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WO2019203073A1 - 脂質の製造方法 - Google Patents

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Publication number
WO2019203073A1
WO2019203073A1 PCT/JP2019/015522 JP2019015522W WO2019203073A1 WO 2019203073 A1 WO2019203073 A1 WO 2019203073A1 JP 2019015522 W JP2019015522 W JP 2019015522W WO 2019203073 A1 WO2019203073 A1 WO 2019203073A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
amino acid
seq
protein
substituted
position corresponding
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2019/015522
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
彰人 川原
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kao Corp
Original Assignee
Kao Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kao Corp filed Critical Kao Corp
Publication of WO2019203073A1 publication Critical patent/WO2019203073A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing lipids. Moreover, this invention relates to the transformant used for the said method.
  • Fatty acids are one of the main components of lipids, and constitute lipids (oils and fats) such as triacylglycerol produced by ester bonds with glycerin in vivo. In many animals and plants, fatty acids are also stored and used as energy sources. Fatty acids and lipids stored in animals and plants are widely used for food or industry. For example, derivatives of higher alcohols obtained by reducing higher fatty acids having about 12 to 18 carbon atoms are used as surfactants. Alkyl sulfate esters and alkylbenzene sulfonates are used as anionic surfactants. Polyoxyalkylene alkyl ethers, alkyl polyglycosides, and the like are used as nonionic surfactants.
  • Cationic surfactants such as alkylamine salts and mono- or dialkyl quaternary ammonium salts, which are derivatives of the same higher alcohol, are routinely used for fiber treatment agents, hair rinse agents, disinfectants, and the like.
  • Benzalkonium-type quaternary ammonium salts are routinely used for bactericides and preservatives.
  • vegetable oils and fats are also used as raw materials for biodiesel fuel.
  • medium-chain fatty acids having 8 or 10 carbon atoms are used for health foods or etching agents.
  • Alcohol derivatives obtained by reducing medium chain fatty acids having 8 or 10 carbon atoms are also used as industrial raw materials for cosmetics, surfactants, plasticizers and the like.
  • acyl-ACP acyl carrier protein thioesterase derived from plants belonging to the genus Cuphea such as Cuphea palustris and Cuphea hookeriana (hereinafter also simply referred to as “TE”)
  • TE Cuphea hookeriana
  • the present invention cultivates a transformant in which a gene encoding the following protein (A) or (B) and a gene encoding the following protein (C) or (D) are introduced into a cell of a microorganism, Or it is related with the manufacturing method of a lipid which makes the lipid which uses this as a structural component produce.
  • a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • B A protein comprising an amino acid sequence having 60% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having acyl-ACP thioesterase activity.
  • C A protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • D A protein comprising an amino acid sequence having 60% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 and having acetyl-CoA synthetase activity.
  • the present invention also relates to a gene encoding the protein (A) or (B) and a transformant that promotes the expression of the gene encoding the protein (C) or (D) in the cells of the microorganism.
  • the present invention relates to a method for producing a lipid, which improves the productivity of a medium chain fatty acid or a lipid comprising the same.
  • the present invention also relates to a transformant that can improve the productivity of medium-chain fatty acids or lipids containing the medium-chain fatty acids and can be suitably used in the above method.
  • acetyl which is a starting material for fatty acid synthesis, in order to further improve the productivity of medium-chain fatty acids for microorganisms produced by introducing a gene encoding TE derived from a plant belonging to the genus Kuffer.
  • CoA CoA
  • malonyl CoA is produced from acetyl CoA, which is a starting material for fatty acid synthesis, by acetyl-CoA carboxylase.
  • malonyl CoA is converted into malonyl ACP by malonyl CoA: ACP transacylase, and further incorporated into the fatty acid chain elongation pathway together with acetyl CoA to produce acetoacetyl ACP.
  • acetoacetyl ACP repeats elongation reaction in the fatty acid chain elongation pathway to synthesize fatty acids having various chain lengths.
  • acetyl CoA is consumed for fatty acid synthesis and at the same time is metabolized to acetic acid by another pathway.
  • the present inventors have repeatedly investigated the conversion (synthesis) of acetic acid to acetyl-CoA for use in fatty acid synthesis while leaving a competitive pathway for fatty acid synthesis, which is metabolized from acetyl-CoA to acetic acid. .
  • the present inventors have introduced a gene encoding TE derived from a plant belonging to the genus Kfea into a host in which expression of a gene encoding an enzyme that synthesizes acetyl CoA from acetic acid has been promoted, so that the medium chain It has been found that the productivity of fatty acids is further improved.
  • the present invention has been completed based on these findings.
  • the productivity of a medium chain fatty acid or a lipid comprising the same can be improved.
  • the transformant of the present invention is excellent in productivity of medium chain fatty acids or lipids comprising the same.
  • lipid refers to neutral lipids (monoacylglycerol (MAG), diacylglycerol (DAG), triacylglycerol (TAG), etc.), waxes, ceramides, and other simple lipids; phospholipids, glycolipids, sulfo Complex lipids such as lipids; and derived lipids derived from these lipids, such as fatty acids (free fatty acids), alcohols, hydrocarbons and the like.
  • Fatty acids generally classified as derived lipids refer to the fatty acids themselves, meaning “free fatty acids”.
  • a fatty acid moiety or an acyl group moiety in simple lipid and complex lipid molecules is referred to as “fatty acid residue”.
  • fatty acid is used as a general term for “free fatty acid” and “fatty acid residue”.
  • fatty acid or lipid containing this as a constituent is used generically as “free fatty acid” and “lipid having the fatty acid residue”.
  • the “fatty acid composition” means the weight ratio of each fatty acid to the total fatty acid (total fatty acid) weighted by regarding the free fatty acid and the fatty acid residue as a fatty acid. The weight (production amount) and fatty acid composition of the fatty acid can be measured by the methods used in the examples.
  • Cx: y in the notation of fatty acids and acyl groups constituting fatty acids means that the number of carbon atoms is x and the number of double bonds is y.
  • Cx represents a fatty acid or acyl group having x carbon atoms.
  • identity of a base sequence and an amino acid sequence is calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 1985, vol. 227, p. 1435-1441). Specifically, it is calculated by performing an analysis assuming that Unit size to compare (ktup) is 2 using the homology analysis (Search homology) program of genetic information processing software Genetyx-Win.
  • stringent conditions include a method described in Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION [Joseph Sambrook, David W. Russell., Cold Spring Harbor Laboratory Press].
  • composition of 1 ⁇ SSC 0.15M sodium chloride, 0.015M sodium citrate, pH 7.0
  • 0.5% SDS 0.5% SDS
  • 5 ⁇ Denhart 100 mg / mL herring sperm DNA
  • upstream of a gene refers to a region continuing on the 5 ′ side of a gene or region regarded as a target, not a position from the translation start point.
  • downstream of a gene indicates a region continuing 3 ′ side of the gene or region captured as a target.
  • intermediate chain means that the acyl group has 8 to 10 carbon atoms, preferably 8 or 10 carbon atoms, and more preferably 8 carbon atoms. The productivity of fatty acids and lipids of the transformant can be measured by the method used in the examples.
  • TE is an enzyme involved in the biosynthesis system of fatty acids and derivatives thereof (such as triacylglycerol (triglyceride)).
  • the enzyme is acyl-ACP (an acyl group that is a fatty acid residue), which is an intermediate in the process of fatty acid biosynthesis, in plastids such as chloroplasts in plants and algae, and in the cytoplasm in bacteria, fungi, and animals. Hydrolyzes the thioester bond of the complex comprising the acyl carrier protein to produce free fatty acids.
  • the fatty acid synthesis on the ACP is completed by the action of TE, and the cut fatty acid is used for synthesis of triacylglycerol and the like.
  • TE has multiple TEs with different reaction specificities depending on the number of carbon atoms and the number of unsaturated bonds in the acyl group (fatty acid residue) that constitutes the substrate acyl-ACP. It is considered to be an important factor that determines the fatty acid composition in vivo.
  • acyl-ACP thioesterase activity (hereinafter also referred to as “TE activity”) refers to an activity of hydrolyzing the thioester bond of acyl-ACP.
  • the protein (A) or (B) is used as TE.
  • the protein (A) consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 2 is a part of the amino acid sequence of wild-type TE derived from Quttle Pulse Tris consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 13.
  • a portion presumed to be a signal sequence is excluded from the full length of the amino acid sequence of wild-type TE.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is obtained by removing the amino acids 1 to 57 from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 and adding a protein synthesis initiation amino acid (methionine) to the N-terminal of the 58th amino acid.
  • a protein synthesis initiation amino acid methionine
  • the region from position 58 to position 411 in the amino acid sequence of wild-type TE derived from Quttle Pulse Tris is important for functioning as TE and sufficient for exhibiting TE activity. That is, since the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 has a region sufficient for TE activity, it has TE activity and functions as TE.
  • TE derived from plants belonging to the genus Kufair has high substrate specificity for medium chain acyl-ACP having 8 or 10 carbon atoms, and improved productivity of medium chain fatty acids having 8 or 10 carbon atoms in transformants. Is preferably used.
  • the protein (A) is also referred to as “CpTE”.
  • Protein (B) is a protein having an amino acid sequence having 60% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having TE activity.
  • an amino acid sequence encoding an enzyme protein does not necessarily indicate enzyme activity unless the sequence of the entire region is conserved, and there are regions that do not affect enzyme activity even if the amino acid sequence changes. It is known to exist. In such a region that is not essential for enzyme activity, the original activity of the enzyme can be maintained even if a mutation such as amino acid deletion, substitution, insertion or addition is introduced. Also in the present invention, a protein that retains TE activity and has a partially mutated amino acid sequence can be used.
  • the identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is 60% or more, preferably 65% or more, more preferably 70% or more, and more preferably 75% or more.
  • 80% or more is more preferable, 85% or more is more preferable, 90% or more is more preferable, 93% or more is more preferable, 95% or more is more preferable, 96% or more is more preferable, 97% or more is more preferable 98% or more is more preferable, and 99% or more is more preferable.
  • the protein (B) one or more (for example, 1 or more and 142 or less, preferably 1 or more and 124 or less, more preferably 1 or more and 106 or less) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 1 or more, 88 or less, more preferably 1 or more and 71 or less, more preferably 1 or more and 53 or less, more preferably 1 or more and 35 or less, more preferably 1 or more and 24 or less. , More preferably 1 to 17 pieces, more preferably 1 to 14 pieces, more preferably 1 to 10 pieces, more preferably 1 to 7 pieces, more preferably 1 to 3 pieces. ), And a protein having TE activity.
  • the protein (B) suitably used in the present invention include a protein in which an amino acid at a specific position in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is substituted (hereinafter also referred to as “CpTE variant”), and Examples include proteins containing the amino acid substitution.
  • CpTE variant the specificity for medium chain acyl-ACP is improved as compared with the protein (A). That is, the modified CpTE uses medium-chain acyl-ACP selectively as a substrate and improves the activity of hydrolyzing it as compared with wild-type CpTE.
  • the amino acid sequence of protein (B) is represented by the following (B-1) to ( Preferably it has at least one amino acid substitution selected from the group consisting of B-11).
  • B-1 An amino acid (preferably or usually leucine) at position 257 of SEQ ID NO: 2 or a position corresponding thereto is substituted with isoleucine.
  • B-2) An amino acid (preferably or usually threonine) at position 251 of SEQ ID NO: 2 or a position corresponding thereto is substituted with arginine.
  • B-3 An amino acid (preferably or usually threonine) at position 251 of SEQ ID NO: 2 or a position corresponding thereto is substituted with lysine.
  • B-4) Amino acid (preferably or usually threonine) at position 251 of SEQ ID NO: 2 or a position corresponding thereto is substituted with histidine.
  • B-5) An amino acid (preferably or usually tryptophan) at position 254 of SEQ ID NO: 2 or a position corresponding thereto is substituted with isoleucine.
  • B-6 Amino acid (preferably or usually tryptophan) at position 254 of SEQ ID NO: 2 or a position corresponding thereto is substituted with tyrosine.
  • B-7 An amino acid (preferably or usually leucine) at position 257 of SEQ ID NO: 2 or a position corresponding thereto is substituted with methionine.
  • B-8 Amino acid (preferably or usually leucine) at position 257 of SEQ ID NO: 2 or a position corresponding thereto is substituted with valine.
  • B-9) An amino acid (preferably or usually leucine) at position 257 of SEQ ID NO: 2 or a position corresponding thereto is substituted with phenylalanine.
  • B-10 Amino acid (preferably or usually valine) at position 266 of SEQ ID NO: 2 or a position corresponding thereto is substituted with cysteine.
  • B-11 An amino acid (preferably or usually tryptophan) at position 271 of SEQ ID NO: 2 or a position corresponding thereto is substituted with tyrosine.
  • the “corresponding position” in the amino acid sequence or the base sequence compares the target amino acid sequence with the reference sequence, and aligns the sequences so as to give the maximum homology to the conserved amino acid residues present in each amino acid sequence. Can be determined.
  • the alignment can be performed using known algorithms, the procedures of which are known to those skilled in the art. For example, the alignment can be performed manually based on the above-mentioned Lipman-Pearson method, etc., but Clustal W multiple alignment program (Nucleic Acids Res., 1994, vol. 22, p. 4673-4680) is set as default Can be used.
  • Clustal W is, for example, the European Bioinformatics Institute (EBI, [www.ebi.ac.uk/index.html]) and the Japan DNA Data Bank (DDBJ, [ It can be used on the website of www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html]).
  • EBI European Bioinformatics Institute
  • DDBJ Japan DNA Data Bank
  • the protein (B) is selected from the group consisting of the following (B-12) to (B-19) It is preferred to have at least one amino acid substitution chosen. In the case of having these amino acid substitutions, the specificity to medium chain acyl-ACP and the productivity of medium chain fatty acids or lipids comprising them are further improved.
  • B-12 An amino acid (preferably or usually valine) at position 106 of SEQ ID NO: 2 or a position corresponding thereto is substituted with isoleucine.
  • An amino acid (preferably or usually asparagine) at position 108 of SEQ ID NO: 2 or a position corresponding thereto is substituted with lysine.
  • B-14 An amino acid (preferably or usually asparagine) at position 108 of SEQ ID NO: 2 or a position corresponding thereto is substituted with arginine.
  • B-15 An amino acid (preferably or usually valine) at position 110 of SEQ ID NO: 2 or a position corresponding thereto is substituted with isoleucine.
  • B-16 An amino acid (preferably or usually valine) at position 110 of SEQ ID NO: 2 or a position corresponding thereto is substituted with methionine.
  • B-17 The amino acid (preferably or usually valine) at position 110 of SEQ ID NO: 2 or a position corresponding thereto is substituted with leucine.
  • the protein (B) has an amino acid substitution of (B-1) and one amino acid substitution selected from the group consisting of (B-12) to (B-19). That is, in the present invention, the protein (B) preferably has an amino acid substitution selected from the group consisting of the following (B-1_B-12) to (B-1_B-19). (B-1_B-12)
  • the amino acid at position 257 of SEQ ID NO: 2 or a position corresponding thereto (preferably or usually leucine) is isoleucine, and the amino acid at position 106 corresponding thereto (preferably or usually) , Valine) is replaced with isoleucine.
  • (B-1_B-13) The amino acid at position 257 of SEQ ID NO: 2, or a position corresponding thereto (preferably or usually leucine) is isoleucine, and the amino acid at position 108 or corresponding position (preferably or usually) , Asparagine) replaced with lysine.
  • (B-1_B-14) The amino acid at position 257 of SEQ ID NO: 2 or a position corresponding thereto (preferably or usually leucine) is isoleucine, and the amino acid at position 108 or corresponding position (preferably or usually) , Asparagine) and arginine respectively.
  • the amino acid at position 257 of SEQ ID NO: 2 or the position corresponding thereto is the amino acid at position 110 corresponding to this, or the position corresponding thereto (preferably or usually) , Valine) and leucine respectively.
  • the amino acid at position 257 of SEQ ID NO: 2 or a position corresponding thereto is isoleucine, and the amino acid at position 110 or corresponding position (preferably or usually) , Valine) and phenylalanine respectively.
  • the protein which contains the amino acid sequence of the said protein (A) or (B) as a part of the amino acid sequence, and shows TE activity is also used suitably.
  • the N-terminal amino acid of the protein is preferably methionine or leucine encoded by the start codon.
  • sequences other than the amino acid sequence of the protein (A) or (B) can be appropriately selected as long as the effects of the present invention are not impaired.
  • an amino acid sequence consisting of any position range from position 1 to position 57 of SEQ ID NO: 13, or one or several amino acids (preferably 1 or more and 20 or less, more preferably 1 or more and 15 or less) And more preferably 1 to 10 or less, more preferably 1 to 5 or less, and more preferably 1 to 3 or less) amino acid sequence in which a mutation is introduced. Mutations include amino acid deletions, substitutions, insertions or additions. These sequences are preferably added to the N-terminal side of the amino acid sequence of the protein (A) or (B).
  • the TE used in the present invention may be a protein consisting of an amino acid sequence in which the N-terminal side is deleted at any position between amino acid positions 2 to 57 of SEQ ID NO: 13 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13. Good.
  • a protein comprising an amino acid sequence in which a signal peptide involved in protein transport or secretion is added to the amino acid sequence of the protein (A) or (B) is also preferable.
  • the fact that the protein has TE activity is introduced, for example, by introducing a DNA linking a gene encoding the protein downstream of a promoter functioning in a host cell such as E. coli into a host cell lacking the fatty acid degradation system. It can be confirmed by culturing under conditions where the gene is expressed, and analyzing changes in the fatty acid composition in the host cell or culture solution using a method such as gas chromatography analysis. At this time, it can be confirmed that the specificity to medium-chain acyl-ACP is improved by comparing the ratio of medium-chain fatty acids in the total amount of fatty acids with the system in which wild-type TE is expressed.
  • Examples of a method for introducing a mutation into an amino acid sequence include a method for introducing a mutation into a base sequence encoding an amino acid sequence.
  • Examples of the method for introducing mutation include site-specific mutagenesis.
  • Specific methods for introducing site-specific mutations include a method using SOE-PCR, an ODA method, a Kunkel method, and the like. You can also use commercially available kits such as Site-Directed Mutagenesis System Mutan-SuperExpress Km kit (Takara Bio), Transformer TM Site-Directed Mutagenesis kit (Clontech), KOD-Plus-Mutagenesis Kit (Toyobo) it can.
  • the target gene after giving a random gene mutation, the target gene can also be obtained by performing activity evaluation and gene analysis by an appropriate method.
  • the proteins (A) and (B) can be obtained by ordinary chemical techniques, genetic engineering techniques, and the like.
  • a protein derived from a natural product can be obtained by isolation, purification, etc. from Quttle Pulse Tris.
  • the proteins (A) and (B) can be obtained by artificial chemical synthesis based on the amino acid sequence information shown in SEQ ID NO: 2.
  • the proteins (A) and (B) may be prepared as recombinant proteins by genetic recombination techniques.
  • the TE gene described below can be used. It should be noted that plants such as Kuffer Pulstris can be obtained from conservation organizations such as private or public laboratories.
  • TE gene As a gene (hereinafter also referred to as “TE gene”) encoding at least one protein selected from the group consisting of the proteins (A) and (B), any one of the following DNAs (a) and (b) The gene which becomes.
  • the DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 shown below encodes a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (protein consisting of a part of wild-type TE derived from Kuffer Pulse Tris).
  • the base sequence encoding the above signal sequence (the amino acid sequence from positions 1 to 57 of SEQ ID NO: 13) corresponds to the base sequence consisting of positions 1 to 171 of SEQ ID NO: 12.
  • CpTE gene the gene consisting of the DNA (a) is also referred to as “CpTE gene”.
