１に接続される。また、細胞分離装置１１には、細胞を分離された培養液を回収するための回収管２４が接続される。回収管２４の他端には、回収タンク１０が接続される。回収管２４には、細胞分離装置１１から培養液を吸引する吸引ポンプ１３が備えられる。
　細胞分離装置１１は、例えば、分離膜に直交する方向に液体を流すタンジェンシャルフロー膜分離（Tangential Flow Filtration：ＴＦＦ）方式、分離膜に直交する方向に液体を流し、分離膜に対する吸引と放出とを交互に繰り返すオルタネーティングタンジェンシャルフロー膜分離（Alternating Tangential Flow Filtration：ＡＴＦ）方式、重力沈降分離方式、大きさや密度の違いを超音波振動で分ける音波分離方式等の各種の方式とすることができる。
　図１６は、培養装置に備えられる培養槽の内部空間の形状・構造を説明する図である。
　図１６に示すように、培養装置２００に備えられる培養槽１は、内幅が高さ方向に一様でなく、槽内に、相対的に狭い内幅を有する下部空間１１０と、相対的に広い内幅を有する上部空間１２０と、を有している。引抜管２２は、培養槽１の下方に向けて突出した下部空間１１０の底部に接続している。
＜培養方法（灌流培養式）＞
　次に、本発明の一実施形態に係る培養方法について、培養装置２００を用いた場合の処理と共に、図を参照しながら説明する。
　培養装置２００では、前記の培養装置１００と同様に、培養槽１内の培養液量を新鮮培地の補充により段階的に拡大し、培養液量が互いに異なる複数の培養工程を段階的に行う。その途中には、培養方式を静置培養から攪拌培養に切り替え、静置培養と、新鮮培地の補充により増量した培養液中における攪拌培養とを、単一の培養槽１で段階的に行う。培養装置２００を用いた灌流培養式の拡大培養は、前記の培養装置１００と同様に、図１４に示す流れで行うことができる。
　培養装置２００において、灌流培養は、静置培養の培養工程（図１４のステップＳ３０参照）のみで行ってもよいし、攪拌培養の培養工程（図１４のステップＳ８０参照）のみで行ってもよいし、これらの両方で行ってもよい。また、静置培養の培養工程、及び、攪拌培養の培養工程のうち、所定の培養スケールの培養工程のみで行ってもよい。灌流培養を行わない培養工程は、回分培養の方式で運転することができる。
　培養装置２００には、前記の培養装置１００と同様に、細胞の培養に必要な培養条件を設定することができる。設定する培養条件の項目としては、前記の培養装置１００の項目に加え、灌流培養を行う培養工程を定めた培養スケジュールや、培養工程毎の灌流量が挙げられる。
　灌流培養中には、引抜ポンプ１２を作動させて、培養槽１内から培養液及び培養された細胞を引き抜く。また、供給ポンプ７を作動させて、培地タンク５から培養槽１内に培養液を補充する。そして、細胞分離装置１１で、引き抜かれた培養液と細胞とを互いに分離する。その後、分離された細胞を培養槽内に戻すと共に、吸引ポンプ１３を作動させて、細胞が産生した物質を含む培養液を回収タンク１０に回収する。
　静置培養の培養工程（図１４のステップＳ３０参照）で灌流培養を行う場合には、攪拌機２を停止した状態で、液面が下部空間１１０内の所定の高さとなる培養スケールを維持しながら、一定に制御した培養条件の下で灌流培養を行う。静置培養の培養工程を灌流培養とすると、栄養の枯渇や、細胞が分泌した老廃物の蓄積が、起こり難くなる。そのため、所定の培養スケールあたり、より高い細胞密度まで増殖させることができる。最終的な細胞数が増えるため、培養槽１自体を小型化することも可能になる。
　一方、攪拌培養の培養工程（図１４のステップＳ８０参照）で灌流培養を行う場合には、培養液を攪拌すると共に、液面が上部空間１２０内の所定の高さとなる培養スケールを維持しながら、可変的に制御される培養条件の下で灌流培養を行う。攪拌培養の培養工程を灌流培養とすると、所定の培養スケールあたり、より高い細胞密度まで増殖させることができるだけでなく、細胞が培養液中に分泌した物質を連続的に回収することができる。細胞の増殖が阻害され難い状態で、目的の物質を連続生産させることができるため、高い生産性を実現することができる。
