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WO2020075788A1 - トリコデルマ・リーセイの変異株およびタンパク質の製造方法 - Google Patents

トリコデルマ・リーセイの変異株およびタンパク質の製造方法 Download PDF

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WO2020075788A1
WO2020075788A1 PCT/JP2019/039935 JP2019039935W WO2020075788A1 WO 2020075788 A1 WO2020075788 A1 WO 2020075788A1 JP 2019039935 W JP2019039935 W JP 2019039935W WO 2020075788 A1 WO2020075788 A1 WO 2020075788A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
amino acid
mutation
acid sequence
sequence represented
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2019/039935
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English (en)
French (fr)
Inventor
雄介 加川
紳吾 平松
山田　勝成
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Toray Industries Inc
Original Assignee
Toray Industries Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Toray Industries Inc filed Critical Toray Industries Inc
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Priority to JP2019567763A priority patent/JPWO2020075788A1/ja
Priority to BR112021006248A priority patent/BR112021006248A2/pt
Priority to US17/283,299 priority patent/US20210388410A1/en
Publication of WO2020075788A1 publication Critical patent/WO2020075788A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/885—Trichoderma

Definitions

  • the present invention relates to a mutant strain of Trichoderma reesei, which can keep the viscosity of a culture solution low, and improves protein production ability, and a method for producing a protein using the mutant strain.
  • Trichoderma reesei has a high protein production ability, and studies on protein production using Trichoderma reesei have been conducted. Trichoderma reesei produces cellulase classified as a saccharifying enzyme among proteins using cellulose, lactose, cellobiose and the like as inducers. In order to enhance the amount of cellulase produced, many studies have been conducted since ancient times such as overexpression of factors controlling cellulase production, modification of genes such as deficiency, and optimization of culture conditions.
  • Trichoderma sp. Belongs to aerobic filamentous fungi that require oxygen for growth and protein production.
  • Trichoderma spp. Has the feature that when it is cultured in a liquid medium, the viscosity of the culture solution increases as it grows. When the viscosity of the culture solution increases, the distribution of oxygen and nutrients becomes non-uniform, so when culturing Trichoderma spp, the culture solution may be stirred or the oxygen supply may be increased to dissolve it in the culture. It is necessary to prevent a decrease in oxygen saturation and maintain it at a certain level or higher.
  • the oxygen transfer capacity coefficient decreases as the size of the culture tank increases, it is necessary to further increase the number of agitation and the oxygen supply amount in order to maintain the dissolved oxygen saturation during culture at a certain level or higher.
  • increasing the agitation number causes a large shear damage to the cells, and there is also a problem that a larger energy is required to increase the oxygen supply amount.
  • Patent Documents 1 to 6 during the aerobic fermentation in the subculture compared to the parent strain before mutation, by reducing the disruption or production of Sfb3, Mpg1, Gas1, Seb1, Crz1 and Tps1 proteins of Trichoderma sp. It is disclosed that it becomes possible to maintain the amount of dissolved oxygen of the above with a low stirring number. Further, Patent Document 7 describes that disruption of the BXL1 gene of Trichoderma sp. Can suppress the decrease in the dissolved oxygen saturation of the culture solution.
  • the present inventors reduce the energy required for agitation even when the culture scale is enlarged, if the viscosity of the culture solution can be kept low during the production of protein by liquid culture using Trichoderma reesei. It was thought that it is possible to suppress the decrease in the dissolved oxygen saturation in the culture solution.
  • an object of the present invention is to provide a method for obtaining a mutant strain of Trichoderma reesei that reduces the viscosity of a culture solution and a method for producing a protein using the mutant strain of Trichoderma reesei.
  • the present inventor has conducted extensive studies to identify a Trichoderma reesei gene capable of keeping the viscosity of a culture medium low, and as a result, the Trichoderma mutated polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 has been identified.
  • Culturing a mutant strain of Reisei preferably a mutant strain having a mutation in one or more polypeptides selected from the polypeptides consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 6, 7, 9, and 10.
  • the viscosity of the culture broth can be kept low, and further, the decrease in the saturated oxygen saturation in the culture broth can be suppressed, and the present invention has been completed.
  • the present invention comprises the following (1) to (14).
  • a mutant strain of Trichoderma reesei which has a mutation in which the function of the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 is deleted or reduced.
  • the mutation is a mutation of the aspartic acid residue at position 1791 from the N-terminal side of the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 to an amino acid residue other than aspartic acid.
  • the mutant strain described.
  • mutant strain according to (3) wherein the mutation is a stop codon mutation that terminates translation at the 137th position from the N-terminal side of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6.
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 is located between the GAL4-like Zn2Cys6 binary cluster DNA-binding domain and the amino acid sequence having a mutation in the amino acid sequence of the fungal transcription factor regulatory regularity region.
  • the mutant strain of Trichoderma reesei of the present invention can keep the viscosity of the culture solution lower than that of the parent strain of Trichoderma reesei before the introduction of the mutation, and also suppresses the decrease in the dissolved oxygen saturation in the culture solution. You can Further, an unexpected effect that the production amount of protein, especially cellulase is also improved can be obtained.
  • the present invention is characterized in that the viscosity of the culture solution can be kept low by introducing a mutation into the parent strain of Trichoderma reesei, which is a microorganism originally excellent in protein-producing ability.
  • the parent strain of Trichoderma reesei used in the present invention is not limited to the wild strain, and a mutant strain of Trichoderma reesei improved so as to enhance the protein production ability can also be preferably used as the parent strain.
  • a mutant strain of Trichoderma reesei is subjected to a mutation treatment with a mutagen or ultraviolet irradiation, and the mutant strain having improved protein productivity can be used as the parent strain.
  • mutant strain used as the parent strain are Trichoderma paralysei (ATCC MYA-4777), which is an ancestor of Trichoderma reesei, QM6a strain (NBRC31326), which is a known mutant strain derived from Trichoderma reesei, and QM9123 strain (ATCC24449).
  • QM9414 strain NBRC31329)
  • PC-3-7 strain ATCC66589
  • QM9123 strain NBRC31327)
  • RutC-30 strain ATCC56765
  • CL-847 strain Enzyme.Microbiol.Technol.10,341-346 (1988).
  • MCG77 strain Biotechnol. Bioeng. Symp.
  • the QM6a strain, the QM9414 strain, and the QM9123 strain can be obtained from NBRC (NITE Biological Resource Center), and the PC-3-7 strain and the RutC-30 strain can be obtained from ATCC (American Type Culture Collection).
  • the present invention is a mutant strain of Trichoderma reesei having a mutation in which the function of the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 is deleted or reduced, and preferably, further, SEQ ID NO: 6, 7, 9, 10 It is a mutant strain having one or more polypeptides selected from the polypeptides consisting of the amino acid sequences represented by either of the following mutations. In the present specification, these mutants may be referred to as the mutants of the present invention.
  • the strain before the introduction of the mutation may be referred to as a parent strain in the present specification.
  • the mutant strain of the present invention has a lower viscosity of the culture medium and a lower saturation of dissolved oxygen in the culture medium than the parent strain.
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 is a polypeptide having a total length of 4,373 amino acids possessed by Trichoderma reesei, and in the National Center for Biotechnology Information, the Dynein heavy17 chain (EGR517 chain of the Trichoderma reesei QM6a strain is possessed. ) Is also registered.
  • Dynein is one of the motor proteins found in eukaryotes, and is a protein that moves along microtubules that make up the cytoskeleton including microtubes by the energy obtained by hydrolysis of ATP. .
  • Dynein heavy chain is a heavy chain that constitutes Dynein, and forms a main skeleton of dynein, and is a protein responsible for converting energy obtained by hydrolysis of ATP into motion (D Eshel, Cytoplasmic dynein is required for normal nuclear segmentation in yeast, Proceedings of the National Academia of Sciences of the 17th, United States of America, 76 States of America, 90 States of America, States of America, 90, 176, 90, and 90%.
  • a specific example of the gene encoding the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 is the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 of the Trichoderma reesei QM6a strain.
  • Examples of methods for deleting or decreasing the function of the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 include a method for introducing a mutation that causes a total deletion of Dynein heavy chain and a partial deletion of Dynein heavy chain, Specifically, there may be mentioned a method of introducing a frame shift mutation or a stop codon mutation into a gene sequence encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 by deleting, inserting or substituting bases. .
  • Dynein heavy chain deficiency refers to a loss of the polypeptide, a loss of the polypeptide, a change of all different amino acids, a change of some different amino acids, or a combination thereof. More specifically, it means that the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 has a sequence identity of 80% or less with the amino acid sequence of Dynein heavy chain shown above, preferably 50% or less, and further preferably Is 20% or less, more preferably 10% or less, further preferably 5% or less, further preferably 3% or less, further preferably 1% or less, and most preferably 0%. .
  • Having a mutation in the amino acid sequence constituting Dynein heavy chain may be a deletion, substitution, or addition of amino acids.
  • it is a mutation of the 1,791st aspartic acid residue from the N-terminal side of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 to an amino acid residue other than the aspartic acid residue, and the amino acid residue after the mutation is Although not particularly limited, it is more preferably mutated to asparagine.
  • SEQ ID NO: 3 is given as a specific example of a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence in which the 1,791th aspartic acid residue from the N-terminal side of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 is mutated to an amino acid residue other than aspartic acid.
  • guanine which is the 5,541st base
  • SEQ ID NO: 8 the 1,791st amino acid residue from the N-terminal side of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 is mutated from aspartic acid to asparagine.
  • the function of the polypeptide may be reduced by introducing a mutation that reduces the expression of the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 or eliminates the expression. It may be due to a decrease or disappearance of the expression level of the polypeptide due to mutation of the promoter or terminator region of the gene encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8.
  • the promoter and terminator regions correspond to regions of several hundred bases before and after the gene involved in transcription.
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 is a polypeptide having a total length of 861 amino acids possessed by Trichoderma reesei, and at the National Center for Biotechnology Information, the N-terminal binuclear Zn cluster possessed by the Trichoderma reesei QM6a strain. It is also registered as a contenting / DNA binding domain-containing protein (EGR44896).
  • N-terminal binary CL cluster-containing / DNA binding domain-containing protein is a protein that binds to DNA because it has a motif consisting of two helices consisting of Zn2Cys6 motif that binds to the DNA internal to the transcription factor GAL4.
  • a specific example of the gene encoding the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 is the nucleotide sequence represented by Trichoderma reesei SEQ ID NO: 1.
  • N-terminal binary CL cluster-containing / DNA binding domain-containing protein is completely deficient, N-terminal binuclear Zn-cluster-
  • a method of introducing a mutation that partially deletes the content / DNA binding domain-containing protein includes methods that introduce frameshift mutations or stop codon mutations by deleting, inserting, or replacing bases. .
  • N-terminal binary Zn cluster-containing / DNA binding domain-containing protein means that the polypeptide is completely eliminated, some are lost, all are changed to different amino acids, or some are changed to different amino acids. Refers to a combination. More specifically, in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, it is said that the sequence identity with the amino acid sequence of N-terminal binuclear Zn cluster-containing / DNA binding domain-maintaining protein is 80% or less. Preferably 50% or less, more preferably 20% or less, further preferably 10% or less, further preferably 5% or less, further preferably 3% or less, further preferably 1% or less. % Or less, and most preferably 0%.
  • the 272nd to 307th amino acid residues from the N-terminal side are GAL4-like Zn2Cys6 binuclear clear DNA-bind38th amino acid residues from the 8th to the N-terminal side. It is disclosed that it is a fungal transcription factor regularity middle homology region, and it is represented by SEQ ID NO: 6 when a mutation such as deletion, substitution, or addition occurs in the amino acid sequence located in any of these domains. If the function of the polypeptide consisting of the amino acid sequence is It is possible.
  • GAL4-like tractor gluing-fractal gluing-unsuccessful gluten-like gluing-unsaturated glucanic-unsaturated protein is a GAL4-like tractor undecorated gluing-unsuccessful gluten-like gluten-unsaturated gluten-unsaturated glucan-like glucan-like glucan-free glucanine-unsaturated glutinous undecreased glucanine glucanine glucanic fluorescein syrup that is responsible for the function of the N-terminal binary cluster-containing / DNA binding domain-containing protein.
  • the amino acid sequences that make up the homology region have disappeared From Ru
  • the function of the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 may be reduced by introducing a mutation that reduces or abolishes the expression of the polypeptide. It may be due to a decrease or disappearance of the expression level of the polypeptide due to mutation of the promoter or terminator region of the gene encoding the amino acid sequence represented by No. 6.
  • the promoter and terminator regions correspond to regions of several hundred bases before and after a gene involved in transcription.
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 is a polypeptide having a total length of 1,138 amino acids possessed by Trichoderma reesei, and according to National Center for Biotechnology Information, the precoded protein (EGR45926) possessed by the Trichoderma reesei QM6a strain is possessed. Is also registered.
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 is a polypeptide of unknown function, but according to the conserveed Domain Architectural Retrieval Tool of National Center for Biotechnology Information, 468 to 721 amino acid residues are located from the N-terminal side.
  • LRRS Leucine-rich repeats
  • RI ribbonase inhibitor
  • ribbonase inhibitor-like subfamily domains means that the domain is completely eliminated, some are lost, all are changed to different amino acids, some are changed to different amino acids, or a combination thereof. More specifically, it indicates that the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 has a sequence identity of 80% or less with the amino acid sequences of the Leucine-rich repeats and the ribbonase inhibitor-like subfamily shown above, and is preferably Is 50% or less, more preferably 20% or less, further preferably 10% or less, further preferably 5% or less, further preferably 3% or less, further preferably 1% or less. Yes, and most preferably 0%.
  • the function of the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 is deleted or reduced by mutation such as deletion, substitution, or addition in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7,
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 there is a frameshift mutation due to the insertion of one base of adenine at the 988th position. Due to the mutation, the 297th amino acid from the N-terminal side of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 was substituted from aspartic acid to arginine, and as a result of the frame shift thereafter, Leucine-rich repeats, ribonuclease inhibitor-like subfamily domains were formed. The amino acid sequence that acts on the protein disappears, whereby the function as the original protein is lost or reduced.
  • the function of the polypeptide may be reduced or deleted by introducing a mutation that reduces the expression of the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 or eliminates the expression. May be due to a decrease or elimination of the expression level of the polypeptide due to a mutation in the promoter or terminator region of the gene encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7.
  • the promoter and terminator regions correspond to regions of several hundred bases before and after a gene involved in transcription.
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 is a polypeptide having a total length of 937 amino acids possessed by Trichoderma reesei, and in National Center for Biotechnology Information, Trichoderma reesei QM6a strain also has a hypothetical protein (EGR4896) as a hypothetical protein. It is registered. According to the conserveed Domain Architectural Retrieval Tool of National Center for Biotechnology Information, the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 has a transcription factor of GAL4 at the 76th to 108th amino acid residues from the N-terminal side.
  • the domain consisting of two helices consisting of a Zn2Cys6 motif that binds to the DNA that it has and the amino acid residues 303 to 681 from the N-terminal side have a fungal transcription factor regulatory region domain.
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 is at least involved in the transcriptional regulation of filamentous fungi.
  • a specific example of the gene encoding the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 is the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 of Trichoderma reesei QM6a strain.
  • GAL4-like Zn2Cys6 binary cluster DNA-binding domain and / or fungal transcription factor GA4 domain deletion regulatory regulatory regulatory regulatory regulatory regulatory regulatory regulatory domain deficiency regulatory regulatory regulatory deficiency regulatory regulatory deficiency regulatory regulatory deficiency regulatory deficiency method is a method of reducing or deleting the function of the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9.
  • GAL4-like Zn2Cycle6bin Conformational changes the relationship between the luster DNA-binding domain and fungal transcription factor regulatory middle homology region domain, a method of introducing a mutation that is the total loss of a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 and the like.
  • GAL4-like Zn2Cys6 binary cluster DNA-binding domain and / or fungal transcription factor regulatory domain region amino acids are all partly different, some are completely different, some are all different Refers to changes or combinations thereof. More specifically, in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, the GAL4-like Zn2Cys6 binary cluster DNA-binding domain or the fungal transcription factor regularity% sequence 80% region amino acid sequence is identical to the amino acid sequence of the GAL4-like Zn2Cys6 binary cluster DNA-binding domain. It is preferably 50% or less, more preferably 20% or less, further preferably 10% or less, further preferably 5% or less, further preferably 3% or less. , More preferably 1% or less, and most preferably 0%.
  • GAL4-like Zn2Cys6 binuclear cluster The conformational changes the relationship between the DNA-binding domain and fungal transcription factor regulatory middle homology region domain, the GAL4-like Zn2Cys6 binuclear cluster DNA-binding domain and fungal transcription factor regulatory middle homology region domain Mutations that result in deletions, substitutions, or additions of amino acids in the intervening amino acid sequences.
  • GAL4-like Zn2Cys6 binary cluster DNA-binding domain and fungal transcription factor regularity domain domain are called protein domain, and protein domain is a part of the sequence structure of protein, and part of the sequence function of protein exists, and protein domain is a part of the sequence structure.
  • the three-dimensional structure consisting of multiple domains forms part of the three-dimensional structure of the protein. Therefore, if the configuration of the domains changes, the three-dimensional structure of the protein changes and the function of the protein decreases. To do.
  • GAL4-like Zn2Cys6 binary cluster DNA-binding domain and fungal transcription factor regularity domain Amino acid sequence located between the amino acid sequence located between the deletion and substitution is a deletion or substitution.
  • the 184th serine residue from the N-terminal side of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 is mutated to an amino acid residue other than serine, and the mutated amino acid residue is not particularly limited. Is preferably mutated to asparagine.
  • a specific example of a base sequence encoding an amino acid sequence in which the 184th serine residue from the N-terminal side of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 is mutated to an amino acid residue other than serine is represented by SEQ ID NO: 4.
  • a sequence in which adenine, which is the 550th base, is mutated to cytosine can be mentioned. Due to the mutation, the 184th amino acid residue from the N-terminal side of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 is mutated from serine to arginine.
  • the function of the polypeptide may be reduced by introducing a mutation that reduces the expression of the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 or eliminates the expression. It may be due to a decrease or disappearance of the expression level of the polypeptide due to a mutation in the promoter or terminator region of the gene encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9.
  • the promoter and terminator regions correspond to regions of several hundred bases before and after the gene involved in transcription.
  • Whether or not the function of the polypeptide is deficient or decreased in the mutant strain in which the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 is mutated depends on the decrease of the viscosity of the mutant strain culture solution with respect to the parent strain culture solution. You can check.
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 is a polypeptide having a total length of 342 amino acids possessed by Trichoderma reesei, and in the National Center for Biotechnology Information, it is also referred to as a predicted protein (EGR53142) possessed by the Trichoderma reesei QM6a strain. It is registered.
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 has a Fatty-based amino acid residue with 147 to 264 amino acids from the N-terminal side according to the conserveed Domain Architectural Retrieval Domain of the National Center for Biotechnology Information. Then it is disclosed.
  • polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 is presumed to have functions such as ⁇ -carotene hydroxylase, C-5 sterol desaturase, and C-4 sterol methyloxidase involved in zeaxanthin synthesis and the like. It A specific example of the gene encoding the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 is the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 of the Trichoderma reesei QM6a strain.
  • a method of reducing or deleting the function of the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 a complete deletion of the Fatty acid hydroxylase superfamily domain, a partial deletion of the Fatty acid hydroxylase superfamily domain, and represented by SEQ ID NO: 10
  • Examples include a method for introducing a mutation that causes a deletion of a polypeptide consisting of an amino acid sequence.