  • A DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • B A DNA encoding a protein having a TE sequence having identity to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having 60% or more identity.
  • the identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 is 60% or more, preferably 65% or more, more preferably 70% or more, and more preferably 75% or more.
  • 80% or more is more preferable, 85% or more is more preferable, 90% or more is more preferable, 93% or more is more preferable, 95% or more is more preferable, 96% or more is more preferable, 97% or more is preferable, 98% or more is more preferable, and 99% or more is more preferable.
  • DNA (b) one or more (for example, 1 or more and 427 or less, preferably 1 or more and 373 or less, more preferably 1 or more and 320 or less) in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and more Preferably from 1 to 267, more preferably from 1 to 213, more preferably from 1 to 160, more preferably from 1 to 106, more preferably from 1 to 74, more Preferably 1 or more and 53 or less, more preferably 1 or more and 42 or less, more preferably 1 or more and 32 or less, more preferably 1 or more and 21 or less, more preferably 1 or more and 10 or less)
  • a DNA encoding the protein (A) or (B) having a base deleted, substituted, inserted, or added and having TE activity is also preferred.
  • the DNA (b) encodes the protein (A) or (B) that hybridizes with a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA (a) under stringent conditions and has TE activity. DNA is also preferred
  • the DNA (b) is also preferably a DNA comprising a base sequence having at least one base substitution selected from the group consisting of the following (b-1) to (b-11).
  • the following (b-1) to (b-11) are base substitutions corresponding to the amino acid substitutions of (B-1) to (B-11).
  • base substitutions (b-1), (b-2), (b-3), (b-4), (b-5), (b-6), (b-7), ( b-8), (b-9), (b-10) and (b-11) are the amino acid substitutions (B-1), (B-2), (B-3), (B-4), respectively. ), (B-5), (B-6), (B-7), (B-8), (B-9), (B-10) and (B-11).
  • B-1) The bases at positions 769 to 771 in SEQ ID NO: 1 or positions corresponding thereto are substituted with bases encoding isoleucine.
  • B-2 The base at positions 751 to 753 of SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto is substituted with a base encoding arginine.
  • B-3 The base at positions 751 to 753 of SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto is substituted with a base encoding lysine.
  • B-4 The base at positions 751 to 753 of SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto is substituted with a base encoding histidine.
  • B-5) The base at positions 760 to 762 in SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto is substituted with a base encoding isoleucine.
  • B-6 The base at positions 760 to 762 in SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto is substituted with a base encoding tyrosine.
  • B-7 The base at positions 769 to 771 in SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto is substituted with a base encoding methionine.
  • B-8 The bases at positions 769 to 771 in SEQ ID NO: 1 or positions corresponding thereto are substituted with bases encoding valine.
  • B-9) The base at positions 769 to 771 in SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto is substituted with a base encoding phenylalanine.
  • B-10 The base at positions 796 to 798 of SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto is substituted with a base encoding cysteine.
  • B-11 The base at positions 811 to 813 of SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto is substituted with a base encoding tyrosine.
  • the DNA (b) is selected from the group consisting of the following (b-12) to (b-19) in addition to at least one base substitution selected from the group consisting of (b-1) to (b-11) It is preferred to have at least one base substitution.
  • the following (b-12) to (b-19) are base substitutions corresponding to the amino acid substitutions of the above (B-12) to (B-19). Specifically, base substitution (b-12), (b-13), (b-14), (b-15), (b-16), (b-17), (b-18) and (b b-19) are the amino acid substitutions (B-12), (B-13), (B-14), (B-15), (B-16), (B-17), (B-18), respectively. ) And (B-19).
  • B-12 The bases at positions 316 to 318 of SEQ ID NO: 1 or positions corresponding thereto are substituted with bases encoding isoleucine.
  • B-13 The base at positions 322 to 324 of SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto is substituted with a base encoding lysine.
  • B-14 The base at positions 322 to 324 of SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto is substituted with a base encoding arginine.
  • B-15 The base at positions 328 to 330 of SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto is substituted with a base encoding isoleucine.
  • B-16 The base at positions 328 to 330 of SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto is substituted with a base encoding methionine.
  • B-17 The base at positions 328 to 330 of SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto is substituted with a base encoding leucine.
  • B-18 The base at positions 328 to 330 of SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto is substituted with a base encoding phenylalanine.
  • B-19 The base at positions 352 to 354 of SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto is substituted with a base encoding isoleucine.
  • the DNA (b) preferably has the base substitution (b-1) and at least one base substitution selected from the group consisting of (b-12) to (b-19). preferable. That is, in the present invention, the DNA (b) preferably has a base substitution selected from the group consisting of the following (b-1_b-12) to (b-1_b-19). (B-1_b-12) The bases at positions 769 to 771 in SEQ ID NO: 1 or positions corresponding thereto encode isoleucine, and the bases at positions 316 to 318 or positions corresponding to isoleucine Substituting each of the encoded bases.
  • (B-1_b-13) The bases at positions 769 to 771 in SEQ ID NO: 1 or the positions corresponding thereto encode isoleucine, and the bases at positions 322 to 324 or positions corresponding thereto are lysine. Substituting each of the encoded bases.
  • (B-1_b-14) The bases at positions 769 to 771 in SEQ ID NO: 1 or the positions corresponding thereto encode isoleucine, and the bases at positions 322 to 324 or positions corresponding to these represent arginine. Substituting each of the encoded bases.
  • (B-1_b-15) The bases at positions 769 to 771 of SEQ ID NO: 1 or positions corresponding thereto encode isoleucine; the bases at positions 328 to 330 or positions equivalent to isoleucine; Substituting each of the encoded bases.
  • (B-1_b-16) The bases at positions 769 to 771 in SEQ ID NO: 1 or the positions corresponding thereto encode isoleucine; Substituting each of the encoded bases.
  • (B-1_b-17) The bases at positions 769 to 771 of SEQ ID NO: 1 or positions corresponding thereto encode isoleucine, the bases at positions 328 to 330 or positions corresponding to leucine Substituting each of the encoded bases.
  • B-1_b-18 Bases at positions 769 to 771 of SEQ ID NO: 1 or positions corresponding thereto encode isoleucine, bases at positions 328 to 330 or positions corresponding thereto are phenylalanine Substituting each of the encoded bases.
  • B-1_b-19 Bases at positions 769 to 771 of SEQ ID NO: 1 or positions corresponding thereto encode isoleucine, bases at positions 352 to 354 or positions corresponding to these are isoleucine Substituting each of the encoded bases.
  • Examples of methods for introducing mutations such as deletion, substitution, insertion and addition into the base sequence include site-specific mutagenesis.
  • Specific methods for introducing site-specific mutations include a method using Splicing overlap extension (SOE) PCR (Gene, 1989, vol. 77, p. 61-68), ODA method (Gene, 1995, 152, 271). -276), Kunkel method (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, vol. 82, p. 488).
  • SOE Splicing overlap extension
  • the target gene can also be obtained by performing an enzyme activity evaluation and gene analysis by an appropriate method.
  • a gene encoding a CpTE variant (hereinafter, also referred to as “CpTE variant gene”) can be obtained by an ordinary genetic engineering technique.
  • a CpTE variant gene can be artificially synthesized based on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • a service such as Invitrogen can be used. It can also be obtained by cloning from Qufare Pulse Tris.
  • Acetyl-CoA synthetase (hereinafter also referred to as “ACS”) is a protein (enzyme) having acetyl-CoA synthetase activity (hereinafter also referred to as “ACS activity”).
  • ACS catalyzes the reaction of producing acetyl-CoA from CoA and acetic acid.
  • the ACS activity refers to an activity that catalyzes a thioesterification reaction between CoA and acetic acid.
  • the protein (C) or (D) is used as ACS.
  • the protein (C) consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is ACS derived from E. coli.
  • the protein (C) is also referred to as “EcACS”.
  • Protein (D) is a protein having an amino acid sequence having 60% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 and having ACS activity.
  • the identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is 60% or more, preferably 65% or more, more preferably 70% or more, and more preferably 75% or more.
  • 80% or more is more preferable, 85% or more is more preferable, 90% or more is more preferable, 93% or more is more preferable, 95% or more is more preferable, 96% or more is more preferable, 97% or more is more preferable 98% or more is more preferable, and 99% or more is more preferable.
  • the protein (D) one or more (for example, 1 or more and 260 or less, preferably 1 or more and 228 or less, more preferably 1 or more and 195 or less) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 1 or more and 163 or less, more preferably 1 or more and 130 or less, more preferably 1 or more and 97 or less, more preferably 1 or more and 65 or less, more preferably 1 or more and 45 or less.
  • a protein having ACS activity for example, 1 or more and 260 or less, preferably 1 or more and 228 or less, more preferably 1 or more and 195 or less.
  • the ACS used in the present invention is an amino acid obtained by adding a signal peptide involved in protein transport or secretion to the amino acid sequence of the protein (C) or (D), or a known amino acid sequence that enhances protein stability. It may be a protein consisting of a sequence.
  • the fact that the protein has ACS activity is, for example, introduced into a host cell deficient in the fatty acid degradation system by introducing a DNA linking the gene encoding the protein downstream of a promoter that functions in a host cell such as E. coli. It can be confirmed by culturing under conditions where the gene is expressed, and analyzing the change in the content of acetic acid or the content of acetyl CoA in the host cell or culture using a method such as gas chromatography analysis.
  • the proteins (C) and (D) can be obtained by ordinary chemical techniques, genetic engineering techniques, and the like.
  • a protein derived from a natural product can be obtained by isolation and purification from E. coli.
  • the proteins (C) and (D) can be obtained by artificial chemical synthesis based on the amino acid sequence information shown in SEQ ID NO: 4.
  • the proteins (C) and (D) may be produced as recombinant proteins by genetic recombination techniques.
  • the ACS gene described below can be used.
  • Microorganisms such as Escherichia coli can be obtained from a storage organization such as a private or public laboratory.
  • ACS gene a gene comprising any one of the following DNA (c) and (d) Is mentioned.
  • DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 shown below encodes a protein (EcACS) consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • EcACS gene the gene consisting of the DNA (c) is also referred to as “EcACS gene”.
  • C DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • D A DNA encoding a protein having a base sequence having 60% or more identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 and having ACS activity.
  • the identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 is 60% or more, preferably 65% or more, more preferably 70% or more, and more preferably 75% or more.
  • 80% or more is more preferable, 85% or more is more preferable, 90% or more is more preferable, 93% or more is more preferable, 95% or more is more preferable, 96% or more is more preferable, 97% or more is more preferable 98% or more is more preferable, and 99% or more is more preferable.
  • DNA (d) one or more (for example, 1 or more and 783 or less, preferably 1 or more and 685 or less, more preferably 1 or more and 587 or less) in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 and more Preferably from 1 to 489, more preferably from 1 to 391, more preferably from 1 to 293, more preferably from 1 to 195, more preferably from 1 to 137, more 1 to 97, preferably 1 to 78, more preferably 1 to 58, more preferably 1 to 39, more preferably 1 to 19)
  • a DNA encoding the protein (C) or (D) having a base deleted, substituted, inserted, or added and having ACS activity is also preferable.
  • the DNA (d) it encodes the protein (C) or (D) which hybridizes with a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA (c) under stringent conditions and has ACS activity. DNA is also preferred.
  • the DNA encoding ACS used in the present invention is a signal peptide involved in protein transport or secretion, or a known amino acid sequence that enhances protein stability, etc. in the base sequence of DNA (c) or (d). It may be a gene consisting of a base sequence to which the encoding DNA is added.
  • the gene encoding ACS can be obtained by ordinary genetic engineering techniques.
  • the ACS gene can be artificially synthesized based on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 or the base sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • services such as Invitrogen can be used. It can also be obtained from E. coli by cloning. For example, it can be performed by the method described in Molecular-Cloning-A-LABORATORY-MANUAL-THIRD-EDITION [Joseph-Sambrook, David-W.-Russell, Cold-Spring-Harbor-Laboratory-Press (2001)].
  • the gene encoding the protein (A) or (B) and the gene encoding the protein (C) or (D) are introduced into a host cell, and the expression thereof is promoted. Yes.
  • productivity of medium chain fatty acids having 8 or 10 carbon atoms in the obtained transformant is obtained. Is known to improve.
  • the transformant prepared by introducing the TE gene and ACS gene into the host compared with the transformant prepared by introducing only the TE gene into the host, The productivity of all fatty acids is significantly improved. Therefore, by culturing the transformant of the present invention, the productivity of medium-chain fatty acids produced in the transformant cells or lipids comprising this as a constituent component is further improved.
  • the transformant of the present invention can be prepared by introducing the gene encoding the protein (A) or (B) and the gene encoding the protein (C) or (D) into a host by a conventional method. it can. Specifically, a recombinant vector or a gene expression cassette capable of expressing the TE gene and the ACS gene in a host cell is prepared and introduced into the host cell to transform the host cell. it can.
  • the host for the transformant can be appropriately selected from those usually used.
  • hosts that can be used in the present invention include microorganisms (including microalgae).
  • the microorganism may be either a prokaryotic organism or a eukaryotic organism, a microorganism belonging to the genus Escherichia, a microorganism belonging to the genus Bacillus, a prokaryotic organism such as cyanobacteria (cyanobacteria), or a yeast or filamentous fungus.
  • Eukaryotic microorganisms such as can be used.
  • Escherichia coli Escherichia coli, Bacillus subtilis , red yeast ( Rhodosporidium toruloides ), or Mortierella sp. Is preferred, and Escherichia coli is more preferred.
  • a vector serving as a base for a plasmid for gene expression or a cassette for gene expression
  • a vector capable of introducing a gene encoding a target protein into a host and expressing the target gene in a host cell If it is.
  • a vector having an expression control region such as a promoter or terminator according to the type of host to be used, and a vector having a replication origin, a selection marker, or the like can be used.
  • it may be a vector that autonomously grows and replicates outside the chromosome, such as a plasmid, or a vector that is integrated into the chromosome.
  • an expression vector that can be preferably used in the present invention, when a microorganism is used as a host, for example, pBluescript (pBS) II SK (-) (Stratagene), pSTV vector (Takara Bio), pUC vectors (Takara Shuzo), pET vectors (Takara Bio), pGEX vectors (GE Healthcare), pCold vectors (Takara Bio), pHY300PLK (Takara Bio), pUB110 ( 1986, Plasma 15 (2), p.
  • pBR322 (Takara Bio)
  • pRS403 (Stratagene)
  • pMW218 / 219 Nippon Gene
  • pRI vector pRI vector
  • Examples include pBI vectors (Clontech) and IN3 vectors (Implanter Innovations).
  • the host is Escherichia coli
  • pBluescript II SK ( ⁇ ) or pMW218 / 219 is preferably used.
  • the DNA fragment include a DNA fragment amplified by a PCR method and a DNA fragment cleaved with a restriction enzyme.
  • Introduction of a gene encoding the target protein into the vector can be performed by a conventional method such as restriction enzyme treatment or ligation.
  • the type of promoter that regulates the expression of the gene encoding the target protein incorporated in the expression vector can also be appropriately selected according to the type of host used. Promoters that can be preferably used in the present invention can be induced by the addition of lac promoter, trp promoter, tac promoter, trc promoter, T7 promoter, SpoVG promoter, isopropyl ⁇ -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG).
  • Promoters related to various derivatives Rubisco operon (rbc), PSI reaction center protein (psaAB), PSII D1 protein (psbA), cauliflower mosil virus 35SRNA promoter, housekeeping gene promoter (eg, tubulin promoter, actin promoter, ubiquitin promoter) etc.), rape or oilseed rape derived Napin gene promoter, a plant-derived Rubisco promoters, Nannochloropsis from the genus violaxanthin / chlorophyll a binding protein gene promoter VCP1 promoter, VCP2 promoter) (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, vol.
  • oleosin-like protein LDSP lipid droplet surface protein
  • LDSP lipid droplet surface protein
  • the promoter of the rrnA operon gene encoding ribosomal RNA can be appropriately selected according to the type of host used.
  • Selectable markers that can be preferably used in the present invention include ampicillin resistance gene, chloramphenicol resistance gene, erythromycin resistance gene, neomycin resistance gene, kanamycin resistance gene, spectinomycin resistance gene, tetracycline resistance gene, blasticidin S Drug resistance genes such as resistance genes, bialaphos resistance genes, zeocin resistance genes, paromomycin resistance genes, and hygromycin resistance genes. Furthermore, a gene defect associated with auxotrophy can be used as a selectable marker gene.
  • the transformation method can be appropriately selected from conventional methods according to the type of host used. For example, transformation methods using calcium ions, general competent cell transformation methods, protoplast transformation methods, electroporation methods, LP transformation methods, methods using Agrobacterium, particle gun methods, etc. .
  • ⁇ Selection of transformant introduced with target gene fragment> can be performed by using a selection marker or the like.
  • a drug resistance gene acquired by a transformant as a result of introduction of a drug resistance gene into a host cell together with a target DNA fragment at the time of transformation can be used as an indicator.
  • the introduction of the target DNA fragment can also be confirmed by PCR method using a genome as a template.
  • the TE gene and ACS gene to be introduced into various hosts are preferably optimized for codons according to the codon usage frequency in the host to be used.
  • Information on codons used by various organisms can be obtained from Codon Usage Database (www.kazusa.or.jp/codon/).
  • the transformant of the present invention significantly improves the productivity of medium-chain fatty acids or lipids containing this as a constituent, compared to transformants into which only the TE gene has been introduced. Therefore, the transformant of the present invention is a fatty acid or lipid having a specific number of carbon atoms, particularly a medium-chain fatty acid or a lipid comprising this as a constituent, preferably a fatty acid having 8 to 10 carbon atoms or a constituent thereof. Lipids, more preferably fatty acids having 8 or 10 carbon atoms, or lipids comprising this, more preferably saturated fatty acids (caprylic acid, capric acid) having 8 or 10 carbon atoms or lipids comprising this.
  • a saturated fatty acid having 8 carbon atoms or a lipid comprising this.
  • a product into which a gene encoding at least one protein selected from the group consisting of the proteins (A) to (D) is introduced is also referred to as “transformant”.
  • a gene into which any of the proteins (A) to (D) is not introduced is also referred to as “host” or “wild strain”.
  • the productivity of a medium chain fatty acid or a lipid comprising the same is promoted in the expression of the protein (A) or (B) and the protein (C) or (D).
  • the transformant of the present invention is cultured under appropriate conditions, and then the medium chain fatty acid or the lipid comprising this as a constituent component is recovered from the obtained culture, the medium chain fatty acid or the lipid comprising this constituent is obtained.
  • “culture” refers to a culture solution and a transformant after culturing.
  • Culture conditions for the transformant of the present invention can be appropriately selected depending on the host, and culture conditions generally used for the host can be used. For example, it is preferable to use glucose or glycerin as the carbon source.
  • acetic acid and acetate as a substrate for ACS may be added to the medium.
  • the Escherichia coli can be cultured, for example, in LB medium or Overnight Express Instant TB Medium (Novagen) at 30 to 37 ° C. for 0.5 to 1 day.
  • the method for collecting lipid from the culture can be appropriately selected from conventional methods.
  • lipid components are isolated and recovered from the aforementioned culture by filtration, centrifugation, cell disruption, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, chloroform / methanol extraction method, hexane extraction method, or ethanol extraction method, etc. can do.
  • oil can be recovered from the culture by pressing or extraction, and then general purification such as degumming, deoxidation, decolorization, dewaxing, and deodorization can be performed to obtain a lipid.