　以上の培養装置２００や培養方法によると、所定の形状・構造の培養槽内に新鮮培地を補充することができるため、前記の回分培養式の培養装置１００や培養方法と同様に、培養液量を段階的に増やし、その途中に、培養方式を静置培養から攪拌培養に切り替える拡大培養を、単一の培養槽１を用いて行うことができる。培養槽１の下部空間１１０を、数式（Ｉ）の関係を満たす形状とし、適切な攪拌方式の構造とすると、細胞の比増殖速度や生存率が高くなる。よって、培養液量及び培養方式が互いに異なる複数の培養工程を、良好な培養効率を維持して、一つの培養槽で段階的に行うことができる。
　特に、以上の培養装置２００や培養方法によると、灌流培養式の拡大培養を行うため、回分培養式と比較して、より高い細胞密度まで増殖させることが可能であり、培養装置や培養施設を、より容易に小型化することができる。細胞が増殖を阻害する物質を大量に分泌するような場合であっても、サイズアップの回数を減らした培養スケジュールを設定して、多量の細胞や多量の目的物質を得ることができる。
　以上、本発明について説明したが、本発明は、前記の実施形態や変形例に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。例えば、本発明は、必ずしも前記の実施形態や変形例が備える全ての構成を備えるものに限定されない。或る実施形態や変形例の構成の一部を他の構成に置き換えたり、或る実施形態や変形例の構成の一部を他の形態に追加したり、或る実施形態や変形例の構成の一部を省略したりすることができる。
　例えば、前記の培養装置１００，２００は、培地タンク５の個数、その他の機器の配置、配管の接続等が、制限されるものではない。培養槽１は、形状例や構造例に示される適宜の形態とすることが可能であり、攪拌機２だけでなく、散気装置３の配置や配管の接続位置についても、攪拌機２と同様に、最適化することができる。
　また、前記の培養装置１００，２００は、散気装置３に加え、気相部に所定のガスを通気するための不図示の散気装置を備えることもできる。このような場合、培養液に対して散気を行う散気装置３は、下部空間１１０及び上部空間１２０のいずれに開口させてもよい。
　また、前記の培養装置１００，２００は、培養槽１と補充装置（５，７）とが、予め接続されたものであってもよいし、培養時に接続されるものであってもよい。培養槽１としてシングルユース式の培養バッグを用いる場合、攪拌機２は、所定の配置となるように予め固定してもよいし、所定の位置に培養時に固定してもよい。
　また、前記の培養装置１００，２００は、補充装置として、培地タンク５と、供給ポンプ７と、を備えている。しかしながら、新鮮培地の供給には、供給ポンプ７に代えて、重力や圧力差を利用してもよい。このような場合、補充装置としては、重力や圧力差を利用して新鮮培地を補充する培地タンク５のみを備えてもよい。培地タンク５としては、各種の容器や、可撓性のバッグ等を備えてもよい。
　また、前記の培養装置１００，２００を用いる培養方法（図１４参照）は、培養槽１における拡大培養の終了後に、生産培養を行うものとしている。しかしながら、生産培養の工程は、培養槽１を使用して行ってもよいし、培養槽１や回収タンク１０から別の培養槽に移し替えて行ってもよい。
　また、前記の培養装置１００，２００を用いる培養方法（図１４参照）は、静置培養の培養工程や、攪拌培養の培養工程を、それぞれ、一段階の培養工程とする培養スケジュールとしてもよい。前記の培養方法においては、供給ポンプ７や攪拌機２の作動・停止の時期を、適宜の条件に変更してもよいし、培養スケールが大きく変化しない範囲で流加培養式の拡大培養を行ってもよい。
　以下、実施例を示して本発明について具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれに限定されるものではない。
　培養スケールを段階的に拡大していく途中に、培養方式を静置培養から攪拌培養に切り替える拡大培養を、単一の培養槽を用いて行い、回分培養式の場合と、灌流培養式の場合とで、培養成績を比較した。