  • a gene sequence encoding the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 has a base of Examples thereof include a method of introducing a frameshift mutation or a stop codon mutation by deletion, insertion, substitution, etc.
  • Deletion of the Fatty acid hydroxylase superfamily domain means that the domain is completely eliminated, some are eliminated, all are changed to different amino acids, some are changed to different amino acids, or a combination thereof. More specifically, in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, it indicates that the sequence identity with the amino acid sequence of the F-box domain shown above is 80% or less, preferably 50% or less, It is more preferably 20% or less, still more preferably 10% or less, further preferably 5% or less, further preferably 3% or less, further preferably 1% or less, most preferably 0%. Is.
  • the function of the polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 may also be reduced by introducing a mutation that reduces the expression level or eliminates the expression. Alternatively, it may be due to a decrease or disappearance of the expression level of the polypeptide due to a mutation in the promoter or terminator region of the gene encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10.
  • the promoter and terminator regions correspond to regions of several hundred bases before and after a gene involved in transcription. Or it can be deleted.
  • the mutant strain of the present invention is a mutant strain of Trichoderma reesei having a mutation in which the function of the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 is deleted or reduced as described above, and preferably SEQ ID NO: 6, A mutant strain having the above mutation in one or more polypeptides selected from the polypeptides consisting of the amino acid sequences represented by 7, 9, and 10. The following combinations are mentioned as combinations of these mutations. To be
  • Mutant strains of the above combination are obtained by existing gene mutation methods such as mutation treatment known to those skilled in the art or mutation treatment with ultraviolet irradiation, homologous recombination using a selectable marker, or transposon mutation.
  • the spores of the parent strain Trichoderma reesei are subjected to gene mutation treatment using nitrosoguanidine (NTG), ethylmethanesulfonic acid (EMS), ultraviolet rays, etc., and the gene of the obtained mutant strain is obtained.
  • NTG nitrosoguanidine
  • EMS ethylmethanesulfonic acid
  • ultraviolet rays etc.
  • the mutant strain of the present invention has a lower viscosity of the culture medium and can also suppress lowering of the dissolved oxygen saturation in the culture medium, as compared with the parent strain before the introduction of the mutation. As a result, the energy required for stirring for the entire period and the number of rotations can be reduced. In addition, since the rotation speed of stirring can be set low, shear damage to the mycelia can be reduced. In particular, when culturing on a large scale, it is more effective because it leads to a reduction in the capacity of the blower and agitation motor and agitation energy required for aeration.
  • the mutant strain of the present invention has improved protein production ability as compared with the parent strain before the introduction of the mutation
  • the culture solution of the mutant strain of the present invention was obtained under the same culture conditions.
  • the protein concentration is increased compared to the culture medium of the parent strain before the introduction of the mutation.
  • the protein is an enzyme
  • the specific activity of the enzyme increases.
  • the increase rate of the protein concentration and the increase rate of the specific activity of the enzyme are not particularly limited as long as they are increased, but are preferably 20% or more.
  • the viscosity of the culture broth uses the value measured under the following conditions, and the comparison of the viscosities involves comparing the maximum values among the values measured under the following conditions.
  • the spores of the mutant strain of Trichoderma reesei to be evaluated and the spores of the parent strain were precultured so that 1.0 ⁇ 10 5 spores were prepared per 1 mL of the preculture medium. 1)) and cultivated in a shaking culture machine at 28 ° C. and 120 rpm until the amount of bacterial cells becomes about 11 g / L.
  • the pre-culture medium was adjusted to 10% (v / v) with respect to the main culture medium shown in Table 2 to which Arbocel B800 (manufactured by Rettenmeier) was added so as to be 100 g / L (w / v). Inoculate and subculture using a 5 L jar fermenter. A digital rotary viscometer is used to measure the viscosity of the culture solution. The digital rotational viscometer is calibrated at 0 points in advance. Designate the culture medium immediately after collection 17, 24, 41, 48, 65, 72, 89, 111 hours after the start of culture or 24, 48, 71, 89, 113, 137 hours after the start of culture, respectively.
  • the mutant strain of Trichoderma reesei of the present invention has a lower viscosity of the culture solution when compared with the case where the parent strain before the mutation is cultured under the same conditions, and the maximum value of the viscosity during the culture is preferably 80%.
  • the above is more preferably 70% or more, further preferably 60% or more, and most preferably 50% or more.
  • the maximum value of the viscosity of the mutant strain of the present invention during the culture is preferably 100 cP or more, more preferably 200 cP or more, more preferably 400 cP or more, more preferably 500 cP or more, as compared with the parent strain, and It is preferably 600 cP or more, more preferably 700 cP or more, further preferably 800 cP or more, further preferably 900 cP or more, particularly preferably 1,000 cP or more.
  • the dissolved oxygen saturation in the culture solution can be calculated by measuring the oxygen utilization rate in the culture solution.
  • the oxygen utilization rate (mM / L / hr) in the present invention refers to the oxygen consumption rate per 1 L of culture solution per unit time 24 hours after the start of culture.
  • the specific calculation method is as follows: culture is performed under constant culture conditions, the supply of oxygen is stopped at 24 hours after the start of culture, and the dissolved oxygen (mg / L) value (DO value) is plotted every 10 seconds. Then, the slope (A) (unit: DO / sec) of the plot of three or more points that logarithmically decreases in the curve is obtained. Equation 1 shown below is used for the calculation of the oxygen utilization rate.
  • Oxygen utilization rate (mM / L / hr) ( ⁇ A) ⁇ (1/32) ⁇ 60 ⁇ 60 (Equation 1).
  • a commercially available DO meter can be used to measure the DO value.
  • the DO meter used is not particularly limited as long as it can accurately measure the DO value. Examples include a closed DO electrode (made by Able Co., Ltd.) and a dissolved oxygen sensor (made by METTLER TOLEDO Co., Ltd.).
  • the DO meter is pre-calibrated with 0 point and span. Zero-point calibration is performed using a 2% sodium sulfite solution. In span calibration, aeration and agitation are performed in the absence of bacterial cells under actual culture conditions, wait until dissolved oxygen is saturated, and then confirm that the indicated value of the instrument is stable, Calibrate according to saturated dissolved oxygen.
  • the culture tank is large, it is necessary to correct the hydrostatic pressure. When performing the correction, the calculation is performed using Equation 2 below.
  • Dissolved oxygen saturation is the culture period for saturated dissolved oxygen when the pH and temperature are set as culture conditions using a culture medium containing no bacteria and the saturated state of dissolved oxygen when aerated is 100%. The ratio of the dissolved oxygen is calculated as the dissolved oxygen saturation.
  • Dissolved oxygen (mg / L) represents the concentration of oxygen dissolved in water. Saturated dissolved oxygen refers to dissolved oxygen in a state where the dissolved oxygen is constant by performing aeration and agitation in the absence of bacterial cells under the culturing conditions for actually culturing. Also, when calculating the dissolved oxygen saturation, the culture conditions such as aeration conditions should not be changed during the culture period. As oxygen demand decreases, dissolved oxygen saturation increases. The dissolved oxygen saturation is calculated according to the following equation 3.
  • Dissolved oxygen saturation (%) (dissolved oxygen during culture) / (saturated dissolved oxygen before the start of culture) ⁇ 100 (Equation 3).
  • the results obtained by aligning the culture conditions such as medium, oxygen supply rate, stirring rate, temperature, culture volume, and inoculum volume.
  • the amount of inoculum at the time of measurement is preferably about 10% (v / v) with respect to the main culture solution.
  • the mutant strain of the present invention and the dissolved oxygen of the parent strain are cultured under similar conditions, the mutant strain has a higher minimum value of the dissolved oxygen saturation than the parent strain, preferably 5% or more, more preferably 6% or more. , More preferably 7% or more, further preferably 8% or more, further preferably 9% or more, further preferably 10% or more, further preferably 11% or more, further preferably 12% or more, further preferably 13% or more, It is more preferably 14% or more, and particularly preferably 15% or more.
  • the mutant strain of the present invention does not have a reduced growth ability as compared with the parent strain before the introduction of the mutation.
  • the difference in proliferative ability can be compared by measuring the amount of bacterial cells.
  • the amount of bacterial cells is measured as the dry cell weight. 10 mL of the culture solution is suction filtered using a qualitative filter paper (grade 4, GE Healthcare), and the residue is dried together with the filter paper at 100 ° C. Then, the weight is measured, and the weight difference between the filter paper before and after filtration is defined as the dry cell weight.
  • the mutant strain of the present invention may have a mutation that improves the protein production amount and / or reduces the viscosity of the culture solution and suppresses the decrease in the dissolved oxygen saturation in the culture solution.
  • a mutation in the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 11, 13, 15, 17, 19, 22, and 24.
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 is a polypeptide possessed by Trichoderma reesei, and is registered in National Center for Biotechnology Information as EGR50654 of predicated protein possessed by the Trichoderma reesei QM6a strain.
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 is a polypeptide whose function is unknown, but according to the Censored Domain Retrieval Tool of National Center for Biotechnology Information, the 95th to 277th amino acid residues from the N-terminal side.
  • MIF4G domain Middle domain of eukaryotic initiation factor 4G domain
  • MA-3 domain amino acid residues 380 to 485 from the N-terminal side
  • MIF4G and MA-3 domains are known to have a function of binding to DNA or RNA (Biochem. 44, 12265-12272 (2005), Mol. Cell. Biol. 1, 147-156 (2007). )).
  • SEQ ID NO: 11 the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 is presumed to have at least the function of binding to DNA and / or RNA.
  • a specific example of a gene encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 is the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 12.
  • a gene mutation in which the function of EGR50654 is reduced or deleted includes all deletions of MIF4G domain and / or MA-3 domain possessed by EGR50654, partial deletion of MIF4G domain and / or MA-3 domain, MIF4G domain and MA-3 domain.
  • Gene mutations that change the configurational relationship with Furthermore, the function of the polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 can be reduced or deleted by introducing a mutation that reduces or eliminates the expression level of the polypeptide.
  • a specific example in which the function of the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 is lacking is that, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 12, any one of the 1,039th to 1,044th bases is missing. Mutations to lose.
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 is a polypeptide possessed by Trichoderma reesei, and is registered as EGR44419 of predictive protein possessed by the strain of Trichoderma reesei QM6a in the National Center for Biotechnology Information.
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 is a polypeptide whose function is unknown, but according to the Censored Domain Retrieval Tool of the National Center for Biotechnology Information, the remaining 26th to 499th amino acids from the N-terminal side.
  • the group is disclosed to have a “Sugar (and other) Transporter domain.
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 is capable of transporting sugar at least between the inside and outside of the bacterial cell. Presumed to be involved.
  • a specific example of a gene encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 is the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 14.
  • a gene mutation in which the function of EGR44419 is reduced or deleted refers to a total deletion of the Sugar (and other) Transporter domain, a partial deletion of the Sugar (and other) Transporter domain, and a configurational relationship of the Sugar (and other) Transporter domain.
  • the gene mutation which changes is mentioned.
  • the function of the polypeptide can be reduced or deleted by introducing a mutation that reduces or eliminates the expression level of the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13.
  • a specific example in which the function of the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 is lacking is a mutation in which 11 bases are inserted at the 1,415th position in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 14.
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 is a polypeptide possessed by Trichoderma reesei, and in the National Center for Biotechnology Information, the EGR registered as beta-adaptin large sub-unit 10 of Trichoderma reesei QM6a strain is registered. There is.
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 constitutes an adapter protein that constitutes vesicles involved in intracellular and extracellular transport that binds to clathrin, which is widely conserved in eukaryotes. It is one of the proteins (Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 101, 14108-14113 (2004)).
  • a specific example of a gene encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 is the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 16.
  • the gene mutation of EGR48910 includes mutation of cytosine, which is the 1,080th base in the base sequence represented by SEQ ID NO: 16, to adenine.
  • Trichoderma reesei which has no mutation in the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 by having a mutation in the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, the liquid culture At that time, the viscosity of the culture solution decreases.
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 is a polypeptide possessed by Trichoderma reesei, and is registered in National Center for Biotechnology Information as EGR45828 of predicated protein possessed by the strain of Trichoderma reesei QM6a.
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 is a polypeptide whose function is unknown, but according to the Censored Domain Retrieval Tool of National Center for Biotechnology Information, the 86th to 186th amino acids from the N-terminal side remain.
  • the group is disclosed as a heat shock factor (HSF) -type DNA-binding domain.
  • HSF heat shock factor
  • the HSF-type DNA-binding domain is known to have the function of binding to the upstream region of the gene encoding HSF, which is a transcription factor that regulates the expression of heat shock proteins (Cell, 65 (3), 363). -366 (1991)).
  • a specific example of a gene encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 is the base sequence represented by SEQ ID NO: 18.
  • a gene mutation in which the function of EGR45828 is reduced or deleted refers to a total deletion of the HSF-type DNA-binding domain possessed by EGR45828, a partial deletion of the HSF-type DNA-binding domain, and a configurational relationship of the HSF-type DNA-binding domain.
  • the gene mutation which changes is mentioned.
  • the function of the polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 can be reduced by introducing a mutation that reduces or eliminates the expression level of the polypeptide.
  • a specific example in which the function of the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 is defective is a mutation causing a frame shift in which one guanine nucleotide is inserted at position 85 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 18.
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 is a polypeptide possessed by Trichoderma reesei, which is also registered as a predicated protein (EGR47155) possessed by the Trichoderma reesei QM6a strain in the National Center for Biotechnology Information. .
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 is a polypeptide whose function is unknown, but according to the Censored Domain Retrieval Tool of National Center for Biotechnology Information, the 362nd to 553rd amino acids from the N-terminal side are left.
  • the group is disclosed as the TLD domain.
  • the TLD domain has an unknown function.
  • a specific example of the gene encoding the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 is the base sequence represented by SEQ ID NO: 20.
  • Examples of the gene mutation in which the function of EGR47155 is reduced or deleted include a total deletion of the TLD domain possessed by EGR47155, a partial deletion of the TLD domain, and a gene mutation in which the configurational relationship of the TLD domain is changed.
  • the function of the polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 can be reduced or deleted by introducing a mutation that reduces or eliminates the expression level of the polypeptide.
  • a specific example in which the function of the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 is lacking is a frame in which 46 bases represented by SEQ ID NO: 21 are inserted at the 6th position in the base sequence represented by SEQ ID NO: 20. Examples include shift mutations.
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 is a polypeptide possessed by Trichoderma reesei, which is also registered as a predicated protein (EGR48056) possessed by the Trichoderma reesei QM6a strain in National Center for Biotechnology Information. .
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 is a polypeptide whose function is unknown, but according to the Censored Domain Retrieval Tool of National Center for Biotechnology Information, the remaining 130 to 172 amino acids from the N-terminal side.
  • the group is disclosed as the F-box domain.
  • the F-box domain is known to be a domain found in proteins that control the cell cycle (Proc. Natl.
  • a specific example of the gene encoding the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 is the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 23.
  • Examples of the gene mutation in which the function of EGR48056 is reduced or deleted include a total deletion of the F-box domain possessed by EGR48056, a partial deletion of the F-box domain, and a gene mutation in which the configurational relationship of the F-box domain is changed.
  • the function of the polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 can be reduced or deleted by introducing a mutation that reduces or eliminates the expression level of the polypeptide.
  • a specific example in which the function of the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 is lacking is a frameshift mutation in which one base at the 499th cytosine in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 23 is deleted.
  • Trichoderma reesei in which the function of the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 is not reduced or deleted due to the decrease or loss of the function of the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22, Protein productivity is improved.
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24 is a polypeptide possessed by Trichoderma reesei, and in the National Center for Biotechnology Information, the glycosyltransferase family4 (76), which is also referred to as the glycosyltransferase family 46 (EGR), is registered in the Trichoderma reesei QM6a strain. Has been done.
  • Glycosyltransferase family 41 is a protein (The EMBO Journal, 27, 2080-2788 (2008)) composed of a dimeric complex, and N in the process of translocation of the nascent protein immediately after translation through the Golgi complex.
  • -It has a function of transferring acetylgalactosamine (GalNAc) to a serine or threonine residue which is an amino acid residue (Biochemistry, Fourth edition, 11,280-281 (1995)).
  • GalNAc acetylgalactosamine
  • a specific example of the gene encoding the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24 is the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 25.
  • the gene mutation in which the function of EGR46476 is reduced or deleted includes all deletions of glycosyltransferase family 41 and partial, which are possessed by EGR46476, partial deletion of glycosyltransferase family mutated 41, partial deficiency of glycosyltranferase family mutated, and partial variation of glyceryl morphylation of glycosyltransferase. Can be mentioned. Furthermore, the function of the polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24 can be reduced or deleted by introducing a mutation that reduces or eliminates the expression level of the polypeptide.
  • the stop codon is changed by mutating the 6261th cytosine to adenine.
  • Examples include mutations to be inserted.
  • Trichoderma reesei in which the function of the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24 is not reduced or deleted due to the decrease or loss of the function of the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24, Protein productivity is improved.
  • the present invention also relates to a method for producing a protein, which comprises a step of culturing the mutant strain.
  • the culture method for culturing Trichoderma reesei in the present invention is not particularly limited, and for example, liquid culture using a centrifuge tube, flask, jar fermenter, tank or the like, and solid culture using a plate or the like can be performed. .
  • Trichoderma reesei is preferably cultivated under aerobic conditions, and among these culturing methods, a jar fermenter and a submerged culturing in which a tank is aerated and agitated are particularly preferable.
  • a protein secreted outside the bacterial cell can be efficiently produced.
  • the protein produced is not particularly limited, but is preferably an enzyme, more preferably a saccharifying enzyme such as cellulase, amylase, invertase, chitinase, pectinase, etc., and further preferably cellulase.
  • the cellulase produced in the present invention contains various hydrolases, including enzymes having a degrading activity for xylan, cellulose, and hemicellulose.
  • hydrolases including enzymes having a degrading activity for xylan, cellulose, and hemicellulose.
  • specific examples are cellobiose hydrolase (EC 3.2.1.91), which produces cellobiose by hydrolysis of cellulose chains, and endoglucanase (EC 3.2.1.4, which hydrolyzes from the central part of the cellulose chain).
  • Cellooligosaccharides and ⁇ -glucosidases that hydrolyze cellobiose EC 3.2.1.21
  • xylanases EC 3.2.1.8
  • Examples include ⁇ -xylosidase (EC 3.2.1.37) that hydrolyzes.
  • the confirmation of the improvement of the protein concentration and the specific activity of cellulase for confirming the improvement of the protein production ability of the mutant strain of the present invention can be confirmed by the fact that one of the specific activities of these hydrolases is improved. Check by.
  • Cellulase protein concentration is measured as follows.
  • the culture broth obtained by culturing Trichoderma reesei by the method of the present invention is centrifuged at 15,000 ⁇ g for 10 minutes, and the supernatant is used as a cellulase solution.
  • the bovine serum albumin solution as a standard solution, the concentration of protein contained in the saccharifying enzyme solution is calculated based on the calibration curve.
  • ⁇ -Glucosidase specific activity is measured by the following method. First, 10 ⁇ L of the enzyme diluent is added to 90 ⁇ L of 50 mM acetate buffer containing 1 mM of p-nitrophenyl- ⁇ -glucopyranoside (manufactured by Sigma-Aldrich Japan) and reacted at 30 ° C. for 10 minutes. Next, 10 ⁇ L of 2 M sodium carbonate is added and mixed well to stop the reaction, and the increase in absorbance at 405 nm is measured. Finally, the specific activity is calculated with the activity of liberating 1 ⁇ mol of p-nitrophenol per minute as 1 U.