  • a fatty acid can be obtained by hydrolyzing the isolated lipid.
  • Examples of the method for isolating fatty acid from the lipid component include a method of treating at a high temperature of about 70 ° C. in an alkaline solution, a method of treating with lipase, a method of decomposing using high-pressure hot water, and the like.
  • a transformant prepared using E. coli that has lost the function of the ⁇ -oxidation pathway, which is a fatty acid degradation pathway as a host, the produced lipid is secreted extracellularly. Therefore, it is not necessary to destroy the cells to collect the lipid, and the cells remaining after the lipid collection can be used repeatedly for lipid production.
  • the lipid produced in the production method of the present invention preferably contains a fatty acid or a fatty acid compound, and more preferably contains a fatty acid or a fatty acid ester compound, from the viewpoint of its availability.
  • the fatty acid ester compound is preferably at least one selected from the group consisting of MAG, DAG and TAG, and more preferably TAG.
  • the fatty acid or fatty acid ester compound contained in the lipid is preferably a medium chain fatty acid or a fatty acid ester compound thereof from the viewpoint of availability to a surfactant or the like and nutritional viewpoint.
  • a fatty acid having 8 to 10 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof is preferable, a fatty acid having 8 or 10 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof is more preferable, and a saturated fatty acid having 8 or 10 carbon atoms (capryl).
  • Acid, capric acid) or a fatty acid ester compound thereof more preferably a saturated fatty acid having 8 carbon atoms (caprylic acid) or a fatty acid ester compound thereof.
  • the fatty acid ester compound is preferably a simple lipid or a complex lipid, more preferably a simple lipid, and even more preferably triacylglycerol.
  • Lipids obtained by the production method of the present invention are used as edible, plasticizers, emulsifiers such as cosmetics, detergents such as soaps and detergents, fiber treatment agents, hair rinse agents, or bactericides and preservatives. Can do.
  • the present invention further discloses the following lipid production method, lipid productivity improvement method, transformant, and production method of the transformant.
  • ⁇ 1> Culturing a transformant in which a gene encoding the following protein (A) or (B) and a gene encoding the following protein (C) or (D) are introduced into a cell of a microorganism, A method for producing a lipid, wherein a lipid comprising this as a constituent is produced.
  • a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • ⁇ 2> Promoting the expression of the gene encoding the protein (A) or (B) and the gene encoding the protein (C) or (D), and being produced in the cells of the transformant of the microorganism
  • ⁇ 3> Fatty acid produced in the cells of the transformant of the microorganism by promoting the expression of the gene encoding the protein (A) or (B) and the gene encoding the protein (C) or (D) To improve the total productivity of lipids.
  • the gene encoding the protein (A) or (B) and the gene encoding the protein (C) or (D) are introduced into a microorganism cell to promote the expression of the gene ⁇ 1>
  • ⁇ 5> culturing a transformant in which a gene encoding the protein (A) or (B) and a gene encoding the protein (C) or (D) are introduced into a cell of a microorganism; A method for producing a lipid, wherein a lipid comprising this as a constituent is produced.
  • ⁇ 6> Culturing a transformant in which a gene encoding the protein (A) or (B) and a gene encoding the protein (C) or (D) are introduced into a microbial cell, A method for improving lipid productivity, which improves the productivity of medium-chain fatty acids produced in cells or lipids comprising the same.
  • ⁇ 7> Culturing a transformant in which a gene encoding the protein (A) or (B) and a gene encoding the protein (C) or (D) are introduced into a microbial cell, A method for improving lipid productivity, which improves the total amount of fatty acids produced in cells.
  • the protein (B) has one or more, preferably 1 to 142, more preferably 1 to 124, more preferably 1 or more amino acid sequences in the protein (A). 106 or less, more preferably 1 or more and 88 or less, more preferably 1 or more and 71 or less, more preferably 1 or more and 53 or less, more preferably 1 or more and 35 or less, more preferably 1 or more 24 or less, more preferably 1 or more and 17 or less, more preferably 1 or more and 14 or less, more preferably 1 or more and 10 or less, more preferably 1 or more and 7 or less, more preferably 1 or more
  • the method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 7>, wherein the protein has TE activity, wherein 3 or less amino acids are deleted, substituted, inserted or added.
  • B-3 An amino acid (preferably or usually threonine) at position 251 of SEQ ID NO: 2 or a position corresponding thereto is substituted with lysine.
  • B-4) Amino acid (preferably or usually threonine) at position 251 of SEQ ID NO: 2 or a position corresponding thereto is substituted with histidine.
  • B-5) An amino acid (preferably or usually tryptophan) at position 254 of SEQ ID NO: 2 or a position corresponding thereto is substituted with isoleucine.
  • B-6 Amino acid (preferably or usually tryptophan) at position 254 of SEQ ID NO: 2 or a position corresponding thereto is substituted with tyrosine.
  • B-7 An amino acid (preferably or usually leucine) at position 257 of SEQ ID NO: 2 or a position corresponding thereto is substituted with methionine.
  • B-8 Amino acid (preferably or usually leucine) at position 257 of SEQ ID NO: 2 or a position corresponding thereto is substituted with valine.
  • B-9) An amino acid (preferably or usually leucine) at position 257 of SEQ ID NO: 2 or a position corresponding thereto is substituted with phenylalanine.
  • B-10 Amino acid (preferably or usually valine) at position 266 of SEQ ID NO: 2 or a position corresponding thereto is substituted with cysteine.
  • the protein (B) includes the following (B-12) to (B-19): The method according to ⁇ 9>, wherein the protein is a protein comprising an amino acid sequence having at least one amino acid substitution selected from the group consisting of: (B-12) An amino acid (preferably or usually valine) at position 106 of SEQ ID NO: 2 or a position corresponding thereto is substituted with isoleucine.
  • the amino acid (preferably or usually valine) at position 110 of SEQ ID NO: 2 or a position corresponding thereto is substituted with leucine.
  • An amino acid (preferably or usually valine) at position 110 of SEQ ID NO: 2 or a position corresponding thereto is substituted with phenylalanine.
  • An amino acid (preferably or usually cysteine) at position 118 of SEQ ID NO: 2 or a position corresponding thereto is substituted with isoleucine.
  • the protein ⁇ B> is a protein comprising an amino acid sequence having an amino acid substitution selected from the group consisting of the following (B-1_B-12) to (B-1_B-19): 10. The method according to any one of 10>.
  • (B-1_B-12) The amino acid at position 257 of SEQ ID NO: 2 or a position corresponding thereto (preferably or usually leucine) is isoleucine, and the amino acid at position 106 corresponding thereto (preferably or usually) , Valine) is replaced with isoleucine.
  • (B-1_B-13) The amino acid at position 257 of SEQ ID NO: 2, or a position corresponding thereto (preferably or usually leucine) is isoleucine, and the amino acid at position 108 or corresponding position (preferably or usually) , Asparagine) replaced with lysine.
  • (B-1_B-14) The amino acid at position 257 of SEQ ID NO: 2 or a position corresponding thereto (preferably or usually leucine) is isoleucine, and the amino acid at position 108 or corresponding position (preferably or usually) , Asparagine) and arginine respectively.
  • (B-1_B-15) amino acid at position 257 of SEQ ID NO: 2 or a position corresponding thereto (preferably or usually leucine) is isoleucine, amino acid at position 110 or corresponding position (preferably or usually) , Valine) is replaced with isoleucine.
  • the amino acid at position 257 of SEQ ID NO: 2 or a position corresponding thereto is isoleucine, and the amino acid at position 110 or corresponding position thereof (preferably or usually) , Valine) and methionine respectively.
  • the amino acid at position 257 of SEQ ID NO: 2 or the position corresponding thereto is the amino acid at position 110 corresponding to this, or the position corresponding thereto (preferably or usually) , Valine) and leucine respectively.
  • (B-1_B-18) The amino acid at position 257 of SEQ ID NO: 2 or a position corresponding thereto (preferably or usually leucine) is isoleucine, and the amino acid at position 110 or corresponding position (preferably or usually) , Valine) and phenylalanine respectively.
  • (B-1_B-19) The amino acid at position 257 of SEQ ID NO: 2 or a position corresponding thereto (preferably or usually leucine) is isoleucine, and the amino acid at position 118 or equivalent position thereof (preferably or usually) , Cysteine) is replaced with isoleucine.
  • the protein (D) has one or more, preferably 1 to 260, more preferably 1 to 228, more preferably 1 or more amino acid sequences in the protein (C). 195 or less, more preferably 1 or more and 163 or less, more preferably 1 or more and 130 or less, more preferably 1 or more and 97 or less, more preferably 1 or more and 65 or less, more preferably 1 or more 45 or less, more preferably 1 or more and 32 or less, more preferably 1 or more and 26 or less, more preferably 1 or more and 19 or less, more preferably 1 or more and 13 or less, more preferably 1 or more
  • the method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 11> above, wherein the protein has ACS activity, wherein 6 or less amino acids are deleted, substituted, inserted or added.
  • the gene encoding the protein (A) or (B) and the gene encoding the protein (C) or (D) are the following DNA (a) or (b), and the following DNA (c) or The method according to any one of the above ⁇ 1> to ⁇ 12>, which is a gene comprising (d).
  • the DNA (b) has one or more, preferably 1 or more and 427 or less, preferably 1 or more and 373 or less, more preferably 1 or more and 320 in the base sequence of the DNA (a).
  • the DNA (b) comprises a base sequence having at least one base substitution selected from the group consisting of the following (b-1) to (b-11), preferably a base substitution (b-1)
  • B-1 The bases at positions 769 to 771 in SEQ ID NO: 1 or positions corresponding thereto are substituted with bases encoding isoleucine.
  • B-2 The base at positions 751 to 753 of SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto is substituted with a base encoding arginine.
  • B-3 The base at positions 751 to 753 of SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto is substituted with a base encoding lysine.
  • B-4) The base at positions 751 to 753 of SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto is substituted with a base encoding histidine.
  • B-5 The base at positions 760 to 762 in SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto is substituted with a base encoding isoleucine.
  • B-6 The base at positions 760 to 762 in SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto is substituted with a base encoding tyrosine.
  • B-7 The base at positions 769 to 771 in SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto is substituted with a base encoding methionine.
  • B-8) The bases at positions 769 to 771 in SEQ ID NO: 1 or positions corresponding thereto are substituted with bases encoding valine.
  • the DNA (b) includes the following (b-12) to (b-19): ⁇ 15>
  • B-12 The bases at positions 316 to 318 of SEQ ID NO: 1 or positions corresponding thereto are substituted with bases encoding isoleucine.
  • B-13 The base at positions 322 to 324 of SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto is substituted with a base encoding lysine.
  • B-14 The base at positions 322 to 324 of SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto is substituted with a base encoding arginine.
  • B-15 The base at positions 328 to 330 of SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto is substituted with a base encoding isoleucine.
  • B-16 The base at positions 328 to 330 of SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto is substituted with a base encoding methionine.
  • B-17 The base at positions 328 to 330 of SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto is substituted with a base encoding leucine.
  • the base at positions 328 to 330 of SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto is substituted with a base encoding phenylalanine.
  • the base at positions 352 to 354 of SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto is substituted with a base encoding isoleucine.
  • the DNA (b) is a DNA having a base sequence having a base substitution selected from the group consisting of the following (b-1_b-12) to (b-1_b-19), and the protein (A) Alternatively, the method according to any one of ⁇ 13> to ⁇ 16>, wherein the DNA encodes (B).
  • B-1_b-12 The bases at positions 769 to 771 in SEQ ID NO: 1 or positions corresponding thereto encode isoleucine, and the bases at positions 316 to 318 or positions corresponding to isoleucine Substituting each of the encoded bases.
  • B-1_b-13 The bases at positions 769 to 771 in SEQ ID NO: 1 or the positions corresponding thereto encode isoleucine, and the bases at positions 322 to 324 or positions corresponding thereto are lysine. Substituting each of the encoded bases.
  • (B-1_b-14) The bases at positions 769 to 771 in SEQ ID NO: 1 or the positions corresponding thereto encode isoleucine, and the bases at positions 322 to 324 or positions corresponding to these represent arginine. Substituting each of the encoded bases.
  • (B-1_b-15) The bases at positions 769 to 771 of SEQ ID NO: 1 or positions corresponding thereto encode isoleucine; the bases at positions 328 to 330 or positions equivalent to isoleucine; Substituting each of the encoded bases.
  • (B-1_b-16) The bases at positions 769 to 771 in SEQ ID NO: 1 or the positions corresponding thereto encode isoleucine; Substituting each of the encoded bases.
  • (B-1_b-17) The bases at positions 769 to 771 of SEQ ID NO: 1 or positions corresponding thereto encode isoleucine, the bases at positions 328 to 330 or positions corresponding to leucine Substituting each of the encoded bases.
  • (B-1_b-18) Bases at positions 769 to 771 of SEQ ID NO: 1 or positions corresponding thereto encode isoleucine, bases at positions 328 to 330 or positions corresponding thereto are phenylalanine Substituting each of the encoded bases.
  • the DNA (d) has one or more, preferably 1 to 783, preferably 1 to 685, more preferably 1 to 587 nucleotide sequences in the DNA (c).
  • DNA encoding the protein (C) or (D) having a base sequence in which not more than one nucleotide is deleted, substituted, inserted, or added, and having ACS activity Is a DNA that hybridizes with a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA (c) under stringent conditions and encodes the protein (C) or (D) having ACS activity,
  • the medium-chain fatty acid or the lipid comprising this as a constituent component is a fatty acid having 8 to 10 carbon atoms or a lipid comprising this, more preferably a fatty acid having 8 or 10 carbon atoms or a constituent thereof Lipid as a component, more preferably a saturated fatty acid having 8 or 10 carbon atoms (caprylic acid, capric acid) or a lipid having this as a constituent, more preferably a saturated fatty acid having 8 carbon atoms (caprylic acid) or this
  • the lipid is a fatty acid or a fatty acid ester compound thereof, preferably a medium chain fatty acid or a fatty acid ester thereof, more preferably a fatty acid having 8 to 10 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof, more preferably a carbon atom number.
  • 8 or 10 fatty acid or a fatty acid ester compound thereof more preferably a saturated fatty acid having 8 or 10 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof, more preferably a saturated fatty acid having 8 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof,
  • ⁇ 21> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 20>, wherein the microorganism is a microorganism selected from Escherichia coli, Bacillus subtilis, red yeast, or Mortierella sp.
  • ⁇ 22> A transformant that promotes the expression of the gene encoding the protein (A) or (B) and the gene encoding the protein (C) or (D) in the cells of the microorganism.
  • ⁇ 23> A gene obtained by introducing a gene encoding the protein (A) or (B), a gene encoding the protein (C) or (D), or a recombinant vector containing the gene into a microorganism. Convertible.
  • ⁇ 24> A transformant for introducing a gene encoding the protein (A) or (B), a gene encoding the protein (C) or (D), or a recombinant vector containing the gene into a microorganism. Manufacturing method.
  • ⁇ 25> The transformant according to any one of ⁇ 22> to ⁇ 24> or the production thereof, wherein the protein (B) is a protein defined in any one of the above ⁇ 8> to ⁇ 11> Method.
  • ⁇ 26> The transformant according to any one of ⁇ 22> to ⁇ 25> or the method for producing the same, wherein the protein (D) is a protein defined in ⁇ 12>.
  • the gene encoding the protein (A) or (B) and the gene encoding the protein (C) or (D) are the DNA (a) or (b) and the DNA (c) or
  • the transformant according to any one of ⁇ 22> to ⁇ 26> which is a gene comprising (d), or a method for producing the transformant.
  • ⁇ 28> The transformant according to ⁇ 27> or the method for producing the same, wherein the DNA (b) is the DNA defined in any one of ⁇ 14> to ⁇ 17>.
  • ⁇ 29> The transformant according to ⁇ 27> or the method for producing the same, wherein the DNA (d) is the DNA defined in ⁇ 8>.
  • ⁇ 30> The transformant according to any one of ⁇ 22> to ⁇ 29> or the production thereof, wherein the microorganism is a microorganism selected from Escherichia coli, Bacillus subtilis, red yeast, or Mortierella sp. Method.
  • the lipid is a fatty acid or a fatty acid ester compound thereof, preferably a medium chain fatty acid or a fatty acid ester thereof, more preferably a fatty acid having 8 to 10 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof, more preferably a carbon atom number.
  • Example 1 Manufacture of lipids using Escherichia coli introduced with CpTE gene and EcACS gene (1) Construction of CpTE gene expression plasmid Primer pBS described in Table 1 using pBS-SK (-) plasmid (manufactured by Agilent Technologies) as a template. PCR was performed using -F (SEQ ID NO: 5) and primer pBS-R (SEQ ID NO: 6) to amplify the pBS-SK (-) linear DNA sequence. Furthermore, a TE gene (GenBank: U38188.1) derived from Quttle Pulse Tris was artificially synthesized.
  • PCR was performed using primer pBS / CpTE-F (SEQ ID NO: 7) and primer CpTE / pBS-R (SEQ ID NO: 8) described in Table 1, and it was estimated as a chloroplast migration signal.
  • the pBS-SK (-) linear DNA sequence and the CpTE gene DNA fragment were mixed, cloned by the In-Fusion (registered trademark) PCR cloning method (Clontech), and the lacO of the pBS-SK (-) plasmid.
  • a pBS-CpTE plasmid CpTE gene expression plasmid in which the CpTE gene was inserted downstream of the promoter was obtained.
  • the pBS-CpTE linear DNA sequence and the EcACS gene DNA fragment are mixed, cloned by the In-Fusion (registered trademark) PCR cloning method (Clontech), and the CpTE gene downstream of the lacO promoter of the pBS-SK (-) plasmid.
  • the pBS-CpTE-ACS plasmid (CpTE-EcACS gene expression plasmid) into which the EcACS gene was inserted was obtained.
  • E. coli mutant K27 strain (fadD88) (Eur. J. Biochem., 1969, vol. 7, p. 559-574) was transformed by the competent cell transformation method.
  • the transformed K27 strain is allowed to stand at 30 ° C. overnight, and the obtained colonies are inoculated into 1 mL of LBAmp liquid medium (Bacto Trypton 1%, Yeast Extract 0.5%, NaCl 1%, ampicillin sodium 50 ⁇ g / mL). And cultured at 30 ° C. overnight.
  • Nitrogen gas was blown onto the obtained hexane layer to dry it, 1 mL of 14% boron trifluoride solution (manufactured by SIGMA) was added, and the temperature was kept constant at 80 ° C. for 30 minutes. Thereafter, 1 mL each of hexane and saturated saline was added and stirred vigorously. After standing for 30 minutes at room temperature, the upper hexane layer was recovered to obtain a fatty acid ester.
  • 14% boron trifluoride solution manufactured by SIGMA
  • the obtained fatty acid ester was subjected to gas chromatography analysis.
  • the gas chromatography was analyzed using 7890A (Agilent Technologies) under the following conditions.
  • (Analysis conditions) Capillary column: DB-1 MS (30m ⁇ 200 ⁇ m ⁇ 0.25 ⁇ m, manufactured by J & W Scientific)
  • Mobile phase High-purity helium column flow rate: 1.0 mL / min
  • Heating program 70 ° C hold for 1 minute ⁇ 70 to 200 ° C (20 ° C / minute temperature increase) ⁇ 200 to 320 ° C (50 ° C / minute temperature increase) ⁇ 320 ° C 5 minutes
  • equilibration time 1 minute
  • Inlet Split injection (split ratio: 100: 1) Pressure 14.49 psi, 104 mL / min
  • Injection volume 1 ⁇ L Washing vial: Methanol / chloroform Detector temperature: 300 ° C
  • the fatty acid ester was identified by subjecting the sample to gas chromatograph mass spectrometry analysis under the same conditions.
  • the amount of methyl ester of each fatty acid was quantified from the peak area of the waveform data obtained by gas chromatography analysis.
  • Each peak area was compared with the peak area of 7-pentadecanone, which is an internal standard, to correct between samples, and the amount of each fatty acid contained per liter of culture and the total amount thereof were calculated.
  • Table 2 is an average value of the result of three independent cultures and chromatographic analyses.
  • C8 0 fatty acids
  • C10 is the sum of C10: 0 and C10: 1 fatty acids
  • C12 is the sum of C12: 0 and C12: 1 fatty acids
  • C14 is the sum of C14: 0 and C14: 1 fatty acids
  • C16 represents the sum of C16: 0, C16: 1, C16: 2 and C16: 3 fatty acids
  • C18 represents the sum of C18: 0, C18: 1, C18: 2 and C18: 3 fatty acids, respectively.
  • total fatty acid production total amount of fatty acids produced means the total of these fatty acids.
  • the C8 fatty acid production amount and the amount of C8 fatty acid produced are produced in the transformant introduced with the CpTE gene and the EcACS gene, compared with the amount of C8 fatty acid produced in the transformant introduced with only the CpTE gene.
  • the total amount of fatty acids has greatly improved. Specifically, in the amount of C8 fatty acid produced, the amount of C8 fatty acid is improved by 1.26 times in the transformant introduced with the CpTE gene and the EcACS gene, compared with the case where only the CpTE gene is introduced. Increased by 1.27 times.