（実験方法）
　供試細胞としては、浮遊細胞系であるＣＨＯ細胞を用いた。また、培地としては、ＤＭＥＭ培地の液体培地を用いた。凍結されているＣＨＯ細胞を、３７℃のウォータバス中で融解し、新鮮培地を加えることによって、０．２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度となる細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液５ｍＬを培養槽に入れて、気相部のガス組成が、大気中５％ＣＯ２、培養液の温度が、３７℃となるように調整し、拡大培養を開始した。
　拡大培養の培養スケール、サイズアップの回数、攪拌方式を切り替える時期等は、図１７に示す従来例と同様とした。拡大培養の培養スケジュールの概要を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示すように、培養工程Ｉから培養工程IIIまでは、静置培養とした。培養工程IVから培養工程IXまでは、攪拌培養とした。培養スケールの拡大は、予め設定した培養時間が経過した時点で、３７℃の新鮮培地を培養液量が設定どおりになるように補充して行った。培養工程IXの終了後には、細胞が産生した物質の回収・精製を行う分離精製工程に移行した。
　各培養スケールの培養工程が終了した時点で、生細胞数と細胞の生存率を求めた。そして、全培養工程を回分培養式とした場合と、全培養工程を灌流培養式とした場合とについて、培養結果の比較を行った。
　図１８は、単一の培養槽で拡大培養を行った結果を示す図である。
　図１８において、左軸は、培養槽内で確認された生細胞の数密度［×１０５　ｃｅｌｌｓ／ｍＬ］、右軸は、培養槽内で確認された細胞の生存率［％］、横軸は、培養時間［日］を示す。▲のプロットは、回分培養式における生細胞の数密度の結果、△のプロットは、回分培養式における生存率の結果、●のプロットは、灌流培養式における生細胞の数密度の結果、○のプロットは、灌流培養式における生存率の結果である。
　図１８に示すように、回分培養式、及び、灌流培養式のいずれにおいても、高い生存率と、ある程度の生細胞数が得られることが確認された。回分培養式の結果と、灌流培養式の結果とを比較すると、灌流培養式の場合に、生細胞の数密度の最大値が５倍以上に高くなることが確認された。
　この結果は、図１７に示すような拡大培養を行う場合、７５Ｌから２０００Ｌまでのスケールアップを一段階で行うことが可能であり、４００Ｌ規模の培養槽を省略することができることを意味する。培養槽としては、従来法の場合よりも小型化された単一の槽を用いることができるといえる。また、灌流培養式の場合には、継代中に生存率の低下は見られず、回分培養式と比較して、より優れた培養効率を実現できるといえる。
１００　培養装置
２００　培養装置
１　　　培養槽
２　　　攪拌機
２ａ　　攪拌翼
２ｂ　　回転軸
２ｃ　　モータ
２ｄ　　振盪台
２ｅ　　ハブ（回転部材）
２ｆ　　偏心ピン（変換部材）
２ｇ　　ベルト
３　　　散気装置
４　　　温度調節装置
５　　　培地タンク
６　　　バルブ
７　　　供給ポンプ
８　　　分析装置
９　　　制御装置
１０　　回収タンク
１１　　細胞分離装置
１２　　引抜ポンプ
１３　　吸引ポンプ
２０　　供給管
２１　　排出管
２２　　引抜管
２３　　返送管
２４　　回収管
５０　　培養液
５２　　バイアル
５３　　フラスコ
５４　　スピナーフラスコ
５５　　バイオリアクタ
１１０　下部空間
１２０　上部空間

Claims (14)

  1. 　培養液中で細胞を培養するための培養槽と、
    　前記培養液を攪拌するための攪拌機と、
    　前記培養槽内に新鮮培地を補充する補充装置と、を備え、
    　前記培養槽内の下部空間は、上部空間よりも狭い内幅を有する下方に突出した形状である培養装置。
  2. 　請求項１に記載の培養装置であって、