  • ⁇ -Xylosidase specific activity is measured by the following method. First, 10 ⁇ L of the enzyme diluent is added to 90 ⁇ L of 50 mM acetate buffer containing 1 mM p-nitrophenyl- ⁇ -xylopyranoside (manufactured by Sigma-Aldrich Japan), and the mixture is reacted at 30 ° C. for 30 minutes. Next, 10 ⁇ L of 2 M sodium carbonate is added and mixed well to stop the reaction, and the increase in absorbance at 405 nm is measured. Finally, the specific activity is calculated with the activity of liberating 1 ⁇ mol of p-nitrophenol per minute as 1 U.
  • the specific activity of cellobiohydrolase is measured by the following method. First, 10 ⁇ L of the enzyme diluent is added to 90 ⁇ L of 50 mM acetate buffer containing 1 mM p-nitrophenyl- ⁇ -lactopyranoside (manufactured by Sigma-Aldrich Japan), and the mixture is reacted at 30 ° C. for 60 minutes. Then, 10 ⁇ L of 2 M sodium carbonate is added and mixed well to stop the reaction, and the increase in absorbance at 405 nm is measured. Finally, the specific activity is calculated with the activity of liberating 1 ⁇ mol of p-nitrophenol per minute as 1 U.
  • the method for culturing the Trichoderma reesei mutant strain of the present invention is not particularly limited, and for example, liquid culture using a centrifuge tube, flask, jar fermenter, tank or the like, and solid culture using a plate or the like may be performed. it can.
  • it is a mutant strain of Trichoderma reesei, it is preferably cultivated under aerobic conditions, and among these culturing methods, jar fermenter and deep culture in which culturing is performed while aerating and stirring in a tank are preferable.
  • the ventilation amount is preferably about 0.1 to 2.0 vvm, more preferably 0.3 to 1.5 vvm, and particularly preferably 0.5 to 1.0 vvm.
  • the culture temperature is preferably about 25 to 35 ° C, more preferably 25 to 31 ° C.
  • the pH condition in the culture is preferably pH 3.0 to 7.0, more preferably pH 4.0 to 6.0.
  • the culture time is not particularly limited as long as it can be performed until a recoverable amount of the protein is accumulated under the condition that the protein is produced, but is usually 24 to 288 hours, preferably 24 to 240 hours, and more preferably Is 36 to 240 hours, more preferably 36 to 192 hours.
  • the medium composition of the culture process is not particularly limited as long as Trichoderma reesei can produce a protein, and a well-known medium composition of Trichoderma reesei can be adopted.
  • the nitrogen source for example, polypeptone, gravy, CSL, soybean meal and the like can be used.
  • an inducer for producing a protein may be added to the medium.
  • the cellulase When the cellulase is produced according to the present invention, it can be cultured in a medium containing at least one or two or more inducers selected from the group consisting of lactose, cellulose and xylan. Further, as the cellulose or xylan, biomass containing cellulose or xylan may be added as an inducer. Specific examples of the biomass containing cellulose or xylan include seed plants, ferns, moss plants, algae, plants such as aquatic plants, and waste building materials. Seed plants are classified into gymnosperms and angiosperms, and both can be preferably used.
  • Angiosperms are further classified into monocotyledonous plants and dicotyledonous plants, and specific examples of monocotyledonous plants include bagasse, switchgrass, napiergrass, Elianthus, corn stover, corncob, rice straw, and straw. Specific examples of leaf plants include beet pulp, eucalyptus, oak, and birch.
  • pretreated one may be used as the biomass containing cellulose or xylan.
  • the pretreatment method is not particularly limited, but known methods such as acid treatment, sulfuric acid treatment, dilute sulfuric acid treatment, alkali treatment, hydrothermal treatment, subcritical treatment, fine pulverization treatment, and steam treatment can be used. Pulp may be used as the biomass containing cellulose or xylan that has been subjected to such pretreatment.
  • the method of recovering the protein contained in the culture medium in which the mutant strain of Trichoderma reesei is cultured is not particularly limited, but the protein can be recovered by removing the Trichoderma reesei cells from the culture medium.
  • the method for removing the bacterial cells include a centrifugal separation method, a membrane separation method, a filter press method and the like.
  • the Trichoderma reesei mutant strain When used as a protein lysate without removing the cells from the culture broth, it is treated so that the Trichoderma reesei mutant strain cannot grow in the culture broth. It is preferable. Examples of the method for treating the cells so that they cannot grow include heat treatment, chemical treatment, acid / alkali treatment, and UV treatment.
  • the culture solution obtained by removing the bacterial cells or treating them so as not to grow as described above can be directly used as the enzyme solution.
  • the dissolved oxygen saturation was set to 100% by setting the pH and temperature as culture conditions using a culture medium containing no bacteria and saturating dissolved oxygen when aerated. In that case, the ratio of the dissolved oxygen during the culture period to the saturated dissolved oxygen was calculated as the dissolved oxygen saturation.
  • As the DO meter a closed type dissolved oxygen electrode SDOC-12F-L120 (manufactured by Able Co., Ltd.) was used.
  • the culture solution after 39, 48, 62, 72, 86, 96, and 111 hours from the start of culture was measured with a digital rotational viscometer DV2T.
  • the viscosity (cP) was determined when the rotation speed was set to 0.3 rpm.
  • the culture solution is suction-filtered with a filter paper, and the difference between the dry cell weight of the filter paper before and after the suction filtration is defined as the bacterial cell quantity. did.
  • mutant strain of Trichoderma reesei lacking the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 (Method for preparing mutant strain)
  • the mutant strain of Trichoderma reesei lacking the function of the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 is a gene represented by SEQ ID NO: 1 which encodes the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6.
  • acetamidase gene (amdS) capable of degrading acetamide as a selectable marker gene.
  • a DNA fragment consisting of the gene sequence represented by SEQ ID NO: 26 was prepared, and the DNA fragment was transformed into Trichoderma reesei QM9414 strain, and the function of the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 was lost.
  • Create a mutant strain of Trichoderma reesei By the method, a mutant strain of Trichoderma reesei deficient in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 can be obtained DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 above and downstream of the DNA sequence containing amdS.
  • a mutation-introducing plasmid is prepared so as to add a portion homologous to the gene sequence of Trichoderma reesei QM9414 strain.
  • PCR was performed using genomic DNA extracted from Trichoderma reesei QM9414 strain according to a standard method and oligo DNAs represented by SEQ ID NOs: 27 and 28, and the obtained amplified fragment was treated with restriction enzymes AflII and KpnI. Let the DNA fragment be an upstream DNA fragment. Further, PCR is performed using the oligo DNAs represented by SEQ ID NOs: 29 and 30, and the obtained amplified fragment is treated with restriction enzymes MluI and SpeI to obtain a downstream DNA fragment.
  • the upstream and downstream DNA fragments are introduced into the plasmid into which amdS has been inserted by using the restriction enzymes AflII and KpnI and MluI and SpeI, respectively, to construct a mutation-introducing plasmid.
  • the mutation-introducing plasmid is treated with restriction enzymes AflII and SpeI, and Trichoderma reesei QM9414 strain is transformed with the obtained DNA fragment represented by SEQ ID NO: 26.
  • the molecular biological method is performed as described in Molecular cloning, laboratory manual, 1st, 2nd, 3rd (1989). Further, the transformation is carried out by using the standard method, protoplast-PEG method, specifically, as described in Gene, 61, 165-176 (1987).
  • mutant strain of Trichoderma reesei lacking the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 (Method for preparing mutant strain)
  • the mutant strain of Trichoderma reesei lacking the function of the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 is a gene represented by SEQ ID NO: 2 which encodes the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7. Is destroyed by replacing acetamide as a selectable marker and acetamidase gene (amdS) capable of degrading acetamide as a selectable marker gene.
  • amdS acetamidase gene
  • a DNA fragment consisting of the gene sequence represented by SEQ ID NO: 31 was prepared, and the DNA fragment was transformed into Trichoderma reesei QM9414 strain.
  • a mutant strain of Trichoderma reesei lacking the function of the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 is prepared.
  • a mutant strain of Trichoderma reesei lacking the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 can be obtained.
  • PCR was performed using genomic DNA extracted from Trichoderma reesei QM9414 strain according to a standard method and oligo DNAs represented by SEQ ID NOs: 32 and 33, and the obtained amplified fragment was treated with restriction enzymes AflII and NotI. Let the DNA fragment be an upstream DNA fragment. Further, PCR is carried out using the oligo DNAs represented by SEQ ID NOS: 34 and 35, and the obtained amplified fragment is treated with restriction enzymes SwaI and AscI to obtain a downstream DNA fragment.
  • the upstream and downstream DNA fragments are introduced into the plasmid into which amdS has been inserted using the restriction enzymes AflII and NotI, and SwaI and AscI, respectively, to construct a mutation-introducing plasmid.
  • the mutation-introducing plasmid is treated with restriction enzymes AflII and AscI, and Trichoderma reesei QM9414 strain is transformed with the obtained DNA fragment represented by SEQ ID NO: 31.
  • the molecular biological method is performed as described in Molecular cloning, laboratory manual, 1st, 2nd, 3rd (1989). Further, the transformation is carried out by using the standard method, protoplast-PEG method, specifically, as described in Gene, 61, 165-176 (1987).
  • mutant strain of Trichoderma reesei lacking the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 (Method for preparing mutant strain)
  • the mutant strain of Trichoderma reesei lacking the function of the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 is a gene represented by SEQ ID NO: 3 which encodes the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7. Is destroyed by replacing acetamide as a selectable marker and acetamidase gene (amdS) capable of degrading acetamide as a selectable marker gene.
  • amdS acetamidase gene
  • a DNA fragment consisting of the gene sequence represented by SEQ ID NO: 36 was prepared, and the DNA fragment was transformed into Trichoderma reesei QM9414 strain.
  • a mutant strain of Trichoderma reesei lacking the function of the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 is prepared.
  • a mutant strain of Trichoderma reesei lacking the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 can be obtained.
  • PCR was performed using genomic DNA extracted from Trichoderma reesei QM9414 strain according to a standard method and oligo DNAs represented by SEQ ID NOs: 37 and 38, and the obtained amplified fragment was treated with restriction enzymes AflII and NotI. Let the DNA fragment be an upstream DNA fragment. Further, PCR is carried out using the oligo DNAs represented by SEQ ID NOs: 39 and 40, and the obtained amplified fragment is treated with restriction enzymes MluI and SpeI to obtain a downstream DNA fragment.
  • the upstream and downstream DNA fragments are introduced into the plasmid into which amdS has been inserted using the restriction enzymes AflII and NotI, and MluI and SpeI, respectively, to construct a mutation-introducing plasmid.
  • the mutation-introducing plasmid is treated with restriction enzymes AflII and SpeI, and the obtained DNA fragment represented by SEQ ID NO: 36 is transformed into Trichoderma reesei QM9414 strain.
  • the molecular biological method is performed as described in Molecular cloning, laboratory manual, 1st, 2nd, 3rd (1989). Further, the transformation is carried out by using the standard method, protoplast-PEG method, specifically, as described in Gene, 61, 165-176 (1987).
  • mutant strain of Trichoderma reesei lacking the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 (method for preparing mutant strain)
  • the mutant strain of Trichoderma reesei lacking the function of the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 is a gene represented by SEQ ID NO: 4 which encodes the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9. Is destroyed by replacing acetamide as a selectable marker and acetamidase gene (amdS) capable of degrading acetamide as a selectable marker gene.
  • amdS acetamidase gene
  • a DNA fragment consisting of the gene sequence represented by SEQ ID NO: 41 was prepared, and the DNA fragment was transformed into Trichoderma reesei QM9414 strain.
  • a mutant strain of Trichoderma reesei lacking the function of the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 is prepared.
  • a mutant strain of Trichoderma reesei lacking the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 can be obtained.
  • PCR was performed using genomic DNA extracted from Trichoderma reesei QM9414 strain according to a standard method and oligo DNAs represented by SEQ ID NOs: 42 and 43, and the obtained amplified fragment was treated with restriction enzymes AflII and NotI. Let the DNA fragment be an upstream DNA fragment. Further, PCR is performed using the oligo DNAs represented by SEQ ID NOS: 44 and 45, and the obtained amplified fragment is treated with restriction enzymes MluI and SpeI to obtain a downstream DNA fragment.
  • the upstream and downstream DNA fragments are introduced into the plasmid into which amdS has been inserted by using the restriction enzymes AflII and NotI, and MluI and SpeI, respectively, to construct a mutation-introducing plasmid.
  • the mutation-introducing plasmid is treated with restriction enzymes AflII and SpeI, and Trichoderma reesei QM9414 strain is transformed with the obtained DNA fragment represented by SEQ ID NO: 41.
  • the molecular biological method is performed as described in Molecular cloning, laboratory manual, 1st, 2nd, 3rd (1989). Further, the transformation is carried out by using the standard method, protoplast-PEG method, specifically, as described in Gene, 61, 165-176 (1987).
  • mutant strain of Trichoderma reesei lacking the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 (Method for preparing mutant strain)
  • the mutant strain of Trichoderma reesei lacking the function of the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 is a gene represented by SEQ ID NO: 5 which encodes the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10. Is destroyed by replacing acetamide as a selectable marker and acetamidase gene (amdS) capable of degrading acetamide as a selectable marker gene.
  • amdS acetamidase gene
  • a DNA fragment consisting of the gene sequence represented by SEQ ID NO: 46 was prepared, and the DNA fragment was transformed into Trichoderma reesei QM9414 strain.
  • a mutant strain of Trichoderma reesei lacking the function of the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 is prepared.
  • a mutant strain of Trichoderma reesei lacking the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 can be obtained.
  • PCR was performed using genomic DNA extracted from Trichoderma reesei QM9414 strain according to a standard method and oligo DNAs represented by SEQ ID NOs: 47 and 48, and the obtained amplified fragment was treated with restriction enzymes AflII and NotI. Let the DNA fragment be an upstream DNA fragment. PCR is carried out using the oligo DNAs represented by SEQ ID NOs: 49 and 50, and the obtained amplified fragment is treated with restriction enzymes SalI and SphI to obtain a downstream DNA fragment.
  • the upstream and downstream DNA fragments are introduced into the plasmid into which amdS has been inserted by using the restriction enzymes AflII and NotI and SalI and SphI, respectively, to construct a mutation-introducing plasmid.
  • the plasmid for mutation introduction is treated with restriction enzymes AflII and SphI, and Trichoderma reesei QM9414 strain is transformed with the obtained DNA fragment represented by SEQ ID NO: 46.
  • the molecular biological method is performed as described in Molecular cloning, laboratory manual, 1st, 2nd, 3rd (1989). Further, the transformation is carried out by using the standard method, protoplast-PEG method, specifically, as described in Gene, 61, 165-176 (1987).
  • Example 6 Culture test of mutant strain of Trichoderma reesei (preculture)
  • the spores of the mutant strain of Trichoderma reesei prepared in Examples 1 to 5 were diluted with physiological saline to a concentration of 1.0 ⁇ 10 7 / mL, and 2.5 mL of the diluted spore solution was added to 1 L shown in Table 1.
  • Trichoderma reesei QM9414 strain is used, and the same experiment operation is performed below.
  • Arbocel B800 (Rettenmeyer) is added to the main culture medium shown in Table 2 and a 5 L jar fermenter (manufactured by Biot) is used for deep culture examination.
  • Collection of culture solution From the start of the culture to the end of the culture for 120 hours, 20 mL of each culture solution is collected over time. A part of the collected culture solution is centrifuged for 10 minutes at 15,000 ⁇ g and 4 ° C. to obtain a supernatant. The supernatant is filtered through a 0.22 ⁇ m filter, and the filtrate is used as a cellulase solution in the following experiment.
  • the protein concentration of cellulase in the culture solution collected 120 hours after the start of culture is measured.
  • the protein concentration in the culture broth of the mutant strain of Trichoderma reesei produced in Examples 1 to 5 is higher than the protein concentration in the culture broth of the Trichoderma reesei QM9414 strain.
  • the QM9414-J strain lacking the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 obtained in Example 3 had a relative protein concentration of 1.3 compared to the Trichoderma reesei QM9414 strain. It was twice as expensive.
  • FIG. 6 shows changes with time of dissolved oxygen in the culture solution of QM9414 and the QM9414-J strain obtained in Example 3.
  • the dissolved oxygen concentrations in the culture solutions of the QM9414 strain and the QM9414-J strain reached their minimum values around 80 hours and 60 hours after the start of the culture, respectively, and the minimum dissolved oxygen concentration of the QM9414-J strain was the minimum dissolved oxygen concentration of the parent strain QM9414. It was about 20% higher than the oxygen concentration.
  • the QM9414-J strain obtained in Example 3 had a relative ⁇ -glucosidase specific activity of 1.2 times, a ⁇ -xylosidase specific activity of 1.2 times, and Biohydrolase specific activity was 1.1 times higher.
  • Example 7 Preparation of mutant strain of Trichoderma reesei having mutation in polypeptide consisting of amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 6 to 8 against strain QM9414-G which is a passage strain of Trichoderma reesei QM9414 strain Genetic mutation treatment was carried out to obtain a mutant strain QM9141-H.
  • spores of the QM9414-G strain were inoculated to give 1.0 ⁇ 10 5 spores per 1 mL of the preculture medium shown in Table 1, 15 mL of the preculture medium was cultured for half a day, and then centrifuged to recover the spores. did.
  • the collected spores are suspended in Tris-maleic acid buffer (pH 6.0) to give a 10 mL spore solution, and dissolved therein with Tris-maleic acid buffer (pH 6.0) to 1.0 g / L. 0.5 mL of the prepared NTG solution was added, and gene mutation treatment was performed at 28 ° C. for 100 minutes.
  • the gene mutation-treated spores were collected by centrifugation, washed three times with Tris-maleic acid buffer (pH 6.0), and finally suspended in 10 mL of Tris-maleic acid buffer (pH 6.0). The spores were treated with gene mutation.
  • the gene-mutation-treated spores were added to an agar medium prepared by adding crystalline cellulose, and the size of halo, which is a region for degrading crystalline cellulose by cellulase generated around the colony, was used as an index, and the QM9414-H strain having a large halo was identified. Selected.
  • the QM9414-G strain retained a gene encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 6 to 10. Then, it was possible to confirm the three mutations described in (1) to (3) below.
  • the 411st guanine in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 was mutated to adenine.
  • the mutation is a mutation that inserts a stop codon at position 137 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6.
  • One base of adenine was inserted at the 988th position in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the mutation is a mutation that inserts a frame shift from the 297th position of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7. (3) The guanine at position 5,541 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 was mutated to adenine.
  • the mutation is a mutation in which the 1,791st aspartic acid in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 is replaced with asparagine.
  • Example 8 Culture test of mutant strain of Trichoderma reesei
  • the QM9414-H strain obtained in Example 7 was cultured in the same manner as in Example 6 and cultured under the conditions of Reference Example 2 and Reference Example 3.
  • the maximum viscosity (cP) in the liquid and the minimum dissolved oxygen saturation (%) in the culture liquid were measured.
  • the QM9414-G strain was used as a control.
  • the value of the QM9414-G strain is 1, the relative value of the viscosity of the QM9414-H strain is shown in FIG.