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Abstract

下記タンパク質（Ａ）若しくは（Ｂ）をコードする遺伝子、並びに下記タンパク質（Ｃ）若しくは（Ｄ）をコードする遺伝子を、微生物の細胞内に導入した形質転換体を培養し、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法。 （Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。 （Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。 （Ｃ）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。 （Ｄ）配列番号４で示されるアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアセチル-ＣｏＡシンテターゼ活性を有するタンパク質。

Description

脂質の製造方法
　本発明は、脂質の製造方法に関する。また本発明は、当該方法に用いる形質転換体に関する。
　脂肪酸は脂質の主要構成成分の１つであり、生体内においてグリセリンとのエステル結合により生成するトリアシルグリセロール等の脂質（油脂）を構成する。また、多くの動植物において脂肪酸はエネルギー源として貯蔵され利用される物質でもある。動植物内に蓄えられた脂肪酸や脂質は、食用又は工業用として広く利用されている。
　例えば、炭素原子数１２～１８前後の高級脂肪酸を還元して得られる高級アルコールの誘導体は、界面活性剤として用いられている。アルキル硫酸エステル塩やアルキルベンゼンスルホン酸塩等は陰イオン性界面活性剤として利用されている。また、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルやアルキルポリグリコシド等は非イオン性界面活性剤として利用されている。そしてこれらの界面活性剤は、いずれも洗浄剤や殺菌剤等に利用されている。同じ高級アルコールの誘導体であるアルキルアミン塩やモノ又はジアルキル４級アンモニウム塩等のカチオン性界面活性剤は、繊維処理剤、毛髪リンス剤、殺菌剤等に日常的に利用されている。また、ベンザルコニウム型４級アンモニウム塩は殺菌剤や防腐剤等に日常的に利用されている。さらに、植物油脂はバイオディーゼル燃料の原料としても利用されている。
　また、炭素原子数が８や１０の中鎖脂肪酸は、健康食品への利用や、エッチング剤に利用されている。また炭素原子数が８や１０の中鎖脂肪酸を還元して得られるアルコール誘導体は、化粧品や、界面活性剤、可塑剤などの工業用原料としても利用されている。
　このように脂肪酸や脂質の利用は多岐にわたる。そのため、植物等において生体内での脂肪酸や脂質の生産性を向上させる試みが行われている。さらに、脂肪酸の用途や有用性はその炭素原子数に依存するため、脂肪酸の炭素原子数、即ち鎖長を制御する試みも行われている。さらに、太陽光やバイオマスなどの再生可能エネルギー源を利用し、大腸菌（Escherichia coli）などの微生物を培養することで脂肪酸を含むバイオケミカルスを生産する方法も注目されている。
　例えば、クフェア・パルストリス（Cuphea palustris）やクフェア・フッケリアナ（Cuphea hookeriana）などのクフェア（Cuphea）属に属する植物由来のアシル-ACP（アシルキャリアプロテイン）チオエステラーゼ（以下単に、「TE」ともいう）やその改変体をコードする遺伝子を宿主に導入することにより、得られた形質転換体における炭素原子数が８又は１０の中鎖脂肪酸の生産性が向上することが知られている（特許文献１及び２参照）。
米国特許第５，９５５，３２９号明細書 米国特許出願公開第２０１１／００２０８８３号明細書
　本発明は、下記タンパク質（Ａ）若しくは（Ｂ）をコードする遺伝子、並びに下記タンパク質（Ｃ）若しくは（Ｄ）をコードする遺伝子を、微生物の細胞に導入した形質転換体を培養し、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法に関する。
 
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアシル-ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｄ）配列番号４で示されるアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアセチル－ＣｏＡシンテターゼ活性を有するタンパク質。
　また本発明は、前記タンパク質（Ａ）若しくは（Ｂ）をコードする遺伝子、並びに前記タンパク質（Ｃ）若しくは（Ｄ）をコードする遺伝子の発現を微生物の細胞内で促進させた形質転換体に関する。
発明の詳細な説明
　本発明は、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質の製造方法に関する。
　また本発明は、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させ、前記方法に好適に用いることができる形質転換体に関する。
　特許文献１及び２などでも報告されているように、クフェア属に属する植物由来のTEをコードする遺伝子を導入した大腸菌やシアノバクテリアなどの形質転換体を用いた中鎖脂肪酸の生産においても、脂肪酸の生産量の向上が試みられている。
　そこで本発明者は、クフェア属に属する植物由来のTEをコードする遺伝子を導入して作製した微生物に対して、中鎖脂肪酸の生産性をより向上させるために、脂肪酸合成の出発物質であるアセチルＣｏＡに着目した。脂肪酸合成の初期反応では、アセチル-ＣｏＡカルボキシラーゼにより、脂肪酸合成の出発物質であるアセチルＣｏＡから、マロニルＣｏＡが生成される。その後、マロニルＣｏＡはマロニルＣｏＡ：ＡＣＰトランスアシラーゼによってマロニルＡＣＰとなり、さらにアセチルＣｏＡと共に脂肪酸鎖伸長経路へと取り込まれてアセトアセチルＡＣＰが生成される。アセトアセチルＡＣＰはその後、脂肪酸鎖伸長経路において伸長反応を繰り返すことで、様々な鎖長の脂肪酸が合成される。一方で、アセチルＣｏＡは脂肪酸合成に消費されると同時に、別の経路によって酢酸へと代謝される。そこで本発明者らは、アセチルＣｏＡから酢酸へと代謝される、脂肪酸合成に対する競合経路を残したまま、酢酸を再びアセチルＣｏＡに変換（合成）して脂肪酸合成に利用することについて検討を重ねた。その結果、本発明者らは、酢酸からアセチルＣｏＡを合成する酵素をコードする遺伝子の発現を促進させた宿主に、クフェア属に属する植物由来のTEをコードする遺伝子を導入することで、中鎖脂肪酸の生産性がより向上することを見出した。
　本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
　本発明の脂質の製造方法によれば、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させることができる。
　また本発明の形質転換体は、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性に優れる。
　本発明の上記および他の特徴および利点は、下記の記載からより明らかになるであろう。
　本明細書における「脂質」は、中性脂質（モノアシルグリセロール（ＭＡＧ）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）等）、ろう、セラミド等の単純脂質；リン脂質、糖脂質、スルホ脂質等の複合脂質；及びこれらの脂質から誘導される、脂肪酸（遊離脂肪酸）、アルコール類、炭化水素類等の誘導脂質を包含するものである。
　一般に誘導脂質に分類される脂肪酸は、脂肪酸そのものを指し、「遊離脂肪酸」を意味する。本発明では単純脂質及び複合脂質分子中の脂肪酸部分又はアシル基の部分を「脂肪酸残基」と表記する。そして、特に断りのない限り、「脂肪酸」は「遊離脂肪酸」と「脂肪酸残基」の総称として用いる。
　また本明細書において、「脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質」は、「遊離脂肪酸」と「当該脂肪酸残基を有する脂質」を総称して用いる。更に本明細書において、「脂肪酸組成」とは、前記遊離脂肪酸と脂肪酸残基を脂肪酸と見做して合計した全脂肪酸（総脂肪酸）の重量に対する各脂肪酸の重量割合を意味する。脂肪酸の重量（生産量）や脂肪酸組成は、実施例で用いた方法により測定できる。
　また本明細書において、脂肪酸や、脂肪酸を構成するアシル基の表記において「Cx:y」とあるのは、炭素原子数がｘであり二重結合の数がｙであることを表す。「Cx」は炭素原子数ｘの脂肪酸やアシル基を表す。
　さらに本明細書において、塩基配列及びアミノ酸配列の同一性は、Lipman-Pearson法（Science，1985，vol．227，p．1435-1441）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Winのホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit　size　to　compare（ktup）を2として解析を行うことにより算出される。
　また本明細書において「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook, David W. Russell., Cold Spring Harbor Laboratory Press］記載の方法が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８～１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
　さらに本明細書において、遺伝子の「上流」とは、翻訳開始点からの位置ではなく、対象として捉えている遺伝子又は領域の5'側に続く領域を示す。一方、遺伝子の「下流」とは、対象として捉えている遺伝子又は領域の3'側に続く領域を示す。
　なお、本明細書において「中鎖」とは、アシル基の炭素原子数が８以上１０以下、好ましくは炭素原子数が８又は１０、さらに好ましくは炭素原子数が８であることをいう。また、形質転換体の脂肪酸及び脂質の生産性については、実施例で用いた方法により測定することができる。
　TEは、脂肪酸やその誘導体（トリアシルグリセロール（トリグリセリド）等）の生合成系に関与する酵素である。当該酵素は、植物体や藻類では葉緑体等の色素体内において、細菌や真菌、動物体では細胞質内において、脂肪酸生合成過程の中間体であるアシル-ＡＣＰ（脂肪酸残基であるアシル基とアシルキャリアプロテインとからなる複合体）のチオエステル結合を加水分解し、遊離の脂肪酸を生成する。TEの作用によって、ＡＣＰ上での脂肪酸合成が終了し、切り出された脂肪酸はトリアシルグリセロール等の合成に供される。TEには、基質であるアシル-ＡＣＰを構成するアシル基（脂肪酸残基）の炭素原子数や不飽和結合数によって異なる反応特異性を示す複数のTEが存在していることが知られており、生体内での脂肪酸組成を決める重要なファクターであると考えられている。
　本明細書において、アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性（以下、「TE活性」ともいう）とは、アシル－ＡＣＰのチオエステル結合を加水分解する活性をいう。
　本発明では、TEとして前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）を用いる。
　配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる前記タンパク質（Ａ）は、配列番号１３で示されるアミノ酸配列からなるクフェア・パルストリス由来の野生型のTEのアミノ酸配列の一部である。配列番号２で示されるアミノ酸配列では、野生型のTEのアミノ酸配列の全長から、シグナル配列（配列番号１３の２位～５７位のアミノ酸配列）と推定される部位が除かれている。すなわち配列番号２で示されるアミノ酸配列は、配列番号１３で示されるアミノ酸配列から１位～５７位のアミノ酸が除かれ、５８位のアミノ酸のＮ末端にタンパク質合成開始アミノ酸（メチオニン）が付加されている。クフェア・パルストリス由来の野生型のTEのアミノ酸配列中５８位～４１１位の領域が、TEとして機能するために重要で、TE活性を示すために十分な領域であることが知られている。すなわち、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、TE活性にとって十分な領域を有するため、TE活性を有し、TEとして機能する。クフェア属に属する植物由来のTEは、炭素原子数が８又は１０の中鎖アシル-ACPに対する基質特異性が高く、形質転換体における炭素原子数が８又は１０の中鎖脂肪酸の生産性の向上に好適に用いられる。
　以下、前記タンパク質（Ａ）を、「CpTE」ともいう。
　タンパク質（Ｂ）は、配列番号２で示されるアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、TE活性を有するタンパク質である。一般に、酵素タンパク質をコードしているアミノ酸配列は、必ずしも全領域の配列が保存されていなければ酵素活性を示さないというものではなく、アミノ酸配列が変化しても酵素活性に影響を与えない領域も存在することが知られている。このような酵素活性に必須でない領域においては、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加といった変異が導入されても酵素本来の活性を維持することができる。本発明においても、このようにTE活性が保持され、かつアミノ酸配列が一部変異したタンパク質を用いることができる。
　前記タンパク質（Ｂ）において、TE活性の点から、配列番号２で示されるアミノ酸配列との同一性は６０％以上であり、６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９６％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がより好ましい。
　また、前記タンパク質（Ｂ）として、配列番号２で示されるアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上１４２個以下、好ましくは１個以上１２４個以下、より好ましくは１個以上１０６個以下、より好ましくは１個以上８８個以下、より好ましくは１個以上７１個以下、より好ましくは１個以上５３個以下、より好ましくは１個以上３５個以下、より好ましくは１個以上２４個以下、より好ましくは１個以上１７個以下、より好ましくは１個以上１４個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上７個以下、より好ましくは１個以上３個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加し、かつTE活性を有するタンパク質が挙げられる。
　本発明で好適に用いられるタンパク質（Ｂ）の具体例としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列中の特定の位置のアミノ酸が置換されたタンパク質（以下、「CpTE改変体」ともいう）、及び該アミノ酸置換を含むタンパク質が挙げられる。CpTE改変体では、前記タンパク質（Ａ）と比べて、中鎖アシル-ＡＣＰに対する特異性が向上する。すなわちCpTE改変体は、野生型のCpTEと比較して、基質として中鎖アシル－ＡＣＰを選択的に利用し、これを加水分解する活性が向上する。
　中鎖アシル－ＡＣＰへの特異性を向上させ、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる観点から、タンパク質（Ｂ）のアミノ酸配列は、下記（Ｂ－１）～（Ｂ－１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有することが好ましい。
 