    　前記培養槽内の下部空間は、前記下部空間に入れた前記培養液の体積をＶ［ｃｍ３］、前記下部空間に入れた前記培養液と気相との界面の面積をＳ［ｃｍ２］としたとき、次の数式（Ｉ）；
    　　Ｓ／Ｖ≦８［ｃｍ－１］　・・・（Ｉ）
    の関係を満たす形状である培養装置。
  3. 　請求項２に記載の培養装置であって、
    　前記培養槽内の下部空間は、錐体形状であり、
    　前記下部空間に入れた前記培養液の高さが、３／８ｃｍより大きい培養装置。
  4. 　請求項２に記載の培養装置であって、
    　前記培養槽内の下部空間は、柱体形状であり、
    　前記下部空間に入れた前記培養液の高さが、１／８ｃｍより大きい培養装置。
  5. 　請求項２に記載の培養装置であって、
    　前記培養槽内の下部空間は、球欠形状であり、
    　前記下部空間に入れた前記培養液の高さｈ［ｃｍ］が、前記下部空間に入れた前記培養液の体積をＶ［ｃｍ３］、前記下部空間に入れた前記培養液と気相との界面の面積をＳ［ｃｍ２］、前記球欠形状の半径をｒ［ｃｍ］、前記下部空間に入れた前記培養液と気相との界面の半径をｃ［ｃｍ］としたとき、次の数式（Ｉ）、（II）及び（III）；
    　　Ｓ／Ｖ≦８［ｃｍ－１］　・・・（Ｉ）
    　　Ｖ＝π・ｈ（３ｃ２＋ｈ２）／６　・・・（II）
    　　Ｓ＝π・ｈ（２ｒ－ｈ）　・・・（III）
    の関係を満たす培養装置。
  6. 　請求項１に記載の培養装置であって、
    　前記攪拌機は、攪拌翼と、前記攪拌翼を回転させる回転軸と、を有し、
    　前記攪拌翼は、前記培養槽内の上部空間に位置し、
    　前記回転軸は、前記培養槽の上方から前記攪拌翼を支持している培養装置。
  7. 　請求項１に記載の培養装置であって、
    　前記攪拌機は、攪拌翼と、前記攪拌翼を回転させる回転軸と、を有し、
    　前記攪拌翼は、前記培養槽内の上部空間に位置し、
    　前記回転軸は、前記培養槽の中心軸から偏心した前記培養槽の下方から前記攪拌翼を支持している培養装置。
  8. 　請求項１に記載の培養装置であって、
    　前記攪拌機は、前記培養槽を支持する振盪台と、前記振盪台の振盪運動を駆動する回転部材と、前記回転部材の回転運動を前記振盪運動に変換する変換部材と、を有し、
    　前記振盪台に支持される前記培養槽の中心軸は、前記回転部材の中心軸から偏心している培養装置。
  9. 　請求項１に記載の培養装置であって、
    　前記培養槽内から前記培養液及び前記細胞を引き抜くための引抜管と、
    　前記培養槽内から引き抜かれた前記培養液と前記細胞とを互いに分離する細胞分離装置と、
    　前記培養液から分離された前記細胞を前記培養槽内に戻すための返送管と、を備える培養装置。
  10. 　培養槽内の下部空間において培養液中で細胞を静置培養し、
    　前記静置培養の後に、前記培養槽内に新鮮培地を補充し、
    　前記新鮮培地の補充により増量した培養液中で前記細胞を攪拌培養する培養方法。
  11. 　請求項１０に記載の培養方法であって、
    　前記静置培養において、前記培養槽内の気相部のガス濃度を一定に制御する培養方法。
  12. 　請求項１０に記載の培養方法であって、
    　前記攪拌培養において、前記培養槽内の上部空間に位置する攪拌翼により前記培養液を攪拌する培養方法。
  13. 　請求項１０に記載の培養方法であって、
    　前記静置培養及び前記攪拌培養のうち少なくとも一方において、前記培養槽内の培養液量を新鮮培地の補充により拡大し、培養液量が互いに異なる培養を行う培養方法。
  14. 　請求項１０に記載の培養方法であって、
    　前記静置培養及び前記攪拌培養のうち少なくとも一方において、前記培養槽内から前記培養液及び前記細胞を引き抜く共に、前記培養槽内に培養液を補充し、引き抜かれた前記培養液と前記細胞とを互いに分離し、分離された前記細胞を前記培養槽内に戻す灌流培養を行う培養方法。
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