  • FIG. 2 shows the time-dependent changes in the dissolved oxygen of the QM9414-G strain and the QM9414-H strain during the culture period.
  • the viscosity of the culture solution during the culture period of the QM9414-H strain was lower than that of the QM9414-G strain.
  • the viscosities of the QM9414-H strain and the QM9414-G strain in the culture broth reached their maximum around 24 hours and 41 hours after the start of culture, respectively.
  • the maximum viscosity of the QM9414-H strain decreased to about 40% of the maximum viscosity of the parent strain QM9414-G.
  • the dissolved oxygen concentration in the culture medium was also higher in the QM9414-H strain than in the QM9414-G strain.
  • the dissolved oxygen concentration in the culture solution of the QM9414-H strain and the QM9414-G strain reached a minimum value around 36 hours after the start of the culture, and the dissolved oxygen concentration of the QM9414-H strain at 36 hours was the same as that of the parent strain QM9414.
  • -It was about 25% higher than the G strain.
  • Example 9 Preparation of mutant strain of Trichoderma reesei having a mutation in the polypeptide consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 9 and 10, which was a passage strain of the Trichoderma reesei QM9414 strain and was obtained in Example 7.
  • the thus-obtained QM9414-H strain was subjected to gene mutation treatment to obtain the mutant strain QM9141-I.
  • spores of the QM9414-H strain were inoculated so as to give 1.0 ⁇ 10 5 spores per mL of the preculture medium shown in Table 1, 15 mL of the preculture medium was cultured for half a day, and then centrifuged to recover the spores. did. Then, the collected spores are suspended in Tris-maleic acid buffer (pH 6.0) to give a 10 mL spore solution, and dissolved therein with Tris-maleic acid buffer (pH 6.0) to 1.0 g / L. 0.5 mL of the prepared NTG solution was added, and gene mutation treatment was performed at 28 ° C. for 100 minutes.
  • the gene mutation-treated spores were collected by centrifugation, washed three times with Tris-maleic acid buffer (pH 6.0), and finally suspended in 10 mL of Tris-maleic acid buffer (pH 6.0).
  • the spores were treated with gene mutation.
  • the gene-mutated spores were added to an agar medium prepared by adding crystalline cellulose, and the size of halo, which is a region for degrading crystalline cellulose by cellulase generated around the colony, was used as an index, and the QM9414-I strain having a large halo was identified. Selected.
  • the QM9414-H strain retained the gene encoding the polypeptide consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 9 and 10. Then, the following two mutations could be confirmed.
  • the adenine at the 550th position in the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 was mutated to cytosine.
  • the mutation is a mutation in which the 184th serine in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 is replaced with arginine.
  • One base of guanine was inserted at the 769th position of the base sequence represented by SEQ ID NO: 5.
  • the mutation is a mutation that inserts a frame shift from the 257th position of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10.
  • Example 10 Culture test of mutant strain of Trichoderma reesei
  • the QM9414-I strain obtained in Example 9 was cultured in the same manner as in Example 6, and Reference Example 1, Reference Example 2, Reference Example 3, Under the conditions of Reference Example 5, the maximum viscosity in the culture medium, the minimum dissolved oxygen saturation in the culture medium, the protein concentration, and the specific activity of cellulase were measured.
  • the QM9414-H strain was used as a control.
  • the value of the QM9414-H strain is 1, the relative value of the viscosity of the QM9414-I strain is shown in FIG.
  • FIG. 4 shows the time-dependent changes in the dissolved oxygen of the QM9414-H strain and the QM9414-I strain during the culture period.
  • the viscosity of the QM9414-I strain in the culture solution was lower than that of the QM9414-H strain.
  • the viscosities of the QM9414-I strain and the QM9414-H strain in the culture solution reached a maximum around 24 hours after the start of the culture.
  • the viscosity of the QM9414-I strain after 24 hours decreased to about 75% of that of the parent strain, QM9414-H strain.
  • the dissolved oxygen concentration in the culture medium was also higher in the QM9414-I strain than in the QM9414-H strain.
  • the dissolved oxygen concentration in the culture solution of the QM9414-H strain and the QM9414-I strain reached a minimum value after 36 hours, and the dissolved oxygen concentration of the QM9414-I strain after 36 hours was the same as that of the parent strain QM9414- It was about 37% higher than that of the H strain.
  • the QM9414-I strain Compared with the QM9414-H strain, the QM9414-I strain has a protein concentration of 1.11 times, a ⁇ -glucosidase specific activity of 1.07 times, a ⁇ -xylosidase specific activity of 1.40 times, and cellobiohydro. The specific enzyme activity was 1.03 times higher.

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Abstract

本発明は、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損または低下する変異を有するトリコデルマ・リーセイの変異株であり、好ましくは、さらに配列番号６、７、９、１０のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドから選ばれる１つ以上のポリペプチドに下記に示す変異を有する変異株に関し、当該変異株を用いて培養液中の培養液の粘度を低く保ちながらタンパク質、特にセルラーゼを生産することができる。

Description

トリコデルマ・リーセイの変異株およびタンパク質の製造方法
　本発明は、培養液の粘度を低く保つことができ、タンパク質の製造能が向上するトリコデルマ・リーセイの変異株および当該変異株を用いたタンパク質の製造方法に関する。
　トリコデルマ・リーセイは、高いタンパク質製造能を有していることが知られており、トリコデルマ・リーセイを用いたタンパク質の製造の検討が行われてきた。トリコデルマ・リーセイは、セルロース、ラクトース、セロビオースなどを誘導物質として、タンパク質の中でも特に糖化酵素に分類されるセルラーゼを製造する。セルラーゼ製造量を強化するため、古くよりセルラーゼ製造を制御する因子の過剰発現、欠損をはじめとする遺伝子の改変、培養条件の最適化などの検討が多々行われている。
　一方で、トリコデルマ属菌は生育やタンパク質の製造に酸素を必須とする好気性糸状菌に属している。また、トリコデルマ属菌は液体培地で培養すると、増殖に伴い培養液の粘度が高まるという特徴を有している。培養液の粘度が高まると、酸素や栄養素の分布が不均一になるため、トリコデルマ属菌を培養する際には、培養液を撹拌したり、酸素供給量を増加させたりして培養中の溶存酸素飽和度の低下を防ぎ、一定以上に維持する必要がある。また、培養槽が大型化すると、酸素移動容量係数が低くなるため、培養中の溶存酸素飽和度を一定以上に保つためには、さらに撹拌数や酸素供給量を増やす必要がある。しかしながら、撹拌数を増やすと、菌体に大きなせん断ダメージを与えてしまうという課題があり、酸素供給量を増やすためにはより大きなエネルギーが必要になるという課題もある。
　特許文献１から６では、それぞれトリコデルマ属菌のＳｆｂ３、Ｍｐｇ１、Ｇａｓ１、Ｓｅｂ１、Ｃｒｚ１およびＴｐｓ１のタンパク質の破壊または生成を減少させることにより、変異前の親株と比較して深部培養における好気性発酵時の溶存酸素量を低い撹拌数で維持することが可能になると開示されている。また、特許文献７には、トリコデルマ属菌のＢＸＬ１遺伝子を破壊すると、培養液の溶存酸素飽和度の低下を抑制することができると記載されている。
特表２０１３－５３３７５１号公報 特表２０１４－５１３５２９号公報 特表２０１４－５１３５３０号公報 特表２０１４－５１３５３１号公報 特表２０１４－５１３５３２号公報 特表２０１４－５１３５３３号公報 国際公開第２０１７／１７０９１７号
　上記のとおり、トリコデルマ・リーセイを用いてタンパク質の製造をするにあたり、培養液中の溶存酸素濃度の低下を抑制し、一定以上に保つことは非常に重要である。本発明者らは、トリコデルマ・リーセイを用いた液体培養によるタンパク質の製造の際に、培養液の粘度を低く保つことができれば、培養スケールを大型化した場合でも、攪拌に必要なエネルギーを低減することができると共に、培養液中の溶存酸素飽和度の低下を抑制することもできると考えた。
　そこで本発明では、培養液の粘度が低下するトリコデルマ・リーセイの変異株の取得および当該トリコデルマ・リーセイの変異株を用いたタンパク質の製造方法を提供することを課題とする。
　本発明者は、培養液の粘度を低く保つことが可能となるトリコデルマ・リーセイの遺伝子を特定するために鋭意検討した結果、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに変異を有するトリコデルマ・リーセイの変異株、好ましくはさらに配列番号６、７、９、１０のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドから選ばれる１つ以上のポリペプチドに変異を有する変異株を培養することにより、培養液の粘度を低く保つことができるようになり、さらに培養液中の溶存酸素飽和度の低下を抑制できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の（１）～（１４）で構成される。
（１）配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損または低下する変異を有する、トリコデルマ・リーセイの変異株。
（２）前記変異が、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端側より１７９１番目のアスパラギン酸残基のアスパラギン酸以外のアミノ酸残基への変異である、（１）に記載の変異株。
（３）さらに配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損または低下する変異を有する、（１）または（２）に記載の変異株。
（４）前記変異が、配列番号６で表されるアミノ酸配列のＮ末端側から１３７番目で翻訳が終了するストップコドン変異である、（３）に記載の変異株。
（５）さらに配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損または低下する変異を有する、（１）～（４）のいずれかに記載の変異株。
（６）前記変異が、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのＬｅｕｃｉｎｅ－ｒｉｃｈ　ｒｅｐｅａｔｓ、ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ－ｌｉｋｅ　ｓｕｂｆａｍｉｌｙドメインが欠損する変異である、（５）に記載の変異株。
（７）前記変異が、配列番号７で表されるアミノ酸配列のＮ末端側から２９７番目のアスパラギン酸残基でのフレームシフト変異である、（５）または（６）に記載の変異株。
（８）さらに配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのＧＡＬ４－ｌｉｋｅ　Ｚｎ２Ｃｙｓ６　ｂｉｎｕｃｌｅａｒ　ｃｌｕｓｔｅｒ　ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇドメインとｆｕｎｇａｌ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｍｉｄｄｌｅ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｒｅｇｉｏｎドメインの間に位置するアミノ酸配列に変異を有する、（１）～（７）のいずれかに記載の変異株。
（９）前記変異が、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおけるＮ末端側より１８４番目のセリン残基のセリン以外のアミノ酸残基への変異である、（８）に記載の変異株。
（１０）さらに配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損または低下する変異を有する、（１）～（９）のいずれかに記載の変異株。
（１１）前記変異が、配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのＦａｔｔｙ　ａｃｉｄ　ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ　ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙドメインが欠損する変異である、（１０）に記載の変異株。
（１２）前記変異が、配列番号１０で表されるアミノ酸配列のＮ末端側から２５７番目のイソロイシン残基でのフレームシフト変異である、（１０）または（１１）に記載の変異株。
（１３）（１）から（１２）のいずれかに記載の変異株を培養する工程を含む、タンパク質の製造方法。
（１４）（１）から（１２）のいずれかに記載の変異株を培養する工程を含む、セルラーゼの製造方法。
　本発明のトリコデルマ・リーセイの変異株は、変異導入前のトリコデルマ・リーセイ親株と比較して培養液の粘度を低く保つことが可能であり、培養液中の溶存酸素飽和度の低下も抑制することができる。さらに、タンパク質、特にセルラーゼの製造量も向上するという予想外の効果も得られる。
トリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４－Ｈ株の培養液中の粘度（相対値）の経時的な推移 トリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４－Ｈ株の培養液中の溶存酸素飽和度の経時的な推移 トリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４－Ｉ株の培養液中の粘度（相対値）の経時的な推移 トリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４－Ｉ株の培養液中の溶存酸素飽和度の経時的な推移 トリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４－Ｊ株の培養液中の粘度（相対値）の経時的な推移 トリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４－Ｊ株の培養液中の溶存酸素飽和度の経時的な推移
　本発明は、もともとタンパク質の製造能に優れる微生物であるトリコデルマ・リーセイの親株に変異を導入することによって、培養液の粘度を低く保つことができることを特徴としている。本発明で用いるトリコデルマ・リーセイの親株は野生株に制限されず、タンパク質製造能が高まるように改良されたトリコデルマ・リーセイの変異株も親株として好ましく用いることができる。例えば、トリコデルマ・リーセイの変異株には、変異剤や紫外線照射などで変異処理を施し、タンパク質の製造性が向上した変異株を上記親株として利用することができる。上記親株として用いる変異株の具体例は、トリコデルマ・リーセイの先祖にあたるトリコデルマ・パラリーセイ（ＡＴＣＣ　ＭＹＡ－４７７７）、トリコデルマ・リーセイに由来する公知の変異株であるＱＭ６ａ株（ＮＢＲＣ３１３２６）、ＱＭ９１２３株（ＡＴＣＣ２４４４９）、ＱＭ９４１４株（ＮＢＲＣ３１３２９）、ＰＣ－３－７株（ＡＴＣＣ６６５８９）、ＱＭ９１２３株（ＮＢＲＣ３１３２７）、ＲｕｔＣ－３０株（ＡＴＣＣ５６７６５）、ＣＬ－８４７株（Ｅｎｚｙｍｅ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０，３４１－３４６（１９８８））、ＭＣＧ７７株（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．Ｓｙｍｐ．８，　８９（１９７８））、ＭＣＧ８０株（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１２，４５１－４５９（１９８２））及びこれらの派生株などが挙げられる。なお、ＱＭ６ａ株、ＱＭ９４１４株、ＱＭ９１２３株はＮＢＲＣ（ＮＩＴＥ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅ　Ｃｅｎｔｅｒ）より、ＰＣ－３－７株、ＲｕｔＣ－３０株はＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）より入手することができる。
　本発明は、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損または低下する変異を有するトリコデルマ・リーセイの変異株であり、好ましくは、さらに配列番号６、７、９、１０のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドから選ばれる１つ以上のポリペプチドに下記に示す変異を有する変異株である。これら変異株については、本明細書中では、本発明の変異株と記載する場合がある。また、前記変異導入前の株については、本明細書中では親株と記載する場合がある。そして本発明の変異株は、親株と比較して、培養液の粘度が低下し、培養液中の溶存酸素飽和度の低下も抑制される。これにより、通気撹拌に必要なエネルギーや、回転数を低減させることができる。また、撹拌の回転数を低く設定できるため、菌糸への剪断ダメージを低減させることもできる。特に、大きなスケールでの培養の際には、通気に必要なブロワや撹拌モーターの容量、撹拌エネルギーの削減につながるためさらに効果的である。
　以下、本発明の変異株が有する各ポリペプチドの変異について、具体的に説明する。
　配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、トリコデルマ・リーセイが有する全長４，３７３アミノ酸のポリペプチドであり、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎでは、トリコデルマ・リーセイ　ＱＭ６ａ株が持つＤｙｎｅｉｎ　ｈｅａｖｙ　ｃｈａｉｎ（ＥＧＲ５１７８７）としても登録されている。Ｄｙｎｅｉｎは、真核生物に見られるモータータンパク質の１種であり、ＡＴＰの加水分解により得られたエネルギーにより、マイクロチューブをはじめとする細胞骨格を構成する微小管上に沿って移動するタンパク質である。Ｄｙｎｅｉｎ　ｈｅａｖｙ　ｃｈａｉｎは、Ｄｙｎｅｉｎを構成する重鎖であり、ダイニンの主な骨格を形成し、ＡＴＰの加水分解により得られたエネルギーを運動に変換する機能を担うタンパク質である（Ｄ　Ｅｓｈｅｌ，Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　ｄｙｎｅｉｎ　ｉｓ　ｒｅｑｕｉｒｅｄ　ｆｏｒ　ｎｏｒｍａｌ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｙｅａｓｔ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ,　Ｖｏｌｕｍｅ ９０，　１９９３，　Ｉｓｓｕｅ　２３，　Ｐ１１１７２－１１１７６）。配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の具体例として、トリコデルマ・リーセイ　ＱＭ６ａ株が有する配列番号３で表される塩基配列が挙げられる。
　配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能を欠損または低下させる方法としては、Ｄｙｎｅｉｎ　ｈｅａｖｙ　ｃｈａｉｎの全欠損、Ｄｙｎｅｉｎ　ｈｅａｖｙ　ｃｈａｉｎの一部欠損させるような変異を導入する方法が挙げられ、具体的には配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子配列に対して、塩基の欠失、挿入、置換などによりフレームシフト変異やストップコドン変異を導入する方法が挙げられる。
　Ｄｙｎｅｉｎ　ｈｅａｖｙ　ｃｈａｉｎの欠損とは、そのポリペプチドが全て無くなる、一部が無くなる、全てが異なるアミノ酸に変わる、一部が異なるアミノ酸に変わる、またはそれらの組み合わせのことを指す。さらに具体的には配列番号８で表されるアミノ酸配列において、上記に示したＤｙｎｅｉｎ　ｈｅａｖｙ　ｃｈａｉｎのアミノ酸配列と配列同一性が８０％以下になることを指し、好ましくは５０％以下であり、さらに好ましくは２０％以下であり、さらに好ましくは１０％以下であり、さらに好ましくは５％以下であり、さらに好ましくは３％以下であり、さらに好ましくは１％以下であり、最も好ましくは０％である。