（Ｂ－１）配列番号２の２５７位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がイソロイシンに置換。
（Ｂ－２）配列番号２の２５１位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、スレオニン）がアルギニンに置換。
（Ｂ－３）配列番号２の２５１位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、スレオニン）がリジンに置換。
（Ｂ－４）配列番号２の２５１位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、スレオニン）がヒスチジンに置換。
（Ｂ－５）配列番号２の２５４位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、トリプトファン）がイソロイシンに置換。
（Ｂ－６）配列番号２の２５４位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、トリプトファン）がチロシンに置換。
（Ｂ－７）配列番号２の２５７位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がメチオニンに置換。
（Ｂ－８）配列番号２の２５７位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がバリンに置換。
（Ｂ－９）配列番号２の２５７位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がフェニルアラニンに置換。
（Ｂ－１０）配列番号２の２６６位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がシステインに置換。
（Ｂ－１１）配列番号２の２７１位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、トリプトファン）がチロシンに置換。
　アミノ酸配列または塩基配列における「相当する位置」は、目的アミノ酸配列を参照配列と比較し、各アミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の相同性を与えるように配列を整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、上述のLipman-Pearson法等に基づいて手作業で行うこともできるが、Clustal Wマルチプルアラインメントプログラム（Nucleic Acids Res., 1994, vol. 22, p. 4673-4680）をデフォルト設定で用いることにより行うことができる。Clustal Wは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（European Bioinformatics Institute:EBI, [www.ebi.ac.uk/index.html]）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（DDBJ, [www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html]）のウェブサイト上で利用することができる。
　前記タンパク質（Ｂ）は、前記（Ｂ－１）～（Ｂ－１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換に加えて、下記（Ｂ－１２）～（Ｂ－１９）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有することが好ましい。これらのアミノ酸置換を有する場合、中鎖アシル－ＡＣＰへの特異性と、中鎖脂肪酸若しくはこれを構成成分とする脂質の生産性が、一層向上する。
 
（Ｂ－１２）配列番号２の１０６位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がイソロイシンに置換。
（Ｂ－１３）配列番号２の１０８位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、アスパラギン）がリジンに置換。
（Ｂ－１４）配列番号２の１０８位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、アスパラギン）がアルギニンに置換。
（Ｂ－１５）配列番号２の１１０位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がイソロイシンに置換。
（Ｂ－１６）配列番号２の１１０位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がメチオニンに置換。
（Ｂ－１７）配列番号２の１１０位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がロイシンに置換。
（Ｂ－１８）配列番号２の１１０位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がフェニルアラニンに置換。
（Ｂ－１９）配列番号２の１１８位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、システイン）がイソロイシンに置換。
　本発明において、前記タンパク質（Ｂ）は、（Ｂ－１）のアミノ酸置換、並びに前記（Ｂ－１２）～（Ｂ－１９）からなる群より選ばれる１つのアミノ酸置換を有することがより好ましい。すなわち、本発明において前記タンパク質（Ｂ）は、下記（Ｂ－１＿Ｂ－１２）～（Ｂ－１＿Ｂ－１９）からなる群より選ばれるアミノ酸置換を有することがより好ましい。
 
（Ｂ－１＿Ｂ－１２）配列番号２の２５７位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がイソロイシンに、１０６位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がイソロイシンに、それぞれ置換。
（Ｂ－１＿Ｂ－１３）配列番号２の２５７位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がイソロイシンに、１０８位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、アスパラギン）がリジンに置換。
（Ｂ－１＿Ｂ－１４）配列番号２の２５７位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がイソロイシンに、１０８位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、アスパラギン）がアルギニンに、それぞれ置換。
（Ｂ－１＿Ｂ－１５）配列番号２の２５７位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がイソロイシンに、１１０位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がイソロイシンに、それぞれ置換。
（Ｂ－１＿Ｂ－１６）配列番号２の２５７位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がイソロイシンに、１１０位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がメチオニンに、それぞれ置換。
（Ｂ－１＿Ｂ－１７）配列番号２の２５７位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がイソロイシンに、１１０位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がロイシンに、それぞれ置換。
（Ｂ－１＿Ｂ－１８）配列番号２の２５７位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がイソロイシンに、１１０位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がフェニルアラニンに、それぞれ置換。
（Ｂ－１＿Ｂ－１９）配列番号２の２５７位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がイソロイシンに、１１８位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、システイン）がイソロイシンに、それぞれ置換。
　また、本発明で使用するTEとして、そのアミノ酸配列の一部として前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列を含んでおり、かつTE活性を示すタンパク質も好適に使用される。なお、該タンパク質のＮ末端のアミノ酸は、開始コドンでコードされるメチオニン又はロイシンであることが好ましい。
　該タンパク質を構成するアミノ酸配列中、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列以外の配列としては、本発明の効果を損なわない範囲で適宜選択することができる。例えば、配列番号１３の１位～５７位の任意の位置範囲からなるアミノ酸配列、又はこのアミノ配列に１個又は数個（好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個以上３個以下）の変異が導入されたアミノ酸配列、等が挙げられる。変異としては、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加が挙げられる。これらの配列は、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列のＮ末側に付加されることが好ましい。
　あるいは、本発明で使用するTEとして、配列番号１３に示すアミノ酸配列において、配列番号１３のアミノ酸配列２位～５７位の任意の位置でＮ末側が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。また、本発明で使用するTEとして、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列に、タンパク質の輸送や分泌に関与するシグナルペプチドが付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質も好ましい。
　前記タンパク質がTE活性を有することは、例えば、大腸菌等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡを脂肪酸分解系が欠損した宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件で培養して、宿主細胞又は培養液中の脂肪酸組成の変化をガスクロマトグラフィー解析等の方法を用いて分析することにより、確認することができる。この時、総脂肪酸量に占める中鎖脂肪酸の割合を、野生型TEを発現させた系と比較することで、中鎖アシル-ACPに対する特異性が向上していることを確認できる。
　また、大腸菌等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡを宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件で細胞を培養した後、細胞の破砕液に対し、Yuanらの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1995, vol. 92(23), p. 10639-10643）によって調製した各種アシル－ＡＣＰを基質とした反応を行うことにより、TE活性を測定することができる。
　アミノ酸配列に変異を導入する方法としては、例えば、アミノ酸配列をコードする塩基配列に変異を導入する方法が挙げられる。変異を導入する方法としては、部位特異的な変異導入法が挙げられる。具体的な部位特異的変異の導入方法としては、SOE-PCRを利用した方法、ＯＤＡ法、Kunkel法等が挙げられる。また、Site-Directed Mutagenesis System Mutan-SuperExpress Kmキット（タカラバイオ社）、Transformer TM Site-Directed Mutagenesisキット（Clontech社）、KOD-Plus-Mutagenesis Kit（東洋紡社）等の市販のキットを利用することもできる。また、ランダムな遺伝子変異を与えた後、適当な方法により活性の評価及び遺伝子解析を行うことにより目的遺伝子を取得することもできる。
　前記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）は、通常の化学的手法、遺伝子工学的手法等により得ることができる。例えば、クフェア・パルストリスから単離、精製等することで天然物由来のタンパク質を取得することができる。また、配列番号２に示すアミノ酸配列情報をもとに人工的に化学合成することで、前記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）を得ることができる。あるいは、遺伝子組み換え技術により、組換えタンパク質として前記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）を作製してもよい。組換えタンパク質を作製する場合には、後述するTE遺伝子を用いることができる。
　なお、クフェア・パルストリス等の植物は、私的又は公的な研究所等の保存機関より入手することができる。
　前記タンパク質（Ａ）及び（Ｂ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子（以下、「TE遺伝子」ともいう）として、下記ＤＮＡ（ａ）及び（ｂ）のいずれか１つからなる遺伝子が挙げられる。ここで、下記に示す配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡは、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（クフェア・パルストリス由来の野生型TEの一部からなるタンパク質）をコードする。なお、前述のシグナル配列（配列番号１３の１位～５７位のアミノ酸配列）をコードする塩基配列は、配列番号１２の１～１７１位からなる塩基配列に相当する。以下、前記ＤＮＡ（ａ）からなる遺伝子を、「CpTE遺伝子」ともいう。
 
（ａ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１で示される塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつTE活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
　前記ＤＮＡ（ｂ）において、TE活性の点から、配列番号１で示される塩基配列との同一性は６０％以上であり、６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９６％以上がより好ましく、９７％以上が好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がより好ましい。
　また前記ＤＮＡ（ｂ）として、配列番号１で示される塩基配列において１又は複数個（例えば１個以上４２７個以下、好ましくは１個以上３７３個以下、より好ましくは１個以上３２０個以下、より好ましくは１個以上２６７個以下、より好ましくは１個以上２１３個以下、より好ましくは１個以上１６０個以下、より好ましくは１個以上１０６個以下、より好ましくは１個以上７４個以下、より好ましくは１個以上５３個以下、より好ましくは１個以上４２個以下、より好ましくは１個以上３２個以下、より好ましくは１個以上２１個以下、より好ましくは１個以上１０個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつTE活性を有する前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードするＤＮＡも好ましい。
　さらに前記ＤＮＡ（ｂ）として、前記ＤＮＡ（ａ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつTE活性を有する前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードするＤＮＡも好ましい。
　本発明で好適に用いられるＤＮＡ（ｂ）の具体例として、タンパク質（Ｂ）のアミノ酸をコードするＤＮＡの塩基配列の特定の位置の塩基が置換されたＤＮＡ、及び、該塩基置換を含むＤＮＡが挙げられる。
　前記ＤＮＡ（ｂ）は、下記（ｂ－１）～（ｂ－１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基置換を有する塩基配列からなるＤＮＡであることも好ましい。下記（ｂ－１）～（ｂ－１１）は、前記（Ｂ－１）～（Ｂ－１１）のアミノ酸置換に相当する塩基置換である。具体的には、塩基置換（ｂ－１）、（ｂ－２）、（ｂ－３）、（ｂ－４）、（ｂ－５）、（ｂ－６）、（ｂ－７）、（ｂ－８）、（ｂ－９）、（ｂ－１０）及び（ｂ－１１）はそれぞれ、前記アミノ酸置換（Ｂ－１）、（Ｂ－２）、（Ｂ－３）、（Ｂ－４）、（Ｂ－５）、（Ｂ－６）、（Ｂ－７）、（Ｂ－８）、（Ｂ－９）、（Ｂ－１０）及び（Ｂ－１１）に対応する。
 
（ｂ－１）配列番号１の７６９位～７７１位、又はこれらに相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に置換。
（ｂ－２）配列番号１の７５１位～７５３位、又はこれらに相当する位置の塩基がアルギニンをコードする塩基に置換。
（ｂ－３）配列番号１の７５１位～７５３位、又はこれらに相当する位置の塩基がリジンをコードする塩基に置換。
（ｂ－４）配列番号１の７５１位～７５３位、又はこれらに相当する位置の塩基がヒスチジンをコードする塩基に置換。
（ｂ－５）配列番号１の７６０位～７６２位、又はこれらに相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に置換。
（ｂ－６）配列番号１の７６０位～７６２位、又はこれらに相当する位置の塩基がチロシンをコードする塩基に置換。
（ｂ－７）配列番号１の７６９位～７７１位、又はこれらに相当する位置の塩基がメチオニンをコードする塩基に置換。
（ｂ－８）配列番号１の７６９位～７７１位、又はこれらに相当する位置の塩基がバリンをコードする塩基に置換。
（ｂ－９）配列番号１の７６９位～７７１位、又はこれらに相当する位置の塩基がフェニルアラニンをコードする塩基に置換。
（ｂ－１０）配列番号１の７９６位～７９８位、又はこれらに相当する位置の塩基がシステインをコードする塩基に置換。
（ｂ－１１）配列番号１の８１１位～８１３位、又はこれらに相当する位置の塩基がチロシンをコードする塩基に置換。
　前記ＤＮＡ（ｂ）は、（ｂ－１）～（ｂ－１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基置換に加えて、下記（ｂ－１２）～（ｂ－１９）からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基置換を有することが好ましい。下記（ｂ－１２）～（ｂ－１９）は、前記（Ｂ－１２）～（Ｂ－１９）のアミノ酸置換に相当する塩基置換である。具体的には、塩基置換（ｂ－１２）、（ｂ－１３）、（ｂ－１４）、（ｂ－１５）、（ｂ－１６）、（ｂ－１７）、（ｂ－１８）及び（ｂ－１９）はそれぞれ、前記アミノ酸置換（Ｂ－１２）、（Ｂ－１３）、（Ｂ－１４）、（Ｂ－１５）、（Ｂ－１６）、（Ｂ－１７）、（Ｂ－１８）及び（Ｂ－１９）に対応する。
 
（ｂ－１２）配列番号１の３１６位～３１８位、又はこれらに相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に置換。
（ｂ－１３）配列番号１の３２２位～３２４位、又はこれらに相当する位置の塩基がリジンをコードする塩基に置換。
（ｂ－１４）配列番号１の３２２位～３２４位、又はこれらに相当する位置の塩基がアルギニンをコードする塩基に置換。
（ｂ－１５）配列番号１の３２８位～３３０位、又はこれらに相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に置換。
（ｂ－１６）配列番号１の３２８位～３３０位、又はこれらに相当する位置の塩基がメチオニンをコードする塩基に置換。
（ｂ－１７）配列番号１の３２８位～３３０位、又はこれらに相当する位置の塩基がロイシンをコードする塩基に置換。
（ｂ－１８）配列番号１の３２８位～３３０位、又はこれらに相当する位置の塩基がフェニルアラニンをコードする塩基に置換。
（ｂ－１９）配列番号１の３５２位～３５４位、又はこれらに相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に置換。
　本発明において前記ＤＮＡ（ｂ）は、前記（ｂ－１）の塩基置換、並びに前記（ｂ－１２）～（ｂ－１９）からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基置換、を有することがより好ましい。すなわち、本発明において前記ＤＮＡ（ｂ）は、下記（ｂ－１＿ｂ－１２）～（ｂ－１＿ｂ－１９）からなる群より選ばれる塩基置換を有することがより好ましい。
 