　Ｄｙｎｅｉｎ　ｈｅａｖｙ　ｃｈａｉｎを構成するアミノ酸配列に変異を有するとは、アミノ酸の欠失、置換、または付加のいずれであってもよい。好ましくは、配列番号８で表されるアミノ酸配列のＮ末端側から１，７９１番目のアスパラギン酸残基の、アスパラギン酸残基以外のアミノ酸残基への変異であり、変異後のアミノ酸残基は特に限定されないが、アスパラギンへ変異していることがより好ましい。配列番号８で表されるアミノ酸配列のＮ末端側から１，７９１番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン酸以外のアミノ酸残基に変異したアミノ酸配列をコードする塩基配列の具体例としては、配列番号３で表される塩基配列のうち、５，５４１番目の塩基であるグアニンがアデニンへの変異した配列が挙げられる。当該変異により、配列番号８で表されるアミノ酸配列のＮ末端側から１，７９１番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸からアスパラギンへ変異する。
　また、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現を低下させる、または発現を消失させる変異を導入することによっても、当該ポリペプチドの機能を低下させてもよく、具体的には配列番号８で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子のプロモーターやターミネーター領域の変異によるポリペプチドの発現量の低下または消失によるものであってもよい。一般的に、プロモーターとターミネーター領域は転写に関与する遺伝子の前後数百塩基の領域に相当する。
　配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが変異した変異株にて当該ポリペプチドの機能が低下または欠損しているかどうかは、当該変異株培養液の親株培養液に対する培養液粘度低下で確認することができる。
　配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、トリコデルマ・リーセイが有する全長８６１アミノ酸のポリペプチドであり、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎでは、トリコデルマ・リーセイ　ＱＭ６ａ株が持つＮ－ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｂｉｎｕｃｌｅａｒ　Ｚｎ　ｃｌｕｓｔｅｒ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ／ＤＮＡ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｄｏｍａｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＧＲ４４８９６）としても登録されている。Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｂｉｎｕｃｌｅａｒ　Ｚｎ　ｃｌｕｓｔｅｒ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ／ＤＮＡ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｄｏｍａｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎは、転写因子であるＧＡＬ４に内在するＤＮＡへ結合するＺｎ２Ｃｙｓ６モチーフからなる２つのヘリックスからなるモチーフを持つことから、ＤＮＡへ結合するタンパク質であり、転写因子の機能を有すると推定される。配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の具体例として、トリコデルマ・リーセイ配列番号１で表される塩基配列が挙げられる。
　配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能を低下または欠損させる方法としては、Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｂｉｎｕｃｌｅａｒ　Ｚｎ　ｃｌｕｓｔｅｒ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ／ＤＮＡ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｄｏｍａｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎの全欠損、Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｂｉｎｕｃｌｅａｒ　Ｚｎ　ｃｌｕｓｔｅｒ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ／ＤＮＡ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｄｏｍａｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎの一部欠損させるような変異を導入する方法が挙げられ、具体的には配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子配列に対して、塩基の欠失、挿入、置換などによりフレームシフト変異やストップコドン変異を導入する方法が挙げられる。
　Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｂｉｎｕｃｌｅａｒ　Ｚｎ　ｃｌｕｓｔｅｒ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ／ＤＮＡ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｄｏｍａｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎの欠損とは、そのポリペプチドが全て無くなる、一部が無くなる、全てが異なるアミノ酸に変わる、一部が異なるアミノ酸に変わる、またはそれらの組み合わせのことを指す。さらに具体的には配列番号２で表されるアミノ酸配列において、上記に示したＮ－ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｂｉｎｕｃｌｅａｒ　Ｚｎ　ｃｌｕｓｔｅｒ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ／ＤＮＡ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｄｏｍａｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎのアミノ酸配列と配列同一性が８０％以下になることを指し、好ましくは５０％以下であり、さらに好ましくは２０％以下であり、さらに好ましくは１０％以下であり、さらに好ましくは５％以下であり、さらに好ましくは３％以下であり、さらに好ましくは１％以下であり、最も好ましくは０％である。
　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＣＤＤ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｒｅｓｕｌｔｓによれば、Ｎ末端側から２７２～３０７番目のアミノ酸残基はＧＡＬ４－ｌｉｋｅ　Ｚｎ２Ｃｙｓ６　ｂｉｎｕｃｌｅａｒ　ｃｌｕｓｔｅｒ　ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇドメイン、Ｎ末端側から３８８～８０５番目のアミノ酸残基はｆｕｎｇａｌ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｍｉｄｄｌｅ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｒｅｇｉｏｎであると開示されており、これらのいずれかのドメイン内に位置するアミノ酸配列に欠失、置換、または付加などの変異がおこることによって、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損または低下させることができる。具体例としては、配列番号１で表される塩基配列において、４１１番目のグアニンがアデニンへ置換したことにより、ストップコドンが挿入される変異が挙げられ、当該変異により、配列番号６で表されるアミノ酸配列のＮ末端側から１３７番目で翻訳は終了し、Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｂｉｎｕｃｌｅａｒ　Ｚｎ　ｃｌｕｓｔｅｒ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ／ＤＮＡ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｄｏｍａｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎの機能を担うＧＡＬ４－ｌｉｋｅ　Ｚｎ２Ｃｙｓ６　ｂｉｎｕｃｌｅａｒ　ｃｌｕｓｔｅｒ　ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇドメインおよびｆｕｎｇａｌ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｍｉｄｄｌｅ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｒｅｇｉｏｎを構成するアミノ酸配列が消失することから、本来のタンパク質としての機能は消失する。
　また、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現を低下させる、または発現を消失させる変異を導入することによっても当該ポリペプチドの機能を低下させてもよく、具体的には配列番号６で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子のプロモーターやターミネーター領域の変異によるポリペプチドの発現量の低下または消失によるものであってもよい。一般的に、プロモーターとターミネーター領域は、転写に関与する遺伝子の前後数百塩基の領域に相当する。
　配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが変異した変異株にて当該ポリペプチドの機能が低下または欠損しているかどうかは、当該変異株培養液の親株培養液に対する培養液粘度低下で確認することができる。
　配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、トリコデルマ・リーセイが有する全長１，１３８アミノ酸のポリペプチドであり、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎでは、トリコデルマ・リーセイ　ＱＭ６ａ株が持つｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＧＲ４５９２６）としても登録されている。配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは機能未知のポリペプチドであるが、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＣｏｎｓｅｒｖｅｄ　Ｄｏｍａｉｎ　Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ　Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ　Ｔｏｏｌによれば、Ｎ末端側から４６８～７２１番目のアミノ酸残基はＬｅｕｃｉｎｅ－ｒｉｃｈ　ｒｅｐｅａｔｓ（ＬＲＲＳ）、ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＲＩ）－ｌｉｋｅ　ｓｕｂｆａｍｉｌｙドメインと開示されている。この記載により、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、リボヌクレアーゼと複合体を形成し、ＲＮＡの安定化などに関与すると推定される。配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の具体例として、トリコデルマ・リーセイ　ＱＭ６ａ株が有する配列番号２で表される塩基配列が挙げられる。
　配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能を低下または欠損させる方法としては、Ｌｅｕｃｉｎｅ－ｒｉｃｈ　ｒｅｐｅａｔｓ、ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ－ｌｉｋｅ　ｓｕｂｆａｍｉｌｙドメインの全欠損、Ｌｅｕｃｉｎｅ－ｒｉｃｈ　ｒｅｐｅａｔｓ、ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ－ｌｉｋｅ　ｓｕｂｆａｍｉｌｙドメインの一部欠損をさせるような変異を導入する方法が挙げられ、具体的には配列番号７表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子配列に対して、塩基の欠失、挿入、置換などによりフレームシフト変異やストップコドン変異を導入する方法が挙げられる。
　Ｌｅｕｃｉｎｅ－ｒｉｃｈ　ｒｅｐｅａｔｓ、ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ－ｌｉｋｅ　ｓｕｂｆａｍｉｌｙドメインの欠損とは、そのドメインが全て無くなる、一部が無くなる、全てが異なるアミノ酸に変わる、一部が異なるアミノ酸に変わる、またはそれらの組み合わせことを指す。さらに具体的には、配列番号７で表されるアミノ酸配列において、上記に示したＬｅｕｃｉｎｅ－ｒｉｃｈ　ｒｅｐｅａｔｓ、ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ－ｌｉｋｅ　ｓｕｂｆａｍｉｌｙドメインのアミノ酸配列と配列同一性が８０％以下になることを指し、好ましくは５０％以下であり、さらに好ましくは２０％以下であり、さらに好ましくは１０％以下であり、さらに好ましくは５％以下であり、さらに好ましくは３％以下であり、さらに好ましくは１％以下であり、最も好ましくは０％である。
　配列番号７で表されるアミノ酸配列に欠失、置換、または付加などの変異がおこることによって、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損または低下する具体例としては、配列番号２で表される塩基配列において、９８８番目にアデニンが１塩基挿入したことによるフレームシフト変異が挙げられる。当該変異により、配列番号７で表されるアミノ酸配列のＮ末端側から２９７番目のアミノ酸がアスパラギン酸からアルギニンへ置換し、以降フレームシフトの結果、Ｌｅｕｃｉｎｅ－ｒｉｃｈ　ｒｅｐｅａｔｓ、ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ－ｌｉｋｅ　ｓｕｂｆａｍｉｌｙドメインを構成するアミノ酸配列は消失し、それにより、本来のタンパク質としての機能は欠損または低下する。
　また、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現を低下させる、または発現を消失させる変異を導入することによっても当該ポリペプチドの機能を低下または欠損させてもよく、具体的には配列番号７で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子のプロモーターやターミネーター領域の変異によるポリペプチドの発現量の低下または消失によるものであってもよい。一般的に、プロモーターとターミネーター領域は、転写に関与する遺伝子の前後数百塩基の領域に相当する。
　配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが変異した変異株にて当該ポリペプチドの機能が低下または欠損しているかどうかは、当該変異株培養液の親株培養液に対する培養液粘度低下で確認することができる。
　配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、トリコデルマ・リーセイが有する全長９３７アミノ酸のポリペプチドであり、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎでは、トリコデルマ・リーセイ　ＱＭ６ａ株が持つｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＧＲ４８３６９）としても登録されている。配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＣｏｎｓｅｒｖｅｄ　Ｄｏｍａｉｎ　Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ　Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ　Ｔｏｏｌによれば、Ｎ末端側から７６～１０８番目のアミノ酸残基は、転写因子であるＧＡＬ４が持つＤＮＡへ結合するＺｎ２Ｃｙｓ６モチーフからなる２つのヘリックスからなるドメインと、Ｎ末端側から３０３～６８１番目のアミノ酸残基は、ｆｕｎｇａｌ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｍｉｄｄｌｅ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｒｅｇｉｏｎドメインを有すると開示されている。この記載により、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、少なくとも糸状菌の転写調節に関与していると推定される。配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の具体例として、トリコデルマ・リーセイ　ＱＭ６ａ株が有する配列番号４で表される塩基配列が挙げられる。
　配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能を低下または欠損させる方法としては、ＧＡＬ４－ｌｉｋｅ　Ｚｎ２Ｃｙｓ６　ｂｉｎｕｃｌｅａｒ　ｃｌｕｓｔｅｒ　ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇドメインおよび／またはｆｕｎｇａｌ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｍｉｄｄｌｅ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｒｅｇｉｏｎドメインの全欠損、ＧＡＬ４－ｌｉｋｅ　Ｚｎ２Ｃｙｓ６　ｂｉｎｕｃｌｅａｒ　ｃｌｕｓｔｅｒ　ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇドメインおよび／またはｆｕｎｇａｌ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｍｉｄｄｌｅ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｒｅｇｉｏｎドメインの一部欠損、ＧＡＬ４－ｌｉｋｅ　Ｚｎ２Ｃｙｓ６　ｂｉｎｕｃｌｅａｒ　ｃｌｕｓｔｅｒ　ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇドメインとｆｕｎｇａｌ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｍｉｄｄｌｅ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｒｅｇｉｏｎドメインとの立体配置関係の変化、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの全欠損させるような変異を導入する方法が挙げられる。
　ＧＡＬ４－ｌｉｋｅ　Ｚｎ２Ｃｙｓ６　ｂｉｎｕｃｌｅａｒ　ｃｌｕｓｔｅｒ　ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇドメインおよび／またはｆｕｎｇａｌ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｍｉｄｄｌｅ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｒｅｇｉｏｎドメインの欠損とは、そのドメインが全て無くなる、一部がなくなる、全てが異なるアミノ酸に変わる、一部が異なるアミノ酸に変わる、またはそれらの組み合わせのことを指す。さらに具体的には、配列番号９で表されるアミノ酸配列において、上記に示したＧＡＬ４－ｌｉｋｅ　Ｚｎ２Ｃｙｓ６　ｂｉｎｕｃｌｅａｒ　ｃｌｕｓｔｅｒ　ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇドメインまたはｆｕｎｇａｌ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｍｉｄｄｌｅ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｒｅｇｉｏｎドメインのアミノ酸配列と配列同一性が８０％以下になることを指し、好ましくは５０％以下であり、さらに好ましくは２０％以下であり、さらに好ましくは１０％以下であり、さらに好ましくは５％以下であり、さらに好ましくは３％以下であり、さらに好ましくは１％以下であり、最も好ましくは０％である。
　ＧＡＬ４－ｌｉｋｅ　Ｚｎ２Ｃｙｓ６　ｂｉｎｕｃｌｅａｒ　ｃｌｕｓｔｅｒ　ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇドメインとｆｕｎｇａｌ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｍｉｄｄｌｅ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｒｅｇｉｏｎドメインとの立体配置関係の変化とは、ＧＡＬ４－ｌｉｋｅ　Ｚｎ２Ｃｙｓ６　ｂｉｎｕｃｌｅａｒ　ｃｌｕｓｔｅｒ　ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇドメインとｆｕｎｇａｌ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｍｉｄｄｌｅ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｒｅｇｉｏｎドメインとの間に位置するアミノ酸配列において、アミノ酸の欠失、置換、または付加が起こる変異によって行われる。ＧＡＬ４－ｌｉｋｅ　Ｚｎ２Ｃｙｓ６　ｂｉｎｕｃｌｅａｒ　ｃｌｕｓｔｅｒ　ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇドメインやｆｕｎｇａｌ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｍｉｄｄｌｅ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｒｅｇｉｏｎドメインは、タンパク質ドメインと呼ばれ、タンパク質ドメインはタンパク質の配列構造の一部を構成し、機能を持った存在である。ドメインが複数ある場合には、複数のドメインからなる立体構造がタンパク質の立体構造の一部を構成するため、ドメイン同士の立体配置が変化すると、タンパク質の立体構造が変化し、タンパク質の機能が低下する。
　以上のように、ドメインのアミノ酸配列自体にアミノ酸の欠失、置換、または付加などの変異が起こらない場合でも、２つのドメインの間に位置するアミノ酸配列にアミノ酸の欠失、置換、または付加などの変異が起こることによって、タンパク質の機能が低下することが知られている。ＧＡＬ４－ｌｉｋｅ　Ｚｎ２Ｃｙｓ６　ｂｉｎｕｃｌｅａｒ　ｃｌｕｓｔｅｒ　ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇドメインとｆｕｎｇａｌ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｍｉｄｄｌｅ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｒｅｇｉｏｎドメインの間に位置するアミノ酸は、配列番号９に示すアミノ酸配列において、１０９～３０２番目のアミノ酸配列の領域を指す。
　ＧＡＬ４－ｌｉｋｅ　Ｚｎ２Ｃｙｓ６　ｂｉｎｕｃｌｅａｒ　ｃｌｕｓｔｅｒ　ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇドメインとｆｕｎｇａｌ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｍｉｄｄｌｅ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｒｅｇｉｏｎドメインの間に位置するアミノ酸配列に変異を有するとは、アミノ酸の欠失、置換または付加のいずれであってもよい。好ましくは、配列番号９で表されるアミノ酸配列のＮ末端側から１８４番目のセリン残基がセリン以外のアミノ酸残基に変異していることが好ましく、変異後ののアミノ酸残基は特に限定されないが、アスパラギンへ変異していることが好ましい。配列番号９で表されるアミノ酸配列のＮ末端側から１８４番目のセリン残基がセリン以外のアミノ酸残基に変異したアミノ酸配列をコードする塩基配列の具体例としては、配列番号４で表される塩基配列のうち、５５０番目の塩基であるアデニンがシトシンへの変異した配列が挙げられる。当該変異により、配列番号９で表されるアミノ酸配列のＮ末端側から１８４番目のアミノ酸残基がセリンからアルギニンへ変異する。
　また、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現を低下させる、または発現を消失させる変異を導入することによっても、当該ポリペプチドの機能を低下させてもよく、具体的には配列番号９で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子のプロモーターやターミネーター領域の変異によるポリペプチドの発現量の低下または消失によるものであってもよい。一般的に、プロモーターとターミネーター領域は転写に関与する遺伝子の前後数百塩基の領域に相当する。
　配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが変異した変異株にて当該ポリペプチドの機能が欠損または低下しているかどうかは、当該変異株培養液の親株培養液に対する培養液粘度低下で確認することができる。
　配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、トリコデルマ・リーセイが有する全長３４２アミノ酸のポリペプチドであり、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎでは、トリコデルマ・リーセイ　ＱＭ６ａ株が持つｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＧＲ５３１４２）としても登録されている。配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＣｏｎｓｅｒｖｅｄ　Ｄｏｍａｉｎ　Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ　Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ　Ｔｏｏｌによれば、Ｎ末端側から１４７～２６４番目のアミノ酸残基はＦａｔｔｙ　ａｃｉｄ　ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ　ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙドメインを有すると開示されている。この記載により、配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ゼアキサンチン合成などに関与するβ－ｃａｒｏｔｅｎｅ　ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ、Ｃ－５　ｓｔｅｒｏｌ　ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ、Ｃ－４　ｓｔｅｒｏｌ　ｍｅｔｈｙｌ　ｏｘｉｄａｓｅなどの機能を持つと推定される。配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の具体例として、トリコデルマ・リーセイ　ＱＭ６ａ株が有する配列番号５で表される塩基配列が挙げられる。
　配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能を低下または欠損させる方法としては、Ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄ　ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ　ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙドメインの全欠損、Ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄ　ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ　ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙドメインの一部欠損、配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの全欠損させるような変異を導入する方法が挙げられ、具体的には、配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子配列に対して、塩基の欠失、挿入、置換などによりフレームシフト変異やストップコドン変異を導入する方法が挙げられる。
　Ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄ　ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ　ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙドメインの欠損とは、そのドメインが全て無くなる、一部が無くなる、全てが異なるアミノ酸に変わる、一部が異なるアミノ酸に変わる、またはそれらの組み合わせのことを指す。さらに具体的には、配列番号１０で表されるアミノ酸配列において、上記に示したＦ－ｂｏｘドメインのアミノ酸配列と配列同一性が８０％以下になることを指し、好ましくは５０％以下であり、さらに好ましくは２０％以下であり、さらに好ましくは１０％以下であり、さらに好ましくは５％以下であり、さらに好ましくは３％以下であり、さらに好ましくは１％以下であり、最も好ましくは０％である。
　Ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄ　ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ　ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙドメイン内に位置するアミノ酸配列に欠失、置換、または付加などの変異がおこることによって、配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損する具体例としては、配列番号５で表される塩基配列において、７６９番目にグアニンが１塩基挿入したことによるフレームシフト変異が挙げられる。当該変異により、配列番号１０で表されるアミノ酸配列のＮ末端側から２５７番目のアミノ酸がイソロイシンからアスパラギン酸へ置換し、以降フレームシフトの結果、Ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄ　ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ　ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙドメインを構成するアミノ酸配列が短くなり、本来の機能は消失すると推測される。
　その他、配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現量の低下させる、または発現を消失させる変異を導入することによっても当該ポリペプチドの機能を低下させてもよく、具体的には、配列番号１０で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子のプロモーターやターミネーター領域の変異によるポリペプチドの発現量の低下または消失によるものであってもよい。一般的に、プロモーターとターミネーター領域は、転写に関与する遺伝子の前後数百塩基の領域に相当する。または欠損させることができる。
　配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが変異した変異株にて当該ポリペプチドの機能が低下または欠損しているかどうかは、当該変異株培養液の親株培養液に対する培養液粘度低下で確認することができる。
　上記遺伝子への変異導入は、当業者にとって公知の変異剤または紫外線照射などによる変異処理、選択マーカーを用いた相同組換えなどの遺伝子組換え、あるいはトランスポゾンによる変異など、既存の遺伝子変異方法を用いることができる。
　本発明の変異株は、前述の通り配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損または低下する変異を有するトリコデルマ・リーセイの変異株であり、好ましくは、さらに配列番号６、７、９、１０のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドから選ばれる１つ以上のポリペプチドに前述の変異を有する変異株であるが、これら変異の組み合わせとしては以下の組み合わせが挙げられる。
　配列番号８および６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが前記変異を有するトリコデルマ・リーセイの変異株。
　配列番号８および７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが前記変異を有するトリコデルマ・リーセイの変異株。
　配列番号８および９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが前記変異を有するトリコデルマ・リーセイの変異株。
　配列番号８および１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが前記変異を有するトリコデルマ・リーセイの変異株。
　配列番号８、６および７およびで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが前記変異を有するトリコデルマ・リーセイの変異株。
　配列番号８、６および９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが前記変異を有するトリコデルマ・リーセイの変異株。
　配列番号８、６および１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが前記変異を有するトリコデルマ・リーセイの変異株。
　配列番号８、７および９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが前記変異を有するトリコデルマ・リーセイの変異株。
　配列番号８、７および１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが前記変異を有するトリコデルマ・リーセイの変異株。
　配列番号８、９および１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが前記変異を有するトリコデルマ・リーセイの変異株。
　配列番号８、６、７および９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが前記変異を有するトリコデルマ・リーセイの変異株。
　配列番号８、６、７および１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが前記変異を有するトリコデルマ・リーセイの変異株。
　配列番号８、６、９および１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが前記変異を有するトリコデルマ・リーセイの変異株。
　配列番号８、７、９および１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが前記変異を有するトリコデルマ・リーセイの変異株。
　配列番号６～１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの全てが前記変異を有するトリコデルマ・リーセイの変異株。
　前述の組み合わせの変異株は、当業者にとって公知の変異剤または紫外線照射などによる変異処理、選択マーカーを用いた相同組換えなどの遺伝子組換え、あるいはトランスポゾンによる変異など、既存の遺伝子変異方法によって取得できるが、好ましくは、親株となるトリコデルマ・リーセイの胞子に対して、ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）、紫外線などを用いて遺伝子変異処理を行い、得られた変異株の遺伝子を解析して、上記の変異を有する変異株をスクリーニングすることで取得できる。
　本発明の変異株は、当該変異導入前の親株と比較して、培養液の粘度が低下し、培養液中の溶存酸素飽和度の低下も抑制することができる。これにより、通期撹拌に必要なエネルギーや、回転数を低減させることができる。また、撹拌の回転数を低く設定できるため、菌糸への剪断ダメージを低減させることもできる。特に、大きなスケールでの培養の際には、通気に必要なブロワや撹拌モーターの容量、撹拌エネルギーの削減に繋がるため、更に効果的である。更には、本発明の変異株は、当該変異導入前と親株と比較して、タンパク質の製造能が向上するため、本発明の変異株の培養液は、同一の培養条件にて得られた当該変異導入前の親株の培養液と比較して、タンパク質濃度が増加する。また、タンパク質が酵素の場合には、酵素の比活性が増加する。ここで、タンパク質濃度の増加率や酵素の比活性の増加率は、増加していれば特に限定されないが、２０％以上であることが好ましい。
　本発明において、培養液の粘度は以下の条件で測定した値を用い、粘度の比較は以下の条件で測定した値のうち最大値同士を比較する。まず、評価対象とするトリコデルマ・リーセイの変異株と親株の胞子を前培養培地１ｍＬあたり１．０×１０５胞子となるよう前培養培地（具体的な培地組成の一例は、実施例中の表１のとおり。）へ接種し、振盪培養機にて２８℃、１２０ｒｐｍの条件にて菌体量が１１ｇ／Ｌ前後になるまで培養を行う。次に、１００ｇ／Ｌ（ｗ／ｖ）になるようＡｒｂｏｃｅｌ　Ｂ８００（レッテンマイヤー社製）を添加した表２で示した本培養培地に対し、１０％（ｖ／ｖ）になるよう前培養培地を接種させ、５Ｌジャーファーメンターを用い、深部培養を行う。培養液の粘度の測定は、デジタル回転粘度計を用いる。デジタル回転粘度計は、予め０点校正を行う。培養開始から、１７、２４、４１、４８、６５、７２、８９、１１１時間後、または、培養開始から、２４、４８、７１、８９、１１３、１３７時間後の採取直後の培養液をそれぞれ指定の容器に１６ｍＬ採取し、培養液にスピンドルを浸して０．３ｒｐｍの回転数にて回転させ、この時のスピンドルに働く粘性抵抗であるトルクを室温条件下にて測定することにより、培養液の粘度を測定する。粘度の単位は、センチポアズ（ｃＰ）とする。１ポアズは、流体内に１ｃｍにつき１ｃｍ／秒の速度勾配があるとき、その速度勾配の方向に垂直な面において速度の方向１ｃｍ２につき１ダインの力の大きさの応力が生ずる粘度と定義される。デジタル回転粘度計には、ＤＶ２Ｔ（ＢＲＯＯＫＦＩＥＬＤ社）、スピンドルには、ＵＬ　ＡＤＡＰＴＯＲ（ＢＲＯＯＫＦＩＥＬＤ社）などを用いることができる。
　本発明のトリコデルマ・リーセイの変異株は、当該変異導入前の親株を同様の条件で培養した場合と比較すると、培養液の粘度が低くなり、培養中の粘度の最大値が、好ましくは８０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは６０％以上、最も好ましくは、５０％以上低くなる。また、絶対値では、本発明の変異株の培養中の粘度の最大値が、親株と比べて、好ましくは１００ｃＰ以上、より好ましくは２００ｃＰ以上、より好ましくは４００ｃＰ以上、より好ましくは５００ｃＰ以上、さらに好ましくは６００ｃＰ以上、さらに好ましくは７００ｃＰ以上、さらに好ましくは８００ｃＰ以上、さらに好ましくは９００ｃＰ以上、特に好ましくは１，０００ｃＰ以上低くなる。
　培養液中の溶存酸素飽和度は、培養液中の酸素利用速度を測定することによって算出することができる。本発明における酸素利用速度（ｍＭ／Ｌ／ｈｒ）は、培養開始後２４時間後の単位時間当たりの培養液１Ｌ当たりの酸素消費速度のことを指す。具体的な算出方法は、培養条件を一定に保って培養を行い、培養開始後２４時間時点で酸素の供給を止め、溶存酸素（ｍｇ／Ｌ）の値（ＤＯ値）を１０秒間ごとにプロットし、その曲線の中で対数的に減少している３点以上のプロットについて、その傾き（Ａ）（単位；ＤＯ／ｓｅｃ）を求める。酸素利用速度の算出には式は以下に示す式１を用いる。
　酸素利用速度（ｍＭ／Ｌ／ｈｒ）＝（－Ａ）×（１／３２）×６０×６０・・・（式１）。
　ＤＯ値の測定には市販のＤＯ計を使用することができる。使用するＤＯ計には特に制限はなく、ＤＯ値を正確に測定できるものであれば良い。例として、密閉型ＤＯ電極（エイブル株式会社製）や溶存酸素センサー（メトラー・トレド株式会社製）などが挙げられる。ＤＯ計は予め０点校正とスパン校正を行っておく。０点校正は亜硫酸ソーダ２％溶液を使用して行う。スパン校正は実際に培養する条件において菌体が存在しない状態で通気、攪拌を行い、溶存酸素が飽和になるまで待ち、その後計器の指示値が安定していることを確認し、その温度での飽和溶存酸素に合わせて校正を行う。また、培養槽を加圧してＤＯ測定を行う際は、圧補正を行う必要がある。さらに、培養槽が大きい場合は静水圧補正を行う必要がある。補正を行う際には、以下に示す式２を用いて算出する。
　Ｄ＝ＤＯ（１＋α＋β）・・・（式２）
Ｄ：補正した飽和溶存酸素
ＤＯ：１気圧、純水中での飽和溶存酸素
α：ゲージ圧（ｋｇ／ｃｍ２）
β：静水圧（ＤＯ計取り付け位置の液深（ｍ）／１０）。
　溶存酸素飽和度は、菌を含まない培地を用いてｐＨや温度を培養条件に設定し、空気を通気した際の溶存酸素の飽和状態を１００％とした場合の、飽和溶存酸素に対する培養期間中の溶存酸素の割合を溶存酸素飽和度として算出する。溶存酸素（ｍｇ／Ｌ）は、水中に溶解している酸素の濃度を表す。飽和溶存酸素とは、実際に培養を行なう培養条件において、菌体が存在しない状態で通気、攪拌を行い、溶存酸素が一定になった状態での溶存酸素のことを指す。また、溶存酸素飽和度を算出する際は、培養期間中に通気条件など培養条件を変化させることはしないこととする。酸素要求性 が低下すると、溶存酸素飽和度は増加する。溶存酸素飽和度は以下の式３に従って算出する。
　溶存酸素飽和度（％）＝（培養中の溶存酸素）／（培養開始前の飽和溶存酸素）×１００・・・（式３）。
　溶存酸素飽和度を比較する場合には、最小値同士を比較する。
　酸素利用速度や、溶存酸素飽和度を比較する場合には、培地、酸素供給量、撹拌速度、温度、培養容量、植菌量などの培養条件を揃えて測定した結果を用いる。測定の際の植菌量は本培養液に対し、１０％（ｖ／ｖ）程度が好ましい。
　本発明の変異株と、親株の溶存酸素を同様の条件で培養すると、変異株は、親株に比べて溶存酸素飽和度の最小値が高くなり、好ましくは５％以上、さらに好ましくは６％以上、さらに好ましくは７％以上、さらに好ましくは８％以上、さらに好ましくは９％以上、さらに好ましくは１０％以上、さらに好ましくは１１％以上、さらに好ましくは１２％以上、さらに好ましくは１３％以上、さらに好ましくは１４％以上、特に好ましくは１５％以上高くなる。
　本発明の変異株は、当該変異導入前の親株と比較して、増殖能が低下しないことが好ましい。増殖能の差は菌体量を測定することで比較することができる。菌体量は、乾燥菌体重量として測定する。培養液１０ｍＬを定性ろ紙（グレード４、ＧＥヘルスケア社）を用いて吸引ろ過し、残渣をろ紙ごと一緒に１００℃にて乾燥させる。そして、重量を測定し、ろ過前後のろ紙の重量差を乾燥菌体重量とする。
　本発明の変異株は、前述の変異以外にも、タンパク質製造量の向上および／または培養液の粘度が低下し培養液中の溶存酸素飽和度の低下が抑制される変異を有していてもよい。具体的には、配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２２、２４のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの変異が挙げられる。
　配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、トリコデルマ・リーセイが有するポリペプチドであり、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎでは、トリコデルマ・リーセイ　ＱＭ６ａ株が持つｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎのＥＧＲ５０６５４として登録されている。配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは機能未知のポリペプチドであるが、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＣｅｎｓｅｒｖｅｄ　Ｄｏｍａｉｎ　Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ　Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ　Ｔｏｏｌによれば、Ｎ末端側から９５～２７７番目のアミノ酸残基はＭｉｄｄｌｅ　ｄｏｍａｉｎ　ｏｆ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　４Ｇドメイン（以降ＭＩＦ４Ｇドメインと記載する。）、Ｎ末端側から３８０番目～４８５番目のアミノ酸残基はＭＡ－３ドメインを有すると開示されている。ＭＩＦ４ＧおよびＭＡ－３の両ドメインは、ＤＮＡまたはＲＮＡに結合する機能を有することが知られている（Ｂｉｏｃｈｅｍ．４４，１２２６５－１２２７２（２００５）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１，１４７－１５６（２００７））。これらの記載により配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、少なくともＤＮＡおよび／またはＲＮＡに結合する機能を有すると推定される。
　配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の具体例として、配列番号１２で表される塩基配列が挙げられる。ＥＧＲ５０６５４の機能が低下または欠損する遺伝子変異とは、ＥＧＲ５０６５４が有するＭＩＦ４Ｇドメインおよび／またはＭＡ－３ドメインの全欠損、ＭＩＦ４Ｇドメインおよび／またはＭＡ－３ドメインの一部欠損、ＭＩＦ４ＧドメインとＭＡ－３ドメインとの立体配置関係の変化する遺伝子変異が挙げられる。さらに、配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現量の低下や消失させる変異を導入することによっても当該ポリペプチドの機能を低下または欠損させることができる。配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損する具体例としては、配列番号１２で表される塩基配列において、１，０３９番目から１，０４４番目のいずれかの塩基が欠失する変異が挙げられる。
　配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下または欠損することにより、配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下または欠損しないトリコデルマ・リーセイと比較し、タンパク質の生産性が向上する。
　配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、トリコデルマ・リーセイが有するポリペプチドであり、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎでは、トリコデルマ・リーセイ　ＱＭ６ａ株が持つｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎのＥＧＲ４４４１９として登録されている。配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは機能未知のポリペプチドであるが、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＣｅｎｓｅｒｖｅｄ　Ｄｏｍａｉｎ　Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ　Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ　Ｔｏｏｌによれば、Ｎ末端側から２６番目～４９９番目のアミノ酸残基は「Ｓｕｇａｒ（ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ）　Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒドメインを有すると開示されている。この記載により配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、少なくとも菌体の内側と外側の間における糖の輸送に関与していると推定される。
　配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の具体例として、配列番号１４で表される塩基配列が挙げられる。ＥＧＲ４４４１９の機能が低下または欠損する遺伝子変異とは、ＥＧＲ４４４１９が有するＳｕｇａｒ（ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ）　Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒドメインの全欠損、Ｓｕｇａｒ（ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ）　Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒドメインの一部欠損、Ｓｕｇａｒ（ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ）　Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒドメインの立体配置関係の変化する遺伝子変異が挙げられる。さらに、配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現量の低下や消失させる変異を導入することによっても当該ポリペプチドの機能を低下または欠損させることができる。配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損する具体例としては、配列番号１４で表される塩基配列において、１，４１５番目に１１塩基が挿入する変異が挙げられる。
　配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下または欠損することにより、配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下または欠損しないトリコデルマ・リーセイと比較し、タンパク質の生産性およびβ－グルコシダーゼの比活性が向上する。
　配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、トリコデルマ・リーセイが有するポリペプチドであり、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎでは、トリコデルマ・リーセイ　ＱＭ６ａ株が持つｂｅｔａ－ａｄａｐｔｉｎ　ｌａｒｇｅ　ｓｕｂｕｎｉｔのＥＧＲ４８９１０として登録されている。配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、真核生物に広く保存されているクラスリンと結合する細胞内外や菌体内外の輸送に関与する小胞を構成するアダプタープロテインを構成するタンパク質のひとつである（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１０１,１４１０８－１４１１３（２００４））。
　配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の具体例として、配列番号１６で表される塩基配列が挙げられる。ＥＧＲ４８９１０の遺伝子変異とは、配列番号１６で表される塩基配列において、１，０８０番目の塩基であるシトシンがアデニンへの変異が挙げられる。
　配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド内に変異を有することにより、配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド内に変異を有さないトリコデルマ・リーセイと比較し、液体培養時の培養液の粘性が低下する。
　配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、トリコデルマ・リーセイが有するポリペプチドであり、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎでは、トリコデルマ・リーセイ　ＱＭ６ａ株が持つｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎのＥＧＲ４５８２８として登録されている。配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは機能未知のポリペプチドであるが、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＣｅｎｓｅｒｖｅｄ　Ｄｏｍａｉｎ　Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ　Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ　Ｔｏｏｌによれば、Ｎ末端側から８６番目～１８６番目のアミノ酸残基はｈｅａｔ　ｓｈｏｃｋ　ｆａｃｔｏｒ（ＨＳＦ）－ｔｙｐｅ　ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇドメインと開示されている。ＨＳＦ－ｔｙｐｅ　ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇドメインは、ヒートショックプロテインの発現を制御する転写因子であるＨＳＦをコードする遺伝子の上流域に結合する機能を有することが知られている（Ｃｅｌｌ，６５（３），３６３－３６６（１９９１））。