（ｂ－１＿ｂ－１２）配列番号１の７６９位～７７１位、又はこれらに相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、３１６位～３１８位、又はこれらに相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ｂ－１＿ｂ－１３）配列番号１の７６９位～７７１位、又はこれらに相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、３２２位～３２４位、又はこれらに相当する位置の塩基がリジンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ｂ－１＿ｂ－１４）配列番号１の７６９位～７７１位、又はこれらに相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、３２２位～３２４位、又はこれらに相当する位置の塩基がアルギニンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ｂ－１＿ｂ－１５）配列番号１の７６９位～７７１位、又はこれらに相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、３２８位～３３０位、又はこれらに相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ｂ－１＿ｂ－１６）配列番号１の７６９位～７７１位、又はこれらに相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、３２８位～３３０位、又はこれらに相当する位置の塩基がメチオニンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ｂ－１＿ｂ－１７）配列番号１の７６９位～７７１位、又はこれらに相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、３２８位～３３０位、又はこれらに相当する位置の塩基がロイシンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ｂ－１＿ｂ－１８）配列番号１の７６９位～７７１位、又はこれらに相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、３２８位～３３０位、又はこれらに相当する位置の塩基がフェニルアラニンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ｂ－１＿ｂ－１９）配列番号１の７６９位～７７１位、又はこれらに相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、３５２位～３５４位、又はこれらに相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、それぞれ置換。
　塩基配列に欠失、置換、挿入、付加等の変異を導入する方法としては、例えば、部位特異的な変異導入法が挙げられる。具体的な部位特異的変異の導入方法としては、Splicing　overlap　extension（SOE）PCR（Gene, 1989, vol. 77, p. 61-68）を利用した方法、ＯＤＡ法（Gene，1995，152，271-276）、Kunkel法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, vol. 82, p. 488）等が挙げられる。また、Site-Directed Mutagenesis System Mutan-SuperExpress Kmキット（タカラバイオ社）、Transformer TM Site-Directed Mutagenesisキット（Clontech社）、KOD-Plus-Mutagenesis Kit（東洋紡社）等の市販のキットを利用することもできる。また、ランダムな遺伝子変異を与えた後、適当な方法により酵素活性の評価及び遺伝子解析を行うことにより目的遺伝子を取得することもできる。
　CpTE改変体をコードする遺伝子（以下、「CpTE改変体遺伝子」ともいう）は、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列又は配列番号１に示す塩基配列に基づいてCpTE改変体遺伝子を、人工的に合成できる。CpTE改変体遺伝子の合成は、例えば、インビトロジェン社等のサービスを利用することができる。また、クフェア・パルストリスからクローニングによって取得することもできる。例えば、Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook, David W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press（2001）］記載の方法等により行うことができる。
　アセチル－ＣｏＡシンテターゼ（以下、「ACS」ともいう）は、アセチル－ＣｏＡシンテターゼ活性（以下、「ACS活性」ともいう）を有するタンパク質（酵素）である。ACSは、ＣｏＡと酢酸からアセチル－ＣｏＡを生成する反応を触媒する。なお、本明細書においてACS活性とは、ＣｏＡと酢酸のチオエステル化反応を触媒する活性をいう。
　本発明では、ACSとして前記タンパク質（Ｃ）又は（Ｄ）を用いる。
　配列番号４で示されるアミノ酸配列からなる前記タンパク質（Ｃ）は、大腸菌由来のACSである。
　以下、前記タンパク質（Ｃ）を、「EcACS」ともいう。
　タンパク質（Ｄ）は、配列番号４で示されるアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつACS活性を有するタンパク質である。
　前記タンパク質（Ｄ）において、ACS活性の点から、配列番号４で示されるアミノ酸配列との同一性は６０％以上であり、６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９６％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がより好ましい。
　また、前記タンパク質（Ｄ）として、配列番号４で示されるアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上２６０個以下、好ましくは１個以上２２８個以下、より好ましくは１個以上１９５個以下、より好ましくは１個以上１６３個以下、より好ましくは１個以上１３０個以下、より好ましくは１個以上９７個以下、より好ましくは１個以上６５個以下、より好ましくは１個以上４５個以下、より好ましくは１個以上３２個以下、より好ましくは１個以上２６個以下、より好ましくは１個以上１９個以下、より好ましくは１個以上１３個以下、より好ましくは１個以上６個以下）のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加し、かつACS活性を有するタンパク質が挙げられる。
　また、本発明で用いるACSは、前記タンパク質（Ｃ）又は（Ｄ）のアミノ酸配列にタンパク質の輸送や分泌に関与するシグナルペプチド、又はタンパク質の安定性を高める既知のアミノ酸配列等が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。
　前記タンパク質がACS活性を有することは、例えば、大腸菌等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子を連結したＤＮＡを脂肪酸分解系が欠損した宿主細胞へ導入し、導入した遺伝子が発現する条件で培養して、宿主細胞又は培養液中の酢酸含有量又はアセチルＣｏＡの含有量の変化をガスクロマトグラフィー解析等の方法を用いて分析することにより、確認することができる。
　前記タンパク質（Ｃ）及び（Ｄ）は、通常の化学的手法、遺伝子工学的手法等により得ることができる。例えば、大腸菌から単離、精製等することで天然物由来のタンパク質を取得することができる。また、配列番号４に示すアミノ酸配列情報をもとに人工的に化学合成することで、前記タンパク質（Ｃ）及び（Ｄ）を得ることができる。あるいは、遺伝子組み換え技術により、組換えタンパク質として前記タンパク質（Ｃ）及び（Ｄ）を作製してもよい。組換えタンパク質を作製する場合には、後述するACS遺伝子を用いることができる。
　なお、大腸菌等の微生物は、私的又は公的な研究所等の保存機関より入手することができる。
　前記タンパク質（Ｃ）及び（Ｄ）のいずれか１つをコードする遺伝子（以下、「ACS遺伝子」ともいう）の具体例として、下記ＤＮＡ（ｃ）及び（ｄ）のいずれか１つからなる遺伝子が挙げられる。ここで、下記に示す配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡは、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（EcACS）をコードする。以下、前記ＤＮＡ（ｃ）からなる遺伝子を、「EcACS遺伝子」ともいう。
 
（ｃ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｄ）配列番号３で表される塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつACS活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
　前記ＤＮＡ（ｄ）において、ACS活性の点から、配列番号３で示される塩基配列との同一性は６０％以上であり、６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９６％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がより好ましい。
　また前記ＤＮＡ（ｄ）として、配列番号３で示される塩基配列において１又は複数個（例えば１個以上７８３個以下、好ましくは１個以上６８５個以下、より好ましくは１個以上５８７個以下、より好ましくは１個以上４８９個以下、より好ましくは１個以上３９１個以下、より好ましくは１個以上２９３個以下、より好ましくは１個以上１９５個以下、より好ましくは１個以上１３７個以下、より好ましくは１個以上９７個以下、より好ましくは１個以上７８個以下、より好ましくは１個以上５８個以下、より好ましくは１個以上３９個以下、より好ましくは１個以上１９個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつACS活性を有する前記タンパク質（Ｃ）又は（Ｄ）をコードするＤＮＡも好ましい。さらに前記ＤＮＡ（ｄ）として、前記ＤＮＡ（ｃ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつACS活性を有する前記タンパク質（Ｃ）又は（Ｄ）をコードするＤＮＡも好ましい。
　また、本発明で用いるACSをコードするＤＮＡは、前記ＤＮＡ（ｃ）又は（ｄ）の塩基配列にタンパク質の輸送や分泌に関与するシグナルペプチド、又はタンパク質の安定性を高める既知のアミノ酸配列等をコードするＤＮＡが付加された塩基配列からなる遺伝子であってもよい。
　ACSをコードする遺伝子は、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、配列番号４に示すアミノ酸配列又は配列番号３に示す塩基配列に基づいてACS遺伝子を、人工的に合成できる。ACS遺伝子の合成は、例えば、インビトロジェン社等のサービスを利用することができる。また、大腸菌からクローニングによって取得することもできる。例えば、Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook, David W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press（2001）］記載の方法等により行うことができる。
　本発明の形質転換体は、前記タンパク質（Ａ）若しくは（Ｂ）をコードする遺伝子、並びに前記タンパク質（Ｃ）若しくは（Ｄ）をコードする遺伝子が宿主の細胞に導入され、その発現が促進されている。
　前述のように、クフェア属に属する植物由来のTEやその改変体をコードする遺伝子を宿主に導入することにより、得られた形質転換体における炭素原子数が８又は１０の中鎖脂肪酸の生産性が向上することが知られている。このような知見に対して、TE遺伝子とACS遺伝子を宿主に導入して作製した形質転換体は、TE遺伝子のみを宿主に導入して作製した形質転換体と比較して、中鎖脂肪酸と、全脂肪酸の生産性が顕著に向上する。
　よって、本発明の形質転換体を培養することで、形質転換体の細胞内で生産される中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性がより向上する。
　前記タンパク質（Ａ）若しくは（Ｂ）をコードする遺伝子、並びに前記タンパク質（Ｃ）若しくは（Ｄ）をコードする遺伝子を常法により宿主に導入することで、本発明の形質転換体を作製することができる。具体的には、前記TE遺伝子及び前記ACS遺伝子を宿主細胞中で発現させることのできる組換えベクターや遺伝子発現カセットを調製し、これを宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換させることにより作製できる。
　形質転換体の宿主としては通常用いられるものより適宜選択することができる。本発明で用いることができる宿主としては、微生物（微細藻類を含む）が挙げられる。
　前記微生物は原核生物、真核生物のいずれであってもよく、エシェリキア（Escherichia）属の微生物やバシラス（Bacillus）属の微生物、シアノバクテリア（藍色細菌）等の原核生物、又は酵母や糸状菌等の真核微生物を用いることができる。なかでも、脂質生産性の観点から、大腸菌、枯草菌（Bacillus　subtilis）、赤色酵母（Rhodosporidium　toruloides）、又はモルチエレラ・エスピー（Mortierella　sp．）が好ましく、大腸菌がより好ましい。
　遺伝子発現用プラスミド又は遺伝子発現用カセットの母体となるベクター（プラスミド）としては、目的のタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入することができ、宿主細胞内で目的の遺伝子を発現させることができるベクターであればよい。例えば、使用する宿主の種類に応じたプロモーターやターミネーター等の発現調節領域を有するベクターであって、複製開始点や選択マーカー等を有するベクターを用いることができる。また、プラスミド等の染色体外で自立増殖・複製するベクターであってもよいし、染色体内に組み込まれるベクターであってもよい。
　本発明で好ましく用いることができる発現用ベクターとしては、微生物を宿主とする場合には、例えば、pBluescript（pBS） II SK(-)（Stratagene社製）、pSTV系ベクター（タカラバイオ社製）、pUC系ベクター（宝酒造社製）、pET系ベクター（タカラバイオ社製）、pGEX系ベクター（GEヘルスケア社製）、pCold系ベクター（タカラバイオ社製）、pHY300PLK（タカラバイオ社製）、pUB110（1986，Plasmid 15（2），p．93-103）、pBR322（タカラバイオ社製）、pRS403（ストラタジーン社製）、pMW218/219（ニッポンジーン社製）、pRI系ベクター（タカラバイオ社製）、pBI系ベクター（Clontech社製）、及びIN3系ベクター（インプランタイノベーションズ社製）が挙げられる。特に、宿主が大腸菌の場合は、pBluescript II SK(-)、又はpMW218/219が好ましく用いられる。
　このＤＮＡ断片としては、例えば、PCR法により増幅したＤＮＡ断片や制限酵素で切断したＤＮＡ断片が挙げられる。目的のタンパク質をコードする遺伝子の前記ベクターへの導入は、制限酵素処理やライゲーション等の常法により行うことができる。
　前記発現ベクターに組み込んだ目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現を調整するプロモーターの種類も、使用する宿主の種類に応じて適宜選択することができる。本発明で好ましく用いることができるプロモーターとしては、lacプロモーター、trpプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーター、SpoVGプロモーター、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によって誘導可能な誘導体に関するプロモーター、Rubiscoオペロン（rbc）、PSI反応中心タンパク質（psaAB）、PSIIのD1タンパク質（psbA）、カリフラワーモザイルウイルス35SRNAプロモーター、ハウスキーピング遺伝子プロモーター（例えば、チューブリンプロモーター、アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター等）、西洋アブラナ又はアブラナ由来Napin遺伝子プロモーター、植物由来Rubiscoプロモーター、ナンノクロロプシス属由来のビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーター（VCP1プロモーター、VCP2プロモーター）（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, vol. 108(52)）、ナンノクロロプシス属由来のオレオシン様タンパクＬＤＳＰ(lipid droplet surface protein)遺伝子のプロモーター（PLOS Genetics, 2012;8(11):e1003064. doi: 10.1371）、及びリボゾームRNAをコードするrrnAオペロン遺伝子のプロモーターが挙げられる。
　また、目的のタンパク質をコードする遺伝子が組み込まれたことを確認するための選択マーカーの種類も、使用する宿主の種類に応じて適宜選択することができる。本発明で好ましく用いることができる選択マーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子、ビアラフォス耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、パロモマイシン耐性遺伝子、及びハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。さらに、栄養要求性に関連する遺伝子の欠損等を選択マーカー遺伝子として使用することもできる。
　形質転換方法は、使用する宿主の種類に応じて常法より適宜選択することができる。例えば、カルシウムイオンを用いる形質転換方法、一般的なコンピテントセル形質転換方法、プロトプラスト形質転換法、エレクトロポレーション法、LP形質転換方法、アグロバクテリウムを用いた方法、パーティクルガン法等が挙げられる。
　目的遺伝子断片が導入された形質転換体の選択は、選択マーカー等を利用することで行うことができる。例えば、薬剤耐性遺伝子が、形質転換時に目的ＤＮＡ断片とともに宿主細胞中に導入された結果、形質転換体が獲得する薬剤耐性を指標に行うことができる。また、ゲノムを鋳型としたPCR法等によって、目的ＤＮＡ断片の導入を確認することもできる。
　各種宿主に導入するTE遺伝子及びACS遺伝子は、使用する宿主におけるコドン使用頻度にあわせてコドンを至適化されることが好ましい。各種生物が使用するコドンの情報は、Codon Usage Database（www.kazusa.or.jp/codon/）などから入手可能である。
　本発明の形質転換体は、TE遺伝子のみを導入した形質転換体に比べ、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性が有意に向上する。そのため、本発明の形質転換体は、特定の炭素原子数の脂肪酸又は脂質、特に中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、好ましくは炭素原子数８以上１０以下の脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくは炭素原子数８若しくは１０の脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくは炭素原子数８若しくは１０の飽和脂肪酸（カプリル酸、カプリン酸）又はこれを構成成分とする脂質、さらに好ましくは炭素原子数８の飽和脂肪酸（カプリル酸）又はこれを構成成分とする脂質の生産に好適に用いることができる。
　以下、本明細書において、前記タンパク質（Ａ）～（Ｄ）からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子が導入されたものを「形質転換体」ともいう。これに対して、前記タンパク質（Ａ）～（Ｄ）のいずれのタンパク質をコードする遺伝子も導入されていないものを「宿主」又は「野生株」ともいう。
　本発明の形質転換体は、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性が、前記タンパク質（Ａ）若しくは（Ｂ）、並びに前記タンパク質（Ｃ）若しくは（Ｄ）の発現が促進されていない宿主と比較して向上している。したがって、本発明の形質転換体を適切な条件で培養し、次いで得られた培養物から中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を回収すれば、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を効率よく製造することができる。ここで「培養物」とは培養した後の培養液及び形質転換体をいう。
　本発明の形質転換体の培養条件は、宿主に応じて適宜選択することができ、その宿主に対して通常用いられる培養条件を使用できる。例えば、炭素源としてグルコースまたはグリセリンを用いることが好ましい。また脂肪酸の生産効率の点から、培地中に、例えばACSの基質となる酢酸および酢酸塩を添加してもよい。
　大腸菌の培養は、例えば、ＬＢ培地又はOvernight Express Instant TB Medium（Novagen社）で、３０～３７℃、０．５～１日間培養することができる。
　培養物から脂質を採取する方法としては、常法から適宜選択することができる。例えば、前述の培養物から、ろ過、遠心分離、細胞の破砕、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、クロロホルム／メタノール抽出法、ヘキサン抽出法、又はエタノール抽出法等により脂質成分を単離、回収することができる。より大規模な培養を行った場合は、培養物より油分を圧搾又は抽出により回収後、脱ガム、脱酸、脱色、脱蝋、脱臭等の一般的な精製を行い、脂質を得ることができる。このように脂質成分を単離した後、単離した脂質を加水分解することで脂肪酸を得ることができる。脂質成分から脂肪酸を単離する方法としては、例えば、アルカリ溶液中で７０℃程度の高温で処理をする方法、リパーゼ処理をする方法、又は高圧熱水を用いて分解する方法等が挙げられる。
　また、脂肪酸分解経路であるβ-酸化経路の機能を喪失させた大腸菌を宿主として作製した形質転換体を用いた場合、生産された脂質は細胞外に分泌される。よって、脂質を回収するために菌体を破壊する必要がなく、脂質回収後に残った細胞を繰り返し脂質生産に使用することができる。
　本発明の製造方法において製造される脂質は、その利用性の点から、脂肪酸又は脂肪酸化合物を含んでいることが好ましく、脂肪酸又は脂肪酸エステル化合物を含んでいることがさらに好ましい。前記脂肪酸エステル化合物は、ＭＡＧ、ＤＡＧ及びＴＡＧからなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましく、ＴＡＧがより好ましい。
　脂質中に含まれる脂肪酸又は脂肪酸エステル化合物は、界面活性剤等への利用性や栄養学的観点から、中鎖脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物が好ましい。具体的には、炭素原子数８以上１０以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物が好ましく、炭素原子数８若しくは１０の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物がより好ましく、炭素原子数８若しくは１０の飽和脂肪酸（カプリル酸、カプリン酸）又はその脂肪酸エステル化合物、さらに好ましくは炭素原子数８の飽和脂肪酸（カプリル酸）又はその脂肪酸エステル化合物がより好ましい。
　脂肪酸エステル化合物は、生産性の点から、単純脂質又は複合脂質が好ましく、単純脂質がさらに好ましく、トリアシルグリセロールがさらにより好ましい。
　本発明の製造方法により得られる脂質は、食用として用いる他、可塑剤、化粧品等の乳化剤、石鹸や洗剤等の洗浄剤、繊維処理剤、毛髪リンス剤、又は殺菌剤や防腐剤として利用することができる。
　上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の脂質の製造方法、脂質生産性の向上方法、形質転換体、並びに該形質転換体の製造方法を開示する。
＜１＞下記タンパク質（Ａ）若しくは（Ｂ）をコードする遺伝子、並びに下記タンパク質（Ｃ）若しくは（Ｄ）をコードする遺伝子を、微生物の細胞に導入した形質転換体を培養し、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは７０％、より好ましくは７５％、より好ましくは８０％、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上のアミノ酸配列からなり、かつＴＥ活性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｄ）配列番号４で示されるアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは７０％、より好ましくは７５％、より好ましくは８０％、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％％以上のアミノ酸配列からなり、かつＡＣＳ活性を有するタンパク質。
＜２＞前記タンパク質（Ａ）若しくは（Ｂ）をコードする遺伝子、並びに前記タンパク質（Ｃ）若しくは（Ｄ）をコードする遺伝子の発現を促進させ、微生物の形質転換体の細胞内で産生される中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質生産性の向上方法。
＜３＞前記タンパク質（Ａ）若しくは（Ｂ）をコードする遺伝子、並びに前記タンパク質（Ｃ）若しくは（Ｄ）をコードする遺伝子の発現を促進させ、微生物の形質転換体の細胞内で産生される脂肪酸の総量を向上させる、脂質生産性の向上方法。
＜４＞前記タンパク質（Ａ）若しくは（Ｂ）をコードする遺伝子、並びに前記タンパク質（Ｃ）若しくは（Ｄ）をコードする遺伝子を微生物の細胞に導入して前記遺伝子の発現を促進させる、前記＜１＞～＜３＞のいずれか１項に記載の方法。
＜５＞前記タンパク質（Ａ）若しくは（Ｂ）をコードする遺伝子、並びに前記タンパク質（Ｃ）若しくは（Ｄ）をコードする遺伝子を、微生物の細胞に導入した形質転換体を培養し、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法。
＜６＞前記タンパク質（Ａ）若しくは（Ｂ）をコードする遺伝子、並びに前記タンパク質（Ｃ）若しくは（Ｄ）をコードする遺伝子を、微生物の細胞に導入した形質転換体を培養し、形質転換体の細胞内で産生される中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質生産性の向上方法。
＜７＞前記タンパク質（Ａ）若しくは（Ｂ）をコードする遺伝子、並びに前記タンパク質（Ｃ）若しくは（Ｄ）をコードする遺伝子を、微生物の細胞に導入した形質転換体を培養し、形質転換体の細胞内で産生される脂肪酸の総量を向上させる、脂質生産性の向上方法。
＜８＞前記タンパク質（Ｂ）が、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上１４２個以下、より好ましくは１個以上１２４個以下、より好ましくは１個以上１０６個以下、より好ましくは１個以上８８個以下、より好ましくは１個以上７１個以下、より好ましくは１個以上５３個以下、より好ましくは１個以上３５個以下、より好ましくは１個以上２４個以下、より好ましくは１個以上１７個以下、より好ましくは１個以上１４個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上７個以下、より好ましくは１個以上３個以下のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加しており、ＴＥ活性を有するタンパク質である、前記＜１＞～＜７＞のいずれか１項記載の方法。
＜９＞前記タンパク質（Ｂ）が、下記（Ｂ－１）～（Ｂ－１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換、好ましくは（Ｂ－１）のアミノ酸置換、を有するアミノ酸配列からなるタンパク質である、前記＜１＞～＜８＞のいずれか１項に記載の方法。
 