　配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の具体例として、配列番号１８で表される塩基配列が挙げられる。ＥＧＲ４５８２８の機能が低下または欠損する遺伝子変異とは、ＥＧＲ４５８２８が有するＨＳＦ－ｔｙｐｅ　ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇドメインの全欠損、ＨＳＦ－ｔｙｐｅ　ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇドメインの一部欠損、ＨＳＦ－ｔｙｐｅ　ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇドメインの立体配置関係の変化する遺伝子変異が挙げられる。さらに、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現量の低下や消失させる変異を導入することによっても当該ポリペプチドの機能を低下させることができる。配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損する具体例としては、配列番号１８で表される塩基配列において、８５番目にグアニン１塩基が挿入するフレームシフトを引き起こす変異が挙げられる。
　配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下または欠損することにより、配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下または欠損しないトリコデルマ・リーセイと比較し、タンパク質の生産性が向上する。
　配列番号１９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、トリコデルマ・リーセイが有するポリペプチドであり、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎでは、トリコデルマ・リーセイ　ＱＭ６ａ株が持つｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＧＲ４７１５５）としても登録されている。配列番号１９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは機能未知のポリペプチドであるが、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＣｅｎｓｅｒｖｅｄ　Ｄｏｍａｉｎ　Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ　Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ　Ｔｏｏｌによれば、Ｎ末端側から３６２番目～５５３番目のアミノ酸残基はＴＬＤドメインと開示されている。ＴＬＤドメインは機能未知である。配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の具体例として、配列番号２０で表される塩基配列が挙げられる。ＥＧＲ４７１５５の機能が低下または欠損する遺伝子変異とは、ＥＧＲ４７１５５が有するＴＬＤドメインの全欠損、ＴＬＤドメインの一部欠損、ＴＬＤドメインの立体配置関係の変化する遺伝子変異が挙げられる。さらに、配列番号１９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現量の低下や消失させる変異を導入することによっても当該ポリペプチドの機能を低下または欠損させることができる。配列番号１９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損する具体例としては、配列番号２０で表される塩基配列において、６番目に配列番号２１で表される４６塩基が挿入するフレームシフト変異が挙げられる。
　配列番号１９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下または欠損することにより、配列番号１９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下または欠損しないトリコデルマ・リーセイと比較し、タンパク質の生産性が向上する。
　配列番号２２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、トリコデルマ・リーセイが有するポリペプチドであり、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎでは、トリコデルマ・リーセイ　ＱＭ６ａ株が持つｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＧＲ４８０５６）としても登録されている。配列番号２２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは機能未知のポリペプチドであるが、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＣｅｎｓｅｒｖｅｄ　Ｄｏｍａｉｎ　Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ　Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ　Ｔｏｏｌによれば、Ｎ末端側から１３０番目～１７２番目のアミノ酸残基はＦ－ｂｏｘドメインと開示されている。Ｆ－ｂｏｘドメインは、細胞周期を制御するタンパク質内に見られるドメインであることが知られている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９５，２４１７－２４２２（１９９８））。配列番号２２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の具体例として、配列番号２３で表される塩基配列が挙げられる。ＥＧＲ４８０５６の機能が低下または欠損する遺伝子変異とは、ＥＧＲ４８０５６が有するＦ－ｂｏｘドメインの全欠損、Ｆ－ｂｏｘドメインの一部欠損、Ｆ－ｂｏｘドメインの立体配置関係の変化する遺伝子変異が挙げられる。さらに、配列番号２２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現量の低下や消失させる変異を導入することによっても当該ポリペプチドの機能を低下または欠損させることができる。配列番号２２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損する具体例としては、配列番号２３で表される塩基配列において、４９９番目のシトシンが一塩基欠損するフレームシフト変異が挙げられる。配列番号２２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下または欠損することにより、配列番号２２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下または欠損しないトリコデルマ・リーセイと比較し、タンパク質の生産性が向上する。
　配列番号２４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、トリコデルマ・リーセイが有するポリペプチドであり、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎでは、トリコデルマ・リーセイ　ＱＭ６ａ株が持つｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　ｆａｍｉｌｙ　４１，ｐａｒｔｉａｌ（ＥＧＲ４６４７６）としても登録されている。ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　ｆａｍｉｌｙ　４１は、２量体の複合体で構成されているタンパク質（Ｔｈｅ　ＥＭＢＯ　Ｊｏｕｒｎａｌ，２７，２０８０－２７８８（２００８））であり、翻訳直後の新生タンパク質がゴルジ複合体を通過する過程において、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）をアミノ酸残基であるセリンまたはスレオニン残基に転移させる機能（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｆｏｕｒｔｈ　ｅｄｉｔｉｏｎ，１１，２８０－２８１（１９９５））を有している。配列番号２４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の具体例として、配列番号２５で表される塩基配列が挙げられる。
ＥＧＲ４６４７６の機能が低下または欠損する遺伝子変異とは、ＥＧＲ４６４７６が有するｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　ｆａｍｉｌｙ　４１，ｐａｒｔｉａｌの全欠損、ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　ｆａｍｉｌｙ　４１，ｐａｒｔｉａｌの一部欠損、ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　ｆａｍｉｌｙ　４１，ｐａｒｔｉａｌの立体配置関係の変化する遺伝子変異が挙げられる。さらに、配列番号２４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現量の低下や消失させる変異を導入することによっても当該ポリペプチドの機能を低下または欠損させることができる。配列番号２４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損する具体例としては、配列番号２５で表される塩基配列において、６，２６１番目のシトシンがアデニンへ変異することによりストップコドンが挿入する変異が挙げられる。配列番号２４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下または欠損することにより、配列番号２４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が低下または欠損しないトリコデルマ・リーセイと比較し、タンパク質の生産性が向上する。
　また、本発明は前記変異株を培養する工程を含むタンパク質の製造方法に関する。
　本発明でトリコデルマ・リーセイを培養する培養方法は特に限定されず、例えば遠沈管、フラスコ、ジャーファーメンター、タンクなどを用いた液体培養や、プレートなどを用いた固体培養などで培養することができる。トリコデルマ・リーセイは、好気的条件で培養することが好ましく、これらの培養方法の中でも、特にジャーファーメンターや、タンク内に通気や撹拌を行いながら培養する深部培養が好ましい。
　本発明の方法では、菌体外に分泌されるタンパク質と効率的に製造することができる。製造されるタンパク質は特に制限はないが、好ましくは酵素であり、より好ましくはセルラーゼ、アミラーゼ、インベルターゼ、キチナーゼ、ペクチナーゼ等の糖化酵素であり、さらに好ましくはセルラーゼである。
　本発明で製造されるセルラーゼには、様々な加水分解酵素が含まれており、キシラン、セルロース、ヘミセルロースに対する分解活性を持つ酵素などが含まれている。具体例としては、セルロース鎖の加水分解によりセロビオースを製造するセロビオハイドラーゼ（ＥＣ　３．２．１．９１）、セルロース鎖の中央部分から加水分解するエンドグルカナーゼ（ＥＣ　３．２．１．４）、セロオリゴ糖およびセロビオースを加水分解するβ－グルコシダーゼ（ＥＣ　３．２．１．２１）、ヘミセルロースや特にキシランに作用することを特徴とするキシラナーゼ（ＥＣ　３．２．１．８）、キシロオリゴ糖を加水分解するβ－キシロシダーゼ（ＥＣ　３．２．１．３７）などが挙げられる。
　前述の通り、本発明の変異株のタンパク質製造能の向上を確認するためのセルラーゼのタンパク質濃度および比活性の向上の確認は、これらの加水分解酵素の比活性のいずれかが向上していることにより確認する。
　セルラーゼのタンパク質濃度は以下の通り測定を行う。本発明の方法でトリコデルマ・リーセイを培養することにより得られた培養液を１５，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清をセルラーゼ溶液とする。Ｑｕｉｃｋ　Ｓｔａｒｔ　Ｂｒａｄｆｏｒｄ　プロテインアッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）２５０μＬに希釈したセルラーゼ溶液を５μＬ添加し、室温で１５分間静置後の５９５ｎｍで用いる吸光度を測定する。牛血清アルブミン溶液を標準液とし、検量線に基づいて糖化酵素溶液に含まれるタンパク質濃度を算出する。
　β－グルコシダーゼ比活性は、以下の方法で測定する。まず、１ｍＭのｐ－ニトロフェニル－β－グルコピラノシド（シグマアルドリッチジャパン社製）を含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬに酵素希釈液１０μＬを添加して３０℃で１０分間反応させる。次に２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合して反応を停止し、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定する。最後に１分間あたり１μｍｏｌのｐ－ニトロフェノールを遊離する活性を１Ｕとして比活性を算出する。
　β－キシロシダーゼ比活性は以下の方法で測定する。まず、１ｍＭのｐ－ニトロフェニル－β－キシロピラノシド（シグマアルドリッチジャパン社製）を含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬに酵素希釈液１０μＬを添加し３０℃で３０分間反応させる。次に、２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合して反応を停止し、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定する。最後に１分間あたり１μｍｏｌのｐ－ニトロフェノールを遊離する活性を１Ｕとして比活性を算出する。
　セロビオハイドロラーゼ比活性は、以下の方法で測定する。まず、１ｍＭのｐ－ニトロフェニル－β－ラクトピラノシド（シグマアルドリッチジャパン社製）を含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬに酵素希釈液１０μＬを添加し３０℃で６０分間反応させる。次にその後、２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合して反応を停止し、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定する。最後に、１分間あたり１μｍｏｌのｐ－ニトロフェノールを遊離する活性を１Ｕとして比活性を算出する。
　本発明のトリコデルマ・リーセイの変異株の培養方法は特に限定されず、例えば遠沈管、フラスコ、ジャーファーメンター、タンクなどを用いた液体培養や、プレートなどを用いた固体培養などで培養することができる。トリコデルマ・リーセイの変異株である場合は、好気的条件で培養することが好ましく、これらの培養方法の中でも、特にジャーファーメンターや、タンク内に通気や撹拌を行いながら培養する深部培養が好ましい。通気量は、０．１～２．０ｖｖｍ程度が好ましく、０．３～１．５ｖｖｍがより好ましく、０．５～１．０ｖｖｍが特に好ましい。培養温度は、２５～３５℃程度が好ましく、２５～３１℃がより好ましい。培養におけるｐＨの条件は、ｐＨ３．０～７．０が好ましく、ｐＨ４．０～６．０がより好ましい。培養時間は、タンパク質が生産される条件で、回収可能な量のタンパク質が蓄積されるまで行える時間であれば特に制限はないが、通常、２４～２８８時間、好ましくは２４～２４０時間、より好ましくは３６～２４０時間、さらに好ましくは３６～１９２時間である。
　培養工程の培地組成は、トリコデルマ・リーセイがタンパク質を製造できるような培地組成となっていれば特に制限はなく、トリコデルマ・リーセイの周知の培地組成を採用することができる。窒素源としては、例えば、ポリペプトン、肉汁、ＣＳＬ、大豆かすなどを用いることができる。また、培地には、タンパク質を製造させるための誘導物質を添加してもよい。
　本発明によりセルラーゼを製造する場合には、培地にラクトース、セルロースおよびキシランからなる群から選択される少なくとも１種類または２種類以上の誘導剤を含む培地で培養することができる。また、セルロースやキシランは、セルロースやキシランを含むバイオマスを誘導物質として添加してもよい。セルロールやキシランを含有するバイオマスの具体例としては、種子植物、シダ植物、コケ植物、藻類、水草などの植物の他、廃建材なども用いることができる。種子植物は、裸子植物と被子植物に分類されるが、どちらも好ましく用いることができる。被子植物はさらに単子葉植物と双子葉植物に分類され、単子葉植物の具体例としては、バガス、スイッチグラス、ネピアグラス、エリアンサス、コーンストーバー、コーンコブ、稲わら、麦わらなどが挙げられ、双子葉植物の具体例としてはビートパルプ、ユーカリ、ナラ、シラカバなどが挙げられる。
　また、セルロースやキシランを含むバイオマスは、前処理されたものを用いてもよい。前処理方法は特に限定されないが、例えば、酸処理、硫酸処理、希硫酸処理、アルカリ処理、水熱処理、亜臨界処理、微粉砕処理、蒸煮処理、など公知の手法を用いることができる。このような前処理をされたセルロールやキシランを含むバイオマスとして、パルプを用いてもよい。
　トリコデルマ・リーセイの変異株を培養した培養液に含まれるタンパク質を回収する方法は特に限定されないが、トリコデルマ・リーセイの菌体を培養液から除去し、タンパク質を回収することができる。菌体の除去方法としては、遠心分離法、膜分離法、フィルタープレス法などが例として挙げられる。
　また、トリコデルマ・リーセイの変異株を培養した培養液から菌体を除去せずに、タンパク質の溶解液として利用する場合には、培養液中でトリコデルマ・リーセイの変異株が生育できないように処理することが好ましい。菌体が生育できないように処理する方法としては、熱処理、薬剤処理、酸・アルカリ処理、ＵＶ処理などが挙げられる。
　タンパク質がセルラーゼのような酵素の場合には、上記のように菌体を除去又は生育していないように処理した培養液を、そのまま酵素液として利用することができる。
　以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
　＜参考例１＞タンパク質濃度測定条件
　使用するタンパク質濃度測定試薬：Ｑｕｉｃｋ　Ｓｔａｒｔ　Ｂｒａｄｆｏｒｄプロテインアッセイ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ製
測定条件
測定温度：室温
タンパク質濃度測定試薬：２５０μＬ
糸状菌の培養液：５μＬ
反応時間：５分
吸光度：５９５ｎｍ
標準品：ＢＳＡ。
　＜参考例２＞溶存酸素飽和度の算出
　溶存酸素飽和度は、菌を含まない培地を用いてｐＨや温度を培養条件に設定し、空気を通気した際の溶存酸素の飽和状態を１００％とした場合の、飽和溶存酸素に対する培養期間中の溶存酸素の割合を溶存酸素飽和度として算出した。ＤＯ計は密閉型溶存酸素電極ＳＤＯＣ－１２Ｆ－Ｌ１２０（エイブル株式会社製）を使用した。
　＜参考例３＞培養液の粘度の測定
　採取した培養液の粘度を測定するため、培養開始３９、４８、６２、７２、８６、９６、１１１時間経過後の培養液をデジタル回転粘度計　ＤＶ２Ｔとスピンドル　ＬＶ－１（ＢＲＯＯＫＦＩＥＬＤ社製）を使用し、回転数を０．３ｒｐｍに設定した際の粘度（ｃＰ）を求めた。
　＜参考例４＞菌体量の測定
　培養液中に含まれる菌体量を測定するため、培養液をろ紙で吸引ろ過し、吸引ろ過前後のろ紙の乾燥菌体重量の差を菌体量とした。
　＜参考例５＞セルラーゼの比活性の測定条件
　（β－グルコシダーゼ比活性の測定条件）
基質：ｐ－ニトロフェニル－β－グルコピラノシド（シグマアルドリッチジャパン社製）
反応液：１ｍＭのｐ－ニトロフェニル－β－グルコピラノシドを含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬ
酵素希釈液：１０μＬ
反応温度：３０℃
反応時間：１０分間
反応停止剤：２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬ
吸収度：４０５ｎｍ。
　（β－キシロシダーゼ比活性の測定条件）
基質：ｐ－ニトロフェニル－β－キシロピラノシド（シグマアルドリッチジャパン社製）
反応液：１ｍＭのｐ－ニトロフェニル－β－キシロピラノシドを含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬ
酵素希釈液：１０μＬ
反応温度：３０℃
反応時間：１０分間
反応停止剤：２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬ
吸収度：４０５ｎｍ。
　（セロビオハイドロラーゼ比活性の測定条件）
基質：ｐ－ニトロフェニル－β－ラクトピラノシド（シグマアルドリッチジャパン社製）
反応液：１ｍＭのｐ－ニトロフェニル－β－ラクトピラノシドを含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬ
酵素希釈液：１０μＬ
反応温度：３０℃
反応時間：１０分間
反応停止剤：２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬ
吸収度：４０５ｎｍ。
　＜実施例１＞配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを欠損させたトリコデルマ・リーセイの変異株の作製
　（変異株の作製方法）
　配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損したトリコデルマ・リーセイの変異株は、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする配列番号１で表される遺伝子を選択マーカーとしてアセトアミド、選択マーカー遺伝子としてアセトアミドを分解することができるアセトアミダーゼ（遺伝子（ａｍｄＳ）と置き換えることで破壊する。配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能を欠損させるため、配列番号２６で表される遺伝子配列からなるＤＮＡ断片を作製し、当該ＤＮＡ断片をトリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４株に形質転換して配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損したトリコデルマ・リーセイの変異株を作製する。この方法により、配列番号１で表される塩基配列が欠損したトリコデルマ・リーセイの変異株が得られる。ａｍｄＳを含むＤＮＡ配列の上流および下流に、上記の配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ断片を導入するために、トリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４株の遺伝子配列と相同的な部分を付加するように変異導入用プラスミドを作製する。
　具体的には、トリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４株から定法に従って抽出したゲノムＤＮＡと配列番号２７および２８で表されるオリゴＤＮＡを用いてＰＣＲをし、得られた増幅断片を制限酵素ＡｆｌＩＩとＫｐｎＩで処理したＤＮＡ断片を上流ＤＮＡ断片とする。また、配列番号２９および３０で表されるオリゴＤＮＡを用いてＰＣＲをし、得られた増幅断片を制限酵素ＭｌｕＩとＳｐｅＩで処理したＤＮＡ断片を下流ＤＮＡ断片とする。そして、上流及び下流ＤＮＡ断片をＡｆｌＩＩとＫｐｎＩ、ＭｌｕＩとＳｐｅＩの制限酵素をそれぞれ用いてａｍｄＳが挿入されたプラスミドへ導入し、変異導入用プラスミドを構築する。そして、変異導入用プラスミドを制限酵素ＡｆｌＩＩとＳｐｅＩで処理し、配列番号２６で示す得られたＤＮＡ断片でトリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４株を形質転換する。分子生物学的手法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ，ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ，１ｓｔ，２ｎｄ，３ｒｄ（１９８９）の記載通りに行う。また、形質転換は、標準的な手法であるプロトプラスト－ＰＥＧ法を用い、具体的にはＧｅｎｅ，６１，１６５－１７６（１９８７）の記載通りに行う。
　＜実施例２＞配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを欠損させたトリコデルマ・リーセイの変異株の作製
　（変異株の作製方法）
　配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損したトリコデルマ・リーセイの変異株は、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする配列番号２で表される遺伝子を選択マーカーとしてアセトアミド、選択マーカー遺伝子としてアセトアミドを分解することができるアセトアミダーゼ遺伝子（ａｍｄＳ）と置き換えることで破壊する。配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能を欠損させるため、配列番号３１で表される遺伝子配列からなるＤＮＡ断片を作製し、当該ＤＮＡ断片をトリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４株に形質転換して配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損したトリコデルマ・リーセイの変異株を作製する。この方法により、配列番号２で表される塩基配列が欠損したトリコデルマ・リーセイの変異株が得られる。ａｍｄＳを含むＤＮＡ配列の上流および下流に、上記の配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ断片を導入するために、トリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４株の遺伝子配列と相同的な部分を付加するように変異導入用プラスミドを作製する。
　具体的には、トリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４株から定法に従って抽出したゲノムＤＮＡと配列番号３２および３３で表されるオリゴＤＮＡを用いてＰＣＲをし、得られた増幅断片を制限酵素ＡｆｌＩＩとＮｏｔＩで処理したＤＮＡ断片を上流ＤＮＡ断片とする。また、配列番号３４および３５で表されるオリゴＤＮＡを用いてＰＣＲをし、得られた増幅断片を制限酵素ＳｗａＩとＡｓｃＩで処理したＤＮＡ断片を下流ＤＮＡ断片とする。そして、上流及び下流ＤＮＡ断片をＡｆｌＩＩとＮｏｔＩ、ＳｗａＩとＡｓｃＩの制限酵素をそれぞれ用いてａｍｄＳが挿入されたプラスミドへ導入し、変異導入用プラスミドを構築する。そして、変異導入用プラスミドを制限酵素ＡｆｌＩＩとＡｓｃＩで処理し、配列番号３１で示す得られたＤＮＡ断片でトリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４株を形質転換する。分子生物学的手法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ，ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ，１ｓｔ，２ｎｄ，３ｒｄ（１９８９）の記載通りに行う。また、形質転換は、標準的な手法であるプロトプラスト－ＰＥＧ法を用い、具体的にはＧｅｎｅ，６１，１６５－１７６（１９８７）の記載通りに行う。