（Ｂ－１）配列番号２の２５７位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がイソロイシンに置換。
（Ｂ－２）配列番号２の２５１位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、スレオニン）がアルギニンに置換。
（Ｂ－３）配列番号２の２５１位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、スレオニン）がリジンに置換。
（Ｂ－４）配列番号２の２５１位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、スレオニン）がヒスチジンに置換。
（Ｂ－５）配列番号２の２５４位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、トリプトファン）がイソロイシンに置換。
（Ｂ－６）配列番号２の２５４位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、トリプトファン）がチロシンに置換。
（Ｂ－７）配列番号２の２５７位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がメチオニンに置換。
（Ｂ－８）配列番号２の２５７位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がバリンに置換。
（Ｂ－９）配列番号２の２５７位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がフェニルアラニンに置換。
（Ｂ－１０）配列番号２の２６６位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がシステインに置換。
（Ｂ－１１）配列番号２の２７１位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、トリプトファン）がチロシンに置換。
＜１０＞前記タンパク質（Ｂ）が、前記（Ｂ－１）～（Ｂ－１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換に加えて、下記（Ｂ－１２）～（Ｂ－１９）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなるタンパク質である、前記＜９＞に記載の方法。
 
（Ｂ－１２）配列番号２の１０６位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がイソロイシンに置換。
（Ｂ－１３）配列番号２の１０８位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、アスパラギン）がリジンに置換。
（Ｂ－１４）配列番号２の１０８位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、アスパラギン）がアルギニンに置換。
（Ｂ－１５）配列番号２の１１０位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がイソロイシンに置換。
（Ｂ－１６）配列番号２の１１０位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がメチオニンに置換。
（Ｂ－１７）配列番号２の１１０位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がロイシンに置換。
（Ｂ－１８）配列番号２の１１０位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がフェニルアラニンに置換。
（Ｂ－１９）配列番号２の１１８位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、システイン）がイソロイシンに置換。
＜１１＞前記タンパク質（Ｂ）が、下記（Ｂ－１＿Ｂ－１２）～（Ｂ－１＿Ｂ－１９）からなる群より選ばれるアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなるタンパク質である、前記＜１＞～＜１０＞のいずれか１項記載の方法。
 
（Ｂ－１＿Ｂ－１２）配列番号２の２５７位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がイソロイシンに、１０６位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がイソロイシンに、それぞれ置換。
（Ｂ－１＿Ｂ－１３）配列番号２の２５７位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がイソロイシンに、１０８位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、アスパラギン）がリジンに置換。
（Ｂ－１＿Ｂ－１４）配列番号２の２５７位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がイソロイシンに、１０８位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、アスパラギン）がアルギニンに、それぞれ置換。
（Ｂ－１＿Ｂ－１５）配列番号２の２５７位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がイソロイシンに、１１０位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がイソロイシンに、それぞれ置換。
（Ｂ－１＿Ｂ－１６）配列番号２の２５７位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がイソロイシンに、１１０位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がメチオニンに、それぞれ置換。
（Ｂ－１＿Ｂ－１７）配列番号２の２５７位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がイソロイシンに、１１０位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がロイシンに、それぞれ置換。
（Ｂ－１＿Ｂ－１８）配列番号２の２５７位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がイソロイシンに、１１０位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、バリン）がフェニルアラニンに、それぞれ置換。
（Ｂ－１＿Ｂ－１９）配列番号２の２５７位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、ロイシン）がイソロイシンに、１１８位、又はこれに相当する位置のアミノ酸（好ましくは又は通常、システイン）がイソロイシンに、それぞれ置換。
＜１２＞前記タンパク質（Ｄ）が、前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上２６０個以下、より好ましくは１個以上２２８個以下、より好ましくは１個以上１９５個以下、より好ましくは１個以上１６３個以下、より好ましくは１個以上１３０個以下、より好ましくは１個以上９７個以下、より好ましくは１個以上６５個以下、より好ましくは１個以上４５個以下、より好ましくは１個以上３２個以下、より好ましくは１個以上２６個以下、より好ましくは１個以上１９個以下、より好ましくは１個以上１３個以下、より好ましくは１個以上６個以下のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加しており、ACS活性を有するタンパク質である、前記＜１＞～＜１１＞のいずれか１項記載の方法。
＜１３＞前記タンパク質（Ａ）若しくは（Ｂ）をコードする遺伝子、並びに前記タンパク質（Ｃ）若しくは（Ｄ）をコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ（ａ）若しくは（ｂ）、並びに下記ＤＮＡ（ｃ）若しくは（ｄ）からなる遺伝子である、前記＜１＞～＜１２＞のいずれか１項記載の方法。
 
（ａ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１で示される塩基配列と同一性が６０％以上、好ましくは７０％、より好ましくは７５％、より好ましくは８０％、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の塩基配列からなり、かつＴＥ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｄ）配列番号３で表される塩基配列と同一性が６０％以上、好ましくは７０％、より好ましくは７５％、より好ましくは８０％、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の塩基配列からなり、かつＡＣＳ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
＜１４＞前記ＤＮＡ（ｂ）が、前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上４２７個以下、好ましくは１個以上３７３個以下、より好ましくは１個以上３２０個以下、より好ましくは１個以上２６７個以下、より好ましくは１個以上２１３個以下、より好ましくは１個以上１６０個以下、より好ましくは１個以上１０６個以下、より好ましくは１個以上７４個以下、より好ましくは１個以上５３個以下、より好ましくは１個以上４２個以下、より好ましくは１個以上３２個以下、より好ましくは１個以上２１個以下、さらに好ましくは１個以上１０個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつＴＥ活性を有する前記タンパク質（Ａ）若しくは（Ｂ）をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ａ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＴＥ活性を有する前記タンパク質（Ａ）若しくは（Ｂ）をコードするＤＮＡ、である、前記＜１３＞項記載の方法。
＜１５＞前記ＤＮＡ（ｂ）が、下記（ｂ－１）～（ｂ－１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基置換、好ましくは（ｂ－１）の塩基置換を有する塩基配列からなるＤＮＡであり、かつ前記タンパク質（Ａ）若しくは（Ｂ）をコードするＤＮＡである、前記＜１３＞又は＜１４＞に記載の方法。
 
（ｂ－１）配列番号１の７６９位～７７１位、又はこれらに相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に置換。
（ｂ－２）配列番号１の７５１位～７５３位、又はこれらに相当する位置の塩基がアルギニンをコードする塩基に置換。
（ｂ－３）配列番号１の７５１位～７５３位、又はこれらに相当する位置の塩基がリジンをコードする塩基に置換。
（ｂ－４）配列番号１の７５１位～７５３位、又はこれらに相当する位置の塩基がヒスチジンをコードする塩基に置換。
（ｂ－５）配列番号１の７６０位～７６２位、又はこれらに相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に置換。
（ｂ－６）配列番号１の７６０位～７６２位、又はこれらに相当する位置の塩基がチロシンをコードする塩基に置換。
（ｂ－７）配列番号１の７６９位～７７１位、又はこれらに相当する位置の塩基がメチオニンをコードする塩基に置換。
（ｂ－８）配列番号１の７６９位～７７１位、又はこれらに相当する位置の塩基がバリンをコードする塩基に置換。
（ｂ－９）配列番号１の７６９位～７７１位、又はこれらに相当する位置の塩基がフェニルアラニンをコードする塩基に置換。
（ｂ－１０）配列番号１の７９６位～７９８位、又はこれらに相当する位置の塩基がシステインをコードする塩基に置換。
（ｂ－１１）配列番号１の８１１位～８１３位、又はこれらに相当する位置の塩基がチロシンをコードする塩基に置換。
＜１６＞前記ＤＮＡ（ｂ）が、前記（ｂ－１）～（ｂ－１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基置換に加えて、下記（ｂ－１２）～（ｂ－１９）からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基置換を有する塩基配列からなるＤＮＡであり、かつ前記タンパク質（Ａ）若しくは（Ｂ）をコードするＤＮＡである、前記＜１５＞に記載の方法。
 
（ｂ－１２）配列番号１の３１６位～３１８位、又はこれらに相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に置換。
（ｂ－１３）配列番号１の３２２位～３２４位、又はこれらに相当する位置の塩基がリジンをコードする塩基に置換。
（ｂ－１４）配列番号１の３２２位～３２４位、又はこれらに相当する位置の塩基がアルギニンをコードする塩基に置換。
（ｂ－１５）配列番号１の３２８位～３３０位、又はこれらに相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に置換。
（ｂ－１６）配列番号１の３２８位～３３０位、又はこれらに相当する位置の塩基がメチオニンをコードする塩基に置換。
（ｂ－１７）配列番号１の３２８位～３３０位、又はこれらに相当する位置の塩基がロイシンをコードする塩基に置換。
（ｂ－１８）配列番号１の３２８位～３３０位、又はこれらに相当する位置の塩基がフェニルアラニンをコードする塩基に置換。
（ｂ－１９）配列番号１の３５２位～３５４位、又はこれらに相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に置換。
＜１７＞前記ＤＮＡ（ｂ）が、下記（ｂ－１＿ｂ－１２）～（ｂ－１＿ｂ－１９）からなる群より選ばれる塩基置換を有する塩基配列からなるＤＮＡであり、かつ前記タンパク質（Ａ）若しくは（Ｂ）をコードするＤＮＡである、前記＜１３＞～＜１６＞のいずれか１項記載の方法。
 
（ｂ－１＿ｂ－１２）配列番号１の７６９位～７７１位、又はこれらに相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、３１６位～３１８位、又はこれらに相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ｂ－１＿ｂ－１３）配列番号１の７６９位～７７１位、又はこれらに相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、３２２位～３２４位、又はこれらに相当する位置の塩基がリジンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ｂ－１＿ｂ－１４）配列番号１の７６９位～７７１位、又はこれらに相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、３２２位～３２４位、又はこれらに相当する位置の塩基がアルギニンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ｂ－１＿ｂ－１５）配列番号１の７６９位～７７１位、又はこれらに相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、３２８位～３３０位、又はこれらに相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ｂ－１＿ｂ－１６）配列番号１の７６９位～７７１位、又はこれらに相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、３２８位～３３０位、又はこれらに相当する位置の塩基がメチオニンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ｂ－１＿ｂ－１７）配列番号１の７６９位～７７１位、又はこれらに相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、３２８位～３３０位、又はこれらに相当する位置の塩基がロイシンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ｂ－１＿ｂ－１８）配列番号１の７６９位～７７１位、又はこれらに相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、３２８位～３３０位、又はこれらに相当する位置の塩基がフェニルアラニンをコードする塩基に、それぞれ置換。
（ｂ－１＿ｂ－１９）配列番号１の７６９位～７７１位、又はこれらに相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、３５２位～３５４位、又はこれらに相当する位置の塩基がイソロイシンをコードする塩基に、それぞれ置換。
＜１８＞前記ＤＮＡ（ｄ）が、前記ＤＮＡ（ｃ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上７８３個以下、好ましくは１個以上６８５個以下、より好ましくは１個以上５８７個以下、より好ましくは１個以上４８９個以下、より好ましくは１個以上３９１個以下、より好ましくは１個以上２９３個以下、より好ましくは１個以上１９５個以下、より好ましくは１個以上１３７個以下、より好ましくは１個以上９７個以下、より好ましくは１個以上７８個以下、より好ましくは１個以上５８個以下、より好ましくは１個以上３９個以下、さらに好ましくは１個以上１９個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつＡＣＳ活性を有する前記タンパク質（Ｃ）若しくは（Ｄ）をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ｃ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＡＣＳ活性を有する前記タンパク質（Ｃ）若しくは（Ｄ）をコードするＤＮＡ、である、前記＜１３＞～＜１７＞のいずれか１項記載の方法。
＜１９＞前記中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質が、炭素原子数８以上１０以下の脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくは炭素原子数８若しくは１０の脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくは炭素原子数８若しくは１０の飽和脂肪酸（カプリル酸、カプリン酸）又はこれを構成成分とする脂質、さらに好ましくは炭素原子数８の飽和脂肪酸（カプリル酸）又はこれを構成成分とする脂質、である、前記＜１＞～＜１８＞のいずれか１項記載の方法。
＜２０＞前記脂質が、脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、好ましくは中鎖脂肪酸又はその脂肪酸エステル、より好ましくは炭素原子数が８以上１０以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数が８又は１０の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数が８又は１０の飽和脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数が８の飽和脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物を含む、前記＜１＞～＜１９＞のいずれか１項記載の方法。
＜２１＞前記微生物が大腸菌、枯草菌、赤色酵母、又はモルチエレラ・エスピーから選ばれる微生物、好ましくは大腸菌である、前記＜１＞～＜２０＞のいずれか１項記載の方法。
＜２２＞前記タンパク質（Ａ）若しくは（Ｂ）をコードする遺伝子、並びに前記タンパク質（Ｃ）若しくは（Ｄ）をコードする遺伝子の発現を微生物の細胞内で促進させた、形質転換体。
＜２３＞前記タンパク質（Ａ）若しくは（Ｂ）をコードする遺伝子、並びに前記タンパク質（Ｃ）若しくは（Ｄ）をコードする遺伝子、又は当該遺伝子を含有する組換えベクターを微生物に導入してなる、形質転換体。
＜２４＞前記タンパク質（Ａ）若しくは（Ｂ）をコードする遺伝子、並びに前記タンパク質（Ｃ）若しくは（Ｄ）をコードする遺伝子、又は当該遺伝子を含有する組換えベクターを微生物に導入する、形質転換体の作製方法。
＜２５＞前記タンパク質（Ｂ）が前記＜８＞～＜１１＞のいずれか１項で規定するタンパク質である、前記＜２２＞～＜２４＞のいずれか１項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜２６＞前記タンパク質（Ｄ）が前記＜１２＞で規定するタンパク質である、前記＜２２＞～＜２５＞のいずれか１項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜２７＞前記タンパク質（Ａ）若しくは（Ｂ）をコードする遺伝子、並びに前記タンパク質（Ｃ）若しくは（Ｄ）をコードする遺伝子が、前記ＤＮＡ（ａ）若しくは（ｂ）、並びに前記ＤＮＡ（ｃ）若しくは（ｄ）からなる遺伝子である、前記＜２２＞～＜２６＞のいずれか１項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜２８＞前記ＤＮＡ（ｂ）が前記＜１４＞～＜１７＞のいずれか１項で規定するＤＮＡである、前記＜２７＞項に記載の形質転換体又はその作製方法。
＜２９＞前記ＤＮＡ（ｄ）が前記＜８＞で規定するＤＮＡである、前記＜２７＞項に記載の形質転換体又はその作製方法。
＜３０＞前記微生物が大腸菌、枯草菌、赤色酵母、又はモルチエレラ・エスピーから選ばれる微生物、好ましくは大腸菌である、前記＜２２＞～＜２９＞のいずれか１項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜３１＞脂質を製造するための、前記＜２２＞～＜３０＞のいずれか１項記載の形質転換体、又は形質転換体の作製方法により得られた形質転換体の使用。
＜３２＞前記脂質が、脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、好ましくは中鎖脂肪酸又はその脂肪酸エステル、より好ましくは炭素原子数が８以上１０以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数が８又は１０の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数が８又は１０の飽和脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数が８の飽和脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物を含む、前記＜３１＞項記載の使用。
　以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。ここで、本実施例で用いるプライマーの塩基配列を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
実施例１　CpTE遺伝子及びEcACS遺伝子を導入した大腸菌による脂質の製造
（１）CpTE遺伝子発現用プラスミドの構築
　pBS-SK(-)プラスミド（アジレント・テクノロジー社製）を鋳型とし、表１記載のプライマーpBS-F（配列番号５）及びプライマーpBS-R（配列番号６）を用いてＰＣＲを行い、pBS-SK(-)線状ＤＮＡ配列を増幅した。
　さらに、クフェア・パルストリス由来のTE遺伝子（GenBank：U38188.1）を人工的に合成した。合成したＤＮＡ配列を鋳型とし、表１記載のプライマーpBS/CpTE-F（配列番号７）及びプライマーCpTE/pBS-R（配列番号８）を用いてＰＣＲを行い、葉緑体移行シグナルと推定される配列を除去したCpTE遺伝子のＤＮＡ断片を増幅した。
　次いで、前記pBS-SK(-)線状ＤＮＡ配列、及びCpTE遺伝子のＤＮＡ断片を混合し、In-Fusion（登録商標）ＰＣＲクローニング法（Clontech）によりクローニングし、pBS-SK(-)プラスミドのlacOプロモーターの下流にCpTE遺伝子が挿入されたpBS-CpTEプラスミド（CpTE遺伝子発現用プラスミド）を得た。
（２）CpTE-EcACS遺伝子発現用プラスミドの構築
　前記プラスミドpBS-CpTEを鋳型として、表１に示すプライマーpBS-F（配列番号５）及びプライマーCpTE/RBS-R（配列番号９）のプライマー対を用いてPCRを行い、pBS-CpTE線状化プラスミドを増幅した。
　大腸菌K-16株のゲノムＤＮＡを鋳型として、表１記載のプライマーRBS/acs-F（配列番号１０）及びプライマーacs/pBS-R（配列番号１１）のプライマー対を用いてPCRを行い、EcACS遺伝子のＤＮＡ断片を増幅した。
　pBS-CpTE線状ＤＮＡ配列、及びEcACS遺伝子のＤＮＡ断片を混合し、In-Fusion（登録商標）ＰＣＲクローニング法（Clontech）によりクローニングし、pBS-SK(-)プラスミドのlacOプロモーターの下流にCpTE遺伝子及びEcACS遺伝子が挿入されたpBS-CpTE-ACSプラスミド（CpTE-EcACS遺伝子発現用プラスミド）を取得した。
（３）遺伝子発現用プラスミドの大腸菌への導入、及び得られた形質転換体を用いた脂質の製造
　前述のCpTE遺伝子発現用プラスミド、並びにCpTE-EcACS遺伝子発現用プラスミドを用いて、大腸菌突然変異株であるK27株（fadD88）（Eur. J. Biochem., 1969, vol. 7, p. 559-574）をコンピテントセル形質転換法により形質転換した。形質転換処理をしたK27株を３０℃で一晩静置し、得られたコロニーをLBAmp液体培地（Bacto Trypton 1%, Yeast Extract 0.5%, NaCl 1%, アンピシリンナトリウム５０μg/mL）１ｍＬに接種し、３０℃で一晩培養した。この培養液２μＬを、1% グリセリン含有の２ｍＬのOvernight Express Instant TB Medium（Novagen社）に接種し、３０℃で振とう培養した。培養２４時間後、培養液に含まれる脂質成分を、下記の方法にて解析した。
（４）大腸菌培養液中の脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析
　培養液０．５ｍＬに、内部標準として1mg/mLの7-ペンタデカノンを２５μＬ添加後、２Ｎ塩酸１０μＬ及びヘキサン２ｍＬを添加して激しく攪拌し、３，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離を行った。パスツールピペットにてヘキサン層（上層）を新しい蓋付きねじ口試験管に回収した。得られたヘキサン層に窒素ガスを吹き付けて乾固し、１４％三フッ化ホウ素溶液（SIGMA社製）１ｍＬを添加し、８０℃にて３０分間恒温した。その後、ヘキサン及び飽和食塩水を各１ｍＬ添加して激しく撹拌し、室温にて３０分間放置後、上層であるヘキサン層を回収して脂肪酸エステルを得た。
　得られた脂肪酸エステルをガスクロマトグラフィー解析に供した。ガスクロマトグラフィーは、７８９０Ａ（Agilent Technologies）を用いて、下記の条件下で解析を実施した。
（解析条件）
キャピラリーカラム：DB-1 MS（30m×200μm×0.25μm、J＆W Scientific社製）
移動相：高純度ヘリウム
カラム内流量：1.0mL/分
昇温プログラム：70℃保持１分間→70～200℃（20℃/分昇温）→200～320℃（50℃/分昇温）→320℃保持５分間
平衡化時間：１分間
注入口：スプリット注入（スプリット比：１００：１）
圧力１４．４９ｐｓｉ、１０４ｍＬ／分
注入量：１μＬ
洗浄バイアル：メタノール・クロロホルム
検出器温度：３００℃
　また、脂肪酸エステルの同定は、同サンプルを同条件でガスクロマトグラフ質量分析解析に供することにより行った。
　ガスクロマトグラフィー解析により得られた波形データのピーク面積より、各脂肪酸のメチルエステル量を定量した。各ピーク面積を、内部標準である7-ペンタデカノンのピーク面積と比較することで試料間の補正を行い、培養1Lあたりに含まれる各脂肪酸の量及びこれらの合計量を算出した。
　その結果を表２に示す。なお表２の結果は、独立した３回の培養とクロマトグラフィー解析の結果の平均値である。
　なお、以下表中Ｃ８：０脂肪酸を、Ｃ１０はＣ１０：０及びＣ１０：１脂肪酸の総和を、Ｃ１２はＣ１２：０及びＣ１２：１脂肪酸の総和を、Ｃ１４はＣ１４：０及びＣ１４：１脂肪酸の総和を、Ｃ１６はＣ１６：０、Ｃ１６：１、Ｃ１６：２及びＣ１６：３脂肪酸の総和を、Ｃ１８はＣ１８：０、Ｃ１８：１、Ｃ１８：２及びＣ１８：３脂肪酸の総和をそれぞれ表す。また、以下表中「総脂肪酸生産量」（産生される脂肪酸の総量）とは、これらの脂肪酸量の合計を意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
　表２から明らかなように、CpTE遺伝子のみを導入した形質転換体でのＣ８脂肪酸生産量と比較して、CpTE遺伝子とEcACS遺伝子を導入した形質転換体では、Ｃ８脂肪酸の生産量及び生産される脂肪酸の総量（総脂肪酸生産量）が大きく向上した。具体的には、Ｃ８脂肪酸の生産量ではCpTE遺伝子のみを導入した場合と比べて、CpTE遺伝子とEcACS遺伝子を導入した形質転換体では、Ｃ８脂肪酸量が１．２６倍向上し、生産される脂肪酸の総量が１．２７倍向上した。
　以上のように、TE遺伝子に加えてACS遺伝子を発現させることで、中鎖脂肪酸の生産性を飛躍的に向上させた形質転換体を作製することができる。そして、この形質転換体を培養することで、中鎖脂肪酸の生産性及び生産される脂肪酸の総量を向上させることができる。
　本発明をその実施態様とともに説明したが、我々は特に指定しない限り我々の発明を説明のどの細部においても限定しようとするものではなく、添付の請求の範囲に示した発明の精神と範囲に反することなく幅広く解釈されるべきであると考える。
　本願は、２０１８年４月１９日に米国で特許出願された米国出願番号62/659,796に基づく優先権を主張するものであり、これはここに参照してその内容を本明細書の記載の一部として取り込む。

Claims (11)

  1. 　下記タンパク質（Ａ）若しくは（Ｂ）をコードする遺伝子、並びに下記タンパク質（Ｃ）若しくは（Ｄ）をコードする遺伝子を、微生物の細胞内に導入した形質転換体を培養し、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法。
    （Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
    （Ｃ）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｄ）配列番号４で示されるアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアセチル-ＣｏＡシンテターゼ活性を有するタンパク質。
  2. 　下記タンパク質（Ａ）若しくは（Ｂ）をコードする遺伝子、並びに下記タンパク質（Ｃ）若しくは（Ｄ）をコードする遺伝子を、微生物の細胞内に導入した形質転換体を培養し、形質転換体の細胞内で産生される脂肪酸の総量を向上させる、脂質生産性の向上方法。
     
    （Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアシル-ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
    （Ｃ）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｄ）配列番号４で示されるアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアセチル-ＣｏＡシンテターゼ活性を有するタンパク質。
  3. 　下記タンパク質（Ａ）若しくは（Ｂ）をコードする遺伝子、並びに下記タンパク質（Ｃ）若しくは（Ｄ）をコードする遺伝子を、微生物の細胞内に導入した形質転換体を培養し、中鎖脂肪酸またはこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、中鎖脂肪酸の生産性の向上方法。
     
    （Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアシル-ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
    （Ｃ）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｄ）配列番号４で示されるアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアセチル-ＣｏＡシンテターゼ活性を有するタンパク質。
  4. 　前記タンパク質（Ｂ）が、下記（Ｂ－１）～（Ｂ－１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換、好ましくは（Ｂ－１）のアミノ酸置換、を有するアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
     
    （Ｂ－１）配列番号２の２５７位、又はこれに相当する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換。
    （Ｂ－２）配列番号２の２５１位、又はこれに相当する位置のアミノ酸がアルギニンに置換。
    （Ｂ－３）配列番号２の２５１位、又はこれに相当する位置のアミノ酸がリジンに置換。
    （Ｂ－４）配列番号２の２５１位、又はこれに相当する位置のアミノ酸がヒスチジンに置換。
    （Ｂ－５）配列番号２の２５４位、又はこれに相当する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換。
    （Ｂ－６）配列番号２の２５４位、又はこれに相当する位置のアミノ酸がチロシンに置換。
    （Ｂ－７）配列番号２の２５７位、又はこれに相当する位置のアミノ酸がメチオニンに置換。
    （Ｂ－８）配列番号２の２５７位、又はこれに相当する位置のアミノ酸がバリンに置換。
    （Ｂ－９）配列番号２の２５７位、又はこれに相当する位置のアミノ酸がフェニルアラニンに置換。
    （Ｂ－１０）配列番号２の２６６位、又はこれに相当する位置のアミノ酸がシステインに置換。
    （Ｂ－１１）配列番号２の２７１位、又はこれに相当する位置のアミノ酸がチロシンに置換。
     
  5. 　前記タンパク質（Ｂ）が、さらに下記（Ｂ－１２）～（Ｂ－１９）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項４に記載の方法。
     
    （Ｂ－１２）配列番号２の１０６位、又はこれに相当する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換。
    （Ｂ－１３）配列番号２の１０８位、又はこれに相当する位置のアミノ酸がリジンに置換。
    （Ｂ－１４）配列番号２の１０８位、又はこれに相当する位置のアミノ酸がアルギニンに置換。
    （Ｂ－１５）配列番号２の１１０位、又はこれに相当する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換。
    （Ｂ－１６）配列番号２の１１０位、又はこれに相当する位置のアミノ酸がメチオニンに置換。
    （Ｂ－１７）配列番号２の１１０位、又はこれに相当する位置のアミノ酸がロイシンに置換。
    （Ｂ－１８）配列番号２の１１０位、又はこれに相当する位置のアミノ酸がフェニルアラニンに置換。
    （Ｂ－１９）配列番号２の１１８位、又はこれに相当する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換。
     
  6. 　前記微生物が大腸菌である、請求項１～５のいずれか１項記載の方法。
  7. 　前記脂質が、炭素原子数が８の飽和脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物を含む、請求項１～６のいずれか１項記載の方法。
  8. 　下記タンパク質（Ａ）若しくは（Ｂ）をコードする遺伝子、並びに下記タンパク質（Ｃ）若しくは（Ｄ）をコードする遺伝子の発現を微生物の細胞内で促進させた、形質転換体。
     
    （Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアシル-ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
    （Ｃ）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （Ｄ）配列番号４で示されるアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアセチル-ＣｏＡシンテターゼ活性を有するタンパク質。
  9. 　前記タンパク質（Ｂ）が、下記（Ｂ－１）～（Ｂ－１１）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換、好ましくは（Ｂ－１）のアミノ酸置換、を有するアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項８に記載の形質転換体。
     
    （Ｂ－１）配列番号２の２５７位、又はこれに相当する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換。
    （Ｂ－２）配列番号２の２５１位、又はこれに相当する位置のアミノ酸がアルギニンに置換。
    （Ｂ－３）配列番号２の２５１位、又はこれに相当する位置のアミノ酸がリジンに置換。
    （Ｂ－４）配列番号２の２５１位、又はこれに相当する位置のアミノ酸がヒスチジンに置換。
    （Ｂ－５）配列番号２の２５４位、又はこれに相当する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換。
    （Ｂ－６）配列番号２の２５４位、又はこれに相当する位置のアミノ酸がチロシンに置換。
    （Ｂ－７）配列番号２の２５７位、又はこれに相当する位置のアミノ酸がメチオニンに置換。
    （Ｂ－８）配列番号２の２５７位、又はこれに相当する位置のアミノ酸がバリンに置換。
    （Ｂ－９）配列番号２の２５７位、又はこれに相当する位置のアミノ酸がフェニルアラニンに置換。
    （Ｂ－１０）配列番号２の２６６位、又はこれに相当する位置のアミノ酸がシステインに置換。
    （Ｂ－１１）配列番号２の２７１位、又はこれに相当する位置のアミノ酸がチロシンに置換。
     
  10. 　前記タンパク質（Ｂ）が、さらに下記（Ｂ－１２）～（Ｂ－１９）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項９に記載の形質転換体。
     
    （Ｂ－１２）配列番号２の１０６位、又はこれに相当する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換。
    （Ｂ－１３）配列番号２の１０８位、又はこれに相当する位置のアミノ酸がリジンに置換。
    （Ｂ－１４）配列番号２の１０８位、又はこれに相当する位置のアミノ酸がアルギニンに置換。
    （Ｂ－１５）配列番号２の１１０位、又はこれに相当する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換。
    （Ｂ－１６）配列番号２の１１０位、又はこれに相当する位置のアミノ酸がメチオニンに置換。
    （Ｂ－１７）配列番号２の１１０位、又はこれに相当する位置のアミノ酸がロイシンに置換。
    （Ｂ－１８）配列番号２の１１０位、又はこれに相当する位置のアミノ酸がフェニルアラニンに置換。
    （Ｂ－１９）配列番号２の１１８位、又はこれに相当する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換。
  11. 　前記微生物が大腸菌である、請求項８～１０のいずれか１項記載の形質転換体。
     
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11505115A (ja) * 1995-05-15 1999-05-18 カルジーン，インコーポレーテッド 植物チオエステラーゼの遺伝子操作および新規な基質特異性を有する植物チオエステラーゼの開示
WO2011008565A1 (en) * 2009-06-29 2011-01-20 Synthetic Genomics, Inc. Acyl-acp thioesterase genes and uses therefor
US20160355793A1 (en) * 2011-07-27 2016-12-08 Iowa State University Research Foundation, Inc. Materials and methods for using an acyl-acyl carrier protein thioesterase and mutants and chimeras thereof in fatty acid synthesis
JP2019050750A (ja) * 2017-09-13 2019-04-04 花王株式会社 脂質の製造方法
WO2019069969A1 (ja) * 2017-10-06 2019-04-11 花王株式会社 脂質の製造方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11505115A (ja) * 1995-05-15 1999-05-18 カルジーン，インコーポレーテッド 植物チオエステラーゼの遺伝子操作および新規な基質特異性を有する植物チオエステラーゼの開示
WO2011008565A1 (en) * 2009-06-29 2011-01-20 Synthetic Genomics, Inc. Acyl-acp thioesterase genes and uses therefor
US20160355793A1 (en) * 2011-07-27 2016-12-08 Iowa State University Research Foundation, Inc. Materials and methods for using an acyl-acyl carrier protein thioesterase and mutants and chimeras thereof in fatty acid synthesis
JP2019050750A (ja) * 2017-09-13 2019-04-04 花王株式会社 脂質の製造方法
WO2019069969A1 (ja) * 2017-10-06 2019-04-11 花王株式会社 脂質の製造方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LI, W. ET AL.: "Effect of NADPH availability on free fatty acid production in Escherichia coli", BIOTECHNOL. BIOENG., vol. 115, no. 2, February 2018 (2018-02-01), pages 444 - 452, XP055649659 *
LIN, H. ET AL.: "Acetyl-CoA synthetase overexpression in Escherichia coli demonstrates more efficient acetate assimilation and lower acetate accumulation: a potential tool in metabolic engineering", APPL. MICROBIOL. BIOTECHNOL., vol. 71, no. 6, 2006, pages 870 - 874, XP019421965, DOI: 10.1007/s00253-005-0230-4 *
RENGEL, R. ET AL.: "Overexpression of acetyl-CoA synthetase (ACS) enhances the biosynthesis of neutral lipids and starch in the green microalga Chlamydomonas reinhardtii", ALGAL RESEARCH, vol. 31, February 2018 (2018-02-01), pages 183 - 193, XP055649667 *
XIAO, Y. ET AL.: "Engineering Escherichia coli to convert acetic acid to free fatty acids", BIOCHEM. ENG. J., vol. 76, 2013, pages 60 - 69, XP028560652 *

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