　＜実施例３＞配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを欠損させたトリコデルマ・リーセイの変異株の作製
　（変異株の作製方法）
　配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損したトリコデルマ・リーセイの変異株は、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする配列番号３で表される遺伝子を選択マーカーとしてアセトアミド、選択マーカー遺伝子としてアセトアミドを分解することができるアセトアミダーゼ遺伝子（ａｍｄＳ）と置き換えることで破壊する。配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能を欠損させるため、配列番号３６で表される遺伝子配列からなるＤＮＡ断片を作製し、当該ＤＮＡ断片をトリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４株に形質転換して配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損したトリコデルマ・リーセイの変異株を作製する。この方法により、配列番号３で表される塩基配列が欠損したトリコデルマ・リーセイの変異株が得られる。ａｍｄＳを含むＤＮＡ配列の上流および下流に、上記の配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ断片を導入するために、トリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４株の遺伝子配列と相同的な部分を付加するように変異導入用プラスミドを作製する。
　具体的には、トリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４株から定法に従って抽出したゲノムＤＮＡと配列番号３７および３８で表されるオリゴＤＮＡを用いてＰＣＲをし、得られた増幅断片を制限酵素ＡｆｌＩＩとＮｏｔＩで処理したＤＮＡ断片を上流ＤＮＡ断片とする。また、配列番号３９および４０で表されるオリゴＤＮＡを用いてＰＣＲをし、得られた増幅断片を制限酵素ＭｌｕＩとＳｐｅＩで処理したＤＮＡ断片を下流ＤＮＡ断片とする。そして、上流及び下流ＤＮＡ断片をＡｆｌＩＩとＮｏｔＩ、ＭｌｕＩとＳｐｅＩの制限酵素をそれぞれ用いてａｍｄＳが挿入されたプラスミドへ導入し、変異導入用プラスミドを構築する。そして、変異導入用プラスミドを制限酵素ＡｆｌＩＩとＳｐｅＩで処理し、配列番号３６で示す得られたＤＮＡ断片でトリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４株を形質転換する。分子生物学的手法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ，ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ，１ｓｔ，２ｎｄ，３ｒｄ（１９８９）の記載通りに行う。また、形質転換は、標準的な手法であるプロトプラスト－ＰＥＧ法を用い、具体的にはＧｅｎｅ，６１，１６５－１７６（１９８７）の記載通りに行う。
　（変異株の作製・評価）
　前述の方法に従って、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが欠損したトリコデルマ・リーセイの変異株ＱＭ９４１４－Ｊ株を取得した。
　＜実施例４＞配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを欠損させたトリコデルマ・リーセイの変異株の作製
　（変異株の作製方法）
　配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損したトリコデルマ・リーセイの変異株は、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする配列番号４で表される遺伝子を選択マーカーとしてアセトアミド、選択マーカー遺伝子としてアセトアミドを分解することができるアセトアミダーゼ遺伝子（ａｍｄＳ）と置き換えることで破壊する。配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能を欠損させるため、配列番号４１で表される遺伝子配列からなるＤＮＡ断片を作製し、当該ＤＮＡ断片をトリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４株に形質転換して配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損したトリコデルマ・リーセイの変異株を作製する。この方法により、配列番号４で表される塩基配列が欠損したトリコデルマ・リーセイの変異株が得られる。ａｍｄＳを含むＤＮＡ配列の上流および下流に、上記の配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡ断片を導入するために、トリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４株の遺伝子配列と相同的な部分を付加するように変異導入用プラスミドを作製する。
　具体的には、トリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４株から定法に従って抽出したゲノムＤＮＡと配列番号４２および４３で表されるオリゴＤＮＡを用いてＰＣＲをし、得られた増幅断片を制限酵素ＡｆｌＩＩとＮｏｔＩで処理したＤＮＡ断片を上流ＤＮＡ断片とする。また、配列番号４４および４５で表されるオリゴＤＮＡを用いてＰＣＲをし、得られた増幅断片を制限酵素ＭｌｕＩとＳｐｅＩで処理したＤＮＡ断片を下流ＤＮＡ断片とする。そして、上流及び下流ＤＮＡ断片をＡｆｌＩＩとＮｏｔＩ、ＭｌｕＩとＳｐｅＩの制限酵素をそれぞれ用いてａｍｄＳが挿入されたプラスミドへ導入し、変異導入用プラスミドを構築する。そして、変異導入用プラスミドを制限酵素ＡｆｌＩＩとＳｐｅＩで処理し、配列番号４１で示す得られたＤＮＡ断片でトリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４株を形質転換する。分子生物学的手法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ，ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ，１ｓｔ，２ｎｄ，３ｒｄ（１９８９）の記載通りに行う。また、形質転換は、標準的な手法であるプロトプラスト－ＰＥＧ法を用い、具体的にはＧｅｎｅ，６１，１６５－１７６（１９８７）の記載通りに行う。
　＜実施例５＞配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを欠損させたトリコデルマ・リーセイの変異株の作製
　（変異株の作製方法）
　配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損したトリコデルマ・リーセイの変異株は、配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする配列番号５で表される遺伝子を選択マーカーとしてアセトアミド、選択マーカー遺伝子としてアセトアミドを分解することができるアセトアミダーゼ遺伝子（ａｍｄＳ）と置き換えることで破壊する。配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能を欠損させるため、配列番号４６で表される遺伝子配列からなるＤＮＡ断片を作製し、当該ＤＮＡ断片をトリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４株に形質転換して配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損したトリコデルマ・リーセイの変異株を作製する。この方法により、配列番号５で表される塩基配列が欠損したトリコデルマ・リーセイの変異株が得られる。ａｍｄＳを含むＤＮＡ配列の上流および下流に、上記の配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡ断片を導入するために、トリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４株の遺伝子配列と相同的な部分を付加するように変異導入用プラスミドを作製する。
　具体的には、トリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４株から定法に従って抽出したゲノムＤＮＡと配列番号４７および４８で表されるオリゴＤＮＡを用いてＰＣＲをし、得られた増幅断片を制限酵素ＡｆｌＩＩとＮｏｔＩで処理したＤＮＡ断片を上流ＤＮＡ断片とする。また、配列番号４９および５０で表されるオリゴＤＮＡを用いてＰＣＲをし、得られた増幅断片を制限酵素ＳａｌＩとＳｐｈＩで処理したＤＮＡ断片を下流ＤＮＡ断片とする。そして、上流及び下流ＤＮＡ断片をＡｆｌＩＩとＮｏｔＩ、ＳａｌＩとＳｐｈＩの制限酵素をそれぞれ用いてａｍｄＳが挿入されたプラスミドへ導入し、変異導入用プラスミドを構築する。そして、変異導入用プラスミドを制限酵素ＡｆｌＩＩとＳｐｈＩで処理し、配列番号４６で示す得られたＤＮＡ断片でトリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４株を形質転換する。分子生物学的手法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ，ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ，１ｓｔ，２ｎｄ，３ｒｄ（１９８９）の記載通りに行う。また、形質転換は、標準的な手法であるプロトプラスト－ＰＥＧ法を用い、具体的にはＧｅｎｅ，６１，１６５－１７６（１９８７）の記載通りに行う。
　＜実施例６＞トリコデルマ・リーセイの変異株の培養試験
　（前培養）
　実施例１～５で作製したトリコデルマ・リーセイの変異株の胞子を１．０×１０７／ｍＬになるように生理食塩水で希釈し、その希釈胞子溶液２．５ｍＬを表１に示した１Ｌバッフル付フラスコへ入れた２５０ｍＬの前培養培地へ接種させ、振盪培養機にて２８℃、１２０ｒｐｍの条件にて７２時間培養を行う。コントロールとして、トリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４株を用い、以下同様の実験操作を行う。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　（本培養）
　Ａｒｂｏｃｅｌ　Ｂ８００（レッテンマイヤー社）を表２で示した本培養培地に添加し、５Ｌジャーファーメンター（バイオット社製）を用い、深部培養検討を行う。
　トリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４株および実施例１～５で作製したトリコデルマ・リーセイの変異株の前培養液２５０ｍＬをＡｒｂｏｃｅｌ　Ｂ８００が添加された本培養培地２．５Ｌに接種する。
　培養条件は、本培養培地に前培養培地を接種後、２８℃、７００ｒｐｍ、通気量１００ｍＬ／ｍｉｎの培養条件にて、ｐＨ５．０に制御しながら深部培養を行う。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　（培養液の採取）
　培養開始から、培養終了時の１２０時間経過後まで経時的に培養液をそれぞれ２０ｍＬ採取する。採取した培養液の１部は、１５，０００×ｇ、４℃の条件下で１０分間遠心分離を行い、上清を得る。その上清を０．２２μｍのフィルターでろ過し、そのろ液をセルラーゼ溶液として、以下の実験に用いる。
　（タンパク質濃度の測定）
　参考例１で記載した手法を用い、培養開始１２０時間経過後に採取した培養液におけるセルラーゼのタンパク質濃度を測定する。その結果、実施例１～５で作製したトリコデルマ・リーセイの変異株の培養液におけるタンパク質濃度は、トリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４株の培養液におけるタンパク質濃度と比較して高くなる。特に、実施例３にて取得した配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを欠損させたＱＭ９４１４－Ｊ株は、トリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４株と比較して相対値でタンパク質濃度は１．３倍高かった。
　（培養液中の溶存酸素飽和度の測定）
　参考例２で記載した手法を用い、実施例１～５で作製したトリコデルマ・リーセイの変異株の培養液中の経時的な溶存酸素飽和度を測定する。その結果、実施例１～５で作製したトリコデルマ・リーセイの変異株の培養液中の溶存酸素飽和度は、トリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４株よりも高くなる。
　また、ＱＭ９４１４と実施例３にて取得したＱＭ９４１４－Ｊ株の培養液中の溶存酸素の経時的変化を図６に示す。ＱＭ９４１４株とＱＭ９４１４－Ｊ株の培養液中の溶存酸素濃度は、それぞれ培養開始から８０時間前後、６０時間前後で最小値となり、ＱＭ９４１４－Ｊ株の最小溶存酸素濃度は、親株のＱＭ９４１４の最小溶存酸素濃度よりも２０％程度高くなった。
　（培養液の粘度の測定）
　参考例３で記載した手法を用い、実施例１～５で作製したトリコデルマ・リーセイの変異株の培養液中の経時的な粘度を測定する。その結果、実施例１～５で作製したトリコデルマ・リーセイの変異株の最大粘度は、トリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４株よりも低くなる。
　また、トリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４株の値を１とした場合の、実施例３にて取得したＱＭ９４１４－Ｊ株の粘度の相対値を図５に示す。その結果、ＱＭ９４１４－Ｊ株の培養期間中の培養液の粘度は、ＱＭ９４１４株よりも低くなった。ＱＭ９４１４株とＱＭ９４１４－Ｊ株の培養液における粘度は、培養開始から７１時間経過前後で最大となった。ＱＭ９４１４－Ｊ株の最大粘度は、親株のＱＭ９４１４株の最大粘度の４０％程度まで低下した。
　（菌体量の測定）
　参考例４で記載した手法を用い、実施例６（前培養）の培養直後の菌体量を測定する。その結果、配列番号６～１０のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損したトリコデルマ・リーセイの変異株とトリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４株間で菌体量の差は確認できない。特に、実施例３にて取得した配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを欠損させたＱＭ９４１４－Ｊ株は、トリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４株と比較して、菌体量の差を確認することはできなかった。
　（酵素活性の測定）
　参考例５の条件で、培養途中に採取した培養液におけるセルラーゼの比活性として、β－グルコシダーゼ、β－キシロシダーゼ、セロビオハイドラーゼの比活性をそれぞれ測定する。比活性は、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定し、１分間あたり１μｍｏｌの基質を遊離する活性を１Ｕとして算出する。その結果、配列番号６～１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損したトリコデルマ・リーセイの変異株の培養液における上記３種類の比活性は、トリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４株の培養液における比活性と比較して高くなる。特に、トリコデルマ・リーセイ　ＱＭ９４１４株と比較して、実施例３にて取得したＱＭ９４１４－Ｊ株は相対値でβ－グルコシダーゼ比活性は１．２倍、β－キシロシダーゼ比活性は１．２倍、セロビオハイドロラーゼ比活性は１．１倍高かった。
　＜実施例７＞配列番号６～８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに変異を有するトリコデルマ・リーセイの変異株の作製
　トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４株の継代株であるＱＭ９４１４－Ｇ株に対し、遺伝子変異処理を行って変異株であるＱＭ９１４１－Ｈ株を取得した。遺伝子変異処理は、ＱＭ９４１４－Ｇ株の胞子を、表１に示す前培養培地１ｍＬあたり１．０ｘ１０５胞子になるよう接種し、前培養培地１５ｍＬを半日培養した後に遠心分離を行い、胞子を回収した。そして、回収した胞子をトリスーマレイン酸バッファー（ｐＨ６．０）にて１０ｍＬの胞子溶液になるよう懸濁し、そこへトリスーマレイン酸バッファー（ｐＨ６．０）で１．０ｇ／Ｌになるよう溶解させたＮＴＧ溶液を０．５ｍＬ添加し、２８℃、１００分間、遺伝子変異処理を行った。遺伝子変異処理した胞子は、遠心分離にて回収した後に、トリスーマレイン酸バッファー（ｐＨ６．０）で３回洗浄し、最終的にトリスーマレイン酸バッファー（ｐＨ６．０）１０ｍＬにて懸濁したものを遺伝子変異処理胞子とした。
　その遺伝子変異処理胞子を、結晶セルロースを添加して調製した寒天培地へ添加し、コロニー周囲に生じるセルラーゼによる結晶セルロース分解領域であるハロの大きさを指標とし、ハロの大きかったＱＭ９４１４－Ｈ株を選抜した。
　ＱＭ９４１４－Ｇ株とＱＭ９４１４－Ｈ株の遺伝子解析の結果、ＱＭ９４１４－Ｇ株では配列番号６～１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子が保持されていたが、ＱＭ９４１４－Ｈ株では以下の（１）～（３）に記す３箇所の変異を確認することができた。
（１）配列番号１で表される塩基配列の４１１番目のグアニンがアデニンへ変異していた。当該変異は、配列番号６で表されるアミノ酸配列の１３７番目にストップコドンを挿入させる変異である。
（２）配列番号２で表される塩基配列の９８８番目にアデニンが１塩基挿入されていた。当該変異は、配列番号７で表されるアミノ酸配列の２９７番目からフレームシフトを挿入させる変異である。
（３）配列番号３で表される塩基配列の５，５４１番目のグアニンがアデニンに変異していた。当該変異は、配列番号８で表されるアミノ酸配列の１，７９１番目のアスパラギン酸をアスパラギンへ置換する変異である。
　＜実施例８＞トリコデルマ・リーセイの変異株の培養試験
　実施例７で取得したＱＭ９４１４－Ｈ株について、実施例６と同様の方法で培養を行い、参考例２と参考例３の条件で、培養液中の最大粘度（ｃＰ）および培養液中の最小溶存酸素飽和度（％）を測定した。コントロールには、ＱＭ９４１４－Ｇ株を用いた。ＱＭ９４１４－Ｇ株の値を１とした場合の、ＱＭ９４１４－Ｈ株の粘度の相対値を図１に示す。また、培養期間中の、ＱＭ９４１４－Ｇ株と、ＱＭ９４１４－Ｈ株の溶存酸素の経時的変化を図２に示す。
　これらの結果、ＱＭ９４１４－Ｈ株の培養期間中の培養液の粘度は、ＱＭ９４１４－Ｇ株よりも低くなった。ＱＭ９４１４－Ｈ株とＱＭ９４１４－Ｇ株の培養液における粘度は、培養開始からそれぞれ２４時間経過時前後、４１時間経過時前後で最大となった。ＱＭ９４１４－Ｈ株の最大粘度は、親株のＱＭ９４１４－Ｇ株の最大粘度の４０％程度まで低下した。
　培養液中の溶存酸素濃度も、ＱＭ９４１４－Ｈ株では、ＱＭ９４１４－Ｇ株に比べて高くなった。ＱＭ９４１４－Ｈ株とＱＭ９４１４－Ｇ株の培養液中の溶存酸素濃度は、ともに培養開始後３６時間経過時前後で最小値となり、ＱＭ９４１４－Ｈ株の３６経過時の溶存酸素濃度は、親株のＱＭ９４１４－Ｇ株と比べて２５％程度高くなった。
　＜実施例９＞配列番号９、１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド内に変異を有するトリコデルマ・リーセイの変異株の作製
　トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４株の継代株であって実施例７で取得したＱＭ９４１４－Ｈ株に対し、遺伝子変異処理を行って変異株であるＱＭ９１４１－Ｉ株を取得した。遺伝子変異処理は、ＱＭ９４１４－Ｈ株の胞子を、表１に示す前培養培地１ｍＬあたり１．０ｘ１０５胞子になるよう接種し、前培養培地１５ｍＬを半日培養した後に遠心分離を行い、胞子を回収した。そして、回収した胞子をトリスーマレイン酸バッファー（ｐＨ６．０）にて１０ｍＬの胞子溶液になるよう懸濁し、そこへトリスーマレイン酸バッファー（ｐＨ６．０）で１．０ｇ／Ｌになるよう溶解させたＮＴＧ溶液を０．５ｍＬ添加し、２８℃、１００分間、遺伝子変異処理を行った。遺伝子変異処理した胞子は、遠心分離にて回収した後に、トリスーマレイン酸バッファー（ｐＨ６．０）で３回洗浄し、最終的にトリスーマレイン酸バッファー（ｐＨ６．０）１０ｍＬにて懸濁したものを遺伝子変異処理胞子とした。　その遺伝子変異処理胞子を、結晶セルロースを添加して調製した寒天培地へ添加し、コロニー周囲に生じるセルラーゼによる結晶セルロース分解領域であるハロの大きさを指標とし、ハロの大きかったＱＭ９４１４－Ｉ株を選抜した。
　ＱＭ９４１４－Ｈ株とＱＭ９４１４－Ｉ株の遺伝子解析の結果、ＱＭ９４１４－Ｈ株では配列番号９および１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子が保持されていたが、ＱＭ９４１４－Ｉ株では以下に記す２箇所の変異を確認することができた。
（１）配列番号４で表される塩基配列の５５０番目のアデニンがシトシンに変異していた。当該変異は、配列番号９で表されるアミノ酸配列の１８４番目のセリンをアルギニンへ置換する変異である。
（２）配列番号５で表される塩基配列の７６９番目にグアニンが１塩基挿入されていた。当該変異は、配列番号１０で表されるアミノ酸配列の２５７番目にからフレームシフトを挿入させる変異である。
　＜実施例１０＞トリコデルマ・リーセイの変異株の培養試験
　実施例９で取得したＱＭ９４１４－Ｉ株について、実施例６と同様の方法で培養を行い、参考例１、参考例２、参考例３、参考例５の条件で、培養液における培養液中の最大粘度、培養液中の最小溶存酸素飽和度、タンパク質濃度、セルラーゼの比活性をそれぞれ測定した。コントロールには、ＱＭ９４１４－Ｈ株を用いた。ＱＭ９４１４－Ｈ株の値を１とした場合の、ＱＭ９４１４－Ｉ株の粘度の相対値を図３に示す。また、培養期間中の、ＱＭ９４１４－Ｈ株と、ＱＭ９４１４－Ｉ株の溶存酸素の経時的変化を図４に示す。
　これらの結果、ＱＭ９４１４－Ｉ株の培養液中の粘度は、ＱＭ９４１４－Ｈ株よりも低くなった。ＱＭ９４１４－Ｉ株とＱＭ９４１４－Ｈ株の培養液における粘度は、培養開始から２４時間経過時前後で最大となった。ＱＭ９４１４－Ｉ株の２４時間経過時の粘度は、親株であるＱＭ９４１４－Ｈ株の７５％程度まで低下した。
　培養液中の溶存酸素濃度も、ＱＭ９４１４－Ｉ株では、ＱＭ９４１４－Ｈ株に比べて高くなった。ＱＭ９４１４－Ｈ株と、ＱＭ９４１４－Ｉ株の培養液中の溶存酸素濃度は、ともに３６時間経過時前後で最小値となり、ＱＭ９４１４－Ｉ株の３６時間経過時の溶存酸素濃度は、親株のＱＭ９４１４－Ｈ株と比べて３７％程度高くなった。
　また、ＱＭ９４１４－Ｈ株と比較して、ＱＭ９４１４－Ｉ株は、タンパク質濃度は１．１１倍、β－グルコシダーゼ比活性は１．０７倍、β－キシロシダーゼ比活性は１．４０倍、セロビオハイドロラーゼ比活性は１．０３倍高くなった。

Claims (14)

  1. 　配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損または低下する変異を有する、トリコデルマ・リーセイの変異株。
  2. 　前記変異が、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端側より１７９１番目のアスパラギン酸残基のアスパラギン酸以外のアミノ酸残基への変異である、請求項１に記載の変異株。
  3. 　さらに配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損または低下する変異を有する、請求項１または２に記載の変異株。
  4. 　前記変異が、配列番号６で表されるアミノ酸配列のＮ末端側から１３７番目で翻訳が終了するストップコドン変異である、請求項３に記載の変異株。
  5. 　さらに配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損または低下する変異を有する、請求項１～４のいずれかに記載の変異株。
  6. 　前記変異が、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのＬｅｕｃｉｎｅ－ｒｉｃｈ　ｒｅｐｅａｔｓ、ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ－ｌｉｋｅ　ｓｕｂｆａｍｉｌｙドメインが欠損する変異である、請求項５に記載の変異株。
  7. 　前記変異が、配列番号７で表されるアミノ酸配列のＮ末端側から２９７番目のアスパラギン酸残基でのフレームシフト変異である、請求項５または６に記載の変異株。
  8. 　さらに配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのＧＡＬ４－ｌｉｋｅ　Ｚｎ２Ｃｙｓ６　ｂｉｎｕｃｌｅａｒ　ｃｌｕｓｔｅｒ　ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇドメインとｆｕｎｇａｌ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｍｉｄｄｌｅ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｒｅｇｉｏｎドメインの間に位置するアミノ酸配列に変異を有する、請求項１～７のいずれかに記載の変異株。
  9. 　前記変異が、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおけるＮ末端側より１８４番目のセリン残基のセリン以外のアミノ酸残基への変異である、請求項８に記載の変異株。
  10. 　さらに配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損または低下する変異を有する、請求項１～９のいずれかに記載の変異株。
  11. 　前記変異が、配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのＦａｔｔｙ　ａｃｉｄ　ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ　ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙドメインが欠損する変異である、請求項１０に記載の変異株。
  12. 　前記変異が、配列番号１０で表されるアミノ酸配列のＮ末端側から２５７番目のイソロイシン残基でのフレームシフト変異である、請求項１０または１１に記載の変異株。
  13. 　請求項１から１２のいずれかに記載の変異株を培養する工程を含む、タンパク質の製造方法。
  14. 　請求項１から１２のいずれかに記載の変異株を培養する工程を含む、セルラーゼの製造方法。
     
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